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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
DISSERTAÇÃO
AÇÃO DE Beauveria bassiana e Metarhizium
anisopliae SOBRE POPULAÇÕES DE
Rhipicephalus (Boophilus) microplus DE
DIFERENTES LOCALIDADES.
Wendell Marcelo de Souza Perinotto
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AÇÃO DE Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae SOBRE
POPULAÇÕES DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus DE
DIFERENTES LOCALIDADES.
Wendell Marcelo de Souza Perinotto
Sob a Orientação da Professora
Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias, Área de
Concentração em Parasitologia
Animal.
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2010
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579.5
P445a
T
Perinotto, Wendell Marcelo de
Souza, 1983-.
Ação de Beauveria bassiana e
Metarhizium anisopliae sobre
populações de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus de diferentes
localidades / Wendell Marcelo de
Souza Perinotto – 2010.
61 f.: il.
Orientador: Vânia Rita Elias Pinheiro
Bittencourt.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Curso de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias.
Bibliografia: f. 40-47.
1. Fungos entomopatogênicos -
Teses. 2. Rhipicephalus - Teses. 3.
Carrapato – Controle – Teses. I.
Bittencourt, Vânia Rita Elias
Pinheiro, 1959-. II. Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro.
Curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias. III. Título.
Dedicatória:
Aos meus pais, Helena e Luiz, meus
irmãos Éder e Cintia, todos meus
familiares, especialmente minha
querida avó Célia (in memorian) e
minha noiva Marcela.
AGRADECIMENTOS
Sei que tudo o que sou e o que sei devo a Deus e é a ele que agradeço em primeiro lugar por
mais essa vitória em minha vida.
Aos meus queridos pais, cujas palavras me faltam para expressar o quanto sou grato por tudo
o que sempre fizeram por mim, mesmo com tantas dificuldades me possibilitaram chegar até
aqui.
Aos meus tios Edinho e Maria Helena que me acolheram e me deram todo apoio para que eu
pudesse realizar este sonho e a todos meus familiares por compartilharem comigo os desafios
desta caminhada.
A professora Vânia que sempre me ajudou nesta minha vida acadêmica desde a bolsa de
alimentação até aqui. Foram muitos anos de orientação, ensinamento, paciência e amizade,
que juntos possibilitaram o meu crescimento acadêmico e pessoal.
A Marcela por todo carinho, companheirismo, incentivo e compreensão por todos estes anos
me estimulando a concretizar meus objetivos.
Aos amigos de laboratório Isabele da Costa Ângelo, Patrícia da S. Golo, Mariana G.
Camargo, Simone B. Quinelato, Ana Paula Moraes, Fillipe Sá, Josie Albuquerque, Caio
Junior Balduino e George Eduardo Gabriel Kluck por todo companheirismo e auxílio na
minha aprendizagem e por todos momentos vividos no laboratório.
Aos amigos que passaram pelo LCM e me ensinaram muitas coisas que sei hoje: Éverton K.
K. Fernandes, Thiago C. Bahiense, Andréia Terra, Rosana Colatino, Denise Melo e Sandra
Borges.
A Dra. Márcia Cristina de Azevedo Prata pelas sugestões, dedicação, simpatia e
principalmente o bom humor que nos enche de ânimo.
Ao Dr. John Furlong, Dra. Gisela Lara Costa e ao Dr. Fábio Scott pelas sugestões para o
engrandecimento na dissertação.
Aos funcionários Mauricio, Ivan, Arthur, Léo, Rodrigo, Zé pela disponibilidade nas horas que
precisei.
A todos professores do curso de Ciências Veterinárias da UFRRJ e aos colegas de turma pelos
conhecimentos trocados nas salas de aulas.
Ao CNPq pelo auxilio financeiro.
BIOGRAFIA
Wendell Marcelo de Souza Perinotto, filho de Luiz Antônio Valentin Perinotto e
Helena Maria de Souza Perinotto, nasceu na cidade de Casa Branca-SP, no dia 29 de março
de 1983.
Cursou o ensino fundamental na Escola Estadual de Primeiro e Segundo Grau
Professora Rita de Macedo Barreto, na cidade de Itobi-SP. Concluiu o ensino Médio e técnico
na E.T.A.E. “Dr. Carolino da Mota e Silva”, formando em Técnico em Agropecuária no ano
de 2000.
Ingressou na faculdade no curso de Zootecnia em outubro de 2002. Porém no ano de
2004, através de um processo seletivo interno, transferiu-se para o curso de Medicina
Veterinária e concluiu o curso em dezembro de 2007, na Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Seropédica-RJ.
Durante todo o período da graduação foi bolsista no Laboratório de Controle
Microbiano, participando de artigos científicos, congressos e eventos locais.
Em março de 2008 iniciou o curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área
de concentração em Parasitologia Animal, ao nível de Mestrado, na Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro.
RESUMO
PERINOTTO, Wendell Marcelo de Souza. Ação de Beauveria bassiana e Metarhizium
anisopliae sobre populações de Rhipicephalus (Boophilus) microplus de diferentes
localidades. 2010. 47 p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia
Veterinária). Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2010.
Estudos recentes indicaram a possibilidade de diferença na susceptibilidade entre populações
distintas de carrapatos, quando submetidos ao tratamento com fungos entomopatogênicos.
Para avaliar se ocorre realmente essa diferença, foi avaliada a ação in vitro dos fungos M.
anisopliae e B. bassiana sobre duas populações distintas de R. (B.) microplus, oriundas de
diferentes propriedades. Foram realizados bioensaios sobre fêmeas ingurgitadas, ovos e
larvas. Para avaliar o efeito dos fungos sobre as fêmeas observaram-se os parâmetros
reprodutivos. Para ovos analisou-se o percentual de eclosão das larvas e sobre larvas
analisaram-se o percentual de mortalidade e tempo médio letal. Foram formados cinco grupos
por propriedade (10
8
, 10
7
conídios/ml de M. anisopliae; 10
8
, 10
7
conídios/ml de B. bassiana e
controle) com 10 repetições cada. No tratamento, as espécimes foram imersas em um ml da
suspensão testada durante três minutos e o grupo controle foi exposto apenas ao diluente. Os
resultados obtidos demonstraram que os fungos influenciaram na maioria dos parâmetros
reprodutivos das fêmeas de ambas as propriedades. Para verificar a susceptibilidade das
populações distintas, foram realizadas análises estatísticas comparando os tratamentos sobre
as fêmeas de diferentes origens. Pode-se observar que houve diferença significativa nos
seguintes parâmetros: períodos de pré-postura, período de eclosão das larvas e índice de
produção de ovos. Além disso, pode-se observar que o isolado Bb 986 de B. bassiana foi mais
patogênico do que o isolado Ma 959 de M. anisopliae sobre fêmeas ingurgitadas, promovendo
um percentual de controle de 49%. No bioensaio com ovos, a redução do percentual de
eclosão das larvas variou entre 3,1 a 49,5% em uma propriedade e 3,4 a 42,7% em outra,
porém não houve diferença significativa entre as duas populações nesta fase do R. (B.)
microplus. No bioensaio com larvas o percentual de mortalidade das larvas variou de 91,8 a
98,7% em uma e 71,0 a 94,0% em outra propriedade. Além disso, o tempo médio letal (LT
90) foi de 19,52 a 27,51 dias em uma das propriedades e de 22, 89 a 37,31 dias na outra.
Através destes resultados, pode-se concluir que os fungos entomopatogênicos utilizados neste
estudo são capazes de agir sobre esta espécie de carrapato. No entanto, populações distintas
apresentam variação na sua susceptibilidade à B. bassiana e M. anisopliae.
Palavras-chave: Rhipicephalus (B.) microplus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae,
susceptibilidade e controle biológico.
ABSTRACT
PERINOTTO, Wendell Marcelo de Souza. Action of Beauveria bassiana and Metarhizium
anisopliae against Rhipicephalus (Boophilus) microplus populations of differents
locations. 47p. Dissertation (Master Science in Veterinary Parasitology, Veterinary Science).
Veterinary Institute, Departament of Animal Parasitology, Federal Rural University of Rio de
Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Recent studies have indicated the possibility of difference in susceptibility between different
populations of ticks, while undergoing treatment with entomopathogenic fungi. To assess
whether this difference actually occurs, this study intents to verify the in vitro effect of fungi
Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana on two distinct populations of Rhipicephalus
(B.) microplus collected from different properties. Experiments were conducted on engorged
females, eggs and larvae. To evaluate the effect of fungi female reproductive parameters were
observed. In eggs, the hatch percentage was evaluated, and in larvae, the mortality rate was
analyzed. Five groups were formed (10
8
, 10
7
conídia/ml of M. anisopliae; 10
8
, 10
7
conídia/ml
of B. bassiana and control group) with 10 repetitions each. The specimens were immersed in
one ml of the suspension for three minutes and the control group was exposed only to diluent.
The results showed that the fungi were efficient, influencing all females’s reproductive
parameters of both properties. To verify the susceptibility of different populations statistical
analysis were carried out comparing the treatments on females of different origins. The
following parameters presented significant difference: periods of the pre oviposition, larvae
hatch and egg production index. Furthermore, B. bassiana was more effective than M.
anisopliae on engorged female. In the bioassay with eggs the hatch percentage ranged
between 3.1 and 49.5% in one property and from 3.4 to 42.7% in another, but there was no
significant difference between the two populations at this stage of R. (B.) microplus. At the
bioassay with larvae the mortality percentage of larvae ranged from 91.8 to 98.7% in one and
71.0 to 94,0% in another property. Moreover, the average lethal time (LT 90) ranged from
19.52 to 27.51 days in one of the properties and 22.89 to 37.31 days in the other. Through
these results, it can be concluded the entomopathogenic fungi used in this study are effective
in controlling this tick species. However, different populations have variation in their
susceptibility to B. bassiana and M.anisopliae.
Key-words: Rhipicephalus (B.) microplus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae,
susceptibility and biological control.
Lista de figuras:
Figura 1. Média e desvio padrão do período de pré-postura, em dias, de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundos da PESAGRO-RJ e
Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais
dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria
bassiana.........................................................................................................................
Figura 2. Média e desvio padrão do peso da postura, em gramas, de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundos da PESAGRO-RJ e
Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais
dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb986 de Beauveria
bassiana.........................................................................................................................
Figura 3. Média e desvio padrão do período de postura, em dias, de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ
e da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações
conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria
bassiana...........................................................................................................................
Figura 4. Média e desvio padrão do período de incubação, em dias, de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ
e da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações
conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria
bassiana..........................................................................................................................
Figura 5. Média e desvio padrão do período de eclosão das larvas, em número de
dias, de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da
PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes
concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de
Beauveria bassiana........................................................................................................
Figura 6. Média e desvio padrão do percentual de eclosão das larvas oriundas dos
ovos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da
PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes
concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de
Beauveria bassiana........................................................................................................
Figura 7. Média e desvio padrão do peso residual de fêmeas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite (UFRRJ),
tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana...................................................................
Figura 8. Média e desvio padrão do índice nutricional (%) de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura
de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma
959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria................................................
19
20
23
24
25
26
27
28
Lista de figuras (continuação):
Figura 9. Média e desvio padrão do índice de produção de ovos (%) de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da
Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais
dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria
bassiana...........................................................................................................................
Figura 10. Média do percentual de eclosão das larvas oriundas dos ovos de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de ambas propriedades, tratadas
com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana..................................................................
Figura 11. Média do percentual de mortalidade no 10º dia pós tratamento das larvas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de ambas propriedades,
tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana...................................................................
Figura 12. Média do percentual de mortalidade no 20º dia pós tratamento das larvas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de ambas propriedades,
tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana...................................................................
Figura 13. Média do percentual de mortalidade no 30º dia pós tratamento das larvas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de ambas propriedades,
tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana...................................................................
29
30
31
32
32
Lista de tabelas:
Tabela 1. Concentrações de conídios dos isolados 959 de Metarhizium anisopliae e
986 de Beauveria bassiana, utilizados nas diferentes fases de desenvolvimento de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus..........................................................................
Tabela 2. Valores médios e desvio padrão do Peso da fêmea (P.F.); Período de Pré-
Postura (P.P.P.); Peso da Postura (Pes. P); Período de Postura (Per. P.); Período de
Incubação (P. I.); Período de Eclosão (P. Ec.); Percentual de Eclosão (% Ec.);
Índice Nutricional (I. N.) e Índice de Produção de Ovos (I.P.O.) de fêmeas
alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da Pesagro-RJ,
tratadas com diferentes concentrações de Metarhizium anisopliae isolado (Ma 959)
e Beauveria bassiana isolado (Bb 986)................................................................
Tabela 3. Valores médios e desvio padrão do Peso da fêmea (P.F.); Período de Pré-
Postura (P.P.P.); Peso da Postura (Pes. P); Período de Postura (Per. P.); Período de
Incubação (P. I.); Período de Eclosão (P. Ec.); Percentual de Eclosão (% Ec.);
Índice Nutricional (I. N.) e Índice de Produção de Ovos (I.P.O.) de fêmeas
alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da Bovinocultura
de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações de Metarhizium anisopliae
isolado (Ma 959) e Beauveria bassiana isolado (Bb 986)............................................
Tabela 4. Percentual de Controle de fêmeas alimentadas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ (IZ) e Bovinocultura de Leite
(IZ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de
Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana..........................................
Tabela 5. Média do percentual de eclosão das larvas oriundas dos ovos de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ (P) e da
Bovinocultura de leite (IZ), tratados com diferentes concentrações conidiais dos
isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria
bassiana.......................................................................................................................
Tabela 6. Tempo Médio Letal (LT 90) em número de dias, das larvas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ (P) e da
Bovinocultura de Leite da UFRRJ (IZ), tratadas com diferentes concentrações
conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria
bassiana.......................................................................................................................
Tabela 7. Percentual de eficiência de produtos comerciais a carrapatos
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da Bovinocultura de Leite da
UFRRJ (FAIZ) e da PESAGRO-RJ............................................................................
14
21
22
28
29
32
35
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus..............................................................
2.2 Controle microbiano utilizando fungos entomopatogênicos...........................
2.3 Metarhizium anisopliae ..................................................................................
2.4 Beauveria bassiana.........................................................................................
2.5 Mecanismos de resistência e sensibilidade nos carrapatos..............................
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização do Experimento .............................................................................
3.2 Obtenção e Manutenção dos Isolados Fúngicos ...............................................
3.3 Elaboração das Suspensões e Quantificação dos Inóculos ...............................
3.4 Viabilidade das Suspensões de Conídios ..........................................................
3.5 Obtenção de Rhipicephalus (Boophilus) microplus...........................................
3.6 Delineamento Experimental...............................................................................
3.7 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas .................................................................
3.8 Bioensaio com Ovos..........................................................................................
3.9 Bioensaio com Larvas........................................................................................
3.10 Reisolamento dos isolados fúngicos após o bioensaio.......................................
3.11 Análise Estatística................. ............................................................................
4 RESULTADOS
4.1 Viabilidade das Suspensões de Conídios ..........................................................
4.2 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de R. (B.) microplus................................
4.2.1 Peso médio das fêmeas ingurgitadas..............................................................
4.2.2 Período de pré-postura ...................................................................................
4.2.3 Peso da postura...............................................................................................
4.2.4 Período de postura .........................................................................................
4.2.5 Período de incubação .....................................................................................
4.2.6 Período de eclosão das larvas ........................................................................
4.2.7 Percentual de eclosão ....................................................................................
4.2.8 Peso residual das fêmeas................................................................................
4.2.9 Índice nutricional ...........................................................................................
4.3 Índice de produção de ovos ...........................................................................
4.3.1 Percentual de controle.................................................................................
4.4 Bioensaio com Ovos de R. (B.) microplus......................................................
4.5 Bioensaio com Larvas não Alimentadas de R. (B.) microplus.......................
4.5.1 Percentual de mortalidade..............................................................................
4.5.2 Tempo Médio Letal........................................................................................
4.6 Reisolamento fúngico.....................................................................................
5 DISCUSSÃO
6 CONCLUSÕES
1
3
5
6
8
10
12
12
12
13
13
14
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16
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16
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18
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27
28
29
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30
31
32
33
34
39
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
40
1
1 INTRODUÇÃO
Os carrapatos são parasitas de diversas espécies de mamíferos, inclusive o homem, e
podem ser causadores de consideráveis perdas econômicas, sobretudo sobre a pecuária
brasileira. As perdas econômicas causadas pelos principais ectoparasitos apenas em bovinos
no Brasil são estimadas em 2,650 bilhões de dólares anuais, destacando-se as causadas pelo
carrapato dos bovinos, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com 2 bilhões (GRISI et al.,
2002).
O parasitismo por esse carrapato causa o desenvolvimento lento dos animais, a
diminuição da produção de leite e carne, perdas na produção do couro e gastos com produtos
carrapaticidas, além de predispor ao surgimento de miíases e transmitirem agentes de doenças
como Anaplasmose e Babesiose que resultam no atraso do desenvolvimento dos animais,
inclusive podem levar seu hospedeiro à morte.
Para o controle de Rhipicephalus (B.) microplus vários métodos são aplicados, e estão
relacionados com as fases não parasitária e parasitária. As técnicas empregadas no controle da
fase não parasitária estão correlacionadas com o manejo das pastagens, já as medidas para o
controle da fase parasitária incluem pesquisas sobre a resistência do hospedeiro,
desenvolvimento de vacinas e uso de produtos carrapaticidas.
A utilização de produtos carrapaticidas é uma prática bastante comum entre os
pecuaristas, porém a utilização indiscriminada desses produtos pode acarretar sérios
problemas. As principais desvantagens da utilização dos acaricidas químicos no gado bovino
são o elevado custo dos produtos, o desenvolvimento de resistência em carrapatos e a
contaminação ambiental e de alimentos pelos acaricidas e seus resíduos. Portanto, a utilização
exclusiva de carrapaticidas é cada dia menos viável em termos práticos e econômicos,
tornando-se necessária a adição de métodos alternativos de controle. Dessa forma, o controle
microbiano vem se destacando, principalmente, na área da entomologia agrícola.
Inúmeros são os microorganismos que têm sido isolados de artrópodes, mas somente
um pequeno número deles tem mostrado algum potencial real para o controle de vetores,
sendo que os agentes mais efetivos têm sido descobertos em países de clima temperado e
tropical.
Os fungos vêm sendo avaliados como agentes promissores para uso em controle de
insetos e outros artrópodes transmissores de agentes de doenças para o homem e animais. Os
2
fungos mais utilizados para o controle de vetores pertencem aos gêneros: Metarhizium,
Beauveria, Lecanicillium, Isaria, Paecilomyces, entre outros.
A evolução da resistência tem sido um mecanismo de defesa dos insetos contra as
táticas de controle. Este problema vem ocorrendo mais freqüentemente com o controle
químico, pois esta tática tem sido a mais difundida no manejo de pragas. Porém, já se sabe
que o problema da resistência de artrópodes não está restrito aos produtos químicos, pois a
mesma já foi identificada para os métodos biológicos de controle.
Trabalhos recentes realizados no Laboratório de Controle Microbiano da UFRRJ têm
apresentado resultados que nos levam a crer que existe uma diferente resposta pelos
carrapatos de diferentes localidades aos fungos entomopatogênicos.
Para verificar esta hipótese, este trabalho avaliou a ação in vitro do isolado 959 de M.
anisopliae e o isolado 986 de B. bassiana em diferentes concentrações para ovos, larvas e
fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus (B.) microplus provenientes de duas propriedades
distintas.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus
O carrapato R. (B.) microplus (Acari: Ixodidae) é originário da Ásia e foi introduzido
no Brasil junto com os primeiros bovinos trazidos pelos colonizadores, onde se adaptou
perfeitamente ao nosso clima (BARCI, 1997).
Está presente em praticamente todos os países compreendidos entre os paralelos 32º de
latitude norte e 35º de latitude sul, sendo ectoparasita de maior relevância na pecuária desses
países (NUÑEZ, et al., 1982). A distribuição deste carrapato na América do Sul ocorre no
norte da Argentina, Paraguai, Uruguai, leste da Bolívia, Colômbia e Venezuela, além do
Brasil, com especial atenção às regiões Sudeste e Centro-oeste e toda a costa brasileira,
obviamente pelas boas condições de umidade e temperatura e pela exploração pecuária mais
intensa (ESTRADA-PEÑA, 1999).
O hospedeiro preferencial do R. (B.) microplus é o bovino, sendo que as maiores
infestações ocorrem em Bos taurus e as menores em Bos indicus. Porém, ovelha, cavalo,
veado, cão, cabra, homem (GONZALES, 1974), búfalos, gatos, coelhos, cangurus, porcos e
onças (PEREIRA, 1980), também podem ser hospedeiros, mas apenas em épocas de grande
infestação nas pastagens.
O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, cuja produtividade é
determinante na economia do país. No entanto, devido às condições climáticas e deficiência
no manejo, o gado brasileiro é altamente acometido pelo carrapato dos bovinos, produzindo
perdas diretas e indiretas pela transmissão de agentes de doenças e pelo custo de seu controle.
Grisi et al., (2002) estimaram que os prejuízos econômicos ocasionados pelo carrapato R. (B.)
microplus no Brasil gira em torno de 2 bilhões de dólares por ano. Estes gastos estão
relacionados com a compra de carrapaticidas, mão de obra para sua administração e pela
perda na produtividade do rebanho (PENNA, 1990).
Uma fêmea de R. (B.) microplus ingere de 0,5 a 3,0 ml de sangue em toda a sua vida.
Durante o repasto sanguíneo provoca intenso desconforto aos bovinos não permitindo que
estes pastem normalmente, diminuindo assim a taxa diária de conversão do alimento em carne
e/ou leite (FURLONG, 1993). Além disso, no momento de sua alimentação, o carrapato
inocula saliva no seu hospedeiro, podendo transmitir os agentes do complexo da tristeza
4
parasitária, que causam doença com elevado grau de morbidez, podendo levar o animal a
morte (PETER et. al, 2005).
Os pontos de parasitismo causados pelos carrapatos se tornam em lesões da pele, que
além de serem prejudiciais às indústrias de couro, promovendo a desvalorização no preço
final do produto, predispõem o desenvolvimento de bactérias e larvas de moscas (HORN;
ARTECHE, 1985).
Através de um estudo realizado na Austrália foi estimado que cada fêmea de R. (B.)
microplus, seria responsável pela queda de produção diária de aproximadamente 8,9 ml de
leite e de 1,0g de peso corporal (JONSSON et al., 1998).
O ciclo de vida do carrapato R. (B.) microplus divide-se em fase de vida livre e fase de
vida parasitária. Na fase de vida livre, são necessários em torno de três dias para a pré-
postura; de três a seis semanas para a postura; de vinte e dois a trinta dias para a eclosão das
larvas e de dois a três dias para o fortalecimento de suas cutículas, transformando-as em
larvas infestantes. A cada postura uma fêmea produz de 2000 a 3000 ovos. Na fase parasitária
são necessários, em média, de 18 a 26 dias para a fixação, alimentação, troca de cutícula, fase
adulta e acasalamento, assim como para a alimentação, ingurgitamento e queda das fêmeas.
Os machos permanecem mais tempo sobre o bovino e se acasalam com outras fêmeas
(FURLONG, 1993).
Vários autores já demonstraram a influência dos fatores sazonais no ciclo de vida dos
carrapatos e a consequente diferença de infestações nos animais, de acordo com o clima da
região em que vivem e com a época do ano. A fase de vida livre é bastante influenciada,
principalmente pela baixa temperatura e umidade (ROCHA et al, 2006).
O controle dos carrapatos é extremamente complexo, devido vários fatores, entre eles:
a grande quantidade de ovos que uma fêmea produz que posteriormente se transformam em
larvas de primeiro instar (KETTLE, 1995), a falta de conhecimentos dos pecuaristas e peões
que lidam com o rebanho e entre outros o desenvolvimento de resistência a diversas bases
químicas (ROCHA et al., 2006).
Na prática, o controle dos carrapatos é feito basicamente através da utilização de
acaricidas químicos. Entretanto, devido às conseqüências provocadas pelo mau uso destes
acaricidas, o controle biológico está sendo cada vez mais atrativo, pois causa menos danos ao
meio ambiente e à saúde humana, além disso, a população humana segue uma tendência
crescente no consumo de produtos orgânicos (SAMISH et al., 2004).
5
2.2 Controle microbiano utilizando fungos entomopatogênicos
O controle microbiano pode ser definido sucintamente como a intervenção humana no
comportamento natural de microrganismos, para controlar e/ou combater as chamadas pragas
parasitárias, observadas tanto na agricultura quanto em medicina veterinária.
A primeira classificação de um entomopatógeno foi feita por Réaumur em 1726,
identificando um fungo do gênero Cordyceps atacando um lepidóptero. Em 1835, Agostino
Bassi, comprovou que o fungo Beauveria bassiana, era o causador de uma doença chamada
“Muscardine Branca”, muito importante para o bicho da seda, demonstrando a natureza
infecciosa de um agente microbiano para um animal (ALVES, 1998).
O controle microbiano possui atributos favoráveis que o possibilita ser usado como
medida estratégica para controle de pragas. Esses fatores são a alta patogenicidade
apresentada por alguns microrganismos, a capacidade de multiplicação e dispersão no
ambiente, o caráter enzoótico e a não toxicidade de mamíferos. Neste tipo de controle há uma
harmonia com o ambiente, e espera-se que haja a redução de populações de insetos
indesejáveis (pragas) para níveis que não provoquem prejuízos. Outra grande vantagem, é que
o controle biológico possibilita a associação de microrganismos com formulações
medicamentosas, diminuindo os resíduos ou toxicidade para animais e o ambiente. Além
disso, há diminuição da possibilidade de aparecimento de resistência, pois os microrganismos
utilizam diversos mecanismos para parasitar seus hospedeiros (ALVES, 1998).
Os fungos entomopatogênicos são os agentes microbianos mais promissores como
método alternativo ao controle químico dos carrapatos, isso se deve a capacidade destes
organismos em penetrar diretamente pela cutícula do artrópode, além disso, não precisa ser
ingerido pelo hospedeiro para iniciar a infecção. Na maioria dos casos os fungos são capazes
de infectar todos os estágios de desenvolvimento do carrapato. A grande variabilidade
genética apresentada pelos fungos entomopatogênicos através de técnicas apropriadas
possibilita a seleção de isolados fúngicos altamente virulentos, mais específicos e tolerantes as
condições climáticas para serem utilizados como inseticidas microbianos (ALVES, 1998).
O controle biológico de carrapatos utilizando fungos entomopatogênicos tem
apresentado resultados potencialmente satisfatórios. Dentre os fungos estudados, B. bassiana
e M. anisopliae são os que têm apresentando resultados mais satisfatórios em condições
laboratoriais, demonstrando-se patogênicos para várias espécies de carrapatos, como
Amblyomma cooperi, (REIS et al., 2003), Amblyomma cajennense (REIS et al., 2004),
Amblyomma variegatum (MARANGA et al., 2005), Rhipicephalus sanguineus (GARCIA et
6
al., 2004; GARCIA et al., 2005; PRETTE et al., 2005) e Rhipicephalus (B.) microplus
(BITTENCOURT et al., 1992; MONTEIRO et al., 1998).
No entanto, sua aplicabilidade está restrita a testes in vitro e diretamente no hospedeiro
(BITTENCOURT et al., 1994 a). A maioria dos testes que foram realizados em nível de
campo com fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos na América do Sul
demonstrou baixa eficácia (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008), com exceção de uma
formulação de gel de celulose polimeralizada e conídios de Beauveria bassiana aplicada
diretamente nas orelhas dos eqüinos para reduzir a infestação de Anocentor nitens (SOUZA et
al., 2009).
Provavelmente, a baixa eficiência dos fungos em testes de campo está relacionada a
fatores bióticos e abióticos que podem influenciar na sua sobrevivência, propagação e
infecção do hospedeiro (GOETTEL et al., 2000).
Os fatores abióticos são essenciais para a sobrevivência dos fungos, dentre estes a
radiação solar UV é considerada a de maior importância (CAGAN; SVERCEL, 2001), pois
pode inativar o conídio, ocasionar danos letais ao DNA e mutações gênicas (NICHOLSON et
al., 2000). Outros fatores de extrema importância para os fungos são a temperatura e umidade.
Rath et al. (1992) observou que em altas temperaturas a sobrevivência do fungo foi
prejudicada, enquanto que em baixas temperaturas ocorreu maior persistência, característica
essa desejável. Sobre a influência de fatores bióticos no desenvolvimento fúngico, Groden;
Lockwood (1991), relataram que microrganismos presentes na microbiota do solo exercem
ação fungistática inibindo a atividade ou sobrevivência dos fungos entomopatogênicos.
A busca de novos fungos e utilização dos mesmos no controle biológico de carrapatos
se deve aos resultados promissores encontrados em testes in vitro. Por isso, a pesquisa nesta
área vem sendo bastante explorada e o número de trabalhos é cada vez maior. O que tem se
buscado é estabelecer estratégias racionais e eficazes para possibilitar uma forma de manejo
integrada para controle de artrópodes (CHANDLER et al., 2000).
2.3 Metarhizium anisopliae
Entre os fungos utilizados no controle biológico de pragas de importância agrícola e
veterinária, o fungo M. anisopliae se destaca como um agente microbiano de extrema
importância. Sua ação é amplamente conhecida, ocorrendo em diversas regiões, desde
ambientes de clima temperado até clima tropical. Pertencente à classe Deuteromycetes, ordem
Moniliales, família Moniliaceae, foi descrito por Metschinikoff em 1879 pela primeira vez
7
como Entomophtora anisopliae. Este pesquisador realizou o primeiro trabalho de controle
microbiano utilizando este fungo para o controle de larvas do besouro Anisopliae austriaca, e
foi finalmente classificado por Sorokin em 1883 como Metarhizium anisopliae. A partir de
então, a utilização deste patógeno vêm sendo estudada sobre muitas espécies de insetos, com
grandes potencialidades para o controle biológico, tendo como hospedeiros mais de 300
espécies de insetos (ALVES, 1998).
Recentemente, através de estudos baseados em técnicas moleculares, novas variedades
da espécie M. anisopliae foram sugeridas: M. anisopliae var. anisopliae, M. anisopliae var.
lepidiotum, M. anisopliae var. acridum, M. anisopliae var. majus e M. anisopliae var.
dcjhyium (DRIVER et al., 2000; DONG et al., 2007).
M. anisopliae é um fungo de cultivo simples, necessitando basicamente de uma fonte
de amido, desenvolve-se em diversos meios de cultura (AZEVEDO, 1998), é cosmopolita e
apresenta grande potencial como entomopatógeno, por isso, é um dos fungos que mais tem
sido estudado em programas de manejo biológico de pragas (ONOFRE et al., 2002).
No Brasil os principais projetos de controle de pragas envolvendo M. anisopliae são:
cigarrinha da cana-de-açúcar (Mahanarva posticata, M. fimriolata), cigarrinha das pastagens
(Deois flavopicta, Zulia entreriana), cupim das pastagens (Cornitermes cumulans), cupim da
cana-de-açúcar (gênero Heterotermes), broca-da-bananeira (Cosmopolites sordidus), broca-
dos-citros (Diploschema rotundicolle), percevejo-do-colmo do arroz (Tibraca limbativentris)
e a broca-do-café (Hipothenemus hampei) (ALVES, 1998).
Além desses projetos, o fungo M. anisopliae vem sendo amplamente estudado em
ensaios laboratoriais no controle de carrapato e tem demonstrado eficiência sobre várias
espécies como Rhipicephalus sanguineus, Anocentor nitens, Amblyomma variegatum,
Amblyomma Cajennense, Rhipicephalus (B.) microplus (KAAYA et al., 1996; MONTEIRO
et al., 1998; BITTENCOURT et al., 1999; BITTENCOURT, 2000; PAIÃO et al., 2001;
GARCIA et al., 2004; LOPES et al., 2007).
A etapa inicial do processo de infecção do Metarhizium anisopliae, se dá pela adesão e
germinação de conídios do fungo na superfície do inseto, seguida de penetração da hifa
através da cutícula. O processo de adesão depende da presença de enzimas (esterases e
proteases) que ocorrem na superfície dos conídios não germinados e que alteram a superfície
do tegumento do inseto, favorecendo a nutrição e a germinação do fungo (St. LEGER et al.,
1991). Na extremidade do tubo germinativo é formada uma estrutura denominada apressório,
que corresponde a uma dilatação da hifa, onde ocorre elevada atividade metabólica devido à
8
produção de enzimas (proteases, lipases e quitinases). Na penetração estão envolvidos os
fatores físicos (pressão da hifa que rompe áreas membranosas ou esclerosadas) e químico,
resultante da liberação destas enzimas que facilitam a penetração mecânica. Após a
penetração, inicia-se o processo de colonização do hospedeiro, no qual ocorre proliferação das
hifas na cavidade do corpo, com liberação de toxinas (dextruxinas e citocalasinas) que
provavelmente causam sua paralização ou morte. Após a morte do hospedeiro, as hifas
crescem invadindo os diversos órgãos internos. O micélio emerge do corpo do inseto
produzindo esporos que poderão ser disseminados para infectar outros indivíduos (ALVES,
1998).
Entre as enzimas estudadas em M. anisopliae, amilase, lípase, protease e quitinase, a
protease (Pr1) parece ser a mais ativa na penetração do hospedeiro (St. LEGER et al., 1992).
Boldo et al. (2009) estudando o efeito de endoquitinases do fungo entomopatogênico
M. anisopliae, observaram a atividade enzimática de uma quitinase específica para saber se
esta era importante na patogenicidade. Os pesquisadores confirmaram que a endoquitinase
CH12 realmente é uma das enzimas responsáveis pela patogenicidade do M. anisopliae.
2.4 Beauveria bassiana
A primeira descrição de Beuveria bassiana (Bals.) Vuillemin foi em 1835 por
Balsamo com o nome de Botrytis bassiana, porém o gênero Bassiana foi reorganizado em
1912 (LIMA, 1989). As espécies de Beauveria ssp. são classificadas como fungos
Deuteromicetos, classe Hifomicetos assexuados, por se reproduzirem através da produção de
conídios. Porém, com o advento da biologia molecular, essas espécies foram agrupadas como
fungos sexuados (REHNER, 2005).
O gênero Beauveria inclui espécies de fungos com grande potencial como agente de
controle microbiano. A espécie B. bassiana (Balsamo) Vuillemin é de ocorrência
cosmopolita, sendo freqüentemente encontrada sobre insetos e amostra de solos (ALVES,
1998).
A germinação dos conídios de B. bassiana ocorre, geralmente, em um período de 12
horas após a inoculação. A fase de penetração do fungo, geralmente pelo tegumento, ocorre
em função de uma ação mecânica e efeitos enzimáticos, com duração de aproximadamente 12
horas. Após 72 horas da inoculação, o inseto apresenta-se colonizado com uma grande
quantidade de conidióforos e conídios. Entretanto, para aumentar a capacidade de
9
disseminação dos propágulos, são necessárias algumas condições favoráveis, destacando-se a
temperatura, umidade relativa e radiação (ALVES, 1998).
Para que ocorra germinação dos conídios, crescimento vegetativo e esporulação de B.
bassiana é ideal que a temperatura esteja na faixa entre 23 a 28ºC, porém este fungo pode
suportar temperaturas de até 45ºC (ALVES; LECUONA, 1998). No entanto, melhor
desenvolvimento e maior virulência dos fungos são atingidos em temperatura ótima (25º C).
As temperaturas abaixo do ótimo são menos prejudiciais à patogenicidade dos fungos, pois
segundo Roberts e Campbell (1977), em alguns casos, aumentam os tempos letais, mas sem
afetar a mortalidade total, já as temperaturas acima do ótimo podem reduzir a patogenicidade
dos fungos entomopatogênicos.
Tanto o calor quanto o frio podem influenciar no uso dos fungos como agentes para o
biocontrole, porém, o fator abiótico mais importante é a radiação solar, particularmente a UV-
B, que possui a maior capacidade de impossibilitar a ação do fungo. Fernandes (2007), em seu
estudo de caracterização e seleção de 60 isolados de Beauveria ssp. para o controle
microbiano do carrapato R. (B.) microplus, observou que alguns isolados, cujos conídios
foram expostos a duas horas de radiação UV apresentaram diminuições significativas dos
percentuais de germinação, influenciando diretamente na virulência destes microrganismos.
O fungo B. bassiana, apresenta variação na viabilidade dos conídios de acordo com a
conservação, segundo Alves e Lecuona (1998), na forma de conídios puros, a viabilidade dura
em torno de 60 dias, e se forem mantidos em formulações podem atingir até oito meses com
alguma viabilidade. Quando se pretende preservar os conídios por longos períodos, a
conservação deve ser em baixas temperaturas, na faixa de -20 a +8ºC.
O primeiro relato de B. bassiana em carrapatos foi sobre a espécie Ixodes ricinus,
quando fêmeas ingurgitadas foram coletadas a campo e mantidas em laboratório sob
observação, sendo verificada a presença de hifas na abertura oral do carrapato após a morte,
porém não houve alterações na postura (SAMSINAKOVA, 1957).
Desde então, a patogenicidade deste fungo vem sendo amplamente estudada e tem
apresentado resultados satisfatórios sobre várias espécies de carrapatos, entre elas R. (B.)
microplus, R. sanguineus, Anocentor nitens, Amblyomma cajennesne (BITTENCOURT et al.,
1995; MONTEIRO, 1997; SOUZA, 1999; BITTENCOURT et al., 2002; MONTEIRO et al.,
2003; REIS et al., 2004).
10
2.5 Mecanismos de Resistência e Sensibilidade nos Carrapatos
A busca de produtos eficazes para o controle do carrapato dos bovinos R. (B.)
microplus ocorre desde o final do século XIX. Em 1896, um fazendeiro australiano formulou
um produto a base de arsênico para banhar os animais, porém em 1937 foi registrado o
aparecimento de resistência em populações de carrapatos na Austrália e África do Sul
(FURLONG et al., 2007).
Até meados do século XX, os acaricidas mais utilizados no controle de carrapatos
eram os derivados arsenicais, os quais tinham baixa eficácia e, além disso, deixavam resíduos
altamente tóxicos para os bovinos (GRAF et al., 2004).
Com o passar dos anos, várias classes de acaricidas foram produzidas, entre elas:
organofosforados, carbamatos, amidinas, piretróides, entre outros. Entretanto, o uso errôneo
destes acaricidas, tem resultado no acúmulo de resíduos tóxicos na carne e no leite, poluição
do meio ambiente, intoxicação dos seres humanos, altos custos para produção, além do
desenvolvimento de mecanismos de resistência (BEUGNET; CHARDONNET, 1995;
JONSSON, 1997; LATIF; LONGEJAN, 2002).
Resistência é a habilidade dos indivíduos sobreviverem a doses de drogas que
poderiam normalmente matar outros da mesma espécie e estágio. Isto é herdado e selecionado
devido aos sobreviventes aos tratamentos que passam genes da resistência para seus
descendentes. Os genes da resistência são inicialmente raros em uma população ou aparece
como raras mutações nos genes, assim como por seleções contínuas. A proporção dos genes
resistentes aumenta de acordo com a proporção dos parasitas resistentes (SANGSTER, 2001).
Devido à seleção de populações resistentes a determinados princípios ativos, há uma
necessidade de utilizar acaricidas com diferentes composições, e o uso destes acaricidas
muitas vezes em um curto período de tempo acaba por selecionar novas populações
resistentes a mais de um princípio ativo, caracterizando um ciclo vicioso (FREITAS et al.,
2005).
Pelo fato da utilização excessiva de acaricidas de diferentes princípios químicos nas
últimas décadas (arsenicais, organoclorados, organofosforados, carbamatos, nitroguanidinas,
fenilpirazoles, formamidinas, piretróides, avermectinas, lactonas macrocíclicas e feniluréias)
diversos mecanismos de resistência foram sendo desenvolvidos como estratégia de
sobrevivência pelo carrapato (HÄUSERMAN et al., 1992).
A base molecular da resistência tem sido estudada em diferentes espécies de
artrópodes, principalmente em insetos, mas algo já é conhecido em carrapatos. O carrapato R.
11
(B.) microplus pode apresentar resistência mais rapidamente do que outras espécies,
provavelmente, pelo menor período de tempo entre as gerações (KOCAN, 1995).
Artrópodes em geral possuem um curto período de tempo entre uma geração e outra.
Isto favorece o surgimento de populações com diferentes características genéticas, de acordo
com a pressão seletiva que estão sofrendo. Estas características variam desde a redução do
poder de penetração do pesticida, aumento do poder seqüestrante de moléculas tóxicas ou
mesmo insensibilidade a compostos tóxicos e aumento da detoxificação celular (CASIDA;
QUISTAD, 1998; OAKESHOTT, 2003; RANSON et al., 2002), o que torna os pesticidas
utilizados defasados em um curto espaço de tempo e torna necessário o aumento da
concentração de uso, mudança de princípio ativo ou a utilização de outros princípios ativos
combinados (SUTHERST et al., 1983).
As bases moleculares da resistência podem ser resumidas em três tipos: aumento de
expressão de genes ou aumento da atividade de enzimas envolvidas em metabolismo de
xenobióticos/detoxificadoras; mutações em neurorreceptores e mutações em canais de sódio
(MARTIN et al., 2003; OAKESHOTT et al., 2003; RUFINGIER et al., 1999).
A evolução da resistência tem sido um mecanismo de defesa dos insetos contra as
táticas de controle. Este problema vem ocorrendo mais freqüentemente com o controle
químico, pois esta tática tem sido a mais difundida no manejo de pragas. No final de década
de 80, havia uma documentação de 504 espécies de insetos e ácaros resistentes à pelo menos
uma classe de pesticida (GEORGHIU; TEJEDA, 1991). No início, acreditava-se que os
insetos não seriam capazes de vencer os agentes do controle biológico, porém sabe-se
atualmente que esse problema não está restrito aos produtos químicos, pois a resistência de
artrópodes já foi identificada para outras táticas de controle, incluindo os entomopatógenos
(ALVES, 1998).
Inicialmente, as diferenças na susceptibilidade de populações de insetos e
entomopatógenos eram observadas apenas a partir de estudos de pressão e seleção em
condições laboratoriais (BURGUES, 1971). No entanto, McGaughey (1985), demonstrou pela
primeira vez, que a resistência a patógenos pode ser observadas em condições de campo,
através da comparação de diferenças em susceptibilidade de populações de Plodia
interpunctella a Bacillus thuringiensis. Posteriormente, outras evidências de resistência de
pragas de importância econômica foram detectadas para vírus e bactérias. Nas condições
brasileiras, pode-se citar o programa de controle da lagarta Anticarsia gemmatalis com
Baculovirus anticarsi na cultura de soja (MOSCARDINI, 1993).
12
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização e Período de Realização do Experimento
O experimento foi realizado no Laboratório de Controle Microbiano, localizado na
Estação para Pesquisas Parasitológicas Wilhemn Otto Neitz (EPPWON), do Departamento de
Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, situado em Seropédica - RJ, entre os paralelos 22º49’ e 22º45’ de latitude sul, e os
meridianos 43º38’ e 43º42’ de longitude oeste de Greenwich, com altitude de 33 metros e
clima do tipo subtropical. Os bioensaios foram realizados em janeiro e fevereiro do ano de
2009.
3.2 Obtenção e Manutenção dos Isolados Fúngicos
O fungo Metarhizium anisopliae (Ma 959) foi obtido através do isolamento em Deois
flavopicta e Beauveria bassiana (Bb 986) foi isolado do carrapato R. (B.) microplus. Para
serem utilizados no experimento foram cedidos pelo Departamento de Entomologia da Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, da Universidade de São Paulo (USP).
Estes isolados foram reproduzidos e são mantidos no Laboratório de Controle
Microbiano de Artrópodes de Importância Veterinária da UFRRJ.
Para o presente bioensaio, os isolados foram repicados em placas de Petri contendo
meio BDA (Batata, Dextrose e Ágar) e mantidos em câmara climatizada regulada a 25 1ºC
e umidade relativa 80%.
3.3 Elaboração das Suspensões e Quantificação dos Inóculos
As suspensões conidiais foram preparadas a partir do crescimento dos isolados em
placas de Petri, contendo meio de cultura BDA.
Para o preparo da suspensão na concentração 10
8
conídios/ml, a superfície da placa de
Petri foi raspada com auxílio de um cabo e lâmina de bisturi e os conídios suspensos em 30
ml de água destilada estéril e espalhante adesivo Tween 80 0,1% (LUZ et al., 1998). A
suspensão foi quantificada com auxílio da Câmara de Neubauer sob microscópio óptico,
segundo Alves (1998).
A concentração 10
7
conídios/ml foi preparada através de diluição seriada a partir da
concentração 10
8
conídios/ml, onde foram utilizados 2 ml dessa suspensão acrescida de 18 ml
de água destilada estéril e Tween 80 0,1%.
13
3.4 Viabilidade das Suspensões de Conídios
Uma amostra de 10μl da concentração 10
7
conídios/ml foi colocada em placas de Petri
contendo meio de cultura BDA e antibiótico (500mg de cloranfenicol :1 litro de meio de
cultura) para avaliação da viabilidade dos conídios de M anisopliae e B. bassiana. As placas
foram mantidas em câmara climatizada sob temperatura de 25 ± 1ºC e umidade relativa ≥
80% e avaliadas 24 horas após. O cálculo da germinação dos conídios foi realizado segundo
Alves (1998).
3.5 Obtenção de R. (B.) microplus
Para realização dos bioensaios, foram coletadas fêmeas ingurgitadas diretamente do
corpo de vacas leiteiras naturalmente infestadas em duas propriedades distintas (PESAGRO-
RJ e Bovinocultura de Leite da Universidade Federal rural do Rio de Janeiro, situadas em
Seropédica - RJ, entre os paralelos 22º49’ e 22º45’ de latitude sul, e os meridianos 43º38’ e
43º42’ de longitude oeste de Greenwich, com altitude de 33 metros e clima do tipo
subtropical. Essas fêmeas ficaram acondicionadas em placas de Petri mantidas em câmaras
climatizadas, tipo (B.O.D.) sob temperatura e umidade relativa controladas, para realizarem
postura. No décimo dia de postura, alíquotas de 500 mg foram pesadas e colocadas em
seringas vedadas com algodão hidrofílico. Quando as larvas completaram 15 dias, foram
utilizadas para infestação artificial de dois bezerros distintos, onde um recebeu larvas
provenientes da PESAGRO-RJ e outro larvas da Bovinocultura, os bezerros permaneceram
em baias individuais. No 21º dias após a infestação, as fêmeas ingurgitadas foram coletadas
do piso da baia dos bezerros e levadas ao Laboratório de Controle Microbiano, lavadas em
água corrente e posteriormente imersas em uma solução de hipoclorito de sódio a 1%, por três
minutos para assepsia da cutícula. Após serem secas em papel toalha, parte das fêmeas foram
submetidas ao tratamento e a outra parte mantida em placas de Petri em câmara climatizada
sob temperatura de 27 ±1 ºC e umidade relativa ≥ 90% para obtenção de ovos e larvas.
3.6 Delineamento Experimental
Para realização do experimento foram preparadas duas suspensões conidiais nas
concentrações 10
7
e 10
8
conídios/ml de cada fungo e um grupo controle. No grupo controle
foi utilizada somente uma solução de água destilada e Tween 80 a 0,1%. Cada tratamento foi
formado por dez repetições. Os mesmos tratamentos foram utilizados nas duas populações
distintas de R. (B.) microplus testadas.
14
As concentrações utilizadas nos bioensaios de cada fase de desenvolvimento de R. (B.)
microplus estão demonstradas na tabela 1.
Tabela 1. Concentrações de conídios dos isolados (Ma 959) de Metarhizium anisopliae e (Bb
986) de Beauveria bassiana, utilizados nas diferentes fases de desenvolvimento de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Fêmeas ingurgitadas
Ovos
Larvas
Ma 959
1,2 × 10
8
conídios/ml
1,3 × 10
8
conídios/ml
1,2 × 10
8
conídios/ml
Bb 986
1,2 ×10
8
conídios/ml
1,3 × 10
8
conídios/ml
1,2 × 10
8
conídios/ml
3.7 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas
Para a homogeneização do peso das fêmeas ingurgitadas destinadas ao tratamento, o
número de classes foi calculado através da fórmula de Yule (SAMPAIO, 2002), em função do
número de observações (n).
Para a formação dos grupos, uma fêmea de cada classe foi escolhida aleatoriamente,
formando grupos com dez repetições. Após formação desses grupos, procedeu-se a pesagem
individual das fêmeas, seguida pela sua identificação e seu respectivo tratamento.
As fêmeas ingurgitadas foram banhadas em tubos de ensaio com um ml de suspensão
fúngica e submersas por um período de três minutos. As fêmeas do grupo controle receberam
um ml da solução contendo água destilada estéril e Tween 80 a 0,1%. Após o tratamento, o
excesso da suspensão foi retirado com ajuda de um papel toalha e, as fêmeas, devidamente
identificadas, foram fixadas com fita adesiva dupla face, no interior das placas de Petri, e
mantidas em câmara climatizada sob condições ideais já descritas no item 3.6.
Para a avaliação do percentual de eclosão das larvas oriundas da postura de fêmeas
tratadas, a massa de ovos de cada fêmea foi coletada e pesada diariamente, armazenada em
pequenos frascos de vidro vedados com algodão hidrófilo e mantidos em câmara climatizada
sob condições já descritas. O percentual de eclosão das larvas foi acompanhado diariamente.
Os parâmetros biológicos utilizados para avaliar o efeito dos isolados de B. bassiana e
M. anisopliae sobre fêmeas ingurgitadas foram: peso inicial das fêmeas (relativo ao peso de
cada fêmea antes de submetê-la ao tratamento), período de pré-postura (período
compreendido entre o desprendimento da fêmea ingurgitada e o início da postura), peso de
postura (somatório dos pesos diários das posturas), período de postura (período compreendido
entre o primeiro e último dia da postura), período de incubação (período compreendido entre
15
o início da postura e a eclosão das primeiras larvas), período de eclosão (tempo compreendido
entre o início e o término da eclosão), percentual de eclosão das larvas (estimativa visual do
percentual de larvas eclodidas em relação à massa de ovos), peso residual da fêmea (peso de
cada fêmea três dias após o término de sua postura).
Esses parâmetros foram observados para permitir o cálculo dos Índices de Produção de
Ovos (IPO) e Nutricional (IN), que foram obtidos através das equações a seguir, segundo
Bennett (1974):
IPO = peso da massa de ovos (g) × 100
peso inicial da fêmea ingurgitada (g)
IN = peso da massa de ovos (g) × 100
[peso inicial das fêmeas ingurgitadas (g) – peso residual das fêmeas (g)]
Para a obtenção do Percentual de controle de R. (B.) microplus exercido pelos fungos
B. bassiana e M. anisopliae, foi calculada a Reprodução Estimada (RE). Ambos os cálculos
foram realizados de acordo com Drummond et al., (1971) e obtidos através das seguintes
equações:
RE = peso da massa de ovos (g) × % eclosão larvas × 20000
peso da fêmea ingurgitada (g)
Percentual de controle = [ média RE (controle) – média RE (tratado) ] × 100
média RE (controle)
% de Redução da Eclosão = [ % Eclosão (controle) - % Eclosão (tratado)] x 100
% Eclosão (controle)
3.8 Bioensaio com Ovos
No 10º dia de postura das fêmeas destinadas à obtenção dos ovos, os mesmos foram
separados, pesados em alíquotas de 50 mg e acondicionados em tubos de ensaio devidamente
vedados com algodão hidrófilo. Para realizar o tratamento dos ovos com as diferentes
concentrações conidiais foi utilizada a mesma metodologia descrita para o tratamento das
16
fêmeas. Após o tratamento, os tubos de ensaio foram mantidos em câmara climatizada sob
condições de umidade e temperatura descritas no item 3.6.
Como parâmetro de avaliação, foi observado diariamente o percentual de eclosão das
larvas.
3.9 Bioensaio com Larvas
Parte da postura do 10º dia das fêmeas foi pesada em alíquotas de 50 mg e
acondicionada em tubos de ensaio, mantidos em câmara climatizada até a completa eclosão
das larvas. Os tubos de ensaio que não apresentaram eclosão superior a 95% não foram
utilizados no bioensaio. O tratamento ocorreu no 15º dia após o início da eclosão das larvas e
a metodologia utilizada para o bioensaio com as larvas de R. (B.) microplus foi a mesma
descrita para fêmeas ingurgitadas e ovos.
A estimativa do percentual de mortalidade das larvas foi observada a cada dez dias, até
o 30º dia após a realização do tratamento das mesmas.
3.10 Reisolamento dos Isolados Fúngicos após o Bioensaio
Três dias após o término da postura, amostras de fêmeas ingurgitadas tanto do grupo
controle como do grupo tratado com as suspensões conidiais, foram colocadas em câmara
úmida e incubadas em câmara climatizada sob temperatura de 27 ±1 ºC e umidade relativa ≥
80% para facilitar o crescimento dos fungos e posterior confirmação de suas características
(SAMSON; EVANS, 1982).
3.11 Análise Estatística
Primeiramente, foram comparados dentro de cada propriedade todos os tratamentos,
inclusive o controle, posteriormente as propriedades foram comparadas entre si para cada
concentração fúngica de ambos isolados.
Para análise dos dados paramétricos foi realizada a análise de variância (ANOVA),
seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls (SNK) para comparação entre as médias, com
nível de significância de 5% (p≤0,05). Os dados não paramétricos foram submetidos à análise
de Kruskal Wallis, seguida pelo teste Student-Newman-Keuls (SNK) para comparação entre
as ordenações médias, com nível de significância de 5% (p≤0,05) (SAMPAIO, 2002).
O cálculo dos tempos médios letais TL
90
, foi realizado pelo software Polo (p≤0,1)
(LeORA SOFTWARE, 1987).
17
4 RESULTADOS
4.1 Viabilidade das Suspensões de Conídios
Os conídios dos isolados Ma 959 e Bb 986 de M. anisopliae e B. bassiana
apresentaram 100% de germinação, sob temperatura de 25 ± 1ºC e umidade relativa ≥80%,
após o período de 24 horas, demonstrando que os fungos estavam aptos a serem utilizados.
4.2 Bioensaio com Fêmeas Ingurgitadas de R. (B.) microplus
Através dos resultados obtidos nos grupos controles de ambas as propriedades pode-se
observar que as fêmeas utilizadas no presente experimento estavam com a capacidade
reprodutiva normal, de acordo com o índice de produção de ovos e percentual de eclosão de
larvas, segundo Glória et al. (1993). Com os resultados encontrados pode-se observar que
ambos isolados testados foram capazes de influenciar na maioria dos parâmetros biológicos
de fêmeas alimentadas de R. (B.) microplus, como demonstram as tabelas 2 e 3.
4.2.1 Peso médio das fêmeas ingurgitadas
O peso médio das fêmeas utilizadas no grupo controle e nos grupos tratados com as
diferentes concentrações dos isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana se
encontram nas tabelas 2 e 3. Pode-se observar que conforme a metodologia, foram obtidas
fêmeas ingurgitadas com pesos homogêneos. Desta forma, as diferenças encontradas nos
parâmetros biológicos podem ser atribuídas à ação dos tratamentos utilizados.
4.2.2 Período de pré-postura
O período de pré-postura não demonstrou diferença significativa quando as diferentes
concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana foram
comparadas com o grupo controle de cada propriedade pesquisada separadamente, como pode
se observar nas tabelas 2 e 3.
18
Tabela 2. Valores médios e desvio padrão do Peso da fêmea (P.F.); Período de Pré-Postura (P.P.P.); Peso da Postura (Pes. P); Período de Postura
(Per. P.); Período de Incubação (P. I.); Período de Eclosão (P. Ec.); Percentual de Eclosão (% Ec.); Peso Residual da Fêmea (P.R.); Índice
Nutricional (I. N.) e Índice de Produção de Ovos (I.P.O.) de fêmeas alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da
Pesagro-RJ, tratadas com diferentes concentrações de Metarhizium anisopliae isolado (Ma 959) e Beauveria bassiana isolado (Bb 986) (*)
Controle
Ma 10
7
Ma 10
8
Bb 10
7
Bb 10
8
P.F. (gr)
0,243 ± 0,02 a
0,247 ± 0,02 a
0,240 ± 0,02 a
0,242 ± 0,02 a
0,240 ± 0,02 a
P.P.P. (dias)
3,8 ± 0,42 a
3,5 ± 0,52 a
3,9 ± 0,31 a
3,6 ± 0,42 a
3,5 ± 0,42 a
Pes.P. (gr)
0,162 ± 0,05 a
0,169 ± 0,07 a
0,134 ± 0,02 b
0,114 ± 0,04 b
0,104 ± 0,02 bc
Per.P. (dias)
17,1 ± 1,52 a
17,2 ± 1,68 a
13,0 ± 1,56 b
12,6 ± 5,79 b
9,8 ± 2,48 bc
P.I. (dias)
23,8 ± 0,42 a
23,5 ± 0,52 a
23,9 ± 0,31 a
23,8 ± 0,42 a
23,8 ± 0,42 a
P. Ec. (dias)
8,0 ± 1,05 a
7,8 ± 1,03 a
8,4 ± 0,96 a
8,2 ± 1,03 a
9,0 ± 0,00 a
Ec. (%)
97,8 ± 1,61 a
82,9 ± 18,44 b
81,8 ± 27,47 b
79,8 ± 16,24 b
89,8 ± 7,17 b
P. R. (gr)
0,051 ± 0,01 a
0,044 ± 0,01 a
0,052 ± 0,01 a
0,059 ± 0,01 a
0,054 ± 0,02 a
I.N. (%)
83,4 ± 18,84 a
82,5 ± 32,35 a
71,2 ± 6,92 b
61,1 ± 20,25 b
56,2 ± 12,69 bc
I.P.O. (%)
65,9 ± 15,57 a
67,5 ± 26,87 a
55,5 ± 4,21 b
46,4 ± 16,61 b
43,8 ± 10,43 b
(*) Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si (p≤ 0,05).
19
Tabela 3. Valores médios e desvio padrão do Peso da fêmea (P.F.); Período de Pré-Postura (P.P.P.); Peso da Postura (Pes. P); Período de
Postura (Per. P.); Período de Incubação (P. I.); Período de Eclosão (P. Ec.); Percentual de Eclosão (% Ec.); Peso Residual da Fêmea (P.R.);
Índice Nutricional (I. N.) e Índice de Produção de Ovos (I.P.O.) de fêmeas alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes
da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações de Metarhizium anisopliae isolado (Ma 959) e Beauveria bassiana
isolado (Bb 986) (*)
Controle
Ma 10
7
Ma 10
8
Bb 10
7
Bb 10
8
P.F. (gr)
0,217 ± 0,02 a
0,239 ± 0,02 a
0,239 ± 0,02 a
0,239 ± 0,02 a
0,240 ± 0,02 a
P.P.P. (dias)
3,3 ± 0,48 a
3,5 ± 0,52 a
3,2 ± 0,42 a
3,6 ± 0,51 a
3,3 ± 0,48 a
Pes.P. (gr)
0,141 ± 0,02 a
0,132 ± 0,02 a
0,128 ± 0,03 a
0,115 ± 0,05 ab
0,088 ± 0,04 b
Per.P. (dias)
19,7 ± 0,48 a
15,4 ± 3,10 b
14,8 ± 3,39 b
12,7 ± 5,16 b
9,5 ± 2,68 bc
P.I. (dias)
23,3 ± 0,48 a
23,5 ± 0,53 a
23,2 ± 0,42 a
23,6 ± 0,52 a
23,3 ± 0,48 a
P. Ec. (dias)
8,0 ± 1,05 a
8,4 ± 0,97 a
8,6 ± 0,84 a
7,6 ± 0,97 a
7,2 ± 0,63 a
Ec. (%)
95,3 ± 3,97 a
94,1 ± 4,33 a
82,5 ± 23,12 ab
84,7 ± 20,76 a
72,0 ± 25,95 bc
P. R. (gr)
0,054 ± 0,02 a
0,040 ± 0,01 a
0,047 ± 0,01 a
0,059 ± 0,01 a
0,059 ± 0,02 a
I.N. (%)
78,3 ± 7,61a
66,9 ± 7,89 b
66,4 ± 11,04 b
64,4 ± 28,04 b
47,0 ± 17,62 bc
I.P.O. (%)
60,0 ± 4,69 a
55,3 ± 4,52 a
53,2 ± 9,17 a
48,5 ± 21,32 b
36,8 ± 15,79 b
(*) Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente entre si (p≤ 0,05).
20
Quando as propriedades foram comparadas entre si para cada concentração fúngica de
ambos os isolados, observou se diferença significativa no período de pré-postura no grupo
tratado com o fungo M. anisopliae na concentração de 10
8
conídios/ml (Figura 1).
Figura 1. Média e desvio padrão do período de pré-postura, em dias, de fêmeas ingurgitadas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundos da PESAGRO-RJ e Bovinocultura de Leite
(UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de
Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.2.3 Peso da postura
Os isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 B. bassiana foram capazes de
promover diminuições significativas no peso final da postura das fêmeas ingurgitadas
tratadas. Na população de fêmeas ingurgitadas oriundas da Pesagro-RJ houve diminuição do
peso da postura em quase todos tratamentos, exceto no grupo tratado com M. anisopliae na
concentração de 10
7
conídios/ml, e na população de carrapatos da Bovinocultura de leite
houve diminuição no grupo tratado com o isolado Bb 986 de B. bassiana na concentração de
10
8
conídios/ml, como demonstram as tabelas 2 e 3. Apesar de não ter sido observadas
diferenças significativas entre as populações estudas ao se comparar cada tratamento (Figura
2), ficou evidenciada uma maior influência do isolado Bb 986 de B. bassiana sobre ambas
populações de R. (B.) microplus, demonstrando assim uma maior patogenicidade a esta
espécie de carrapato.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(dias)
Período de Pré-postura
a
a
a
a
a
a
a
b
a
a
21
Figura 2. Média e desvio padrão do peso da postura, em gramas, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundos da PESAGRO-RJ e Bovinocultura de Leite
(UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de
Metarhizium anisopliae e Bb986 de Beauveria bassiana.
4.2.4 Período de postura
As diferentes concentrações dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986
de Beauveria bassiana apresentaram alterações significativas no período de postura das
fêmeas alimentadas de R. (B.) microplus de ambas propriedades (Tabelas 2 e 3). No entanto,
em uma avaliação combinada deste parâmetro com o peso das posturas, evidencia-se que a
redução de período em determinado tratamento pode estar mais ligada à redução na
quantidade de ovos postos do que uma possível aceleração no processo.
Quando se comparou o período de postura entre as populações estudadas, não foram
observadas diferenças significativas (Figura 3).
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(g de ovos)
Peso da Postura
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
22
Figura 3. Média e desvio padrão do período de postura, em dias, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite
(UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.2.5 Período de incubação
O período de incubação dos ovos oriundos das fêmeas tratadas com os isolados
entomopatogênicos Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana, não demonstraram
redução significativa nos grupos tratados, independente da concentração de conídios utilizada
(Tabelas 2 e 3). Além disso, não foi observada diferença entre as duas populações estudadas
através deste parâmetro, como demonstra a figura 4, indicando que não há influência dos
fungos na velocidade do desenvolvimento embrionário dos carrapatos.
0
4
8
12
16
20
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(Dias)
Período de Postura
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
23
Figura 4. Média e desvio padrão do período de incubação, em dias, de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite
(UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de
Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.2.6 Período de eclosão das larvas
Os isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana não promoveram
redução significativa neste parâmetro das fêmeas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus,
conforme mostrados nas tabelas 2 e 3. No entanto, quando foi comparado o período de
eclosão de larvas entre as duas populações distintas, houve diferença significativa no grupo
tratado com o isolado Bb 986 de B. bassiana na concentração de 10
8
conídios /ml (Figura 5).
21,5
22
22,5
23
23,5
24
24,5
25
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(Dias)
Período de Incubação
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
24
Figura 5. Média e desvio padrão do período de eclosão das larvas, em número de dias, de
fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ e
da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos
isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.2.7 Percentual de eclosão
Ao se avaliar cada população separadamente para este parâmetro, observou-se que na
propriedade PESAGRO-RJ, ambos isolados estudados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 896 de
B. bassiana, nas duas concentrações promoveram diminuição significativa. No entanto, nos
grupos formados com fêmeas provenientes da Bovinocultura de leite (UFRRJ), apenas na
maior concentração (10
8
conídios/ml) do isolado Bb 986 de B. bassiana é que houve
diminuição significativa no percentual de eclosão das larvas (Tabelas 2 e 3). Quando as
propriedades foram comparadas entre si para cada concentração fúngica de ambos isolados
através deste parâmetro não foi observada diferença significativa (Figura 6). Mesmo não
apresentando diferença significativa entre os tratamentos nas duas populações, ficou
evidenciada que a população de carrapatos da PESAGRO-RJ foi mais sensível aos isolados
fúngicos estudados.
0
2
4
6
8
10
12
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(Dias)
Período de Eclosão
a
a
a
a
a
a
a b
a
a
25
Figura 6. Média e desvio padrão do percentual de eclosão das larvas oriundas dos ovos de
fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da
Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados
Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.2.8 Peso Residual das Fêmeas
Este parâmetro não demonstrou diferença significativa quando as diferentes
concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana foram
comparadas com o grupo controle de cada propriedade pesquisada separadamente, como pode
se observar nas tabelas 2 e 3. Quando as propriedades foram comparadas entre si para cada
concentração fúngica de ambos isolados, também não observou se diferença significativa no
peso residual das fêmeas (Figura 7).
0
20
40
60
80
100
120
140
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(% de eclosão)
Percentual de Eclosão
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
26
Figura 7. Média e desvio padrão do peso residual de fêmeas de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite (UFRRJ), tratadas com
diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986
de Beauveria bassiana.
4.2.9 Índice Nutricional
Os isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana ocasionaram
diminuição significativa no Índice Nutricional de fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus
das duas propriedades. De um modo geral, a ação dos fungos determinou sobre ambas as
populações um desvio nutricional para outros processos metabólicos não relacionados à
produção de ovos.
Ao se avaliar separadamente este parâmetro, observou-se que na propriedade
Bovinocultura de Leite (UFRRJ), ambos isolados estudados, nas duas concentrações
promoveram redução significativa. No entanto, as fêmeas provenientes da PESAGRO, que
foram tratadas com Ma 959 de M. anisopliae na concentração 10
7
conídios/ml, não
apresentaram redução significativa, todos os demais tratamentos foram significativos.
(Tabelas 2 e 3). Através deste parâmetro, não foi observada diferença significativa entre as
populações testadas (Figura 8).
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(g)
Peso Residual das fêmeas
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
27
Figura 8. Média e desvio padrão do índice nutricional (%) de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite
(UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de
Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.3 Índice de Produção de Ovos
Através deste parâmetro pode-se observar diferença na ação dos dois isolados fúngicos
testados sobre as fêmeas de R. (B.) microplus de origem diferentes. Nas fêmeas oriundas da
PESAGRO, o Índice de Produção de Ovos foi reduzido significativamente nos grupos
tratados com Ma 959 10
8
, Bb 986 10
7
e 10
8
conídios/ml. Nas fêmeas provenientes da
Bovinocultura de leite, houve diferença significativa neste parâmetro com o isolado Bb 986
nas duas concentrações 10
7
e 10
8
conídios/ml (Tabela 2 e 3).
Através destes resultados pode-se observar que o isolado fúngico Ma 959 de M.
anisopliae, não foi capaz de reduzir significativamente a conversão do sangue ingerido em
ovos pelas fêmeas de R. (B.) microplus oriundas da Bovinocultura de Leite (UFRRJ).
Enquanto que o isolado Bb 986 de B. bassiana, foi capaz de reduzir significativamente a
conversão do sangue ingerido em ovos pelas fêmeas de ambas populações estudadas,
independente da concentração.
Quando as propriedades foram comparadas entre si para cada concentração fúngica de
ambos isolados sobre o Índice de Produção de Ovos foi observada diferença significativa
entre os grupos tratados com o isolado Ma 959 na concentração de 10
7
conídios/ml (Figura 9).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(%)
Índice Nutricional
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
28
Figura 9. Média e desvio padrão do índice de produção de ovos (%) de fêmeas ingurgitadas
de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ e da Bovinocultura de Leite
(UFRRJ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de
Metarhizium anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana.
4.3.1 Percentual de Controle
Os percentuais de controle obtidos ao se tratar as fêmeas de R. (B.) microplus oriundas
de ambas as propriedades, com os isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana,
podem ser observados na tabela 4. Através destes resultados pode-se observar que houve uma
melhor atuação do isolado Bb 986 de B. bassiana, principalmente na maior concentração.
Além disso, com esses dados pode-se dizer que a população de carrapatos da PESAGRO-RJ
foi mais sensível à B. bassiana, sendo mais fácil de ser controlada utilizando este fungo. Os
percentuais de controle encontrados utilizando B. bassiana são relativamente satisfatórios
para controle biológico, visto que a utilização de fungos entomopatogênicos é uma proposta
para somar-se a um método integrado de controle de carrapatos e não substituir o método
químico.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(%)
Índice de Produção de Ovos
a a
a
a
b
a
a
a
a
a
29
Tabela 4. Percentual de Controle de fêmeas alimentadas de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus oriundas da PESAGRO-RJ (IZ) e Bovinocultura de Leite (IZ), tratadas com
diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986
de Beauveria bassiana.
M.a
B.b.
P IZ
P IZ
10
7
11,5 10,0
42,3 38,0
10
8
28,7 20,0
39,9 49,0
4.4 Bioensaio com Ovos de R. (B.) microplus
Os dois isolados fúngicos nas maiores concentrações conidiais foram capazes de
promover redução no percentual de eclosão das larvas de ambas as propriedades quando os
ovos de R. (B.) microplus foram submetidos aos tratamentos. No entanto, na concentração de
10
7
conídios/ml, somente houve redução no percentual de eclosão de larvas na população da
PESAGRO-RJ, que foi tratada com o isolado Ma 959 de M. anisopliae (Tabela 5). Porém,
quando as propriedades foram comparadas entre si para cada concentração fúngica de ambos
isolados, os resultados obtidos não ocasionaram diferença significativa entre os tratamentos
(Figura 10). Através dos resultados obtidos neste bioensaio utilizando ovos foi demonstrada
novamente a maior eficácia do fungo B. bassiana sobre este carrapato.
Tabela 5. Média do percentual de eclosão das larvas oriundas dos ovos de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus provenientes da PESAGRO-RJ (P) e da Bovinocultura de leite (IZ),
tratados com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana (*).
M.a
B.b.
P IZ
P IZ
Controle
99,4 ± 0,7 a 98,2 ± 1,8 a
99,4 ± 0,7 a 98,2 ± 1,8 a
10
7
94,4 ± 3,3 b 96,9 ± 2,8 a
96,6 ± 2,8 a 93,2 ± 5,8 a
10
8
70,0 ± 16,3 bc 64,0 ± 21,7 b
57,3 ± 33,3 b 50,5 ± 30,2 b
(*) Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si utilizando o
Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls (p≤ 0,05).
30
Figura 10. Média do percentual de eclosão das larvas oriundas dos ovos de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus provenientes de ambas propriedades, tratadas com diferentes
concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986 de
Beauveria bassiana.
4.5 Bioensaio com Larvas não Alimentadas de Rhipicephalus (B.) microplus
4.5.1 Percentual de mortalidade
Os resultados obtidos sobre as larvas não alimentadas de R. (B). microplus foram os
mais interessantes, pois neste estágio ambos os isolados fúngicos testados apresentaram alta
patogenicidade. Isto demonstra que o estágio larval do carrapato seria o alvo mais fácil para
ação dos fungos entomopatogênicos. Além disso, em aplicações destes fungos em nível de
campo, a chance dos fungos agirem sobre larvas é maior do que sobre ovos, visto que as
larvas estão mais expostas nas pastagens.
Sobre este estágio do carrapato houve uma inversão dos valores nos resultados
encontrados, onde ficou evidenciada uma melhor eficácia do isolado Ma 959 de M. anisopliae
quando comparado com o isolado Bb 986 de B. bassiana.
Quando as duas populações foram analisadas separadamente, ambas foram sensíveis
aos isolados fúngicos, entretanto, a população oriunda da Bovinocultura de Leite (UFRRJ)
apresentou percentual de mortalidade das larvas bem mais alto, evidenciando uma expressiva
diferença entre as duas populações estudadas. Ao se comparar o percentual de mortalidade
obtido entre as duas propriedades, observou se diferença significativa em todos os grupos (no
0
20
40
60
80
100
120
140
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(%)
Percentual de Eclosão
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
31
30º dia pós tratamento), exceto com o isolado Bb 986 10
7
conídios/ml comprovando maior
sensibilidade da população da Bovinocultura de Leite (UFRRJ) (Figuras 11, 12 e 13).
Figura 11. Média do percentual de mortalidade no 10º dia pós tratamento das larvas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de duas propriedades, tratadas com
diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986
de Beauveria bassiana.
Figura 12. Média do percentual de mortalidade no 20º dia pós tratamento das larvas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de duas propriedades, tratadas com
diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986
de Beauveria bassiana.
0
5
10
15
20
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(% ao 10º dia)
Percentual de Mortalidade
a
a
a
a
a
a
a
a
b
a
0
20
40
60
80
100
120
140
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(% ao 20º dia)
Percentual de Mortalidade
a
a
a
a
a
a
b
b
a
a
32
Figura 13. Média do percentual de mortalidade no 30º dia pós tratamento das larvas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes de duas propriedades, tratadas com
diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium anisopliae e Bb 986
de Beauveria bassiana.
4.5.2 Tempo Médio Letal
Ao se comparar as duas populações de acordo com o tempo médio letal (LT 90), ou
seja, tempo necessário para que o fungo conseguisse matar 90% das larvas da população
estudada, foi observada diferença significativa entre as duas propriedades nas menores
concentrações (10
7
conídios/ml), de ambos os isolados fúngicos (Tabela 6). Além disso, ficou
bem evidenciada a maior eficácia do isolado Ma 959 de M. anisopliae sobre este estágio do
carrapato R. (B.) microplus, pois levou menos dias para alcançar a LT 90.
Tabela 6. Tempo Médio Letal (LT 90) em número de dias, das larvas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus oriundas da PESAGRO-RJ (P) e da Bovinocultura de Leite da UFRRJ
(IZ), tratadas com diferentes concentrações conidiais dos isolados Ma 959 de Metarhizium
anisopliae e Bb 986 de Beauveria bassiana (*).
M.a.
B.b.
P IZ
P IZ
10
7
37,3 a 27,2 b
35,7 a 27,5 b
10
8
22,9 a 19,5 a
35,8 a 26,7 a
(*) Médias seguidas da mesma letra, na mesma linha de cada coluna, não diferem significativamente entre si
(p≤0,1).
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
CTR
Ma 107
Ma 108
Bb 107
Bb 108
Pesagro
Bovinocultura
(% ao 30º dia)
Percentual de Mortalidade
a
a
a
a
b
a
b
b
a
a
33
4.6 Reisolamento Fúngico
As amostras de fêmeas pós-postura (residuais), ovos e larvas não alimentadas de R.
(B.) microplus submetidas ao tratamento com as diversas concentrações dos isolados fúngicos
Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana, apresentaram desenvolvimento de colônias
fúngicas após 10 dias de incubação em câmara úmida, confirmando que o fungo penetrou e se
desenvolveu nos diferentes estágios do carrapato. E como esperado, as amostras utilizadas no
grupo controle não demonstraram desenvolvimento de colônias.
34
5 DISCUSSÃO
Através dos resultados obtidos neste trabalho pode se observar que ambos os isolados
testados foram capazes de influenciar nas diferentes fases de R. (B.) microplus, demonstrando
potencial patogênico para esta espécie de carrapato.
O tratamento sobre fêmeas alimentadas apresentou bons resultados, obtendo
percentuais de controle variando de 10 a 49%, esses valores são satisfatórios para controle
biológico. No entanto, Bittencourt et al. (1992) utilizando o mesmo isolado Ma 959 de M.
anisopliae, conseguiu um percentual de controle de 96,6%. Uma possível explicação para esta
diferença seria as características intrínsecas tanto das populações de carrapatos, como dos
isolados fúngicos utilizados nos diferentes experimentos.
No bioensaio com ovos, a redução do percentual de eclosão das larvas variou entre 3,1
a 49,5 %. Em um estudo realizado por Bittencourt et al. (1996), utilizando o mesmo isolado
Bb 986 de B. bassiana sobre carrapatos da mesma espécie, foi encontrada uma redução no
percentual de eclosão das larvas entre 20 a 86,6 %, e Bittencourt et al. (1994 b) utilizando o
mesmo isolado Ma 959 de M. anisopliae, obteve percentuais de eclosão de larvas variando de
3,3 a 66,0 % nas concentrações de 10
5
a 10
9
, respectivamente. Em relação ao tratamento de
larvas não alimentadas de R. (B.) microplus, os valores encontrados foram similares aos
presentes na literatura, no entanto neste trabalho, o tempo necessário para obter altos
percentuais de mortalidade foi maior. Os percentuais de mortalidade do presente estudo
variaram de 71,0 a 98,7%, porém esses valores só foram alcançados no 30º dia após o
tratamento. Bittencourt et al. (1996) ao verificarem a patogenicidade dos isolados 986 e 747
de B. bassiana sobre larvas não alimentadas de R. (B.) microplus observaram um maior
percentual de mortalidade das larvas dos grupos tratados com as suspensões fúngicas de
diferentes concentrações, variando entre 18,8 e 88%; enquanto que no grupo controle esse
percentual variou entre 13 e 16,5%. Bahiense et al. (2003) também obtiveram bons resultados
ao testarem o isolado Bb LCM 01 de B. bassiana sobre o mesmo estágio de R. (B.) microplus.
O percentual de mortalidade foi de 6, 14, 27, 55 e 93% nas concentrações 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
e
10
9
conídios/ml, respectivamente.
Como se pode observar, os percentuais de mortalidade foram similares, no entanto,
tanto Bittencourt et al. (1996) como Bahiense et al. (2003), conseguiram esses valores no 10º
dia após o tratamento, ou seja, 20 dias a menos do que o do presente estudo.
35
A variação de resultados utilizando os mesmos isolados fúngicos sobre o mesmo
gênero de carrapato pode estar relacionada tanto a mecanismos de defesa dos carrapatos num
processo de adaptação ou a uma diminuição da virulência destes entomopatógenos. Além
disso, pode ainda haver uma combinação de ambos os fatores. Devido estas possibilidades
seria interessante a realização de mais estudos nesta área para esclarecer estas hipóteses.
Anteriormente, a hipótese de resistência ou diferença na susceptibilidade de
populações de carrapatos estava restrita a produtos químicos. No entanto, Fernandes (2007)
estudando a ação de 60 isolados fúngicos de B. bassiana observou que no primeiro bioensaio
todos os isolados de B. bassiana promoveram tardiamente a mortalidade às larvas de R. (B.)
microplus, porém, em um segundo bioensaio utilizando larvas de carrapato de outra
procedência a mortalidade das larvas foi significativa no décimo dia pós-tratamento. Estes
resultados levantaram a hipótese de diferença na susceptibilidade entre populações distintas
de carrapatos. No presente estudo, esta diferença foi observada em vários tratamentos para os
diferentes estágios evolutivos do carrapato R. (B.) microplus. Entretanto, foi no bioensaio com
larvas não alimentadas que ficou mais evidente a diferença entre as populações de carrapatos
aos fungos testados, pois para atingir a mortalidade de 90% da população de carrapatos em
uma das propriedades necessitou de 10 dias a mais do que a outra, sendo que as suspensões
fúngicas utilizadas foram as mesmas para ambas populações.
As possíveis diferenças observadas por populações de carrapatos oriundos de locais
diferentes podem estar relacionadas às características genéticas e fisiológicas de determinadas
cepas, por isso podem apresentar diferentes respostas quando são desafiadas com os fungos
entomopatogênicos. Segundo Polar et al. (2005) é possível que os carrapatos sejam fisiológica
ou estruturalmente tolerantes a infecção por fungos entomopatogênicos, visto que elevadas
concentrações de conídios estabelecidas nos ensaios em laboratório são necessárias para
estabelecer a rápida mortalidade dos carrapatos. Essa afirmativa é sustentada pelo fato de que
não foram encontrados relatos de epizootias ocorrendo naturalmente em carrapatos. No
entanto, não se pode descartar a possibilidade de um contato prévio destas cepas de carrapatos
aos fungos entomopatogênicos, visto que estes podem estar presentes no solo.
Coincidentemente, no mesmo período deste experimento, um teste de sensibilidade a
produtos carrapaticidas químicos foi realizado nas mesmas propriedades de onde os
carrapatos deste estudo foram coletados, e os resultados obtidos demonstraram diferença na
susceptibilidade entre as duas populações a diferentes produtos químicos, como pode ser
observado na tabela 7.
36
Tabela 7. Percentual de eficiência de produtos comerciais sobre carrapatos Rhipicephalus
(Boophilus) microplus provenientes da Bovinocultura de Leite da UFRRJ (FAIZ) e da
PESAGRO-RJ.
Produto Comercial
Eficiência do Produto (%)
FAIZ PESAGRO
CYPERCLOR PLUS
100
100
FLYTION SP
100
100
TOPLINE POUR-
100
44,9
AMIPHÓS
95,6
86,7
COLOSSO PULVERIZAÇÃO
80,3
78,7
CARRAPATICIDA E
SARNICIDA U.C.B.
50,8
91,8
Fonte: EMBRAPA, Gado de Leite (2009).
Na propriedade da FAIZ, a população de carrapato foi mais sensível aos produtos
comerciais “Cyperclor Plus, Flytion Sp, TopLine pour on” e menos à “Colosso e
Carrapaticida e Sarnicida U.C.B.” A população oriunda da PESAGRO, se comportou de
maneira oposta, sendo mais sensível ao Carrapaticida e Sarnicida U.C.B e menos a TopLine
pour on. Através destes dados pode-se observar que realmente, a resposta é diferente nas
populações distintas, independentemente do controle ser químico ou biológico. Essa diferença
de sensibilidade entre as populações provavelmente é devido a contatos prévios com produtos
com estas mesmas bases químicas, acarretando na seleção de cepas resistentes, por isso um
histórico do controle de carrapatos nestas propriedades é de extrema importância.
Quando se sabe que uma população de carrapatos é resistente a produtos químicos,
não se pode descartar a possibilidade de interferência dos mecanismos desta resistência na
atuação dos fungos entomopatogênicos, principalmente pelo fato de que tanto os produtos
químicos como os fungos entomopatogênicos agem nos carrapatos através de contato com a
cutícula. Em um estudo com R. (B.) microplus resistentes a acaricidas, Baffi et al. (2007)
observaram diferentes pontos de mutações genéticas nestas populações resistentes a produtos
químicos a base de piretróides e organofosforados. E quando Bahiense (2007) estudou a ação
in vivo dos isolados Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana associados ou não a
Deltametrina no controle de uma cepa do carrapato R. (B.) microplus resistente a piretróides,
o autor observou que esta cepa sofreu ação pelos fungos, porém com valores abaixo dos
encontrados na literatura. Nos grupos tratados apenas com suspensões fúngicas, os
percentuais médio de controle foram de 6,43% e 8,18% nas concentrações de 10
8
conídios/ml
de M. anisopliae e B. bassiana, respectivamente. Em testes in vitro, Bittencourt et al. (1992),
37
utilizando a mesma concentração deste isolado fúngico de M. anisopliae, verificou um
percentual de 96,6%, evidenciando que experimentos realizados em laboratório, a eficácia
observada é mais elevada do que nos experimentos in vivo. Isto se deve aos experimentos
laboratoriais serem executados em ambiente de umidade e temperatura favorável ao patógeno
e controlada, ao contrário das condições a campo, onde as variações climáticas são bruscas e
nem sempre favorável ao patógeno. Além destes fatores climáticos influenciando na eficácia
dos isolados fúngicos, outras hipóteses não devem ser descartadas, como por exemplo,
diferenças intrínsecas entre os isolados utilizados em momentos diferentes e uma possível
correlação entre cepas resistentes a produtos químicos e controle biológico utilizando fungos
entomopatogênicos, visto que o presente estudo foi realizado sobre condições laboratoriais
assim como por Bittencourt et al. (1992) e os resultados aqui encontrados foram menores.
Outro fator bastante importante que pode favorecer o entendimento sobre diferença
entre populações distintas de carrapatos é conhecimento genotípico destes artrópodes. Passos
et al. (1999) estudando a variabilidade genética entre populações do carrapato bovino R. (B.)
microplus no sudeste do Brasil, sugeriu através dos resultados encontrados em seu trabalho,
que há uma diversidade genotípica complexa em regiões endêmicas de populações de R. (B.)
microplus. O mesmo foi evidenciado por Labruna et al. (2009) que estudaram populações
oriunda de três continentes: Africano, Americano e Asiático, e evidenciaram divergências
genéticas e reprodutivas entre as populações distintas de R. (B.) microplus. Apesar de não ter
sido realizado nenhum estudo genotípico sobre as populações no presente experimento, as
informações obtidas por Passos et al. (1999) e Labruna et al. (2009) ajudam a explicar a
diferença na susceptibilidade entre as populações estudadas.
A partir deste estudo, pode se observar que diferentes populações desta espécie de
carrapato podem manifestar diferentes níveis de susceptibilidade à infecção por B. bassiana e
M. anisopliae. Neste caso, não só as condições genéticas e fisiológicas dos isolados fúngicos,
mas também a susceptibilidade dos indivíduos de uma população podem interferir na eficácia
do biocontrole de determinada população do carrapato R. (B.) microplus. Neste sentido, tendo
em vista que é possível a seleção dos isolados de maior potencial virulento sobre diferentes
populações de carrapato, a pesquisa de uma formulação destes isolados pode favorecer uma
maior eficácia nos programas de controle biológico de carrapatos.
Pelo fato deste estudo ter sido pioneiro acerca da sensibilidade entre populações de R.
(B.) microplus utilizando os fungos entomopatogênicos M. anisopliae (isolado Ma 959) e B.
bassiana (isolado Bb 986), os resultados encontrados demonstram grande importância e são
38
motivadores para dar continuidade a esta linha de pesquisa, isto devido a complexidade do
assunto.
39
6 CONCLUSÕES
Existe diferença na susceptibilidade ao controle biológico entre diferentes
populações de R. (B.) microplus, quando desafiadas com os isolados fúngicos
Ma 959 de M. anisopliae e Bb 986 de B. bassiana, não apenas com relação a
concentração necessária para seu controle, como também no tempo necessário
para seu controle;
Em aplicações futuras dos fungos entomopatogênicos em nível de campo, pode
se aplicar a metodologia de teste de sensibilidade dos carrapatos aos fungos
antes do tratamento, para saber qual espécie fúngica é mais patogênica a
determinada população de carrapatos, proporcionando assim melhores
resultados;
40
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