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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Estudos de Pré-Formulação e Formulação de
Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae).
Russany Silva Da Costa
Belém – PA
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Estudos de Pré-Formulação e Formulação de
Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae).
Autor: Russany Silva da Costa
Orientador: Prof. Dr. José Otávio Carréra Silva Júnior.
Belém – PA
2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas, área de concentração:
Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da
Saúde, da Universidade Federal do Pará, como requisito
para obtenção do título de mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca Central da UFPA
Dedicatória
Costa, Russany Silva da, 1985-
Estudos de pré-formulação e formulação de Heliotropium
indicum (L.) DC (Boraginaceae) / Russany Silva da Costa ;
orientador, José Otávio Correa Silva Júnior. — 2010.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará,
Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas, Belém, 2010.
1. Matéria médica vegetal – Controle de qualidade. 2.
Tecnologia farmacêutica. I. Título.
Dedicatória
À minha família
meus pais,
meus avós e
irmão pelo
Apoio incondicional nos momentos que mais precisei.
À minha mãe, Rosângela Costa, o melhor exemplo de dignidade,
solidariedade, seriedade e força, com sua experiência e sabedoria,
cujos passos jamais hesitarei em seguir. Meu apoio e incentivo
durante a elaboração deste trabalho. Obrigada por sempre acreditar
em mim.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, Rosângela Costa, por está sempre disponível nos momentos
que precisei.
À Universidade Federal do Pará, pela oportunidade oferecida para
realização deste trabalho.
Ao orientador Prof. Dr. José Otávio Carréra Silva Júnior, meu agradecimento
pela oportunidade em realizar esta pesquisa, amizade, orientação e confiança
durante a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. José Maria dos Santos Vieira, pelo incentivo e apoio quando
mais precisei e pelos esclarecimentos nos ensaios da atividade antimicrobiana.
Ao Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa, pela orientação técnica e
científica e oportunidade de realização dos processos de extração e cromatografia
em seu Laboratório de Fitoquímica.
Ao Prof. Dr. Carlos Emmerson F. da Costa, pela orientação técnica-científica
na etapa das análises termogravimétricas.
Ao Prof. Dr. Flávio Vasconcelos, pela orientação sobre atividade tóxica da
espécie estudada.
Aos colegas de pós-graduação: Auriekson, Luana, Núbia, Hugo, Michelli,
Jaqueline, Patricia, Christian, Sarah e Raimundo pela amizade, companheirismos e
agradável convivência, tão importante no período de duração do curso.
Aos técnicos dos laboratórios da Faculdade de Farmácia: Jaílton, João e
Lenita, pela ajuda oferecida sempre que solicitados.
À farmacêutica Carla Lúcia pela valiosa contribuição nos ensaios da
atividade antimicrobiana.
Ao mestre em Ciências Farmacêuticas, Mauro Sérgio Alves, pelo apoio e
atenção dedicados sempre que solicitei.
À amiga e doutoranda Kariane Nunes, pela ajuda oferecida em Ribeirão
Preto.
Ao químico José Luiz Cardoso, pela valiosa contribuição no processo de
liofilização do extrato vegetal.
Ao estagiário Charles Alberto do Laboratório de Catálise e Oleoquímica do
Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Faculdade de Química, pela valiosa
contribuição na análise térmica.
À Prof. Dra. Roseanne Ribeiro pela oportunidade de utilizar o Laboratório de
Controle de Qualidade Físico-Químico.
Aos meus amigos da UFPA (não citarei nomes pelo receio de cometer
injustiça) pela amizade e torcida.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
pelo auxílio financeiro oferecido na forma de bolsa concedida para realização do
trabalho.
Enfim, a todos as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para
realização deste trabalho.
À todos vocês de forma muito especial e particular,
Meu muito obrigada!
Resumo
vi
RESUMO
ESTUDOS DE PRÉ-FORMULAÇÃO E FORMULAÇÃO DE Heliotropium
indicum (L.) DC -BORAGINACEAE
Heliotropium indicum L. (Boraginaceae) é um subarbusto que atinge até 70 cm
de altura, é amplamente distribuído geograficamente. A espécie é conhecida como
fedegoso na região norte e nordeste. Diante do potencial biológico desta espécie
este trabalho objetiva determinar parâmetros de qualidade da droga vegetal até o
produto final e avaliar a atividade antimicrobiana de suas folhas, com finalidade de
se obter uma formulação fitoterápica semi-sólida. Para isso utilizou-se parâmetros
de controle de qualidade físico, químico e físico-químico descritos na Farmacopéia
Brasileira e literatura pertinente. A droga vegetal foi classificada como pó grosso,
apresentou valores médios de perda por dessecação e cinzas totais de 12,88% e
17,14%, respectivamente. A análise termogravimétrica do pó e do extrato liofilizado
mostrou que ambos apresentaram boa estabilidade térmica até 180°C. Os
espectros na região do IV mostraram um aumento na intensidade das bandas de
absorção do extrato liofilizado, que pode está relacionado à extração dos
constituintes químicos da matriz celular. A prospecção química do extrato
confirmou a presença de classes de metabólitos secundários já relatados em
literatura. A fração clorofórmica sugere a presença de alcalóides pelo teste de
precipitação com reagente de Dragendorff. A CCD e a CLAE mostraram uma
possível presença de uma mesma substância nas frações alcaloídicas e hexânicas.
O extrato bruto de H. indicum L. inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus
apresentando halos de 12,5 mm±0,707 e 10,5 mm±0,707 para as concentrações
de 500 mg/mL e 250 mg/mL, respectivamente. As misturas físicas do extrato com
os adjuvantes farmacêuticos, utilizados no desenvolvimento da formulação
fitoterápica, não apresentaram incompatibilidade física e não houve modificações
significativas no perfil de absorção entre os compostos analisados. A formulação
fitoterápica semi-sólida manteve-se estável após sua preparação, após a
submissão do gel a força centrípeta e após ação do estresse térmico.
Palavras Chaves: Heliotropium indicum L. Controle de qualidade. Gel. Atividade
antimicrobiana.
Abstract
vii
ABSTRACT
PRE-FORMULATION AND FORMULATION STUDIES OF Heliotropium indicum
(L.) DC -BORAGINACEAE
Heliotropium indicum L. (Boraginaceae) is a shrub, reaches up to 70 cm high.
It is known as “fedegoso” in the north and northeast of Brazil. Because of the
biological potential of this species, this work aims to determine the quality parameters
of the vegetable drug to the final product and evaluate the antimicrobial activity of the
leaves of H. indicum L. The purpose of obtaining a phytotherapic formulation semi-
solid, we used the parameters of quality control physical, chemical and physical-
chemical described in the Brazilian Pharmacopoeia and others literature. The
vegetable drug was classified as coarse powder, showed values of loss on drying
and total ash of 12.88% and 17.14%, respectively. The thermogravimetric analysis of
the powder and the extract showed that both had good physical stability up to 180
°C. The spectra in the region IR showed an increase in the intensity of the absorption
bands of the extract, which may relates to the extraction of chemical constituents of
the cellular matrix. The prospecting chemical extract confirmed the presence of
classes of secondary metabolites already reported in literature. The chloroform
fraction suggests the presence of alkaloids by precipitation test with Dragendorff
reagent. The TLC and HPLC showed a possible presence of the same substance in
the alkaloidal and hexane fractions. The crude extract inhibited the growth of
Staphylococcus aureus with halos of 12.5 mm ± 0.707 and 10.5 ± 0.707 mm for
concentrations of 500 and 250 mg / mL, respectively. The physical mixtures of the
extract with adjuvant pharmaceutical used to develop the phytotherapic formulation
showed no physical incompatibility and no significant changes in the absorption
profile of the compounds analyzed. The phytotherapic formulation semi-solid has a
good stability after the preparation, after the submission of the gel by centripetal force
and after the action of heat stress.
Keyword: Heliotropium indicum L, Quality Control, Gel, Antimicrobial activity.
Lista de Figuras
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Fotografia da espécie Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae)
mostrando aspectos gerais (A) e detalhe da folha e inflorescência
(B)
26
Figura 2.
Alcalóides isolados da espécie H. indicum L. (A) heliotrina; (B)
europina; (C) licopsamina; (D) heliosurpina; (E) helindicina; (F)
indicina.
29
Figura 3.
Exsicata da espécie H. indicum L. (Boraginaceae) MG 145574.
54
Figura 4.
Esquema da partição líquido-líquido ácido e básico para obtenção
da fração hexânica (FH) e da fração alcaloídica (FA).
65
Figura 5.
Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas de H.
indicum L.
75
Figura 6.
Curva TG e DrTG do pó das folhas de H. indicum L. obtida a
5°C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00 mL/min.
76
Figura 7.
Curva DSC do pó das folhas de H. indicum L. obtida a
5°C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00 mL/min.
77
Figura 8.
Espectro na região do IV do pó das folhas de H. indicum L.
78
Figura 9.
Cromatograma da FA visualizado no UV a 254 nm (à esquerda) e
revelado com Dragendorff e HCl 5% (à direita) obtido pelo sistema
eluente CHCl
3
⁄CH
3
OH (90:10), em atmosfera de NH
4
OH.
81
Figura 10.
Cromatograma da FH visualizado no UV a 254 nm (à esquerda)
revelado com Dragendorff e HCl 5% (à direita) obtido pelo sistema
eluente CHCl
3
⁄CH
3
OH (90:10), em atmosfera de NH
4
OH.
81
Figura 11.
Perfil cromatográfico por CLAE-UV/DAD a 250 nm do extrato bruto
de H. indicum L. Cromatogramas: A- extrato bruto (1,60 min); B-
fração alcaloídica (1,73 min), C- fração hexânica (1,73 min).
82
Figura12.
Espectros no UV em 250 nm idêntico ao pico com Rt=1,60 min
(extrato) e Rt=1,73 min (fração alcaloídica).
83
Figura 13.
Curvas TG e DrTG do extrato liofilizado de H. indicum L.
obtida a 5°C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00 mL/min.
84
Figura 14.
Curva DSC do extrato liofilizado de H. indicum L. obtida a 5
°C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00 mL/min.
85
Figura 15.
Espectro na região do IV do extrato liofilizado de H. indicum
L.
86
Figura 16.
Espectros na região do infravermelho da droga vegetal e do
extrato liofilizado de H. indicum L.
87
Lista de Figuras
ix
Figura 17.
Placa mostrando os halos de inibição do crescimento da
cepa de S. aureus com discos contendo diferentes
concentrações do EB de H. indicum L dissolvido em DMSO.
88
Figura 18.
Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L.,
mistura binária (extrato/HEC -1:1 p/p) e HEC.
89
Figura 19.
Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., a
mistura binária (extrato/HEC – 1:1 p/p) e a HEC
90
Figura 20.
Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado de H. indicum L., a
mistura binária (extrato/HEC – 1:1 p/p) e a HEC.
91
Figura 21.
Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binária
(extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) e metilparabeno.
92
Figura 22.
Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binária
(extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) e metilparabeno.
93
Figura 23.
Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binária
(extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) e metilparabeno.
93
Figura 24.
Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binária
(extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) e ao propilenoglicol.
95
Figura 25.
Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binária
(extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) e propilenoglicol.
96
Figura 26.
Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura binária
(extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) e propilenoglicol.
96
Figura 27.
Espectros na região do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da
mistura binária (extrato/HEC 1:1 p/p) e da HEC, analisados na faixa
de absorção de 4000-500 cm
-1
.
98
Figura 28.
Espectros na região do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da
mistura binária (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e do metilparabeno,
analisados na faixa de absorção de 4000-500 cm
-1
.
98
Figura 29.
Espectros na região do IV do extrato liofilizado de H. indicum L., da
mistura binária (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e do propilenoglicol,
analisados na faixa de absorção de 4000-500 cm
-1
.
99
Figura 30.
Valores de pH obtidos pelo teste do estresse térmico das amostras
do gel de H. indicum L. submetido a estufa (45°C ± 2°C) e das
amostras do gel de H. indicum L. submetido a temperatura ambiente
(25°C ± 2°C), n= 3.
100
Figura 31.
Características da viscosidade da formulação contendo tintura de H.
indicum L.
101
Figura 32.
Perfil reológico da formulação contendo tintura de H. indicum L. 101
Lista de Tabelas
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Determinação da perda por dessecação e teor de cinzas totais do pó
das folhas de H. indicum L.
76
Tabela 2.
Perfil térmico (TG) do pó das folhas de H. indicum L. com suas
respectivas perdas de massa, em cada intervalo de temperatura (°C).
77
Tabela 3.
Valores das entalpias apresentadas pelo pó das folhas de H. indicum
L. em diferentes temperaturas, analisadas por DSC.
78
Tabela 4.
Determinação do pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura
de H. indicum L.
79
Tabela 5.
Prospecção química do extrato bruto de H. indicum L.
80
Tabela 6.
Perfil térmico (TG) do extrato liofilizado de H. indicum L. com suas
respectivas perdas de massa, em cada intervalo de temperatura (°C).
84
Tabela 7.
Valores das entalpias apresentadas pelo extrato liofilizado de H.
indicum L. em diferentes temperaturas, analisadas por DSC.
85
Tabela 8.
Faixa de absorção das ligações das moléculas no extrato de H.
indicum L.
86
Tabela 9.
Valores médios dos halos de inibição (mm) obtidos pelo método de
difusão em disco utilizado na análise do extrato bruto de H. indicum L.
em diferentes concentrações.
88
Tabela 10.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de
massa (∆m) do extrato liofilizado de H. indicum L, da HEC e da
mistura binária do extrato liofilizado e HEC (1:1 p/p).
90
Tabela 11.
Resultados termogravimétricos (DTA e DSC) correspondente a
variação de energia (∆H) do extrato liofilizado de H. indicum L., da
HEC e da mistura binária do extrato liofilizado e HEC (1:1 p/p).
91
Tabela 12.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de
massa (∆m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do metilparabeno e
da mistura binária do extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p).
92
Tabela 13.
Resultados termogravimétricos (DTA e DSC) correspondente a
variação de energia (∆H) do extrato liofilizado de H. indicum L., do
metilparabeno e da mistura binária do extrato liofilizado e
metilparabeno (1:1 p/p).
94
Tabela 14.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de
massa (∆m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do propilenoglicol e
da mistura binária do extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p).
95
Tabela 15.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de
massa (∆m) do extrato liofilizado de H. indicum L., do propilenoglicol e
da mistura binária do extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p).
97
Lista de Quadros
xi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1.
Componentes da formulação fitoterápica semi-sólida e suas
respectivas concentrações.
70
Lista de Abreviaturas
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABIFITO
Associação Brasileira da Indústria de Fitoterápicos
ATCC
American Type Culture Colection
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CIM Concentração inibitória mínima
CG Cromatografia gasosa
GC-MS
Gas chromatography-mass spectrometry
/
Cromatografia gasosa
acoplado a espectrômetro de massa
GC-FID
Gas chromatography-flame ionization detector/Cromatografia
gasosa acoplado a detectores de ionização de chama
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Arranjo de Diodo
DMSO Dimetilsufóxido
DSC
Differential scanning calorimetry/Calorimetria exploratória
diferencial
DTA
Differential thermal analysis/Análise térmica diferencial
EB Extrato Bruto
FA Fração Alcaloídica
FH Fração Hexânica
FTIR
Fourier transform infrared spectroscopy/Espectroscopia na região
do infravermelho com transformada de Fourier
IBGE Instituto Brasileiro de Geográfia e Estatísticas
IV Infravermelho
OMS/ WHO
Organização Mundial da Saúde⁄ World Health Organization
PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
Rf Retention factor/Fator de retenção
Rt Retention time/Tempo de retenção
RMN Ressonância Magnética Nuclear
SUS Sistema Único de Saúde
TG Termogravimetria
TGA Análise termogravimétrica
UFC Unidade Formadora de Colônia
UV Ultravioleta
Sumário
xiii
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
16
2
REVISÃO DE LITERATURA
19
2.1 Plantas medicinais 20
2.2 O gênero Heliotropium 23
2.3 Heliotropium indicum L. 24
2.3.1 Descrição botânica 24
2.3.2 Dados taxonômicos 26
2.3.3 Distribuição geográfica 27
2.3.4 Dados etnofarmacológico 27
2.3.5 Constituintes químicos e atividade farmacológica 28
2.3.6 Toxicidade da espécie H. indicum L. 32
2.4 Tinturas 33
2.5 Extrato liofilizado 35
2.6 Estudos de pré-formulação 35
2.7 Técnicas analíticas utilizadas no desenvolvimento, avaliação e
controle de qualidade de fitoterápicos
36
2.7.1 Espectroscopia na região do infravermelho 36
2.7.2 Análise térmica 38
2.7.2.1 Termogravimetria (TG) 39
2.7.2.2 Análise térmica diferencial (DTA) 40
2.7.2.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) 40
2.8 Estrutura e funções da pele 41
2.8.1 Vias de permeação percutânea pelo estrato córneo 42
2.9 Formulações para uso tópico 44
2.9.1 Gel 44
2.9.2 Hidroxietilcelulose (Natrosol®) 46
2.10 Estudo de estabilidade das formulações 46
2.10.1 Avaliação preliminar da estabilidade 47
2.10.2 Teste de estabilidade acelerada 47
3
OBJETIVOS
49
3.1 Objetivo Geral 50
3.2 Objetivos Específicos 50
4
MATERIAL E MÉTODOS
51
4.1 Material 52
4.1.1 Matéria-prima vegetal 52
4.1.2 Reagentes, soluções e substâncias utilizadas 52
4.1.3 Equipamentos 52
4.1.4 Cepas de micro-organismos utilizados 53
4.2 Métodos 53
4.2.1 Obtenção e identificação botânica do material vegetal 53
4.2.2 Processamento do material vegetal 54
4.2.3 Caracterização física e físico-química das folhas de H. indicum
L.
55
4.2.3.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó. 55
4.2.3.2 Determinação de perda por dessecação do pó. 56
4.2.3.3 Determinação do teor de cinzas totais do pó. 56
4.2.3.4 Obtenção do perfil térmico por termogravimetria (TG, DSC) do
pó.
56
4.2.3.5 Obtenção do perfil espectroscópico na região do IV do pó. 57
Sumário
xiv
SUMÁRIO
4.2.4 Obtenção e caracterização química e físico-química da solução
extrativa de H. indicum L.
57
4.2.4.1 Obtenção da tintura a partir das folhas de H. indicum L. 57
4.2.4.2 Determinação do pH da tintura. 57
4.2.4.3 Determinação da densidade aparente da tintura. 58
4.2.4.4 Determinação do resíduo seco da tintura. 58
4.2.5 Abordagem fitoquímica da tintura. 58
4.2.5.1 Obtenção do extrato bruto a partir da tintura. 58
4.2.5.2 Prospecção química do extrato bruto. 59
4.2.5.3 Obtenção da fração alcaloídica (FA). 64
4.2.5.4 Determinação do perfil cromatográfico da fração alcaloídica (FA)
e da fração hexânica (FH) por cromatografia em camada
delgada (CCD).
65
4.2.5.5 Determinação do perfil cromatográfico por CLAE 66
4.2.6 Obtenção do extrato liofilizado a partir da tintura 66
4.2.6.1 Obtenção do perfil térmico por termogravimetria (TG, DTA e
DSC) do extrato liofilizado.
66
4.2.6.2 Obtenção do perfil espectroscópico na região do IV do extrato
liofilizado.
67
4.2.7 Ensaio biológico do extrato hidroalcóolico de H. indicum L. 67
4.2.7.1 Micro-organismos testados 67
4.2.7.2 Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato bruto. 68
4.2.8 Estudos da formulação contendo a tintura padronizada de H.
indicum L.
69
4.2.8.1 Obtenção da formulação 69
4.2.8.2 Caracterização físico-química da mistura física do extrato
liofilizado x adjuvantes farmacêuticos empregados na
formulação por Termogravimetria (TG), Análise Térmica
Diferencial (DTA), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e
espectrometria na região do infravermelho (IV)
70
4.2.8.2.1 Preparo das amostras 70
4.2.8.2.2 Termogravimetria (TG e DTA) dos excipientes da formulação e
de suas misturas binárias com o extrato liofilizado.
71
4.2.8.2.3 Análise da calorimetria exploratória diferencial (DSC) 71
4.2.8.2.4 Análise espectrofotométrica na região do infravermelho dos
excipientes da formulação e de suas misturas binárias com o
extrato liofilizado.
72
4.2.9 Avaliação preliminar da estabilidade da formulação 72
4.2.9.1 Teste de centrifugação 72
4.2.9.2 Teste do estresse térmico 72
4.2.9.3 Determinação do valor do pH 73
4.2.9.4 Avaliação do perfil reológico da formulação 73
5
RESULTADOS
74
5.1 Estudos de pré-formulação 75
5.1.1 Avaliação das características físicas e físico-químicas da droga
vegetal
75
5.1.1.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó. 75
5.1.1.2 Determinação da perda por dessecação e do teor de cinzas
totais do pó de H. indicum L.
76
5.1.1.3 Análise do perfil térmico por TG do pó. 76
5.1.1.4 Análise DSC do pó. 77
5.1.1.5 Perfil espectroscópico na região do IV do pó. 78
Sumário
xv
SUMÁRIO
5.1.2 Caracterização físico-química da tintura de H. indicum L. 79
5.1.2.1 Determinação do pH, densidade aparente e resíduo seco da
tintura.
79
5.1.3 Abordagem Fitoquímica da tintura. 79
5.1.3.1 Prospecção química do extrato bruto. 79
5.1.3.2 Determinação do perfil cromatográfico da fração alcaloídica (FA)
e da fração hexânica (FH) obtido por cromatografia em camada
delgada (CCD).
81
5.1.3.3 Determinação do perfil do extrato bruto, da fração alcaloídica e
da fração hexânica de H. indicum L. por CLAE
82
5.1.4 Caracterização físico-química do extrato liofilizado de H.
indicum L.
83
5.1.4.1 Análise do perfil térmico por TG do extrato liofilizado 83
5.1.4.2 Análise DSC do extrato liofilizado. 85
5.1.4.3 Perfil espectroscópico na região do infravermelho do extrato
liofilizado.
86
5.2 Avaliação preliminar da atividade antimicrobiana do extrato
bruto de H. indicum L.
87
5.3 Estudo da formulação 89
5.3.1 Determinação dos ensaios preliminares do extrato liofilizado de
H. indicum L. com suas misturas binárias por termogravimetria
(TG), análise térmica diferencial (DTA) e calorimetria
exploratória diferencial (DSC).
89
5.3.2 Análise espectrofotométrica na região do infravermelho do
extrato liofilizado de H. indicum L. e suas misturas binárias.
97
5.3.3 Formulação fitoterápica contendo tintura padronizada de H.
indicum L.
99
5.3.3.1 Avaliação da formulação semi-sólida contendo a tintura de H.
indicum L.
99
5.3.3.2 Teste de Centrifugação 99
5.3.3.3 Teste de estresse térmico 100
5.3.3.4 Determinação do pH da formulação 100
5.3.3.5 Avaliação do comportamento reológico da formulação 101
6
DISCUSSÃO
102
7
CONCLUS
ÃO
121
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
124
16
1. INTRODUÇÃO
Introdução
17
1.
1.1.
1. Introdução
IntroduçãoIntrodução
Introdução
As plantas são consideradas uma valiosa fonte de substâncias biologicamente
ativas, que têm sido exploradas pelo homem desde os primórdios da humanidade. O
maior número de espécies vegetais encontra-se nas regiões equatoriais da América
do Sul, África e Ásia. No Brasil encontra-se a maior diversidade vegetal, estimando-se
em 20% as espécies vegetais e animais existentes (GUERRA, 2003). Devido à
riqueza da biodiversidade da flora brasileira, a atenção do mundo está voltada para a
floresta amazônica, mata atlântica e cerrado (CARLOS, 2007). A floresta amazônica
ocupa territórios do Brasil, Bolívia, Peru, Equador, Colômbia, Venezuela, Guiana,
Suriname e Guiana Francesa, com uma área de aproximadamente 6.000.000 km
2
da
América do Sul, sendo constituída por diferentes tipos de vegetação. Cerca de 65%
dessa região é coberta por um tipo florestal denominado floresta de terra firme,
caracterizada principalmente pela elevada riqueza e diversidade de espécies
(OLIVEIRA e AMARAL, 2004). A floresta amazônica é um ecossistema que apresenta
uma diversidade florística muito elevada, maior que os demais ecossistemas florestais
do mundo (LEITÃO FILHO, 1987).
A descrição da utilização de plantas brasileiras para fins medicinais é relatada
desde a época da colonização por exploradores europeus, através da observação do
uso dos vegetais pelos índios, conforme descrição de Gabriel Soares de Sousa, em
sua obra denominada “Tratado Descritivo do Brasil em 1587” (BRANDÃO, 2003).
Atualmente, a utilização de plantas medicinais e produtos fitoterápicos estão
em expansão no Brasil e no mundo, o que tem impulsionado as indústrias
farmacêuticas e também o governo federal a investir em pesquisa, na forma de
incentivos através das políticas públicas para uso racional destes produtos, pois a
oportunidade para produtos com possível utilização econômica aumenta com a
diversidade das espécies (CARLOS, 2007). Com isso, há a necessidade cada vez
maior de estabelecer parâmetros de qualidade destes produtos, o que implica em um
controle de qualidade desde a matéria-prima vegetal, do produto intermediário até a
obtenção do produto final.
Introdução
18
Nesse contexto, este trabalho pretende contribuir para estimular linhas de
pesquisas em fitoterapia e ainda promover desenvolvimento tecnológico, com base no
uso tradicional de plantas medicinais da região amazônica, priorizando as
necessidades epidemiológicas da população. A espécie em estudo Heliotropium
indicum L. apresenta aspectos econômicos, acadêmicos e farmacológicos que
justificam sua escolha para investigação, pois é uma planta de ocorrência na região
amazônica muito utilizada na forma de cataplasma para tratamento de lesões
dérmicas (AMOROZO e GELLY, 1988; DI STASI, 1996) e possuidora de atividade
antimicrobiana (REINA et al, 1995; SINGH et al, 2002).
Entretanto, diversos estudos fitoquímicos têm demonstrado que a espécie H.
indicum L. apresenta alcalóides pirrolizidínicos em todo o vegetal (PANDEY et al,
1982; SINGH et al, 2005) e estes possuem uma atividade hepatotóxica (CHEEKE,
1988). Tendo em vista a conhecida atividade hepatotóxica da espécie, este trabalho
propõe desenvolver uma formulação fitoterápica semi-sólida para uso tópico contendo
a tintura de H. indicum L. Assim, os alcalóides pirrolizidínicos, responsáveis pela
atividade tóxica, não sofrerão metabolismo de primeira passagem, não sendo,
portanto, absorvido pelo fígado.
Contudo, sabe-se que para se obter um produto com qualidade, segurança e
eficácia é preciso padronizar as etapas do desenvolvimento tecnológico desde a
coleta do material vegetal até a avaliação do produto final obtido, a fim de garantir
uma eficácia e segurança ao usuário do fitomedicamento. Por isso, este trabalho
propõe a identificação e caracterização dos marcadores químicos presentes na tintura
obtida das folhas de H. indicum L. e estudos de pré-formulação e formulação para a
obtenção do gel fitoterápico seguindo critérios para obtenção de um produto final
eficaz e seguro.
19
2. REVISÃO DE
LITERATURA
Revisão de Literatura
20
2 Revisão de Literatura
Revisão de LiteraturaRevisão de Literatura
Revisão de Literatura
2.1 Plantas medicinais
A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a
sua complexidade, calcula-se a existência de mais de 2,0 milhões de espécies
distintas de plantas, animais e micro-organismos. O Brasil é o país com a maior
diversidade genética vegetal do mundo. Cerca de dois terços das espécies se
encontram nos trópicos, estimando que o Brasil detenha cerca de 75% de todas as
espécies florestais nas suas duas principais formações: a Floresta Tropical Atlântica
e a Floresta Amazônica (DIAS, 1996).
Das espécies catalogadas estas podem ser medicinais, aromáticas ou
apresentar outras utilidades. Entretanto essa biodiversidade encontra-se seriamente
ameaçada pelo ritmo atual de extinção de plantas que já é entre 50 e 100 vezes
maior que as taxas médias observadas no passado (GUERRA et al, 2003). As
principais causas de perda da diversidade genética têm sido associadas à
destruição e à fragmentação dos ecossistemas e aos estresses ambientais como
poluição e as mudanças climáticas globais (BAUR e SCHMID, 1996).
As plantas medicinais têm sido base dos principais produtos indicados para
tratamento de diversas moléstias desde a Antigüidade. Praticamente todos os povos
ou etnias do mundo usam plantas medicinais ou seus derivados de forma direta ou
indireta para o tratamento de males que acometem o homem e/ou para atingir o
estado de completo bem-estar físico, mental e social (KOROLKOVAS, 1996). Por
isso, o reconhecimento do valor delas como recurso clínico, farmacêutico e
econômico cresce progressivamente em vários países. Por conta disso, essas
nações vêm normatizando e legislando acerca dos diferentes critérios de segurança,
eficácia e qualidade que devem envolver esses produtos (REIS et al, 2004; BRASIL,
2009).
A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico de grande
aceitação pela população e vem crescendo junto à comunidade médica, desde que
sejam utilizadas plantas cuja atividade biológica tenha sido investigada
cientificamente, comprovando sua eficácia e segurança (YUNES et al, 2001). E o
uso de plantas medicinais pela população mundial tem sido bastante significativo, de
Revisão de Literatura
21
acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mais da metade dos
habitantes do planeta, especialmente aqueles de países pobres em
desenvolvimento, fazem uso de algum tipo de erva na busca de alívio de
sintomatologia dolorosa ou desagradável. Desse total pelo menos 30% ocorre por
indicação médica (ESTRELA, 1995). Há informações de que os produtos naturais e
as preparações fitoterápicas são responsáveis por 25% do receituário médico nos
países desenvolvidos e cerca de 80% nos países em desenvolvimento, dados
revelados pela OMS. Tal fato que pode ser exemplificado pelo oeste da África, onde
mais da metade das espécies são empregadas como plantas medicinais pela
população rural, estimando-se que as espécies encontradas neste continente muitas
sintetizam compostos com atividades anti-carcinogênica (MALO e ROY, 1996).
Estima-se que no mercado mundial, cerca de 50% das plantas são usadas na
alimentação, 25% em cosméticos, 20% pela indústria farmacêutica e 5% em outras
atividades e calcula-se em 10.000 o número de espécies vegetais medicinais
(CAÑIGUERAL et al., 2003). No Brasil, além das plantas medicinais serem
comercializadas em feiras livres e mercados públicos, nos últimos anos elas têm
sido componentes de produtos industrializados que são comercializados com
indicações terapêuticas em estabelecimentos como farmácias, casas de produtos
naturais e supermercados, como drogas vegetais
a
ou/e fitoterápicos
b
.
1
Conforme a Associação Brasileira da Indústria de Fitoterápicos – ABIFITO, o
setor representa 5,5% do mercado de princípios ativos. Segundo pesquisas da
Universidade de São Paulo, no território nacional, existem cerca de 200 fabricantes
de medicamentos fitoterápicos. O mercado estima o crescimento de 6% ao ano, em
2010, com lucros anuais em torno de US$ 1 bilhão. Como se pode verificar o
mercado de produtos fitoterápicos continua em expansão no mundo inteiro. No
Brasil, em 2001, a venda de medicamentos fitoterápicos atingiu US$ 270 milhões,
representando 5,9% do mercado de medicamentos (CALIXTO, 2003). Nota-se,
a Droga vegetal - “planta medicinal ou suas partes, após processos de coleta, estabilização e secagem,
podendo ser íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada” (BRASIL, 2004);
b Fitoterápico - “é todo medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas
vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são validadas através de
levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações técnico-científicas em publicações ou
ensaios clínicos fase 3” (BRASIL, 2004);
Revisão de Literatura
22
também, um crescimento do mercado internacional movimentando cerca de US$ 50
bilhões, sendo que a Alemanha possui o maior mercado de fitoterápicos
representando 10% do mercado farmacêutico mundial (SIMÕES et al, 2001).
O interesse atual pelas plantas medicinais e medicamentos delas derivados
ocorre principalmente pela frustração advinda da exagerada expectativa em torno de
fármacos de origem sintética, aos efeitos indesejáveis e prejuízos causados tanto
pelo uso incorreto como pelo uso abusivo destes, assim como também, ao
reconhecimento de que vários vegetais são importantes no desenvolvimento de
novas substâncias terapeuticamente ativas e a crescente atenção que vem sendo
dada, pela comunidade científica, para produtos farmacêuticos (SCHENKEL et al,
1985; AKERELE, 1992). Por isso, é preciso considerar a contribuição das plantas
medicinais como fonte natural de fármacos devido à diversidade de constituintes
químicos presentes nelas. No entanto, inúmeras plantas que são usadas em
preparações fitoterápicas carecem de um rigoroso controle de qualidade, já que a
literatura científica indica que muitas delas podem apresentar substâncias tóxicas ou
composição química variável (NOLDIN et al, 2003; SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES,
2008; NUNES, 2009).
Para aumentar a fiscalização no uso racional das plantas medicinais e
produtos fitoterápicos disponíveis no comércio brasileiro, o governo federal
juntamente com os ministérios em exercício aprovaram medidas voltadas à garantia
de acesso seguro e uso correto de plantas medicinais e produtos fitoterápicos pela
população à utilização sustentável da biodiversidade brasileira e ao desenvolvimento
da indústria nacional, através do Decreto nº 5813 de 22 de junho de 2006, o qual
instituiu a Política Nacional de Plantas Medicinal e Fitoterápico (PNPMF) e grupo de
trabalho interministerial, para elaborar o Programa Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápico. Tal programa visa estabelecer linhas de ação prioritárias para o uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos e também consolidar as iniciativas de
relevância no país e as recomendações nacionais e internacionais sobre o tema.
A idéia é que se construa no Brasil uma rede de esforços para o
desenvolvimento de medidas voltadas à melhoria da atenção à saúde, ao
fortalecimento da agricultura familiar, à geração de emprego e renda, à inclusão
social e ao desenvolvimento industrial e tecnológico de fitoterápicos. E ainda,
ampliação das opções terapêuticas ofertadas aos usuários do Sistema Único de
Saúde (SUS), com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e serviços
Revisão de Literatura
23
relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da
integralidade a atenção à saúde. Para isso, o ministério da saúde elaborou uma
relação de plantas medicinais de interesse ao SUS. Nesta relação constam 71
espécies de plantas e está sendo divulgada pelo Programa Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos do Ministério da Saúde. A finalidade desta lista é orientar
estudos e pesquisas que possam subsidiar a elaboração da relação de fitoterápicos
disponíveis para uso da população, com segurança e eficácia para o tratamento de
determinada doença e para que os Estados possam ser estimulados a oferecer o
serviço com esse tipo de medicamento. São doze os estados brasileiros que já
oferecem o serviço de fitoterapia aos pacientes do SUS (PORTAL DA SAÚDE,
2009).
2.2 O gênero Heliotropium
O gênero Heliotropium consiste de aproximadamente 300 espécies,
distribuídas nas regiões tropicais, subtropicais e temperadas; ocorrendo
principalmente nas zonas áridas (GENTRY, 1993; FÖRTHER, 1998). É considerado
um dos maiores e mais complexos gêneros da família Boraginaceae (AKHANI e
FÖRTHER, 1994). Possui hábito em geral herbáceo associado ao fruto seco. Foi
nomeado por Tournefort em 1719, sendo efetivamente publicado por Carl Linnaeus
em 1735. O gênero Heliotropium foi descrito por Carl Linnaeus e a etimologia de
Heliotropium vem de “hélios” que significa sol e “trepein” que significa mudar,
referindo-se ao fato de suas flores torcerem-se após a exposição ao sol (DI STRATA
e HIRUMA-LIMA, 2002).
A primeira contribuição para o entendimento da sistemática do gênero foi
dada por De Candolle em 1845, baseado fundamentalmente na forma da antera e
no tipo de estigma, propôs quatro seções: Heliotropium sect. Catimas A. DC.,
Heliotropium sect. Piptoclaina (G. Don) Endl., Heliotropium sect. Heliotropium A. DC.
e Heliotropium sect. Orthostachys R.Br. Mais tarde, Bentham & Höoker (1876)
trataram o gênero Heliophytum A. DC. como sinônimo de Heliotropium, propondo
para este último mais uma seção: Heliotropium sect. Heliophytum. O tratamento
mais recente para as espécies sul-americanas de Heliotropium reconhece 73
espécies e as posicionam em 10 seções (MELO e SALES, 2004).
Revisão de Literatura
24
Apesar de bem representado no Brasil, com estimativa de mais de 25
espécies, os estudos sobre Heliotropium ainda são escassos. Os tratamentos
sistemáticos que incluem espécies brasileiras são, na maioria, obras clássicas e
antigas, como a monografia de Fresenius (1857), na Flora Brasiliensi (MELO e
SALES, 2004). Um grande número dessas espécies do gênero Heliotropium é útil
como ornamental, e as espécies H. amplexicaule e H. europaeum são
reconhecidamente medicinais (DI STRATA e HIRUMA-LIMA, 2002).
2.3 Heliotropium indicum L.
2.3.1 Descrição botânica
É uma pequena planta herbácea anual, ereta ou decumbente, ramificada, de
textura um tanto carnosa, pubescente, podendo atingir 50 a 70 cm de altura (Figura
1A) (LORENZI e MATOS, 2002). A espécie possui ramos angulosos, fistulosos.
Suas folhas são simples, alternadas e sub-opostas no mesmo indivíduo, de
superfície bulada com nervuras do tipo eucamptódroma impressas na face superior
e tamanho variando de 3 a 6 cm de comprimento (LORENZI e MATOS, 2002; MELO
e SEMIR, 2008). As folhas são do tipo oval-elíptica a oval-deltóide, raramente
rômbica, apresenta base truncada às vezes assimétrica estreitando-se para o
pecíolo e ápice acuminado (Figura 1B). Na face abaxial é pubescente, mais denso
sobre as nervuras. A margem varia de erosa a plana, com face adaxial plana e
pubescente com tricomas curtos entremeados por tricomas aciculiformes com uma
base discóide. O pecíolo varia de 1,2 a 6,2 cm de comprimento, é parcialmente
alado e possui lâmina de 3,4-12,2 x 1,7-9 cm de comprimento (MELO e SALES,
2004; MELO e SEMIR, 2008).
A espécie é caracterizada por inflorescência escorpióide terminais de 15 a 20
cm de comprimento de cor azulada-clara, do tipo axilar e terminal, não bracteada,
congesta no ápice e pedunculada (Figura 1B) (LORENZI e MATOS, 2002). O
pedúnculo varia de 1,5-4 cm comprimento. Suas flores têm aproximadamente 3-5
mm de comprimento, são sésseis. O cálice tem aproximadamente 2,6-3,2 mm de
comprimento, é profundamente lobado, sendo maior que a metade do comprimento
da corola e persistente no eixo da inflorescência. Os lobos são de 2,2 - 2,6 x 0,2- 0,4
Revisão de Literatura
25
mm, estreitamente lanceolados, de tamanhos levemente diferentes, possui margem
com tricomas aciculiformes esparsos. As corolas têm 3,5-4,5 mm de comprimento,
do tipo hipocrateriforme e coloração variando de branca a arroxeada. Possui tubo de
2,5 - 4 mm de comprimento, subcilíndrico, estreitando-se na fauce e lobos de 0,5-0,9
mm de comprimento (MELO e SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008).
A espécie apresenta estames sésseis, inseridos de 0,8-1,5 mm acima da
base do tubo da corola; as anteras têm de 0,8 a 1 mm de comprimento, são oblongo-
ovais, possui ápice discretamente apiculado, livres entre si, e base levemente
cordada. O ovário tem aproximadamente 0,5 mm de comprimento, é
longitudinalmente sulcado e glabro, possui estilete evidente de aproximadamente
0,2-0,4 mm de comprimento e estigma de 0,6 mm de comprimento. É do tipo
subcapitado. A espécie possui um óvulo por lóculo, curvo e achatado (MELO e
SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008).
Os frutos são do tipo mitriforme, com 2 a 3 mm de diâmetro, possui quatro
núculas agrupadas 2 a 2, com 2 ou 3 nervuras salientes na face dorsal e
divergentes, com ápices acentuadamente bidentado. As sementes são
caracterizadas por unidade nas núculas, atingindo até 1,5 mm, com forma elipsóide,
coloração esbranquiçada e lisa (MELO e SALES, 2004; MELO e SEMIR, 2008). Esta
espécie multiplica-se apenas por sementes (LORENZI, 2000).
H. indicum foi primeiramente descrita por Linnaeus em 1753, com base em
material procedente da Índia. É uma espécie bem definida, a qual Johnston (1928)
reconheceu sete sinônimos. Apesar de próxima de Heliotropium elongatum, pode ser
facilmente identificada pela lâmina foliar com a face adaxial plana e pelo ovário 4-
locular, com um único óvulo por lóculo e principalmente pelo fruto constituído por 4
núculas (MELO e SALES, 2004).
Revisão de Literatura
26
2.3.2 Dados taxonômicos
Reino: Plantae
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Sub-Classe: Asteridae
Ordem: Lamiales
Família: Boraginaceae
Gênero: Heliotropium
Espécie: Heliotropium indicum L.
Figura 1
. Fotografia da espécie Heliotropium indicum (L.) DC (Boraginaceae) mostrando
aspectos gerais (A) e detalhe da folha e inflorescência (B).
Fonte: http://www.plants.usda.gov
(A) (B)
Revisão de Literatura
27
2.3.3 Distribuição geográfica
A espécie H. indicum L. é a mais amplamente distribuída do gênero, ocorre
nas Américas, desde sudeste dos Estados Unidos até a Argentina, incluindo as
Antilhas. É encontrada também na África Tropical, Ásia e Austrália. No Brasil pode
ser encontrada nas regiões: Norte (AC, AM e PA), Nordeste (AL, BA, CE, MA e PE),
Centro-Oeste (GO, MS e MT), Sudeste (ES, MG, RJ e SP) e Sul (PR) (FRÖHLICH et
al, 1981).
No estado de Pernambuco a espécie é registrada apenas nas zonas do Litoral
e da Mata e nas ilhas do arquipélago de Fernando de Noronha, habitando
preferencialmente áreas abertas, em geral próximas a cursos d’água e margens de
estradas e algumas vezes em culturas (MELO e SEMIR, 2004).
Devido sua ampla distribuição geográfica a espécie recebe várias
denominações populares sendo conhecida como: borragem-brava e cravo-de-urubu
(MG); crista-de-galo (BA, MT); fedegoso (MG, PE, PA, AM); crista-de-peru (BA);
gervão-branco (ES). Outras sinonímias são aguaraciunha-assu, aguaraquiunha,
jamacanga e jacuacanga. (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002; MELO e SEMIR, 2008),
erva-de-são-fiacre, aguaraá, tureroque, turirí, borracha-brava, grinalda-de-boneca
(LORENZI e MATOS, 2002).
2.3.4 Dados etnofarmacológico
H. indicum L. é uma espécie bastante utilizada pela medicina popular. A
literatura etnofarmacológica registra o uso de todas as partes desta planta na
medicina caseira de algumas regiões do país. Às suas raízes, folhas e flores são
atribuídas propriedades diuréticas e peitoral (LORENZI e MATOS, 2002). É relatado,
também, que na região amazônica o macerado das folhas em água é indicado em
preparações tópicas contra hemorróidas, afecções cutâneas: incluindo úlceras,
abscesso, furúnculos, picadas de inseto e também em casos de queimaduras
(BRAGA, 1976; DI STASI, 2002). Amorozo e Gély (1988) referem que as folhas
amassadas com folhas de mucuracaá (Petiveria alliacea L.)
são usadas para
tratamento tópico de lesões teciduais. O decocto das folhas, na forma de bochecho
e gargarejo, é utilizado para tratar aftas, estomatites, ulcerações da garganta e da
Revisão de Literatura
28
faringe (CORRÊA, 1984; LORENZI e MATOS, 2002). Na medicina tradicional
salvadorenha, as folhas e raízes maceradas são usadas como preparações tópicas
em regiões inflamadas do corpo (GUERRERO, 1994).
2.3.5 Constituintes químicos e atividade farmacológica
Estudos fitoquímicos mostraram que as folhas de H. indicum L. possuem
alcalóides, taninos e triterpenos, enquanto as raízes, além de alcalóides e taninos,
possuem também glicosídeos cardiotônicos (GUERRERO, 1994). Outros estudos
relatam que já foram isolados os alcalóides: heliotrina (Figura 2A) e lasiocarpina e
compostos não-alcaloídicos, como β-sitosterol, lupeol, β-amirina e β-
sitosterolglucosídeo (PANDEY et al, 1982; SINGH et al, 2003).
A espécie possui alcalóides pirrolizidínicos em todas as partes do vegetal
(PANDEY et al, 1982; SINGH et al, 2005; SOUZA, et al, 2005). Estes são
considerados de grande interesse por suas atividades farmacológicas e biológicas
(CATALFAMO, 1982; REDDY et al, 2002). Entretanto, outros estudos relatam que
tais alcalóides possuem uma significativa atividade hepatotóxica (KUGELMAN et al,
1976; OHNUMA et al, 1982) .
Também foram encontrados nas folhas e inflorescências das espécies de H.
indicum e H. angiospermum as aminas: putrescina, espermidina e espermina. Sendo
que os teores dessas aminas diminuem com a idade do vegetal (BIRECKA et al,
1984). Além dessas, a homospermidina foi identificada no eixo da inflorescência de
folhas jovens de H. indicum. Comprovando que os tecidos jovens exibiram níveis
elevados de putrescina e alcaloídes pirrolizidínicos (BIRECKA et al, 1984).
Os alcalóides pirrolizidínicos são derivados do acetato e tem origem
biossiténtica pelo ciclo do ácido cítrico e precursor biogenético o aminoácido L-
ornitina. Este alcalóide é formado por duas moléculas do aminoácido L-ornitina, a
qual originará a estrutura do anel pirrolizídinico (Figura 2). A detecção de
homospermidina nas plantas apóia a teoria de que o agrupamento pirrolizidínico é
obtido a partir de duas moléculas de putrescina com homospermidina como
intermediário da reação.
Os metabólitos secundários, principalmente os alcalóides e taninos, têm sidos
isolados de uma enorme variedade de plantas, especialmente dos gêneros
Revisão de Literatura
29
pertencente à família Boraginaceae. E podem estar relacionados a uma possível
atividade antimicrobiana desta família (BIRECKA et al, 1980). Estudos
demonstraram que já foram isolados três alcalóides pirrolizidínicos de todo vegetal:
acetillasiocarpina, europina (Figura 2B), heliosupina (Figura 2D) (SINGH et al, 2005).
N
O
OH
O
H
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
OH
N
H
OH
O
O
CH
3
OH
CH
3
O
CH
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CH
3
N
OH
H
O
O
OH
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OH
O
H
O
CH
3
OH
CH
3
CH
3
OH
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Figura 2.
Alcalóides isolados da espécie
H. indicum
L. (A) heliotrina; (B) europina; (C) licopsamina;
(D) heliosurpina; (E) helindicina; (F) indicina.
Revisão de Literatura
30
Um novo alcalóide denominado helindicina (Figura 2E) e o já descrito
licopsamina (Figura 2C) foram isolados das raízes de H. indicum L. O alcalóide
helindicina representa o primeiro relato de um alcalóide contendo um anel lactônico
no gênero Heliotropium, o qual demonstrou uma moderada atividade antioxidante
(SOUZA, et al, 2005). O alcalóide heliotrina (Figura 2A) foi isolado das sementes de
H. indicum L., e é responsável por uma possível atividade bloqueadora ganglionar.
Porém, estudos realizando testes in vitro e in vivo não demonstraram possuir
atividade no sistema nervoso central ou propriedade bloqueadora neuromuscular
(PANDEY et al, 1982).
Singh e col. (2002), utilizando a espécie Heliotropium subulatum, mostram
que os alcalóides heliotrina e retronecina, na dose de 5 µg/kg/dia, apresentaram
atividade inibitória de 41,7% e 38,6% contra Sarcoma 180, respectivamente. O
extrato hexânico na concentração de 3 µg/mL e a heliotrina na concentração de 10
µg/mL e 5 µg/mL revelaram citotoxicidade seletiva contra células de hamster chinês
V79. Já o extrato bruto etanólico e o extrato bruto hexânico mostraram atividade
antiviral para coxsackievírus, poliovírus e vírus do sarampo nas concentrações de
100 µg/mL e 500 µg/mL. Enquanto a heliotrina apresentou atividade contra
poliomielite e estomatite vesicular na concentração de 10 µg/mL.
Ensaios utilizando o extrato metanólico de H. indicum L para pesquisar
componentes biologicamente ativos foram realizados e demonstraram significativa
atividade antitumoral diante de carcinoma de Ehrlich e sarcoma em camundongos.
Sendo o principal ativo isolado: N-oxido do alcalóide indicina (Figura 2F) o
responsável pela atividade biológica referida deste vegetal (KUGELMAN et al, 1976;
DUTTA et al., 1987). Além dessas propriedades, também é atribuído aos alcalóides
as propriedade analgésica, anti-espasmódica e bactericida (OKWU, 2004).
A espécie em estudo, além de apresentar alcalóides pirrolizidínicos, também
apresenta outros componentes em menor quantidade como flavonóides e
compostos derivados geranil aromáticos (SOUZA et al, 2005). Uma nova isoflavona
glicosilada denominada heliosídeo, juntamente com 7- hidroxiflavanona e
naringerina 5-Me também foram isolados de todo vegetal (SINGH et al, 2003). A
estrutura de heliosídeo foi estabelecida como genisteína 7-O-{α-L-ramnosil-(1 2)-
[
β-D-glucosil-(1 3)]- β-D-glucosideo} (PANDEY et al, 2007).
Revisão de Literatura
31
Os flavonóides são constituintes químicos naturais das plantas que possuem
propriedades antialérgicas, anti-inflamatória, antiviral, anti-proliferativa e anti-
carcinogênica, assim como exercem efeito no metabolismo dos mamíferos
(MIDDLETON e KANDASWAMI, 1993). Assim, é atribuído aos flavonóides a
capacidade de proteção contra radicais livres, responsáveis por dificultar a
agregação plaquetária e de atuar contra o desenvolvimento de úlceras e
hepatotoxinas (FARQUHAR, 1996).
Estudos a partir do extrato etanólico de H. indicum L. confirmaram a presença
de polifenóis e taninos (CASTILLO, 2004). Dois novos dihidroxi-esteróis e um
triterpenóide foram isolados a partir das folhas da espécie estudada, e foram
caracterizados como 14α-metil-5α-colesta-9,24-dieno-3β,7α-diol; e 14α-Me-24-
metileno-5α-colesta-9,24-dieno-3α,7α-diol e ácido acácico lactona (SRINIVAS et al,
2002).
Andhiwal e col. (1985) trabalharam com extrato de éter de petróleo de H.
indicum (Boraginaceae) e obtiveram nas frações ésteres (C34-C58) composta
principalmente de ésteres: n-hexacosanol e esteróis (sitosterol 58.4%, estigmasterol
31.42%, chalinasterol 1.65% e campesterol 8.34%). Com isso, verificaram que o
extrato inibiu em 40% a fertilidade na dose de 500 mg/Kg quando testadas em ratas
albinas, enquanto que o extrato aquoso desta espécie não apresentou nenhuma
atividade anticonceptiva.
Reddy e col. (2002) estudaram a eficiência do extrato etanólico de H. indicum
L. no processo de cicatrização de lesões teciduais em ratos. A atividade de
cicatrização foi estudada usando excisão e incisão de ferida em modelos de ratos
utilizando o extrato para tratamento tópico. Com isso, foi possível verificar que o
extrato de H. indicum apresentou uma melhor atividade na fase de remodelação da
cicatrização, com aumento na porcentagem de cicatrização da ferida e conclusão de
cicatrização em até 14 dias, indicando uma rápida epitelização e formação de
colágeno no local lesado.
Machan e col. (2006) isolaram por hidrodestilação um óleo volátil marron claro
das partes áreas de H. indicum. A identificação do óleo por cromatografia gasosa
(GC-FID) e cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massa (GC-MS)
identificou a composição do óleo: fitol (49,1%), 1-dodecanol (6,4%) e -linalol
(3,0%). E ainda, este óleo mostrou uma significativa atividade antimicrobiana contra
Revisão de Literatura
32
Mycobacterium tuberculosis H37Ra com uma concentração inibitória mínima de 20,8
µg/ml.
Em outro trabalho utilizando o extrato bruto hexânico da parte aérea de H.
indicum obtiveram dezesseis ácidos graxos livres: ácido 9,12-octadecadienóico
(39,7%), ácido 9-octadecenóico (32,4%), ácido hexadecanóico (14,2%) e ácido
octadecanóico (5,1%), como os principais constituintes. E o extrato bruto hexânico
mostrou uma moderada atividade antimicrobiana (CIM de 100 µg/mL) contra
Mycobacterium tuberculosis H37Ra (MACHAN et al, 2007).
2.3.6 Toxicidade da espécie H. indicum L.
Muitas plantas contêm substâncias capazes de exercer ação tóxica contra
organismos vivos. Segundo algumas teorias, essas substâncias seriam formadas
com a função de defender a espécie contra seus predadores. Por isso, não é de
surpreender que muitas delas acumulem substâncias de elevada toxicidade
(SIMÕES et al, 2001).
A espécie H. indicum L. possui alcalóide pirrolizidínicos (AP), estes constituem
um amplo grupo de alcalóides contendo o núcleo pirrolizidínico em toda sua
estrutura. Os APs representam uma grande classe de produtos naturais e mostram-
se os responsáveis por uma atividade hepatotóxica e carcinogênica (CHEEKE,
1988), em alguns casos podem levar a uma atividade pneumotóxica e até
neurotóxica (COOPER e HUXTABLE, 1999). Os alcalóides pirrolizidínicos são
metabolizados no fígado pelo sistema citocromo P-450 e convertidos em um
intermediário reativo dehidroalcalóide, que podem produzir hepatotoxicidade
(COOPER e HUXTABLE, 1999; WANG et al, 2007).
Mais de 350 alcalóides pirrolizidínicos foram identificados em mais de 6.000
espécies das famílias Boraginaceae, Asteraceae e Leguminosae. Cerca da metade
dos alcalóides pirrolizidínicos identificados são tóxicos e vários têm sido
demonstrado que são causadores de lesões hepáticas e cancerígenos para os
roedores (STEGELMEIER e EDGAR, 1999; CREWS e KRSKA, 2008). Essas
espécies têm distribuição mundial e estes alcalóides são responsáveis por afetar a
Revisão de Literatura
33
pecuária, animais selvagens e até humanos. A intoxicação de humanos ocorre mais
freqüentemente e é resultado da contaminação dos alimentos ou quando essas
espécies vegetais são usadas para fins medicinais (STEGELMEIER e EDGAR,
1999).
Foi relatado um caso de enorme mortalidade de eqüinos que ocorreu
provavelmente devido à intoxicação por alcalóide pirrolizidínicos de H. indicum L. Por
mais de 4 anos, mais de 75% de uma população de cerca de 110 cavalos em uma
fazenda na Costa Rica morreu apresentando sintomas neurológicos, com
manifestações clínicas aguda e crônica, ambos com um desfecho fatal (VAN
WEEREN et al, 1999).
As plantas que contêm os alcalóides pirrolizidínicos estão disseminadas pelo
mundo e são em grande parte responsáveis pela intoxicação de animais e seres
humanos, entre elas as duas espécies da família Boraginaceae que mais causam
danos hepáticos são: Echium plantaguineum e Heliotropium europeaum. Outro
membro importante da família Boraginaceae é o confrei (Symphytum officinale), uma
planta comumente cultivada como forragem e uma erva medicinal. O confrei contém
pelo menos oito AP hepatotóxicos (CULVENOR et al., 1980), alguns dos quais são
conhecidas como cancerígenos. Hirono e col. (1978) demonstraram que as folhas e
raízes de confrei são cancerígenas para ratos. Por isso, atualmente o Ministério da
Saúde proibiu o uso pela via oral do confrei, devido à presença de alcalóides
pirrolizidínicos.
2.4 Tinturas
Não se sabe ao certo quando o uso de tinturas extraídas de vegetais, animais
ou minerais começou a ser utilizada como auxiliar no tratamento de doenças. Foi de
Teofrasto Paracelso (1493-1541), médico, antropólogo e teólogo da Europa
medieval, a descrição e produção de tinturas para fins terapêuticos, descrevendo a
formulação de diversas substâncias, dotadas de indiscutível valor farmacológico. A
primeira farmacopéia a descrever as tinturas foi o Dispensatorium Valerii Cordi
Revisão de Literatura
34
(1666), que indicava o modo de obtenção de algumas dessas preparações, como a
tintura da casca de laranja (PRISTA et al, 1990).
A Farmacopéia Brasileira IV (1988) define as tinturas como sendo
preparações alcoólicas ou hidroalcoólicas resultantes da extração de drogas
vegetais, minerais e animais no estado seco ou da diluição dos respectivos extratos.
Entretanto, é comum dar-se a mesma designação às soluções extrativas preparadas
com outros solventes, que não o álcool, como o éter, clorofórmio, acetona, etc. As
tinturas são classificadas em simples e compostas, conforme preparadas com uma
ou mais matérias-primas, exceto quando se encontra diferentemente, 10 mL de
tintura simples correspondem a 1g da droga seca. O nome tintura provém de sua
apresentação, pois as soluções extrativas contêm princípios ativos dotados de cor e
vários pigmentos (ex: clorofila, flavonas, quinonas, etc.). Na preparação de uma
tintura deve-se observar o estado do fármaco, a escolha do álcool de graduação e o
método de extração empregado. Habitualmente, utilizam-se as drogas vegetais para
preparar tinturas, raras vezes se escolhe o uso de drogas animais ou minerais. Entre
suas vantagens destaca-se a grande riqueza em princípios ativos, boa conservação
face às invasões microbianas e a facilidade de medição posológica que apresentam
(PRISTA et al, 1996).
As drogas vegetais podem ter grande atividade ou ser pouco ativas, sendo
classificada, portanto como droga heróica e droga não heróica, respectivamente.
Dessa forma, utilizam-se três processos para obtenção das tinturas: maceração,
percolação e dissolução do extrato seco. A maceração é o processo correntemente
utilizado para preparar tinturas de drogas pouco ativas. Obtida as substâncias
através da maceração, a solução alcoólica é filtrada. Dessa forma, quanto ao
método de extração, a maceração é o processo utilizado para preparar tinturas de
drogas não heróicas. (FARMACOPEIA BRASILEIRA II, 1959; PRISTA et al, 1996;
GENARO, 2004). A percolação consiste em fazer passar o solvente através da
camada da droga, até o seu completo esgotamento. A percolação simples
compreende a extração exaustiva da droga com solvente sempre renovado. Em
pequena escala, a percolação é conduzida em extratores, denominados
percoladores, de corpo cilíndrico ou cônico, provido de torneira na parte inferior, para
regular o fluxo do solvente (SANTOS, 2000).
Revisão de Literatura
35
2.5 Extrato liofilizado
A liofilização é um processo de estabilização, no qual uma substância é
previamente congelada e então a quantidade de solvente é reduzida, primeiro por
sublimação e posteriormente por dessecação para valores tais que impeçam
atividade biológica e reações químicas. A liofilização freqüentemente é o método de
escolha para a desidratação de fármacos, vacinas, produtos de biotecnologia e
diagnostico, devido às vantagens oferecidas em termos de estabilidade térmica e
retenção de atividades durante o processo e durante o subseqüente armazenamento
do produto liofilizado (AYROSA, 2004; AYROSA et al, 2007).
O processo de secagem por liofilização é um método controlável de desidratar
materiais lábeis, através da dessecação sob pressão reduzida que apresenta várias
vantagens quando comparado a outros processos de desidratação. A baixa
temperatura, mantida durante todo o processo, evita qualquer alteração química das
substâncias sensíveis ao calor e umidade. Por este motivo, um produto seco por
esta técnica mantém inalterável a sua composição química original, a sua atividade
terapêutica e outras propriedades características. Se for acondicionado
convenientemente, poderá manter-se sem alteração por um longo período. Os
produtos liofilizados apresentam facilidade na reconstituição devido à estrutura
porosa deixada pela saída da água. Isto garante a reprodução fiel do produto original
uma vez em contato com a fase líquida primitiva. A liofilização reduz a tendência que
certos produtos têm para aglomerarem quando dessecados por outras técnicas,
além de reduzir também a perda de constituintes voláteis (AYROSA, 2004).
2.6 Estudos de pré-formulação
O desenvolvimento de um novo medicamento requer estudos de pré-
formulação. Esta fase de desenvolvimento é caracterizada pela avaliação das
propriedades físico-químicas do fármaco isolado ou associado a diversos adjuvantes
(ARAÚJO, 2003). Cada fármaco possui características químicas e físicas
importantes que precisam ser estudadas antes da sua incorporação em um
veículo/excipiente farmacêutico. Entre esses parâmetros pode-se citar a
solubilidade, coeficiente de partição, velocidade de dissolução, forma física de
Revisão de Literatura
36
apresentação e estabilidade (ANSEL et al, 2000), podem ser avaliados através de
metodologias como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), espectroscopia
na região do infravermelho (IV) e análises térmicas (TGA, DTA e DSC) (VILA JATO,
2001; SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009).
O fármaco candidato ao medicamento, seja qual for à via de administração,
deve ser solúvel em alguma fração aquosa, ser absorvido e apresentar resposta
terapêutica. Muitos dos componentes do extrato aquoso ou hidroalcoólico de plantas
apresentam boa solubilidade em água e fácil incorporação no veículo farmacêutico.
Ao se analisar extratos vegetais o estudo de pré-formulação torna-se mais difícil,
pois os marcadores disponíveis podem sofrem alterações em função do pH,
polaridade de solventes, temperatura e interações entre excipientes ou veículos
utilizados. Portanto, ao formular produtos, contendo ativos naturais, é fundamental a
identificação padronizada de marcadores ou o desenvolvimento de métodos que
permitam a quantificação de grupos químicos purificados antes, durante e após o
processo de obtenção (SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES, 2008).
Com os resultados dos estudos de pré-formulação elabora-se um informe que
definirá a viabilidade da forma farmacêutica proposta e a metodologia a ser seguida
no desenvolvimento na fase de formulação e elaboração (VILA JATO, 2001).
2.7 Técnicas analíticas utilizadas no desenvolvimento, avaliação e controle de
qualidade de fitoterápicos
2.7.1 Espectroscopia na região do infravermelho (IV)
Define-se espectroscopia na região do IV como a medida da absorção, por
parte de compostos químicos analisados, de uma radiação eletromagnética em que
o comprimento de onda se situa na faixa de 10
–4
a 10
–2
cm, sendo este espectro
único para cada substância com exceção aos isômeros ópticos que em solução
apresentam espectros idênticos (KOROLKOVAS, 1984).
A espectroscopia no IV é um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a
região do infravermelho do espectro eletromagnético. Como as demais técnicas
espectroscópicas, esta pode ser usada para identificar um composto ou investigar a
Revisão de Literatura
37
composição de uma amostra. A espectroscopia no IV se baseia no fato de que as
ligações químicas das substâncias possuem freqüências de vibração específicas, as
quais correspondem a níveis de energia da molécula (chamados nesse caso de
níveis vibracionais). Tais freqüências dependem da forma da superfície de energia
potencial da molécula, da geometria molecular, das massas dos átomos e
eventualmente do acoplamento vibrônico. Portanto, se a molécula receber radiação
eletromagnética com 'exatamente' a mesma energia de uma dessas vibrações,
então a luz será absorvida desde que sejam atendidos a determinadas condições.
Para que uma vibração apareça no espectro IV, a molécula precisa sofrer uma
variação no seu momento dipolar durante essa vibração (SILVERSTEIN et al, 2006).
Logo, o espectro na região do IV de uma substância orgânica corresponde ao
conjunto de bandas de absorção apresentadas pela amostra submetida à radiação
infravermelha e estas bandas correspondem às mudanças na energia vibracional
dos compostos orgânicos. A energia absorvida da radiação IV provoca alterações
transitórias nas ligações interatômicas, que podem sofrer estiramentos ou
deformações nos ângulos de ligação. As frequências em que ocorrem as vibrações
dependem da natureza das ligações em particular, mas são também afetadas pela
vizinhança química e pela molécula como um todo. A presença de insaturações
(conjugadas ou não), sistemas aromáticos e grupos funcionais específicos pode ser
verificada através da presença de bandas características que têm grande
importância na análise estrutural. Se o espectro IV da substância desconhecida é
superponível com o espectro IV de uma amostra autêntica conhecida, então isso
pode servir como uma prova de identidade, a qual é muitas vezes preconizada para
ideniticação de fármacos pelas farmacopéias (FALKENBERG et al, 2001).
A Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) é
uma técnica de análise para colher o espectro infravermelho e acumular maior
quantidade de dados. Pois, ao invés de se coletar os dados variando-se a freqüência
da luz infravermelha a cada comprimento de onda, a luz IV (com todos os
comprimentos de onda da faixa usada) é guiada através de um interferômetro.
Depois de passar pela amostra o sinal medido é o interferograma. Realizando-se
uma transformada de Fourier no sinal resulta-se em um espectro idêntico ao da
espectroscopia IV convencional (dispersiva). Esta técnica espectroscópica
complementar pode ser usada para identificar um composto ou investigar a
composição de uma amostra. Atualmente a espectroscopia na região do
Revisão de Literatura
38
infravermelho é largamente usada tanto na indústria quanto na pesquisa científica
pois ela é uma técnica rápida e confiável para medidas, controle de qualidade e
análises dinâmicas (SILVERSTEIN et al, 2006).
Os dados de análise em infravermelho além de fornecer características
estruturais do material ativo, também auxiliam na seleção de componentes da
formulação. Dependendo da natureza química da substância em estudo, há várias
opções de instrumentos analíticos que podem auxiliar no estudo de pré-formulação e
doseamento como: cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa
(CG), ressonância magnética nuclear (RMN) de
1
H e
13
C, análise térmica, etc.
(SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009). Com isso, a espectroscopia
na região do IV auxilia nos estudos de pré-formulação, na qual as características
químicas de cada excipiente podem ser avaliadas isoladamente e/ou misturando
com o componente da formulação (ALVES, 2008; NUNES, 2009).
2.7.2 Análise térmica
Análise Térmica é um termo que abrange um grupo de técnicas nas quais
uma propriedade física ou química de uma substância, ou de seus produtos de
reação, é monitorada em função do tempo ou temperatura. Enquanto a temperatura
da amostra, sob uma atmosfera específica, é submetida a uma programação
controlada, a amostra está sujeita a um esquema de temperatura que consiste de
uma série de segmentos pré-selecionados, nos quais esta (amostra) é aquecida ou
resfriada a uma razão constante ou mantida a temperatura constante
(WENDTLENDT, 1986; GIOLITO e IONASHIRO, 1988).
As técnicas termoanalíticas adquiriram importância crescente em todas as
áreas de conhecimento na química básica e aplicada. A utilização dessa
metodologia, dotada de grande potencialidade, foi favorecida pela disponibilidade de
instrumentos controlados por microprocessadores, capazes de fornecer informações
quanto ao comportamento térmico dos materiais de forma precisa e num tempo
relativamente curto. Tais métodos estão sendo largamente utilizados no controle de
qualidade de drogas naturais ou sintéticas, pois fornecem, com rapidez, dados sobre
a estabilidade do material analisado, em relação ao seu comportamento térmico.
Além de que dados preliminares sobre o material analisado levam a pensar que se
Revisão de Literatura
39
conhecendo o comportamento térmico do componente majoritário de uma planta,
pode-se identificar a autenticidade de um extrato bruto (GIOLITO e IONASHIRO,
1988).
A análise termogravimétrica para estudo de pré-formulação ou
compatibilidade fármaco-excipiente vem ganhando importância crescente no Brasil,
pois vários trabalhos têm sidos publicados nesta área. Destacam-se, entre outros,
aplicação da termogravimetria (TG) no controle de qualidade da milona
(Cissampelos sympodialis Eichi.) Minispermaceae (ARAGÃO et al, 2002); estudo de
compatibilidade de zidovidina com excipientes (ARAÚJO, 2003); estudo
termoanalítico de comprimidos revestidos contendo captopril através de
termogravimetria e calorimetria exploratória diferencial (BAZZO e SILVA, 2005);
estudo termoanalítico (TG, DTG e DSC) dos cafés in natura e processados
(SCHNITZLER et al, 2005); determinação dos teores de umidade e cinzas de
amostras comerciais de guaraná utilizando métodos convencionais e análise térmica
(ARAÚJO et al, 2006); avaliação físico-qímica do extrato fluido e seco por
nebulização de Symphytum officinale L. (SILVA JÚNIOR et al, 2006); estudo
termoanalítico e de compatibilidade fármaco-excipiente de rifampicina e alguns
medicamentos utilizados na terapêutica da tuberculose (ALVES, 2007); estudo de
caracterização física, química, físico-química e de pré-formulação de Arrabidaea
chica (H&B) Verlot (ALVES, 2008); caracterização termoanalítica e estudo do perfil
de dissolução de comprimidos contendo metronidazol (RODRIGUES et al, 2008),
caracterização química e físico-química e estudos preliminares de planejamento da
formulação fitoterápica semi-sólida contendo tintura de Calêndula officinalis L.
(NUNES, 2009).
2.7.2.1 Termogravimetria (TG)
TG é a técnica na qual a mudança da massa de uma substância é medida em
função da temperatura enquanto esta é submetida a uma programação controlada.
Esta técnica determina as perdas ou ganhos de massa de uma substância em
função da temperatura ou do tempo (GIOLITO e IONASHIRO, 1988). Os
experimentos para avaliar as variações de massa de um material em função da
temperatura são executados através da termobalança, permitindo o trabalho sob as
Revisão de Literatura
40
mais variadas condições experimentais. As curvas geradas possibilitam a obtenção
de informações quanto à estabilidade térmica da amostra, composição e estabilidade
dos compostos intermediários e do produto final (ARAÚJO, 2003; ALVES, 2007).
Nas curvas termogravimetricas convencional ou dinâmica são registradas as
massa da amostra (m) em função da temperatura (T) ou tempo (t). Nessas curvas,
os degraus em relação ao eixo das ordenadas correspondem às variações de massa
sofrida pela amostra e permitem a obtenção de dados que podem ser utilizados com
finalidades quantitativas.
2.7.2.2 Análise térmica diferencial (DTA)
A DTA é a técnica pela qual a diferença de temperatura (∆T) entre a
substância e o material de referência (termicamente estável) é medida em função da
temperatura, enquanto ambos são submetidos a uma programação controlada de
temperatura. A temperatura é medida por termopares conectados aos suportes
metálicos das cápsulas de amostra e do material de referência, ambos contidos no
mesmo forno. As variações de temperatura na amostra são devidas às transições
entálpicas ou reações endotérmicas ou exotérmicas. As curvas DTA representam os
registros de ∆T em função da temperatura (T) ou do tempo (t), de modo que os
eventos são apresentados na forma de picos. Os picos ascendentes caracterizam os
eventos exotérmicos e os descendentes os endotérmicos (WENDLANDT, 1986;
MACHADO e MATOS, 2004).
2.7.2.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
DSC é a técnica na qual se mede a diferença de energia fornecida à
substância e a um material de referência, termicamente inerte em função da
temperatura, enquanto a substância e a referência são submetidas a uma
programação controlada de temperatura (GIOLITO e IONASHIRO, 1988).
De acordo com o método de medida utilizado, há duas modalidades:
calorimetria exploratória diferencial com compensação de potência e a calorimetria
exploratória diferencial com fluxo de calor. Na DSC com compensação de potência,
Revisão de Literatura
41
a amostra e a referência são aquecidas em compartimentos distintos, assim é
possível mantê-las em condições isotérmicas. Neste caso, a amostra sofre variações
de temperatura devido a eventos endotérmicos ou exotérmico em função do
aquecimento ou resfriamento, ocorre uma modificação na potência de entrada do
forno correspondente, proporcionando a anulação desta diferença (WENDTLENDT,
1986).
Na DSC com fluxo de calor, a amostra e a referência são colocadas em
cadinhos idênticos, localizados sobre um disco termoelétrico e aquecidos por uma
única fonte de calor. Assim, o calor é transferido através do disco para amostra e
referência, sendo que o fluxo de calor diferencial entre ambas é monitorado por
termopares localizados abaixo dos cadinhos. Dessa forma, a diferença no fluxo de
calor da amostra e da referência é diretamente proporcional à diferença de potência
das junções dos termopares (WENDTLENDT, 1986).
2.8 Estrutura e funções da pele
A pele é o maior e mais complexo órgão do corpo humano segundo sua
histologia e contém pelo menos cinco diferentes tipos de células que contribuem
para sua organização estrutural, e demais tipos celulares, provenientes dos sistemas
circulatório e imunológico (MENON, 2002; HADGRAFT, 2004). A função primordial
da pele é a proteção contra processos de desidratação e micro-organismos
agressores. Desta forma, ela se faz mais ou menos permeável às substâncias
químicas e permite a passagem de medicamentos em certas condições, podendo
ser considerada como uma interface terapêutica. E mesmo que a pele represente
uma barreira física à penetração de substâncias, existem várias formas
farmacêuticas de uso tópico que sofrem absorção, inclusive as de uso sistêmico
(LIRA, 2003).
A estrutura geral da pele é formada por um tecido estratificado disposto em
quatro planos ou camadas, e dentre eles do plano interno para o plano externo: a
derme reticular e a superficial ou papilar, a epiderme viável e o estrato córneo (EC).
Cada plano ou camada possui características fisiológicas distintas e funções
biológicas próprias (BAUMANN, 2002). Abamba (1993), Foldvari (2000) e Baumann
Revisão de Literatura
42
(2002) acrescentaram um quinto plano ou camada, o tecido adiposo, subcutâneo ou
hipoderme que está situado abaixo da derme reticular.
A epiderme é a camada externa da pele, é derivada da ectoderme e está em
contato direto com o meio ambiente. É avascular, possui em sua constituição o
epitélio estratificado pavimentoso, terminações nervosas livres e algumas células
migratórias provenientes da derme (BENY, 2000; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
A derme é o tecido conjuntivo em que se apóia a epiderme e une a pele ao tecido
celular subcutâneo ou hipoderme (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). É
caracterizada como acelular, mas é rica em vasos sanguíneos, vasos linfáticos e
terminações nervosas (FOLDVARI, 2000). Já a hipoderme funciona como um
amortecedor mecânico e barreira térmica, que sintetiza e estoca rapidamente
substâncias energéticas prontamente disponíveis (AUTON, 2005). O estrato córneo
é a barreira que limita a velocidade e restringe os movimentos de entrada e saída de
substâncias (LACHMAN, 2001).
Na pele também são observadas estruturas anexas como glândulas sebáceas
e sudoríparas (écrinas e apócrinas), folículos pilosos e unhas (WILKINSON e
MOORE, 1990; BARRY, 2002).
A função essencial da pele é a proteção do organismo frente as diversidades
do meio externo, como agentes físicos, químicos e biológicos, poeira e gases, micro-
organismos patogênicos e radiações. A pele é responsável pela termorregulação, ou
seja, regulação da perda e ganho de calor; atua como órgão sensorial, pois exerce a
função neuro-sensorial através do tato; tem a função de percepção da temperatura e
da dor; apresenta funções endócrinas, como: função de ossificação, pela síntese da
vitamina D; exerce influência na reprodução humana e perpetuação da espécie (pela
síntese de feromônios); por meio de sinais visuais ou expressões emocionais, é um
órgão que permite evidenciar a comunição não-verbal (ABAMBA, 1993; MENON,
2002).
2.8.1 Vias de permeação percutânea pelo estrato córneo
A permeação percutânea de fármacos pelo estrato córneo (EC) até as
camadas mais profundas da pele ocorre por difusão através de três vias diferentes, a
seguir discriminadas:
Revisão de Literatura
43
• Via transcelular por difusão através das células – (através dos
corneócitos e matriz lipídica intercelular);
• Via intercelular por difusão entre as células – (por entre os corneócitos
e pela matriz lipídica);
• Via transanexal por difusão através dos folículos pilosos, glândulas
sudoríparas e sebáceas e anexos pilosebáceos (ANSEL et al, 2000).
Se a pele estiver intacta, a principal via de penetração dos fármacos são as
camadas epidérmicas e não os folículos pilosos ou ductos das glândulas, pois sua
área superficial é bastante pequena em comparação com a da pele que não contém
nenhum desses elementos anatômicos. Portanto, a absorção percutânea dos
medicamentos resulta da penetração direta do fármaco através do estrato córneo,
passando aos tecidos epidérmicos mais profundo e atingindo a derme que é
vascularizada e onde o fármaco torna-se disponível para absorção (ANSEL et al,
2000).
O termo penetração apresenta um conceito fundamentado na passagem
dos(s) princípio(s) ativo(s) somente através do EC, enquanto que permeação está
relacionada com a passagem dos(s) princípio(s) ativo(s) através da epiderme
atingindo a epiderme viável ou a derme. Já o termo absorção faz referência a
passagem dos(s) princípio(s) ativo(s) para corrente saguínea (RIEGER, 1993).
A eficácia de produtos farmacêuticos ou cosméticos apresentando em sua
composição princípios ativos funcionais é dependente da penetração limitada deste
na pele. Os métodos existentes que promovem aumento deste processo se
fundamentam: no emprego de promotores de penetraçaõ; no estudo profundo das
características químicas e fisico-químicas das substâcias ativas e a possibilidade do
emprego de seus derivados quando estes forem desfavoráveis; na interação das
substâncias ativas e componentes da formulação e material de acondicionamento;
na utilização de sistemas veiculados de liberação, como microemulsão,
ciclodextrinas, nanossomas, lipossomas e a ação de agentes atuantes como
promotores físicos de penetração, como iontoforese, sonoforese e eletroporação
(NAIK et al, 2000; MOSER et al, 2001).
Revisão de Literatura
44
2.9. Formulações para uso tópico
Os fármacos que têm administração tópica (aplicados na pele) tanto podem
agir no local de aplicação, como para produzir efeitos sistêmicos. Entretanto, na
maioria dos casos, o que se pretende com as preparações farmacêuticas aplicadas
à pele é que tenham ação local e, para tanto, são formuladas para ter contato local
prolongado com absorção mínima (ANSEL et al, 2000).
Os fármacos aplicados à pele para ação local são antissépticos, antifúngicos,
anti-inflamatórios, anestésicos locais, emolientes e protetores contra as condições
ambientais, como o sol, vento, insetos e irritantes químicos. E para essa finalidade,
são administrados como formulações semi-sólidas como: as pomadas, géis, cremes,
pastas; como pós secos, aerossóis ou até preparações líquidas, como as soluções e
loções (ANSEL et al, 2000).
2.9.1 Gel
Géis são sistemas semi-sólidos que consistem na dispersão de moléculas
grandes ou pequenas em um veículo líquido que adquire consistência semelhante à
gelatina pela ação de uma substância a ele adicionada, como carboximetilcelulose
(ANSEL et al, 2000).
Existem duas classes de géis: géis hidrofóbicos, nas quais suas bases
(oleogéis) geralmente consistem em parafina líquida com polietileno ou óleos
gordurosos gelificados com sílica coloidal, sabões de alumínio ou zinco e géis
hidrofílicos (hidrossolúveis, hidrogéis), cujas bases geralmente consistem em água,
glicerol ou propilenoglicol gelificado com agentes gelificantes adequados como
tragacanto, amido, celulose, derivados, polímeros de carboxivinil e silicatos de
magnésio-alumínio (GENNARO, 2004).
Os géis hidrossolúveis têm sido muito usados em produtos cosméticos e
como base dermatológica, pois apresentam fácil espalhamento, não são gordurosos
e podem veicular princípios ativos hidrossolúveis. Geralmente, as substâncias
formadoras de géis são polímeros, que quando dispersos em meio aquoso,
assumem conformação doadora de viscosidade à preparação. Polímeros são
substâncias de alto peso molecular, também chamados de macromoléculas
(CORRÊA et al, 2005).
Revisão de Literatura
45
O tipo de polímero empregado na formulação do gel pode influenciar o
comportamento reológico desta e, portanto, pode influenciar a estabilidade física do
produto, assim como, o seu comportamento sobre a pele (liberação de ativos pelo
veículo e formação de filme na pele) (CORRÊA et al, 2005).
Apesar do estudo científico das macromoléculas ter se iniciado há pouco
tempo (cerca de 50 anos), seu desenvolvimento tem sido vertiginoso. Vários
polímeros vêm sendo usados nas formulações de géis de aplicação cosméticas e/ou
farmacêuticas, pois apresentam fácil espalhamento, não são gordurosos nem
comedogênicos e podem transportar princípios ativos hidrossolúveis, lipossolúveis,
vetores carreadores de fármacos como lipossomas e nanopartículas. São mais
indicados para pessoas que possuem pele oleosa e mista (FLORENCE e
ATTWOOD, 2003; CORRÊA et al, 2005).
Existe grande variedade de matérias-primas disponíveis para a preparação de
géis e a seleção adequada para o desenvolvimento destas formulações, baseia-se
nos requisitos necessários para a estabilidade, liberação e eficácia do ativo que
eventualmente será incorporado na preparação.
Segundo Aulton (2005) e Lopes e col. (2005), os numerosos agentes
gelificantes podem ser divididos em três classes: derivados da celulose
(metilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose
sódica); polímeros não-celulósicos naturais ou semi-sintéticos (gomas, pectinas,
ágar, ácido algínico); polímeros do ácido acrílico (carbômeros – carbopol).
Partindo do pressuposto de que o fármaco não se liga ao polímero, tais géis
liberam bem o fármaco. Os poros permitem a difusão relativamente livre de
moléculas menores (AULTON, 2005). Gennaro (2004) também comenta que os géis
muitas vezes proporcionam uma liberação mais rápida da droga,
independentemente da solubilidade da droga em água, quando comparados com os
cremes e pomadas.
A formulação semi-sólida gel é muito utilizada, pois atua como transportadora
para medicamentos que são topicamente administrados por meio da pele, córnea,
tecido retal, mucosa nasal, vagina, tecido bucal, membrana uretral e revestimento
externo da orelha. Devido ao seu comportamento reológico, os semi-sólidos (creme,
pomada, pasta, gel) podem aderir à superfície de aplicação por períodos
suficientemente longos até serem removidos. Tal propriedade ajuda a prolongar a
liberação do medicamento no local de aplicação, apresenta facilidade de aplicação,
Revisão de Literatura
46
capacidade de liberação tópica de uma grande variedade de moléculas
medicamentosas (GUPTA e GARG, 2002).
2.9.2 Hidroxietilcelulose (Natrosol®250)
Este composto tem grupos hidroxetila ligado à cadeia de celulose e também
se encontra disponível em diferentes graus de viscosidade. Hidroxietilcelulose tem a
vantagem de ser solúvel tanto em água quente quanto na água fria, não formando
gel sob aquecimento (AULTON, 2005).
Entre os géis de natureza não iônica à base de celulose, o de maior interesse
para veiculação de ativos em dermatologia é o gel de hidroxietilcelulose (HEC), pois
é solúvel em água fria ou quente, tolera bem pH ácido e é indicado para
incorporação de ativos que levam a um abaixamento do pH final da formulação
(FERREIRA, 2000).
2.10 Estudo de estabilidade das formulações
Os estudos de estabilidade de produtos cosméticos e farmacêuticos procuram
fornecer informações que indiquem o grau de estabilidade relativa de um produto
nas condições diversas de exposição a que possa estar sujeito, até o encerramento
de seu prazo de validade. Geram subsídios para a orientação nos estudos de
desenvolvimento, como: escolha dos componentes da formulação e do material de
acondicionamento adequado; forma de apresentação; materiais de
acondicionamento e embalagens alternativas e a confirmação do prazo de validade
estimado (RIBEIRO et al, 1996).
Primeiramente são avaliadas as características organolépticas (aspecto, cor e
odor), o valor de pH e da viscosidade das formulações. Estes parâmetros são
estudados comparativamente, considerando-se as características iniciais do produto
e suas alterações ao longo do tempo (BABY, 2005).
Os estudos de estabilidade geram resultados que são avaliados
comparativamente exigindo que os ensaios sejam conduzidos em paralelo com um
produto de referência. Este pode ser um produto de mercado, uma formulação
Revisão de Literatura
47
recém preparada ou uma amostra armazenada em condições de alteração reduzida,
como refrigerador (5,0 ± 2,0 °C) ou temperatura ambiente ao abrigo de luz e
umidade (25 ± 2,0 °C) que conhecidamente preserve as características físicas,
químicas, microbiológicas e toxicológicas do produto (BRASIL, 2004).
Vários fatores influenciam a estabilidade das formulações, dentre eles os
extrínsecos, que envolvem condições externas às quais os produtos ficam expostos,
como: tempo, temperatura, luz, oxigênio, umidade, material de acondicionamento,
microorganismos e vibração; os intrínsecos que estão relacionados com a natureza
da formulação e a interação de seus componentes. Geram, principalmente,
incompatibilidades físicas e químicas que podem resultar em alterações nas
características organolépticas da formulação, separação de fases e redução do teor
da substância ativa (VELASCO-DE-PAOLA, 2001).
2.10.1 Avaliação preliminar da estabilidade
A avaliação preliminar da estabilidade envolve, comumente, número elevado
de formulações e testes que apresentam condições drásticas de temperatura, efeito
de gravidade e umidade, aplicadas às preparações, permitindo, portanto, selecionar
as de melhor desempenho quanto à estabilidade física e físico-química. A avaliação
preliminar da estabilidade permite que o formulador escolha, dentre as várias
fórmulas da etapa de desenvolvimento do produto e em concordância com os
critérios estabelecidos para a aceitação ou rejeição, qual ou quais estão
aparentemente estáveis (RIBEIRO et al, 1996; BRASIL, 2004).
As formulações são sujeitas às condições de estresse térmico, visando
acelerar o surgimento de possíveis sinais de instabilidade. Aquelas que
apresentarem modificações após o teste deverão ser rejeitadas pelo estudo ou
pesquisadas as possíveis modificações nos componentes das preparações para
melhoria da estabilidade. Aquelas que indicarem melhor desempenho deverão ser
submetidas ao teste de estabilidade acelerada.
2.10.2 Teste de estabilidade acelerada
O teste de estabilidade acelerada é orientativo na previsão da estabilidade do
produto em condições drásticas de armazenamento e de duração reduzida de
Revisão de Literatura
48
tempo. As formulações são submetidas ao armazenamento em situações de
temperatura e luminosidade extremas e são avaliadas após os ensaios,
selecionando-se as de melhor desempenho ao teste.
Os parâmetros avaliados envolvem possíveis alterações físicas e físico-
químicas, como: aspecto, cor, odor, valor de pH e viscosidade.
O material de acondicionamento possui papel relevante na estabilidade de
formulações cosméticas ou farmacêuticas, pois pode proteger o produto da
exposição à luz, da umidade e dos gases atmosféricos, mas não pode evitar o efeito
da variação da temperatura do ambiente onde é armazenada (BABY, 2005).
49
3. OBJETIVOS
Objetivos
50
3. Objetivos
3. Objetivos3. Objetivos
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Desenvolver e avaliar uma formulação fitoterápica semi-sólida (gel) para uso
tópico contendo tintura padronizada de Heliotropium indicum L. (Boraginaceae) com
atividade antimicrobiana.
3.2. Objetivos Específicos
• Caracterizar através de parâmetros físico, químico e físico-químico a droga
vegetal e a tintura de H. indicum L.
• Obter os perfis cromatográficos do extrato hidroalcoólico e frações da espécie
em estudo, utilizando cromatografia em camada delgada – CCD e
cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE – DAD;
• Caracterizar a tintura em função de marcadores internos com fins de controle
de qualidade;
• Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato bruto da espécie vegetal
investigada;
• Realizar estudos de planejamento da formulação fitoterápica semi-sólida
contendo a tintura de H. indicum L.
• Realizar estudos de formulação do extrato liofilizado de H. indicum L. com os
adjuvantes farmacêuticos empregados na formulação;
• Realizar estudos de estabilidade preliminar da formulação farmacêutica
fitoterápica;
• Analisar o comportamento reológico do gel fitoterápico;
51
4.MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
52
4 Material e Métodos
4 Material e Métodos4 Material e Métodos
4 Material e Métodos
4.1 Material
4.1.1 Matéria-prima vegetal
Material Vegetal: Heliotropium indicum L.
Família: Boraginaceae
Parte Utilizada: Folhas
4.1.2 Reagentes, soluções e substâncias utilizadas
Reativo de Pascová, reativo de Fehling A, reativo de Fehling B, HCl P.A,
H
2
SO
4
P.A, lugol, solução aquosa de ninhidrina a 1%, solução alcoólica de FeCl
3
a
1%, metanol P.A, raspas de magnésio, solução de HCl a 5%, reativo de
Bouchardat, reativo de Dragendorff, reativo de Mayer, solução de HCl 6N, H
2
O
2
concentrado a 30%, solução de NH
4
OH 6N, reativo de Kedde, solução aquosa de
vanilina a 1%, solução alcoólica de cloridrato de hidroxilamina a 10%, solução
metanólica de KOH a 10%, solução de HCl a 1 N, clorofórmio P.A, anidrido acético
P.A, reativo para azuleno, éter de petróleo, ácido trifluoracético, éter etílico, solução
de NaOH a 1N, tolueno, solução de NH
4
OH a 10%, solução tampão fosfato pH 4,0
e pH 7,0, Sulfato de sódio anidro, DMSO, acetonitrila P.A., solução HCl a 5%,
hidroxietilcelulose - Natrozol® 250 HHRP, propilenoglicol PA-ACS – Química
especializada Erich LDTA, metilparabeno – mapric.
4.1.3 Equipamentos
Estufa de circulação forçada de ar - Quimis® Aparelhos científicos LTDA,
modelo Q-314M222; moinho de facas tipo Willy; balança analítica Gehaka BH500;
mufla; agitador eletromagnético para peneiras – Bertel Indústria Metalúrgica LTDA;
evaporador rotativo de baixa pressão Fisatrom, modelo 802; analisador térmico
DTG-60, Shimadzu®, analisador térmico DSC-60, Shimadzu®, espectrofômetro de
infravermelho Thermo Electron Corporation modelo IR100 espectrometer;
potênciometro PHTEK modelo PHs-EB; liofilizador Thermo Savant
Material e Métodos
53
MicroModulyo/115 com bomba a vácuo acoplada LP200-Thermo Savant,
cromatógrafo líquido de alta eficiência Merck Hitachi LaChrom® D-7000 com
detector no ultravioleta e com arranjo de diodos, reômetro marca Rheotet, modelo 2
(tipo cilindro).
4.1.4 Cepas de micro-organismos utilizados:
Foram utilizadas as cepas de micro-organismos: Staphylococcus aureus
ATCC 29913; Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC
25853; Candida albicans ATCC 40175. As cepas de microorganismos foram
provenientes do Instituto Oswaldo Cruz – RJ.
4.2 Métodos
As análises foram realizadas nos laboratórios de Processamento de Material
Vegetal, Fitoquímica, Microbiologia, Controle de Qualidade Físico-Químico e
Farmacotécnica da Faculdade de Farmácia do Instituto de Ciências da Saúde, e no
Laboratório de Pesquisa e Análise de Combustível, Laboratório de Química-
Pesquisa do Instituto de Ciências Exatas e Naturais da Universidade Federal do
Pará.
4.2.1 Obtenção e identificação botânica do material vegetal
O material vegetal foi adquirido junto à Associação Ver-as-Ervas (Feira do
Ver-o-Peso), Belém – PA, Brasil. O material foi coletado no mês de maio de 2008,
às 18 horas, procedente do município de São Miguel do Guamá, localizado no
estado do Pará a 150 km da capital Belém, com latitude de 01º37'36" sul e
longitude de 47º29'00" oeste (IBGE, 2008). Houve o cuidado em separar uma
amostra das partes aéreas do vegetal (com folhas, flores e vagens) e
posteriormente a secagem, foi confeccionada a exsicata deste material (BARBOSA
et al, 2001). A exsicata (Figura 3) foi submetida à identificação botânica,
confirmando, assim, a espécie de estudo: Heliotropium indicum (L.) DC,
pertencente à família Boraginaceae, com número de registro no herbário do Museu
Material e Métodos
54
Paraense Emílio Goeldi: MG 145574. A identificação botânica foi realizada pela
Coordenação de Botânica do Museu Paraense Emílio Goeldi, sob cuidados
técnicos do Prof. Dr. Mário Augusto Gonçalves Jardim.
4.2.2 Processamento do material vegetal
A planta fresca foi higienizada mediante lavagem em água potável e corrente
para remoção de terra, insetos e outras impurezas. O material vegetal foi imerso
em uma solução alcoólica a 70% v/v, com a finalidade de remover micro-
organismos presentes e interromper o metabolismo do vegetal, evitando a
alteração dos compostos químicos originalmente presentes. Posteriormente o
Figura 3
. Exsicata da espécie
H
.
indicum
L.
(Boraginaceae) MG 145574.
Fonte: Arquivo Pessoal
Material e Métodos
55
material vegetal foi selecionado, separando-se as folhas, vagens (contendo as
sementes), pecíolo e raiz. A parte do vegetal utilizada neste estudo foi: folhas
jovens e maduras de H. indicum L.
As folhas foram secas em temperatura ambiente (por 48 horas) sobre
bancadas do laboratório de processamento de material vegetal da Faculdade de
Farmácia (UFPA), as quais se encontravam previamente limpas, sanitizadas e
revestidas com papel absorvente. A secagem das folhas foi realizada em estufa de
circulação forçada de ar mantida a temperatura de 40°C, durante quatro dias, tendo
a massa de uma amostra das folhas rigorosamente monitorada até peso constante.
Após a retirada das folhas já secas (droga vegetal) da estufa, estas foram
pulverizadas em um moinho de facas a fim de reduzir o material vegetal a
fragmentos de pequenas dimensões.
4.2.3 Caracterização física e físico-química das folhas de H. indicum L.
4.2.3.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó.
O procedimento foi desenvolvido usando um agitador de tamises
eletromagnético que produziu movimentos horizontais e verticais e utilizando-se
tamises padronizados superpostos, partindo-se de maior ao menor diâmetro.
Exatamente 10g da droga seca e pulverizada foram submetidos à série de tamises
com abertura de malha de 1700 µm, 710 µm, 355 µm, 250 µm, 180 µm, 125 µm;
durante 30 minutos. O tamanho das partículas foi avaliado pela quantificação
percentual de retenção de pó de H. indicum L. em cada tamis (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA IV, 1988).
Material e Métodos
56
4.2.3.2 Determinação de perda por dessecação do pó.
Exatamente 3 g da droga seca e pulverizada foram transferidas para pesa-
filtro. A amostra foi submetida a aquecimento em estufa a 105˚C durante 2 horas,
seguida de resfriamento em dessecador e pesagem. Repetiu-se a operação até
obtenção de peso constante. Os resultados de três determinações foram avaliados
em termos de porcentagem ponderal sobre a quantidade da amostra, utilizando a
seguinte equação: (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV, 1988).
% perda = Pu– Ps/Pa x 100
Onde:
Pa = peso da amostra (g)
Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação (g)
Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação(g)
4.2.3.3 Determinação do teor de cinzas totais do pó.
Exatamente 3 g da droga foram transferidos para cadinho de porcelana,
previamente calcinados, resfriados e pesados. As amostras nos cadinhos foram
aquecidas gradualmente até atingir 450°C, então carbonizadas em chama direta e
incineradas. Após resfriamento em dessecador sob vácuo, as amostras foram
pesadas em balança analítica, repetindo-se o procedimento até a obtenção de
peso constante. A porcentagem de cinzas foi calculada em relação à droga seca
(FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV, 1988).
4.2.3.4 Obtenção do perfil térmico por termogravimetria (TG, DTA, DSC) do
pó.
As análises termogravimétricas do pó de H. indicum L. foram realizadas por
TG, DTA e DSC. Tais análises foram obtidas nas seguintes condições: utilizou-se
uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um
cadinho de platina, logo após, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre
Material e Métodos
57
25 °C a 600 ºC, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de
aquecimento de 5 ºC/min. Os cálculos de perda de massa foram realizados com
auxílio do programa TA-60W da Shimadzu® (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES, 2008;
NUNES, 2009).
A determinação da curva DSC do pó foi analisada na faixa de temperatura
de 25 °C até 300 °C. Para todos os outros parâmetros seguiram-se os mesmos
critérios adotados para TG e DTA.
4.2.3.5 Obtenção do perfil espectroscópico na região do IV do pó.
Na análise por espectroscopia na região do IV as leituras foram realizadas
na faixa de absorção de número de onda de 4000 cm
-1
a 500 cm
-1
, com quantidade
apropriada da amostra comprimida em cristal de seleneto de zinco (SILVA
JUNIOR, 2006; ALVES, 2008; NUNES, 2009).
4.2.4 Obtenção e caracterização química e físico-química da solução extrativa
de H. indicum L.:
4.2.4.1 Obtenção da tintura a partir das folhas de H. indicum L.
A extração de ativos da espécie vegetal em questão foi realizada de acordo
com o método preconizado pela FARMACOPÉIA BRASILEIRA II (1959), seguindo
o processo geral M para a obtenção de tintura a partir do processo extrativo -
maceração. A tintura fitoterápica foi preparada por maceração (protegido da luz e
sob temperatura ambiente), em solução hidroalcoólica a 70° GL, por 10 dias, com
teor de 20% da droga (p/v).
4.2.4.2 Determinação do pH da tintura.
A determinação do pH de H. indicum L. foi realizada em potenciômetro
previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 e os resultados
Material e Métodos
58
corresponderam à média de três determinações independentes (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA IV, 1988).
4.2.4.3 Determinação da densidade aparente da tintura.
A análise da densidade aparente da tintura seguiu o método do picnômetro.
Um picnômetro com capacidade para 5 mL, previamente tarado, foi preenchido
com o líquido padrão (água recém destilada e fervida) e pesado. Em seguida o
picnômetro foi rinsado com a amostra e pesado. A relação entre o peso da amostra
e do líquido padrão, em um volume fixo, forneceu o valor da densidade aparente da
tintura à média de três determinações independentes (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA IV, 1988).
4.2.4.4 Determinação do resíduo seco da tintura.
Exatamente 1 mL da tintura foi pipetado e transferido para cápsulas de
porcelana previamente taradas nas mesmas condições empregadas durante a
análise propriamente dita. As cápsulas foram colocadas em banho maria, não
excedendo a temperatura de 40 °C, até secura e, em seguida, levadas à estufa a
110 ° C, até peso constante. Após resfriarem em dessecador, as cápsulas foram
pesadas, tendo a média de três determinações de resíduo seco calculado (MACIEL
et al, 2006).
4.2.5 Abordagem Fitoquímica da tintura.
4.2.5.1 Obtenção do extrato bruto a partir da tintura.
Um volume da tintura foi concentrado em evaporador rotativo a baixa
pressão, para remoção do solvente orgânico (solução hidroalcoólica a 70° GL)
tendo o cuidado para que a temperatura de aquecimento não excedesse 40°C.
Após a evaporação do solvente o extrato foi levado à estufa a 40°C, até total
Material e Métodos
59
evaporação do resíduo de solvente e para obtenção do extrato bruto de H. indicum
L.
4.2.5.2 Prospecção química do extrato bruto:
A prospecção química do extrato bruto foi realizada com a finalidade de
identificar a presença de classes de metabólitos secundários na espécie em
estudo. Dessa forma, realizaram-se testes para: saponinas, ácidos orgânicos,
açúcares redutores, polisssacarídeos, fenóis e taninos, proteínas e aminoáciodos,
flavonóides gerais, glicosídeos cardíacos, catequinas, derivados de
benzoquinonas, naftoquionas, fenantroquinonas, lactonas sesquiterpênicas e
outras lactonas, alcalóides, purinas, esteróides, triterpenóides, azulenos,
carotenóides, depsídios, depsidonas, derivados da cumarina e antraquinonas. Os
testes foram realizados em triplicata e seguiram as condições estabelecidas no
Manual para Análise Fitoquímica e Cromatográfia de Extratos Vegetais (BARBOSA
et al, 2001). O procedimento experimental segue descrito:
a. Testes que utilizam como solvente água destilada
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de H. indicum L. para
realizar os testes que utilizam água destilada como solvente. Para isso, foram
pesados 140 mg de EB e dissolvidos em 28 mL de água destilada. Em seguida
esta solução foi levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto.
Posteriormente, a solução foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo,
reservando o filtrado e obtendo-se a solução-mãe.
Saponinas espumídicas:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio (triplicata),
sendo diluída em 15 mL. Em seguida, a solução foi agitada vigorosamente por 2
minutos em tubo fechado. Se a camada de espuma permanece estável por mais de
meia hora, o resultado é considerado positivo.
Ácidos orgânicos:
Material e Métodos
60
Foram transferidos 2 mL da solução-mãe já filtrada para uma placa
escavada. À solução foi adicionada gotas do reativo de Pascová. Se houver
descoloração do reativo, a reação é positiva.
Açúcares redutores:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio. Em seguida,
foram adicionados 2 mL do reativo de Fehling A e 2 mL do reativo de Fehling B e
levados ao aquecimento em banho maria até ebulição por 5 minutos. O
aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, indica presença de açúcares
redutores.
Polissacarídeos:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado de
2 gotas de lugol. O aparecimento de coloração azul indica resultado positivo.
Fenóis e taninos:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado de
2 gotas de solução alcoólica de FeCl
3
a 1%. Qualquer mudança na coloração ou
formação de precipitado indica reação positiva, quando comparado com o teste em
branco (solvente+reativo). Uma coloração inicial entre o azul e o vermelho é
indicativa da presença de fenóis. Precipitado escuro de tonalidade azul indica
presença de taninos pirogálicos, e verde, presença de taninos catéquicos.
Proteínas e aminoácidos:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado de
0,5 mL de solução aquosa de nihidrina a 1% e aquecido em banho maria até
ebulição. O aparecimento de coloração violeta persistente indica reação positiva.
b. Testes que utilizam como solvente metanol
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de H. indicum L. para
realizar os testes que utilizam metanol como solvente. Para isso, foram pesados
120 mg de EB e dissolvidos em 24 mL de metanol. Em seguida esta solução foi
Material e Métodos
61
levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a
solução foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e
obtendo-se a solução-mãe.
Flavonóides:
Foram transferidos 10 mL da solução-mãe para tubo de ensaio (triplicata),
em seguida foram adicionadas 5 gotas de HCl concentrado e raspas de magnésio.
O surgimento de uma coloração rósea indica reação positiva.
Glicosídeos cardíacos:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio. Esta foi
separada em duas porções de 2 mL cada e adicionada gotas do reativo de Kedde.
O aparecimento de coloração azul ou violeta indica reação positiva.
Catequinas:
Foram transferidos 3 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado 1
mL de solução aquosa de vanilina a 1% e 1 mL de HCl concentrado. O surgimento
de coloração vermelha intensa indica reação positiva.
Derivados de benzoquinonas, naftoquinonas e fenantraquinonas:
Foram transferidos 3 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado 2
gotas de Na
2
CO
3
a 25%, 2 gotas de formaldeido a 4% e 2 gotas de o-
dinitrobenzeno a 5%. Em seguida, a solução foi aquecida em banho maria. O
aparecimento de uma coloração violeta indica reação positiva.
Sesquiterpenolactonas e outras lactonas:
Foram transferidos 3 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado 12
gotas de solução alcoólica de cloridrato de hidroxilamina a 10% e 2 gotas de
solução metanólica de KOH a 10%. A solução foi aquecida em banho maria
durante 2 minutos. Em seguida, resfriada e acidulada com solução de HCl a 1N,
por fim foi adicionado 1 gotas de FeCl
3
1%. O surgimento de uma coloração violeta
indica reação positiva.
Material e Métodos
62
c. Testes que utilizam como solvente clorofórmio
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de H. indicum L. para
realizar os testes que utilizam clorofórmio como solvente. Para isso, foram pesados
75 mg de EB e dissolvidos em 15 mL de clorofórmio. Em seguida esta solução foi
levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a
solução foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e
obtendo-se a solução-mãe.
Esteróides e triterpenóides:
10 ml da solução-mãe foram filtrados sobre carvão ativado (triplicata). O
filtrado foi transferido para um tubo de ensaio completamente seco, adicionado 1
mL de anidrido acético e agitado suavemente. Em seguida, foram adicionadas 3
gotas de H
2
SO
4
concentrado e novamente agitado. O rápido desenvolvimento de
cores que vão do azul evanescente ao verde persistente indicam resultado positivo.
Azulenos:
2 mL da solução-mãe foram transferidos para tubo de ensaio. Esta foi
concentrada até 0,5 mL em banho maria e adicionada 2,5mL da solução de reativo
de azuleno. Em seguida, a solução foi aquecida em banho maria durante 5
minutos. Após resfriar, o conteúdo do tubo de ensaio foi transferiu para um funil de
decantação e adicionado 10 mL de éter de petróleo. Este foi agitado e quando as
duas fases estavam distintas, a fase aquosa foi observada. Quando há presença
de proazulenos, a fase aquosa adquire coloração azul, porém, quando estes estão
em pequena quantidade, a coloração observada é esverdeada.
Carotenóides:
3 ml da solução-mãe foram transferidas para tubo de ensaio, no qual foram
adicionadas gotas de ácido trifluoracético. O desenvolvimento de coloração azul
indica reação positiva.
d. Testes que utilizam como solvente éter etílico
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de H. indicum L. para
realizar os testes que utilizam éter etílico como solvente. Para isso, foram pesados
Material e Métodos
63
50 mg de EB e dissolvidos em 10 mL de éter etílico. Em seguida esta solução foi
levada ao banho de ultra-som a fim de dissolver todo soluto. Posteriormente, a
solução foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo, reservando o filtrado e
obtendo-se a solução-mãe.
Depsídios e depsidonas:
5 mL da solução-mãe foram transferidos para um tubo de ensaio (triplicata) e
evaporado em banho maria. Posteriormente, 3 mL de metanol foram adicionados
ao resíduo e agitado. Após agitação, foram adicionadas 3 gotas da solução de
FeCl
3
1%. O aparecimento de coloração verde, azul ou cinza indica reação
positiva.
Derivados da cumarina:
5 mL da solução-mãe foram transferidas para um tubo de ensaio (triplicata),
o solvente foi concentrado em banho maria até 0,5 mL. Em seguida, foi aplicada
em um papel de filtro gotas da solução etérea, de modo que se formou duas
manchas de aproximadamente 1 cm de diâmetro cada. A uma destas manchas foi
adicionada 1 gota de solução de NaOH 1N e a metade dela foi coberta com papel
escuro, expondo a outra metade à luz ultravioleta. Para leitura do resultado as
manchas foram descobertas e comparadas. O aparecimento de fluorescência azul
na parte exposta da mancha indica reação positiva.
e. Outros testes realizados:
Alcalóides:
25 mg do extrato bruto de H. indicum L. foram dissolvidos em 5 mL de
solução de HCl 5% e filtrados. Foram separadas quatro porções de 1 mL em cada
cavidade de uma placa escavada e 1 mL do branco e adicionado em cada
cavidade gotas dos reativos de Bouchard, Dragendorff, Mayer e Bertrand.
Precipitação ou turvação em pelo menos uma cavidade é indicativa de resultado
positivo.
Purinas
:
Material e Métodos
64
5 mg do extrato bruto, 3 gotas de solução de HCl 6N e 2 gotas de H
2
O
2
a
30% foram reunidas em uma cápsula de porcelana e levadas ao banho maria até
formação de um resíduo corado de vermelho. Posteriormente, 3 gotas de solução
de NH
4
OH 6N foram adicionadas a cápsula de porcelana. O surgimento de
coloração violeta indica reação positiva.
4.2.5.3 Obtenção da fração alcaloídica (FA).
A fração alcaloídica foi obtida por partição líquido-líquido em meio ácido e
básico, representado esquematicamente na figura 4. A partição consistiu no
tratamento de 2,61 g do extrato bruto com 50 mL de HCl 5%. Em seguida, a
solução ácida foi filtrada em papel de filtro qualitativo - Whatman. O filtrado ácido
obtido foi transferido para funil de decantação e tratado com alíquotas n-hexano (5
x 10 mL), recolhendo a fração hexânica ácida. Após a obtenção da fração
hexânica, a solução aquosa foi transferida para um erlenmeyer e alcalinizada com
NH
4
OH concentrado até pH 10. A solução aquosa alcalina foi transferida para um
funil de decantação para extração dos alcalóides, para isso foram utilizadas
alíquotas de clorofórmio (5 x 10 mL). A extração dos alcalóides foi monitorada
através de spots tests sobre cromatoplaca e aspergida com reagente de
Dragendroff. (SHARAPIN, 2000).
À fração clorofórmica total obtida foi reunida, transferida para funil de
decantação e lavada com água destilada, até neutralização do clorofórmio. A
fração clorofórmica neutra obtida foi filtrada utilizando sulfato de sódio anidro para
remoção de água residual. Em seguida, a fração alcaloídica foi evaporada em
evaporador rotativo sob baixa pressão (não excedendo 35 °C) e transferida para
um frasco previamente pesado. O solvente residual foi evaporado à temperatura
ambiente e protegido da luz, obtendo a fração alcaloídica.
Material e Métodos
65
4.2.5.4 Determinação do perfil cromatográfico da fração alcaloídica (FA) e da
fração hexânica (FH) por cromatografia em camada delgada (CCD).
As frações FA e FH resultante da partição ácido e básico foram aplicadas na
forma de barras sobre placas cromatográficas de 5x10 cm utilizando como fase
Figura 4.
Esquema da partição líquido-líquido ácido e básico para obtenção da fração
hexânica (FH) e da fração alcaloídica (FA).
Material e Métodos
66
estacionária gel de sílica Merck® e fase móvel CHCl
3
/CH
3
OH na proporção de
90:10 em cuba cromatográfica com atmosfera de NH
4
OH. Após eluição dos
solventes de polaridade crescente e separação das substâncias, os
cromatogramas foram observados sob luz visível, luz ultravioleta (254 nm e 365
nm) e por fim revelados com reagente de Dragendorff. (solução de BiONO
3
e KI em
ácido acético diluído) e HCl 5% (WAGNER e BLADT, 2001). O resultado é
considerado positivo quando a reação leva ao aparecimento de uma “mancha” com
coloração vermelho alaranjado. O Rf deu-se pela razão das distâncias percorridas
pela mancha e pelo eluente na cromatoplaca.
4.2.5.5 Determinação do perfil cromatográfico por CLAE.
Para a análise da fração alcaloídica e hexânica (3 mg/mL) na tintura de H.
indicum L (20 mg/mL) empregou-se uma coluna Agilent LiChrospher 100®, RP8 (5
mm e 250 x 3,0 mm) mantida a temperatura de 26 °C. A fase móvel foi constituída
de acetonitrila e metanol, em gradiente linear de 80% de acetonitrila e 20% de
metanol, terminando com 99% de acetonitrila e 1% de metanol, com fluxo de 0,75
mL/min durante 18 min. O volume da amostra carregada foi de 50 µL sendo 20 µL
injetados pelo sistema de injeção Rheodyne. A análise foi realizada na faixa de
absorbância de 200 a 350 nm.
4.2.6 Obtenção do extrato liofilizado a partir da tintura.
O extrato liofilizado de H. indicum L. foi obtido após a evaporação do
solvente etanol em evaporador rotativo sob baixa pressão e o extrato aquoso
resultante foi resfriado a -70°C e liofilizado.
4.2.6.1 Obtenção do perfil térmico por termogravimetria (TG, DTA e DSC) do
extrato liofilizado.
As análises termogravimétricas do extrato liofilizado foram realizadas por
TG, DTA e DSC. Tais análises foram obtidas nas seguintes condições: utilizou-se
uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um
Material e Métodos
67
cadinho de platina, logo após, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre
25 °C a 600 ºC, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de
aquecimento de 5 ºC/min. Os cálculos de perda de massa foram realizados com
auxílio do programa TA-60W da Shimadzu® (SILVA JUNIOR, 2006, ALVES, 2008,
NUNES, 2009).
A determinação da curva DSC do extrato foi analisado na faixa de
temperatura de 25 °C até 300 °C. Para todos os outros parâmetros seguiram-se os
mesmos critérios adotados para TG.
4.2.6.2 Obtenção do perfil espectroscópico na região do IV do extrato
liofilizado.
O extrato liofilizado foi submetido à análise por espectroscopia de absorção
na região do IV. As leituras foram realizadas na faixa de absorção de número de
onda de 4000 cm
-1
a 500 cm
-1
, com quantidade apropriada da amostra comprimida
em cristal de seleneto de zinco (SILVA JUNIOR, 2006, ALVES, 2008, NUNES,
2009).
4.2.7 Ensaio biológico do extrato hidroalcoólico de H. indicum L.
4.2.7.1 Micro-organismos testados:
Os micro-organismos testados foram cepas padrão ATCC (American Type
Culture Colection) recomendadas para testes de suscetibilidade aos
antimicrobianos (CLSI, 2003). Em resumo, os micro-organismos testados
apresentam as seguintes características:
Staphylococcus aureus (ATCC 29913): Cocos gram-positivos, amplamente
encontrados na natureza, compõem a microbiota normal da pele. Alguns são
causadores de infecções de caráter oportunistas no homem e nos animais. São
responsáveis por inúmeras e variadas infecções e síndromes em humanos e com
Material e Métodos
68
resistência a várias classes de antimicrobianos (TORTORA et al, 2003; LEVINSON
e JAWETZ, 2005).
Escherichia coli (ATCC 25922): Bacilos gram-negativos. Constituem a microbiota
intestinal, tornando-se patogênico em localizações extra-intestinal ou mesmo
intestinal. São agentes de infecção gastrointestinal e os principais responsáveis por
infecções urinárias em mulheres. Apresentam facilidade na aquisição e
transferência de plasmídeos de resistência a antimicrobianos (TORTORA et al,
2003; LEVINSON e JAWETZ, 2005).
Pseudomonas aeruginosas (ATCC 25853): Bacilos gram-negativos não
fermentadores. Podem ser encontrados na pele, fezes e garganta de indivíduos
normais. Este microorganismo causa infecções tipicamente oportunistas do tipo
nosocomial e é resistente a uma grande variedade de antimicrobianos (TORTORA
et al, 2003; LEVINSON e JAWETZ, 2005).
Candida albicans (ATCC 40175): Fungo leveduriforme. É comensal no trato
gastrointestinal e geniturinário, porém é o principal agente de infecções fúngicas
oportunistas, principalmente no trato vaginal e oral (TORTORA et al, 2003;
LEVINSON e JAWETZ, 2005).
4.2.7.2 Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato bruto.
Para a avaliação preliminar da atividade antimicrobiana do extrato bruto de
H. indicum L., empregou-se o método de disco-difusão em meio sólido (BAUER et
al, 1966, NCCLS, 2003a; KARTAL et al, 2003;SANTOS et al, 2007). Esta técnica
consiste na preparação dos inóculos dos microorganismos a serem testados,
tomando-se 3 a 4 colônias isoladas e diluídas em solução salina a 0,85% até atingir
a turbidez correspondente ao tubo 0,5 da escala de Mac Farland [0,5 mL de cloreto
de bário a 1,75% (p/v) + 99,5 mL de solução de ácido sulfúrico a 1% (v⁄v)]
correspondendo a aproximadamente 1 a 2 x 10
8
UFC/mL de E. coli (BAUER et al,
1966; CLSI, 2003; KARTAL et al, 2003).
Material e Métodos
69
Para a inoculação das placas de teste utilizou-se um swab de algodão estéril
o qual foi imerso na suspensão ajustada, até 15 minutos após ajustar a turbidez da
suspensão do inóculo. A superfície da placa contendo ágar Müeller-Hinton foi
inoculada através da técnica da semeadura do swab em toda a superfície estéril do
meio. Repetiu-se o procedimento semeando outras duas vezes, girando a placa
aproximadamente 90° cada vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do
inóculo. Como passo final, passou-se o swab na margem da placa de ágar.
Posteriormente procedeu-se a aplicação dos discos nas placas, realizado
por um conjunto predeterminado de discos de papel de filtro padronizados e
estéreis (Whatman - tipo n° 3) com 6,0 mm de diâmetro. Em cada disco de papel
foram impregnados 10 µL do extrato dissolvido em DMSO, nas concentrações de
500, 250, 125 e 62,5 mg⁄mL. Os discos contendo o extrato em diferentes
concentrações foram aplicados na superfície da placa semeada, de maneira a
assegurar contato completo com a superfície do meio de cultura. As placas,
contendo o inóculo semeado e os discos controle (10 µL de DMSO) e teste (10 µL
do extrato dissolvido em DMSO), foram armazenados em estufa a 35,5 °C ±1° C,
durante 24 horas.
Após a incubação das placas, procedeu-se a leitura dos resultados para a
verificação e aferição da possível formação de halos de inibição, em milímetros, ao
redor dos discos contendo o extrato. O resultado final representa a média de duas
determinações e foi considerado como suscetível halo igual ou superior a 8,0 mm
de diâmetro (PAREKH e CHANDA, 2007; SANTOS et al, 2007).
4.2.8 Estudos da formulação contendo a tintura padronizada de H. indicum L.
4.2.8.1 Obtenção da formulação.
Foi empregada uma base galênica de característica hidrofílica empregando-
se como polímero o hidroxietilcelulose (Natrozol® 250) comumente empregado na
farmacotécnica de formas farmacêuticas semi-sólidas, na qual foi incorporada a
tintura de H. indicum L. na concentração de 10%.
Para o preparo da base, foram pesados cada componente da formulação
separadamente (Quadro 1) O conservante metilparabeno foi diluído em água e
Material e Métodos
70
essa mistura foi levada a uma placa aquecedora sob temperatura de 55,0 ºC ± 2,0
ºC. Em seguida, acrescentou-se o polímero hidroxietilcelulose umedecido em
propilenoglicol, agitando-se continuamente com bastão de vidro até completa
dispersão desses componentes. Obtida a completa dispersão dos componentes da
formulação, a mistura foi retirada do aquecimento e deixada em repouso à
temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período a tintura foi incorporada à
base (NUNES, 2009). Todos os componentes empregados na formulação seguem
descritos no quadro abaixo.
Quadro 1.
Componentes da formulação fitoterápica semi-sólida e suas respectivas concentrações.
Componentes da Formulação
Concentração (%)
Tintura de Heliotropium indicum L.
10
Hidroxietilcelulose (Natrosol®250) 1,5
Propilenoglicol 5
Metilparabeno 0,2
Água destilada q.s.p. 100
4.2.8.2 Caracterização físico-química da mistura física do extrato liofilizado x
adjuvantes farmacêuticos empregados na formulação por Termogravimetria
(TG), Análise Térmica Diferencial (DTA), Calorimetria Exploratória Diferencial
(DSC) e espectrometria na região do infravermelho (IV).
4.2.8.2.1 Preparo das amostras.
As misturas binárias foram preparadas por misturas físicas do extrato
liofilizado de H. indicum L com os excipientes da formulação nas seguintes
concentrações:
Material e Métodos
71
- Extrato liofilizado/hidroxietilcelulose. (1:1 p/p)
- Extrato liofilizado/propilenoglicol /. (1:2 p/p)
- Extrato liofilizado/metilparabeno /. (1:1 p/p)
4.2.8.2.2 Termogravimetria (TG e DTA) dos excipientes da formulação e de
suas misturas binárias com o extrato liofilizado.
Para obtenção das curvas termogravimétricas (TG e DTA) dos excipientes e
de suas misturas binárias com o extrato liofilizado, utilizou-se uma massa de
aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um cadinho de
platina, logo após, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre 25 °C a 600
ºC, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento
de 5ºC/min. Os cálculos de perda de massa foram realizados com auxílio do
programa TA-60W da Shimadzu® (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES 2008, NUNES,
2009).
4.2.8.2.3 Análise da Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).
Para obtenção das curvas DSC dos excipientes e de suas misturas binárias
com o extrato liofilizado, utilizou-se uma massa de aproximadamente 8 mg de cada
amostra e as transferiu para um cadinho de platina. Em seguida, foram submetidas
a uma faixa de temperatura entre 25 °C até 300 ºC, sob atmosfera dinâmica de
nitrogênio (25,00 mL/min) e razão de aquecimento de 5ºC/min. Os cálculos da
diferença de temperatura (H) foram realizados com auxílio do programa TA-60W
da Shimadzu® (SILVA JUNIOR, 2006; NUNES, 2009).
Material e Métodos
72
4.2.8.2.4 Análise espectrofotométrica na região do infravermelho dos
excipientes da formulação e de suas misturas binárias com o extrato
liofilizado.
As amostras dos excipientes da formulação e das misturas binárias do
extrato liofilizado com seus excipientes foram submetidas à análise por
espectroscopia de absorção na região do infravermelho. As leituras foram
realizadas na faixa de absorção de número de onda de 4000 cm
-1
a 500 cm
-1
, com
quantidades apropriadas das amostras comprimidas em cristal de seleneto de
zinco (SILVA JUNIOR, 2006; ALVES 2008, NUNES, 2009).
4.2.9 Avaliação preliminar da estabilidade da formulação.
4.2.9.1 Teste de centrifugação.
Foram pesados 5,0 g do gel em tubos de centrífuga. O teste da
centrifugação foi realizado em duplicata, nas seguintes condições experimentais:
temperatura ambiente (25 ºC ± 2,0 ºC); velocidade de rotação de 3.000 rpm e
tempo de teste de 30 minutos (BRASIL, 2004).
4.2.9.2 Teste do estresse térmico.
Foram utilizadas réplicas de 12 amostras do gel de 5,0 g do mesmo lote, as
quais foram acondicionadas em vidros neutros. Seis amostras foram submetidas ao
aquecimento em estufa à temperatura de 45 ºC ± 2,0 ºC em 6 ciclos avaliados no
intervalo de 24 h, enquanto as outras seis amostras permaneceram à temperatura
ambiente (25 ºC ± 2 ºC), as quais foram utilizadas como controle, pois é esperado
as menores alterações nessas condições (BRASIL, 2004). Logo após o término de
cada ciclo, as amostras foram avaliadas pelos seguintes parâmetros:
características organolépticas (enfatizando possíveis alterações na aparência, cor e
odor. A homogeneidade, brilho e ausência de grumos e precipitados também foram
analisados) e determinação do valor de pH. Os resultados obtidos nos tempos t
1
a
Material e Métodos
73
t
6
do ciclo da estufa foram comparados aos resultados das amostras de referências
(amostras que permaneceram à temperatura ambiente) (BRASIL, 2004).
4.2.9.3 Determinação do valor de pH.
O pH das amostras (t
0
a t
6
) foi determinado nas dispersões das amostras em
água recém destilada e na proporção 1:10 em três determinações e à temperatura
ambiente (25 ºC ± 2 ºC). As leituras de cada amostra foram realizadas em três
determinações.
4.2.9.4 Avaliação do perfil reológico da formulação.
Após 48 h de sua preparação, a formulação obtida foi avaliada quanto ao
comportamento reológico em reômetro marca Rheotet, modelo 2 (tipo cilindro),
utilizando o dispositivo AIICS 1. As leituras mensuradas foram realizadas a
velocidade crescente e decrescente para obtenção das curvas ascendentes e
descendentes. A partir dos dados experimentais, as curvas de escoamento foram
avaliadas graficamente pela velocidade versus tensão de cisalhamento e pela
viscosidade aparente versus velocidade de cisalhamento.
74
5. RESULTADOS
5
5 5
5
Resultados
Resultados Resultados
Resultados
5.1 Estudos de pré-
formulação
5.1.1 Avaliação das características físicas e físico
5.1.1.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó
Pela avaliação granulométrica
classificar a droga vegetal como pó grosso, sendo estabelecido pela
FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV (1988) como aquele cujas partículas passam em
sua totalidade pelo tamis como abertura nominal de malha de 1700 µm, e no
máximo, 40% pelo tamis co
0
20
40
60
1700
Massa Retida (%)
Figura 5
. Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas de
H. indicum
formulação
5.1.1 Avaliação das características físicas e físico
-
químicas da droga vegetal
5.1.1.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó
.
Pela avaliação granulométrica
do pó das folhas de
H. indicum
classificar a droga vegetal como pó grosso, sendo estabelecido pela
FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV (1988) como aquele cujas partículas passam em
sua totalidade pelo tamis como abertura nominal de malha de 1700 µm, e no
máximo, 40% pelo tamis co
m abertura nominal de malha de 355 µm (Figura 5).
1700
710
355
250
180
125
0,4
20,81
45,29
12,59
9,22
4,26
Abertura de malha
do tamis (µm)
. Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas de
H. indicum
L.
Resultados
75
químicas da droga vegetal
.
H. indicum
L. foi possível
classificar a droga vegetal como pó grosso, sendo estabelecido pela
FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV (1988) como aquele cujas partículas passam em
sua totalidade pelo tamis como abertura nominal de malha de 1700 µm, e no
m abertura nominal de malha de 355 µm (Figura 5).
Fundo
4,26
5,35
do tamis (µm)
. Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas de
Resultados
76
5.1.1.2 Determinação da perda por dessecação e do teor de cinzas totais do
pó de H. indicum L.
5.1.1.3 Análise do perfil térmico por TG do pó.
A curva termogravimétrica (TG) do pó mostra que houve perda inicial de
massa de 11,88% na faixa de temperatura de 25 °C a 110 °C. Observou-se que da
temperatura de 240 °C até aproximadamente 330 °C houve perda de massa de
32,12% e de 390 °C até 600 °C houve uma perda de massa do material de 33,94%.
Foi possível verificar uma perda total de massa de 79,64% na faixa de temperatura
analisada de 25 °C a 600 °C, com resíduo de 20,36% (Figura 6; Tabela 2).
Testes
η
Χ (%) ± DPR
Perda por dessecação 3 12,88 ± 0,046
Teor de cinzas totais 3 17,14 ± 0,726
Figura 6
. Curvas TG e DrTG do pó das folhas de
H. indicum
L.
obtida a 5
°
C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00
mL/min.
η
= n° de amostras
X = médias dos resultados independentes
DPR = desvio padrão relativo
Tabela 1
. Determinação da perda por dessecação e teor de cinzas totais do pó das folhas de
H.
indicum
L.
Resultados
77
Amostra
Temperatura (°C)
25 – 110 240 – 330 390 – 570 25 – 600 Resíduo
Perda de Massa (∆m) (%)
Pó das folhas
11, 88
32,12
33,94
79,64
20,36
5.1.1.4 Análise DSC do pó.
A curva DSC da droga vegetal mostra um evento endotérmico na faixa de
temperatura de 29 °C a 140 °C, com um consumo de energia de 369,43 J⁄g. O
processo de decomposição tem início na temperatura de 250 °C, sendo
evidenciado por dois eventos exotérmicos consecutivos. O primeiro ocorre na faixa
de temperatura de 275 °C a 365 °C (∆H= 222,97 J/g) e o segundo de menor
intensidade ocorre na faixa de temperatura de 558 °C a 594 °C (∆H= 7,39 J/g)
(Figura 7; Tabela 3).
Figura 7
. Curva DSC do pó das folhas de
H. indicum
L. obtida
a 5
°
C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00 mL/min.
Tabela 2
. Perfil térmico (TG) do pó das folhas de
H. indicum
L. com suas respectivas perdas de
massa, em cada intervalo de temperatura (°C).
Resultados
78
Tabela 3
. Valores das entalpias apresentadas pela droga vegetal de
H. indicum
L. em diferentes
temperaturas, analisadas por DSC.
Amostra
Temperatura (°C)
29-140 275-365 558-594
∆H (J⁄g)
Pó das folhas
369,43 222,97 7,39
5.1.1.5 Perfil espectroscópico na região do IV do pó.
A análise espectrométrica na região do IV do pó das folhas de H. indicum L.,
teve a finalidade de obter informações preliminares dos constituintes químicos
presentes na droga vegetal. As principais bandas de absorção em 3340 cm
-1
, 3270
cm
-1
, 3229 cm
-1
, 1599 cm
-1
, 1408 cm
-1
, 1010 cm
-1
(Figura 8) correspondem aos
grupamentos funcionais apresentados na tabela 8 (p.86).
Figura 8.
Espectro na região do IV do pó das folhas de
H. indicum
L
.
Resultados
79
5.1.2 Caracterização físico-química da tintura de H. indicum L.
5.1.2.1 Determinação do pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura.
Os valores do pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura de H.
indicum L. estão descritos na tabela 4.
Tabela 4
. Determinação do pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura de
H. indicum
L.
Testes
η
Χ (%) ± DPR
pH 3 7,81 ± 0,006
Densidade aparente
3 0,8953 ± 0,001
Resíduo Seco 3 1,44 ± 0,199
5.1.3 Abordagem Fitoquímica da tintura.
5.1.3.1 Prospecção química do extrato bruto.
A determinação dos constituintes químicos relevantes para identificação de
drogas vegetais faz parte da avaliação da matéria-prima empregada. O perfil
químico indicou a presença das seguintes classes químicas na tintura: açúcares
redutores, fenóis e taninos, esteróides e triterpenóides, carotenóides e indicativo de
proazulenos. A reação de precipitação do extrato bruto com Dragendorff não foi
observada, entretanto a fração alcaloídica apresentou reação com Dragendorff
indicado pela presença de um precipitado vermelho alaranjado, sugerindo a
presença de alcalóide na espécie (Tabela 5).
η
= n° de amostras
X = médias dos resultados
DPR = desvio padrão relativo
Resultados
80
Tabela 5.
Prospecção química do extrato bruto de
H. indicum
L.
Metabólitos Secundários
Resultado
Saponinas
-
Açúcares redutores
+
Polissacarídeos
-
Fenóis
+
Taninos Catéquicos
+
Proteínas e Aminoácidos
-
Flavonóides
-
Glicosídeos cardíacos
-
Catequinas
-
Derivados de Benzoquinonas, Naftoquinonas
e fenantraquinonas
-
Lactonas sesquiterpênicas e outras lactonas
-
Alcalóides
- (EB)
+ (FA)
Purinas
-
Esteróides e triterpenóides
I
Azulenos
I (proazulenos)
Carotenóides
+
Depsídios e Depsidonas
-
Antraquinonas
-
+ positivo
- negativo
I = indicativo
Resultados
81
5.1.3.2 Determinação do perfil cromatográfico da fração alcaloídica (FA) e da
fração hexânica (FH) obtido por cromatografia em camada delgada (CCD).
As figuras 9 e 10 mostram os cromatogramas das FA e FH com os fatores
de retenção das substâncias separadas pelo sistema eluente CHCl
3
/CH
3
OH na
proporção de 90:10 em atmosfera de NH
4
OH. A mancha com fator de retenção de
0,84 foi observada em ambos cromatogramas da FA e da FH, sugerindo se tratar
da mesma substância.
Figura 9.
Cromatograma da FA visualizado no
UV a 254 nm (à esquerda) e revelado
com Dragendorff e HCl 5% (à direita)
obtido pelo sistema eluente
CHCl
3
⁄CH
3
OH (90:10), em atmosfera
de NH
4
OH.
Figura 10.
Cromatograma da FH visualizado
no UV a 254 nm (à esquerda)
revelado com Dragendorff e HCl
5% (à direita) obtido pelo sistema
eluente CHCl
3
⁄CH
3
OH (90:10), em
atmosfera de NH
4
OH.
Resultados
82
5.1.3.3 Determinação do perfil do extrato bruto, da fração alcaloídica e da
fração hexânica de H. indicum L. por CLAE.
A CLAE foi utilizada para gerar o perfil cromatográfico do extrato bruto de H.
indicum L. e suas frações (fração alcaloídica e hexânica). A figura 11 mostra que o
cromatograma A referente ao extrato bruto apresenta um pico com Rt=1,60 min e
0,9607 de pureza. Este pico foi reproduzido na fração alcaloídica e na fração
hexânica ambos com Rt=1,73 min e pureza de 0,9621 e 0,9147, respectivamente
(Figura 11B e 11C)
Figura 11
. Perfil cromatográfico por CLAE-UV/DAD a 250
nm do extrato bruto de
H. indicum
L.
Cromatogramas: A- extrato bruto (1,60 min); B-
fração alcaloídica (1,73 min), C- fração
hexânica (1,73 min).
Resultados
83
Quando comparado os espectros na região do ultravioleta referente ao
extrato bruto e a fração alcaloídica idêntico aos picos com Rt=1,60 min e Rt=1,73
min respectivamente, é observado uma semelhança entre esses dois espectros,
apresentando correlação de 0,9657 (Figura 12).
5.1.4 Caracterização físico-química do extrato liofilizado de H. indicum L.
5.1.4.1 Análise do perfil térmico por TG do extrato liofilizado.
A curva TG do extrato liofilizado a partir da tintura de H. indicum L. mostra
que houve perda inicial de massa de 5,3% na faixa de temperatura de 25 °C a 110
°C. Na temperatura de 200 °C até aproximadamente 330 °C houve perda de massa
acumulada de 29,08%; a partir de 390 °C até 600 °C ocorreu perda de massa
acumulada do material de 14,85%. Foi possível verificar uma perda total de massa
de 65,00% na faixa de temperatura analisada de 25 °C a 600 °C (Figura 13; Tabela
6).
Figura 12
. Espectros no UV em 250 nm idêntico ao pico com
Rt
=1,60 min (extrato) e
Rt
=1,73 min (fração
alcaloídica).
Resultados
84
Tabela 6
. Perfil térmico (TG) do extrato liofilizado de
H. indicum
L. com suas respectivas perdas de
massa, em cada intervalo de temperatura (°C).
Amostra
Temperatura (°C)
25 – 110 200-330 390-600 25 – 600 Resíduo
Perda de Massa (∆m) (%)
Extrato liofilizado
5,3
29,08
14,85
65,00
35,00
Figura 13
. Curvas TG e DrTG do extrato liofilizado de
H. indicum
L. obtida a 5
°
C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00
mL/min.
Resultados
85
5.1.4.2 Análise DSC do extrato liofilizado.
A
curva DSC do extrato liofilizado demonstra um evento endotérmico, na
faixa de temperatura de 80 °C a 160 °C, com consumo de energia de 18,33 J/g. O
processo de decomposição tem início na temperatura de 250 °C caracterizados por
eventos exotérmicos (Figura 14; Tabela 7).
Tabela 7
. Valores das entalpias apresentadas pelo extrato liofilizado de
H. indicum
L. em diferentes
temperaturas, analisadas por DSC.
Amostra
Temperatura (°C)
80 - 160 250-350 400-450 520- 540 550-600
∆
H
(J
⁄g)
Extrato
liofilizado
18,33
179,69
99,22
25,71
531,70
Figura 14
. Curva DSC do extrato liofilizado de
H. indicum
L. obtida
a 5
°
C/min, sob atmosfera: N
2
, fluxo: 25,00 mL/min.
Resultados
86
5.1.4.3 Perfil espectroscópico na região do IV do extrato liofilizado.
Pela Figura 15 é possível verificar bandas de absorção de 3283 cm
-1
característica de grupamento funcional hidroxila fenólica, absorção em 2917 cm
-1
e
2849 cm
-1
característico de C-H e 1573 cm
-1
característico de carbonila (C=O)
conjugadas.
Tabela 8
. Faixa de absorção de ligações das moléculas no extrato de
H. indicum
L.
Faixa de absorção (cm
-
1
) Tipo de ligação
3400-3200 -OH
2900-2820 C-H (alifático)
1640-1540 C=O
1385-1380 CH
2
1175- 1050 C-O
Figura 15.
Espectro na região do IV do extrato liofilizado de
H.
indicum
L.
Resultados
87
A figura 16 mostra um aumento na intensidade das bandas de absorção
observadas no espectro na região do IV do extrato liofilizado, quando comparado
com o espectro na região do IV da droga vegetal.
5.2 Avaliação preliminar da atividade antimicrobiana do extrato bruto de H.
indicum L.
Os ensaios preliminares da atividade antimicrobiana in vitro do EB de H.
indicum L. revelam uma inibição no crescimento das cepas gram-positivas (Figura
17; Tabela 9).
Figura 16.
Espectros na região do infravermelho da droga
vegetal e do extrato liofilizado de
H. indicum
L.
Resultados
88
Tabela 9.
Valores médios dos halos de inibição (mm) obtidos pelo método de difusão em disco
utilizado na análise do extrato bruto de
H. indicum
L. em diferentes concentrações.
Cepas de microorganismos
Concentração (mg⁄mL)
500 250 125 62,5
Staphylococcus aureus
(ATCC 29913)
+
(12,5 ±0,707)
+
(10,5 ± 0,707)
- -
Pseudomonas aeruginosas
(ATCC 25853)
- - - -
Escherichia coli
(ATCC 25922)
- - - -
Candida albicans
(ATCC 40175)
- - - -
+ positivo; (média do halo de inibição ± DPR)
- negativo
Figura 17.
Placa mostrando os halos de inibição do
crescimento da cepa de
S. aureus
com discos
contendo diferentes concentrações do EB de
H.
indicum
L dissolvido em DMSO.
Resultados
89
5.3 Estudo da formulação.
5.3.1 Determinação dos ensaios preliminares do extrato liofilizado de H.
indicum L. com suas misturas binárias por termogravimetria (TG), análise
térmica diferencial (DTA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC).
As curvas TG, DTA e DSC do extrato liofilizado, hidroxietilcelulose (HEC) e
suas misturas binárias (extrato/HEC – 1:1 p/p) estão apresentadas nas Figuras 18,
19 e 20, respectivamente. Os resultados referentes aos seus percentuais de perda
de massa e variação de temperatura estão descritos na Tabela 10 e Tabela 11,
respectivamente.
Figura 18.
Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado de
H.
indicum
L., mistura binária extrato/HEC (1:1 p/p) e HEC.
Resultados
90
Componentes da
formulação
Temperatura
inicial (°C)
Temperatura
final (°C)
Perda de
massa (∆m)
(%)
Extrato liofilizado
25 110 5,3
200 330 29,08
390 600 14,85
HEC
25 110 7,71
220 370 64,09
400 595,76 4,89
Extrato/HEC (1:1 p/p)
25 110 6,6
180 370 49,53
390 600 13,83
Figura 19.
Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado de
H.
indicum
L., a mistura binária (extrato/HEC – 1:1 p/p) e a
HEC.
Tabela 10.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de massa (
∆
m) do
extrato liofilizado de
H. indicum
L, da HEC e da mistura binária do extrato liofilizado e
HEC (1:1 p/p).
Resultados
91
Componentes da
formulação
Temperatura
inicial (°C)
Temperatura
final (°C)
DTA
∆H (J/g)
DSC
∆H (J/g)
Extrato liofilizado
80 150 85,05 18,33
220 350 1023,90 -
550 600 761,61 -
HEC
25,92 75,66 239,8 -
80 150 - 93,13
Extrato/HEC (1:1 p/p)
25 80 111,71 82,55
210 335 1042,22 -
530 600 1204,22 -
Figura 20.
Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado de
H. indicum
L., a mistura binária (extrato/HEC – 1:1
p/p) e a HEC.
Tabela 11.
Resultados termogravimétricos (DTA e DSC) correspondente a variação de energia
(
∆H
) do extrato liofilizado de
H. indicum
L., da HEC e da mistura binária do extrato
liofilizado e HEC (1:1 p/p).
Resultados
92
As curvas TG, DTA e DSC do extrato liofilizado, metilparabeno e suas
misturas binárias (extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) estão apresentadas nas Figuras
21, 22 e 23, respectivamente. Os resultados referentes aos seus percentuais de
perda de massa e variação de temperatura estão descritos na Tabela 12 e 13.
Componentes da
formulação
Temperatura
inicial (°C)
Temperatura
final (°C)
Perda de massa (%)
Extrato liofilizado
25 110 5,3
200 330 29,08
390 600 14,85
Metilparabeno
27 99 0,31
100 216 99,83
300,1 550,61 0,22
Extrato/Metilparabeno
(1:1 p/p)
25 110 3,83
186 227 59,54
443 600 5,07
Figura 21.
Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a
mistura binária (extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) e
metilparabeno.
Tabela 12.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de massa (
∆
m) do
extrato liofilizado de
H. indicum
L., do metilparabeno e da mistura binária do
extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p).
Resultados
93
Figura 23.
Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a mistura
binária (extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) e metilparabeno.
Figura 22.
Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a
mistura binária (extrato/metilparabeno – 1:1 p/p) e
metilparabeno.
Resultados
94
As curvas TG, DTA e DSC do extrato liofilizado, propilenoglicol e suas
misturas binárias (extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) estão apresentadas nas Figuras
24, 25 e 26, respectivamente. Os resultados referentes aos seus percentuais de
perda de massa e variação de temperatura estão descritos na Tabela 14 e 15.
Componentes da
formulação
Temperatura
inicial (°C)
Temperatura
final (°C)
DTA
∆H (J/g)
DSC
∆H
(J/g)
Extrato liofilizado
80 150 85,05 -
80 160 - 18,33
220 350 1023,90 -
550 600 761,61 -
Metilparabeno
80,12 130,07 240,24 -
125 150 238,61 147,16
160 225 548,26 -
165 206 - 60,78
225 245 - 58,99
Extrato/Metilparabeno
(1:1 p/p)
80 130 94,05 -
80 110 - 33,15
112 135 - 10,53
145 205 - 72,35
160 250 271,67 -
251 360 395,50 -
558 600 393,26 -
Tabela 13.
Resultados termogravimétricos (DTA e DSC) correspondente a variação de energia
(
∆H
) do extrato liofilizado de
H. indicum
L., do metilparabeno e da mistura binária do
extrato liofilizado e metilparabeno (1:1 p/p).
Resultados
95
Componentes da
formulação
Temperatura
inicial (°C)
Temperatura
final (°C)
Perda de massa
(%)
Extrato liofilizado
25 110 5,3
200 330 29,08
390 600 14,85
Propilenoglicol 108 140 99,95
Extrato/Propilenoglicol
(1:2 p/p)
25 140 62,79
218 269,45 10,3
435 461 3,86
Figura 24.
Curvas TG correspondente ao extrato liofilizado, a mistura
binária (extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) e ao
propilenoglicol.
Tabela 14.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de massa (
∆
m) do
extrato liofilizado de
H. indicum
L., do propilenoglicol e da mistura binária do
extrato liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p).
Resultados
96
Figura 25.
Curvas DTA correspondente ao extrato liofilizado, a
mistura binária (extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) e
propilenoglicol
.
Figura 26.
Curvas DSC correspondente ao extrato liofilizado, a
mistura binária (extrato/propilenoglicol – 1:2 p/p) e
propilenoglicol.
Resultados
97
Componentes da
formulação
Temperatura
inicial (°C)
Temperatur
a final (°C)
DTA
∆H (J/g)
DSC
∆H (J/g)
Extrato liofilizado
80 150 85,05 -
80 160 - 18,33
220 350 1023,90 -
550 600 761,61 -
Propilenoglicol
28 150 823,46 -
222 237 - 155,74
Extrato/Propilenoglicol
(1:2 p/p)
25 150 1160,37 -
530 600 303,63 -
90 180 - 88,33
5.3.2 Análise espectrofotométrica na região do infravermelho do extrato
liofilizado e suas misturas binárias.
Os espectros na região do IV do extrato liofilizado, da mistura binária
(Extrato/Hidroxietilcelulose – 1:1 p/p) e a hidroxietilcelulose estão apresentadas na
Figura 27. As bandas de absorção do extrato liofilizado foram observadas na
mistura binária com seus excipientes analisados, verificando uma compatibilidade
do extrato com as misturas binárias dos excipientes farmacêuticos utilizados na
formulação.
Tabela 15.
Resultados termogravimétricos (TG) correspondente a perda de massa (
∆
m) do
extrato liofilizado de
H. indicum
L., do propilenoglicol e da mistura binária do extrato
liofilizado e propilenoglicol (1:2 p/p).
Resultados
98
Os espectros na região do IV do extrato liofilizado, da mistura binária
(Extrato/Metilparabeno – 1:1 p/p) e o metilparabeno estão apresentados na Figura
28.
Figura 27.
Espectros na região do IV do extrato liofilizado
de
H. indicum
L., da mistura binária (extrato/HEC
1:1 p/p) e da HEC, analisados na faixa de
absorção de 4000-500 cm
-1
.
Figura 28.
Espectros na região do IV do extrato liofilizado de
H. indicum
L., da mistura binária
(extrato/metilparabeno 1:1 p/p) e do
metilparabeno, analisados na faixa de absorção
de 4000-500 cm
-1
.
Resultados
99
Os espectros na região do IV do extrato liofilizado, da mistura binária
(Extrato/Propilenoglicol – 1:2 p/p) e o propilenoglicol estão apresentados na da
Figura 29.
5.3.3 Formulação fitoterápica contendo tintura padronizada de H. indicum L.
5.3.3.1 Avaliação da formulação semi-sólida contendo a tintura de H. indicum
L.
Os aspectos primários considerados na estabilidade de uma formulação
cosmética são os aspectos físicos que devem conservar as propriedades físicas
originais como aspecto, cor, odor, uniformidade (BRASIL, 2004). Portanto, a
formulação farmacêutica fitoterápica obtida apresentou uma boa consistência de
gel, usando o polímero hidroxietilcelulose na concentração de 1,5%, cor verde,
característico da tintura de H. indicum L. e odor também característico da tintura.
5.3.3.2 Teste de Centrifugação.
Figura 29.
Espectros na região do IV do extrato liofilizado
de
H. indicum
L., da mistura binária
(extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) e do
propilenoglicol, analisados na faixa de
absorção de 4000-500 cm
-1
.
Resultados
100
Após a submissão do gel à força centrípeta visando à aceleração de
possíveis processos de instabilidade, foi possível observar a não ocorrência de
desestruturação da cadeia polimérica do gel contendo a tintura de H. indicum L.,
assim a formulação foi aprovada no teste de centrifugação, permitindo a
continuidade dos testes de estabilidade do gel.
5.3.3.3 Teste de estresse térmico.
Para realização dos ciclos em estufa e temperatura ambiente foi verificada
as seguintes características organolépticas: aspecto, cor e odor (BRASIL, 2004;
LIMA et al, 2008). Após 24 h do preparo da formulação, observou-se que o gel
apresenta aspecto homogêneo, cor verde e odor característico da tintura de H.
indicum L.. Essas características foram consideradas como padrão para
comparação com as amostras submetidas aos ciclos em estufa (45°C±2°C). Após a
análise macroscópica de cada amostra ao término dos ciclos não se observou
quaisquer características apresentadas pela amostra padrão.
5.3.3.4 Determinação do pH da formulação
Os valores de pH obtidos por potenciômetria direta em dispersão aquosa
das amostra do gel em estufa (45°C±2°C) e das amostras que permaneceram à
temperatura ambiente (25°C±2°C), estão representadas na figura 30.
3
4
5
6
7
8
9
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
Valor de pH
Ciclo de estabilidade
Amostra a 25°C
Amostra a 45
°
C
Figura 30
. Valores de pH obtidos pelo teste do estresse térmico das amostras do gel de
H.
indicum
L. submetido a estufa (45 °C ± 2 °C) e das amostras do gel de
H.
indicum
L. submetido a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C), n= 3.
Resultados
101
5.3.3.5 Avaliação do comportamento reológico da formulação
A figura 31 mostra que a formulação apresenta perfil de material fluidificante.
O comportamento de deformação da formulação obtida pode ser observado na
figura 32. O gel apresentou uma pequena área de histerese, ocorrendo uma
sobreposição das curvas ascendentes e descendentes do processo.
Figura 31.
Características da viscosidade da formulação contendo
tintura de
H. indicum
L.
Figura 32
. Perfil reológico da formulação contendo tintura de
H.
indicum
L.
102
6. DISCUSSÃO
Discussão
103
6. Discussão
6. Discussão6. Discussão
6. Discussão
O Brasil é um dos países mais ricos em biodiversidade vegetal e um grande
fornecedor deste tipo de matéria-prima, porém o desenvolvimento tecnológico de
medicamentos fitoterápicos no país ainda é incipiente, necessitando de um controle
de qualidade mais rigoroso e eficiente. Várias empresas nacionais empregam
matéria-prima vegetal diretamente na elaboração de seus medicamentos. No Brasil
20% da população é responsável por 63% do consumo dos medicamentos
fitoterápicos disponíveis (DI STASI, 1996). Essa alternativa é utilizada tanto dentro
de um contexto cultural, na medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos. Por
isso, os fitoterápicos vêem sendo, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da
indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte (FARIAS et
al, 1994). Várias prefeituras municipais têm estruturado programas de uso de
fitoterápicos, como a prefeitura municipal de Curitiba, que desde 1989, lançou um
programa implantando a fitoterapia nas unidades de saúde do município. Seguindo
este exemplo alguns estados no país vêm realizando a implantação de programas
de fitoterapia na atenção primária à saúde, com o objetivo de conhecer o perfil de
utilização e prescrição dos fitoterápicos (SIMÕES et al, 2001; PORTAL DA SAÚDE,
2009).
Atualmente, o uso de plantas medicinais tem despertado o interesse de
órgãos governamentais na tentativa de utilizar esses produtos como recurso
terapêutico, porém é essencial que o medicamento fitoterápico passe por todo
processo de avaliação da eficácia, toxicidade, testes microbiológicos, ou seja, um
rigoroso controle de qualidade para depois ser comercializado como produto
terapêutico.
A utilização de matérias-primas vegetais para obtenção de uma formulação
fitoterápica não apresentava os critérios definidos de aceitação da qualidade. Foi
somente com a RDC n° 17 de 2000 e RDC n° 48 de 2004 (revoga anterior) que tais
critérios passaram a ser definidos e exigidos. Assim, para desenvolver um
medicamento fitoterápico é preciso planejar e obter preparações intermediárias para
transformação da matéria-prima vegetal em um produto acabado, o qual originará a
apresentação farmacêutica desejada. Tal processo é importante porque o material
inicial para estudo deverá ser estável de modo que garanta a reprodutibilidade do
Discussão
104
processo e suficientemente seco e pulverizado para que se consiga um bom
rendimento no processo de extração dos constituintes químicos de interesse
farmacêuticos (SILVA JÚNIOR, 2006).
Neste trabalho foi realizado o processo de caracterização física, química e
físico-química da droga vegetal e da solução extrativa (tintura) das folhas de H.
indicum L. (Boraginaceae) em virtude da importância que estas determinações
proporcionam na montagem de métodos para controle de qualidade desde o
processo da coleta do material vegetal até a obtenção do produto intermediário e
final.
Dessa forma, o material vegetal foi coletado, higienizado, seco, pulverizado e
armazenado, tendo todas estas etapas devidamente padronizadas para garantir a
reprodutibilidade do processo. A espécie foi coletada no mês de maio de 2008, às 18
horas. Informações sobre época e horário de coleta são importantes, pois as
espécies apresentam épocas específicas em que contêm maior quantidade de
princípios ativos no seu tecido, podendo variar tanto no período de um dia como em
épocas do ano (MARTINS et al, 1995). Este critério é importante no que diz respeito
à qualidade química do produto, pois uma baixa concentração da substância ativa
no material pode levar a uma desconfiança na pureza do produto. Logo, o
conhecimento da época correta de coleta do material desejado leva à obtenção de
produtos de melhor qualidade.
É fundamental todo um aparato técnico-científico no momento da coleta do
vegetal, pois o conhecimento prévio de coleta e manuseio do vegetal até a secagem
é uma maneira de evitar danos às plantas. O recipiente de coleta do material colhido
não deverá danificá-lo, a fim de evitar o esmagamento. E o material vegetal deve
estar protegido da incidência de raios solares, pois estes aceleram sua degradação.
Assim, o material colhido deve ser imediatamente levado ao local de secagem para
impedir reações que destruam os princípios ativos das plantas (CORRÊA JÚNIOR et
al, 1994).
Quando se estuda plantas, a identificação da espécie e sua perpetuação
como testemunho são os passos mais importantes para que qualquer investigação
possa ser reproduzida. Por isso, a espécie vegetal em estudo foi devidamente
Discussão
105
identificada por profissional capacitado e depositada no herbário do Museu
Paraense Emílio Goeldi.
Na preparação do material vegetal, visando uma maior estabilidade química e
a fim de interromper os processos metabólicos que ocorrem mesmo após a coleta da
planta, o material foi submetido a processo de estabilização e secagem. Para a
estabilização do vegetal, este foi imediatamente tratado com solução etanólica 70%
(v/v) de forma a impedir a ação enzimática e, assim, evitar a alteração dos
compostos químicos originalmente presentes no vegetal. Tal processo consistiu na
desnaturação protéica das enzimas celulares, através da destruição das estruturas
quaternárias e terciárias, pela ação de um agente desidratante (etanol). A secagem
do material teve por finalidade a retirada de água e, com isso, impedir reações de
hidrólise e de crescimento microbiano. Após secagem, o material vegetal seco foi
submetido a processo de moagem para reduzi-lo, mecanicamente, a fragmentos de
pequenas dimensões, preparando-o, assim, para a próxima etapa que consisti na
extração.
A determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas de H. indicum
L. foi importante para determinar o grau de divisão do pó expresso pela referência à
abertura nominal da malha do tamis. A droga vegetal recebeu a classificação de pó
grosso pela FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV (1988) (Figura 5, p.75). A
determinação da distribuição granulométrica da droga vegetal é um parâmetro da
eficiência da extração, porque partículas muito finas impedem a absorção do líquido
extrator e diminuem a eficiência da extração. Já partículas de alta granulometria não
apresentam grande superfície de contato, o que também diminui a eficiência da
extração (PÉRTILE, 2007).
A perda por dessecação é um indicativo do teor de material volátil do vegetal e,
indiretamente da umidade residual presente em drogas vegetais (COSTA, 1982). A
perda por dessecação da droga vegetal em estudo é inferior a 14% (Tabela 1, p.76),
logo está dentro do parâmetro estabelecido pela FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV
(1988). O conhecimento sobre perda por dessecação do material vegetal faz-se
importante, pois irá influenciar no processo de conservação que aliado a um
armazenamento adequado, manterá a qualidade da espécie vegetal, a estabilidade
e a preservação de suas propriedades terapêuticas (BRAGA et al, 2007). A
Discussão
106
determinação do teor de água residual presente nas drogas vegetais também
garante um índice da qualidade de sua preparação e da garantia de sua
conservação (COSTA, 1982). Dessa forma, o valor encontrado para a droga vegetal
em estudo encontra-se dentro dos valores estabelecidos pela Farmacopéia
Brasileira IV (1988), indicando uma boa conservação e uma secagem eficiente da
matéria-prima vegetal.
A importância da determinação da perda por dessecação está ligada também à
estabilidade microbiológica da matéria-prima vegetal, como expressão da sua
suscetibilidade ao desenvolvimento de fungos e bactérias, e à estabilidade química,
representada especialmente pelos processos de hidrólise (WHO, 1992). Além de
representar riscos devido à produção de substâncias tóxicas, pode acarretar
destruição e/ou alteração dos princípios ativos tornando-se assim o material vegetal
impróprio ao consumo (AMARAL et al., 2003). A perda por dessecação pode, ainda,
fornecer dados a cerca do rendimento de extração, já que a secagem influi no
estado de integridade das estruturas celulares, expondo-as mais ou menos ao
contato com solventes (HARBORNE et al, 1975). Além do que, sob o ponto de vista
tecnológico e de produção, é importante conhecer quantitativamente o conteúdo de
água presente na matéria-prima, para que este valor seja considerado nos cálculos
de rendimento (DE PAULA, 1996).
A determinação de cinzas totais em material vegetal pode servir como método
para avaliar a pureza do material, detectando a presença excessiva de substâncias
aderentes. É aplicada uma metodologia simples no controle de qualidade da droga
vegetal, permitindo detectar adulterações e evitar a exposição do consumidor ao
risco real do uso de material vegetal inadequado (AMARAL et al., 2003). As cinzas
resultantes da incineração do material vegetal podem ser fisiológicas (derivada dos
componentes minerais da própria planta) e não fisiológicas (derivada da matéria
estranha, como solo, areia que adere à superfície da droga vegetal). Quando estas
cinzas apresentam um teor superior ao indicado pela monografia, geralmente são
referentes a procedimentos de colheita e pós-colheita inadequados (SHARAPIN et
al, 2000).
O resultado encontrado na determinação do teor de cinzas totais para o pó das
folhas de H. indicum L. indica a quantidade de substância residual não-volátil no
processo de incineração (Tabela 1, p.76). Tal valor, apesar de relativamente
Discussão
107
elevado, corrobora com os valores encontrados na literatura para material vegetal
referente à família Boraginaceae (TOLEDO et al, 2003). Entretanto inúmeros fatores
podem alterar esse teor, como aqueles relacionados aos procedimentos de coleta,
secagem e transporte dos materiais, ou mesmo devido às diferenças em termos da
localização geográfica dos materiais analisados (SILVA JÚNIOR, 2006).
A análise térmica tem despertado grande interesse dos pesquisadores e
tecnólogos, principalmente nos últimos anos, devido à utilização deste grupo de
técnicas na caracterização da droga de origem natural ou sintética e também em
alimentos. Pode ser aplicada a materiais como polímeros, fármacos e produtos
cosméticos em geral (ARAGÃO et al, 2002; OLIVEIRA et al, 2004).
Essa metodologia analítica visa substituir os atuais métodos clássicos utilizados
no controle de qualidade de produtos naturais, entre outros fatores por ser uma
metodologia confiável e de rápida execução (ARAGÃO et al, 2002). As técnicas
termoanalíticas também são usadas na área de fármacos e medicamentos para a
aplicação e estudos de estabilidade térmica, compatibilidade fármaco-excipiente e
para determinação da pureza (RODRIGUES et al, 2005; ALVES et al, 2006).
Ressalta-se, ainda, que os resultados obtidos conduzem a parâmetros
relevantes no processamento industrial de fármacos e de medicamentos. E uma das
potencialidades analíticas da termogravimetria é determinar o teor de umidade do
material analisado, por isso, é utilizada no controle biológico para armazenamento.
Pode ser utilizada, também, para determinação do teor de cinzas como indicador da
qualidade de sais minerais e possíveis adulterações do material com compostos
inorgânicos (FELSNER e MATOS, 1998).
As análises termoanalíticas (TG, DTA e DSC) do pó da planta e do extrato
liofilizado foram analisadas na faixa de temperatura de 25 °C a 110 °C próximo da
faixa de temperatura dos métodos convencionais descritos pela Farmacopéia
Brasileira IV (1988), com finalidade de comparar as condições experimentais entre
os métodos convencionais e termogravimétricos. Deu-se preferência pelo processo
de liofilização, pois é mantida uma melhor estabilidade do material, conservando sua
composição química e atividade biológica (AYROSA et al, 2007).
As curvas termogravimétricas (TG, DTA e DSC) obtidas em atmosferas de
nitrogênio mostram perdas de massa e variação de entalpia caracterizada pelos
eventos de decomposição do material analisado. A figura 6 (p.76) mostra um
Discussão
108
primeiro estágio de perda de massa da droga no intervalo de temperatura de 25 °C a
110 °C, que está de acordo com o evento endotérmico ocorrido pela curva DSC da
droga (Figura 7, p.77 e Tabela 3, p.78). Essa perda de massa inicial pode ser
atribuída à desidratação da droga vegetal e evaporação de constituintes voláteis
como os óleos essenciais (WESOLOWSKI et al., 2003). A curva TG do pó da planta
(Figura 6, p.76) mostra eventos que também são observados na curva DSC (Figura
7, p.77) e correspondem à perda de água superficial ou de umidade da droga e/ou
evaporação de compostos voláteis. Com tais dados da análise termogravimétrica e o
resultado do ensaio gravimétrico de perda por dessecação do pó das folhas de H.
indicum L. é possível verificar que a análise termogravimétrica fornece uma
estimativa do conteúdo de água residual presente no material após seu preparo
(SILVA JÚNIOR, 2006) (Tabela 1, p.76 e Tabela 2, p.77).
No segundo estágio de decomposição que se inicia por volta de 240 °C
(Figura 6, p.76; Tabela 2,, p.77), ocorre uma significativa perda de massa, devido à
decomposição térmica de carboidratos e demais compostos orgânicos presentes na
droga e ao início da carbonização do material vegetal (WESOLOWSKI et al.,2003;
ARAÚJO et al, 2006) que é refletida pela curva TG, enquanto ao mesmo tempo a
curva DSC indica fortes eventos exotérmico nessa temperatura (Figura 7, p.77). A
partir de 390 °C, observa-se a terceira etapa de decomposição do material vegetal,
referente à queima de restos carbonizados da matéria orgânica (Figura 6; Tabela 2)
(FARIA et al, 2002).
A curva TG referente ao extrato liofilizado (Figura 13, p.84) mostra uma perda
de massa inicial de 5,3% (Tabela 6, p.84) na faixa de temperatura analisada de 25
°C até 110 °C. Esta perda de massa é simultaneamente acompanhada por um
evento endotérmico verificado pelas curvas DTA e DSC (Figura 14; Tabela 7, p.85).
Tais valores podem ser atribuídos à desidratação do material vegetal e/ou
evaporação de constituintes voláteis, garantindo, assim, uma estabilidade térmica do
extrato nesta faixa de temperatura.
A partir de 200 °C observam-se eventos caracteristicamente exotérmicos
evidenciados pelas curvas DTA e DSC (Figura 14), com um consumo de energia
caracterizando um processo de decomposição térmica do material (Tabela 7). As
curvas TG e DSC na faixa de temperatura de 200 °C a 330 °C mostram uma perda
de massa significativa e um consumo de energia elevado (Figura 13 e 14; Tabela 6 e
Discussão
109
Tabela 7, respectivamente) atribuído provavelmente à queima de material orgânico
presente no extrato liofilizado e acima de 400 °C foi evidenciada a formação de
cinzas do material (Figura 13; Tabela 6).
Com isso, verifica-se por meio das análises térmicas que tanto a droga
vegetal quanto o extrato liofilizado de H. indicum L. apresentam uma boa
estabilidade térmica até 180°C (Figuras 6, p.76 e Figura 13, p.84). Esta informação é
extremamente importante para os testes de estabilidade térmica e compatibilidade
entre as misturas físicas do extrato liofilizado e os adjuvantes farmacêuticos
utilizados no estudo de formulação para o desenvolvimento do gel fitoterápico.
Os espectros de absorção na região do IV referente à droga vegetal e ao
extrato liofilizado de H. indicum L., foram realizados com o objetivo de inferir
informações preliminares sobre os constituintes químicos da planta e assim
forneceram um agregado rico de bandas de absorção (Figura 8, p.78 e Figura 15,
p.86). A análise das bandas características de determinados grupos funcionais de
uma molécula fornece, através de uma análise do espectro e consulta a tabelas de
dados, um conjunto de informações sobre a estrutura da molécula a qual será
utilizada como uma ferramenta importante para o controle de qualidade do marcador
químico presente no extrato (BARBETTA e MAGINI, 2006). Entretanto, o espectro
na região do IV não diferencia normalmente uma amostra pura de uma não pura.
Logo, uma amostra pura apresenta bandas de absorção bem agudas e resolvidas, já
o espectro de um produto bruto que contém muitos tipos diferentes de moléculas
pode apresentar bandas de absorção arredondadas e mal resolvidas devido às
diversas absorções presentes (DYER, 1965).
Pelos espectros da droga vegetal e do extrato liofilizado é possível verificar a
presença de bandas largas na região de 2900-2820 cm
-1
sugerindo a presença de C-
H de alifáticos. A absorção em 1599 cm
-1
e 1573 cm
-1
, nos espectros da droga
vegetal e no extrato liofilizado, respectivamente, sugere a presença de C=O
conjugada de ésteres e a absorção em 1175-1050 cm
-1
relativo a vibrações de
estiramento C-O para anidridos acíclicos (Figuras 8 e 15). Esta faixa de absorção
relativo a grupamento éteres sugere a presença de uma ampla classe de metabólitos
secundários tais como: flavonóides, cumarinas, antraquinonas, alcalóides
quinolínicos e quinolônicos e outros fenil propanóides.
Discussão
110
Com isso, basicamente os mesmo grupamentos funcionais aparecem nos
espectros das duas amostras (droga vegetal e extrato liofilizado) (Figura 16, p.87). A
figura 8 (p.78) relativa ao espectro do pó de H. indicum L. mostra que há absorção
em 3340 cm
-1
, 3270 cm
-1
, 3229 cm
-1
. O espectro na região do IV referente ao extrato
liofilizado (Figura 15, p.86) mostra que também há absorção em 3283 cm
-1
. Esta
faixa de absorção é característica de grupamento funcional hidroxila presente em
muitos constituintes do extrato liofilizado e do etanol presente na solução extratora.
Entretanto, por não se disponibilizar neste trabalho de um padrão de referência dos
alcalóides pirrolizidínicos para comparar as bandas de absorção características dos
grupamentos funcionais de sua estrutura molecular com o espectro do extrato
liofilizado de H. indicum L. torna-se dificultada a interpretação da estrutura do
marcador químico no extrato, uma vez que o extrato de H. indicum L. é composto de
inúmeras substâncias orgânicas.
Analisando os espectros da droga e do extrato (Figura 16, p.87) é possível
verificar grupos funcionais presentes na droga vegetal, que também são observados
no extrato. O espectro do extrato liofilizado mostra um aumento nos sinais de
absorção quando comparados ao espectro da droga. Assim, é observado um
aumento na intensidade das bandas no intervalo de 3200-3400 cm-
1
, 2400-3200 cm
-
1
, 1300-1450 cm
-1
e 1010-1220 cm
-1
do extrato liofilizado, que pode está relacionado
à extração dos constituintes químicos da matriz celular.
A avaliação da qualidade de uma tintura inicia-se com a análise da matéria-
prima ou droga vegetal utilizada para sua obtenção, atentando-se principalmente
para identificação botânica ou zoológica (DESMICHELLE, 1987). Após o processo
de produção, as tinturas devem passar por vários ensaios, dentre eles: a
identificação, observação de características organolépticas, determinação da
densidade, do resíduo seco e do teor alcoólico e doseamento de compostos
marcadores (FONSECA e LIBRANDI, 2008). Tais ensaios são importantes para
assegurar a qualidade, atendendo a uma especificação pré-estabelecida. Seguindo
este entendimento, na caracterização e no controle de qualidade da tintura obtida a
partir do pó de H. indicum L. o valor da densidade aparente se manteve dentro do
limite preconizado para tinturas fitoterápicas (0,87 a 0,98 g/cm
3
) (PRISTA et al,
1990). A tintura apresenta um caráter neutro (Tabela 4, p.79), tal resultado é
determinante na escolha dos adjuvantes empregados na formulação fitoterápica,
Discussão
111
pois é um fator que influencia na estabilidade de formulações (MACIEL et al, 2006).
A determinação do resíduo seco é um parâmetro fundamental e preliminar quando
se objetiva alcançar a eficácia de uma formulação fitoterápica, pois este ensaio
implica na quantificação das substâncias extraídas da planta através da eliminação
do solvente extrator, e é um indicativo da concentração da tintura de H. indicum L.
(OLIVEIRA e BERRETTA, 2007).
A prospecção química do extrato bruto revela a presença de classes de
metabólitos secundários como fenóis, taninos, carotenóides e indicativo de
esteróides e triterpenóides (Tabela 5, p.80). Estes resultados corroboram com as
classes de metabólitos encontrados na literatura para esta espécie (GUERRERO,
1994; PANDEY et al, 2007). Porém, o extrato bruto não apresenta reação de
precipitação com os reagentes específicos para alcalóides. Entretanto, a fração
alcaloídica revela a reação caracterizada pelo surgimento de um precipitado com
coloração vermelha alaranjado após adição do reagente de Dragendorff, indicando a
presença de alcalóides na espécie em estudo.
Também pela prospecção química foi verificada a presença de taninos no
extrato. Os taninos têm relevância na utilização da espécie por causa da sua
propriedade cicatrizante relatada pela medicina tradicional, pois os taninos são
responsáveis pela formação de uma camada protetora (constituída por um complexo
tanino-proteína e/ou polissacarídeo) sobre a pele ou mucosa danificada. A formação
desta camada, portanto, favorece o processo de cicatrização (SANTOS e MELO,
2004).
Uma das principais técnicas preliminares para separação de substâncias
presente no extrato vegetal é a cromatografia em camada delgada, pois é uma
técnica simples, rápida e de baixo custo (SIMÕES et al, 2001). O perfil
cormatográfico obtido por CCD mostrou a separação das substâncias presentes na
fração alcaloídica (FA) e na fração hexânica (FH) e a reação destas frações com
reagente de Dragendorff (Figura 9; Figura 10, p.81), sugerindo se tratar de
alcalóides. O sistema eluente CHCl
3
:CH
3
OH na proporção 90:10 em atmosfera de
NH
4
OH foi o que melhor separou as substâncias da FA (Figura 9). A substância com
Rf de 0,84 apareceu em ambos os cromatogramas das frações FA e FH. Para se
obter um valor de Rf considerado ótimo de um extrato bruto ou fração bruta é
preciso adequar as condições cromatográficas até poder visualizar a mancha
Discussão
112
escolhida numa altura superior a um quarto e inferior a um terço do caminho
percorrido pelo eluente na cromatoplaca (BARBOSA, 2001).
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma das técnicas mais
utilizadas para análise e isolamento de produtos naturais a partir de matrizes
complexas como, por exemplo, os extratos de plantas (QUEIROZ e
HOSTETTMANN, 2006). Por isso, a CLAE tem sido utilizada de maneira rotineira
como método “piloto” para o isolamento em escala preparativa de produtos naturais
pela otimização das condições experimentais, pelo controle de diferentes frações
obtidas durante o isolamento e pelo controle de pureza final dos compostos isolados
(KINGSTON, 1979; ARSLANIAN e STERMITZ, 1991; GRÄNICHER et al, 1994).
Assim, a utilização de cromatogramas como a “impressão digital” de uma
determinada amostra, poderá ajudar na identificação de amostras autênticas e
auxiliar na identificação de possíveis compostos utilizados em uma adulteração da
mesma.
Os cromatogramas obtidos através da CLAE permitem verificar que o pico com
absorção máxima ocorreu em 250 nm e apresentou um tempo de retenção de 1,60
min referente ao extrato bruto e se repetiu na fração alcaloídica e na fração hexânica
com Rt=1,73 min (Figura 11, p.82). Portanto, a substância que se apresenta na
fração alcaloídica também pode estar presente na fração hexânica, o que já havia
sido observado pela CCD (Figura 9 e 10, p.81). Ao analisarmos os espectros na
região do ultravioleta referente ao extrato de H. indicum L. e sua fração alcaloídica é
notável a semelhança entre esses espectros, apresentando uma correlação de
0,9657 (Figura 12, p.83). Entretanto, pela falta de uma substância de referência ou
uma substância padrão dos alcaloídes pirrolizidínicos nesse trabalho, houve a
impossibilidade em se fazer um estudo minucioso para validação desse marcador
químico presente na tintura.
Na CLAE acoplada à detecção ultravioleta (CL-UV) o nível de informação
estrutural obtido da substância é limitado pelo tipo de detector acoplado à CLAE,
pois os detectores baseados em absorção de luz ultravioleta, fluorescência, índice
de refração, difração de luz e eletroquímica proporcionam uma boa detecção e
sensibilidade, porém pouca ou nenhuma informação estrutural da substância
analisada (QUEIROZ e HOSTETTMANN, 2006). Por isso a introdução das técnicas
Discussão
113
de acoplamento tais como CL/UV equipada com uma rede de detecção por
fotodiodos (CL/UV-DAD) proporcionou um real avanço na identificação estrutural de
produtos naturais (LINDON et al, 1997). E os espectros no UV dos produtos naturais
podem dar informações úteis sobre a classe de substâncias presentes na amostra
analisada.
Embora as indústrias farmacêuticas venham produzindo novos antibióticos e
modificando algumas drogas já existentes, as estatísticas mostram que a resistência
a essas moléculas pelos micro-organismos está em contínuo crescimento. Tal fato
tem causado preocupação, pois cresce o número de pacientes em hospitais que tem
a imunidade suprimida com concomitante surgimento de linhagens de bactérias e
fungos as quais apresentam novos perfis de resistências a antimicrobianos. Por isso,
as buscas de novas substâncias com potencial atividade antimicrobiana nas plantas
vêem crescendo consideravelmente nos últimos anos. Segundo a OMS as plantas
medicinais são a melhor fonte para se obter uma variedade de drogas e cerca de
80% da população mundial usa a medicina tradicional na busca de alívio de alguma
sintomatologia dolorosa ou desagradável (NASCIMENTO et al, 2000; CAETANO et
al, 2002; SANTOS et al, 2007)).
Os ensaios da atividade antimicrobiana in vitro mostram que o extrato bruto
das folhas de H. indicum L. inibiu o crescimento das cepas gram-positivas, mas não
foi capaz de inibir as cepas gram-negativas. O extrato bruto inibiu o crescimento da
cepa de S. aureus nas concentrações de 500 mg/mL e 250 mg/mL, mas não
apresentou atividade frente as cepas de P. aerugiona, E. coli e C. albicans em
nenhuma concentração analisada (Figura 17; Tabela 9, p.88). A capacidade de
inibição do crescimento bacteriano do extrato de H. indicum L. frente à cepa gram-
positiva pode estar diretamente relacionada com a estrutura da parede celular
destes micro-organismos, pois esta é uma das principais características que separa
os dois grupos de bactérias. Também pode ser devido à presença da membrana
externa das cepas gram-negativas, pois ela age como uma barreira para certos tipos
de antibióticos, enzimas digestivas e metais pesados (TORTORA et al, 2003;
SANTOS et al, 2007).
O extrato hidroalcoólico apresenta uma atividade antimicrobiana relativamente
baixa que pode ser atribuída ao fato de trabalharmos com o extrato bruto, ou seja,
Discussão
114
uma mistura de substâncias que podem estar contribuindo para esta atividade (e
outras que não têm atividade antimicrobiana). Logo, estas substâncias não devem
estar numa quantidade suficiente para ser detectada uma ótima atividade
antimicrobiana da espécie.
Em estudos com a espécie Heliotropium ellipticum foi verificado um amplo
espectro e uma elevada atividade antimicrobiana, utilizando a fração hexânica do
extrato etanólico, constatando que a substância β-amirina apresentou a maior
atividade antimicrobiana, enquanto que o acetato de β-amirina foi o mais ativo para
atividade antifúngica (JAIN et al, 2001). Como a espécie em estudo neste trabalho
(H. indicum) também possui a substância β-amirina na sua composição (SINGH et
al, 2003), sugere-se que esta substância possa contribuir para a atividade
antimicrobiana de H. indicum L.
A importância do extrato bruto de H. indicum L. em apresentar inibição no
crescimento da cepa de S. aureus está relacionado principalmente ao fato dessa
espécie de bactéria ser responsável por causar abscessos e várias infecções
piogênicas em humanos e ainda, mais de 90% destes cocos gram-positivos contêm
plasmídeos que codificam β-lactamase, uma enzima que degrada muitas penicilinas
disponíveis para tratamento (LEVINSON e JAWETZ, 2005). Hughes (1976) e Mason
(1991), citado por Carlos, 2007 ao encontrarem apenas 15% de cepas sensíveis,
consideraram inadequada a terapia com penicilinas para este micro-organismo.
Zavadinack-Netto e col. (2001) concluíram que o S. aureus é resistente às
penicilinas in vitro, por isso estas não devem ser utilizadas como alternativas
terapêuticas.
Os resultados referentes à atividade antimicrobiana do extrato bruto de H.
indicum frente às cepas de S. aureus demonstram, portanto, que a espécie em
estudo apresenta atividade antimicrobiana, tornando relevante este estudo no que
diz respeito ao uso de antimicrobianos para uso tópico.
Os estudos de planejamento/formulação do gel fitoterápico contendo tintura
de H. indicum L. foram realizados para avaliar a viabilidade do seu desenvolvimento
tecnológico. A escolha do gel à base do polímero hidroxietilcelulose para
incorporação do extrato liofilizado de H. indicum L. foi feita devido as propriedade
físico-químicas do polímero, pois este é de natureza não-iônica, é estável em uma
Discussão
115
ampla faixa de pH e apresenta facilidade de aplicação e fácil espalhabilidade sobre a
pele (MAIA CAMPOS, 2002; CORRÊA et al, 2005).
A termogravimetria (TG) permite registrar as variações de massa em função
do tempo do ciclo de aquecimento e arrefecimento e/ou temperatura, por isso, as
curvas obtidas podem fornecer informações referentes à estabilidade térmica da
formulação. Visto que, a estabilidade e a biodisponibilidade dos fármacos podem
ocorrer devido a interações entre fármacos e adjuvantes nas diferentes formas
farmacêuticas. A análise térmica diferencial (DTA) associada à termogravimetria
(TG) é bastante útil nos estudos de formulação, na investigação e predição de
incompatibilidades físico-químicas entre fármacos e adjuvantes farmacêuticos
(ALVES, 2007).
As curvas TG dos excipientes hidroxietilcelulose, metilparabeno e
propilenoglicol comparadas com as curvas TG de suas misturas binárias com o
extrato liofilizado de H. indicum L. apresentam comportamentos térmicos particulares
observados pela perda de massa da amostra nos intervalos de temperatura
analisados (25 °C a 600 °C) (Figura 18, p.89, Figura 21, p.92 e Figura 24, 95).
Entretanto a DTA e DSC mostram que houve um evento endotérmico, até 180 °C,
em todas as curvas DTA e DSC do extrato e das misturas binárias
(extrato/excipientes) (Figuras 19, p. 90; Figura 20, p. 91; Figura 22; Figura 23, p. 93;
Figura 25 e Figura 26, p. 96).
Nas curvas DTA do extrato liofilizado e das misturas binárias dos excipientes
com extrato liofilizado (Figura 19, p. 90; Figura 22, p. 93 e Figura 25, p. 96) é
evidenciada a presença de um pico ascendente após a temperatura de 500 °C,
caracterizando um evento exotérmico, confirmando a autenticidade do extrato nas
preparações e manutenção das suas propriedades físicas. Tal evento pode
funcionar como uma assinatura termodinâmica, ou seja, uma característica do
extrato de H. indicum L. para controle de qualidade de produtos contendo-o em sua
composição.
A hidroxietilcelulose (HEC) é um polímero gelificante formador de gel não-
iônico, tem ponto de fusão entre 135 °C a 140 °C e decompõem-se a temperatura de
205 °C a 210 °C (PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 2001), é útil como veículo para
diversos princípios ativos (CORRÊA, 2005). A curva TG da mistura física do extrato
Discussão
116
liofilizado com a HEC (1:1 p/p) mostra que não houve mudança significativa na faixa
de temperatura de 25 °C a 110 °C (Figura 18, p.89), quando comparada com as
curvas do extrato liofilizado e HEC isolados (Tabela 10, p.90). Os resultados obtidos
inferem uma compatibilidade física entre a HEC e o extrato liofilizado, pois a mistura
manteve um comportamento térmico semelhante dos compostos isolados.
Comparando-se as curvas por DTA e DSC da hidroxietilcelulose e da mistura
física (extrato/HEC 1:1 p/p) (Figuras 19 e 20, p. 90 e 91 respectivamente) é possível
verificar que não há mudanças significativas nos eventos térmicos na faixa de
temperatura de 25°C a 110°C, pois os eventos térmicos ocorridos nesta faixa de
temperatura são característicos de uma deflexão inicial proporcional à capacidade
calorífera, seguida de evaporação da umidade da amostra (ALVES, 2008).
O metilparabeno é usado como conservante da formulação, é um pó
cristalino, fino, branco e praticamente inodoro, muito usado como conservante
fungicida (FARMACOPÉIA BRASILIERA III, 1977). É um conservante bastante
empregado em formulações cosméticas e farmacêuticas, possui um amplo espectro
de ação contra bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos. Tem ponto de
fusão em 125 °C a 128 °C e faixa de ebulição de 270 °C a 280 °C (FARMACOPÉIA
BRASILIERA IV, 1988; PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 2001).
A curva TG da mistura física (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) apresenta um
comportamento térmico semelhante ao do extrato liofilizado, pois suas perdas de
massa ocorrem em três etapas (Figura 21, p.92). A primeira etapa de perda de
massa da mistura física ocorre no intervalo de temperatura de 25 °C a 110 °C, com
percentual de perda de massa 3,83% (Figura 21, Tabela 12, p.92). Este resultado
revela uma melhora da estabilidade térmica do extrato liofilizado quando misturado
fisicamente com o metilparabeno, pois o extrato quando analisado
independentemente apresenta um percentual de termodecomposição de 5,3% na
mesma faixa de temperatura (Tabela 12, p.92).
As curvas DTA da mistura física (extrato/metilparabeno 1:1 p/p) (Figura 22,
p.93) mostram a manutenção das características do extrato liofilizado quando
misturado fisicamente com o metilparabeno. Entretanto, há uma alteração no valor
de variação da temperatura de 240,24 J/g do metilparabeno para 94,05 J/g da
mistura binária, na faixa de temperatura de 80 °C a 130 °C (Tabela 13, p.94). Os
Discussão
117
eventos térmicos que ocorreram nesta faixa de temperatura foram de pequenas
alterações, provavelmente devido às misturas físicas, sugerindo que não há
ocorrência de interações entre os mesmos (BAZZO e SILVA, 2005).
O propilenoglicol é um líquido incolor, viscoso e higroscópico, é usado como
adjuvante farmacêutico, solvente, agente plastificante e umectante. O propilenoglicol
é muito usado em formulações farmacêuticas de uso externo, pois diminui a
agressividade do álcool e ainda promove a hidratação da pele. Tem ponto de fusão
de -60 °C e faixa de ebulição de 187 °C a 189 °C (FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV,
1988; PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, 2001).
A curva TG da mistura física do extrato liofilizado com o propilenoglicol 1:2 p/p
(Figura 24, p.95) mostra que na faixa de temperatura de 25 °C até 140 °C a mistura
física (extrato/propilenoglicol 1:2 p/p) apresenta uma perda de massa inferior a perda
de massa observada pelo propilenoglicol puro. Esta perda de massa do
propilenoglicol puro ocorre em apenas uma etapa de termodecomposição (Figura 24;
Tabela 14, p.95).
As curvas DTA da mistura física do extrato com o propilenoglicol 1:2 p/p
(Figura 25, p.96) mostram que ocorreu um evento descendente, caracterizando um
evento endotérmico até a temperatura de 150 °C. Este evento é verificado nas três
curvas, referente ao extrato liofilizado, a mistura binária e ao propilenoglicol puro,
sendo o pico com maior área apresentado pelo propilenoglicol puro (Figura 25,
p.96). É verificada uma diferença no valor da variação de temperatura com aumento
do valor de entalpia do propilenoglicol puro de 823,46 J/g para 1160,37 J/g para a
mistura do extrato com o propilenoglicol (Tabela 15, p.97). Nas curvas DSC do
extrato liofilizado e da mistura física observam-se eventos discretos e descendentes
(Figura 26, p.96), que não ocorre na curva DSC do propilenoglicol puro,
apresentando evento em menor quantidade após 200 °C e com pico mais
acentuado.
A análise espectrofotométrica na região do IV, em conjunto a outras técnicas
analíticas, é importante para monitorar os estudos de pré-formulação auxiliando na
seleção de componentes da formulação (ZARONI, 2006). Dessa forma, a aplicação
desta técnica analítica neste trabalho teve a finalidade de avaliar possíveis
Discussão
118
incompatibilidades do extrato liofilizado de H. indicum L. com os componentes
escolhidos na formulação proposta.
Os espectros na região do IV dos adjuvantes puros, quando comparados com
os espectros obtidos de sua mistura física com o extrato liofilizado, revelam que não
há modificações significativas no perfil de absorção (Figuras 27, 28 , p.98 e Figura
29, p.99). Também é notável que as bandas de absorção presentes nos espectros
dos adjuvantes puros e de suas misturas físicas coincidem com as bandas de
absorção presentes no espectro do extrato liofilizado, sugerindo a ausência de
interação entre os componentes da formulação (ZARONI, 2006).
O estudo de estabilidade preliminar consiste na realização do teste na fase
inicial do desenvolvimento do produto, empregando-se condições extremas de
temperatura (estresse térmico), com o objetivo de acelerar possíveis reações entre
seus componentes e o surgimento de sinais de instabilidade que devem ser
observados e analisados conforme as características específicas de cada tipo de
produto (BRASIL, 2004; BABY et al, 2008; ISAAC et al, 2008). Após 24 h do preparo
da formulação, esta foi submetida à avaliação preliminar da estabilidade,
empregando-se os testes de centrifugação e do estresse térmico.
Para Bilia e colaboradores (2001), o estudo de estabilidade representa uma
parte indispensável para o ensaio de produtos farmacêuticos e cosméticos, pois a
instabilidade das preparações modifica os requisitos qualidade, eficácia e
segurança. O teste de estabilidade preliminar serviu como orientação para o
desenvolvimento da formulação, a qual foi submetida a centrifugação e a condições
extremas de temperatura com o objetivo de acelerar possíveis processos de
instabilidade na formulação.
A formulação desenvolvida foi analisada macroscopicamente. Após 24 h de
repouso, o gel macroscopicamente não apresenta alterações físicas e apresenta cor
verde claro, com o odor característico da tintura de H. indicum L. A aparência clara
do gel facilita a aceitabilidade dos pacientes ao tratamento com formulações semi-
sólidas, pois pesquisas já demonstraram a preferência dos pacientes em utilizar géis
transparentes, uma vez que os géis com coloração escura dão a idéia de que podem
manchar a pele (LIEBERMAN et al, 1996).
Discussão
119
O teste de centrifugação tem caráter eliminatório e foi realizado para
avaliação da estabilidade preliminar da formulação. Assim, após a amostra ter sido
submetida a uma força centrípeta de 3000 rpm por 30 minutos, esta manteve sua
característica física, ou seja, não houve qualquer sinal de instabilidade na
formulação, que poderia ser observado pela desestruturação da cadeia polimérica
do gel. Entretanto, a ausência de sinais de instabilidade no gel nesse teste não
assegura sua estabilidade, somente indica que o produto pode ser submetido, sem
necessidade de reformulação, ao teste do estresse térmico (BRASIL, 2004; ISAAC
et al, 2008; LIMA et al,2008).
Durante o estudo de estabilidade, os resultados obtidos na avaliação da
formulação foram considerados satisfatórios, pois a preparação semi-sólida
permaneceu estável durante os dias de avaliação, visto que não se identificou sinais
de instabilidade como sinérese, ou seja, separação espontânea de um sistema
coloidal em duas fases: gel e líquido, alteração de cor, odor e da aparência da
homogeneidade.
A determinação do pH foi o parâmetro utilizado para avaliação do teste do
estresse térmico, o qual foi submetido o gel contendo tintura de H. indicum L. Assim,
verifica-se pela figura 30 que o gel apresenta uma variação inicial no valor de pH da
amostra submetida à temperatura ambiente e da amostra submetida à estufa. A
partir do segundo dia de experimento, as amostras apresentaram uma queda no
valor do pH mantendo um valor em torno de 5,5 durante todos os dias até o final do
experimento (Figura 30, p.100). Portanto, não houve alteração significativa no valor
de pH do gel após o teste do estresse térmico, assim, a base gelificante de HEC a
1,5% permaneceu estável a mudanças de temperatura, caracterizando-a em mais
um indicativo primário de estabilidade da formulação.
Tais estudos preliminares de estabilidade de uma formulação semi-sólida
ajudam a obtenção de resultados satisfatórios para desenvolvimento de uma
formulação estável em um curto intervalo de tempo. Porque é comum no
desenvolvimento de uma formulação farmacêutica semi-sólida ocorrer
incompatibilidades entre os princípios ativos e os excipientes da formulação (ISAAC
et al, 2008; LIMA et al, 2008). Particularmente nas formulações fitoterápicas do tipo
gel as incompatibilidades podem ocorrer entre o polímero formador do gel e os
Discussão
120
outros constituintes da formulação, principalmente após a incorporação de extratos
ou tinturas gerando processos de incompatibilidades como: turbidez, precipitação,
cristalização, alteração de cor, alteração de odor, desestruturação da cadeia
polimérica (ISAAC et al, 2008).
A análise reológica vem sendo muito aplicada na área farmacêutica com
particular interesse em preparações semi-sólidas, as quais sofrem fortes influências
quanto ao espalhamento e a aderência na pele, extrusão das embalagens e
liberação de princípios ativos. O interesse em usar este parâmetro analítico foi de
avaliação do comportamento reológico da formulação. A figura 31 (p.101) mostra
que a formulação apresenta perfil de corpos fluidificantes devido a uma redução de
resistência do material ao escoamento quando a velocidade é aumentada. Há
relatos de que materiais com este perfil quando em repouso apresentam estruturas
reticulares que podem ser constituídas por aglomerados de moléculas que se atraem
ou por uma rede de cadeias poliméricas emaranhadas (ALMEIDA e BAHIA, 2003).
As curvas ascendentes e descendentes do gel se sobrepõem apresentando
uma pequena área de histerese (Figura 32, p.101), entretanto a recuperação da
viscosidade inicial é mais rápida o que sugere a presença de um componente
viscoelastico na formulação. A literatura classifica a hidroxietilcelulose como agente
doador de viscosidade em formulações semi-sólidas, com comportamento
viscoelastico (MINER, 1993).
121
7.CONCLUSÃO
Conclusão
122
7. Conclusões
7. Conclusões 7. Conclusões
7. Conclusões
Com os resultados obtidos no trabalho podemos concluir que:
O material vegetal passou por procedimentos de colheita e pós-colheita
adequados, garantindo a reprodutibilidade do processo e manutenção de sua
estabilidade química.
A droga vegetal foi classificada como pó grosso, pois a maior quantidade de
massa retida foi encontrada no tamis com abertura de malha de 355 µm.
A droga vegetal apresentou teor de perda por dessecação dentro dos
parâmetros estabelecidos pela Farmacopéia Brasileira, indicando que os
procedimentos de colheita e pós-colheita foram adequados e garantiram boa
conservação e secagem eficiente da matéria-prima vegetal.
O resultado da determinação do teor de cinzas totais do pó das folhas de
Heliotropium indicum L. corrobora com os valores encontrados na literatura para
material vegetal pertencente à família Boraginaceae.
Pela análise térmica foi possível constatar que a droga vegetal e o extrato
liofilizado apresentaram boa estabilidade física até 180°C e revelaram valores de
perda de umidade muito próximos ao valor obtido pelo método gravimétrico de
perda por dessecação.
Os espectros de absorção na região do infravermelho do pó e do extrato
liofilizado mostram que houve um aumento na intensidade das bandas de absorção
e que pode está relacionado à extração dos constituintes químicos da matriz
celular.
A prospecção química do extrato bruto mostrou reação negativa para a classe
de alcalóides. A fração alcaloídica foi positiva para alcalóides, indicando que o
resultado do extrato bruto foi mascarado pela presença de corantes naturais ou
encobertas por substâncias majoritárias como ácidos graxos.
As CCD das frações mostraram reação positiva após revelação com reagente
de Dragendorff e o sistema eluente que melhor separou as substâncias foi
CHCl
3
:CH
3
OH na proporção de 90:10 em atmosfera de NH
4
OH.
Conclusão
123
O perfil cromatográfico do extrato bruto e de suas frações obtido por CLAE
mostraram que o pico observado no extrato referente ao Rt=1,60 min. é observado
nas frações alcaloídica e hexânica com Rt=1,73 min. Sugerindo-se tratar da
mesma substância química.
O extrato bruto das folhas de H. indicum L. apresentou inibição no
crescimento da cepa de Staphylococcus aureus. Confirmando, portanto, que a
espécie em estudo apresenta uma importante atividade antimicrobiana como foi
relatado pelo uso tradicional.
As análises termogravimétricas e espectroscópicas na região do infravermelho
das misturas físicas do extrato liofilizado com os adjuvantes farmacêuticos
utilizados no desenvolvimento da formulação fitoterápica não apresentaram
incompatibilidade física e não houve modificações significativas no perfil de
absorção entre os compostos analisados.
O gel fitoterápico manteve-se estável após sua preparação. Não houve
desestruturação da cadeia polimérica após a submissão do gel a força centrípeta e
este permaneceu estável após sofrer ação do estresse térmico e apresentou
características de corpos fluidificantes.
124
8.
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