( PDF ) Degradação de patulina por composto bioativo obtido de levedura

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Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE

Campus de São José do Rio Preto - UNESP

Celli, Marcos Giovani Celli

Degradação de patulina por composto bioativo obtido de levedura /

Marcos Giovani Celli - São José do Rio Preto: [s.n.], 2010.

104 f. : 17. ; 30 cm.

Orientador: Crispin Humberto Garcia Cruz

Co-orientador: Maurício Boscolo

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas.

1. Tecnologia de alimentos. 2. Biodegradação. 3. Composto bioativo.

4. Patulina. 5. Levedos. 6.Detoxificação. 6. Saccharomyces cerevisiae.

I. Garcia Cruz, Crispin Humberto. II. Celli, Marcos Giovani

. III.

Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências

Exatas. IV. Título

CDU - 664

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Programa de Pós-Graduação Stricto sensu

Doutorado em Engenharia e Ciência de Alimentos

Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos

MARCOS GIOVANI CELLI

DEGRADAÇÃO DE PATULINA POR COMPOSTO BIOATIVO OBTIDO DE

LEVEDURA

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO

2010

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

CAMPUS DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS

EXATAS DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO

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MARCOS GIOVANI CELLI

DEGRADAÇÃO DE PATULINA POR COMPOSTO BIOATIVO OBTIDO DE

LEVEDURA

Tese apresentada para obtenção do título de Doutor

em Engenharia e Ciência e Tecnologia de

Alimentos, Área de Ciência de Alimentos junto ao

Programa de Pós Graduação em Engenharia e

Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências,

Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual

Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São

José do Rio Preto.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz

Livre Docente

Universidade Estadual Paulista

Orientador

Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho

Professor Doutor

Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Prof

. Dr

. Elisabete Yurie Sataque Ono

Professora Doutora

Universidade Estadual de Londrina

Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi

Professor Doutor

Universidade Estadual Paulista

Prof

. Dr

. Eleni Gomes

Livre Docente

Universidade Estadual Paulista

São José do Rio Preto, 02 de fevereiro de 2010.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela minha vida, pelas oportunidades oferecidas;

Ao meu orientador Professor Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz, pela incansável orientação,

dedicação, incentivo, paciência e amizade, sem os quais este trabalho não seria possível;

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Mauricio Boscolo, pela orientação, atenção e apoio no

desenvolvimento deste trabalho, e utilização do HPLC no laboratório do Departamento de Química e

Ciências Ambientais;

Aos membros titulares Dr. Alexandre Rodrigo Coelho, Dra. Elisabete Yurie Sataque Ono, Dr.

Vanildo Luiz Del Bianchi, Dra. Eleni Gomes e suplentes da banca examinadora, pelas valiosas sugestões,

que contribuíram para o aprimoramento desta Tese;

À Universidade Estadual Paulista, e aos professores do Departamento de Engenharia e

Tecnologia de Alimentos, pelos preciosos ensinamentos durante o desenvolvimento do Curso de Doutorado,

onde pude contar com a colaboração de todos;

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pela Bolsa de

Doutorado;

Ao Dr. Alexandre Rodrigo Coelho pelos preciosos ensinamentos durante o desenvolvimento deste

trabalho e, sobretudo pela amizade, eternamente grato;

Aos Professores Dr. Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez e Dra. Eleni Gomes pela colaboração,

apoio no desenvolvimento deste trabalho e utilização do laboratório para análises de eletroforese;

À Dra. Patrícia Peres Polizelli e às Doutorandas Rejane Yuriko Ouchi e Natália Martin pelo

auxílio nas análises de eletroforese;

À Professora Dra. Elisa Yoko Hirooka pela colaboração, apoio no desenvolvimento deste trabalho

e utilização do laboratório no Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos, UEL;

À técnica Tânia Maria Vinturim Gonçalves do Departamento de Engenharia e Tecnologia de

Alimentos por sempre me ajudar quando precisava;

Às amigas do Curso de Pós-Graduação Adriana, Aline, Catharina, Crislene, Daniele, Fernanda,

Gisele, Juliana, Luana, Michelle e Vidiany pela alegria, companheirismo e amizade;

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho;

Às amigas Carmen Ligia, Caroline Calliari e aos irmãos Angela e Rodrigo pelo apoio constante

nos momentos mais difíceis, muito obrigado;

Aos meus pais Norberto e Mary Dalva, por todo o carinho, exemplo, amor e esforços realizados

para a minha formação profissional.

RESUMO

A patulina, toxina com potencial carcinogênico, mutagênico e teratogênico produzida

por Penicillium spp., Aspergillus spp. e Byssoclamys spp., pode ser encontrada em maçãs,

sucos comerciais e outros produtos não fermentados constituindo-se num problema neste setor

agroindustrial. Em bebidas fermentadas, porém, não é detectável mesmo que a matéria-prima

esteja visivelmente contaminada. O presente trabalho visou quantificar a patulina tanto no

tecido deteriorado de maçãs in natura quanto na parte sadia ao redor da lesão, monitorar a

degradação no processo fermentativo típico utilizando Saccharomyces cerevisiae e degradar a

toxina presente em produtos derivados de maçã pela ação do composto bioativo produzido

pela levedura. A micotoxina foi quantificada por CLAE em sistema isocrático de fase reversa

e detector UV a 275 nm. O grau de recuperação alcançado foi de 86,24% e os limites de

detecção e de quantificação foram 4,3 µg/L e 8,6 µg/L, respectivamente. Foram analisados 35

frutos de maçã in natura cultivar Fuji, tendo sido constatada a presença de patulina em 32

amostras, em concentrações que variaram de 1,01 a 120,4 mg/Kg de tecido na porção

deteriorada e de 0,02 a 5,02 mg/Kg de tecido, na sadia. Para avaliação da cinética de

degradação de patulina, suco de maçã contendo 5,0 µg de patulina/mL foi inoculado com

0,25g de células de levedura seca ativa/L, sendo observada uma maior redução no teor de

toxina de 81,6% nas primeiras 48 horas de fermentação. Este tempo foi utilizado como

parâmetro para obtenção do extrato bruto contendo o composto bioativo capaz de degradar a

toxina. Na cinética de degradação de patulina pelo extrato bruto estéril inoculado com 3,0 µg

de patulina/mL, foi obtida a maior taxa de degradação (50%) da toxina nas primeiras 48

horas, seguido de uma degradação mais lenta de apenas 5,7% nas 48 horas restantes de

análise. Na cinética de degradação de patulina pelo extrato dialisado inoculado com 3,0 µg de

patulina/mL, foi obtida total eliminação da toxina em 24 horas, sendo que no controle a

concentração de toxina permaneceu em 98,3% neste mesmo tempo. A diálise empregando

membrana dialisadora com limite de exclusão de 8000-10000 Da reteve o composto bioativo.

Na cinética de degradação de patulina pelo extrato ultrafiltrado inoculado com 3,0 µg de

patulina/mL, foi obtida redução de 51% em 16 horas de análise, 74% em 24 horas e níveis não

detectáveis em 32 horas. No controle a concentração de toxina permaneceu em 96,6% neste

mesmo tempo. A ultrafiltração empregando membrana de celulose regenerada com limite de

exclusão de 10000 Da reteve o composto bioativo. Para caracterização bioquímica do

composto bioativo, foi estimada sua massa molecular por meio de ensaios de eletroforese

após sua separação por eletroforese não desnaturante, ponto isoelétrico por eletroforese 2D,

presença de carboidratos, estabilidade térmica e pH e temperatura de máxima atividade. A

massa molecular estimada para este composto foi de 22,07 kDa e ponto isoelétrico inferior a

3. Apresentou baixa estabilidade térmica, perdendo sua atividade após tratamento a 80°C por

20 minutos, que pode ser devido a ausência de glicosilações, as quais não foram detectáveis

pela metodologia utilizada (Método fenol sulfúrico). O pH e temperatura de máxima atividade

degradadora encontrados estavam entre 4 - 5 e 30 - 35°C, respectivamente. O composto

bioativo demonstrou eficiente degradação de patulina podendo ser utilizado na degradação da

toxina pela adição deste em produtos derivados de maçã, antes ou após sua pasteurização.

Palavras-chave: patulina, maçã, fermentado, Saccharomyces cerevisiae, detoxificação.

ABSTRACT

Patulin, a toxin with potential carcinogenic, mutagenic and teratogenic effects produced by

Penicillium sp., Aspergillus sp. and Byssoclamys sp., can be found in apples, juices and other

commercial non-fermented products making up a problem in the agribusiness sector.

However, patulin is not detectable in fermented beverages even if the raw material is visibly

contaminated. This paper aimed to quantify patulin in both the tissue deteriorated fresh apples

and at the sound around the lesion, to monitor the degradation in typical fermentation process

using Saccharomyces cerevisiae and degrade the toxin present in products derived from apple

by the action of the bioactive compound produced by yeast. The mycotoxin was quantified by

HPLC in isocratic system of reversed phase and UV detection at 275 nm. The degree of

recovery achieved was 86.24% and the limits of detection and quantification were 4.3 µg/L

and 8.6 µg/L, respectively. Thirty five fresh apple fruits Fuji were analyzed and it was, found

the presence of patulin in 32 samples in concentrations that ranged from 1.01 to 120,4 mg/Kg

of tissue in the damaged portion and 0.02 to 5, 02 mg/Kg of tissue in sound. To evaluate the

kinetics of degradation of patulina, apple juice with 5.0 µg patulin/mL was inoculated with

0.25 g of cells active dry yeast/L, being observed a greater reduction in the toxin content of

81.6% in the first 48 hours of fermentation. This time was used as a parameter to obtain the

crude extracts containing bioactive compound capable of degrading the toxin. The kinetics of

patulin degradation by the crude extract inoculated with 3.0 µg patulin/mL showed the highest

rate of the toxin degradation (50%) in the first 48 hours, followed by only 5.7% degradation

after the remaining 48 hours of analysis. The kinetics of degradation of patulin by the extract

dialysate inoculated with 3.0 µg patulin/mL showed total elimination of the toxin after 24

hours. Dialysis using a dialyzing membrane with a cutoff of 8000-10000 Da retained the

bioactive compound. The kinetics of degradation of patulin by the extract ultrafiltered

inoculated with 3.0 µg patulin/mL, showed a reduction of 51% in 16 hours of analysis, 74% at

24 hours and undetectable levels in 32 hours. In the control treatment the concentration of

toxin remained at 96.6% in the same time. The ultrafiltration using regenerated cellulose

membrane with a cutoff of 10000 Da retained the bioactive compound. For biochemical

characterization of the bioactive compound it was estimated by its molecular tests

electrophoresis after their separation by non-denaturing electrophoresis, isoelectric point in

2D electrophoresis, the presence of carbohydrates, thermal stability, pH and temperature of

maximum activity. The molecular weight estimated for this compound was 22.07 kDa and

possessed an isoelectric point less than 3. Bioactive compound showed low thermal stability,

losing its activity after treatment at 80°C for 20 minutes, which may be due to lack of

glicosilations, which were not detectable by the method (phenol-sulfuric acid method). The

pH and temperature of maximum degrading activity were found between 4 - 5 and 30 - 35°C,

respectively. The bioactive compound showed efficient degradation of patulin, indicating the

it can be used in the degradation of the toxin by the addition of products derived from apple,

before or after the pasteurization.

Keywords: patulin, apples, fermentation, Saccharomyces cerevisiae, detoxification.

LISTA DE SIGLAS

ABMP - Associação Brasileira dos Produtores de Maçã

AOAC - Association of Official Analytical Chemists

CCD - Cromatografia de Camada Delgada

CG - Cromatografia Gasosa

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

EM - Espectrometria de Massa

FAO - Food and Agriculture Organization

FDA - Food and Drug Administration

FSA - Food Standards Agence

IBRAF - Instituto Brasileiro de Frutas

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

MAFF - Ministry of Agriculture, Fisheries and Food

MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MECC - Cromatografia Eletrocinética Capilar Micelar

NMWL - Nominal Molecular Weight Limit

OMS - Organização Mundial da Saúde

PAGE – Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Eletroforese em gel de poliacrilamida)

pI - Ponto Isoelétrico

Rf - Retention Factor (fator de retenção)

SDS - Dodecil Sulfato de Sódio

UV - Ultravioleta

YES - Yeast Extract Saccharose

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Países que possuem legislação para patulina e o limite máximo permitido

Tabela 02. Ocorrência de patulina em sucos de maçã e derivados em alguns países

Tabela 03. Taxa de recuperação de patulina adicionada em suco de maçã

Tabela 04. Concentração de patulina em podridões e áreas não afetadas de maçãs

Tabela 05. Determinação da cinética de degradação de patulina em suco de maçã

inoculado com Saccharomyces cerevisiae

Tabela 06. Determinação da cinética de degradação de patulina no extrato bruto

estéril

Tabela 07. Determinação da cinética de degradação de patulina no extrato dialisado

estéril quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com

detector UV

Tabela 08. Determinação da cinética de degradação de patulina no extrato

ultrafiltrado estéril quantificada por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência com detector UV

Tabela 09. Determinação da cinética de degradação de patulina nos extratos bruto,

dialisado e ultrafiltrado estéreis quantificada por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência com detector UV

Tabela 10. Atividade degradadora de patulina pelos compostos protéicos separados

por eletroforese quantificada por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência com detector UV

Tabela 11. Determinação do pH de máxima atividade do composto bioativo presente

no ultrafiltrado estéril em 24hs, quantificada por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência com detector UV

Tabela 12. Determinação da temperatura de máxima atividade do composto bioativo

presente no ultrafiltrado estéril em 16hs, quantificada por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência com detector UV 88

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 – Estrutura molecular da patulina

Figura 02 – Metabolismo secundário e formação da patulina

Figura 03 – Via de formação da patulina Produtos da degradação da patulina.

Figura 04 – Produtos da degradação da patulina

Figura 05A – Curva de calibração de patulina

Figura 05B – Cromatograma de uma amostra

Figura 06 – Curvas de tendências de patulina nas maçãs deterioradas

Figura 07 – Cinética de degradação de patulina por S. cerevisiae

Figura 08 – Cinética de degradação de patulina no extrato bruto estéril

Figura 09 – Cinética de degradação de patulina no extrato dialisado estéril

Figura 10 – Cinética de degradação de patulina no extrato ultrafiltrado estéril

Figura 11 – Cinética de degradação de patulina nos extratos bruto, dialisado e

ultrafiltrado estéreis

Figura12 – Bandas protéicas visualizadas em gel de poliacrilamida

Figura 13– Atividade degradadora de patulina dos compostos protéicos separados

por eletroforese

Figura 14 – Eletroforese SDS-PAGE para avaliação do composto bioativo e

determinação de sua massa molecular.

Figura 15 – Curva padrão obtida pela plotagem do log da massa molecular dos

padrões versus Rf da migração relativa de cada padrão

Figura 16 – Degradação de patulina pelo composto bioativo presente no extrato

ultrafiltrado estéril em pHs 2, 3, 4, 5 e 6

Figura 17 – Degradação de patulina pelo composto bioativo presente no extrato

ultrafiltrado estéril à diferentes temperaturas. 88

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

REVISÃO DA LITERATURA

2.1 PRODUÇÃO DE FRUTAS NO PAÍS 17

2.1.1 Maçã 17

2.1.1.1

Colheita e armazenagem 18

2.1.1.2

Produção de maçãs no Brasil e no Mundo 19

2.1.2 Suco de maçã 19

2.1.2.1

Produção e consumo de suco de maçã 20

2.1.2.2

Qualidade e legislação de suco de maçã 21

2.1.3 Propriedades estruturais e funcionais de patulina 22

2.1.3.1

Principais microrganismos produtores de patulina 27

2.1.3.2

Controle de fungos 32

2.1.3.3

Incidência de patulina em alimentos 34

2.1.3.4

Estratégias para redução da contaminação 42

2.1.3.5

Degradação de patulina 46

2.1.3.6

Detecção e Quantificação de Patulina 50

OBJETIVO

3.1 OBJETIVO GERAL 54

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 54

MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MICRORGANISMOS 55

4.2 PATULINA PADRÃO E REAGENTES QUÍMICOS 55

4.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO DE TRABALHO 55

4.4 PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA 56

4.5 PRODUÇÃO DE PATULINA 56

4.6 EXTRAÇÃO DE PATULINA DOS FRUTOS CONTAMINADOS 57

4.7 EXTRAÇÃO DE PATULINA DE SUCOS FERMENTADOS 57

4.8 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PATULINA 58

4.9 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA 58

4.10 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO CONTENDO O COMPOSTO

BIOATIVO 59

4.11 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

UTILIZANDO EXTRATO BRUTO 60

4.12 OBTENÇÃO DO EXTRATO DIALISADO CONTENDO O COMPOSTO

BIOATIVO 60

4.13 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

UTILIZANDO O EXTRATO DIALISADO 61

4.14 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE COMPOSTO BIOATIVO POR

ULTRAFILTRAÇÃO 61

4.15 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

UTILIZANDO O EXTRATO ULTRAFILTRADO 62

4.16 ELETROFORESE DO EXTRATO ULTRAFILTRADO EM CONDIÇÕES

DESNATURANTES E NÃO DESNATURANTES 62

4.16.1 Rastreamento e isolamento por eletroforese do composto bioativo 63

4.16.2 Determinação do Rf (fator de retenção) em condições desnaturantes 63

4.17 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO COMPOSTO BIOATIVO 64

4.17.1 Eletroforese em SDS-page para avaliação da pureza do composto bioativo e

determinação da massa molecular 64

4.17.2 Focalização isoelétrica e determinação do ponto isoelétrico (eletroforese 2D)

do composto bioativo 64

4.17.3 pH de máxima atividade do composto bioativo 65

4.17.4 Temperatura de máxima atividade degradadora do composto bioativo 65

4.17.5 Estabilidade térmica do composto bioativo a 80ºC 66

4.17.6 Determinação de carboidratos 66

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE DA PATULINA 67

5.2 PRODUÇÃO DE PATULINA 68

5.3 QUANTIFICAÇÃO DE PATULINA EM MAÇÃS CONTAMINADAS 69

5.4 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

PELO PROCESSO FERMENTATIVO 72

5.5 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

UTILIZANDO O EXTRATO BRUTO ESTÉRIL 74

5.6 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

UTILIZANDO O EXTRATO DIALISADO ESTÉRIL 76

5.7 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

UTILIZANDO O EXTRATO ULTRAFILTRADO ESTÉRIL 79

5.8 RASTREAMENTO DO COMPOSTO BIOATIVO POR ELETROFORESE 82

5.9 AVALIAÇÃO DA PUREZA DO COMPOSTO BIOATIVO E

DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR 84

5.10 FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA E DETERMINAÇÃO DO PONTO

ISOELÉTRICO DO COMPOSTO BIOATIVO 85

5.11 pH DE MÁXIMA ATIVIDADE DO COMPOSTO BIOATIVO 85

5.12 TEMPERATURA DE MÁXIMA ATIVIDADE DEGRADADORA DO

COMPOSTO BIOATIVO 87

5.13 PRESENÇA DE CARBOIDRATOS 89

5.14 ESTABILIDADE TÉRMICA DO COMPOSTO BIOATIVO A 80ºC 89

CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS

1. INTRODUÇÃO

A produção de fruta brasileira superou os 43,7 milhões de toneladas em 2007,

classificando o país entre os quatro maiores produtores mundiais juntamente com a China,

Índia e EUA. Do total produzido, 45% destinou-se ao consumo in natura e 53% à indústria

processadora. A maçã (Malus domestica L.) foi a segunda fruta mais exportada no ano de

2007 e o seu consumo em forma in natura ou processada é amplamente difundido, obtendo-se

os mais variados produtos derivados, seja suco, polpa, purê, produtos fermentados,

desidratados, conservas e doces, com grande aceitabilidade pelos consumidores.

Em países com tradição no processamento de maçãs, as fábricas são supridas com

frutas de variedades industriais, usualmente rústicas e sem muita necessidade de manejo,

colhidas e transportadas para as unidades de processamento onde o processo de seleção é

menos rigoroso do que aquele utilizado no caso de frutas de mesa. Nos países que começam a

processar maçãs, como o caso do Brasil, a matéria-prima disponível é a desqualificada para

uso in natura, por defeitos diversos, como picadas de pássaros, injúrias mecânicas, cicatrizes

na epiderme, má formação do fruto e distribuição desuniforme da coloração.

Não obstante, a matéria-prima deve estar livre de deterioração por fungos

filamentosos, responsáveis por perdas substanciais na indústria de processamento. Na

categoria, Penicillium spp. representa o principal agente deteriorante, com destaque a P.

expansum, que além de colonizar o fruto e causar dano à polpa, produz a patulina, micotoxina

de caráter teratogênico e cancerígeno em embriões de galinha e camundongos.

Embora não exista nenhum dado toxicológico ou epidemiológico em seres humanos,

a patulina vem sendo empregada como indicador de qualidade nos frutos e produtos de maçã.

Em 2001 o Food and Drug Administration-FDA publicou um documento, “The Draf

Guidance Document of FDA Components and Industry on Apple Juice and Apple Juice

Products”, que estabelece o limite de 50 µg/L para sucos de maçã e derivados, embora a

União Européia tenha estabelecido 25 µg/Kg em compotas e purês e 10 µg/Kg em produtos

infantis.

A contaminação de suco de maçã por patulina ocorre principalmente em períodos de

baixa produção ou entressafras quando a matéria-prima é escassa. Com o intuito de evitar

maiores perdas na produção de suco, maçãs deterioradas são também utilizadas no

processamento, aumentando o risco de incidência da micotoxina em produtos derivados.

Entretanto, este problema é minimizado em derivados fermentados, cujas leveduras utilizadas

no processo fermentativo têm poder detoxificante, reduzindo e/ou eliminando a contaminação

presente na matéria-prima.

A degradação da toxina por leveduras está associada a um mecanismo de defesa do

microrganismo, relacionado à síntese de proteínas. O emprego de leveduras e seus

metabólitos no biocontrole durante o armazenamento dos frutos tem apresentado excelentes

resultados contra o desenvolvimento e germinação de esporos de fungos deteriorantes.

Sendo assim, a investigação de compostos bioativos de leveduras sobre possível

efeito degradador de micotoxinas associado ao biocontrole de caráter inócuo, compatíveis

com a aplicação prática, seria favorável para garantir a qualidade e segurança de produtos

oriundos da fruticultura.

A necessidade de aprofundar o conhecimento de compostos bioativos detoxificantes

produzidos por leveduras, com ênfase em purificação, caracterização e estabilidade,

possibilitará direcionar com eficiência racional, o controle de micotoxinas em alimentos,

melhorando a qualidade higiênico-sanitária do produto.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 PRODUÇÃO DE FRUTAS NO PAÍS

A produção de frutas no Brasil cresceu 4,5% em 2008, estimulada por um expressivo

consumo interno, pela demanda crescente de agroindústrias e pelas vendas externas. Os

últimos dados informados pelo Instituto Brasileiro de Frutas (INSTITUTO BRASILEIRO DE

FRUTAS-IBRAF, 2008) são referentes ao ano de 2007, quando o Brasil produziu mais de

43,7 milhões de toneladas de frutas, classificando o país como o terceiro maior produtor

mundial, atrás da China e da Índia, é o 15º maior exportador e ocupa o 8° lugar em eficiência

de produção (FOOD AGRICULTURE ORGANIZATION-FAO, 2008; IBRAF, 2008). Do

total produzido, 45% das frutas destina-se ao consumo nacional in natura, 53% à indústria

processadora e apenas 2% à exportação de frutas frescas, evidenciando a necessidade de

incentivo para agilizar maior inserção no mercado internacional (FAO, 2008). As exportações

brasileiras de frutas in natura geraram divisas de 430 milhões de dólares em 2007, sendo que

cerca de 65 milhões foram decorrentes da maçã e seus derivados com crescimento de 100%

nas exportações da fruta in natura, passando de 53 mil toneladas em 2006 para 106 mil

toneladas em 2007 (IBRAF, 2008).

2.1.1 Maçã

Atualmente, há diversas espécies de macieiras como, por exemplo, a Malus sylvestris

originária da Europa e a Malus prinifolia originária do Cáucaso e de parte da Rússia, mas não

se sabe ao certo quando e onde se originou a macieira e qual ou quais foram as espécies

silvestres que deram origem à maçã contemporânea, cujas variedades são atualmente

conhecidas. Os frutos da macieira podem ser distinguidos e agrupados por suas variações de

sabor, tamanho, forma, aparência, consistência da polpa e casca, e por suas distintas

utilidades. De uma forma geral, as maçãs podem ser classificadas em três tipos: de mesa, de

cozinhar ou próprias à fabricação de sidra ou de vinagre (TODA FRUTA, 2008). Uma mesma

árvore pode fornecer frutos com diferentes aproveitamentos, de acordo com sua classificação.

Pela sua capacidade de produzir fibras de boa qualidade e pelo seu alto teor de potássio, a

maçã é uma fruta indicada para manutenção da saúde, prevenindo doenças cardíacas e

excesso de colesterol no sangue, e para dietas de emagrecimento (TODA FRUTA, 2008).

2.1.1.1 Colheita e armazenagem

As macieiras se desenvolvem bem em clima temperado, sendo favorável e essencial

para uma boa produtividade, o que limita as regiões de plantio, colocando o Sul do Brasil em

posição privilegiada em relação às demais regiões (SIMÃO, 1998).

A colheita é feita de acordo com os critérios de qualidade relacionados as

características que se desenvolvem pós-colheita, durante a maturação dos frutos (TU;

NICOLAI; DE BAERDEMAEKER, 2000).

Frutos destinados à comercialização imediata e à exportação são aqueles que

apresentam melhor qualidade em termos de aparência, como coloração uniforme, forma

característica, ausência de podridões e danos mecânicos ou machucados. Frutos com maior

tamanho, mais aromáticos, com elevado teor de sólidos solúveis e com coloração mais intensa

são obtidos com colheita tardia (ARGENTA, 1993; WATKINS et al., 1993).

Os frutos que não se destinam imediatamente ao mercado consumidor são

armazenados em câmaras frigoríficas que contribuem para diminuição do seu metabolismo,

conservação das características físico-químicas e diminuição no crescimento de fungos. Esta

armazenagem pode ser associada à atmosfera controlada onde baixas concentrações de

oxigênio e dióxido de carbono (1 e 0,5% respectivamente) mantêm melhor a qualidade da

maçã, proporcionando maior retenção da firmeza da polpa e menor incidência de

degenerescência na temperatura de -0,5°C (BRACKMANN; MAZARO; LUNARDI, 1998).

2.1.1.2 Produção de maçãs no Brasil e no Mundo

A extensão territorial e a diversidade climática do Brasil permitem o cultivo das mais

variadas frutas, porém, o fator determinante no plantio das macieiras numa região depende do

período de baixa temperatura, necessário para o repouso vegetativo e conseqüente quebra de

dormência (FUNDAÇÃO CARGILL, 1983). No Brasil, safra 2007/08, foram produzidas 1,1

milhões de toneladas de maçã (IBRAF, 2009). As exportações de maçãs in natura chegaram a

112 mil toneladas e na forma de suco de maçã a 33 mil toneladas em 2008 (IBRAF, 2009). A

Região Sul do país apresenta o clima mais propício para produção de maçã, sendo responsável

por 98% da produção nacional, com aproximadamente 4% provenientes do Estado do Paraná

(PR), 42% do Rio Grande do Sul (RS) e 54% de Santa Catarina (SC) (INSTITUTO

BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA-IBGE, 2007; MINISTÉRIO DA

AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO-MAPA, 2007). As cultivares

predominantes de maçã são Gala e Fuji, com representatividade de 46 e 45%,

respectivamente, em relação à produção total (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DOS

PRODUTORES DE MAÇÃ-ABPM, 2004).

No ano de 2000, o Brasil exportou mais de 60 mil toneladas de maçã para a Europa e

está atingindo auto-suficiência na suplementação do mercado interno, recebendo destaque

entre os frutos exportados, devido à vantagem na diferença de periodicidade em relação ao

Hemisfério Norte (IBRAF, 2005). A safra nacional de maçã 06/07 atingiu 1113,8 mil

toneladas, indicando aumento de 31,2% em comparação com os dados da produção anterior

(produção de 849 mil toneladas) (IBGE, 2007).

2.1.2 Suco de maçã

O suco de maçã é o produto extraído da fruta por moagem ou prensagem (pressão),

passando por um processamento de clarificação, adição de antioxidante, desaeração,

pasteurização e envase, sem adição de açúcar, adoçante ou conservantes. O produto final se

apresenta como líquido límpido, claro e brilhante (KOZLOWSKA et al., 2003; WOSIACKI

et al., 2002). O suco também pode receber adição de polpa para melhorar sua consistência ou

adição de açúcar para corrigir a doçura, sendo então chamado de néctar de maçã.

2.1.2.1 Produção e consumo de suco de maçã

Como acontece com a maioria das produções agrícolas, existe uma fração de safra de

maçã que acaba não sendo comercializada no mercado in natura, que pode chegar a 30% da

produção nacional, sendo destinado à industrialização (WOSIACKI; NOGUEIRA; SILVA,

2000).

A indústria consumiu 18,9% da produção nacional de maçãs na safra 01/02, 81,1%

destinado ao comércio da fruta in natura, sendo 7,6% destes para exportação (ABPM, 2005).

Com o aumento da produção nacional, aumentaram as exportações da fruta in natura e a

venda para as fábricas de suco (WOSIACKI et al., 2002). A maior parte da produção nacional

de suco concentrado de maçã destina-se à exportação, apresentando grande concorrência com

a Argentina e Chile, países com tradição no processamento de maçãs e grandes produtores

mundiais (PRADO, 2000).

No Brasil, o comércio interno de suco de fruta é pequeno, em torno de 5 a 7 litros

anuais por habitante, decorrente do alto preço, falta de divulgação, incentivo, investimentos e

de disponibilidade de variedades. A produção e comercialização de suco no Brasil é

insignificante quando comparado com a Europa e os Estados Unidos, onde o consumo de

sucos de fruta chega a 30 litros anuais por habitante, destacando-se o suco de maçã como o

mais popular e segundo suco mais consumido no mundo (GALCIA-CLOSAS et al., 2004;

IBRAF, 2005).

2.1.2.2 Qualidade e legislação de suco de maçã

O Ministério da Agricultura define o suco de maçã como sendo a bebida não

fermentada e não diluída, obtida da parte comestível da maçã (Malus domestica Borkh) por

processo tecnológico adequado devendo obedecer aos Padrões de Identidade e Qualidade,

fixados para suco de fruta (MAPA, 2000).

Pelo regulamento técnico para fixação dos padrões de identidade e qualidade para

suco de maçã, deverá obedecer as características e composição. A cor deve ser translúcida, o

aroma próprio, sólidos solúveis num mínimo de 10,5°Brix (20°C), acidez total acima de

0,15g/100g expressa em ácido málico, acidez volátil no máximo de 0,04g/100g expressa em

ácido acético e açúcares totais naturais do fruto até 13,5g/100g (BRASIL, 2000).

Alguns países da Europa e os EUA também estabelecem níveis máximos para

conteúdo de patulina em derivados de maçã. A Organização Mundial da Saúde (OMS)

recomenda concentrações inferiores à 50 µg/L e, em 2001, o Food and Drug Administration

(FDA) publicou um documento, “The Draf Guidance Document of FDA Components and

Industry on Apple Juice and Apple Juice Products”, que estabelece o limite de 50 µg/L para

sucos de maçã e derivados (RICHARD et al., 2003). A União Européia adotou recentemente

este mesmo nível máximo e também 25 µg/Kg em produtos sólidos incluindo compota e purê

de maça e ainda o nível máximo permitido de 10 µg/Kg é proposto para produtos de maçã

destinados a crianças (FONSECA, 2008).

Uma das principais preocupações em relação à contaminação do suco de maçã com a

patulina é o fato de que o Brasil exporta este produto para países que possuem limites

estabelecidos por legislação para esta micotoxina em sucos (MELLO, 2004).

Na Tabela 01 observa-se que os países que tem legislação seguem a recomendação

da OMS e da FDA de no máximo 50 µg/L de patulina em suco de maçã.

Tabela 01. Países que possuem legislação para patulina e o limite máximo permitido.

País Tipo de alimento

Limite (µg/L ou µg/Kg)

Alemanha Suco de maçã 50

Áustria Suco de frutas 50

Finlândia Todos os alimentos 50

França Suco de maçã e produtos derivados 50

Grécia Suco de maçã e produtos de maçã 50

Israel Suco de maçã 50

Itália Suco de frutas 50

Noruega Suco de maçã concentrado 50

República Tcheca Todos os alimentos

Alimentos para crianças

Alimentos infantis

Romênia Todos os alimentos

Rações

Suécia Suco de frutas 50

Suíça Suco de frutas 50

Uruguai Suco de frutas 50

Fonte: (FONSECA, 2008).

2.1.3 Propriedades estruturais e funcionais de patulina

A patulina, 4hidroxi-4furo[3,2-c]pirano(6H)-1 (Figura 01), uma micotoxina termo-

resistente da classe hidroxifuropiranona e também chamada clavicina, claviformina ou

expansina, apresenta fórmula empírica C

e sua massa molecular é de 154,12 Da. Pode

ser produzida como metabólito secundário por várias espécies de fungos para inibir o

crescimento de outros microrganismos. A patulina foi isolada pela primeira vez de

Penicillium claviforme, nomeada claviformina, mas em razão de seu freqüente isolamento

partindo de Penicillium patulum, hoje se chama patulina. Achava-se que era um antibiótico,

mas pelos seus efeitos tóxicos em animais, foi considerada uma toxina. Apresenta estabilidade

em ácidos diluídos e é resistente à temperatura de 125°C na faixa de pH entre 3,5 e 5,5,

ocorrendo o inverso em soluções alcalinas e compostos sulfurosos representados por

metabissulfito e radicais sulfidrilas, quando diminui a sua atividade biológica (ENGEL;

TEUBER, 1984; GONÇALEZ; PINTO; FELICIO, 2001; SCUSSEL, 1998). Sua atividade

carcinogênica é atribuída à insaturação α, β, junto com uma dupla ligação conjugada externa,

unida na posição 4 do anel lactona. Apresenta absorção UV máxima de 256,5 nm e

solubilidade em água e solventes orgânicos comuns, exceto éter de petróleo (MAJERUS;

KAPP, 2002; MOAKE; PADILLA-ZAKOUR; WOROBO, 2005; RYCHLIK;

SCHIEBERLE, 2001).

Figura 01 – Estrutura molecular da patulina (MOSS, 2008).

Formada pela via das policetidas (Figura 02), a patulina causa efeitos tóxicos em

animais, de caráter teratogênico e cancerígeno em camundongos, além de lesões pulmonares,

hepáticas e renais (GÖKMEN; ACAR, 1998 [01]; RICHARD et al., 2003), efeitos

gastrointestinais e neurotóxicos (HOPKINS, 1993) e imunotóxicos (SHARMA, 1993). A dose

de letalidade - DL

para camundongos varia de 5 a 30 mg/Kg de peso corpóreo

(BOONZAAIJER; BODELDIJK; VAN OSENBRUGGEN, 2005). Segundo pesquisadores, a

dupla ligação presente na estrutura da patulina interage com os ácidos nucléicos, afetando a

transcrição gênica e conseqüentemente a síntese de biomoléculas (ARAFAT; MUSA, 1995;

HATEZ; GAYE, 1978; MIURA; HASUMI; ENDO, 1993; MOULE; HATEY, 1977), também

ocasiona o rompimento da membrana do protoplasma (MAHFOUD et al., 2002; RILEY;

SHOWKER, 1991) e inibição da produção de interferon (WICHMANN;

HERBARTH;

LEHMANN

, 2002). O resultado destes estudos é, como um todo, inconclusivo em humanos,

mas sugere que sintomas agudos pelo consumo de patulina podem incluir agitação,

convulsões, congestão pulmonar, edema, ulceração, hiperemia, distensão gastrointestinal,

hemorragia intestinal, degeneração de células epiteliais, inflamação intestinal, vômitos e

danos nos rins (MAHFOUD et al., 2002; MCKINLEY; CARLTON; BOON, 1982). Após

ingestão, a patulina é rapidamente excretada (cerca de 87%), sendo 49% nas fezes, 36% na

urina e 1 a 2% pela via respiratória na forma de dióxido de carbono (MOSS, 2008).

Figura 02 – Metabolismo secundário e formação da patulina. (GRIFFIN, 1993)

(Arte gráfica: Dra. Elisa Hirooka).

Ác. 6 Metilsalicílico

Ác. orselínico

Ác. Penicílico

Aflatoxina

Citrinina

Esterigmatocistina

Griseofulvina

Luteoskirina

Ocratoxina

PATULINA

Versicolorinas

Zearalenona

Succinato

Citrato

Aconitato

Hexose

PO4

Triose PO4

Ác. P. Glicérico

PEP

PYR Ác. graxos

Isoprenóides

Mevalonato

Policetida

Oxaloacetato

ACETIL Co

Ceto Glutamato

Patulina

A produção de patulina ocorre quando a taxa de crescimento diminui em virtude das

limitações do consumo de nitrogênio (GROOTWASSINK; GAUCHER, 1980). A biossíntese

de patulina é bem compreendida e envolve uma série de condensações e reações de

oxiredução, muitas, se não todas, catalisadas por enzimas. Sua síntese é iniciada com uma

unidade de acetil-Coenzima A e três unidades de malonil-Coenzima A, sendo condensados em

ácido 6-metilsalicilico (6-MAS) pela ação da enzima ácido 6-metilsalicilico sintetase (6-MAS

sintetase). A próxima etapa envolve a conversão de 6-MAS em m-cresol pela atividade da 6-

MAS descarboxilase. M-cresol é convertido em álcool m-hidroxibenzil através da m-cresol

hidrolase. O próximo passo é a conversão do álcool m-hidroxibenzil a gentisaldeido pela

enzima álcool m-hidroxibenzil desidrogenase, tendo como intermediário de reação o m-

hidroxibenzaldeido ou o álcool gentisil. Uma vez formado o gentisaldeido, é convertido para

isopoxidona, filostina, neopatilina, E-ascladiol e finalmente para patulina (Figura 03)

(GRIFFIN, 1993).

Figura 03 – Via de formação da patulina

1 ACETIL Co-A

3 MALONIL Co-A

redução

descarboxilação

Ácido 6 metil salicílico

descarboxilação

oxidação

m-hidroxi-benzaldeído

rearranjo

Selmanoglu e Koçkaya (2004) investigaram os efeitos tempo-dependentes de

patulina nos níveis de triiodotironina (T3), tetraiodotironina (T4), hormônio tireóide

estimulante (TSH), testosterona, hormônio luteinizante (LH) e hormônio de crescimento (GH)

no desenvolvimento de ratos machos de 5-6 semanas de idade por um período de 60 e 90 dias.

A dose de patulina utilizada foi baseada em níveis de exposição humana (0,1 mg/Kg de peso

corporal/dia). Ao término da experiência foram verificados os níveis de hormônio no soro e

análise histopatológica por microscopia da tireóide e testículos. Os resultados revelaram que,

após 60 dias de ingestão, os ratos apresentaram um aumento de 66,6% nos níveis de

testosterona e uma diminuição de 17,3% nos níveis de T4. Após 90 dias de ingestão de

patulina, os níveis de testosterona estavam aumentados em 75% e LH em 146%. Os exames

histopatológicos do testículo demonstraram hiperplasia local no tecido intersticial e também

desorganização do epitélio do tubo seminífero. A tireóide revelou infiltração de células

linfóides e aumento do tecido intersticial entre os folículos e degeneração coloidal.

Em 2006, Iwahashi et al. avaliaram a citotoxicidade da patulina em leveduras por

análise de transcrição observando a resposta nas leveduras após exposição a 50ppm de

patulina. Encontraram a expressão de genes patulina-induzidos, semelhantes à expressão de

genes obtidos após tratamento com substâncias agrícolas antifúngicas (maneb



e zineb



Além disso, o tratamento com patulina ativou a degradação de proteínas, especialmente as

atividades de proteossoma, metabolismo de aminoácidos sulfurados e sistema de defesa

contra oxidação. Sugeriram danos no DNA por alquilação, o qual era reparado por

recombinação e mecanismos de reparos. Os resultados também proveram genes biomarcados

para a descoberta de patulina em produtos agrícolas. Os resultados sugeriram a possibilidade

de aplicar o sistema de transcrição das leveduras para avaliação de substâncias químicas,

especialmente para substâncias naturais que são difíceis de resistir à síntese orgânica.

Embora não exista nenhum dado toxicológico ou epidemiológico em seres humanos,

a patulina vem sendo empregada como indicador de qualidade nos frutos e produtos de maçã

(MOSS, 1996). O Ministério Britânico de Agricultura, Pesca e Alimentos (MINISTRY OF

AGRICULTURE, FISHERIES AND FOOD-MAFF) tem monitorado os níveis de patulina

em sucos de maçã desde 1980. Quando contaminações acima de 50 µg/L foram confirmadas

pela primeira vez, em 1992, foi sugerido o limite máximo permitido de até 50 µg/L, que foi

confirmado em 1995 (UNITED KINGDOM, 1993). Com o estabelecimento de programas de

controle, a redução dos níveis de patulina em sucos de maçã alcançou 60% (UNITED

KINGDOM, 1998). Outros países como Suécia, Bélgica e Noruega também estabeleceram

concentração máxima permitida de até 50 µg/L, como recomendado pela Organização

Mundial de Saúde (OUGH; CORISON, 1980).

Em 2001, o Food and Drug Administration (FDA) publicou um documento, “The

Draf Guidance Document of FDA Components and Industry on Apple Juice and Apple Juice

Products”, que estabelece o limite de 50 µg/L para sucos de maçã e derivados (RICHARD et

al., 2003), embora a União Européia tenha estabelecido 25 µg/Kg em compotas e purês e 10

µg/Kg em produtos infantis (BOONZAAIJER; BODELDIJK; VAN OSENBRUGGEN, 2005;

EUROPEAN COMMISSION, 2003). A Organização Mundial de Saúde (OMS) alterou o

limite de ingestão de 7,0 para 0,4 µg/Kg de peso corpóreo/dia (BAERT et al., 2004;

BOLGER, 2002).

2.1.3.1 Principais microrganismos produtores de patulina

A patulina é produzida por mais de 60 espécies de fungos pertencentes a 30 gêneros

(LAI, FUH, SHIH, 2000). Dentre esses citam-se Penicillium expansum (P. leucopus), P.

patulum (P. urticae, P. griseofulvum), P. crustosum, P. roqueforti, P. claviforme,

Paecilomyces spp., Saccharomyces vesicarium, Alternaria alternata, Byssochlamys nivea, B.

fulva, Aspergillus giganteus, A. terreus, e A. clavatus (AYTAC; ACAR 1994; LAIDOU;

THANASSOULOPOULOS; LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES, 2001; MOSS; LONG, 2002),

destacando-se com especial importância e interesse o P. expansum, patógeno facultativo que

invade frutas danificadas causando podridão, mais comum em maçãs, podendo assim ocorrer

patulina em suco de maçã fresco. Normalmente é encontrada em altas concentrações na parte

da fruta onde há presença de esporos (93 a 95% de toda toxina), difundindo-se para outras

partes sadias do fruto devido sua hidrossolubilidade, até 4 cm além da lesão (BAERT et al.,

2004; LAIDOU et al., 2001). Também pode ser produzida por Aspergillus clavatus em

resíduos de cevada malteada e restos de cereal no campo, e por Byssochlamys nívea e B. fulva

em silagem (SCUSSEL, 1998). Microrganismos produtores de patulina também já foram

isolados de uvas, cerejas, pêras, damascos, nectarinas, pêssegos, tomates, mirtilo e amêndoas

(DEMIRCI; ARICI; GUMUS, 2003; JIMINEZ et al., 1991; LEGGOTT; SHEPHARD 2001;

PRIETA et al., 1994; RITIENI, 2003).

Penicillium spp. é certamente o fungo toxigênico de maior incidência em maçãs,

considerado um patógeno de ferimentos, que cresce em atividade de água (a

) entre 0,83 a

0,99 e tem a capacidade de tolerar até 80% de sacarose (p/v) no meio de crescimento,

causando podridão de coloração azul na parte externa da maçã e bege ou marrom-clara no

tecido, deixando o fruto aguado e mole (HEFNAWY; ABOU-ZEID, 2003). Stott e Bullerman

(1975) avaliaram a microbiota fúngica que contaminavam naturalmente maçãs, observando

que 66% tem a capacidade de produzir patulina, sendo predominantes os gêneros Penicillium,

Aspergillus e Byssoclamys.

Dombrink-Kurtzman e Blackburn (2005) avaliaram diferentes espécies de

Penicillium spp. para determinar sua toxigenicidade em diferentes meios de cultivo. Para isto,

utilizaram 11 espécies toxigênicas dos fungos, P. expansum (4), P. griseofulvum (3), P.

clavigerum (2), P. coprobium (1) e Penicillium spp. (1) isolado de maçã. As culturas foram

cultivadas em meios líquidos Batata Dextrose, Extrato de Malte e Extrato de Levedura

peptonado adicionado de glucose, todos com e sem suplementação de manganês, totalizando

seis formulações diferentes. A quantificação foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE) com detector Ultravioleta (UV). As três cepas de P. griseofulvum

apresentaram maior produção de patulina ao final do experimento. Para a maioria das cepas, o

Caldo Batata Dextrose suplementado com manganês propiciou máxima produção de

micotoxinas. Embora P. expansum seja freqüentemente citado como provável fonte de

patulina em sucos de maçã, outras espécies de Penicillium podem ser mais toxigênicas,

devendo a indústria estar alerta à possibilidade destas outras serem as responsáveis pela

ocorrência de patulina.

Hasan (2000) determinou as espécies de fungos predominantes e ocorrência de

micotoxinas em maçãs sadias (100) e deterioradas (100). Também avaliou o efeito do tempo e

temperatura sobre o crescimento de P. expansum em meio contendo glucose, NaNO

, MgSO

, KCl e extrato de maçã e a inibição da produção de patulina e aflatoxina

utilizando óleos de frutas. Aspergillus flavus (100%), A. niger (63%), Penicillium expansum

(50%) e Rizopus stolonifer (50%) foram os fungos isolados com maior freqüência em frutas

saudáveis. A. niger foi o microrganismo mais comum em maçãs deterioradas (83%), seguido

de A. flavus (67%), P. expansum (58%), R. stolonifer (53%) e Alternaria alternata (42%). As

micotoxinas naturalmente encontradas em maçã deteriorada foram aflatoxina e principalmente

patulina. A temperatura ótima para produção de patulina por P. expansum foi de 15°C após 15

dias. Utilizando 0,2% de óleo de limão no meio de cultivo, a produção de patulina foi inibida

completamente e com 0,05% de óleo de limão mais 0,2% de óleo de laranja reduziu mais de

90% da produção. A formação de aflatoxina foi reduzida em 90% quando era utilizado 0,2%

de óleo de limão. A freqüente ocorrência de P.expansum produtor de patulina em frutas

aponta a importância do controle durante o armazenamento das maçãs para evitar riscos de

ingestão de toxina, devendo ser removido o tecido danificado antes da utilização do fruto.

Baseado nos tratamentos de lavagem de maçãs antes do armazenamento em câmaras

frias, Chen, Ingham e Ingham (2004), avaliaram a efeticácia desses tratamentos em maçãs

cultivar Empério com relação ao crescimento de P. expansum NRRL 2304 e produção de

patulina. Para os tratamentos foram utilizados satinitizantes comumente empregados na

indústria. Os sanitizantes consistiram de solução de 200 ppm NaOCl, StorOx

1%, sorbato de

potássio 0,5%, 300 ppm SO

, e solução de ácido acético entre 0 e 5%. Esporos de P.

expansum foram inoculados em fatias de maçãs e, então, mergulhadas nas soluções por 5 min.

O crescimento do fungo e a produção de patulina foram monitorados durante o

armazenamento subseqüente. A solução de sorbato de potássio (0,5%) e a de SO

(300 ppm)

não afetou a sobrevivência do fungo ou produção de patulina. StorOx

(1%) foi efetivo

contra os esporos em solução (destruição de 4 log de Número Mais Provável de esporos), mas

não teve efeito quando os esporos estavam inoculados em fatias de maçãs. A lavagem com

200 ppm de NaOCl dificultou o crescimento de P. expansum em discos de maçã inoculados,

mas não inibiu completamente a produção de patulina. A solução ácido acética (2 a 5%)

apresentou maior eficácia contra P. expansum. Um tratamento de lavagem com 2% de ácido

acético por 1 min foi suficiente para inibir por completo o crescimento do fungo e

subseqüente produção de patulina em maçãs armazenadas destinadas à produção de suco e

sidra.

A produção de diferentes metabólitos de P. expansum isolados de culturas de origem

pura foi demonstrada por Andersen, Smedsgaard e Frisvad (2004). Ao contaminar frutas e

produtos de frutas, o fungo produziu substâncias tóxicas diferentes da patulina. Os autores

enfocaram a atenção das legislações e das indústrias alimentícias no problema relacionado aos

metabólitos de P. expansum. De acordo com a literatura, este fungo pode produzir citrinina,

ocratoxina A, patulina, penitrem A, e rubratoxina B. Neste estudo a produção qualitativa de

metabólitos foi examinada usando Cromatografia de Camada Delgada (CCD) (260 fungos),

CLAE (85 fungos), e Espectrometria de massa (EM) (22 fungos). Os resultados mostraram

que nenhum dos 260 fungos isolados produziram ocratoxina A, penitrem A ou rubratoxina B.

Porém, quetoglobosina A e comunesina B foram produzidos constantemente por todos os

fungos. Patulina e roquefortina C foram produzidos por 98% do fungos isolados e descobertos

expansolidas A/B e citrinina em 91 e 85%, respectivamente.

Abramson et al. (2009) isolaram de maçãs provenientes do Canadá, 24 cepas de P.

expansum e avaliaram sua capacidade de produção de patulina e citrinina. Quando cultivaram

estes microrganismos em caldo YES (Yeast Extract Saccharose, extrato de levedura acrescido

de sacarose) a 25°C por 28 dias, os isolados mostraram-se potentes produtores de citrinina ou

patulina, e na maioria dos casos, ambas as micotoxinas. Citrinina e patulina foram produzidas

em concentrações máximas de 565µg/mL (média 269µg/mL) e 100 µg/mL (média de

31µg/mL) respectivamente. Dentre os isolados, 91% produziram citrinina e 83% produziram

patulina.

Em 2001, Abrunhosa et al. determinaram o potencial toxigênico de fungos isolados

de uvas destinadas à produção de vinho de duas regiões vinícolas de Portugal. Os fungos

toxigênicos isolados (51) foram identificados como P. expansum produtores de patulina e/ou

citrinina, as quais foram quantificadas por CCD, e nenhum fungo produtor de ocratoxina foi

encontrado. Quando os fungos eram cultivados em caldo YES, favorecia a produção de

citrinina (51 cepas) e desfavorecia a produção de patulina (20 cepas). Quando cultivados em

suco de uva, 33 cepas produziram patulina enquanto citrinina foi produzida por apenas uma

das cepas. A presença de micotoxinas em vinhos de uva é discutida. A contaminação das uvas

com patulina pareceu não contribuir para contaminação do vinho. As uvas da cultivar Douro

apresentavam contaminação por P. expansum, mas as uvas da cultivar Vinho Verde não

apresentavam tal contaminação. Isto ocorreu devido à resistência dos cultivares a fungos ou

por sofrer influência de fatores ambientais.

2.1.3.2 Controle de fungos

Tratamentos pós-colheita com fungicidas são utilizados para reduzir as deteriorações

do fruto, como por exemplo, a aplicação do fungicida sintético imazalil (Freshgard



Fungaflor



) em maçãs (NUNES et al., 2001), mas cepas de P. expansum acabam

desenvolvendo resistência (CONWAY et al., 2004; JANISIEWICZ et al., 2003). Em vista do

interesse na ampliação da exportação de frutas brasileiras, o controle na armazenagem se

tornou essencial para garantir a qualidade (IBRAF, 2008). Os consumidores cada vez mais

conscientes vêm impondo exigências quanto à necessidade de produtos isentos de resíduos de

agrotóxicos (CONWAY et al., 2004; WISNIEWSKI; WILSON, 1992).

Métodos alternativos desenvolvem-se para o controle do bolor azul como a utilização

de microrganismos antagônicos (COELHO, 2005; LEVY et al., 2000) aplicação de

antibióticos naturais (BATTA, 2004; SHOLBERG; BEDFORD; STOKES, 2005), aplicação

de produtos sanitizantes (CONWAY et al., 2004).

Okull e Laborde (2004) avaliaram a influência da oxidação eletrolítica (19,0 A) na

viabilidade de esporos de P. expansum. O teste foi realizado em uma suspensão aquosa

contendo o fungo (10

esporos/mL) e em maçãs inoculadas com os esporos (10

esporos)

imersas em solução de cloridrato de sódio (0,1%). Aplicando a força eletrolítica máxima e de

50%, diminuiu a população de esporos viáveis por 4 e 2 unidades logarítmicas,

respectivamente. A oxidação eletrolítica não preveniu a formação posterior da lesão na fruta

inoculada diretamente com P. expansum, porém, ocorreu a formação de uma lesão menor

quando as maçãs foram armazenadas. Concluíram que a oxidação eletrolítica é uma potencial

alternativa como desinfetante, podendo substituir o cloro no controle de infecções de maçãs

por P. expansum durante o armazenamento e processamento das frutas.

Inicialmente as pesquisas para controle biológico eram direcionadas aos metabólitos

bacterianos que demonstravam perspectivas promissoras para restringir o uso de agrotóxicos

químicos (SANHUEZA; KRETZCHMAR; BORSÓI, 1992). Florianowicz (2001) mostrou a

eficiência da atividade antifúngica de Bacillus megaterium, Bacillus subtillis, Lactobacillus

casei, L. delbrueckii e L. lactis contra P. expansum. Nunes et al. (2001) relataram excelente

controle exercido por Pantoea agglomerans (CPA-2) contra B. cinerea e P. expansum sob

refrigeração, evidenciada pela redução de mais de 80% na deterioração de pêra (8,0 x 10

UFC/mL) causada por P. expansum e Rhyzopus stolonifer (10

, 10

e 10

conídias/mL).

Nos últimos anos, as leveduras e seus metabólitos também vem sendo estudados para

sua utilização no controle biológico. Levy et al. (2000) analisaram o potencial antagônico de

18 leveduras contra Penicillium spp. produtor de patulina, avaliando o potencial e a

estabilidade dos compostos ativos produzidos, utilizando o sobrenadante do meio de

leveduras para realização de antifungigrama. Testes indicaram que o sobrenadante da

levedura #38 apresentou maior halo e tempo de inibição. Esta atividade mostrou perspectivas

para aplicação, porém, após 7 dias o efeito antagônico diminuiu devido à baixa estabilidade

do composto responsável pela inibição, restringindo a aplicabilidade. Sob a forma de

microrganismos vivos, os autores abrem perspectivas para estender ensaios com

armazenagem a médio e longo prazo.

Usall et al. (2001) obtiveram resultados satisfatórios utilizando a levedura Candida

sake (cepa CPA-1) no biocontrole de doenças pós-colheita causadas por P. expansum em

maçãs, reduzindo a incidência de frutas deterioradas em mais de 70%. O tratamento de maçãs

(cultivar Golden Delicious) pós-colheita com C. sake sob estocagem a frio em duas estações

(1994/5 e 1995/6) também resultou no controle efetivo de P. expansum, com redução de 80%

no diâmetro da lesão e 50% na ocorrência das lesões (TEIXIDO; USALL; VINAS, 1999). No

Brasil, Tavares (1996) obteve uma redução de P. expansum em até 80%, utilizando Bacillus

subtillis e B. thuringiensis, sendo o resultado obtido superior ao controle químico.

Em estudo realizado por Coelho (2005), do total de 44 leveduras isoladas (16 de

frutas, 10 de silagem de milho e 18 de formigueiro de laboratório), 5 apresentaram

antagonismo contra esporos de P. expansum toxigênico (107 µg patulina/mL) em Ágar Meio

para Levedura, associado à antibiose (produção de substância extracelular), sendo Pichia

ohmeri 158 e Candida guilliermondii P3 as de maior atividade antagônica. No antifungigrama

em meio líquido (caldo MPL) o sobrenadante do cultivo de Candida guilliermondii (25°C/72

horas) inibiu 58,15% da germinação dos esporos de P. expansum, e Pichia ohmeri (25°C/48

horas) inibiu o desenvolvimento de hifas em 66,17%, sugerindo mecanismo associado ao

caráter killer, uma vez que ambas as leveduras foram positivas perante as linhagens padrão

Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006 e Pichia kluyveri CAY-15.

2.1.3.3 Incidência de patulina em alimentos

Pesquisas mostraram que nem todos os produtos de maçã estão livres de patulina

(SHILIHA; ASKAR, 1999). Alimentos infantis como os purês de maçãs, freqüentemente

utilizados em papinhas de bebê, podem apresentar elevada contaminação, o que se torna mais

preocupante pelo efeito correlato de dose ingerida x peso corporal. Os produtos comerciais

obtidos a partir de maçã com maior valor agregado são os sucos clarificados e/ou

reconstituídos e os fermentados, base para sidras (BISSESSUR; PERMAUL; ODHAV,

2001).

A presença de patulina em sucos de maçã está relacionada à contaminação da

matéria-prima com fungos produtores da micotoxina e é de conhecimento técnico que o

processo de clarificação não diminui o conteúdo de patulina no suco, apenas em pequena

proporção (16%) (BISSESSUR; PERMAUL; ODHAV, 2001). A temperatura empregada para

pasteurização ou para produção de suco concentrado degrada a patulina, mas apenas num

percentual pouco significativo. A utilização de radiação diminui as concentrações da toxina

no suco de maçã causando pequenas alterações na coloração e nas concentrações de ácido

ascórbico (ZEGOTA; ZEGOTA; BACHMAN, 1988). Pesquisas mostraram que os sucos

clarificados e reconstituídos brasileiros não apresentaram teores de patulina preocupantes

(SYLOS; RODRIGUES-AMAYA, 1999), contendo níveis abaixo do máximo recomendado

pela Organização Mundial da Saúde (OMS) de 50 µg/L, supostamente pela utilização de

matéria-prima de boa qualidade.

Em 1999, pesquisadores de São Paulo-Brasil determinaram a incidência de patulina

em frutas e sucos de frutas comercializados em Campinas utilizando-se de técnicas de

cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV e estabelecendo o limite de detecção

de 5 µg/L com cromatografia de camada delgada para confirmação (SYLOS; RODRIGUES-

AMAYA, 1999). Dentre as 30 amostras testadas, compostas de sucos comerciais adquiridos

no mercado nacional, apenas em uma foi detectada a presença de patulina com a concentração

de 17 µg/L. Os autores realizaram testes de recuperação mediante metodologias de diversos

pesquisadores tendo obtido resultados diferentes, porém aceitáveis, dada a pequena

variabilidade encontrada, e levantaram a hipótese de que a baixa incidência de patulina pode

estar relacionada à sulfitagem dos sucos comerciais, permitido pela legislação brasileira, mas

nada foi feito para confirmação.

Na Itália, Beretta et al. (2000) analisaram 82 amostras de produtos de maçã

produzidos no país, concluindo que todas as amostras apresentaram boa qualidade, estando

com concentrações de patulina inferiores a 50 µg/L. Ritieni (2003) analisou três

procedimentos de extração de patulina utilizados para suco de maçã, sucos clarificados,

alimento infantil e vinagre de maçã comercializados na Itália. Relatou que o método descrito

por MacDonald et al. (2000), o qual remove proteínas com sulfato de amônio sem adição de

enzima, como sendo aquele que apresentou melhor recuperação, além de ser rápido e de baixo

custo. A solução deste método clarificada em coluna de sílica gel também pode ser analisada

por CLAE sem problemas. Dentre as amostras analisadas, somente uma delas apresentou

nível superior ao permitido (50 µg/L); esta amostra era o purê de maçã orgânico com agente

anti-microbiano (metabissulfito de sódio) com uma concentração de 74,2 µg/L.

Lai; Fuh e Shih (2000) estudaram as condições de CLAE de fase reversa em coluna

de C

com detecção UV a 276 nm e avaliaram seu desempenho utilizando cromatografia

gasosa para confirmação, visto que a espectrometria de massas foi ineficiente para confirmar

baixas concentrações. Ao utilizar um volume de injeção de 50 µL, o limite de detecção

calculado em suco de maçã foi de aproximadamente 0,5 µg/L e o limite de quantificação de

15 µg/L, abaixo de 20 µg/L como sugerido pela Association of Official Analytical Chemists –

AOAC (2000). As taxas de recuperação atingidas foram satisfatórias, variando de 93,1 a

96,6%. As análises mostraram que das 105 amostras de sucos, 83,1% estavam isentas de

patulina e 11,4% apresentaram pequenas quantidades, encontrando-se, ainda, dentro dos

limites aceitáveis de no máximo 50 µg/L recomendado pela OMS.

Harwig et al. (1973) constataram alta ocorrência de P. expansum aliada à presença de

patulina em 46% das maçãs naturalmente deterioradas, sob armazenagem sem refrigeração no

Canadá, indicando aceleração na produção da toxina devido à conservação inadequada. O

mesmo ocorreu com suco de maçã na Austrália, onde 65% das amostras apresentaram-se

contaminadas por patulina (WATKINS; FAZERAS; PALMER, 1990). Anon (1999) e

Brackett e Marth (1979) detectaram acima de 50 µg/L e 10 a 350 µg/L de patulina em 2,5 e

58% de amostras de sucos de maçã em Londres (Inglaterra) e Wisconsin (EUA),

respectivamente. De 100 amostras de suco de maçã analisadas para verificação da incidência

de patulina na Espanha, 82 estavam contaminadas, sendo que sete apresentaram níveis acima

de 50 µg/L (PRIETA et al., 1994). A incidência de patulina também foi observada por Burda

(1992) em 23% das 328 amostras de suco analisadas entre 1989/1990 no Reino Unido, com

níveis da toxina entre 51 e 1130 µg/L em 73 amostras.

A contaminação com patulina em 215 amostras de suco concentrado de maçã foi

detectada na Turquia, com valores variando de 7 a 376 µg/L (GÖKMEN; ACAR, 1998 [02]).

Lindroth e Niskanen (1978) relataram a ocorrência de patulina em 20% dos sucos de maçã

industrializados e 40% nos sucos caseiros, constatando-se no último grupo concentrações

maiores que 1000 µg/L, provavelmente devido a condições inadequadas de estocagem, aliada

à matéria-prima de baixa qualidade. Steiner; Werner e Washutti (1999) demonstraram a

presença de níveis altos de patulina (500-2500 µg/L) em sucos de maçã, quando processados

com frutas deterioradas. Boonzaaijer, Bobeldijk e Van Osenbruggen (2005) avaliaram a

presença de patulina em 63 produtos comerciais derivados de maçã comercializados na

Holanda e não encontraram níveis quantificáveis da toxina na maioria das amostras, porém a

amostra de suco orgânico de maçã apresentou a toxina. Em uma pesquisa realizada em 42

amostras comerciais de suco e 23 de suco concentrado de maçã no Irã em 2002, a patulina foi

detectada em 33 e 56%, respectivamente, com níveis superiores a 50 µg/L, cujo valor máximo

foi 285,3 µg/L (CHERAGHALI et al., 2005).

Em estudo realizado por Jackson et al. (2003), foi avaliado o efeito das condições de

armazenamento sobre os níveis de patulina. A patulina não foi detectada em maçãs

selecionadas, colhidas diretamente das árvores e não pasteurizadas, mas foi detectada, em

altos níveis, naquelas que tiveram contato com o solo no momento da colheita, durante seu

armazenamento e/ou processamento e que também não foram pasteurizadas. O mesmo foi

observado no concentrado desses dois tipos de maçãs armazenado por 4 a 6 semanas em

temperatura de 0 a 2°C.

Koca e Eksi (2005) investigaram o efeito da temperatura de armazenamento sobre a

redução de patulina em sucos concentrados durante 6 meses, mantidos a 22°C e a 30°C,

contaminados com toxina nas concentrações de 64, 105 e 150 µg/L. Os resultados

demonstraram uma redução de patulina tempo e temperatura dependentes. Após 1 mês de

armazenamento a 22°C a redução foi de 45 a 64% e a 30°C, de 66-86%, sendo gradativo até o

quarto mês, quando não encontraram teores detectáveis da toxina.

Outra pesquisa foi desenvolvida a fim de avaliar a produção de patulina em maçãs

nos cultivares Gala e Fuji inoculados com P. expansum (NRRL 1172) e P. variabile isolado

de maçãs. Para isso, foram utilizadas temperaturas de armazenamento empregadas na

industria (0°C), de câmara fria (4°C) e temperatura ambiente (25°C) nos tempos de 15, 30, 60

e 90 dias. A produção de patulina ocorreu em todas as combinações de armazenagem,

constatando que à medida que se elevava a temperatura, era acelerado o desenvolvimento dos

fungos e a produção de patulina. A 0°C o aparecimento de patulina só foi detectado em 60

dias, a 4°C em 30 dias e a 25°C em 15 dias. As variações de pH não foram significativas e a

deterioração macroscópica aumentava conforme o aparecimento de toxina. Os autores

concluíram que os riscos freqüentes de produção de patulina nas temperaturas de refrigeração

indicam a necessidade de melhor controle nos estágios de colheita e armazenagem de maçãs

(ROSS et al., 1998).

Marin et al. (2006) avaliaram o grau de contaminação por patulina em maçãs

infectadas com P. expansum, armazenadas à temperatura ambiente (20°C) por curtos períodos

de tempo (5 dias) e sua relação com a cultivar (Golden ou Fuji), grau de maturação, tamanho

das lesões e capacidade migratória da toxina no tecido sadio. Altas concentrações de patulina

foram encontradas em maçãs Golden, maduras e que apresentavam lesões maiores. A

migração da toxina pelo tecido sadio da fruta era maior quanto maior o tamanho da lesão,

chegando a 4 cm quando apresentavam grandes áreas afetadas e de 2 cm em lesões menores.

Entre 2 a 6% de patulina migrou para o tecido sadio, estando mais concentrada no diâmetro de

1,5 cm da lesão. Os autores sugeriram que a remoção do tecido afetado e tecido sadio

próximo é uma boa prática para prevenção de toxina em derivados de maçã.

Morales el al. (2007) avaliaram a produção de toxina por P. expansum toxigênico

isolado de frutos em maçãs maduras cultivar Golden, com e sem aplicação de fungicida

(Folpet



, tiabendazol e imazalil), durante armazenamento a 1°C por 6 semanas. Em nenhum

fruto foi detectada a presença de toxina, indicando que à temperatura de armazenamento

inibiu a produção de toxina pelo microrganismo. Em adição, mantiveram esses frutos à

temperatura de 20°C por 3 dias, simulando a temperatura e tempo de transporte. Neste caso,

observaram o aparecimento de lesões significativas com semelhante acúmulo de patulina em

todos os frutos, indicando que o tratamento com fungicida não alterou a produção de toxina

pelo fungo.

Em estudo semelhante, Higashihara et al. (2009) verificaram o efeito da temperatura

de estocagem de maçãs na produção de patulina por P. expansum, e encontraram que a

temperatura necessária para preservação dos frutos deve ser maior que 0°C. Para redução da

produção de patulina pelo fungo, a temperatura deveria ser inferior a 5°C, sendo indicada a de

1°C como ideal para armazenamento pós-colheita.

Wilson e Nuovo (1973) isolaram 60 cepas de P. expansum produtoras de patulina em

maçãs com deterioração, mantidas sob armazenagem de 0°C. Northolt; Van Egmond e

Paulsch (1978) confirmaram o fato, constatando o desenvolvimento e produção de patulina

em maçãs armazenadas a 1°C. Rychlik e Schieberle (2001) avaliaram a capacidade migratória

da toxina em maçãs, encontrando concentrações de patulina em porções de até 4cm de

distância da lesão, sendo essas com valor menor que 6 x 10

-5

µg de patulina/g de tecido sadio.

Celli (2006) quantificou a concentração de patulina em podridões de maçã, bem como o

tecido sadio ao redor da lesão (1cm). Encontrou patulina em todos os tecidos deteriorados e

sadios analisados, chegando a 115,65 e 5,02µg de patulina/g de tecido, respectivamente.

Martins et al. (2002) verificaram a ocorrência simultânea de patulina e citrinina,

micotoxinas produzidas principalmente por Penicillium spp. e Aspergilus spp.,

respectivamente, em 351 podridões de maçã de diferentes cultivares, utilizando CCD para

detecção e quantificação. O nível de detecção foi de 120-130 µg/Kg para patulina e de 15-20

µg/Kg para citrinina. Do total de amostras, 68,6% estavam contaminadas somente com

patulina, 3,9% somente com citrinina e 19,6% contaminadas com patulina e citrinina,

simultaneamente. A concentração de patulina chegou à 80,50 mg/Kg na cultivar Richared, e a

de citrinina 0,92 mg/Kg na cultivar Rome Beauty, não sendo encontradas concentrações

elevadas de ambas em uma mesma amostra. Os autores concluíram que maçãs que

apresentam porções deterioradas apresentam risco ao ser humano se consumidos, como fruta

ou suco de fruta, uma vez que podem conter elevada concentração de patulina.

Uma verificação da possível contaminação por patulina no aroma de maçã, um

destilado de interesse comercial produzido durante a concentração de suco, foi realizada por

Kryger (2001). O autor produziu um aroma de maçã a partir de um suco com elevada taxa de

toxina (3420 ppb) e verificou que nenhuma patulina foi encontrada no destilado. Destacou,

por outro lado, que ocorreu diminuição desta micotoxina presente no suco concentrado, mas

que essa diminuição era decorrente do tratamento térmico empregado, o que já tinha sido

relatado por outros pesquisadores. As concentrações de toxina reduziram aproximadamente

33% num tratamento térmico a 100°C por 3 horas sob vácuo. Das análises realizadas em 4

amostras de aromas comerciais, nenhuma apresentou níveis detectáveis de patulina.

Sendo a patulina um parâmetro de qualidade em sucos de maçã, Kadakal, Nas e

Ekinci (2004) determinaram a presença de ergosterol e patulina em sucos contaminados para

verificar se havia alguma relação entre elas. Sucos produzidos a partir de maçãs sadias, e a

partir de maçãs deterioradas apresentando 30%, 60% e 100% da área contendo podridão,

foram analisados. Utilizando CLAE com detector diodo array para quantificação de patulina e

de ergosterol, encontraram concentrações crescentes de ambos à medida em que as podridões

da matéria prima aumentavam, variando de 1,9 à 861,0 µg de patulina/L (R=0,99) e de 0,7 à

111,0 mg de ergosterol/L (R=0,99). Correlacionando todas as concentrações de patulina e

ergosterol, encontraram uma correlação linear de 0,98. Concluíram que, assim como a

patulina, o ergosterol também pode ser utilizado como um controle microbiológico em maçãs.

Gökmen e Acar (1998 [01]) investigaram a relação entre a patulina e o ácido

fumárico em 70 sucos comerciais de maçã concentrados para determinar se a presença de

ácido fumárico é decorrente da atividade microbiológica da matéria-prima. Tanto a patulina,

micotoxina produzida em maçãs principalmente por P. expansum, como o ácido fumárico,

formado a partir do ácido málico sintético adicionado no suco de maçã durante a concentração

do suco ou pelo crescimento de Rhizopus spp., foram quantificados por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência. Nenhuma correlação significativa foi encontrada para as amostras

com níveis de patulina abaixo de 50 µg/L. As amostras que continham níveis de 67 a 216 µg

de patulina/L tiveram um coeficiente de correlação ligeiramente maior que 0,55. O coeficiente

de correlação mais significativo (0,71) foi determinado quando todas as 70 amostras foram

correlacionadas. Este estudo indicou que a presença de ácido fumárico em suco de maçã é

devido a atividade microbiológica da matéria-prima, porém, o tratamento de calor aplicado

para concentração do suco, também propicia grande aumento desses níveis.

Pesquisas apontam que maçãs orgânicas apresentam maiores níveis de patulina que

maçãs convencionais, sendo que essa maior contaminação se deve ao não tratamento com

fungicidas, o que provavelmente resultou em maior incidência de fungos toxigênicos e,

conseqüentemente, de patulina nessas frutas (MALMAURET et al., 2002; PIEMONTESE

;

SOLFRIZZO; VISCONTI

, 2005). A Tabela 02 mostra a ocorrência de patulina em sucos de

maçã e derivados comercializados em alguns países.

Tabela 02. Ocorrência de patulina em sucos de maçã e derivados em alguns países

País

n° de amostras

analisadas

n° amostras

positivas

Concentração de

patulina (µg/L)

Referência

Brasil 30 1 (3,5%) < 17

Sylos e Rodrigues-

Amaya (1999)

EUA 10 2 (20%) 80 – 110 Trucksess e Tang (1999)

Inglaterra 40 1 (2,5%) > 50 Anon (1999)

Brasil 13 1 (7,5%) < 10 Prado et al. (2000)

Itália 82 2 (2,5%) 0,68 - 1150 Beretta et al. (2000)

Turquia 482 162 (33,5%)

50 – 376 Gökmen e Acar (2000)

África do Sul 20 6 (30%) 5 – 45

Leggott e Shephard

(2001)

Cuba 20 1 (5%) < 1,72

Fernández-Trevejo et al.

(2001 [02])

Suécia 39 5 (13%) 2 – 50

Fernández-Trevejo et al.

(2001 [02])

Turquia 45 27 (60%) 19,1 – 732,8

Yurdun, Omurtag e

Ersoy (2001)

Bélgica 43 35 (81,5%) 0,7 - 17,3 Tangni et al. (2003)

Itália 21 5 (24%) 5,8 - 56,4 Ritieni (2003)

Japão 76 15 (20%) 1,4 - 45,6 Ito et al. (2004)

Itália 67 28 (42%) 0,07 - 69,3

Piemontese, S

olfrizzo e

Visconti

(2005)

Irã 23 18 (78%) 15 – 149 Cheraghali et al. (2005)

Holanda 63 1 (1,5%) < 25

Boonzaaijer, Bodeldijk e

Van Osenbruggen (2005)

Brasil 27 3 (11%) 3 – 7 Iha e Sabino (2008)

Arábia

Saudita

120

dados não

informados

47 – 104 Gashlan (2009)

Brasil 16 4 (25%) 15 – 46 Welke et al. (2009[2])

2.1.3.4 Estratégias para redução da contaminação

Vários métodos são freqüentemente utilizados para reduzir os níveis de patulina em

sucos de maçã, dentre eles destacam-se o tratamento com carvão ativado (LEGGOTT et al.,

2001; KADAKAL; NAS, 2002), dióxido de enxofre, irradiação gama, fermentação e lavagem

das maçãs infectadas pelo fungo. Muitos desses processos são caros e/ou demorados. Por esta

razão, é necessário encontrar um processo eficiente e econômico para controlar esses níveis

(BISSESSUR; PERMAUL; ODHAV, 2001).

Em 2001, Gökmen et al. analisaram os efeitos da clarificação sobre a concentração

de patulina, compostos fenólicos e ácidos orgânicos no suco de maçã. Os processos de

clarificação empregados utilizaram tratamento enzimático para floculação seguidos de

combinações de gelatina e bentonita, carvão ativado, ultrafiltração, resina adsorvente e/ou

polivinilpolipirrolidona (PVPP). A clarificação convencional que utiliza gelatina, bentonita e

carvão ativado demonstrou ser a mais eficaz na redução de patulina (40,9%), porém, esta

técnica causou uma diminuição significativa na intensidade da cor e de compostos fenólicos

no suco, afetando diretamente os padrões de identidade. A clarificação empregando

ultrafiltração seguida de tratamento com resina adsorvente também resultou na diminuição de

patulina (11,0%), trazendo melhorias na cor e transparência do suco. O PVPP não apresentou

nenhum efeito sobre os teores de patulina, mas removeu drasticamente a concentração de

fenóis. A composição de ácidos orgânicos não foi afetada pelas técnicas empregadas.

O carvão ativado, por suas propriedades adsorventes, foi usado para reduzir os níveis

de patulina em suco de maçã, porém, sabe-se que a aparência e o sabor do suco podem ser

afetados pelo tratamento (LEGGOTT et al., 2001; HUEBNER et al., 2000; KADAKAL,

NAS, 2002).

A cinética de adsorção da patulina em carvão ativado, energia de ativação e calor de

adsorção foi avaliado por Mutlu, Hizarcioglu e Gökmen (1997). Os pesquisadores

estabeleceram uma aproximação para investigar o mecanismo de adsorção em carvão ativado

de um grupo de substâncias químicas importantes nos sucos de fruta, selecionando a patulina

como a substância química modelo. A cinética de sua adsorção em carvão ativado era

determinada por curvas isotérmicas de adsorção de equilíbrio a qual variou de 20 a 80°C e

concentrações de patulina de 100 a 400 µg/L. Constantes da taxa de adsorção aparentes

aapp

) foram alterados de 1,07×10

-3

para 1,86×10

-3

/g.min enquanto a temperatura aumentava.

Para as curvas de adsorção de equilíbrio, foi empregado o modelo de Langmuir e parâmetros

ajustados (K e Q°) foram obtidos para diferentes temperaturas. Energia de ativação e calor de

adsorção foram determinados em sistema de adsorção do grupo (Ea = 2,02 kcal/mol e ∆H =

2,24 kcal/mol). Concluíram que a adsorção ocorreu endotermicamente através de mecanismos

físicos, a dependência de temperatura na cinética de adsorção foi descrita pelo modelo de

Langmuir na fórmula de Arrhenius e o calor estável da patulina no processo em grupo foi

reduzido ao mínimo.

Um material constituído de partículas de carvão ativado ligado a grãos de quartzo foi

desenvolvido e caracterizado por Huebner et al. (2000) para remover a patulina em solução

aquosa. Para confirmar a eficiência do material desenvolvido utilizaram um micro

invertebrado aquático (Hydra attenuata) que possui baixa tolerância a toxinas. Sua

sensibilidade a torna ideal para avaliar a toxicidade de diversos compostos químicos, como a

patulina. Os resultados indicaram que o material estudado reduz em até 76% o nível de

patulina em suco de maçã naturalmente contaminado.

Três tipos diferentes de carvão ativado (NORIT SA 4, NORIT SX 4 e NORIT CA 1)

foram avaliados quanto ao seu potencial na redução de patulina em suco concentrado de

maçã, provendo uma detoxificação de sucos com níveis elevados da toxina. Os tratamentos

foram realizados em sucos com 12°Brix e 120ng de patulina/mL e outro com 20°Brix e 160ng

de patulina/mL, utilizando diferentes dosagens de carvão e temperaturas para verificar sua

influência. O carvão NORIT SA 4 e o NORIT SX 4 exibiram curvas isotérmicas de adsorção

semelhantes numa dosagem de 1 g/L. Eles alcançaram reduções de 80% e 70% de patulina,

respectivamente, em 12°Brix e a 55°C. A semelhança no desempenho entre eles (carvão-

vapor ativado) sugeriu que a pureza e a acidez de superfície não influenciam a adsorção de

patulina. O carvão quimicamente-ativado (NORIT CA 1) foi menos efetivo na remoção de

patulina, reduzindo 45% da concentração inicial numa dose de 1 g/L. A remoção da patulina

foi influenciada pelo Brix do suco, sendo que em Brix mais elevados a dose de carvão ativado

requerido para remoção equivalente era maior. Numa dose de 1 g/L, NORIT SA 4 removeu

somente 45% da patulina em suco com 20°Brix, enquanto a mesma dose removeu 80% da

patulina em suco com 12°Brix. A remoção de patulina dos sucos por NORIT SA 4 (dose

1g/L) não foi influenciada pelas mudanças de temperatura entre 30 a 65°C. Em conclusão, o

carvão ativado NORIT SA 4 provou ser o tratamento mais efetivo para a redução das

concentrações de patulina em suco de maçã utilizando menores dosagens de carvão

(LEGGOTT et al., 2001).

O efeito da quantidade e do tempo de contato do carvão ativado sobre a concentração

de patulina em suco de maçã foi estudado por Kadakal e Nas (2002). O melhor resultado foi

obtido quando utilizaram 3 gramas de carvão ativado por litro de suco com tempo de contato

de 5 minutos, obtendo redução na concentração da micotoxina de 62,2 para 30,8 µg/Kg.

Bebidas fermentadas não devem apresentar teores detectáveis de patulina, uma vez

que as leveduras fermentativas degradam a toxina em condições anaeróbias. Em meio

contendo patulina a levedura é induzida a produzir composto(s) capaz(es) de degradar a

toxina. (LIPOWSKA et al., 1990; STINSON et al., 1978). Sumbu; Thonart e Bechet (1983)

mostraram que a degradação de patulina por leveduras está associada a um mecanismo de

defesa do microrganismo e depende da síntese de proteínas, uma vez que esta micotoxina não

era degradada quando adicionada simultaneamente com ciclo-heximida, um inibidor de

síntese protéica.

Drilleau e Bohoun (1973) analisaram 8 sidras francesas e 5 sidras dos EUA,

detectando patulina em 5 e 4 amostras, respectivamente. Visto que os processos utilizados são

os mesmos até os dias de hoje, suspeita-se que a contaminação apresentada nestas sidras

provenham do uso de matéria-prima com elevado grau de contaminação ou por alguma

modificação nas etapas de produção como longo período entre a obtenção do suco e o início

da fermentação, onde o crescimento fúngico e a produção de toxina continuam.

Em 2003 a Agência Britânica de Segurança Alimentar (Food Standards Agency -

FSA) realizou um estudo em 100 amostras de sidras comerciais, não encontrando

concentrações detectáveis de patulina (limite de detecção de 3 µg/L). Enfatiza-se que o

processo fermentativo por S. cerevisiae é capaz de degradar de 93 a 99% da toxina inicial.

2.1.3.5 Degradação de patulina

Na indústria, o uso de conservantes durante o processamento de frutas se tornou uma

necessidade para garantir a saúde dos consumidores por sua capacidade de preservar a

qualidade dos produtos derivados (LEITÃO, 1990). A ação do metabissulfito é um fato

comprovado, com vantagem na capacidade de degradar a patulina (ROSS, 1995). Além da

degradação de patulina por compostos sulfurados, os estudos promissores mencionam outras

alternativas com eventual utilidade, citando-se a remoção das partes deterioradas do fruto

antes do processamento, porém pouco viável para as indústrias (CHERAGHALI et al., 2005;

SYDENHAM et al., 1995), e detoxificação biológica efetuada pela microbiota presente no

próprio fruto (HARWIG et al., 1973; KARLOVSKY, 1999; ROSS, 1995; WALKER;

MCLEOD; HODGSON, 1995).

Karlovsky (1999) citou a detoxificação de patulina por leveduras durante os

processos fermentativos. Harwig et al. (1973) eliminaram a patulina submetendo o suco de

maçã à fermentação de duas semanas por Saccharomyces spp. As leveduras destinadas à

fabricação de sidras, constituídas de S. cerevisiae industriais, removeram eficientemente a

patulina (BURROUGHS, 1977).

Stinson, Osman e Bills analisaram, em 1979, a solubilidade dos produtos da

degradação da patulina ocasionado pelo processo fermentativo utilizando patulina marcada

com

C. Encontraram pelo menos 6 diferentes produtos que migraram durante a

cromatografia em camada delgada (CCD) além de um componente majoritário, imóvel.

Relataram também a formação de pequena quantidade de CO

a partir da patulina.

Diferente de Stinson, Osman e Bills (1979) que haviam relatado a formação de CO

Moss e Long (2002) verificam que não há formação de componentes gasosos pela degradação

de patulina. Ao utilizar a patulina marcada com

C, estes últimos tinham como objetivo a

caracterização melhor definida das condições sob as quais a S. cerevisiae degrada patulina e a

identificação dos principais produtos da degradação. Todos os carbonos da molécula de

patulina marcados foram rastreados nos produtos formados e concluíram que a degradação da

patulina só ocorre quando o crescimento é anaeróbio, separando por CLAE um dos principais

componentes formados, o (E)-ascladiol (Figura 04). Relataram traços de (Z)-ascladiol e outros

componentes não caracterizados com massas moleculares inferiores, sendo que nenhum

desses compostos era gasoso nem apresentavam volatilidade.

Figura 04 – Produtos da degradação da patulina (MOSS; LONG, 2002).

Stinson et al. (1978) projetaram um estudo para avaliar a persistência de patulina em

suco de maçã durante a fermentação utilizando oito cepas de leveduras comerciais e três

(E)-ascladiol (Z)-ascladiol

OH CH

HOH

diferentes processos para produção de sidra utilizados nos EUA, o Noroeste do Pacífico, que

utiliza a adição de açúcar para dar início à fermentação, o da Califórnia que recebe adição de

açúcar em duas etapas da fermentação e o Tradicional, sem adição de açúcar baseando-se na

presença de açúcar do próprio suco. Somente duas cepas, pelo processo Tradicional, não

foram capazes de remover patulina a um nível inferior a 50 µg/L. Visto que este último

processo não é utilizado por indústrias, suspeita-se que a contaminação apresentada em sidras

comerciais se dá por alguma modificação nas etapas de produção, como a diminuição do

tempo de fermentação ou a adição de suco contaminado no fermentado.

Lipowska et al. (1990) examinaram a variação na concentração de patulina durante a

produção de vinho de maçã, utilizando 12 mostos com presença de patulina. Após o término

da fermentação a patulina não foi detectada e o tempo necessário para seu desaparecimento é

curto, chegando a 48 horas do início da fermentação alcoólica. Avaliaram também a

influência da sulfitagem do suco de maçã destinado à fermentação, mostrando que SO

conduz a uma eliminação de patulina no mosto, o que condiz com os achados de Sylos e

Rodrigues-Amaya (1999).

Sumbu, Thonart e Bechet (1983) estudaram a ação da patulina sobre S. cerevisiae

(cepa codificada como 1278b[α]) verificando a existência de inibição do crescimento da

levedura, embora passageira, cuja duração é proporcional à concentração da toxina no meio.

Demonstraram que existem dois momentos na ação da patulina em células de levedura:

primeiro, a ação da toxina no metabolismo da levedura e a inibição subseqüente de

crescimento e, segundo, a retomada de crescimento indicando o aparecimento de um

mecanismo de resistência provavelmente associado com o desaparecimento da micotoxina

durante o processo fermentativo. Também observaram que a degradação de patulina por

leveduras está associada a outro fator, um mecanismo de defesa do microrganismo e

dependente da síntese de proteínas, uma vez que esta micotoxina não era degradada quando

adicionada simultaneamente com cicloheximida, um inibidor de síntese protéica, mas não foi

concluído se essa proteína atua diretamente sobre a patulina ou se permite a síntese de uma

substância responsável pela degradação. Da mesma forma, Celli (2006) verificou a

degradação de patulina em suco de maçã pelo crescimento de Saccharomyces cerevisiae

(LALVIN ICV D47). Ao cultivar a levedura em meio contendo 7µg de patulina/mL, observou

que nas primeiras 19,5 horas, a toxina não foi degradada. Após esse período a toxina passou a

ser eliminada, com velocidade de 0,078 µg/mL.h.

Considerando o efeito antagônico e degradador de Pichia membranifaciens e

Sporobolomyces roseus na degradação de 588,4 para 290,0 µg de patulina (25°C/15 dias) em

estudos preliminares (COELHO et al., 2004; LEVY et al., 2002), Coelho (2005) avaliou o

efeito degradador de Pichia ohmeri 158 isolada de ecossistema natural (formigueiro) sobre

patulina produzida por P. expansum toxigênico (107 µg patulina/mL). Para tanto, foi

adicionado simultaneamente 223 µg de patulina e 3,0 x 10

células de P. ohmeri 158 em 25

mL de Caldo Extrato de Malte, seguido de quantificação da toxina aos 2, 5, 10 e 15 dias de

incubação a 25°C por CLAE. A levedura reduziu em mais de 99% da toxina inicialmente

adicionada após 15 dias de incubação.

Ricelli et al. (2007) determinaram o efeito degradador de patulina utilizando uma

bactéria isolada de maçãs contaminadas, a qual foi identificada como Gluconobacter oxydans.

Empregaram suco de maçã contaminado com 100µg de patulina/mL e inoculado com 10

células/mL, mantidos a 30°C sob agitação de 175rpm. Nestas condições obtiveram uma

degradação de 91% da toxina em 72 horas.

Em 2008, Fuchs et al. avaliaram a

remoção de patulina em meio líquido por trinta

diferentes cepas de bactérias ácido láticas. Utilizando CLAE com detecção de UV ou de fluorescência

para determinação de toxina, encontraram que a cepa de Bifidobacterium animalis VM 12 foi eficaz na

degradação de patulina.

2.1.3.6 Detecção e Quantificação de Patulina

Desde a descoberta de patulina, diferentes métodos vem sendo desenvolvidos com

intuito de tornar a análise mais rápida e aumentar os níveis de detecção e quantificação

(MOAKE; PADILLA-ZAKOUR; WOROBO, 2005). Atualmente, os métodos mais utilizados

para quantificar patulina em produtos de fruta são baseados na separação da toxina por CLAE

com detector UV. Este é o método oficial adotado pela AOAC para suco de maçã (método

995.10, AOAC, 2000) com um limite de quantificação de 5 µg/L. Neste método o suco é

extraído 3 vezes com acetato de etila, seguidos de desidratação com sulfato de sódio. O

solvente é evaporado sob fluxo de nitrogênio gasoso a 40°C e o resíduo deverá ser dissolvido

em acetonitrila:água (10:90) no momento da análise em CLAE. A cromatografia líquida

utiliza coluna C18 de fase reversa (5 µm, 250 x 4,6 mm) e detector UV fixado em 276nm. O

sistema é isocratico, com fluxo de 1 mL/min e fase móvel acetonitrila:água (5:95). Utilizando

esta técnica, Fernández-Trevejo, Verdes e Espinosa (2001 [01]) fizeram uma curva de

calibração para validação da metodologia de detecção de patulina em sucos de maçãs e

obtiveram a curva y = 1952,5x + 1673,5 com um coeficiente de correlação 0,9991. O limite

de detecção foi 1,72 µg/L e o de quantificação, de 5,2 µg/L. O valor médio da recuperação de

patulina obtido por esses autores foi de 82,51%, a partir de níveis de contaminação de 0,020,

0,050 e 0,100 µg/mL.

Sheu e Shyu (1999) desenvolveram uma técnica para extração de patulina de suco de

maçã, a qual utilizava diálise combinada com derivatização e acilação seguida de confirmação

por Cromatografia Gasosa (CG) e Espectrometria de Massas (EM). As amostras de suco de

maçã adicionadas de 4-N,N-dimetilaminopiridina eram dialisadas usando cloreto de metano e

anidrido acético nos tubos de diálise. A patulina era derivatizada em seu acetato e

determinada utilizando CG e EM com o íon seletivo para monitorar a concentração. A curva

de calibração apresentou linearidade entre 10 e 250 µg de patulina/L, e o limite de

quantificação foi 10 µg/L. Os níveis de patulina em sucos comerciais variaram de 0 a 107,2

µg/L com 77-109% de recuperação. A patulina foi detectada em 7 amostras das 10

analisadas. A técnica que combina extração de patulina por diálise e acilação demonstrou

grande potencial podendo ser utilizada para extração de compostos em meio aquoso que

necessitem derivatização antes da determinação.

Sewram et al. (2000) desenvolveram outro método para determinação de patulina, o

qual empregou CLAE-EM-EM com monitoramento selecionado de reação (SMR - selected

reaction monitoring) utilizando a pressão atmosférica e moléculas ionizadas (APCI -

atmospheric pressure chemical ionization) como íons positivos e negativos. Este método que

tem como princípio a indução da dissociação por colisão (CID) apresentou um coeficiente de

correlação de 0,99 quando comparado aos resultados encontrados por CLAE, demonstrando

sua aplicabilidade como uma nova ferramenta para análise de patulina em suco de maçã,

mesmo em baixas concentrações, uma vez que quantificaram concentrações de 4µg/L.

Gökmen e Acar (1999) descreveram um método simultâneo para determinação de

hidroximetilfurfural (HMF) e patulina em sucos de maçã. A toxina foi extraída com acetato de

etila e passou por coluna de clarificação (sílica mais carbonato de sódio) para remoção de

interferentes e da umidade. O HMF e a patulina foram determinadas por CLAE de fase

reversa usando coluna C18 e detector diodo. A fase móvel utilizada foi acetonitrila – água

(99:1, v/v) e fluxo de 1,0 mL/min. A taxa de recuperação do HMF variou de 86% a 100%,

obtendo média de 94%, e a da patulina variou de 94% a 125% com média de 103%. Os

limites de detecção foram menores que 0,01 mg/L para HMF e que 5 µg/L para patulina.

No ano seguinte, Shephard e Leggott (2000) revisaram os métodos analíticos

disponíveis para determinação de patulina em fruta e sucos de fruta. Dentre eles, CLAE com

detector UV e com detector diodo, Cromatografia Gasosa e Cromatografia em Camada

Delgada. O método de escolha foi o CLAE, por ser mais rápido e seguro, e por ter aplicação a

diversas amostras. Os autores apontaram que futuramente métodos mais sensíveis serão

necessários para confirmação de níveis mais baixos de patulina, os quais serão,

provavelmente, o emprego de espectrometria de massas e o desenvolvimento de anticorpos

patulina-específicos. Moake, Padilla-Zakour e Worobo (2005) complementaram as

conclusões de Shephard e Leggott (2000), que há anos não existem novos métodos para

quantificação da toxina, sendo que os existentes exigem operadores treinados para manusear

materiais e equipamentos, sugerindo que o desenvolvimento de um método rápido e “caseiro”

seria extremamente benéfico para a indústria.

Em 2005, Boonzaaijer, Bobeldijk e Van Osenbruggen desenvolveram um método

analítico seguro para determinação e quantificação de patulina utilizando técnicas

convencionais, disponível à maioria dos laboratórios. O método que utiliza CLAE com

detector diodo, é aplicável a sucos de maçã e outros produtos mais sólidos. A separação da

micotoxina se deu pela adição de hidroximetilfurfural (HMF), obtendo limite de quantificação

de 25µg/L ou 25µg/Kg e um grau de recuperação de 87% para sucos de maçã. Os

pesquisadores afirmam que este método tem sensibilidade para ser utilizado no controle de

qualidade, uma vez que a União Européia estabelece um máximo de 50µg de patulina/L,

porém, não pode ser utilizada para alimentos infantis, no qual é permitido um máximo de

10µg de patulina/L.

Silva, Schuch e Jabolnski (2007) descreveram um método rápido para separação e

identificação de 5-hidroximetilfurfural (HMF) e patulina em sucos de maçã através de

cromatografia eletrocinética capilar micelar (MECC), empregando dodecil sulfato de sódio

(SDS) como surfactante. A separação foi feita usando o Instrumento de Eletroforese Capilar

3D (Hewlett-Packard-Stras-se 8,D-76337) equipado com detector UV. Nas condições

otimizadas (tampão SDS:borato 50:50), encontraram melhor efeito na resolução do analito e

no seu tempo de migração quando era aplicada a voltagem de 9Kv. Obtiveram boa separação

na linha de base entre o HMF e a patulina e limites de detecção de 30 µg/L e 9 µg/L,

respectivamente, mostrando ser um método útil para um amplo intervalo de concentração de

HMF e de patulina em sucos de maçã, sem nenhuma desvantagem em relação ao método

oficial.

Em 2009, Cunha, Faria e Fernandes validaram um método para quantificação de

patulina por cromatografia gasosa e espectrometria de massa utilizando patulina comercial

marcada

5-7

. O método foi baseado na extração da toxina com acetato de etila – hexano

seguidas de alcalinização e sililação com N,O-bis-trimetilsililtrifluoroacetamida e 1% de

trimetilcloro-silano. Os limites de detecção e quantificação foram 0,4 e 1,6 µg/Kg,

respectivamente. O método obteve sucesso quando aplicado a frutas, sucos, sidras e alimentos

para bebê.

No mesmo ano, a validação de um método de CCD para detecção e quantificação de

patulina foi realizada por Welke et al. (2009[1]). Com os valores de recuperação e limite de

quantificação alcançados de 95% e 14 µg/L, respectivamente, concluíram que este método foi

sensível o suficiente para ser utilizado como monitoramento por indústrias processadoras de

maçã ou acompanhamento por órgãos do governo, com a vantagem de ser mais barato e de

fácil realização.

WU et al. (2009) estudaram três métodos para extração de patulina, líquido-líquido,

dispersão de matriz em fase sólida e a extração em fase sólida. Concluíram que a extração por

dispersão de matriz em fase sólida foi a mais eficiente, a qual utiliza acetato de etila, metanol,

diclorometano e hexano para extração de patulina, seguida de limpeza da amostra em coluna

de sílica C

e desidratação do eluato. As taxas de recuperação da toxina utilizando este

método de extração foram de 79,68 à 94,32%.

3. OBJETIVO

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a biodegradação de patulina, empregando compostos bioativos obtidos de

uma levedura de interesse industrial (Saccharomyces cerevisiae ICV D47), assim como

proceder à concentração, purificação e caracterização bioquímica do composto bioativo

envolvido no processo de degradação contribuindo para o estudo da qualidade de derivados de

maçã.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Validar a metodologia de análise de patulina presente em maçã e seus produtos

por cromatografia líquida de alta eficiência.

- Quantificar a patulina presente em podridões de maçãs e tecido não afetado do

fruto, verificando a capacidade da toxina migrar para o tecido sadio.

- Determinar a cinética de degradação da patulina pelo processo de fermentação.

- Produzir composto bioativo com capacidade de degradar patulina por meio de

processo fermentativo empregando leveduras de interesse industrial;

- Extrair o composto do meio de cultivo, separando a biomassa do sobrenadante;

- Comprovar a atividade detoxificante do composto bioativo no extrato bruto

avaliando a remoção da toxina de sucos contaminados.

- Isolar, purificar e caracterizar o composto bioativo, empregando equipamentos

e técnicas analíticas.

- Estudar a estabilidade do composto bioativo isolado e purificado.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MICRORGANISMOS

Foi utilizada a cepa toxigênica P. expansum nº 2 produtora de patulina isolada de

maçã cultivar Gala para produção de patulina empregada nos experimentos (LEVY;

HIROOKA, 1999). Este microrganismo, proveniente de cultura monospórica (NELSON;

TOUSSON; MARASAS, 1983), foi mantido em Ágar Batata Dextrose-BDA inclinado a 4°C

na ausência de luz e usado como cultura estoque. Desta, quando necessário, foi recuperado em

ágar Extrato de Malte-AEM inclinado a 21°C/5 dias e padronizado (10

esporos/mL).

Foi usada a cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae LALVIN ICV D47

(LALVIN



, Canadá) usualmente utilizada para produção de sidras. Esta cepa foi utilizada

para degradação de patulina pelo processo fermentativo e obtenção do composto bioativo com

capacidade detoxificante por ter apresentado maior atividade degradadora (CELLI et al.,

2005).

4.2 PATULINA PADRÃO E REAGENTES QUÍMICOS

Nas análises de quantificação de patulina foi utilizada como padrão de comparação

patulina com 99,0% de pureza (SIGMA, USA) e os reagentes químicos de grau

cromatográficos. Nas demais análises foram utilizados reagentes de grau P.A.

4.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO DE TRABALHO

Foram dissolvidos 5 mg da película de patulina padrão (SIGMA



) em 1 mL de

clorofórmio, subdivididos em cinco frascos (200 µL), secos com gás N

e estocados a -20°C.

Para quantificação do padrão, a película de um dos frascos citados foi suspensa em etanol e

quantificada a 275 nm em espectrofotômetro Cintra 20 (AOAC, 2000). Uma fração seca do

padrão calibrado (1000 µg) foi suspensa em acetonitrila:água (1:9) e diluída para construção

de uma curva de calibração, de 0,020 a 0,350 µg/mL de patulina.

4.4 PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA

O desempenho da metodologia para extração de patulina, utilizado nas condições de

laboratório, foi avaliado por meio da determinação da recuperação, limite de detecção e de

quantificação (CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION, 1998; IHA; SABINO, 2008).

O limite de detecção foi calculado como sendo a menor concentração da substância

na amostra que pode ser diferenciada de zero (7 leituras). Para isso, foram utilizadas

concentrações de patulina próximas ao menor ponto da curva padrão (0,010 µg/mL) e o limite

de quantificação foi determinado multiplicando por 2 vezes o limite de detecção (IHA;

SABINO, 2008).

A recuperação foi avaliada em triplicata pela adição de 50, 100 e 150 µg de

patulina/L de suco de maçã, seguidos de extração, limpeza e quantificação.

4.5 PRODUÇÃO DE PATULINA

Para produção de patulina, empregada nos experimentos, foi inoculando uma

alíquota de 10

esporos/mL de P. expansum em 10 Erlenmeyers de 250 mL com 25 mL de

Caldo Extrato de Malte pH 4,4 (extrato de malte 0,6%, dextrose 0,6%, maltose 0,18%, extrato

de levedura 0,14%) a 25°C/15 dias. O filtrado do meio de fermentação submersa foi extraído

por três vezes com 25 mL de acetato de etila. Os extratos foram misturados perfazendo um

volume total de 75 mL e desidratados com 30 g de sulfato de sódio anidro por 30 min. O

extrato desidratado foi filtrado e evaporado a 40°C até atingir aproximadamente 25 mL e

introduzido na coluna de limpeza (500 x 10 mm, com 8,5 g de sílica gel 60G, 70-230 mesh,

SIGMA) previamente condicionada (24hs com álcool e 24hs com acetato de etila a 5ºC). A

seguir procedeu-se a eluição com 75 mL de benzeno-acetato de etila (75:25) e o eluato foi

evaporado a 40°C até atingir aproximadamente 5 mL, sendo seco sob fluxo de gás N

(AOAC, 2000). A patulina produzida foi quantificada por CLAE e utilizada para as análises

de cinética de degradação.

4.6 EXTRAÇÃO DE PATULINA DOS FRUTOS CONTAMINADOS

Trinta e cinco maçãs da cultivar Fuji apresentando diferentes graus de deterioração

foram coletadas do comércio local, pesadas, separadas as podridões e calculadas as

porcentagens de deterioração do fruto relacionando peso/peso. Os tecidos deteriorados e os

tecidos sadios (correspondendo à circunferência ao redor da lesão, tendo 2cm de espessura)

foram triturados e homogenizados com auxílio de almofariz e coletada uma alíquota de 10 g,

submetida a três extrações com 10 mL de acetato de etila. Os extratos foram misturados

perfazendo um volume total de 30 mL e desidratados com 5 g de sulfato de sódio anidro por

30 min. O extrato desidratado foi filtrado e evaporado sob vácuo a 40°C até atingir um

volume menor ou igual a 10 mL, ajustado seu volume para exatamente 10 mL e introduzido

na coluna de limpeza (80 x 15 mm, com 1,5 g de sulfato de sódio anidro e 3,5 g de sílica gel

60G, 70-230 mesh, SIGMA). A seguir foi coletada uma fração de 2 mL do eluato, seca a

40°C sob fluxo de gás N

e armazenada a -20°C (AOAC, 2000).

4.7 EXTRAÇÃO DE PATULINA DE SUCOS FERMENTADOS

Alíquotas de 10 mL da amostra foram submetidas a três extrações com 10 mL de

acetato de etila. Os extratos foram misturados perfazendo um volume total de 30 mL e

desidratados com 5 g de sulfato de sódio anidro por 30 min. O extrato desidratado foi filtrado

e evaporado sob vácuo a 40°C até atingir um volume menor ou igual a 10 mL, ajustado seu

volume para exatamente 10 mL e introduzido na coluna de limpeza (80 x 15 mm, com 1,5 g

de sulfato de sódio anidro e 3,5 g de sílica gel 60G, 70-230 mesh, SIGMA). A seguir foi

coletada uma fração de 2 mL do eluato, seca a 40°C sob fluxo de gás N

e armazenada a

-20°C (AOAC, 2000).

4.8 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PATULINA

O resíduo obtido na extração de patulina foi redissolvido com 500 µL de

acetonitrila/água (1:9) e analisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE

(forno Dionex STH 585, bomba Jasco PU 980 e detector UV Jasco-UV 975). Cem microlitros

do resíduo redissolvido foram aplicados em sistema isocrático de fase reversa utilizando

coluna C

(5 µm, 250 x 4,6 mm I.D., Dionex 201 SP VYDAC), previamente equilibrada

com acetonitrila/água (5:95). A eluição foi conduzida a fluxo de 1,5 mL/min. a 30°C,

procedendo-se ao monitoramento da fração eluída a 275 nm (KAWASHIMA; VALENTE

SOARES; MASSAGUER, 2002). Nestas condições a patulina apresentou tempo de retenção

de 5,6 min.

A patulina foi quantificada por comparação entre a área dos picos das amostras e a

área dos picos de concentrações conhecidas do padrão da toxina (0,010; 0,020; 0,035; 0,050;

0,100; 0,200; 0,250 e 0,350 µg/mL).

4.9 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA

Maçãs da cultivar Fuji, selecionadas e lavadas, foram processadas em centrífuga de

frutas Walita

de pequeno porte para obtenção do suco de maçã, utilizado como mosto de

fermentação. Para remoção da pectina foram adicionadas enzimas pectinolíticas (Pectinex

100L, 3 g/hL) e mantidas em banho-maria a 45°C por duas horas, e o sobrenadante límpido

foi trasfegado, constituindo-se no mosto para fermentação.

Saccharomyces cerevisiae (LALVIN ICV D47) foi cultivada em 10 tubos de 25 mL

contendo 20 mL de suco de maçã contaminado com 5,0 µg de patulina/mL (SUMBU;

THONART; BECHET, 1983). O inóculo consistiu de 0,25 g de levedura seca ativa/L de suco

de maçã (correspondente a 1,8.10

células/mL) e o sistema foi incubado a 25°C sem agitação

para promover o metabolismo fermentativo, durante 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 64, 72, 96 e 120

horas. Todos os tubos estavam adaptados com uma mangueira para saída do gás produzido, a

qual era mergulhada em um recipiente contendo uma solução de metabissulfito de sódio (3%)

para impedir a entrada de oxigênio e microrganismos contaminantes. Tubos contendo suco e

toxina serviram como controle da degradação de patulina por componentes do suco e do

efeito do tempo.

Os resultados foram obtidos perfazendo três repetições, cada uma constituída de onze

dados (0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 64, 72, 96 e 120 horas) para a concentração de patulina no

fermentado.

4.10 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO CONTENDO O COMPOSTO BIOATIVO

A obtenção do extrato bruto foi realizada em duas etapas. A primeira consistiu no

crescimento da levedura em meio contendo patulina para induzir a produção do composto

bioativo. Desta forma, foram adicionados 0,25g de levedura seca ativada/L provendo um

inóculo de aproximadamente 1,8 x 10

células/mL em um Erlenmeyer contendo 250 mL de

Caldo MPL e patulina (3 µg/mL), com incubação a 25°C por 48 horas sem agitação.

Decorridas 48 horas, foram separadas assepticamente as células do meio de cultivo contendo

a toxina por centrifugação. A segunda etapa consistiu na obtenção do composto bioativo sem

a presença de patulina, cultivando a levedura condicionada a produzir o composto bioativo em

meio sem toxina. Nesta etapa foi adicionada a biomassa obtida na primeira fase em

Erlenmeyer contendo 50 mL de caldo Meio para Levedura isenta de toxina com incubação a

25°C por 48 horas sem agitação. Após esse período o fermentado foi centrifugado, o

sobrenadante foi coletado e submetido a filtração esterilizante por membrana (Durapore

0,22U de poro, Millipore

) consistindo no extrato bruto.

O inóculo foi baseado na escala de MacFarland, cuja enumeração de 1 a 10

corresponde a faixa de 3 x 10

a 3 x 10

células/mL, respectivamente, para contagem

bacteriana (ITAL, 1995). Para a padronização do inóculo de leveduras, a mesma escala foi

adaptada recalculando-se a contagem, obtendo-se os valores de 3 x 10

(escala nº1) a 3 x 10

(escala nº10) leveduras/mL, considerando-se que o tamanho de uma levedura seja equivalente

a 10 vezes ao bacteriano (LEVY; HIROOKA, 1999)

4.11 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA UTILIZANDO

EXTRATO BRUTO

Em 7 tubos de ensaio estéreis foram adicionados 5 mL de extrato bruto (pH 3,5) e 15

µg de patulina, obtendo concentração de 3 µg da toxina/mL. Os tubos foram incubados a

25°C e analisados após 0, 16, 24, 32, 48, 72 e 96 horas, quanto à porcentagem de toxina

degradada (MOSS; LONG, 2002). Tubos contendo suco despectinizado estéril e toxina

serviram como controle da degradação de patulina por componentes do suco e do efeito do

tempo. As análises foram realizadas em triplicata, e foi utilizada a média aritmética dos 3

resultados obtidos para cada tempo.

4.12 OBTENÇÃO DO EXTRATO DIALISADO CONTENDO O COMPOSTO BIOATIVO

Uma alíquota de 50 mL do extrato bruto estéril foi dialisada sob refrigeração (4°C)

por 72 horas em becker contendo 1 L de água destilada utilizando membranas de diálise de

celulose regenerada da Spectra/Por com um ponto de corte (MWCO) de 8000-10000 Da,

trocando-se a água a cada 8 horas, visando a eliminação de açúcares, peptídeos e proteínas de

baixa massa molecular, sendo então coletada a fração retida no interior da membrana

dialisadora. Esta fração foi chamada de extrato dialisado e utilizada para testes de avaliação

da cinética de degradação de patulina.

O experimento foi realizado por duas vezes para obtenção de um volume suficiente

para análises subseqüentes, sendo misturadas as duas frações dialisadas, totalizando um

volume aproximado de 100 mL.

4.13 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA UTILIZANDO O

EXTRATO DIALISADO

Em 6 tubos de ensaio estéreis foram adicionados 5 mL de extrato dialisado e 15 µg

de patulina, obtendo concentração de 3 µg de patulina/mL. Os tubos foram incubados a 25°C

e analisados após 0, 16, 24, 32, 48 e 72 horas, quanto à porcentagem de toxina degradada

(MOSS; LONG, 2002). Os resultados foram obtidos perfazendo três repetições, cada uma

constituída de seis dados para a concentração de patulina no extrato dialisado e utilizada a

média aritmética dos 3 resultados obtidos para cada tempo.

4.14 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE COMPOSTO BIOATIVO POR

ULTRAFILTRAÇÃO

A ultrafiltração do extrato bruto foi realizada em cuba de agitação Millipore, Modelo

8400, 400 mL, diâmetro 76mm utilizando membrana Millipore ultracel amicon YM100,

membrana de celulose regenerada, de 10.000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit -

Limite Nominal de Peso Molecular), 76mm, a 5°C sendo o sistema pressurizado com gás

nitrogênio. Dois litros de extrato bruto foram ultrafiltrados em alíquotas de 400 mL até

obtenção de um volume de 30 mL, e diluídos com água ultrapura até 400 mL. Este processo

foi repetido para uma maior remoção de açúcar. O volume final obtido para cada alíquota de

extrato bruto (400 mL) foi de 10 mL, totalizando 50 mL de extrato ultrafiltrado, o qual foi

armazenado a -20°C.

4.15 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA UTILIZANDO O

EXTRATO ULTRAFILTRADO

Para avaliação da cinética de degradação de patulina pelo extrato ultrafiltrado, 5

tubos de ensaio estéreis contento 9,75 mL de água ultrapura e 0,25 mL de extrato ultrafiltrado

foram adicionados de 30 µg de patulina (3 µg de patulina/mL). Os tubos em triplicata foram

incubados a 25°C e analisados após 0, 16, 24, 32 e 48 horas para determinação da

porcentagem de toxina degradada (MOSS; LONG, 2002). Os resultados foram obtidos pela

média aritmética dos 3 resultados para cada tempo.

4.16 ELETROFORESE DO EXTRATO ULTRAFILTRADO EM CONDIÇÕES

DESNATURANTES E NÃO DESNATURANTES

A eletroforese das proteínas presentes nas amostras de extrato ultrafiltrado foi feita

em gel de poliacrilamida na ausência de SDS (condições não desnaturantes). O gel foi

preparado na concentração de 12,5% (água, acrilamida, tampão tris 1,5 M pH 8,8, persulfato

de amônia, TEMED). O gel de empilhamento era constituído de acrilamida 4% (água,

acrilamida, tampão tris 0,5 M pH 6,8; persulfato de amônia, TEMED) (LAEMMLI, 1970). A

eletroforese foi realizada em géis de 12x12cm em cuba tipo “Hoefer SE 600 Ruby” da

Amersham Biosciences.

Para análise de proteínas sob condições desnaturantes foi adicionado SDS (SDS-

PAGE 10%) tanto na formulação do gel, como no gel de empilhamento e no tampão de

corrida segundo metodologia descrita por Schagger e Von Jagow (1987).

4.16.1 Rastreamento e isolamento do composto bioativo por eletroforese

O isolamento do composto bioativo foi realizado por eletroforese em condições não

desnaturantes com o extrato ultrafiltrado. Após a corrida, parte do gel foi corada com nitrato

de prata para identificação das bandas protéicas e cálculos dos respectivos Rfs (fator de

retenção, do inglês, retention factor), os quais são baseados na relação entre a distância

percorrida por cada amostra e aquela percorrida pela frente de migração. A outra parte do gel

foi recortada seguindo as bandas dos Rfs obtidos para extração dos compostos presentes;

macerado e adicionado de 1 mL de água ultrapura contendo 3 µg de patulina para cada. O pH

foi corrigido com ácido clorídrico 0,01N até 5 e mantido a 25°C por 24hs.

A quantidade de amostra adicionada em cada depósito do gel de eletroforese foi de

30µL e, como foram recortadas as bandas protéicas de 10 depósitos, totalizaram 300µL de

amostra.

4.16.2 Determinação do Rf (fator de retenção) em condições desnaturantes

A determinação do Rf em condições desnaturantes foi necessária para identificação

da banda de interesse nas análises subseqüentes como a estimativa da massa molecular e

ponto isoelétrico. Essa determinação foi realizada segundo descrito no item 4.16.

Rf =

_DP (distância entre o depósito e a banda protéica)__

DT (distância entre o depósito e a frente de migração)

4.17 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO COMPOSTO BIOATIVO

4.17.1 Eletroforese em SDS-PAGE para avaliação da pureza do composto bioativo e

determinação da massa molecular

As amostras coletadas da eletroforese sob condições não desnaturantes foram

analisadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante segundo

LAEMMLI (1970). Para a revelação do gel foi utilizado o método com o reagente nitrato de

prata de acordo com BLUM; BEIER; GROSS (1987).

A massa molecular do composto foi estimada através da curva padrão obtida pela

inserção em gráfico do logaritmo das massas moleculares das proteínas padrão contra seu

fator de retenção (Rf) e posterior regressão linear. Para isso, as proteínas utilizadas como

marcadores de massa molecular (marcador de baixa massa molecular GE, α-lactalbumina

(14,4kDa), Inibidor de tripsina (20,1kDa), Anidrase carbônica (30kDa), Ovalbumina (45kDa),

Albumina (66kDa), e Fosforilase b (97kDa)) foram depositadas no gel de eletroforese

paralelamente ao composto estudado.

4.17.2 Focalização isoelétrica e determinação do ponto isoelétrico (eletroforese 2D) do

composto bioativo

O ponto isoelétrico do composto foi determinado utilizando a focalização isoelétrica

(IEF – PAGE) pelo sistema Ettan IPGphor II (Amersham Bioscience), conduzido em uma tira

contendo gradiente imobilizado de pH linear de 3,0-10,0 em gel de poliacrilamida (7 cm)

contendo anfólitos (Pharmalito – 0,5%), seguindo as instruções do fabricante que consistiu

numa prévia hidratação do gel (60 µL de amostra e 65 µL de tampão de reidratação) durante

16hs e a passagem de corrente elétrica durante 4hs (500V/1h, 1000V/1h e 8000V/2hs) a 20°C.

Uma vez terminada a focalização, os géis foram incubados com solução de equilíbrio

contendo ditiotreitol (DTT) por 30 min e em solução de equilíbrio contendo iodoacetamida

por mais 30min. Após essas incubações a tira de gel foi posicionada horizontalmente no topo

do gel SDS-PAGE 8x10cm e selada com gel de agarose. Após a corrida, as bandas do gel

foram visualizadas pela coloração com nitrato de prata.

4.17.3 pH de máxima atividade do composto bioativo

O pH de máxima atividade do composto bioativo foi realizado em 5 tubos de ensaio

contento 8 mL de água ultrapura, 0,5 mL do extrato ultrafiltrado e, uma vez que os alimentos

derivados de maçã possuem caráter ácido, foram acidificados com solução de ácido clorídrico

0,01N até os valores de pH de 2, 3, 4, 5 e 6, ajustado seu volume para 10 mL com água

ultrapura e adicionados de 30 µg da toxina (3 µg/mL). Após 24 horas de incubação a 25°C as

amostras foram submetidas a extração e quantificação de patulina. Água ultrapura estéril

acidificada e adicionada de patulina serviu de controle. As análises foram realizadas em

triplicata e utilizadas as médias aritméticas.

4.17.4 Temperatura de máxima atividade degradadora do composto bioativo

A temperatura de máxima atividade foi testada em 7 tubos de ensaio contendo 9,5

mL de água ultrapura e 0,5 mL do extrato ultrafiltrado adicionados de 30 µg da toxina (3

µg/mL) e armazenados por 16 horas nas temperaturas de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50°C. Após

período de incubação as amostras foram submetidas à extração e quantificação de patulina.

Água ultrapura e estéril adicionada de toxina serviu de controle. As análises foram realizadas

em triplicata e utilizadas as médias aritméticas.

4.17.5 Estabilidade térmica do composto bioativo a 80ºC

A estabilidade térmica foi avaliada à temperatura de pasteurização utilizada na

indústria processadora de maçãs de 80°C por 20 min.

Um tubo de ensaio contendo 9,5 mL de água ultrapura e 0,5 mL do extrato

ultrafiltrado foi submetido a 80°C por 20 min, o qual foi rapidamente resfriado em água

corrente, adicionado de 30 µg da toxina (3 µg/mL) e mantido por 16 horas em incubação a

25°C e, então, realizada a extração e quantificação de patulina. Água ultrapura e estéril

adicionada de toxina serviu de controle. A análise foi realizada em triplicata e utilizada a

média aritmética.

4.17.6 Determinação de carboidratos

A determinação de açúcares totais foi realizada pelo Método de fenol sulfúrico

(DUBOIS et al., 1956).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE DA PATULINA

Na Figura 05A estão apresentadas a curva de calibração e a equação de regressão que

relaciona as áreas médias de cada pico calculadas por integração eletrônica e a concentração

de patulina no intervalo de 0,010 a 0,350 µg/mL, com um coeficiente de correlação linear de

0,998. Nas condições de trabalho, o tempo de retenção da patulina foi de 5:03 minutos, como

pode ser observado na Figura 05B.

Figura 05A – Curva de calibração de patulina

obtida pela leitura de sete soluções de padrão

(0,010, 0,020; 0,050; 0,100; 0,200; 0,250 e

0,350 µg/mL, R

= 0,998).

Figura 05B – Cromatograma de uma amostra

obtida de tecido deteriorado de maçã. Coluna

analítica C

, 250 x 4.6 mm I.D., diâmetro 5 µm.

Fase móvel acetonitrila/água (5:95), fluxo de 1,5

mL/min, detector UV 275 nm, 40°C.

O limite de detecção foi determinado como sendo a menor concentração da

substância na amostra que pode ser diferenciada de zero (7 leituras). Para isso, foram

utilizadas concentrações de patulina próximas ao menor ponto da curva padrão, que foi de 4,3

µg/L. O limite de quantificação foi determinado multiplicando por 2 vezes o limite de

detecção, resultando 8,6 µg/L. O desvio padrão de 1,4 foi calculado utilizando 7 leituras desta

última concentração. Estes dois valores de limites são suficientes para o objetivo deste estudo

e estão abaixo de 20 µg/L como sugerido pela Association of Official Analytical Chemists –

AOAC (2000).

Na Tabela 03 estão apresentados os resultados da determinação dos teores de

patulina em sucos de maçãs artificialmente contaminados, sendo estabelecidas as taxas de

recuperação, com um valor médio de 86,24% ± 2,72, semelhante aos resultados obtidos por

Fernández-Trevejo, Verdes e Espinosa (2001, [01]).

Tabela 03. Taxa de recuperação de patulina adicionada em suco de maçã.

Patulina (µg/L)

Substrato

Adicionada Recuperada*

Recuperação

(%)

Coeficiente

de Variação

(%)

Média

Recuperação

(%)*

50 42,03 ± 1,73 84,06 4,11

100 85,37 ± 4,21 85,37 4,93

Suco de maçã

150 133,93 ± 7,74 89,29 5,78

86,24 ± 2,72

*média aritmética ± desvio padrão

A curva de calibração para validação da metodologia de detecção de patulina em

sucos de maçãs realizada por Fernández-Trevejo, Verdes e Espinosa (2001, [01]), resultou na

equação y = 1952,5x + 1673,5 com um coeficiente de correlação 0,9991. O limite de detecção

foi 1,72 µg/L e o de quantificação, de 5,2 µg/L. O valor médio da recuperação de patulina

obtido por esses autores foi de 82,51%, a partir de níveis de contaminação de 0,020, 0,050 e

0,100 µg/mL. Em 2008, Iha e Sabino obtiveram um grau de recuperação de patulina em suco

de maçã de 81,1% com desvio padrão de 7,7% e em bebida de soja contendo suco de maçã de

73,7% com desvio padrão de 1,8%, tendo a curva de calibração um coeficiente de correlação

linear de 0,9999 e os limites de detecção e de quantificação foram de 3 µg/L e 7 µg/L.

5.2 PRODUÇÃO DE PATULINA

A quantidade de toxina obtida pelo crescimento de P. expansum nº 2 foi de 26750 µg

(107 µg de patulina/mL) quando cultivado em Caldo Extrato de Malte pH 4,4 a 25°C/15 dias.

Em 1974, Sommer et al. avaliaram a toxigenicidade de diferentes cepas de P.

expansum isoladas de maçãs e encontraram valores de 10 a 950 µg de patulina/mL quando

cultivados a 22-24°C por 21 dias em caldo batata dextrose. Ross et al. (1998) encontraram

uma toxigenicidade de 6,4 µg de patulina/g para P. expansum cepa NRRL 1172 quando

cultivada em maçã a 4°C por 90 dias. Hasan (2000) obteve máxima produção de toxina por P.

expansum quando era cultivado em meio glicose-Czapek’s-maçã a 20°C por 15 dias,

resultando numa toxigenicidade de 5,2 µg de patulina/mL. HE et al. (2009) utilizaram suco de

maçã e P. expansum P99418 isolado de maçãs infectadas com fungo azul para produção de

patulina. Inoculando o suco com 10

esporos/mL, conseguiram uma produção máxima de 21,9

mg de patulina em 50 mL (0,438 mg/mL) quando cultivados durante 10 dias sem agitação a

25°C.

5.3 QUANTIFICAÇÃO DE PATULINA EM MAÇÃS CONTAMINADAS

O fungo contaminante de maior importância em maçãs é o gênero Penicillium, uma

vez que é detectado com maior freqüência em todas as etapas do cultivo, causando podridões

no fruto (DOMBRINK-KURTZMAN; BLACKBURN, 2005). P. expansum é considerado o

principal patógeno das lesões do fruto e causa podridão de coloração azul na parte externa da

maçã, sendo sua forma esporulada, e de cor bege ou marrom-clara no tecido, deixando o fruto

aguado e mole (HEFNAWY; ABOU-ZEID, 2003).

Neste experimento foi realizada a quantificação de patulina em 35 maçãs in natura,

das quais 32 mostraram-se positivas, com níveis variando de 1,01 a 120,4 mg/Kg no tecido

deteriorado. Os teores de patulina encontrados no tecido sadio próximo à lesão de 31 amostras

variaram de 20 a 5020 µg/Kg, sendo 20 µg/Kg considerado traços, e em 4 amostras não foram

detectados. Destas, a amostra 4 apresentou patulina na lesão e concentração não detectada

(abaixo do limite de detecção) no tecido sadio próximo (Tabela 04). Estes resultados estão de

acordo com Beretta et al. (2000), que encontraram a toxina em 80,7% dos 26 frutos

analisados em concentrações máximas de 113.343 mg de patulina/Kg de tecido deteriorado.

A média da concentração de patulina apresentou-se elevada mesmo quando as

porcentagens de podridão dos frutos eram pequenas (Tabela 04).

Tabela 04. Concentração de patulina em podridões e áreas não afetadas de maçãs.

Concentração de patulina

Amostras

Áreas deterioradas

(%)

Área deteriorada

(µg/Kg)

Área não afetada** (µg/Kg)

1 2,5 102400 4380

2 3,0 1380 20

3 3,2 2120 130

4 3,9 1010 nd*

5 4,0 2860 30

6 4,1 nd* nd*

7 4,5 4360 150

8 5,2 12700 530

9 5,8 13100 660

10 7,8 35200 970

11 8,9 15330 580

12 10,2 23800 950

13 10,8 21600 1010

14 12,0 47600 2480

15 14,2 24560 1150

16 16,2 nd* nd*

17 16,4 15700 890

18 17,9 27430 1730

19 19,2 32550 2370

20 21,4 70380 1620

21 24,2 25150 2790

22 27,5 107300 3810

23 27,5 nd* nd*

24 28,1 89320 2470

25 30,6 51740 1030

26 33,1 71360 2180

27 35,7 103410 3620

28 38,6 120400 4130

29 40,1 92180 3480

30 43,7 118800 5020

31 44,5 83400 2110

32 47,3 63420 2920

33 50,3 65180 1600

34 50,8 115650 4770

35 52,3 48220 1850

* nd: não detectado

** circunferência ao redor da lesão (2cm de espessura).

Considerando as propriedades hidrossolúveis da patulina, as porções sadias dos

frutos imediatamente ao redor do foco de infecção, sem alteração na coloração e textura,

foram analisadas para avaliar a capacidade migratória para o tecido não deteriorado.

No tecido sadio detectaram-se concentrações preocupantes desta substância, que

atingiram 5020 µg/Kg de tecido (Tabela 04), acima do limite estabelecido pela FDA de 50

µg/Kg (RICHARD et al., 2003). Essas concentrações de patulina detectadas no tecido sadio

apresentaram-se crescentes com o aumento no diâmetro da podridão (Figura 06 A). Os frutos

com grande porcentagem de podridão e menores concentrações de toxina também

apresentaram proporção nas concentrações de toxina na porção sadia ao redor (Figura 05 B).

Figura 06 – Curvas de tendências de patulina nas maçãs deterioradas.

(A) relacionando concentração de patulina no tecido deteriorado com a porcentagem de

podridão do fruto; (B) relacionando concentração de patulina no tecido sadio próximo a lesão

com a porcentagem de podridão do fruto.

Esses resultados concordam com Rychlik e Schieberle (2001) que avaliaram a

capacidade migratória da toxina em maçãs, encontrando concentrações de patulina em

porções de até 4cm de distância da lesão, sendo essas com valor menor que 6 x 10

-5

µg de

patulina/g de tecido sadio.

5.4 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA PELO PROCESSO

FERMENTATIVO

A patulina em bebidas fermentadas não deve ser detectável, uma vez que as

leveduras fermentativas produzem, sob condições anaeróbias e por indução, uma proteína

capaz de degradar a toxina (LIPOWSKA et al., 1990; STINSON et al., 1978).

Na Tabela 05 são apresentados os resultados (média aritmética de 3 quantificações)

de um experimento conduzido com suco de maçã ao qual foi adicionada patulina e

Saccharomyces cerevisiae para avaliar a cinética de degradação de patulina.

Tabela 05. Determinação da cinética de degradação de patulina em suco de maçã inoculado

com Saccharomyces cerevisiae.

5,00 µg de patulina/mL

Tempo (h)

Sem S. cerevisiae* Com S. cerevisiae*

0 5,00 5,00

4,82± 0,017 4,73± 0,013

4,82± 0,015 3,81± 0,009

4,80± 0,011 3,53± 0,018

4,80± 0,018 1,77± 0,015

4,80± 0,011 1,29± 0,010

4,79± 0,013 0,92± 0,015

4,79± 0,006 0,70± 0,006

4,78± 0,016 0,43± 0,011

4,74± 0,010 0,26± 0,014

120

4,72± 0,003 0,18± 0,016

Meio utilizado: suco de maçã despectinizado. Cultivo estático sob condições anaeróbias a 25°C.

* Cada valor corresponde à média aritmética das triplicatas ± desvio padrão.

Os teores de patulina nos ensaios inoculados com S. cerevisiae, onde foram

adicionados 5,0 µg/mL de suco, permaneceram estáveis no período inicial de 8 horas. Após

este tempo, até 32 horas, a eliminação da toxina ocorreu em maior intensidade, chegando a

1,77 µg/mL, o que representa uma redução de 64,6%. O processo continuou gradativamente

com redução da toxina, porém de forma lenta, permanecendo um teor final de 3,6% (0,18 µg

de patulina/mL) após 120 horas de fermentação (Figura 07). Esta degradação de patulina por

leveduras durante os processos fermentativos foi citada por Karlovsky (1999).

Figura 07 – Cinética de degradação de patulina por S. cerevisiae.

concentração inicial 5,00 µg de patulina/mL, controle (incubação sem levedura,

5,00 µg de patulina/mL).

Harwig et al. (1973) demonstraram a total degradação de patulina (3 µg/mL) do suco

de maçã, submetendo à fermentação durante duas semanas por S. cerevisiae Y-99 e S.

ellipsoideus DAVIDS #522, e durante quatro semanas quando inocularam S. cerevisiae MAC

#Y2947. Burroughs (1977) removeu eficientemente a patulina (5 µg/mL) de sucos

contaminados utilizando leveduras industriais para produção de sidras e tempo de

fermentação de 12 dias.

A diminuição do teor de patulina pode estar associado a um mecanismo de defesa da

levedura, onde ela produz uma proteína ainda não caracterizada capaz de degradar a toxina

(SUMBU; THONART; BECHET, 1983). Os mesmos autores observaram a permanência de

patulina no meio de cultivo, quando adicionada simultaneamente com 2 µg/mL de ciclo-

heximida (inibidor da síntese protéica). Não obstante, se ciclo-heximida fosse adicionada 3

horas após a adição de patulina, a velocidade e a taxa de degradação seria reduzida, porém

não suspensa.

Sumbu, Thomart e Bechet (1983) e Moss e Long (2002) relataram a existência de

uma fase de adaptação das leveduras ou uma inibição temporária por um período proporcional

à dose da toxina, ou seja, ocorre uma inibição concentração-dependente do crescimento,

quanto maior a dose da toxina, maior é a fase de adaptação das leveduras e mais prolongada é

a fase lag (estacionária). No crescimento de S. cerevisiae existem duas fases na ação da

patulina sobre as células. Primeiro, uma ação da toxina no metabolismo da levedura e a

inibição subseqüente de crescimento, onde a levedura passa por uma fase de adaptação, sendo

observada até 24 horas após a incubação. Segundo, a retomada de crescimento e degradação

da patulina, indicando o aparecimento de um mecanismo de resistência provavelmente

associado com o desaparecimento da micotoxina durante a fermentação do suco de maçã.

5.5 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA UTILIZANDO O

EXTRATO BRUTO ESTÉRIL

Uma vez que o desaparecimento de patulina pode estar associado a um mecanismo

de defesa da levedura, devido a produção de um composto protéico capaz de degradar a

toxina (SUMBU; THONART; BECHET, 1983), foi avaliada a atividade degradadora do

extrato bruto da fermentação livre de células.

Analisando a cinética de degradação de patulina pelo processo fermentativo, onde

houve notório decréscimo da toxina após 48hs de cultivo, os ensaios para obtenção do extrato

bruto estéril foram conduzidos baseando-se neste tempo de crescimento do microrganismo

para coleta do extrato bruto.

Após adição de toxina no extrato bruto estéril sem teor de patulina detectável, as

análises mostraram uma redução de 55,7% (de 3,00 µg/mL para 1,33 µg/mL) durante o

período de análises (96h), sendo que uma redução de 28,3% desta (de 3,00 µg/mL para 2,15

µg/mL) foi observada em 24 horas e de 50% (de 3,00 µg/mL para 1,5 µg/mL) decorridas 48

horas quando mantidos a 25°C sob condições estáticas e estéreis (Tabela 06).

Tabela 06. Determinação da cinética de degradação de patulina no extrato bruto estéril

quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Tempo (h)

Suco de maçã estéril* Extrato bruto*

0 3,00 3,00

2,91± 0,010 2,37± 0,023

2,86± 0,018 2,15± 0,016

2,86± 0,009 1,72± 0,019

2,85± 0,012 1,50± 0,011

2,82± 0,015 1,41± 0,020

2,79± 0,012 1,33± 0,012

Suco de maçã despectinizado utilizado como controle. Mantidos estáticos e estéreis a 25°C.

*média aritmética ± desvio padrão.

A maior redução nos teores de patulina foi observada nas primeiras 48 horas

(redução de 50%) quando comparado às 48 horas finais (de 48 à 96 horas), onde a redução foi

de 5,7%, podendo ser atribuída à diminuição da atividade do composto bioativo presente,

porém, ainda apresentou maior degradação da toxina quando comparado ao controle (Figura

08), a qual foi de 3% no período de 48 à 96 horas.

Figura 08 – Cinética de degradação de patulina no extrato bruto estéril.

concentração inicial 3,00 µg de patulina/mL, controle (incubação em suco de

maçã estéril, 3,00 µg de patulina/mL).

5.6 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA UTILIZANDO O

EXTRATO DIALISADO ESTÉRIL

O equilíbrio de diálise é um método que possibilita a separação de componentes de

alta massa molecular daqueles de baixa massa molecular utilizando para isto o diferencial de

permeação entre membranas seletivas. A permeação das moléculas através da membrana

depende da concentração do analito, do seu coeficiente de partição óleo/água e da área de

superfície da membrana (TSAI, 2003).

A amostra de extrato bruto apresenta moléculas de alta massa molecular, como por

exemplo, as proteínas, e estas devem ser separadas de substâncias interferentes a fim de medir

sua atividade degradadora. Os mecanismos envolvidos no processo de permeação de

substâncias pela membrana baseiam-se em forças dirigidas como diferença de concentração,

de potencial elétrico e de pressão. Dentre estes mecanismos, os que apresentam maiores

aplicações estão relacionado à concentração e à pressão (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM,

2001).

Esta técnica utiliza membranas de diálise com um tamanho de poro menor que o das

proteínas e suas subunidades. O princípio da técnica se baseia na passagem de substâncias

interferentes através da membrana de diálise até o equilíbrio, em temperatura constante,

apresentando a vantagem de ser uma técnica termodinamicamente correta e livre de qualquer

problema elétrico ou mecânico (VOLPE; FILHO, 1994).

Após adição da toxina no extrato dialisado estéril sem teor de patulina detectável, as

análises mostraram completa remoção da toxina durante o período de análises (72hs), sendo

que a redução de 62,3% desta (de 3,00 µg/mL para 1,13 µg/mL) foi observada em 16 horas,

chegando a níveis não detectáveis decorridas 24 horas quando mantidos a 25°C sob condições

estáticas e estéreis (Tabela 07).

A grande redução nos teores de patulina foi observada nas primeiras 16 horas

(redução de 62,3%) quando comparado ao controle (1,7%) e de 100% (níveis não detectáveis)

a partir de 24 horas de análise, enquanto o controle apresentava degradação de 1,7%, restando

2,95 µg de patulina/mL, que corresponde a 98,3% do total adicionada.

Tabela 07. Determinação da cinética de degradação de patulina no extrato dialisado estéril

quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Tempo (h)

Água estéril* Extrato dialisado*

0 3,00 3,00

2,95± 0,015 1,13± 0,026

2,95± 0,028

nd**

2,92± 0,013

nd**

2,91± 0,010

nd**

2,86± 0,018

nd**

Água estéril utilizada como controle. Mantidos estáticos e estéreis a 25°C.

*média aritmética ± desvio padrão; **não detectado.

A Figura 09 mostra a cinética de degradação de patulina adicionada em extrato

dialisado estéril durante os intervalos de tempo 0, 16, 24, 32, 48 e 72 horas, bem como o

controle onde era adicionada a toxina em água estéril para verificar sua degradação em

relação ao tempo de análise, quantificadas por CLAE com detector UV.

Figura 09 – Cinética de degradação de patulina no extrato dialisado estéril.

concentração inicial 3,00 µg de patulina/mL, controle (incubação em suco de

maçã estéril, 3,00 µg de patulina/mL).

Com a utilização do extrato dialisado observou-se uma rápida degradação da patulina

quando comparada com extrato bruto (28,3% em 24hs, Tabela 06) que pode estar relacionada

à presença de alguma substância inibidora do composto bioativo que estava presente no

extrato bruto e foi removida pelo processo de diálise empregado.

Estes resultados indicaram que o composto bioativo permaneceu no interior da

membrana dialisadora (MWCO de 8000-10000 Da) e possui massa molecular superior a

10000 Da.

5.7 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO DE PATULINA UTILIZANDO O

EXTRATO ULTRAFILTRADO ESTÉRIL

Realizada uma ultrafiltração do extrato bruto estéril em cuba de agitação Millipore,

Modelo 8400, 400mL, diâmetro 76mm utilizando membrana Millipore ultracel amicon

YM100, membrana de celulose regenerada, de 10.000 NMWL (Nominal Molecular Weight

Limit), 76mm, a 5°C e sistema pressurizado com gás nitrogênio, foi determinada a cinética de

degradação de patulina pelo extrato ultrafiltrado.

A toxina adicionada neste extrado ultrafiltrado estéril sem teor de patulina detectável,

foi totalmente degradada durante o período de análise (48hs). Uma redução de 51% (de 3,00

µg/mL para 1,48 µg/mL) foi observada nas primeiras 16hs, 74% (de 3,00 µg/mL para 0,79

µg/mL) em 24hs e não foi detectada em 32hs de análise quando mantidas a 25°C sob

condições estáticas e estéreis (Tabela 08).

A maior redução de patulina foi constatada nas primeiras 16 horas (redução de 51%)

quando comparada ao controle (2%), passando a níveis não detectáveis em 32 horas de

análise, enquanto o controle permanecia com 96,6% (2,90 µg/mL) da toxina total adicionada

após as 48 horas.

Tabela 08. Determinação da cinética de degradação de patulina no extrato ultrafiltrado

estéril quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Tempo (h)

Água estéril* Extrato ultrafiltrado*

0 3,00 3,00

2,94± 0,030 1,48± 0,036

2,95± 0,023 0,79± 0,022

2,90± 0,018

nd**

2,90± 0,022

nd**

Água estéril utilizada como controle. Mantidos estáticos e estéreis a 25°C.

*média aritmética ± desvio padrão; **não detectado.

A Figura 10 mostra a cinética de degradação de patulina adicionada no extrato

ultrafiltrado estéril durante os intervalos de tempo 0, 16, 24, 32 e 48 horas, bem como o

controle (toxina em água estéril), quantificadas por CLAE com detector UV.

Figura 10 – Cinética de degradação de patulina no extrato ultrafiltrado estéril.

concentração inicial 3,00 µg de patulina/mL, controle (incubação em suco de

maçã estéril, 3,00 µg de patulina/mL).

Tanto no extrato dialisado como no ultrafiltrado, observou-se uma rápida degradação

da patulina quando comparada com extrato bruto (28,3% em 24hs), porém, mais lenta quando

comparada com o extrato dialisado (62,3% em 16hs e não detectada em 24hs), que pode ser

devido a aderência de uma parte do composto bioativo na membrana ultrafiltradora, bem

como à redução de sua atividade durante o tempo de ultrafiltração.

Estes resultados confirmam que o composto bioativo foi retido no extrato

ultrafiltrado após filtração na membrana de celulose regenerada (10000 NMWL) possuindo

massa molecular superior ao tamanho do poro.

Numa comparação entre as atividades degradadoras de patulina entre os diferentes

extratos por 32hs (Tabela 09) verificou-se uma maior degradação de patulina quando utilizado

o extrato dialisado, com níveis não detectáveis em 24hs de análise. O extrato ultrafiltrado foi

capaz de degradar a toxina presente, com níveis não detectáveis em 32hs de análise e o extrato

bruto, o qual consistiu de suco de maçã fermentado por 24hs e livre da biomassa, degradou a

toxina até concentrações de 1,72 µg/mL (42,7% da total adicionada) nas mesmas 32hs.

Tabela 09. Determinação da cinética de degradação de patulina nos extratos bruto, dialisado

e ultrafiltrado estéreis quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com

detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Tempo (h)

Extrato bruto* Extrato dialisado* Extrato ultrafiltrado*

0 3,00 3,00 3,00

2,37± 0,023 1,13± 0,026 1,48± 0,036

2,15± 0,016

nd**

0,79± 0,022

1,72± 0,019

nd** nd**

Mantidos estáticos e estéreis a 25°C.

*média aritmética ± desvio padrão; **não detectado.

A maior atividade do composto bioativo após etapas de purificação por diálise ou

ultrafiltração indica a eficiência desses processos.

Na Figura 11 podemos observar a rápida degradação de patulina com a utilização do

extrato dialisado e com o ultrafiltrado quando comparados ao extrato bruto.

Figura 11 – Cinética de degradação de patulina nos extratos bruto, dialisado e ultrafiltrado

estéreis.

no extrato bruto, no extrato ultrafiltrado, no extrato dialisado.

Conduzidos de modo estéreis com concentração inicial 3,00 µg de patulina/mL.

5.8 RASTREAMENTO DO COMPOSTO BIOATIVO POR ELETROFORESE

Na eletroforese sob condições não desnaturantes, para separar o composto bioativo

sem perder sua atividade, foram observadas variações na intensidade de 5 bandas protéicas as

quais possuíam valores para o fator de retenção (Rf) de 0,075; 0,21; 0,41; 0,58 e 0,73,

respectivamente, como pode ser observado na Figura 12.

Figura12 – Bandas protéicas visualizadas em gel de poliacrilamida

Concentração de 12,5% sob condições não desnaturantes separadas por eletroforese utilizando

extrato ultrafiltrado.

Ao determinar a atividade degradadora de patulina utilizando essas frações protéicas

(5 bandas) extraídas do gel não corado pelo recorte das bandas segundo valores de Rf,

seguidos de maceração, adição de 1mL de água ultrapura contendo toxina e acidificação, foi

observada esta atividade degradadora na banda com Rf = 0,73 quando a redução de patulina

foi de 48% (de 3,00 µg/mL para 1,56 µg/mL), após 24hs de incubação a 25°C em condições

estáticas, indicando efetivamente ser o composto bioativo. Nas demais frações (Rf de 0,075;

0,21; 0,41 e 0,58), a máxima redução de toxina foi de 4% (de 3,00 µg/mL para 2,88 µg/mL na

fração protéica com Rf 0,41), permanecendo 96% (2,88 µg/mL) da concentração de patulina

total adicionada (Tabela 10).

Tabela 10. Atividade degradadora de patulina pelos compostos protéicos separados por

eletroforese quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Rf das frações

protéicas analisadas

Concentração de patulina em 24

horas (µg de patulina/mL)

Porcentagem de degradação

0,075 2,93 2,3%

0,21 2,90 3,3%

0,41 2,88 4,0%

0,58 2,91 3,0%

0,73 1,56 48%

Concentração de patulina inicial de 3,00 µg de patulina/mL. Mantidos estáticos a 25°C/24hs.

A Figura 13 ilustra a atividade degradadora de patulina nas frações protéicas obtidas

pela separação em eletroforese sob condições não desnaturantes.

0,5

1,5

2,5

3,5

inicial 0,075 0,21 0,41 0,58 0,73

Concentração de patulina (µg/mL)

Figura 13 – Atividade degradadora de patulina dos compostos protéicos separados por

eletroforese.

Condições não desnaturantes.Incubação por 24hs a 25°C.

É importante destacar que o pH do gel (8,8) não foi capaz de desnaturar o composto

bioativo, uma vez que apresentou atividade após sua extração.

5.9 AVALIAÇÃO DA PUREZA DO COMPOSTO BIOATIVO E DETERMINAÇÃO DA

MASSA MOLECULAR

Determinada a banda protéica com atividade

degradadora de patulina (Rf = 0,73), o

composto bioativo purificado pelos processos de ultrafiltração e eletroforese sob condições

não desnaturantes foi analisado por SDS-PAGE (eletroforese desnaturalizante) para avaliar o

grau de pureza bem como estimar a sua massa molecular. Os géis obtidos dessa análise estão

ilustrados na Figura 14, comprovando a homogeneidade da mesma.

Figura 14 – Eletroforese SDS-PAGE para avaliação do composto bioativo e determinação de

sua massa molecular.

(A) composto bioativo produzido por Saccharomyces cerevisiae ICV D47. (B) Marcador de

massa molecular GE Healthcare.

A massa molecular do composto bioativo puro foi estimada por meio de análise de

regressão linear, plotando os valores do logaritmo da massa molecular dos padrões utilizados

versus Rf da migração relativa de cada padrão e o do composto (Figura 15). Por esses cálculos

a massa molecular do composto bioativo foi estimada em 22,07 kDa.

y = -1,6709x + 2,5636

= 0,9903

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

1,8

1,9

0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0,85

log Massa Molecular

Cálculo:

y = -1,6709.(Rf) + 2,5636

Massa Molecular = antilog y

y = - 1,6709. 0,73+ 2,5636 = 1,343843

Massa Molecular = antilog 1,343843

Massa Molecular = 22,07 kDa

Figura 15 – Curva padrão obtida pela plotagem do log da massa molecular dos padrões versus

Rf da migração relativa de cada padrão.

Curva utilizada para o cálculo da massa molecular do composto bioativo.

5.10 FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA E DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO

DO COMPOSTO BIOATIVO

O ponto isoelétrico (pI) de uma proteína corresponde ao valor de pH no qual o

somatório de todas as suas cargas parciais é igual a zero, não sendo dependentes da

concentração de proteínas (BERKELMAN; STENSTED, 2004). A análise para determinar o

ponto isoelétrico do composto bioativo realizada por focalização isoelétrica em gel de

poliacrilamida usando anfólitos Pharmalite com pH de 3,0 a 10 seguido de eletroforese SDS-

PAGE, resultou na concentração deste composto exatamente no pólo positivo, indicando que

nem o menor pH existente no gel (pH=3) foi capaz de precipitar o composto. Desta forma

estima-se que seu ponto isoelétrico é inferior a 3.

5.11 pH DE MÁXIMA ATIVIDADE DO COMPOSTO BIOATIVO

A atividade do composto bioativo produzido por Saccharomyces cerevisiae ICV

D47, acidificado em diferentes pHs (2, 3, 4, 5 e 6), mantido a 25°C por 24hs e realizado com

o extrato ultrafiltrado são mostrados na Tabela 11.

Nesta Tabela 11 pode ser observado que, dentre os pHs testados, o composto

apresentou maior atividade em pH 5, no qual não foram encontrados níveis detectáveis de

patulina após as 24hs de análise, porém, em pH 4 a degradação foi de 95% (3,00 µg/mL para

0,15µg/mL) e que o pH de máxima atividade deve encontrar-se entre os valores de 4 e 5,

apresentando uma redução de 95 % e 100% respectivamente. Desta forma o composto

apresenta uma faixa restrita de pH ótimo, onde uma pequena variação provoca a diminuição

desta atividade. Em pH 2 ele não demonstrou estabilidade, reduzindo sua atividade

degradadora em 9% (3,00 µg/mL para 2,73 µg/mL) como mostrados na Tabela 11. Isso pode

estar relacionado com seu pI (inferior a 3), onde ocorre a precipitação do composto pelas

equivalências de cargas e conseqüente perda de atividade.

Tabela 11. Determinação do pH de máxima atividade do composto bioativo presente no

ultrafiltrado estéril em 24hs, quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com

detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Água estéril* Extrato ultrafiltrado*

2,93± 0,014 2,73 ± 0,037

2,95± 0,015 1,80± 0,014

2,93± 0,028 0,15±0,030

2,94± 0,013

nd**

2,94± 0,010 0,68± 0,022

Água estéril utilizada como controle. Mantidos estáticos e estéreis a 25°C/24hs.

*média aritmética ± desvio padrão; **não detectado.

A Figura 16 ilustra a atividade do composto bioativo em degradar patulina em

diferentes valores de pHs (2, 3, 4, 5 e 6).

0,5

1,5

2,5

3,5

2 3 4 5 6

Concentração de patulina (µg/mL)

Figura 16 – Degradação de patulina pelo composto bioativo presente no extrato ultrafiltrado

estéril em pHs 2, 3, 4, 5 e 6.

Concentração inicial 3,00 µg de patulina/mL, mantidos estáticos a 25°C por 24hs.

controle

(incubação em água ultrapura estéril acidificada,

extrato ultrafiltrado acidificado.

5.12 TEMPERATURA DE MÁXIMA ATIVIDADE DEGRADADORA DO COMPOSTO

BIOATIVO

A temperatura de máxima atividade do composto bioativo quando analisada

utilizando extrato ultrafiltrado adicionados de 3µg da toxina/mL e armazenados por 16hs nas

temperaturas de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50°C, foi de 35°C.

Os resultados estão apresentados na Tabela 12, onde é possível verificar maior

redução nos teores de patulina quando utilizada a temperatura de 35°C (74% de redução). Na

temperatura de 30°C apresentou a segunda maior redução de 69,3%, e compreenderam as

duas temperaturas onde o composto apresentou maior atividade.

Nas temperaturas de 20 e 25°C a degradação de patulina foi menor (52,3% e 50,7%,

respectivamente), bem como, após o aumento da temperatura para 40 e 45°C (61,7% e 52,6%,

respectivamente). Na temperatura de 50°C o composto apresentou a menor atividade

degradadora (40%) dentre as temperaturas testadas, indicando inibição da atividade ou perda

de sua estabilidade pelo calor.

Tabela 12. Determinação da temperatura de máxima atividade do composto bioativo presente

no ultrafiltrado estéril em 16hs, quantificada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

com detector UV.

3,00 µg de patulina/mL

Temperatura

Água estéril* Extrato ultrafiltrado*

2,93± 0,013 1,43± 0,032

2,95± 0,032 1,48± 0,043

2,95± 0,021 0,92± 0,017

2,92± 0,032 0,78± 0,026

2,94± 0,015 1,15± 0,014

2,93± 0,040 1,42± 0,022

2,91± 0,025 1,80± 0,007

Água estéril utilizada como controle. Mantidos estáticos e estéreis por 16hs.

*média aritmética ± desvio padrão.

A Figura 17 ilustra a atividade do composto bioativo em degradar patulina à

temperatura de 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50°C por 16hs.

0,5

1,5

2,5

3,5

20 25 30 35 40 45 50

Temperatura (°C)

Concentração de patulina (µg/mL)

Figura 17 – Degradação de patulina pelo composto bioativo presente no extrato ultrafiltrado

estéril à diferentes temperaturas.

Concentração inicial 3,00 µg de patulina/mL.

controle (incubação em água ultrapura estéril,

extrato ultrafiltrado.

Estas análises foram realizadas com o extrato ultrafiltrado estéril que estava

armazenado a -20°C até o período das análises, o qual apresentou atividade mesmo após

congelamento e descongelamento, mostrando a estabilidade do composto bioativo à baixas

temperaturas.

5.13 PRESENÇA DE CARBOIDRATOS

O Método fenol sulfúrico (DUBOIS et al., 1956) foi utilizado para determinação de

carboidratos. Com limite de dectecção de 1µg/mL, o composto bioativo não apresentou

níveis detectáveis de carboidratos, indicando pouca ou nenhuma glicosilação.

5.14 ESTABILIDADE TÉRMICA DO COMPOSTO BIOATIVO A 80ºC

Após tratamento térmico empregado a 80°C por 20 minutos, o qual é utilizado na

indústria processadora de maçãs, o composto bioativo não apresentou atividade degradadora

de patulina. Este resultado pode ser devido à baixa ou nenhuma glicosilação do composto,

uma vez que não foi detectada a presença de carboidratos. Wang et al. (1996) encontraram

que a estabilidade térmica de proteínas parece depender do teor de carboidratos, ou seja, das

glicosilações presentes, tendo descrito que a maior estabilidade térmica foi observada em

proteínas mais fortemente glicosiladas, independentemente das cadeias de carboidratos

ligados covalentemente.

6. CONCLUSÕES

A metodologia de quantificação da patulina por CLAE foi padronizada, apresentando

recuperação de 86,24%, um limite de detecção de 4,3 µg/L e de quantificação de 8,6 µg/L.

Em maçãs destinadas ao consumo in natura apresentando manchas de infecção

microbiana, a toxina ocorreu em concentrações altas, mesmo nas partes não afetadas, o que

pode se constituir num problema ao consumidor.

A patulina adicionada no suco inoculado com S. cerevisiae foi reduzida até 3,6% da

concentração inicial em 120 horas, ocorrendo 64,6% de degradação em 32 horas.

O extrato bruto obtido por fermentação alcoólica com S. cerevisiae foi capaz de

degradar patulina, 50% da total adicionada em 48 horas e 55,7% em 96 horas.

O extrato bruto dialisado degradou 62,3% da patulina adicionada em 16 horas,

chegando a níveis não detectáveis a partir de 24 horas.

O extrato bruto ultrafiltrado foi capaz de degradar 51% da patulina em 16 horas de

análise, 74% em 24 horas e níveis não detectáveis em 32 horas.

O composto bioativo foi purificado em duas etapas, através de técnica de

ultrafiltração seguida de eletroforese em condições não desnaturantes.

A massa molecular encontrada para este composto foi estimada em 22,07 kDa,

possuindo ponto isoelétrico inferior a 3.

pH e temperatura de máxima atividade degradadora encontrados estavam entre 4 e 5,

e 30 e 35°C, respectivamente.

O composto não apresentou glicosilações detectáveis por análise de carboidratos e

uma baixa estabilidade térmica, não resistindo a temperatura de 80°C por 20 minutos.

O composto bioativo demonstrou eficiente degradação de patulina devendo ser

realizados testes de toxigenicidade deste e dos subprodutos da degradação de patulina para

que possa ser utilizado na degradação da toxina pela sua adição em produtos derivados de

maçã, antes ou após sua pasteurização.

7. REFERÊNCIAS

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<http://www.abpm.org.br> Acesso em: 25/10/2004.

ABPM - Associação Brasileira dos Produtores de Maçã. Disponível em:

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Autorizo a reprodução xerográfica para fins de pesquisa.

São José do Rio Preto, 26 / 02 / 2010

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Marcos Giovani Celli

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