( PDF ) Desenvolvimento de curativos para cicatrização de feridas por segunda intenção baseados em biomateriais capazes de promoverem resposta celular controlada via estímulo externo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Curso de Pós-Graduação em Engenharia Metalúrgica e de Minas

Tese de doutorado

"Desenvolvimento de curativos para cicatrização

de feridas por segunda intenção baseados em

biomateriais capazes de promoverem

resposta celular controlada via estímulo externo”

Autor: Carlos Ignacio

Orientador: Prof. Rodrigo Lambert Oréfice

Junho de 2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Curso de Pós-Graduação em Engenharia Metalúrgica e de Minas

Carlos Ignacio

DESENVOLVIMENTO DE CURATIVOS PARA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS

POR SEGUNDA INTENÇÃO BASEADOS EM BIOMATERIAIS CAPAZES DE

PROMOVEREM RESPOSTA CELULAR CONTROLADA VIA ESTÍMULO

EXTERNO

Defesa de tese de doutorado apresentada ao

Curso de Pós-Graduação em Engenharia

Metalúrgica e de Minas da Universidade

Federal de Minas Gerais

Área de concentração: Ciências e Engenharia de Materiais

Orientador: Prof. Rodrigo Lambert Oréfice

Belo Horizonte

Escola de Engenharia da UFMG

2009

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Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Rodrigo Lambert Oréfice, pelo apoio, orientação, incentivo.

À Dra. Sandra A. L. Moura, pela solidariedade e amizade, desde o início deste trabalho,

no UNILESTEMG e depois no ICB/UFMG.

À Prof. Dra. Lucíola Barcelos, pelo incentivo e incansável colaboração nos

experimentos com os animais, tarefa que faz com muito carinho. E pela ajuda na

montagem do protocolo do CETEA.

À Prof. Dra. Mônica Diniz Ferreira, pelo incentivo e pela colaboração na interpretação

dos resultados de histologia.

À Prof. Dra. Sílvia Passos de Andrade, pela disponibilização do laboratório de

Angiogênese.

Aos alunos de graduação, do Curso de Engenharia de Materiais, Igor Alan Soares,

Cinthia Brito, Helbert Andrade, Kelly Pontes, que muito colaboraram nos trabalhos.

A José Eugênio de Oliveira e Silva, graduando de engenharia elétrica, pela ajuda na

construção da fonte de alta voltagem e do gerador de radiofreqüência.

Ao Instituto de Ciências Biológicas ICB-UFMG, pela disponibilização e uso dos

laboratórios de Fisiologia e Biofísica e Patologia Geral.

Ao departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais – DEMET/UFMG, pela

disponibilização das análises de Microscopia Eletrônica e Espectroscopia

Infravermelho.

Ao Centro Universitário do Leste de Minas Gerais-UNILESTE, pela disponibilidade de

uso dos laboratórios e pela bolsa de doutorado.

À faculdade de farmácia do UNILESTE, pela disponibilização dos laboratórios.

À Fapemig, pela Bolsa de Iniciação Cientifica Tecnológica e Institucional da

FAPEMIG –PROBIC, concedida ao aluno Igor Alan Gomes Soares.

À minha família, pela compreensão nos períodos de ausência.

A tantos outros, que direta ou indiretamente colaboraram com este trabalho.

iii

Sumário

Agradecimentos ................................................................................................................ii

Lista de figuras.................................................................................................................. v

Lista de tabelas................................................................................................................iix

Lista de equações............................................................................................................iix

Abreviaturas...................................................................................................................... x

Resumo ...........................................................................................................................xii

Abstract..........................................................................................................................xiv

Capítulo 1 - Introdução..................................................................................................... 1

Capítulos 2 - Objetivos ..................................................................................................... 7

Capítulo 3 - Revisão bibliográfica.................................................................................... 8

3.1 - Epiderme............................................................................................................................... 8

3.2 - Derme ................................................................................................................................... 9

3.3 - Feridas na pele .................................................................................................................... 10

3.4 - Cicatrização ........................................................................................................................ 14

3.5 - Curativos............................................................................................................................. 20

3.6 - Tipos de curativo ................................................................................................................ 21

3.7 - Polímeros inteligentes......................................................................................................... 25

3.8 – Graftização ou enxertia ...................................................................................................... 37

3.9 - Graftização e adesão de proteínas...................................................................................... 39

3.10 - Cultura de células e adesão celular................................................................................... 40

3.11 - Técnicas preparatórias de superfícies poliméricas para graftização................................. 44

3.12 – Estudos in vivo com materiais ......................................................................................... 52

Capítulo 4 – Procedimento Experimental....................................................................... 53

4. 1 - Materiais ............................................................................................................................ 54

4. 1. 1 - Preparação dos filmes:.............................................................................. 54

4. 1. 2 - Obtenção do filme ..................................................................................... 55

4. 1. 3 – Limpeza e extração de contaminantes do filme........................................ 57

4. 1. 4 - Purificação do monômero – N – isopropilacrilamida (N-IPAAm) ........... 59

4. 1. 5 - Tratamento corona..................................................................................... 63

4. 1. 6 - Tratamento com radiação Ultravioleta ...................................................... 65

4. 1. 7 - Graftização ................................................................................................ 66

4. 1. 8 - Medidas do ângulo de contato................................................................... 68

4. 1. 9 – Transição LCST........................................................................................ 69

4. 1. 10 – Espectroscopia infravermelho FTIR-ATR.............................................. 70

4. 1. 11 – Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ........................................ 71

4. 1. 12 - Teste in vitro de adesão em proteína ....................................................... 71

4. 2 - Testes in vivo ..................................................................................................................... 72

4. 2. 1 - Preparação do curativo .............................................................................. 72

4. 2. 2 - Implantação ............................................................................................... 73

4.2.3 - Verificação do mecanismo on-off em um modelo de ferida cutânea

excisional. ............................................................................................................... 75

Capítulo 5 - Resultados e Discussão............................................................................... 83

5.1 - Ângulo de Contato.......................................................................................... 83

5.1 – Ganho de massa – graftização. ...................................................................... 85

5.3 - Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV ................................................ 87

5.4 - Transição LCST.............................................................................................. 92

5.5 - Espectroscopia infravermelho com transformada de Fourier - FTIR............ 95

5.6 - Testes de adesão com deposição de albumina................................................ 98

5. 7 - Testes in vivo............................................................................................... 101

Capítulo 6 - Conclusão ................................................................................................. 118

Capítulo 7- Referências Bibliográficas......................................................................... 119

Lista de figuras

Figura 1.1: Representação da transição (LCST) nos enxertos de P-N-IPAAm em

poliuretano ................................................................................................................ 5

Figura 1.2: Esquema representando o leito de ferida por segunda intenção e curativo.... 5

Figura 1.3: Esquema representando curativo posicionado sobre o leito da ferida............ 5

Figura 1.4: Esquema representando proliferação de células............................................. 6

Figura 1.5: Esquema representando o acionamento on-off............................................... 6

Figura 1.6: Esquema representando a retirada do curativo sem trauma. .......................... 6

Figura 3.1: Estrutura da pele, indicando principais elementos....................................... 10

Figura 3.2: Matriz extracelular (ECM) e fibroblastos .................................................... 17

Figura 3.3: Esquema gráfico representando os vários estágios de lesão e o tempo de

duração.................................................................................................................... 18

Figura 3.4: Tipos de feridas - Primeira, segunda e terceira intenção.............................. 19

Figura 3.5: Fórmula química estrutural para o poli(n-isopropilacrilamida) ................... 27

Figura 3.6: Transição globular para enovelada............................................................... 27

Figura 3.7: Esquema representando a reação RAFT

..................................................... 30

Figura 3.8: Esquema representativo de polimerização RAFT de P-N-IPAAm ............. 31

Figura 3.17: Efeito do tipo de comonômero na LCST do PNIPAM .............................. 32

Figura 3.18: Esquema representativo do hidrogel de PNIPAM ..................................... 34

Figura 3.19: Esquema representativo da progressão da formação do gel....................... 35

Figura 3.20: Gráfico representando Grau de inchamento x Tempo ............................... 35

Figura 3.21: Gráfico representando Retenção de água em relação ao tempo................. 36

Figura 3.22: Gráfico: LCST x Concentração de sais no PNIPAM................................. 37

Figura 3.10: Esquema representando alguns tipos de polymers brushes

...................... 38

Figura 3.11: Esquema representativo de graftização: grafting to e grafting from ......... 39

Figura 3.12: Esquema representando alguns tipos de polymers brushes ....................... 40

Figura 3.13: Mecanismo de adesão da célula. ................................................................ 42

Figura 3.14: Esquema representando dispositivo on-off, para camadas de células........ 42

Figura 3.15: Eletromicrografia do cultivo e células sobre superfície com poli (N-IPAAm

co DEGMA) à temperatura de 37°C (a) e destacamento após decréscimo de

temperatura (b)........................................................................................................ 43

Figura 3.16: Esquema representando tipos de adesão de células sobre substrato. ......... 43

Figura 3.23: Esquema representando ângulo de contato entre liquido e sólido. ............ 45

Figura 3.24: Esquema representativo sistema corona ponta-plano................................. 48

Figura 3.25: Gráfico de densidade de elétrons em função da energia. ........................... 49

Figura 4.1 – Fluxograma da metodologia utilizada ........................................................ 53

Figura 4.2: Poliuretano Elastollan ELA585A10 natural.............................................. 54

Figura 4.3: Poliuretano em piridina a temperatura de 50°C ........................................... 54

Figura 4.4: Poliuretano totalmente dissolvido em piridina a 50°C................................. 55

Figura 4.5: Derramamento da solução sobre a placa de vidro........................................ 55

Figura 4.6: Início da operação de espalmagem da solução............................................. 56

Figura 4.7: Fim do processo de espalmagem da solução................................................ 56

Figura 4.8: Retirada do filme da placa............................................................................ 57

Figura 4.9: Extrator Soxhlet............................................................................................ 58

Figura 4.10: Detalhe da câmara do Soxhlet com filme de PU........................................ 58

Figura 4.11: N – isopropilacrilamida sendo preparado para purificação........................ 59

Figura 4.12: N- hexano adicionado ao n-isopropilacrilamida (N-IPAAm).................... 59

Figura 4.13: Dissolução de N-IPAAm em n-hexano com aquecimento e agitação. ...... 60

Figura 4.14: Dissolução total de N-IPAAM em n-hexano a 60°C. ................................ 60

Figura 4.15: Filtragem à vácuo da solução de N-IPAAm em n-hexano......................... 61

Figura 4.16: Solução filtrada de N-IPAAm em n-hexano. ............................................. 61

Figura 4.17: N-IPAAm purificado e totalmente separado do n-hexano......................... 62

Figura 4.18: Sistema de secagem à vácuo de N-IPAAm................................................ 62

Figura 4.19: Sistema para tratamento corona do filme de PU........................................ 64

Figura 4.20: Sistema para tratamento corona do filme de PU........................................ 64

Figura 4.21: Câmara de vácuo/gás indicando cor azul na abertura do arco elétrico ...... 65

Figura 4.22: Tratamento com radiação ultravioleta........................................................ 66

Figura 4.23: Filme de PU exposto ao UV....................................................................... 66

Figura 4.24: Sistema do reator com atmosfera controlada. ............................................ 67

vii

Figura 4.25: Reator para graftização............................................................................... 67

Figura 4.26: Porta amostra do filme na medida do ângulo de contato. .......................... 68

Figura 4.27: Lupa para observação do ângulo de contato .............................................. 69

Figura 4.28: Esquema representativo para medição da LCST........................................ 70

Figura 4.29: Montagem do curativo. .............................................................................. 73

Figura 4.30: Acondicionamento dos camundongos no biotério. .................................... 75

Figura 4.31: Aplicação de anestesia no camundongo..................................................... 76

Figura 4.32: Preparação da pele do dorso do camundongo. ........................................... 76

Figura 4.33: Excisão da pelr com punch......................................................................... 77

Figura 4.34: Feridas prontas para serem cobertas........................................................... 77

Figura 4.35: Feridas recobertas com curativos ............................................................... 78

Figura 4.36: Reforço para assegurar a montagem do conjunto. ..................................... 78

Figura 4.37: Medidas das feridas.................................................................................... 78

Figura 4.38: Termômetro à laser para leitura da temperatura da pele. ........................... 79

Figura 4.39: Leitura de temperatura sobre o curativo..................................................... 80

Figura 4.40: Retirada do curativo. .................................................................................. 80

Figura 4.41: Retirada do curativo ................................................................................... 80

Figura 4.42: Retirada do tecido região das feridas dorso do camundongo..................... 81

Figura 4.43: Vista das feridas lado interno da pele.e a direita esquema representativo. 81

Figura 4.44: Seccionamento com punch , para análises histológicas ............................. 81

Figura 4.45: Preparação para fixação.(A) Feridas sendo seccionadas............................ 82

Figura 4.46: Acondicionamento do tecido em formalina (A)......................................... 82

Figura 5.1: Molhabilidade de uma gota de água deionizada sobre asuperfície do PU

graftizado com P-N-IPAAm ................................................................................... 83

Figura 5.2: Esquema representativo da formação de grupos.......................................... 84

Figura 5.3: Esquema representativo da graftização poli-N-Isopropilacrilamida superfície

de poliuretano ......................................................................................................... 85

Figura 5.5: Eletromicrografia do PU graftizado após tratamento corona....................... 87

Figura 5.6: Eletromicrografia do poliuretano graftizado com P-N- IPAAm.................. 88

Figura 5.7: Eletromicrografia do poliuretano graftizado com P-N-IPAAm................... 88

Figura 5.8: Eletromicrografia do poliuretano graftzado com P-N-IPAAm.................... 89

viii

Figura 5.9: Eletromicrografia do poliuretano poroso sem grafts.................................... 90

Figura 5.10: Eletromicrografia do poliuretano poroso com grafts. ................................ 90

Figura 5.11: Eletromicrografia do poliuretano poroso sem graft. ................................. 91

Figura 5.12: Eletromicrografia do poliuretano poroso com graft................................... 91

Figura 5.13: Eletromicrografia do poliuretano poroso graftizado. ................................. 92

Figura 5.14: Poliuretano graftizado com P-N-IPAAm. T= 31,7°C. ............................... 93

Figura 5.15: Poliuretano graftizado com P-N-IPAAm T= 32,2°C. ................................ 93

Figura 5.16. esquema representativo do estado das moléculas....................................... 94

Figura 5.17 - Esquema representativo da estrutura química do ..................................... 95

Figura 5.18 - Esquema representativo da estrutura química do poliuretano. ................. 95

Figura 5.19: Espectros na região do infravermelho de filmes: PU puro sem grafts (A),

PU tratado com UV (B), PU graftizado com P-N-IPAAm (C) ......................... 96

Figura 5.20: Espectros na região do infravermelho de PU tratado corona e graftizado. 97

Figura 5.21: Gráfico indicando deposição e adesão de albumina................................... 99

Figura 5.22: Esquema representativo da deposição de albumina, sobre a superfície de

poliuretano com grafts de P-N-IPAAm. ............................................................... 100

Figura 5.24 – Cortes histológicos de implantes de P-N-IPAAm com 7 dias................ 103

Figura 5.25: Grau de contração das feridas sem e com cobertura ................................ 105

Figura 5.26: Feridas excisionais em camundongos ...................................................... 106

Figura 5.27: Testes on-off para verificação de aderência ............................................. 107

Figura 5.28: Esquema representativo do corte do tecido.............................................. 109

Figura 5.29 – Corte de pele normal de camundongo Swiss ......................................... 110

Figura 5.30A – Pele de camundongo mostrando área de lesão Ferida sem cobertura. 112

Figura 5.31A.- Pele de camundongo mostrando área de lesão Ferida com cobertura de

PU com grafts. Coloração H&E. .......................................................................... 114

Figura 5.32 – Pele de camundongo mostrando área de lesão cobertura de poliuretano e

sem graft.. ............................................................................................................. 116

Lista de tabelas

Tabela 3.1.Relação de formulação para polimerização………………...........................29

Tabela 3.2 LCST de polímeros a base de acrilamida………………………................. 33

Tabela 3.3 Tipos de polímeros com sua representação química e o valor da tensão

superficial…................................................................................................................... 46

Tabela 5.1 Ângulo de contato entre água deionizada e material………........................ 84

Tabela 5.2 Ganho de massa após graftização……......................................................... 86

Lista de equações

Equação 3.1.....................................................................................................................45

Equação 3.2.....................................................................................................................51

Equação 4.1.....................................................................................................................78

Equação 4.2.....................................................................................................................79

Abreviaturas

AAm - Monômero acrilamida

ATR – Attenuated Total Reflection

AIBN - 4,4’azobis(isobutyronitrile)

ASTM – American Standard Testing Materials

DMA – Dynamical Mechanical Analysis

DSC – Differential Scanning Calorimeter

DTE - Ditioester

ESCA – Electron Spectroscopy for Chemical Analysis

FTIR – Fourier Transformed Infrared

GPC – Cromatografia de Permeação a GEL

HEMA - Monômero 2-hidroxietil metacrilato

HPMA – Hidroxipropilmetacrilamida

IPN – Interpenetrant Polymers Network

ISO – International Standard Organization

LCST – Low Critical Solution Temperature.

LDH – Teste de citotoxidade

MEV – Microscópio Eletrônico de Varredura.

MTT – MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide – teste

citotoxidade

MBAAm - N, N′-metileno-bisacrilamide

NIPAM – Monômero n-isopropilacrilamida

N-tBAAm - Monômero butil acrilamida

- Massa Molar Numérica Média

- Massa Molar Ponderal Média

PHPMA – Poli Hidroxipropilmetacrilamida

P-N-IPAAm – Poli(n-isopropilacrilamida).

PDI- Índice de Poli Dispersão

RAFT - Reservible Addition Fragmentation Chain Transfer

RMN-H Ressonância Magnética Nuclear – Hidrogênio.

RMN-C

Ressonância Magnética Nuclear – Carbono 13

PU - Poliuretano

SEC - Cromatografia por exclusão de tamanho

– Temperatura de transição vítrea

UV-VIS – Espectroscopia Ultra Violeta Visível.

XPS – Espectroscopia fotoelétrica de raios-x

xii

Resumo

O mercado conta hoje com uma gama variada de curativos que têm por finalidade

básica proteger feridas de possíveis infecções e ressecamento durante sua cicatrização.

A evolução científica aliada à elevada incidência de feridas cicatrizadas por segunda

intenção e seus altos custos para a saúde pública têm estimulado pesquisadores de

diversas regiões do mundo a buscar soluções mais eficientes e baratas, pautados na

convicção de que um curativo não tem apenas que proteger feridas. Um bom curativo

deve proporcionar proteção aos ferimentos, potencializar condições adequadas para a

recuperação dos tecidos lesados, dar suporte para a fixação celular e desenvolvimento

do novo tecido sadio. A estratégia, mais frequentemente utilizada, tem sido a de acelerar

os mecanismos de proliferação celular buscando propiciar melhores condições para a

recuperação da pele. Neste trabalho buscou-se, elaborar um novo curativo que

protegesse, contribuísse para a reconstrução tecidual e que no momento adequado e

previamente estipulado, pudesse ser removido do tecido neoformado por meio de um

estímulo externo favorecendo o descolamento celular sem causar-lhe dano sensível.

Utilizou-se, para desenvolvê-lo, polímeros baseados no poli (N-isopropilacrilamida) (P-

N-IPAAm) que é sensível a estímulos externos pois possui a propriedade de transição

de fase (LCST), que o torna hidrofílico quando atinge temperaturas abaixo de 32º C e

hidrofóbico para temperaturas acima de 32ºC. A hipótese principal envolveu a

utilização do comportamento desse polímero em contato com as novas células.

Enquanto hidrofóbico, o polímero favorece a adesão de proteínas e células, porém,

quando tornado hidrofílico (abaixo da temperatura de transição), proporciona uma perda

da aderência celular, denominado como mecanismo on-off. A estrutura do curativo

utilizado possuía duas camadas, sendo a primeira composta por um filme de poliuretano

(PU) com 50µm de espessura, cuja função é a proteção do ferimento e a segunda

composta por uma micro camada de enxertos de P-N-IPAAm, com a função de

proporcionar boas condições para atividade celular e o mecanismo on-off. Na primeira

camada utilizou-se filmes de poliuretano termoplástico que foram fabricados por

processo de espalmagem. Para inserir os enxertos de P-N-IPAAm, foi necessária a

formação de grupos reativos à superfície do filme de PU, para isto utilizou-se dois tipos

xiii

de tratamentos diferentes: efeito corona e radiação ultravioleta. O tratamento por

radiação ultravioleta se mostrou mais simples e eficiente, na formação desses grupos.

Realizou-se nos filmes tratados com radiação ultravioleta o processo de enxertia de

moléculas de P-N-IPAAm por polimerização radicalar em solução, utilizando-se nitrato

cérico amoniacal como iniciador, e obtendo-se camadas de polímero enxertado de 3 a

8µm de espessura. Detectou-se a transição LCST do P-N-IPAAm enxertado ao

substrato de poliuretano em torno de 32°C. Essa transição pode ser visualizada pelo

ponto de turvação do filme e por diferenças na molhabilidade com água (ângulo de

contato). Realizaram-se também os testes do mecanismo on-off in vitro, com a proteína

albumina, fazendo a variação da temperatura acima e abaixo da transição LCST do P-N-

IPAAm. Os resultados obtidos indicaram que a camada enxertada é adequada para

viabilizar o mecanismo on-off e assim permitir o controle sobre o processo de adsorção

e dessorção de albumina. Realizaram-se também testes de mecanismo on-off in vivo

através de cobertura de lesão excisional feita em camundongos tipo Swiss, colocando-se

o material em contato direto com a ferida durante três dias e verificou-se que o tecido

não estava aderido ao curativo no momento da retirada do curativo. Não foi possível

verificar e registrar o mecanismo on-off do curativo, devido à rápida diminuição de

temperatura da pele dos camundongos após a anestesia, registrada em 28°C, e esta é

uma temperatura abaixo da LCST. Portanto para obter-mos resultados mais conclusivos

será necessário a manipulação da LCST para abaixo de 25°C. Entretanto verificou-se

através das análises histológicas do processo de cicatrização, que as feridas com

cobertura apresentaram processo inflamatório menos intenso e tecido conjuntivo mais

denso do que as feridas sem cobertura. As feridas cobertas com curativos possuindo

enxertos (grafts) apresentaram sinais de reepitelização e angiogênese mais intenso.

xiv

Abstract

The high incidence of wound healing by second intention and the high costs associated

with their treatment are changing the idea that healing dressing is just for wound

protection but to accelerate cell proliferation and to provide good conditions for the skin

recuperation. In this work, a new curative was develop that would be able, in the

appropriate and programmed moment, to be removed from the new tissue through an

external stimulus that would favor cellular detachment without extensive damages. We

used for such, polymers based in poly (N-isopropylacrylamide} (P-N-IPAAm), that is

sensitive to external stimulus. This polymer has a phase transition that turns it

hydrophilic when it is used in temperatures below 32°C and hydrophobic for

temperatures above 32ºC. The main hypothesis of this work involved the use of the

behavior of this polymer in contact with the cells that participate in the wound healing

process. While hydrophobic, the polymer can favor protein adhesion, however, when

turned hydrophilic (below the transition temperature), it can lead to cellular detachment,

the so called on-off mechanism. We prepared a wound dressing with two layers, being

the first composed by a polyurethane film (PU) with 50µm of thickness, whose function

was the protection of the wound and the second composed by a micro layer of grafts of

P-N-IPAAm, whose function is to provide good conditions for cellular activity and the

mechanism on-off. Thermoplastic PU films were manufactured by lamination process

and the P-N-IPAAm were grafted onto previously created reactive groups on the surface

of the PU film. Two types of treatments were used to activate the surface: corona effect

and the ultraviolet radiation. The treatment by ultraviolet radiation was shown to be

easier to use and more efficient. The grafting process of P-N-IPAAm molecules was

accomplished by radical polymerization in solution using ceric ammonium nitrate as the

initiator. Layers ranging from 3 to 8 µm of thickness of grafts were obtained. The

transition LCST of P-N-IPAAm grafted to the PU was detected around 32°C. This

transition was monitored by checking the cloudy point of the film and by measuring the

contact angle as a function of the temperature. The mechanism on-off in vitro was

studied by measuring the adsorption of albumin in temperatures above and below the

LCST transition of P-N-IPAAm. Results showed that the grafted layer is able to display

the on-off mechanism to allow the control of the process of albumin

adsorption/desorption. They also took place tests of mechanism on-off in vivo through

covering of lesion excisional done in mice type Swiss, being put the material in direct

contact with the wound for three days and it was verified that the tissue was not adhered

to the curative in the moment of the retreat of the curative. It was not possible to verify

and to register the mechanism on-off of the curative, due to the fast decrease of

temperature of the skin mice after the anesthesia, there was fall temperature of the skin,

registered in 28°C that it is below LCST (32°C), at this stage no adherence between the

tissues and the curative could be noticed. Therefore to get more conclusive results it will be

necessary to manipulate the LCST of the grafts for a temperature below 25°C. However it was

verified through histological analyses of cicatrization process, that wounds with

curatives presented less intense inflammatory process and denser conjunctive tissue

than the wounds without covering. The wounds with covered by PU with grafts showed

signs of more intense re-epithelization and angiogenesis.

Capítulo 1 - Introdução

A pele é o maior órgão do corpo humano e recobre toda a sua superfície, constituindo

cerca de 20% do peso corporal. É dividida em duas camadas distintas: a epiderme e a

derme. A epiderme é a camada externa, composta por diferentes tipos celulares: os

queratinócitos, os melanócitos e as células de Langerhans e de Merkel. A derme é a

camada mais profunda e é formada por tecido conjuntivo, constituído por fibrilas de

colágeno e elastina com numerosos fibrócitos que sintetizam estas proteínas e sustentam

o tecido, a derme também é constituído por mastócitos perivasculares e dendrócidos,

importantes na imunidade e reparo da derme

. Além de fazer a comunicação com o

meio ambiente, a pele tem a finalidade de proteção química, física, biológica e realiza,

entre outras funções, a termoregulação e proteção imunológica. Entretanto, alguns

danos, que geralmente se manifestam na forma de feridas, podem comprometer sua

anatomia e fisiologia

e cuidados específicos devem ser tomados, para que não haja um

maior comprometimento do organismo. Dealey

conceitua ferida como “qualquer lesão

que leve a uma quebra da continuidade da pele”, ou seja, qualquer ruptura que

comprometa a principal barreira de proteção do nosso organismo. Existem variados

tipos e formas de feridas, e vários e amplos são os estudos existentes a respeito do tema,

mas, restringiremos nosso escopo às feridas crônicas que são, em sua origem,

manifestação de doença subjacente e costumam vir associadas a eventos vasculares

locais ou sistêmicos.

De modo geral, as feridas são classificadas como agudas ou crônicas. Aquelas,

normalmente, duram menos que oito semanas, já estas, são assim denominadas, por

falharem em seu processo normal de cicatrização, requerendo um tempo maior para

cicatrizar; ou não cicatrizando completamente; ou tornando-se recorrente.

queimaduras severas, diabéticas, úlceras de pressão (decúbito), úlceras venosas são

consideradas feridas crônicas.

4,5

Sua origem pode decorrer como consequência de uma

agressão ao tecido vivo; associada à diabetes ou a má circulação sanguínea local ou do

avanço da idade; gerando incômodo e perda de qualidade de vida para o paciente.

Embasados na literatura médica

sabe-se que, somente na América Latina, anualmente,

surgem aproximadamente 1,1 milhões de novos casos de feridas crônicas. Cerca de 4%

dos portadores de diabetes sofrem com úlcera ativa e ainda 1% de pessoas com mais de

65 anos sofrem com úlceras de pressão. A úlcera de pressão é uma ferida que ocorre em

pacientes acamados por longo tempo, atingindo tanto jovens como idosos e gerando

custos elevados. Recentes estimativas do custo

de seu tratamento (clínico e cirúrgico)

revelaram custo médio hospitalar de US$ 21.675,00. Quando um paciente com fratura

de colo de fêmur desenvolve uma úlcera de pressão, os encargos hospitalares aumentam

em média US$10.986,00/paciente. No paciente cirúrgico, o grande impacto nos custos

de internação parece ser determinado pela presença ou não de complicações pós-

operatórias, as quais podem alterar significantemente o período de internação.

Moryson

afirma que, no Brasil, embora não haja dados confiáveis sobre o número de

pessoas acometidas por feridas crônicas, alguns trabalhos relatam que a cronificação de

lesões, em especial as úlceras crônicas dos pés e pernas é extremamente alta, causando

grande impacto psíquico, social e econômico sobre o indivíduo por ela acometido. Os

portadores dessas lesões, com freqüência, desenvolvem seqüelas que podem levar à

perda de membros e de suas funções, com conseqüente afastamento do trabalho e de

suas atividades normais o que vem a repercutir em elevados custos financeiros e

profundas conseqüências sociais tanto para o cidadão quanto para o país.

As feridas crônicas demandam atenção e exigem tratamento especializado para

obtenção de retorno funcional e anatômico da região. Havendo grande perda de pele ou

presença de dificuldades para a cicatrização, é necessário fazer a cobertura imediata

com um curativo

. Este terá a função de proteger a área da perda de fluidos e proteínas,

prevenir infecção por bactérias e subseqüente danos aos tecidos e, em alguns casos,

estimular a cicatrização por possibilitar um suporte para a proliferação de células

enfim, procurando substituir, paliativamente, a função natural da pele.

Focando o olhar para uma maior qualidade de vida aos portadores de feridas crônicas e

redução de custos hospitalares, chegamos à conclusão de que um novo conceito de

curativo é necessário. Desenvolvendo-se curativos que ajam de forma mais efetiva na

ferida acelerando seu processo de cicatrização, proporcionar-se-ía menor tempo de

internação e maior conforto aos pacientes. Entretanto, para que se atinja com eficácia a

população é preciso que ocorra, concomitantemente, o desenvolvimento de matéria-

prima mais abundante e barata, processos de fabricação automatizados e métodos de

esterilização mais simples.

A grande maioria dos curativos encontrados no mercado brasileiro hoje é importada

e/ou têm tecnologia patenteada por empresas multinacionais

. Atualmente, há um

grande número de pesquisadores

8, 9, 10, 11, 12, 13

trabalhando na síntese e modificação de

novos materiais biocompatíveis para aplicação em curativos e grandes avanços têm

ocorrido na compreensão dos processos e fenômenos envolvidos nas diversas fases da

reparação tissular, porém, muito há, ainda, a se pesquisar. Fundamentalmente, os

curativos têm sido construídos dentro do padrão “dupla camada”

tendo uma camada

elástica externa e uma subcamada interna. Aquela é, geralmente, feita utilizando

poliuretano ou silicone substituindo artificialmente a epiderme e essa é feita utilizando

um hidrogel, que, dada a sua alta capacidade de absorção de água, funciona como um

armazenador do esxudato da ferida, propiciando a manutenção do ambiente úmido que

promove o debridamento natural de tecido necrosado.

10, 15

Os curativos oferecidos no mercado atual se deparam com dois efeitos determinantes e

antagônicos entre si que são: adesão ativa e adesão passiva.

11, 17

Para que ocorra a

cicatrização é preciso obter tensões superficiais adequadas que proporcionem boa

aderência para a ativação, proliferação e diferenciação das células (adesão ativa), mas

em contraponto, esse mesmo efeito torna-se indesejado na retirada do curativo, pois

arrasta consigo uma boa parte do tecido neoformado, abrindo novamente a ferida.

A proposta deste trabalho é desenvolver um curativo que possua um sistema de

acionamento e desligamento (on-off)

20, 21, 22

de aderência à ferida que irá como

consequência, acelerar o processo de cicatrização sem, contudo gerar danos quando da

sua retirada. A estrutura projetada utilizará a mesma estratégia do curativo de duas

camadas, ou seja, uma primeira camada substituindo a epiderme protegendo o

ferimento, impedindo a entrada de bactérias e permitindo a troca de gases, porém,

inovando na segunda, que possuirá uma interface especial (poli (N-isopropilacrilamida))

que estará em contato direto com as células.

Essa interface terá a capacidade de

modificar sua natureza ao passar por sua temperatura crítica (LSCT)

22,24,25

de 32°C. A

hipótese principal desta tese é de que o poli (n-isopropilacrilamida) à temperatura do

corpo humano será capaz de proporcionar um nível de tensão superficial mais adequado

à proliferação e adesão das células (hidrofóbico). E, no momento da retirada do

curativo, bastará mudar a sua temperatura, alterando a natureza hidrofóbica do polímero

para hidrofílica, para proporcionar um descolamento suave do tecido neoformado sem

causar danos às células.

O trabalho foi dividido em três etapas, sendo que a primeira foi dedicada a preparação

do filme polimérico e preparação de uma interface especial construída pela graftização

(enxertia) de poli (N-isopropilacrilamida) em sua superfície.

A segunda etapa foi dedicada à caracterização química, física e morfológica da

superfície do polímero. Esses testes foram necessários para se compreender suas

propriedades.

A terceira etapa foi dedicada aos testes in vitro e in vivo para verificar reações

inflamatórias e cinéticas de cicatrização, bem como testar os mecanismos de

desligamento (on - off) in vivo.

As Figuras 1.1 a 1.6 ilustram a estratégia proposta para o curativo com mecanismo

inteligente de desligamento.

Figura 1.1: Representação da transição (LCST) nos enxertos de P-N-IPAAm em poliuretano

Figura 1.2: Esquema representando o leito de ferida por segunda intenção e curativo

Figura 1.3: Esquema representando curativo posicionado sobre o leito da ferida.

Leito da ferida

Poliuretano flexível graftizado

(polymer brushes)

IPAAm hidrofóbico

Ferida aberta sem a presença do curativo

Película de poliuretano com graft P-N-IPAAm

PAAm hidrofílico

T < 32°C

T >32°C

T < 32°C

T > 32°C

P-N-IPAAm hidrofóbico

IPAAm hidrofílico

Filme de Poliuretano

Figura 1.4: Esquema representando proliferação de células

em contato com o P-N-IPAAm

Figura 1.5: Esquema representando o acionamento on-off

Figura 1.6: Esquema representando a retirada do curativo sem trauma.

P-N-IPAAm hidrofílico

abaixo de 32°C

Agente externo de alteração da temperatura para abaixo da LCST

borda da lesão

novo tecido

Capítulos 2 - Objetivos

Objetivo geral

Estudar o potencial do uso de cadeias enxertadas de poli (N-isopropilacrilamida) em

substratos de poliuretano visando a geração de curativos avançados inteligentes capazes

de modular processos de adesão celular e tissular a partir de estímulos externos.

Objetivos específicos:

- Avaliar a efetividade do processo corona e de radiação ultravioleta em preparar a

superfície dos filmes de poliuretano para receber os enxertos (grafts) de P-N-

IPAAm;

- Enxertar polímeros baseados no poli (N-isopropilacrilamida) na superfície do

poliuretano por polimerização em solução aquosa;

- Caracterizar o sistema polimérico obtido;

- Verificar a transição LCST na superfície do poliuretano graftizado.

- Avaliar a mecanismo on-off in vitro através da adesão de proteínas no

poliuretano graftizado

- Avaliar in vivo os curativos desenvolvidos, visando monitorar: eficiência na

recuperação do ferimento e mecanismo on-off de descolamento do curativo.

Capítulo 3 - Revisão bibliográfica

A pele é o maior órgão do corpo humano, correspondendo a 15% do peso de uma

pessoa e exerce diversas funções como: regulação térmica, defesa orgânica, controle do

fluxo sanguíneo, proteção contra agentes diversos do meio ambiente. Compete-lhe

também funções sensoriais de proteção ao calor, frio, pressão, dor e tato. Protege o

corpo de invasão por parasitas e injúrias mecânicas. A melanina produzida pelos seus

melanócitos atua no sentido de proteger o corpo contra a radiação ultravioleta. É um

órgão vital composto de vários tipos de células estruturadas por uma matriz extracelular.

É formada pela epiderme e pela derme, e embora a hipoderme esteja localizada logo

abaixo da derme, não é considerada como parte da pele

3.1 - Epiderme

A epiderme tem, entre suas funções, prevenir a perda de calor e de água para o

ambiente, e a infiltração de bactérias. Seu principal componente é o queratinócito, que

forma estruturas mantidas unidas por desmossomas, que promovem adesão célula a

célula, que dá origem à camada córnea, composta basicamente de queratina, uma

proteína responsável pela impermeabilização da pele. Não possui vasos, os nutrientes e

o oxigênio chegam a ela por difusão a partir de vasos sangüíneos da derme. Em geral a

epiderme possui quatro camadas, a camada basal, camada espinhosa, camada granulosa

e a camada córnea.

1, 2, 4

O extrato ou camada basal é responsável pela reposição celular, a renovação celular

constante da epiderme faz com que as células da camada córnea sejam gradativamente

eliminadas e substituídas por outras.

Esta camada está em um plano mais profundo, em

contato com a derme. É constituído por células cúbicas ou prismáticas pouco

diferenciadas que apresenta intensa atividade mitótica, sendo responsável pela

renovação constante da epiderme. Contém citoqueratina, algumas destas células

diferenciam-se e passam para as camadas mais superficiais, enquanto outras

permanecem na camada basal e continuam a se dividir

Na camada espinhosa, encontramos células poligonais cúbicas, cubóides ou

ligeiramente achatadas com mais queratina que as basais. Começam a formar junções

celulares umas com as outras, como desmosomas, dando o aspecto de espinhos

Na camada granulosa, as células são poligonais achatadas com núcleo central, com

grânulos de queratina proeminentes.

A camada córnea é a camada mais externa, constituída de células achatadas eosinófilas

sem núcleo (mortas) com grande quantidade de filamentos, principalmente queratinas

3.2 - Derme

A derme é um tecido conjuntivo que sustenta a epiderme. É constituída por numerosos

fibrócitos que sintetizam as proteínas das fibrilas do colágeno e da elastina que

sustentam o tecido. É composta pela região papilar de contato com a epiderme e pela

região reticular mais densa. É na derme que se localizam os vasos sanguíneos e

linfáticos responsáveis pela nutrição da epiderme e também os nervos e órgãos

sensoriais a eles associados.

1, 2

Estes incluem vários tipos de sensores:

- Corpúsculo de Vater-Pacini, sensíveis à pressão;

- Corpúsculo de Meissner com função de detecção de pressões de intensidades

variadas;

- Órgão de Ruffni, sensíveis ao calor;

- Célula de Merckel, sensíveis a tato e pressão;

- Folículo piloso, com terminações nervosas associadas;

- Terminação nervosa livre, com dendritos livres sensíveis.

Figura 3.1: Estrutura da pele, indicando principais elementos

(fonte: Merck)

3.3 - Feridas na pele

Ferida pode ser definida como qualquer ruptura da integridade da pele, membranas

mucosas ou qualquer outra estrutura do corpo

podendo ser causada por traumas físicos,

Hipoderme

químicos ou desencadeada por uma afecção clínica, apresentando-se de diversas formas,

tamanhos e profundidades

3.3.1 - Úlceras de Pressão ou Decúbito

Úlceras de Pressão ou Decúbito são úlceras decorrentes de isquemia tecidual local

provocada pela alteração do reflexo de dor em pacientes com lesão medular

(tetraplégicos, paraplégicos ou hemiplégicos) ou pacientes debilitados, idosos ou

cronicamente doentes. As úlceras de pressão têm sido alvo de grande atenção nos EUA,

devido a uma população de idosos vivendo em instituições de longa permanência,

estimada em torno de 1,5 milhões, sendo que, dentre estes, cerca de 25% a 33% chegam

a essas instituições já portando úlceras de pressão, e que aproximadamente 35% deles

ainda as desenvolverão em algum tempo de sua estadia. Sendo ainda causa indireta de

morte em paraplégicos, com uma freqüência de 7 a 8%.

A etiologia da úlcera de pressão ainda não está totalmente esclarecida, mas é sabido que

a pressão contínua sobre a pele é fator preponderante. Estudos indicam que pressão

entre 60 e 580mmHg no período de 1 a 6 horas pode ocasioná-las. Além da pressão,

forças de cisalhamento e fricção podem agir sinergicamente no desenvolvimento de

uma ferida em pacientes que estão desnutridos, incontinentes, acamados ou com

distúrbios mentais

Uma úlcera de pressão em seu primeiro estágio é uma alteração observável relacionada

com pressão na pele íntegra, cujos indicadores comparativos à área adjacente ou oposta

do corpo podem incluir mudanças em uma ou mais das seguintes condições:

temperatura da pele (aquecimento ou resfriamento) e/ou sensibilidade (dor, prurido). Ela

manifesta-se como uma área definida de hiperemia persistente na pele pouco

pigmentada, ao passo que, em peles mais escuras, ela pode manifestar-se com

tonalidades persistentes de vermelho, azul ou púrpura.

O segundo estágio é caracterizado por perda cutânea de espessura parcial envolvendo

epiderme ou derme. É superficial e manifesta-se clinicamente por abrasão, flictema ou

cratera rasa.

O terceiro estágio é determinado por perda cutânea de espessura total envolvendo lesão

ou necrose do tecido subcutâneo que pode se estender até a fáscia (tecido conjuntivo)

subjacente, sem atravessá-la. Manifesta-se clinicamente como uma cratera profunda.

No quarto estágio nota-se a perda cutânea de espessura total com destruição extensa,

necrose tecidual ou lesão muscular, óssea ou das estruturas de suporte (por ex.: tendão

ou cápsula articular). A formação de túneis ou de tratos fistulosos também pode estar

associada nesse estágio.

3.3.2 - Úlceras Venosas ou de estase

Ferida que surge nas pernas e/ou pés em consequência da dificuldade do sangue voltar

para o coração. As úlceras dos membros inferiores são muito freqüentes, extremamente

incapacitantes e afetam de modo significativo a produtividade e a qualidade de vida dos

indivíduos, além de determinar gastos significativos para os serviços de saúde. Os três

principais tipos de úlceras dos membros inferiores são as venosas, as arteriais e as

neuropáticas. As venosas são as mais comuns, representando 80% das úlceras de pernas.

A causa mais comum e importante das úlceras dos membros inferiores é a insuficiência

venosa crônica, seguida de arteriosclerose, que representa de 10 a 25% de todas as

úlceras; e que pode coexistir com a doença venosa. A maioria das úlceras venosas é

tratada com alguma forma de compressão (bandagens compressivas / bota de Unna), e,

portanto, se houver algum grau de insuficiência arterial nesses doentes, esse tipo de

tratamento tão utilizado na rotina médica poderá, além de ser pouco benéfico, retardar a

cicatrização da úlcera e causar danos maiores, como maior isquemia do membro

acometido.

As terapias de compressão são consideradas o ponto mais importante da cicatrização,

pois facilita o retorno venoso, impedindo a estase e consequentemente a trombose e

necrose. Consistem de alta compressão graduada, capaz de manter o local comprimido

por até 1 semana. Os dispositivos de compressão permitem manter um curativo simples

e não-aderente sobre a úlcera, propiciando um ambiente de cicatrização úmido e limpo.

Em alguns casos é possível determinar o tipo de bactérias que infecta a ferida e

administrar medicamentos tópicos. Não há um curativo em particular que seja mais

efetivo na cicatrização das úlceras venosas de perna. O recomendável é que o curativo

tenha baixo custo e seja pouco ou não-aderente, para evitar danos ao leito da ferida

momento de sua retirada.

O tratamento de úlceras venosas tem custos substanciais em todo o mundo. Na

Escandinávia, o custo do tratamento tem sido estimado em U$25 milhões/ano (1985 US

dólares); na Inglaterra, em U$200 milhões/ano (1989 US dólares). Nos EUA, as feridas

crônicas geram gastos em torno de 7 bilhões/ano e as venosas por volta de U$ 1

bilhão/ano.

3.3.3 - Queimadura

As lesões cutâneas causadas por queimaduras ocupam o terceiro lugar entre os acidentes

que mais ocorrem no mundo. No Brasil, as estatísticas publicadas são escassas e

desatualizadas e, segundo os dados fornecidos pelo Ministério da Saúde (2000), o

Sistema Único de Saúde (SUS) gasta anualmente, cerca de R$ 55 milhões com o

tratamento.

Um recente levantamento, realizado por Dallan

, em sua dissertação, aponta que para o

tratamento de queimaduras, há atualmente no mercado cerca de 120 tipos de produtos

constituídos de diversos materiais, sendo quase todos importados. Dentre eles, há

somente dois produtos nacionais: um biomaterial do tipo hidrogel reforçado com fibras

de polipropileno para uso em queimaduras que foi desenvolvido pelos Instituto de

Química da Universidade de São Paulo (USP, São Paulo, SP, Brasil) e Instituto de

Pesquisas e Energia Nuclear (IPEN, São Paulo, SP, Brasil) e uma biomembrana natural,

sintetizada por bactérias, que foi desenvolvido pela empresa Bionext Produtos

Biotecnológicos (São Paulo, SP) em parceria com pesquisadores do Instituto de

Química da Universidade Estadual Paulista (UNESP, campus em Araraquara, SP) e do

Instituto de Física da Universidade de São Paulo (USP, campus em São Carlos, SP).

Esta mesma dissertação aponta que, apesar da diversidade de materiais, o custo do

tratamento é bastante elevado, sendo fatores preponderantes o custo dos curativos e a

necessidade de troca freqüente.

A ferida causada por queimaduras é classificada segundo o grau de gravidade, sendo

que a queimadura de primeiro grau é bem superficial e tem como característica não

atingir funções hemodinâmicas e apresenta alteração da cor da pele. A de segundo grau

tem como característica atingir a epiderme e a derme e causa alterações nas funções

hemodinâmicas e tem uma característica bem peculiar que é a presença de bolhas. A de

terceiro grau é profunda, atingindo todas as camadas da pele e ainda tecidos subjacentes

atingindo os tecidos subcutâneos, o tecido ósseo, os músculos. A de quarto grau tem

como característica a carbonização dos tecidos.

O tratamento das lesões por queimaduras é um grande desafio aos profissionais da

saúde, devido, sobretudo, ao elevado potencial para desenvolvimento de infecções. A

terapêutica sistêmica ou local visa, fundamentalmente, o equilíbrio das funções vitais

assim como a instalação de medidas de prevenção de complicações, dentre as quais

estão as infecções. Após a lesão, uma grande quantidade do líquido extracelular é

seqüestrada para a área lesada, podendo este desvio de líquido causar falência dos

órgãos e dos tecidos restantes do corpo.

3.4 - Cicatrização

Cicatrização de feridas é um tipo de reparo dos tecidos humanos e envolve uma

seqüência complexa de eventos

. Fatores de crescimentos peptídicos produzidos por

plaquetas, macrófagos, células epidérmicas e dérmicas são muito importantes na

reconstrução dos tecidos.

8, 9, 13, 33

O processo de cicatrização consiste de inflamação,

seguido por formação de tecido de granulação e remodelação tecidual

. A fibrose

ocorre subsequentemente a formação de tecido de granulação, e é um importante evento

para reduzir o tamanho da lesão. Regeneração epidérmica e dérmica (contração da

lesão) podem usualmente fechar a ferida suavemente. Fibroblastos ricos em actina, em

tecidos de granulação, conhecidos como miofibroblastos, são os responsáveis pela

contração da ferida.

8, 9

Existem numerosos fatores sistêmicos e locais que podem vir a afetar a cicatrização,

interrompendo o processo de inflamação e ocasionando falhas na produção e

interligação do colágeno e na neovascularização. Estes fatores podem ser ocasionados

por: alterações nutricionais, idade, tabagismo, uso de medicamento, imunodepressão,

infecção local, insuficiência renal, insuficiência vasculogênicas, presença de tecido

necrosado, escaras, agentes tópicos inadequados.

O processo de cicatrização é complexo e compreende a resposta dinâmica e imediata do

organismo à lesão, com intuito de restaurar a característica anatômica, estrutural e

funcional do tecido lesionado. Consiste de três fases sobreponíveis: a inflamatória, a

proliferativa e a maturação.

3. 4. 1 - Fase inflamatória ou exudativa

Em condições fisiológicas normais, a fase inflamatória é a mais curta, com duração de

quatro a dez dias. Ocorre, inicialmente, a vasoconstrição que busca estancar o

sangramento. As plaquetas afluem para a ferida propiciando o controle do sangramento

e a limpeza, durando aproximadamente três dias

. As plaquetas têm uma função

importantíssima que é formar a placa de fibrina, elemento inicial de contenção do

sangramento, produzindo substâncias quimiotáxicas, que têm como função atrair outras

células para o local, e produzindo, caso da cicatrização, substâncias do grupo dos

polipeptídios formadas nos focos inflamatórios, que atraem leucócitos e fatores

estimulantes do crescimento

. Há presença de eritema, calor, edema, dor e perda de

função no local. Após a vasoconstrição vem a vasodilatação que ocorre quando se dá a

ruptura das terminações nervosas, por uma ação reflexa, determinada pela

vasoconstrição e pela liberação no leito da ferida de substâncias vasoativas que vão

gerar essa vasodilatação. Nessa fase, a migração de leucócitos manterá a ação de

limpeza e defesa, feitas principalmente através dos neutrófilos com função de

fagocitose. Os monócitos também aparecem no leito da ferida para substituir os

neutrófilos e gerando os macrófagos. O macrófago é a célula inflamatória mais

importante dessa fase. Permanece do terceiro ao décimo dia. Fagocita bactérias e

neutrófilos mortos e direciona o desenvolvimento de tecido de granulação. Formações

como fibrina, crosta composta de soro e hemácias impedem que o tecido se resseque,

mantendo um ambiente favorável à reparação.

3.4.2 - Fase proliferativa ou de tecido de granulação

Nessa fase acontece o preenchimento da lesão com duração que varia entre 7 e 21 dias.

É dividida em três processos: reepitelização, fibroplasia e angiogênese.

Na reepitelização, acontece a divisão ou mitose de queratinócitos não danificados das

bordas da ferida e dos anexos epiteliais, quando a ferida é de espessura parcial. E apenas

das margens, nas de espessura total. Sabe-se que o plano de movimento dos

queratinócitos migrantes é determinado também pelo conteúdo de líquido no leito da

ferida. Feridas superficiais abertas e ressecadas reepitelizam mais lentamente do que as

ocluídas.

33, 36

Fatores de crescimento são os prováveis responsáveis pelos aumentos das

mitoses e hiperplasia do epitélio.

Subsequentemente acontece a fibroplasia e a formação da matriz extracelular, fatores

fundamentais para a formação do tecido de granulação que são uma coleção de

elementos celulares, incluindo fibroblastos, células inflamatórias e componentes

neovasculares e da matriz, como a fibronectina, as glicosaminoglicanas e o colágeno

(Figura 3.2). A formação do tecido de granulação depende do fibroblasto, célula crítica

na formação da matriz. Longe de ser apenas produtor de colágeno, ele produz elastina,

fibronectina, glicosaminoglicana e proteases, sendo estas responsáveis pelo

debridamento e remodelamento fisiológico.

Em seguida ocorre a angiogênese ou formação de vasos sanguíneos, essencial para o

suprimento de oxigênio e nutrientes para a cicatrização. Inicialmente, as células

endoteliais migram para a área ferida, ocorrendo a proliferação das células endoteliais

que dão acesso às células responsáveis pelas próximas fases. A mediação dos

macrófagos iniciará a produção de fatores de angiogênese que estimularão a migração

de células endoteliais da periferia para o leito da ferida, formando os novos vasos. Essa

vascularização só acontece em meio úmido.

Figura 3.2: Matriz extracelular (ECM) e fibroblastos

3.4.3 - Contração

O miofibroblasto ocasiona tensões que potencializam o encolhimento da ferida. Após a

produção de uma falha cutânea, a área assim formada sofre imediata contração, como

resultado da retração das margens da lesão, conseqüente à ação centrífuga das fibras

elásticas da pele.

7, 5, 26

Quando, numa ferida plana se inicia o processo de cicatrização,

sua área torna-se progressivamente menor, devido ao movimento centrípeto de suas

ECM

bordas, sobretudo em resposta à ação de miofibroblastos presentes no tecido de

granulação

8, 26

. Este fenômeno é denominado de contração da ferida e sua conclusão

requer meses, sendo muitas vezes incompleto.

3.4.4 - Fase de maturação

O tempo de duração desta etapa varia de seis meses a dois anos e clinicamente se

observa uma cicatriz contraída que inicialmente é fina e pálida e que posteriormente se

transforma em uma cicatriz madura hipo ou hiper pigmentada.

4, 5, 7

Apesar de a cicatriz

ter uma aparência mais grossa e mais dura do que a pele, ela nunca tem 100% da

resistência mecânica à tração em relação a pele. A Figura 3.3 mostra um esquema da

cinética de cicatrização de uma lesão.

Figura 3.3: Esquema gráfico representando os vários estágios de lesão e o tempo de duração.

(Fonte: Cirurgia Cosmética. Princípios e Técnicas. 2000: 19)

3.4.5 Classificação segundo o tipo de cicatrização

A cicatrização pode ser por primeira, segunda ou terceira intenção.

4, 5

Primeira intenção (união primária): as bordas da ferida são opostas ou aproximadas,

com perda mínima do tecido, ausência de infecção e pequeno edema. O tecido de

granulação não é visível.

Segunda intenção (granulação): esta ferida tem presença de infecção e como a borda da

ferida está distante, o reparo é mais demorado e mais complicado. Caracterizada por

grande perda de tecido, permanecendo aberta. Suas fases de cicatrização são marcantes,

com resposta inflamatória evidenciada. Necessita de maior quantidade de tecido de

granulação, com epitelização visível, tendo necessidade de fortalecimento e um grande

processo de contração.

Terceira intenção (sutura secundária): ficará aberta enquanto houver infecção real e

depois se fechará por aproximação cirúrgica das bordas da ferida. A Figura 3.4

representa os três tipos de cicatrização.

Figura 3.4: Tipos de feridas - Primeira, segunda e terceira intenção.

(Fonte: Mandelbaum et al)

3.5 - Curativos

Curativo é um termo muito amplo e consiste no conjunto de procedimentos que

envolvem limpeza, debridamento e aplicação de cobertura à ferida, tendo como objetivo

o favorecimento da cicatrização; e de prevenção da colonização de locais de inserção

por dispositivos invasivos feitos para diagnósticos, ou terapêuticos.

Os diferentes materiais utilizados em curativos buscam proteger e promover o alívio da

dor, servindo em alguns casos como auxiliares no debridamento. Os materiais mais

utilizados são membranas de poliuretano usadas como camada externa devido a sua

biocompatibilidade e hemocompatibilidade. São altamente elastoméricos (extensíveis) e

permeáveis às substâncias gasosas, criando um ambiente inerte para o sangue,

controlando a perda de líquidos e calor através da área ferida e prevenindo a invasão por

bactérias. São mecanicamente resistentes e protegem a ferida de efeitos externos.

Os hidrogéis são usados como material da subcamada, ficando em contato direto com o

leito da ferida, podendo ser microporosos e macios. Como absorvem água mantém a

ferida úmida favorecendo o debridamento e alívio da dor. A gelatina preparada do

colágeno é uma opção interessante, pois além de tornar-se um hidrogel mais resistente

mecanicamente - se a ela acrescentarmos ligações cruzadas - tem a característica de não

expressar antigenicidade.

Não se pode desprezar o potencial do colágeno nativo,

porém a sua difícil solubilidade e antigenicidade em algumas condições fisiológicas o

tornam menos conveniente que a gelatina. Devido a sua alta capacidade de absorção de

água, a gelatina pode acumular fluidos e debris de células que são absorvidos e retidos

dentro da esponja. O crescimento de tecido ocorreria na matriz esponjosa e o curativo

permaneceria na ferida sendo bioabsorvido posteriormente e substituído pelo novo

tecido em crescimento.

Excesso de líquido acumulado no curativo tipo hidrogel sem macroporos pode causar a

maceração do tecido nas bordas da ferida, por isso, este curativo não tem aplicação em

feridas com muito exudato. Uma estrutura altamente porosa ou um hidrogel com alta

capacidade absorção de água evita este tipo de problema, preservando o tecido nas

bordas da ferida.

Há diversos tipos de curativos no mercado e cada tipo de ferida deve ser bem avaliado

antes de se optar por um deles. Existem alguns pré-requisitos básicos a serem

considerados nos curativos, que estão relacionados a seguir.

3, 4, 5, 26, 34, 40

− Boa tolerância dérmica;

− Proporcionar conforto físico e psicológico ao paciente;

− Comprimir, sustentar ou imobilizar;

− Remover/absorver a drenagem das secreções;

− Manter a umidade entre a lesão e o curativo;

− Proteger contra as infecções - impermeabilidade às bactérias;

− Ser isento de partículas e de compostos tóxicos contaminadores;

− Permitir troca gasosa;

− Fornecer isolamento térmico;

− Ser permeável aos raios-x e/ou exames;

− Não aderência à lesão - evitando traumas durante a sua retirada.

3.5.1 - Umidade e armazenamento do exudato

A partir de 1962, ocorreu uma verdadeira "revolução no conceito de curativos", quando

Winter e Roove

demonstraram que a taxa de epitelização era 50% mais rápida em um

ambiente úmido e que a formação de crostas era minimizada, trazendo efeitos

extremamente benéficos para o processo cicatricial e reduzindo a dor, devido à proteção

das terminações nervosas contra o dessecamento. O interesse gerado ocasionou o

desenvolvimento de pesquisas, produção e comercialização desse tipo de recurso.

3.6 - Tipos de curativo

Há diversos tipos de curativos no mercado, alguns são específicos, outros já são

utilizados em duas ou mais aplicações. Uma boa descrição é feita por Pereira

em seu

trabalho de mestrado, intitulado “Revisão Sistemática da Literatura Sobre Produtos

Usados no Tratamento de Feridas”, onde é feita a descrição de quase todos os tipos de

curativos existentes, citando aplicações, forma de uso, contra indicações e nomes

comerciais.

3.6.1 - Poliuretano

Apresentados na forma de filmes transparentes são bastante versáteis, podendo ser

utilizados tanto como coberturas primárias quanto secundárias. Indicados para

tratamento de feridas superficiais minimamente exsudativas, sendo também benéficos

para áreas doadoras de enxertos cutâneos com baixa exsudação, proteção de feridas

cirúrgicas sem complicações, fixação de cateteres, curativos secundários, prevenção de

lesões de pele por umidade excessiva ou atrito, como por exemplo, em úlcera por

pressão e lacerações.

3.6.2 Hidrocolóide

Cobertura estéril, composta por espuma externa ou filme de poliuretano permeável ao

vapor, unida a um material interno, sendo mais comumente o carboximetilcelulose, a

gelatina ou a pectina. Em contato com a ferida, o hidrocolóide interage com o exudato

formando um gel. O gel evita a aderência à ferida e proporciona alívio da dor, por

manter úmidas as terminações nervosas. A inibição do crescimento bacteriano é

potencializada pelo microambiente ácido promovido pela oclusão com este polímero.

3.6.3 - Hidrogel

É um gel transparente, formado por redes tridimensionais de polímeros e copolímeros

hidrofílicos compostos de água - 78 a 96%, uretanos, poli (vinil pirrolidona) (PVP) e

polietileno glicol. Está disponível em forma de placa e gel e requer a utilização de

cobertura secundária. Devido à reduzida capacidade de absorção é contra indicado em

feridas exsudativas. As trocas devem ser realizadas entre 1 a 3 dias.

3.6.4 - Papaína

É constituída de enzimas proteolíticas sendo usada no processo de reparação de tecidos

danificados. Seu efeito está relacionado à retirada de tecidos necróticos, desvitalizados e

infectados da lesão. Ela é, após o seu preparo, um pó de cor leitosa, com odor forte e

característico. Sua molécula é constituída de 17 aminoácidos diferentes com massa

molar relativa de 20900g/mol. Na forma de pó, deve ser preparada imediatamente antes

da realização do curativo. A papaína não danifica os tecidos, porém deve-se ter

precaução com o produto da digestão das enzimas, ou seja, o exudato contendo esta

substância pode ser irritativo sobre a pele íntegra, sendo necessárias trocas freqüentes de

curativos, para evitar lesões na pele, ao redor da ferida.

3.6.5 - Carvão ativado

Se constitui em cobertura estéril, composta de tecido de carvão ativado impregnado com

prata, envolvido externamente por invólucro de não-tecido poroso feito de fibras de

náilon, selado em toda sua extensão. É produzido pela carbonização de raiom de

viscose. Possui um sistema de poros no tecido capaz de reter bactérias, que são

inativadas pela ação da prata. É uma cobertura primária e requer cobertura secundária,

sendo feita usualmente com gazes, que devem ser trocadas diariamente ou mais de uma

vez ao dia. Tem indicação em feridas infectadas ou não, úlceras vasculogênicas, feridas

fúngicas, neoplasias, deiscência cirúrgica, úlceras por pressão e aquelas com drenagem

de exudato moderado ou abundante. É contra indicado em feridas secas e recobertas por

escaras. Em lesões com pouco exudato, o carvão ativado pode aderir e causar

sangramento durante sua remoção, principalmente nas áreas com tecido de granulação.

3.6.6 - Alginatos

Os alginatos são polissacarídeos derivados do ácido algínico, que são obtidos

principalmente de algas marinhas da espécie Laminaria. São utilizados há algumas

décadas devido às suas propriedades hemostáticas. O sódio do exudato e o cálcio do

alginato sofrem troca iônica formando um gel solúvel de alginato de sódio. Esse gel não

é aderente à ferida e é indicado para feridas exsudativas. É também utilizado para o

tratamento de feridas de espessura total, como deiscência de ferida cirúrgica, úlceras,

etc. De fácil aplicação, tem duas apresentações: placa ou fita, porém sua utilização deve

ser bem avaliada devido ao seu custo elevado.

Tabela 3. 2 – Custo de curativos disponíveis no mercado (Fonte: Pereira

)

3.6.7 – Curativos com fatores de crescimento

Com o desenvolvimento da becaplermina, que é o fator de crescimento derivado de

plaquetas (PDGF), foi estabelecida a categoria dos curativos bioativos, isto é, curativos

ou substâncias que interagem diretamente com as fases da cicatrização promovendo sua

aceleração.

22, 42

São indicados somente em situações especiais devido ao seu alto custo.

A utilização da becaplermina é feita, apenas, nos casos em que exista deficiência da

ação dos fatores de crescimento comprovada como, por exemplo, nas úlceras

neuropáticas crônicas de pacientes diabéticos.

3.6.8 - Estrutura tridimensional para proliferação de células

Os curativos temporários podem ser agrupados em duas categorias distintas: aqueles

que possuem poros em suas estruturas,

permitindo assim, a migração celular e aqueles

que não permitem o crescimento de células em suas superfícies podendo ser utilizados

como recobrimentos (como por exemplo, algumas membranas poliméricas simples).

A porosidade permite a ancoragem das células à estrutura do curativo havendo,

portanto, a necessidade de sua retirada por intervenção cirúrgica. Tal procedimento

pode ser suprimido, caso seja utilizado, conjuntamente ao curativo, uma estrutura

porosa de natureza biodegradável. Neste caso, as células podem se ancorar a essa

camada e lá permanecerão até o fim do processo. Neste caso não se retira o curativo,

deixando-o no local até que a camada biodegradável seja totalmente absorvida pelo

organismo ao longo do processo de cicatrização.

30, 45

Estes materiais, ao serem

bioabsorvidos, ainda apresentam algumas reações inflamatórias e este é um problema

ainda a ser resolvido.

3.7 - Polímeros inteligentes

Os polímeros inteligentes ou que respondem a um estímulo – stimuli responsive

polymers - são cada vez mais utilizados em aplicações de alta tecnologia, devido a sua

capacidade de responder a um estimulo externo e apresentar grandes modificações de

propriedades tais como hidrofilia-hidrofobia, tensão superficial, memória de forma,

além de outras.

47, 48, 49, 50, 51, 52

Os estímulos podem ser físicos tais como: temperatura,

ultra-som, campo elétrico, campo magnético, ondas eletromagnéticas ou ao ambiente

químico, por exemplo, sensibilidade ao pH ou a presença de íons (sais).

3.7.1 - Poli (n-isopropilacrilamida) (P-N-IPAAm)

O poli (n-isopropilacrilamida) possui o mecanismo de estímulo físico relativo a

temperatura, relacionado com uma transição de fase que pode ocorrer próxima à

temperatura do corpo humano, tornando-o potencialmente um material com forte

potencial para aplicações médicas.

Em 1978, Tanaka

observou precisamente a transição de fase nos polieletrólitos

derivados de poliacrilamida, tais como: N–isopropilacrilamida, dietilacrilamida, entre

outros. Desde então, ele e seus colaboradores têm demonstrado este comportamento em

géis ionizados de poliacrilamida. Também interpretaram as mudanças de volume dos

hidrogéis termosensíveis a partir de modelos cinéticos que obedecem à lei de Fick para

a difusão, o que deu início a um crescente número de trabalhos envolvendo o poli (N-

isopropilacrilamida), cuja unidade estrutural esta representada na Figura 3.5.

Esse é, provavelmente, o mais conhecido polímero que apresenta inversão de

solubilidade sob aquecimento, isto é, diminui a solubilidade em água com o aumento da

temperatura. Esta característica é observada em polímeros que apresentam LCST

(Lower Critical Solution Temperature) que é a temperatura crítica inferior de

solubilidade do polímero em um determinado solvente.

54, 55

Isto ocorre geralmente em

sistemas que apresentam fortes interações secundárias do tipo ligações de hidrogênio

entre polímero e solvente à baixas temperatura, permitindo haver uma boa miscibilidade

entre eles, para temperaturas mais altas o sistema se torna instável devido as forças de

hidrogênio entre polímero-solvente se aniquilarem, separando as fases (colapso). Essa

temperatura pode ser observada visualmente, através da turvação de uma solução do

sistema solvente-polímero ao ultrapassar a temperatura de 32°C. Este método é

conhecido como ponto de turvação.

54, 55

Figura 3.5: Fórmula química estrutural para o poli(n-isopropilacrilamida)

Acima da LCST prevalecem as interações hidrofóbicas, resultando na precipitação do

polímero na água. As mudanças estruturais do material devido a presença da água gera

uma expansão das moléculas e a saída de água gera um colapso das moléculas

resultando a contração volumétrica, denominada transição globular par anovelada,

conforme mostra a Figura 3.6.

53,54,55

Figura 3.6: Transição globular para enovelada.

(fonte: Han et al

)

Nas diversas aplicações para o poli (n-isopropilacrilamida) é comum este estar

misturado com alguns aditivos, que por sua vez, podem vir a perturbar a LCST do

polímero

se tiverem a capacidade de interagir com a água ou com o polímero. Este

comportamento, entretanto, torna-o ainda mais interessante, pois potencializa diversas

aplicações, dentre as quais se destacam, na liberação controlada de fármacos e na

utilização em processos de separação industrial, entre outras.

A facilidade que a LCST dos géis de poli (n-isopropilacrilamida) tem de ser ajustada

para próximo da temperatura do corpo humano, através de copolimerizações e do uso de

aditivos, torna este polímero um material extremamente útil em aplicações biomédicas,

principalmente na liberação controlada de medicamentos. O processo consiste,

basicamente, na incubação do gel em solução contendo as biomoléculas à temperatura

abaixo da LCST e posteriormente as moléculas podem ser expelidas ao se colocar o gel

em soluções (ou corpo humano) a uma temperatura acima da LCST.

Outra aplicação muito importante e com inúmeras patentes é o processo de separação de

moléculas. É realizado por seletividade de tamanho e ocorre quando o gel é colocado

em uma solução aquosa contendo vários solutos. A água presente na solução penetra e

causa o inchamento do gel, os solutos grandes tais como macromoléculas, que estão na

solução, não conseguem adentrar na rede porosa do gel por impedimento estérico,

enquanto que os solutos pequenos transitam e penetram livremente nela. Após a

remoção do gel, a solução é deixada mais concentrada de macromoléculas. O gel é

removido e colocado em outra solução aquosa a uma temperatura acima da LCST,

causando a liberação da água de sua estrutura. Juntamente com ela, as moléculas de

pequena massa molar também são lixiviadas, possibilitando a reciclagem do gel para

utilização posterior.

3.7.2 Polimerização do n-isopropilacrilamida

O processo de polimerização de P-N-IPAAm linear pode ser realizado adicionando

monômero de N-IPAAm em 40 ml de metanol, na presença de iniciador α′-azobis-

isobutironitrila (AIBN) e aquecendo até 60°C.

A reação é mantida com nitrogênio

seco por duas horas. A massa molar do polímero pode ser controlada pela relação

monômero/iniciador (M/I), como listado na Tabela 3.2. Em seguida, adiciona-se uma

solução 8% (NH

)

por gotejamento na solução de poli(n-isopropilacrilamida). O

polímero precipitado é lavado em água destilada à quente (80°C) e, em seguida, é seco

sob vácuo. A massa molar média pode ser estimada por viscosidade intrínseca (equação

de Mark-Houwink). Este método usualmente não fornece a curva de distribuição de

massa molar.

Tabela 3.1. Exemplo de Formulação para polimerização.

Relação M/I (monômero/Iniciador) e massa molar resultante do processo

de polimerização (Fonte: Stevin et al

)

P-N-IPAAm

(g)

AIBN (g) M / I

(relação molar)

Massa Molar

média

4,52 0,164 40 222.000

4,52 0,0657 100 223.000

4,52 0,0329 200 289.000

O controle da distribuição de massa molar é um dos aspectos mais importantes na

caracterização de um polímero e geralmente é expresso através de médias. As duas mais

importantes são: massa molar numérica média (M

) e massa molar ponderal média

) e a sua relação indica o índice de polidispersividade (PDI), dada pela equação 1.

Equação 1

PDI= M

/ M

(1)

Ganachaud et al

relata que têm encontrado dificuldades na medida da distribuição de

massa molar do P-N-IPAAm usando técnicas de cromatografia por exclusão de tamanho

(SEC) e apresentam um trabalho aonde comparam várias técnicas de medida, tais como

espalhamento de luz, titulação de grupos terminais com SEC. Eles demonstraram que há

discrepâncias em valores acima de 10

g/mol de massa molar e sugeriram alguns

procedimentos de preparação e de manipulação da amostra para diminuir estas

discrepâncias. Convertine et al

por outro lado, contornaram este problema utilizando

polimerização viva, que é um tipo de reação que mantêm a polimerização muito bem

controlada, previsível e com PDI próximo a 1. Dentre as diversas maneiras de

polimerização viva, ultimamente tem-se destacado a polimerização RAFT (Reservible

Addition Fragmentation Chain Transfer) ou polimerização

por transferência,

fragmentação e adição reversíveis. O processo envolve a adição de monômeros, um

bom solvente para o polímero e o monômero, um iniciador azo ou peróxido e o agente

de transferência reversível

como mostra a Figura 3.7.

Propagação

S A

Monômero (M)

R M*

A M*

Polimerização

DTE

A =

R M*

Figura 3.7: Esquema representando a reação RAFT

O agente de transferência (ditioester, DTE) reage com o radical do iniciador (R ) ou o

radical de propagação (R-M

) para dar origem a outro agente de transferência A , que

reinicia a polimerização. O comportamento vivo envolve uma reversível seqüência de

adição fragmentação entre a espécie ativa e a espécie dormente o S=C(Ph)S .

Convertine et al

utilizaram a polimerização RAFT para a produção do poli(N-

isopropilacrilamida), realizada em um solvente, o N, N-dimetilformamida (DMF),

empregando um azo iniciador convencional

2,2-azo bis (4-metoxy-2,4-

dimetilvaleronitrila) - como fonte de radicais primários e um agente de transferência de

cadeia disponível comercialmente (tri-tiocarbonatado), o 2-dodecil sulfanil tiocarbono

sulfato ácido l-2-metil propionico (DMP), como mostrado na Figura 3.8. Todas as

polimerizações foram conduzidas a 25 °C sob atmosfera de nitrogênio e 33 % em massa

de monômero. Elas apresentaram excelente controle sobre o tamanho e estrutura das

cadeias poliméricas, sem revelar sinais de reações indesejáveis ao agente de

transferência de cadeia que pudesse gerar ramificações ao final da reação. Os autores

também fizeram várias comparações metodológicas na medida de distribuição de massa

molar e concluíram que, com esta técnica, as medidas podem ser realizadas com GPC,

mesmo acima de 10

g/mol.

Figura 3.8: Esquema representativo de polimerização RAFT de P-N-IPAAm

Este tipo de polimerização pode ser utilizado em processos de enxertia de moléculas na

superfície de polímeros. É uma técnica chamada grafting from, que será vista

posteriormente.

3.7.3 - Ligações cruzadas

Os hidrogéis são materiais poliméricos que possuem a propriedade de aumentar várias

vezes o seu volume inicial através da absorção de água sem, no entanto, perder a sua

forma. As aplicações deste tipo de material dependerão do grau de inchamento e de suas

propriedades mecânicas. Um hidrogel necessita formar uma rede tridimensional na sua

estrutura para ser estabilizado, para isto necessita de um agente reticulante. Esse agente

pode ser químico (através de ligações cruzadas covalentes), ou pode ser físico (através

de cargas complexas - ligações de hidrogênio, van der Waals, etc.).

As ligações

cruzadas são as mais interessantes e geralmente melhoram as propriedades mecânicas

dos hidrogéis. A gelatina é um hidrogel estabilizado por agentes físicos e geralmente

suas propriedades mecânicas são pobres. Estas propriedades podem ser melhoradas

acrescentando-se um agente reticulante químico, como o glutaraldeído, por exemplo.

No caso do P-N-IPAM, as ligações cruzadas são preparadas em solução aquosa com

persulfato de potássio (iniciador) e monômero de N-I-PAAm e N, N′-metileno-

bisacrilamide (MBAAm, como agente reticulante mantido a 70°C por 4h). As ligações

cruzadas geralmente permitem ao polímero absorver água impedindo a sua completa

dissolução. O polímero apenas sofre um inchamento ao absorver a água. Aumentando-

se a densidade de ligações cruzadas, melhoram-se as propriedades mecânicas do

hidrogel, mas limita-se a absorção de água.

3.7.4 – Influência da arquitetura dos polímeros inteligentes na LCST

Há várias maneiras de estruturação do polímero e dos copolímeros que podem

influenciar a temperatura de transição (LCST) bem como a cinética de absorção de

água. A copolimerização com outro monômero que possui diferente hidrofobia pode

controlar a LCST do P-N-IPAAm.

57, 58

A Figura 3.17 apresenta o efeito de dois

comonômeros de diferentes naturezas, na LCST do P-N-IPAM em relação à

composição do copolímero. O monômero acrilamida (AAm) tem natureza hidrofílica,

enquanto o butil acrilamida N-tBAAm possui uma natureza hidrofóbica.

Figura 3.17: Efeito do tipo de comonômero na LCST do PNIPAM

Monômero Acrilamida (AAm) de natureza hidrofílica

Monômero N-tBAAm de natureza hidrofóbica

Efeito da copolimerização sobre a

LCST do P-N-IPAAm

Os valores de LCST são influenciados pelos grupos hidrofóbicos e hidrofílicos, assim

como o posicionamento desses grupos ao longo da cadeia. O tipo de copolimerização

também pode proporcionar uma arquitetura em nível molecular bastante distinta entre si

e, portanto, podendo gerar diferentes resultados em termos de LCST. Os resultados

apresentados na Figura 3.17 foram obtidos para copolímeros randômicos, já os

copolímeros graftizados com os mesmos tipos de co-monômeros não apresentam

variação de LCST

com a variação de composição do copolímero.

Tabela 3.2 – LCST de polímeros a base de acrilamida

3.7.5 Influência da arquitetura do hidrogel na velocidade de absorção e perda de

água

Algumas aplicações para polímeros inteligentes dependem de uma resposta rápida,

como, por exemplo, o uso como músculos artificiais. A velocidade de absorção de água

também é modulada pela arquitetura do material. Os mecanismos de transporte da água

dependerão da estruturação molecular. O empacotamento do hidrogel pode ser

modulado controlando-se a topologia do polímero de P-N-IPAAm simplesmente

graftizando-o com oligômeros do próprio polímero na rede do hidrogel (N-IPAAm)

(Figura 3 18) o que proporciona uma desidratação muito rápida com a mudança de

temperatura.

Figura 3.18: Esquema representativo do hidrogel de PNIPAM

Tipo normal e tipo combinado (com graftização de oligômeros de PNIPAM)

(Fonte: Gil et al

)

Liu et al

relatam que obtiveram uma resposta rápida na absorção de água pelo hidrogel

simplesmente mudando o método de realização da polimerização. Este resultado foi

obtido quando foram comparados hidrogéis polimerizados pelo sistema convencional de

polimerização radicalar com outros produzidos via polimerização RAFT. A diferença

foi devido à formação de uma arquitetura hiper ramificada do hidrogel polimerizado

pelo sistema RAFT permitindo a formação de espaços intermoleculares por onde

possibilitava e facilitava a saída ou entrada de água. O esquema da estrutura dos dois

Junção química

Cadeia de P-N-IPAAm graftizada

Hidrogel P-N-IPAAm normal Hidrogel P-N-IPAAm combinado

sistemas pode ser visto na Figura 3.19 e na figura 3.20 mostra a diferença entre o

sistema polimerizado via raft e o convencional.

Figura 3.19: Esquema representativo da progressão da formação do gel

Diferentes estruturas dos géis (a)–(c) sistema convencional de polimerização.

Polimerização RAFT d)–(f)

Figura 3.20: Gráfico representando Grau de inchamento x Tempo

Tempo (min.)

Grau de

inchamento

(%)

Raft

convencionais

Gel

Hiper ramificado

Formação gel

Sistema de polimerização convencional

Sistema de polimerização raft

polímero morto

Cadeia não expandida

Cadeia expandida

Zhang et al

, relatam um trabalho no qual utilizaram água e acetona no sistema de

polimerização e formação de ligações cruzadas. Este procedimento permitiu que a

estrutura do hidrogel se expandisse pela ação do solvente, durante a sua estruturação e

permitisse caminhos livres para a saída rápida da água. Na Figura 3.21 pode ser vista a

perda de água em relação ao tempo com os sistemas em que se variava a quantidade de

acetona. Nota-se que o tempo de perda de água diminuía com o aumento da quantidade

de acetona na preparação do hidrogel.

Figura 3.21: Gráfico representando Retenção de água em relação ao tempo

Variando a composição acetona – água: 0 (20% , 80%) ; ◊

(40%, 60%) ;

∆ (60%, 40%);  (80%,20%).

3.7.6 Influência de sais na LCST

Os sais exercem forte influência na LCST na seguinte ordem KI <KCl < KOH que esta

de acordo com a série de Hoffmeister. Os sais interagem com as moléculas de água por

hidratação diminuindo a entropia do sistema. Para manter o equilíbrio, a entropia do

sistema pode ser aumentada assim que as moléculas de água são liberadas fora da

molécula hidrofóbica. A Figura 3.22 apresenta o comportamento LCST com a

concentração do sal.

Tempo (min.)

Retenção

de água

(%)

Figura 3.22: Gráfico: LCST x Concentração de sais no PNIPAM.

( KI, ◊ KCl , ∆ KOH). (Fonte: Panayiotou et al

)

3.8 – Graftização ou enxertia

A modificação de uma superfície sólida de outro polímero ou mesmo de um material

inorgânico, através da inserção de um polímero é denominado polymers brushes (Figura

3.10). Esta técnica consiste em aderir quimicamente uma monocamada de polímero

sobre a superfície desejada.

66, 67, 68, 69

Primeiramente, há uma preparação da superfície,

que consiste em criar uma interface para futuras ligações químicas, com o material

polimérico, que pode ser um oligômero, ou uma rede de hidrogel (com ligações

cruzadas, ou não). As possibilidades arquitetônicas

70, 71, 72

deste tipo de interface são

inúmeras, podendo variar o comprimento de cadeia polimérica, ou variar a densidade de

ligações à superfície, ou copolimerizar um bloco no polímero graftizado, ou colocar

diferentes polímeros graftizados lado a lado na superfície modificada.

Concentração de sal

LCST

(°C)

Figura 3.10: Esquema representando alguns tipos de polymers brushes

Há dois tipos de graftização (enxertia) em superfície de materiais poliméricos que são

predominantes: grafting to e grafting from. Grafting to é uma técnica em que o

polímero a ser enxertado é previamente fabricado por polimerização, por exemplo,

RAFT (pré-polímero) e depois enxertado na superfície a ser modificada. É condição

necessária que a superfície deve ser preparada de modo a possuir grupos reativos com o

pré polímero, a vantagem deste processo é que pode se controlar e medir o tamanho dos

enxertos, com extrema facilidade.

A graftização from é uma técnica realizada através de polimerização radicalar

utilizando-se iniciadores que coordenam a formação de radicais na superfície do

polímero a ser graftizado. Tais radicais promovem a incorporação do monômero que

reage propagando-se a partir da superfície. Há reações de homo polimerização em

paralelo que competem com a graftização. A figura 3.11 representa este dois modelos.

Liquido cristalino

Copolímero em bloco

Mistura de homopolímeros

Semi-flexíveis

Flexíveis

Copolímeros randômicos

Homopolímero carregado

Figura 3.11: Esquema representativo de graftização: grafting to e grafting from

3.9 - Graftização e adesão de proteínas.

Alguns trabalhos sobre adesão de proteínas indicam que há uma influência grande da

morfologia das cadeias de superfícies graftizadas com PEO (polietileno glicol) e

também com P-N-IPAAm. Assim, a densidade de cadeias, comprimento das cadeias e a

extensão do estiramento das cadeias da camada graftizada afetam as interações com as

moléculas de proteínas.

74,75,76,77,78, 79,80, 81

A figura 3.12 mostra um esquema representativo dos tipos de conformação relacionado

a densidade de moléculas enxertadas sobre a superfície do polímero e o comportamento

frente a uma transição LCST. No esquema A e B tem-se uma baixa densidade de

moléculas, chamada conformação em cogumelos (mushroom conformation). No

esquema C e D tem-se uma alta densidade de moléculas e conformação tipo escova

(brush conformation). A e C estão no estado hidratado (abaixo de LCST) e B e D estão

no estado colapsado (acima da LCST).

Figura 3.12: Esquema representando alguns tipos de polymers brushes

A conformação em cogumelo ocorre quando a separação das moléculas é maior que o

raio de giração das cadeias poliméricas. Quando o raio de giração é inferior tem-se a

conformação em escova. A conformação em cogumelo pode levar a exposição do

substrato, particularmente no estado colapsado.

82, 83

A modificação de superfícies de materiais poliméricos para uso em cateteres, através da

graftização de poliacrilamida que possui propriedades antitrombogênicas

84, 85, 86, 87, 88

bastante estudada e utilizada.

3.10 - Culturas de células e adesão celular

A primeira condição para adesão de uma célula a uma determinada superfície é a adesão

de proteínas,

89, 90, 91, 92, 93

e apesar de algumas proteínas poderem se fixar na superfície

hidrofílica do P-N-IPAAm (abaixo da LCST), as células não se fixam devido às

propriedades mecânicas do hidrogel serem inadequadas (macia demais).

A modelagem da adsorção de proteínas pode ser feita pelas medidas das forças de

interação entre as pontas (sonda) do Microscópio de Força Atômica (AFM) com

proteínas e P-N-IPAAm em solução tampão. Entretanto diferenças na preparação do

recobrimento e as condições de uso na CP-AFM tem mostrado diferenças significativas

nos resultados.

95, 96, 97

Estudos para avaliação de forças interfaciais envolvidas entre proteínas e recobrimentos

de P-N-IPAAm são feitos através de microscopia de força atômica (AFM) utilizando-se

sondas do microscópio (probe) revestidas com colóide (CP-AFM) e tem fornecido

informações das interações entre as proteínas da superfície e da sonda do microscópio e

a superfície de P-N-IPAAm acima e abaixo da LCST.

94, 96, 97, 98

Alguns trabalhos tem utilizado esta técnica de avaliação

95, 99, 100, 101, 102,

de superfície .

Em geral é notado que há forças atrativas significantes entre a ponta hidrofóbica e a

superfície do P-N-IPAAm a temperaturas acima da LCST, enquanto abaixo da LCST,

as forças interativas são desprezíveis.

A massa molar das proteínas tem um papel importante na adsorção: os recobrimentos de

baixa densidade de graftização podem permitir a aproximação de proteínas de massa

molar pequena. Como a adsorção de proteínas é usualmente irreversível sobre substrato

não hidratado, é de se esperar que o recobrimento incompleto do substrato, quando o

estado colapsado é atingido, deve promover uma reversão incompleta das interações

entre proteína e recobrimento.

96, 97, 102, 103

A quantidade de proteína que é irreversivelmente adsorvida não é somente determinada

pelas interações químicas e da microestrutura do recobrimento, mas também pelo tipo

de proteína, tempo de residência da proteína sobre a superfície e a desnaturação da

proteína.

98, 104

Recentemente, Shimizu et al

realizaram importantes trabalhos a respeito de adesão de

células para uso em dispositivos de proliferação e crescimento de células. A idéia do

grupo, a princípio, era construir, através de uma nova concepção, um tecido

tridimensional. Primeiramente, construíram-se camadas bidimensionais de células e

posteriormente estas foram montadas, camada por camada, até se obter um tecido

espesso e funcional. Porém, para isso tornar-se possível, era necessário fazer a retirada

da camada de célula que estava sobre a placa de cultura, sem rompimento da estrutura

bidimensional, já construída. Para solucionar este problema Shimizu

teve a idéia de

revestir placas de poliestireno com uma fina camada de poli (n-isopropilacrilamida)

(técnica de feixe de elétrons) e sobre esta placa fez crescer uma camada de células a

37°C. Nesta condição, o polímero se mostra hidrofóbico e propicio à adesão e

crescimento celulares. Quando se diminui a temperatura para menos de 32°C, o

polímero torna-se hidrofílico, liberando a camada de células que pode ser retirada sem

causar nenhum dano às células (Figuras 3.13 e 3.14).

Figura 3.13: Mecanismo de adesão da célula.

A – Superfície hidrofóbica

B - Destacamento com agentes químicos

C – Destacamento com mudança da superfície

Figura 3.14: Esquema representando dispositivo on-off, para camadas de células.

Junção célula-célula

hidrofílico

hidrof

óbico

hidrof

óbico

hidrofílico

membrana de

proteína

Nitschke et al

fizeram estudos sobre adesão e destaque de células sobre superfícies

de copolímero P(NIPAMM co-DEGMA), onde os grupos de dietileno glicol

proporcionaram melhoria no destaque das células. A figura 3.15 mostra uma eletro

micrografia de proliferação de células sobre uma superfície com resposta ao

destacamento de células via estímulo externo.

Figura 3.15: Eletro micrografia do cultivo e células sobre superfície com poli (N-IPAAm co

DEGMA) à temperatura de 37°C (a) e destacamento após decréscimo de temperatura (b).

Os mecanismos de destacamento celulares da superfície de um polímero termicamente

sensível não são simples e representam mudanças no metabolismo celular. As células

entram em contato com uma superfície (adesão passiva) e a partir daí estão

dinamicamente alterando as suas membranas e sua morfologia para otimizar as

interações e estabilizar a interface célula-material (adesão ativa) (Figura 3.16).

Figura 3.16: Esquema representando tipos de adesão de células sobre substrato.

esão

Destacamento

Adesão passiva Adesão ativa

Processo ativo

A mudança da natureza da adesão nas células envolve mudanças na interface célula-

material e isto demanda um consumo de energia

que advém, obviamente, do

metabolismo celular. O P-N-IPAAm começa a se hidratar a 32°C, neste momento as

células começam a se modificar e quanto menor a temperatura mais o P-N-IPAAm se

hidrata, o que facilita o destacamento das células de sua superfície. Entretanto, o

metabolismo da célula também se reduz o que demanda um maior tempo para o

destacamento. Foi observado que a temperatura específica para se destacar as células

integralmente (sem danos), de uma superfície termosensivel

varia de acordo com o

tipo de células, pois cada tipo apresenta uma temperatura sensitiva diferente e

metabolismos celulares diversos. Okano et al

relataram diferenças significativas de

temperatura sensitiva entre as células hepatocíticas (10°C) e endoteliais (20°C) e

apontaram que esta tecnologia é importante não só no destacamento integral de células

em culturas, mas também para purificação, ordenação e separação de células.

Harriz

et al

demonstraram que o comportamento mecânico (flexibilidade e rigidez) do

material é muito importante na adesão e espalhamento das células. Pelham e Wang

105

reportaram um trabalho minucioso no qual exploraram a topografia superficial dos

hidrogéis, utilizando-se de indentação por microscopia de força atômica, e concluíram

que a adesão e espalhamento das células sobre uma variedade de géis, a base de

acrilamidas, são regulados pela flexibilidade dos substratos. Vários estudos indicam que

a transdução mecânica entre células e matriz extracelular é um fator importante no

comportamento celular tais como: adesão, migração, proliferação, diferenciação, re-

diferenciação, metástase e apoptose.

18, 73

3.11 - Técnicas preparatórias de superfícies poliméricas para graftização

A característica de uma superfície pode ser representada pela medida de sua tensão

superficial, que por sua vez pode ser medida pelo ângulo de contato entre a superfície a

ser caracterizada e um líquido de tensão superficial conhecida.

O ângulo de contato

pode ser relacionado com três forças superficiais que mantém a gota de um líquido em

equilíbrio com uma superfície sólida (figura 3.23), dada por:

γγ

cosθ

θθ

θ + γ

γγ

( 3.1)

onde

- energia interfacial entre liquido e vapor

(mN/m).

- energia interfacial entre sólido e liquido (mN/m).

- energia interfacial entre sólido e vapor (mN/m).

Figura 3.23: Esquema representando ângulo de contato entre liquido e sólido.

O ângulo θ igual a 0° significa que o líquido molha completamente a superfície, ou seja,

líquido e sólido possuem a mesma tensão superficial. Por outro lado, ângulos que se

aproximam de 180°, indicam que o líquido tem baixa molhabilidade sobre a superfície

sólida, ou seja, tensão superficial do líquido é muito diferente que a da superfície sólida.

A tensão superficial dos polímeros varia com a composição química de suas moléculas.

Assim, polímeros que possuem flúor em sua composição têm valores de tensão

superficiais bem baixos e vão aumentando conforme se muda a composição tal como

mostra o esquema representativo na tabela 3.3. Nota-se que a medida que se acrescenta

grupos de hidrogênio, cloro, oxigênio e nitrogênio, os valores de tensão superficial vão

aumentando.

Líquido

Sólido

Tabela 3.3 Tipos de polímeros com sua representação química e o valor da tensão

superficial.

Polímero Fórmula Tensão Superficial

(

γγ

γ)

(Mn/m)

Teflon (PTFE)

16,2

Polifluoreto de

Vinilideno (PVDF)

Polietileno (PE)

Poliestireno (PS)

Álcool polivinilico

(PVA)

Policloreto de vinila

(PVC)

Polietileno tereftalato

(PET)

A superfície do polímero é a região de fronteira entre a massa polimérica e o ambiente

externo. Muitos polímeros apresentam hidrofobia e inércia química que são indesejáveis

em certas aplicações. A possibilidade de modificação da superfície torna-se uma

estratégia muito interessante para se obter atividades especificas de uso sem

comprometer as propriedades mecânicas do material.

73, 95, 96, 106, 107, 108, 109

Diversas técnicas são utilizadas para realizar o acoplamento de macromoléculas a

superfície de polímeros e tipicamente envolvem a criação de sítios reativos (radicais) e

formação de hidroperóxidos na superfície com posterior reação com as moléculas a

serem enxertadas covalentemente. Essas moléculas podem ser um pré polímero que se

liga aos sítios reativos ou pode ocorrer a partir de monômeros que iniciam a

polimerização se ligando aos sítios da superfície do polímero. Dentre as técnicas

existentes, se destacam: tratamento químico,

110

tratamento corona,

111, 112, 113, 114

plasma

a baixa temperatura,

115, 116, 117, 118, 119, 120, 121

radiação ultravioleta,

121, 122, 123

radiação

gama,

124

feixes de partículas (elétrons, íons), etc. Na prática podemos considerar que

ainda há limitações para todas essas técnicas, por exemplo: a radiação UV pode

diminuir a resistência mecânica dos filmes; o plasma necessita de sistema de baixa

pressão (vácuo), o que dificulta a linha de produção; o tratamento com raios Gama

necessita equipamentos caros; o tratamento Corona apresenta dificuldades em materiais

de geometria complexa, além de necessitar de um bom controle ambiental (temperatura,

fluxo de ar, tipo de gás, umidade relativa, limpeza de eletrodos).

Vai ser abordado neste trabalho somente as técnicas de tratamento corona e irradiação

ultravioleta.

3.11.1 - Tratamento corona

A descarga corona é produzida quando um potencial elétrico é aplicado entre dois

eletrodos,

114

que pode ser ponta-placa ou placa-placa. Geralmente o ar atmosférico é o

gás que está entre as placas, tal como está representado na figura 3.24. Este método tem

diversos campos de aplicação, desde tratamento de água até a separação de poluentes

(precipitadores eletrostáticos) e é muito utilizada em tratamentos superficiais,

principalmente no setor de embalagens plásticas, onde a superfície é tratada para

melhorar a adesão da tinta de impressão.

Figura 3.24: Esquema representativo sistema corona ponta-plano.

Quando o alto campo elétrico (5.000 a 20.000Volts) é aplicado entre os eletrodos, os

elétrons colidem com as moléculas de gás que são ionizadas, causando o vento corona e

espécies ativas (íons). Se um polímero é colocado entre os eletrodos, este sofre ataque

dessas espécies ativas, podendo inclusive, criar radicais na superfície do material

polimérico.

Alguns fenômenos visíveis acontecem entre os eletrodos. Dentre eles, se destaca a

abertura de uma descarga luminosa que indica que está presente uma alta densidade de

elétrons dotados de alta energia. Este fenômeno fica mais estável e intenso quando se

diminui a quantidade de moléculas entre os eletrodos (vácuo). A colisão dos elétrons

com oxigênio, nitrogênio e outros gases faz com que este elétron perca energia que é

transferida às moléculas, excitando-as ao estado energético mais elevado.

Posteriormente, essas moléculas voltam ao seu estado natural liberando energia, na

forma de luz, calor e outras radiações eletromagnéticas. A figura 3.25 indica a

quantidade de energia dos elétrons que são necessárias para a geração de descarga

luminosa. Note que o valor varia de 1 a 20eV. Sabe-se que a energia para quebrar uma

ligação hidrogênio-carbono e gerar uma espécie ativa na superfície do polímero é cerca

de 2,5eV, ou seja, há energia suficiente durante as colisões para gerar tais espécies.

Durante efeito corona, gera-se muito gás ozônio, perceptível pelo cheiro característico,

Fonte de

Tensão

Medidor de corrente

Eletrodo

Camada isolante

Vento corona

Polímero

significando que há oxigênio nascente próximo à superfície do polímero. Este oxigênio

se combinará facilmente com as espécies ativas formando grupos hidroxilas e carbonilas

na superfície do polímero. Estes grupos serão os pontos de ligação de moléculas para ali

serem enxertadas.

Figura 3.25: Gráfico de densidade de elétrons em função da energia.

114

Os parâmetros que influenciam nas propriedades superficiais dos filmes tratados com

descarga corona são: temperatura, umidade relativa, distância dos eletrodos, forma dos

eletrodos, tipos de gases utilizados, tensão aplicada e tempo de tratamento

107

. Segundo

Torres e Sinésio, em um trabalho de tratamento corona em PET, as maiores influências

no valor do ângulo de contato, portanto, na eficácia do tratamento por descarga Corona,

normalmente são exercidas pela distância da ponta de descarga à amostra e pelo tempo

de tratamento. Nos ensaios realizados, no entanto, a distância apresentou uma influência

menor na eficácia do tratamento em relação ao tempo.

108

Zhu et al

estudaram a modificação de membranas de polietersulfona através de

tratamento corona em uma câmara com ar seco e fluxo controlado (10L/min.) com duas

placas de alumínio como eletrodo de dimensões de 20x30 cm a uma distância entre

placas de 8 mm, a placa inferior possuía um revestimento de silicone com 4mm de

espessura, utilizou-se também um gerador de freqüência (10KHz). A graftização em sua

superfície foi feita meio aquoso com ácido acrílico (1 a 2mol/L). A reação de

graftização atingiu 5 horas em seu melhor grau de polimerização que chegou a 150 a

200µg/cm

. Foram feitas medidas de ângulo de contato de água sobre a superfície do

polímero e indicou variação de 90° no ângulo de contato entre antes e após a

graftização. O estudo se estendeu as propriedades mecânicas do material e mostra que

até 100W de potência, quase não houve alterações nas propriedades mecânicas do

material, mas acima de 200W de potência há comprometimento dessas propriedades.

Jingxin e Liao

graftizaram poli (ácido acrílico) em filmes de polietileno de baixa

densidade, utilizando-se o tratamento corona. Neste trabalho houve a impregnação de

benzofenona no filme de polietileno, antes de realizar o tratamento corona. A

graftização ocorreu em solução aquosa de ácido acrílico. Parâmetros, tais como, tempo

de tratamento corona e voltagem fez com que o grau de graftização aumentasse até um

valor máximo e depois decrescesse. O aumento de tempo de reação, temperatura de

reação e concentração de monômeros (ácido acrílico) fez com que o grau de graftização

aumentasse. O melhor resultado obtido (grau de graftização de 220µg/cm

) ocorreu com

tempo de tratamento de 70s, 20% de ácido acrílico, 1,5 horas de reação a temperatura de

70°C.

3.11.2 – Tratamento por radiação de fótons ou ultravioleta

A radiação ultravioleta é classificada segundo faixas de comprimento de onda (λ): UVA

(400 – 320nm, também chamada de "luz negra" ou onda longa), UVB (320–280nm,

também chamada de onda média) e UVC (280 - 100nm, também chamada de UV curta

ou "germicida"). A energia fornecida pela onda eletromagnética é suficientemente alta

para gerar sítios ativos e formação de hidroperóxidos na superfície dos materiais

poliméricos.

A equação de Planck permite o cálculo da energia necessária para a propagação da

onda, dada por:

E = h c / λ

λλ

λ (3.2)

Onde h é a constante de Planck que vale 4,13 x 10

-15

eV.s e c é a velocidade da luz.que

vale 3x10

m/s.

O comprimento de onda máximo para ultravioleta está em torno de 400nm, significando

que a energia mínima para este comprimento de onda é 3,1eV (elétrons volts). Esta

energia é suficiente para a quebra de ligação C-H, que é cerca de 2,54eV e a energia

para a quebra de uma ligação C-C é de 3,79eV. Ambas são geradoras de sítios ativos na

superfície dos polímeros.

Vários estudos sobre a radiação UV têm sido feito para observar seus efeitos na

fotodegradação dos materiais poliméricos e na foto polimerização de resinas, vernizes e

adesivos. Seu uso na modificação de superfícies poliméricas é uma técnica que tem sido

usada com freqüência.

Ebara et al

utilizando técnicas de UV, graftizou P-N-IPAAm em micro canais de

membranas de polidimetilsiloxano para uso em processos de filtragem, afim de se

produzir uma válvula aos micro canais, permitindo a passagem de moléculas

específicas. Neste trabalho foi empregada uma polimerização direta, utilizando a

benzofenona como foto iniciador. Nesta técnica, primeiramente faz- se a adsorção da

benzofenona na superfície do filme polimérico e posteriormente mergulha-se o filme em

uma solução aquosa de N-IPAAm (monômero) sob irradiação UV com uma lâmpada de

365nm e 100W de potência. A densidade de moléculas na superfície do filme aumenta

com o aumento do tempo de exposição e a concentração de foto iniciador.

Curtia. et al

graftizaram P-N-IPAAm sobre a superfície de polietileno tereftalato

(PET) e poliestireno (PS) através de UV. Foi utilizado pré-irradiação da superfície com

uma lâmpada de 215W seguida de foto polimerização do n isopropilacrilamida (N-

IPAAm) e acrilamida (AAm) em uma solução aquosa tendo como foto iniciador o

periodato de sódio. Os resultados indicaram alterações importantes no ângulo de contato

entre água e a superfície dos polímeros utilizados e ainda apresentou a mudança de

natureza hidrofóbica – hidrofílica em 35°C (LCST do copolímero P-N-IPAAm/

PAAm).

O uso de radiação ultravioleta é evidenciado pela facilidade de aplicação e manuseio. A

possibilidade de irradiar grandes áreas superficiais de geometria complexa, talvez seja a

maior vantagem de se utilizar esta técnica. Além disso, este é um método relativamente

barato e de baixa manutenção.

3.12 – Estudos in vivo com materiais

Os testes in vivo são mais difíceis de serem realizados e tem um custo mais elevado.

Além disso, eles são mais difíceis de se controlar, envolvem sempre um comitê de ética

e por isso são usados mais na fase final, quando já se tem um bom conhecimento a

partir de testes in vitro.

Para se testar curativos, geralmente se preparam feridas por segunda intenção em

animais, como ratos, camundongos, coelhos ou cães. O curativo é aplicado sobre a área

da ferida e sempre há um grupo controle onde não se aplica o curativo em teste. Neste

caso, apenas protege-se o ferimento com gaze e vaselina. O teste tem duração máxima

de 28 dias, onde se verifica a aderência, absorção e aspecto do exudato

a cinética de

cicatrização.

125

A cinética é realizada com medidas dimensionais da ferida com

paquímetro ou via programas de computador baseados em fotografia. A troca de

curativos pode ser realizada diariamente, ou em intervalos maiores, dependendo da

especificidade do trabalho. Alguns animais são sacrificados no decorrer dos

experimentos para serem submetidos a biópsias na região da ferida para análises

histológicas

131

. Tais análises buscam verificar informações como: a presença de

macrófagos, fibroblastos, angiogênese, disposição das fibras de colágenos, presença de

hemorragia, aspecto granular e reações inflamatórias.

Capítulo 4 – Procedimento Experimental

O fluxograma abaixo (fig. 4.1) representa a metodologia utilizada neste trabalho

Figura 4.1 – Fluxograma da metodologia utilizada

4. 1 - Materiais

4. 1. 1 - Preparação dos filmes:

Os filmes de poliuretano termoplástico Elastollan ELA585A10 (Basf), gentilmente

cedido pela empresa Petropol Polímeros, foram obtidos através da técnica de

espalmagem, por espalhamento de uma solução de poliuretano 20% em piridina PA,

sobre uma placa de vidro.

O procedimento adotado para seu desenvolvimento começou com a pesagem de 20g de

poliuretano (figura 4.2), juntamente com 80g de piridina PA (figura 4.3). O béquer foi

tampado com um vidro de relógio para evitar evaporação do solvente, até a sua

completa dissolução (figura 4.4) e deixado por 24 horas à temperatura de 50°C,

Figura 4.2: Poliuretano Elastollan ELA585A10 natural

Figura 4.3: Poliuretano em piridina a temperatura de 50°C

Figura 4.4: Poliuretano totalmente dissolvido em piridina a 50°C

4. 1. 2 - Obtenção do filme

Para a obtenção do filme, utilizou-se uma placa de vidro de 150x170mm, que foi

primeiramente lavada com solução sulfocrômica, enxaguada diversas vezes com água

destilada. Após sua secagem em estufa a 105°C, foram coladas, simetricamente, várias

camadas de fita adesiva em suas bordas laterais, de modo que as fitas que determinaram

a espessura do filme a ser formado ficassem com a mesma altura.

A espalmagem do filme foi realizada, dentro de uma capela, espalhando-se a solução

sobre uma placa de vidro em uma quantidade suficientemente grande para poder cobrir

toda a placa (figura 4.5).

Figura 4.5: Derramamento da solução sobre a placa de vidro

Em seguida, com auxílio de um bastão de vidro apoiado sobre as fitas das bordas,

conforme mostra a figura 4.6, espalhou-se a solução sobre a placa de vidro, com uma

velocidade lenta e uniforme. (figura 4.7).

Figura 4.6: Início da operação de espalmagem da solução

Figura 4.7: Fim do processo de espalmagem da solução

Após o espalhamento, desligou-se o exaustor e fechou-se a porta da capela, a fim de que

a secagem do filme se desse sempre de maneira suave e lenta. Após 8 horas, tempo

suficiente para que o filme se formasse, retirou-se o filme da placa de vidro, puxando

lentamente uma de suas bordas, até retirada completa do filme, conforme figura 4.8..

fita

adesiva

fita

adesiva

bastão de

vidro

solução

PU/Piridina

Figura 4.8: Retirada do filme da placa

Os filmes porosos foram obtidos acrescentando à solução de piridina, cerca de 10% de

cloreto de lítio, em seguida repetiu-se o mesmo procedimento de espalmagem descrito

acima. Após a evaporação da piridina, os filmes foram retirados da placa de vidro e

imersos em um béquer contendo água destilada à temperatura de 50°C sob agitação,

para retirada do cloreto de lítio. A água foi trocada a cada 60 minutos de agitação. Foi

realizado um total de seis trocas de água, sendo que na última o tempo de agitação se

estendeu por 24 horas. O objetivo é a formação de poros pela retirada dos sais (cloreto

de lítio) da estrutura do material.

4. 1. 3 – Limpeza e extração de contaminantes do filme.

O filme, após ser retirado da placa, foi cortado em pedaços menores para facilitar a

colocação em um extrator Soxhlet para retirada de eventuais aditivos (plastificantes,

antiaderentes, etc.). Utilizou-se como solvente o etanol P.A. O processo de extração foi

realizado por 24 horas. O equipamento utilizado para a extração (figura 4.9) consistiu de

uma manta de aquecimento, um balão para o depósito de etanol, um extrator Soxhlet e

um condensador de refluxo, refrigerado a água.

Figura 4.9: Extrator Soxhlet

Figura 4.10: Detalhe da câmara do Soxhlet com filme de PU

Condensador

Refluxo

Soxlhet

Balão

com etanol

Filme de PU

Detalhe do filme

de PU em etanol

na câmara do

Soxhlet

Manta

4. 1. 4 - Purificação do monômero – N – isopropilacrilamida (N-IPAAm)

Na purificação do n-isopropilacrilamida 97% (Aldrich) (fig. 4.11), 50g de n-

isopropilacrilamida (fig. 4.12) foram dissolvidos em 300ml de n-hexano (Sinth). a 60°C,

com agitação por 15 minutos.(fig. 4.13 e fig. 4.14).

Figura 4.11: N – isopropilacrilamida sendo preparado para purificação

Figura 4.12: N- hexano adicionado ao n-isopropilacrilamida (N-IPAAm).

Figura 4.13: Dissolução de N-IPAAm em n-hexano com aquecimento e agitação.

Figura 4.14: Dissolução total de N-IPAAM em n-hexano a 60°C.

Transcorrido o tempo, foi feita a primeira filtração a vácuo na solução, ainda quente,

tendo como objetivo retirar-lhe as impurezas insolúveis (fig. 4.15 até fig. 4.16).

Utilizou-se um funil de Buchner e um filtro de papel.

Figura 4.15: Filtragem à vácuo da solução de N-IPAAm em n-hexano.

Figura 4.16: Solução filtrada de N-IPAAm em n-hexano.

Após a filtragem a quente, transferiu-se o líquido filtrado do kitassato para um béquer

de 500ml e realizou-se a precipitação a -6°C, utilizando-se para isto uma solução de

salmoura e gelo dentro de um recipiente de porcelana.

Após 6horas, observou-se uma intensa precipitação de cristais de N-IPAAm, que foram

levados novamente ao processo de filtração a vácuo (fig. 4.17), onde foram separados,

ainda em baixa temperatura, para que o N-IPAAm não se solubilizasse novamente e

houvesse perda no rendimento da purificação. Este procedimento foi repetido como

medida de precaução.

Kitassato

Solução

hexano

ipaam

Figura 4.17: N-IPAAm purificado e totalmente separado do n-hexano.

Após a filtragem à vácuo, o N-IPAAm foi colocada na embalagem original (após

limpeza) e levado para secagem à vácuo durante 2 horas, utilizando se um dessecador

acoplado a uma bomba de vácuo, conforme a figura 4.18. O N-IPAAm foi guardado em

local adequado aguardando as etapas de polimerização.

Figura 4.18: Sistema de secagem à vácuo de N-IPAAm.

cristais de

n-ipaam

purificado

n-hexano

com

impurezas

solúveis

dessecador

N-IPAAm

vacuômetro

bomba

vácuo

4. 1. 5 - Tratamento corona

O equipamento para tratamento corona foi construído (fig. 4.23) com ajuda de alguns

colaboradores e com recursos do laboratório de tecnologia mecânica e laboratório de

polímeros do Unileste. O gerador de freqüência e o formato dos eletrodos foram os

detalhes do projeto em que mais houve necessidade de aprimoramento: o gerador de

freqüência por necessidade de ajuste da impedância entre gerador e os eletrodos pela

necessidade de se distribuir melhor o vento corona.

O tratamento corona foi realizado utilizando-se dois procedimentos:

1 – Tratamento do poliuretano (purificado) em corona com atmosfera livre com 60% de

umidade relativa. (fig. 4.19)

2 – Tratamento do poliuretano (purificado) em corona sob vácuo primário (20torr) e

adição de argônio sob atmosfera rarefeita (fig. 4.20 e 4.21).

Em ambos os casos foi utilizado uma tensão de 20.000Volts, corrente de 3 a 6mA e

freqüência de 12kHz. O filme foi colocado entre os dois eletrodos, mais especificamente

sobre o anodo. Houve variação de tempo de tratamento e variação da distância dos

eletrodos, sendo que, para verificar esses pontos ideais de tratamento, houve a medida

da redução de ângulo de contato entre a água e a superfície do poliuretano (tensão

superficial). Essas medidas foram feitas 5 minutos após tratamento à atmosfera livre e

30 minutos após tratamento em vácuo.

Figura 4.19: Sistema para tratamento corona do filme de PU.

Figura 4.20: Sistema para tratamento corona do filme de PU.

Cilindro

argônio

Bomba

Vácuo

Saída

alta

voltagem

Gerador

freqüência

e alta

voltagem

Câmara

vácuo / gás

Cátodo

Anodo

Filme de PU

Figura 4.21: Câmara de vácuo/gás indicando cor azul na abertura do arco elétrico

4. 1. 6 - Tratamento com radiação Ultravioleta

O tratamento com radiação ultravioleta foi feito adaptando-se uma lâmpada de baixa

pressão, com comprimento de onda 256-370nm, com de potência 30W, dentro de uma

calha de lâmpada fluorescente (fig. 4.22), com revestimento de alumínio. Realizou-se o

tratamento colocando-se o filme de poliuretano sobre uma placa cerâmica a uma

distância de 5cm da lâmpada (fig. 4.23), durante vários intervalos de tempo.

Primeiramente foi realizado 12 horas de tratamento, para verificar o comprometimento

das propriedades mecânicas do poliuretano após longa exposição à radiação. Após esta

verificação, padronizou-se um tratamento de 4 horas para a formação de hidroperóxidos

e radicais livres na superfície do PU para a posterior graftização com N-IPAAm.

Entrada

de gás

Cátodo

Anodo

Vácuo

Câmara

de vácuo/gás

com formação

de descarga

(glow discharge)

Figura 4.22: Tratamento com radiação ultravioleta.

Figura 4.23: Filme de PU exposto ao UV.

4. 1. 7 - Graftização

A graftização do N-IPAAm foi realizada em um balão de três bocas (fig. 4.24 e 4.25)

com agitação magnética, fluxo de nitrogênio (1 bolha por segundo) e controle de

temperatura (abaixo de 32°C). A solução foi preparada com 5% de monômero N-

IPAAm em ácido nítrico 0,04N e 0,1% nitrato cérico amoniacal e degaseificada em

vácuo. Após pesagem, os filmes de poliuretano foram introduzidos no reator,

juntamente, como referência, de um pedaço de filme de poliuretano sem tratamento.

Transcorridas doze horas, os filmes foram retirados da solução e devidamente lavados

para a retirada de monômeros e polímeros que não estavam adequadamente aderidos à

sua superfície. Essa limpeza foi feita com trocas contínuas de água destilada a 70°C,

que foi agitada durante 4 horas. Os filmes foram secos em estufa 105°C e novamente

pesados.

Figura 4.24: Sistema do reator com atmosfera controlada.

Figura 4.25: Reator para graftização

Termômetro

Reator

Polimerização

em Solução

com filme de

poliuretano

Sistema de

borbulhamento

de nitrogênio

Nitrogênio

Reator

Placa de

aquecimento

com agitador

magnético

Cilindro de

nitrogênio

Fluxímetro

Válvula

do nitrogênio

4. 1. 8 - Medidas do ângulo de contato

O ângulo de contato entre a gota de água deionizada e o filme de poliuretano foi medido

utilizando-se uma lupa e um porta amostra que foi montado do seguinte modo:

colocou-se a lupa na posição inclinada de 90° em relação a sua posição original (fig.

4.26), nesta posição poderia se observar a gota na horizontal. Fixou-se o filme sobre a

borda lateral de um vidro de 2mm de espessura com a ajuda de dois grampos (fig. 4.27),

para que ficasse bem esticado e reto. Com uma micro seringa colocou-se 1µL de água

deionizada sobre a superfície do filme em seguida fotografou-se a gota, para posterior

medição em microcomputador. As medidas foram tomadas após pelo menos 30

segundos de contato da água com a superfície do poliuretano e foram realizadas cinco

medidas em cada filme, com desvio de 2°.

Figura 4.26: Porta amostra do filme na medida do ângulo de contato.

porta

amostra

Figura 4.27: Lupa para observação do ângulo de contato

4. 1. 9 – Transição LCST

A medida da temperatura de transição LCST foi realizada colocando-se um filme de

poliuretano graftizado com P-N-IPAAm em uma placa de Petri imerso em água

destilada (fig.4.28). Aqueceu-se a água até uma temperatura de 35°C e deixou-se

resfriar naturalmente. Foi feita leitura de temperatura através de uma termo resistência

PT100 classe B, mergulhado na água. Este sensor foi acoplado a um multímetro para

leitura da resistência ôhmica e através de uma tabela convertia-se ao valor da

temperatura. O erro deste tipo de montagem (sensor e multímetro) é de 0,30°C. O

registro foi feito visualmente e com uma câmera digital através da verificação de

alteração da transparência. Para melhor visualização do efeito, a placa de Petri foi

colocada sobre uma figura contendo um código de barra.

Figura 4.28: Esquema representativo para medição da LCST.

4. 1. 10 – Espectroscopia infravermelho FTIR-ATR

As amostras foram caracterizadas por espectroscopia na região do infravermelho

(FTIR). Espectros de FTIR foram coletados num espectrômetro Perkim-Elmer Paragon

1000, utilizando-se um acessório para reflexão total atenuada (ATR). Durante as

análises, as amostras foram pressionadas contra a superfície de um cristal ATR: KRS-5.

A análise por reflexão atenuada permite a análise da superfície do material, pois é

baseada na reflexão total da radiação na interface de matérias com índices de refração

diferentes.

Multímetro

código de barras

filme

sensor

Os espectros foram obtidos utilizando 16 leituras por espectro; resolução de 4cm

-1

região de aquisição de 4000 a 400cm

-1

em ar atmosférico e espectro de referência,

background obtido com a presença do cristal.

4. 1. 11 – Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A superfície de fratura dos materiais produzidos foi investigada através de microscopia

eletrônica de varredura, utilizando-se um Microscópio Eletrônico de Varredura, marca

JEOL, modelo 6360LV, do departamento de Engenharia Metalúrgica da UFMG. As

superfícies de fratura foram obtidas através da imersão dos materiais em nitrogênio

líquido por cinco minutos e fratura imediatamente realizada após a remoção. Este

procedimento permite preservar a morfologia original da estrutura interna, visualizando

o formato dos poros e possibilitando fazer medidas da camada superficial de material

enxertado. As superfícies de fratura foram recobertas com ouro e visualizadas no

microscópio eletrônico de varredura.

4. 1. 12 - Teste in vitro de adesão em proteína

O teste de adesão on-off in vitro foi feito testando a adesão de proteína sobre a

superfície do poliuretano graftizado com P-N-IPAAm, primeiramente fazendo-se aderir

proteína (albumina 2,0% em água) em duas condições: acima e abaixo de 32°C. Neste

caso, foi analisado qual o estado da superfície do PU (hidrófilo ou hidrófobo) seria mais

adequado para a fixação das proteínas. Em seguida, foi verificado se as proteínas que

aderiram acima de 32°C (estado hidrófobo) estavam bem fixas e se abaixo de 32°C

essas proteínas seriam eluídas.

As amostras 1 e 2 foram feitas de poliuretano graftizado com P-N-IPAAm. A amostra 1

foi colocada em uma solução de albumina a temperatura maior que 32°C durante 5 dias.

A amostra 2 foi colocada em uma solução de albumina a temperatura abaixo de 32°C

durante 5 dias.

Após a etapa de deposição em solução aquosa de albumina as amostras foram lavadas,

secas e pesadas da seguinte maneira (limpeza 1):

- Amostra 1 lavada em água destilada a temperatura acima de 32°C

- Amostra 2 lavada em água destilada a temperatura abaixo de 32°C

A amostra 1 foi novamente lavada em água destilada, mas desta vez à temperatura

abaixo de 32°C para verificar se haveria perda de massa, ou seja, se a proteína que

aderiu acima de 32°C perderia a aderência abaixo de 32°C. A amostra 2 foi novamente

lavada a temperatura abaixo de 32°C (Limpeza 2). Em seguida foram secas em estufa e

pesadas novamente para verificação da variação de massa.

4. 2 - Testes in vivo

Os testes in vivo foram realizados no ICB – Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

departamento de Fisiologia e Biofísica/Lab. de Angiogênese.

O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Experimentação Animal - CETEA

protocolo 069/09.

4. 2. 1 - Preparação do curativo

Os curativos foram preparados no Departamento de Micro Clínica da Faculdade de

Farmácia, do Unileste. Foram utilizados os filmes de poliuretano com e sem tratamento,

que foram cortados utilizando-se um vazador de 10mm de diâmetro. Após o corte, o

filme foi levado para esterilização em luz ultravioleta de 30W de potência e

comprimento de onda 254-370nm, durante dois minutos de exposição em cada face do

filme a uma distância de 2cm do filme. Os filmes esterilizados foram colocados dentro

de um coletor de amostra previamente esterilizado e levados para a montagem final, em

uma capela de fluxo laminar com ambiente esterilizado por luz ultravioleta.

A montagem foi feita utilizando-se duas películas - uma com adesivo para prender o

material à pele do animal e a outra simples (sem adesivo) apenas para proteger

temporariamente o material até seu uso no teste in vivo - que foram montadas

paralelamente, tendo entre elas o material tratado (fig. 4.29). Para esse fim, foi utilizada

capela previamente esterilizada por luz ultravioleta durante 15 minutos, luvas de látex e

pinças de aço inox para manuseio das partes com e sem adesivo do curativo.

Figura 4.29: Montagem do curativo.

Os curativos prontos foram colocados em um coletor de amostra convencional e levados

para a aplicação nos testes in vivo.

4. 2. 2 - Implantação

Todos os testes in vivo foram feitos no Instituto de Ciências Biológicas - ICB - da

UFMG.

Este teste foi realizado para dois tipos de materiais: o poliuretano e poli(n-

isopropilacrilamida). O poliuretano utilizado é o mesmo fabricado no procedimento

4.1.2 e sem poros. O poli(n-isopropilacrilamida) foi sintetizado pelo processo de

polimerização em solução aquosa, em um reator de vidro de três bocas. A solução

possuía a seguinte composição:

proteção

do adesivo

adesivo

cobertura

- 50g água;

- 3,35g de N-IPPAm; monômeros.

- 0,067g MBAAm (N, N′-metileno-bisacrilamida); agente de ligação cruzada.

- 0,0335g APS – persulfato de amônia; Iniciador

- 0,0335g TEMED-trietiletilenodiamina, acelerador.

A reação acorreu à temperatura ambiente em cerca de 15 minutos e o resultado foi um

hidrogel, de consistência macia tal como uma gelatina. O material foi lavado em água

destilada, cerca de 5 vezes, sempre fazendo-se várias ciclagens de temperatura,

aquecendo e resfriando-se o banho em torno da LCST (32°C) para facilitar a limpeza,

pois acima de 32°C a água é expulsa do interior do hidrogel carreando as impurezas

(monômeros, iniciadores e catalisadores). Para aplicação do implante, cortou-se, com

auxilio de uma lâmina, pequenos pedaços (0,3x0,5 cm) deste hidrogel.

Tanto o poliuretano como o hidrogel foram esterilizados em autoclave à vapor, à

temperatura de 130°C, durante o tempo de uma hora. Em seguida colocados dentro de

um recipiente esterilizado que foi hermeticamente fechado e levado ao ICB para

implantação nos animais.

Os implantes foram colocados na região subcutânea dorsal de camundongos (Swiss),

através de uma incisão de 10mm de comprimento. Não houve nenhuma fixação do

implante. Assim que o material for implantado, a abertura foi suturada. Após 7 dias os

animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e os implantes retirados para

análise histológica

Foram utilizados três animais, por material, totalizando-se 6 animais. Os implantes para

avaliação histológica, depois de retirados, foram fixados em formalina tamponada

(aldeído

fórmico (37- 40%) 100ml, fosfato monossódico 4g, fosfato bisódico 4,5g, água

destilada 900 ml) por 24 horas. Posteriormente o material foi processado para inclusão

em parafina. Os blocos foram submetidos à microtomia (5 µm) e as lâminas montadas e

coradas com hematoxilina e eosina (H&E).

As imagens microscópicas dos cortes histológicos foram capturadas com uma objetiva

(40x) plana apocromática em microscópio (Zeiss Axiolab; Zeiss; Germany). As

imagens foram digitalizadas e transferidas para o analisador de imagem (Kontron

Eletronics, Carl Zeiss – KS300 versão 2).

O acondicionamento dos camundongos foi feito em Biotério de manutenção

(laboratório de angiogênese, local onde os experimentos foram realizados). Os animais

foram distribuídos em caixas de polipropileno (fig. 4.30) sobre estantes vazadas, o que

permitia a circulação de ar entre as caixas (distância de 5cm entre cada uma

horizontalmente e de 80cm verticalmente). Os animais foram tratados com ração

industrial e água filtrada. O barulho era restrito e a iluminação controlada. Os ciclos de

claro-escuro foram controlados artificialmente, diariamente, segundo o ciclo natural da

espécie. A temperatura também foi controlada e a circulação de ar garantida por

exaustor.

Figura 4.30: Acondicionamento dos camundongos no biotério.

4.2.3 - Verificação do mecanismo on-off em um modelo de ferida cutânea

excisional.

Testes para verificação do mecanismo on-off dos curativos foram executados em

camundongos Swiss que foram anestesiados (fig.4.31) e tiveram dorso previamente

depilado (fig. 4.32) com maquina elétrica de corte de pelos para a produção de duas

feridas cutâneas excisionais, criadas através do pressionamento da pele da região dorsal

com um furador circular tipo punch de biópsia (diâmetro de 0,5cm e área de 0,196cm

(fig. 4.33 e fig. 4.34). Os animais foram previamente divididos em dois grupos: grupo

sem cobertura e grupo com cobertura. A anestesia utilizada foi 80mg/Kg de cetamina e

10 mg/Kg de xilazina. Foram usados 2 grupos e 5 camundongos, num total de 10

camundongos. Testes anteriores indicaram que houve um pequeno desvio padrão nas

variáveis estudadas, por isto o valor de n igual a 5 apresenta boa confiabilidade.

Figura 4.31: Aplicação de anestesia no camundongo.

Figura 4.32: Preparação da pele do dorso do camundongo.

Figura 4.33: Excisão da pelr com punch.

Figura 4.34: Feridas prontas para serem cobertas.

Cinco animais tiveram recobertas as feridas do lado direito (5 feridas) com poliuretano sem

graft ou qualquer outro tipo de tratamento (fig. 4.35 e fig. 4.36). As feridas do lado esquerdo

(cinco feridas) foram recobertas com poliuretano graftizado com P-N-IPAAm. Um grupo de

cinco animais sem cobertura (10 feridas) foi usado como controle.

sem grafts

com grafts

Figura 4.35: Feridas recobertas com curativos

Figura 4.36: Reforço para assegurar a montagem do conjunto.

Após a retirada dos curativos, as feridas foram avaliadas, medidas (antes e durante o

processo de cicatrização) (fig. 4.37) e fotografadas. A avaliação do fechamento da

ferida foi realizada com paquímetro e as medidas foram tomadas observando-se o maior

e menor diâmetro.

Figura 4.37: Medidas das feridas..

A área foi calculada pela equação (4.1)

A = π

ππ

πR.r (4.1)

Onde r é o raio menor e R é o raio maior, medidos em uma mesma ferida.

O cálculo do fechamento da ferida foi feito pela equação (4.2)

M ±

±±

± DP = (A

– A

) / A

(4.2)

Onde A

é a área inicial da ferida e A

é a área da ferida no dia da observação. M é a

média e DP é o desvio padrão.

As observações consistiram primordialmente de anotar os aspectos de coloração,

aderência, presença de infecção, presença de tecido de granulação e teve como

fatores preponderantes os seguintes tópicos:

- Observar o arraste de tecido na retirada do curativo.

- Testar e observar mecanismo on-off.

Testou-se e observou-se o mecanismo on-off através da verificação da mudança de

aderência do curativo à ferida. Para isto, primeiramente mediu-se a temperatura

diretamente sobre a superfície do curativo, utilizando-se um termômetro a laser

como indica a figura 4.38, em seguida retirou-se os curativos com temperatura da

pele acima de 32°C (fig. 4.39) e observou-se a aderência do material em contato

com a ferida. (fig. 4.40- 4.41).

Figura 4.38: Termômetro à laser para leitura da temperatura da pele.

Figura 4.39: Leitura de temperatura sobre o curativo.

Figura 4.40: Retirada do curativo.

Figura 4.41: Retirada do curativo

Após as observações do mecanismo on-off e os animais serem sacrificados, iniciou-se a

retirada de amostra da pele retirando-se os tecidos com uma tesoura cirúrgica (fig. 4.42

e fig. 4.43) e o seccionamento da lesão foi feita incluindo área de lesão e área da borda

da lesão com tecido normal com auxilio de um punch (8mm) com diâmetro maior que o

utilizado para a produção das lesões. (fig. 4.44).

Figura 4.42: Retirada do tecido região das feridas dorso do camundongo.

Figura 4.43: Vista das feridas lado interno da pele.e a direita esquema representativo.

Figura 4.44: Seccionamento com punch , para análises histológicas

8 mm tecido da ferida e 3 mm da borda da ferida

ferida 1

ferida 2

tecido dorso

Posteriormente fez-se o corte transversal do tecido (fig. 4.45) e acondicionamento em

formalina tamponada (formaldeído a 37-40% 100ml, água destilada 900ml, fosfato de

sódio monobásico 4g, fosfato de sódio dibásico (anidro) 6,5g) por 24 horas, (fig.4.46),

posteriormente o material foi processado para inclusão em parafina e emblocado. Os

blocos foram submetidos à microtomia (5µm) e as lâminas montadas e coradas com

hematoxilina e eosina (H&E).

Figura 4.45: Preparação para fixação.(A) Feridas sendo seccionadas

(B) Seccionamento do tecido em corte transversal para análises histológicas

C) Esquema representando o corte.

Figura 4.46: Acondicionamento do tecido em formalina (A)

Esquema representativo do corte do tecido a ser embutido e

microtomisado para análises histológicas (B).

Capítulo 5 - Resultados e Discussão

5.1 - Ângulo de Contato.

As medidas do ângulo de contato indicam alterações da superfície do material.

Analisando-se os resultados da tabela 5.1, nota-se que o poliuretano puro possui um

ângulo de contato de 45° e que todos os tratamentos realizados alteraram a sua

superfície. Vale destacar que o melhor tratamento para formação de hidroperóxidos à

superfície do poliuretano foi o ataque com luz ultravioleta, que gerou um ângulo de

contato de 32°. Tal resultado indica que este tratamento poderia gerar uma densidade de

hidroperóxidos por área maior e, conseqüentemente, uma maior densidade de moléculas

graftizadas em sua superfície.

Figura 5.1: Molhabilidade de uma gota de água deionizada sobre a superfície do PU graftizado

com P-N-IPAAm

A figura 5.1 são fotos de gotas de água deionizada que estão sobre a superfície do

poliuretano enxertado com P-N-IPAAm em duas situações a 25 e 40°C. Nota-se que a

25°C a água molha muito mais a superfície do polímero, o que indica que o estado da

superfície é mais hidrófilo e a 40°C a molhabilidade é inferior, o que indica um estado

hidrofóbico, os ângulos de medida podem ser verificados na tabela 5.1.

25°C

40°C

Tabela 5.1 – Ângulo de contato entre água deionizada e material.

As mudanças do ângulo de contato com o tratamento corona em poliuretano foram bem

menos expressivos do que o tratamento por radiação ultravioleta, o que indica que o

tratamento UV foi mais eficiente na formação de grupos reativos na superfície do PU. A

figura 5.2 representa o efeito da luz UV na superfície do material polimérico, na

formação de hidroxilas, carbonila e epoxies. Cada novo grupo formado é consequencia

da oxidação da superfície do poliuretano, na presença de radiação que é a fonte

energética destas reações.

Figura 5.2: Esquema representativo da formação de grupos

hdroxilas, carbonila e epoxies, quando da exposição de PU à radiação UV

Filme de poliuretano Ângulo de contato

Sem tratamento (25°C)

45° (±

±±

± 2°)

Tratamento Ultra Violeta (25°C)

32° (±

±±

± 2°)

Tratamento Corona ao ambiente (25°C)

42° (±

±±

± 2°)

Tratamento Corona atmosfera

controlada e rarefeita (25°C)

38° (±

±±

± 2°)

PU com grafts P-N-IPAAm

(25°C)

28° (±

±±

± 2°)

PU com grafts P-N-IPAAm

(40°C)

74° (±

±±

± 2°)

Poliuretano

LUZ UV

Poliuretano

Os resultados de ângulo de contato dos filmes graftizados se referem à graftização

usando-se o tratamento por ultravioleta. As medidas demonstram claramente o

comportamento da superfície abaixo e acima da transição LCST (T=32°C) resultando

um ângulo de 28° na temperatura abaixo de 32°C e o ângulo de 74° para temperatura

acima de 32°C. Mostrando assim uma forte alteração do ângulo de contato, quando este

material ultrapassa a LCST do P-N-IPAAm, o que indica variação do comportamento

hidrofílico para hidrofóbico. O estado hidrofóbico da superfície do PU graftizado, pode

favorecer a adesão de proteínas insolúveis ou que tenha baixa solubilidade em água.

5.1 – Ganho de massa – graftização.

A figura 5.3 representa a graftização tipo graftization from da poliacrilamida na

superfície de um polímero, utilizando nitrato cérico amoniacal como catalisador, onde o

iniciador tem papel fundamental em formar o radical nos grupos hidroxilas e possibilitar

a formação dos enxertos, a formação do homopolímero ocorre em paralelo, este é

separado depois por lavagem do filme enxertado.

Figura 5.3: Esquema representativo da graftização poli-N-Isopropilacrilamida superfície de

poliuretano

Pela tabela 5.2 pode se observar que o tratamento ultravioleta foi muito mais eficiente

que o tratamento corona e que o ganho de massa superior dos filmes com poros, foi

devido ao aumento da área superficial específica do material.

Tabela 5.2 – Ganho de massa após graftização.

Tipo de pré tratamento do filme Ganho de massa após a graftização

(µ

µµ

µg/cm

)

Controle 0,0

Tratamento corona

Atmosfera rarefeita de argônio (10torr)

Distância eletrodos 5 mm (25KV e 3mA)

Tempo: 20s

0,3

Tratamento Ultravioleta

Filme sem poros

Distância do filme 5 cm e tempo 4 horas.

Tratamento Ultravioleta

Filme com poros

Distância do filme 5 cm e tempo 4 horas

Se compararmos este resultado com os resultados do ângulo de contato (tabela 5.1)

nota-se que os resultados com o tratamento corona e ultravioleta estão coerentes com os

resultados de ganho de massa após graftização.

Observa-se também que no grupo controle, ou seja, poliuretano sem nenhum

tratamento, não houve nenhum ganho de massa e graftização.

5.3 - Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV

A figura da figura 5.4 é uma eletro micrografia da amostra de poliuretano sem

graftização

Figura 5.4: Eletro micrografia do poliuretano sem graftização.

Vista da superfície natural

A figura 5.5 mostra a eletro micrografia da superfície de uma amostra de poliuretano

graftizado com poli (N-isopropilacrilamida) (P-N-IPAAM), após tratamento corona.

Nota-se a presença dos poros na superfície do poliuretano, indicando que a camada de

material graftizado é bem delgada. Não foi possível medir a camada graftizada, que se

mostrou com uma dimensão incapaz de ser resolvida pela microscopia eletrônica de

varredura.

Figura 5.5: Eletro micrografia do PU graftizado após tratamento corona.

Vista da superfície natural

A figura 5.6 é uma eletro micrografia que mostra a superfície de um filme após

graftização de poliuretano tratado por luz ultravioleta.

Figura 5.6: Eletro micrografia do poliuretano graftizado com P-N- IPAAm.

Após tratamento UV – Vista da superfície natural

A figura 5.7 é a eletro micrografia que mostra a superfície da seção do filme fraturado.

Nota-se que não há presença de poros no interior do filme. O processo de espalmagem

gera este tipo de estrutura, deixando poucos poros restritos geralmente à superfície do

filme. Observa-se também um filme fino na superfície, melhor visualizado na figura 5.8.

Figura 5.7: Eletro micrografia do poliuretano graftizado com P-N-IPAAm.

Após tratamento UV – Vista da superfície de fratura

A figura 5.8 é a eletro micrografia que revela corte transversal do filme da figura 5.6 em

diferentes aumentos. A camada de polímero modificada através do tratamento e UV e

de graftização foi medida com um aumento de 7500x, e registrou uma espessura de

1,8µm.

Figura 5.8: Eletro micrografia do poliuretano graftzado com P-N-IPAAm.

Após tratamento UV - Vista da superfície de fratura - 7500x

A figura 5.9 é a eletro micrografia que revela a superfície de uma amostra de

poliuretano poroso, preparado através da introdução de cloreto de lítio e posterior

extração. O objetivo do incremento na porosidade foi o de proporcionar uma maior

adesão e maior permeabilidade do filme ao vapor d’água e ao oxigênio, visando a

aplicação como curativo.

Figura 5.9: Eletro micrografia do poliuretano poroso sem grafts

Vista da superfície natural

Pode-se observar o aumento de porosidade do filme pelo aspecto da superfície quando

comparada à exibida na figura 5.4 (filme produzido sem cloreto de lítio). O cloreto de

lítio foi retirado do filme, após a sua obtenção, por limpeza em água, o que é

relativamente fácil, pois o cloreto de lítio é extremamente solúvel em água.

Figura 5.10: Eletro micrografia do poliuretano poroso com grafts.

Após tratamento UV – Vista da superfície natural

A figura 5.10 é a eletro micrografia que mostra a superfície da amostra da figura 5.9

após graftização com P-N-IPAAm, através de tratamento com luz ultravioleta. Nota-se

nitidamente o aspecto diferente da superfície, com total desaparecimento dos poros e

com a formação de escamas, o que indica que a camada graftizada é espessa.

Figura 5.11: Eletro micrografia do poliuretano poroso sem graft.

Vista da superfície fraturada

A figura 5.11 é a eletro micrografia que diz respeito à amostra da figura 5.9 (superfície

da secção fraturada). Nota-se que os poros são uniformes e distribuídos por toda a

espessura do filme, o que é interessante, pois aumentará a permeabilidade do material.

Estes poros têm em média o de diâmetro 5µm.

Figura 5.12: Eletro micrografia do poliuretano poroso com graft.

Vista da superfície fraturada

Figura 5.13: Eletro micrografia do poliuretano poroso graftizado.

Após tratamento UV – Vista da superfície fraturada

As figuras 5.12 e 5.13 são eletro micrografias da superfície fraturada do PU poroso

graftizado após tratamento UV. Pode-se perceber que os poros do poliuretano foram

parcialmente ocupados pelo P-N-IPAAm, indicando que há uma boa penetração do

material nos poros, dificultando até a medida da espessura da camada da superfície

modificada que foi estimada em 5µm.

5.4 - Transição LCST

A temperatura de transição do P-N-IPAAm graftizado sobre a superfície do poliuretano

foi medida observando-se a mudança de transparência do filme, conforme esquema

representativo da figura 4.32. O efeito visual da transição de temperatura pode ser

observado nas figuras 5.14 e 5.15 que retratam o filme de PU graftizado submetido às

temperaturas abaixo e acima de 32°C. Nota-se que abaixo de 32°C o filme está mais

transparente, pois as moléculas do P-N-IPAAm graftizado estão absorvendo água

(higroscópico) e sofrem um inchamento proporcionando transparência ao conjunto.

Alguns trabalhos utilizam teste de absorção na espectroscopia UV-Vis. para medida da

LCST, que é um método bastante preciso

83, 127

. No caso deste trabalho, a opacidade do

filme devido à elevada espessura da camada graftizada (8 a 10µm de espessura) não

permitiu a leitura, através de espectrofotômetro. A leitura foi feita por observação

visual.

Figura 5.14: Poliuretano graftizado com P-N-IPAAm. T= 31,7°C.

Figura 5.15: Poliuretano graftizado com P-N-IPAAm T= 32,2°C.

Na figura 5.13, o filme submetido a temperaturas superiores a 32ºC se mostra mais

opaco, pois as moléculas graftizadas não absorvem água (hidrofóbico) e entraram em

colapso (mas ainda permanecem graftizadas a superfície) e com isto ficam mais

agrupadas restringindo a transmissão de luz (maior espalhamento).

Figura 5.16. Esquema representativo do estado das moléculas

Tendo em vista os possíveis erros de medida de temperatura, pode-se considerar que a

LCST do filme graftizado seria em torno de 32°C. Este fenômeno é totalmente

reversível e ocorre muito rapidamente.

Cole et al

fizeram uma revisão ampla sobre este assunto e apontam que não há

valores exatos para medida de LCST de polímeros graftizados e sim uma faixa de

transição. Os autores indicam que o valor da LCST só é preciso quando se trata de

polímeros não graftizados. Eles sugerem também que o LCST pode ter relação com o

tamanho, a arquitetura, espessura e densidade dos grafts e que há poucos trabalhos que

esclarecem isto.

Annaka et al

126

apresentaram resultados utilizando micro balança de quartzo para medir

a transição LCST para P-N-IPAAm graftizado, em superfície de quartzo, na espessura

de 50nm e obtiveram uma variação contínua nos valores, com inicio de transição em

torna de 15°C e final de transição em 50°C. Os autores sugerem que o comprimento dos

grafts, assim como o índice de polidispersão desses mesmos grafts e a densidade de

grafts sobre a superfície, tem forte influência nos resultados.

O trabalho de Curtia et al

obtém resultados mais estreitos a respeito da LCST de P-N-

IPAAm graftizado na superfície de PET (camada de 30µm de espessura), utilizando

ângulo de contato para medir a transição LCST. O resultado aponta o inicio da transição

em torno de 30°C e com término em 35°C. Este resultado se aproxima mais do

resultado obtido nesta tese, provavelmente devido à grande espessura da camada

Colapso das moléculas

(acima LCST)

Expansão das moléculas

(abaixo LCST)

graftizada. Este fato possibilita que o P-N-IPAAm tenha uma densidade elevada de

moléculas levando a um comportamento semelhante ao polímero puro não graftizado.

5.5 - Espectroscopia infravermelho com transformada de Fourier - FTIR

Na obtenção dos espectros na região do infravermelho, utilizou-se a técnica ATR

(reflexão total atenuada). Este tipo de análise é restrita a superfície do material, sendo

útil para investigar as modificações efetuadas no poliuretano.

Banda (cm

-1

) Característica

1604 N-H vibração amida II

1446 C-N estiramento

1650 Estiramento carbonila

1540 N-H Estiramento amida I

Figura 5.17 - Esquema representativo da estrutura química do

poli-N-isopropilacrilamida e bandas típicas do espectro infravermelho.

Banda (cm

-1

) Característica

1538 Amida II - deformação - d NH

1724 Amida I - estiramento C=O

3330 Estiramento NH.

Figura 5.18 - Esquema representativo da estrutura química do poliuretano.

e bandas típicas do espectro infravermelho.

As figuras 5.17 e 5.18 apresentam as principais bandas do espectro infravermelho do P-

N-IPAAm e do Poliuretano.

Figura 5.19: Espectros na região do infravermelho de filmes: PU puro sem grafts (A),

PU tratado com UV (B), PU graftizado com P-N-IPAAm (C)

A figura 5.19 mostra três espectros: poliuretano puro, poliuretano que foi tratado com

radiação ultravioleta e poliuretano que possui moléculas de P-N-IPAAm graftizadas em

sua superfície com pré-tratamento com radiação ultravioleta. A principal diferença entre

os espectros está na banda à 1639cm

-1

que é relativo ao grupo carbonila (C=O)

(estiramento) pertencente ao grupo amida (CONH) do P-N-IPAAm. A banda em

3334cm

-1

para o poliuretano puro é relacionada à funcionalidade NH do grupo uretânico

e hidroxila. Esta mesma região esta mais larga no espectro do poliuretano que sofreu

tratamento com radiação ultravioleta (espectro B), provavelmente devido à formação de

hidroperóxidos resultantes do ataque por radiação.

As bandas que aparecem em 1727 (amida I - C=O estiramento - n) associada aos grupos

carbonila da ligação uretânica no espectro do poliuretano puro desaparecem no espectro

de poliuretano graftizado com P-N-IPAAm, como resultado da presença das cadeias

enxertadas do P-N-IPAAm que atenuam o feixe de infravermelho. Nota-se também que

a banda à 1727cm

-1

relativa aos grupos carbonila sofreram alteração, como

conseqüência da oxidação da superfície gerada pela atuação da radiação ultravioleta.

A banda em 3400 cm

-1

do espectro C possivelmente devido aos grupos OH da água,

pois a superfície graftizada é altamente higroscópica.

A figura 5.20 diz respeito a espectros na região do infravermelho relacionados ao

tratamento utilizando o efeito corona nos filmes de PU. Nota-se que o poliuretano

graftizado teve alterações no espectro semelhantes ao poliuretano graftizado da figura

5.14, com notável aparecimento da banda em 1639cm

-1

relacionado à carbonila (C=O)

do grupo amida do P-N-IPAAm (estiramento) e alargamento da banda em 3300cm

-1

relacionado aos grupos hidroxilas da água

Figura 5.20: Espectros na região do infravermelho de PU tratado corona e graftizado

com P-N-IPAAm (D), PU purificado (F) e PU sem grafts (E).

Nota-se que o espectro do poliuretano purificado no extrator Soxhlet é idêntico ao

poliuretano sem graft tratado com corona, o que indica que o grau de alteração na

superfície (oxidação) foi menor que aquele obtido pelo tratamento UV.

As análises indicam que a graftização ocorreu tanto no tratamento com radiação

ultravioleta como no tratamento corona. Nota-se também que o espectro D da figura

5.20 indica que o tratamento corona graftizou uma camada bem delgada de P-N-

IPAAm, pois ainda apresenta sinais da banda do espectro do PU a 1727 cm

-1

diferente

da figura 5.19, onde o espectro C (PU graftizado com UV), não apresenta banda a 1700

-1

5.6 - Testes de adesão com deposição de albumina

O teste on-off de adesão de albumina foi realizado em duas condições, acima de 32 °C,

quando o poliuretano graftizado está hidrofóbico e abaixo de 32°C, quando este está em

condições hidrofílicas. O material que foi utilizado nas duas condições foi o mesmo, ou

seja, poliuretano poroso modificado com UV e graftizado com P-N-IPAAm.

O resultado apresentado na figura 5.21 indica que a proteína (albumina) adere melhor à

superfície em que foi depositada na condição em que o poliuretano está em condição

hidrofóbica, chegando a atingir em média 3,5% do peso inicial do filme. Ao se lavar o

filme de poliuretano graftizado em água destilada abaixo da temperatura LCST houve a

perda, em parte, de aderência da proteína, chegando a ficar retido ainda 0,5% de

proteína.. Isto acontece porque quando a superfície do poliuretano passa para a condição

hidrofílica as moléculas de proteínas, que estão imobilizadas apenas por interações

secundárias perdem a adesão. Provavelmente por que quando os grafts da superfície do

poliuretano se expandem acontece uma diminuição dos pontos de interações secundárias

realizadas anteriormente. Em paralelo os grafts absorvem uma grande quantidade de

moléculas de água, ou seja, há uma grande competição entre água e albumina, e,

logicamente, a superfície hidrofílica prefere se ligar às moléculas de água.

Deposição de Albumina em Poliuretano Graftizado com

P-N-IPAAM

Após limpeza na respectiva

temperatura de deposição

(Limpeza 1)

Após limpeza abaixo de 32 °C

(Limpeza 2)

Albumina

(%)

Deposição de albumina abaixo de 32°C

Deposição de albumina acima de 32°C

Figura 5.21: Gráfico indicando deposição e adesão de albumina

em poliuretano graftizado com P-N-IPAAm.

Isto significa que o mecanismo on-off para albumina, em água, foi efetivo. Alguns

autores, trabalhando com albumina bovina chegaram a conclusões similares

83, 87

O resultado indica também que há uma baixa adesão de proteínas nas condições em que

a superfície do poliuretano estaria em uma condição higroscópica (abaixo de LCST),

significando que a extensão das cadeias de P-N-IPAAm restringe a penetração das

moléculas de proteína.

100

Figura 5.22: Esquema representativo da deposição de albumina, sobre a superfície de

poliuretano com grafts de P-N-IPAAm.

5 dias

Deposição de albumina em temperatura

Temperatura menor que LCST

Deposição de albumina em

temperatura maior que LCST

5 dias

Limpeza

T < 32°C

101

5. 7 - Testes in vivo

5. 7.1 - Implantes

Os polímeros usados como implantes nos ensaios in vivo foram o poliuretano sem

graftização, recortado em retângulos de 1,0 x 1,5cm, e o P-N-IPAAm puro, com

aproximadamente 0,3mm de altura e 0,5mm de diâmetro. Cada polímero foi implantado

sub-cutaneamente na região dorsal de camundongos Swiss e lá permaneceram durante 7

dias. Após esse período os animais foram sacrificados, os implantes retirados e

processados rotineiramente para inclusão em parafina. As lâminas histológicas foram

preparadas com cortes de tecido a 5 µm e coradas com hematoxilina-eosina (H&E).

Nos implantes de poliuretano sem graftização observou-se o desenvolvimento de uma

cápsula envolvendo todo o implante. Essa cápsula era constituída por tecido conjuntivo

mais frouxo (fibras finas e separadas), tecido adiposo, células inflamatórias (macrófagos

e linfócitos) e vasos sanguíneos (Fig. 5.23).

Nos implantes de P-N-IPAAm puro, foram observados tecido conjuntivo com fibras

mais espessas e maduras (mais denso) e maior vascularização indicando um processo de

reparo mais adiantado (Fig. 5.24). Também havia presença de tecido adiposo, células

inflamatórias. Não houve infiltração celular na matriz de nenhum dos implantes e seus

poros não foram visíveis pela microscopia óptica até 60X.

102

Figura 5.23 – Cortes histológicos de implante de poliuretano sem graftização com 7 dias. A

seta, com duas pontas, mostra a região do implante (imp). TC- tecido conjuntivo

apresentando fibras finas e frouxas; TA- tecido adiposo; v- vasos sangüíneos. B, C e D

representam diferentes aumentos de A. Coloração H&E.

imp

10x

20x

60x

103

Figura 5.24 – Cortes histológicos de implantes de P-N-IPAAm com 7 dias. A seta, com duas

pontas, mostra a região do implante (imp). TC- tecido conjuntivo apresentando fibras mais

espessas e densas; TA- tecido adiposo; v- vasos sangüíneos em grande quantidade. B, C e D

representam diferentes aumentos de A. Coloração H&E.

imp

10x

20x

60x

104

Analisando os achados dos implantes de poliuretano e P-N-IPAAm em termos de

desenvolvimento e amadurecimento do tecido até sete dias de implantação, observa-se

que o processo de reparo no P-N-IPAAm está mais adiantado. A temperatura corporal

normal do camundongo varia de 35,2 a 37,9 °C, isto significa que o implante de P-N-

IPAAm estava em um ambiente com temperatura acima da LCST cujo valor é de 32°C,

isso contribui para um estado hidrofóbico do polímero. É sabido que esse estado

favorece a adesão de proteínas e células

11, 12, 28, 29, 30

. Isso, aliado a um baixo grau de

toxidade em relação ao poliuretano provavelmente tenha contribuído para um

amadurecimento do tecido conjuntivo e o crescimento de vasos gerando um processo

mais avançado em torno do P-N-IPAAm.

105

5.7.2 – Avaliação da cicatrização da ferida cutânea.

A figura 5.25 representa a avaliação do fechamento das férias (determinado através da

equação 4.4) que estão apresentadas na figura 5.27.

Figura 5.25: Grau de contração das feridas sem e com cobertura

Observando-se o gráfico verifica-se que os valores do grau de contração estão bem

próximos e não existe diferença estatística entre feridas cobertas com ou sem graft

Na figura 5.26 têm-se as feridas que receberam coberturas. As fotos do lado C também

foram realizadas imediatamente após a indução da ferida, enquanto as fotos do lado D

são feridas que receberam cobertura durante 3 dias de cicatrização. As feridas com a

legenda A receberam cobertura com poliuretano poroso graftizado com P-N-IPAAm e

as fotos com legenda B receberam poliuretano poroso sem graftização. A idéia de se

colocar um grupo controle (B) ao lado do grupo em análise (A) foi para eliminar a

variação de resultados de animal para animal.

Estas feridas até o terceiro dia ainda estão em processo de auto limpeza e inflamação, e

iniciando o processo de reparo e proliferação

1, 2, 3, 4, 35, 38

, portanto ainda não se verifica a

presença acentuada de novas células e de tecido neoformado. Mesmo assim tiveram

fechamento em torno de 20%, provavelmente devido em parte ao inicio do reparo e em

106

parte devido às tensões centrípetas que são comuns nas feridas abertas

5, 7

e que ainda

permanece em feridas fechadas.

Figura 5.26: Feridas excisionais em camundongos

Fotos lado C feridas recentes.

Fotos lado D feridas após 3 dias de cicatrização

(Feridas com cobertura)

lado C lado D

107

5. 7. 3 – Teste do mecanismo on-off

Figura 5.27: Testes on-off para verificação de aderência

do tecido na superfície dos materiais.

Os testes on-off realizados diretamente na ferida foram feitos e registrado como na

figura 5.27. O teste era simplesmente verificar a aderência acima da LCST e a não

aderência abaixo da LCST. O resultado indicou que todos os curativos colocados nos

camundongos não apresentaram aderência. Analisando as condições no momento da

retirada dos curativos, notou-se que havia uma incerteza da temperatura da pele do

camundongo, pois após a anestesia houve hipotermia no camundongo e

consequentemente houve queda temperatura da pele, registrada em 28°C que é abaixo

da LCST (32°C). Portanto houve a necessidade de garantir que a temperatura da pele se

sustentasse acima da LCST e o teste não foi conclusivo. Para solucionar este problema,

pode se manipular os grafts de P-N-IPAAm de maneira a abaixar a LCST do curativo.

108

Não se pode deixar de considerar que este teste foi realizado até o terceiro dia de

cicatrização, nestas condições, o tecido ainda não está em fase de proliferação plena,

portanto, é de se esperar que a aderência seja também restrita. Os cortes histológicos

indicaram que houve uma pequena reepitelização e isto tenha contribuído para que

facilitasse a retirada do curativo. Portanto há ainda a necessidade de se expandir os

testes para 7 e 14 dias de cicatrização.

Foi observado, também que o crescimento de pelos do animal pode interferir na

aderência do material à superfície da lesão, pois os pelos estariam levantando o

curativo. Há duas maneiras que poderiam resolver este problema: a primeira seria usar

camundongos hairless que não possuem pelos ou utilizar uma ferida maior para que os

pelos não interferissem tanto e o mecanismo ficaria também mais fácil de se observar.

5.7. 4 - Cortes histológicos

Os cortes histológicos que serão aqui apresentados são dos processos de cicatrização e

na figura 5.28 este representado o esquema dos cortes das lesões. Após a retirada do

tecido lesionado, fez-se um corte transversal, em seguida foram fixados em formalina,

onde permaneceu até serem colocados em parafina e cortados conforme o esquema

abaixo.

109

Figura 5.28: Esquema representativo do corte do tecido

Vista lateral indicando as bordas preservadas e o tecido em recuperação

À direita foto de corte histológico (A).

5.7.5 – Influencia dos polímeros no processo de reparo tecidual

A habilidade do corpo em substituir células lesionadas ou mortas e reparar tecidos após

inflamação é crítica à sobrevivência. Quando os agentes lesivos danificam as células e

os tecidos, o hospedeiro responde desencadeando uma série de eventos com o objetivo

de eliminar esses agentes, conter o dano e preparar as células sobreviventes para a

replicação. O reparo do tecido danificado por ressecção cirúrgica, ferimentos e diversos

tipos de lesão pode ser dividido em dois processos: regeneração e cicatrização. A

regeneração resulta na restituição dos tecidos perdidos; a cicatrização pode restaurar as

estruturas originais, porém envolve a deposição de colágeno e a formação de cicatriz.

Os ferimentos superficiais, como um ferimento cutâneo que danifica somente o epitélio,

sofrem reparo por regeneração epitelial. Os ferimentos cutâneos incisionais que

danificam a derme sofrem reparo através da formação de uma cicatriz de colágeno. A

regeneração requer uma arquitetura de tecido conjuntivo intacto. Ao contrário, a

cicatrização ocorre se a estrutura da matriz extracelular estiver danificada, causando

alterações na arquitetura tecidual.

128

Com o objetivo de investigar a contribuição dos polímeros no processo de reparo

tecidual, lesões na pele de camundongos Swiss foram feitas com o auxilio de um

Tecido preservado (borda)

Tecido

cicatricial

Borda

Tecido

cicatricial

110

vazador o qual removia uma área circular de tamanho padronizado da pele do dorso do

animal, em 2 áreas distintas. Em um grupo, a lesão foi deixada exposta (sem cobertura)

e em outros dois grupos usou-se como cobertura o poliuretano (poroso) sem graft e o

poliuretano graftizado com P-N-IPAAm. O processo cicatricial dessas lesões foi

observado durante o período de 3 dias após o qual os animais foram sacrificados e a

pele (lesão mais uma borda intacta) foi removida para estudo histológico. A pele normal

da região dorsal do camundongo é dividida em duas regiões, a epiderme e a derme. A

epiderme é constituída de células epiteliais de revestimento formando um epitélio

estratificado pavimentoso queratinizado, enquanto a derme é formada por tecido

conjuntivo onde se encontram vasos sangüíneos e linfáticos, nervos, folículo piloso e

glândulas sebáceas. Abaixo da derme observam-se tecidos adiposo e muscular Fig.5.29.

Figura 5.29 – Corte de pele normal de camundongo Swiss mostrando epiderme (E) com

queratina, derme (D) constituída por tecido conjuntivo (TC), com folículo piloso (fp), glândula

sebácea (gs) e tecidos adiposo (TA) e muscular (m). H&E. Aumento de 4x.

111

Nas lesões de pele sem cobertura observa-se extensa área de necrose superficial, com

presença de tecido de granulação logo abaixo. Esse tecido está constituído por um

conjuntivo frouxo com fibras muito finas, delicadas e separadas, vasos sangüíneos

neoformados e células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos e linfócitos) Fig.5.30A e

112

Figura 5.30A – Pele de camundongo mostrando área de lesão (L) e a borda intacta (b). Na

superfície da lesão observar área de necrose (n) Ferida sem cobertura. Coloração H&E.

113

Figura 5.30B – Pele de camundongo mostrando área de lesão (L) e a borda intacta (b). Ferida sem

cobertura. Na superfície da lesão observar área de necrose (n). Próximo à borda da lesão observa-

se área de tecido conjuntivo (TC) frouxo, com vasos sangüíneos (v) neoformados e muito

infiltrado inflamatório (setas) correspondendo ao tecido de granulação (tg) ou tecido cicatricial

jovem. B, C e D representam diferentes aumentos de A. Coloração H&E.

10x

40x 60x

114

Nas lesões de pele com cobertura de poliuretano graftizado com P-N-IPAAm observa-

se ausência de área de necrose superficial, presença de tecido de granulação constituído

por conjuntivo mais denso (fibras espessas) indicando um processo mais evoluído,

vasos sangüíneos e células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos e linfócitos)

Fig.5.31A e B.

Figura 5.31A.- Pele de camundongo mostrando área de lesão (L) e a borda intacta (b Ferida com

cobertura de PU com grafts. Coloração H&E.

115

Figura 5.31B.- Pele de camundongo mostrando área de lesão (L) e a borda intacta (b). Ferida

com cobertura de PU com grafts de P-N-IPAAm. Próximo à borda da lesão observa-se área de

tecido conjuntivo (TC) mais denso e infiltrado inflamatório (setas) correspondendo ao tecido de

granulação (tg) ou tecido cicatricial jovem. B, C e D representam diferentes aumentos de A.

Coloração H&E.

10x

116

Figura 5.32 – Pele de camundongo mostrando área de lesão (L) e a borda intacta (b) de ferida

com cobertura de poliuretano e sem graft. Na superfície da lesão observa-se área de necrose (n).

Próximo à borda da lesão há área de tecido conjuntivo (TC) denso. C e D representam diferentes

aumentos de A e B respectivamente. Coloração H&E.

117

Nas lesões de pele com cobertura de poliuretano sem graft observa-se área de necrose

superficial menos intensa em relação às lesões sem cobertura, presença de tecido de

granulação constituído por tecido conjuntivo com fibras mais espessas e densas, vasos

sangüíneos e menos células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos e linfócitos). O

processo de reparo nessa lesão apesar da presença de necrose encontra-se bem mais

evoluído do que o observado na lesão sem cobertura Fig.5.33.

As análises histológicas apesar de terem sido realizadas em amostras de feridas até o

terceiro dia de recuperação, já apontam que o processo de cicatrização é mais

organizado, tem menor processo inflamatório, menor necrose, menor contração e não

apresenta saliência na borda da ferida quando esta recebe uma cobertura.

As coberturas que possuem P-N-IPAAm graftizado na superfície do poliuretano,

apresentaram uma ligeira melhora no processo de cicatrização, promovendo

reepitelização e angiogênese. A temperatura corporal normal do camundongo varia de

35,2 a 37,9 °C, isto significa que o implante de P-N-IPAAm estava em um ambiente

com temperatura acima da LCST (nome da sigla) cujo valor é de 32°C, isso contribui

para um estado hidrofóbico do polímero. É sabido que esse estado favorece a adesão de

proteínas e células

11, 12, 28, 29, 30

. Isso, aliado a um baixo grau de toxidade em relação ao

poliuretano provavelmente tenha contribuído para um amadurecimento do tecido

conjuntivo e o crescimento de vasos gerando um processo mais avançado em torno do

P-N-IPAAm.

118

Capítulo 6 - Conclusão

O tratamento por luz ultravioleta se mostrou mais simples e eficiente que o tratamento

corona para alteração da superfície do poliuretano através da inserção de grupos polares.

Foi possível graftizar o poli (N-isopropilacrilamida) em superfícies de poliuretano

modificado por tratamentos corona e com radiação ultravioleta.

Foi demonstrada a viabilidade de se modular o grau de molhamento de superfícies de

PU através de processos de oxidação baseados em radiação UV ou processo corona e

através de enxertia de poli (N-isopropilacrilamida) na superfície do PU.

Foi detectada a transição LCST do P-N-IPAAm enxertado em substrato PU.

Foi demonstrada a possibilidade de se manipular o grau de molhamento de superfícies

de PU contendo cadeias enxertadas de poli (N-isopropilacrilamida) através da alteração

da temperatura.

A alteração da temperatura acima ou abaixo da temperatura de transição LCST do poli

(N-isopropilacrilamida) se mostrou adequada para viabilizar o mecanismo on-off e

assim permitir o controle sobre o processo in vitro de adsorção e dessorção de albumina.

Os testes de verificação do mecanismo on-off para três dias de cicatrização em feridas

de segunda intenção, não foram conclusivos, porque não havia certeza da temperatura,

no momento da retirada dos curativos.

As feridas com cobertura apresentam processos inflamatórios menos intensos e tecido

conjuntivo mais denso do que as feridas sem cobertura.

As feridas com cobertura com grafts apresentaram sinais de reepitalização e

angiogênese, mais intensos que as feridas com poliuretano sem grafts. .

119

Capítulo 7- Referências Bibliográficas

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