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ii
INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
Seleção de Isolados dos Fungos Entomopatogênicos Beauveria
bassiana e Metarhizium anisopliae Visando o Controle da Broca da
Cana-de-Açúcar, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae)
LUCIANO OLMOS ZAPPELINI
Biólogo
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico, da Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios, para
obtenção do título de Mestre em
Sanidade, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Vegetal, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio
Orientador: Dr. Antonio Batista Filho
São Paulo
2009
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iii
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca
Instituto Biológico
Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Zappelini, Luciano Olmos
Seleção de isolados dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae visando o
controle da broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) / Luciano Olmos
Zappelini. -- São Paulo, 2009.
Dissertação (Mestrado) Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação.
Área de concentração: Sanidade Vegetal,Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio.
Linha de pesquisa: Controle Microbiano de Insetos
Orientador: Batista Filho, Antonio.
Screening of the entomopathogenic fungus beauveria bassiana and metarhizium anisopliae to the sugar cane
borer control, diatraea saccharalis (lepidoptera: crambidae)
1. Controle microbiano 2. Pragas da cana-de-açúcar 3. Entomopatógenos, produção 4. Controle biológico
5. Saccharum spp I. Batista Filho, Antonio II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação
III. Título
IB/Bibl /001/2009
iv
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome do candidato: Luciano Olmos Zappelini
Título: Seleção de isolados dos fungos entomopatogênicos Beauveria
bassiana e Metarhizium anisopliae visando o controle da broca da cana-
de-açúcar, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae)
Orientador(a): Prof. Dr. Antonio Batista Filho
Dissertação apresentada ao
Instituto Biológico da Agência
Paulista de Tecnologia dos
Agronegócios para obtenção do
título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental
no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Vegetal, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
Prof. Dr.: Antonio Batista Filho
Instituição: Instituto Biológico
Assinatura:
Prof. Dr.: José Eduardo Marcondes de Almeida
Instituição: Instituto Biológico
Assinatura:
Prof. Dr.: Carlos Frederico Wilcken
Instituição: Universidade Estadual Paulista (UNESP - FCA) - Campus Botucatu
v
Aos meus pais,
José Lucio Zappelini e Lurdes Bernal Fernandez Olmos Zappelini,
Pelo carinho e amor em nossa querida família.
Por serem eternos exemplos de caráter, dignidade, honestidade e garra a serem
seguidos.
Pelo apoio e afinco em minha formação pessoal e profissional.
Por sempre incentivarem e apoiarem meus sonhos.
DEDICO
À minha irmã,
Karina
Por toda amizade, conselhos e carinho.
À Dani, Ju e Fefa´s,
Pela amizade, companheirismo e boas risadas...
Ofereço
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antonio Batista Filho, por inicialmente ter me acolhido no Laboratório de
Controle Biológico como estagiário por 17 horas pela faculdade, pela sua orientação na pós-
graduação e principalmente, pelo incentivo, dedicação, confiança e colaboração em meu
enriquecimento profissional.
Ao Prof. Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida, por sua co-orientação. Pela
paciência e resolução de minhas mais variadas dúvidas e principalmente por ter me
mostrado a magnitude e a beleza do controle microbiano de pragas.
Ao Prof. Dr. Carlos Frederico Wilcken, pelas suas preciosas contribuições e
correções na dissertação.
À Usina São João, pelo fornecimento das lagartas para a realização dos
experimentos e à Usina da Barra por todo apoio na realização dos experimentos em campo.
Aos amigos de laboratório Alexandre, Fernando (Ferdiga), Fernando (Bello), Fábio e
Márcio (T2) pela amizade, convivência e pelos momentos de descontração.
vii
Paraevitarcríticas,nãofaçanada,
nãodiganada,nãosejanada.
(ElbertHubbard)
“Ofuturoestánasmãosdaqueles
quesãocapazesdedaràsgeraçõesdeamanhã,
razõesválidasparavivereteresperança.”
(TheilharddeChardin)
viii
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................................x
ABSTRACT.............................................................................................................................xii
LISTA DE FIGURAS..............................................................................................................xiv
LISTA DE TABELAS..............................................................................................................xv
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................................xvii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................... 3
2.1. Cana-de-açúcar no Brasil................................................................................................. 3
2.2. Broca da cana-de-açúcar D. saccharalis......................................................................... 4
2.2.1. Biologia do inseto .......................................................................................................... 4
2.2.2 Prejuízos......................................................................................................................... 5
2.2.3. Controle químico............................................................................................................ 5
2.2.4. Controle biológico com parasitóides.............................................................................. 6
2.2.5.Controle biológico com fungos entomopatogênicos....................................................... 6
2.3.Seleção de isolados de fungos entomopatogênicos ......................................................... 9
2.4. Produção de fungos entomopatogênicos ....................................................................... 10
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 12
3.1. Isolados de fungos entompatogênicos ........................................................................... 12
3.2. Determinação da concentração letal (CL
90
).................................................................... 16
3.3. Seleção de isolados de Beauveria bassiana e Metarhiaium anisopliae (Etapa 1) ......... 17
3.4. Seleção final dos isolados de Beauveria bassiana e Metarhiaium anisopliae (Etapa 2) 18
3.5. Produção dos melhores isolados em arroz pré-cozido................................................... 18
3.6. Avaliação da eficiência dos melhores isolados de B. bassiana e M. anisopliae em
condições de campo.............................................................................................................. 19
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................ 21
4.1. Determinação da concentração...................................................................................... 21
4.2. Seleção de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae ......................... 23
4.2.1. Beauveria bassiana..................................................................................................... 23
4.2.2. Metarhizium anisopliae................................................................................................ 29
4.3. Seleção final dos isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae................ 33
4.3.1. Beauveria bassiana..................................................................................................... 33
4.3.2. Metarhizium anisopliae................................................................................................ 34
4.4. Produção dos melhores isolados em arroz pré-cozido................................................... 35
4.4.1 Beaveria bassiana........................................................................................................ 35
4.4.2. Metarhizium anisopliae................................................................................................ 37
ix
4.5. Avaliação da eficiência dos melhores isolados selecionados de B. bassiana e M.
anisopliae em condições de campo....................................................................................... 38
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................................. 41
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 43
x
RESUMO
ZAPPELINI, L.O. SELEÇÃO DE ISOLADOS DOS FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS
Beauveria bassiana E Metarhizium anisopliae VISANDO O CONTROLE DA BROCA DA
CANA-DE-AÇÚCAR, Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) 2009.
Dissertação (Mestrado em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio) –
Instituto Biológico.
O setor sucro-alcooleiro tem-se destacado pela rápida expansão das áreas de plantio da
cana-de-açúcar, o que está levando as usinas e produtores de cana a buscarem novas
técnicas de controle de pragas, dentre elas o controle biológico da broca da cana-de-açúcar,
Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Os canaviais localizam-se em regiões
quentes e com alta taxa de umidade, onde a utilização de fungos entomopatogênicos passa
a ser muito promissora. O objetivo desta pesquisa foi selecionar isolados de fungos
entomopatogênicos para controle da broca da cana. Foram determinados os valores da
concentração letal (CL
90
) para Beauveria bassiana (IBCB 66) e Metarhizium anisopliae
(IBCB 425), isolados padrão aplicados em lagartas da broca da cana-de-açúcar; Foi
realizado um teste de seleção envolvendo 99 isolados de ambos os fungos e posteriormente
uma repetição deste teste para confirmação dos resultados, porém apenas para isolados
capazes de provocar mortalidades confirmadas iguais ou superiores a 80%, além do cálculo
do tempo letal (TL
50
). Em seguida estes foram submetidos a um bioensaio de produção
massal em laboratório para avaliação do potencial de produção de conídios de cada isolado,
sendo que o melhor isolado de cada fungo foi produzido e um ensaio em condições de
campo foi realizado. Ao término das avaliações ficou estabelecido que a CL
90
para B.
bassiana ficou em 1 x 10
8
conídios/mL e para M. anisopliae estabeleceu-se a concentração
de 5 x 10
8
conídios/mL. Os resultados dos testes de seleção classificaram como
promissores nove isolados de B. bassiana (IBCB 215, 278, 279, 281, 302, 593, 597, 598 e
600 ) e nove de M. anisopliae (IBCB 351, 353, 383, 384, 410, 417, 418, 425 e 481), pois
estes foram capazes de gerar mortalidades confirmadas superiores ou iguais a 80%, suas
respectivas virulências foram confirmadas no segundo teste onde as mortalidades
confirmadas variaram entre 92 a 98% para B. bassiana e 70 a 82% para M. anisopliae.
Ainda com os mesmos isolados, para B. bassiana a menor TL
50
foi registrada para o isolado
IBCB 600 com 5,48 dias e para M. anisopliae a menor TL
50
foi observada para o isolado
IBCB 384 com 6,83 dias. Quanto a produção de conídios o IBCB 215 (B. bassiana) foi o
mais produtivo com 4,99 x 10
9
conídios por grama de arroz, sendo que o IBCB 417 (M.
anisopliae) com uma produção de 2,52 x 10
9
conídios por grama de arroz foi o isolado que
mais se destacou. Sendo assim os ensaios em condições de campo foram realizados com a
aplicação dos isolados de B. bassiana IBCB 215 e M. anisopliae IBCB 417, sendo que não
foi observada diferença estatística entre os tratamentos, em todos os períodos de avaliação,
xi
mas foi observada tendência à diminuição no número de lagartas por metro linear em
especial para o tratamento envolvendo o IBCB 417 na dosagem de 10kg de arroz + fungo
por hectare, enquanto que para B. bassiana a dosagem mais eficiente foi de 6kg de arroz
mais fungo por hectare. Logo, ambos os isolados apresentam bom potencial para controle
da broca da cana-de-açúcar D. saccharalis, podendo assim incrementar o manejo integrado
de pragas (MIP) na cultura da cana-de-açúcar.
Palavras-chave: controle microbiano, pragas da cana-de-açúcar, produção de
entomopatógenos, controle biológico, Saccharum spp.
xii
ABSTRACT
ZAPPELINI, L.O. SCREENING OF THE ENTOMOPATHOGENIC FUNGUS Beauveria
bassiana AND Metarhizium anisopliae TO THE SUGAR CANE BORER CONTROL,
Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) 2009. Dissertation (Mestrado em
Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio) – Instituto Biológico.
The sugar-alcohol industry has stood up among others by the rapid expansion of plantation
areas of sugar cane, which is leading the mills and sugar cane produces to seek new
methods of controlling pests, among them the biological control sugar cane borer Diatraea
saccharalis. The sugar cane fields are found in hot-weather regions with high rates of
humidity, where the use of entomopathogenic fungi can be very promising. Therefore, the
objective of this research was to determine the to lethal concentration (LC
90
) to standard
isolates of Beauveria bassiana (IBCB 66) and Metarhizium anisopliae (IBCB 425) applied to
larva of sugar cane borer. This was a test of selection (involving 99 strains of both fungi) and
then the same test was repeated to confirm the results, but only for the best strain those
capable of causing mortality rates verifiedly greater than or equal to 80%, in addition it was
made the calculation of lethal time (LT
50
); the better strains were subjected to a bioassay for
mass production in the laboratory to evaluate the potential of for conidia production of each
strain, in which the best of each fungus strain was produced and a test was conducted
carried out in field. At the end of the evaluations it has been established that the LC
90
for B.
bassiana was 1 x 10
8
conidia / ml and for M. anisopliae there was a concentration of 5 x 10
8
conidia / ml. The results of the selection tests rated 9 strains of B. bassiana (IBCB 215, 278,
279, 281, 302, 593, 597, 598 and 600) and M. anisopliae (IBCB 351, 353, 383, 384, 410,
417, 418, 425 and 481) as promising because they were able to generate mortality rates
provenly greater than or equal to 80%, whose virulence were confirmed in the second test
which verified that the mortality ranged between 92 and 98% for B. bassiana and 70 to and
82% for M. anisopliae. Still with the same strains, regarding B. bassiana the lowest LT
50
was
recorded for the strain IBCB 600 with 5.48 days and for M. anisopliae the lowest LT
50
was
observed in IBCB 384 with in 6.83 days. For the production of the conidia, IBCB 215 (B.
bassiana) was the most productive isolate with 4.99 x 10
9
conidia per gram of rice, and the
IBCB 417 (M. anisopliae) with a yield of 2.52 x 10
9
conidia per gram of rice was the strain
that stood out the most. So the tests under field conditions were carried out with the
implementation of the isolates of B. bassiana IBCB 215 and M. anisopliae IBCB 417, and at
the end of evaluations it was not verified no statistical difference between treatments in all
periods of assessment, but a tendency to decrease was observed in the number of larvae
per linear meter especially for the treatment involving the IBCB 417 in the strength of 10kg of
rice + fungus per hectare, while for B. bassiana the most effective dosage was 6kg of rice +
xiii
fungus per hectare. Therefore, both isolates have good potential for sugar cane borer D.
saccharalis and thus enhance the integrated pest management (IPM) in sugar cane crop.
Keywords: microbial control, sugar cane pests, entomopathogenic production, biological
control, Saccharum spp
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Mortalidade de lagartas de D. saccharalis 10 dias após a
aplicação do isolado IBCB 66 de Beauveria bassiana, nas
concentrações de 5 × 10
6
, 1 × 10
7
, 5 × 10
7
, 1 × 10
8
e 5 × 10
8
conídios/mL (Temp.: 25ºC, UR: 70% e fotofase: 12 horas).
22
Figura 2
Mortalidade de lagartas de D. saccharalis 10 dias após a
aplicação do isolado IBCB 66 de Metarhizium anisopliae, nas
concentrações de 5 × 10
6
, 1 × 10
7
, 5 × 10
7
, 1 × 10
8
e 5 × 10
8
conídios/mL (Temp.: 25ºC, UR: 70% e fotofase: 12 horas).
22
Figura 3
Distribuição de freqüência de isolados de B. bassiana em relação
a mortalidade confirmada causada em lagartas de D. saccharalis.
29
Figura 4
Distribuição de freqüência de isolados de B. bassiana em relação
a mortalidade confirmada causada em lagartas de D. saccharalis.
32
Figura 5
Número acumulado de lagartas de Diatraea saccharalis por
metro em cana-de-açúcar submetidas a diferentes fungos
entomopatogênicos e inseticidas juvenóides (Igaraçú do Tietê-
SP) (28 de fevereiro de 2008).
40
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Identificação dos isolados do fungo Beauveria bassiana,
utilizados nos experimentos com Diatraea saccharalis
12
Tabela 2
Identificação dos isolados do fungo Metarhizium anisopliae,
utilizados nos experimentos com Diatraea saccharalis
14
Tabela 3
Mortalidade confirmada (%) de D. saccharalis pelos fungos
entomopatogênicos B. bassiana e M. anisopliae (Temp. 25ºC, UR
de 70% e fotofase de 12 horas).
21
Tabela 4
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Beauveria bassiana em lagartas de
Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa 70±10%
e fotofase de 12 horas).
24
Tabela 5
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Beauveria bassiana em lagartas de
Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa 70±10%
e fotofase de 12 horas).
25
Tabela 6
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Beauveria bassiana em lagartas de
Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa 70±10%
e fotofase de 12 horas).
26
Tabela 7
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Beauveria bassiana em lagartas de
Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa 70±10%
e fotofase de 12 horas).
27
Tabela 8
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Beauveria bassiana em lagartas de
Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa 70±10%
e fotofase de 12 horas).
27
xvi
LISTA DE TABELAS (Cont.)
Tabela 9
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Metarhizium anisopliae em lagartas
de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa
70±10% e fotofase de 12 horas).
30
Tabela 10
Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da
pulverização de isolados de Metarhizium anisopliae em lagartas
de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e Umidade Relativa
70±10% e fotofase de 12 horas).
31
Tabela 11
Mortalidade média de lagartas de Diatraea saccharalis causada
por isolados selecionados de Beauveria bassiana (Temperatura:
25±2
o
C e Umidade Relativa: 60±10%).
33
Tabela 12
Mortalidade média de lagartas de Diatraea saccharalis causada
por isolados selecionados de Metarhizium anisopliae
(Temperatura 25±2
o
C e Umidade Relativa 60±10%).
35
Tabela 13
Produção média de conídios/g em arroz pré-cozido dos isolados
de Beauveria bassiana, selecionados para o controle de Diatraea
saccharalis. (Temperatura 25
o
C, Umidade Relativa 60%).
36
Tabela 14
Produção média de conídios/g em arroz pré-cozido dos isolados
de Metarhizium anisopliae, selecionados para o controle de
Diatraea saccharalis. (Temperatura 25
o
C, Umidade Relativa
60%).
37
Tabela 15
Número médio de lagartas de Diatraea saccharalis em cana-de-
açúcar tratada com fungos entomopatogênicos e inseticidas
juvenóides (Igaraçú do Tietê-SP), em 28 de fevereiro de 2008.
39
xvii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
BDA
BOD
CL
CV
CTC
IAA
MIP
UR
TL
Batata Dextrose Ágar
Biological Oxigen Development
Concentração Letal
Coeficiente de Variação
Centro de Tecnologia Canavieira
Instituto do Açúcar e Álcool
Manejo Integrado de Pragas
Umidade Relativa
Tempo Letal
1
1. INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.), uma gramínea semiperene de origem asiática,
é uma das principais culturas no Brasil, sendo de extrema importância sócio-econômica em
virtude de seus derivados, principalmente o álcool e o açúcar. O agronegócio brasileiro está
diretamente ligado ao saldo positivo da balança comercial, sendo movimentado entre outras
culturas expressivas, principalmente pela cana-de-açúcar.
A estimativa da produção nacional de cana-de-açúcar na safra 2007/08, é de 528
milhões de toneladas, superior à safra passada em 11,2% (IEA, 2008). A área ocupada com
essa cultura é de 6,6 milhões de hectares, superior em 7,4% (456,9 mil hectares) à safra
anterior. Esse comportamento do mercado está relacionado diretamente com o avanço das
exportações do açúcar e à maior demanda interna de álcool com o aumento de venda dos
carros com motorização baseada na nova tecnologia flex fuel, carros bicombustíveis
(ÚNICA, 2008).
O Estado de São Paulo é o maior produtor de cana-de-açúcar, sendo responsável
por aproximadamente 60% de toda a produção nacional, colhendo e esmagando em torno
de 316,7 milhões de toneladas na safra 2007/2008 (UDOP, 2008). Grandes extensões
cultivadas com uma mesma cultura favorecem o surgimento de insetos praga e doenças em
relação a áreas menores.
Dentre as várias pragas que ocorrem na cultura da cana-de-açúcar, a broca da cana-
de-açúcar Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), é classificada como uma das
principais, especificamente pelos danos ocasionados, caracterizando-se pelo complexo
broca-podridão, causado por microrganismos que penetram nos colmos juntamente com a
praga, além do dano direto devido a abertura de galerias ao longo da planta (GALLO, et al.,
2002).
Sua ocorrência é relatada em todo o hemisfério oeste onde a cana-de-açúcar é
cultivada, porém segundo Pinto (2006), existem ainda outras plantas hospedeiras como o
milho, sorgo, arroz e também em plantas nativas sem importância econômica.
Vários relatos já foram descritos, referenciando inimigos naturais como fungos, vírus,
bactérias entomopatogênicas, predadores e parasitóides atacando a broca da cana-de-
açúcar. Porém, com a introdução de um parasitóide trazido do Japão, o braconídeo Cotesia
flavipes é que o sucesso do controle biológico da D. saccharalis foi consolidado a partir da
década de 70 no Brasil, devido à facilidade de criação massal e a capacidade desta
vespinha em localizar seu hospedeiro (GALLO et al., 2002; PINTO, 2006).
2
Segundo Nehmi Filho (2005), até o ano de 2013 a área total de plantio de cana-de-
açúcar deve crescer aproximadamente 48% em relação a área atual, mantendo-se o alto
preço do petróleo, o que estimula o investimento e desenvolvimento do setor
sucroalcooleiro.
Porém, com a rápida expansão da cultura da cana-de-açúcar, a produção dos
parasitóides C. flavipes teria que proporcionalmente acompanhar este aumento, o que não
seria possível devido ao curto espaço de tempo, assim a utilização de outros métodos de
controle, como os fungos entomopatogênicos, incrementará o controle biológico da broca da
cana-de-açúcar além de contribuir na manutenção da baixa utilização de agrotóxicos para o
controle da D. saccharalis.
Este método de controle, bem como outros benefícios obtidos pela agricultura
brasileira, são frutos de investimentos em inovação, ciência e tecnologia gerando uma
melhora quali-quantitativa nos principais processos de produção agrícola.
O uso de fungos entomopatogênicos no controle de pragas apresenta grande
viabilidade, uma vez que, mesmo sendo utilizados em altas concentrações, não ocasionam
desequilíbrios biológicos de importância nos ecossistemas e ao homem, pois ao contrário
dos inseticidas químicos de largo espectro, conseguem manter as populações de
parasitóides, predadores e polinizadores presentes nesses ambientes, colocando-se como
um importante fator no Manejo Integrado de Pragas (MIP) (Pereira et al. 1998, Neves et al.
2001).
Espera-se assim, que as técnicas moleculares venham concomitantemente ao
controle biológico de pragas, agilizarem os processos de identificação de isolados altamente
virulentos e promissores ao controle, podendo fornecer com maior rapidez, mais uma opção
ecologicamente correta e menos impactante tanto ao trabalhador rural quanto ao meio
ambiente na manutenção de populações de insetos-praga.
Este trabalho teve por objetivos:
a) Selecionar isolados virulentos dos fungos B. bassiana e M. anisopliae em condições
de laboratório, visando o controle de D. saccharalis;
b) Determinar a concentração letal e tempo letal desses entomopatógenos;
c) Avaliar a esporulação dos melhores isolados na produção massal em laboratório;
d) Testar a eficiência do melhor isolado de B. bassiana e M. anisopliae em populações
naturais de D. saccharalis em cultivo de cana-de-açúcar;
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Cana-de-açúcar no Brasil
Originária do Sudeste da Ásia, a cana-de-açúcar é utilizada como fonte de energia
desde a antiguidade. Há 12 mil anos, a cana já era domesticada na Nova Guiné (Oceania).
No século III o açúcar era usado como remédio em certas regiões do Norte da Índia. Em
1170, o álcool foi preparado medicinalmente em países da Europa, tendo sua expansão até
as Américas (JUNHO, 1986).
Não se sabe a data exata da implantação dos primeiros engenhos de cana-de-
açúcar no Brasil. O cultivo da cana-de-açúcar, dominado pelos portugueses, provavelmente
desde 1420, foi introduzido pelo Infante Dom Henrique na Ilha da Madeira. O primeiro alvará
para sua introdução no Brasil data de 1516, quando o rei Dom Manuel determinou que “se
encontrasse gente prática capaz de dar princípio a um engenho de açúcar no Brasil”. Martim
Affonso de Souza, em 1532, trouxe a primeira muda de cana-de-açúcar ao Brasil e iniciou
seu cultivo na Capitania de São Vicente, atual estado de São Paulo. Ali construiu o primeiro
engenho, denominado “Governador” e depois “São Jorge dos Erasmos”. Mas foi no
Nordeste, nas Capitanias de Pernambuco e da Bahia, que os engenhos de açúcar se
multiplicaram. A história do Brasil registra no desenvolvimento da colônia, um período
específico, o ciclo da cana-de-açúcar (MAPA, 2008a).
Em 1889, o açúcar ocupava o 3º lugar nas exportações brasileiras, atrás do café e da
borracha. A partir de 1924, a economia açucareira nordestina enfrentou dificuldades devido
à queda das exportações e aumento da produção do açúcar em São Paulo.
Desde então, a cultura da cana-de-açúcar vem sofrendo altos e baixos, mas desde a
década de 30, o governo brasileiro desenvolve programas de incentivo como o proposto
pelo presidente Getúlio Vargas que incentivou o álcool-motor ao determinar que o Ministério
da Agricultura abrisse crédito especial de 125 mil contos de réis para a montagem de
“bombas para o fornecimento do carburante nacional e também para a aquisição de frota de
autotransportante para o serviço de abastecimento dessas bombas” (MAPA, 2008a).
Mais tarde, na década de 70, foi criado o IAA (Instituto do Açúcar e Álcool),
objetivando assegurar o equilíbrio do mercado do açúcar e aproveitar a oportunidade do
álcool industrial, além de possibilitar o desenvolvimento de uma política técnico-científica
que permitiu avanços significativos na agricultura voltada para a cana-de-açúcar. Programas
4
nacionais como o Proálcool, também contribuíram para o avanço da cultura, o que acarretou
em uma expansão da área plantada (UNICA, 2008; MAPA, 2008a).
Nesta última década, o Brasil passou a ser o maior exportador mundial dos produtos
derivados da cana-de-açúcar, com os menores custos de produção, sendo cultivada em
todos os estados, porém sua maior produção concentra-se no Estado de São Paulo, com
aproximadamente 60% da produção nacional (CONAB, 2008).
Desde então a cultura da cana-de-açúcar assumiu no Brasil um papel de importância
sócio-econômica significativa, devido a sua vasta utilização, produzindo diversos alimentos
para o homem e para animais, além da produção de álcool combustível direcionado à
indústria automobilística.
2.2. Broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis
2.2.1. Biologia do inseto
Devido às extensas áreas de cultivo de cana-de-açúcar distribuídas por todo
território brasileiro, porém, mais adensada no Estado de São Paulo, bem como a região
climática em que se encontram, propicia um agroecossistema muito favorável ao
desenvolvimento de insetos-praga, dentre elas a broca da cana-de-açúcar Diatraea
saccharalis (Lepidoptera: Crambidae), devido a sua sazonalidade e alta freqüência de
ocorrência, gera danos e prejuízos à cultura (PINTO et. al., 2006).
Segundo Gallo et. al. (2002), os ovos são colocados geralmente na face dorsal das
folhas, com um agrupamento muito característico assemelhando-se a uma escama de
peixe, contendo em média de 5 a 50 ovos e a fêmea durante seu ciclo pode colocar de 300
a 600 ovos, os quais demorarão em torno de 4 a 12 dias para que ocorram as primeiras
eclosões de larvas.
Ainda segundo os mesmos autores, as lagartas apresentam coloração branco-
amarelada com cabeça marrom podendo atingir até 2,5 cm de comprimento. Logo após a
eclosão, as lagartas de 1º instar alimentam-se do parênquima das folhas até a 1ª ecdise,
onde passam a caminhar em direção ao colmo. Entre o 2º e 3º instar, as lagartas penetram
pelo colmo na região do entre nós, abrindo galerias longitudinais e transversais até a fase de
pupa. Esta fase larval tem duração média de 20 a 79 dias, variando em função das
5
condições climáticas. Após esse período ocorre a fase pupal, onde as pupas de coloração
marrom ficam no interior das galerias abertas até a emergência do adulto.
Os adultos são mariposas de coloração amarela-palha tendo 2,5 cm de envergadura,
sendo as fêmeas maiores com abdômen dilatados e os machos com o último par de pernas
cobertos por cerdas, possuindo em média 2 a 9 dias de longevidade (GALLO et. al., 2002;
PINTO et. al., 2006).
2.2.2. Prejuízos
Os danos provocados pela lagarta de D. saccharalis podem ser diretos, por meio de
abertura de galerias no interior do colmo da planta, reduzindo o fluxo de seiva, além de
torná-la mais suscetível ao tombamento pela ação do vento e chuvas. Em canas jovens a
broca produz o secamento dos ponteiros, chamado de “coração morto”; ou indiretos, quando
os orifícios favorecem a penetração de microrganismos fitopatogênicos no interior do colmo,
caso da podridão vermelha causada pelos fungos Colletotrichum falcatum e Fusarium
moniliforme que invertem a sacarose, diminuindo assim a pureza e qualidade do caldo,
acarretando um menor rendimento de álcool e açúcar (GALLO et al., 2002).
2.2.3. Controle químico
As recomendações para o controle desta praga consiste na aplicação em
pulverização, nas proximidades do “palmito” (conjunto de folhas centrais), fazendo uso de
algum dos produtos recomendados, tendo como ingredientes ativos o triflumuron, lufenuron,
ou fipronil, quando houver 3% de canas com lagartas recém eclodidas (GALLO et. al., 2002;
MAPA, 2008b). Esta última condição é vital no sucesso do controle, pois segundo Bortoli et
al. (2004), uma vez no interior do colmo, o controle das lagartas torna-se muito difícil.
6
2.2.4. Controle biológico com parasitóides
Naturalmente, uma série de inimigos naturais como entomopatógenos e alguns
predadores e parasitóides já foram descritos como controladores das populações de D.
sacharalis. A mosca cubana Lixophaga diatraea (Díptera: Tachinidae) foi o primeiro
parasitóide utilizado no controle da broca da cana na década de 50 (PLANALSUCAR, 1973).
Atualmente o manejo da broca da cana-de-açúcar vem sendo feito com o parasitóide
larval Cotesia flavipes (Himenoptera: Braconidae). As primeiras liberações massais no Brasil
foram realizadas no ano de 1977 no Estado de São Paulo, aumentando gradativamente. Os
índices de parasitismo passaram de 0,14% em 1979 para 30 a 40% no fim da década de 90.
O sucesso na utilização destas vespinha foi devido as facilidades da produção massal em
laboratórios de criação e a sua capacidade de localização da praga (BOTELHO; MACEDO,
2002).
Outro inimigo natural promissor ao controle da broca é o microhimenóptero
Trichogramma galloi que ataca ovos de lepidópteros. O parasitóide vem sendo produzido
em larga escala em laboratórios e suas liberações tem mostrado que é um eficiente
regulador da população da praga (BOTELHO et. al., 1995).
2.2.5. Controle biológico com fungos entomopatogênicos
Esses agentes foram os primeiros patógenos de insetos a serem utilizados no
controle microbiano. A utilização de fungos entomopatogênicos para o controle biológico
de pragas tem sido estudada há mais de 100 anos e, atualmente, há um aumento no
interesse do desenvolvimento comercial desses patógenos, o qual certamente tem sido
estimulado pela persistência dos problemas de resistência a pesticidas e devido ao
crescimento dos custos econômicos e ambientais, mas também por um número recente
de avanços em técnicas que parecem aumentar a eficácia e a confiança das preparações
com inseticidas microbianos (WRAIGHT & BRADLEY, 1996).
Os agentes de controle biológico vêm ganhando destaque no controle de insetos-
praga. O crescimento do interesse nestes agentes ocorreu em parte devido à atenção
dada aos perigos causados pelo uso indiscriminado de pesticidas químicos e pela
agregação de valor ao produto final processado. Assim, o maior incentivo para o
7
crescimento dos biopesticidas vem através da atenção dada por produtores para a
importância do manejo integrado de pragas como mais uma segurança para o ambiente,
além da economia e proteção da produção (MENN, 1996; PIEDADE NETO, 2003).
Dentro deste contexto, o controle microbiano com fungos entomopatogênicos é
uma das alternativas mais importantes, com alto potencial de utilização, sem deterioração
dos recursos naturais. O número de fungos com potencial para emprego como
controladores biológicos já ultrapassa 750 espécies e 85 gêneros (PUTZKE & PUTZKE,
2002). Além disso, os fungos são patógenos de amplo espectro, capazes de atacar
diversas espécies de insetos e de causar epizootias naturais. São versáteis, podendo
infectar diferentes estádios de desenvolvimento dos hospedeiros (ALVES, 1998b).
Assim, dependendo das condições ambientais, como temperatura, umidade, luz,
radiação ultravioleta, além das condições nutricionais e da suscetibilidade do hospedeiro,
este é infectado, geralmente, através do tegumento com a adesão, germinação e
penetração dos conídios por meio de forças físicas, pelo rompimento do tegumento, e
químicas, pela elaboração de enzimas que provocam a histólise dos tecidos da cutícula.
O fungo então ramifica-se colonizando o hospedeiro desde os corpos gordurosos, até o
sistema nervoso, o que provoca a morte do inseto devido a produção de micotoxinas e ao
esgotamento de nutrientes (ALVES, 1998b).
Portanto, dentre os agentes microbianos de controle, os fungos são de extrema
importância, sendo que os Hyphomycetes possuem muitas características desejáveis
para um patógeno (GASSEN, 2006).
O gênero Beauveria, segundo Mac Leod (1954), é o mais comumente encontrado
em insetos mortos no ambiente natural, além disso, ocorre enzooticamente ou causando
epizootias em espécies de pragas, infectando cerca de 200 espécies de insetos de
diferentes ordens.
A espécie B. bassiana é um patógeno amplamente estudado como agente de
controle biológico para muitas espécies de insetos praga, sendo um dos fungos de
ocorrência generalizada em todos os países. Pode ocorrer em lepidópteros, coleópteros,
hemípteros, dípteros, himenópteros e ortópteros. Este fungo tornou-se conhecido
internacionalmente pelo produto Boverin, formulado e utilizado em grande escala pela ex-
União Soviética em 1970, para o controle do besouro do Colorado, Leptinotarsa
decemlineata (SAMSINAKOVA, 1966; IGNOFFO, 1975).
No Brasil, um dos principais projetos envolvendo este fungo visa o controle dos
cupins das pastagens e surgiu como uma alternativa eficiente, ecológica e econômica para a
solução do problema desta praga. Segundo ALVES (1998c), depois de um a dois meses, a
8
eficiência do controle pode chegar a 100% para ninhos pequenos com a aplicação de 3 a 6
g de conídios puros. Além disso, este fungo também vem sendo estudado no controle da
broca-da-bananeira, broca-do-café, cascudinho dos aviários, entre outros.
Outra espécie de fungo bastante estudada no controle de pragas é Metarhizium
anisopliae, que se caracteriza por atacar um grande número de espécies de insetos.
Amplamente distribuído na natureza, pode ser encontrado facilmente nos solos. Além disso,
é produzido no Brasil em escala industrial por empresas estatais e particulares, sendo usado
principalmente nos estados de São Paulo, Alagoas, Pernambuco, Mato Grosso e Bahia
visando, principalmente, o controle das cigarrinhas-das-pastagens e da cana-de-açúcar.
A utilização de M. anisopliae expandiu no Brasil, principalmente no Estado de São
Paulo, devido à redução de aproximadamente 72% nos índices de infestação da cigarrinha
da cana-de-açúcar, proporcionada pela aplicação do fungo, e também, pela conseqüente
diminuição do emprego de inseticidas químicos para o controle desse inseto na cultura
(ALVES, 1998a).
Os fungos entomopatogênicos B. bassiana. e M. anisopliae são mundialmente
conhecidos e utilizados como agentes biocontroladores de inúmeras pragas agrícolas.
Essas espécies apresentam potencial de controle para diversas ordens de insetos (Bridge et
al. 1990, Alves 1992, Pereira et al. 1993), inclusive para lepidópteros pragas como Plutella
xylostella, Alabama argillacea e Diatraea saccharalis.
Estes fungos entomopatogênicos, têm mostrado um grande potencial como agentes
de controle biológico no manejo integrado de pragas na cana-de-açúcar (ALVES et. al.,
1985; LEUCONA, ALVES, 1988), em decorrência do uso indiscriminado e dos sérios danos
que os inseticidas químicos têm causado aos ecossistemas. Além disso, a utilização de
agentes entomopatogênicos tem demonstrado vantagens com relação aos pesticidas
químicos, quando observados critérios como: eficácia, baixo custo, redução de resíduos
químicos nos alimentos e no meio ambiente, preservação dos inimigos naturais e aumento
da biodiversidade nos ecossistemas, bem como na segurança do homem e de outros
organismos (Alves 1998a, Lacey et al. 2001).
De acordo com Alves (1998b) e Coutinho (2008), D. saccharalis é suscetível aos
fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae, sendo que esse fungo ocorre
naturalmente em cerca de 10% das lagartas nas condições do Nordeste. Estes fungos são
patogênicos para todos os estágios de desenvolvimento da broca, sendo altamente eficiente
para ovos de um a dois dias de idade. Em experimentos realizados em condições de campo,
foi constatada a infecção de 58% de lagartas por M. anisopliae e 44% por B. bassiana, com
dosagem de 10
13
conídios/ha.
Alves et. al. (1985) avaliaram a eficiência do fungo B. bassiana no controle da broca
da cana-de-açúcar, D. saccharalis. Preliminarmente, determinou-se a CL
50
para pré-pupa,
9
encontrando-se uma dose de 1,3 x 10
5
conídios/ml. Em condições de campo, colmos de
cana-de-açúcar foram infestados com lagartas de terceiro instar de D. saccharalis,
previamente tratadas com suspensões do fungo. Observou-se uma mortalidade de 47,5% e
56%, respectivamente para 3,7 x 10
7
e 3,7 x10
8
conidios/ml, e redução no dano causado
pela praga.
As lagartas da broca da cana-de-açúcar D. saccharalis, quando submetidas a um
elevado potencial de inóculo de B. bassiana, sob temperatura média de 25º C e UR 90%
após 48 horas, reduzem a sua alimentação, parando o processo após 72 horas. Em geral,
96 horas depois da inoculação ocorrem 100% de mortalidade e o fungo passa a crescer
saprofiticamente (Alves 1998b).
Folegatti (1985) concluiu que a aplicação conjunta de M. anisopliae e C. flavipes é
mais eficiente que a aplicação do fungo isoladamente e de sua não interferência, ou seja, o
fungo não se mostrou patogênico aos diferentes estágios de desenvolvimento da vespinha.
Logo, o fungo M. anisopliae pode ser utilizado como mais um agente de biocontrole a broca
da cana-de-açúcar, vindo a incrementar o manejo integrado de pragas na cultura da cana-
de-açúcar.
2.3. Seleção de isolados de fungos entomopatogênicos
Para Alves (1998c), os testes de seleção de isolados são a base para a implantação
de um programa de controle microbiano de pragas consistente e bem sucedido,
representando também uma etapa fundamental no processo de desenvolvimento de um
bioinseticida. Este procedimento é recomendado principalmente devido à enorme
variabilidade genética existente entre os entomopatógenos, o que lhes confere diferentes e
importantes características como virulência e patogenicidade a grupos específicos de
insetos.
Para tanto, alguns parâmetros, como crescimento vegetativo, conidiogênese, tipos
de meio de cultura, sensibilidade a produtos químicos, produção enzimática e tolerância a
luz ultravioleta devem ser considerados e analisados para uma melhor diferenciação entre
os isolados (PACCOLA-MEIRELES & AZEVEDO, 1990; SÓSA-GOMEZ, 1994).
Dada sua importância, diversos e variados trabalhos de seleção de isolados de
fungos entomopatogênicos estão descritos em literatura, como os realizados para: cupins
(ALMEIDA, 1994, ALMEIDA et al., 1997), pragas de grão armazenados (MOINO Jr. Et al.,
1998), ácaro rajado (TAMAI et al., 2002), cigarrinhas da raiz da cana-de-açúcar
10
(LOUREIRO, 2004; MACEDO, 2006) e à broca da cana-de-açúcar (WENZEL et al., 2006).
Em todos os testes de seleção foi observado que a eficiência dos isolados variou,
provocando mortalidades entre 10 e 95% aos insetos testados.
Estudando diferentes isolados de B. bassiana para o controle de D. saccharalis na
Argentina, Leucona et al. (1996), observaram uma variação entre os isolados podendo os
co-relacionar quanto suas respectivas origens, onde foi constatado que os isolados mais
patogênicos foram os argentinos quando comparados aos isolados brasileiros.
2.4. Produção de fungos entomopatogênicos
Após a seleção dos isolados, Alves & Pereira (1998) salientam que outro importante
parâmetro que deve ser rigorosamente analisado é a produção do fungo de interesse em
condições experimentais e industriais, considerando a quantidade de propágulos produzido,
tempo total do processo, meio de cultura balanceado e adequado, qualidade final do
bioinseticida, custo/benefício, condições de armazenamento, longevidade e potencial de
mercado.
Contudo, os Hyphomycetes possuem características apropriadas e desejáveis para
torná-los efetivamente bons bioinseticidas, destacando a facilidade de produção e aplicação,
especificidade, ausência de toxicidade ao homem e ao meio ambiente, além de permitir a
associação com outros organismos biocontroladores, despertando cada vez mais o
interesse em estudos básicos e aplicados (Alves, 1998a).
Leite et al. (2003) enfatizaram a pesquisa com estes fungos pela capacidade de
atacar um grande número de espécies de artrópodes em praticamente todos os estados de
desenvolvimento com diversas estruturas reprodutivas como micélio, blastósporos e
conídios, sendo este último a forma mais produzida e comercializada atualmente no Brasil.
A produção de conídios utilizando meio de cultura sólidos como grãos de arroz é
utilizada desde a década 70, sendo aperfeiçoada por Alves & Pereira (1989) e desde então
é o principal método de produção e comercialização em larga escala de fungos
entomopatogênicos como M. anisopliae e B. bassiana no Brasil.
Várias alternativas e diferentes meios de culturas (feijão, fava, sorgo, bagacilho de
cana, farelo, casca e tipos de arroz) foram estudados para a produção de fungos
entomopatogênicos, porém, segundo Vilas Boas et al. (1996), o arroz foi o melhor
tratamento para a produção de B. bassiana, corroborando os dados encontrados por
11
Mendonça & Rocha (1992), onde o arroz parbolizado foi o único substrato onde a
concentração foi de 10
10
conídios/g de arroz.
Ottati-de-Lima (2007), recentemente realizou estudos similares e concluiu que dentre
os diferentes substratos testados, o arroz é o mais indicado devido a sua característica
econômica e produtiva para o fungo M. anisopliae, estando de acordo com os dados
levantados por Almeida & Batista Filho (2006).
Estima-se que as vendas de fungos entomopatogênicos no mercado latino-
americano é de aproximadamente US$ 20 milhões por ano. No Brasil, no ano de 1998 as
vendas chegaram a US$ 1 milhão, com potencial estimado em US$ 140 milhões.
Estimativas mostraram que oito anos depois o mercado de fungos entomopatogênicos
demonstrou crescimento significativo no Brasil, fechando o ano de 2006 com um
faturamento de aproximadamente US$ 10 milhões (Alves & Lopes, 2008).
Somente o estado de São Paulo foi responsável pela produção de 268 toneladas de
fungos entomopatogênicos, com uma área tratada de 161.910 ha, gerando uma receita de
US$ 1,2 milhões na safra 2002-2003 da cana-de-açúcar. O valor médio do tratamento por
hectare foi de aproximadamente US$ 20 comparado ao custo de US$ 60 do tratamento com
controle químico, gerando diretamente 148 empregos (ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2006;
AVES & LOPES, 2008).
Entretanto, mesmo com um mercado potencial elevado, Loureiro (2004) atenta para
o fato de existir uma limitação no desenvolvimento e comercialização de produtos
microbianos, pela falta de caracterização e padronização da linhagem selecionada, visando
sua identidade durante o processo produtivo.
12
3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado no Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico,
sediado em Campinas-SP.
3.1. Isolados de fungos entompatogênicos
Nos experimentos foram utilizados os fungos entomopatogênicos Beauveria
bassiana (67 isolados) e Metarhizium anisopliae (27 isolados), provenientes da Coleção de
Microrganismos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Laboratório de Controle
Biológico do Instituto Biológico, os quais encontram-se armazenados em “freezer” a -12ºC,
na forma de conídios puros em tubos plásticos de 1,5 mL (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1. Identificação dos isolados do fungo Beauveria bassiana, utilizados nos
experimentos com Diatraea saccharalis
Isolado Hospedeiro Coletor Localidade
IBCB 01 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 02 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 04 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 05 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 13 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 14 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 66
Hypothenemus hampei
A. Batista Filho S. José Rio Pardo-SP
IBCB 87
Cosmopolites sordidus
Embrapa Goiânia-GO
IBCB 215 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 276 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 278 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 279 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 280 Solo de cana-de-çaúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 281 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 282 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 283 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 284 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
13
Tabela 1. (cont.) Identificação dos isolados do fungo Beauveria bassiana, utilizados nos
experimentos com Diatraea saccharalis
Isolado Hospedeiro Coletor Localidade
IBCB 285 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 294 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 295 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 296 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 297 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 298 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 300 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 301 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 302 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 303 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Ribeirão Preto-SP
IBCB 306 Solo de cana-de-açúcar C. Lamas Maracaí-SP
IBCB 307 Solo de cana-de-açúcar C. Lamas Maracaí-SP
IBCB 308 Solo de cana-de-açúcar C. Lamas Maracaí-SP
IBCB 392 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Esp. Santo Pinhal-SP
IBCB 483 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Esp. Santo Pinhal-SP
IBCB 484 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Esp. Santo Pinhal-SP
IBCB 486 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Esp. Santo Pinhal-SP
IBCB 487 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Esp. Santo Pinhal-SP
IBCB 488 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Esp. Santo Pinhal-SP
IBCB 510 Solo de cana-de-açúcar D. Lainetti Jaguariúna-SP
IBCB 511 Solo de cana-de-açúcar D. Lainetti Jaguariúna-SP
IBCB 512 Solo de cana-de-açúcar A.H. Sano Jaguariúna-SP
IBCB 513 Solo de cana-de-açúcar R.M. Goulart Jaguariúna-SP
IBCB 514 Solo de cana-de-açúcar E.S. Loureiro Jaguariúna-SP
IBCB 515 Solo de cana-de-açúcar D. Lainetti Jaguariúna-SP
IBCB 516 Solo de cana-de-açúcar A.H. Sano Jaguariúna-SP
IBCB 517 Solo de cana-de-açúcar A.H. Sano Jaguariúna-SP
IBCB 518 Solo de cana-de-açúcar E.S. Loureiro Jaguariúna-SP
IBCB 519 Solo de cana-de-açúcar R.M. Goulart Jaguariúna-SP
IBCB 520 Solo de cana-de-açúcar D. Lainetti Jaguariúna-SP
IBCB 521 Solo de cana-de-açúcar D. Lainetti Jaguariúna-SP
IBCB 522 Solo de cana-de-açúcar R.M. Goulart Jaguariúna-SP
IBCB 523 Solo de cana-de-açúcar E.S. Loureiro Jaguariúna-SP
14
Tabela 1. (cont.) Identificação dos isolados do fungo Beauveria bassiana, utilizados nos
experimentos com Diatraea saccharalis
Isolado Hospedeiro Coletor Local de coleta
IBCB 565 Solo de café J.E.M. Almeida Franca-SP
IBCB 586 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 587 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 588 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 589 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 590 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 592 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 593
IBCB 594
IBCB 596
IBCB 597
IBCB 598
IBCB 599
IBCB 600
IBCB 601
IBCB 602
IBCB 604
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
Solo de cana-de-açúcar
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
J.E.M. Almeida
Araras-SP
Assis-SP
Assis-SP
Assis-SP
Assis-SP
Echaporã-SP
Cardoso-SP
Cardoso-SP
Cardoso-SP
Cardoso-SP
Tabela 2. Identificação dos isolados do fungo Metarhizium anisopliae, utilizados nos
experimentos com Diatraea saccharalis
Isolado Hospedeiro Coletor Localidade
IBCB 116 Solo J.E.M. Almeida Contagem-MG
IBCB 153 Solo R. Cassol Aral Moreira-MS
IBCB 154 Solo R. Cassol Guaraniaçu-PR
IBCB 155 Solo de gramado R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 156 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 158 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 159 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 167 Solo R. Cassol Cascavel-PR
IBCB 171 Solo de soja R. Cassol Aral Moreira-MS
IBCB 351 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Guariba-SP
IBCB 352 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Valparaíso-SP
15
Tabela 2. (cont.) Identificação dos isolados do fungo Metarhizium anisopliae, utilizados nos
experimentos com Diatraea saccharalis
Isolado Hospedeiro Coletor Local de coleta
IBCB 353 Solo de cana-de-açúcar J.E.M. Almeida Valparaíso-SP
IBCB 360 Solo de banana L.G. Leite Piedade-SP
IBCB 361 Solo de banana L.G. Leite Piedade-SP
IBCB 363
Mahanarva fimbriolata
J.E.M. Almeida Araras-SP
IBCB 380
Mahanarva fimbriolata
L.G. Leite Água Branca-SP
IBCB 382 Pão-de-galinha pastagem J.E.M. Almeida Passo Fundo-RS
IBCB 383
Mahanarva fimbriolata
L.G. Leite Água Branca-SP
IBCB 384
Mahanarva fimbriolata
L.G. Leite Sertãozinho-SP
IBCB 391
Mahanarva fimbriolata
J.E.M. Almeida Tabapuã-SP
IBCB 410 Solo de mata atlântica E. Denardo Iporanga-SP
IBCB 417 Solo de mata atlântica E. Denardo Iporanga-SP
IBCB 418 Solo de mata atlântica E. Denardo Iporanga-SP
IBCB 425 Solo de mata atlântica E. Denardo Iporanga-SP
IBCB 426 Solo de mata atlântica E. Denardo Iporanga-SP
IBCB 478 Solo de algodão J.E.M. Almeida Mogi das Cruzes-SP
IBCB 481 Solo de sorgo L.G. Leite Campinas-SP
Para a realização dos experimentos, os isolados de B. bassiana e M. anisopliae
foram repicados em placas de Petri, de 9,0 cm de diâmetro, contendo meio de cultura
B.D.A., com a seguinte composição:
Batata................................... 200 g
Ágar-ágar............................. 20 g
Dextrose............................... 20 g
Água destilada..................... 1000 mL
Com o auxílio de uma alça de platina, uma pequena quantidade dos fungos foi
transferida para as placas de Petri contendo o meio de cultura, através da inoculação em
três pontos eqüidistantes.
As placas foram mantidas em câmaras de germinação (B.O.D.) a 25±1ºC, umidade
relativa 70±10% e fotoperíodo de 12 horas. O período de incubação foi de 10 dias em média
16
e após esse período, as placas foram armazenadas em geladeira (4ºC) até a utilização nos
experimentos.
3.2. Determinação da concentração letal (CL
90
)
Foi realizado um experimento para a determinação da concentração dos
entomopatógenos a serem utilizadas nos testes de seleção dos isolados dos fungos B.
bassiana e M. anisopliae.
Foram utilizados como padrões IBCB 66 (B. bassiana isolado de Hypothenemus
hampei de São José do Rio Pardo-SP) e o IBCB 425 (M. anisopliae isolado de solo de
Iporanga-SP), utilizados em diversos programas de controle microbiano de pragas do
Instituto Biológico.
As suspensões foram preparadas a partir da conidiogênese dos fungos em placas
com o meio de cultura sólido B.D.A, descrito no item 3.1, com água destilada, estéril e
espalhante adesivo (Tween 80) a 0,1%. Com o auxílio de um microscópio óptico e uma
câmara de Neubauer foi feita a contagem do número de conídios.
O experimento foi composto por cinco tratamentos contendo diferentes
concentrações, 5x10
6
; 1x10
7
; 5x10
7
; 1x10
8
e 5x10
8
conídios/mL dos isolados considerados
padrão, pulverizados em lagartas de D. saccharalis no 3º a 4º ínstar (1,5 cm de
comprimento) com quatro repetições, para ambos os fungos, com delineamento
inteiramente casualizado.
As lagartas da broca da cana-de-açúcar foram fornecidas pela Usina São João,
sediada no município de Araras-SP, e eram provenientes de uma criação de laboratório.
A aplicação de 1 mL das suspensões dos fungos B. bassiana e M. anisopliae sobre
as lagartas de D. saccharalis foram feitas com o auxílio da Torre de Potter, adaptada, com
pressão de 15 libras/pol.². Após a pulverização, as lagartas foram transferidas para
pequenos potes plásticos (5 cm de altura e 4 cm de diâmetro) com tampas de rosca e tela,
contendo um pedaço de colmo de cana-de-açúcar, os quais foram acondicionados em uma
sala climatizada com temperatura de 25±1ºC, umidade relativa 70±10% e fotoperíodo de 12
horas.
As avaliações foram realizadas diariamente por um período de 15 dias, onde cada
inseto morto foi transferido para uma placa de Petri contendo um chumaço de algodão
umedecido com água destilada, estabelecendo-se uma câmara úmida, a fim de proporcionar
a extrusão dos fungos pelo tegumento do inseto. As placas foram mantidas em câmara
17
climatizada B.O.D. com temperatura média de 25±1ºC, fotofase de 12 horas e umidade
relativa de 70±10%. Este procedimento foi realizado para confirmação da mortalidade
causada pelo entomopatógeno.
A partir dos dados obtidos pela mortalidade confirmada dos insetos, através da
análise de Probit, foi possível calcular e determinar a CL
90
(concentração letal em
conídios/mL a 90% dos insetos) bem como o tamanho da lagarta ideal à ser utilizada nos
testes de seleção subseqüentes.
3.3. Seleção de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae
(Etapa 1)
Com base nas concentrações selecionadas no experimento para determinação da
CL
90
, foram realizados ensaios de seleção utilizando 67 isolados de B. bassiana e outros 27
de M. anisopliae, sendo sua grande maioria provenientes de áreas de plantio de cana-de-
açúcar.
O experimento de seleção teve que ser realizado em etapas, sendo que para B.
bassiana, foram realizados cinco bioensaios contendo cada um números diferentes de
isolados, além de um tratamento testemunha e outro com o isolado padrão IBCB 66. Já para
M. anisopliae, foram três bioensaios contendo também diferentes quantidades de isolados,
um tratamento testemunha e o isolado padrão IBCB 425.
Os isolados foram multiplicados em placas de Petri contendo meio de cultura B.D.A.,
sendo as suspensões pulverizadas com o auxílio de uma Torre de Potter, utilizando a
metodologia descrita no item 3.2.
Cada tratamento recebeu a aplicação de 1 mL das suspensões padronizadas, sendo
1x10
8
conídios/mL para os isolados de B. bassiana e 5x10
8
conídios/mL para os isolados de
M. anisopliae.
Os tratamentos foram compostos por placas de Petri com 9 cm de diâmetro,
contendo 50 lagartas de D. saccharalis variando entre o 3º e 4º instar de desenvolvimento,
onde logo após a pulverização os insetos foram transferidos para potes plásticos (4 cm de
diâmetro e 5 cm de altura com tampa rosqueada e tela) contendo pedaços de colmo de
cana-de-açúcar, totalizando 5 repetições com 10 lagartas cada, sendo que o delineamento
experimental foi inteiramente casualizado.
As avaliações foram realizadas diariamente por um período de 15 dias, conforme
descrito na etapa anterior.
18
3.4. Seleção final dos isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae
(Etapa 2)
Nesta etapa, foram selecionados os 10 isolados mais virulentos de B. bassiana e os
10 mais virulentos de M. anisopliae, ou seja, aqueles que provocaram mortalidades
confirmadas superiores ou iguais a 80%.
Novamente, placas de Petri contendo lagartas de D. saccharalis entre o 3º e 4º instar
foram pulverizadas em Torre de Potter com 1 mL de suspensão, sendo esta padronizada de
acordo com a espécie do fungo (1x10
8
conídios/mL para os isolados de B. bassiana e 5x10
8
conídios/mL para os isolados de M. anisopliae), onde posteriormente foram acondicionadas
em potes plásticos (idem metodologia item 3.3), com delineamento experimental
inteiramente casualizado com 10 tratamentos e cinco repetições, sendo que cada repetição
foi constituída de 10 lagartas de D. saccharalis com 1,5 a 2,0 cm de comprimento
Ainda com a mesma metodologia, foram realizadas avaliações diárias por um
período de 15 dias e os dados obtidos pela mortalidade confirmada foram submetidos a
análise de Probit para se determinar o TL
50
para cada isolado, sendo estes ainda analisados
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
3.5. Produção dos melhores isolados em arroz pré-cozido
A fim de se estabelecer os padrões de produção de conídios, apenas os isolados
mais virulentos de B. bassiana e M. anisopliae às lagartas de D. saccharalis foram utilizados
nesta etapa.
Esses isolados foram repicados em placas de Petri contendo o meio de cultura
B.D.A., as quais foram incubadas durante dez dias em câmaras de germinação B.O.D.
(temperatura de 25±1ºC, umidade relativa 70±10% e fotoperíodo de 12 horas). Após o
crescimento das colônias, os conídios foram removidos da superfície do meio com o auxílio
de uma espátula metálica para o preparo de uma suspensão contendo 1 x 10
8
conídios/mL
com água estéril mais espalhante adesivo Tween 80 a 0,1%.
A preparação do substrato para produção massal partiu do pré-cozimento do arroz,
foi feito em água fervente até que os grãos apresentassem a textura “emborrachado”,
retirando o excesso de água através da passagem do arroz por um escorredor e o
colocando em bandejas. Logo em seguida, 300 g de arroz foram colocados em sacos de
19
polipropileno (35 cm de comprimento e 22 cm de altura), os quais foram fechados com
grampos de metal e autoclavados por 20 minutos a 120ºC.
Após o resfriamento, os sacos foram inoculados com 10 mL de suspensão de B.
bassiana e M. anisopliae respectivamente, na concentração de 1 x 10
8
conídios/mL,
totalizando 5 repetições para cada um dos 9 tratamentos, para cada espécie de fungo,
sendo que o delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Em seguida, os sacos
foram agitados vigorosamente para proporcionar uma distribuição homogênea dos conídios
no grão de arroz.
Após a inoculação, os sacos foram acondicionados em uma sala climatizada (25±1ºC
e fotoperíodo de 12 horas) por 10 dias para a colonização do arroz pelos entomopatógenos.
Decorrido este período, os sacos foram selecionados e analisados visualmente para a
eliminação de contaminantes, para daí então serem abertos em suas partes superiores, a
fim de proporcionar uma ventilação maior e uma conseqüente secagem mais rápida do arroz
com fungo. Após 5 dias da abertura, os sacos foram armazenados em “freezer” (-12ºC).
Para o exame da concentração de conídios, de cada saco foi retirado 1 g de arroz
com fungo, o qual foi adicionado em um tubo de ensaio contendo 10 mL de água destilada
mais espalhante adesivo (Tween 80) a 0,1%, para a preparação de uma suspensão de
conídios. As suspensões foram diluídas e quantificadas em câmara de Neubauer, com o
auxílio do microscópio óptico com aumento de 400x.
Os valores de produção dos conídios foram submetidos à análise de variância e as
médias comparadas por meio do teste de Duncan a 5% de probabilidade e as médias
originais transformadas para análise por raiz quadrada x + 0,5.
3.6. Avaliação da eficiência dos melhores isolados de B. bassiana e M. anisopliae
em condições de campo
Para avaliar o controle da broca da cana-de-açúcar mediante aplicação dos isolados
selecionados dos fungos B. bassiana e M. anisopliae, foi conduzido um experimento de
campo em canavial, com histórico de ataque do inseto-praga, no período de outubro a
março.
O experimento foi realizado em área de cana-de-açúcar com variedade SP80-1842,
infestada com broca-da-cana na Usina da Barra, no município de Igaraçú do Tietê, SP. A
instalação foi em 25 de fevereiro de 2008.
Foram utilizados os dois melhores isolados, sendo um de B. bassiana e outro de M.
anisopliae.
20
O delineamento experimental foi o de blocos casualizados com dez tratamentos e
quatro repetições. Cada parcela foi composta de 12 linhas de cana de 20 metros de
comprimento, para aplicação terrestre com pulverizador costal, sendo aplicadas as 10 linhas
centrais.
Os tratamentos foram os seguintes:
1 - Testemunha
2 – Metarhizium anisopliae – 2 kg arroz + fungo/ha;
3 - Metarhizium anisopliae – 4 kg arroz + fungo/ha;
4 - Metarhizium anisopliae – 6 kg arroz + fungo/ha;
5 – Beauveria bassiana – 2 kg arroz + fungo/ha;
6 - Beauveria bassiana – 4 kg arroz + fungo/ha;
7 - Beauveria bassiana – 6 kg arroz + fungo/ha;
8 – Certero (i.a. Triflumurom) 80 mL/ha;
9 – DPX + 2Y45 35% WG 60 g/ha;
1
10 - Metarhizium anisopliae – 10 kg arroz + fungo/ha;
2
Avaliou-se o número de lagartas por metro linear em cada repetição, aos 3, 7 e 10
dias após a aplicação dos tratamentos.
Os dados obtidos foram convertidos em médias, os quais foram comparados pelo teste
de Duncan a 5% de probabilidade.
_______________________
1 – Inseticida juvenóide experimental utilizado pela Usina da Barra.
2
–
Mesma dose utilizada para controle da cigarrinha-da-raiz da cana-de-açúca
r
21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Determinação da concentração letal
As duas espécies de fungos entomopatogênicos testadas mostraram-se patogênicas
às lagartas da broca da cana-de-açúcar D. saccharalis. Para o fungo B. bassiana a maior
concentração (5 x 10
8
conídios/mL) causou a maior mortalidade, atingindo 90% de
mortalidade confirmada (Tabela 3).
Já para o fungo M. anisopliae, foi possível observar ao término das avaliações, que
as maiores concentrações foram capazes de gerar as maiores mortalidades confirmadas, ou
seja, para 1 x10
8
e
5 x 10
8
conídios/mL foram obtidos 26 e 68% da mortalidade confirmada
respectivamente (Tabela 3).
Portanto, o isolado IBCB 66 de B. bassiana mostrou-se mais virulento em menores
concentrações às lagartas da broca da cana-de-açúcar D. saccharalis, quando comparado
ao IBCB 425 de M. anisopliae.
Tabela 3. Mortalidade confirmada (%) de D. saccharalis pelos fungos entomopatogênicos B.
bassiana e M. anisopliae (Temp.: 25ºC, UR: 70% e fotofase: 12 horas).
Patógenos
Tratamentos
B. bassiana
(IBCB 66)
M. anisopliae
(IBCB 425)
5 x 10
6
16 4
1 x 10
7
22 12
5 x 10
7
44 20
1 x10
8
68 26
5 x 10
8
90 62
Testemunha 0 0
Para o fungo B. bassiana, a concentração letal 90 (CL
90
) para lagartas de D.
saccharalis determinada para o 10º dia, foi de 1 x 10
8
conídios/mL, (Figura 1). O fungo M.
anisopliae foi o menos virulento, e aos 10 dias de avaliações a concentração letal 90 (CL
90
)
foi estimada em 5 x 10
8
conídios/mL (Figura 2).
22
5x10^6
1x10^7
5x10^7
1x10^8
5x10^8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0123456
Mortalidade confirmada (%)
Log da concentração
y=0,00000000232+3,29830x
Figura 1. Mortalidade de lagartas de D. saccharalis 10 dias após a aplicação do isolado
IBCB 66 de Beauveria bassiana, nas concentrações de 5 × 10
6
, 1 × 10
7
, 5 × 10
7
, 1 × 10
8
e 5
× 10
8
conídios/mL (Temp. 25ºC, UR de 70% e fotofase de 12 horas).
5x10^6
1x10^7
5x10^7
1x10^8
5x10^8
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
0123456
Mortalidade confirmada (%)
Log da concentração
y=0,00000000242+3,34981x
Figura 2. Mortalidade de lagartas de D. saccharalis 10 dias após a aplicação do isolado
IBCB 66 de Metarhizium anisopliae, nas concentrações de 5 × 10
6
, 1 × 10
7
, 5 × 10
7
, 1 × 10
8
e 5 × 10
8
conídios/mL (Temp. 25ºC, UR de 70% e fotofase de 12 horas).
Para Fargues & Rodrigues-Rueda (1980), a rapidez da mortalidade do hospedeiro
normalmente apresenta correlação positiva com a concentração de conídios, o que pode ser
observado na determinação da concentração de M. anisopliae. Para B. bassiana esta
correlação foi também observada através do aumento da mortalidade concomitantemente à
elevação das concentrações de conídios.
23
Wenzel et al. (2006), testando a patogenicidade do mesmo isolado IBCB 66 de B.
bassiana em lagartas de D. saccharalis, apontou uma menor concentração letal (1,58 x 10
7
conídios/mL) porém para 50% das lagartas (CL
50
).
Estudando outras pragas que ocorrem na cultura da cana-de-açúcar, Loureiro et al.
(2005) observaram que a CL
50
para ninfas da cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar
(Mahanarva fimbriolata) pulverizadas com M. anisopliae, foi estimada em 1,2 x 10
7
conídios/mL.
Reis et al. (1998), avaliando a virulência de 3 isolados de M. anisopliae sobre adultos
do carrapato Amblyomma cajennense, verificaram que as maiores mortalidades foram
ocasionadas com valores de CL
90
variando em 6,69 x 10
9
. 3,77 x 10
10
e 6,7 x 10
10
conídios/mL.
Estas variações demonstram a importância da determinação dos valores das
concentrações letais antes do início dos testes de seleção, pois estes parâmetros são uma
preciosa ferramenta na validação dos dados obtidos, bem como levar a um melhor
entendimento da interação de diferentes patógenos em um mesmo hospedeiro.
4.2. Seleção de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae
4.2.1. Beauveria bassiana
Ao término das avaliações, foi possível constatar que todos os 67 isolados do fungo
B. bassiana foram patogênicos à broca da cana-de-açúcar , pois a menor mortalidade foi
provocada pelo IBCB 282, que matou 22 % das lagartas (Tabela 4).
Ao longo dos cinco experimentos que compuseram o teste de seleção, foram
observadas variações nos índices de mortalidade confirmadas em lagartas de D.
saccharalis. Para Alves (1998) esta variação na patogenicidade é observada com freqüência
em testes de seleção, podendo estar associada a fatores como baixa virulência de alguns
isolados, especificidade, tolerância do hospedeiro, entre outros aspectos.
Observando-se a Tabela 4, referente ao primeiro experimento, foi possível notar uma
variação de 22 a 92% de mortalidade confirmada, sendo que o IBCB 215 foi o mais
virulento, sendo seguidos pelos IBCB 278, 279 e 281, todos com mortalidades confirmadas
superiores a 87%. Giometti et al. (2006), ao realizar estudos de teste de seleção de isolados
do fungo entomopatogênico B. bassiana em condições de laboratório, também observaram
24
altos índices de mortalidades para alguns isolados, em especial ao isolado IBCB 215 que
ocasionou 95,8% de mortalidade confirmada em lagartas de D. saccharalis, corroborando
assim os dados obtidos neste trabalho.
Tabela 4. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Beauveria bassiana em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado
Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 01 50 59 40
IBCB 02 50 45 33
IBCB 04 50 61 52
IBCB 05 50 63 60
IBCB 13 50 62 54
IBCB 14 50 57 54
IBCB 66 50 60 77
IBCB 87 50 80 62
IBCB 215 50 95 92
IBCB 278 50 94 90
IBCB 279 50 93 87
IBCB 280 50 82 79
IBCB 281 50 92 88
IBCB 282 50 92 22
IBCB 276 50 80 75
Testemunha 50 6 0
No segundo experimento (Tabela 5) apenas o isolado IBCB 302 apresentou
mortalidade confirmada superior a 80%. No terceiro experimento (Tabela 6), nenhum dos
isolados apresentaram mortalidades acima de 80%, sendo o maior índice observado para o
IBCB 510 que alcançou 78% de mortalidade confirmada.
25
Tabela 5. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Beauveria bassiana em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 283 50 80 43
IBCB 284 50 82 53
IBCB 285 50 73 69
IBCB 294 50 90 77
IBCB 295 50 78 64
IBCB 296 50 60 42
IBCB 297 50 70 68
IBCB 298 50 78 67
IBCB 300 50 51 39
IBCB 301 50 98 69
IBCB 302 50 88 88
IBCB 303 50 90 75
IBCB 306 50 94 72
IBCB 307 50 92 78
IBCB 308 50 79 64
IBCB 66 50 58 71
Testemunha 50 4 0
26
Tabela 6. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Beauveria bassiana em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 392 50 61 59
IBCB 483 50 69 45
IBCB 484 50 70 64
IBCB 486 50 90 59
IBCB 487 50 69 63
IBCB 488 50 73 60
IBCB 510 50 80 78
IBCB 511 50 65 52
IBCB 512 50 79 64
IBCB 513 50 83 71
IBCB 514 50 73 65
IBCB 515 50 58 45
IBCB 516 50 73 63
IBCB 517 50 68 53
IBCB 518 50 81 59
IBCB 66 50 55 70
Testemunha 50 5 0
No quarto experimento (Tabela 7), os isolados IBCB 519, 589, 592 e 593 provocaram
mortalidades confirmadas variando de 70 a 80%. No quinto experimento (Tabela 8), dois
isolados (IBCB 597 e 598) destacaram-se dos demais por proporcionarem mortalidades
confirmadas acima de 84%, sendo o IBCB 600 o mais virulento neste quinto experimento,
alcançando 91% de mortalidade confirmada em lagartas de D. saccharalis.
27
Tabela 7. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Beauveria bassiana em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 519 50 78 77
IBCB 520 50 65 41
IBCB 521 50 89 64
IBCB 522 50 55 50
IBCB 523 50 76 69
IBCB 565 50 69 64
IBCB 586 50 55 42
IBCB 587 50 78 68
IBCB 588 50 70 64
IBCB 589 50 76 70
IBCB 599 50 63 50
IBCB 592 50 79 72
IBCB 593 50 86 80
IBCB 594 50 81 68
IBCB 66 50 57 69
Testemunha 50 5 0
Tabela 8. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Beauveria bassiana em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 596 50 79 62
IBCB 597 50 92 88
IBCB 598 50 92 84
IBCB 599 50 74 70
IBCB 600 50 100 91
IBCB 601 50 71 64
IBCB 602 50 86 68
IBCB 604 50 77 62
IBCB 66 50 60 52
Testemunha 50 3 0
28
Lecuona et al. (1996), testando a patogenicidade de diferentes isolados do fungo B.
bassiana pulverizados em lagartas da broca da cana-de-açúcar D. saccharalis, puderam
observar variações entre as mortalidades confirmadas que permaneceram entre 50 e 90%.
Estudando a mesma praga, verificando a virulência de conídios de B. bassiana, Marques et
al. (2000), observaram altos índices de mortalidades confirmadas entre 92 e 96% dos
insetos.
Em um estudo de atividades de conídios de B. bassiana e micélio seco obtidos a
partir de diferentes meios de culturas, Arcas et al.(2005) também registraram mortalidades
entre 21 e 85% das lagartas de D. saccharalis em condições de laboratório.
Neste trabalho, foi possível observar que a patogenicidade de B. bassiana variou de
33 a 92% de mortalidade confirmada após 15 dias de avaliações diárias.
Resultados semelhantes foram encontrados por Figueiredo et al. (2002), realizando
testes de seleção de isolado de B. bassiana e M. anisopliae a outros lepidópteros que
atacam a cultura da cana-de-açúcar, onde novamente variações nas porcentagens de
mortalidade confirmada foram observadas, estando entre 53 e 83%.
Estas variações nas mortalidades confirmadas geradas por diferentes isolados de B.
bassiana também foram relatadas por outros autores trabalhando com outras ordens e
famílias de insetos, como Almeida (1994) com testes de seleção de fungos ao cupim
Heterotermes tenuis, Neves & Hirose (2005) testando diferentes isolados de B. bassiana à
broca do café (Hypothenemus hampei), Tamai (2002) para controle de ácaros, Silva (2001)
controlando o bicudo do algodoeiro e De Paula (2007) controlando culicídeos.
Já os dados referentes à mortalidade total, variaram de 45 a 100%, porém nem
sempre foi possível a caracterização destas mortalidades pela penetração do fungo. Este
fato pode ser explicado devido à septicemia generalizada causada por bactérias, interferindo
no crescimento vegetativo do fungo no interior dos insetos (Loureiro, 2004).
Desta maneira os testes de seleções têm como principal função excluir isolados
pouco virulentos e com baixa capacidade de penetração e germinação, selecionando os
isolados com maior potencial para uma avaliação mais eficiente, tendo na escolha da
mortalidade confirmada como parâmetro de seleção, uma maior confiabilidade e precisão
nos dados obtidos (MOINO, Jr., 1993; HAJEK & ST. LEGER, 1994).
Dentre os 67 isolados testados, apenas 9 foram capazes de proporcionar índices de
mortalidade confirmada iguais ou superiores a 80%. Assim, este valor foi adotado como
padrão no critério dos isolados com bom potencial para o controle da broca da cana-de-
açúcar D. saccharalis. As mortalidades ocorreram mais intensamente após o 4º. dia de
aplicação e estenderam-se até o 12º dia.
Assim, analisando a distribuição de freqüência de isolados de B. bassiana em
relação à mortalidade confirmada causada em lagartas de D. saccharalis (Figura 3),
29
podemos observar que existem três grupos distintos de isolados. O primeiro grupo é
composto por quatro isolados que geraram mortalidades entre 21 e 40%, o segundo grupo e
mais numeroso compreende 55 isolados com mortalidades variando de 41 a 80% e por
último o terceiro grupo, composto por 8 isolados altamente virulentos à broca da cana-de-
açúcar com mortalidades entre 81 a 92%, sendo estes de maior interesse neste estudo.
Loureiro et al. (2005), em um teste de seleção de isolados de M. anisopliae em ninfas
da cigarrinha-da-raiz da cana-de-açúcar (Mahanarva fimbriolata), relataram que a maioria
dos isolados causaram mortalidades confirmada entre 41 e 69% e apenas uma minoria dos
isolados eram de interesse, com mortalidades confirmadas entre 70 e 90%.
Desta forma, os isolados selecionados, que proporcionaram mortalidades
confirmadas iguais ou superiores a 80% foram o IBCB 215, 278, 279, 281, 302, 593, 597,
598 e 600.
00
22
8
12
22
13
6
2
0
5
10
15
20
25
0-10 11 20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100
% de mortalidade
Numero de isolados
Figura 3. Distribuição de freqüência de isolados de B. bassiana em relação a mortalidade
confirmada causada em lagartas de D. saccharalis em bioensaios de laboratório.
4.2.2. Metarhizium anisopliae
Os resultados gerados pelas mortalidades confirmadas dos 27 isolados do fungo
Metarhizium anisopliae, evidencia que todos são patogênicos à broca da cana-de-açúcar,
pois a menor mortalidade foi de 49% do IBCB 158 (Tabela 9.) Analisando a mesma tabela
podemos observar que somente três isolados foram capazes de causar mortalidades
confirmadas iguais ou superiores a 80%, quais sejam: IBCB 425 (82%), IBCB 351 (90) e o
30
IBCB 353 (94). Todos o demais não se adequaram ao padrão de seleção pré estabelecido
(idem item 4.2.1) pois apresentaram mortalidades confirmadas abaixo de 79%.
Tabela 9. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Metarhizium anisopliae em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado
Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 116 50 86 61
IBCB 153 50 63 59
IBCB 154 50 71 66
IBCB 155 50 55 54
IBCB 156 50 82 70
IBCB 158 50 66 49
IBCB 159 50 98 63
IBCB 167 50 59 55
IBCB 171 50 82 77
IBCB 351 50 81 90
IBCB 352 50 99 54
IBCB 353 50 99 94
IBCB 360 50 88 68
IBCB 361 50 77 68
IBCB 363 50 73 72
IBCB 425 50 85 82
Testemunha 50 2 0
O segundo experimento (Tabela 10) ficou caracterizado pelo fato de que dos 12
isolados testados, 7 apresentaram mortalidades confirmadas acima de 80%, com destaque
para o IBCB 417 que controlou 100% das lagartas de D. saccharalis, seguido pelo IBCB 418
com 96% de mortalidade confirmada.
Acevedo et al. (2007) estudando as interações entre diversos entomopatógenos e a
broca da cana-de-açúcar D. saccharalis, relataram variações nos índices de mortalidade e
apontam um isolado como altamente promissor, pois este foi capaz de provocar a
mortalidade de 100% das lagartas em seu tratamento.
Bueno (2004) e Lecuona (1990) apud Fava et al. (2004), novamente apontam
diferenças nos valores de mortalidades confirmadas de D. saccharalis pelo fungo M.
31
anisopliae, quando aplicado em lagartas de 1º e 2º instar em concentrações de 1 a 3 x 10
8
conídios/mL em condições de laboratório.
Estas mesmas variações também puderam ser observadas em outros grupos de
insetos. Cintra et al. (2003), observaram mortalidades confirmadas entre 10 e 70% para
ninfas da cigarra-de-café Fidicina sp. Xavier & Ávila (2005) em teste de patogenicidade de
alguns isolados ao percevejo castanho, também observaram variações nos valores das
mortalidades confirmadas estando entre 10 e 78%. Loureiro et al. (2005) selecionando
isolados de M. anisopliae à cigarrinha-da-raiz da cana-de-açúcar Mahanarva fimbriolata,
relatam que variações entre 10 a 90% também ocorreram em seus experimentos.
Tabela 10. Mortalidade acumulada (total e confirmada) após 15 dias da pulverização de
isolados de Metarhizium anisopliae em lagartas de Diatraea saccharalis (Temp. 25±1
o
C e
Umidade Relativa 70±10% e fotofase de 12 horas).
Isolado
Nº total
Insetos
Mortalidade Total
(%)
Mortalidade confirmada
(%)
IBCB 380 50 75 70
IBCB 382 50 81 78
IBCB 383 50 93 85
IBCB 384 50 97 96
IBCB 391 50 78 60
IBCB 410 50 92 84
IBCB 417 50 100 100
IBCB 418 50 97 96
IBCB 425 50 87 86
IBCB 426 50 78 72
IBCB 478 50 86 74
IBCB 481 50 85 80
Testemunha 50 2 0
Foi observado que dentre os 27 isolados de M. anisopliae testados, novamente 9
isolados apresentaram mortalidades confirmadas iguais ou superiores a 80%. Este valor foi
adotado como padrão de seleção dos isolados com bom potencial para o controle da broca
da cana-de-açúcar D. saccharalis. As mortalidades ocorreram principalmente entre o 5º e
12º dias após a aplicação da suspensão de conídios.
Quando as mortalidades confirmadas dos isolados são dispostas em uma
distribuição de freqüência (Figura 4), podemos observar a separação dos mesmos em
32
grupos de acordo com as porcentagens, onde 6 isolados controlam entre 41 a 60% das
lagartas, 13 mostraram mortalidades entre 61 e 80% e outros 8 isolados de M. anisopliae
alcançaram mortalidades entre 81 e 100%, sendo estes últimos selecionados para o
controle de lagartas de D. saccharalis.
0000
1
5
7
6
44
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0-10 11 20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100
% de mortalidade
Numero de isolados
Figura 4. Distribuição de freqüência de isolados de B. bassiana em relação a mortalidade
confirmada causada em lagartas de D. saccharalis em bioensaios de laboratório.
Esses dados corroboram com aqueles obtidos por Loureiro et al. (2005) verificando
que a grande maioria do isolados está abaixo do padrão estabelecido anteriormente e
apenas uma minoria esta acima do padrão.
Os isolados de M. anisopliae selecionados foram: IBCB, 351, 353, 383, 384, 410,
417, 418, 425 e 481.
33
4.3. Seleção final dos isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae
4.3.1. Beauveria bassiana
Todos os isolados testados não diferiram estatisticamente entre si e apresentaram
mortalidades confirmadas médias acima de 90%, o que vem a comprovar a alta virulência
destes fungos quando aplicados em lagartas da broca da cana-de-açúcar D. saccharalis
(Tabela 11)
Tabela 11. Mortalidade média (%) de lagartas de Diatraea saccharalis causada por isolados
selecionados de Beauveria bassiana (Temperatura: 25±2
o
C e Umidade Relativa: 60±10%).
Isolados selecionados de
B. bassiana
1
Mortalidade média de
lagartas (n=5)
TL
50
(Dias)
IBCB 215 92,0±0,44 a 6,74
IBCB 278 92,0±0,83 a 6,34
IBCB 279 94,0±0,54 a 6,16
IBCB 281 92,0±0,83 a 7,42
IBCB 302 96,0±0,89 a 6,19
IBCB 593 96,0±0,54 a 8,13
IBCB 597 92,0±0,83 a 6,20
IBCB 598 98,0±0,44 a 5,57
IBCB 600 98,0±0,44 a 5,48
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Dados não
transformados. CV = 7,0%.
Trabalhando com uma mesma concentração para o fungo B. bassiana foi possível
observar que ocorreram variações nos valores da TL
50
, sendo que apenas dois isolados,
IBCB 600 e IBCB 598, apresentaram os menores tempos letais, provocando doença em
50% da população de insetos testados com 5,48 e 5,57 dias, respectivamente. Os demais
isolados tiveram suas TL
50
entre 6,16 e 8,13 dias (Tabela 11).
Foi possível ainda observar correlação positiva para alguns isolados, onde os
menores valores da TL
50
ocorreram em concomitância às maiores porcentagens de
mortalidades confirmadas.
34
Lecuona et al. (1996), avaliando em condições de laboratório a virulência de conídios
de B. bassiana em lagartas de D. saccharalis, puderam observar que os tempos letais
variaram entre 2,1 e 8,4 dias, sendo muito próximos aos valores encontrados nesta
pesquisa, onde também afirmam que estas variações ocorreram em função da localização
geográfica onde o fungo foi isolado.
Giometti et al. (2006), trabalhando com os isolados de B. bassiana IBCB 215, 278 e
279, quanto a patogenicidade em lagartas de D. saccharalis, observaram valores próximos
aos encontrados, porém quanto a virulência, foi possível evidenciar que estes isolados
causaram doença em 50% dos insetos com 4,2 dias, 5,0 dias e 5,1 dias, respectivamente,
diferindo assim dos valores obtidos nestes experimentos. Porém, novamente foi observado
correlação positiva entre os menores tempos letais causando os maiores índices de
mortalidades confirmadas.
4.3.2. Metarhizium anisopliae
Os isolados de M. anisopliae novamente apresentaram mortalidades iguais ou
superiores a 62%, resultados semelhantes e/ou iguais ao primeiro teste de seleção
realizado.
Os dados obtidos (Tabela 12) indicam que houve diferença estatística apenas entre
os isolados IBCB 384 e 425. Novamente podemos estabelecer uma relação positiva entre
mortalidade confirmada e os valores para TL
50
, pois foi possível observar que os menores
tempos letais ocorreram para os isolados IBCB 384 e 383 com 6,47 e 6,83 dias,
respectivamente, os quais provocaram as maiores porcentagens de mortalidades
confirmadas, com 90 e 86%, respectivamente, sendo considerados como os mais
patogênicos e virulentos.
35
Tabela 12. Mortalidade média (%) de lagartas de Diatraea saccharalis causada por isolados
selecionados de Metarhizium anisopliae (Temperatura 25±2
o
C e Umidade Relativa 60±10%).
Isolados selecionados de
B. bassiana
1
Mortalidade média de
lagartas (n=5)
TL
50
(Dias)
IBCB 351 74,0±0,89 ab 9,10
IBCB 353 74,0±2,07 ab 9,22
IBCB 383 86,0±0,54 ab 6,83
IBCB 384 90,0±0,00 a 6,47
IBCB 410 70,0±0,70 ab 10,25
IBCB 417 76,0±1,81 ab 8,66
IBCB 418 82,0±0,83 ab 8,47
IBCB 425 62,0±1,30 b 10,21
IBCB 481 78,0±0,83 ab 8,06
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Dados não
transformados. CV = 17,0%.
Em função de poucas referências sobre o uso de M. anisopliae para o controle de D.
saccharalis, optou-se por considerar também o efeito desses entomopatógenos sobre outras
espécies da ordem Lepidoptera, onde Figueiredo et al. (2002), estudando a patogenicidade
de diferentes isolados de M. anisopliae sobre a broca gigante da cana de açúcar, puderam
observar que os tempos letais a 50% da população de insetos variaram entre 7,3 a 17,9 dias
e estes estavam inversamente relacionados com as crescentes mortalidades confirmadas
obtidas, ou seja existiu também uma correlação positiva entre menor tempo letal com a
maior mortalidade.
Estas relações de acréscimo da mortalidade confirmada em função do decréscimo
do tempo letal, também puderam ser observadas por Silva et al. (2003) com M. anisopliae
sobre lagartas de Plutela xylostella, por César Filho et al. (2001), com lagartas de Alabama
argillacea pulverizadas com M. anisopliae.
4.4. Produção dos melhores isolados em arroz pré-cozido
4.4.1 Beauveria bassiana
Os isolados IBCB, 215, 598 e 279, foram os mais produtivos, não diferindo
estatisticamente entre si e apresentaram rendimento médio de duas vezes os valores
36
obtidos para os demais isolados, com rendimentos de 4,99 x 10
9
, 4,94 x 10
9
e 4,11 x 10
9
conídios/g de arroz, respectivamente (Tabela 13).
Tabela 13. Produção média de conídios/g em arroz pré-cozido dos isolados de Beauveria
bassiana, selecionados para o controle de Diatraea saccharalis. (Temperatura 25
o
C,
Umidade Relativa 60%).
Isolados
Produção de conídios/g de arroz (x10
9
)
1,2
(±EP)*
IBCB 215 4,99±1,05 a
IBCB 278 1,90±0,43 b
IBCB 279 4,11±0,77 a
IBCB 281 1,71±0,30 b
IBCB 302 1,87±0,40 b
IBCB 593 1,70±0,44 b
IBCB 597 2,38±0,16 b
IBCB 598 4,94±1,21 a
IBCB 600 2,82±1,49 b
* Erro padrão da média
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.
2
Médias
originais, transformadas para análise por √ x + 0,5.
Alguns trabalhos relatam as variações nas quantidades de conídios produzidos por
grama, onde a produção também é feita em meio sólido. A produtividade de conídios de B.
bassiana em arroz pré-cozido atingiu, segundo Londono et al. (1992), uma produção média
de 7,7 x 10
9
de conídios/g de arroz e Vilas Boas et al. (1996), observaram produção máxima
de 2,7 x 10
10
de conídios/g de arroz.
Rhode et al. (2008), mostraram que o isolado UNIOESTE 04 de B. bassiana
manteve elevada produção, apresentando uma média de 8,3 x 10
8
conídios/g arroz,
resultado inferior ao observado por Leite et al. (2003), que foi de 6 x 10
9
conídios/g de arroz
para um outro isolado de B. bassiana.
Ottati de Lima (2007), testando variados tipos de substrato como alternativa para o
crescimento de fungos entomopatogênicos, aponta o arroz como o meio mais produtivo e
econômico, obtendo em média 2,5 x 10
8
conídios/g para o fungo B. bassiana, corroborando
assim os relatos de Mendonça Filho & Rocha (1992), que apontam o arroz como um bom
substrato para o cultivo de fungos entomopatogênicos.
Apesar do método utilizado para produção ser baseado no citado por Alves & Pereira
(1998) e Leite et al. (2003), a diferença pode estar relacionada a fatores que envolvem
37
pequenas variações no substrato, o método de produção empregado, como o tempo de pré-
cozimento do arroz, teor de umidade, tempo e condições de incubação, bem como a
quantidade de substrato dentro de cada recipiente e a quantidade de inoculo aplicado. Além
desses fatores, a qualidade do arroz utilizado no experimento e a qualidade do inóculo
empregado, são fatores que podem explicar a variação.
4.4.2. Metarhizium anisopliae
Dentre os isolados que foram produzidos em arroz, o IBCB 417 e 481 com uma
quantidade média de conídios por grama, respectivamente de 2,52 e 2,46 x10
9
, foram os
mais produtivos nesta fase do teste, pois diferiram estatisticamente apenas ao isolado IBCB
353, sendo que estes não diferiram significativamente dos demais isolados (Tabela 14).
Tabela 14. Produção média de conídios/g em arroz pré-cozido dos isolados de Metarhizium
anisopliae, selecionados para o controle de Diatraea saccharalis. (Temperatura 25
o
C,
Umidade Relativa 60%).
Isolados
Produção de conídios/g de arroz (x10
9
)
1,2
(±EP)*
IBCB 351 1,67±0,54 ab
IBCB 353 1,31±0,59 b
IBCB 383 2,25±0,58 ab
IBCB 384 1,67±0,49 ab
IBCB 410 1,90±0,26 ab
IBCB 417 2,52±1,25 a
IBCB 418 2,20±0,46 ab
IBCB 425 2,29±0,38 ab
IBCB 481 2,46±1,06 a
* Erro padrão da média
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.
2
Médias
originais, transformadas para análise por √ x + 0,5.
Loureiro et al. (2005b), analisando a produção em arroz pré-cozido de isolados
selecionados de M. anisopliae visando o controle de cigarrinhas-da-raiz da cana-de-açúcar,
observaram que a quantidade média de conídios variou entre 0,86 a 2,30 x 10
8
conidios/g
38
para o isolado IBCB 425 sendo o mais produtivo, estando esses dados 10 vezes abaixo dos
valores encontrados para o isolado IBCB 417 com 2,52 x 10
9
conídios/g de arroz.
Produzindo em condições semelhantes, Takada (2002) observou o rendimento
médio de 3 isolados de M. anisopliae e constatou que os valores oscilaram entre 2,25 a 2, 4
x10
8
conídios por grama de arroz.
Os valores citados acima estão abaixo dos valores encontrados nos resultados dos
testes de produção, porém, segundo Tamai (1997), estas diferenças na produção de
conídios entre os isolados podem estar relacionada com a dificuldade de se reproduzir entre
um experimento e outro, todas as condições disponíveis para o crescimento dos fungos em
arroz, tais como: umidade e tempo de cozimento do arroz, variações na temperatura e nível
de contaminação.
Assim, considerando os mais altos valores de conídios por grama de arroz, para o
fungo M. anisopliae os isolados com melhor potencial são o IBCB 417 e 481. Para Alves
(1998) a quantidade de conídios é um fator de seleção importante em um isolado, pois
quanto maior sua produção maior será o potencial de inóculo.
4.5. Avaliação da eficiência dos melhores isolados selecionados de B. bassiana
e M. anisopliae em condições de campo
Foi observado que em nenhum tempo de avaliação (0, 3, 7 e 10 dias) houve
diferença estatística entre os tratamentos, embora observou-se em alguns dias uma
tendência à diminuição do número de lagartas (Tabela 15).
Observou-se que na avaliação prévia, o número de lagartas estava bem distribuído
entre os tratamentos, variando entre 1,5 a 3 lagartas por metro linear em media, haja visto
que não houve diferença estatística significativa entre os tratamentos, sugerindo ainda que a
distribuição espacial dos ovos foi homogênea (Tabela 15).
Com 7 dias de avaliações após a aplicação dos isolados no campo, verificou-se que
mesmo não diferindo estatisticamente, houve tendência à diminuição do número de lagartas,
com exceção ao tratamento DPX + 2Y45 60g/ha, que manteve em zero o número lagartas
encontradas. Finalmente, aos 10 dias, as avaliações mostraram que o número de lagartas
permaneceu baixo, onde novamente os tratamentos não diferiram entre si, mas apenas três
tratamentos, Certero 80 mL/ha, DPX + 2Y45 60g/ha e M.anisopliae 10kg/ha, foram capazes
de manter em zero o número de lagartas ao 10 dias de avaliação (Tabela 15).
39
Tabela 15. Número médio de lagartas de Diatraea saccharalis em cana-de-açúcar tratada
com fungos entomopatogênicos e inseticidas juvenóides (Igaraçú do Tietê-SP), fevereiro a
março de 2008.
Tratamentos
1
0 dias 3 dias 7 dias 10 dias
Testemunha 1,5±1,2 a 0,5±0,6 a 0,5±0,6 a 0,2±0,5 a
M.anisopliae 2kg/ha 2,2±1,7 a 1,2±1,2 a 0,5±0,6 a 0,2±0,5 a
M.anisopliae 4kg/ha 1,7±0,9 a 0,2±0,5 a 0,0±0,0 a 1,0±0,8 a
M.anisopliae 6kg/ha 1,7±1,5 a 1,2±1,9 a 0,5±1,0 a 0,2±0,5 a
B. bassiana 2kg/ha 1,7±2,0 a 1,0±1,1 a 0,2±0,5 a 1,0±2,0 a
B. bassiana 4kg/ha 3,0±0,8 a 0,2±0,5 a 0,7±0,9 a 0,7±1,5 a
B. bassiana 6kg/ha 2,0±1,8 a 0,0±0,0 a 0,2±0,5 a 0,7±1,5 a
Certero 80 mL/ha 2,2±1,7 a 1,2±0,9 a 0,2±0,5 a 0,0±0,0 a
DPX + 2Y45 60g/ha 2,0±1,8 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 a
M.anisopliae 10kg/ha 1,5±1,3 a 0,0±0,0 a 0,5±1,0 a 0,0±0,0 a
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%. Dados
originais, porém transformados por log x+10.
Após a realização do cálculo da somatória das médias de lagartas por tratamento
(Figura 5), observou-se que ao final de 10 dias da aplicação dos fungos B. bassiana e M.
anisopliae, somente os tratamentos 9 (DPX + 2Y45 WG 60g/ha) e 10 (M. anisopliae 10
kg/ha), apresentaram médias de 0,5 lagartas, sendo estes valores inferiores ao do
tratamento testemunha com 0,69 lagartas, onde os demais tratamentos apresentaram
médias superiores variando entre 0,75 a 1,19 lagartas. Esta última dosagem de M.
anisopliae 10 kg/ha, foi utilizado como comparativo, uma vez que esta é recomendada para
o controle da cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar(Mahanarva fimbriolata).
O sucesso na utilização de fungos entomopatogênicos no controle da broca da cana-
de-açúcar D. saccharalis, já havia sido descrito por Alves et al. (1981), onde em condições
de campo, colmos de cana-de-açúcar infestados com D. saccharalis de 3º instar, foram
previamente tratadas com suspensões do fungo B. bassiana , obtendo-se mortalidades
confirmadas de 47,5% e 56% para as concentrações de 3,7x10
7
e 3,7x10
8
conídios/mL,
respectivamente, além de uma redução do dano causado nos colmos.
Estrada et al. (1997) controlando, em condições de campo, lagartas de D.
saccharalis, utilizaram o fungo B. bassiana na concentração de 1 x 10
12
conídios/ha e
observaram um incremento na produção de cana-de-açúcar em torno de 10 toneladas por
hectare.
Recentemente, Alves et al. (2008) também observaram resultados promissores, pois
ao avaliarem a
eficiência de M. anisopliae e B. bassiana no controle de lagartas de D.
40
saccharalis, puderam observar que após a aplicação dos entomopatógenos em campo, a
porcentagem de colmos brocados na testemunha foi de 43%, enquanto que para M.
anisopliae foi de 21% e para B. bassiana foi de 18%, respectivamente.
0,69
1,06
0,75
0,94
1
1,19
0,75
0,94
0,5 0,5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
12345678910
Tratamentos
No. médio de lagartas D.
saccharalis
6- B. bassiana 4 kg/ha
7- B. bassiana 6 kg/ha
8- Certero 80mL/ha
9- DPXe2Y45 WG 60g/ha
10
-
M anisopliae
10 kg/ha
1- Testemunha
2- M. anisopliae 2 kg/ha
3- M. anisopliae 4 kg/ha
4- M. anisopliae 6 kg/ha
5
-
B bassiana
2 kg/ha
Legenda:
Figura 5. Número acumulado de lagartas de Diatraea saccharalis por metro linear em cana-
de-açúcar submetidas a diferentes fungos entomopatogênicos e inseticidas juvenóides
(Igaraçú do Tietê-SP, 2008).
Assim, por apresentar capacidade de controle semelhante ao inseticida juvenóide
DPX + 2Y45 WG e melhor que o inseticida Certero, o fungo entomopatogênico M. anisopliae
na dosagem de 10 kg por hectare, passa a ser uma alternativa no incremento ao controle da
broca da cana-de-açúcar D. saccharalis.
41
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A cultura da cana-de-açúcar vêm demonstrando nos últimos anos crescimento
significativo em relação a sua área plantada, bem como modificações em seu sistema de
produção, principalmente pela proibição parcial da queima, o que acarreta em acúmulo da
palha no solo após o corte, constituindo assim microclima muito favorável à manutenção dos
entomopatógenos, porém ao mesmo tempo fornecendo uma condição muito propícia ao
desenvolvimento de populações de pragas.
A broca da cana-de-açúcar é hoje uma das principais pragas da cultura de cana-de-
açúcar e seus danos estão diretamente ligados à qualidade dos produtos finais extraídos do
caldo da cana.
Desde a década de 70 o controle de D. saccharalis vem sendo realizado com grande
sucesso devido à introdução de microhimenópteros como o parasitóide larval Cotesia
flavipes e o parasitóide de ovos Trichogramma galloi, principalmente pela facilidade de
produção massal em laboratório destas vespinhas, bem como pela alta eficiência devido a
capacidade de localização da praga no campo, além de apresentar um custo/benefício
melhor que os inseticidas recomendados.
Porém, a expansão de áreas de plantio de cana-de-açúcar cresce em uma
velocidade maior que o aumento do número de laboratórios de produção destas vespinhas,
fazendo com que haja um déficit na área tratada com esses parasitóides. Segundo
informações de entidades de pesquisa como o CTC (Centro de Tecnologia Canavieira), a
quantidade destes laboratórios teriam que ser quintuplicadas para atender a demanda de
vespinhas em relação a área de cana plantada atualmente no Brasil.
Sendo assim, acredita-se que a utilização de fungos entomopatogênicos como B.
bassiana e M. anisopliae no controle de D. saccharalis, possa vir a incrementar o manejo
integrado de pragas na cultura da cana-de-açúcar, contribuindo para que esta cultura
continue a suportar o maior programa de controle biológico do Brasil, fazendo cada vez mais
o uso racional de agrotóxicos, gerando menor impacto na saúde e equilíbrio ambiental, bem
como ao trabalhador rural, em busca por sistemas de produção sustentáveis.
42
6. CONCLUSÕES
- As concentrações de 5 x 10
8
conídios/mL para o fungo M. anisopliae e 1 x 10
8
conídios/mL
para B. bassiana, são as que promoveram a maior mortalidade de lagartas de D.
saccharalis.
- Todos os isolados testados são patogênicos à D. saccharalis.
- Os isolados mais virulentos de B. bassiana são os IBCB 600, 598, 279, 302 e 597.
- Os isolados mais virulentos de M. anisopliae são os IBCB 384, 383, 481,418 e 417.
- A maior produção de conídios de B. bassiana é obtida com os isolados IBCB 215, 279 e
598.
- A maior produção de conídios de M. anisopliae é obtida com os isolados IBCB 481 e 417.
- B. bassiana é eficiente em campo na dosagem de 6 kg de arroz + fungo/ha para o controle
de D. saccharalis.
- M. anisopliae é eficiente em campo na dosagem de 10 kg de arroz + fungo/ha para o
controle de D. saccharalis.
- O fungo B. bassiana é mais virulento que M. anisopliae, sendo ambos promissores para
aplicação no controle microbiano de broca-da-cana.
43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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