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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE ODONTOLOGIA e CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
CÂMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO DE GAMETAS E EMBRIÕES BOVINOS
PRODUZIDOS IN VITRO APÓS EXPOSIÇÃO
EXPERIMENTAL AO BoHV-5
Camila da Silva Frade
Médica Veterinária
ARAÇATUBA – SP
2009
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE ODONTOLOGIA e CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
CÂMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO DE GAMETAS E EMBRIÕES BOVINOS
PRODUZIDOS IN VITRO APÓS EXPOSIÇÃO
EXPERIMENTAL AO BoHV-5
Camila da Silva Frade
Orientadora: Profa. Dra. Tereza Cristina Cardoso
Co-orientador: Prof. Adjunto Alicio Martins Júnior
ARAÇATUBA – SP
2009
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia – Unesp, Curso de Medicina Veterinária,
Câmpus de Araçatuba, como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal
(Medicina Veterinária Preventiva e Produção
Animal).
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
CAMILA DA SILVA FRADE – nascida em 05 de janeiro de 1982, na
cidade de Araçatuba-SP, formada em Medicina Veterinária pela Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) – Araçatuba – SP, em
2007. Possui iniciação científica na área de Microbiologia Animal e
Biotecnologia Aplicada à Reprodução Animal, ambas com bolsa FAPESP.
Apresenta seis trabalhos completos publicados em periódicos e trinta trabalhos
publicados em anais de eventos (resumo).
“O futuro pertence àqueles que
acreditam na beleza de seus sonhos”
(Elleanor Roosevelt)
DEDICATÓRIA
• Dedico este trabalho primeiramente a Deus, pois sem Ele, nada seria
possível e não estaríamos aqui reunidos, desfrutando juntos, deste
momento tão importante.
• Aos meus pais, Marcos e Marina, ao meu irmão Marcos Júnior e ao meu
esposo Marcelo, que de maneira especial contribuíram para realização
deste sonho.
• Aos meus amigos, pelo apoio, motivação e alegrias.
• Dedico àqueles que me ajudaram, direta e indiretamente, na construção
deste trabalho.
• E ainda dedico este trabalho a todos aqueles que acreditam que a
ousadia e o erro são caminhos para as grandes realizações.
AGRADECIMENTOS
• A Professora Assistente Doutora TEREZA CRISTINA CARDOSO, pela
orientação, confiança, exemplo como pesquisadora, capacidade de
orientação e incentivo em todos os momentos. Sem a sua
disponibilidade e esforço eu não teria atingido este objetivo. Além disso,
agradeço pela amizade conquistada neste período;
• Ao Professor Adjunto ALICIO MARTINS JÚNIOR, pelos ensinamentos e
pela atenção dedicada a minha formação profissional, além de todo
apoio e amizade;
• Ao Curso de Pós-graduação em Ciência Animal do Curso de Medicina
Veterinária da UNESP – Câmpus de Araçatuba pela aceitação do meu
nome como aluna regular no Mestrado, e por tornar real mais uma
conquista;
• Aos amigos que fiz junto ao Laboratório de Virologia do Curso de
Medicina Veterinária da FOA – UNESP – Câmpus de Araçatuba:
Deriane Elias Gomes, Gilmara Castilho, Ana Carolina Guedes Rosa,
Heitor Ferrari, Rodrigo Lopes e a todos os alunos de iniciação científica;
• Aos amigos que fiz junto ao Laboratório de Biotecnologia da Reprodução
Animal do Curso de Medicina Veterinária da FOA – UNESP – Câmpus
de Araçatuba: Ana Carolina Borsanelli, Heloise Paulo Pazian, Margareth
(Margô), Martha Pato, Renata Sanches Calegari, José Antônio Tanajura
Neto e Diego Gouvêa Souza;
• Aos funcionários da seção de pós-graduação da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba, UNESP, Câmpus de Araçatuba: Diogo e
Valéria;
• Aos professores (Maria Cecília Rui Luvizotto, Alexandre Lima de
Andrade, Roberto Gameiro e Sílvia Helena Venturolli) e a todos os
amigos do Programa de Pós-graduação pelo convívio, amizade e
carinho;
• Aos funcionários do Curso de Medicina Veterinária da FOA – UNESP –
Câmpus de Araçatuba: Elza Branco, Isabel Pereira, Fátima Maria
Berttoluci e Valdemar (in memoria);
• À FAPESP pelo apoio financeiro (processo: 2007/57774-7).
SUMÁRIO
Página
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS .................................................... 5
1. Exposição de oócitos, espermatozóides e embriões bovinos produzidos in
vitro pelo BoHV-5 ............................................................................................... 5
2. Conceitos sobre os marcadores pro e anti-apoptose ............................... 11
2.1. TUNEL .............................................................................................. 11
2.2. Anexina-V ......................................................................................... 12
2.3. Caspase-2 e -3 ................................................................................. 12
2.4. Bcl-2 .................................................................................................. 13
3. Referências ............................................................................................... 14
CAPÍTULO 2 .................................................................................................... 22
Resumo ......................................................................................................... 22
Summary ....................................................................................................... 23
2.1. Introdução .............................................................................................. 24
2.2. Material e Métodos ................................................................................ 25
2.2.1. Titulação Viral ................................................................................ 26
2.2.2. Experimento I ................................................................................. 26
2.2.3. Experimento II ................................................................................ 28
2.2.4. Experimento III ............................................................................... 28
2.2.5. Detecção do vírus .......................................................................... 29
2.2.6. Reação em Cadeia da Polimerase ................................................ 29
2.2.7. Hibridização in situ ......................................................................... 31
2.2.8. Análise estatística .......................................................................... 33
2.3. Resultados ............................................................................................. 33
2.3.1. Exposição Experimental com BoHV-5 ........................................... 33
2.3.2. Desenvolvimento e produção in vitro de embriões ........................ 36
2.4. Discussão .............................................................................................. 39
2.5. Conclusão .............................................................................................. 42
2.6. Referências ............................................................................................ 43
CAPÍTULO 3 .................................................................................................... 48
Resumo ......................................................................................................... 48
Página
Summary .......................................................................................................... 49
3.1. Introdução .............................................................................................. 50
3.2. Material e Métodos ................................................................................ 52
3.2.1. Titulação Viral ................................................................................ 52
3.2.2. Experimento I ................................................................................. 53
3.2.3. Experimento II ................................................................................ 53
3.2.4. Experimento III ............................................................................... 55
3.2.5. Teste de TUNEL ............................................................................ 56
3.2.6. Imunofluorescência Indireta para Anexina-V, caspases e Bcl-2 .... 56
3.2.7. Semi quantificação e análise dos dados ........................................ 57
3.3. Resultados ............................................................................................. 58
3.4. Discussão .............................................................................................. 60
3.5. Conclusão .............................................................................................. 63
3.6. Referências ............................................................................................ 63
APÊNDICES .................................................................................................... 69
ABREVIATURAS
ANOVA – análise de variância
BoHV-5 – Herpesvirus bovino tipo 5
BoHV-1 – Herpesvirus bovino tipo 1
BSA – albumina sérica bovina
BVDV – vírus da diarréia viral bovina
CIV – cultivo in vitro
COC – complexo cumulus oócitos
CO
2
– dióxido de carbono
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – ácido dexorribonucléico
FIV – fecundação in vitro
FSH – hormônio folículo estimulante
gC – glicoproteína C
HIV – vírus da imunodeficiência humana
IETS – International Embryo Transfer Society
IP – iodeto de propídio
ISH – hibridização in situ
LH – hormônio luteinizante
MDBK – Madin Darby bovine kidney
MEM – minimum essential medium
MgCl
2
– cloreto de magnésio
MIV – maturação in vitro
MM – meio de maturação
pb – pares de base
PBS – tampão fosfato salina
PCR – reação em cadeia da polimerase
PHE – penicilamina, hipotaurina e epinefrina
PIV – produção in vitro
PS - fosfatidilserina
PVA – álcool polivinílico
RNA – ácido ribonucléico
SFB – soro fetal bovino
SOF – synthetic oviduct fluid
SPTZ – espermatozóide
SSC – solução citrato salina
TALP – Tyrode albumina lactato e piruvato
TBE – tampão tris, ácido bórico e EDTA
TCID – tissue culture infective dose
TCM – tissue culture medium
TE – transferência de embriões
ZP – zona pelúcida
w/v – weight/volume (peso/volume)
AVALIAÇÃO DE GAMETAS E EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN
VITRO APÓS EXPOSIÇÃO EXPERIMENTAL AO BoHV-5
RESUMO – A produção in vitro (PIV) de embriões e a transferência de
embriões (TE) tratam-se de biotecnologias da reprodução, as quais são
rotineiramente aplicadas no melhoramento genético da espécie bovina. No
entanto, resta determinar até que ponto sua utilização implica na disseminação
de patógenos no rebanho. A fim de elucidar a possibilidade de transmissão do
BoHV-5 através de células germinativas e/ou embriões, após exposição
experimental in vitro, uma série de 3 experimentos foram realizados. Estes
consistiram na exposição de oócitos, espermatozóides e embriões bovinos ao
BoHV-5, tendo como critério de avaliação o desenvolvimento embrionário, bem
como a detecção do vírus através de emprego da técnica de hibridização in situ
(ISH) e PCR, além da apoptose, determinada pelo teste de TUNEL e pela
imunomarcação dos fatores pro-apoptóticos (anexina-V, caspase-2 e -3) e anti-
apoptóticos (BCl-2). O experimento I foi realizado durante o período de
maturação oocitária, sendo dividido em I (controle + 10% SFB), II (vírus + 10%
SFB; BoHV-SFB) e III (vírus + 1 mg/mL PVA; BoHV-PVA); o experimento II foi
realizado na etapa de fertilização, sendo dividido em I (controle) e II (exposto;
BoHV-SPTZ); e o experimento III foi feito no período de cultura embrionária,
sendo dividido em I (controle) e II (exposto; BoHV-PZ). A análise estatística
para os resultados de desenvolvimento embrionário será feita pela ANOVA e
teste-t de Bonferroni para os dados dos oócitos infectados e pelo teste t não
pareado para os resultados de espermatozóides e embriões infectados, já para
a análise da apoptose e marcadores apoptóticos será empregado o teste de
Kruskal-Wallis e Dunn, diferenças serão consideradas significativas quando
p<0,05.
Palavras-Chave: Apoptose, BoHV-5, embriões, ISH e PCR
AVALIATION OF BOVINE GAMETES AND EMBRYOS IN VITRO
PRODUCED AFTER EXPERIMENTAL EXPOSURE TO BoHV-5
SUMMARY – The in vitro production (IVP) of embryos and embryo
transfer (ET) are reproduction biotechnologies, which are routinely applied in
breeding bovine. However, it remains to determine if these techniques can
promote spread of pathogens in the herd. In order to elucidate the possibility of
transmission of BoHV-5 by germ cells and/or embryos after in vitro experimental
exposure, a total of 3 experiments were performed. These consisted of
exposure of oocytes, sperm and embryos to BoHV-5, with the evaluation
embryonic development, and detection of the virus through use of the technique
of in situ hybridization (ISH) and PCR, in addition to apoptosis, determined by
TUNEL test and by immunostaining of the factors pro-apoptotic (annexin-V,
caspase-2 and -3) and anti-apoptotic (Bcl-2). The first experiment was
conducted during the period of oocyte maturation and was divided into I (control
+ 10% FBS), II (virus + 10% fetal calf serum; BoHV-SFB) and III (virus + 1 mg /
ml PVA, BoHV-PVA ), the second trial was conducted at the stage of
fertilization, was divided into I (control) and II (exposure, BoHV-SPTZ), and
experiment III was done during the growing stage, and divided into I (control)
and II (exposure; BoHV-PZ). Statistical analysis for the results of embryo
development will be made by ANOVA and Bonferroni-t test to the data from
exposed oocytes and the unpaired t test for the results of sperm and embryos
exposed, as for the analysis of apoptosis will be used the Kruskal-Wallis and
Dunn, differences are considered significant when p <0.05.
Keywords: Apoptosis, BoHV-5, embryos, ISH e PCR
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. EXPOSIÇÃO DE OÓCITOS, ESPERMATOZÓIDES E EMBRIÕES
BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO AO BoHV-5
A produção in vitro (PIV) de embriões e a transferência de embriões (TE)
são biotécnicas de reprodução artificial comumente utilizadas no melhoramento
genético de bovinos. Porém, ainda permanece incerto até que ponto a
aplicação das mesmas pode influenciar na disseminação de patógenos no
rebanho. Todavia, quando monitoradas corretamente, podem ser empregadas
para prevenir a propagação de agentes infecciosos, embora, não representem
uma rota natural para a transmissão de doenças (GARD et al., 2007).
A garantia de segurança sanitária no comércio de embriões bovinos é
importante para aumentar o número de exportações e importações, e minimizar
a ocorrência de surtos de doenças ou até mesmo a introdução de uma nova
enfermidade no rebanho.
A Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS)
apresentou dados de 2003, mostrando que, aproximadamente 694.000
embriões bovinos produzidos in vivo foram transferidos para receptoras em
todo o mundo. Além disso, cerca de 331.000 embriões bovinos foram obtidos
através da PIV (THIBIER, 2004).
O uso de embriões tornou-se amplamente aceito como um meio seguro,
eficiente e prático para o deslocamento de germoplasma. Entretanto, os
procedimentos de TE e de PIV de embriões podem facilitar a disseminação de
alguns patógenos, os quais podem ser transmitidos ocasionalmente pelo
sêmen ou embriões (GARD et al., 2007).
Portanto, há a necessidade de protocolos eficientes para a PIV de
embriões bovinos que, além de favorecer a sanidade do rebanho, ofereçam
resultados satisfatórios, taxas constantes de produção embrionária e produtos
saudáveis (SILVA, 2005).
O primeiro vírus considerado pela IETS (1998) como de ocorrência em
oócitos e embriões de zona pelúcida intacta, é o vírus da Diarréia Viral Bovina
(BVDV). Além disso, muitos patógenos têm sido relatados no sêmen de
bovinos e de outros animais domésticos (AFSHAR et al., 1990; PHILPOTT,
1993; EAGLESOME et al., 1997).
Considerando que a PIV de embriões é também realizada a partir de
oócitos bovinos colhidos de animais de abatedouros com controle sanitário
desconhecido, fica evidente o risco potencial de transmissão de patógenos
como o Herpesvirus bovino tipo 1 (D’ANGELO et al., 2002). Porém,
comercialmente, os oócitos recuperados são de doadoras com sanidade
comprovada, o que dificulta a disseminação de agentes infecciosos. O risco de
transmissão de doenças deve-se, provavelmente, aos produtos de origem
animal que são utilizados no processo de produção in vitro de embriões
(SILVA, 2005), além da manipulação indiscriminada dos gametas e embriões.
Alguns vírus como o BoHV-1 e o BVDV podem estar presentes no soro
(KNIAZEFF et al., 1975), fluido folicular (STRINGFELLOW e GIVENS, 2000a)
ou células da granulosa de oócitos bovinos (BIELANSKI et al., 1997), assim
como nas células do oviduto (GIVENS et al. 2002), indicando que animais
infectados tem um potencial em transmitir a doença (BIELANSKI e DUBUC,
1994).
Esses relatos servem para destacar à necessidade de considerar o
material de origem animal empregado na fecundação in vitro (FIV) e TE, bem
como a saúde do touro, da doadora, dos embriões e receptoras quando se
deseja produzir embriões livres de patógenos.
A PIV de embriões bovinos requer que o sistema e seus componentes
estejam livres de doenças específicas e que garantam uma elevada
porcentagem de produção embrionária com resultados repetíveis. O uso de
macromoléculas não protéicas, especialmente do álcool polivinílico (PVA), tem
sido discutido, a fim de eliminar o uso de produtos de origem animal nos meios
de cultura in vitro (CIV) de embriões, os quais representam uma ameaça
quanto a disseminação de patógenos. Segundo Seidel et al. (1990) e Nowshari
e Brem (2000) o PVA pode substituir o soro fetal bovino (SFB) nos protocolos
de PIV.
Além do BVDV e BoHV-1, há também uma preocupação com a possível
transmissão do BoHV-5, devido sua grande similaridade genômica com o
BoHV-1, observada por Abdelmagid et al. (1995); dessa forma, é possível que
o BoHV-5, após a reativação viral, tenha tropismo pelo aparelho genital,
levando a comprometimentos na esfera reprodutiva, assim como observado
para o BoHV-1. Dessa maneira, o desenvolvimento de experimentos usando o
BoHV-5 pode elucidar a susceptibilidade do aparelho reprodutor de bovinos ao
vírus.
O BoHV-5, vírus DNA de dupla fita, membro da família Herpesviridae e
subfamília Alphaherpesvirinae, é o agente etiológico da meningoencefalite nos
bovinos (RISSI et al., 2007), o qual causa perdas econômicas significantes
para o gado de corte no sul da América (CARDOSO et al., 2007). Essa
enfermidade é de curso geralmente fatal e afeta principalmente animais jovens
(LOVATO, 1998; ROEHE et al., 1998).
Recentemente, o BoHV-5 foi classificado como a segunda maior causa
de encefalite letal, em bovinos (SANCHES et al., 2000), com tendência a ser
reativado da latência, após uma situação de estresse, incluindo infecções por
outros agentes etiológicos (OSÓRIO, 1998). A infecção causada pelo BoHV-5
tem sido descrita na Argentina (CARILLO et al., 1983), Brasil (WEIBLEIN et al.,
1989), Austrália (STUDDERT, 1989), Estados Unidos (D’OFFAY et al., 1993) e
Hungria (ABDELMAGID et al., 1995).
Os genomas do BoHV-1 e BoHV-5 apresentam uma homologia de
aproximadamente 85%, de acordo com testes de cruzamento-hibridização do
genoma completo (ABDELMAGID et al., 1995; ENGELHARDT e KEIL, 1996).
Ambos BoHV-5 e BoHV-1 são vírus neurotrópicos que estabelecem latência no
gânglio trigeminal (CHOWDHURY et al., 2000).
Em bovinos, o BoHV-1 causa uma variedade de problemas respiratórios
e reprodutivos (vulvovaginites, endometrites, aborto e balanopostite). Em
touros, o vírus geralmente replica na mucosa do prepúcio, pênis e uretra. O
sêmen é provavelmente contaminado pelo vírus presente na mucosa durante a
ejaculação (WRATHALL et al., 2006).
O BoHV-5, o qual é potencialmente neuropatogênico, foi detectado em
amostras de sêmen de animais infectados com BoHV-5 sem sintomatologia
clínica, usando o sistema “nested polimerase chain reaction” (nested - PCR),
amplificando o gene US4, diretamente e após o isolamento em cultura de
células (GOMES et al., 2003).
Segundo Gomes et al. (2003) não há nenhuma correlação entre o título
de anticorpos e a excreção de BoHV-5 no sêmen. Alguns autores têm relatado
a detecção do BoHV-1 em amostras de sêmen de touros soronegativos
(PARSONSON e SNOWDON, 1975; KUPFERSCHMIED et al., 1986).
O BoHV-5 foi isolado em fetos abortados (SCHUDEL et al., 1986), em
amostras de sêmen frescas (ESTEVES et al., 2003) e em amostras de sêmen
congeladas (KIRKLAND et al., 2009), sugerindo que o BoHV-5 pode estar
associado a enfermidades reprodutivas, assim como o BoHV-1 (GOMES et al.,
2003).
Diversos autores têm relatado a presença do BoHV-1 no sêmen bovino,
empregando a técnica de PCR, mas a detecção do BoHV-5 foi descrita pela
primeira vez por Gomes et al. (2003). Sendo assim, a infecção experimental
com BoHV-5 em sêmen, oócitos e embriões bovinos pode determinar a
susceptibilidade destes ao vírus e, talvez, medidas profiláticas possam ser
tomadas, além de verificar se o vírus causa danos no desenvolvimento
embrionário.
Apesar do grande número de embriões bovinos, oriundos de TE, que
são transferidos anualmente, em todo o mundo, somente dois pesquisadores
demonstraram a transmissão do BVDV através dessa técnica (LINDBERG et
al., 2000; DREW et al., 2002), constatando a escassez de literatura sobre o
assunto. Em ambos os relatos, o uso de soro fetal bovino contaminado foi
mencionado como possível origem do vírus.
Nussbaum et al. (1993) concluíram que, espermatozóides podem
facilmente servir como carreadores de genes virais, especialmente de vírus
envelopados como os Herpesvírus. Além disso, Bacceti et al. (1994)
encontraram partículas virais do vírus da imunodeficiência adquirida humana
(HIV) em zigotos humanos, morfologicamente similares às visualizadas nos
espermatozóides. Concluíram que, o vírus foi carreado pelos espermatozóides
infectados para dentro dos oócitos durante a fertilização. Segundo Wrathall et
al. (2006), o carreamento de vírus pela zona pelúcida de oócitos, através da
fecundação in vitro, nunca foi descrito na espécie bovina.
Vanroose et al. (2000) estudaram os poros externos da zona pelúcida e
mostraram que estes são largos o suficiente para permitir a entrada do BoHV-1
(180 – 200 nm). Também observaram em alguns zigotos fertilizados, a
formação de escavações e fissuras na zona pelúcida com dimensão exata da
cabeça espermática, podendo proporcionar um ponto de entrada para o vírus
no momento da fecundação. Nesse local o vírus encontra-se protegido contra
eventuais medidas sanitárias, como por exemplo, lavagens e tratamento com
tripsina (KUBOVICOVA, 2008).
Dessa maneira, a tripsina não é suficiente para remover o BoHV-1 do
embrião (BIELANSKI e DUBUC, 1994; BIELANSKI et al., 1997; D’ANGELO et
al., 2002; EDENS et al., 2003; D’ANGELO et al., 2008) sugerindo uma
interação entre o vírus e o embrião. Segundo Gillespie et al. (1990) o BoHV-1
adere ao embrião após exposição artificial. Sendo assim, o embrião pode
funcionar como vetor na transmissão de patógenos.
O risco de introduzir agentes infecciosos na PIV de embriões é fato.
Lavagens e tratamentos com tripsina são utilizados de maneira empírica e
seguem o mesmo protocolo utilizado para os embriões produzidos in vivo, que
não são efetivos para os embriões produzidos in vitro (STRINGFELLOW e
GIVENS, 2000b), levando à redução na taxa de prenhez, após a TE (IETS,
1998).
Como descrito por Bielanski no artigo 3 do manual da IETS (1998), os
embriões de PIV apresentam maior susceptibilidade a infecções virais quando
comparados com os embriões produzidos in vivo. Bielanski et al. (1997)
concluíram que, comparado com os embriões obtidos in vivo, os embriões PIV
possuem uma maior tendência a carrear o BoHV-1, após exposição
experimental ao vírus, sendo mais difícil de removê-los por meio do protocolo
de tratamento com tripsina recomendado pela IETS (1998).
Guerin et al. (1990) estudaram o efeito do BoHV-1 em grupos de oócitos
que foram expostos ao vírus durante a maturação e fecundação. O vírus
parece não ter efeito na maturação dos oócitos, porém reduziu
significativamente a taxa de fecundação. Os autores concluíram que o BoHV-1
não somente foi adsorvido ao gameta como também prejudicou sua habilidade
de fecundar o oócito, possivelmente devido ao fato de alterar a penetração
espermática ou afetar o mecanismo de interação intracelular de fusão.
Segundo Bielanski e Dubuc (1994) a proporção de blastocistos
morfologicamente normais foi reduzida quando esses foram produzidos no
sistema de PIV, infectado com BoHV-1. Assim como, Makarevich (2007)
observou comprometimento no desenvolvimento embrionário pré-implantação
após exposição ao BoHV-1 e ele conclui que a conseqüência da infecção viral
na viabilidade dos embriões pode depender do título viral.
Os embriões com zona pelúcida intacta foram protegidos contra a
exposição, contudo, os blastocistos expandidos, expostos ao BoHV-1,
apresentaram antígenos virais em aproximadamente 13% de suas células e
tornaram-se degenerados (VANROOSE et al., 1996). Em outro estudo,
Vanroose et al. (1999) encontraram taxas de clivagem e de formação de
blastocistos significativamente reduzidas, após a exposição ao vírus durante a
etapa de FIV.
Vanroose et al. (2000) usaram espermatozóides previamente incubados
com BoHV-1 na FIV, encontrando uma redução de até 60% no número de
espermatozóides aderidos na ZP, quando comparada ao grupo controle (sem
exposição ao vírus).
Gomes et al. (2003) e Schudel et al. (1986) demonstraram que o BoHV-5
também pode comprometer o aparelho reprodutor, semelhante ao BoHV-1.
É fato que embriões livres de patógenos podem ser produzidos; porém,
não estão estabelecidos os melhores métodos que podem prover tal condição.
Segundo a IETS (1998), são necessárias mais pesquisas sobre a interação de
patógenos com oócitos fecundados in vitro.
Com base na literatura, constata-se uma escassez de trabalhos
direcionados para a pesquisa da transmissão viral, in vitro, em oócitos,
espermatozóides e embriões bovinos, bem como da inexistência de relatos
dessa forma de disseminação quando o agente viral é o Herpesvirus bovino
tipo 5.
Dessa forma, o presente estudo foi delineado com o objetivo de buscar
informações a respeito da susceptibilidade de gametas e embriões produzidos
in vitro, na expectativa de comprovar a possibilidade de propagação desse
agente viral, in vitro, além de procurar elucidar a forma de interação com os
gametas e/ou embriões. Os resultados, independentemente da comprovação
de transmissão e/ou de danos causados pelo vírus citado, podem trazer
significativa contribuição para a área de TE e PIV de embriões.
A hipótese de trabalho é que oócitos, espermatozóides e prováveis
zigotos expostos ao BoHV-5 diminui a produção in vitro de embriões bovinos,
além de interferir no processo de apoptose acelerando a morte celular.
2. CONCEITOS SOBRE OS MARCADORES PRO E ANTI-APOPTOSE
2.1 Técnica de TUNEL
A apoptose é um processo fisiológico ativo da condensação da
cromatina, redução do volume celular e formação de vesículas na membrana
denominadas de corpos apoptóticos, tendo como resultado a fragmentação e
eliminação da célula (SCHWARTZMAN E CIDLOWSKI, 1993).
A apoptose envolve dois mecanismos: intrínseco, dependente da
mitocôndria, sendo iniciada por sinais intracelulares pro-apoptóticos levando a
liberação do citocromo c e ativação das caspases, e extrínsico, que ocorre
ligação receptor-ligante levando à ativação das caspases (Figura 1).
Considerando a grande complexidade do processo de apoptose, não é
possível determinar o grau de apoptose das células utilizando apenas um único
teste, portanto, foram utilizados outros quatros marcadores de apoptose
mencionados a seguir, a fim de melhor elucidar o estudo da apoptose.
A técnica de TUNEL detecta a fragmentação de DNA das células
apoptóticas por meio de rupturas do DNA, expondo um grande número de
hidroxila final 3’. Estes grupos de hidroxila servem de terminais iniciadores
para a deoxinucleotídeo transferase (TdT), a qual adiciona
deoxiribonucleotídeos. Posteriormente, a BrdUTP marca os sítios de quebra do
DNA, sendo detectada com o uso de anticorpo anti-BrdU por meio do Alexa
Flúor
®
488 dye conjugado ao anticorpo anti-BrdU, visualizando a reação em
microscopia de fluorescência.
2.2 Anexina-V
A Anexina-V pertence a uma classe de proteínas dependentes de Ca
2+
,
mostrando estar envolvida na exocitose, inibição da proteína quinase C e na
atividade dos canais de cálcio. Todas essas funções estão relacionadas com a
habilidade da anexina ligar-se a fosfolipídios ácidos. A Anexina-V tem
afinidade pela fosfatidilserina, normalmente este fosfolipídeo se encontra na
parte interna da membrana citoplasmática. Durante o estágio de apoptose
inicial a fosfatidilserina é translocada da parte interna para externa da
membrana, levando a exposição deste fosfolipídeo, o qual pode ser
reconhecido pela Anexina-V (HAYES et al., 2004), tal processo caracteriza a
perda da simetria da membrana.
2.3 Caspase-2 e 3
As caspases são proteases cisteínas as quais são essenciais no
processo de apoptose. Elas são sintetizadas como precursores inativos e
podem ser caracterizadas como iniciadoras ou efetoras da cascata das
caspases (TORNBERRY E LAZEBNIK, 1998). As iniciadoras (caspase-2, 8, 9 e
10) clivam as caspases efetoras inativas, ativando-as. Em contraste, as
efetoras (caspase-3, 6 e 7) desencadeiam o mecanismo de apoptose, clivando
substratos que são essenciais para função e estrutura da célula, levando a
mudanças morfológicas e morte das células.
A procaspase 2 está localizada na mitocôndria e é liberada no citosol
após ativação por vários estímulos fisiológicos e patológicos. A procaspase 3 é
uma proteína citosólica (EARNSHAW et al., 1999).
2.4 Bcl-2
O regulador da morte celular nos mamíferos é o protooncôgene Bcl-2, a
expressão do gene Bcl-2 tem como função proteger as células da morte
prevenindo ou impedindo o processo de apoptose. O Bcl-2 é uma proteína
localizada na membrana externa da mitocôndria e essencial na regulação da
liberação da citocromo c (YANG et al., 1997). Uma vez liberada, a citocromo c
ativa os efetores da apoptose (caspases).
Figura 1. Representação esquemática do mecanismo de apoptose: extrínseco
e intrínseco.
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CAPÍTULO 2 - ARTIGO
Estudos In Vitro Sobre a Interação de Gametas e Embriões Bovinos
Expostos Experimentalmente ao BoHV-5
RESUMO - O Herpesvirus bovino pode estar associado a distúrbios
reprodutivos. O Tipo 1 (BoHV-1) é a espécie mais estudado. Embora o tipo 5
tenha sido detectado em fetos abortados e sêmen bovino, nenhum relato
comprovou a presença do vírus em gametas e embriões. Este estudo foi
dividido em três experimentos, os quais avaliaram: I) oócitos expostos
experimentamente ao BoHV-5 (em meio contendo SFB ou PVA) fecundados
por espermatozóides livre de vírus; II) oócitos fecundados por espermatozóides
expostos ao BoHV-5; e III) prováveis zigotos expostos ao BoHV-5. A presença
do BoHV-5 foi detectada pela PCR e hibridização in situ, e a capacidade de
fecundação e desenvolvimento embrionário foi avaliada utilizando o
procedimento de cultivo in vitro (CIV). A exposição experimental foi detectada
em todos os experimentos e, a transmissão vertical do BoHV-5 pelos gametas
foi confirmada, já que a exposição realizada nos oócitos e espermatozóides
produziu embriões com presença de vírus. A taxa de fecundação foi reduzida
(9,5%) no grupo de oócitos expostos ao vírus em meio contendo SFB
(Bonferroni teste-t, P<0,05), mas a produção de embriões resultantes deste
grupo foi semelhante aos demais (Bonferroni teste-t, P>0,05). A exposição dos
gametas ao BoHV-5 não comprometeu o desenvolvimento embrionário, já
prováveis zigotos expostos ao vírus no 1°dia pós-fecundação produziram um
menor (11,4%) número de embriões (Student t-test, P<0,05). Estes resultados
sugerem que o BoHV-5 pode interagir com gametas e prováveis zigotos e, que
pode ocorre a propagação do vírus para o embrião durante o desenvolvimento
in vitro.
Palavras-chave: bovino, embriões, Herpesvirus, hibridização in situ e PCR
In Vitro Studies About Bovine Gametas and Embryos Interaction
Experimentally Exposed to BoHV-5
SUMMARY - Bovine Herpesviruses may be associated to reproductive
disorders. Type 1 (BoHV-1) is the most studied strain. Although the type 5 strain
has been detected in bull semen and aborted fetuses, it has not been found in
gametes and embryos. This study consisted of three experiments that
evaluated: I) BoHV-5-exposed oocytes (in medium with FBS or PVA) fertilized
by normal sperm; II) normal oocytes fertilized by BoHV-5-exposed sperm; and
III) exposition of presumptive zygotes by BoHV-5. BoHV-5 exposition was
detected by PCR and in situ hybridization assay, and fertilization capacity and
embryonic development was assessed using the in vitro culture procedure.
Experimentally induced exposition was obtained in all experiments, and vertical
transmission of BoHV-5 by the gametes was confirmed, the oocytes and
spermatozoa exposed to BoHV-5 produced embryos with presence of virus.
The fertilization rate was reduced (9,5%) only in oocytes exposeed in FBS
medium (Bonferroni t-test, P<0.05), but the resulting embryo production of this
group was similar to the others (Bonferroni t-test, P>0.05). The development of
embryos exposed by any of the gametes was not compromised, but
presumptive zygotes directly exposed on day 1 post-fertilization produced a
lower (11,4%) number of embryos in vitro (Student t-test, P<0.05). These
results show that BoHV-5 can interact gametes and presumptive zygotes, and
then the virus can be transmitted to the embryo during in vitro development.
Keywords: bovine, embryos, Herpesvirus, in situ hybridization and PCR
2.1 Introdução
O Herpesvirus bovino é um patógeno que acomete a espécie bovina,
podendo presente em animais aparentemente sadios. Existem três tipos
conhecidos de Herpesvirus bovino (BoHV-1, 4 e 5), que estão associados a
distúrbios reprodutivos (SMITH, 1997). O BoHV-1 é o mais investigado, tendo
grande impacto econômico na pecuária (MUYLKENS et al., 2007; WRATHALL
et al., 2006). Sua ocorrência foi relacionada a rinotraqueíte infecciosa bovina,
endometrite, aborto, vulvovaginite pustulosa infecciosa, balanopostite, e a
infecção sistêmica em neonatos. Animais acometidos que sobrevivem ao
Herpesvirus, e não apresentam sintomas clínicos da doença, albergam o vírus
de forma latente nos gânglios sensoriais do sistema nervoso (WRATHALL et
al., 2006).
Oócitos, espermatozóides e embriões bovinos produzidos in vitro
representam um risco potencial de transmissão do BoHV-1, visto que, o vírus
pode ser carreado por animais clinicamente sadios (WRENZYCKY et al., 2007).
O BoHV-1 pode ser encontrado no líquido folicular e em células epiteliais de
oviduto bovino (D’ANGELO et al., 2009). Nos machos, o vírus pode ser liberado
no sêmen após reativação viral, desencadeada por fatores estressantes (VAN
WAGTENDONK-DE LEEUW et al., 2000), tais como: transporte, vacinação,
variações de temperatura, entre outros. O vírus replica inicialmente na mucosa
do prepúcio, pênis e uretra. Desta forma, o vírus presente nas mucosas
infectadas contamina o sêmen no momento da ejaculação (MUYLKENS et al.,
2007; WRENZYCKI et al., 2007). Embriões também podem ser infectados pelo
BoHV-1 através dos componentes de origem animal presentes nos meios
utilizados para produção in vitro (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al.,
2000). O soro fetal bovino (SFB), comumente utilizado na PIV de embriões,
pode ser responsável por carrear fungos, bactérias e vírus (CARDOSO et al.,
2005; MAKOSCHEY et al., 2002), para os meios em que é utilizado. Por esta
razão, o PVA é uma alternativa sintética para substituir o SFB, já que ambos
são macromoléculas, no entanto o PVA apresenta menor possibilidade de
contaminação (NOWSHARI e BREM, 2000; MERTEN et al., 1999).
O BoHV-5 e o BoHV-1, são alfa-herpesvirus, e apresentam 85% de
similaridade genômica (CHOWDHURY, 1995). Assim, apesar das escassas
informações disponíveis a respeito do BoHV-5 relacionado com o sistema
reprodutivo, supõe-se que, após a reativação e replicação viral o mesmo possa
causar distúrbios reprodutivos em bovinos. O BoHV-5 é o agente causador da
segunda mais importante doença infecciosa cerebral, denominada de encefalite
herpética, a qual afeta o rebanho bovino na América Latina. O vírus é
caracterizado por uma rápida replicação lítica em cultura de células e, como
BoHV-1, estabelece latência nos gânglios sensoriais do sistema nervoso do
hospedeiro (RISSI et al., 2007). O BoHV-5 foi detectado no sêmen bovino
(GOMES et al., 2003; KIRKLAND et al., 2009) e em fetos abortados, mas
nenhum relato menciona sua presença em gametas e embriões bovino.
O presente estudo tem como objetivo investigar se há interação entre
oócitos, espermatozóides e/ou zigotos bovinos com o BoHV-5, como também
avaliar os efeitos da propagação do vírus durante o desenvolvimento
embrionário.
2.2 Material e Métodos
O delineamento experimental incluiu gametas e zigotos bovinos
expostos experimentalmente ao BoHV-5, e subseqüente detecção do DNA viral
pelo uso da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização in
situ (ISH), bem como avaliação da taxa de fecundação e o desenvolvimento
embrionário in vitro. No Experimento I, oócitos expostos ao vírus foram
fecundados com espermatozóides livre do vírus e no Experimento II oócitos
sadios foram fecundados com espermatozóides contaminados com BoHV-5. O
Experimento III testou a exposição pelo BoHV-5 nos prováveis zigotos.
2.2.1 Titulação Viral
Amostras do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), isoladas de bovinos
acometidos pela infecção na região de Araçatuba, São Paulo, Brasil, em 2007
(FERRARI et al., 2007) foi propagado em células “Madin Darby Bovine Kidney”
(MDBK, ATCC) e cultivado em “minimum essential medium” (MEM). A dose
infectante da cultura de tecidos por 50 µL (TCID
50
) da amostra de vírus foi
determinada pela técnica de neutralização em células MDBK (CARDOSO et
al., 2007). Alíquotas da amostra viral (100 µL), com 10
3,3
TCID
50
/50µL foram
mantidas em freezer a -86°C até o uso.
2.2.2 Experimento I
O Experimento I objetivou avaliar os efeitos da exposição de oócitos
bovinos pelo BoHV-5 na produção in vitro de embriões. Os oócitos utilizados
foram obtidos a partir de ovários de animais mestiços abatidos no frigorífico
Brasfrigo. Os ovários foram transportados para o laboratório no prazo de 1 h
post mortem em solução fisiológica a 37ºC. Os complexos cumulus-oócito
(COC) foram recuperados por aspiração dos folículos com diâmetro de 2-6 mm.
Apenas os COC que apresentavam 3 a 4 camadas ou mais de células cumulus
compacta e citoplasma homogêneo, foram selecionados. Estes foram divididos
em gotas com 15 a 20 oócitos para serem utilizados nos experimentos.
Os oócitos (n = 542) foram distribuídos equitativamente em três grupos,
sendo: meio de maturação (MM) acrescido de SFB (controle, n = 179), MM
acrescido de SFB com BoHV-5 (BoHV-SFB, n = 185) e MM acrescido de PVA
com BoHV-5 (BoHV-PVA, n = 178).
O meio de maturação era constituído de 100 µL TCM-199 (GIBCO-BRL,
Grand Island, E.U.A.), 2,2 mg/mL de bicarbonato de sódio, 0,02 mg/mL de
piruvato de sódio, 0,05 mg/mL de sulfato de gentamicina, 0,5 mg/mL de FSH e
50 mg/mL de LH, suplementado com 10% SFB ou 1 mg/mL de PVA (cat #
P8136 Sigma-Aldrich, St. Louis, MA). As gotas de maturação eram cobertas
com óleo mineral e levadas para estufa de CO
2
por 2 horas antes de receber
os oócitos para a estabilização do meio com relação à temperatura e pH.
Os oócitos dos grupos BoHV-SFB e BoHV-PVA foram expostos
experimentalmente com 10 µL de BoHV-5 (FERRARI et al., 2007), sendo estes
co-incubado por 1 h a 39°C e 5% de CO
2
em ar. Em seguida, os oócitos foram
lavados sequencialmente em MM por três vezes e, posteriormente, transferidos
para gotas de MM livre de vírus, a fim de prosseguirem o desenvolvimento in
vitro. O grupo controle foi submetido ao mesmo protocolo, exceto à exposição
ao BoHV-5. Após 24 h de maturação, os oócitos foram transferidos para gotas
contendo meio de fertilização in vitro (FIV).
As doses de sêmen (0,5 mL/dose) foram obtidas de um único touro Bos
indicus, sendo todas as amostras pertencentes à mesma partida. Antes de
iniciar os experimentos, o sêmen foi avaliado quanto à concentração,
motilidade e patologia, e observou-se 20 x 10
6
espermatozóides por dose, 60%
de movimento progressivo e 90% de espermatozóides com ausência de
patologia, apresentando-se apto para o procedimento de fertilização in vitro
(FIV).
Para a realização da FIV, uma amostra (palheta 0,5 mL) de sêmen foi
descongelada a 37ºC por 30 segundos e centrifugada em gradiente Percoll
(45% e 90%; Nutricell
®
, Campinas, Brasil) a 700 X g durante 20 min. O “pellet”
de espermatozóides resultante foi lavado em meio TALP (Tyrode albumina
lactato piruvato suplementado com 6 mg/mL de BSA) a 200 X g por 5 min. O
sedimento foi diluído em meio FIV (meio TALP suplementado com 3 mg/mL de
heparina e solução PHE: 2 mM penicilamina, 1 mM hipotaurina e 250 mM de
epinefrina, Sigma-Aldrich
®
), para obter uma concentração final de 1x10
5
espermatozóides em 100 µL de meio FIV.
Posteriormente, os oócitos e espermatozóides foram co-incubados no
meio FIV por 20 h, nas mesmas condições utilizadas para maturação in vitro
(MIV). A capacidade de fertilização foi determinada pela taxa de clivagem, e o
desenvolvimento embrionário foi avaliado pelo número de oócitos que atingiram
o estágio de mórula (Mo)/blastocisto (Bl), Bl/blastocisto expandido(Bx) e
Bl/Bx/blastocisto eclodido (Be) às 72, 144 e 168 h pós-fecundação,
respectivamente. Após a produção dos blastocistos no dia 7 pós-fecundação
(GONÇALVES et al., 2008), apenas os embriões classificados como grau 1
(excelente), 2 (bom) (ROBERTSON e NELSON, 1998) foram utilizados para a
pesquisa viral.
2.2.3 Experimento II
Para avaliar a exposição dos espermatozóides ao BoHV-5 um total de
289 oócitos foram divididos equitativamente em dois grupos para receberem
um dos seguintes tratamentos: sêmen controle (controle, n = 148) e sêmen
contaminado com BoHV-5 (BoHV-SPTZ, n = 141). A obtenção, seleção e
maturação dos oócitos, bem como o procedimento de FIV, foram realizados
segundo o Experimento I, descrito acima.
Para a exposição dos espermatozóides foram utilizadas duas palhetas
de sêmen (1 mL) sendo estas colocadas em um mesmo tubo e,
posteriormente, dividida em duas partes iguais de 0,5 mL. Todavia apenas uma
das partes da amostra foi co-incubada com 5 µL do vírus (diluição 1:10) por 1 h
à temperatura ambiente e protegida da luz. Após este período as amostras de
sêmen foram depositadas sobre o gradiente Percoll, centrifugadas e utilizadas
para fertilizar os oócitos. A taxa de fertilização e o desenvolvimento embrionário
foram avaliados como no Experimento I.
2.2.4 Experimento III
Os mesmos procedimentos utilizados no Experimento I foram
empregados neste experimento. As gotas com os prováveis zigotos (n = 327),
produzidos no dia 1 pós-fecundação foram divididas em dois grupos: ausência
vírus (controle, n = 164) e expostos ao BoHV-5 (BoHV-PZ, n = 163). O grupo
BoHV-PZ foi co-incubado com o vírus na diluição de 1:10, nas mesmas
condições utilizadas no Experimento I. Após o período de adsorção (1 h), os
prováveis zigotos foram lavados sequencialmente por três vezes em meio de
cultivo e transferidos para gotas de meio SOF (fluido sintético de oviduto) livre
de vírus, por sete dias, nas mesmas condições utilizadas para a MIV e FIV. O
desenvolvimento embrionário foi avaliado como no Experimento I e II.
2.2.5 Detecção do Vírus
A presença do BoHV-5 e BoHV-1 foi avaliada em todos os reagentes
utilizados durante o procedimento de PIV de embriões bovinos, já que estes
apresentam grande homologia.
Foram testados: soro fetal bovino (SFB, Nutricell
), hormônio folículo-
estimulante (FSH, Pluset
®
, Calier, Espanha), hormônio luteinizante (LH,
Lutropin-V
®
, Bioniche Inc., Canadá), sêmen, células (gametas e embriões) e
células MDBK pela técnica de PCR, visando o gene da glicoproteína-C como
descrito abaixo. A presença do vírus em oócitos, espermatozóides e embriões
produzidos in vitro foi determinada pela técnica de PCR e ISH.
As amostra de oócitos, sêmen e embriões foram obtidas após o período
de maturação (24 h), após realização do gradiente de Percoll e após 168 h pós-
fecundação, respectivamente.
2.2.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
O DNA dos oócitos, espermatozóides e embriões foram extraídos com
uso de Mini Kit PureLink
TM
Viral RNA/DNA (Invitrogen
TM
, cat # 12280-050),
seguindo as recomendações do fabricante (Figura 1). A reação de PCR foi
realizada utilizando o sistema GeneAmp
®
High Fidelity (Applied Biosystems,
Califórnia, E.U.A.). Resultando um volume final de 25 µL composto por 10 µL
da amostra de DNA, 2,5 µL de DMSO (dimetilsulfóxido), 10 pmol de cada
primer, 10 mM de dNTPs, 1,5 mM MgCl
2
, 2,5 µL do tampão 10X GeneAmp
®
High Fidelity e 1,0 µL da enzima GeneAmp
®
High Fidelity. O conjunto de
"primers" escolhido foi B5 específico para o BoHV-5 (5’-CGG ACG AGA CGC
CCT TGG-3’ nt 322-339) e o consenso denominado Bcon (5’-AGT GCA CGT
ACA GCG GCT CG-3’ nt 519-538) capaz de amplificar 159 bp do BoHV-5
(gene da gC).
A reação de PCR seguiu as seguintes condições:
1º. - 94°C durante 5 minutos – desnaturação inicial
2º. - 94°C durante 15 segundos
3º. - 55°C durante 30 segundos – anelamento
4º. - 68°C por 1 minuto – extensão
5º. - Extensão final a 72°C por 5 minutos
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1,2%, corado com brometo de etídio (0,5 mg/mL) em tampão TBE pH
8,4 e visualizados sob luz ultravioleta (white/ultraviolet transilluminator – UVP
®
).
As imagens do gel foram captadas pela câmara digital Canon Imagem Quant
150 - Power Shot A640 (GE) e transportadas para o “software” ADOBE 8.0.
Figura 1. Extração de DNA viral usando o PureLink
TM
Viral RNA/DNA Mini Kit.
40 ciclos
Fonte: Domínio público
2.2.7 Hibridização in situ
Para a realização da hibridização in situ, a sonda de DNA foi preparada
a partir dos produtos da PCR do gene da gC (CHOWDHURI et al., 2000) do
DNA viral (FERRARI et al., 2007). Produtos de 159 pares de base (pb) foram
produzidos pela técnica de PCR pelos “primers” senso gI + (5 `- GTG CTC TTC
TCC ATC CCG-3») e anti-senso gI-(5 `-GCG GAG GAGGAG TCG TTG G-3")
(Invitrogen
TM
, Brasil). Após a purificação do DNA em gel de agarose, o produto
da PCR foi ligado ao TA-vetor (pGEMTEasy, Promega, Madison, WI, E.U.A.) e
ligação dos produtos foi introduzida em E. coli por choque térmico. Colônias
positivas foram confirmadas pelo sequenciamento do DNA (Figura 2). A colônia
positiva foi cultivada e o DNA do plasmídio foi preparado utilizando um kit
comercialmente disponível (Promega Mini-Prep, Promega, Madison, WI,
E.U.A.). A sonda foi gerada pela reação de PCR, visando o gene da gC
localizado no plasmídio como descrito anteriormente, usando a biotina marcada
com o “primer” anti-senso (Invitrogen
TM
).
Figura 2. Representação esquemática da técnica utilizada para reprodução do
fragmento de DNA (sonda).
Para a realização da técnica de ISH os oócitos, espermatozóides e
embriões, com os respectivos meios de manutenção, foram colocados em
lâminas de vidro, pré-tratadas com poli-L-lisina pura (Sigma-Aldrich
®
) e estes
foram fixados com 4% (w/v) de paraformaldeído (Sigma -Aldrich
®
) diluído em
tampão fosfato salina (PBS) por 24 horas a 4°C. Os oócitos e embriões foram
lavados antes da fixação por três vezes em gotas contendo 500 µL de PBS.
Para iniciar o procedimento de ISH as lâminas foram tratadas com proteinase K
(10 mg/mL, Invitrogen
TM
) durante 10 minutos a temperatura ambiente e, em
seguida lavadas com PBS. A sonda denaturada de 159-pb ligada a biotina foi
diluída no volume de 2 µL (2 ng/mL) para 98 µL de tampão pré-hibridação
Fonte: Domínio público
(formamida 50%, 5% soroalbumina bovina, 1% N-lauroilsarcosina e sulfato
dodecil de sódio 0,02%) . As lâminas com a sonda foram incubadas por 12 h a
37°C, mantidas em câmara úmida. Em seguida, estas foram lavadas em
soluções de concentração decrescente: 1 x SSC (solução salina de citrato de
sódio) e 0,1 x SSC por 10 min a 42°C. O sistema de detecção consistiu de
estreptavidina conjugada à fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich
®
, cat # S2890) por
2 horas a 37°C, seguido de incubação com o substrato SIGMA FAST
TM
(Fast
Red TR/Napthol AS-MX fosfatase alcalina, cat # F4648) por 20 minutos em
temperatura ambiente. As lâminas foram cobertas com lamínulas usando
glicerol em solução tamponada (pH 7.0) e foram analisadas em microscopia
óptica.
2.2.8 Análise Estatística
As variáveis estudadas são: infecção pelo BoHV-5 (variável
independente, categórica nominal) e produção in vitro de embriões bovino
(variável dependente, numérica discreta).
As taxas de fertilização e desenvolvimento embrionário foram analisadas
utilizando ANOVA e teste-t de Bonferroni para Experimento I. Para os dados do
Experimento II e III foi utilizado o teste-t de Student para amostras
independentes. P>0,05 foi considerado como diferença estatística.
2.3 Resultados
2.3.1 Exposição Experimental ao BoHV-5
O gene da gC foi amplificado pela técnica de PCR em oócitos e
embriões (Experimento I); espermatozóides e embriões (Experimento II) e
embriões (Experimento III) co-incubados com BoHV-5, sendo possível a
visualização dos produtos com 159 pb (Figura 3).
A ISH para detecção do BoHV-5 foi positiva em todos os Experimentos
(I, II e III). A presença do vírus foi evidenciada pela deposição de pigmento
vermelho nos oócitos, espermatozóides e embriões infectados. O vírus foi
detectado predominantemente nas células do cumulus e no citoplasma dos
CCO (Figura 4), ligado à membrana externa da cabeça e cauda dos
espermatozóides, (Figura 5), bem como no trofoblasto e embrioblasto (Figura 6
e 7).
A amplificação do gene e os depósitos de pigmento vermelho nas
células não foram detectados em nenhuma estrutura do grupo controle para os
Experimentos I, II e III.
Figura 3. Amostras analisadas pela técnica de PCR para pesquisa do BoHV-5:
A. oócitos (BoHV-SFB), B. oócitos (BoHV-PVA), C. embriões (BoHV-
SFB), D. embriões (BoHV-PVA), E. sêmen (BoHV-SPTZ), F.
embriões (BoHV-SPTZ), G. embriões (BoHV-PZ), H. controle
positivo e I. controle negativo.
Figura 4. Infecção experimental de oócitos bovino pelo BoHV-5 submetidos à técnica
de ISH: (A) controle, (B) BoHV-SFB e (C) BoHV-PVA. Sinais positivos de ISH
são representados pela deposição de pigmentos vermelhos nos grupos
infectados.
A
B
C
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Figura 5. Infecção experimental de espermatozóides bovino pelo BoHV-5
submetidos à técnica de ISH: (A) espermatozóides controle e (B)
espermatozóides infectados. Sinais positivos na ISH são
representados pela deposição de pigmentos vermelhos no grupo
infectado.
Figura 6. Embriões bovino oriundos de oócitos infectados com BoHV-5 e submetidos
à técnica de ISH: (A) controle, (B) BoHV-SFB e (C) BoHV-PVA. Sinais
positivos de ISH são representados pela deposição de pigmentos vermelhos
nos grupos infectados.
A B
A B
C
Figura 7. Embriões bovinos oriundos de (A) fertilização com espermatozóides
infectados com BoHV-5 e (B) PZ infectados às 20h pós-fecundação.
Os sinais positivos obtidos pela ISH são representados por
depósitos de pigmento vermelho nos embriões.
2.3.2 Desenvolvimento e Produção in Vitro de Embrião
No experimento I (Tabela 1, Figura 8 e 9) observou-se que a taxa de
fertilização no grupo BoHV-SFB foi menor quando comparado ao grupo
controle (P<0,05), e ambos não diferiram do grupo BoHV-PVA. Não houve
diferença estatística entre os diferentes grupos de tratamento para a produção
in vitro de embriões (P>0,05). No experimento II (Tabela 1, Figura 10) não
houve diferença significativa na taxa de fertilização e desenvolvimento
embrionário entre os diferentes grupos (P>0,05). No Experimento III (Tabela 1,
Figura 11) não houve diferença estatística entre os grupos para a taxa de
fertilização (P>0,05), todavia houve menor (P<0,05) produção de embriões no
grupo infectado quando comparado ao grupo controle.
A B
Tabela 1 – Produção in vitro de embriões bovino após exposição de oócitos,
espermatozóides e prováveis zigotos ao BoHV-5, respectivamente (N=9
por tratamento)
Desenvolvimento embrionário (média ± S)
Tratamentos
Número
total de
oócitos
Fertilização Mo/Bl/Bx* Bl/Bx/Be*
Experimento I – Infecção dos oócitos
Controle-SFB 179 89.9 ± 6.5
a
31.1 ± 7.7 28.8 ± 9.2
BoHV-SFB 185 80.4 ± 8.9
b
31.2 ± 8.2 29.3 ± 8.2
BoHV-PVA 178 87.3 ± 7.1
ab
37.5 ± 13.0 35.6 ± 13.1
Experimento II – Infecção do sêmen
Controle 141 87.5 ± 7.5 41.7 ± 9.9 39.6 ± 10.3
BoHV-5 148 92.2 ± 5.5 44.3 ± 7.7 40.8 ± 9.2
Experimento III – Infecção dos prováveis zigotos
Controle 164 83.8 ± 7.6 31.6 ± 4.6
a
31.6 ± 4.6
a
BoHV-5 163 80.5 ± 8.7 25.0 ± 5.5
b
20.2 ± 5.4
b
a,b
Valores seguidos por letras diferentes na mesma coluna e experimento indicam diferença
estatística entre os tratamentos (P>0.05)
*mórula (Mo), blastocisto (Bl), blastocisto expandido (Bx) e blastocisto eclodido (Be)
Figura 8. Oócitos bovinos maturados por 24 h, após infecção dos oócitos com BoHV-5, sendo:
A: controle; B: BoHV-SFB e C: BoHV-PVA.
Figura 9. Embriões bovinos 168 h pf, após infecção dos oócitos com BoHV-5, sendo:
A: controle; B: BoHV-SFB e C: BoHV-PVA.
Figura 10. Embriões bovinos 168 h pós-fecundação, após infecção dos
espermatozóides com BoHV-5, sendo: A: controle; B: infectado.
A
C
B
A
B
C
A
B
Figura 11. Embriões bovinos 168 h pós-fecundação, após infecção dos PZ com BoHV-5,
sendo: A: controle; B: infectado.
2.4 Discussão
Observou-se que os oócitos, espermatozóides e embriões bovinos são
susceptíveis à exposição pelo BoHV-5. A exposição experimental dos oócitos
diminuiu a taxa de fecundação in vitro, entretanto este resultado não
comprometeu o desenvolvimento embrionário e a produção in vitro de
embriões. O vírus não afetou a fertilização e produção embrionária quando co-
incubado com espermatozóides bovino. No entanto, zigotos infectados no dia 1
pós-fecundação apresentaram comprometimento no desenvolvimento
embrionário com redução no número de embriões produzidos.
A ISH foi utilizada para detectar o BoHV-5 em oócitos, espermatozóides
e embriões, e mostrou ser superior a outras técnicas, tais como PCR
(WRENZYCKI et al., 2007), a qual é sensível, mas não possibilita identificar
com precisão as células positivas in situ (SEGALÉS et al., 1999). De acordo
com os resultados de ISH, a exposição experimental apresentou marcação
positiva em todos os Experimentos (I, II e III), confirmando a eficiência do
protocolo utilizado para a exposição experimental.
Estudos recentes sobre causas de alterações reprodutivas no rebanho
bovino têm focado o Herpesvirus bovino tipo 1, por ser este o agente viral mais
comumente conhecido na esfera reprodutiva (BROCK, 1998). Apesar da
grande similaridade genômica com o BoHV-5, este encontra-se restrito a
A
B
enfermidades do sistema nervoso central. Portanto, o BoHV-1 está
provavelmente mais adaptado ao sistema reprodutivo que o tipo 5. Tal fato
pode explicar as diferenças encontradas entre os dados apresentados para o
tipo 5 e os dados da literatura sobre o tipo 1. O título viral também pode
influenciar os resultados, uma vez que, a diminuição da ligação do
espermatozóide à zona pelúcida diminuiu com o aumento do título viral para o
BoHV-1 (TANGHE et al., 2005). Embora o BoHV-5 apresente características
que o difira do BoHV-1 é possível inferir que o título viral tenha influenciado nos
resultados.
Guerin et al. (1990) usando espermatozóides infectados com BoHV-1 e
oócitos expostos ao BoHV-1 para a produção in vitro de embrião demonstraram
que o BoHV-1 não interfere na maturação oocitária, mas reduz
significativamente a FIV. O BoHV-1 não é somente adsorvido aos gametas,
como também prejudica a fertilização in vitro, possivelmente devido a efeito
sobre a penetração espermática ou a interação com mecanismos intracelulares
de fusão (GUERIN et al., 1990). Na verdade, o BoHV-1 pode reduzir até 60%
da ligação do espermatozóide à zona pelúcida (VANROOSE et al., 2000). De
acordo com Choi et al. (2008), o BoHV-1 pode modificar as propriedades
elétricas da membrana plasmática através de alterações nos gradientes de
catiônicos ou interações com as proteínas da membrana que modulam os
canais iônicos. No presente estudo, observou-se que o BoHV-5 não afetou a
morfologia e os movimentos dos espermatozóides, porém diminuiu a FIV dos
oócitos infectados (BoHV-SFB). Esta observação pode estar relacionada com o
mecanismo de fusão (oócito-espermatozóide) ou com as propriedades elétricas
da membrana plasmática do oócito, entretanto o ponto é que o estresse
imposto pelo vírus pode ter prejudicado a fecundação. O efeito negativo da
infecção ocorreu apenas em oócitos maturados em meio contendo SFB,
enquanto que oócitos infectados maturados em meio com PVA tiveram taxa de
fertilização semelhante ao grupo controle. A viabilidade viral em meio com PVA
é reduzida (MERTEN et al., 1999), provavelmente porque o PVA é composto
de moléculas não protéicas, dificultando a adsorção viral. Além disso, PVA
pode fornecer maior estabilidade à membrana do oócito favorecendo a
fecundação.
Durante a fecundação, os espermatozóides podem prontamente servir
como um carreador do gene viral, especialmente para os vírus envelopados,
como o Herpesvirus (NUSSBAUM et al., 1993). Tal fato foi confirmado com o
BoHV-5, o qual foi transmitido verticalmente para os embriões através de
espermatozóides infectados (Fig. 5). O BoHV-5 infectando o espermatozóide
também provou que o gradiente de Percoll, o qual normalmente é utilizado para
reduzir ou eliminar a carga viral no sêmen (MAKAREVICH et al., 2007) não é
eficiente para a remoção do BoHV-5. Contudo, os embriões produzidos por
espermatozóides infectados apresentaram desenvolvimento semelhante ao
grupo controle, sendo obtido resultados similares às 144 e 168 h pf. Os oócitos
infectados também transmitiram verticalmente o BoHV-5, sem comprometer o
desenvolvimento dos embriões. Espermatozóides expostos ao BoHV-1 durante
a FIV levaram a comprometimento no desenvolvimento embrionário
(MAKAREVICH et al., 2007), além de reduzirem a taxa de clivagem e de
formação de blastocistos (VANROOSE et al., 1999). A infecção em oócitos com
BoHV-1 levou a diminuição na taxa de formação de blastocistos (BIELANSKI e
DUBUC, 1994). O presente resultado pode ser divergente dos achados da
literatura usando BoHV-1, devido a não adaptabilidade do BoHV-5 ao trato
genital, característica esta intrínseca de cada tipo viral.
O desenvolvimento embrionário foi comprometido quando os prováveis
zigotos foram co-incubado com o vírus às 24 h pós-fecundação. Este resultado
provavelmente possa ser em decorrência da fase escolhida para a infecção, já
que os prováveis zigotos foram infectados durante o estágio de bloqueio das
oito células, em que o genoma do embrião é ativado. As informações genéticas
materna são responsáveis pela manutenção do embrião até o estágio de oito
células, a partir desta fase o genoma embrionário é ativado, e o
desenvolvimento genético torna-se dependente da transcrição de proteínas
utilizando as informações genéticas do embrião (YU et al., 2007). Tanto o vírus
quanto o embrião necessitam das mesmas organelas para replicação e
desenvolvimento celular, respectivamente. Por conseguinte, problemas
intrínsecos ou extrínsecos ocorridos nesta fase podem levar ao bloqueio do
desenvolvimento embrionário (MEIRELLES et al., 2004).
Os resultados obtidos através da ISH confirmam que a zona pelúcida
não é uma barreira eficaz para proteger oócitos e prováveis zigotos da infecção
pelo BoHV-5. A zona pelúcida é comumente conhecida pelo seu importante
papel na proteção de oócitos e embriões na etapa pré-implantacional contra a
infecção viral, no entanto mostrou-se ineficaz na proteção contra o BoHV-1
(MAKAREVICH et al., 2007), o qual transpõe os grandes poros externo da zona
pelúcida (180 a 200 nm) (VANROOSE et al., 2000).
No nosso estudo encontramos a primeira evidência de que gametas e
embriões bovinos são susceptíveis ao BoHV-5. A exposição dos gametas não
compromete a produção in vitro de embriões. Apesar da taxa de clivagem de
oócitos cultivados em meio de maturação contendo SFB ter sido diminuída,
ainda assim a produção de embriões foi mantida, sem diferir do grupo controle.
Todavia, quando infecção ocorreu nos prováveis zigotos, o desenvolvimento
dos embriões foi comprometido.
Por esta razão, as boas práticas de cultivo celular devem ser adotadas
para garantir que a cultura, reagentes e equipamentos, bem como o ambiente
de trabalho estejam livres de patógenos. Embora o BoHV-5 não tem sido
considerado importante na esfera reprodutiva, este pode representar um
problema sanitário emergente com consequências econômicas para a
pecuária.
2.5 Conclusão
O BoHV-5 possivelmente pode ser transmitido diretamente e
verticalmente durante a produção in vitro de embriões bovino, a partir de
oócitos, espermatozóides e prováveis zigotos contaminados, sendo possível
obter embriões viáveis após a infecção dos gametas. No entanto, a infecção no
dia 1 pós-fecundação compromete o desenvolvimento embrionário diminuindo
o número de embriões produzidos.
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CAPÍTULO 3 – ARTIGO
Análise da Apoptose em Embriões Bovino Expostos Experimental ao
Herpesvirus Bovino Tipo 5
RESUMO – O presente estudo foi conduzido para pesquisar marcadores de
apoptose em embriões bovino após exposição experimental com Herpesvirus
bovino tipo 5 (BoHV-5) em oócitos (Experimento I), espermatozóides
(Experimento II) e prováveis zigotos (Experimento III). Cada experimento foi
constituído de 150 oócitos bovino. A técnica de imunofluorescência indireta foi
empregada para determinar os marcadores de apoptose: Anexina-V, TUNEL,
caspase-2, -3 e Bcl-2. O teste de TUNEL revelou moderado sinal de imuno-
marcação no grupo controle (20% dos embriões não infectados) comparado
com grupo II infectado (leve, 20%) e group III (ausente). A Anexina-V foi
considerada como grau de marcação moderada no grupo controle e leve no
grupo II (40% dos embriões analisados, respectivamente). O marcador Bcl-2 foi
identificado em todos os embriões infectados pertencentes a todos os
diferentes grupos. Nenhuma alteração na expressão da caspase-2 e -3
puderam ser detectadas nos grupos infectados. Embora, a atividade da
caspase tenha sido revelada em grau moderado em 80% dos embriões
analisados. Tendo em vista os resultados obtidos, a presença do BoHV-5
parece suprimir alguns passos da apoptose em embriões bovino sem acarretar
prejuízo no desenvolvimento embrionário.
Palavras-chave: Anexina-V, Bcl-2, caspase-2, caspase-3 e TUNEL
Analysis of Apoptosis in Bovine Embryos Experimental Exposed to
Bovine Herpesvirus Type 5
SUMMARY – The present study was conducted to search bovine embryos
apoptosis markers after experimental exposition with bovine Herpesvirus type 5
(BoHV-5) on oocytes (Experiment I), on sperm (Experiment II) and on
presumptive zygotes (Experiment III). Each experiment was constituted of 150
bovine oocytes. The indirect immunofluorescence assay was employed to
determine apoptosis markers: Annexin-V, TUNEL, activity of apoptotic proteins
such as caspase-2 and -3, and Bcl-2. The TUNEL assay revealed moderate
immuno-labeling signals in control group (20% of non-infected embryos)
compared with infected group II (light, 20%) and group III (absent). The
Annexin-V was considered moderated labeled in control group and considered
lightly labeled in group II (40% of analyzed embryos, respectively). The Bcl-2
marker was identified in all infected embryos belonging to all different groups.
Finally, no alteration of caspase-2 and -3 expressions could be detected on
infected groups. However, caspase activity revealed moderate levels in 80% of
analyzed embryos. Take these results together, BoHV-5 presence seems to
suppress some apoptosis pathways in bovine embryos accomplished by none
interference on the embryonic development.
Key words: Annexin-V, Bcl-2, caspase-2, caspase-3 and TUNEL
3.1 Introdução
O potencial de desenvolvimento de embriões produzidos in vitro é
afetado por vários fatores, incluindo o sistema de cultura, a qualidade dos
oócitos, a presença de SFB, a qualidade do sêmen e a presença de patógenos.
O Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) foi isolado recentemente de amostras de
sêmen congelado, as quais foram utilizadas para programas de inseminação
artificial (KIRKLAND et al., 2009). Silva-Frade et al. (2009) expôs
experimentalmente oócitos, espermatozóides e prováveis zigotos bovinos ao
BoHV-5 e comprovou a suscetibilidade destes ao vírus, além de ter observardo
que a presença do vírus não interferiu no número e qualidade dos embriões
produzidos in vitro. Baseado nesses achados, é possível inferir que o BoHV-5
possui mecanismos para inibir a morte celular e, por algum mecanismo
desconhecido, favorece a viabilidade da célula hospedeira. Talvez porque a
célula hospedeira não é a célula de eleição para sua replicação.
Para prolongar a viabilidade celular e facilitar a replicação, os vírus
desenvolveram múltiplos mecanismos para inibir a resposta da apoptose no
hospedeiro. A apoptose pode também servir como uma resposta celular inata à
infecção, a qual limita o tempo e a maquinaria celular disponível para a
replicação do vírus (VAUX et al, 1994). Muitos dos principais eventos
bioquímicos que ocorrem durante a apoptose são mediadas por proteases
(KIDD et al., 2000), a mais importante delas são as caspases (proteases
cisteína dependentes de específico aspartato).
As características típicas de células apoptóticas incluem uma série de
alterações celulares, morfológicos e bioquímicos, tais como condensação da
cromatina, exposição da fosfatidilserina (PS), retração citoplasmática,
invaginação da membrana, fragmentação do DNA e ativação da caspase (HAY
E KANNOURAKIS, 2002).
A apoptose é iniciada por mecanismos extrínsecos ou intrínsecos. O
desencadeamento extrínseco da apoptose ocorre após a ligação dos
receptores de morte com o fator de necrose tumoral (TNF), ligante Fas (FasL) e
TNF relacionado com ligante indutores da apoptose (TRAIL). A ligação do
receptor TNF resulta na formação do complexo sinalizador da indução da morte
(DISC) (KISCHKEL et al., 1995) necessários para a ativação das caspases
iniciadoras. A ativação intrínseca da apoptose é desencadeada após a
translocação dos membros pró-apoptóticas da família Bcl-2, como Bid ou Bax,
na mitocôndria (YIN, 2006; YOULE et al., 2008), resultando na formação de
poros e permeabilidade da membrana externa da mitocôndria (YIN, 2006;
CARRIDO et at., 2006).
Os mecanismos da apoptose apresentam muitas etapas individuais. O
vírus pode influenciar apenas um único ponto do processo e afetar o início ou o
progresso da morte celular programada pela manipulação de uma variedade de
proteínas apoptóticas essenciais (HAY e KANNOURAKIS, 2002).
Como explicado acima, a proteína efetora chave que é ativada durante a
apoptose e representa o alvo dos vírus para a inibição da apoptose, são
caspases (ALNEMRI et al., 1996). As caspases efetoras e iniciadoras avaliadas
neste experimento foram caspase-2 e -3, respectivamente. As caspases
existem no celular como pró-caspases inativas ou zimogênio e é necessária a
sua clivagem para serem ativadas.
A atividade das caspases é regulada pela família de proteínas Bcl-2
(REED, 1997; ADAMS e CORY, 1998; GREEN e REED, 1998) as quais foram
divididos em dois subgrupos: aqueles que exercem efeitos anti-apoptóticos (por
exemplo, Bcl-2) e aqueles que são pró-apoptóticas (por exemplo, Bax, Bad e
Bid) (CORY e ADAMS, 1998). Encontrou-se que a proteína Bcl-2 previne a
apoptose por diversos estímulos e mantém a sobrevivência celular por
influenciar na liberação de citocromo c da mitocôndria (YANG et al., 1997).
A apoptose inicial é conhecida como resultado da perda de simetria dos
fosfolipídios da membrana e exposição da PS. A anexina-V tem alta afinidade
pela PS e, portanto, serve como uma sonda sensível para detecção da
apoptose inicial (MARTIN et al., 1995).
O método de TUNEL foi utilizado para a detecção de fragmentos de
DNA pela marcação in situ da 3'-OH do DNA fragmentado de DNA pela enzima
deoxinucleotídeo transferase terminal (TdT), na presença do nucleotídeo
marcado com fluorescência, nucleotídeo trifosfato deoxiuridina bromolato
(BrdU) (GAVRIELI et al., 1992; GORCZYCA et al., 1993).
Em resumo, o objetivo principal do presente estudo foi avaliar a
apoptose por meio de marcadores específicos em embriões bovinos, após a
exposição experimental pelo BoHV-5 em oócitos, espermatozóides e prováveis
zigotos detectada pela técnica de TUNEL e imunohistoquímica para
visualização da expressão de moléculas pró e anti-apoptóticas (descritas como
Anexina-V e Bcl-2, respectivamente) e atividade das caspases (caspase-2 e -
3).
3.2 Material e Métodos
O delineamento experimental inclui exposição experimental em gametas
e prováveis zigotos bovinos ao BoHV-5 (Silva-Frade et al., 2009) e
subsequente análise dos marcadores de apoptose através do teste de TUNEL,
Anexina-V, caspase-2, -3 e Bcl-2 pelo uso da imunofluorescência indireta. Este
estudo foi dividido em três experimentos: oócitos expostos ao BoHV-5 foram
fecundados com sêmen livre do patógeno no Experimento I, enquanto oócitos
livre do patógeno foram fertilizados por espermatozóides expostos ao BoHV-5
no Experimento II. Experimento III testou os prováveis zigotos expostos ao
BoHV-5.
3.2.1 Titulação Viral
Amostras do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), isoladas de bovinos
acometidos pela infecção na região de Araçatuba, São Paulo, Brasil, em 2007
(FERRARI et al., 2007) foi propagado em células “Madin Darby Bovine Kidney”
(MDBK, ATCC) e cultivado em “minimum essential medium” (MEM). A dose
infectante da cultura de tecidos por 50 µL (TCID
50
) da amostra de vírus foi
determinada pela técnica de neutralização em células MDBK (CARDOSO et
al., 2007). Alíquotas da amostra viral (100 µL), com 10
3,3
TCID
50
/50µL foram
mantidas em freezer a -86°C até o uso.
3.2.2 Experimento I
Este experimento avaliou a presença de oócitos bovinos com BoHV-5
durante a produção in vitro de embriões. Os oócitos utilizados foram obtidos a
partir de ovários de coletados em abatedouro (Brasfrigo, Birigui, SP, Brasil) e
transportados para o laboratório em 1 h post mortem. Complexos cumulus-
oócitos (COC) foram recuperados por aspiração dos folículos de 2 a 6 mm de
diâmetro. Foram selecionados apenas os COC com várias camadas de células
do cumulus compactas e citoplasma homogêneo. Estes foram divididos em
gotas de 15 a 20 oócitos cada, para serem utilizados nos experimentos.
As gotas com os oócitos foram divididas em três grupos (9 gotas/grupo),
como segue: (1) oócitos maturados sem a presença do vírus (controle); (2)
oócitos expostos ao BoHV-5 e maturados em meio contendo SFB (BoHV-FBS)
e (3) oócitos expostos ao BoHV-5 maturados em meio contendo álcool
polivinílico (BoHV-PVA).
O meio de maturação foi preparado com 100 µL TCM-199 (GIBCO-BRL,
Grand Island, NY, E.U.A.) suplementado com 10% FBS (Nutricell ®, Campinas,
SP, Brasil) ou 1 mg/mL de PVA (cat # P8136 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
E.U.A.), 2,2 mg/mL de bicarbonato de sódio, 0,02 mg/mL de piruvato de sódio,
0,05 mg/mL de sulfato de gentamicina, 0,5 mg/mL de FSH (Pluset
®
, Calier,
Barcelona, Espanha) e 50 mg/mL de LH (Lutropin-V
®
, Inc. Bioniche, Belleville,
ON, Canadá) O meio de PVA é uma alternativa sintética para o SFB na cultura
de oócitos, com função semelhante, mas menos susceptível a contaminação
(SEIDEL et al., 1990; MERTEN et al., 1999; NOWSHARI e BREM, 2000). Os
oócitos selecionados foram lavados em meio de maturação (MM) e transferidos
para gotas contendo 100 µL de MM e levados para estufa por 24 h a 39°C e
5% de CO
2
em ar.
Os oócitos dos grupos de BoHV-FBS e BoHV-PVA foram infectados
experimentalmente pela co-incubação com 10 µL de BoHV-5 (10
3,3
TCID
50
) por
1 h a 39°C e 5% de CO
2
em ar. Os oócitos foram, posteriormente, lavados três
vezes em MM livre de vírus e transferidos para novas gotas de maturação para
seguir o desenvolvimento in vitro. O grupo controle foi submetido ao mesmo
protocolo, exceto a exposição ao BoHV-5. Após 24 h de maturação, os oócitos
foram transferidos para gotas contendo meio de fertilização in vitro . Trinta
oócitos foram analisados pela técnica de ISH e não seguiram o
desenvolvimento.
Os espermatozóides utilizados para a fecundação foram obtidos a partir
de palhetas (0,5 mL) congeladas de um único touro (Bos indicus) mantido em
central de inseminação artificial no Brasil. O sêmen foi centrifugado em
gradiente de Percoll (45% e 90%; Nutricell
®
, Campinas, SP, Brasil) a 700 X g
por 20 min. O pellet de espermatozóides obtido foi lavado em meio TALP
(Tyrode albumina lactato e piruvato suplementado com 6 mg/mL de BSA) a 200
X g por 5 min. O sedimento foi diluído em meio de fecundação (meio TALP
suplementado com 3 mg/mL de heparina e solução de PHE: 2 mM de
penicilamina, 1 mM de hipotaurina e 250 mM de epinefrina, Sigma-Aldrich
®
) a
fim de obter uma concentração final de 1 x 10
6
espermatozóides/mL em cada
gota de 100 µL.
Para a fertilização in vitro (FIV), os oócitos e espermatozóides foram co-
incubados em meio FIV por 20 h, sob as mesmas condições utilizadas para
MIV. Em seguida, os PZ foram colocados em meio de cultura in vitro (CIV) até
ao dia 7 (dia 0 = dia da fertilização). Após a produção de blastocistos no dia 7
pós-fecundação, foram utilizados apenas os embriões classificados como grau
1 (excelente) ou 2 (bom) segundo as normas da IETS [24]. Trinta embriões
foram utilizados para cada teste (TUNEL, Anexina-V, caspase-2, -3 e Bcl-2).
3.2.3 Experimento II
Para avaliar os efeitos da infecção dos espermatozóides com BoHV-5
sobre a produção in vitro de embriões bovinos, a FIV foi realizada com sêmen
exposto e não exposto ao BoHV-5 (9 gotas por grupo). A obtenção dos oócitos,
bem como o preparo do sêmen para FIV foram realizados conforme descrito no
Experimento I.
Para a exposição dos espermatozóides, duas palhetas de sêmen foram
descongeladas e homogeneizadas em um mesmo tubo e, posteriormente,
divididas em duas partes iguais de 0,5 mL. Uma parte da amostra foi co-
incubada com 50 µL de BoHV-5 (1:10, como para os oócitos, 10
3,3
TCID
50
) por
1 h a temperatura ambiente e protegido da luz (BoHV-SPTZ). A outra parte da
amostra foi submetida ao mesmo procedimento, exceto a presença do vírus
(controle). O sêmen foi submetido ao gradiente de Percoll, centrifugado e
diluído para fecundar os oócitos. A taxa de fecundação e o desenvolvimento
embrionário foram avaliados como no Experimento I. Trinta embriões foram
utilizados para cada teste (TUNEL, Anexina-V, caspase-2, -3 e Bcl-2).
3.2.4 Experimento III
Os mesmos procedimentos utilizados no Experimento I foram
empregados para a obtenção dos oócitos e seleção dos espermatozóides. No
dia 1 pós-fecundação, as gotas com os prováveis zigotos foram divididas em
dois grupos (9 gotas por grupo): (1) prováveis zigotos exposto ao BoHV-5
(controle) e (2) prováveis zigotos livre da infecção viral (BoHV-PZ). Os
prováveis zigotos com zona pelúcida intacta foram co-incubados com BoHV-5,
nas mesmas condições utilizadas para a exposição dos oócitos. Após o
período de adsorção (1 h), os prováveis zigotos foram lavados por três vezes
em meio SOF (fluido do oviduto sintético) e cultivados em gotas de cultivo livre
do vírus por 7 dias, sob as mesmas condições utilizadas para a maturação e
fecundação. O desenvolvimento embrionário foi avaliado como no Experimento
I e II. Trinta embriões foram utilizados para cada teste (TUNEL, Anexina-V,
caspase-2, -3 e Bcl-2).
3.2.5 Teste de TUNEL
Os embriões (n=30 por grupo) foram lavados três vezes em PBS
(tampão fosfato salina, pH = 7,4) e fixados em lâmina com paraformaldeído a
4% por 24 horas à 4°C. Em seguida, as amostras foram lavadas com PBS e
permeabilizadas com proteinase K (10 mg/mL) por 15 minutos à temperatura
ambiente. A técnica de TUNEL foi realizada seguindo as recomendações do
fabricante (A35126 APO-BrdU
TM
TUNEL Assay Kit, Invitrogen
TM
).
Resumidamente, os embriões foram lavados duas vezes em tampão de
lavagem (ABO-BrdU Kit) e incubados a 4°C por 12 h com a solução de
marcação do DNA fragmentado (ABO-BrdU Kit) contendo a enzima TdT,
BrdUTP, tampão de reação TdT e água destilada. Após duas lavagens em
tampão de enxágue (ABO-BrdU Kit), os embriões foram incubados por 30
minutos protegidos da luz e a temperatura ambiente com solução de anticorpo
(anticorpo monoclonal anti-BrdU conjugado a fluoresceína e tampão de
enxágue). O controle positivo consistiu de embriões de bovinos pré-incubadas
com 1µL/mL de DNAse por 1 h a 37°C. O controle negativo foi incubado sem a
enzima TdT. Posteriormente, todas as amostras foram contra-coradas, com
6,25 mg/mL de iodeto de propídio (IP) por 15 minutos a temperatura ambiente
antes de montar as lâminas com as lamínulas. O IP cora os núcleos das
células vivas em vermelho, enquanto os núcleos fragmentados foram corados
em verde pela fluoresceína do teste de TUNEL.
3.2.6 Imunofluorescência Indireta para Anexina-V, caspases e Bcl-2
Os embriões foram fixados e permeabilizados conforme descrito para o
teste de TUNEL. Após o pré-tratamento com proteinase K a 4°C, as lâminas
foram incubadas por 12 h com os anticorpos primários (Anexina-V, caspase-2, -
3 e Bcl-2 anti-mouse) diluídos em DAKO (S3022, diluente para anticorpos,
América do Norte Dako®). Veja a Tabela 1 para detalhes dos anticorpos
primários. Em seguida, as lâminas foram incubadas por 24 h a 4°C com o
anticorpo secundário (FITC-goat IgG anti-mouse - 626511, Zymed
®
). A omissão
do anticorpo primário foi utilizada como controle negativo para os diferentes
anticorpos.
Tabela 1 – Detalhes dos anticorpos primários utilizados na imunofluorescência
Antibody Product N. Dilution Species Supplier
Annexin-V
number
Monoclonal
anti-
annexin-V
A 8604
1:4000 Mouse Sigma-
Aldrich
Caspase-3
number
Anti-
caspase 2
(ICH1 L)
C 8487 1:400 Rabbit Sigma-
Aldrich
Caspase-3
number
Anti-
caspase 3,
Active
C 7349 1:1000 Rabbit Sigma-
Aldrich
Bcl-2
number
Monoclonal
anti-Bcl-2
B 9804 1:500 Mouse Sigma-
Aldrich
3.2.7 Semi quantificação e análise dos dados
Os diferentes parâmetros estudados no presente experimento, tais como
TUNEL, Anexina-V, caspase-2, -3 e Bcl-2 foram semi-quantificados de acordo
com a intensidade da imunomarcação. Os resultados foram expressos em
escores com base na intensidade, classificados como se segue: grau I (leve), II
(moderado) e III (severo). O resultado negativo foi interpretado como ausência
de marcação e classificados como grau 0. Toda a avaliação foi realizada por
dois observadores realizando a análise subjetiva. As imagens foram
processadas no microscópio Axio Imager A.1 (Carl Zeiss Oberkochen,
Alemanha) conectado a câmera AxioCam MRc (Carl Zeiss) e as micrografias
foram processadas no “software” Axiovision 4.7 (Carl Zeiss). O número de
embriões classificados entre grau I, II e III após o teste de TUNEL, anexina-V,
caspase-2, -3 e Bcl-2 foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e Dun.
Diferenças estatísticas foram consideradas para P<0,05.
3.3 Resultados
Os resultados da coloração do teste de TUNEL, Anexina-V, caspase-
2, -3 e Bcl-2 em embriões bovinos após a exposição durante o período
maturação in vitro, fecundação, cultivo são representados na Figura 1A, B e C,
respectivamente. Menor grau de apoptose (P<0,05) foi observada em embriões
do grupo BoHV-FBS, enquanto os grupos BoHV-PVA, BoHV-SPTZ e BoHV-PZ
apresentaram ausência de marcação para o teste de TUNEL. Os embriões
não-infectados (grupo controle) mostraram grau moderado de apoptose para o
teste de TUNEL.
A fragmentação do DNA no núcleo dos embriões foi revelada como
uma marcação verde de fluorescência após o teste de TUNEL (Figura 2A e D).
A intensidade dos sinais positivos foram comparados com os sinais
visualizados nos embriões, que a enzima TdT foi omitida (Figura 2E) e com
embriões previamente incubada com a DNAse bovina (Figura 2F).
A proporção de marcadores de apoptose foi significativamente menor
(P<0,05) nos embriões expostos em relação ao grupo controle. Além disso, a
Anexina-V foi considerada estatisticamente diferente para a taxa de apoptose
precoce entre o controle (não-infectado; grau moderado, Figura 2G), BoHV-
FBS (grau leve, Figura 2H) e BoHV-PVA, BoHV-SPTZ e BoHV-PZ (grau 0,
Figura 2I).
O grau de imunomarcação para ambas caspase-2 e -3 foi negativo
em embriões dos grupos BoHV-FBS, BoHV-PVA, BoHV-SPTZ e BoHV-PZ, em
relação ao grupo controle (não infectado, Figura 2J). A expressão das
caspases foi detectada em embriões cultivados sem a presença do vírus
(Figura 2L). A expressão da proteína Bcl-2 foi detectada em todos os embriões
de bovinos infectados pertencem aos grupos BoHV-FBS, BoHV-PVA, BoHV-
SPTZ e BoHV-PZ (Figura 2M). Os embriões não infectados foram considerados
negativos para a marcação do Bcl-2. Todos os experimentos foram repetidos
por seis vezes para cada marcador e 30 embriões foram analisadas em cada
grupo de tratamento.
A
0
20
40
60
80
100
leve moderado severo
percentagem de
embriões
reativos (%)
TUNEL
Anexina-V
caspase-2
caspase-3
Bcl-2
Figure 1. Análise semi-quantitativa de acordo com a intensidade da imunomarcação
para os testes de TUNEL, Anexina-V, caspase-2, -3 e Bcl-2. A: experimento I,
B: experimento II, C: experimento III e D: grupo controle.
Figura 2. TUNEL: A. BoHV-SFB, B. BoHV-PVA, C. BoHV-SPTZ, D. BoHV-PZ, E.
controle negativo e F. controle positivo; Anexina-V: G. grupo controle, H.
BoHV-SFB, I. BoHV-PVA, BoHV-SPTZ e BoHV-PZ; caspase-3: J. grupo
controle e L. grupos infectados, Bcl-2: M. grupos infectado.
3.4 Discussão
O sucesso da replicação do vírus na célula requer uma extraordinária
cascata de interação entre o vírus e a célula hospedeira. Muitos vírus têm
como parte de seu arsenal a habilidade de modular as vias da apoptose no
hospedeiro através da manipulação de uma variedade de proteínas chaves
para a apoptose (HAY e KANNOURAKIS, 2002)
A apoptose é um processo fisiológico ativo da condensação da
cromatina, redução do volume celular e formação de vesículas na membrana
chamada corpos apoptóticos, resultando em fragmentos e eliminação de
células desnecessárias e danificados (SCHWARTZMAN e CIDLOWSKI, 1993).
Considerando a complexidade extrema do processo de apoptose, é preciso
associar diferentes testes para determinar o grau de apoptose nas células.
Em muitos modelos bem conhecidos, a apoptose pode ser dividida em
quatro estágios: estímulo, sinalização, regulação e execução. Antes da célula
atingir o último estágio da regulação, a apoptose é considerada um processo
reversível (MORITA e TILLY, 1999).
Em todos os grupos de embriões expostos (Experimento I, II e III), a
marcação para o teste de TUNEL foi observada, indicando que a presença do
BoHV-5 interfere na integridade do DNA. A avaliação da apoptose pelo teste de
TUNEL permite a observação in situ da células apoptóticas por meio da
marcação de fragmentos do DNA gerados pela atividade da DNAse endógena
durante o processo de apoptose.
É possível diferir a apoptose inicial da tardia através da imunomarcação
da Anexina-V, a qual se liga a PS exposta nos processos de apoptose inicial,
sendo detectada nos embriões dos grupos controle e expostos ao BoHV-5.
Segundo Oberhammer et al. (1994)a exposição da PS é um processo inicial da
apoptose, precedendo a condensação nuclear e o desarranjo do citoesqueleto
intracelular e dos constituintes da matriz nuclear (THOMSON, 2001).
A Anexina-V foi classificada em grau leve e moderado nos embriões
pertencentes aos grupos expostos (Experimento I, II e III) e houve predomínio
de grau moderado e severo nos embriões não infectados.
Em geral o grau de apoptose observado nos embriões eqüinos, suínos e
bovinos produzidos in vitro foi considerado baixo (POMAR et al., 2005). Além
disso, um maior grau de apoptose tem sido observado em embriões bovinos
produzidos in vitro quando comparado aos produzidos in vivo (POMAR et al.,
2005).
É sabido que os vírus podem produzir fatores pró e anti-apoptóticas
dentre eles estão a caspase-2, -3 e Bcl-2, respectivamente. As caspases
existem na célula como pró-caspases inativas ou zimogênios (KUMAR, 2007),
e o mecanismo usado pelo vírus para suprimir a ativação das caspases é a
inibição da permeabilização da membrana mitocondrial, impedindo ou
retardando a liberação de citocromo c (BOYA et al., 2004; THOMSON, 2001).
As caspases podem ser caracterizadas como iniciadoras ou efetoras da
cascata das caspases (SALVESON e DIXIT, 1997; COHEN, 1997;
THOMBERRY e LAZEBNIK, 1998).
As caspase-1, -2, -4 e -9 apresentam domínios cujos alvo são os
complexos de iniciação internos (apoptossoma) ou moléculas adaptadoras que
interagem com receptores da superfície celular. Em contraste, as caspase-3, -6
e -7 precisam ser ativadas por outras caspases e agem como efetoras,
clivagem os substratos que são parte integrante da estrutura celular. Além
disso, Exley e Warmer (1999) descreveram as caspases iniciadoras (caspase-
2) e efetoras (caspase-3) em oócitos e embriões de camundongos pré-
implantação.
No presente estudo as caspase-2 e -3 não foram visualizadas em
embriões bovinos infectados com BoHV-5. A ausência dos antígenos das
caspase-2 e -3 em todos os embriões pertencentes aos grupos expostos,
sugere que a presença do BoHV-5 deve interferir na expressão destas
proteínas, as quais foram observadas nos embriões não expostos ao vírus,
ambas caspases iniciadora (caspase-2) e efetora (caspase-3) foram descritas
em oócitos e embriões pré-implantacionais de camundongos (EXLEY e
WARMER, 1999).
O Bcl-2 é uma proteína integral da membrana localizada principalmente
na membrana externa da mitocôndria (YANG et al., 1997) e age na liberação
do citocromo c. Um importante mecanismo que o vírus utiliza para suprimir a
ativação das caspases é a inibição da permeabilização da membrana
mitocondrial, impedindo a liberação de citocromo c. Nessa situação, o vírus
pode infectar uma célula e não ser detectado, evitando assim a destruição da
célula hospedeira e permitindo sua replicação (PAROLI et al., 2000).
A expressão do Bcl-2 em oócitos e embriões bovinos foi observada em
maior grau em oócitos e zigotos no estágio de quatro células quando
comparado a blastocistos e embriões bovinos de péssima qualidade (MELKA et
al., 2009). Nos grupos estudados foi possível observar a presença do Bcl-2 nos
embriões expostos com predomínio do grau leve, entretanto não houve
marcação desta proteína nos embriões do grupo controle (não exposto ao
vírus). Ou seja, o vírus desenvolveu mecanismos para impedir ou retardar o
avanço da apoptose na célula hospedeira, provavelmente por produzir
proteínas que mimetizam a função do Bcl-2, ou por estimularem a produção
desta proteína. O mecanismo exato de como o BoHV-5 age contra o processo
da apoptose ainda permanece desconhecido.
Tais achados trazem uma grande preocupação com o controle de
qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro, uma vez que a infecção
viral é silenciosa e na maioria das vezes não compromete o desenvolvimento
embrionário.
3.5 Conclusão
A contaminação experimental de oócitos, espermatozóides e prováveis
zigotos com BoHV-5 aumentou a viabilidade de embriões bovinos produzidos in
vitro. Contudo, vários mecanismos estão envolvidos na inibição da resposta
apoptótica no embrião bovino e a maioria deles permanecem desconhecidos.
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APÊNDICES
Tabela 1 – Classificação dos oócitos segundo De LOOS et al. (1989).
Tipo de oócito Descrição
Grau I
- Revestido com várias camadas de células do cumulus compacto
- Ooplasma homogêneo
- COC claro e transparente
Grau II
- Revestido com várias camadas de células do cumulus compacto
- Ooplasma com alguns pontos escuros (picnóticos)
- COC levemente escuro e menos transparente
Grau III
- Revestimento com poucas camadas de células do cumulus compacto
- Ooplasma irregular com vários pontos escuros
- COC mais escuro que os de grau I e II
Grau IV
- Revestimento de células do cumulus expandido
- Ooplasma irregular com vários pontos escuros
- COC escuro e irregular
Tabela 2 – Componentes utilizadas na produção in vitro de embriões
Componentes Laboratório Código
SFB Gibco BRL 1043-028
Penicilina Sigma P7794
Gentamicina Sigma G1264
17-ß estradiol Sigma E2758
Piruvato Sigma P3662
Óleo Mineral Sigma M8410
Glicina Sigma G6388
Alanina Sigma A7627
BSA Sigma A6003
Percoll (90% e 45%) Nutricell -
Heparina Sigma H3149
Penicilamina Sigma P4875
Hipotaurina Sigma H1364
Epinefrina Sigma E4250
CaCl
2
.2H
2
O Sigma C7902
KCl Sigma P5405
KH
2
PO
4
Sigma P5655
MgCl
2
Sigma M2393
MgSO
4
.7H
2
O Sigma M2643
NaCl Sigma S5886
NaHCO
3
Sigma S4019
NaH
2
PO
4
Sigma S5011
Fenol Red Sigma P5530
Meio 199 Sigma M2154
Ácido lático 60% Sigma L4263
Tabela 3 – Meios para lavagem dos oócitos (ML)
Componentes 50 mL
PBS 45 mL
SFB 5 mL
Tabela 4 – Meio de maturação (MM)
Componentes 5 mL
TCM 199 4,5 mL
SFB 500 µL
Piruvato 10 µL
Gentamicina 25 µL
FSH 50 µL
LH 50 µL
Tabela 5 - Meio para lavagem espermática (TALP sperm)
Componentes g/50 mL
Água Mili-Q 50,0 mL
NaCl 0,2920
KCl 0,0116
MgCl
2
.6H
2
0 0,0040
NaH
2
PO
4
.H
2
O 0,0020
NaHCO
3
0,1050
CaCl
2
.2H
2
O 0,0150
Ácido Lático 155,0 µL
Phenol red 0,0005
Hepes 0,1190
Tabela 6 - Meio de fertilização (TALP stock)
Componentes g/50 mL
Água Mili-Q 50,0 mL
NaCl 0,3330
KCl 0,0120
MgCl
2
.6H
2
0 0,0050
NaH
2
PO
4
.H
2
O 0,0023
NaHCO
3
0,1050
CaCl
2
.2H
2
O 0,0150
Ácido lático 72,0 µL
Phenol red 0,0005
Tabela 7 – Meio de cultivo (SOF)
Componentes 1 mL
Meio SOF estoque 968 µL
Piruvato 2,0 µL
Gentamicina 5,0 µL
SFB 25 µL
Livros Grátis
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