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I
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS -
BIOQUÍMICA
INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DE ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA LONGA
HIDROXILADA ACUMULADOS NAS DEFICIÊNCIAS DA DESIDROGENASE DE
HIDROXIACIL-COA DE CADEIA LONGA E DA PROTEÍNA TRIFUNCIONAL
MITOCONDRIAL SOBRE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO E
HOMEOSTASE MITOCONDRIAL EM CÉREBRO DE RATOS JOVENS
ANELISE MIOTTI TONIN
ORIENTADOR: Prof. Dr. MOACIR WAJNER
CO-ORIENTARORA: Prof
a
.Dr
a
. PATRÍCIA F. SCHUCK
Porto Alegre, 2010
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
II
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul por me proporcionar uma
formação gratuita e de qualidade.
Ao meu orientador, Professor Moacir Wajner, pelo carinho, pela paciência e
pelo incentivo.
À minha família do laboratório 38 por serem pessoas maravilhosas, e à
todos aqueles que já passaram por esse laboratório e deixaram muita saudade.
À minha primeira “chefinha” e co-orientadora Patrícia por todos os
ensinamentos bioquímicos, toda ajuda e por toda a amizade.
Ao meu amigão Gustavo, por toda ajuda e por sua amizade.
À Carolina, por ser uma pessoa adorável, por todo o carinho, toda a ajuda.
Aos meus “queridinhos” Guilhian e César pelo imenso carinho todos esses
anos.
Ao Mateus, cuja ajuda foi fundamental para a realização deste trabalho.
Aos mestrandos Estela, Carolina, Alexandre e Bianca por colaborarem com
este trabalho e por sua amizade.
Aos bolsistas Alana, Luaciana, Ângela, Lisiane e Duda por estarem sempre
prontos a ajudar e por toda a amizade.
Aos meus pais e à minha irmã, por todo amor e entenderem a importância
de meu mestrado.
Ao Douglas, por todo amor, por toda a compreensão e por tornar minha
vida mais feliz.
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III
SUMÁRIO
PARTE I ............................................................................................................. 1
RESUMO ........................................................................................................ 2
ABSTRACT ..................................................................................................... 3
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... 4
I.1.INTRODUÇÃO ........................................................................................... 6
I.1.1.Erros Inatos do Metabolismo .............................................................. 6
I.1.2.Defeitos de Oxidação de Ácidos Graxos ............................................ 7
I.1.3.Deficiência da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da
Desidrogenase de 3-hidroxiacil-CoA de Cadeia longa (LCHAD)................ 9
I.1.3.1.Metabólitos Acumulados nos Pacientes com Deficiência da LCHAD
e da MTP .................................................................................................. 12
I.1.3.2.Aspectos moleculares das deficiência de LCHAD/MTP ........... 13
I.1.3.3.Fisiopatologia nas Deficiências LCHAD/MTP ........................... 14
I.1.4.Fosforilação Oxidativa e Homeostase Mitocondrial .......................... 16
I.1.5.Radicais Livres ................................................................................. 22
I.1.5.1.Defesas Antioxidantes .............................................................. 24
I.1.5.2.Estresse Oxidativo.................................................................... 25
I.1.5.3.Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas ................ 26
I.2.OBJETIVOS ............................................................................................. 29
I.2.1. Objetivo Geral ................................................................................. 29
IV
I.2.2. Objetivos Específicos ...................................................................... 29
PARTE II .......................................................................................................... 31
Capítulo I ...................................................................................................... 32
Capítulo II ..................................................................................................... 67
PARTE III ......................................................................................................... 96
III.1.DISCUSSÃO .......................................................................................... 97
III.2.CONCLUSÕES .................................................................................... 106
III.3.PERSPECTIVAS ................................................................................. 109
III.4.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 110
1
PARTE I
Introdução e Objetivos
2
RESUMO
As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da
desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos
hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas
deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os
ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-
hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é
caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e
hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e
retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas
doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de
que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos
tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos
3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase
mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos
que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica
evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano
oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o
conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os
níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático
presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O
ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a
adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina
(DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo
que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos
3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e
diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também
diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de
NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação
oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O
quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado
piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de
glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste
ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na
deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a
homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar
envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas
deficiências.
3
ABSTRACT
Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-
hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of
metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue
accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA),
3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical
presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy,
seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction,
cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the
pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient
patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids
could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in
vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on
mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA,
3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by
increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl
formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl
content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein
oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH)
levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate
and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most
pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and
free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially
prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on
GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA
markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio.
3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the
matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In
addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used
glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were
used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be
inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty
acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair
mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the
neurological damage found in affected patientes.
4
LISTA DE ABREVIATURAS
m – potencial de membrana mitocondrial
8-OHdGA – 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina
ANT – translocador de nucleotídeos de adenina
ATC – atractilosídeo
CCCP – cianeto de carbonila de meta-clorofenil-hidrazona
CoA – coenzima A
CoQ – coenzima Q
CsA – ciclosporina A
DCFH – 2’,7’-di-hidroclorofluoresceína
DFO - deferoxamina
EIM – erros inatos do metabolismo
ERN – espécies reativas de nitrogênio
ERO – espécies reativas de oxigênio
GSH – glutationa reduzida
LCHAD – desidrogenase de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa
LDL – lipoproteína de baixa densidade
MCAD – desidrogenase de acil-CoA de cadeia média
MEL – melatonina
MTP – proteína trifuncional mitocondrial
Pi – fosfato inorgânico
RCR – índice de controle respiratório
5
SCAD – desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta
SCHAD – desidrogenase de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia curta
SOD – superóxido dismutase
TAR – reatividade antioxidante total do tecido
TBA-RS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TRAP - potencial antioxidante total do tecido
TRO – trolox
VLCAD – desidrogenase de acil-CoA de cadeia muito longa
6
I.1. INTRODUÇÃO
I.1.1. Erros Inatos do Metabolismo
Em 1908, Sir Archibald E. Garrod usou pela primeira vez o termo erros
inatos do metabolismo (EIM) para designar doenças como a alcaptonúria, em que
os indivíduos afetados excretam grandes quantidades de ácido homogentísico na
urina. Garrod observou uma maior frequência desta doença em indivíduos de uma
mesma família e maior incidência de consanguinidade entre os pais dos pacientes.
Baseando-se nas leis de Mendel e no fato de que os pais dos indivíduos afetados
não apresentavam a doença, Garrod propôs um modelo de herança autossômica
recessiva para este distúrbio. Através da observação de que o ácido
homogentísico presente em excesso na urina dos pacientes era um metabólito
normal da degradação protéica, ele relacionou este acúmulo a um bloqueio na rota
de catabolismo da tirosina. Com o surgimento de novos distúrbios relacionados a
alterações genéticas e que envolviam o acúmulo de outras substâncias nos
líquidos biológicos dos pacientes, postulou-se que estas doenças resultavam da
síntese qualitativa ou quantitativamente anormal de uma proteína, enzimática ou
não, pertencente ao metabolismo (Scriver, et al. 2001). Presumiu-se, então, que
em consequência deste bloqueio metabólico pode ocorrer o acúmulo de
precursores da reação catalisada pela enzima envolvida, com o desvio dos
precursores para rotas metabólicas alternativas e a deficiência de produtos
essenciais ao organismo (Bickel, 1987).
Até o momento foram descritos mais de 500 EIM, a maioria deles
envolvendo processos de síntese, degradação, transporte e armazenamento de
moléculas no organismo (Scriver et al., 2001). Embora individualmente raras,
7
essas doenças em seu conjunto afetam aproximadamente 1 a cada 500/2.000
recém nascidos vivos (Baric, Furnic e Hoffmann, 2001).
Neste contexto, o acúmulo tecidual e excreção urinária elevada de ácidos
carboxílicos são característicos das acidemias orgânicas e dos defeitos de
oxidação de ácidos graxos. Essas doenças são consideradas os distúrbios
hereditários do metabolismo mais frequentes em crianças hospitalizadas, o que se
refletiu em intensos estudos clínicos, laboratoriais e epidemiológicos nos últimos
anos. Os pacientes afetados acumulam em seus tecidos ácidos orgânicos
específicos e apresentam severa disfunção neurológica com anormalidades
cerebrais relevantes, cuja etiopatogenia é pouco conhecida..
I.1.2. Defeitos de Oxidação de Ácidos Graxos
A β-oxidação mitocondrial de ácidos graxos é a principal fonte de energia
para a síntese de ATP, principalmente em períodos de estresse metabólico e
depleção de glicogênio decorrente de um jejum prolongado. Este processo gera
acetil-coenzima A e energia na forma de ATP. A rota de oxidação dos ácidos
graxos é complexa e inclui muitos passos: captação celular de ácidos graxos,
ativação desses mesmos ácidos graxos a ésteres acil-CoA, trans-esterificação a
acilcarnitinas, translocação através da membrana mitocondrial, re-esterificação a
acil-CoA, e a espiral da beta-oxidação intramitocondrial, que fornece elétrons para
flavoproteínas transferidoras de elétrons e acetil-CoA. Cada etapa da espiral de
oxidação é catalisada por enzimas específicas para o comprimento da cadeia
carbônica do ácido graxo (Smith, Marks e Lieberman, 2005).
8
Defeitos na β-oxidação de ácidos graxos de cadeia longa podem afetar
diversas enzimas catalíticas ou de transporte de ácidos graxos de cadeia longa
para dentro da mitcocôndria. Atualmente, já estão descritas pelo menos 20
diferentes entidades clínicas dentro deste grupo de doenças, incluindo defeitos no
transporte de carnitina na membrana plasmática, nas enzimas carnitina
palmitoiltransferase I e II (CPT I e CPT II), carnitina/acilcarnitina translocase, nas
desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa (VLCAD), média (MCAD) e
curta (SCAD), na 2,4-dienoil-CoA redutase e nas desidrogenases de 3-hidroxi-acil-
CoA de cadeia longa (LCHAD) e curta (SCHAD), bem como na proteína
trifuncional mitocondrial (MTP) (Roe e Ding, 2001).
Acredita-se que a prevalência dessas doenças seja subestimada, visto que
seu diagnóstico depende da detecção dos metabólitos acumulados por métodos
sofisticados e equipamentos de alto custo que poucos laboratórios possuem
(Walker, 1994; Wajner et al., 2002). Além disso, devido à semelhança do quadro
clínico, uma parte considerável dos pacientes afetados por defeitos de oxidação
de ácidos graxos é diagnosticada erroneamente como síndrome de morte súbita
da infância, infecção bacteriana aguda (septicemia), síndrome de Reye, fígado
gorduroso da gravidez ou síndrome de vômito cíclico (Rinaldo et al., 1998).
Dentre os defeitos de β-oxidação de cadeia longa, a deficiência de LCHAD
é considerada como clinicamente mais severa e de maior mortalidade que as
desordens de oxidaçao de ácidos graxos de cadeias carbonadas menores, sendo,
após a deficiência de MCAD, a doença mais comum desse grupo (Ventura et al.,
1998).
9
I.1.3. Deficiência da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da
Desidrogenase de 3-hidroxiacil-CoA de Cadeia longa (LCHAD)
Ácidos graxos de cadeia longa provenientes da dieta ou mobilizados a partir
do tecido adiposo durante a lipólise são convertidos a ésteres de acil-CoA
próximos a membrana mitocondrial externa pela enzima acil-CoA tioesterase.
Após, são transportados para dentro da matriz mitocondrial através de passos
seqüenciais pelas proteínas CPT I, carnitina/acilcarnitina translocase e CPT II.
Dentro da mitocôndria cada ciclo de β-oxidação de ácidos graxos de cadeia linear
consiste de quatro reações enzimáticas que são específicas para determinado
comprimento de cadeia. Para ácidos graxos de cadeia longa, o primeiro passo da
β-oxidação é calatisado pela VLCAD. As três reações enzimáticas subseqüentes
são catalisadas pela MTP. Esse complexo enzimático se apresenta na forma de
um hetero-octâmero (α4β4) associada a membrana mitocondrial interna. A
subunidade α contém as enzimas 2-enoil-CoA hidratase e acil-CoA desidrogenase
de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) enquanto a subunidade β contém a atividade
de 3-cetoacil-CoA tiolase (LKAT) (Ushikubo et al. 1996).
Mutações em ambas as subunidades, α e β, podem levar a deficiência da
MTP com a redução das três atividades enzimáticas. Contudo, uma mutação
isolada no domínio catalítico de uma destas três enzimas resulta em uma
deficiência isolada da atividade enzimática. A deficiência da LCHAD aparece
como a mais comum dentre as deficiências do complexo MTP. Juntas as
deficiências LCHAD/MTP ocorrem com uma prevalência estimada de 1:110.000
nascidos vivos (Das et al. 2006). Recentemente foram identificados dois pacientes
10
com a deficiência isolada da LKAT (Das et al. 2006; Sander et al. 2005). Assim,
desordens do complexo MTP compreendem a deficiência da MTP e as
deficiências isoladas da LCHAD e LKAT. A figura 1 mostra a oxidação
mitocondrial de ácidos graxos de cadeia longa.
A deficiência da LCHAD (McKusick 143450) é uma desordem de caráter
autossômico recessivo que geralmente se manifesta do nascimento até os três
anos de idade. Essa desidrogenase catalisa o terceiro passo da oxidação
mitocondrial dos ácidos graxos de cadeia longa hidroxilada convertendo 3-
hidroxiacil-CoA em seu éster correspondente 3-cetoacil-CoA. Essa desordem
metabólica foi primeiramente descrita em 1990 por Wander e colaboradores. Até o
presente momento, mais de cem casos foram relatados destacando-se uma
sintomatologia clínica variada.
11
Figura 1. Esquema da β-oxidação mitocondrial de ácidos graxos. Carnitina
palmitoiltransferase I e II (CPT I e CPT II), carnitina/acilcarnitina translocase (CT),
desidrogenase de acil-CoA de cadeia muito longa (VLCAD), proteína trifuncional
mitocondrial (MTP), 2-enoil-CoA hidratase (LCEH), acil-CoA desidrogenase de
cadeia longa hidroxilada (LCHAD) and 3-cetoacil-CoA tiolase (LKAT). (Adaptado
de Tyni e Pihko, 1999)
A obtenção de energia a partir de ácidos graxos de cadeia longa é
prejudicada em todos os defeitos de oxidação de ácidos graxos. Assim, pacientes
afetados por essas doenças geralmente apresentam sintomas em situações de
estresse metabólico como infecções, vacinação, jejum ou exercício prolongado
sobrepondo a capacidade da mitocôndria em oxidar ácidos graxos para a
Acil-CoA cadeia longa
+
carnitina
MTP
Mitocôndria
Acil-CoA
CT
VLCAD
CPT I
LCEH
LCHAD
LCKAT
Enoil-CoA
3-Hidroxiacil-CoA
3-Cetoacil-CoA
Acil-CoA + Acetil-CoA
Membrana mitocondrial interna
Membrana mitocondrial externa
FA
D
FAD
H
2
H
2
O
NAD
+
NAD
H
2
CoA-
SH
CoA
CPT II
12
produção energética. Uma das características apresentadas por esses pacientes é
hipoglicemia hipocetótica. A sintomatologia é variada, podendo apresentar
vômitos, recusa alimentar, convulsão, letargia, coma, hipotonia, retardo no
desenvolvimento motor, retinopatia, neuropatia periférica, além de cardiomiopatia,
disfunção hepática, fraqueza muscular ou morte súbita. Alguns pacientes descritos
apresentaram quadro epilético com retardo mental e microcefalia (Tyni et al.,
1997). Achados neuroradiológicos incluem atrofia cortical. Além disso, possuem
infiltração de ácidos graxos em músculo e fibras degeneradas, bem como
anormalidades na morfologia mitocondrial e na função dos complexos da cadeia
respiratória, indicando disfunção mitocondrial (Tyni et al. 1996).
A apresentação clínica de pacientes afetados pela deficiência da LCHAD é
geralmente mais severa que a dos pacientes afetados pela deficiência da MTP,
com morte prematura em quatro de cinco casos descritos (Wanders et al., 1999).
O tratamento consiste em evitar períodos de jejum, especialmente durante
infecções e períodos de estresse metabólico. Dieta hipercalórica com redução de
ácidos graxos de cadeia longa e suplementação com triglicerídeos de cadeia
média.
I.1.3.1. Metabólitos Acumulados nos Pacientes com Deficiência da LCHAD e
da MTP
O defeito no catabolismo de ácidos graxos de cadeia longa hidroxilada
ocasiona um leve aumento das concentrações de ácidos graxos e seus derivados
em períodos assintomático. Entretanto, principalmente durante os períodos de
13
crise, as concentrações desses ácidos graxos encontram-se muito aumentados no
sangue e tecidos e são excretados na urina dos pacientes (Costa et al., 1998;
Jones et al., 2000).
Testes de laboratório durante episódios sintomáticos revelam hipoglicemia
não- cetótica, altos níveis de lactato, leve aumento dos níveis de amônia, aumento
plasmático de transaminases e creatina quinase. O perfil de acilcarnitinas do
sangue de pacientes afetados apresenta concentrações aumentadas de
acilcarnitinas de cadeia longa, 3-hidroxiacilcarnitinas de cadeia longa, ácidos 3-
hidroxidicarboxílicos e 3-hidroxiácidos de cadeia longa. Também é observada a
excreção de grandes quantidades de ácidos dicarboxílicos derivados hidroxilados,
como os ácidos 3-hidroxidodecanedióico e 3-hidroxitetradecanedióico. A detecção
de ácidos graxos de cadeia longa hidroxilada em sangue e urina permite a
diferenciação destas doenças de outros defeitos de β-oxidação mitocondrial.
Contudo, a análise do perfil das acil-canitinas e dos ácidos orgânicos na urina não
permite a diferenciação das deficiências da LCHAD e da MTP. A confirmação do
diagnóstico pode ser feita por dosagem das enzimas em fibroblastos dos
pacientes ou por análise mutacional.
I.1.3.2. Aspectos moleculares das deficiência de LCHAD/MTP
As subunidades α e β da MTP são codificadas por diferentes genes
denominados HADHA e HADHB, localizados no cromossomo 2p23. Mais de 60%
dos casos associados com a deficiência da LCHAD são homozigóticos para a
mutação E474Q (c.1528G>C) no gene HADHA
na região catalítica desta enzima.
14
O restante dos casos consiste da deficiência completa da MTP que é causada por
um defeito na subnidade α ou β codificadas pelo gene HADHB. Geralmente, as
três atividades enzimáticas do complexo MTP são indetectáveis nesta deficiência
pela falta das proteínas codificadas por HADHA e HADHB. Até o presente
momento não se tem uma correlação genótipo/fenótipo estabelecida. O fenótipo
dessas doenças ainda é geralmente severo com morte prematura em muitos
casos. Deve-se considerar também que o desenvolvimento dos sintomas deve ser
influenciado pelo grau de estresse metabólico e a combinação de fatores, tais
como infecçãom, hipertermia e jejum (Matsubara et al., 1992).
I.1.3.3. Fisiopatologia nas Deficiências LCHAD/MTP
Há duas hipóteses para explicar a pouca idade em que ocorre o início da
apresentação dos sintomas e a alta mortalidade nas deficiências da LCHAD e da
MTP: a toxicidade dos ésteres de hidroxiacil-CoA de cadeia longa podem
contribuir para o aumento da mortalidade por causar distúrbios no ritmo cardíaco,
falência respiratória/ ou hepática. Além disso, o bloqueio na oxidação de ácidos
graxos de cadeia longa resulta em uma quase completa inabilidade em sintetizar
corpos cetônicos e produzir ATP a partir de ácidos graxos de cadeia longa que é a
mais abundante forma de armazenamento de energia no homem.
Neste contexto, há alguns estudos descrevendo efeitos tóxicos in vitro de
ácidos graxos e seus derivados hidroxilados, a maioria desses estudos está
relacionada a um bloqueio em distintos passos do metabolismo energético. Foram
demonstrados que hidroxiacilas-CoA de cadeia longa inibiram a síntese de ATP
15
(Ventura et al. 2005), o translocador de nucleotídeos de adenina, além de
transportadores mitocondriais de ácidos dicarboxílicos, bem como enzimas da
cadeia respiratória em preparações mitocondriais de fígado de ratos (Ventura et al.
2006). Esses achados reforçam a ideia de que a acidemia lática descrita em
pacientes afetados por essas doenças se deva a um possível distúrbio no sistema
fosforilante causado pelo aumento intramitocondrial de acil-CoA de cadeia longa
hidroxilada (Ventura et al., 1998; den Boer et al., 2002) .
Outro fator que contribui para a deficiência energética apresentada por
estes pacientes é a inibição da gliconeogênese, já que este processo da energia
gerada pela lipólise e pela β-oxidação, tanto para o fornecimento de glicerol que
pode ser convertido em glicose, quanto para o suprimento energético
propriamente dito para que tal processo ocorra. Como uma consequência do
defeito da β-oxidação e da depleção energética, um aumento compensatório na
produção de glicose seria esperado. Contudo, isto não é observado. Há, no
entanto, um aumento da lipólise, aumentando a disponibilidade de ácidos graxos
em geral, que potencialmente podem ser metabolizados, sobrepondo a atividade
de outras enzimas envolvidas na β-oxidação (Wanders et al. 1999). Assim, o
aumento da lipólise compensaria por algumas horas a demanda energética, porém
aumentando o risco de efeitos tóxicos mediados por esses ácidos graxos.
Além disso, a síntese diminuída de corpos cetônicos durante o jejum ocorre
nas deficiências das proteínas LCHAD e MTP devido a baixa disponibilidade de
acetil-CoA, fazendo com que aumente a importância do consumo da glicose
sanguínea como fonte de energia celular, ocasionando hipoglicemia nos
pacientes. Outra consequência da não-utilização dos ácidos graxos de cadeia
16
longa hidroxilada na síntese de corpos cetônicos é o acúmulo de acil-CoA de
ácido graxo de cadeia longa hidroxilada dentro das mitocôndrias. Eleva-se então a
razão acil-CoA:CoA, causando a inibição das enzimas piruvato desidrogenase e -
cetoglutarato desidrogenase, que utilizam coenzima A como substrato. Assim,
ocorre diminuição da conversão do piruvato a acetil-CoA e diminuição na
velocidade do ciclo do ácido cítrico, visto que a síntese do citrato e a conversão do
-cetoglutarato a sucinil-CoA também estão diminuídas.
A hipoglicemia apresentada por pacientes tem sido sugerida com o principal
mecanismo de dano cerebral nas deficiências da LCHAD e MTP. Entretanto,
considerando que coma e edema cerebral também ocorrem em pacientes
afetados por essas doenças que apresentam níveis normais de glicose, sugere
que os metabólitos acumulados poderiam estar envolvidos na patogenia do dano
neurológico (den Boer et al., 2002).
I.1.4. Fosforilação Oxidativa e Homeostase Mitocondrial
A fosforilação oxidativa é o processo pelo qual o O
2
é reduzido a H
2
O, por
elétrons doados pelo NADH e FADH
2
, que fluem através de vários pares redox
(cadeia transportadora de elétrons), gerando ATP a partir de ADP e Fosfato
inorgânico (Pi) (Nelson e Cox, 2000). Em eucariotos, a fosforilação oxidativa
ocorre nas mitocôndrias, mais especificamente na cadeia respiratória, e é
responsável pela maior parte da energia obtida pela célula. As mitocôndrias são
corpúsculos envoltos por uma membrana externa, facilmente permeável a
pequenas moléculas e íons, e por uma membrana interna, impermeável à maioria
17
das moléculas e íons, incluindo prótons (Nelson e Cox, 2000). A membrana
mitocondrial interna contém transportadores específicos para a passagem de
substâncias como o piruvato, glicerolfosfato, malato, ácidos graxos e outras
moléculas essenciais às funções mitocondriais (Abeles, Frey e Jencks, 1992). O
fluxo de elétrons do NADH e FADH
2
até o O
2
se dá através de complexos
enzimáticos ancorados na membrana mitocondrial interna (cadeia transportadora
de elétrons). Essa transferência de elétrons é impulsionada por um crescente
potencial redox existente entre os equivalentes reduzidos (NADH e o FADH
2
), os
complexos enzimáticos da cadeia transportadora de elétrons e o O
2
, que é o
aceptor final dessa cadeia de reações de oxidação.
A cadeia respiratória é composta por vários complexos enzimáticos e uma
coenzima lipossolúvel, a coenzima Q (CoQ) ou ubiquinona (Di Donato, 2000). O
complexo I, conhecido como NADH desidrogenase ou NADH: ubiquinona
oxidorredutase, transfere os elétrons do NADH para a ubiquinona. O complexo II
(succinato desidrogenase) reduz a ubiquinona com elétrons do FADH
2
provenientes da oxidação do succinato a fumarato no ciclo do ácido cítrico. O
complexo III, citocromo bc
1
ou ubiquinona-citocromo c oxidoredutase, catalisa a
redução do citocromo c a partir da ubiquinona reduzida. Na parte final da cadeia
de transporte de elétrons, o complexo IV (citocromo c oxidase) catalisa a
transferência de elétrons de moléculas reduzidas de citocromo c para O
2
,
formando H
2
O. São necessárias quatro moléculas de citocromo c para reduzir
completamente uma molécula de O
2
. Todos esses complexos possuem
grupamentos prostéticos específicos para desempenharem o papel de aceptores e
doadores de elétrons (Abeles, Frey e Jencks, 1992). No entanto, a membrana
18
mitocondrial interna é impermeável às moléculas de NADH ou a FADH
2
,
necessitando sistemas de transferência desses equivalentes reduzidos do citosol
para a matriz mitocondrial. Nesse contexto, a oxidação do NADH formado no
citosol é possibilitada por sistemas chamados lançadeiras que transferem elétrons
do NADH do citosol para a matriz, através de moléculas capazes de ser
transportadas através da membrana mitocondrial interna. Existem duas
lançadeiras para este fim, designadas de lançadeira do glicerol-3-fosfato e
lançadeira de malato/aspartato, conforme ilustra a figura 2. Uma vez formadas na
matriz, as moléculas de NADH e FADH
2
podem ceder elétrons para o complexo I
ou para a CoQ, respectivamente, suprindo a cadeia respiratória (Nelson e Cox,
2000).
O fluxo de elétrons através dos complexos da cadeia respiratória é
acompanhado pelo bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o
espaço intermembranas, através dos complexos I, III e IV, gerando um potencial
de membrana. Assim, cria-se um gradiente eletroquímico transmembrana que
pode ser utilizado por um quinto complexo protéico, a ATP sintase, para a síntese
de ATP. Dessa forma, a oxidação de substratos energéticos está acoplada ao
processo de fosforilação do ADP, ou seja, quando o potencial de membrana é
dissipado pelo fluxo de prótons a favor do gradiente eletroquímico, a energia
liberada é utilizada pela ATP sintase, que atua como uma bomba de prótons ATP-
dependente (Nelson e Cox, 2000).
19
Figura 2. Lançadeira do malato (A) e lançadeira do glicerol-3-P (B) (Adaptado de
Smith, Marks e Lieberman, 2005).
Desse modo, a respiração mitocondrial pode ser estimada através da
medida do consumo de O
2
. Apesar de que essa medida determina diretamente
apenas a velocidade de uma única reação (transferência final de elétrons para
O
2
), muitas informações sobre outros processos mitocondriais podem ser obtidos
simplesmente pela adaptação das condições de incubação, tornando o processo
de análise significativo na taxa de consumo final de oxigênio. Vários passos
podem ser investigados, incluindo o transporte de substratos através da
membrana mitocondrial, a atividade das desidrogenases, a atividade dos
complexos da cadeia respiratória, o transporte de nucleotídeos de adenina pela
20
membrana mitocondrial, a atividade da ATP sintase e a permeabilidade da
membrana mitocondrial a H
+
(Nicholls e Ferguson, 2002). Experimentalmente,
pode-se dividir a respiração mitocondrial em 5 estágios, conforme ilustra a figura
3. No entanto, apenas os parâmetros estados 3 e 4 são comumente utilizados. O
estado 3 representa o consumo de oxigênio quando as mitocôndrias, em um meio
contendo substrato oxidável, são expostas a ADP, estimulando o consumo de O
2
e produzindo ATP (estado fosforilante). O estado 4 reflete o consumo de O
2
após
as mitocôndrias já terem depletado todo o ADP disponível, reduzindo a taxa da
respiração (estado não-fosforilante) (Nicholls e Ferguson, 2002). A transdução de
energia entre a cadeira respiratória e o gradiente eletroquímico de H
+
é bem
regulada, sendo que um pequeno desequilíbrio termodinâmico entre ambos pode
resultar em uma alteração importante no transporte de elétrons pela mesma.
Assim, quando o gradiente de prótons é dissipado pela ação da ATP sintase,
devido à adição de ADP, há um desequilíbrio que estimula a transferência de
elétrons pela cadeia respiratória e, consequentemente, o consumo de oxigênio.
Sendo assim, para que a ATP sintase esteja ativa, são necessários dois fatores:
disponibilidade de ADP e potencial de membrana suficientemente alto (Nelson e
Cox, 2000). Nesse contexto, o acoplamento da respiração mitocondrial é definido
como a capacidade da mitocôndria gerar energia (ATP) quando exposta ao ADP,
ou seja, unir (acoplar) os processos de oxidação e de fosforilação. A dissipação do
gradiente eletroquímico de prótons no espaço mitocondrial intermembranas
determinado por dano ou aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial
interna desacopla o transporte de elétrons da síntese de ATP, resultando em um
21
aumento do consumo de oxigênio (atividade respiratória aumentada) com reduzida
formação de ATP (Nicholls e Ferguson, 2002).
Figura 3. Estados da respiração mitocondrial. (Adaptado de Nicholls e Ferguson,
2002).
Além da regeneração do ATP, que é a sua principal função, a mitocôndria
desempenha outros importantes papéis. Esta organela é a principal fonte de
espécies reativas de oxigênio e de defesas antioxidantes nas células (Cadenas e
Davies, 2000), gerando ânions superóxido (O2●-) no espaço intermembrana pelo
vazamento de elétrons que se combinam com o oxigênio molecular no complexo
III em um processo que é dependente do potencial de membrana (m), e na
matriz, através de um sítio não definido do complexo I (Han et al., 2001). Além
disso, a mitocôndria participa ativamente da homeostase de cálcio (Nicholls e
Akerman, 1982) e está envolvida em diversos processos que levam à morte
22
celular, incluindo liberação de citocromo c (Liu et al., 1996). Acredita-se que todos
estes processos estejam interligados e que um desequilíbrio nessas funções
possa estar envolvido na fisiopatologia de diversas doenças neurodegenerativas,
incluindo as doenças de Alzheimer, Parkinson, Huntington, esclerose lateral
amiotrófica (Beal, 2007; Sasaki et al., 2007; Gil e Rego, 2008; Reddy e Beal,
2008), doenças psiquiátricas, tais como transtorno bipolar, esquizofrenia e
depressão (Wang, 2007; Ben-Shacar e Kerry, 2008; Gardner et al., 2008; Shao et
al., 2008; Regenold et al., 2009), bem como também de vários erros inatos do
metabolismo (Schuck et al., 2002; Reis de Assis et al., 2004; Latini et al., 2005;
Zugno et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Mirandola et al., 2008; Moshal et al., 2008;
Ribeiro et al., 2008; Viegas et al., 2008).
A função mitocondrial pode ser avaliada pela medida da produção de
espécies reativas, do potencial de membrana mitocondrial, do estado redox
estimado pelo conteúdo de NAD(P)H/NAD(P)
+
, e pelo inchamento mitocondrial,
que pode ser secundário à abertura do poro de transição mitocondrial.
1.1.5. Radicais Livres
Um radical livre é qualquer espécie química capaz de existir de forma
independente e que contenha um ou mais elétrons desemparelhados (Southorn e
Powis, 1988; Halliwell, 2001; Halliwell, 2006; Halliwell e Gutteridge, 2007).
Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbico, o oxigênio
molecular (O
2
) sofre redução tetravalente, com incorporação de quatro elétrons,
resultando na formação de água (H
2
O). No entanto, aproximadamente 5% do
23
oxigênio
utilizado na cadeia respiratória mitocondrial não são completamente
reduzido à água, podendo ser convertido a intermediários reativos como o radical
superóxido (O
2
) e hidroxil (
OH), e também a peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
),
processo esse que pode ser exacerbado em condições patológicas (Boveris,
1998).
O termo genérico “Espécies Reativas de Oxigênio” (ERO) é usado para
incluir não só os radicais formados pela redução do O
2,
o radical superóxido (O
2
)
e o radical hidroxil (
OH), mas também alguns não-radicais derivados do oxigênio,
como o H
2
O
2
, o oxigênio singlet (
1
O
2
) (Halliwell e Gutteridge, 2007). Além dessas,
existem ainda as espécies reativas de nitrogênio (ERN), sendo o óxido nítrico
(NO
) e o peroxinitrito (ONOO
-
) os principais representantes.
As ERO e ERN ocorrem tanto em processos fisiológicos quanto patológicos
do organismo. Fisiologicamente, essas espécies reativas apresentam diversas
funções (Bergendi et al., 1999). Assim, um aumento da liberação local de radicais
livres pode ser benéfico, como é o caso da liberação de espécies tóxicas
oxidantes pelos neutrófilos, que podem atuar na defesa do hospedeiro contra uma
infecção (Delanty e Dichter, 1998; Halliwell e Gutteridge, 2007). Participam ainda
de processos de sinalização celular e também estão envolvidos na síntese e
regulação de algumas proteínas (Halliwell e Gutteridge, 2007).
Por outro lado, quando formadas em excesso, essas espécies altamente
reativas têm o potencial de oxidar moléculas (Maxwell, 1995). Com relação aos
efeitos prejudiciais das reações oxidantes ao organismo, os radicais livres podem
promover lipoperoxidação, causar a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade
24
(LDL), reagir com proteínas, levando à sua inativação e consequente alteração de
sua função e reagir com o DNA e RNA, levando a mutações somáticas e à
distúrbios de transcrição (Delanty e Dichter, 1998; Halliwell e Whiteman, 2004),
dentre outros efeitos.
I.1.5.1. Defesas Antioxidantes
Para evitar os efeitos danosos das espécies reativas, existem mecanismos
eficientes para sua eliminação, como a produção endógena de enzimas
antioxidantes e alguns antioxidantes não-enzimáticos. Embora diferindo na
composição, as defesas antioxidantes estão amplamente distribuídas no
organismo (Halliwell e Gutteridege, 2007) e compreendem:
agentes que removem cataliticamente os radicais livres, como as
enzimas superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, entre outras;
proteínas que minimizam a disponibilidade de pró-oxidantes (íons de
ferro e cobre, por exemplo), ao se ligarem aos mesmos como as transferrinas;
proteínas que protegem biomoléculas de dano oxidativo por outros
mecanismos;
agentes de baixo peso molecular que aprisionam espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio, como glutationa, -tocoferol, ácido ascórbico e a
bilirrubina.
25
I.1.5.2. Estresse Oxidativo
Organismos saudáveis em condições normais produzem espécies reativas,
que em sua maior parte são controladas pelos sistemas de defesa antioxidante.
No entanto, em determinadas condições patológicas pode haver um desequilíbrio
entre a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes, favorecendo a
ocorrência do estresse oxidativo.
Assim, o termo “estresse oxidativo” é usado para se referir à situação na
qual a geração de espécies reativas ultrapassa a capacidade das defesas
antioxidantes disponíveis. Pode resultar tanto de uma diminuição das defesas
antioxidantes quanto de uma produção aumentada de oxidantes, bem como da
liberação de metais de transição ou a combinação de quaisquer desses fatores
(Halliwell, 2006).
O estresse oxidativo pode promover adaptação, dano ou morte celular:
Adaptação: as células podem tolerar um estresse oxidativo
moderado, que geralmente resulta em um aumento da síntese de sistemas de
defesa antioxidante a fim de restaurar o balanço oxidante/antioxidante. Apesar
disso, nem sempre o estresse oxidativo precisa envolver defesas antioxidantes
aumentadas.
Dano celular: o estresse oxidativo pode danificar alvos moleculares
(DNA, proteínas, carboidratos e lipídios) (Halliwell e Gutteridge, 2007). A resposta
à injúria pode ser reversível: a célula entra em um estado de homeostase alterado
temporário ou prolongado, que não leva à morte celular.
26
Morte celular: pode ocorrer tanto por necrose quanto por apoptose.
Na morte celular por necrose, a célula incha e se rompe, liberando seu conteúdo
para o meio extracelular. Pode haver a liberação de antioxidantes, como a
catalase e a glutationa reduzida, e também de pró-oxidantes, como os íons cobre
e ferro e proteínas do grupo heme, agentes esses que podem afetar as células
adjacentes, podendo até mesmo induzi-las a um estresse oxidativo. Já na
apoptose, o mecanismo de morte celular programada é ativado e não há a
liberação do conteúdo celular. A apoptose pode estar acelerada em certas
doenças, tais como as desordens neurodegenerativas, havendo envolvimento do
estresse oxidativo (Halliwell e Gutteridge, 2007).
I.1.5.3. Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas
Numerosas hipóteses têm sido propostas para explicar a
neurodegeneração das doenças de Alzheimer, Huntington e Parkinson (Alexi et
al., 2000; Mendéz-Álvarez et al., 2001; Behl et all., 2002; Halliwell, 2006), sem,
entretanto, obter até o momento uma explicação completamente satisfatória para
explicar o dano cerebral dessas doenças. No entanto, acredita-se que possíveis
mecanismos envolvam deficiência no metabolismo energético, estresse oxidativo
e neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos do tipo NMDA
(excitotoxicidade), ou, possivelmente, um somatório desses fatores (Rose e
Henneberry, 1994).
Numerosas evidências sugerem que os radicais livres e o estresse oxidativo
possam estar envolvidos na patogênese do dano neurológico em várias doenças
27
neurodegenerativas. Estudos demonstraram uma diminuição na atividade do
complexo I da cadeia respiratória em cérebros postmortem de pacientes
portadores de doença de Parkinson (Schapira et al., 1990). Essa inibição do
complexo I pode acarretar um aumento na geração de espécies reativas, tais
como ânion superóxido, hidroxil e peroxinitrito, as quais poderiam causar um
prejuízo ainda maior na cadeia transportadora de elétrons. Dessa forma, é
possível que o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial formem um “ciclo
vicioso” na doença de Parkinson (Schapira et al., 1989, 1990a,b;Gu et al., 1998).
Na doença de Alzheimer, a mais comum dentre as doenças
neurodegenerativas, é possível que o estresse oxidativo tenha um papel chave na
morte neuronal. Tem sido proposto que o peptídeo β-amilóide, o formador das
chamadas placas senis, tenha a capacidade de gerar radicais livres
espontaneamente. Estudos também evidenciaram um dano oxidativo em cérebros
humanos postmortem com doença de Alzheimer, através da observação de
aumento de 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina (8-OHdGA), produtos de oxidação de
outras bases e de RNA, carbonilas de proteínas, nitrotirosina e marcadores de
peroxidação lipídica (Markesbery e Carney, 1999; Nourooz-Zadeh et al., 1999;
Lovell et al., 2000).
Por outro lado, vários estudos têm evidenciado um dano oxidativo
importante em pacientes portadores da doença de Huntington, particularmente
representado pela formação de 3-nitrotirosina nas áreas afetadas (Alexi et al.,
2000). Entretanto, o dano oxidativo observado nessa doença aparentemente tem
menor importância do que nas doenças de Parkinson e Alzheimer.
28
Nos últimos anos, foi verificado que vários metabólitos acumulados em
alguns EIM induzem estresse oxidativo no cérebro de animais experimentais
(Latini et al., 2007; Feksa et al., 2008; Kessler et al., 2008; Leipnitz et al., 2008;
Zugno et al., 2008 e em seres humanos (Sitta et al., 2006; Deon et al., 2007;
Ribeiro et al., 2007; Barschak et al., 2008a,b; Deon et al., 2008), indicando que
compostos acumulados nestas doenças possam causar dano oxidativo.
29
I.2. OBJETIVOS
I.2.1. Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho foi investigar o efeito in vitro de metabólitos
acumulados nas deficiências da LCHAD e MTP sobre importantes parâmetros de
estresse oxidativo e de função mitocondrial em cérebro de ratos jovens, visando a
uma melhor compreensão dos mecanismos neurotóxicos desses ácidos graxos.
I.2.2. Objetivos Específicos
Investigar o efeito in vitro dos ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-
hdroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) nas concentrações de
10, 25, 50 e 100 μM sobre o dano oxidativo lipídico (níveis de substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico), dano oxidativo protéico (formação de carbonilas e o
conteúdo de grupamentos tióis), defesas antioxidantes não-enzimáticas
(concentração de glutationa reduzida) e sobre a produção de nitratos e nitritos
em homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida.
Investigar o efeito in vitro dos ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-
hdroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) nas concentrações de
25, 50 e 100 μM sobre os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, índice de
controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O, medidos através do consumo de
oxigênio em preparações mitocondriais de cérebro de ratos;
30
Investigar o efeito in vitro dos ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-
hdroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) nas concentrações de
25, 50 e 100 μM sobre o potencial de membrana mitocondrial e sobre o conteúdo
dos equivalentes reduzidos de NADH e NADPH em preparações mitocondriais de
cérebro de ratos;
31
PARTE II
Artigos Científicos
32
Capítulo I
Long-chain 3-hydroxy fatty acids accumulating in LCHAD and MTP
deficiencies induce oxidative damage and reduce the antioxidant defenses in
cerebral cortex of young rats
Anelise M. Tonin, Mateus Grings, Estela N. B. Busanello, Alana P. Moura, Gustavo
da Costa Ferreira, Carolina Maso Viegas, Carolina G. Fernandes, Patrícia F.
Schuck, Moacir Wajner
Artigo científico submetido para publicação no periódico
Cellular and Molecular Neurobiology
33
Long-chain 3-hydroxy fatty acids accumulating in LCHAD and MTP
deficiencies induce oxidative damage and reduce antioxidant defenses in
cerebral cortex of young rats
Anelise M. Tonin
1
, Mateus Grings
1
, Estela N. B. Busanello
1
, Alana P. Moura
1
,
Gustavo C. Ferreira
1
, Carolina M. Viegas
1
, Carolina G. Fernandes
1
, Patrícia F.
Schuck
1,3
, Moacir Wajner
1,2
1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
2
Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS, Brazil.
3
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do
Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil.
Correspondence: M. Wajner, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Rua Ramiro Barcelos, 2600 - Anexo, CEP 90035-003, Porto
Alegre, RS, Brazil. Tel: 55 51 33085571. Fax: 55 51 33085540, E-mail.
mwajner@ufrgs.br
34
Abstract
Accumulation of long chain 3-hydroxy fatty acids is the biochemical hallmark
of long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) and mitochondrial
trifunctional protein (MTP) deficiencies. These disorders are clinically characterized
by neurological symptoms, such as convulsions and lethargy, as well as by
cardiomiopathy and muscle weakness. In the present work we investigated the in
vitro effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-
hydroxypalmitic (3HPA) acids, which accumulate in these disorders, on important
oxidative stress parameters in cerebral cortex of young rats in the hope to clarify
the mechanisms leading to the brain damage found in patients affected by these
disorders. It was first verified that these compounds significantly induced lipid
peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances
levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased and sulfhydryl
content decreased by 3HTA and 3HPA, which indicates that these fatty acids elicit
protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced
glutathione (GSH) levels, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we
observed that the addition of the antioxidants and free radical scavengers trolox
and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage,
whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by 3HTA. Our
present data showing that 3HDA, 3HTA and 3HPA elicit oxidative stress in rat brain
indicate that oxidative damage may represent an important pathomechanism
involved in the neurologic symptoms manifested by patients affected by LCHAD
and MTP deficiencies.
35
Running Title: Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and oxidative
stress
36
Mitochondrial β-oxidation of fatty acids is an important source of energy,
especially during fasting episodes and during metabolic stress. The last three steps
of β-oxidation of long-chain fatty acids are catalyzed by a multienzyme complex
associated with the inner mitochondrial membrane, the trifunctional protein (MTP).
This complex encompasses the activities of long-chain enoyl-CoA hydratase, long-
chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) and long-chain 3-ketothiolase.
There are clinical and molecular genetics differences between isolated LCHAD
deficiency and the combined defects of all three catalytic activities (MTP
deficiency). Plasma accumulation and high excretion of long-chain 3-
hydroxyacylcarnitines and fatty acids including 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids in urine are the
biochemical hallmarks of these disorders (Costa et al. 1998).
Isolated LCHAD deficiency (McKusick 600890) is recognized with increasing
frequency, and is one of the most severe fatty acid oxidation disorders. The
phenotypic spectra in LCHAD deficient patients include liver failure, psychomotor
delay, seizures, microcephaly, cardiomyopathy, skeletal myopathy, retinal
pigmentary changes, peripheral neuropathy, lethargy, coma and sudden death.
The cerebral MRI imaging reveals brain cortical atrophy with white matter
hypodensity (Tyni et al., 1996; den Boer et., 2002). Otherwise, MTP deficient
patients present primarily with heart disease and/or skeletal myopathy (Jackson et
al. 1992) and only a few patients with this disorder had a predominant liver
disease. Progressive encephalopathy is also found in both disorders (Tyni and
Pihko 1999) and the appearance of the clinical symptoms usually occurs between
birth and 3 years of age and is usually triggered by fasting or infections (Tyni and
37
Pihko 1999). These stress situations are characterized by a dramatic increase of
the concentrations of the accumulating fatty acids, so it is conceivable that
neurotoxic actions may be attributed to these compounds, as previously postulated
(Roe and Coates, 1989; Gregersen et al., 2001; Spiekerkoetter et al. 2004).
At present, the pathomechanisms of the tissue damage of disorders in which
long chain 3-hydroxy fatty acids accumulate are virtually unknown. Considering
that oxidative stress was shown to be involved in the pathophysiology of common
neurodegenerative disorders (Perez-Severiano et al. 2000; Bogdanov et al. 2001;
Behl and Moosmann 2002; Stoy et al. 2005; Berg and Youdim 2006; Mancuso et
al. 2006) and that the role of 3HDA, 3HTA and 3HPA on biological oxidations has
not yet been evaluated, the aim of the present work was to investigate the in vitro
effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on a wide spectrum of oxidative stress
parameters in homogenates from cerebral cortex of young rats. The evaluated
parameters were thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), carbonyl
content, sulfhydryl groups oxidation, reduced glutathione (GSH) levels and nitrates
and nitrites production.
1. Experimental procedures
1.1 Animals and reagents
Thirty-day-old male Wistar rats obtained from the Central Animal House of
the Department of Biochemistry, ICBS, Federal University of Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, RS – Brazil, were used. The animals were maintained on a 12:12 h
light / dark cycle (lights on 07.00 - 19.00 h) in air conditioned constant temperature
(22°C ± 1°C) colony room, with free access to water and 20% (w/w) protein
38
commercial chow (SUPRA, Porto Alegre, RS, Brazil). The experimental protocol
was approved by the Ethics Committee for animal research of the Federal
University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil and followed the “Principles of
Laboratory Animal Care (NIH publication 85-23, revised 1996). All efforts were
made to minimize the number of animals used and their suffering.
All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA), except for
3HDA and 3HTA that were purchased from Indofine Chemical Company,
Hillsborough, New Jersey, United States of America. 3HDA, 3HTA and 3HPA were
dissolved on the day of the experiments in the incubation medium used for each
technique with pH adjusted to 7.4. The final concentrations of these fatty acids in
the medium ranged from 10μM to 100μM.
1.2 Tissue preparation and incubation
On the day of the experiments the animals were sacrificed by decapitation
without anesthesia, and the brain was rapidly excised on a Petri dish placed on ice.
The olfactory bulbs, pons, medulla, cerebellum and striatum were discarded, and
the cerebral cortex was peeled away from the subcortical structures, weighed and
homogenized in 10 volumes (1:10, w/v) of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4
containing 140 mM KCl. Homogenates were centrifuged at 750 x g for 10 min at
4ºC to discard nuclei and cell debris (Evelson et al. 2001). The pellet was
discarded and the supernatant, a suspension of mixed and preserved organelles,
including mitochondria, was separated and incubated in 20 mM sodium phosphate
buffer, pH 7.4 containing 140 mM KCl at 37° C for one hour with 3HDA, 3HTA or
3HPA at final concentrations of 10, 25, 50 and 100μM. Controls did not contain any
39
of these metabolites in the incubation medium. Immediately after incubation,
aliquots of the cortical supernatants were incubated in the absence or presence of
the metabolites (1:5, v/v) for 60 min, after which the values of TBA-RS levels,
carbonyl and sulfhydryl content, GSH concentrations and nitrates and nitrites levels
were measured.
We always carried out parallel experiments with blanks (controls) in the
presence or absence of the tested metabolites (3HDA, 3HTA and 3HPA) and
without cortical supernatants in order to detect artifacts caused by these fatty acids
in the assays. By doing so, any interference of these acids on the reactions used to
measure the oxidative stress parameters would be identified.
1.3 Thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels
TBA-RS levels were determined according to the method of Esterbauer and
Cheeseman (1990). Briefly, 300 µL of cold 10 % trichloroacetic acid were added to
150 µL of 3HDA, 3HTA or 3HPA pre-treated cerebral cortex supernatants and
centrifuged at 300 x g for 10 min. Three hundred microliters of the supernatant
were transferred to a pyrex tube and incubated with 300 µL of 0.67 % TBA in 7.1 %
sodium sulphate on a boiling water bath for 25 min. The tubes containing the
mixture were allowed to cool on running tap water for 5 min. The resulting pink-
stained TBA-RS was determined in a spectrophotometer at 532 nm. A calibration
curve was performed using 1,1,3,3-tetramethoxypropane, and each curve point
was subjected to the same treatment as supernatants. Some experiments were
performed in the presence or absence of melatonin (MEL; 100 M), trolox (TRO; 5
40
M), the nitric oxide synthase inhibitor N
ω
-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME;
200 M), a combination of the antioxidant enzymes catalase (CAT; 10 mU/mL)
plus superoxide dismutase (SOD; 10 mU/mL), deferoxamine (DFO; 150 μM) or
reduced glutathione (GSH; 100 M). The concentrations of the antioxidant used
were as previously described (Leipnitz et al. 2009). TBA-RS values were
calculated as nmol of TBA-RS/mg protein and represented as percentage of
control.
1.4 Determination of protein carbonyl formation content
Protein carbonyl content formation, a marker of oxidized proteins, was
measured spectrophotometrically according to Reznick and Packer (1994). One
hundred microliters of the aliquots from the incubation were treated with 400 µL of
10 mM 2,4-dinitrophenylhidrazine (DNPH) dissolved in 2.5 N HCl or with 2.5 N HCl
(blank control) and left in the dark for one hour. Samples were then precipitated
with 500 µL 20 % TCA and centrifuged for 5 min at 10,000 x g. The pellet was then
washed with 1 mL ethanol: ethyl acetate (1:1, v/v) and re-dissolved in 550 µL 6 M
guanidine prepared in 2.5 N HCl. Then, the tubes were incubated at 37 º C for 5
min to assure the complete dissolution of the pellet and the resulting sample was
determined at 365 nm. The difference between the DNPH-treated and HCl-treated
samples was used to calculate the carbonyl content. The results were calculated
as nmol of carbonyls groups/mg of protein and represented as percentage of
control, using the extinction coefficient of 22,000 x 106 nmol/mL for aliphatic
hydrazones.
41
1.5 Sulfhydryl (thiol) group oxidation
This assay is based on the reduction of 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)
(DTNB) by thiols, generating a yellow derivative (TNB) whose absorption is
measured spectrophotometrically at 412 nm (Aksenov and Markesbery, 2001).
Briefly, 0.1 mM DTNB was added to 3HDA, 3HTA or 3HPA pre-treated cortical
supernatants. This was followed by 30 min incubation at room temperature in a
dark room. Absorption was measured at 412 nm. The protein-bound sulfhydryl
content is inversely correlated to oxidative damage to proteins. Results were
reported as nmol TNB/mg protein and represented as percentage of control.
1.6 Reduced glutathione (GSH) concentrations
Reduced glutathione (GSH) concentrations were measured according to
Browne and Armstrong (1998). 3HDA, 3HTA or 3HPA pre-treated cerebral cortex
supernatants were diluted in 20 volumes of (1:20, v/v) 100 mM sodium phosphate
buffer pH 8.0, containing 5 mM EDTA. One hundred microliters of this preparation
were incubated with an equal volume of o-phthaldialdehyde (1 mg/mL methanol) at
room temperature during 15 min. Fluorescence was measured using excitation and
emission wavelengths of 350 nm and 420 nm, respectively. Some experiments
were performed in the presence or absence of melatonin (MEL; 100 M), trolox
(TRO; 5 M), the nitric oxide synthase inhibitor N
ω
-nitro-L-arginine methyl ester (L-
NAME; 200 M), a combination of the antioxidant enzymes catalase (CAT; 10
mU/mL) plus superoxide dismutase (SOD; 10 mU/mL) or deferoxamine (DFO; 150
μM). Calibration curve was prepared with standard GSH (0.01 - 1 mM) and the
42
concentrations were calculated as nmol/mg protein and represented as percentage
of control.
The oxidation of a commercial solution of GSH (200 M) was also tested by
exposing this solution to 100μM of 3HTA or 3HPA for one our in a medium devoid
of brain supernatants. After 3HTA or 3HPA exposition, 7.4 mM o-phthaldialdehyde
was added to the vials and the mixture was incubated at room temperature during
15 min.
1.7 Nitrate and nitrite determination
Nitrate and nitrite concentrations were determined according to Miranda et
al., (2001). Briefly, 12 µL of 20 % trichloroacetic acid were added to 300 µL of
3HDA, 3HTA or 3HPA pre-treated cerebral cortex supernatants and centrifuged at
12,000 x g for 10 min. Two hundred microliters of the supernatant were transferred
to a eppendorf tube and incubated with 200 µL of 0.8 % VCl
3
in 1 M HCl and 200µL
of the Griess reagent (2% sulfanilamide in 5% HCl and 0.1% N-1-
(naphtyl)ethylenediamine in H
2
O) at 37ºC for 30 min in a dark room. Absorbance
was then determined at 540 nm by spectrophotometry. A calibration curve was
performed using sodium nitrate, and each curve point was subjected to the same
treatment as supernatants and the concentrations were calculated as µmol/mg
protein and represented as percentage of control.
1.8 Protein determination
43
Protein was measured by the method of Lowry et al. (1951) using bovine
serum albumin as standard.
1.9 Statistical analysis
Results are presented as mean standard error of the mean. Assays were
performed in triplicate and median was used for statistical analysis. Data was
analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the post-hoc
Duncan multiple range test when F was significant. Linear regression analysis was
used to detect dose-dependent effects. Differences between groups were rated
significant at P < 0.05. All analyses were carried out in an IBM-compatible PC
computer using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software.
2. Results
2.1 Lipid peroxidation is induced by 3HDA, 3HTA and 3HPA in rat cerebral cortex
We initially tested the influence of 3HDA, 3HTA and 3HPA on TBA-RS
levels. Figure 1 shows that 3HDA (A), 3HTA (B) and 3HPA (C) significantly
increased TBA-RS levels relative to controls [3HDA: F
(5,24)
= 2.91; P < 0.05; 3HTA:
F
(4,20)
=12.59; P < 0.001; 3HPA: F
(4,25)
=10.25; P < 0.001] in a dose-dependent
manner [3HDA: =0.607; P < 0.001; 3HTA: =0.796; P < 0.001; 3HPA: =0.747; P
< 0.001].
We also tested the effect of the antioxidants melatonin (MEL; 100 M),
trolox (TRO; 5 M), the nitric oxide synthase inhibitor N
ω
-nitro-L-arginine methyl
ester (L-NAME; 200 M), the combination of the antioxidant enzymes catalase
44
(CAT; 10 mU/ mL) plus superoxide dismutase (SOD; 10 mU/mL), deferoxamine
(DFO; 150μM) or glutathione (GSH; 100 μM) on the 3HTA-elicited increase of
TBA-RS levels. These antioxidants were co-incubated with 100 μM 3HTA and
cerebral cortex homogenates for 60 min, after which the TBA-RS levels were
measured. We observed that TRO and DFO partially prevented 3HTA-induced
increased lipid peroxidation [F
(7,40)
=10,57; P < 0.001] (Figure 1D). In contrast, MEL,
L-NAME, CAT plus SOD and GSH, were not able to prevent the increase of TBA-
RS values caused by 3HTA relative to controls.
3HTA and 3HPA induce protein oxidative damage in rat cerebral cortex
2.2 3HTA and 3HPA induce protein oxidative damage in rat cerebral cortex
We then evaluated the effect of 3HDA, 3HTA and 3HPA on carbonyl
formation and sulfhydryl oxidation in cortical homogenates in order to evaluate
protein oxidation parameters. We found that 3HTA [F
(4,20)
=31,80; P < 0.001] and
3HPA [F
(4,15)
=3,085; P < 0.05] significantly increased protein carbonyl groups
content in cortical homogenates relative to controls (Figure 2), in a dose-dependent
manner [3HTA: =0.918; P < 0.001; 3HPA: =0.666; P < 0.001]. 3HTA
[F
(4,20)
=6.65; P < 0.001] and 3HPA [F
(4,25)
= 4.11; P < 0.01] also decreased
sulfhydryl content relative to controls in a dose-dependent manner [3HTA: = -
0.717; P < 0.001] (Figure 3). In contrast, 3HDA did not affect any of these
parameters relative to controls.
45
2.3 Non-enzymatic antioxidant defenses are decreased by 3HTA and 3HPA in rat
cerebral cortex
The in vitro effect of 3HDA, 3HTA and 3HPA on the non-enzymatic
antioxidant defense was then investigated by measuring GSH levels. We found
that 3HTA [F
(4,25)
=4.61; P < 0.01] and 3HPA [F
(4,25)
=20.59; P < 0.001], but not
3HDA, significantly decreased GSH levels relative to controls (Figure 4 A,B,C).
Furthermore, when DFO was co-incubated with 100 μM 3HTA, the decrease in
GSH levels was totally prevented [F
(6,35)
=6.12; P < 0.001] (Figure 4D). However,
the other antioxidants including MEL, TRO, L-NAME and CAT plus SOD were not
able to prevent this effect.
2.4 3HTA and 3HPA do not directly react with a commercial solution of GSH
We then investigated whether the 3HTA and 3HPA-induced GSH levels
decrease was due to a direct oxidative attack or to an artifact. We therefore
exposed a commercial solution of GSH (200 M) to 100μM of 3HTA or 3HPA for
60 min in the absence of tissue supernatants. It was observed that these
compounds did not oxidize free GSH, suggesting that these long chain fatty acid
per se are not direct oxidant agents, but elicit oxidative damage probably via free
radical generation. (Table I)
2.5 3HDA, 3HTA and 3HPA do not affect nitrite and nitrate generation in rat
cerebral cortex
46
Finally, the effect of 3HDA, 3HTA and 3HPA on reactive nitrogen species
generation was assessed, by measuring nitrate and nitrite production. We
observed that this parameter was not altered by 3HDA, 3HTA and 3HPA (data not
shown).
3. Discussion
Long chain 3-hydroxy fatty acids accumulate in plasma and are extensively
excreted in urine of patients affected by long-chain 3-hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase (LCHAD) and mitochondrial trifunctional protein (MTP)
deficiencies, a group of diseases affecting fatty acid oxidation (Tyni et al. 1996;
Jones et al. 2000). These disorders are characterized by hypoketotic
hypoglycemia, seizures and lethargy, as well as retinopathy, peripheral neuropathy
and multiple organ failure (Tyni et al. 1996) and current long-term therapy includes
avoidance of fasting and a high carbohydrate low-fat diet with supplementary
dietary medium-chain fatty acids (Roe and Ding 2001; Jones et al. 2003). To date,
very little is known about the mechanisms underlying the neuropathology of
LCHAD and MTP deficiencies. Hypoglycemia may acutely affect the central
nervous system. However, it has been recently proposed that the metabolites
accumulating in fatty acid oxidation disorders including LCHAD and MTP
deficiencies, may be neurotoxic, since encephalopathic crises that sometimes lead
to a fatal outcome occur in the absence of low blood glucose levels. (Roe and
Coates 1989; Gregersen et al. 2001; Spiekerkoetter et al. 2004).
There are convincing evidences that oxidative stress and reactive oxygen
species (ROS) generation are related to the etiology and/or progression of a
47
number of neurodegenerative disorders (Perez-Severiano et al. 2000; Bogdanov
et al. 2001; Behl and Moosmann 2002; Stoy et al. 2005; Berg and Youdim 2006;
Mancuso et al. 2006) and also of some inherited disorders of the intermediary
metabolism (de Oliveira Marques et al. 2003; Barschak et al. 2006; Sgaravatti et al.
2007; Schuck et al. 2007, 2009). Considering that the role of long-chain 3-hydroxy
fatty acids on biological oxidations was not yet fully evaluated, in the present work
we investigated the in vitro influence of 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids on a large
number of oxidative stress parameters in cerebral cortex of young rats.
3HDA, 3HTA and 3HPA at micromolar doses significantly increased lipid
peroxidation in cerebral cortex, as verified by high TBA-RS levels relative to
controls (Halliwell and Gutteridge 1999). The in vitro lipid peroxidation induced by
3HTA, which presented the most pronounced effects on TBA-RS levels as
compared to 3HDA and 3HPA, was partially prevented by trolox (TRO) and
deferoxamine (DFO), but not by melatonin (MEL), reduced glutathione (GSH), the
nitric oxide synthase inhibitor N
ω
-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) or a
combination of the antioxidant enzymes catalase (CAT) plus superoxide dismutase
(SOD). TRO is a hydrophilic analogue of vitamin E, the major lipid soluble
antioxidant of lipoproteins and biomembranes, and appears to be effective against
peroxyl radicals (Halliwell and Gutteridge 2007). On the other hand, DFO forms a
complex with iron (chelator), which subsequently cannot be reduced to the ferrous
form (Fe
2+
) thus rendering the Fenton reaction impossible (Gutteridge et al. 1979).
The data indicate that iron and peroxyl radical were probably involved in 3HTA-
elicited increase of TBA-RS levels. On the other hand, it is unlikely that the radicals
48
hydroxyl, mainly scavenged by MEL (Reiter, 1998), superoxide and hydrogen
peroxide, scavenged by CAT plus SOD, respectivelly, and nitric oxide, which
synthesis is inhibited by L-NAME, mediated 3HTA-induced in vitro lipid
peroxidation .
We also verified that the content of protein carbonyl, the most general and
widely used marker of protein oxidation both in vitro and in vivo (Stadtman and
Berlett 1997), was markedly augmented by 3HTA and 3HPA, but not by 3HDA.
Carbonyl groups (aldehydes and ketones) are mainly produced by oxidation of
protein side chains (especially Pro, Arg, Lys, and Thr), by oxidative cleavage of
proteins, or from the reaction of reducing sugars or their oxidation products with
lysine protein residues (Dalle-Done et al. 2003). Generally, detection of elevated
levels of protein carbonyl is a sign not only of protein oxidative damage but also of
protein dysfunction (Dalle-Donne et al. 2009). Although protein carbonyls are
usually caused by ROS-mediated protein damage, we cannot also exclude the
possibility that aldehydes resulting from lipid peroxidation may also induce carbonyl
generation (Dalle-Done et al. 2003).
Similarly, but in a lesser degree, sulfhydryl content was decreased by 3HTA
and 3HPA. As most cellular sulfhydryl groups are protein-bound (Reznick and
Packer 1994; Levine et al. 2002), it is conceivable that these results allied to
carbonyl formation strongly indicate that 3HTA and 3HPA provoke protein oxidation
with possible deleterious effects on protein functioning.
3HTA and 3HPA also decreased GSH levels, the major brain antioxidant
defense, in cerebral cortex, suggesting that the rat cortical antioxidant defenses
were impaired by these fatty acids (Lissi et al. 1995; Halliwell and Gutteridge 1999;
49
Evelson et al. 2001). It was also found that DFO, but not MEL, TRO, L-NAME or
CAT plus SOD, were able to prevent 3HTA-decrease of GSH levels in cortical
supernatants, implying that an iron-dependent effect may be involved in the
decrease of the reduced GSH levels provoked by 3HTA.
In contrast, 3HTA and 3HPA did not oxidize a cell free commercial solution of
GSH, indicating that these fatty acids provoked lipid and protein oxidative damage
via free radical induction, rather than exerting a direct oxidative effect on this
purified antioxidant. This assumption is further strengthened by the findings that
antioxidants attenuated or prevented the lipid oxidative damage and the reduction
of GSH levels induced by 3HTA.
Although we cannot at present establish which reactive species were
responsible for the oxidative effects detected, it could be postulated that oxygen
derived free radicals were mainly involved since L-NAME, an inhibitor of nitric
oxide synthase, did not prevent the 3HDA, 3HTA and 3HPA-increase of lipid
oxidative damage and the decrease of antioxidant defenses and that did not elicit
an increase of nitrite and nitrate production.
Our findings showing that the long chain 3-hydroxy fatty acids accumulating in
LCHAD and MTP deficiencies, especially 3HTA and 3HPA, provoke lipid and
protein oxidative damage and reduced brain antioxidant defenses is indicative that
they cause oxidative stress in cerebral cortex in vitro (Halliwell and Gutteridge
1999). In this scenario, we emphasize that the brain has a low capacity to react
agains free radicals because it has lower antioxidant defenses compared to other
tissues.
50
At the present, although we cannot establish the pathophysiological
significance of our present data since brain concentrations of the long chain 3-
hydroxy fatty acids in patients affected by LCHAD and MTP deficiencies are
unknown, it is feasible that our results are important. In this scenario, we
emphasize that 3HDA, 3HTA and 3HPA provoked significant alterations of the
oxidative stress parameters at micromolar doses similar to those found in plasma
of patients affected by LCHAD and MTP deficiencies (Martínez et al. 1997; Roe
and Ding 2001). Moreover, considering that the enzymes of fatty acid oxidation are
expressed in the neural cells (Tyni et al. 2004), it is feasible that the brain
concentrations of the accumulating metabolites may dramatically increase in these
patients during metabolic crises due to the blockage of the enzymatic step
catalyzed by LCHAD or MTP (Martínez et al. 1997; Roe and Ding 2001).
In conclusion, we describe for the first time that metabolites accumulating in
LCHAD and MTP deficiencies, particularly 3HTA and 3HPA, induce lipid and
protein oxidative damage and decrease the antioxidant defenses in rat brain in
vitro. In case the present findings are confirmed in vivo in tissues of patients
affected by LCHAD and MTP deficiencies, we presume that excessive reactive
species generation might contribute, at least in part, to the neuropathology of these
disorders. Therefore, antioxidants may possibly represent an adjuvant therapy to
for these patients especially during crises to avoid brain oxidative damage.
51
Acknowledgements
This work was supported by grants from CNPq, PRONEX II, FAPERGS,
PROPESQ/UFRGS, and FINEP research grant Rede Instituto Brasileiro de
Neurociência (IBN-Net) # 01.06.0842-00, INCT-EN.
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60
Legends to Figures
Figure 1. In vitro effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA) (A), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) (B) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) (C) acids on
thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels in rat cerebral cortex
homogenates. In some experiments the antioxidants melatonin (MEL; 100 M),
trolox (TRO; 5 M), the nitric oxide synthase inhibitor N
ω
-nitro-L-arginine methyl
ester (L-NAME; 200 M), a combination of the antioxidant enzymes catalase (CAT;
10 mU/mL) plus superoxide dismutase (SOD; 10 mU/mL), deferoxamine (DFO;
150 μM) or reduced glutathione (GSH) were added simultaneously with 100 μM
3HTA to the incubation medium and TBA-RS levels measured afterwards (D).
Values are mean standard error of the mean for five independent experiments
performed in triplicate. TBA-RS levels were calculated as nmol/mg protein and are
expressed as percentage of controls. Controls did not contain the tested fatty
acids. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 relative to controls;
#
P < 0.05 relative
to 3HTA alone (Duncan multiple range test).
Figure 2. In vitro effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA) (A), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) (B) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) (C) acids on
carbonyl content in rat cerebral cortex homogenates. Values are mean standard
error of the mean for five independent experiments performed in triplicate.
Carbonyl content were calculated as nmol/mg protein and are expressed as
percentage of controls. Controls did not contain the tested fatty acids. ***P < 0.001
relative to controls (Duncan multiple range test).
61
Figure 3. In vitro effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA) (A), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) (B) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) (C) acids on
sulphydryl content in rat cerebral cortex homogenates. Values are mean
standard error of the mean for five independent experiments performed in
triplicate. Sulphydryl contents were calculated as nmol/mg protein and are
expressed as percentage of controls. Controls did not contain the tested fatty
acids. *P < 0.05, ***P < 0.001 relative to controls (Duncan multiple range test).
Figure 4. In vitro effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA) (A), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) (B) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) (C) acids on
reduced glutathione (GSH) levels. In some experiments the antioxidants melatonin
(MEL; 100 M), trolox (TRO; 5 M), the nitric oxide synthase inhibitor N
ω
-nitro-L-
arginine methyl ester (L-NAME; 200 M), a combination of the antioxidant
enzymes catalase (CAT; 10 mU/mL) plus superoxide dismutase (SOD; 10 mU/mL)
or deferoxamine (DFO; 150 μM) were added simultaneously with 100 μM 3HTA to
the incubation medium and GSH levels measured afterwards (D). Values are
mean standard error of the mean for five independent experiments performed in
triplicate. GSH levels were calculated as nmol/mg protein and are expressed as
percentage of controls. Controls did not contain the tested fatty acids. *P < 0.05,
***P < 0.001 relative to controls;
#
P < 0.05 compared to 3HTA (Duncan multiple
range test).
62
Figure 1.
63
Figure 2.
64
Figure 3.
65
Figure 4.
66
Table I. Effect of 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA)
acids on a commercial solution of reduced glutathione (GSH).
Groups GSH levels
Control
100 ± 4.38
100 µM 3HTA
100 µM 3HPA
95.6 ± 4.51
107.4 ± 3.79
A commercial solution of 200 mM GSH was exposed to 100 μM of 3HTA or
3HPA for 60 min at 37
o
C, after which GSH content was measured. Values are
mean ± standard error of the mean for three independent experiments
performed in triplicate and are expressed as percentage of control.
67
Capítulo II
Disturbance of mitochondrial energy homeostasis caused by the metabolites
accumulating in LCHAD and MTP deficiencies in rat brain
Anelise Miotti Tonin, Gustavo da Costa Ferreira, Mateus Grings, Carolina Maso
Viegas, Estela Natacha Busanello, Alexandre Umpierrez Amaral, Ângela Zanatta,
Patrícia Fernanda Schuck, Moacir Wajner
68
Disturbance of mitochondrial energy homeostasis caused by the metabolites
accumulating in LCHAD and MTP deficiencies in rat brain
Anelise M. Tonin
1
, Gustavo C. Ferreira
1
, Mateus Grings
1
, Carolina M. Viegas
1
,
Estela N. Busanello
1
, Alexandre U. Amaral, Ângela Zanatta
1
, Patrícia Fernanda
Schuck
1,3
, Moacir Wajner
1,2
1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
2
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS, Brazil.
3
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do
Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil.
Corresponding Author: M. Wajner, Departamento de Bioquímica, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Rua Ramiro Barcelos, 2600 - Anexo, CEP 90035-
003, Porto Alegre, RS, Brazil. Tel: +55 51 33085571. Fax: +55 51 33085539, E-
mail: [email protected]
69
Abstract
Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-
hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of
metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present tissue accumulation of
the long chain 3-hydroxy fatty acids 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-
hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical
presentation is characterized by a multiorgan involvement, with cardiomyopathy,
retinopathy, peripheral neuropathy, as well as severe CNS impairment with
encephalopathic crises with lethargy, coma and seizures, besides mental
retardation, whose pathophysiology is poorly known. In the present work, we
investigated the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on various parameters of
energy homeostasis in mitochondrial preparations from brain of young rats. We
found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and
diminished the respiratory control ratio using glutamate plus malate or succinate as
substrates. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential
and the matrix NAD(P)H levels. In addition, 3HTA decreased ADP/O ratio and
state 3 respiration, using malate but not pyruvate/malate or succinate as
substrates. Our data indicate that the long chain 3-hydroxy fatty acids that
accumulate in LCHAD/MTP deficiencies act as uncouplers of oxidative
phosphorylation, while 3HTA also behaves as a metabolic inhibitor. It is presumed
that impairment of brain energy homeostasis caused by these endogenous
compounds may contribute at least in part to the neuropathology of LCHAD/MTP
deficiencies.
Keywords: Long-chain 3-hydroxy fatty acids; LCHAD deficiency; mitochondrial
function, rat brain
70
Introduction
The mitochondrial trifunctional protein (MTP) defects have recently emerged
as an important group of inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation
because of their clinical implications. Human inherited defects in the MTP complex,
that encompass three enzyme activities, cause either isolated long chain 3-
hydroxyacil-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiency, with normal or partially
reduced thiolase and hydratase activity, or complete MTP deficiency with markedly
reduced activity of all three enzymes (Rinaldo et al. 1998; Kompare and Rizzo
2008). Patients have been described with either MTP deficiency or more commonly
with an isolated LCHAD deficiency. The biochemical hallmarks of this group of
disorders are severe episodes of hypoketotic hypoglycemia, latic acidemia and
accumulation of long-chain 3-hydroxy fatty acids such as 3-hydroxydodecanoic
(3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids in
tissues and body fluids of affected individuals, especially during prolonged fasting
or infection (Costa et al. 1998; Olpin et al. 2000; Hintz et al. 2001; Sander et al.
2005). It is interesting to note that lactic acid accumulation indicates mitochondrial
dysfunction and a patient with LCHAD deficiency was initially diagnosed as a
respiratory chain defect (Das et al. 2000). Clinically, affected patients may present
encephalopathy with seizures, lethargy, coma mental retardation, microcephaly,
hipotonia, as well as hepatic dysfunction, and/or skeletal and cardiac myopathy or
sudden death (Tyni et al. 1996; Tyni and Pihko 1999; den Boer et al. 2002,
Spiekerkoetter et al. 2009). Current management of patients with MTP or LCHAD
defects include long-term dietary therapy of fasting avoidance, low-fat/high-
71
carbohydrate diet with restriction of long-chain fatty acid intake and replacement
with medium-chain fatty acids (Roe and Ding 2001; Jones et al. 2003).
Hypoglycemia has been originally suggested as the main mechanism of
brain damage in MTP/LCHAD deficiencies. On the other hand, it was
demonstrated that the coma and brain edema may occur in the absence of low
blood glucose levels, implying that the accumulating compounds could be
potentially neurotoxic (Scriver et al. 2001; Gregersen et al. 2008). In this context,
there are a few studies describing toxic in vitro effects of fatty acids and their
derivatives, most related to impairment of distinct steps of energy metabolism.
Long chain acyl-CoA esteres have been shown to inhibit oxidative phosphorylation
(Ventura et al. 2005), the mitochondrial ATP/ADP and dicarboxylate carriers, as
well as respiratory chain enzymes (Ventura et al. 2006). These fatty acids were
also shown to induce oxidative stress in the brain (data not published). However,
knowledge of the pathogenic processes in LCHAD and MTP deficiencies is still
underdeveloped.
We therefore investigated in the present work, the effect of 3HDA, 3HTA
and 3HPA on important parameters of mitochondrial bioenergetics in the brain,
including states 3 and 4 of mitochondrial respiration, the respitarory control ratio
(RCR) and the ADP/O ratio assessed by oxygen consumption, as well as
mitochondrial membrane potential (∆Ψm) and NAD(P)H content in brain
mitochondrial preparations from young rats.
72
Experimental Procedure
Reagents
All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA), except for
3HDA and 3HTA that were purchased from Indofine Chemical Company,
Hillsborough, New Jersey, United States of America. 3HDA, 3HTA and 3HPA were
dissolved on the day of the experiments in the incubation medium used for each
technique with pH adjusted to 7.4. The final concentrations of these fatty acids in
the medium ranged from 25 μM to 100μM. Controls did not contain such acids in
the incubation medium.
Animals
Wistar rats obtained from the Central Animal House of the Departamento de
Bioquímica, ICBS, UFRGS were used. Rats were kept with dams until weaning at
21 days of age. The animals had free access to water and to a standard
commercial chow and were maintained on a 12:12 h light/dark cycle in an air-
conditioned constant temperature (221 C) colony room. The “Principles of
Laboratory Animal Care” (NIH publication no. 80-23, revised 1996) were followed
in all experiments and the experimental protocol was approved by the Ethics
Committee for Animal Research of the Universidade Federal do Rio Grande do
Sul. All efforts were made to minimize the number of animals used and their
suffering.
73
Preparation of mitochondrial fractions
Forebrain mitochondria were isolated from 30-day-old rats as described
(Rosenthal et al. 1987), with slight modifications. Animals were sacrificed by
decapitation, had their brains rapidly removed and put into ice-cold isolation buffer
containing 225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 1 mM EGTA, 0.1% bovine serum
albumin (BSA; free fatty acid) and 10 mM HEPES, pH 7.2. The cerebellum, pons,
medulla and olfactory bulbs were removed and the remaining material was used as
the forebrain. The forebrain was cut into small pieces using surgical scissors,
extensively washed to remove blood and homogenized 1:10 in a Dounce
homogenizer using both a loose-fitting and a tight-fitting pestle. The homogenate
was centrifuged for 3 min at 2,000 x g. After centrifugation, the supernatant was
again centrifuged for 8 min at 12,000 x g. The pellet was suspended in 20 mL of
isolation buffer containing 10 μL of 10% digitonin and centrifuged for 8 min at
12,000 x g. The supernatant was discarded and the final pellet gently washed and
suspended in isolation buffer devoid of EGTA, at an approximate protein
concentration of 25-35 mg . mL-1. This preparation results in a mixture of
synaptosomal and non-synaptosomal mitochondria similar to the general brain
composition.
We always carried out parallel experiments with various blanks (controls) in
the presence or absence of 3HDA, 3HTA e 3HPA and also with or without
mitochondrial preparations in the reaction medium in order to detect any
interference (artifacts) of this fatty acid on the techniques utilized to measure the
mitochondrial parameters.
74
Respiratory parameters determined through mitochondrial oxygen consumption
The rate of oxygen consumption and the ADP/O ratio were measured
polarographically using a Clark-type electrode in a thermostatically controled
(37ºC) and magnetically stirred incubation chamber. 3HDA, 3 HTA and 3HPA (25 –
100μM) were added to the reaction medium at the beginning of the assay. The
assay was performed with purified mitochondrial preparations (0.75 mg protein .
mL
-1
when 2.5 mM malate plus 2.5 mM glutamate or 10mM pyruvate plus 2.5mM
malate were used as substrates, and 0.50 mg protein. mL
-1
when succinate was
used as substrate) incubated in a buffer containing 0.3 M sucrose, 5 mM MOPS, 5
mM potassium phosphate, 1 mM EGTA and 0.1% BSA. State 3 respiration was
measured after addition of 1 mM ADP to the incubation medium. In order to
measure state 4 respiration, 1 μg . mL-1 oligomycin A was added to the incubation
medium. Some experiments were carried out in the presence of 1 M atractyloside
(ATC), an inhibitor of adenine nucleotide translocator (ANT). The respiratory
control ratio (RCR; state 3/state 4) was then calculated. States 3 and 4 were
expressed as nmol O
2
consumed . min-1 . mg of protein-1. The ADP/O ratio was
estimated according to Estabrook (1967), using 100 µM ADP in the incubation
medium. Only mitochondrial preparations with RCR higher than 5 were used in the
experiments.
Determination of mitochondrial inner membrane potentials (∆Ψm)
Mitochondrial inner membrane potentials (∆Ψm) were estimated according
to Akerman and Wikström (1976) and Kowaltowski et al. (2002) using mitochondria
75
(0.50 mg protein. mL-1) supported by 2.5 mM glutamate plus 2.5 mM malate or 5
mM succinate as substrates, in the presence of 1 µg . mL-1 oligomycin A. The
fluorescence of 5 µM cationic dye safranin O at an excitation wavelength of 495 nm
and emission wavelength of 586 nm on a Hitachi F-4500 spectrofluorometer were
followed during 5 minutes. Data were expressed as fluorescence arbitrary units
(FAU).
Determination of NAD(P)H Fluorescence
Matrix mitochondrial NAD(P)H autofluorescence was measured at 37°C
using 366 nm excitation and 450 nm emission wavelengths on a Hitachi F-4500
spectrofluorometer using mitochondrial preparations (0.5 mg protein . mL-1) in an
incubation medium containing 125 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 0.1 mg.
mL-1 BSA, 5 mM HEPES, 2 mM KH2PO4, pH 7.3, using 2.5 mM malate plus 2.5
mM glutamate as substrates. Some experiments were carried out in the presence
of 1 µM carbonyl cyanide m-chloro phenyl hydrazone (CCCP). Data were
expressed as nmol NAD(P)H . mg of protein-1.
Protein Determination
Protein was measured by the method of Bradford (1976) using bovine
serum albumin as standard.
Statistical Analysis
Results were presented as mean ± standard deviation. Assays were
performed in duplicate and the mean was used for statistical analysis. Data were
analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the post-hoc
76
Duncan multiple range test when F was significant. Only significant F values were
shown in the text. Differences between groups were rated significant at P < 0.05.
All analyses were carried out using the Statistical Package for the Social Sciences
(SPSS) software.
Results
This study used mitochondrial preparations from rat brain to identify possible
alterations provoked by 3HDA, 3HTA and 3HPA, since these preparations allow
reliable analysis of bioenergetic parameters and manipulations of experimental
conditions not possible with whole brain.
We first determined the influence of 3HDA, 3HTA and 3HPA on respiratory
parameters assessed by the rate of oxygen consumption (Figures 1 and 2). It can
be observed in the figures that rat brain mitochondria incubated under our
conditions were fully coupled, as indicated by the higher respiratory rates observed
in the presence of ADP (state 3), as compared to those obtained after the addition
of the ADP synthase inhibitor oligomycin A (state 4). We found that all fatty acids
increased state 4 respiration regardless of the substrate used up to 240%
[glutamate/malate: 3HDA: F(3,16) = 5.40; P < 0.01; 3HTA: F(3,12) = 6.26; P <
0.01; 3HPA: F(3,12) = 60.8; P < 0.001; succinate: 3HDA: F(4,15) = 5.43; P < 0.05;
3HTA: F(4,15) = 36.12; P < 0.05; 3HPA: F(5,18) = 7.03; P < 0.001]. In addition,
3HDA, 3HTA and 3HPA significantly diminished the RCR [glutamate/malate:
3HDA: F(3,12) = 8.34; P < 0.01; 3HTA: F(3,12) = 8.56; P < 0.01; 3HPA: F(3,12) =
91.33; P < 0.001; succinate: 3HDA: F(4,15) = 37.41; P < 0.05; 3HTA: F(4,15) =
37.60; P < 0.05; 3HPA: F(5,18) = 66.75; P < 0.001]. In contrast, state 3 respiration
77
and ADP/O ratio were decreased in 20% and 24%, respectivelly, only by 3HTA in
the presence of glutamate plus malate as substrates [state 3: F(3,12) = 9.66; P <
0.001; ADP/O ratio: F(4.15) = 5.55; P < 0.05], but not when succinate was used as
substrates. Furthermore, when pyruvate plus malate were used as substrates
3HTA did not alter state 3 respiration (results not shown). These experiments
suggest that 3HDA, 3HTA and 3HPA behave as uncouplers of the oxidative
phosphorylation and that 3HTA may also act as a metabolic inhibitor, decreasing
the eficiency of mitochondrial respiration.
In order to better characterize the uncoupling effect of 3HDA, 3HTA and
3HPA on oxidative phosphorylation, mitochondrial membrane potentials (∆Ψm)
were measured using the fluorescent probe safranin O. We observed that 3HTA
and 3HPA, but not, 3HDA significantly decreased ∆Ψm in state 4-respiring
mitochondria using glutamate plus malate (Figure 3) or succinate (Figure 4) as
substrates.
We then assessed oxygen consumption in the presence of the ANT inhibitor
ATC (1 M) in order to examine the mechanism through which these fatty acids
uncouples mitochondria. We observed that the stimulatory effect of 3HTA on
oxygen consumption was not prevented by ATC [F(3,12) = 22.93; P < 0.001]
(Figure 5), ruling out a selective mitochondrial membrane permeabilization via ANT
in the 3HTA-elicited uncoupling effect.
The next step of our investigation was to evaluate whether 3HDA, 3HTA and
3HPA could alter matrix NAD(P)H content, since uncouplers of the oxidative
phosphorylation provoke a reduction of the mitochondrial matrix NAD(P)H pool. It
78
was observed that 3HTA and 3HPA, but not 3HDA, provoked an immediate drop in
the NAD(P)H autofluorescence (Figure 6). The addition of CCCP to the incubation
medium at the end of the trace provoked a further reduction in matrix NAD(P)H
autofluorescence, indicating that these fatty acids, at the highest tested
concentration, did not elicit maximal uncoupling of the oxidative phosphorylation.
We also assessed the mitochondrial swelling in the presence of 3HDA,
3HTA and 3HPA following light scattering of the mitochondrial suspensions. We
found that these fatty acids did not affect mitochondrial swelling under our
experimental conditions (data not shown).
Discussion
Very little is known about the mechanisms underlying the neuropathology of
mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-
CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies. However, it has been recently
proposed that the accumulating fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA),
3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids, and their
derivatives may play an important role in the pathophysiology of these disorders
(Gregersen et al. 2008).
Although the pathomechansims of tissue damage in LCHAD deficiency are
so far unknown, lactic acidemia, inhibition of various complexes of the respiratory
chain and mitochondrial morphological abnormalities observed in patients affected
by these diseases indicate mitochondrial dysfunction (Tyni et al. 1996; Ventura et
al. 1998; Das et al. 2000).
79
Previous reports demonstrated that some long chain acyl-CoA derivatives
inhibit ATP synthesis and oxygen consumption (under state 3) in liver mitochondria
(Ventura et al. 2005). Therefore, in the present work we investigated the effect of
3HDA, 3HTA and 3HPA on a wide spectrum of brain bioenergetic parameters in
the hope to clarify the mechanisms through which these fatty acids disturb
mitochondrial homeostasis.
Initially, it was observed that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly increased
state 4 respiration and decreased RCR at low micromolar concentrations. In
addition, 3HTA and 3HPA decreased ∆Ψm and matrix NAD(P)H levels in state 4-
respiring mitochondria, similarly but to a lesser extent than the classical uncoupler
CCCP. Our data suggest that these fatty acids behave as uncouplers of oxidative
phosphorylation. We also observed that the adenine nucleotide translocator (ANT)
inhibitor atractyloside (ATC) did not prevent the increase in the rate of oxygen
consumption in state 4-respiring mitochondria elicited by 3HTA, implying that the
involvement of ANT in 3HTA-uncoupling effect, as previously shown for other fatty
acids (Brustovetskyl et al., 1990; Skulachev, 1998; Samartsev et al., 2000), is
unlikely. In this context, interaction with other anion transporters, with mitochondrial
membrane phospholipids, or a distortion of the packing of the lipids in the inner
mitochondrial membrane leading to alterations in fluidity and ion permeability
(Kimmelberg and Pahadjopoulos, 1974; Lee, 1976; Abeywardena et al., 1983;
Schonfeld and Struy, 1999; Skulachev, 1999; Mokhova and Khailova, 2005) may
possibly underlie the uncoupling effect promoted by this compound.
On the other hand, only 3HTA was able to decrease state 3 respiration and
ADP/O ratio in the presence of glutamate plus malate but not of pyruvate plus
80
malate as substrate, suggesting that the oxidative system is also impaired by this
fatty acid. These data suggest that the inhibition of state 3 respiration elicited by
this fatty acid using glutamate plus malate as substrate may be secondary to
impaired transport or oxidation of glutamate into the mitochondrial matrix.
Interestingly, it has been demonstrated that long-chain acyl-CoA esters inhibit
glutamate and succinate transport, ATP synthesis and oxygen consuption (state 3)
in rat liver mitochondria (Ventura et al. 2005). Therefore, more studies should be
carried out in order to clarify whether glutamate oxidation or transport are involved
in the 3HTA-elicited state 3 reduction leading to a disturbance of mitochondrial
homeostasis.
We cannot establish at present the exact pathophysiological relevance of
our data since brain 3HDA, 3HTA and 3HPA concentrations are not yet established
in these diseases. It is possible however that our present data showing that major
long chain 3-hydroxy acids accumulating in LCHAD/MTP deficiencies compromise
mitochondrial homeostasis (oxidative phosphorylation) may explain the lactic
acidosis, alterations of the respiratory chain complexes activities and mitochondrial
abnormalities described in patients affected by LCHAD/MTF deficiencies.
Furthermore, it should be stressed that these fatty acids, particularly 3HTA,
provoked an impairment of some parameters of mitochondrial homeostasis at
similar concentrations to those found in plasma (Martínez et al. 1997; Jones et al.
2000) of affected patients. Moreover, considering that the enzymes of fatty acid
oxidation are expressed in the neural cells (Reichmann et al. 1988; Tyni et al.
2004), it is feasible that the concentrations of the accumulating metabolites may
dramatically increase in these patients during metabolic crises due to the blockage
81
of the enzymatic step catalyzed by LCHAD or MTP (Martínez et al. 1997; Roe and
Ding 2001; Halldin et al. 2007). The present data therefore reinforce the hypothesis
that intramitochondrial accumulation of fatty acids and their derivatives may be
involved in the pathological findings found in these diseases (Ventura et al. 1998).
Conclusion
In conclusion, according to our knowledge we showed for the first time that
3HDA, 3HTA and 3HPA, which accumulate in LCHAD/ MTP deficiencies, provoke
mitochondrial dysfunction by acting as uncouplers and 3HTA also as a metabolic
inhibitor of the oxidative phosphorylation. We speculate that these effects could
exacerbate the energy deficit caused due to the defect in fatty acid oxidation,
impairing gluconeogenesis and leading to the occurrence of severe hypoglycemia
and lactic acidosis. It is therefore presumed that our present findings could be
involved in the cerebral abnormalities and neurological symptoms found in
LCHAD/MTP patients.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CNPq, PRONEX II, FAPERGS,
PROPESQ/UFRGS, FAPESP and FINEP research grant Rede Instituto Brasileiro
de Neurociência (IBN-Net) # 01.06.0842-00, INCT-EN.
Conflict of Interest statement
The authors declare that there are no conflicts of interest.
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88
Legends of Figures
Figure 1. Effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA)
and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids on oxygen consumption in non-ADP-
stimulated (state 4) and ADP-stimulated (state 3) in mitochondria supported by
glutamate plus malate (A and C) or succinate (B and D), respectivelly. Values are
mean standard deviation for four independent experiments and states 3 and 4 of
mitochondrial respiration are expressed as nmol O
2
. min
-1
. mg of protein
-1
. *P<0.05
**P<0.01, ***P<0.001 compared to controls (Duncan multiple range test).
Figure 2. Effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA)
and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids on respiratory control ratio (RCR) and on
ADP/O ratio in mitochondria supported by glutamate plus malate (A and C) or
succinate (B and D), respectivelly. Values are mean standard deviation for four
independent experiments and states 3 and 4 of mitochondrial respiration are
expressed as nmol O
2
. min
-1
. mg of protein
-1
. *P<0.05 compared to controls
(Duncan multiple range test).
Figure 3. Effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA)
and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids on mitochondrial membrane potential using
glutamate plus malate as substrate. CCCP (1 M) was added at the end of the
measurements. Traces are representative of four independent experiments and
were expressed as fluorescence arbitrary units (FAU).
89
Figure 4. Effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA)
and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids on mitochondrial membrane potential using
succinate as substrate. CCCP (1 M) was added at the end of the measurements.
Traces are representative of four independent experiments and were expressed as
fluorescence arbitrary units (FAU).
Figure 5. Effect of 3HTA on oxygen consumption in glutamate/malate-supported
mitochondria respiring in state 4. After addition of mitochondrial preparation (0.7
mg protein . mL
-1
), 100µM was supplemented to the incubation medium in the
presence or in the absence of 1 µM atractyloside (ATC). Values are mean
standard deviation for four independent experiments and state 4 of mitochondrial
respiration is expressed as nmol O
2
. min
-1
. mg of protein
-1
. ***P<0.001 compared to
controls (Duncan multiple range test).
Figure 6. Effect of 3-hydroxydodecanoic (3HDA) (A), 3-hydroxytetradecanoic
(3HTA) (B) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) (C) acids on mitochondrial NAD(P)H
content using glutamate plus malate as substrates. Data were expressed as nmol
NAD(P)H . mg of protein
-1
. Traces are representative of four independent
experiments.
90
Figure 1.
Control 25uM 50uM 100uM
0
5
10
15
20
(A)
(D)
**
**
*
(B)
Glutamate/malate
*
State 4 respiration
(nmol O
2
. min
-1
. mg protein
-1
)
Glutamate/malate
(C)
Control 25uM 50uM 100uM
0
20
40
60
*
*
*
*
Succinate
State 4 respiration
(nmol O
2
. min
-1
. mg protein
-1
)
Succinate
Control 25uM 50uM 100uM
0
30
60
90
120
***
***
**
State 3 respiration
(nmol O
2
. min
-1
. mg protein
-1
)
Control 25uM 50uM 100uM
0
30
60
90
3HDA
3HTA
3HPA
State 3 respiration
(nmol O
2
. min
-1
. mg protein
-1
)
91
Figure 2.
Control 25uM 50uM 100uM
0
10
20
30
(D)
(A)
(B)
(C)
*
*
*
*
*
*
*
Respiratory control ratio
Glutamate/malate
Control 25uM 50uM 100uM
0
2
4
6
8
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Sucinate
Respiratory control ratio
Succinate
Control 25uM 50uM 100uM
0
1
2
3
4
*
Glutamate/malate
ADP/O ratio
ADP/O ratio
Control 25uM 50uM 100uM
0
1
2
3
4
3HDA
3HTA
3HPA
92
Figure 3.
0 100 200 300
300
240
180
120
60
0
m
Membrane Potential (F.A.U.)
Time(s)
Mit
CCCP
100uM
50uM
25uM
0 100 200 300
300
240
180
120
60
0
3HTA
m
(B)
100uM
50uM
Membrane Potential (F.A.U.)
Time(s)
Mit
25uM
CCCP
3HDA
0 100 200 300
300
240
180
120
60
0
3HPA
m
(C)
Membrane Potential (F.A.U.)
Time (s)
CCCP
(A)
Mit
100uM
25uM
50uM
93
Figure 4.
0 100 200 300
300
240
180
120
60
0
(C)
(B)
m
50uM
25uM
100uM
Membrane Potential (F.A.U.)
Time (s)
Mit
CCCP
50uM
(A)
0 100 200 300
300
240
180
120
60
0
m
100uM
Membrane Potential (F.A.U.)
Time (s)
Mit
CCCP
25uM
0 100 200 300
300
250
200
150
100
50
3HTA
3HDA
m
Membrane Potential (F.A.U.)
Time (s)
Mit
CCCP
50uM
100uM
25uM
3HPA
94
Figure 5.
Control ATC 3HTA 3HTA+ATC
0
5
10
15
20
***
State 4 respiration
(nmol.O
2
.min
-1
. mg protein
-1
)
***
95
Figure 6.
0 100 200 300
30
45
60
75
90
(C)
(B)
NAD(P)H fluorescence
(F.A.U.)
Time (s)
Mit
3HDA
CCCP
(A)
0 100 200 300
30
45
60
75
90
NAD(P)H fluorescence
(F.A.U.)
Time (s)
Mit
3HTA
CCCP
0 100 200 300
20
40
60
80
NAD(P)H fluorescence
(F.A.U.)
Time (s)
Mit
3HPA
CCCP
96
PARTE III
Discussão e Conclusões
97
III.1. DISCUSSÃO
As deficiências da LCHAD e da MTP caracterizam-se clinicamente por
hipoglcemia hipocetótica, convulsões, coma, letargia, neuropatia periférica,
retinopatia, além de cardiopatia, disfunção hepática e morte súbita nos primeiros
trës anos de vida (Brackett et al. 1995), sendo fenotipicamente mais severos do
que os outros distúrbios da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por
esses defeitos também apresentam moderada a severa acidemia lática, indicando
disfunção mitocondrial. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes,
pouco se sabe sobre os mecanismos fisiopatológicos do dano cerebral que
acomete os pacientes portadores das deficiências de LCHAD/MTP. Alguns
investigadores apontam a hipoglicemia e a síntese diminuída de corpos cetônicos
como as principais causas do dano neurológico, embora outros presumem que os
ácidos graxos acumulados na nessas deficiências possuem ações neurotóxicas e
estejam envolvidos na patofisiologia desses defeitos (Gregersen et al., 2008).
Deve-se enfatizar que várias manifestações clínicas desta doença ocorrem na
ausência de hipoglicemia, fortalecendo a hipótese de que os compostos
acumulados possam atuar como agentes neurotóxicos.
Considerando que o cérebro é um órgão susceptível ao ataque de espécies
reativas e que a mitocôndria desempenha um papel central na geração de energia
para a homeostasia dos processos celulares através da manutenção dos níveis de
ATP, bem como regulando a as concentrações intracelulares de cálcio (Nicholls e
Akerman, 1982) e que alterações mitocondriais, tais como inibições de complexos
da cadeia respiratória, podem levar a um aumento na geração de espécies
98
reativas (Halliwell e Gutteridge, 2007), o presente trabalho teve por objetivos
avaliar o efeito dos ácidos 3HDA, 3THA e 3HPA, importantes metabólitos
acumulados nas deficiências de LCHAD e MTP sobre alguns parâmetros de
estresse oxidativo (capítulo I) e de função mitocondrial (capítulo II) em
preparações mitocondriais obtidas de cérebro de ratos de 30 dias de vida.
Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento
importante na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado pelo
aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). A
medida de TBA-RS reflete a quantidade de malondialdeído (MDA) formado, que é
um produto da oxidação de ácidos graxos poliinsaturados de lipídios complexos. O
MDA é altamente tóxico, já que reage com proteínas e bases do DNA, causando
alterações nos resíduos de aminoácidos e provocando mutações (Halliwell e
Gutteridge, 2007b).
Verificamos também que a indução in vitro de peroxidação lipídica pelo 3HTA,
que provocou o maior aumento dos níveis de TBA-RS, comparado ao efeito dos
outros ácidos, foi parcilmente prevenida pelos antioxidantes trolox (TRO) e
deferoxamina (DFO), mas não por L-NAME, melatonina, GSH e a combinação de
SOD com CAT. O trolox é uma análogo hidrofílico da vitamina E, o principal
antioxidante lipossolúvel de lipoproteínas e biomembranas, muito ativo contra
radicais peroxila (Halliwell and Gutteridge, 2007a). Por outro lado, DFO forma um
complexo com ferro, reduzindo a formação do íon ferroso (Fe
2+
) e, portanto, a
reação de Fenton, principal origem do radical hidroxila (Gutteridge et al., 1979).
Assim, os dados sugerem que íons ferro e as espécies reativas de oxigênio (ROS)
peroxil estariam envolvidas no aumento de TBA-RS provocado pelo 3HTA. Por
99
outro lado, é pouco provável que superóxido e peróxido de oxigênio, sequestrados
pela SOD e CAT, respectivamente, e óxido nítrico, cuja síntese é inibida por L-
NAME, estejam envolvidos no aumento da lipoperoxidação induzida por esse
ácido.
Verificamos ainda que o 3HTA e o 3HPA, mas não o 3HDA, aumentaram o
conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Esses
resultados indicam que o 3HTA e o 3HPA induzem dano oxidativo protéico. A
dosagem do conteúdo de grupamentos carbonila é amplamente utilizada como
marcador de dano oxidativo protéico utilizado tanto in vitro quanto in vivo
(Stadtman and Berlett, 1997). A formação de grupos carbonila (aldeídos e
cetonas) é uma modificação não-enzimática irreversível principalmente produzida
por oxidação de cadeias laterais de proteínas (especialmente prolina, argina, lisina
e triptofano), por clivagem oxidativa de proteínas, ou a partir de reações de
açúcares redutores bem como de seus produtos de oxidação com resíduos de
lisina (Dalle-Done et al., 2003). Embora a carbonilação de proteínas seja
usualmente causada por dano oxidativo induzido por espécies reativas, nós não
podemos excluir a possibilidade de que aldeídos resultantes da peroxidação
lipídica possam também induzir a geração de carbonilas (Dalle-Done et al., 2003).
Neste contexto, é importante salientar que a maior parte dos equivalentes
tiólicos nas proteínas é encontrada na forma reduzida e que tem sido proposto que
esses grupamentos (PSH) são tão importantes quanto a GSH na manutenção do
estado redox celular. Isso é possível porque, por um lado, os grupamentos
sulfidrílas de proteínas constituem um “pool” maior que os grupamentos sulfidrílas
da GSH e, por outro lado, porque durante a exposição a algum oxidante (radicais
100
livres, por exemplo), os PSH podem ser reversivelmente oxidados formando
pontes dissulfeto (PSSP) ou derivados glutationilados (PSSG), sendo reduzidos e
regenerados após o restabelecimento do estado redox normal da célula (Hansen
et al., 2009). Dessa forma, a oxidação de grupamentos sulfidríla causada pelos
ácidos orgânicos estudados representa tanto dano protéico quanto diminuição das
defesas antioxidantes não-enzimáticas no córtex cerebral. Enfatize-se também
que a oxidação dos grupos sulfidrila de determinadas proteínas (resíduos de
cisteína específicos) geram dissulfetos, alterando o estado redox de proteínas e
causando a sua inativação (Kuhn et al., 1999).
Além disso, o 3HTA e o 3HPA diminuíram significativamente os níveis de
glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no
cérebro. Considerando que este parâmetro é usado para avaliar a capacidade de
um tecido em prevenir e responder ao dano associado a radicais livres (Lissi et al.,
1995; Halliwell and Gutteridge, 1999; Evelson et al., 2001), pode-se concluir que
as defesas antioxidantes do córtex cerebral de ratos são comprometidas por estes
ácidos graxos. Outros experimentos demonstraram que a diminuição dos níveis de
GSH provocada pelo 3HTA foi totalmente prevenida por DFO, reforçando a idéia
de um envolvimento de ferro e da reação de Fenton nesse efeito.
Por outro lado, observamos que os ácidos graxos testados não foram
capazes de oxidar uma solução comercial de GSH na ausência de
homogeneizado cortical no meio de incubação, sugerindo que estes compostos
não atuam diretamente como agentes pró-oxidantes e tampouco que nossos
achados de redução dos níveis de GSH pudessem ser devidos a artefatos (reação
dos ácidos com reagentes utiliados na determinação dos níveis de GSH, etc). Por
101
outro lado, considerando esses achados e também que antioxidantes foram
capazes de prevenir parcial ou totalmente os efeitos do 3HTA, presumimos que a
indução da oxidação lipídica e proteica pelos ácidos de cadeia longa hidroxilada
acumulados nas deficiências de LCHAD e MTP ocorreram provavelmente através
da formação de radicais livres por esses ácidos.
Outra parte de nossa investigação focou o efeito do 3HDA, 3HTA e 3HPA
sobre alguns parâmetros mitocondriais medidos através de captação de oxigênio
em preparações purificadas de mitocôndrias obtidas de córtex cerebral de ratos.
Verificamos que esses metabólitos aumentaram o estado 4 da respiração
mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório (RCR)
quando glutamato/malato ou sucinato foram usados como substratos, indicando
que os mesmos atuam como desacopladores da fosforilação oxidativa.
Muitos trabalhos demonstraram que o translocador de nucleotídeos adenina
(ANT) está envolvido no efeito desacoplador de alguns ácidos graxos, e que neste
caso esse efeito poderia ser prevenido pela co-incubação com atractilosídeo
(ATC) (Brustovetskyl et al., 1990; Skulachev, 1998; Samartsev et al., 2000).
Assim, na tentativa de esclarecer o mecanismo pelo qual o AcD exerce seu efeito
desacoplador, testamos o efeito da co-incubação de AcD e ATC sobre o consumo
de oxigênio. Observamos que o efeito desacoplador do AcD não foi alterado pela
presença de ATC, indicando que este ácido graxo provavelmente atue por um
mecanismo distinto de outros ácidos graxos, não interferindo no ANT. Uma
possível explicação para estes achados seria a de que o AcD afeta a bicamada
lipídica da membrana mitocondrial, levando a uma alteração na fluidez,
102
permeabilidade a íons e interação de fosfolipídeos (Kimmelberg e Pahadjopoulos,
1974; Lee, 1976; Abeywardena, Allen e Charnock, 1983).
O 3HTA e o 3HPA também diminuíram significativamente o potencial de
membrana mitocondrial com ambos substratos testados, bem como o conteúdo de
equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondriaL, o que pode ser
explicado por um efeito desacoplador causado por esses compostos, visto que
desacopladores dissipam o potencial de membrana, levando a um aumento do
consumo de equivalentes reduzidos para a manutenção do potencial.
Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração em concentrações tão
baixas quanto 25 µM e a razão ADP/O na concentração de 100 µM, quando
utilizado glutamato/malato, mas não sucinato como substrato, indicando que este
ácido funciona como um inibidor metabólico com provável prejuízo na fosforilação
oxidativa. No entanto, o 3HTA não alterou o estado 3, quando piruvato/malato
foram utilizados como substratos da fosforilação oxidativa, indicando que o efeito
desse ácido no estado fosforilante (com acréscimo de ADP no meio de incubação)
possa ter sido devido ao transporte e/ou oxidação mitocondrial do glutamato.
Tendo em vista que alguns ésteres de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada inibem
o transporte de glutamato e sucinato pela membrana mitocondrial interna em
preparações mitocondriais de fígado de ratos, reduzindo a síntese de ATP e o
consumo de oxigênio (estado 3) (Ventura et al., 2005), presumimos que a
oxidação do glutamato esteja comprometida pelo 3HTA. Entretano, no presente
trabalho não investigamos esse aspecto que certamente merece ser elucidado em
estudos posteriores.
103
Com base nestes dados, podemos sugerir que o 3HTA comprometa a
fosforilação oxidativa através de um efeito desacoplador e outro de inibição
metabólica, com interferência em processos mitocondriais de oxidação.
Neste contexto, é possível que nossos achados demonstrando que o
comprometimento da fosforilação oxidativa causada por ácidos hidroxilados de
cadeia longa possam explicar, ao menos em parte, a acidemia lática descrita em
pacientes afetados pelas deficiências da LCHAD/MTP (Ventura et. al.,1998; den
Boer et al., 2002). Por outro lado, nossos dados reforçam a hipótese de que o
acúmulo intramitocondrial de ácidos graxos e seus derivados hidroxilados possam
estar envolvidos com os achados patológicos nestas doenças (Ventura et al.,
1998). Apesar de não podermos precisar a relevância fisiopatológica dos
presentes achados, deve-se enfatizar que os efeitos tóxicos aqui apresentados
ocorreram em concentrações similares àquelas encontradas em tecidos de
pacientes afetados pela por essas deficiências durante as crises metabólicas em
que ocorre um aumento significativo nas concentrações teciduais dos ácidos
graxos de cadeia longa hidroxilada.
Considerando que a hipotonia e fraqueza muscular intensa e os achados
musculares de rabdomiólise que são encontrados nos pacientes com as
deficiêncas da LCHAD e da MTP e ainda que o suprimento energético adequado a
partir de carboidratos e ácidos graxos de cadeia média previne e reverte esses
sintomas, acreditamos que a redução da fosforilação oxidativa causada pelos
ácidos graxos hidroxilados de cadeia longa seja responsável por esses achados
clínicos. Não se pode também afastar a possiblidade de que a neuropatia
periférica, retinopatia e os sintomas neurológicos característicos nas deficiências
104
LCHAD e MTP sejam devidos a efeitos tóxicos desses metabólicos acídicos
acumulados. Deve-se considerar que as enzimas envolvidas na oxidação de
ácidos graxos, incluindo a MTP, são expressas no cérebro e retina. Portanto, é
possível que nas deficiências de LCHAD e MTP exista acúmulo cerebral dos
ácidos graxos acumulados nestas doenças. Enfatize-se ainda que ácidos graxos,
tais como o ácido octanóico, inibem o efluxo de ácidos carboxílicos através do
plexo coróide, além de serem capazes de lesar a barreira hematoencefálica. Se o
mesmo ocorrer com o 3HDA, 3HTA e 3HPA que são produzidos no fígado em
grandes quantidades, poderia-se supor que esses intermediários potencialmente
podem lesar esta barreira e a partir do sangue penetrar no cérebro, acumulando-
se neste tecido. Uma disfunção na barreira hematoencefalica, associada ao
acúmulo desses metabólitos neurotóxicos, poderia contribuir para o coma e
edema cerebral apresentado pelos pacientes.
Concluindo, os presentes resultados indicam que os principais metabólitos
acumulados nas deficiências de LCHAD/MTP exercem efeitos neurotóxicos
importantes e que os sintomas característicos dessa doença não podem ser
exclusivamente devidos à hipoglicemia e diminuição da síntese de corpos
cetônicos. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse
oxidativo, possivelmente aliados a outros mecanismos, atuem sinergicamente,
levando ao dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas
deficiências. Acreditamos, portanto, que os achados deste trabalho possam
auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos da neurodegeneração
servindo como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas
105
relevantes no tratamento e na melhora da qualidade de vida dos indivíduos
afetados.
106
III.2. CONCLUSÕES
• Os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e
3-hidroxipalmítico (3HPA), acumulados nas deficiências da proteína trifuncional
mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de hidroxiacil-CoA de cadeia longa
(LCHAD), induziram lipoperoxidação (dano oxidativo lipídico determinado através
do aumento da medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) em
homogeneizado de córtex cerebral de ratos jovens.
• A lipoperoxidação induzida pelo 3HTA foi parcialmente prevenida pelos
antioxidantes trolox e deferoxamina, indicando que radicais peroxila e íons ferro
estariam envolvidas no aumento de TBA-RS provocado pelo 3HTA
• O 3HTA e o 3HPA provocaram dano oxidativo protéico, evidenciado pelo
aumento da formação de grupamentos carbonila e da oxidação de grupamentos
sulfidrila em homogeneizado córtex cerebral de ratos jovens.
• O 3HTA e o 3HPA também diminuíram significativamente as defesas
antioxidantes não-enzimáticas evidenciado pela redução das concentrações de
glutationa reduzida (GSH) em homogeneizado de córtex cerebral de ratos.
• A diminuição das concentrações de GSH causada pelo 3HTA em córtex
cerebral de ratos jovens foi prevenida pela deferoxamina, indicando que íons ferro
estariam envolvidas na diminuição das concentrações de GSH.
• Os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA não alteraram a oxidação dos
grupamentos tióis em uma solução comercial de GSH, sugerindo que esses
compostos não atacam diretamente esses grupamentos.
107
• Os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA não alteraram o conteúdo de nitratos e
nitritos em homogeneizado de córtex cerebral de ratos, sugerindo que espécies
reativas de nitrogênio não estão envolvidas nos efeitos pró-oxidantes
desencadeados por estes ácidos graxos.
• Os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 e diminuíram o
índice de controle respiratório (RCR), tanto quando glutamato/malato como
quando succinato foram utilizados como substratos nas preparações
mitocondriais de cérebro de ratos.
• 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana mitocondrial
em preparações mitocondriais de cérebro de ratos de 30 dias de vida quando
glutamato/malato ou succinato foram utilizados como substratos, comportando-se
como desacopladores da fosforilação oxidativa.
• O translocador de nucleotídeos de adenina parece não estar envolvido no
efeito desacoplador do 3HTA, visto que a presença de atractilosídeo não foi capaz
de reverter o efeito desacoplador desse ácido.
• 3HTA e 3HPA também diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos
de NAD(P)H na matriz mitocondrial.
• 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração quando utilizado
glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou
sucinato como substratos em preparações mitocondriais de cérebro de ratos
• 3HTA diminuiu a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como
substrato, mas não quando utilizado sucinato como substratos em preparações
mitocondriais de cérebro de ratos
108
Os metabólitos testados induziram estresse oxidativo e comprometeram a
homeostase mitocondrial em córtex cerebral, mecanismos que podem estar
envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pelas
deficiências da MTP ou da LCHAD.
109
III.3. PERSPECTIVAS
• Avaliar o efeito in vitro do 3HTA sobre o transporte de substratos para dentro da
mitocôndria em preparações mitocondriais de cérebro de ratos jovens.
• Avaliar os efeitos in vitro dos ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-
hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) sobre parâmetros de
estresse oxidativo em fígado e coração de ratos jovens.
• Avaliar os efeitos in vivo dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de
metabolismo energético e função mitocondrial em fígado e coração de ratos
jovens.
• Avaliar os efeitos ex vivo dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre processos de
oxidações biológicas (estresse oxidativo) em córtex cerebral de ratos na presença
ou ausência de neuroinflamação induzida pela administração inflamação sistêmica
ou intracerebroventricular (neuroinflamação)
110
III.4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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