( PDF ) Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA APLICADA

ANGELA DE GÓES LARA CARDOZO COSTA

ESTUDO QUÍMICO DE Baccharis dracunculifolia DC. E SUA CORRELAÇÃO COM

A PRÓPOLIS DE UMA MICRORREGIÃO DOS CAMPOS GERAIS DO PARANÁ

PONTA GROSSA

2009

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ANGELA DE GÓES LARA CARDOZO COSTA

ESTUDO QUÍMICO DE Baccharis dracunculifolia DC. E SUA CORRELAÇÃO COM

A PRÓPOLIS DE UMA MICRORREGIÃO DOS CAMPOS GERAIS DO PARANÁ

Dissertação apresentada para a obtenção do

grau de Mestre em Química Aplicada,

Programa de Pós-Graduação em Química

Aplicada, Universidade Estadual de Ponta

Grossa.

Orientador

Prof. Dr. Domingos Sávio Nunes

PONTA GROSSA

2009

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Ficha Catalográfica Elaborada pelo Setor de Processos Técnicos BICEN/UEPG

Costa, Angela de Góes Lara Cardozo

C837e Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua

correlação com a própolis de uma microrregião dos Campos Gerais

do Paraná. / Angela de Góes Lara Cardozo Costa. Ponta Grossa,

2009.

76 f.

Dissertação (Mestrado em Química Aplicada) - Universidade

Estadual de Ponta Grossa.

Orientador : Prof. Dr. Domingos Sávio Nunes

1. Baccharis dracunculifolia . 2. Óleo essencial. 3. Própolis

regionais. 4. Atividade antioxidante. 5. CLAE . I. Nunes,

Domingos Sávio. II. T .

CDD: 547

À minha mãe e primeira professora Terezinha, que ainda hoje com sua paciência e sabedoria tem

me ensinado muito. Ao meu esposo e meus filhos Cecília, Pedro Henrique e João Alfredo que

com seus encantos tem feito minha vida melhor.

À minha pequena Natália, luz do meu caminho.

AGRADECIMENTOS

A DEUS, pela vida.

À Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Ao Prof. Dr. Domingos Sávio Nunes, pela orientação e confiança em mim depositada, por

abrir as portas que possibilitaram a melhoria do trabalho e pelo rigor científico em conduzir a

realização do mesmo.

À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Química Aplicada e a todos os professores

da área pelos ensinamentos durante as disciplinas cursadas.

Ao Prof. Dr. Severino Matias de Alencar, da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

(ESALQ) pelas orientações e por proporcionar a realização das análises em CLAE.

À Prof. Drª Mariza Boscacci Marques pela colaboração nas análises antioxidantes.

Ao Prof. Dr. Gert Atschbach pela classificação botânica.

Ao Prof. Dr. Alberto Wisniewski Junior, do Instituto de Pesquisas Tecnológicas de Blumenau

– IPT-FURB-SC, pelos dados fornecidos das análises por CG-EM.

Ao Prof. Dr. Ricardo Antonio Ayub e Profª Dra. Carolina Weigert Galvão, do Laboratório de

Biotecnologia – UEPG, pela utilização do espectrofotômetro nas leituras das amostras.

Aos alunos de iniciação científica Ana Paula I. Malaquias e Renato Marques.

Aos servidores e funcionários do CIPP e da UEPG.

Aos colegas de mestrado cuja amizade que se formou permitiu a conquista desta vitória.

Aos amigos e familiares pelo apoio e incentivo no decorrer desta caminhada.

A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização desta pesquisa.

“Se as coisas são inatingíveis... ora!

Não é motivo para não querê-las...

Que tristes os caminhos, se não fora

a presença distante das estrelas!

(Mário Quintana)

RESUMO

Neste trabalho, foram analisados extratos de amostras de própolis e de folhas de espécies

vegetais do gênero Baccharis da região de Ponta Grossa – PR, visando classificar a própolis

regional em comparação com a própolis verde (PG12). Baccharis dradunculifolia, a fonte da

própolis verde, pode apresentar variações metabólicas relacionadas a fatores ambientais. Para

comparar dados publicados sobre esta planta com dados obtidos do vegetal coletado nesta

região, foram analisados por CG-EM os óleos essenciais obtidos por hidrodestilação das

folhas de espécimes feminino (0,81%) e masculino (0,85%) de B. dracunculifolia colhidos na

estação seca. As duas amostras apresentaram baixa razão monoterpenos/sesquiterpenos

(0,85/96,88% ♀; 2,35/95,25% ♂). Foram identificados os monoterpenos β-pineno, limoneno

e terpinen-4-ol. Os sesquiterpenos hidrocarbonetos principais foram: β-cariofileno (♀ 7,88%;

♂ 8,88%), α-humuleno (♀ 4,61%; ♂ 2,18%), germacreno D (♀ 5,53%; ♂ 4,04%), trans-β-

guaieno (♀ 7,98%; ♂ 6,06%) e δ-cadineno (♀ 7,34%; ♂5,48%). Os sesquiterpenos

oxigenados (E)-nerolidol (♀ 24,69%; ♂ 17,16%) e espatulenol (♀ 14,62%; ♂ 21,39%) se

encontraram como constituintes majoritários. O alto rendimento, a baixa relação

monoterpenos/sesquiterpenos e as altas proporções de sesquiterpenos oxigenados são as

principais características do óleo essencial de B. dracunculifolia desta região. As folhas de

três espécies de Baccharis (B. dracunculifolia, B. semiserrata e B. uncinella) foram extraídas

em aparelho Soxhlet com a sequência de solventes clorofórmio, acetato de etila e metanol,

analisando-se os extratos por CCD, UV e CLAE. Foram identificados os ácidos fenólicos

livres: ácido caféico (Bd ♀ e Bd ♂), ácido p-cumárico (Bd ♀), ácido ferúlico (Bd ♀, Bd ♂,

Bu e Bs) e o flavonóide rutina (Bd ♀, Bd ♂, Bu). Assim, demostrou-se, pela primeira vez, a

co-ocorrência de substâncias fenólicas polares nestas três espécies vegetais. Os extratos

etanólicos obtidos de 13 amostras de própolis foram analisados por CCD-AR e UV-VIS,

permitindo classificar as própolis regionais em três grupos. Foi escolhida a amostra mais

característica de cada grupo (ADI, WS-3, RS-2) para análise por CLAE em comparação com

a própolis verde PG12. Brotos frescos dos espécimes masculino e feminino de B.

dracunculifolia foram extraídos por enxágüe com metanol e também submetidos à análise por

CLAE. Todos os extratos, de própolis e de B. dracunculifolia, apresentaram artepilina C

garantindo que esta é a fonte vegetal da própolis regional. Os ácidos caféico, ferúlico e p-

cumárico foram identificados nas quatro amostras de própolis. Apigenina estaria presente

somente nas própolis regionais, entre 2,4% e 3,9%, enquanto a crisina foi identificada

somente na PG12, mas como componente principal (18,1%). Um flavonoide (λ

máx

365 nm,

42,96 min) é a substância principal das três amostras de própolis regionais e também do

extrato obtido por enxágue dos brotos da planta, mas não foi identificado. Todos os extratos

etanólicos de própolis regionais apresentaram excelentes níveis de atividade antioxidante

quando testados frente ao radical DPPH, vários deles chegando a ser mais efetivos que o da

PG12. Uma análise comparativa do poder antioxidante e da composição química das amostras

permitem concluir que o flavonóide não identificado é o responsável pela fortíssima atividade

antioxidante de ADI e WS-2 em comparação com RS-2 e PG12.

Palavras-chave: Baccharis dracunculifolia; óleo essencial; própolis regionais; atividade

antioxidante; CLAE.

ABSTRACT

This study aimed to chemically analyze extracts of propolis samples and leaves of plant

species of the Baccharis genus in the region of Ponta Grossa - PR, to classify the regional

propolis compared to the green propolis (PG12). Baccharis dracunculifolia, the source of

green propolis, may present metabolic changes related to environmental factors. To compare

with published data, the essential oils obtained by hydrodistillation from the leaves of female

(0.81%) and male (0.85%) specimens of B. dracunculifolia harvested in the dry season were

analyzed by GC-MS. The two samples showed a low monoterpenes/sesquiterpenes ratio

(0.85/96.88% ♀; 2.35/ 95.25% ♂). The monoterpenes β-pinene, limonene and terpinen-4-ol

were identified. The main sesquiterpenes hydrocarbons are β-caryophyllene (♀ 7.88%; ♂

8.88%), β-humulene (♀ 4.61%; ♂ 2.18%), germacrene D (♀ 5.53%; ♂ 4.04%) trans-β-

guaiene (♀ 7.98%; ♂ 6.06%) and cadinene (♀ 7.34%; ♂ 5.48%). The oxygenated

sesquiterpenes (E)-nerolidol (♀ 24.69%; ♂ 17.16%) and spathulenol (♀ 14.62%; ♂ 21.39%)

were found as the major constituents. The high yield, the low monoterpenes / sesquiterpenes

ratio and the high proportions of oxygenated sesquiterpenes are the main characteristics of the

essential oil of B. dracunculifolia from this region. The leaves of three species of Baccharis

(B. dracunculifolia, B. semiserrata and B. uncinella) were extracted using a Soxhlet apparatus

with the sequence of solvents chloroform, ethyl acetate and methanol, and the extracts were

analyzed by TLC, UV and HPLC. Free phenolic acids were identified: caffeic acid (Bd ♀ and

Bd ♂), p-coumaric acid (Bd ♀), ferulic acid (Bd ♀, ♂ Bd, Bu and Bs) and the flavonoid rutin

(Bd ♀, Bd ♂, Bu). Thus, it is demonstrated for the first time, the co-occurrence of polar

phenolic substances in these three plant species. The ethanol extracts obtained from 13

samples of propolis were analyzed by TLC-HR and UV-VIS, allowing the classification of

the regional propolis in three groups. The most characteristic sample of each type (ADI, WS-

3, RS-2) was chosen for analysis by HPLC in comparison with green propolis PG12. Fresh

sprouts of male and female specimens of B. dracunculifolia were extracted by rinsing with

methanol and the extracts were analyzed by HPLC. All extracts of propolis and B.

dracunculifolia showed artepillin C ensuring that this plant is the source of regional propolis.

The caffeic acid, ferulic acid and p-coumaric acid were identified in the four samples of

propolis. Apigenin is present only in the regional propolis samples, between 2.4% and 3.9%,

while crisin was identified only in the PG12, but as a main component (18.1%). An

unidentified flavonoid (λ

ma x

365 nm, 42,96 min) is the main substance present in the three

samples of regional propolis and also the extract obtained by the rinsing of the plant sprouts.

All the ethanol extracts of regional propolis showed excellent levels of antioxidant activity

when tested against the radical DPPH, several of them getting to be more effective than the

PG12. A comparative analysis of antioxidant power and chemical composition of the samples

indicates that the unidentified flavonoid is responsible for the strong antioxidant activity of

ADI and WS-2 compared to RS-2 and PG12.

Keywords: Baccharis dracunculifolia; essential oil; regional propolis; antioxidant activity;

GC-MS; HPLC.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 -

Figura 2 -

Figura 3 -

Figura 4 -

Figura 5 -

Figura 6 -

Figura 7 -

Figura 8 -

Figura 9 -

Figura 10 -

Figura 11 -

Figura 12 -

Figura 13 -

Figura 14 -

Figura 15 -

Figura 16 -

Figura 17 -

Figura 18 -

Dois sesquiterpenos importantes do óleo essencial de B. dracunculifolia

Estruturas de outros compostos encontrados no óleo essencial de B.

dracunculifolia ..........................................................................................

Insetos na espécie B. dracunculifolia........................................................

Desenho esquemático da coleta e utilização da própolis pelas abelhas....

Apis mellifera visitando flores de B. dracunculifolia...............................

Estrutura do ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico ..................................

Estruturas de alguns flavonóides comumente encontrados em própolis e

em B. dracunculifolia................................................................................

Estruturas de alguns ácidos fenólicos presentes na própolis verde...........

Estruturas dos ácidos cafeoil quínicos: ácidos 3,5-dicafeoil-muco-

quínico, 3,5-dicafeoil-quínico, 4,5-dicafeoil quínico e 5-cafeoil-quínico

(ácido clorogênico)....................................................................................

Cromatogramas obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência dos

extratos etanólicos de B. dracunculifolia (a) e Própolis (b) identificando

os ácidos: clorogênico (1), caféico (2), p-cumárico (3), 4,5

dicafeoilquínico (4), 3,4 dicafeoilquínico (5)............................................

Esquema mostrando as partes de um Cromatógrafo Gasoso....................

Espectros de Massa dos principais constituintes do óleo essencial de B.

dracunculifolia obtidos da espectroteca NIST do sistema CG-EM........

Gráfico simplificado mostrando como pode ser explicada a

deconvolução.............................................................................................

Cromatógrafo Shimadzu ODS-A utilizado para CLAE...........................

Reação da sílica com o cloro-metil-silano, utilizado na preparação de

colunas cromatográficas............................................................................

Representação esquemática de um cromatógrafo líquido para CLAE.....

2,2-difenil-1-picrilidrazil como radical livre e como molécula estável

DPPH-H....................................................................................................

Mecanismo de transferência de hidrogênio da (+)-catequina para o

radical cumilperoxil via transferência de elétrons....................................

Figura 19 -

Figura 20 -

Figura 21 -

Figura 22 -

Figura 23 -

Figura 24 -

Figura 25 –

Figura 26 –

Figura 27 –

Figura 28 –

Figura 29 –

Desenho e medidas do aparelho de hidrodestilação utilizado ...............

Médias de precipitação mensal dos últimos 10 anos e precipitações

mensais medidas durante 2006 próximo ao local onde foram feitas as

coletas........................................................................................................

Comparação entre os cromatogramas obtidos por detecção de ionização

de chama para os óleos essenciais de B. dracunculifolia analisados no

presente trabalho.......................................................................................

Variação do rendimento do óleo essencial de espécimes feminino e

masculino de B. dracunculifolia no decorrer do ano................................

Análises por CCD dos extratos metanólicos de B. dracunculifolia (BdF

e BdM), B. semiserrata (Bs) e B. uncinella (Bu) utilizando sistema

eluente polar (AcOEt:MeOH:H

O 7:3:0,5). Revelação: observação sob

luz UV de 254 e 360 nm; FeCl

(CCD1); H

e aquecimento

(CCD2)......................................................................................................

Análises por CLAE dos extratos metanólicos das folhas de B.

dracunculifolia, B. uncinella e B. semiserrata..........................................

Abelhas coletando de folhas de B. dracunculifolia o material para a

produção da própolis verde.......................................................................

Espectros UV-VIS dos extratos etanólicos das amostras WS-3 e RS-2,

consideradas típicas de cada um dos dois grupos de própolis regionais...

Espectro de ultravioleta do pico da artepilina C (t

=75,23 min), com

seu máximo de absorção em torno de 280 nm..........................................

Cromatogramas obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência dos

extratos metanólicos de brotos de B. dracunculifolia masculino (Bd ♂)

e feminino (Bd ♀), extratos das própolis regionais WS-3, RS-2, ADI e

da PG12.....................................................................................................

Cinética da reação entre o radical DPPH e os extratos de própolis

regionais ADI, WS-3 e RS-2 e de própolis verde PG12 nas alíquotas de

20, 30, 60 e 120 µL...................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -

Tabela 2 -

Tabela 3 -

Tabela 4 -

Tabela 5 -

Tabela 6 -

Tabela 7 –

Tabela 8 –

Tabela 9 –

Tabela 10 –

Tabela 11 –

Tabela 12 –

Tabela 13 –

Derivados do ácido cafeoil quínico identificados em amostras de

própolis brasileira, seus t

e seus UV

máx

....................................................

Classificação das própolis brasileiras........................................................

Coletas de material botânico......................................................................

Produtores da região e amostras de própolis..............................................

Resultado das extrações de B. dracunculifolia (BdM e BdF), B.

uncinella (Bu) e B. semiserrata (Bs).........................................................

Componentes dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação das

folhas de espécimes feminino (♀) e masculino (♂) de B. dracunculifolia

Rendimentos das extrações de folhas de três espécies de Baccharis

obtidas com a seqüência de solventes.......................................................

Máximos de absorção (λ

máx

)

dos espectros de ultravioleta dos extratos

das folhas de B. dracunculifolia (♀ e ♂), B. uncinella e B. semiserrata

obtidos com acetato de etila e metanol......................................................

Principais dados das análises por CLAE sobre a rutina e os ácidos

fenólicos e derivados dos extratos metanólicos de B. dracunculifolia

(Bd ♀, Bd ♂), B. uncinella (Bu) e B. semiserrata (Bs)............................

Máximos de absorbância (λ máx.) dos extratos etanólicos da própolis

PG12 e das própolis regionais separadas em Grupo 1 e Grupo 2.............

Reagrupamento das própolis da região de Ponta Grossa..........................

Principais dados das análises por CLAE dos extratos da própolis PG12,

das própolis regionais WS-3, RS-2 e ADI e dos brotos de B.

dracunculifolia (Bd ♀ e Bd ♂).................................................................

Sequestro do radical DPPH dos extratos de própolis e brotos de B.

dracunculifolia em porcentagem...............................................................

LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E FÓRMULAS

AcOEt – acetato de etila

Bd ♀ ou BdF - Baccharis dracunculifolia espécime feminino

Bd ♂ ou BdM - Baccharis dracunculifolia espécime masculino

BHT - 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol

CCD – cromatografia em camada delgada

CCD-AR – cromatografia em camada delgada de alta resolução

CG – cromatografia gasosa

CG-DIC – cromatografia gasosa com detector de ionização de chama

CG-EM – cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CHCl

– clorofórmio

CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência

DPPH – 2,2-difenil-1-picrilidrazil

ERN – espécie reativa de nitrogênio

ERO - espécie reativa de oxigênio

HPLC- High Performance Liquid Chromatography

IK – índice de Kovàts

LDL – lipoproteína de baixa densidade

MeOH – metanol

PG12 - própolis verde utilizada como padrão

Rf – fator de retenção

TIC – cromatograma de íons totais

UV – ultravioleta

λ - comprimento de onda (nm)

SUMÁRIO

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.6.1

1.6.2

1.7

2.1

2.2

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.5.1

3.5.2

3.5.3

INTRODUÇÃO ......................................................................................................

A família Asteraceae e o gênero Baccharis...............................................................

Baccharis dracunculifolia DC. e seu óleo essencial..................................................

Baccharis dracunculifolia e os insetos......................................................................

Baccharis dracunculifolia e a própolis verde............................................................

Derivados do ácido quínico.......................................................................................

Métodos de análise importantes para esta pesquisa...................................................

A cromatografia gasosa.............................................................................................

A cromatografia líquida de alta eficiência................................................................

Avaliação do potencial antioxidante..........................................................................

OBJETIVOS ............................................................................................................

Geral ..........................................................................................................................

Específicos ................................................................................................................

MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................

Reagentes analíticos...................................................................................................

Equipamentos.............................................................................................................

Coleta de própolis e materiais botânicos...................................................................

Obtenção de amostras de óleo essencial....................................................................

Obtenção de extratos..................................................................................................

Extratos obtidos com uma sequência de solventes....................................................

Extratos obtidos por enxágue.....................................................................................

Extratos de própolis...................................................................................................

3.6

3.7

3.8

3.9

3.10

4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

Análises por CG/EM..................................................................................................

Análises por espectrofotometria UV-VIS..................................................................

Análises por CCD-AR...............................................................................................

Análises por CLAE....................................................................................................

Análises da atividade antioxidante............................................................................

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................

Análise dos óleos essenciais de Baccharis dracunculifolia.......................................

Análises comparativas de três espécies Baccharis....................................................

Correlações químicas entre B. dracunculifolia e a própolis regional.........................

Atividade antioxidante...............................................................................................

Conclusões.................................................................................................................

Perspectivas para este trabalho..................................................................................

REFERÊNCIAS......................................................................................................

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

1 INTRODUÇÃO

1.1 A família Asteraceae e o gênero Baccharis

A família Asteraceae, uma das maiores famílias dentro das Angiospermas,

compreende cerca de 1.100 gêneros e 25.000 espécies. São plantas de aspecto extremamente

variado, incluindo principalmente pequenas ervas ou arbustos e raramente árvores. Plantas

dessa família são extensivamente estudadas quanto à sua composição química e atividade

biológica, sendo que algumas têm proporcionado o desenvolvimento de novos fármacos e

inseticidas (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005).

O gênero Baccharis é um importante gênero desta família, pertence à tribo Asterae

e está representado por mais de 500 espécies distribuídas principalmente no Brasil,

Argentina, Colômbia, Chile e México, ocupando as regiões mais elevadas (BUDEL et al.,

2004). A alta concentração de espécies no Brasil e nos Andes indica que uma destas áreas é

o provável centro de origem desse gênero (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005).

No Brasil, estão descritas 120 espécies de Baccharis, distribuídas em maior concentração na

Região Sul do país (AGOSTINI et al., 2005).

As espécies deste gênero possuem alto valor sócio-econômico, com ampla

dispersão nos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo e Rio Grande do Sul, entre

outras regiões do país, onde grande número delas é utilizado na medicina popular para

controle ou tratamento de várias doenças (CORRÊA, 1984). São consumidas principalmente

na forma de chás com indicações para males do estômago, fígado, anemias, inflamações,

diabetes, doenças na próstata, sendo também descritas como remédio para processo de

desintoxicação do organismo (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005). Este gênero

produz várias classes de metabólitos secundários, mas apenas cerca de 15% das espécies de

Baccharis foram estudadas do ponto de vista fitoquímico pelo menos uma vez e poucas

delas têm estudos mais completos (AGOSTINI et al., 2005).

Segundo a divisão de Barroso (1976), o grupo Spicata compreende arbustos

ramificados com 50 cm a 3 m de altura, apresentando folhas sésseis. Sete espécies

representam este grupo, dentre elas: Baccharis dracunculifolia DC., B. spicata (Lam.) Baill.,

B. erioclada DC., B. caprariaefolia DC., B. nummularia Hees, B. uncinella DC., B.

megapotamica e sua variedade. A espécie B. dracunculifolia está classificada na secção

Discolores DC., e já apresentou as seguintes sinonímias: B. bracteata Hook. et Arn., B.

leptospermoides DC. e B. tandilensis Spreng (BUDEL et al., 2004). Atualmente, o banco de

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

dados IPNI (The International Plant Names Index), criado e mantido pelas três maiores

instituições da área da botânica, The Royal Botanic Gardens, The Harvard University

Herbaria e o Australian National Herbarium, não reconhece a existência de sinônimos para

B. dracunculifolia, mas três variedades desta espécie vegetal continuam registradas como

válidas: integerrima Kuntze, subdentata Kuntze e subviscosa Kuntze (IPNI, 2009).

1.2 Baccharis dracunculifolia DC. e seu óleo essencial

A espécie Baccharis dracunculifolia DC., conhecida vulgarmente como “alecrim

do campo, alecrim vassoura, carqueja, chilca, cilca, erva-de-são-joão-maria, suncho, thola,

vassoureira ou vassourinha” , utilizada para combater distúrbios gástricos, cansaço físico,

inapetência, afecções febris e debilidade orgânica (BUDEL et al., 2004) é um arbusto com

ocorrência espontânea no Brasil, Uruguai, Argentina, Paraguai e encontrada também nos

altos vales da Bolívia, chegando até 3.280 m de altitude (CASSEL et al., 2000), onde é

considerada importante pela população local em vista de seus usos na medicina tradicional

(LOAYZA et al., 1995).

Esta espécie é arbustiva, possui folhas lanceoladas, membranáceas, uninérvias,

com 1 a 2 cm de comprimento e 3 a 4 mm de largura, densamente pontuadas de glândulas,

com margens inteiras, 1 a 3 denteadas, raramente apresentando entre 5 e 7 dentes. Possui

flor feminina com corola de 2 a 3 mm de comprimento e flor masculina com corola de 2,5 a

3 mm de comprimento. É uma espécie normalmente encontrada em campos secos e locais

alterados, florescendo desde o início de janeiro até maio nos Campos Gerais do Paraná,

conforme observações feitas no decorrer do presente trabalho de pesquisa. A planta já foi

muito utilizada na confecção de vassouras rústicas, de onde vem um de seus nomes

populares, e por ser uma planta que cresce espontaneamente em campos de criação de gado,

seus efeitos tóxicos já foram observados em animais (TAKEDA; FARAGO, 2001).

O óleo essencial de B. dracunculifolia é produzido no Brasil em pequena escala

para uso em perfumaria, pelo seu aroma exótico, dependendo de sua origem geográfica e

processo de extração. A sua importância comercial reside nos teores de (E)-nerolidol (1) e

espatulenol (2), normalmente encontrados como componentes principais em óleos obtidos

com a utilização de processos de hidrodestilação (CASSEL et al., 2000; FABIANE et al.

2008; FERRACINI et al., 1995; FRIZZO et al., 2008). Óleos essenciais com baixas

concentrações de (E)-nerolidol (1) e espatulenol (2) são considerados de baixa qualidade e

não são aceitos por algumas farmacopéias (WAGNER; BLADT, 1995).

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

(E)-nerolidol (1) espatulenol (2)

Figura 1 – Dois sesquiterpenos importantes do óleo essencial de B. dracunculifolia.

Para Ferracini e colaboradores (1995), na análise dos óleos essenciais obtidos de

espécimes feminino e masculino, as concentrações de (E)-nerolidol (1) foram de 20,80%

(♀) e 12,02% (♂) e de espatulenol (2) foram de 2,58% (♀) e 3,79% (♂). Compostos como

germacreno-D (3), β-pineno (4) e δ-cadineno (5) também já foram identificados em

proporções de 4%, 18% e 13%, respectivamente (LOAYZA et al., 1995). Outros terpenóides

como β-cariofileno (6), β-selineno (7), globulol (8), viridiflorol (9) e α-cadinol (10) já foram

também relatados como componentes majoritários em óleos essenciais de B. dracunculifolia

(FERRACINI et al., 1995; AGOSTINI et al., 2005).

germacreno-D (3) β-pineno (4) δ-cadineno (5) β-cariofileno (6)

β-selineno (7) globulol (8) viridiflorol (9) α-cadinol (10)

Figura 2 – Estruturas de outros compostos encontrados no óleo essencial de B. dracunculifolia

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

Os óleos essenciais de espécies do gênero Baccharis estão sujeitos a variações

muito grandes em suas composições, as quais parecem estar fortemente relacionadas a

fatores climáticos e outros fatores ambientais. O rendimento de óleo essencial e a

concentração de cada um dos constituintes do óleo de uma determinada espécie podem

variar durante o ciclo vegetativo do vegetal. Fatores ambientais e práticas de cultivo também

causam impactos, influenciando a composição química dos óleos essenciais e o seu

rendimento. A temperatura, a umidade relativa, a duração total da exposição ao sol e o

regime de ventos também exercem influência direta na composição e rendimento,

especialmente em espécies que possuem estruturas superficiais de produção e

armazenamento de óleos essenciais (BRUNETON, 1995); e ainda, diferentes órgãos de uma

mesma planta podem apresentar óleos essenciais com composição química, caracteres

físico-químicos e odores bem distintos (SIMÕES; SPITZER, 2003).

1.3 Baccharis dracunculifolia e os insetos

Os insetos visitam flores para se alimentar de néctar e pólen e nesse processo, eles

geralmente polinizam as flores, de modo que ambos se beneficiam dessa associação

mutualista (Figura 3). Nesta relação há três fatores bioquímicos que interagem: o cheiro, a

cor das flores e o valor nutricional do néctar e pólen. Os insetos vivem no mundo da

comunicação química - utilizam feromônios e são capazes de detectar os terpenos e outros

voláteis de flores a grandes distâncias. Quando um polinizador se aproxima de uma planta,

ele também recebe um sinal visual, que é o destaque das flores coloridas contra o verde da

folhagem (FERRACINI, 1995).

Entretanto, é difícil determinar qual ou quais polinizadores são ativos numa

espécie vegetal sendo que alguns animais podem visitar flores por outras razões que não

sejam a polinização, também podem ser capazes de alimentar-se de néctar, sem que ocorra a

polinização necessária à planta. Formigas, por exemplo, são bem conhecidas como visitantes

ilegítimos, isto é ladrões de néctar, e são freqüentemente tão pequenas que patrulham as

flores por dentro e por fora sem tocar os órgãos reprodutores. Contudo, elas agem como

polinizadoras em alguns casos (FERRACINI, 1995). Os insetos herbívoros que utilizam de

B. dracunculifolia para produzir suas galhas também podem exercer um efeito negativo

sobre o desenvolvimento da planta (FAGUNDES; NEVES; FERNANDES, 2005). Galhas

são crescimentos especializados em tecidos vegetais, induzidos por alguns vírus, bactérias,

fungos, nematóides, ácaros ou insetos. Em galhas induzidas por insetos, quando o indutor

COSTA, A. G. L.C

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começa a se alimentar, é muito freqüente a formação de tecido nutritivo, revestindo a

câmara larval. Emprega-se este termo para as galhas onde estão presentes fungos que

servem de alimento para a larva do indutor. No Brasil, já foi descrita a ocorrência de 17

tipos de galhas em B. dracunculifolia (ARDUIN; KRAUS, 2001).

No grupo das Angiospermas, a maioria das plantas requer insetos para a

polinização. Isto é observado principalmente em plantas dióicas, como é o caso da espécie

em estudo, B. dracunculifolia.

Figura 3 - Insetos na espécie B. dracunculifolia (Fotos de D. S. Nunes, 2006).

COSTA, A. G. L.C

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1.4 Baccharis dracunculifolia e a própolis verde

Própolis é um termo de origem grega que significa “em defesa da cidade”, aplicado

a este material que as abelhas produzem para a proteção de suas colméias. É formada por

material resinoso e balsâmico de composição química complexa, sendo este coletado pelas

abelhas dos brotos, exsudatos de árvores e de outras partes do tecido vegetal (BANKOVA,

2005; SANTOS et al., 2003). Este material é usado pelas abelhas como selante, para fechar

as brechas e proteger a colméia contra ataque de micro-organismos e até para mumificar

insetos invasores (Figura 4). Estima-se que o uso da própolis na medicina popular antecede

300 a.C. e o consumo mundial está em torno de 700 a 800 toneladas por ano (SILVA et al.,

2006).

Figura 4 - Desenho esquemático da coleta e utilização da própolis pelas abelhas.

Fonte: Apicultura (2007).

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As própolis brasileiras foram classificadas em 12 tipos, segundo o perfil químico,

além das atividades antimicrobiana e antioxidante (PARK; IKEGAKI; ALENCAR, 2000).

Para a região sudeste do Brasil, o grupo 12, representa com fidelidade a sua origem

botânica: B. dracunculifolia (KUMAZAWA et al., 2003; PARK; ALENCAR; AGUIAR,

2002).

B. dracunculifolia tem sido apontada como provável fonte de origem da própolis

verde, produzida pelas abelhas (Figura 5) que coletam material dos brotos ou exudatos,

substâncias voláteis e ceras de plantas (TEIXEIRA et al., 2005). Em estudos onde se

observou o comportamento de abelhas da espécie Apis mellifera foi relatado que estas obtêm

o material para a manipulação da própolis, preferencialmente em espécies de B.

dracunculifolia (ALENCAR et al., 2005; KUMAZAWA et al., 2003; PARK et al., 2004).

Figura 5 - Apis mellifera visitando flores de B. dracunculifolia.

(Foto de D. S. Nunes, 2006)

Muitos dos constituintes químicos encontrados na própolis são também

encontrados em sua fonte botânica, então, comparando-se a composição química de extratos

da planta e da própolis tem-se um bom indicador para avaliar a possível fonte botânica.

Alencar et al. (2005) investigaram a composição química da própolis produzida em São

Paulo e Minas Gerais pelas abelhas africanizadas Apis mellifera e a maior relação

encontrada entre a própolis e os extratos metanólicos foi a alta proporção do composto

fenólico conhecido como artepilina C (ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico) (11) e outros

similares.

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COOH

artepilina C (11)

Figura 6 - Estrutura do ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico.

OOH

rutinose

OOH

rutina (12) pinobanksina (13) quercetina (14)

canferol (15) apigenina (16) pinocembrina (17)

crisina (18) galangina (19) tectocrisina (20)

Figura 7 - Estruturas de alguns flavonóides comumente encontrados em própolis e em B. dracunculifolia.

A artepilina C é um dos principais ácidos fenólicos presentes no extrato de própolis

PG12. Apresenta grande importância por possuir várias atividades biológicas, como anti-

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inflamatória (PAULINO et al., 2008), antitumoral, indutora de apoptose, imunomoduladora

e antioxidante (PISCO et al., 2006) e supressora da angiogênese tumoral (AHN et al., 2007).

Além da artepilina C, outros três componentes da própolis brasileira, identificados

como ácidos 3-prenil-4-hidroxicinâmico, 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-benzopirano e

2,2-dimetil-6-carboxietenil-8-prenil-2H-1-benzopirano foram testados contra bactérias

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Streptococcus faecalis

encontrando-se, em todos os quatro, atividade contra estas bactérias e também contra

Tripanosoma cruzi, além disso, efeito miorrelaxante foi relatado (MARCUCCI et al., 2001).

Vários flavonóides também estão presentes em amostras de própolis e B.

dracunculifolia: rutina (12), pinobanksina (13), quercetina (14), canferol (15), apigenina

(16), pinocembrina (17), crisina (18), galangina (19), tectocrisina (20) e canferide

(MARÓSTICA JUNIOR et al., 2008; PARK; ALENCAR; AGUIAR, 2002).

Também os ácidos caféico (21), ferúlico (22) e p-cumárico (23) estão presentes na

própolis brasileira (MARCUCCI, 2006). Os ácidos caféico e p-cumárico mostraram

atividade antimutagênica induzida por desoxirrubicina (RESENDE et al., 2007).

COOH

MeO

COOH

ácido caféico (21) ácido ferúlico (22) ácido p-cumárico (23)

Figura 8 - Estruturas de alguns ácidos fenólicos presentes na própolis verde.

Assim como a própolis possui atividades biológicas: antioxidante (MENEZES,

2005; SHENG et al., 2007; SILVA et al., 2006), antimicrobiana (CASTRO et al., 2007;

GEBARA; LIMA; MAYER, 2002; KUJUMGIEV et al., 1999; MARCUCCI, 1996;

MENEZES, 2005) citotóxica (MARCUCCI, 1996), anti-inflamatória (MENEZES, 2005),

hepatoprotetora (MENEZES, 2005), antitumoral (AHN et al., 2007; FUNARI; FERRO;

MATHOR, 2007), os extratos de B. dracunculifolia também apresentaram as suas

atividades: antimutagênica (RESENDE et al., 2007) e antibacteriana (FERRONATTO et al.,

2007; LEITÃO et al., 2004).

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1.5 Derivados do ácido quínico

Nos últimos anos têm se dado atenção especial a estes compostos, principalmente

após a confirmação da origem botânica da própolis brasileira. Tendo a própolis merecido

destaque por conter tantas atividade biológicas, os extratos de Baccharis sp. também foram

ocupando espaço na literatura, pois são muito utilizadas na medicina tradicional em toda a

América Latina.

Quatro derivados do ácido cafeoil quínico: ácidos 3,5-dicafeoil-muco-quínico (24),

3,5-dicafeoil-quínico (25), 4,5-dicafeoil quínico (26) e 5-cafeoil-quínico (ácido clorogênico)

(27) foram isolados de Aster scaber, estabelecendo-se suas estruturas por RMN de

H e de

C de alta resolução. Estes compostos apresentaram atividade contra proteína do HIV-1

(Figura 9).

HOOC

(24) R = cafeoil

cafeoil

(25) R

e R

= cafeoil, R

= H

(26) R

= H, R

e R

= cafeoil

(27) R

e R

= H e R

= cafeoil

Figura 9 - Estruturas dos ácidos cafeoil quínicos: ácidos 3,5-dicafeoil-muco-

quínico (24), 3,5-dicafeoil-quínico (25), 4,5-dicafeoil quínico (26) e

5-cafeoil-quínico (ácido clorogênico) (27). Fonte: Kwon et al., 2000.

Extratos metanólicos das folhas de B. dracunculifolia, apresentam glicosídeos

contendo grupos (E)-cafeoil que pela primeira vez foram relatados na literatura

(NAGATANI; WARASHINA; NORO, 2001 e 2002). Posteriormente derivados do ácido

clorogênico (27) foram isolados da parte aérea de B. dracunculifolia (ABAD; BERMEJO,

2007).

Estas substâncias também foram identificadas em amostras de própolis brasileira:

ácido clorogênico (ácido 5-cafeoilquínico) (27) e os seus derivados 3,5-dicafeoilquínico

(25), 3,4-dicafeoilquínico (26) e tricafeoilquínico (GARDANA et al., 2007) (Tabela 1).

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Tabela 1 – Derivados do ácido cafeoil quínico identificados em amostras de

própolis brasileira, seus t

e UV

máx

Substância t

(min) UV

máx

ácido clorogênico 2,7 325

ácido caféico 3,4 324

ácido cumárico 4,8 310

ácido ferúlico 5,3 324

ácido dicafeoilquínico 5,3 325

ácido dicafeoilquínico 5,9 325

ácido tricafeoilquínico 13,3 325

Fonte: Gardana et al. (2007).

Derivados do ácido cafeoilquínico (ácido 3,4-dicafeoilquínico, 3,5- dicafeoilquínico

e 3,4,5-tricafeoilquínico) foram isolados de própolis de B. dracunculifolia e detectados em

comprimento de onda de 325 nm. Os extratos de própolis com concentrações definidas de

cada componente foram avaliados segundo o potencial de indução na hipotensão em ratos,

sugerindo ação anti-hipertensiva para estes compostos (MISHIMA et al., 2005). Estes ácidos

foram encontrados em própolis originárias de B. dracunculifolia em maiores proporções se

comparados com as amostras originárias de Araucária spp (SALOMÃO et al., 2007). Para

comprovar a relação entre Baccharis e própolis, Kumazawa et al. (2003) identificaram como

componentes polares, em CLAE, no extrato etanólico de ambos, os ácidos: clorogênico,

caféico, p-cumárico, 4,5 dicafeoilquínico, 3,4 dicafeoilquínico como mostra a Figura 10.

Figura 10 - Cromatogramas obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência

dos extratos etanólicos de B. dracunculifolia (a) e Própolis (b)

identificando os ácidos: clorogênico (1), caféico (2), p-cumárico (3),

4,5 dicafeoilquínico (4), 3,4 dicafeoilquínico (5). Fonte: Kumazawa et

al. (2003).

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Ésteres do ácido caféico (fenetil éster do ácido caféico) assim como outros

compostos fenólicos foram apontados como responsáveis por importantes atividades

antimicrobiana e antitumoral (SFORCIN; ORSI; BANKOVA, 2005).

Outro trabalho relevante identificou no extrato metanólico de folhas jovens de B.

dracunculifolia os seguintes ácidos: clorogênico, caféico, p-cumárico, ferúlico e trans-

cinâmico. Estes compostos em própolis foram avaliados, levando os autores a afirmar que

há um efeito tóxico dose-dependente em fibroblastos de ratos (FUNARI; FERRO;

MATHOR, 2007).

Estes ácidos já são conhecidos por possuírem ação potente e seletiva como

inibidora de vírus Tipo 1 HIV, não sendo tóxicos nas concentrações utilizadas. O ácido

clorogênico é um inibidor competitivo da glucose-6-fosfatase; é ela quem regula a

concentração de glicose no sangue. Quando ingerido em alimentos, o ácido clorogênico é

absorvido no intestino e passa para a circulação sanguínea. O ácido clorogênico, juntamente

com ácido caféico, são antioxidantes “in vitro”, protegendo o LDL (lipoproteína de baixa

densidade) da oxidação e conseqüentemente prevenindo contra doenças do envelhecimento

(PEREIRA et al., 2003).

Num contexto onde os produtos naturais vêm recuperando espaço e importância na

indústria farmacêutica, seja por si ou como fonte inspiradora de novos padrões moleculares

bioativos (VIEGAS; BOLZANI; BARREIROS, 2006), o estudo da espécie Baccharis

dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis merece atenção especial, já que ambas

apresentam atividades farmacológicas comprovadas em estudos científicos e também por

existirem evidências diretas de que a B. dracunculifolia é a fonte de origem da própolis

brasileira (PG12).

1.6 Métodos de análise importantes para esta pesquisa

1.6.1 A cromatografia gasosa

Neste método (Figura 11) separa-se uma mistura em seus componentes fazendo-se

mover um gás sobre um adsorvente estacionário. A amostra é analisada em fase gasosa e,

portanto, os analitos devem ser voláteis ou volatilizáveis.

A cromatografia gasosa é uma técnica com poder de resolução excelente,

possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma amostra. Dependendo do tipo

de substância a ser analisada e do detector empregado, consegue-se detectar cerca de 10

-12

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do composto por mL

-1

de solução. Essa sensibilidade permite que pequenas quantidades de

amostra possam ser analisadas (PERES, 2002).

Figura 11 – Esquema mostrando as partes de um cromatógrafo gasoso: 1

reservatório de gás e controles de vazão / pressão; 2 injetor

(vaporizador) de amostra; 3 coluna cromatográfica e forno da

coluna; 4 detector; 5 eletrônica de tratamento (amplificação) de

sinal; 6 registro de sinal (registrador ou computador). (Fonte:

Cromatógrafo Gasoso, 2009).

O gás de arraste - A separação é auxiliada pelo gás de arraste que é normalmente o

hélio, nitrogênio, hidrogênio ou argônio e a escolha depende da disponibilidade, pureza,

consumo e tipo de detector utilizado. Hélio é o preferido com detectores de condutividade

térmica porque tem condutividade térmica alta em relação aos vapores da maior parte dos

compostos orgânicos. Além do reservatório de gás em alta pressão, são necessários

reguladores de pressão e medidores de vazão para controlar e medir o fluxo do gás.

A introdução da amostra - Vários dispositivos de introdução da amostra foram

desenvolvidos. O mais importante envolve a introdução de amostras líquidas com uma

microseringa dotada de uma agulha hipodérmica; a agulha passa através de um septo de

borracha de silicone auto-selante e coloca a amostra em um bloco de metal aquecido que

está na entrada da coluna. A temperatura do bloco deve ser suficiente para que a amostra

líquida se vaporize rapidamente sem decomposição ou fracionamento. Para melhorar a

eficiência, a amostra deve ser a menor possível (1 a 10 µL).

A coluna - A separação dos componentes da amostra que foi injetada é feita na

coluna onde a natureza do suporte sólido, o método de empacotamento, o tamanho da coluna

e a temperatura são fatores importantes para a resolução desejada. A coluna é colocada em

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um forno controlado termostaticamente, de modo a manter a temperatura constante com

variação de 0,5ºC, garantindo assim condições reprodutíveis. O uso de colunas empacotadas

têm diminuído muito nos últimos anos, substituindo-se pelas colunas capilares, que se

baseiam na interação entre a mistura e a fase estacionária na forma de um filme fino e

coerente depositado na superfície interna de um tubo longo e fino (capilar).

O detector - A função do detector, situado na saída da coluna, é registrar e medir as

pequenas quantidades dos componentes da mistura separados na coluna e levados pelo fluxo

de gás de arraste. O sinal de saída do detector alimenta um dispositivo que produz um

gráfico denominado cromatograma; o detector de ionização de chama (DIC), utilizado em

nossa análise, baseia-se na queima do ar efluente da coluna, misturado com hidrogênio, com

produção de uma chama de energia suficiente para ionizar as moléculas de soluto cujos

potenciais de ionização são baixos, e estes íons produzidos são coletados por eletrodos e a

corrente iônica produzida é então medida. O jato do queimador é o eletrodo negativo. O

anodo é usualmente um filamento que atinge a extremidade da chama. A combustão de

misturas de hidrogênio e ar produz poucos íons e assim, só quando o gás de arraste e o

hidrogênio se queimam, obtém-se um sinal praticamente constante. Na presença de

compostos que contém carbono, ocorre ionização e a condutividade elétrica da chama

aumenta fortemente. A amostra é destruída na chama, assim se usa um dispositivo para

dividir o fluxo de efluente quando se deseja continuar a análise da amostra. O divisor de

fluxo é colocado entre a coluna e o detector e permite que a maior parte da amostra evite o

detector. O detector DIC tem grande aplicabilidade no uso de detecção de compostos

orgânicos, além disso, o fato de ser altamente sensível e estável, ter resposta rápida e uma

faixa de resposta linear faz com que este tipo de detector seja o mais popular em uso.

O sistema CG/EM

Os sistemas em que são acoplados um Cromatógrafo Gasoso a um Espectrômetro

de Massas permitem a redução do tempo necessário para a identificação dos componentes

de um cromatograma de íons totais (TIC) através da detecção seletiva de massa, havendo a

busca automática em biblioteca de referência de espectros de massa (“espectroteca”) –

Figura 12. Os espectros de massas obtidos de uma mistura complexa sofrem a contribuição

de componentes vizinhos não resolvidos durante a separação, por sangramento da coluna ou

contaminação dos septos. Caracterizar e remover estas contribuições de íons não claros, que

dificultam a análise visual e comparativa dos espectros adquiridos de espectrotecas é o papel

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essencial da deconvolução (Figura 13), onde o espectro de massas é obtido a partir de

modelo de forma, seguido um método de mínimos quadrados.

Nerolidol

80 100 120 140 160 180 200

220

100

107

123

136

148

161

189

204

atulenol

100 120 140 160 180 200

220

100

105

119

131

147

159

177

187

205

220

Figura 12 - Espectros de Massa dos principais constituintes do óleo essencial de B. dracunculifolia

obtidos da espectroteca NIST do sistema CG-EM.

Figura 13 - Gráfico simplificado mostrando como pode ser explicada a deconvolução.

Fonte: Deconvolução (2009)

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1.6.2 A cromatografia líquida de alta eficiência

É um processo de separação de substâncias por adsorção; baseia-se em interações

diferenciadas entre os diversos solutos e sítios ativos fixos em um adsorvente sólido

finamente dividido (Figura 16).

Fase móvel – Uma separação cromatográfica efetiva depende de diferenças na

interação entre os solutos e as fases móvel e estacionária. Os solventes utilizados em

cromatografia líquida de alta eficiência são geralmente muito caros. Para garantir a

repetitividade do desempenho, as impurezas dos solventes, inclusive a água, no caso de

solventes orgânicos devem estar ao nível de traços. Estes reagentes para uso em CLAE

podem ser comprados sem que seja necessária uma purificação, porém, é sempre necessário

eliminar os gases imediatamente antes do uso. A fase móvel é vital em CLAE e por isso,

vale a pena examinar os fatores que determinam sua escolha. O poder de eluição da fase

móvel é determinado por sua polaridade, pela polaridade da fase estacionária e pela natureza

dos componentes da amostra. No caso de separação com fase normal, o poder de eluição

aumenta com o aumento da polaridade do solvente. Nas separações com fase reversa, o

poder de eluição diminui com o aumento da polaridade do solvente. A cromatografia com

fase reversa é muito popular, em parte, por causa do tipo de material no qual se usa a

cromatografia com fase líquida, mas também porque existem vantagens no uso de fases

móveis polares como água e metanol. Em comparação com as fases apolares, as fases

polares são mais baratas e a purificação é mais fácil. Além disso, elas são menos afetadas

por pequenas quantidades de impurezas e são menos tóxicas. Solventes especialmente

purificados para CLAE, livres de impurezas que absorvem no ultravioleta e de partículas

sólidas estão disponíveis comercialmente. É importante remover também o ar dissolvido e

eventuais bolhas de ar na coluna, que são uma das causas de problemas na bomba e no

detector durante o uso. Para evitar estes problemas pode-se desgaseificar a fase móvel antes

do uso, colocando a fase móvel em vácuo ou aquecendo sob ultra-som. Não existem regras

fixas para escolher a melhor fase para uma dada separação, a não ser “o semelhante separa o

semelhante”.

Método isocrático e de gradiente - A operação pelo método isocrático é mais simples

do que os métodos em gradiente. No método isocrático é possível escolher uma mistura de

solventes para ser usada durante todo o experimento. O uso de gradientes na eluição permite

freqüentemente a separação de solutos que não podem ser separados por uma operação

isocrática, mesmo com solventes mistos. Ela é especialmente eficiente quando os

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componentes da amostra diferem muito em polaridade. Muitos cromatógrafos comerciais

possuem sistema de manuseio de líquidos que podem misturar dois ou mais solventes em

proporções crescentes de 0 a 100% de um dos componentes, gerando um perfil de

composição em relação ao tempo.

Figura 14 - Cromatógrafo Shimadzu ODS-A utilizado para CLAE.

(Foto de A. G. L. Cardozo, 2007)

Introdução do solvente – Há certa variedade de sistemas usados em CLAE, onde o

mais popular é a bomba de controle alternado, que manipula volumes pequenos, tem fluxo

constante e pode fornecer taxas controladas de fluxo da ordem de 1 a 15 mL/min contra uma

coluna que exerce pressões de até 7.250 psi (50 MPa).

Injeção da amostra - A introdução da amostra é geralmente feita de duas maneiras

por injeção com seringa ou com válvula de amostragem. Os septos de injeção permitem a

introdução da amostra com uma seringa de alta pressão que atravessa um septo auto-selante

feito com um elastômero. Os dispositivos mais utilizados atualmente em instrumentos

comerciais são as válvulas de amostragem de pequeno volume que permitem a introdução

da amostra, de forma reprodutiva, em colunas pressurizadas, sem interrupção significativa

do fluxo da fase móvel. A amostra é colocada, na pressão atmosférica, no lado externo da

válvula e introduzida na corrente de fase móvel pela rotação apropriada da válvula. O

volume de amostra pode variar entre 2 µL e mais de 100 µL simplesmente com a mudança

da válvula ou com válvulas especiais de volume variável. Podem ser usados injetores

automáticos de amostra que permitem a operação desassistida do instrumento (durante a

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noite, por exemplo). A válvula de injeção é preferida para o trabalho quantitativo devido sua

maior precisão com relação à injeção com seringa.

A coluna – Feitas de tubos de aço inoxidável de diâmetro interno controlado, com

dimensões entre 10 e 30 cm de comprimento e 4 a 5 mm de diâmetro interno. A fase

estacionária, ou empacotamento, é retida por filtros de aço inoxidável com poros de 2 µm ou

menos, colocados em cada extremidade. Os empacotamentos usados em quase todas as

colunas comercialmente importantes são feitos de partículas porosas de sílica (diâmetro < 10

µm). Pode-se ligar quimicamente a fase estacionária a um material de suporte. Esta forma

em que fases monoméricas e poliméricas se ligam a materiais de suporte é chamada

cromatografia com fase ligada, onde as reações de silanização são muito usadas (Figura 15).

Os grupos silanol da superfície da sílica reagem com cloro-silanos substituídos. Um

exemplo típico é a reação da sílica com cloro-metil-silano que produz uma fase monomérica

ligada na qual cada molécula do agente de silanização reage com um grupo silanol.

H Cl

Figura 15 – Reação da sílica com o cloro-metil-silano, na preparação de colunas cromatográficas.

Em colunas analíticas de CLAE o grupo mais importante é do tipo apolar C18 em

que o grupo “R” é octadecila. Esta coluna C18 permite a separação de misturas

moderadamente polares e é muito usada na análise de produtos farmacêuticos, drogas e

pesticidas.

Figura 16 - Representação esquemática de um cromatógrafo líquido para CLAE.

Fonte: Cromatógrafo Líquido para HPLC (2009)

O detector - O detector de CLAE mais utilizado é o de absorção no ultravioleta

medindo a quantidade de luz UV/visível absorvida durante a passagem do efluente por uma

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pequena célula de fluxo colocada no caminho ótico do feixe de radiação. Possuem alta

sensibilidade e por medirem propriedades do soluto, são relativamente insensíveis a variação

de temperatura e da velocidade de fluxo do efluente. É apropriado para experimentos em

gradiente de eluição porque muitos dos solventes usados em CLAE não absorvem

apreciavelmente nos comprimentos de onda usados para monitorar o efluente.

1.7 Avaliação do potencial antioxidante

Os antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres gerados pelo

metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo ataque sobre os lipídios, os

aminoácidos das proteínas a dupla ligação dos ácidos graxos poliinsaturados e as bases do

DNA evitando formação de lesões e a perca da integridade celular (BIANCHI, ANTUNES;

1999). As pesquisas têm se intensificado a procura de produtos que controlem ou acabem

com a formação destes radicais, visando à prevenção do envelhecimento celular e

conseqüentemente as doenças relacionadas.

Considerando que a própolis é importante fonte de substâncias farmacologicamente

ativas, o seu efeito antioxidante, seqüestrador de radicais livres também já está comprovado.

A atividade de dois extratos de própolis (etanólico e etéreo) foi determinada pelo método de

seqüestro de radicais livres utilizando o DPPH e tiocianato de ferro comparando com 2,6-di-

terc-butil-4-metilfenol (BHT) e α-tocoferol, mostrando que a própolis contém uma alta

concentração de substâncias com capacidade antioxidante. Os extratos etanólicos tiveram

maior atividade que aqueles obtidos com éter de petróleo na mesma concentração, mas,

aumentando-se a concentração do extrato etéreo, pode-se comparar efeitos semelhantes ao

extrato etanólico, mostrando que a atividade deste extrato é dose-dependente (SHENG et al.,

2007).

Outro trabalho importante avaliando 49 amostras de própolis do Brasil (diferentes

estados) mostra que os resultados de maior atividade antioxidante estão diretamente

relacionados com a maior concentração de compostos fenólicos. Este fato é conseqüência

das diferentes composições químicas encontradas em extratos de própolis, que depende das

variáveis biogeográficas (flora local, clima e efeitos sazonais) (SILVA et al., 2006).

Recentemente, a síntese de compostos análogos a artepilina C, mereceu especial atenção,

principalmente pela sua atividade antioxidante (PISCO et al., 2006).

COSTA, A. G. L.C

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DPPH (radical livre)

DPPH-H

Figura 17 - 2,2-difenil-1-picrilidrazil como radical livre e como molécula estável DPPH-H.

O teste utilizando o radical estável DPPH (Figura 17) mede a capacidade das

substâncias em doar hidrogênio radicalar a este radical, assim, quanto maior o número de

hidroxilas presentes na amostra, maior pode ser a sua atividade antioxidante. Mas além da

hidroxila, a saída de outros tipos de hidrogênio pode levar a formação de radicais muito

estáveis, como ocorre nos grupos prenila presentes na artepelina C. A estabilidade dos

radicais formados pelo antioxidante é o fator que influencia sobre o potencial, sendo maior

nas substâncias com maior capacidade de deslocalizar os elétrons na estrutura (DUARTE-

ALMEIDA et al., 2006).

A oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do nosso metabolismo, então os

radicais livres são produzidos naturalmente, por alguma disfunção biológica, em processos

inflamatórios ou provenientes de alimentos.

A produção de radicais livres no organismo está relacionada com fatores endógenos

como: respiração aeróbica, inflamações, peroxissomos, enzimas do citocromo P450; e com

fatores exógenos como: ozônio, radiações gama e ultravioleta, medicamentos, dieta, cigarro

e outros (BIANCHI; ANTUNES, 1999).

As moléculas orgânicas e inorgânicas e os átomos que contém um ou mais elétrons

não pareados, com existência independente, podem ser classificados como radicais livres.

Os radicais livres cujo elétron desemparelhado encontra-se centrado nos átomos de oxigênio

ou nitrogênio são denominados ERO (espécie reativa de oxigênio) ou ERN (espécie reativa

de nitrogênio) (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

As principais EROs distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO

•

superóxido (O

), peroxila (ROO

•

) e alcoxila (RO

•

); e os não radicalares: oxigênio, peróxido

de hidrogênio e ácido hipocloroso. Dentre as ERN incluem-se o óxido nítrico (NO

•

), óxido

nitroso (N

), ácido nitroso (HNO

), nitritos (NO

), nitratos (NO

) e peroxinitritos

(ONOO

). Enquanto alguns deles podem ser altamente reativos no organismo atacando

COSTA, A. G. L.C

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lipídios, proteínas e DNA, outros são reativos apenas com os lipídios. Existem ainda alguns

que são pouco reativos, mas apesar disso podem gerar espécies danosas (BARREIROS;

DAVID; DAVID, 2006).

Essa configuração faz dos radicais livres moléculas altamente instáveis, com meia-

vida curta e quimicamente muito reativas. A presença dos radicais é crítica para a

manutenção de muitas funções fisiológicas normais (BIANCHI; ANTUNES, 1999).

Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na

membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA) está relacionado

com seu sítio de formação.

De acordo com Halliwell (1994) “Antioxidante é qualquer substância que, quando

presente em baixa concentração comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou

previne significativamente a oxidação do mesmo”. Os compostos fenólicos podem ser

considerados assim e englobam desde moléculas simples até outras com alto grau de

polimerização. Estão presentes na natureza na forma livre ou ligados a açúcares ou a

proteínas. Dois grandes grupos destes compostos estão largamente distribuídos na natureza:

os flavonóides, os ácidos fenólicos (ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados) e

cumarinas (SOARES, 2002).

Há duas possibilidades no mecanismo de transferência de hidrogênio de compostos

fenólicos para espécies radicalares: no primeiro caso ocorre em uma etapa onde há

transferência do átomo de hidrogênio e no segundo caso ocorre transferência do elétron

seguido pela transferência do próton. Há relatos de que a transferência de hidrogênio da (+)-

catequina (flavonóide), um dos mais poderosos antioxidantes naturais, para o radical

cumilperoxil procede via transferência de elétron da (+)-catequina para o radical

cumilperoxil, a qual é acelerada pela presença do íon escândio (Sc

) (Figura 18).

Antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais e algumas vezes

como quelantes de metais, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do

processo oxidativo, formando produtos intermediários relativamente estáveis devido à

ressonância do anel aromático apresentada por estas substâncias. A atividade antioxidante

dos ácidos fenólicos indica que as formas isoméricas reunidas do ácido dicafeoquínico são

mais eficazes na inibição da peroxidação induzida de microssomas do que os ácidos caféico

e clorogênico separadamente, os quais também apresentaram elevado potencial antioxidante

(SOARES, 2002).

COSTA, A. G. L.C

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Sc(OTf)

PhCMeOOH

PhCMeO

Figura 18 - Mecanismo de transferência de hidrogênio da (+) - catequina

para o radical cumilperoxil via transferência de elétrons.

Fonte: Nakanishi et al. (2003)

O estudo de espécies do gênero Baccharis, tem mostrado avanço no que diz respeito

ao seu uso na medicina caseira na América Latina. Em sua fitoquímica se destaca a

ocorrência de compostos fenólicos como flavonóides e ácidos fenólicos (VERDI;

BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005). Também ocorrem estes mesmos compostos em

própolis de diferentes localizações geográficas (GARDANA et al., 2007).

Foram muitos os artigos que relacionaram diretamente a própolis da região sudeste

com a planta B. dracunculifolia, desde que Banskota et al. (1998) publicaram sobre um

derivado diacilado do álcool dihidrodiconiferil encontrado em própolis e um importante

intermediário na formação de lignina da madeira, que já havia sido previamente encontrado

em Baccharis spp.

Park, Ikegaki e Alencar (2000) classificaram as própolis de diversas regiões do

Brasil (Tabela 2) e outros trabalhos relacionaram a própolis do Grupo 12 (PG12) com sua

COSTA, A. G. L.C

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fonte botânica B. dracunculifolia (PARK; ALENCAR; AGUIAR, 2002; KUMAZAWA et

al., 2003).

Tabela 2 - Classificação das própolis brasileiras.

Extrato Etanólico de Própolis

Grupos Cor

Substâncias Solúveis

(%)

Origem da

própolis

Grupo 1 (RS5) Amarelo 63,0 Região Sul

Grupo 2 (RS1) Castanho claro 57,5 "

Grupo 3 (PR7) Castanho escuro 65,0 "

Grupo 4 (PR8) Castanho claro 54,5 "

Grupo 5 (PR9) Marrom esverdeado 58,7 "

Grupo 6 (BA11) Marrom avermelhado 45,9 Região Nordeste

Grupo 7 (BA51) Marrom esverdeado 43,8 "

Grupo 8 (PE5) Castanho escuro 41,3 "

Grupo 9 (PE3) Amarelo 46,7 "

Grupo 10 (CE3) Amarelo escuro 24,1 "

Grupo 11 (PI1) Amarelo 23,1 "

Grupo 12

(SP12)

Verde ou Marrom

esverdeado

61,0 Região Sudeste

Fonte: Park; Ikegaki e Alencar (2000)

A classificação adotada por estes pesquisadores tem sido utilizada desde então e a

própolis do Grupo 12, que está relacionada a diversas propriedades biológicas tem alto valor

comercial.

A composição da própolis depende de sua fonte botânica. A variabilidade na

composição dos metabólitos secundários depende tanto de causas internas quanto externas à

planta, mormente em espécies vegetais crescendo livremente na natureza. Assim, para o

estudo de própolis novas, é altamente recomendável a realização de pesquisas fitoquímicas

concomitantes das plantas relacionadas.

Dentro de um projeto de pesquisas mais amplo sobre a química de espécies do

gênero Baccharis, no qual foram estudadas anteriormente B. uncinella e B. semiserrata, dá-

se atenção agora à B. dracunculifolia, tendo em vista a sua relação com a própolis e também

a importância comercial de seu óleo essencial.

COSTA, A. G. L.C

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Analisar quimicamente amostras de própolis e parte aérea de Baccharis

dracunculifolia DC. da região de Ponta Grossa - PR, comparando com extratos de outras

espécies do gênero Baccharis, visando classificar a própolis regional em comparação com a

própolis verde padrão.

2.2 Objetivos específicos

Determinar a composição química do óleo essencial das folhas de espécimes

masculino e feminino de Baccharis dracunculifolia DC. por cromatografia gasosa acoplada

à espectrometria de massas, como forma de caracterização química do vegetal que cresce in

natura em nossa região.

Comparar a composição química de extratos obtidos com diferentes solventes a

partir das folhas das três espécies vegetais (B. dracunculifolia, B. uncinella e B.

semiserrata), utilizando métodos cromatográficos, especialmente a CLAE e

espectrofotometria.

Verificar as correlações químicas existentes entre as três espécies vegetais,

especialmente B. dracunculifolia, e amostras da própolis produzidas na Região dos Campos

Gerais do Paraná.

Mensurar o potencial antioxidante de extratos obtidos de vegetais e de própolis,

como mais um parâmetro de comparação com a própolis verde padrão e como indicativo da

importância da composição de extratos e de substâncias individuais.

COSTA, A. G. L.C

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Reagentes analíticos

Foram utilizados solventes e reagentes com especificação PA ou de outros graus de

pureza conforme a necessidade. Para a análise química de antioxidação foi utilizado o

radical 2,2-difenil-1-picrilidrazil (DPPH, D9132-5G, Sigma Co). Os seguintes padrões

analíticos de ácidos fenólicos e flavonóides foram utilizados nas análises por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou por Cromatografia de Camada

Delgada (CCD): ácido para-cumárico, ácido ferúlico, ácido cinâmico, ácido gálico,

quercetina, canferol, canferide, apigenina, isosakuranetina, pinocembrina, crisina,

acacetina, galangina e miricetina (Extrasynthese Co.).

3.2 Equipamentos

As análises de óleos essenciais foram feitas em Cromatógrafo Gasoso da marca

Varian® CP-3800 acoplado a um detector de ionização de chama (DIC) ou de massas (EM)

da marca Saturn® 2000, utilizando o software de gerenciamento Saturn® GC-MS

Workstation 5.51, numa cooperação informal entre pesquisadores do nosso laboratório de

pesquisas e do IPT-FURB, Instituto de Pesquisas Tecnológicas da Fundação Universidade

Regional de Blumenau, Blumenau - SC.

As análises de compostos fenólicos sólidos foram feitas por CLAE em

cromatógrafo Shimadzu ODS-A com detector de arranjo fotodiodo (SPD-M10AVp,

Shimadzu Co.). As análises de varredura espectral foram realizadas em equipamento UV

Mini 1240 da Shimadzu em comprimento de onda entre 200-600 nm. Ambos os tipos de

análise foram feitas no Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição da Escola

Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), Universidade de São Paulo,

Piracicaba - SP.

Um espectrofotômetro Multispec – 1501 Shimadzu foi utilizado para as análises de

DPPH, com 518 nm de comprimento de onda. Acoplado ao MS-Windows® para coleta de

dados e detector de fotodiodos com 512 elementos de precisão espectral de 0,1nm.

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3.3 Coleta de própolis e materiais botânicos

O material botânico utilizado neste trabalho, composto por folhas e galhos, foi

coletado na periferia da cidade de Ponta Grossa, Paraná, num terreno situado nas

coordenadas 25º05’16” SUL e 50º06’22” OESTE, conforme especificado na Tabela 3.

Foram preparadas exsicatas dos espécimes masculino e feminino utilizando um ramo

contendo folhas e flores, seguindo indicações da literatura (FIDALGO; BONONI, 1989). As

amostras foram identificadas como Baccharis dracunculifolia DC. pelo Dr. Gert Atschbach

e depositadas no Herbário do Museu Botânico de Curitiba sob os números 338991

(espécime masculino, Bd ♂); 338982 (espécime feminino, Bd ♀).

Tabela 3 - Coletas de materiais botânicos

AMOSTRAS Parte e quantidade

coletada

Data da coleta Finalidade

Bd ♂

~1 Kg de folhas Agosto de 2006 OE e extração c/ solventes

Bd ♀

~1 Kg de folhas Agosto de 2006 OE e extração c/ solventes

Bd ♂

20 g de brotos apicais Julho de 2007 Extração por enxágüe

Bd ♀

20 g de brotos apicais Julho de 2007 Extração por enxágüe

O material vegetal coletado em maior quantidade, constituído por galhos, passou por

um processo de limpeza, eliminando-se matérias estranhas ou partes atacadas por insetos.

Efetuou-se a secagem em temperatura ambiente por sete dias, separando-se as folhas

cuidadosamente para armazenamento em recipientes herméticos, na temperatura ambiente e

ao abrigo da luz até o momento de sua utilização (Item 4.5). Os brotos apicais foram

utilizados logo após a coleta (Item 4.6). Treze amostras de própolis foram obtidas de

apicultores locais (Tabela 4) e conservadas a frio até o momento das extrações (Item 4.6). A

amostra de própolis verde (PG12), utilizada como padrão de comparação neste trabalho, foi

gentilmente cedida pelo professor Dr. Severino Matias de Alencar, da Escola Superior de

Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ).

Tabela 4 - Produtores da região e amostras de própolis

Produtor Número de amostras Código das amostras

ADI 1 ADI

EBS 3 EBS-1; EBS-2; EBS-3

RA 2 RA-1; RA-2

WS 4 WS-1; WS-2; WS-3; WS-4

RS 3 RS-1; RS-2; RS-3

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3.4 Obtenção de amostras de óleo essencial

As folhas secas foram moídas em liquidificador, submetendo-se aproximadamente

100 g de material vegetal dos espécimes masculino e feminino à hidrodestilação em

aparelho de vidro (Figura 19), conforme Stahl e Schild (1981).

Foi utilizado um balão de 5 L contendo 2 L de água destilada, destilando-se durante

4 horas. O óleo volátil foi obtido em éter dietílico, secando-se a solução com Na

anidro.

O solvente foi evaporado na temperatura ambiente, calculando-se o rendimento (0,85% e

0,81% para os espécimes masculino e feminino, respectivamente).

Figura 19 - Desenho e medidas do aparelho

de hidrodestilação utilizado.

(Stahl; Schild, 1981).

3.5 Obtenção de extratos

3.5.1 Extratos obtidos com uma sequência de solventes

Aproximadamente 20 g de folhas de B. dracunculifolia coletadas em 08/2006, após

secagem e trituração, foram extraídos exaustivamente em aparelho Soxhlet por 20 horas

com cada um dos seguintes solventes: clorofórmio (CHCl

), acetato de etila (AcOEt) e

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metanol (MeOH). Os extratos foram concentrados em evaporador rotativo a vácuo

(rendimentos na Tabela 5), obtendo-se os espectros de ultravioleta-visível (UV-VIS) e

análises por CCD e CLAE.

Foram realizadas diversas análises por CCD sobre placas de sílica HF254 e GF254,

utilizando-se sistemas eluentes compostos por AcOEt/MeOH/H

O ou CHCl

/MeOH/H

em diferentes proporções, fazendo-se comparações entre os extratos metanólicos dos

espécimes feminino e masculino de B. dracunculifolia com extratos metanólicos de B.

semiserrata e B. uncinella. Após a eluição, os cromatogramas foram visualizados em luz

UV nos dois comprimentos de onda e revelados: 1) com solução de H

/ metanol (1:1)

seguido de aquecimento sobre placa; 2) com solução 5% de FeCl

em metanol. Os

resultados das placas foram armazenados em arquivos de imagens digitalizadas.

Tabela 5 - Resultado das extrações de B. dracunculifolia (Bd ♂ e Bd ♀), B. uncinella

(Bu) e B. semiserrata (Bs)

Espécime/solvente Folhas (g) Extrato (g) Rendimento (%)

Bd ♂-CHCl

9,882 1,1828 11,97

Bd ♂-AcOEt 9,882 0,9712 9,83

Bd ♂-MeOH 9,882 1,1359 11,49

Bd ♀-CHCl

10,0181 1,4784 14,76

Bd ♀-AcOEt 10,0181 1,1293 11,27

Bd ♀-MeOH 10,0181 1,5324 15,39

3.5.2 Extratos obtidos por enxágue

Foram obtidos extratos dos brotos apicais de espécimes masculinos e femininos

recém coletados (julho de 2007), utilizando-se a técnica de extração por enxágue. Cerca de

20 g de brotos foram obtidos no local de coleta por corte com tesoura e levados

imediatamente ao laboratório, onde foi feita uma limpeza para a retirada de folhas maduras.

Com o auxílio de uma pinça, cada broto foi segurado sobre um béquer, procedendo-se então

ao enxágue com o auxílio de uma pipeta de Pasteur. Cada broto foi lavado com gotas de

metanol por cerca de 2 minutos, trocando o material para novo enxágue até completarem-se

10 mL dos extratos de cada um dos espécimes.

COSTA, A. G. L.C

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3.5.3 Extratos de própolis

Para a obtenção dos extratos etanólicos de própolis foi utilizada a técnica da

maceração. Aproximadamente 2,0 g de própolis e 10,0 mL de etanol a 70% (p/v) ficaram em

contato durante 20 dias, ao abrigo da luz, com agitação e posterior filtração, sendo então as

soluções etanólicas conservadas em geladeira até o momento das análises. Foram obtidos da

mesma forma os extratos das treze amostras de própolis regionais e do padrão de própolis

verde (PG12).

3.6 Análises por CG/EM

Tanto na análise por CG-DIC como na CG-EM, foi utilizada uma coluna capilar de

sílica fundida apolar CP-Sil 8 CB Low Bleed/MS (comprimento de 30 m, diâmetro interno

de 0,25 mm e filme com espessura de 0,25 µm). O fluxo de hélio, o gás de arraste utilizado,

foi de 1,0 mL/min, com a temperatura do injetor mantida em 250 ºC e a do detector DIC em

200 ºC. A temperatura do forno foi programada para iniciar a 60 ºC, permanecendo por aí 3

minutos, subindo então 5 ºC/min até 200 ºC e permanecendo na temperatura final por 15

minutos.

O programa AMDIS (Automated Mass Spectra Deconvolution and Identification

System) acompanha o sistema CG-EM e permite fazer a deconvolução do arquivo de dados

digital obtido para cada amostra injetada no equipamento. A deconvolução leva ao

cromatograma TIC (Total Ion Chromatogram), que é obtido a partir do total de fragmentos

iônicos de cada substância da amostra que atinge o detector EM. A identificação de cada

componente no cromatograma TIC é realizada inicialmente pelo cálculo do seu índice de

retenção de Kovàts (IK) (VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963), determinado em relação à

série homóloga de n-alcanos (C

–C

) e comparado com dados publicados (ADAMS, 1995).

Em seguida, o espectro de massas da substância em questão é comparado pelo AMDIS com

os espectros fornecidos pela biblioteca do sistema NIST, listando-se em ordem decrescente

de similaridade as substâncias que apresentam espectros de massas similares, entre as quais

normalmente é encontrada aquela que tem também um idêntico valor de IK.

A quantificação das substâncias voláteis de cada amostra foi feita com base em seu

cromatograma obtido com uso do detetor DIC, transformando-se em porcentagens as áreas

sob os picos. Os cálculos dos IK foram feitos de forma semelhante ao explicado acima, a

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partir de nova injeção da amostra de óleo essencial e dos padrões de n-alcanos, comparando-

se com os dados obtidos anteriormente com uso do TIC.

(r)x

– t

(r)y

= 100y + 100(z-y) ____________

(r)z

– t

(r)y

Onde:

y = n

de carbonos do padrão de n-alcano à esquerda do componente x;

z = n

de carbonos do padrão de n-alcano à direita do componente x;

(r)x

= tempo de retenção do pico da substância em questão;

(r)y

= tempo de retenção do padrão de n-alcano à esquerda;

(r)z

= tempo de retenção do padrão de n-alcano à direita.

3.7 Análises por espectrofotometria UV-VIS

Todos os extratos obtidos no Item 3.5 foram submetidos à análise do perfil de

varredura espectrofotométrica na faixa de comprimento de onda entre 200 nm e 600 nm,

utilizando-se metanol como solvente. Os resultados destas análises estão apresentados e

discutidos no item 4.3.

3.8 Análises por CCD-AR

Estas análises foram realizadas com os extratos etanólicos das própolis regionais e

PG12, extratos obtidos por enxágüe dos brotos de B. dracunculifolia feminino (Bd ♀-

brotos) e B. dracunculifolia masculino (Bd ♂-brotos) (Item 3.5.2 e 3.5.3). Foram utilizadas

placas de sílica RP-18 F254, 10x10 da MERCK e a mistura EtOH:H

O na proporção de

45:55 como eluente. A quantidade de amostra aplicada em cada ponto foi de 3 µL. Após a

eluição, as placas foram borrifadas com anisaldeído sulfúrico (0,5 mL de anisaldeído, 10 mL

de ácido acético glacial, 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico) e observadas sob luz

UV nos dois comprimentos de onda usuais (254 e 366 nm).

3.9 Análises por CLAE

Foram injetados 15 µL dos extratos das amostras de própolis selecionadas (PG12,

WS-3, ADI e RS-2), comparando-se com os extratos de Bd ♀-brotos e Bd ♂-brotos (20 µL).

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Também foram analisados por CLAE nas mesmas condições os extratos metanólicos de B.

dracunculifolia (espécimes masculino e feminino), B. uncinella e B. semiserrata obtidos

com a seqüência de solventes clorofórmio, acetato de etila e metanol.

Os extratos foram filtrados com um filtro de 0,22 µm (Millipore) e injetados no

sistema CLAE. A coluna RP-18 (4,6 mm × 250 mm; partículas de 5 µm) foi eluída usando-

se um gradiente linear de ácido acético:água (1:20) (solvente A) e metanol (solvente B),

iniciando com 30% de B e aumentando até 90% de B, com vazão de solvente de 1 mL/min.

Os cromatogramas foram registrados a 260 nm como descrito por Park et al. (1997).

3.10 Análises da atividade antioxidante

A atividade antioxidante das amostras de própolis e de brotos de B. dracunculifolia

(itens 4.5.2 e 4.5.3) foi medida frente ao radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH·)

utilizando análise espectrofotométrica em UV/VIS, segundo o método utilizado por Castro e

colaboradores (2006). Uma alíquota de cada amostra (20 µL, 30 µL, 60 µL e 120 µL) foi

adicionada a 2.700 µL de solução de DPPH·0,5 µM preparada em etanol absoluto PA para

medir a possível atividade redutora em presença do DPPH·.

A cinética de descoloração do DPPH· frente às amostras foi registrada durante 5

minutos em 517 nm. Este experimento foi realizado em triplicata e a porcentagem de

atividade seqüestrante foi calculada a partir da fórmula:

[(A

–A

)/A

]*100

onde A

= absorbância sem adição de extrato

= absorbância com adição de extrato.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análise dos óleos essenciais de Baccharis dracunculifolia

A composição química do óleo essencial de Baccharis dracunculifolia (Óleo de

Vassoura) tem sido objeto de estudo há muitos anos (FERRACINI et al., 1995; FRIZZO et

al., 2008; LOAYZA et al., 1995; QUEIROGA et al., 1990). O valor dado a este óleo pela

indústria de perfumes se deve ao seu aroma exótico, que depende da sua composição,

origem geográfica e processo de extração. A importância comercial está relacionada à fração

oxigenada, especificamente a proporções mais elevadas de (E)-nerolidol (1) e espatulenol

(2) (CASSEL et al., 2000).

O presente estudo de B. dracunculifolia seguiu uma metodologia desenhada para

minimizar os fatores considerados responsáveis por variações na composição química de

óleos essenciais. Além dos cuidados práticos considerados importantes no trabalho de

obtenção e análise de qualquer amostra de óleo essencial (AGOSTINI et al., 2005; CASSEL

et al., 2000; FRIZZO et al., 2008; MARCHESAN et al., 2006), foram adotados aqui vários

cuidados especialmente recomendáveis para o estudo dos componentes voláteis de espécies

Baccharis, com base nos problemas enfrentados em vários estudos encontrados na literatura.

Já que estas plantas são dióicas, a coleta de espécimes masculinos e femininos no

mesmo local e horário elimina diversas variáveis importantes associadas a fatores

ecológicos como a quantidade de luz e de água disponíveis. Os materiais vegetais utilizados

neste trabalho foram exclusivamente folhas, eliminando-se totalmente os galhos finos ou

inflorescências, se presentes, e simplificando a comparação entre amostras.

Foi escolhida uma população de plantas com muitos espécimes masculinos e

femininos, crescendo em uma propriedade privada próxima ao Campus, há cerca de 10

quilômetros da Fazenda Escola da UEPG, onde se situa a estação meteorológica que

forneceu os dados sobre precipitação pluviométrica utilizados neste trabalho. Uma forte

florada foi observada no início de 2006, quando diversos espécimes masculinos e femininos

foram marcados com etiquetas de plástico, para permitir que a coleta de material

identificado pudesse ser feita em agosto, ao final da época de estiagem. O material vegetal

foi propositalmente coletado ao final do período mais seco, e ao final de uma tarde de sol,

para uma melhor avaliação da influência da disponibilidade de água sobre o rendimento e a

composição química dos óleos essenciais.

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

JFMAMJJASONDJ

100

150

200

250

Precipitações mensais em 2006

Média das precipitações mensais dos últimos 10 anos

Precipitação (mm)

Ano 2006

Figura 20 - Médias de precipitação mensal dos últimos 10 anos e precipitações mensais

medidas durante 2006 próximo ao local onde foram feitas as coletas. Dados

fornecidos pela Estação Meteorológica da Fazenda Escola, UEPG.

O ano de 2006 foi especialmente seco, com precipitação total de 1.257 mm, bem

abaixo dos 1.644 mm, que é a média anual calculada para os últimos dez anos. A Figura 20

mostra que as precipitações mensais registradas para aquele ano estiveram quase sempre

abaixo das médias mensais dos últimos dez anos e a estação seca, entre abril e agosto, foi

drasticamente mais seca do que a média. O material vegetal utilizado neste estudo dos óleos

essenciais de B. dracunculifolia foi coletado no dia 8 de agosto de 2006, após 10 dias de

ausência de chuvas na região.

O resultado das análises da composição dos óleos essenciais das folhas de

espécimes feminino e masculino de B. dracunculifolia, feitas por técnicas de Cromatografia

Gasosa e Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas, são mostrados

resumidamente na Tabela 6, onde são apresentadas também as porcentagens dos

constituintes e seus Índices de Kovàts calculados para a coluna apolar utilizada (item 3.6.1).

As composições dos óleos essenciais obtidos de espécimes feminino e masculino se

mostram semelhantes, com 24 componentes identificados, representando 97,73 e 97,60%

dos totais, respectivamente. Os monoterpenos perfazem apenas 0,85% da composição do

óleo da planta feminina e 2,35% do óleo da planta masculina, com β-pineno, limoneno e 4-

terpineol como componentes identificados. Os sesquiterpenos hidrocarbonetos totalizaram

(♀ 45,06 – ♂ 37,84%) destacando-se as presenças de β-cariofileno (♀ 7,88 – ♂ 8,88%),

aromadendreno (

♀ 2,93 – ♂ 3,02%), α-humuleno (♀ 4,61 – ♂ 2,18%), γ-muuroleno (♀ 3,48

– ♂ 2,33%), germacreno D (

♀ 5,53 – ♂ 4,04%), trans-β-guaieno (♀ 7,98 – ♂ 6,06%), δ-

cadineno (♀ 7,34 – ♂ 5,48%). Os sesquiterpenos oxigenados constituem as frações

COSTA, A. G. L.C

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

majoritárias dos óleos essenciais de ambos os espécimes (♀ 48,88 – ♂ 49,51%),

apresentando (E)-nerolidol (♀ 24,69 – ♂ 17,16%) e espatulenol (♀ 14,62 – ♂ 21,39%) como

principais componentes, identificando-se ainda outros cinco em porcentagens menores:

cariofileno óxido (♀ 1,16 – ♂ 2,07%), viridiflorol (♀ 1,61 – ♂ 0,88%), α-cadinol (♀ 1,90 –

♂ 2,83%), β-bisabolol (♀ 0,84 – ♂ 2,86%) e α-bisabolol (♀ 1,86 – ♂ 0,10%).

A Figura 21 permite que se faça uma comparação visual dos cromatogramas

registrados nas análises dos dois óleos utilizando um detector de ionização de chama, pois

mostram de imediato as baixas proporções de monoterpenos encontradas em ambas as

amostras.

Tabela 6 - Componentes dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação das folhas de espécimes

feminino (♀) e masculino (♂) de B. dracunculifolia

Componentes

Bd ♀

0,81

Bd ♂

0,85%

coluna apolar

β-pineno

0,10 1,58

980

limoneno

0,45 0,43

1032

terpinen-4-ol

0,40 0,34

1178

α-cubebeno

0,65 0,43

1350

α-copaeno

0,67 0,99

1376

β-elemeno

0,93 0,72

1393

α-gurjuneno

0,46 0,63

1410

β-cariofileno

7,88 8,88

1418

aromadendreno

2,93 3,02

1446

α-humuleno

4,61 2,18

1456

γ-muuroleno

3,48 2,33

1478

germacreno D

5,53 4,04

1482

α-muuroleno

0,38 0,58

1493

trans-β-guaieno

7,98 6,06

1500

γ-cadineno

2,22 2,50

1507

δ-cadineno

7,34 5,48

1512

não identificado

1,09 0,75

1541

(E)-nerolidol

24,69 17,16

1565

espatulenol

14,62 21,39

1576

cariofileno oxido

1,16 2,07

1581

viridiflorol

1,61 0,88

1590

não identificado

0,10 0,84

1596

carotol

1,03 1,57

1599

não identificado

2,51 3,76

1625

α-cadinol

1,90 2,83

1649

não identificado

0,10 1,34

1655

β-bisabolol

0,84 2,86

1665

α-bisabolol

1,86 0,10

1677

não identificado

0,10 0,42

1765

Total identificado

97,73

% 97,60 %

Monoterpenos

0.85

% 2.35 %

Sesquiterpenos

96,88

% 95,25 %

Sesquiterpenos hidrocarbonetos

45,06

% 37,84 %

Sesquiterpenos oxigenados

48,88

% 49,51 %

COSTA, A. G. L.C

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Figura 21 - Comparação entre os cromatogramas obtidos por detecção de

ionização de chama para os óleos essenciais de B. dracunculifolia

analisados no presente trabalho.

Nove amostras de óleos essenciais de B. dracunculifolia coletadas no Sul do Brasil

(4 amostras), Sudeste do Brasil (1 amostra), Uruguai (3 amostras) e Bolívia (1 amostra),

foram apresentadas em uma publicação recente (FRIZZO et al., 2008). Em geral, as

diferentes amostras apresentaram índices elevados de monoterpenos, que atingiram 57,2%

numa das amostras uruguaias, mas a amostra proveniente do Sudeste (Limeira - SP) tinha

apenas 11,5% em monoterpenos, incluindo α-pineno (1,7%), β-pineno (3,5%) e limoneno

(5,4%). Esta amostra de Limeira apresentou como principais sesquiterpenos: β-cariofileno

(6,5%), germacreno D (3,9%), biciclogermacreno (7,5%), δ-cadineno (5,5%), (E)-nerolidol

(18,4%) e espatulenol (5,7%), chamando atenção a notável semelhança desta composição

com as dos óleos obtidos das folhas coletadas em Ponta Grossa (Tabela 6). É interessante

notar também, que os compostos mencionados acima não são os principais componentes

encontrados nas demais amostras analisadas por Frizzo et al. (2008), com exceção do

espatulenol – presente em todas as amostras, e do (E)-nerolidol – ausente nas amostras

uruguaias.

Ferracini et al. (1995) analisaram sistematicamente as possíveis causas de variação

do conteúdo químico dos óleos essenciais de sete espécies do gênero Baccharis coletadas

em área de Cerrado, no Estado de São Paulo. Naquele trabalho, pela primeira vez, foram

comparadas as composições de voláteis extraídos de espécimes femininos e masculinos de

B. caprariaefolia, B. dracunculifolia, B. erioclada. As diferenças encontradas entre os óleos

de espécimes masculinos e femininos da mesma espécie vegetal suscitaram a análise

experimental de diversas hipóteses. Ao longo dos muitos experimentos de coleta, extração e

análise, aqueles autores concluíram que tais diferenças estavam relacionadas à presença de

2,35% monoterpenos

95,25% sesquiterpenos

0,85% monoterpenos

96,88% sesquiterpenos

Óleo do espécime masculino

Óleo do espécime feminino

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inflorescências como impureza contida nas folhas destinadas à extração, levando-nos a

adotar um estrito controle na separação das folhas para as extrações no presente trabalho.

Pode-se considerar que este fator muito contribuiu para a maior similaridade entre os óleos

essenciais das folhas dos espécimes masculinos e femininos de B. dracunculifolia coletados

nos Campos Gerais do Paraná.

Analisando as possíveis causas das diferenças encontradas entre os óleos dos

espécimes feminino e masculino de B. dracunculifolia, Ferracini et al. (1995) submeteram

galhos retirados de uma mesma planta a diferentes condições de irrigação nas 72 horas que

precederam cada hidrodestilação. A primeira amostra foi obtida depois de deixar o galho

permanecer por 72 horas ao ar; a segunda e a terceira amostras foram obtidas após deixar os

galhos com as pontas imersas em água destilada (estresse aquoso) ou em solução aquosa de

cloreto de magnésio 10

-4

M (estresse por MgCl

). Após 72 h nas condições estabelecidas, as

folhas de cada amostra foram hidrodestiladas e analisadas por CG. Uma diminuição da razão

monoterpenos/sesquiterpenos e um aumento de até 100% no rendimento em óleo foram

observados para os materiais vegetais submetidos a estresse por água e por cloreto de

magnésio. Outro experimento foi realizado pelos mesmos autores, monitorando os óleos

essenciais de uma planta feminina e outra masculina de B. dracunculifolia durante a estação

chuvosa e a estação seca (Figura 22), observando-se baixos rendimentos em óleo e uma

maior razão monoterpenos/sesquiterpenos na estação seca.

Figura 22 - Variação do rendimento do óleo essencial de espécimes feminino e

masculino de B. dracunculifolia no decorrer do ano. Fonte:

Ferracini et al. (1995).

Os resultados do conjunto de experimentos feitos em Campinas (FERRACINI et

al., 1995) são concordantes e complementares entre si. No entanto, observou-se que as duas

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amostras do Paraná analisadas no presente trabalho apresentaram também uma baixa razão

monoterpenos/sesquiterpenos e um elevado rendimento (0,81 e 0,85%), mesmo tendo sido

coletadas em agosto de 2006, ao final da época seca nesta região (vide Figura 20, página 48)

e após oito dias de ausência de chuvas. Assim, tudo parece indicar que outros fatores, além

da disponibilidade de água para as plantas, estão desempenhando papéis importantes na

definição do conteúdo químico dos óleos essenciais.

Os altos rendimentos dos óleos essenciais obtidos de plantas crescendo

espontaneamente, as baixas razões monoterpenos/sesquiterpenos e as altas proporções dos

sesquiterpenos oxigenados, especialmente (E)-nerolidol e espatulenol, são as principais

características do óleo das folhas de B. dracunculifolia dos Campos Gerais do Paraná,

quando coletada em condição de baixa disponibilidade de água. A composição do óleo

essencial encontrada aqui reúne propriedades desejáveis sob o ponto de vista comercial

(MOTL; TRKA, 1983). Para melhor avaliar os efeitos que a disponibilidade de água tem

sobre o metabolismo, seria recomendável o uso de outras técnicas de medida, como as

obtidas com a Câmara de Pressão de Scholander (ESPÍRITO-SANTO et al., 2003;

SCHOLANDER et al., 1965). Os resultados do presente estudo mostram também que ainda

é importante estudar os metabólitos secundários produzidos por esta espécie vegetal

crescendo in natura nos mais diferentes ambientes.

4.2 Análises comparativas de três espécies Baccharis

Dentre as espécies do gênero Baccharis que ocorrem na região dos Campos Gerais

do Paraná, três delas são conhecidas como “vassouras” e têm estrutura de arbusto: B.

dracunculifolia, B. uncinella e B. semiserrata. Em épocas de floração, todas são visitadas

por abelhas Apis mellifera, sendo possível que seus componentes façam parte do mel e da

própolis produzida nesta região (NUNES; SENS; SWITALA, 2001). Plantas deste gênero

chamam atenção dos pesquisadores principalmente pela diversidade de metabólitos

secundários que podem produzir (AGOSTINI et al., 2005).

Os rendimentos dos extratos das folhas destas três espécies de Baccharis obtidos

com a seqüência de solventes de polaridade crescente clorofórmio, acetato de etila e

metanol, podem ser comparados na Tabela 7. Os extratos das folhas de espécimes feminino

(♀) e masculino (♂) de B. dracunculifolia foram comparados com extratos similares obtidos

em trabalhos de pesquisa anteriores, realizados em nosso próprio laboratório com B.

uncinella (ASCARI, 2007) e B. semiserrata (MENDES, 2007), as quais não haviam sido

COSTA, A. G. L.C

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diferenciadas, naquele tempo, por identificação dos espécimes masculinos e femininos.

Observam-se proporções diferentes de metabólitos secundários extraídos de cada espécie e

espécime, com rendimentos totais dos extratos variando de 24,28% até 41,42%.

Tabela 7 - Rendimentos das extrações de folhas de três espécies de Baccharis obtidas com a

seqüência de solventes

Espécie CHCl

AcOEt MeOH Totais

B. dracunculifolia ♂

11,97 % 9,83 % 11,49 % 33,29%

B. dracunculifolia ♀

14,76 % 11,27 % 15,39 % 41,42%

B. uncinella

15,78% 2,63% 14,02% 32,43%

B. semiserrata

5,77% 8,13 % 10,38 % 24,28%

As amostras de folhas dos espécimes masculino e feminino de B. dracunculifolia

apresentaram proporções semelhantes nos três extratos, com boa proporção de metabólitos

secundários de polaridade média, que aparecem principalmente nos extratos obtidos com

acetato de etila. O mesmo não ocorre quando se trata de B. uncinella, mostrando que podem

ocorrer diferenças significativas entre as espécies.

Todos os extratos obtidos com metanol, último solvente da seqüência, contém

quantidades apreciáveis de substâncias fenólicas polares, como mostram claramente as

análises por cromatografia de camada delgada. Assim, as placas cromatográficas de sílica

dos extratos metanólicos das três espécies de Baccharis: B. dracunculifolia, B. uncinella e

B. semiserrata foram corridas com sistemas eluentes polares, como AcOEt/MeOH/H

O na

proporção de 7:3:0,5 e reveladas para fenóis com solução 5% de FeCl

em metanol ou com

/MeOH (1:1) seguido de aquecimento sobre chapa (Figura 23).

As análises por cromatografia em camada delgada mostraram pelo menos cinco

componentes polares com os mesmos Rf, que são encontrados em todos os quatro extratos

metanólicos, sendo estas as primeiras observações já feitas sobre a ocorrência de substâncias

fenólicas idênticas em B. dracunculifolia, B. semiserrata e B. uncinella. Os extratos das três

espécies também foram analisados por CCD com vários sistemas eluentes, em comparação

com padrões de ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido cinâmico, ácido gálico e quercetina,

mas nenhuma destas substâncias pôde ser detectada em nenhum dos extratos.

Os estudos químicos publicados sobre a composição das folhas de B. dracunculifolia

(KUMAZAWA et al., 2003; NAGATANI; WARASHINA; NORO, 2001 e 2002), indicam

que os principais compostos fenólicos polares aí presentes são quecetina-3-β-O-glucosídeo,

ácido 3,4-dicafeoilquínico, ácido 3,5-dicafeoilquínico e dracunculifosídeo A. Derivados do

COSTA, A. G. L.C

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

ácido mono-, di-, e tricafeoilquínico já foram também encontrados em própolis provenientes

do Brasil (GARDANA et al., 2007) e já foi demonstrada a ocorrência destes compostos na

própolis verde (KUMAZAWA et al., 2003).

Figura 23 - Análises por CCD dos extratos metanólicos de B. dracunculifolia (Bd F e

Bd M), B. semiserrata (Bs) e B. uncinella (Bu) utilizando sistema eluente

polar (AcOEt:MeOH:H

O 7:3:0,5). Revelação: observação sob luz UV de

254 e 360 nm; FeCl

(CCD 1); H

e aquecimento (CCD 2).

Os espectros de absorção ultravioleta dos quatro extratos metanólicos apresentaram

perfis muito semelhantes: os extratos das folhas dos espécimes feminino e masculino de B.

dracunculifolia têm máximos de absorção em 323 e 327 nm, respectivamente; B. uncinella e

B. semiserrata em 328 nm (Tabela 8). Estas absorções são características dos mencionados

ácidos fenólicos livres e dos ésteres mono-, di- e tricafeoil do ácido quínico (vide Tabela 1).

Tabela 8 – Máximos de absorção dos espectros de UV dos extratos das folhas de B. dracunculifolia

(♀ e ♂), B. uncinella e B. semiserrata obtidos com acetato de etila e metanol.

Extrato

UV (λ

máx

)

Bd ♀ MeOH 294 e 323 nm

Bd ♂ MeOH 327 nm

Bu MeOH 328 nm

Bs MeOH 244 e 328 nm

Bd ♀ AcOEt 292 nm

Bd ♂ AcOEt 291 nm

Bu AcOEt 311 nm

Bs AcOEt 320 nm

(CCD 1) (CCD 2)

COSTA, A. G. L.C

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

Nos espectros de ultravioleta dos quatro extratos obtidos com acetato de etila

utilizando a seqüência de solventes iniciada com clorofórmio, observa-se que há diferenças

significativas. Os dois extratos AcOEt de B. dracunculifolia têm máximos em torno de 290

nm, que equivalem aos de alguns flavonóides como pinobancsina, pinocembrina. Uma

absorção máxima em 294 nm também foi encontrada no espectro do extrato metanólico do

espécime feminino de B. dracunculifolia. Por outro lado, os extratos de B. semiserrata e B.

uncinella obtidos com acetato de etila apresentam máximos em 311 e 320 nm, que podem

indicar a predominância dos ésteres aromáticos do ácido quínico.

Os extratos metanólicos obtidos ao final da seqüência de solventes a partir de folhas

das três espécies Baccharis foram também analisados por CLAE, cromatografia líquida de

alta eficiência, utilizando um equipamento Shimadzu ODS-A com detector de arranjo

fotodiodo (SPD-M10AVp, Shimadzu Co.). As identificações são asseguradas pelo tempo de

retenção e pelo espectro de ultravioleta, que correspondem satisfatoriamente aos dados

obtidos na injeção dos padrões. Na Figura 24 são mostrados os cromatogramas CLAE dos

quatro extratos vegetais, para uma comparação visual e a Tabela 9 apresenta resumidamente

os resultados destas quatro análises.

Estas análises levaram à identificação do flavonóide rutina (12) (13,54 min) em

ambos os extratos de B. dracunculifolia e, pela primeira vez, num extrato de B. uncinella.

Também é inédita a identificação do ácido ferúlico (22) (9,18 min) em B. uncinella (2,5%) e

em B. semiserrata (7,5%). Observa-se um total de ~19% em ácidos aromáticos livres nos

dois extratos de B. dracunculifolia, aparecendo o ácido ferúlico como um dos principais

componentes (

♀ 8,4 – ♂ 14,1%); os ácidos caféico (21) (♀ 4,5 – ♂ 4,8%, 5,57 min) e p-

cumárico (23) (8,14 min, presente apenas em ♀, 6,0%) foram detectados em menores

proporções.

As análises por CLAE confirmam as previsões iniciais, baseadas em CCDs, sobre a

co-ocorrência de compostos fenólicos majoritários de natureza polar nos extratos

metanólicos das três espécies vegetais. No entanto, as substâncias identificadas por CLAE

são os ácidos fenólicos livres, encontrados em menor proporção e que não foram detectados

nas análises preliminares por CCD. Vários picos dos cromatogramas apresentaram

substâncias com espectros de ultravioleta e máximos de absorção característicos da presença

de oxigênio nas posições 3 e 4 dos anéis aromáticos de cafeoilésteres do ácido quínico (em

torno de 325 nm), encontrados anteriormente em B. dracunculifolia (KUMAZAWA et al.,

2003; NAGATANI; WARASHINA; NORO, 2001 e 2002), mas não foram identificados

completamente pela inexistência de padrões adequados.

COSTA, A. G. L.C

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

Figura 24 – Análises por CLAE dos extratos metanólicos das folhas de B. dracunculifolia, B. uncinella e

B. semiserrata.

Tabela 9 – Principais dados das análises por CLAE sobre a rutina e os ácidos fenólicos e

derivados dos extratos metanólicos de B. dracunculifolia (Bd ♀, Bd ♂), B.

uncinella (Bu) e B. semiserrata (Bs).

min

máx

Bd ♀

Bd ♂

4,31 325 nm 10,13 19,02 12,71 22,39

5,56 324 nm, ácido caféico 4,84 4,49 - -

6,47 323 nm 1,91 1,80 1,28 -

8,15 310 nm, ácido p-

cumárico

6,08 - - -

9,18 324 nm, ácido ferúlico 8,48 14,18 2,59 7,56

10,33 325 nm 6,84 9,64 13,44 11,66

13,52 252 nm, rutina 3,94 3,01 2,76 -

14,50 324 nm 10,27 12,60 14,93 15,75

17,97 322 nm 1,30 - - -

18,98 313 nm 0,63 - - -

21,49 327 nm - - 2,18 -

25,99 326 nm 1,99 1,96 - -

. dracunculifolia, feminino

B. uncinella

B. dracunculifolia, masculino

B. semiserrata

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

Os dados referentes às três substâncias majoritárias dos quatro cromatogramas, com

tempo de retenção em 4,29, 10,36 e 14,52 minutos, sugerem tratar-se dos ácidos

clorogênico, 3,4-dicafeoilquínico e 3,5-dicafeoilquínico, respectivamente, identificados

anteriormente em B. dracunculifolia e na própolis verde (KUMAZAWA et al., 2003

NAGATANI; WARASHINA; NORO, 2001 e 2002). Estes dados ampliam o conhecimento

científico sobre a ocorrência de derivados do ácido cafeoilquínico no gênero Baccharis, que

parece ser bem mais generalizada, pois foram também isolados anteriormente de três outras

espécies, as carquejas B. trimera, B. usterii e B. crispa, onde desempenham papéis

importantes relacionados à suas atividades biológicas já comprovadas em extratos

(SIMÕES-PIRES et al., 2005).

4.3 Correlações químicas entre B. dracunculifolia e a própolis regional

Muitas plantas são utilizadas pelas abelhas como fonte da própolis. Park, Ikegaki e

Alencar (2000), classificaram as própolis brasileiras em 12 grupos, de acordo com a fonte

botânica principal. Segundo esta classificação, a própolis de maior importância comercial e

considerada também como fonte de substâncias únicas em suas bioatividades, é encontrada

na região sudeste do Brasil, principalmente nos estados de São Paulo e Minas Gerais, sendo

conhecida como própolis verde pela sua cor e classificada no grupo 12, PG12.

Figura 25 – Abelhas coletando de folhas de B. dracunculifolia o material para a

produção da própolis verde. Fonte: Kumazawa et al., 2003.

COSTA, A. G. L.C

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

O grupo 12 incluiu as própolis que têm como fonte botânica a planta Baccharis

dracunculifolia (Figura 25), também conhecida como alecrim-do-campo ou vassoura

(KUMAZAWA et al., 2003; ALENCAR et al., 2005).

As abelhas retiram da base dos brotos mais tenros de B. dracunculifolia a resina que

utilizam para preparar a própolis verde (KUMAZAWA et al., 2003; PARK; ALENCAR;

AGUIAR, 2002). Para o estabelecimento de uma correlação entre a composição química dos

brotos apicais de B. dracunculifolia e as amostras de própolis da região de Ponta Grossa, a

metodologia utilizada foi aquela desenvolvida por Park, Ikegaki e Alencar (2000).

Assim, foram inicialmente comparados os perfis de absorção de luz ultravioleta e

visível dos extratos etanólicos de cada amostra de própolis regional (Item 3.5.2), agrupando-

as de acordo com a semelhança entre seus máximos de absorção. A análise comparativa dos

espectros de absorção UV-VIS sugeriu a separação das amostras em dois grupos distintos,

como mostrado na Tabela 10, abaixo.

Tabela 10 - Máximos de absorbância (λ máx.) dos extratos etanólicos da

própolis PG12 e das própolis regionais separadas em Grupo 1

e Grupo 2.

Grupo 1 λ máx. Grupo 2 λ máx.

RA-1 307,0 nm RS-1 271,0 nm

RA-2 299,5 nm RS-2 271,5 nm

ADI 306,5 nm RS-3 274,0 nm

EBS-1 300,5 nm WS-1 279,0 nm

EBS-2 311,0 nm WS-2 271,5 nm

EBS-3 311,0 nm

WS-3 313,0 nm

WS-4 296,5 nm

PG12 290,0 nm

Figura 26 – Espectros UV-VIS dos extratos etanólicos das amostras WS-3 e RS-2,

consideradas típicas de cada um dos dois grupos de própolis regionais.

As amostras do Grupo 1 têm espectros de absorção similares ao obtido para o padrão

de própolis verde PG12, e aos obtidos por Park, Ikegaki e Alencar (2000) para a própolis do

RS-2

Grupo 2

WS-3

Grupo1

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

sudeste do Brasil, com máximos de absorção geralmente entre 290 e 313 nm. O Grupo 2

reúne amostras que apresentaram espectros bastante similares entre si e com máximos entre

271,5 e 279 nm.

Para uma comparação, a Figura 26 apresenta os espectros de ultravioleta de amostras

típicas de cada um dos dois grupos, observando-se que os extratos do Grupo 2 apresentaram

menores intensidades de absorção, isto podendo indicar a ocorrência de menores

concentrações de substâncias fenólicas.

Os extratos obtidos por enxágüe dos brotos frescos de espécimes feminino e

masculino de B. dracunculifolia, conforme descrito no item 3.5.2, também foram analisados

por CCD-AR, demonstrando a predominância das substâncias fenólicas apolares, como

esperado em comparação com a literatura (ALENCAR et al., 2005; MARCUCCI et al.,

2001). Na obtenção destes extratos foi empregado o método do enxágüe rápido dos brotos

apicais frescos, que permite extrair principalmente as substâncias que compõem a resina da

planta, onde estão os compostos mais importantes encontrados também na própolis verde.

Os espectros de ultravioleta destes extratos obtidos por enxágüe apresentaram dois máximos

de absorção, em torno de 281 nm e de 366 nm, já indicando a provável presença de

artepelina C (vide espectro, Figura 27).

Spectrum at time 75.23

200

225 250 275 300 325 350

75.23

Figura 27 - Espectro de ultravioleta do pico da artepilina C (t

=75,23 min), com seu

máximo de absorção em torno de 280 nm.

As análises dos extratos de própolis regionais por CCD-AR (item 3.6.3) mostraram

mais alguns detalhes, semelhanças e diferenças nas composições, que indicaram a

conveniência de subdividir oito das amostras de própolis regionais em Grupo 1a, Grupo 1b e

Grupo 2, como apresentado na Tabela 11.

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

Tabela 11 - Reagrupamento das própolis da região de Ponta Grossa.

GRUPO 1 GRUPO 2

1a 1b

ADI WS-3 RS-2

RA-2 EBS-2 WS-1

WS-4 PG12 EBS-1

Três amostras de própolis regionais, uma de cada um dos três grupos acima, foram

escolhidas para comparação usando CLAE com o padrão de própolis verde PG12: ADI,

WS-3 e RS-2. Além disto, os extratos metanólicos obtidos por enxágüe dos brotos de

espécimes feminino e masculino de B. dracunculifolia também foram submetidos a análises

nas mesmas condições. Os resultados destas análises por CLAE são apresentados

resumidamente na Figura 28 e na Tabela 12.

Tabela 12 - Principais dados das análises por CLAE dos extratos da própolis PG12, das própolis

regionais WS-3, RS-2 e ADI e dos brotos de B. dracunculifolia (Bd ♀ e Bd ♂).

Substância

identificada

máx

min

PG12

WS-3

RS-2

ADI

Bd ♀

Bd ♂

- 324 nm 4,17 1,22 1,08 0,65 3,94 - -

ácido caféico 322 nm 5,54 traço 0,80 0,56 1,86 - -

ácido p-cumárico 307 nm 8,08 3,86 3,34 3,26 3,55 - -

ácido ferúlico 322 nm 10,25 3,15 2,77 2,63 1,21 - -

- 325 nm 14,44 5,05 4,46 2,70 2,07 - -

- 289 nm 22,86 2,31 1,15 0,60 0,70 - -

apigenina 264 nm 34,86 - 3,96 2,46 3,06 4,73 7,34

- 265 nm 42,96 - 17,85 11,85 20,73 10,41 20,02

- 312 nm 45,80 1,01 1,80 5,73 1,73 - 2,31

crisina 269 nm 49,08 18,10 - - - - -

- 277 nm 49,69 - 2,06 3,37 2,80 31,71 21,84

- 290 nm 55,05 - 2,32 1,24 1,94 17,04 10,98

- 313 nm 64,01 8,59 8,87 10,22 9,74 8,78 9,58

artepilina C 279 nm 75,48 13,25 6,08 4,68 1,88 8,72 10,25

- 314 nm 77,35 2,91 3,54 1,64 3,16 traço traço

As amostras de própolis apresentaram porcentagens moderadas dos ácidos

fenólicos livres, totalizando entre 6,4 e 7,0%, embora o ácido caféico tenha sido detectado

apenas como traço no padrão de PG12. As substâncias com tempo de retenção 4,17 min (λ

máx

= 324 nm) e 14,44 min (λ

máx

= 325 nm) são vistas nas quatro amostras de própolis e devem

corresponder ao ácido clorogênico a ao ácido 3,5-dicafeoilquínico detectados anteriormente

(item 4.2) nos extratos metanólicos das folhas de B. dracunculifolia, B. uncinella e B.

semiserrata. Nenhuma destas substâncias polares aparece nos extratos obtidos por enxágüe

rápido dos brotos tenros de B. dracunculifolia, que extrai essencialmente substâncias

presentes na resina e normalmente são preparados para correlacionar amostras de própolis

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

desconhecidas a esta planta, pela presença de substâncias que podem ser consideradas de

polaridades baixas a medianas.

Figura 28 – Cromatogramas obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência dos extratos metanóli-

cos de brotos de B. dracunculifolia masculino (Bd ) e feminino (Bd ), extratos das pró-

polis regionais WS-3, RS-2, ADI e da PG12.

A presença das substâncias apolares com tempos de retenção de 64,01 min, 75,48

min e 77,35 min, em todos os cromatogramas da Figura 28, pode ser considerada uma

indicação segura de que as quatro própolis analisadas foram preparadas com resina de B.

WS-3 RS-2

ADI PG12

Bd ♂ Bd ♀

COSTA, A. G. L.C

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microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

dracunculifolia (KUMAZAWA et al., 2003; PARK; ALENCAR; AGUIAR, 2002). A

artepilina C (75,48 min), segunda principal substância presente no extrato de própolis PG12

(13,25%), é de extrema importância para a qualidade da própolis verde brasileira

(ALENCAR et al., 2005; KONISHI et al., 2005; PAULINO et al., 2008; PISCO et al.,

2006). As amostras de própolis regionais ADI, WS-3 e RS-2 apresentaram proporções

baixas de artepelina C, assim como dos outros dois componentes apolares, o que poderia

levar a uma depreciação em relação à própolis verde.

Mas, na faixa de tempos de retenção medianos das análises por CLAE,

encontramos flavonóides como substâncias principais. A crisina (18) (49,08 min), já

encontrada antes como um dos principais componentes da própolis verde (GARDANA et

al., 2007; MARÓSTICA JR et al., 2008), é também a principal substância do extrato da

PG12 (18,1%) mas está ausente nos extratos de própolis regionais. Por sua vez, as amostras

ADI, WS-3 e RS-2 apresentaram proporções entre 2,4% e 3,9% de apigenina (16) (34,86

min, λ

máx

= 264 nm), não detectada no padrão de PG12. Além disto, a principal substância

presente em cada um dos três extratos das própolis regionais, mas ausente na PG12, com

porcentagens de até 20,7% (ADI), apresentou tempo de retenção de 42,96 minutos e um

máximo de absorção em 265 nm. Apesar de apresentar um máximo de absorção muito

similar ao da apigenina, os tempos de retenção diferem grandemente, e a substância não foi

identificada pela inexistência de padrão.

Assim, os dados destas análises por CLAE indicam que as própolis regionais têm

características químicas gerais muito similares ao padrão da própolis verde PG12 utilizada,

sendo garantido que a sua origem vegetal é B. dracunculifolia. A principal diferença

observada está relacionada ao conteúdo em flavonóides: enquanto que o extrato do padrão

PG12 apresentou 18,1% de crisina, os extratos de própolis regionais ADI, WS-3 e RS-2

apresentaram 17,8%, 11,8% e 20,7%, respectivamente, de um flavonóide diferente que não

foi identificado. Este suposto flavonóide (42,96 min) aparece também nos extratos dos

brotos de B. dracunculifolia como componente majoritário, mostrando claramente a

existência de uma co-relação química entre a planta que cresce livre na natureza da região

dos Campos Gerais e as amostras de própolis ali produzidas.

4.4 Atividade antioxidante

Os resultados do teste de atividade antioxidante das amostras de própolis avaliadas

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

são apresentados Tabela 13, expressos como porcentagem de inibição da oxidação. Em

geral, observou-se que todas as amostras apresentaram excelente atividade antioxidante,

várias delas chegando a ser mais efetivas que a própolis PG12 utilizada como referência.

Comparativamente, várias amostras também inibiram menos do que 100% do DPPH

presente, durante o tempo total de 300 segundos, mesmo com a alíquota de 120 µL de

extrato.

Três das amostras de própolis regionais causaram uma inibição de 100% já com a

alíquotas de 20 µL (WS-3, RA-1 e RA-2), todas inicialmente reunidas no Grupo 1 das

própolis regionais (Tabela 10). O extrato da própolis regional ADI também apresentou

comportamento semelhante, inibindo 91% na menor concentração. As análises por CLAE

mostraram que as concentrações de substâncias fenólicas nos extratos de própolis podem

ser ligeiramente diferentes, além das diferenças nas composições e nas proporções entre os

componentes.

Os dois extratos obtidos por enxágüe dos brotos de B. dracunculifolia aparecem

separados na Tabela 13, parte inferior, porque podem ser comparados somente entre si. As

atividades antioxidantes registradas para estes extratos vegetais mostram coerência com a

presença maciça de substâncias fenólicas, como bem mostraram as análises por CLAE.

Além disto, observa-se grande semelhança entre os efeitos antioxidantes dos extratos

obtidos dos espécimes masculino e feminino, nas quatro concentrações.

Tabela 13 - Seqüestro do radical DPPH dos extratos de própolis e brotos de

B. dracunculifolia em porcentagem.

EXTRATO

20 µL 30 µL 60 µL 120 µL

EBS-01

59,63% 60,82% 100% 100%

EBS-02

86,47% 91,25% 100% 100%

EBS-03

66,14% 100% 100% 100%

WS-1

59,58% 100% 100% 100%

WS-2

72,83% 100% 100% 100%

WS-4

73,73% 100% 100% 100%

RS-1

59,43% 52,26% 72,79% 100%

RS-3

22,39% 29,78% 50,67% 72,03%

RA-1

100% 100% 100% 100%

RA-2

100% 100% 100% 100%

ADI

91,03% 100% 100% 100%

WS-3

100% 100% 100% 100%

RS-2

25,95% 39,39% 100% 100%

PG12

16,78% 28,54% 51,48% 100%

Bd ♀ brotos

64,64% 72,40% 100% 100%

Bd ♂ brotos

54,43% 73,72% 100% 100%

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

Os gráficos da Figura 29, abaixo, mostram a cinética de seqüestro do radical livre

DPPH dos três extratos de própolis regionais em comparação com o extrato de PG12. Pode-

se observar que, mesmo na menor concentração, os extratos de própolis ADI e WS-3

reduziram o radical livre DPPH em menos de 1/3 do tempo de leitura de 300 segundos. Por

outro lado, os extratos das amostras RS-2 e PG12 apresentaram cinéticas bastante

semelhantes, com perfil alongado, atingindo 100% de inibição somente com 60 ou 120 µL.

Todos os extratos de própolis foram preparados de forma idêntica (item 3.5.3), de forma que

os resultados dos testes como antioxidante devem ser proporcionais ao conteúdo químico de

quantidades iguais de cada amostra.

0 50 100 150 200 250 300

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

2IR

ABSORBÂNCIA

TEMPO EM SEGUNDOS

20 uL

30 uL

60 uL

120 uL

0 50 100 150 200 250 300

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

ABSORBÂNCIA

TEMPO EM SEGUNDOS

20 uL

30 uL

60 uL

120 uL

0 50 100 150 200 250 300

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

R02

ABSORBÂNCIA

TEMPO EM SEGUNDOS

20 uL

30 uL

60 uL

120 uL

0 50 100 150 200 250 300

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

PG12

ABSORBÂNCIA

TEMPO EM SEGUNDOS

20 uL

30 uL

60 uL

120 uL

Figura 29 – Cinética da reação entre o radical DPPH e os extratos de própolis regionais ADI, WS-3 e RS-2 e

de própolis verde PG12 nas alíquotas de 20, 30, 60 e 120 µL.

Considerando mais uma vez os resultados das análises por CLAE das quatro

amostras de própolis ADI, WS-3, RS-2 e PG12, dados na Tabela 12, observa-se que as seis

ADI

WS-3

RS-2

PG12

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

substâncias polares presentes nestas amostras entre os tempos de retenção de 4,17 e 22,86

minutos, incluindo os ácidos caféico, p-cumárico e ferúlico, aparecem em proporções

individuais abaixo de 5,0%, e totalizam entre 10,4 e 15,6% nos extratos. Assim, pode-se

esperar que estes componentes não sejam os responsáveis por diferenças importantes entre

as atividades antioxidantes medidas nos extratos.

Por outro lado, entre as três substâncias menos polares, foram observadas

porcentagens similares entre os picos em 64,01 minutos (de 8,59% a 10,22%) e em 77,35

minutos, mas uma variação grande no conteúdo de artepilina C (de 1,88% a 13,25%).

Considerando a baixa influência relativa da crisina sobre a atividade antioxidante em

comparação com a artepilina C (KUMAZAWA; HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004),

pode-se concluir que este ácido fenólico diprenilado é o principal responsável pelo

desempenho da própolis PG12 neste teste. No entanto, observou-se que as amostras de

própolis regionais apresentaram valores de porcentagens de artepilina C que não tem uma

relação direta com os resultados dos testes antioxidantes: 6,08% em WS-3, 4,68% em RS-2

e apenas 1,88% em ADI.

A apigenina, ausente nesta amostra de PG12 e presente em até 3,96% nas própolis

regionais, também tem uma baixa influência relativa sobre a atividade antioxidante destes

extratos (KUMAZAWA; HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004). Assim, parece provável que

o flavonóide não identificado nas amostras de própolis regionais (λ

máx

365 nm, 42,96 min)

seja o principal responsável pelas fortes atividades antioxidantes dos extratos de própolis

regionais. WS-3 apresenta 6,08% de artepilina C, menos da metade do que a PG12, mas isto

seria compensado pela presença de 17,85% do flavonóide em questão, elevando a atividade

antioxidante. A amostra ADI apresenta uma cinética semelhante à WS-3, tendo seu baixo

conteúdo em artepilina C (1,88%) compensado pelos 20,73% do flavonóide não

identificado. E a amostra RS-2, com 4,68% de artepilina C e apenas 11,85% do suposto

flavonóide, acaba apresentando uma cinética diferente das outras duas amostras de própolis

regionais, e mais parecida à PG12.

4.5 Conclusões

→ Os altos rendimentos dos óleos essenciais obtidos de plantas crescendo espontaneamente,

as baixas razões monoterpenos/sesquiterpenos e as altas proporções dos sesquiterpenos

oxigenados, especialmente (E)-nerolidol e espatulenol, são as principais características do

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

óleo essencial das folhas de B. dracunculifolia dos Campos Gerais do Paraná, quando

coletada em condição de baixa disponibilidade de água.

→ A composição do óleo essencial encontrada aqui reúne propriedades desejáveis sob o

ponto de vista comercial.

→ Foram identificados o flavonóide rutina (12) em ambos os extratos de B. dracunculifolia

e, pela primeira vez, num extrato de B. uncinella. Também é inédita a identificação do ácido

ferúlico (22) em B. uncinella (2,5%) e em B. semiserrata (7,5%).

→ Ácidos aromáticos livres estão presentes nos dois extratos de B. dracunculifolia,

aparecendo o ácido ferúlico como um dos principais componentes (Bd ♀ 8,4 – ♂ 14,1%); os

ácidos caféico (21) (Bd ♀ 4,5 – Bd ♂ 4,8%) e p-cumárico (23) (presente apenas em Bd ♀ -

6,0%) foram detectados em menores proporções.

→ Está confirmada a co-ocorrência de compostos fenólicos majoritários de natureza polar

nos extratos metanólicos das três espécies vegetais podendo, sendo muito provável tratar-se

de ésteres do ácido quínico.

→ As própolis regionais têm características químicas gerais muito similares ao padrão de

própolis verde PG12 utilizado, sendo garantido que a sua origem vegetal é B.

dracunculifolia.

→ Os extratos de própolis regionais ADI, WS-3 e RS-2 apresentaram um flavonóide

diferente que não foi identificado. Este suposto flavonóide mostra claramente a existência de

uma co-relação química entre a B. dracunculifolia da região dos Campos Gerais e as

amostras de própolis.

→ Todas as amostras de própolis utilizadas apresentaram excelente atividade antioxidante.

4.6 Perspectivas para este trabalho

Os resultados do presente estudo mostram que ainda é importante pesquisar os

metabólitos secundários produzidos por esta espécie vegetal crescendo in natura nos mais

COSTA, A. G. L.C

.- Estudo químico de Baccharis dracunculifolia DC. e sua correlação com a própolis de uma

microrregião dos Campos Gerais do Paraná.

diferentes ambientes. O estudo das variações na composição do óleo essencial de B.

dracunculifolia ao longo do ano, com avaliação contínua dos efeitos que a disponibilidade

de água tem sobre o metabolismo. O uso de técnicas de medida da disponibilidade real de

água, como as obtidas com a Câmara de Pressão de Scholander poderiam trazer

contribuições importantes no esclarecimento sobre o papel da água na acumulação de

compostos voláteis.

Outra perspectiva importante apontada por este trabalho, é o isolamento e a

identificação das substâncias polares contidas nos extratos metanólicos de Baccharis

dracunculifolia, B. uncinella e B. semiserrata, da mesma forma que o isolamento e

identificação do suposto flavonóide (λ

máx

365 nm, 42,96 min) presente nos extratos de

própolis e de B. dracunculifolia regionais.

Os resultados deste trabalho são colocados, desde já, à disposição da comunidade de

apicultores da Região dos Campos Gerais como um marco inicial a caminho do

reconhecimento dos valores da própolis regional.

Referências

5 REFERÊNCIAS

ABAD, M. J.; BERMEJO, P. Baccharis (Compositae): a review update. ARKIVOC, v.2, p.76-96,

2007.

ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by Gas Chromatography – Mass

Spectroscopy. Carol Stream: Allured, 1995. 469 p.

AGOSTINI, F.; SANTOS, A. C. A.; ROSSATO, M.; PANSERA, M. R.; ZATTERA, F.;

WASUM, R.; SERAFINI, L. A. Estudo do óleo essencial de algumas espécies do gênero

Baccharis (Asteraceae) do sul do Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 15, n. 3, p.

215-220, jul./set. 2005.

AHN, M.; KUNIMASA, K.; OHTA, T.; KUMAZAWA, S.; KAMIHIRA, M.; KAJI, K.; UTO, Y.;

HORI, H.; NAGASAWA, H.; NAKAYAMA, T. Supression of tumor-induced angiogenesis by

Brazilian propolis: Major component artepillin C inhibits in vitro tube formation and endothelial

cell proliferation. Cancer Letters, v. 252, n. 2, p. 235-243, 2007.

ALENCAR, S. M.; AGUIAR, C. L.; PAREDES-GUZMÁN, J.; PARK, Y. K. Composição

química de Baccharis dracunculifolia, fonte botânica das própolis dos estados de São Paulo e

Minas Gerais. Ciência Rural, Santa Maria, v. 35, n. 4, p. 909-915, jul./ago. 2005.

Apicultura. Disponível em: http:/www.breyer.ind.Br/apicultura/apicultura_própolis.htm. Acesso

em 23 nov. 2007.

ARDUIN, M.; KRAUS, J. E. Anatomia de galhas de ambrosia em folhas de Baccharis concinna e

Baccharis dracunculifolia (Asteraceae). Revista Brasileira de Botânica. v. 24, n. 1, p. 63-72,

2001.

ASCARI, J. Estudo Químico e Bioatividades de Baccharis uncinella DC. Dissertação (Mestrado

em Química Aplicada). Universidade Estadual de Ponta Grossa, 2007.

BANKOVA, V. Recent trends and important developments in propolis research. Advance Access

Publication, eCAM v. 2, n. 1, p. 29-32, 2005.

BANSKOTA, A. H.; TEZUKA, Y.; PRASAIN, J. K.; MATSUSHIGE, K.; SAIKI, I.; KADOTA,

S. Chemical Constituents of Brazilian Propolis and Their Cytotoxic Activities. J. Nat. Prod. v. 61,

p. 896-900, 1998.

BARREIROS, A. L. B.S.; DAVID, J. P.; DAVID, J. M. Estresse Oxidativo: Relação entre espécies

reativas de oxigênio e a defesa do organismo. Quím. Nova. v. 29, p. 113-123, 2006.

Referências

BARROSO, G.M. Compositae-subtribo Baccharidineae Hoffmann. Estudo das espécies ocorrentes

no Brasil. Rodriguesia, v. 28, p. 1-273, 1976.

BIANCHI, M. DE L. P., ANTUNES, L. M. G. Radicais Livres e os Principais Antioxidantes da

Dieta. Rev. Nutr., Campinas, v. 12, n. 2, p. 123-130, mai./ago., 1999.

BRUNETON, J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. 2. ed. França: Lavoisier

Publishing, 1995, 819 p.

BUDEL, J. M.; DUARTE, M. R.; SANTOS, C. A. M.; FARAGO, P. V. Morfoanatomia Foliar e

Caulinar de Baccharis dracunculifolia DC., Asteraceae. Acta Farm. Bonaerense, v. 23, n. 4, p.

477-83, 2004.

CASTRO, I. A.; ROGERO, M. M.; JUNQUEIRA, R. M.; CARRAPEIRO, M. M. 2,2-Diphenyl-1-

picrylhydrazil free radical scavenging activity of antioxidant mixtures evaluated by response

surface methodology. International Journal of Food Science and Technology, v. 41, p. 59-67,

2006.

CASTRO, M. L.; CURY, J. A.; ROSALEN, P. L.; ALENCAR, S. M.; IKEGAKI, M.; DUARTE,

S.; KOO, H. Própolis do Sudeste e Nordeste do Brasil: Influência da Sazonalidade na Atividade

Antibacteriana e Composição Fenólica. Quím. Nova, v. 30, n. 7, p. 1512-1516, 2007.

CASSEL, E.; FRIZZO, C. D.; VANDERLINDE, R.; ATTI-SERAFINI, L.; LORENZO, D.;

DELLACASSA, E. Extraction of Baccharis Oil by Supercritical CO

. Ind. Eng. Chem. Res., v.

39, p. 4803-4805, 2000.

CORRÊA, M. P.; Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Imprensa

Nacional: Rio de Janeiro, 1984, vol. 1-6.

Cromatógrafo Gasoso. Disponível em http:/www.iq.unesp.br/pet/analisevinhoscg.pps. Acesso em

15 de abr. 2009.

Cromatógrafo Líquido para HPLC. Disponível em

http:/www.dspace.ist.utl.pt/bitstream/2295/49904/1/LQIII-Cromat_HPLC_cafeína.pdf. Acesso em

24 jan. 2009.

Deconvolução. Disponível em http:/www.chem.agilent.com/enus/products/instruments/ms/pa

ges/gp14509.aspx. Acesso em 24 jan. 2009.

DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J. dos; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Avaliação

da atividade antioxidante utilizando sistema β-caroteno/ácido linoléico e método de sequestro de

radicais DPPH۟۟ . Ciênc. Tecnol. Aliment. v. 26, n. 2, p. 446-452, abr./jun., 2006 .

Referências

ESPÍRITO-SANTO. M. M.; MADEIRA, B. G.; NEVES, F. S.; FARIA, M. L.; FAGUNDES, M.;

FERNANDES, G. W. Sexual Differences in Reproductive Phenology and their Consequences for

the Demography of Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), a Dioecious Tropical Shrub. Annals

of Botany. v. 91, p. 13-19, 2003.

FABIANE, K. C.; FERRONATTO, R.; SANTOS, A. C. dos; ONOFRE, S. B. Physicochemical

characteristics of the essential oils of Baccharis dracunculifolia and Baccharis uncinella DC.

(Asteraceae). Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 18, n. 2, p. 197-203, abr./jun. 2008.

FAGUNDES, M.; NEVES, F. S.; FERNANDES, G. W. Direct and indirect interactions ants,

insects herbivores, parasitoids, and host plant Baccharis dracunculifolia (Asteraceae). Ecological

Entomology, v. 30, p. 28-35, 2005.

FERRACINI, V. L. Óleos Essenciais de Baccharis e sua interação com insetos polinizadores.

1995, 205f. Tese (Doutorado). Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas,

Campinas, 1995.

FERRACINI, V. L.; PARAIBA, L. C.; LEITÃO FILHO, H. F.; SILVA, A. G.; NASCIMENTO,

L. R.; MARSAIOLI, A. G. Essential Oils of Seven Brazilian Baccharis Species. J. Essent. Oil

Res.,v. 7, p. 355-367, 1995.

FERRONATO, R.; MARCHESAN, E. D.; PEZENTI, E.; BEDNARSKI, F.; ONOFRE, S. B.

Atividade antimicrobiana de óleos essenciais produzidos por Baccharis dracunculifolia D.C. e

Baccharis uncinella DC. (Asteraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, n. 2, p. 224-

230, abr./jun, 2007.

FIDALGO, O.; BONONI, V. L. R. Técnicas de coleta, preservação e herborização de material

botânico. São Paulo: (Série Documentos) Instituto de Botânica, 1989. 62p.

FRIZZO, C. D.; SERAFINI, L. A.; LAGUNA, S. E.; CASSEL, D. L.; DELACASSA, E. Essential

oil variability is Baccharis uncinella DC and Baccharis dracunculifolia DC growing wild in

southern Brazil, Bolivia and Uruguay. Flavour and Fragrance Journal, v. 23, p. 99-106, 2008.

FUNARI, C. S. de; FERRO, V. de O.; MATHOR, M. B. Analysis of própolis from Baccharis

dracunculifolia DC. (Compositae) and its effects on mouse fibroblasts. Journal of

Ethnopharmacology, v. 111, p. 206-212, 2007.

GARDANA, C.; SCAGLIANTI, M.; PIETTA, P.; SIMONETTI, P. Analysis of the polyphenolic

fraction of propolis from different sources by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 45, p. 390-399, 2007.

Referências

GEBARA, E. C. E.; LIMA L. A.; MAYER, M. P. A. Propolis antimicrobial activity against

periodontopathic bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, p. 365-369, 2002.

GÓMEZ-CARAVACA, A. M.; GÓMEZ-ROMERO, M.; ARRÁEZ-ROMÁN, D.; SEGURA-

CARRETERO, A.; FERNÁNDEZ-GUTIÉRREZ, A. Advances in the analysis of phenolic

compounds in products derived from bees. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,

v. 41, p. 1220-1234, 2006.

HALLIWELL, B. Free radicals and antioxidants: a personal view. Nutrition Reviews, v. 51, n. 8,

p. 253-265, 1994.

IPNI – International Plant Names Index. Disponível em: <http://www.ipni.org>. Acesso em: 02

mai. 2009.

ISI - Institute of Scientific Information, Web of Knowledge. Disponível em:

<http://www.portal.isiknowledge.com>. Acesso em: 18 jul. 2008.

KONISHI, Y.; HITOMI, Y.; YOSHIDA, M.; YOSHIOKA, E. Absorption and Bioavailability of

Artepillin C in Rats after Oral Administration. J. Agric. Food Chem. v. 53, p. 9928-9933, 2005.

KUJUMGIEV, A.; TSVETKOVA, L.; SERKEDJIEVA, Y.; BANKOVA, V.; CHRISTOV, R.;

POPOV, S. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic

origin. Journal of Ethnopharmacology, v. 64, p. 235-240, 1999.

KUMAZAWA, S.; YONEDA, M.; SHIBATA, I.; KANAEDA, J.; HAMASAKA, T.;

NAKAYAMA, T. Direct evidence for the plant origin of Brazilian propolis by the observation of

honeybee behavior and phytochemical analysis. Chem. Pharm. Bull., v. 51, n. 6, p. 740-742,

2003.

KUMAZAWA, S., HAMASAKA, T., NAKAYAMA, T. Antioxidant activity of propolis of

various geographic origins. Food Chemistry, v. 84, p. 329–339, 2004.

KWON, H. C.; JUNG, C. M.; SHIN, C. G.; LEE, J. K.; CHOI, S. U.; KIM, S. Y.; LEE, K. R. A

New Caffeoyl Quinic Acid from Aster scaber and Its Inhibitory Activity against Human

Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) Integrase. Chem. Pharm. Bull. v. 48, n. 11, p. 1796-1798,

2000.

LEITÃO, D. P. S.; SILVA FILHO, A. A. da; POLIZELLO, A. C. M.; BASTOS, J. K.;

SPADARO, A. C. C. Comparative Evaluation of in-Vitro Effects of Brazilian Green Própolis and

Baccharis dracunculifolia extracts on Cariogenic Factors of Streptococcus mutans. Biol. Pharm.

Bull., v. 27, n. 11, p. 1834-1839, 2004.

Referências

LOAYZA, I.; ABUJDER, D.; ARANDA, R.; JAKUPOVIC, J.; COLLIN, G.; DESLAURIERS, H;

JEAN, F.I. Essential Oils of Baccharis salicifolia, B. latifolia and B. dracunculifolia.

Phytochemistry, v. 38. n. 2, p. 381-389, 1995.

MARCUCCI, M. C. Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes químicos da própolis.

Quim. Nova, v. 19, n. 5, p. 529-533, 1996.

MARCUCCI, M. C.; FERRERES, F.; GARCÍA-VIGUERA, C.; BANKOVA, V. S.; DE

CASTRO, S. L.; DANTAS, A. P.; VALENTE P. H. M.; PAULINO, N. Phenolic compounds from

Brazilian propolis with pharmacological activities. Journal of Ethnopharmacology, v. 74, p. 105-

112, 2001

MARCUCCI, M. C. Própolis Tipificada: Um Novo Caminho para a Elaboração de Medicamentos

de Origem Natural, Contendo este Produto Apícola. Revista Fitos, v. 01, n. 03, p. 36-46, 2006.

MARCHESAN, E. D.; FERRONATTO, R.; BEDNARSKI, F.; ALENCAR, S. M.; ONOFRE, S.

B. Ação dos óleos essenciais produzidos por Baccharis dracunculifolia DC. e Baccharis uncinella

DC. (Asteraceae) sobre a atividade hialuronidase. Arq. Ciênc. Saúde Unipar, v. 10, n. 2, p. 63-

66, mai./ago. 2006.

MARÓSTICA JUNIOR M. R.; DAUGSCH A.; MORAES C. S.; QUEIROGA C. L.; PASTORE

G. M.; PARK Y. K. Comparison of volatile and polyphenolic compounds in Brazilian green

propolis and its origin Baccharis dracunculifolia. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 28, n. 01, p. 178-

181, jan./mar. 2008.

MENDES, S. Estudo Químico e bioatividade de Baccharis semiserrata DC. Dissertação

(Mestrado em Química Aplicada). Universidade Estadual de Ponta Grossa. 2007.

MENEZES, H.; Própolis: uma revisão dos recentes estudos de suas propriedades farmacológicas.

Arq. Inst. Boil., São Paulo, v. 72, n. 3, p. 405-411, jul./set. 2005.

MISHIMA, S.; YOSHIDA C.; AKINO S.; SAKAMOTO T. Antihypertensive Effects of Brazilian

Propolis: Identification of Caffeoylquinic Acids as Constituents Involved in the Hypotension in

Spontaneously Hypertensive Rats. Biol. Pharm. Bull., v. 28, n. 10, p. 1909-1914, 2005.

MOTL, O., TRKA, A. Zusammensetsung des brasilianischen Vassoura-oils (aus Baccharis

dracunculifolia). Parfum. Kosmet. v. 64, p. 488-491, 1983.

NAGATANI, Y; WARASHINA, T.; NORO, T. Studies on the constituents from the aerial part of

Baccharis dracunculifolia DC.. Chem. Pharm. Bull. v. 49, n. 11, p. 1388-1394, 2001.

Referências

NAGATANI, Y; WARASHINA, T.; NORO, T. Studies on the constituents from the aerial part of

Baccharis dracunculifolia DC II. Chem. Pharm. Bull. v. 50, n. 5, p. 583-589, 2002.

NAKANISHI, I.; UTO Y.; OHKUBO K.; MIYAZAKI K.; YAKUMARU H.; URANO, S.;

OKUDA H.; UEDA J.; OZAWA T.; FUKUHARA K.; FUKUZUMI S.; NAGASAWA H.; HORI,

H.; IKOTA N. Efficient radical scavenging ability of artepillin C, a major component of Brazilian

propolis, and the mechanism. Org. Biomol. Chem. v. 1, p. 1452-1454, 2003.

NASCIMENTO, E. A.; CHANG, R.; MORAIS, S. A. L.; PILÓ-VELOSO, D.; REIS, D. C. Um

marcador químico de fácil detecção para a própolis de Alecrim-do-Campo (Baccharis

dracunculifolia). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 3, p.379-386, jul./set. 2008.

NUNES, D. S.; SENS, S. L.; SWITALA, M. Investigação de valores químicos e biológicos de

Asteraceae comuns nos Campos Gerais. IX Encontro de Química da Região Sul-SBQ-SUL. Anais,

Londrina, 2001.

PARK, Y. K.; KOO, M. H.; IKEGAKI, M.; CONTADO, J. L. Comparison of flavonoid aglycone

contents of Apis mellifera propolis from various regions of Brasil. Arq. Biol. Tecnol., v. 40, p. 97-

106, 1997.

PARK, Y. K.; IKEGAKI, M.; ALENCAR, S. M. Classificação das Própolis Brasileira a Partir

de Suas Propriedades Fisico-Químicas e Propriedades Biológicas. Mensagem Doce, n. 58, p. 2-7,

2000.

PARK, Y. K.; ALENCAR, S. M.; AGUIAR, C. L. Botanical Origin and Chemical Composition of

Brazilian Propolis. J. Agric. Food Chem., v. 50, p. 2502-2506, 2002.

PARK, Y. K.; PAREDES-GUZMAN, J. F.; AGUIAR, C. L.; ALENCAR, S. M.; FUJIWARA, F.

Y. Chemical constituints in Baccharis dracunculifolia as the main botanical origin of southeast

brazilian propolis. J. Agric. Food Chem. v. 52, p. 1100-1103, 2004.

PAULINO, N.; ABREU, S. R. L.; UTO, Y.;KOYAMA, D.; NAGASAWA, H.; HORI, H.;

DIRSCH, V. M.; VOLLMAR, A. M.; SCREMIN, A.; BRETZ, W. A. Anti-inflamatory effects of a

bioavailable compound, Artepillin C, in Brazilian própolis. European Journal of Pharmacology,

v. 587, p. 296-301, 2008.

PEREIRA, A. dos S.; PEREIRA, A. F. de M.; TRUGO, L. C.; AQUINO NETO, F. R. de.

Distribution of Quinic Acid Derivatives and Other Phenolic Compounds in Brazilian Propolis. Z.

Naturforsch. v. 58, p. 590-593, 2003

PERES, T. B.; Noções Básicas de Cromatografia . Biológico, v. 64, n. 2, p. 227-229, jul./dez.

2002.

Referências

PISCO, L.; KORDIAN, M.; PESEKE, K.; FEIST, H.; MICHALIK, D.; ESTRADA, E.;

CARVALHO, J.; HAMILTON, G.; RANDO, D.; QUINCOCES, J. Synthesis of compounds with

antiproliferative activity as analogues of prenylated natural products existing in Brazilian propolis.

European Journal of Medicinal Chemistry, v. 41, p. 401-407, 2006.

QUEIROGA, C. L.; FUKAI, A. E.; MARSAIOLI, A. Composition of the essential oil of vassoura.

J. Braz. Chem. Soc. v. 1, p. 105-109, 1990.

RESENDE F. A.; ALVES, J. M.; MUNARI, C. C.; SENEDESE, J. M.; SOUSA, J. P. B.;

BASTOS, J. K.; TAVARES, D. C. Inhibition of doxirrubicin-induced mutagenicity by Baccharis

dracunculifolia. Mutation Research, v. 634, p. 112-118, 2007.

SALOMÃO K.; PEREIRA P. R. S.; CAMPOS L. C.; BORBA C. M.; CABELLO P. H.;

MARCUCCI M. C.; CASTRO S. L. de. Brazilian Propolis: Correlation Between Chemical

Composition and Antimicrobial Activity. Advance Access Publication, eCAM, p. 1-8, 2007.

SANTOS, F. A.; BASTOS, E. M. A. F.; MAIA, A. B. R. A.; UZEDA, M.; CARVALHO, M. A.

R.; FARIAS, L. M.; MOREIRA E. S. A. Brazilian Propolis: Physicochemical Properties, Plant

Origin and Antibacterial Activity on Periodontopathogens. Phytoteraphy Research, v. 17, p. 285-

289, 2003.

SCHOLANDER, P. F. ; HAMMEL, H. T. ; BRADSTREET, E. D. ; HEMMINGSEN, E. A. Sap

pressure in vascular plants. Science, v. 148, p. 339-346, 1965.

SFORCIN, J. M.; ORSI R. O.; BANKOVA V. Effect of propolis, some isolated compounds and its

source plant on antibody production. Journal of Ethnopharmacology, v. 98, p. 301-305, 2005.

SHENG J.; ZHOU J.; WANG L.; XU J.; HU Q. Antioxidant activity of ethanol and petroleum

ether extracts from Brazilian propolis. Eur. Food Res. Technol., v. 225, p. 249-253, 2007.

SILVA, J. F. M. da; SOUZA, M. C. de; MATTA S. R.; ANDRADE M. R. de; VIDAL, F. V. N.

Correlation analysis between phenolic levels of Brazilian propolis extracts and their antimicrobial

and antioxidant activities. Food Chemistry, v. 99, p. 431-435, 2006.

SIMÕES, C. M. O.; SPITZER, V.; Óleos voláteis. In: SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia:

da Planta ao Medicamento. 5. ed. rev. atual. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS; UFSC, 2003.

SIMÕES-PIRES, C. A.; QUEIROZ, E. F.; HENRIQUES, A. T.; HOSTETTMANN, K. Isolation

and on-line identification of antioxidant compounds from three Baccharis species by HPLC-UV-

MS/MS with post-column derivatization. Phytochem. Anal. v. 16, n. 5, p. 307-314, 2005.

Referências

SOARES, S. E. Ácidos fenólicos como antioxidantes. Rev. Nutr. Campinas, v. 15, n. 1, p. 71-81,

jan./abr. 2002.

STAHL, E.; SCHILD, W. Pharmazeutische Biologie. 4. Drogenanalyse II: Inhaltsstoffe und

Isolierungen. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag. p. 19, 1981.

TAKEDA, I.J.M.; FARAGO, P. Vegetação do Parque Estadual de Vila Velha: guia de campo.

Ponta Grossa: Serzegraf, 2001, 419 p.

TEIXEIRA, E. W.; NEGRI, G.; MEIRA, R. M. S. A.; MESSAGE, D.; SALATINO, A. Plant

origin of green propolis: Bee behavior, plant anatomy and chemistry. Advance Access

Publication, eCAM v. 2, n. 1, p. 85-92, 2005.

VAN DEL DOOL, H; KRATZ, P. A generalization of the retention index system including linear

temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography. v.

11, p. 463-471, 1963.

VERDI, L. G.; BRIGHENTE, I. M. C.; PIZZOLATTI, M. G. Gênero Baccharis

(ASTERACEAE): Aspectos químicos, econômicos e biológicos. Quím. Nova, v. 28, n. 1, p. 85-

94, 2005.

VIEGAS, JR. C.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E. J. Os produtos naturais e a química medicinal

moderna. Quím Nova, v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006.

WAGNER, H.; BLADT, S. Plant drug analysis – a thin layer chromatography atlas. 2. ed. Berlin:

Springer, 1995. 384 p.

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