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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO CLEMENTINO FRAGA FILHO
FACULDADE DE MEDICINA DA UFRJ
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
VALÉRIA BATTISTELLA AMADO DOS SANTOS
SEGURANÇA DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE
VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICO SUBAGUDO
RIO DE JANEIRO
2009
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VALÉRIA BATTISTELLA AMADO DOS SANTOS
SEGURANÇA DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DA MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL
ISQUÊMICO SUBAGUDO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Clínica Médica, com área de atuação em
Neurologia
Orientadores:
Charles André
Rosália Mendez-Otero
Gabriel Rodriguez de Freitas
Rio de Janeiro
2009
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B336 Battistella, Valéria
Segurança do transplante autólogo de células monucleares
da medula óssea em pacientes com acidentes vascular cerebral
isquêmico sub-agudo. / Valéria Battistella. – 2009
75 f.
Dissertação (Mestrado em Clínica Médica) –Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho. Hospital Clementino Fraga Filho, Rio de Janeiro, 2009.
Orientador: Charles André.
1.Clínica médica – Teses. 2. AVC isquêmico. 3.Célula
Tronco. 4. Medula óssea. I. André, Charles. II. Universidade
Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Pós-Graduação em
Clínica Médica. III. Título.
CDD 616
Valéria Battistella Amado dos Santos
SEGURANÇA DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DA MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL
ISQUÊMICO SUBAGUDO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Clínica Médica, com área de atuação em
Neurologia.
_____________________________________________
Prof. Dr. Charles André
Universidade Federal do Rio de Janeiro
_____________________________________________
Profª Drª Lea Miriam Barbosa da Fonseca
Universidade Federal do Rio de Janeiro
_____________________________________________
Prof. Dr. Marcos Raymundo Gomes de Freitas
Universidade Federal Fluminense
_____________________________________________
Prof. Dr. Maurice Vincent
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Data: ________________________________________
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela minha vida.
Aos meus pais, Paulo e Ieda, pelo esforço desempenhado com minha educação.
Aos meus irmãos, Wagner e Wander, e madrinha Edinéa, pelo estímulo constante aos estudos.
Ao meu marido Cesar pelo amor e companheirismo nos últimos 15 anos e à minha filha
Beatriz, simplesmente por existir.
A toda a equipe multiprofissional envolvida neste projeto, pelo carinho e dedicação em sua
realização: Daniel Mercante, Juliana Dias, Regina Goldenberg, Thais Kazai-Binswick, Bianca
Gutfien, Cláudia Lopes, Eduardo Wajnberg, Soniza Vieira e Lea Miriam Barbosa da Fonseca.
Aos meus orientadores, Charles, Rosália e Gabriel, pela atenção e orientação a mim
dispensada, nesta importante fase da vida acadêmica.
RESUMO
O Acidente vascular cerebral (AVC) permanece a principal causa de incapacidade no mundo
e há poucos estudos clínicos avaliando formas efetivas de melhorar a incapacidade residual
(CRAMER, 2008). Nos últimos anos, muitos estudos investigaram o potencial papel
restaurador de células-tronco, de diferentes fontes, em modelos animais de isquemia cerebral
(MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007). Este é um estudo clínico
fase 1, para averiguar a segurança e exequibilidade do transplante autólogo de células
mononucleares da medula óssea (CMMO), em pacientes com acidente vascular cerebral
(AVC) isquêmico, em território da artéria cerebral média (ACM), ocorrido até 90 dias antes
da infusão. Dez por cento das células a serem injetadas foram marcadas com
99m
tecnécio para
avaliação da cinética das CMMO após a injeção. Sete pacientes (idade entre 24 e 65 anos)
preencheram todos os critérios de inclusão. Foi realizado aspirado de medula óssea pela crista
ilíaca, sob sedação e anestesia local. As CMMO foram isoladas do aspirado utilizando
gradiente Ficoll; 10% das células foram separadas e marcadas com
99m
tecnécio e reinjetadas
na ACM responsável pelo AVC (mínimo de 1 x 10
8
e máximo de 5 x 10
8
células injetadas),
por técnica de Seldinger. Imagens cintilográficas foram realizadas duas e 24 horas após o
procedimento. Eletroencefalograma foi feito nos primeiros sete dias após o transplante. Os
pacientes foram avaliados utilizando hemograma e bioquímica e avaliação de escalas
neurológicas (escala de AVC do Instituto Nacional de Saúde Americano, Escala modificada
de Rankim e Índice de Barthel), antes da infusão das CMMO e 1, 3, 7, 30, 60, e 120 dias
após. Não houve qualquer complicação ou eventos adversos ligados diretamente ao
procedimento. Em seis pacientes não houve piora evolutiva das escalas neurológicas até o
final do acompanhamento. Um paciente necessitou intervenção cirúrgica uma semana após a
infusão das CMMO (intercorrência clínica não ligada ao procedimento), apresentando novo
evento isquêmico cerebral no pós-operatório. Em todos os pacientes houve captação na
Tomografia Computadorizada de fóton único (sigla em inglês, SPECT) e nas imagens
corporais totais realizados duas horas após infusão das CMMO marcadas. Devido à meia-vida
curta do tecnécio (seis horas), nem todas as imagens realizadas 24 horas após a infusão
apresentavam atividade do radiofarmaco. Todos os pacientes permaneceram em
acompanhamento mesmo após o término do protocolo (120 dias) e dois pacientes
apresentaram crise convulsiva tônico-clônica generalizada, aproximadamente 200 dias após a
infusão. Apesar das crises convulsivas, não houve alteração nas escalas de avaliação,
comparado ao 120° dia de acompanhamento. Neste pequeno estudo piloto, fase 1, a infusão
intra-arterial de CMMO em pacientes com AVC isquêmico (fase subaguda) foi segura e
exequível. Observou-se que a fração de CMMO marcada permaneceu na área isquêmica por,
pelo menos, 24 horas em alguns pacientes. Estudos fase 2, com inclusão de maior número de
pacientes, são necessários para avaliar eficácia e segurança.
PALAVRAS-CHAVE: AVC ISQUÊMICO, CÉLULA-TRONCO, MARCAÇÃO CÉLULA-
TRONCO, CÉLULA MONONUCLEAR, MEDULA ÓSSEA.
ABSTRACT:
Stroke remains the leading cause of disability in the world. There are few clinical trials that
evaluated effective ways to enhance recovery in patients with residual disability (CRAMER,
2008). In recent years, several studies have investigated the potential restorative role of stem
cells from different sources in animal models of brain ischemia (MENDEZ-OTERO; de
FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007). This is a phase 1 clinical study to assess the safety
and feasibility of bone-marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation in patients with
middle cerebral artery (MCA) territory ischemic stroke, within 90 days of stroke onset. In all
patients a portion of the infusion cells (10%) was marked with tecnecium-99-m to evaluate
the fate of BMMC after injection. Seven patients (aged 24 to 65 years) filled all the inclusion
criteria according to a protocol registered in the Research Ethics Committee, number 169/03.
Iliac-crest bone-marrow aspiration was performed under sedation and local anesthesia.
BMMC were isolated using a Ficoll gradient, and 10% of the cells were separated and labeled
with
99m
Tc and re-injected in the MCA responsible for the stroke (minimum: 1 x 10
8
and
maximum: 5 x 10
8
injected cells) after navigation (Seldinger technique). Single photon
emission computerized tomography (SPECT) and whole-body scan images were done two
and 24 hours after the procedure. Electroencephalogram was done within 7 days after
transplantation. Patients were evaluated with complete blood count, biochemical exams and
by neurological scales (National Institute of Health Stroke Scale, modified Rankin Scale, and
Barthel Index) before BMMC infusion and 1, 3, 7, 30, 60 and 120 days after. No patient
exhibited any complication or adverse events during the procedure. In six patients there was
no worsening in neurologic scales until the end of follow-up. One patient needed surgery (not
related to the BMMC infusion) one week after the procedure. He had a new ischemic stroke.
Whole-body scans and SPECT obtained two hours after infusion of labeled BMMCs showed
uptake in the brains of all patients. Due to the six-hour half-life of
99m
Tc, the brain uptake at
24h after cell infusion couldn’t be visualized in all patients. All the patients remained
monitored even after the end of follow-up (120 days) and two patients had generalized
seizures, 200 days after cell infusion. In spite of that, the scales evaluated remained the same
of the 120
th
day. In this small phase 1 pilot study, BMMC intra-arterial injection in patients
with sub-acute ischemic strokes proved feasible and safe. The fraction of labeled BMMC
stayed in the ischemic area for at least 24 hours in some patients. Phase II studies with more
patients are required to further evaluate efficacy and safety of BMMC transplantation in
patients with ischemic stroke.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fisiopatologia simplificada da lesão induzida
pelo AVC, reparo endógeno e regeneração 17
Figura 2: Penumbra isquêmica 17
Figura 3: Paciente 1 - Imagens SPECT 2h após infusão CMMO 40
Figura 4: Paciente 1 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 41
Figura 5: Paciente 1 - Imagens de corpo inteiro 24h após infusão CMMO 42
Figura 6: Paciente 2 - Imagens SPECT 2h após infusão CMMO 43
Figura 7: Paciente 2 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 44
Figura 8: Paciente 2 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO 45
Figura 9: Paciente 3 - Imagens SPECT 2h após infusão CMMO 46
Figura 10: Paciente 3 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 47
Figura 11: Paciente 3 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO 48
Figura 12: Paciente 3 - Imagem cerebral 24h após infusão CMMO 49
Figura 13: Paciente 4 - Imagens SPECT 2h após infusão CMMO 50
Figura 14: Paciente 4 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 51
Figura 15: Paciente 4 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO 52
Figura 16: Paciente 5 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 53
Figura 17: Paciente 5 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO 54
Figura 18: Paciente 6 - Imagens SPECT 2h após infusão CMMO 55
Figura 19: Paciente 6 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 56
Figura 20: Paciente 6 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO 57
Figura 21: Paciente 7 - Imagens cerebrais 2h após infusão CMMO 58
Figura 22: Paciente 7 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO 59
LISTA DE QUADROS, TABELAS E GRÁFICOS
Quadro 1: Protocolo de acompanhamento 34
Tabela 1: Características gerais dos pacientes 36
Quadro 2: Celularidade do material infundido 38
Tabela 2: Escala de AVC do Instituto Nacional Americano de Saúde
(sigla em inglês, NIHSS) da amostra 60
Tabela 3: Índice de Barthel dos pacientes 60
Tabela 4: Escala modificada de Rankin dos pacientes 61
Gráfico 1: NIHSS (abscissa) x Dias após infusão (ordenada) 61
LISTA DE ABREVIATURAS
99m Metaestável
ACM Artéria Cerebral Média
AIT Ataque Isquêmico Transitório
AVC Acidente Vascular Cerebral
CEP Comissão de Ética em Pesquisa
CMMO Células Mononucleares da Medula Óssea
CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
CTH Células-tronco Hematopoiéticas
CTM Células-tronco Mesenquimais
ECASS European Cooperative Acute Stroke Study
EEG Eletroencefalograma
EMS European Motor Scale
ESS European Stroke Scale
FC Fragment crystallizable
FDA Food and Drug Administration
FWHM Full Width at Half-max
GCSF Granulocyte Colony-stimulating Factor
GRID Gadolinium Rhodamine Dextran
HMG Hemograma
HUCFF Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
IB Índice de Barthel
MIE Membro Inferior Esquerdo
MHC Major Histocompatibility Complex
MO Medula Óssea
NIHSS National Institute of Health Stroke Scale
NINDS National Institute of Neurological Disorders and Stroke
NK Natural Killer
PET Positron EmissionTomography
RM Ressonância Magnética
rt-PA recombinant tissue Plasminogen Activator
SPECT Single Photon Emission Computed Tomography
TC Tomografia Computadorizada
TCA Tempo de Coagulação Ativado
TCE Traumatismo Crânioencefálico
TRM Traumatismo Raquimedular
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO CRÍTICA DA LITERATURA 16
2.1 ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL (AVC) 16
2.2 CÉLULAS-TRONCO 19
2.2.1 Conceito 19
2.2.2 Aplicações 21
2.2.3 Estudos experimentais/ clínicos 23
2.2.3.1 Células-tronco na cardiologia 23
2.2.3.2 Células-tronco para reparo muscular e ósseo 23
2.2.3.3 Células-tronco para doenças da pele 24
2.2.3.4 Células-tronco na neurologia 24
3 OBJETIVOS 28
3.1 OBJETIVO GERAL 28
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 28
4 PACIENTES E MÉTODOS 29
4.1 PACIENTES 29
4.2 INTERVENÇÃO 30
4.2.1 Admissão hospitalar (D0) 30
4.2.2 Aspirado da medula óssea (D1) 30
4.2.3 Separação das células 31
4.2.4 Marcação das CMMO com radioisótopo 31
4.2.5 Infusão das células 32
4.2.6 Acompanhamento durante internação (D1 a D3) 32
4.2.7 Acompanhamento após a alta hospitalar 33
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 34
4.4 MONITORIZAÇÃO DE EFEITOS ADVERSOS 34
5 RESULTADOS 35
5.1 CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA 35
5.2 SEGURANÇA DO PROCEDIMENTO 37
5.3 CELULARIDADE DO MATERIAL INFUNDIDO 38
5.4 IMAGENS 39
5.4.1 Paciente 1 40
5.4.2 Paciente 2 43
5.4.3 Paciente 3 46
5.4.4 Paciente 4 50
5.4.5 Paciente 5 53
5.4.6 Paciente 6 55
5.4.7 Paciente 7 58
5.5 ESCALAS DE AVALIAÇÃO 60
5.6 PARÂMETROS LABORATORIAIS 62
6 DISCUSSÃO 63
7 CONCLUSÃO 67
REFERÊNCIAS 68
ANEXOS 76
1 INTRODUÇÃO
O AVC é a terceira causa de morte em países desenvolvidos (MURRAY; LOPEZ,
1997) e a principal causa de morte em alguns países em desenvolvimento (WU et al, 2001),
incluindo o Brasil (ANDRÉ et al, 2006). O AVC permanece a principal causa de incapacidade
no mundo: pelo menos 30% dos sobreviventes a um AVC têm recuperação incompleta e
outros 20% necessitam de assistência com as atividades de vida diária (BONITA;
SOLOMON; BROAD, 1997). Embora alguns fatores no tratamento do AVC agudo, como as
Unidades de AVC e o uso dos trombolíticos, possam melhorar o prognóstico dos pacientes, há
poucos estudos clínicos avaliando formas efetivas de melhorar a incapacidade residual
(CRAMER, 2008). Nos últimos anos, muitos estudos investigaram o potencial papel
restaurador de células-tronco, de diferentes fontes, em modelos animais de isquemia cerebral
(MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA; ANDRÉ, 2007). Estes estudos mostraram
que a administração de células-tronco melhora a perda funcional observada após isquemia,
tornando o transplante destas células uma abordagem atrativa para restaurar a função cerebral
após AVC em humanos.
Duas instituições brasileiras diferentes (estudos clínicos fase 1) avaliaram a segurança
do transplante autólogo de células-tronco nos primeiros dez dias após AVC isquêmico
(MENDONÇA et al, 2006; de FREITAS et al, 2006). Vinte e seis pacientes (soma dos dois
estudos) com infarto no território da ACM receberam transplante autólogo de CMMO, por via
intra-arterial. Um paciente apresentou deterioração neurológica durante arteriografia cerebral,
porém antes da injeção das células-tronco. Os pacientes tratados não exibiram piora clínica e
nem lesões novas apareceram na avaliação sequencial por Ressonância Magnética (RM) de
crânio, incluindo imagem pesada em difusão. Estes estudos sugeriram que o transplante
autólogo de CMMO, via intra-arterial, é seguro nos primeiros dez dias após AVC isquêmico.
O transplante de células-tronco, após a fase aguda de uma isquemia cerebral, apresenta
alguns obstáculos. A formação de tecido cicatricial e a restauração da barreira
hematoencefálica podem afetar de forma adversa as células implantadas. Poucos modelos de
estudos animais em AVC investigaram transplante de células-tronco, meses após o infarto
(SAVITZ et al, 2002). Entretanto, há alguns estudos clínicos fase 1 e 2 que avaliaram
pacientes com AVC isquêmico crônico e transplante de células-tronco nessa fase, incluindo
pacientes até mesmo 10 anos após o evento isquêmico (KONDZIOLKA et al, 2000, 2005;
SAVITZ et al, 2005; BANG et al, 2005) e dois desses estudos utilizaram células derivadas de
teratocarcinoma humano (KONDZIOLKA et al, 2000, 2005; SAVITZ et al, 2005) e células
porcinas (SAVITZ et al, 2005), que podem provocar respostas graves de rejeição. Bang e
colaboradores examinaram a segurança e eficácia de células-tronco mesenquimais (CTM),
autólogas, expandidas em cultura e administradas via intravenosa em dois momentos: a
primeira infusão entre quatro e cinco semanas e a segunda entre sete e nove semanas após o
início dos sintomas (BANG et al, 2005). Os cinco pacientes que receberam essas células não
apresentaram efeitos adversos e tiveram melhora clínica em três e seis meses, comparados ao
grupo controle. Nesse estudo, as células da medula óssea eram cultivadas por várias semanas
antes do transplante, o que pode aumentar o risco de contaminação. Além disso, nenhum
desses estudos avaliou a cinética das células in vivo.
Baseado no exposto acima, desenhamos um estudo clínico fase I para avaliação da
segurança e exequibilidade da infusão de células mononucleares autólogas da medula óssea,
em pacientes com AVC isquêmico ocorrido em até 90 dias antes da infusão. Em todos os
pacientes do estudo uma parte das células a serem injetadas foram marcadas com tecnécio-99-
m para avaliação da cinética das CMMO após a injeção.
2 REVISÃO CRÍTICA DA LITERATURA
2.1 ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL (AVC):
AVC é a terceira causa de morte e é a maior causa de incapacidade em países em
desenvolvimento (ANDRÉ et al, 2006). A incidência de AVC varia entre os países e aumenta
exponencialmente com a idade. Nas sociedades ocidentais, aproximadamente 80% dos casos
são causados por isquemia cerebral focal devido à oclusão arterial e os outros 20%, causados
por hemorragias (FEIGIN et al, 2003).
A fisiopatologia tanto do AVC isquêmico quanto do hemorrágico tem sido muito
estudada. Um grande número de eventos celulares e metabólicos se segue após a injúria
cerebral (Fig. 1). Os mecanismos fisiopatológicos da isquemia cerebral e suas interações são
muito complexos. Inicialmente, a porção central da lesão com perfusão muito baixa é cercada
por uma área de disfunção causada por distúrbios iônicos e metabólicos, mas com integridade
estrutural preservada, a penumbra isquêmica (Fig. 2). Entretanto, após essa fase dramática de
injúria inicial, a lesão continua a crescer muitas horas e até dias após o início da isquemia.
Dependendo do grau de fluxo sanguíneo residual e da duração da isquemia, a penumbra irá,
eventualmente, ser incorporada ao infarto, se não ocorrer reperfusão
(van der WORP; van
GIJN, 2007). Portanto, quando um vaso arterial cerebral oclui, uma complexa cascata de
eventos ocorre. Células despolarizam e edemaciam, aminoácidos excitatórios e íons potássio
são liberados, enquanto os níveis de íons cálcio intracelular elevam-se rapidamente
(excitotoxicidade). Alguns mecanismos de isquemia cerebral podem ter tanto ações benéficas
quanto deletérias: (a) inflamação e interação imune-mediada, que contribuem para a expansão
da lesão, mas também são instrumentos de contenção do crescimento da lesão e reparo; o
desfecho do AVC é modulado pela interação do cérebro lesado com o sistema imune; (b)
glutamato, que tem papel importante na excitotoxicidade, mas que também é essencial para a
função cerebral normal e reorganiza a sinaptogênese após a injúria; (c) óxido nítrico,
produzido pela óxido-nítrico sintetase em resposta à injúria e que pode aumentar o fluxo
sanguíneo neuronal, mas também resulta no aumento de radicais livres. Portanto, o contexto
celular, o tempo e a intensidade do estímulo são importantes para determinar se uma mesma
molécula está em uma via de sinalização ou destruição e reparo
(ENDRES et al, 2008).
Figura 1: Fisiopatologia simplificada da lesão induzida pelo AVC, reparo endógeno e
regeneração.
Adaptada com permissão de Dr. Ulrich Dirnagl, do artigo “Improving outcome after stroke: overcoming the translational
roadblock. Cerebrovas Dis 2008;25:269”.
Figura 2: Penumbra isquêmica.
Adaptada com permissão de Dr. Ulrich Dirnagl, do artigo “Pathobiology of ischemic stroke:
an integrated view. Trend neurosci 1999;22:394”.
Baseado na duração dos sintomas, as isquemias podem ser transitórias ou permanentes
(ataque isquêmico transitório [AIT] ou AVC, respectivamente). AIT é um déficit neurológico
temporário, sem piora evolutiva, de início súbito, atribuído à isquemia focal do cérebro, retina
ou cóclea, e que dura menos que 24 horas. Entretanto, a maioria dos AITs dura de cinco a 20
minutos. Sintomas com duração maior que 24 horas são considerados AVC isquêmicos
(BILLER; LOVE; SCHNECK, 2008).
No atendimento emergencial ao paciente com sintomas sugestivos de isquemia
cerebral, o déficit neurológico deve ser investigado por um exame neurológico cuidadoso. A
escala de AVC do Instituto Nacional de Saúde Americano – NIHSS (do inglês, National
Institute of Health Stroke Scale) (BROTT et al, 1989) é a escala mais utilizada para
quantificar a gravidade do déficit. O infarto cerebral não pode ser distinguido, com certo grau
de certeza, de hemorragia intracerebral com base nos sinais e sintomas somente. Em todos os
pacientes com suspeita de AVC isquêmico, tomografia computadorizada (TC) ou RM de
crânio deve ser realizada. A TC sem contraste é suficiente, pois tem alta sensibilidade para
hemorragia intracraniana
(van der WORP; van GIJN, 2007).
Tratamento trombolítico intravenoso com ativador do plasminogênio tecidual
recombinante (sigla em inglês rt-PA), iniciado nas primeiras três horas após o início dos
sintomas, é a única terapia clínica atualmente disponível para o AVC isquêmico agudo. Um
estudo de AVC multicêntrico, randomizado (National Institute of Neurological Disorders and
Stroke Recombinant Tissue Plasminogen Activator – NINDS rt-PA) utilizando 0,9 mg/Kg de
peso de rt-PA, iniciado nas primeiras três horas após o início dos sintomas, demonstrou
probabilidade 30% maior de ter incapacidade mínima ou nenhuma incapacidade em três
meses, quando comparado com placebo
(THE NINDS STUDY GROUP, 1995). Dois estudos
europeus, European Cooperative Acute Stroke Study (ECASS) e ECASS II, investigaram um
tempo maior para o uso do trombolítico após o início dos sintomas (seis horas), mas estes
estudos falharam em mostrar eficácia (HACKE et al, 1995 e 1998). Em 2008 foram
publicados os resultados do ECASS III, onde era utilizado rt-PA intravenoso entre três e
quatro horas e meia após o início dos sintomas, ocorrendo modesta, mas significativa melhora
no desfecho clínico, sem níveis maiores de hemorragia intracraniana do que o relatado
previamente entre pacientes tratados nas primeiras três horas. Entretanto, o tratamento
precoce permanece essencial. A significância do efeito da trombólise é tempo-dependente. O
tempo “porta-agulha” (chegada ao hospital ao início da infusão intravenosa de rt-PA)
permanece importante e deve ser o mais curto possível para aumentar a chance de um
desfecho melhor (HACKE et al, 2008). Portanto, devido ao curto tempo para o tratamento,
poucos pacientes recebem esta terapia.
Reduzir o risco de eventos aterotrombóticos futuros, em pacientes com história de
AVC isquêmico, tem um papel importante na terapêutica. Devem-se utilizar agentes
antiplaquetários, inibidores da 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima-A redutase (estatinas) e anti-
hipertensivos, bem como adoção de alterações no estilo de vida (LUTSEP, 2009).
Conforme revisado por Mendez-Otero, numerosos estudos pré-clínicos e clínicos têm
sido realizados nas últimas décadas, em busca de um agente neuroprotetor para tratar os
pacientes com AVC isquêmico (MENDEZ-OTERO et al, 2007). Neuroproteção é qualquer
estratégia ou combinação de estratégias que antagonizam, interrompem ou diminuem a
sequência de eventos bioquímicos e moleculares da lesão que, caso não realizados, levariam à
injúria isquêmica irreversível (GINSBERG, 2008). Entretanto, nenhuma das drogas testadas,
até o momento, embora efetivas em estudos animais, foi eficaz em seres humanos e, portanto,
novas estratégias devem ser desenvolvidas para evitar morte neuronal e/ou restauração da
função cerebral lesada, após um AVC (MENDEZ-OTERO; de FREITAS; MENDONÇA;
ANDRÉ, 2007 e SHUAIB et al, 2007).
2.2 CÉLULAS-TRONCO:
2.2.1 Conceito:
Células-tronco são células autorrenováveis, não-diferenciadas, capazes de produzir
grande número de células diferenciadas. A característica que distingue as várias populações
de células-tronco é seu potencial para gerar diversos tipos de células especializadas. Em
outras palavras, as células-tronco podem ter características totipotenciais, pluripotenciais,
bipotenciais ou unipotenciais. O zigoto é um exemplo de células totipotenciais, pois tem
capacidade de gerar outro organismo. As células embrionárias (derivadas diretamente da
massa celular interna do embrião pré-implantação no estágio de blastocisto) representam a
população de células pluripotenciais, porque elas podem gerar todos os tecidos de um
organismo, mas não outro organismo (pois não geram a placenta e nem folhetos
extraembrionários). Usualmente, as células-tronco pluripotentes são definidas como células
que dão origem às três camadas germinativas: ectoderma (pele, tecido neural), mesoderma
(sangue, tecido adiposo, cartilagem, osso ou músculo) e endoderma (células do sistema
respiratório e digestivo). Células multipotentes são capazes de diferenciar-se em tipos
celulares múltiplos, mas dentro de certa linhagem (Ex: células-tronco hematopoiéticas,
diferenciando-se em hemácias, leucócitos e plaquetas), ou seja, com potencial mais limitado
(exemplo: sangue do cordão umbilical). O mioblasto representa um precursor de uma célula
unipotente. Ele é capaz de gerar somente um tipo celular (FILIP et al, 2008).
Células-tronco que têm pluripotência similar ou igual às células-tronco embrionárias
também podem ser derivadas de células germinativas, isto é, células germinativas
embrionárias, células de carcinoma embrionário (de tumores testiculares adultos) e células de
linhagem germinativa derivadas de células-tronco espermatogoniais ou de células de
superfície de ovários adultos. As células-tronco persistem na vida adulta, mas o dogma tem
sido se estas células-tronco adultas são mais restritas em sua capacidade de diferenciar e,
também, se são somáticas ou órgão-específicas (BELLEHSEN; NAGLER; LEVI-
SCHAFFER, 2008).
As células-tronco adultas multipotentes (células indiferenciadas) residem com células
diferenciadas nos seus tecidos de origem, com nomenclatura correlacionada. As células
progenitoras e as células-tronco adultas têm um papel reparativo, repondo as células e
mantendo ciclo normal dos órgãos regenerativos, como o sangue, pele ou tecido intestinal
(FARIN et al, 2009). As células do estroma mesenquimal adulto são células multipotentes e
indiferenciadas, as quais residem, primariamente, na medula óssea e têm potencial de
diferenciar-se em múltiplos fenótipos esqueléticos, como osteoblastos, condrócitos,
adipócitos, células do estroma, fibroblastos e, possivelmente, tendões. No corpo humano, elas
podem ser vistas como reservatórios disponíveis de células reparadoras, capazes de mobilizar-
se, proliferar-se e diferenciar-se ao tipo celular apropriado em resposta a sinais específicos
(CAPLAN, 2007).
Um nicho de células-tronco pode ser definido como um sítio específico ou reservatório
definido, composto não somente de células de suporte, mas também de glicoproteínas da
matriz organizadas em uma matriz funcional tridimensional. O contato entre esses elementos
permite interações moleculares e sinalizadoras que são cruciais para a regulação da
quiescência das células-tronco, autorrenovação, diferenciação e proliferação, bem como
fatores que influenciam a mobilização e homing da progenitora. A regulação da
autorrenovação e diferenciação das células-tronco adultas é crucial para a manutenção da
homeostase tecidual. Portanto, a estrutura do nicho não somente providencia um ambiente
propício à célula-tronco, mas também determina o estado apropriado regulado por
mecanismos intrínsecos e moleculares (MORRISON; SPRADLING, 2008). Células-tronco
adultas e seus nichos têm sido identificados em diferentes tipos de tecidos em mamíferos,
incluindo o sistema hematopoiético, sistema epitelial, sistema intestinal e sistema nervoso (LI;
XIE, 2005).
Em estado de repouso, a grande maioria das células-tronco hematopoiéticas (CTH) é
quiescente, com somente uma fração dessas células entrando em um estado cíclico para
proliferar e dar origem às “células-filhas”, que ir-se-ão proliferar e diferenciar como
progenitoras de linhagens de células sanguíneas maduras. Tem sido estimado que bilhões de
células sanguíneas sejam produzidas, a cada hora, em um organismo humano adulto saudável,
durante a vida e, na maioria das circunstâncias, essa enorme produção é balanceada por perda
celular programada, mantendo o número de células circulantes relativamente constante.
Entretanto, quando ocorre estresse sistêmico como infecção, sangramento agudo ou
quimioterapia, as CTH são recrutadas a responder com proliferação extensa, para manter
progenitores suficientes, suprindo a necessidade das células sanguíneas (BRYDER; ROSSI;
WEISSMAN, 2006).
2.2.2 Aplicações:
Transplante de CTH refere-se a qualquer procedimento onde células hematopoiéticas
serão fornecidas para um receptor, com a intenção de repovoar ou substituir o sistema
existente, em parte ou no total. Tradicionalmente, o transplante de CTH é realizado após um
regime de alta dose de quimioterapia, com ou sem irradiação, para ablação da medula óssea e
das células tumorais. Células-tronco colhidas são, então, transfundidas para repovoar a
medula e restaurar a competência hematológica e imunológica. O transplante de CTH repõe o
termo antigo utilizado “transplante de medula óssea” para indicar a gama de fontes de células
doadoras disponíveis: medula óssea, células-tronco periféricas e sangue do cordão umbilical.
As células-tronco podem ter origem no próprio paciente (autólogas), num gêmeo idêntico –
singênica - ou em um doador – halogênica (JAGANNATHAN et al, 2008).
O uso de terapias imunes e celulares para tratar doenças hematológicas vem sendo
estabelecido. Nos últimos 50 anos, o transplante de células hematopoiéticas desenvolveu-se
em terapia curativa para uma variedade de estados de falência da medula óssea, malignidades
hematológicas, imunodeficiências e erros inatos do metabolismo. Observação do efeito tumor
contra enxerto vem providenciando fundamento para o tratamento de malignidades
hematológicas com infusão de leucócitos do doador que exploram a resposta halogênica dos
linfócitos T do doador, e experimentos com infusão de outras populações celulares efetoras
halogênicas como as células natural killer (NK). Durante esta era, investigadores têm feito
acentuado progresso para doadores alternativos para transplante e medidas para prevenir e
tratar doença enxerto contra hospedeiro e infecções (McGLAVE, 2008).
As CTH possuem propriedades únicas que têm permitido, no contexto do transplante
de medula óssea, ser o único tipo de célula-tronco no uso clínico rotineiro. Primeiro: embora a
maioria das CTH normalmente residam no espaço extravascular na medula óssea, também
possuem incrível habilidade de retornar a seus nichos após injeção na circulação venosa. Esta
habilidade de recircular parece estar ligada às propriedades naturais das CTH, pois elas
migram entre a medula óssea, o sangue, a linfa e órgãos extramedulares em condições
fisiológicas. Portanto, as CTH podem ser injetadas endovenosamente ao invés de diretamente
na medula do recipiente, tornando seu uso clínico relativamente fácil. Segundo: aumentando a
propriedade circulatória das CTH usando agentes farmacológicos como fator estimulador das
colônias de granulócitos (sigla em inglês, GCSF) pode-se obter, rotineiramente, CTH do
sangue periférico de doadores saudáveis ao invés de obtê-las da medula óssea (procedimento
mais invasivo). Finalmente, CTH expressam uma combinação única de marcadores de
superfície celular que permitem sua purificação (BHATTACHARYA; EHRLICH;
WEISSMAN, 2008).
Um grande número de barreiras clínicas, entretanto, permanece, dificultando o uso
rotineiro do transplante de medula óssea para o tratamento das doenças hematológicas, como
toxicidade do regime usual pré-transplante autólogo de CTH e complicações da doença
enxerto contra hospedeiro (HAROUSSEAU, 2007).
Indicações estabelecidas (JAGANNATHAN et al, 2008):
- Doenças malignas:
a) Mieloma Múltiplo;
b) Linfoma não – Hodgkin;
c) Linfoma de Hodgkin;
d) Leucemia Mielóide Aguda;
e) Síndrome Mielodisplásica;
f) Leucemia Linfoblástica Aguda;
g) Leucemia Mielóide Crônica;
h) Leucemia Linfocítica Crônica;
i) Neuroblastoma, tumores de células germinativas e outras malignidades sólidas.
- Doenças não-malignas:
(A) Talassemia;
(B) Anemia falciforme
(C) Anemia aplástica
(D) Algumas desordens genéticas e imunológicas.
2.2.3 Estudos experimentais/ clínicos:
O uso de populações de células progenitoras e de células-tronco diferentes de CTH
para reparar tecidos de origem, bem como outros tecidos, está em intensa fase de
investigação.
2.2.3.1 Células-tronco na cardiologia: a ideia de reparar o tecido cardíaco usando diferentes
tipos de células-tronco tem levado a diferentes estudos experimentais. Esforços são feitos para
restaurar a função do coração lesado com transplante de células-tronco não-residentes, como
cardiomiócitos fetais, células-tronco embrionárias, células musculares esqueléticas, CTM
derivadas da medula óssea
ou células-tronco derivadas do tecido adiposo (LAFLAMME;
MURRY, 2005). Diferentemente das células-tronco embrionárias, não há evidência
convincente que células de tecidos pós-natal outros que não o coração, possam gerar
cardiomiócitos funcionais in vivo. Estudos clínicos têm sugerido que somente 1,3 a 2,6% das
células-tronco derivadas da medula óssea ficam retidas no coração. Benefícios funcionais
também podem ser mediados através da secreção parácrina de fatores de crescimento ou
citocinas, as quais podem, indiretamente, promover a sobrevida dos cardiomiócitos,
mobilização de células progenitoras endógenas ou neovascularização (ROSENZWEIG,
2006).
2.2.3.2 Células-tronco para reparo muscular e ósseo: a capacidade regenerativa da
musculatura esquelética é atribuída às células-tronco musculares, também conhecidas como
células satélite. Atualmente é bem aceito que as CTM constituem uma fonte de progenitores
de tecidos derivados do mesoderma, como osso, cartilagem e gordura. Essas CTM
multipotentes podem ser isoladas baseadas nas suas propriedades plásticas e de aderência e
podem ser expandidas em culturas, de forma relativamente fácil. O reconhecimento de seu
potencial terapêutico é um avanço importante na terapia celular: está bem estabelecido seu
uso no reparo tecidual ósseo (reparo de defeitos ósseos segmentares de tamanho crítico em
animais, restaurar cicatrização de fraturas de ossos longos nos seres humanos ou tratar ossos
de crianças com osteogênese imperfeita), pouco se sabendo a respeito das vias de sinalização
e determinantes moleculares envolvidos na diferenciação miogênica das CTM (GARCIA-
CASTRO et al, 2008).
2.2.3.3 Células-tronco para doenças da pele: terapias celulares com queratinócitos têm sido
praticadas com sucesso. Reconstituição da barreira epidérmica funcional com regeneração da
derme papilar tem sido realizada com camadas epidérmicas autólogas em pacientes com
queimaduras de pele, bem como em outras doenças de pele (PROSPER; VERFAILLIE,
2008).
O uso de células-tronco como material básico na engenharia tecidual tem o potencial
de melhorar desfechos clínicos tanto em cicatrização de feridas e em terapia genética para
doenças cutâneas e sistêmicas. Estudos de engenharia tecidual de pele têm mostrado que
células-tronco epidérmicas podem fornecer uma fonte superior de células-tronco
multipotentes para engenharia tecidual. Entretanto, avanços na engenharia tecidual de pele são
necessários para a aplicação clínica (CHARRUYER; GHADIALLY, 2009).
2.2.3.4 Células-tronco na neurologia: o ponto-chave no tratamento das doenças
neurológicas é que o processo de lesão neuronal é frequentemente irreversível, porque os
neurônios do cérebro e da medula espinhal são incapazes de regenerar espontaneamente
(EINSTEIN; BEN-HUR, 2008).
Embora tenha sido sugerido que possa haver transdiferenciação das CTM em células
de linhagem neural in vitro , nenhum grupo ainda observou que as CTM dão origem a
neurônios completamente diferenciados e funcionais. A maioria dos dados atuais indica que
fatores bioativos (neurotrofinas e fatores de crescimento), secretados pelas CTM, em resposta
ao ambiente local, são os responsáveis pelos efeitos restauradores das CTM (LI; CHOPP,
2009).
a) No traumatismo crânio-encefálico (TCE): modelos experimentais demonstraram
que as CTM derivadas de ratos doadores transplantadas no cérebro de roedores, intracerebral
(MAHMOOD et al, 2002), intra-arterial (LU et al, 2001a) ou intravenoso (LU et al, 2001b)
-
com TCE induzido por contusão, melhorou significativamente o desfecho neurológico. Um
estudo Fase I, que avaliará a infusão intravenosa de células autólogas, mononucleares,
derivadas da medula óssea de crianças após TCE grave, está em andamento (NCT 00254722).
b) Na lesão de medula espinhal: uma das terapias celulares que vem sendo estudada
para lesões na medula espinhal é o transplante de células gliais do bulbo olfatório na tentativa
de restabelecer conexões através da cicatriz glial. Nesta terapia, o objetivo não é o de
substituir neurônios perdidos, mas permitir o crescimento axonal através da cicatriz de glia.
(MENDEZ-OTERO et al, 2007). Estudos publicados em traumatismo raqui-medular (TRM)
têm encontrado efeitos positivos na administração local de células-tronco derivadas da medula
óssea, comparado à administração endovenosa (SYKOVA et al, 2006).
c) Na Doença de Parkinson: modelos de parkinsonismo têm sido estudados mais
extensivamente do que qualquer outra doença neurológica degenerativa (MEZEY, 2007).
Transplante de células-tronco derivadas da medula óssea melhorou a função motora em
modelo animal de Doença de Parkinson (LI et al, 2001).
d) Células-tronco em AVC isquêmico: estudos experimentais têm demonstrado que o
transplante de CTM facilitam os mecanismos de neuro-restauração endógenos, incluindo
redução da apoptose (CHEN et al, 2003a), e promoção do remodelamento glial, neuronal (LI
et al, 2005 e SHEN et al, 2007), e vascular (CHEN et al, 2003b), não sendo esses eventos
mutuamente exclusivos. Uma revisão recente mostrou que muitos estudos evidenciaram, em
modelos animais variados de AVC isquêmico, melhora na recuperação funcional dos animais.
Foram utilizadas CTM e/ou células da medula óssea (MEZEY, 2007).
Baseado nesses resultados, Bang e colaboradores examinaram a segurança,
exequibilidade e eficácia da terapia celular usando CTM autólogas, expandidas em cultura,
em pacientes com AVC isquêmico. Concluíram que, em pacientes com infarto cerebral grave,
a infusão endovenosa de CTM autólogas parece ser segura e exequível e pode melhorar a
recuperação funcional do paciente (BANG et al, 2005).
Outro estudo clínico, fase I, observou pacientes com AVC isquêmico agudo (entre três
e dez dias após o início dos sintomas), realizando infusão intra-arterial (via artéria femoral) de
células mononucleares autólogas da medula óssea, com resultados preliminares demonstrando
segurança e exequibilidade (de FREITAS et al, 2006).
Dados limitados existem a respeito do uso de células exógenas em pacientes que
tiveram AVC isquêmico. A segurança e viabilidade do transplante intracerebral de células
neuronais culturadas foi estabelecido em dois estudos utilizando neurônios da Layton Bio
Science – LBS (KONDZIOLKA et al, 2000 e 2005). Entretanto, apesar de haver melhora no
déficit motor dos pacientes, traduzindo-se em melhora na capacidade de algumas atividades
de vida diária, o estudo fase 2 não encontrou evidência de benefício significativo na função
motora, que era o objetivo primário do estudo (KONDZIOLKA et al, 2005).
Investigadores de Boston avaliaram a segurança do transplante de células fetais suínas
através de cirurgia estereotáxica em cinco pacientes na fase crônica (três meses a dez anos
antes) do AVC isquêmico acometendo os gânglios da base (SAVITZ et al, 2005). As células
foram retiradas da eminência gangliônica lateral, que são derivadas do striatum primitivo.
Para evitar rejeição, as células foram tratadas antes do transplante com um fragmento F (ab’)
2
contra o Complexo Maior de Histocompatibilidade (sigla em inglês, MHC) classe I sem a
região Fragment crystallizable (Fc). Os três primeiros pacientes não apresentaram efeitos
colaterais em um acompanhamento de quatro anos. O quarto paciente teve piora progressiva
da hemiparesia esquerda. A RM de crânio mostrou captação de contraste no lobo frontal
direito. Biópsia desse local mostrou necrose e inflamação sugestivas de infarto e o paciente
foi tratado com corticóide com boa reposta. Um comitê de avaliação independente considerou
o evento como sendo um infarto por uma oclusão venosa provavelmente secundária à
cirurgia. O quinto paciente teve crises convulsivas parciais complexas e generalizadas
atribuídas à hiperglicemia. A RM de crânio mostrou captação de contraste no lobo frontal
direito e na área de isquemia. Devido a esses efeitos adversos o estudo foi interrompido pelo
Food and Drug Administration - FDA (MENDEZ-OTERO et al, 2007).
Muitos ensaios utilizaram fatores tróficos para estudar a diminuição da incapacidade
dos pacientes com AVC isquêmico. Dentre eles, predominam os que utilizaram granulocyte
colony stimulating factor (G-CSF). Um estudo randomizado e cego de Shyu e colaboradores
(2006) avaliou a segurança e eficácia da administração subcutânea de G-CSF (15µg/Kg/dia)
por cinco dias, iniciando nos sete primeiros dias após o evento isquêmico, em 10 pacientes
com AVC no território da artéria cerebral média e com a escala de AVC do Instituto Nacional
de saúde americano (sigla em inglês NIHSS) entre 9 e 20. Os sete pacientes que receberam G-
CSF tiveram maior percentual de melhora neurológica entre avaliação inicial e 12 meses do
que os três pacientes do grupo controle (p. ex. 59% vs. 36% de melhora no NIHSS, p < 0,05).
Foram utilizadas quatro escalas nesta avaliação: NIHSS, Escala de AVC Européia (sigla em
inglês, ESS), Subescala Motora da ESS (sigla em inglês, EMS) e Índice de Barthel (sigla em
inglês, BI). Além disso, exame de tomografia por emissão de pósitrons (sigla em inglês, PET)
com fluordeoxiglicose mostrou melhora do metabolismo cerebral na área cortical peri-infarto
dos pacientes tratados em comparação com os pacientes do grupo controle. De forma
interessante, houve correlação entre o metabolismo cerebral avaliado pelo PET e a função
motora medida através da escala motora da ESS. Outro dado relevante foi que os pacientes
que receberam G-CSF no primeiro dia (D1) pós-AVC parecem ter tido maior recuperação do
que os que receberam numa fase mais tardia.
Baseado nos estudos experimentais e clínicos acima, desenhamos um estudo clínico
fase I para avaliação da segurança e exequibilidade da infusão de células mononucleares
autólogas da medula óssea, em pacientes com AVC isquêmico em território da artéria cerebral
média, com até 90 dias após o início dos sintomas. Estudamos, também, a cinética destas
células através de marcação com radioisótopo, abordagem ainda não feita no campo da
neurologia. A evolução, clínica e laboratorial, foi avaliada durante o seguimento do estudo,
sendo todos os eventos registrados e descritos.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a segurança e a exequibilidade do transplante autólogo de células
mononucleares marcadas da medula óssea em pacientes com AVC isquêmico no território da
artéria cerebral média, em até 90 dias após o AVC.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Descrever a cinética das células mononucleares autólogas derivadas da medula
óssea marcadas com radiotraçador, duas e 24 horas após infusão na artéria
cerebral média.
• Avaliar modificação dos parâmetros clínicos através de escalas de avaliação
motora e funcional e medir a variação de parâmetros hematológicos e
bioquímicos na corrente sanguínea ao longo do seguimento.
• Descrever os eventos adversos observados durante o seguimento.
4 PACIENTES E MÉTODOS
4.1 PACIENTES:
Este é um estudo clínico fase 1, unicêntrico, realizado no Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho (HUCFF). O protocolo e o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa do HUCFF (CEP
169/03) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Protocolo de Pesquisa nº 10385 –
CONEP), sob o título “Terapia celular pelo transplante autólogo de células-tronco de medula
óssea em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico”. Também foi registrado no
portal www.clinicaltrials.gov (NCT00473057). O TCLE foi obtido de todos os participantes.
Pacientes entre 18 e 75 anos de idade eram elegíveis para o estudo se tivessem as
seguintes características:
(1) AVC isquêmico em território da ACM, evidenciado por TC ou por RM, dentro de 90 dias
após os sintomas;
(2) recanalização da ACM envolvida, avaliada por estudo de Doppler transcraniano ou por
angio-ressonância de crânio;
(3) uma pontuação entre 4 e 17 no NIHSS;
(4) Assinatura do TCLE.
Foram excluídos pacientes que preenchessem qualquer dos seguintes critérios:
(a) dificuldade em obter acesso vascular para procedimento percutâneo;
(b) estenose de carótida maior que 50% ao estudo de Doppler (ipsilateral ao AVC);
(c) piora neurológica (maior do que 4 pontos no NIHSS) antes da injeção, devido a edema ou
hemorragia intracerebral;
(d) trombofilias ou doenças hematológicas primárias;
(e) desordens neurodegenerativas;
(f) AVC prévio com Escala modificada de Rankin maior que 2;
(g) trombo intracardíaco;
(h) desordens autoimunes;
(i) sepsis (de acordo com critérios definidos pela Sociedade de Terapia Intensiva e Colégio
Americano de Médicos Torácicos, de 1992);
(j) história de neoplasia ou outra doença associada que tivesse impacto na sobrevida do
paciente a curto prazo;
(k) qualquer condição que, no julgamento dos investigadores, poderia colocar o paciente sob
risco;
(l) desordens ósseas que pudessem aumentar o risco do procedimento de coleta de aspirado da
medula óssea;
(m) insuficiência hepática;
(n) insuficiência renal (creatinina sérica maior que 2 mg/mL);
(o) instabilidade hemodinâmica ou respiratória;
(p) AVC lacunar;
(q) gravidez;
(r) participação em outro ensaio clínico.
4.2 INTERVENÇÃO:
4.2.1 Admissão hospitalar (D0):
Os pacientes foram admitidos na véspera do procedimento, sendo esse considerado o
D0 de protocolo. Neste dia, o paciente foi submetido à avaliação clínica e visita pré-
anestésica. Foi realizada hidratação venosa com solução salina (1000 mL em infusão
contínua, 12 horas antes e 12 horas após o final da intervenção).
O uso prévio de medicações para hipertensão arterial sistêmica e diabetes era suspenso
apenas no dia da intervenção, devido ao jejum prolongado (cerca de 10 horas), retornando
após a infusão das CMMO.
4.2.2 Aspirado da medula óssea (D1):
Antes do encaminhamento ao centro cirúrgico, foram coletadas amostras de sangue
para exames laboratoriais e obtenção de soro autólogo para suspensão das CMMO. No centro
cirúrgico, os pacientes foram submetidos à sedação venosa, objetivando Escala de RASS -3
(ELY et al, 2003). As células foram obtidas com o paciente em decúbito ventral, após
anestesia local, através de aspirado de medula da crista ilíaca póstero-superior (cerca de 20
aspirações, sendo 10 em cada crista ilíaca), obtendo-se um volume total de 100 mL.
Procedimento este, realizado por um hematologista, conforme protocolo utilizado pelo
Serviço de Hematologia do HUCFF, baseado em um protocolo Iugoslavo (BATINIC et al,
1990). Após observação na Unidade de Recuperação Pós-Anestésica, o paciente foi
encaminhado ao quarto.
4.2.3 Separação das células:
O material proveniente da aspiração era, então, encaminhado ao Laboratório de
Marcação de Células e Moléculas do Serviço de Medicina Nuclear do HUCFF em 20 seringas
heparinizadas contendo 5 mL de aspirado de medula óssea (MO) em cada. Após filtração de
coágulos, gordura e espículas ósseas, foi iniciada a separação de células por centrifugação
(400xg) em gradiente de Ficoll-Hypaque. O anel contendo as CMMO foi diluído em albumina
a 5% e soro autólogo em um total de 20 mL, esperando-se uma contagem de 5 – 10 x 10
7
células (PERIN et al, 2003). Da solução contendo as CMMO, foram retiradas pequenas
alíquotas para:
contagem celular;
imunofenotipagem por citometria de fluxo em aparelho BD FACSCanto™ classe 1,
realizada no Laboratório de Terapia Celular do Instituto Nacional de Cardiologia de
Laranjeiras;
culturas (germes comuns e fungos), encaminhadas ao Laboratório de Bacteriologia do
HUCFF;
marcação celular com radioisótopo.
4.2.4 Marcação das CMMO com radioisótopo:
Uma alíquota (10%) da solução final contendo as CMMO foi incubada com 500 µl de
cloreto estanoso (SnCl
2
) em solução fisiológica de cloreto de sódio (NaCl 0,9%) por 10
minutos em temperatura ambiente, conforme técnica desenvolvida no Laboratório de
marcação de células e moléculas (LMCM) /UFRJ, para marcação com
99m
tecnécio
(GUTFILEN et al, 1999). A seguir, as células foram incubadas por mais 10 minutos com 45
mCi de
99m
Tecnécio. Após centrifugação (500 x g por cinco minutos), o sobrenadante foi
removido e lavado novamente com solução salina. A viabilidade das células marcadas foi
avaliada pelo teste de exclusão vital com azul de trypan (CARVALHO et al, 2008; CORREA
et al, 2007). A eficiência da marcação (%) foi calculada pela atividade no precipitado (pellet)
dividida pela soma da radioatividade no precipitado mais o sobrenadante, multiplicado por
100. A viabilidade das células foi superior a 93% em todos os casos. As células marcadas
foram agregadas ao restante da suspensão de CMMO, sendo a solução (volume final: 10 mL)
transferida para uma seringa e encaminhada à Unidade de Hemodinâmica. O procedimento de
separação e marcação das células ocorreu em, aproximadamente, quatro horas. Todos os
procedimentos foram realizados em condições estéreis, em capela de fluxo laminar.
4.2.5 Infusão das células:
Esta solução foi injetada lentamente na artéria cerebral média do próprio paciente
(autóloga), ipsilateral ao AVC, através da técnica de Seldinger, via cateter introduzido na
artéria femoral, por um único hemodinamicista, especializado em arteriografia cerebral. A
técnica utilizada foi a coaxial de rotina, com punção de artéria femoral com cateter guia de
diâmetro 6 french (Envoy-Cordis, Miami, Fla ou Guider-Soft tip- Boston Scientific-Target
Therapeutics- Fremont, Califórnia), posicionado em nível cervical com infusão contínua de
solução salina. Os pacientes foram anticoagulados com heparina endovenosa para obter um
tempo de coagulação ativado (TCA) duas a três vezes o nível normal e todo o procedimento
foi monitorizado por arteriografia cerebral. Um microcateter de diâmetro interno maior (SL
1018 Boston Scientific – Target Therapeutics, Fremont, California) foi introduzido até a
porção M1 da ACM e a infusão foi realizada em, aproximadamente, 10 minutos. Pacientes
receberam entre 1,25 x 10
8
e 5 x 10
8
CMMO, e o procedimento demorou, em média, uma
hora. Anestesia local e sedação leve (Escala de RASS -1), esta procedida por anestesiologista
do Serviço de Hemodinâmica, foi realizada durante o procedimento.
4.2.6 Acompanhamento durante internação (D1 a D3):
Os pacientes foram submetidos à cintilografia de corpo inteiro e à tomografia
computadorizada com emissão de fóton único (sigla em inglês SPECT) no Serviço de
Medicina Nuclear do HUCFF, utilizando câmera Xeleris (General Electric Medical Systems,
Milwaukee, Wisconsin), duas e vinte e quatro horas após a infusão das CMMO, para avaliação
da localização das mesmas. Imagens de corpo inteiro (anterior e posterior) foram adquiridas
por 20 minutos, usando um explorador de duas cabeças de alta resolução e colimador de baixa
energia. As imagens planares foram adquiridas por 10 minutos, matriz 256 x 256, incidência
anterior, lateral direita e esquerda e posterior. O SPECT foi realizado com dois detectores de
rotação opostos com colimadores de alta resolução e baixa energia. O equipamento utilizado
para reconstrução da imagem (software e hardware) foi uma estação de trabalho processadora
GE-Xeleris, para reconstrução das imagens do SPECT. Projeções foram coletadas em 24
minutos, com cada detector usando rotação de 180° para completar 360° numa órbita circular
do crânio do paciente, em decúbito dorsal. Os volumes das imagens foram reconstruídos
usando o algoritmo OSEM com alisamento axial e filtro Butterworth com ordem de 5 e ponto
de corte 0,45. Volumes de imagens consistiram de 64 x 64 x 64 voxel cada um medindo 4,38
mm³. O detector de distância variou de 14 a 20 cm durante a rotação, resultando em resolução
espacial completa com full width at half-max (FWHM), de aproximadamente 12 mm. Para
cada paciente, a captação no cérebro, fígado, baço, pulmões, bexiga e corporal total foram
avaliados após a injeção celular em imagens planares. A percentagem de captação nos
hemisférios direito e esquerdo foi quantificada em imagens de SPECT para todos os
pacientes.
Avaliação clínica e laboratorial foi realizada após os exames cintilográficos e 48h após
a infusão das CMMO, onde os pacientes, estando em condições de alta, eram liberados do
hospital. Estas avaliações tinham o objetivo de detectar possíveis complicações imediatas do
procedimento. Também foram utilizadas escalas de avaliação motora e funcional: NIHSS,
Índice de Barthel (IB) e Escala modificada de Rankin (EmR).O Quadro 1 detalha todo o
protocolo de acompanhamento.
4.2.7 Acompanhamento após a alta hospitalar:
As avaliações de seguimento foram realizadas em 7, 30, 60, 90 e 120 dias após a
infusão das CMMO, por meio das escalas clínicas supracitadas e de testes laboratoriais de
rotina (hemograma completo e bioquímica), os quais eram realizados no laboratório de
análises clínicas do HUCFF. Um eletroencefalograma (EEG) foi realizado nos primeiros sete
dias após a infusão das CMMO, pelo Serviço de Neurologia do HUCFF.
Quadro 1. Protocolo de Acompanhamento: este quadro informa todos os exames
laboratoriais realizados, nas respectivas datas de avaliação.
D0 INFUSÃOD
1
ALTA D3 DIA 7 DIA 30 DIA 60 DIA 120
Glicose x x x x x x x
Sódio x x x x x x x
Uréia x x x x x x x
Creatinina x x x x x x x
HMG compl. x x x x x x x
Plaquetas x x x x x x x
EEG -- -- -- x -- -- --
EmR x x x x x x x
NIHSS x x x x x x x
IB x x x x x x x
EEG, eletroencefalograma; EmR, Escala modificada de Rankin; HMG compl., hemograma completo; IB, Índice
de Barthel; D0, Dia da internação hospitalar; D1, Dia da infusão celular; D3, 3° dia de infusão celular; D7, 7°
dia de infusão celular; D30, 30° dia de infusão celular; D60, 60° dia de infusão celular; D120, 120° dia de
infusão celular; NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale.
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram discutidos com Dr. Ronir Raggio Luiz (professor associado de
Estatística da UFRJ) e, devido ao reduzido número de pacientes e ao tipo de estudo
observacional, foi realizada apenas análise descritiva dos dados.
4.4 MONITORIZAÇÃO DE EFEITOS ADVERSOS
A avaliação quanto à possível relação entre efeitos adversos e a infusão de CMMO
foram avaliadas por dois neurologistas não ligados diretamente à avaliação dos pacientes.
Qualquer alteração clínica ou laboratorial, ligada ou não ao procedimento, também era
comunicada ao Comitê de Ética e Pesquisa, através de relatório.
5 RESULTADOS:
5.1 CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA:
As características clínicas e radiológicas dos pacientes incluídos estão na Tabela 1,
sendo todos do sexo masculino. Dois pacientes estavam em uso de anticoagulante oral, que
foi trocado por heparina de baixo peso molecular subcutânea (enoxaparina 1 mg/Kg duas
vezes ao dia), uma semana antes do procedimento. Foram incluídos sete pacientes, no período
de dezembro de 2006 a maio de 2008.
Tabela 1: Características gerais dos pacientes: esta tabela informa as características
clínicas e radiológicas dos pacientes antes da infusão das CMMO, bem como a avaliação
do NIHSS, IB e EmR no dia da infusão.
Pac 1 Pac 2 Pac 3 Pac 4 Pac 5 Pac 6 Pac 7
Sexo/
Idade
M/24 M/ 65 M/ 47 M/ 65 M/ 57 M/47 M/ 60
Fator de
risco
FOP HAS/ DM/
DLP
HAS FA/ DM HAS HAS HAS/ DM
Sintomas
Afasia,
Hemipl.
Disartria,
Hemipl.
Afasia,
Hemip.
Afasia,
Hemipl.
Disartria,
Hemipl.
Disartria,
Hemipl.
Disartria,
Hemipl.
Local do
infarto
Esquerdo Direito Esquerdo Esquerdo Direito Direito Direito
Mecan. do
AVC
Cardioem. Aterotr. Durante
clip.
aneurisma
Cardioem. Aterotr. Aterotr. Aterotr.
Tto
agudo
Conserv. Conserv. Conserv. rt-PA IV rt-PA IV rt-PA IV +
IA +
craniect.
Craniect.
Transf.
Hemorr.
Não Sim Não Sim Não Sim Não
D1:
NIHSS/
IB/ EmR
(dias após
o AVC)
7/ 100/ 2
(67)
9/ 35/ 4
(82)
4/ 95/ 1
(62)
13/ 25/ 5
(72)
9/ 30/ 4
(59)
13/ 10/ 5
(73)
13/ 20/ 5
(89)
Aterotr, Aterotrombótico; Cardioem, Cardioembólico; Clip, clipagem; Conserv, conservador; Craniect,
Craniectomia; DLP, dislipidemia; DM, Diabetes Melitus; EmR, Escala modificada de Rankin; FA,
Fibrilação atrial; FOP, Forâmen oval patente; HAS, Hipertensão arterial sistêmica; Hemip, hemiparesia;
Hemipl, Hemiplegia; Hemorr, Hemorrágica; IA, Intra-arterial; IB, Índice de Barthel; IV, intravenoso; M,
Masculino; Mecan, mecanismo; NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale; Pac, Paciente; Transf,
transformação; Tto, tratamento.
5.2 SEGURANÇA DO PROCEDIMENTO
Não houve efeitos adversos relacionados ao procedimento, tampouco alteração clínica
e laboratorial nos primeiros sete dias do acompanhamento. Os EEG de todos os pacientes
demonstravam ritmo difusamente lento nas respectivas áreas isquêmicas. O EEG do paciente
3, além de lentificação, demonstrou surtos de pontas, ondas agudas e ondas irregulares, na
projeção temporal esquerda (local da isquemia), mas sem expressão clínica. Apenas o
paciente 1 fazia uso regular de fenitoína (100 mg, três vezes ao dia), devido à crise convulsiva
no dia do AVC.
Na fase de avaliação pré-internação do paciente 7, observamos diminuição de pulso
arterial periférico (dorsal do pé e tibial posterior) e história de claudicação intermitente no
membro inferior esquerdo (MIE). A arteriografia cerebral para infusão das CMMO foi
realizada, portanto, através da canulização da artéria femoral direita. Durante este
procedimento, foi constatado que a ACM direita (envolvida no AVC), estava ocluída.
Entretanto, como havia muitos ramos de colaterais, optamos pela infusão das células. O
exame prévio realizado (Doppler transcraniano), para averiguação da patência da ACM, não
demonstrava oclusão. Não houve alteração clínica nem laboratorial nos primeiros sete dias
após o procedimento. Após avaliação por um cirurgião vascular (encaminhado por seu médico
clínico), o paciente foi submetido à revascularização do MIE, sob anestesia geral. Apresentou
hipotensão arterial durante o ato cirúrgico e piora do déficit motor no pós-operatório. À RM
de crânio, foi evidenciado novo evento isquêmico no território da ACM direita.
Os pacientes permaneceram em acompanhamento no Ambulatório de Neurologia do
HUCFF após o período de acompanhamento do protocolo. Dois destes (pacientes 5 e 6),
apresentaram crise convulsiva tônico-clônica generalizada após, aproximadamente, 200 dias
da infusão das CMMO. O paciente 5 foi tratado com fenitoína (100 mg, três vezes ao dia) e o
paciente 6, com duas drogas: oxcarbazepina (300 mg, três vezes ao dia) e lamotrigina (100
mg/ dia), pois apresentou alergia à fenitoína e as crises não foram controladas com uma droga
anti-epiléptica somente. Apesar das crises convulsivas, não houve alteração nas escalas de
avaliação, comparado ao D120 de acompanhamento.
Todos os pacientes foram submetidos a um método de imagem (TC ou RM de crânio)
por volta de 180 dias. À exceção do paciente 7, anteriormente descrito, nenhum apresentou
novas lesões vasculares (isquêmicas ou hemorrágicas) ou lesões expansivas.
5.3 CELULARIDADE DO MATERIAL INFUNDIDO
A média da infusão total de células na ACM foi de 3,2 x 10
8
, variando entre 1 x 10
8
e
5 x 10
8
. O Quadro 2 demonstra a celularidade de cada paciente. Os dados da celularidade do
paciente 7 não estão disponíveis até o momento.
Quadro 2: Celularidade do material infundido: este quadro demonstra a celularidade do
material infundido, avaliada através de imunofenotipagem por citometria de fluxo em
aparelho BD FACSCanto™ classe 1
Pacientes Infundidas (x10
8
) CMMO (%) CTM (%) CTH (%)
1
5,0 x 10
8
66 0,15 1,10
2
1,25 x 10
8
65 0,27 3,39
3
3,9 x 10
8
69 0,09 4,68
4
4,0 x 10
8
73 1,73 2,51
5
3,2 x 10
8
73 0,07 0,67
6
1,0 x 10
8
58 0,04 2,02
7
4,0 x 10
8
x x x
CMMO, células mononucleares da medula óssea; CTH, células-tronco hematopoiéticas;
CTM, células-tronco mesenquimais.
5.4 IMAGENS
As imagens de corpo inteiro, obtidas duas horas após a infusão das CMMO marcadas,
mostraram captação no cérebro de todos os pacientes. A localização das células pode ser
melhor visualizada nas imagens de SPECT do que nas imagens corporais totais. O SPECT do
paciente 2 permite pouca visualização das células marcadas porém, à quantificação realizada
pelo aparelho de cintilografia, confirmou-se a presença das mesmas em menor quantidade,
quando comparada aos outros pacientes. Houve captação distribuída no fígado, baço, pulmões
e rins em todos os pacientes. Devido à meia-vida de seis horas do
99m
Tecnécio, a resolução da
imagem diminuiu, de forma importante, 24h após a infusão das CMMO marcadas. Portanto, a
captação cerebral só pode ser visualizada no cérebro dos pacientes 1 e 3, enquanto que, em
todos, a captação era vista no fígado, pulmões, baço, rins e bexiga. O paciente 7 não possui
gravadas as imagens de cintilografia realizadas 24h após a infusão das CMMO.
5.4.1 Paciente 1
Figura 3: Imagens SPECT 2h após infusão CMMO
CMMO marcadas com
99m
Tecnécio na área isquêmica
Figura 4: Paciente 1 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio
na área isquêmica
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio
nos pulmões
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
Posterior
Figura 5: Paciente 1 - Imagens de corpo inteiro 24h após infusão CMMO
Posterior
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio
na área isquêmica
5.4.2 Paciente 2
Figura 6: Imagens SPECT 2h após infusão CMMO
CMMO marcadas com
99m
Tecnécio na área isquêmica
Figura 7: Paciente 2 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nos
pulmões
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Posterior
Figura 8: Paciente 2 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO
CMMO
marcadas
com
99m
Tecnécio
nas vias
urinárias
CMMO
marcadas
com
99m
Tecnécio
no fígado e
baço
Posterior
5.4.3 Paciente 3
Figura 9: Imagens SPECT 2h após infusão CMMO
CMMO marcadas com
99m
Tecnécio na área isquêmica
Figura 10: Paciente 3 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio
nas vias
urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nos
pulmões
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Posterior
Figura 11: Paciente 3 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio
nas vias urinárias
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio
no fígado e baço
CMMO marcadas
com
99m
Tecnécio
na área isquêmica
Posterior
Figura 12: Paciente 3 - Imagem cerebral 24h após infusão CMMO
CMMO marcadas com
99m
Tecnécio na área isquêmica
5.4.4 Paciente 4
Figura 13: Imagens SPECT 2h após infusão CMMO
CMMO marcadas com
99m
Tecnécio na área isquêmica
Figura 14: Paciente 4 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio
nas vias
urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio
nos pulmões
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Posterior
Figura 15: Paciente 4 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
Posterior
5.4.5 Paciente 5
Figura 16: Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nos
pulmões
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Posterior
Figura 17: Paciente 5 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
Posterior
5.4.6 Paciente 6
Figura 18: Imagens SPECT 2h após infusão CMMO
CMMO marcadas com
99m
Tecnécio na área isquêmica
Figura 19: Paciente 6 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nos
pulmões
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Posterior
Figura 20: Paciente 6 - Imagens corpo inteiro 24h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
Posterior
5.4.7 Paciente 7
Figura 21: Imagens cerebrais 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Figura 22: Paciente 7 - Imagens corpo inteiro 2h após infusão CMMO
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nas
vias urinárias
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio no
fígado e baço
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio nos
pulmões
CMMO
marcadas com
99m
Tecnécio na
área isquêmica
Posterior
5.5 ESCALAS DE AVALIAÇÃO
Todos os pacientes já ultrapassaram os 120 dias após a infusão das CMMO previstos
pelo protocolo. Somente o paciente 3 era independente nas atividades de vida diária no dia da
infusão das CMMO (IB 95 e EmR 1). No dia 120 (D120) de acompanhamento, os seis
primeiros pacientes haviam melhorado suas escalas de avaliação clínica. O sétimo paciente
manteve dependência total nas atividades de vida diária e piora na escala de AVC (NIHSS).
As tabelas 2, 3 e 4 demonstram os resultados das escalas: NIHSS, IB e EmR,
respectivamente, e o Gráfico 1 demonstra a evolução do NIHSS dos sete pacientes.
Tabela 2: NIHSS dos pacientes: esta tabela demonstra todos os valores
coletados do NIHSS, dos sete pacientes, após a infusão das CMMO,
durante o protocolo de acompanhamento.
Pacientes D1 D3 D7 D30 D60 D120
1
7 6 5 5 4 4
2
9 9 8 6 6 6
3
4 3 3 3 3 3
4
13 12 12 11 9 9
5
9 6 5 3 4 1
6
13 13 12 12 12 11
7
13 13 13 15 15 15
D1, Dia da infusão celular; D3, 3° dia de infusão celular; D7, 7° dia de infusão celular; D30,
30° dia de infusão celular; D60, 60° dia de infusão celular; D120, 120° dia de infusão celular;
NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale.
Tabela 3: Índice de Barthel dos pacientes: em sete pacientes, após a infusão
das CMMO, durante o protocolo de acompanhamento
Pacientes D1 D3 D7 D30 D60 D120
1
100 100 100 100 100 100
2
35 35 35 50 55 75
3
95 95 95 100 100 100
4
25 25 25 25 30 35
5
30 30 30 50 90 100
6
10 10 15 25 30 50
7
20 20 20 10 10 10
D1, Dia da infusão celular; D3, 3° dia de infusão celular; D7, 7° dia de infusão celular; D30,
30° dia de infusão celular; D60, 60° dia de infusão celular; D120, 120° dia de infusão celular
Tabela 4: Escala modificada de Rankin dos pacientes: avaliada nos sete
pacientes após a infusão de CMMO, durante o protocolo de acompanhamento
Pacientes D1 D3 D7 D30 D60 D120
1
2 2 2 1 1 1
2
4 4 4 4 4 3
3
1 1 1 1 1 1
4
5 5 5 4 4 4
5
4 4 4 3 1 1
6
5 5 5 5 5 4
7
5 5 5 5 5 5
D1, Dia da infusão celular; D3, 3° dia de infusão celular; D7, 7° dia de infusão celular; D30,
30° dia de infusão celular; D60, 60° dia de infusão celular; D120, 120° dia de infusão celular
Gráfico 1: NIHSS (ordenada) x Dia de infusão (abscissa): gráfico demonstrativo
do NIHSS dos sete pacientes avaliados, durante protocolo de acompanhamento.
Pacientes 1 a 7 em cores, conforme legenda ao lado do gráfico.
D1, Dia da infusão celular; D3, 3° dia de infusão celular; D7, 7° dia de infusão celular; D30,
30° dia de infusão celular; D60, 60° dia de infusão celular; D120, 120° dia de infusão celular;
NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
D1 D3 D7 D30 D60 D120
1
2
3
4
5
6
7
5.6 PARÂMETROS LABORATORIAIS
Não houve alteração evolutiva em nenhum dos parâmetros laboratoriais colhidos
durante o acompanhamento.
6 DISCUSSÃO
Nesta série de pacientes apresentados, a infusão de CMMO mostrou ser segura e
exequível em sete pacientes com AVC isquêmico em território da ACM, em até 90 dias após
a isquemia. Não houve complicações diretas relacionadas ao procedimento. Apenas um
paciente piorou o NIHSS em dois pontos (sétimo paciente) por intercorrência clínica não
diretamente ligada ao procedimento de infusão das CMMO. Os outros seis pacientes
melhoraram suas escalas de avaliação (NIHSS, IB, EmR), no final do protocolo de
acompanhamento (Tabelas 2, 3 e 4 e Gráfico 1) e permanecem sem alterações evolutivas até o
momento.
Terapias baseadas em células-tronco representam novas e importantes estratégias para
o tratamento do AVC. Em modelos animais de isquemia, células-tronco de diferentes fontes
foram usadas com resultados promissores e diferentes mecanismos de ação têm sido sugeridos
para explicar esses benefícios funcionais (LI et al, 2000; BORLONGAN et al, 2004; SHYU et
al, 2004). Por exemplo: a introdução das células-tronco neurais/ progenitoras neurais em áreas
de perda celular pode resultar em reparação e restauração do circuito (ENGLUND et al,
2002). Alternativamente, quando as células-tronco derivadas da medula óssea (mesenquimais
ou mononucleares) são empregadas, os benefícios funcionais observados em alguns estudos
ocorrem, provavelmente, devido à liberação de citocinas e/ou fatores tróficos, os quais têm
efeito imunomodulador e/ou contribuem para a redução da apoptose na área de penumbra em
períodos mais precoces após a isquemia cerebral (GIRALDI-GUIMARÃES et al, 2009).
Além disso, tem sido sugerido que terapias baseadas nas células melhoram o processo de
reparação cerebral e plasticidade, incluindo neurogênese, angiogênese e sinaptogênese, o que
poderia explicar os benefícios observados nos modelos experimentais de AVC, até mesmo
quando as células são infundidas mais tardiamente (SAVITZ et al, 2004; CAPLAN et al,
2007; VENDRAME et al, 2005).
Até o momento, poucos estudos clínicos envolvendo terapia celular em pacientes com
AVC agudo e crônico foram publicados (KONDZIOLKA et al 2000 e 2005; SAVITZ et al,
2005; BANG et al, 2005). Não há nenhum estudo clínico em larga escala e somente dois
desses estudos envolveram o uso de células tronco autólogas, derivadas da medula óssea
(MENDONÇA et al, 2006; BANG et al, 2005). Em um deles, Bang e colaboradores
investigaram a segurança da infusão intravenosa de CTM, autólogas, derivadas da medula
óssea e expandidas in vitro, em pacientes com infarto cerebral agudo (BANG et al, 2005). O
procedimento foi seguro e exequível; os pacientes do grupo que receberam as CTM (n=5)
tiveram aumento no IB no terceiro e sexto mês após a infusão. Entretanto, as alterações no
NIHSS e na EmR não foram estatisticamente significativas. Outro ponto a ser discutido diz
respeito à preparação das células: embora exequível, tem custo elevado e é potencialmente
perigosa (risco de contaminação, principalmente). O outro estudo também foi realizado na
fase aguda do AVC (três a dez dias após o evento isquêmico) e avaliou a segurança do
transplante intra-arterial de CMMO em pacientes com infartos em território da ACM em duas
instituições brasileiras diferentes. Em uma delas, seis pacientes foram envolvidos e
receberam, aproximadamente, 3,0x10
8
células no território da ACM, via artéria femoral, por
técnica de Seldinger. Resultados preliminares demonstraram que o procedimento é seguro e
exequível (MENDONÇA et al, 2006; de FREITAS et al, 2006).
Com relação ao AVC na fase crônica, Savitz e colaboradores estudaram transplante
intracerebral de células fetais porcinas, em pacientes que haviam tido AVC entre três meses e
dez anos antes do estudo. Os pacientes foram submetidos a implante estereotáxico (guiado por
TC) de células fetais de porco, tratadas previamente com anticorpo para prevenir rejeição. O
estudo foi parado pelo Food and Drug Administration (sigla em inglês FDA), devido aos
eventos adversos (oclusão de veia cortical secundária à cirurgia em um paciente e convulsões
em dois pacientes – uma e três semanas após o implante (SAVITZ et al, 2005). Kondziolka e
colaboradores conduziram um estudo fase 2 (randomizado) que incluiu pacientes com tempo
médio de AVC isquêmico de três anos e meio. Eles receberam implantes estereotáxicos de
células neuronais humanas, derivadas de uma linhagem celular de carcinoma embrionário
humano e cultivadas em laboratório. O estudo foi negativo para o desfecho primário medido
(melhora no déficit neurológico motor, medido através da ESS), embora tenha havido
melhora, porém não estatisticamente significativa, em alguns pacientes. Um paciente
apresentou crise convulsiva um dia após a cirurgia, enquanto outro desenvolveu hematoma
subdural, que necessitou drenagem cirúrgica, um mês após o implante das células
(KONDZIOLKA et al, 2005). Os resultados desses dois estudos sugerem que o transplante
intracraniano tem risco potencial. No nosso estudo, a razão para se ter escolhido a dosagem
das células baseou-se no estudo de segurança descrito acima (de FREITAS et al, 2006) e a
razão para selecionar pacientes com AVC não-agudo foi baseada nos resultados de estudos
clínicos de terapia celular na fase crônica do AVC (KONDZIOLKA et al, 2000). Parece que a
janela terapêutica deve ser determinada em função da dose terapêutica e que o regime de
repetição de dose pode otimizar o benefício da recuperação (The STEPS participants, 2009).
Para entender o processo dinâmico envolvido no reparo cerebral mediado pelas
células-tronco, têm-se estudado a marcação de células in vitro com agentes de contraste na
RM. A pré-marcação das células-tronco com contrastes à base de ferro (SHAPIRO; SKRTIC;
KORETSKY, 2005) ou à base de gadolínio - Gadolinium Rhodamine Dextran – GRID
(MODO et al, 2004) permitiu visualizar, em ratos, a presença e migração das células-tronco
transplantadas para o sítio de isquemia cerebral. Entretanto, alguns pontos devem ser
observados: (a) apesar do uso de moléculas de ferro cada vez menores, sua toxicidade ainda
representa uma grande preocupação, pois, sendo um elemento essencial no metabolismo
celular, seu acúmulo produz acentuada proliferação celular (WHITNALL et al, 2006); (b)
para os dois tipos de marcação celular foram utilizados aparelhos de RM de 4,7 Tesla (T),
7,0T e 11,7T, ainda não liberados para uso clínico.
A marcação celular com radioisótopos é um método bem estabelecido que permite
monitorização sistêmica das células e tem sido aplicada em alguns estudos clínicos
envolvendo terapia celular no infarto do miocárdio (GOUSSETIS et al, 2006; HOFMANN et
al, 2005; PENICKA et al, 2007) e na fase aguda do AVC isquêmico (CORREA et al, 2007).
A segurança e a exequibilidade da injeção de CMMO na fase subaguda do AVC isquêmico,
bem como a marcação celular com
99m
Tecnécio ainda não haviam sido estudadas em ensaio
clínico. Estima-se que haja ruptura da barreira hematoencefálica após a isquemia, mas ainda
não há definição pela literatura do tempo levado para a sua restauração. Neste estudo
pudemos observar que, mesmo após dois meses do evento isquêmico cerebral, as CMMO
marcadas puderam ser visualizadas duas horas após a infusão, na área isquêmica de todos os
pacientes e que, pelo menos em dois pacientes, elas permaneceram na área de lesão por 24
horas. A meia-vida do
99m
Tecnécio é de apenas seis horas, o que permite um monitoramento
muito curto das células injetadas, porém resulta em boa resolução da imagem e menor
radiação para o paciente, quando comparado ao 111-Indium-oxina, outro radiofármaco
comumente usado (PALESTRO et al, 2009). Comprovamos o destino de parte das células
marcadas: lesão isquêmica cerebral, fígado, pulmões, baço e rins. Outros estudos devem ser
realizados, utilizando outras formas de marcação celular, como GRID por exemplo, para
avaliar o comportamento das células-tronco no cérebro humano. Entretanto, estes estudos
clínicos ainda estão longe de ocorrerem, pois, conforme descrito acima, ainda há questões de
segurança não respondidas nos ensaios experimentais.
Inicia-se também, outra importante discussão: há necessidade da patência do vaso
envolvido no AVC isquêmico (neste caso ACM), para que as CMMO atinjam a área cerebral
lesada? As imagens relacionadas ao paciente 7 levantam essa questão, pois apesar da ACM
ocluída à arteriografia, houve captação de
99m
Tecnécio após infusão das CMMO marcadas.
Não está claro se as convulsões tardias em dois pacientes, após o período de
acompanhamento, foram causadas por alguma reação tardia das células mononucleares
injetadas, pelo redirecionamento errático das fibras de regeneração tecidual (re-inervação
aberrante) ou pela própria presença do tecido isquêmico, fornecendo substrato anatômico.
Embora muitos fatores de risco para convulsões precoces ou tardias após o AVC tenham sido
identificados, não há um preditor claro de epilepsia pós-AVC (RYVLIN; MONTAVONT;
NIGHOGHOSSIAN, 2006). Aproximadamente cinco a dez por cento dos pacientes após
AVC isquêmico agudo têm convulsões precoces, as quais ocorrem tipicamente em 24 horas
(CAMILO; GOLDSTEIN, 2004). Já as convulsões tardias ocorrem usualmente nas primeiras
duas semanas após o AVC (BLADIN; ALEXANDROV, 2000 e GUPTA; RUBINO, 1988)
variando consideravelmente entre as séries – 3 a 67% dos casos (CAMILO; GOLDSTEIN,
2004 e LOSSIUS et al, 2005). O impacto potencial da convulsão na mortalidade do AVC e
desfecho neurológico deve ser levado em consideração, porque influencia a decisão do
tratamento após a primeira convulsão. Entretanto, este ponto ainda permanece em debate, com
dados limitados a respeito do impacto de convulsões tardias e recorrentes no desfecho
funcional (RYVLIN; MONTAVONT; NIGHOGHOSSIAN, 2006). Devido à nossa amostra
ser muito pequena, nós não podemos descartar que uma incidência de convulsão seja
explicada pelo acaso.
Alguns pontos ainda devem ser discutidos, pois apesar do uso de células-tronco
parecer seguro e exequível, muitas questões permanecem não-respondidas. Há tantas formas
potenciais de terapia celular tanto quanto tipos celulares: embrionárias, fetais, derivadas de
teratocarcinoma, células neurais culturadas, CMMO ou CTM, com as doses variando entre os
estudos. Ainda não sabemos qual a melhor via de administração das células (intravenosa,
intra-arterial, implante cerebral), pois se discute se há necessidade das células estarem
próximas ao tecido lesado para exercer seu efeito (já que o mecanismo de atuação mais aceito
atualmente é o efeito parácrino das células-tronco). O melhor tempo após o início do AVC
também não foi definido: fase aguda ou crônica do AVC? Inflamação acentuada X
fechamento da barreira hematoencefálica (KLEINIG; VINK, 2009), bem como se há
estabilidade no tempo após a infusão celular (ENGLAND; MARTIN; BATH, 2009). Estas
questões só serão respondidas após esforços para coordenar e estandardizar métodos e
parâmetros de avaliação clínica e funcional (TROUNSON, 2009).
Embora não se possa, até o momento, repopular as áreas perdidas no AVC, a
tecnologia com células-tronco é um campo promissor, que poderá impactar significativamente
o tratamento futuro do AVC isquêmico.
7 CONCLUSÃO
O transplante de CMMO é exequível e parece ser seguro em pacientes com AVC
isquêmico na fase subaguda. Houve evidência de que as CMMO marcadas com
99m
Tecnécio
permanecem na área afetada pela isquemia cerebral por, pelo menos, 24 horas. Não houve
modificação dos parâmetros clínicos e laboratoriais de seis pacientes ao longo do seguimento.
Estudos clínicos randomizados são necessários para estabelecer a eficácia e segurança a longo
prazo deste procedimento.
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ANEXOS
ANEXO 1 – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu fui convidado a participar do estudo "SEGURANÇA DO TRANSPLANTE
AUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EM
PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICO
SUBAGUDO". Em relação ao estudo, eu fui informado das seguintes questões:
1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital (n° 169/03) e pela
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (n° 10385).
2. O objetivo deste estudo é avaliar se o transplante de células retirada da medula do
osso é seguro no tratamento do AVC (acidente vascular cerebral, ou "derrame") em seres
humanos. O estudo está sendo realizado pois as células-tronco conseguiram ajudar na
recuperação do AVC em ensaios em animais. Nesses ensaios, os animais que receberam as
células-tronco após o AVC tiveram menos seqüelas do que os animais que não receberam
estas células. Não se sabe se as células-tronco se transformam em neurônios ou se produzem
substâncias que ajudam na recuperação.
3. O estudo irá incluir apenas pessoas entre 18 e 75 anos que tenham apresentado um
AVC isquêmico nos últimos 90 dias confirmado pela tomografia computadorizada de crânio.
Não poderão ser incluídas pessoas que tenham alguma doença ou condição que possam
dificultar a realização do estudo como, por exemplo, câncer, insuficiência do fígado, gravidez.
4. Uma vez que eu concorde em participar do estudo, eu serei submetido (a) aos
seguintes procedimentos:
a) Será realizada retirada de células através de punção da medula (parte interna) do osso da
bacia, sob efeito de sedativos e analgésicos, por um especialista em hematologia. Este
procedimento é semelhante aos já realizados para transplantes de medula utilizados em larga
escala na medicina de hoje. Não constitui nenhuma novidade no meio médico, além de
oferecer risco muito baixo de complicações. Estes riscos envolvem perfuração óssea e
infecção do osso, e ocorrem em menos de 1% dos casos;
b) O implante de células tronco ocorrerá no mesmo dia, e a via de administração será o
cateterismo cerebral. O cateterismo consiste na colocação, após anestesia local, de um cateter
em uma artéria na região da virilha, o que permite levar esse cateter até as artérias cerebrais
para visualização destas e infusão das células-tronco de medula óssea. O cateterismo cerebral
é o único procedimento do estudo que é considerado invasivo, porém é um procedimento
seguro, com risco de complicações em cerca de 1,4% dos casos. O cateterismo será realizado
por um especialista em radiologia intervencionista.
c) Serão realizados dois exames de cintilografia cerebral para avaliar a "posição" das células-
tronco no meu cérebro: 2 e 24horas após a injeção das células.
Eu vou ficar internado (a) no Hospital por dois dias após o implante de células tronco
e, neste período serei submetido a novos exames de sangue, tomografia computadorizada (se
necessário), eletroencefalograma, assim como escalas neurológicas para verificar o grau de
independência e recuperação. Depois da alta hospitalar, consultas e exames de sangue serão
realizados 7, 30, 60 e 120 dias após o transplante das células.
5. Eu estou consciente de que podem existir alguns efeitos colaterais relacionados ao
estudo. Os riscos do implante de células em seres humanos são muito pouco conhecidos.
Existem seres humanos que já receberam células parecidas com as da medula óssea no
cérebro, em doenças degenerativas, como Doença de Parkinson através de procedimento
cirúrgico, com implante direto. Outros pacientes já foram submetidos a implantes de células
na fase aguda do acidente vascular cerebral. Não houve qualquer complicação relatada até o
momento. Observe que apenas poucos pacientes já se submeteram a este procedimento
previamente, o que é muito pouco para que possamos afirmar qualquer coisa com respeito às
complicações. No entanto, existe a possibilidade de algumas complicações, além das acima,
ocorrerem: inflamação no cérebro, levando a aumento da lesão e inchaço no mesmo,
sangramento cerebral,aparecimento de atividade epiléptica, infecção no cérebro e crescimento
de tecidos não cerebrais no cérebro.
6. Eu estou consciente de que não existe remuneração referente à inclusão no estudo,
nem ressarcimentos ou indenizações relacionadas às complicações dos procedimentos do
estudo. Caso o paciente apresente alguma complicação, os investigadores serão responsáveis
pelo seu tratamento.
7. Eu estou consciente de que os pesquisadores do estudo terão acesso ao meu
prontuário, para verificar doenças passadas ou futuras. A revisão dos prontuários e registros
médicos será realizada de acordo com a legislação brasileira (resoluções do Conselho Federal
de Medicina n° 1605/2000, 1638/2002, 1642/2002).
8. Eu estou consciente que, enquanto o estudo estiver sendo realizado, eu não serei
identificado por quaisquer pessoas de fora do estudo, e de que os meus resultados serão
confidenciais.
9.Eu estou consciente que posso me recusar a participar do estudo e que eu posso sair
do estudo quando quiser, e que isto não vai afetar o meu tratamento médico. Se eu apresentar
algum problema que eu suspeite que tenha resultado do meu envolvimento no estudo, eu
estou ciente que devo falar com meu neurologista. Conheço e posso telefonar, se necessário,
para os Drs. Charles André (telefone pessoal: 9989.7937), Gabriel de Freitas (telefone
pessoal: 9973.0164) e Valéria Battistella (telefone pessoal:9328.7596).
_____________________________________ _________________
Assinatura do paciente ou responsável legal Data
Eu expliquei ao paciente ____________________________________________________ o
projeto de pesquisa e os efeitos do tratamento. Acredito que ele (a) tenha compreendido a
minha explicação e que deu o seu consentimento de livre e espontânea vontade.
__________________________________ _________________
Gabriel R. de Freitas, CRM 52.60589-7 Data
Charles André, CRM 52.38570-7
Valéria Battistella, CRM 52.70716-3
ANEXO 2 – NIHSS
1.a – Nível de consciência:
0 - alerta
1 - acorda facilmente
2 - torpor
3 - coma
1.b – Orientação:
0 - ambas corretas
1 - uma correta
2 - nenhuma resposta correta
1.c – Comandos
0 - ambas corretamente
1 - apenas uma das tarefas
2 - não realiza nenhuma das tarefas
2. Olhar:
0 - normal
1 - paralisia parcial
2 - desvio forçado ou paralisia total
3. Campos visuais:
0 - normal
1 - hemianopsia parcial
2 - hemianopsia completa
3 - hemianopsia bilateral
4. Paralisia facial:
0 - normal
1 - mínima
2 - parcial
3 - completa
5.a – Motricidade MSE:
0 - mantém posição
1 - membro desce antes de 10s
2 - esforço contra gravidade
3 - nenhum esforço contra gravidade
4 - nenhum movimento
5.b – Motricidade MSD:
0 - mantém posição
1 - membro desce antes de 10s
2 - esforço contra gravidade
3 - nenhum esforço contra gravidade
4 - nenhum movimento
6.a – Motricidade MIE:
0 - mantém posição
1 - membro desce antes de 5s
2 - esforço contra gravidade
3 - nenhum esforço contra gravidade
4 - nenhum movimento
6.b – Motricidade MID:
0 - mantém posição
1 - membro desce antes de 5s
2 - esforço contra gravidade
3 - nenhum esforço contra gravidade
4 - nenhum movimento
7. Ataxia de membros:
0 - ausente
1 - presente em um membro
2 - presente em dois membros
8. Sensibilidade:
0 - normal
1 - perda parcial
2 - perda grave ou total
9. Linguagem:
0 - normal
1 - afasia leve/ moderada
2 - afasia grave
3 - afasia global/ mutismo
10. Disartria:
0 - articulação normal
1 - disartria leve/ moderada
2 - disartria grave
11. Negligência:
0 - atenção normal
1 - negligência parcial
2 - negligência grave
ANEXO 3 – ESCALA MODIFICADA DE RANKIN
Grau 0. Assintomático.
Grau 1. Sintomas sem incapacidade. Capaz de realizar suas tarefas e atividades
habituais prévias.
Grau 2. Incapacidade leve. Incapaz de realizar todas suas atividades habituais prévias,
mas capaz de realizar suas necessidades pessoais sem ajuda.
Grau 3. Incapacidade moderada. Requer alguma ajuda para as suas atividades, mas é
capaz de andar sem ajuda de outra pessoa.
Grau 4. Incapacidade moderada a grave. Incapacidade de andar sem ajuda,
incapacidade de realizar suas atividades sem ajuda.
Grau 5. Incapacidade grave. Limitado a cama, incontinência, requer cuidados de
enfermeiros e atenção constante.
Grau 6. Óbito.
ANEXO 4 – ÍNDICE DE BARTHEL
Alimentação:
10 = independente. O paciente pode alimentar-se sozinho quando alguém coloca comida de
forma alcançável. Ele consegue cortar a comida, servir-se de sal e pimenta e passar manteiga.
5 = alguma ajuda é necessária ou o paciente é incapaz de alimentar-se sozinho em um
determinado tempo.
Movimentação da cadeira de rodas para cama e retornar ou levantar e deitar na cama e
cadeira sem cadeira de rodas:
15 = independente em todas as fases desta atividade.
10 = necessita (mesmo que seja pequena ajuda) em algum passo desta atividade ou o paciente
necessita de ajuda física para transferir-se.
5 = paciente consegue sentar-se sem ajuda de uma segunda pessoa, mas necessita de
assistência física para transferência.
Higiene pessoal:
5 = o paciente consegue lavar as mãos e face, pentear os cabelos, escovar os dentes e barbear-
se. Ele deverá ser capaz de utilizar giletes, inclusive encaixando-as no barbeador e depois as
guardando sem ajuda. Mulheres são capazes de maquiar-se, mas não de fazer penteados.
Asseio pessoal:
10 = o paciente é capaz de entrar e sair do banheiro, retirar e colocar suas roupas e usar papel
higiênico sem ajuda. Ele pode usar barras de apoio ou outro objeto para apoiar-se. (Se for
necessário usar cadeira higiênica ao invés de banheiro, o paciente deve ser capaz de esvaziá-la
e limpá-la)
5 = o paciente necessita de ajuda para despir-se ou usar o papel higiênico.
Banho:
5 = o paciente é capaz de usar banheira ou chuveiro de forma completa. Ele deve ser capaz de
realizar todos os passos envolvidos em qualquer método escolhido sem estar presente outra
pessoa.
Andar:
15 = paciente pode andar sem ajuda ou supervisão. Ele pode usar muletas e ficar em pé ou
sentado com elas.
10 = paciente necessita ajuda ou supervisão em qualquer dos passos acima, mas pode
caminhar até 50 metros com pequena ajuda.
5 = paciente pode andar curtas distâncias (menos que 50 metros) com assistência física ou
supervisão.
5 = utilizar cadeira de rodas, se a pessoa não pode deambular independentemente. Ele deve
ser capaz de realizar manobras para a mesa, cama, banheiro, etc. Ele deve ser capaz de
utilizar, manualmente a cadeira por até 50 metros ou utilizar cadeira com movimentação
elétrica.
Subir e descer escadas:
10 = o paciente é capaz de subir e descer escadas de forma segura, sem ajuda ou supervisão.
Ele pode e deve usar corrimão, bengala e muletas, quando necessário. Ele deve ser capaz de
carregar as muletas ou bengala, ao subir e descer escadas.
5 = paciente necessita de ajuda ou supervisão para realizar qualquer tarefa supracitada.
Vestindo-se e despindo-se:
10 = paciente é capaz de colocar e retirar toda a roupa, abotoando ou utilizando qualquer
método adaptativo e realizar laços. Esta atividade inclui colocar e remover muletas, quando
prescrito. Algumas vestimentas especiais como suspensórios, sapatos sem cadarços ou roupas
que abrem na frente podem ser usados quando necessário.
5 = paciente necessita de ajuda para colocar e remover qualquer peça de roupa. Ele deve ser
capaz de realizar pelo menos metade do trabalho sozinho. Ele deve realizar em um tempo
plausível.
Continência fecal:
10 = paciente é capaz de controlar suas evacuações ou independentemente manejar seu
programa fecal e sem acidentes.
5 = paciente tem acidentes ocasionais ou necessita de ajuda para manejar seu programa fecal.
Continência urinária:
10 = paciente é capaz de controlar sua bexiga dia e noite. Pacientes que usam acessórios
externos devem ser capazes de colocá-los e retirá-los independentemente, esvaziar e lavar a
bolsa e permanecer seco noite e dia.
5 = paciente tem acidentes ocasionais ou não pode esperar pela cadeira higiênica ou ir ao
banheiro a tempo ou necessita de ajuda com acessórios externos.
ANEXO 5 – ARTIGO PUBLICADO
ANEXO 6 – ARTIGO ACEITO
ANEXO 7 – ARTIGO SUBMETIDO
ISSN: 1524-4539
Copyright © 2009 American Heart Association. All rights reserved. Print ISSN: 0009-7322. Online
72514
Circulation is published by the American Heart Association. 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX
DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.109.863084
2009;120;539-541 Circulation
Andre
Wajnberg, Paulo Henrique Rosado de Castro, Rosalia Mendez-Otero and Charles
Bianca Gutfilen, Regina Coeli dos Santos Goldenberg, Angelo Maiolino, Eduardo
Lea Mirian Barbosa da Fonseca, Valeria Battistella, Gabriel Rodriguez de Freitas,
Intra-Arterial Delivery in a Patient With Chronic Stroke
Early Tissue Distribution of Bone Marrow Mononuclear Cells After
http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/120/6/539/DC1
Data Supplement (unedited) at:
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The online version of this article, along with updated information and services, is
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Permissions: Permissions & Rights Desk, Lippincott Williams & Wilkins, a division of Wolters
http://circ.ahajournals.org/subscriptions/
Subscriptions: Information about subscribing to Circulation is online at
by on August 24, 2009 circ.ahajournals.orgDownloaded from
Early Tissue Distribution of Bone Marrow Mononuclear
Cells After Intra-Arterial Delivery in a Patient With
Chronic Stroke
Lea Mirian Barbosa da Fonseca, MD, PhD; Valeria Battistella, MD;
Gabriel Rodriguez de Freitas, MD, PhD; Bianca Gutfilen, PhD;
Regina Coeli dos Santos Goldenberg, PhD; Angelo Maiolino, MD, PhD;
Eduardo Wajnberg, MD; Paulo Henrique Rosado de Castro;
Rosalia Mendez-Otero, MD, PhD; Charles Andre, MD, PhD
A
24-year-old man with a cerebral infarct within the left
middle cerebral artery (MCA) territory was enrolled in a
study to assess the safety of autologous bone marrow mono-
nuclear cell (BMMC) transplantation in patients with ische-
mic stroke (NCT00473057). His National Institutes of Health
Stroke Scale score was 7. Computed tomography (Figure 1A)
and technetium-99m ethyl cysteinate dimer (
99m
Tc ECD)
single photon emission computed tomography (SPECT) (Fig-
ures 1B and 2 and Movie I in the online-only Data Supple-
ment) indicated the location of the infarct. Sixty-seven days
after onset of symptoms, the patient underwent BMMC
transplantation. Bone marrow blood was aspirated under local
anesthesia from both iliac crests and processed to isolate the
mononuclear cell fraction. A total of 5ϫ10
8
BMMCs was
suspended into a volume of 10 mL, and 1 mL of the cell
suspension was radiolabeled with
99m
Tc (radioactivity 111
MBq, physical half-life 6 hours), as described previously,
1,2
and then added back to the unlabeled cell suspension. After
catheter navigation via femoral artery access under local
anesthesia and conscious sedation, cells were injected into the
M1 portion of the MCA, and the infusion was completed
within Ϸ10 minutes. To monitor the fate of transplanted
BMMCs, whole-body and planar scintigraphies were per-
formed at 2, 24, and 48 hours after cell therapy. The patient
had no complications during the procedure or follow-up.
Planar and SPECT views revealed uptake and retention of
the labeled BMMCs in the territory of the left MCA for up to
48 hours (Figures 1C, 3, and 4 and Movie II in the online-only
Data Supplement). The remaining uptake occurred mainly in
the liver and spleen (Figure 4). To our knowledge, there has
been only 1 report of BMMC homing in cerebral infarction,
which indicated the retention of BMMCs 8 hours after
intra-arterial injection in 1 patient in the subacute phase, 9
days after stroke.
3
We here report for the first time the
migration and homing of BMMCs to the brain of a patient in
the chronic phase of stroke, Ͼ2 months after the onset of
symptoms. The mechanisms involved in the possible thera-
peutic effect of BMMC therapy are still largely unknown, but
accumulating evidence from animal studies suggests that
these cells may behave as minipumps producing cytokines
and/or trophic factors that support cell survival in the pen-
umbra area and stimulate neurogenesis and angiogenesis,
increasing brain remodeling and functional regeneration after
ischemia.
4
In vivo tracking of BMMCs after grafting is of
great importance because the retention of transplanted cells at
the site of the lesion may be critical for the success of cell
therapy.
3,4
In animal models, different methods have been
used to track the transplanted cells, and it has been suggested
that signals that are involved in the transit of inflammatory
cells to injured tissue may also direct the transplanted bone
marrow– derived cells.
4
Our results indicate that labeling
BMMCs with
99m
Tc is feasible and that noninvasive imaging
may be used to study the migration and homing of trans-
planted cells in vivo in the setting of chronic stroke.
Figure 1. A, Computed tomography showing ischemic lesion in
the left MCA territory. B, Brain perfusion
99m
Tc ECD SPECT
showing left hypoperfusion. C,
99m
Tc BMMC brain SPECT
revealing accumulation of the BMMCs in the left brain hemi-
sphere 2 hours after cell transplantation.
From Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (L.M.B.d.F., V.B., G.R.d.F., B.G., A.M., E.W., P.H.R.d.C., C.A.) and Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho (R.C.d.S.G., R.M.-O.), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
The online-only Data Supplement is available with this article at http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/120/7/539/DC1.
Clinical trial registration information—URL: http://www.clinicaltrials.gov. Unique identifier: NCT00473057.
Correspondence to Lea Mirian Barbosa da Fonseca, MD, PhD, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Departamento de Radiologia, subsolo,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rua Professor Rodolpho Paulo Rocco 255, Ilha do Fundão, 21949-913, Rio de Janeiro, Brazil. E-mail
[email protected]
(Circulation. 2009;120:539-541.)
© 2009 American Heart Association, Inc.
Circulation is available at http://circ.ahajournals.org DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.109.863084
539
Images in Cardiovascular Medicine
by on August 24, 2009 circ.ahajournals.orgDownloaded from
Sources of Funding
This study was supported by grants from the Carlos Chagas Filho
Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro to Dr
Gutfilen (grant 180.011/2005) and to Dr Mendez-Otero (grant
110.391/2007) and a grant from the Ministry of Health and Ministry
of Science and Technology of Brazil to Dr Mendez-Otero (grant
552201/2005-7).
Disclosures
None.
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Figure 2. Transverse (A), sagittal (B), and coronal (C) images of
99m
Tc ECD SPECT scintigraphy, demonstrating decreased perfu-
sion in the left MCA territory.
Figure 3. Transverse (A), sagittal (B), and coronal (C) images of
99m
Tc BMMC SPECT scintigraphy, demonstrating cell homing in
the left MCA territory 2 hours after cell transplantation.
540 Circulation August 11, 2009
by on August 24, 2009 circ.ahajournals.orgDownloaded from
Figure 4. Anterior whole-body scans performed 2 (A), 24 (B),
and 48 hours (C) after infusion in the territory of the MCA show
the distribution of BMMCs labeled with
99m
Tc. Uptake in the left
brain hemisphere is well visualized. The remaining activity was
distributed mainly to the liver and spleen.
Barbosa da Fonseca et al Tracking Cell Therapy in Chronic Stroke 541
by on August 24, 2009 circ.ahajournals.orgDownloaded from
Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic stroke
after intra-arterial injection
Lea Mirian Barbosa da Fonseca
a,
⁎
, Bianca Gutfilen
a
, Paulo Henrique Rosado de Castro
a
, Valeria Battistella
a
,
Regina C.S. Goldenberg
b
, Tais Kasai-Brunswick
b
, Claudia L.R. Chagas
a
, Eduardo Wajnberg
a
,
Angelo Maiolino
a
, Sérgio Salles Xavier
a
, Charles Andre
a
, Rosalia Mendez-Otero
b
, Gabriel R. de Freitas
a
a
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Departamento de Radiologia, subsolo, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, 21949-913, Rio de Janeiro, Brazil
b
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
abstractarticle info
Article history:
Received 9 July 2009
Revised 6 October 2009
Accepted 15 October 2009
Available online xxxx
Keywords:
Stroke
Cell therapy
99m
Tc
Scintigraphy
Cell-based treatments have been considered a promising therapy for neurological diseases. However,
currently there are no clinically available methods to monitor whether the transplanted cells reach and
remain in the brain. In this study we investigated the feasibility of detecting the distribution and homing of
autologous bone-marrow mononuclear cells (BMMCs) labeled with Technetiu m-99 m (
99m
Tc) in a cell-based
therapy clinical study for chronic ischemic stroke. Six male patients (ages 24–65 years) with ischemic
cerebral infarcts within the middle cerebral artery (MCA) between 59 and 82 days were included. Cell dose
ranged from 1.25×10
8
to 5×10
8
. Approximately 2×10
7
cells were labeled with
99m
Tc and intra-arterially
delivered together with the unlabeled cells via a catheter navigated to the MCA. None of the patients showed
any complications on the 120-day follow-up. Whole body scintigraphies indicated cell homing in the brain of
all patients at 2 h, while the remaining uptake was mainly distributed to liver, lungs, spleen, kidneys and
bladder. Moreover, quantification of upta ke in Single-Photon Emission Computed Tomography (SPECT) at
2 h showed preferential accumulation of radioactivity in the hemisphere affected by the ischemic infarct in
all patients. However, at 24 h homing could only distinguished in the brains of 2 patients, while in all
patients uptake was still seen in the other organs. Taken together, these results indicate that labeling of
BMMCs with
99m
Tc is a safe and feasible technique that allows monitoring the migration and engraftment of
intra-arterially transplanted cells for at least 24 h.
© 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
Introduction
Over the last decade, stem-cell-based therapy has been introduced
as a promising attempt to improve recovery after stroke (Dobkin,
2007, Kondziolka et al., 2005, 2000, Savitz et al., 2005). Autologous
bone marrow-derived stem cells have been used more frequently,
both in pre-clinical studies (Chopp and Li, 2002, Liu et al., 2006,
Mezey, 2007, Tang et al., 2007) and in a few pilot and ongoing clinical
trials (Bang et al., 2005, Mendez-Otero et al., 2007, Mendonca et al.,
2006). In experimental models, it has been suggested that possible
therapeutic effects could be due to the production of trophic factors by
bone marrow-derived cells and lead to an increase in angiogenesis,
neurogenesis and synaptogenesis, allowing favorable remodeling of
the brain (Chen et al., 2003, Chopp and Li, 2002).
Non-invasive in-vivo imaging of the transplanted cells may provide
better understanding of many unresolved issues in this field, such as the
efficiency of different approaches to cell delivery and the correlation
with functional evaluation. Radioisotope cell labeling is a well-
established method that allows systemic monitoring of cells, and has
been applied in different clinical studies involving cell therapy for
myocardial infarction (Goussetis et al., 2006, Hofmann et al., 2005, Kang
et al., 2006, Penicka et al., 2007) and acute stroke (Correa et al., 2007).
In this study, we investigated the distribution and homing of intra-
arterial-delivered radioactive-labeled bone-marrow mononuclear
cells in patients enrolled in a research study to assess the safety of
this procedure for chronic ischemic stroke.
Patients and methods
Patients
Six male patients (ages 24–65 years) with ischemic cerebral
infarcts within the territory of the middle cerebral artery (MCA) were
included in this non-randomized, open-label phase I clinical trial
(NCT00473057). The following criteria were required for patient
enrollment: (1) age between 18 and 75 years, (2) ischemic stroke in
the MCA territory within the last 90 days evidenced by computed
tomography (CT) or magnetic-resonance imaging (MRI); (3) recan-
alization of the involved MCA as assessed by transcranial Doppler
Experimental Neurology xxx (2009) xxx–xxx
⁎ Corresponding author. Fax: +55 21 2562 2399.
E-mail address: [email protected] (L.M. Barbosa da Fonseca).
YEXNR-10373; No. of pages: 7; 4C: 4, 5
0014-4886/$ – see front matter © 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
Contents lists available at ScienceDirect
Experimental Neurology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/yexnr
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Barbosa da Fonseca, L.M., et al., Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic
stroke after intra-arterial injection, Exp. Neurol. (2009), doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
(TCD) studies; and (4) a score between 4 and 17 according to the
National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS). We excluded
patients to whom any of the following criteria applied: (1) carotid
stenosis ( N 50%, by Doppler studies) ipsilateral to the stroke, (2)
neurological worsening (N 4 points in the NIHSS ) before injection, due
to either edema or intracerebral hemorrhage, (3) thrombophilias or
primary hematological diseases, (4) previous stroke with modified
Rankin Scale N 2, (5) neurodegenerative disorders, (6) auto-immune
disorders, (7) intracardiac thrombus, (8) sepsis (according to the
1992 criteria of the Society of Critical Care Medicine and the American
College of Chest Physicians), (9) history of neoplasia or other
comorbidity that could impact the patient's short-term survival,
(10) bone disorders that could increase the risk of the bone-marrow
harvesting procedure, (11) renal failure (creatinine N 2 mg/ml), (12)
liver failure, (13) lacunar stroke, (14) life-support dependence, (15)
pregnancy or previous participation in other clinical trials, (16)
difficulty in obtaining vascular access for percutaneous procedure,
(17) any condition that in the judgment of the investigator would
place the patient at undue risk.
The Research Ethics Committee of the Institution and the National
Committee of Ethics and Scientific Research approved the study
protocol. Written informed consent was obtained from all patients.
They were informed in detail about the nature of the procedure and
the radiolabeling technique.
Bone-marrow aspiration, cell separation and labeling with
Technetium-99m
Bone marrow (80 ml) was aspirated under local anesthesia from the
posterior iliac crest. BMMCs were isolated by density gradient on Ficoll
at 400×g for 30 min (Ficoll-Paque Plus 1.077, 1:2 , Amersham
Biosciences, São Paulo, Brazil). Mononuclear cells were washed in saline
containing 5% human serum albumin and filtered through 100-μm
nylon mesh to remove cell aggregates. After washing, counting and
viability testing, the cells were resuspended in 10 ml of saline solution
with 5% autologous serum. For each patient, 2 ×10
7
cells were labeled
with
99m
Tc based on previously published protocols (Carvalho et al.,
2008, Gutfilen et al., 2006, 1999, Lopes de Souza et al., 2004, Quintanilha
et al., 2008). All the procedures for cell preparation and labeling were
carriedout in a laminar flow. In short, 500 μlofsterileSnCl2solutionwas
added to the cell suspension in 0.9% NaCl, and the mixture was
incubated at room temperature for 10 min. Then, 45 mCi
99m
Tc was
added and the incubati on continued for another 10 min. After
centrifugation (500×g for 5 min), the supernatant was removed and
the cells were washed again in saline solution. The pellet was
resuspended in salinesolution. Viability of the labeled cells was assessed
by the trypan blue exclusion test, and was estimated to be greater than
93% in all cases. Labeling efficiency (%) was calculated by the activity in
the pellet divided by the sum of the radioactivity in the pellet plus
supernatant, and was estimated to be greater than 90% in all cases.
Flow-cytometry analysis and fibroblast colony-forming assay
Isolated mononuclear bone-marrow cells were characterized by
flow-cytometry analysis of specific surface antigens. Cells were
incubated for 20 min at room temperature with primary antibodies
conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin
(PE), allophycocyanin (APC), peridinin chlorophyll protein (PercP)
and phycoerythrin cyano 7 (PE-Cy7). The markers tested included:
pan-leukocyte: CD45 (Immunostep); pan T cell: CD3 (BD Biosciences
Pharmigen); cytotoxic T cell: CD8 (BD Biosciences Pharmigen); helper
T cell: CD4 (BD Biosciences Pharmigen); pan B cell: CD19 (BD
Biosciences Pharmigen); NK cell: CD56 (BD Biosciences Pharmigen);
promonocyte: CD64 (Immunotech); monocyte: CD14 (IQP); hemato-
poietic progenitor cells: CD117 (BD Biosciences Pharmigen) and CD34
(BD Biosciences Pharmigen); mesenchymal cells: CD105 (Immuno-
step), CD73 (BD Biosciences Pharmigen) and CD90(BD Biosciences
Pharmigen); neutrophils: CD31(BD Biosciences Pharmigen) and CD33
(BD Biosciences Pharmigen); anti HLA-DR (MHC-II, BD Biosciences
Pharmigen). After staining, erythrocytes were lysed with the B&D Lysis
Buffer Solution. Data acquisition was performed on a BD FACS CANTO
cytometer (Beckton & Dickson) and analyzed with the “Paint-a-Gate”
software. A fibroblast colo ny-for ming assay was performed to
determine the presence of putative progenitor cells of mesenchymal
lineages, as previously described (Castro-Malaspina et al., 1980).
Cell transplantation
Cells labeled as described above were added back to the total
mononuclear cell suspension (final volume of 10 ml). Femoral arterial
punctures were done in all patients. A 6 Fr. Guiding catheter (Envoy-
Cordis, Miami, Florida; or a Guider Soft tip, Boston Scientific, Target
Therapeutics, Fremont, California) was used. Patients underwent
anticoagulation with intravenous heparin to obtain an activated
clotting time of two to three times baseline. A digital cerebral
angiography was performed (Angiostar, Siemens Medical Systems,
Erlangen, Germany) to allow visualization o f the intracranial
vasculature before injection and monitoring of flow normality and
vessel patency. A large-inner-diameter micro catheter (SL 1018
Boston Scientific, Target Therapeut ics, Fremont, California) was
navigated to the M1 portion of the middle cerebral artery, and the
infusion was done at the rate of approximately 1 ml/min.
Imaging
Whole-body and planar images were captured using a Millennium
GE camera (General Electric Medical Systems, Milwaukee, Wiscon-
sin). Acquisition protocols were performed at 2 h and 24 h after cell
therapy. Whole-body images were acquired for 20 min in anterior and
posterior views, using a dual-head whole-body scanner with high-
resolution, low-energy collimator. Planar images were acquired for
10 min, matrix 256 × 256, in anterior, right and left lateral, and
posteri or views. Single-Photon-Emission Computed T omograph y
(SPECT) was performed with two 180° opposed rotating detectors
with low-e nergy hig h-resolution collimators. The software and
hardware for image reconstruction was a Xeleris-GE processing
workstation for reconstruction of the SPECT image data. Projections
were collected over 24 min, with each detector rotating 180 to make a
complete 360 revolution in a circular orbit with the patient placed in
the supine position. Image volumes were reconstructed using the
OSEM algorithm with axial smoothing and a Butterworth filter with
an order of five and a cutoff of 0.45. Image volumes consisted of
64×64× 64 voxels each measuring 4.38 mm
3
. The detector distance
ranged from 14 cm to 20 cm during rotation, resulting in a spatial
resolution FWHM (full width at half-max) of approximately 12 mm.
For each patient, regions of interest were drawn for the brain, liver,
spleen, lungs, kidneys, bladder, and for the whole body, and the
radioactive counts were automatically quantified for these regions in
whole body planar images at 2 h after cell injection. Uptake was
defined as the percentage of organ-originated number of counts
compared to the total number of counts in the whole body. To allow
better discrimination of the uptake in the brain, regions of interest
corresponding to the left and right hemispheres were drawn in SPECT
images and the radioactive counts were automatically quantified.
Uptake in hemispheres ipsilateral and contralateral to the lesion was
defined as the percentage of hemisphere-originated number of counts
compared to the total number of counts in both hemispheres.
CT images were acquired before cell transplantation with a 40–
detector row scanner (Brilliance-40, Philips Medical S ystems).
Volumetric analysis was performed to measure the approximate
volumes of the infarcted areas. Volumes were obtained by multiplying
the measured area per slice by the section thickness. SPECT and CT
2 L.M. Barbosa da Fonseca et al. / Experimental Neurology xxx (2009) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Barbosa da Fonseca, L.M., et al., Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic
stroke after intra-arterial injection, Exp. Neurol. (2009), doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
images were exported by DICOM protocol, and transferred to a
Macintosh computer (MacOS X, version 10.4). Images were fused with
dedicated image processing software ( OsiriX imaging software,
version 3.6, Geneva, Switzerland).
Clinical evaluation
Patients underwent neurological examination at admission, on the
day of transplantation and at 3, 7, 30, 60, 90 and 120 days after cell
infusion. The examination included the Barthel Index, the modified
Ranking scale and the National Institutes of Health Stroke Scale.
Laboratory tests (complete blood count and biochemical tests for
urea, creatinine and electrolytes) were also performed at the same
time-points. An electroencephalogram (EEG) was performed within
7 days of cell transplantation.
Statistical analysis
Because of thesmall sample size, the analysis was mostly descriptive.
The descriptive statistics of cell characteristics on FACS are given as
mean values with standard deviation. Pearson and Spearman correla-
tion tests were used to assess the relationship between total brain
uptake and different variables (age, time from onset to cell therapy,
number of injected cells, lesion volume and ipsilateral hemisphere
uptake). Probability values of 0.05 or less were considered to indicate
statistical significance. Statistical analysis was performed with the SPSS
17 (SPSS Science) statistical software package for Windows.
Results
Patients
The patient characteristics are presented in Table 1. All individuals
had cerebral infarcts that involved the MCA territory as documented
by neuroimaging exams. Patients received between 1.25×10
8
and
5×10
8
mononuclear cells, and cell transplantation took place
between 59 and 82 days after the stroke. Clinical, laboratory and
electroencephalographic eval uations showed no adverse e ffects
during the procedure or follow-up, and no patient scored worst on
the BI, mRS, or NIHSS tests. The cell immunophenotype is presented in
Table 2.
Imaging
Whole-body scans obtained 2 h after transplantation of labeled
BMMCs showed uptake in the brains of all patients, which ranged
from 0.6% to 5.1 % when compared to the activity in the whole body.
The location of cell homing could be better visualized in SPECT images
than in whole-body planar images. Transverse views of SPECTs, CTs
and SPECT/CT fusion images for two representative patients are
shown in Fig. 1. Quantification of cell uptake in SPECT images
indicated preferential uptake on the side of the lesion in all patients
(Table 3). Nevertheless, these differences were widely variable,
ranging from 58% to 98% of total brain uptake (Table 3). The
remaining cell uptake was distributed mainly to the liver, lungs,
spleen and kidneys in all patients (Table 3). Due to the 6-h half-life of
99m
Tc, image resolution was greatly decreased at 24 h after cell
transplantation, and regions of interest could not be adequately
determined to allow quantification of uptake in different organs (Fig.
2). At 24 h, uptake could only be visualized in the brains of patients 1
and 3, while in all patients uptake was seen in the liver, lungs, spleen,
kidneys and bladder. Fig. 2 illustrates the whole-body images from
one of the patients in which cells could not be identified in the brain at
24 h; and Fig. 3 shows brain planar views of one patient in which
uptake could be identified at 24 h. The presence of free
99m
Tc was
excluded by thyroid region planar nuclear imaging. Movies 1 and 2
correspond to dynamic three-dimensional SPECT images, demon-
strating cell homing in the left MCA territory 2 h after cell
Table 1
Patient characteristics.
Characteristics Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6
Sex/age (years) M/24 M/65 M/47 M/65 M/57 M/47
Infarct location Left Right Left Left Right Right
NIHSS at admission 9 7 4 13 9 13
Time from onset to
BMMC infusion (days)
67 82 62 72 59 73
N° of injected cells 5× 10
8
1.25× 10
8
3.9× 10
8
4×10
8
3.2× 10
8
1×10
8
Lesion volume (cm
3
) 116 47 17 71 181 213
BMMC: Bone-marrow mononuclear cells; NIHSS: National Institutes of Health Stroke Scale.
Table 2
Cell immunophenotype.
CD markers Phenotype % No of cells ×10
7
CD45
low
CD34
high
SSC↓ Hematopoietic stem cells 1.60± 0.83 11.80 ± 2.17
CD45
low
CD34+CD19+ B-cell progenitors 1.30± 0.95 0.37± 0.16
CD45+CD34-CD33+CD64+CD14- Promonocytes 0.78± 0.47 0.22± 0.08
CD105+CD90
high
CD73+CD45-CD34- Mesenchymal stem cells 0.12± 0.09 0.03± 0.01
CD105+CD90
high
CD73+CD45-CD34+ Endothelial stem cells 0.04± 0.07 0.01± 0.01
CD45+CD34-CD64+CD14+ Monocytes 4.45 ± 3.97 1.28± 0.68
CD45+CD34-CD3+ T Lymphocytes 8.75± 4.80 2.51± 0.82
CD45+CD34-CD3+CD4+ Helper T cells 5.84± 3.87 1.68± 0.67
CD45+CD34-CD3+CD8+ Cytotoxic T cells 2.32± 1.57 0.67± 0.27
CD45+CD34-CD3-CD19+ B cells 2.32± 1.56 0.67± 0.27
CD45+CD34-CD56+ NK cells 7.86± 3.076 2.26 ± 0.53
Functional assay No of colonies × 10
6
BMMC seeded
Fibroblast Colony-forming assay 35.75± 7.63
The indicated percentages of immune cell subtypes have been calculated using the Paint-a-Gate PRO software (BD Biosciences), which displays a combination of the morphological
characteristics (side scatter and forward scatter) and the specific CD marker expression, thus allowing a multiparametric analysis and identification of the cell subtype percentages.
3L.M. Barbosa da Fonseca et al. / Experimental Neurology xxx (2009) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Barbosa da Fonseca, L.M., et al., Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic
stroke after intra-arterial injection, Exp. Neurol. (2009), doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
transplantation in patients 3 and 4, respectively. Statistical analysis
indicated that brain uptake at 2 h seemed to be inversely related to
age (r= − 0.883; p=0.02). Also, greater uptake in the brain was
related to a preferential uptake in the lesion's hemisphere (r = 0.869;
p=0.025). Volume of lesion (r = 0.057; p=0.914), time from onset
to infusion (r=− 0.314; p = 0.544) and the number of cells injected
(r=0.543; p = 0.266) did not seem to be related to brain uptake.
Discussion
Bone-marrow mesenchymal stem cells (MSCs) and mononuclear
cells (BMMCs) increase functional outcomes in animal models of
stroke when delivered by intravenous, intracerebral and intra-arterial
routes (Chen et al., 2001, 2003, Chopp and Li, 2002, Giraldi-Guimaraes
et al., 2009, Kamiya et al., 2008, Li et al., 2001, 2000). It has been
shown that bone marrow cells target the ischemic lesion, and this is
thought to be mediated by injury-induced chemokines (Hill et al.,
2004, Shen et al., 2007a,b). Current preclinical evidence indicates that
the main mechanism of cell-based therapy is not by direct cell
replacement, but by trophic, anti-inflammatory and immunomodu-
latory effects that have an acute but persistent effect on the brain
before these cells die (Barnabe et al., 2009, Bliss et al., 2007, Hess and
Borlongan, 2008, Mendez-Otero et al., 2007). Therefore, long-term
cell persistence and engraftment in the brain may not be necessary for
a therapeutic effect (Bliss et al., 2007, Hess and Borlongan, 2008,
Mendez-Otero et al., 2007). Cells may not even need to enter the brain
to elicit an effect, but rather act in the periphery to increase trophic-
factor expression in the brain, (Borlongan et al., 2004, Sarnowska et
al., 2009 ) and positive effects have been seen even when cell injection
takes place 1 month after the stroke (Shen et al., 2007a,b, Yasuhara et
al., in press).
Radioisotope cell labeling is a well-established method that allows
systemic monitoring of cells in nuclear-medicine studies (Palestro et
al., 2009) , and has already been applied for tracking cells in cell
therapy for myocardial infarction (Goussetis et al., 2006, Hofmann et
al., 2005, Kang et al., 2006, Penicka et al., 2007) and acute stroke
(Correa et al., 2007) in humans. The 6-h half-life of
99m
Tc is an
important advantage over the half-life of 110 min of 18F-fluorodeox-
yglycose (FDG). 111-Indium-oxine, another commonly used radio-
pharmaceutical , allows cel l trackin g for up to 96 h, but has
disadvantages that include suboptimal photon energies, low resolu-
tion images and the 18- to 24-h interval between injection and
imaging that is usually required (Banerjee et al., 2005, Palestro et al.,
2009).
99m
Tc allows imaging for 24–48 h and results in higher image
Fig. 1. Transverse views of SPECT s (upper row), CTs (middle row) and SPECT/CT fusion images (lower row) of patients 3 (A) and 6 (B).
Table 3
Quantification of uptake in different regions at 2 h after cell transplantation in percentages.
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Mean ±SD
Uptake quantified in whole body planar images
Brain/whole body 5.1 0.7 1.5 0.5 0.9 1.4 1.68 ±1.71
Liver/whole body 42.4 39.9 47.7 38.5 48.7 44.2 43.56 ±4.10
Spleen/whole body 5.2 3.1 2.2 4.1 5.6 3.7 3.98± 1.27
Kidneys/whole body 3.6 4.1 7.3 2.4 5.9 2.8 4.35± 1.89
Lungs/whole body 7.8 6.6 4.7 9.1 8.8 6.2 7.20 ±1.68
Bladder/whole body 8.7 8.1 10.2 7.9 9.4 9.8 9.01 ±0.93
Uptake quantified in Brain SPECT images
Ipsilateral hemisphere/brain 97.8 65.7 82.2 77.4 58.3 79.2 76.76± 13.72
Contralateral hemisphere/brain 2.2 34.3 17.8 22.6 41.7 20,8 23.23 ±13.72
Uptake in the brain, liver, spleen, kidneys, lungs and bladder was defined as the percentage of organ-originated number of counts compared to the total number of counts in whole
body planar images 2 h after cell transplantation.
To allow better discrimination of the uptake in the brain than in whole body planar images, uptake in hemispheres ipsilateral and contralateral to the lesion was defined as the
percentage of hemisphere-originated number of counts compared to the total number of counts in both hemispheres in SPECT images 2 h after cell transplantation.
4 L.M. Barbosa da Fonseca et al. / Experimental Neurology xxx (2009) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Barbosa da Fonseca, L.M., et al., Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic
stroke after intra-arterial injection, Exp. Neurol. (2009), doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
resolution and a lower radiation burden to the patient (Banerjee et al.,
2005, Palestro et al., 2009).
In preclinical models, direct cell labeling with contrast agents such
as superparamagnetic iron oxides (SPIO) for MRI allows cell tracking
from a few days to several weeks after transplantation (Budde and
Frank, 2009, Lee et al., 2008, Modo et al., 2005). Moreover, this
technique imaging provides higher spatial resolution and direct
anatomical correlation (Budde and Frank, 2009, Lee et al., 2008, Modo
et al., 2005). Cell tracking with MRI suffers from common limitations
observed with exogenous cell tagging, such as the sensitivity of the
imaging technique, dilution of the contrast with cell division, and
potential transfer of the magnetic label to tissue macrophages ( Budde
and Frank, 2009, Lee et al., 2008, Modo et al., 2005). Currently there
have been only 4 clinical studies in the literature involving a total of
24 patients using magnetically labeled cells and MRI to monitor the
migration of cells to target tissue (Callera and de Melo, 2007, de Vries
et al., 2005, Toso et al., 2008, Zhu et al., 2006) and at this time
superparamagnetic or paramagnetic agents are not approved by
regulatory agencies for cell labeling (Budde and Frank, 2009, Lee et al.,
2008, Liu and Frank, 2009, Modo et al., 2005).
In humans, preliminary data from two Phase I clinical trials
involving intra-arterial injection of BMMCs for acute ischemic stroke
(3–10 days post-ictus) with a total of 25 patients have suggested the
procedure is feasible and safe (Correa et al., 2007, Freitas et al., 2006,
Friedrich et al., 2006, Mendonca et al., 2006), but the final reports have
not been published. In one of these studies, one patient received cells
labeled with
99m
Tc-HMPAO, and whole-body scintigraphy and SPECT
indicated cell accumulation in the brain 8 h after cell transplantation
(Correa et al., 2007). Another Phase I study treated 5 patients with a
total of 1 ×10
8
intravenous bone marrow autologous MSCs in two
doses at 4–5 and at 7–9 weeks after stroke and found the procedure to
be feasible and safe (Bang et al., 2005).
Nonetheless, the safety and feasibility of BMMC injection in chronic
stroke, as well as cell labeling, have never been studied in humans.
Data from pre-clinical studies with acute ischemic models comparing
different administration routes suggest that there are differences in
cell retention rate (Lappalainen et al., 2008, Walczak et al., 2008).
Intracerebral injection usually leads to poor cell distribution through-
out the lesion (Li et al., 2000, Walczak et al., 2008), and intra-arterial
injection of BMMCs and MSCs provides greater cell retention when
compared to intravenous injection (Kamiya et al., 2008, Lappalainen et
al., 2008, Walczak et al., 2008). Nevertheless, there are no reports on
the percentage of BMMCs grafted after intra-arterial injection, and
only limited reports for MSCs, where cell homing varied from 1%
(Lappalainen et al., 2008) to 21% (Li et al., 2001). A recent study
suggested that intra-arterial injection of MSCs led to wide variation in
cerebral engraftment, and 17% of animals had no cells detectable in the
brain. The same study also suggested that high cerebral engraftment
rates of MSCs were associated with impeded cerebral blood flow as
measured by laser Doppler flow (Walczak et al., 2008). Notwithstand-
ing, there may be significant differences, depending on the ratio
between the diameter of cells injected and the capillary size
(Lappalainen et al., 2008, Walczak et al., 2008). Furthermore, this
effect may have been increased by cerebral edema, because cell
injection was performed 30 min after the stroke (Walczak et al., 2008),
and therefore further studies are warranted to assess these questions.
Early data from a clinical trial investigating the safety and feasibility of
BMMCs for acute stroke monitored cerebral blood flow by TCD and
EEG, and found no evidence of embolization or electroencephalo-
graphic changes (Freitas et al., 2006, Mendonca et al., 2006).
The total number of cells injected was the maximum obtained
from 80 ml of bone-marrow aspiration, and varied according to each
patient (1.25× 10
8
to 5× 10
8
). These differences in cell quantity were
in accordance with the interval approved for this protocol. This cell
dose was consistent with other studies involving intra-arterial BMMC
injection in ischemic myocardial infarction (Huikuri et al., 2008,
Fig. 3. Anterior andleft lateral viewsof brain planar scans indicate homingof BMMCs at 2 h
(A and B, respectively) and 24 h (C and D, respectively) after cell injection in patient 3.
Fig. 2. Anterior whole-body scans performed 2 h (A) and 24 h (B) after cell injection in
the territory of the MCA show the distribution of BMMCs labeled with
99m
Tc in patient
4. Uptake in the left brain hemisphere could only be distinguished at 2 h. The remaining
activity was distributed mainly to the liver and spleen at 2 h and 24 h. Arrows indicate
the location of the liver, lungs, spleen, kidneys and bladder.
5L.M. Barbosa da Fonseca et al. / Experimental Neurology xxx (2009) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Barbosa da Fonseca, L.M., et al., Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic
stroke after intra-arterial injection, Exp. Neurol. (2009), doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
Lunde et al., 2006, Meyer et al., 2006, Penicka et al., 2007, Strauer et al.,
2005, Tendera et al., 2009) and cerebral infarction (Correa et al., 2007,
Mendonca et al., 2006). The transplanted cell population was
characterized using a well-defined set of phenotypic markers, and
we observed many phenotypes that included different progenitor
cells. Moreover, the functional characterization of fibroblastic like
cells confirmed the presence of putative progenitor cells of mesen-
chymal lineages.
We have previously reported preliminary data from this study that
indicated that the procedure was safe (Battistella et al., 2008) and that
the cells labeled with
99m
Tc migrated to the brain of the first patient
enrolled (Barbosa da Fonseca et al., 2009). Here, we provide further
evidence that BMMC homing occurs in the brain after intra-arterial
injection in chronic stroke. Furthermore, we provide for the first time
the quantification of cell uptake in the brain and in other organs after
cell therapy for stroke. A study with an animal model of stroke has
suggested that the abundance and responsiveness of bone marrow
progenitor cells to gradients of factors such as Stromal Derived Factor-
1 may decrease with age and reduce the chemoattraction of such cells
to the damaged tissue (Kucia et al., 2006). However, it is not currently
possible to explain the wide variability of homing between patients,
and there are probably multiple variables involved that remain to be
investigated in future studies.
In summary, we would like to suggest that non-invasive imaging
modalities such as the one described in this study can be used to
monitor the delivery and tracking of cells, and may improve
understanding of possible functional responses in the setting of
chronic stroke. Moreover, the advantages offered by other imaging
modalities, such as cell labeling with SPIO for MRI, could be used in the
future in conjunction with SPECT to provide further information on
cell homing.
Acknowledgments
The authors thank Dr. Daniel Richard Mercante and Dr. Cristiane
Amaral Garcia Mendonça for bone-marrow harvesting. Dr. Janet W. Reid
revised the English text. This study was supported by grants from the
Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de
Janeiro (FAPERJ) to Bianca Gutfilen (grant number 180.011/2005) and
to Rosalia Mendez-Otero (grant number 110.391/2007); and a grant
from the Ministry of Health and Ministry of Science and Technology of
Brazil to Rosalia Mendez-Otero (grant number 552201/2005-7).
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found, in
the online version, at doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010.
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stroke after intra-arterial injection, Exp. Neurol. (2009), doi:10.1016/j.expneurol.2009.10.010
JOURNAL OF THE AMERICAN HEART ASSOCIATION
STROKE/2009/567016 VERSION 1
Mendez-Otero, and Charles André
Regina C Goldenberg, Juliana V Dias, Tais Kasai-Brunswick, Eduardo Wajnberg, Rosália
Valéria Battistella, Gabriel de Freitas, Lea MB da Fonseca, Daniel Mercante, Bianca Gutfilen,
subacute ischaemic stroke
Safety of autologous bone-marrow mononuclear cell transplantation in patients with
This information is current as of September 28, 2009
on September 28, 2009 http://submit-stroke.ahajournals.orgDownloaded from
SAFETY OF AUTOLOGOUS BONE-MARROW MONONUCLEAR CELL
TRANSPLANTATION IN PATIENTS WITH SUBACUTE ISCHAEMIC STROKE
Authors: Battistella V
1
; de Freitas GR
1
; Barbosa da Fonseca LM
2
; Mercante D
3
; Gutfilen B
2
;
Goldenberg RC
3,4
; Dias VJ
3,4
; Kasai-Binswick TH
3,4
; Wajnberg E
2
; Mendez-Otero R
3,4
; Andre C
1
.
From the Departments of Neurology
1
, Radiology
2
and Cell Therapy Program
3
of the Clementino
Fraga Filho University Hospital and Carlos Chagas Filho
Biophysic Institute
4
of the Rio de Janeiro
Federal University.
Background: To assess the safety and feasibility of bone-marrow mononuclear cell (BMMC)
transplantation in patients with middle cerebral artery (MCA) territory ischaemic stroke within 90
days of stroke onset.
Methods: Six male patients (aged 24 to 65 years) received intra-arterial BMMC 60 to 90 days after
mild to moderate MCA infarcts (National Institutes of Health Stroke Scale [NIHSS] between 4 and
13) according to a defined protocol (NCT00473057). Iliac-crest bone-marrow aspiration was
performed under sedation and local anaesthesia. BMMC were isolated using a Ficoll gradient, and
10% of the cells were separated and labelled with 99mTc and re-injected in the MCA (minimum: 1
x 10
8
and maximum: 5 x 10
8
injected cells) after navigation (Seldinger technique). SPECT was done
2 h after the procedure, and whole-body scan and planar images were also taken after 24 h.
Electroencephalogram was done within 7 days after transplantation. Patients were evaluated with
blood tests, NIHSS, modified Rankin Scale (mRS), and Barthel Index (BI) before treatment, and 1,
3, 7, 30, 60, 90, 120, and 180 days after the infusion.
Findings: No patient exhibited any complication or adverse events during the procedure. There was
no worsening in NIHSS, mRS, or BI until the end of follow-up. Two patients had generalized
seizure after the end of follow-up.
Interpretation: In this small pilot study, BMMC intra-arterial injection in patients with ischaemic
strokes proved feasible and safe. Phase II studies are required to further evaluate efficacy and
safety.
INTRODUCTION:
Stroke is the third cause of death in developed countries
1
and the leading cause of death in
some developing countries
2
including Brazil
3
. Stroke remains a leading cause of disability in the
world: at least 30% of stroke survivors make an incomplete recovery, and a further 20% require
assistance for activities of daily living
4
. Although acute-stroke care facilities such as stroke units
and the use of thrombolytics may improve prognosis, there are few clinical trials evaluating
effective ways to enhance recovery in patients with residual disability
5
. In recent years, several
studies have investigated the potential restorative role of stem cells from different sources in animal
models of brain ischaemia
6
. They showed that stem-cell administration ameliorates the functional
loss observed after ischaemia, making stem-cell transplantation an attractive approach to restore
brain function after stroke in humans.
Two different Brazilian institutions (phase I clinical trials) evaluated the safety of stem-cell
transplantation in the first ten days of ischaemic stroke
7,8
. Twenty-six patients (the sum of two
studies) with middle cerebral artery (MCA) territory infarction received intra-arterial autologous
bone-marrow mononuclear cells (BMMC) transplantation. One patient presented neurological
deterioration (recurrent embolisation) during arteriography, before the injection of stem cells.
Treated patients exhibited uneventful clinical courses, with no new lesions appearing in sequential
magnetic resonance imaging (MRI) evaluation, including diffusion-weighted imaging (DWI) and
on September 28, 2009 http://submit-stroke.ahajournals.orgDownloaded from
no epileptic activity on frequent electroencephalography studies
9
. These studies suggest that intra-
arterial autologous BMMC transplantation is safe in patients in the first 10 days after ischaemic
stroke, and that SPECT imaging with labelled BMMC is a feasible noninvasive method for studying
the homing of transplanted cells in vivo.
Transplantation of stem cells after the first few days of ischaemia may present several
obstacles. The formation of scar tissue and the restoration of the blood-brain barrier might adversely
affect implanted cells. Moreover, there are few reliable animal models of chronic stroke to
investigate transplantation several months after the infarction
10
. Nevertheless, there are some phase
I and II clinical studies evaluating stem cell transplantation in patients with chronic stroke,
including patients even 10 years after the index event
11,12,13,14
. However, two of these studies
employed cells derived from a human teratocarcinoma
11,12
and porcine cells
13
,which may provoke
severe rejection responses. Bang and colleagues examined the safety and efficacy of cultured
expanded autologous mesenchymal stem cells administered intravenously 4-5 and 7-9 weeks after
symptom onset
14
. The five patients who received these cells had no adverse effects and presented
better outcomes at 3 and 6 months than the control group. In this study the bone marrow cells were
cultivated for several weeks before transplantation, which may increase the risk of contamination.
In addition, none of these studies evaluated the fate of the transplanted cells in vivo.
The aim of this study was to examine the feasibility and safety of intra-arterial
transplantation of autologous BMMC in patients with MCA territory infarction, between 2 and 3
months after the ictus.
METHODS:
Subjects: This study is an unblinded, uncontrolled Phase I clinical trial. The protocol and the
consent form were approved by the Institutional Research Ethics Committee and the National
Committee of Ethic and Scientific Research. Written informed consent was obtained from all
subjects.
Eighteen to seventy-five year-old individuals were eligible for the study if they had the
following characteristics: (1) ischaemic stroke in the MCA territory evidenced by computed
tomography (CT) or MRI occurring within 90 days; (2) recanalisation of the involved MCA as
assessed by transcranial Doppler (TCD) studies or by magnetic resonance angiography (MRA); and
(3) a score between 4 and 17 according to the National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS).
We excluded patients who met any of the following criteria: difficulty in obtaining vascular access
for percutaneous procedure, ipsilateral carotid stenosis (>50%, by Doppler studies), neurological
worsening (>4 points in the NIHSS) before injection due to either edema or intracerebral
hemorrhage, thrombophilias or primary haematological diseases, neurodegenerative disorders,
previous stroke with modified Rankin Scale > 2, intracardiac thrombus, auto-immune disorders,
sepsis (according to the Society of Critical Care Medicine and the American College of Chest
Physicians 1992 criteria), history of neoplasia or other comorbidity that could impact a patient's
short-term survival, any condition that in the judgment of the investigator would place the patient
under undue risk, bone disorders that could increase the risk of the bone-marrow harvesting
procedure, liver failure, renal failure (serum creatinine > 2mg/mL), haemodynamic or respiratory
instability, lacunar stroke, pregnancy, or previous participation in other clinical trials.
Bone-marrow aspiration, cell separation, and cell injection: Cells were obtained by marrow
aspiration of the iliac crest (50-80ml) and processed by Ficoll density centrifugation. After washing,
counting and viability testing (greater than 98%), cells were resuspended in 10 mL of saline
solution with 5% autologous serum. One mL of this solution was labelled with 99 mTc
15
.
Labelled cells were added back to the total mononuclear cell suspension (final volume 10
mL) and slowly injected into the territory of the MCA, via the femoral artery, after navigation
(Seldinger technique). Intravascular infusion of mononuclear cells was performed under local
anaesthesia and conscious sedation. A routine coaxial technique with femoral arterial puncture was
used. A 6 Fr. Guiding catheter (Envoy-Cordis, Miami, Florida or Guider Soft tip, Boston Scientific,
Target Therapeutics, Fremont, California) was positioned at the cervical level with continuous
on September 28, 2009 http://submit-stroke.ahajournals.orgDownloaded from
flushing with normal saline. Intravenous heparin was used (bolus of 80 Units/ Kg of body weight)
and as needed to maintain the activated clotting time between two and three times baseline values.
A large-inner-diameter microcatheter (SL 1018 Boston Scientific, Target Therapeutics, Fremont,
California) was navigated to the M1 portion of the MCA and the infusion was performed in about
10 minutes.
Neurologic evaluation: All individuals were evaluated at admission, on the day of
transplantation, and 1, 3, 7, 30, 60, 90, 120 and 180 days after cell infusion using the NIHSS, the
Barthel Index (BI), and the mRS by a single board-certified neurologist (VB). Routine laboratory
tests (complete blood count and biochemical examinations: urea, creatinine, and electrolytes) were
done at these points. An Electroencephalogram (EEG) was obtained within 7 days after
transplantation.
RESULTS:
Baseline characteristics: The clinical and radiologic characteristics and the number of
injected cells of the included patients are shown in Table 1. Two patients were taking an oral
anticoagulant drug to prevent recurrent strokes, and were switched to low-molecular-weight heparin
(enoxaparine 1 mg/Kg b.i.d.) one week before the procedure.
Safety of the procedure: There were no significant adverse effects related to the procedures.
The EEG showed polymorphic slow activity in the ischaemic area, and only one patient exhibited
spike-wave activity. Two patients suffered generalized seizures after the end of follow-up, around
200 days after the BMMC infusion; one was successfully treated with phenytoin, the other was
treated with a combination of oxcarbazepine and lamotrigine.
Functional Outcome: Only one patient (patient 3) was independent in daily activities at
BMMC infusion day (BI 95 and mRS 1). At the 180-day follow-up evaluation, all patients had
improved their scores (Table 1 and Figure 1).
NIHSS scores improved (range -1 to -8 points) during follow-up in all patients. No patient
scored lower on the BI, mRS, or NIHSS tests.
on September 28, 2009 http://submit-stroke.ahajournals.orgDownloaded from
TABLE 1 : Baseline characteristics and follow-up:
Characteristics
Patient 1
Patient 2
Patient 3
Patient 4
Patient 5
Patient 6
Sex/ Age
M / 24
M /
65
M /47
M / 65
M / 57
M / 47
Risk factor
PFO
Hyperte
nsion,
DM,
Dislipidaemia
Hypertension
AF, DM
Hypertension
DM,
Hypertension
Symptoms
Aphasia,
Hemiplegia
Dysarthria,
Hemiplegia
Aphasia,
Hemiparesis
Aphasia,
Hemiplegia
Dysarthria,
Hemiplegia
Dysarthria,
Hemiplegia
Infarct location
Left
Right
Left
Left
Ri
ght
Right
Stroke
Mechanisms
Cardioembolism
Athero
During
aneurism
clipping
Cardioembolism
Athero
Athero
Acute treatment
Conservative
Conservative
Conservative
IV
Thrombolytics
IV
Thrombolytics
IV + IA
Thrombolytics
+ craniectomy
Haemorrhagic
transformation
No
Yes
No
Yes
No
Yes
Infusion day:
NIHSS/BI/mRS
(days since
stroke)
7/ 100/ 2
(67)
9/ 35/ 4
(82)
4/ 95/ 1
(62)
13/ 25/ 5
(72)
9/ 30/ 4
(59)
13/ 10/ 5
(73)
NIHSS/BI/mRS
at day 3
6/ 100/ 2
9/ 35/ 4
3/ 95/ 1
12/ 25/ 5
6/ 30/ 4
13/ 10/ 5
NIHSS/BI/mRS
at day 7
5/ 100/ 2
8/ 35/ 4
3/ 95/ 1
12/ 25/ 5
5/ 30/ 4
12/ 15/ 5
NIHSS/BI/mRS
at day 30
5/ 100/ 1
6/ 50/ 4
3/ 100/ 1
11/ 25/ 4
3/ 50/ 3
12/ 25/ 5
NIHSS/BI/mRS
at day 60
4/ 100/ 1
6/ 55/ 4
3/ 100/1
9/ 30/ 4
4/ 90/ 1
12/ 30/ 5
NIHSS/BI/mRS
at day 90
4/
100/ 1
6/ 65/ 3
3/ 100/1
10/ 35/ 4
4/ 90/ 1
12/ 30/ 5
NIHSS/BI/mRS
at day 120
4/ 100/ 1
6/ 75/ 3
3/ 100/1
10/ 35/ 4
1/ 100/ 0
11/ 50/ 3
NIHSS/BI/mRS
at day 180
4/ 100/ 1
6/ 80/ 3
3/ 100/1
10/ 35/ 4
1/ 100/ 0
11/ 50/ 3
No. of injected
cells
5 x 10
8
1.25
x 10
8
3.9 x 10
8
4 x 10
8
3.2 x 10
8
1 x 10
8
PFO: Patent Foramen Ovale DM: Diabetes mellitus AF: Atrial fibrillation
NIHSS: National Institutes of Health Stroke Scale
Cardioemb: cardioembolism Athero: atherosclerotic
mRS: modified Rankin Scale BI: Barthel Index
IV: intra-venous, IA: intra-arterial
on September 28, 2009 http://submit-stroke.ahajournals.orgDownloaded from
DISCUSSION:
In the present series, BMMC transplantation proved to be safe and feasible in 6 patients with
ischaemic stroke in the MCA territory within 90 days after onset. There were no complications or
unexpected outcomes related to the procedure. All the patients improved their scores (NIHSS, BI,
and mRS) at the end of follow-up (Table 1 and Figure 1). Two patients suffered seizures about 200
days after the cell infusion These patients are under extended follow-up.
Stem-cell-based therapies may represent new and important strategies for the treatment of
stroke. In animal models of ischaemia, stem cells from different sources have been used with
promising results, and different mechanisms of action have been suggested to explain these
functional benefits
16-18
. For example, the introduction of neural stem cells/ neural progenitors into
areas of cell loss may result in repair and restoration of circuitry
19
. Alternatively, when bone-
marrow-derived stem cells (mesenchymal or mononuclear cells) are employed, the functional
benefits observed are probably due to the release of cytokines and/or trophic factors which may
have an immunomodulatory effect and/or contribute to a reduction in apoptosis in the penumbra
area in earlier periods after ischaemia
20
. In addition, it has been suggested that cell-based therapies
amplify endogenous processes of brain repair and plasticity, including neurogenesis, angiogenesis,
and synaptogenesis, which could explain the benefits observed in experimental models of stroke,
even when cells are administered at later times
21-23
.
Up to now, only a few clinical studies involving cellular therapies in patients with acute and
chronic stroke have been published
6,11,12
; only two of these studies involved therapy with
autologous bone-marrow-derived stem cells
7,14
. In one, Bang and cols. investigated intravenous
infusion of autologous mesenchymal bone-marrow cells, expanded in vitro, in patients with acute
cerebral infarcts
14
. The procedure was safe and feasible; the group receiving mesenchymal cells
(n=5) had their BI increased after the MSC infusion on 3 and 6 months after the onset of symptoms.
However, the changes in NIHSS and mRS were not statistically significant. Another point of
discussion is cell preparation: although feasible, it is potentially dangerous and is also expensive.
Another study carried out during the acute phase of stroke (3-10 days post-ictus) evaluated the
safety of intra-arterial bone-marrow mononuclear cell transplantation in patients with MCA
territory infarcts in two different Brazilian institutions. In one of them, six patients were enrolled
and received approximately 30 x 10
6
cells into the territory of the middle cerebral artery, via the
femoral artery, after navigation (Seldinger technique). Preliminary reports showed that the
procedure is safe and feasible
7,8
. With respect to chronic stroke, Savitz and cols studied
neurotransplantation of fetal porcine cells in patients who had suffered a stroke 3 months to 10
years prior to study. The patients underwent CT-guided stereotactic implantation of fetal cells
pretreated with an antibody to prevent rejection. The study was terminated by the Food and Drug
Administration (FDA) because of adverse events (cortical-vein occlusion secondary to the surgery
in one patient, and seizures in two patients)
13
. Kondziolka and cols carried out a phase II
randomized trial that included patients for whom the mean time after onset of stroke was 3.5 years.
They received stereotactic implants of human cultured neuronal cells, derived from a human
embryonic carcinoma cell line. The study was negative for the primary outcome measure, although
a measurable improvement, without statistical significance, was noted in some patients. One patient
developed a single seizure 1 day after surgery, while another developed a subdural haematoma that
required drainage 1 month after surgery
12
. The results of these two studies suggest that intracranial
transplantation does carry risk.
Some issues need to be addressed. Although the transplantation seems to be safe and
feasible, many questions remain unanswered, including the origin and dose of stem cells,
administration route, timing of the infusion (acute x sub-acute x chronic stage of stroke), the
territory of stroke (cortical x subcortical territories, anterior x posterior circulation), and the
mechanisms of action of bone-marrow-derived stem cells in the setting of stroke. In our study, the
rationale for selecting the cell dose was based on the results of the safety studies described above
7,8
and the reason for selecting non-acute patients was based the on results from experimental models
of cell therapy in stroke
24
, although the two issues are interconnected. A therapeutic window should
be determined as a function of therapeutic dose, and the repeated-dose regimen could optimize
on September 28, 2009 http://submit-stroke.ahajournals.orgDownloaded from
recovery benefit
25
.
It is not clear whether late seizures in two patients were caused by some late reaction of the
mononuclear cells injected, by misdirection of regenerating nerve fibres (aberrant reinervation) or
by the anatomic substrate of the ischaemic tissue itself. Although several risk factors for early or
late seizures have been identified, there is no clear predictor of post-stroke epilepsy
26
.
Approximately 5-10 percent of acute ischaemic-stroke patients have early seizures, which typically
occur within 24 hours
27
. Late seizures, usually occurring at least 2 weeks after the stroke
28,29
occur
in 3% to 67%, varying considerably among series
27,30
. The potential impact of seizure on stroke
mortality and neurologic outcome is a matter of concern that may influence the treatment decision
after a first seizure. However, this issue remains a matter of debate, with limited data regarding the
specific impact of late and recurrent seizures on functional recovery
26
. Since our sample is very
small, we cannot rule out that the 33% incidence (2 out of 6) of seizures is explained by chance.
In conclusion, transplantation of BMMC is feasible and seems to be safe in patients with
subacute ischemic stroke. Further randomized clinical trials are necessary to establish the efficacy
and long term safety of this procedure.
Conflict of interest:
The authors have no conflicts of interest regarding this work.
Acknowledgments:
This study was supported by a grant from the Ministry of Health and Ministry of Science
and Technology of Brazil to Rosalia Mendez-Otero (grant number 552201/2005-7).
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