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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DO SORO FETAL BOVINO E DO ETOSSULFATO DE FENAZINA
SOBRE O ACÚMULO LIPÍDICO, APOPTOSE E RESPOSTA À VITRIFICAÇÃO
EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
MATEUS JOSÉ SUDANO
BOTUCATU-SP
2010
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITO DO SORO FETAL BOVINO E DO ETOSSULFATO DE FENAZINA
SOBRE O ACÚMULO LIPÍDICO, APOPTOSE E RESPOSTA À VITRIFICAÇÃO
EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
MATEUS JOSÉ SUDANO
Dissertação apresentada junto ao
Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária para a
obtenção do título de Mestre
Orientador: Prof
a
Dr
a
Fernanda da
Cruz Landim e Alvarenga
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Sudano, Mateus José.
Efeito do soro fetal bovino e do estossulfato de fenazina sobre o acúmulo
lipídico, apoptose e resposta à vitrificação em embriões bovinos produzidos in
vitro / Mateus José Sudano. – Botucatu, 2010.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2010
Orientador: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga
Assunto CAPES: 50500007
1. Bovino - Reprodução 2. Embriões
Palavras-chave: Acúmulo lipídico; Apoptose; Criotolerância; Embriões
bovinos; Etossulfato de fenazina; Soro fetal bovino
iii
Nome do Autor: Mateus José Sudano
Título: EFEITO DO SORO FETAL BOVINO E DO ETOSSULFATO DE FENAZINA
SOBRE O ACUMULO LIPÍDICO, APOPTOSE E RESPOSTA A VITRIFICAÇÃO
EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof
a
. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga
Presidente e Orientadora
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ-UNESP-Botucatu- SP
Prof. Roberto Sartori Filho
Membro
Departamento de Zootecnia
ESALQ-USP – Piracicaba - SP
Dr. Rui Machado
Membro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa
Embrapa Pecuária Sudeste – CPPSE – São Carlos – SP
Data defesa: 12 de fevereiro de 2010.
iv
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu amor Andréia, aos
meus pais Gilberto e Maria e aos meus irmãos
Alessandra, Alexandre e Marcos.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo;
Ao meu amor Andréia que ao longo de todos os momentos de
dificuldades e incertezas sempre esteve presente, apoiando-me e amando-me
e que, cada vez mais, tornou-se a minha maior certeza, definitivamente.
Aos meus pais Gilberto Luis Sudano e Maria Aparecida Risardi, pela
exaustiva dedicação e empenho em minha educação, pelos exemplos que me
deram e pelo amor com que sempre contei.
Aos meus irmãos Alessandra, Alexandre e Marcos, cunhados Eduardo e
Sabrina, e as minhas sobrinhas Mayara e Mirela por todos os momentos
compartilhados que tanto me alegraram e motivaram;
A Prof
a
. Dr
a
. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga, que me possibilitou
uma formação diferenciada na graduação e orientou-me ao longo do mestrado,
garantindo-me oportunidades que tanto valorizo. Por sua amizade,
companheirismo, receptividade, paciência, incentivo e pelos ensinamentos.
Muito obrigado!!
Aos professores da minha Banca Examinadora de Dissertação de
Mestrado Dr. Roberto Sartori Filho, um grande exemplo de professor e
pesquisador, que valorizo muito; e Dr. Rui Machado, um amigo, um grande
parceiro de experimentos e excelente pesquisador.
Aos professores Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira e Dr
a
. Maria Denise
Lopes pelas ricas contribuições no meu Exame Geral de Qualificação.
A professora Dra. Luzia Aparecida Trinca pelas dúvidas esclarecidas com
relação à análise estatística.
Aos professores das Disciplinas que cursei ao longo do curso do
mestrado pelos excepcionais ensinamentos proporcionados.
A Daniela Martins Paschoal pela amizade, parceria e ajuda nos
experimentos.
Aos amigos de Laboratório Tatiana, João, Ieda, Midian, Luis, Cely, Letícia,
Camila, Taila, Tatícia, Tassiana, Henrique e os estagiários por todo auxílio e
amizade ao longo do mestrado.
A Adriano Seddon que possibilitou a execução da pesquisa experimental
a campo.
vi
A Carla Bianchini Ponchirolli, Elen S. C. Siqueira Pyles, e Claudia
Barbosa Fernandes pela amizade e todos os conhecimentos compartilhados
quando ingressei no Laboratório de Reprodução Avançada e Terapia Celular e
durante minhas iniciações científicas.
Aos professores do Departamento de Reprodução Animal Dr. Sony Dimas
Bicudo, Dr. Marco Antonio Alvarenga, Dr. Frederico Ozanam Papa, Dr.
Cezinande de Meira, Dr. Nereu Carlos Prestes e Dr
a
. Eunice Oba pelos
ensinamentos e amizade.
A Rosemary Cristina da Silva (Meire) pela amizade, atenção e paciência
na correção das minhas referências bibliográficas.
Aos funcionários do Departamento de Reprodução Animal: Raquel,
Walter, Cristina, Edílson, Cida, e Zé Luis por todo auxílio e ajuda fundamental.
A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Campus Botucatu, em especial ao
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio
financeiro (bolsa de mestrado e auxílio pesquisa) na elaboração desta
dissertação.
vii
“É caminhando
Que se faz o caminho...”
Enquanto houver sol - Sérgio Britto - Titãs
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Média (± erro padrão) das diferentes concentrações de SFB e do uso
do PES sobre porcentagem de clivagem, de blastocistos/ oócitos, de
blastocistos/ estruturas clivadas, e os escores do estágio de desenvolvimento e
grau de qualidade dos blastocistos. ................................................................. 57
Tabela 2: Efeito principal do SFB e do PES sobre a média (± erro padrão) da
porcentagem de clivagem, de blastocistos/ oócitos, de blastocistos/ estruturas
clivadas, e os escores do estágio de desenvolvimento e grau de qualidade dos
blastocistos. ..................................................................................................... 58
Tabela 3: Média (± erro padrão) do número total de células e de células
apoptóticas dos blastocistos frescos e aquecidos, e da porcentagem de Re-
expansão dos diferentes grupos. ..................................................................... 66
Tabela 4: Efeito principal do SFB e do PES sobre a média (± erro padrão) do
número total de células e células apoptóticas dos blastocistos frescos e
aquecidos, e da porcentagem de re-expansão. ............................................... 68
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação da contribuição relativa da glicólise no estágio de
desenvolvimento inicial e na compactação embrionária e formação da
blastocele.. ................................................................................................................ 25
Figura 2: Modelo hipotético do gradiente de O
2
nos estágios das primeiras
clivagens (desenvolvimento inicial) e pós-compactação durante o
desenvolvimento embrionário in vivo. .................................................................... 26
Figura 3: Mecanismo de ação do EDTA, NaN
3
, Cerulenin, DNP e PES. .............. 30
Figura 4: Representação esquemática dos eventos morfológicos e bioquímicos
envolvidos no processo da apoptose ....................................................................... 39
Figura 5: Delineamento Experimental em fatorial 4x3. ........................................... 46
Figura 6: Grade para quantificação lipídica dos embriões através da coloração de
Sudan Black B. .......................................................................................................... 52
Figura 7: Montagens das palhetas de vitrificação. ............................................... 53
Figura 8: Média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas citoplasmáticas
pequenas dos diferentes grupos.. ........................................................................... 59
Figura 9: Média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas citoplasmáticas
médias dos diferentes grupos. ................................................................................ 60
Figura 10: Média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas citoplasmáticas
grandes dos diferentes grupos. ............................................................................... 61
Figura 11: Efeito principal das diferentes concentrações de SFB (0%, 2,5%,
5% e 10%) sobre a média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. ...................................................... 62
Figura 12: Efeito principal dos grupos Controle, PES D2,5 e PES D4 sobre a
média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas,
médias e grandes ..................................................................................................... 63
Figura 13: Relação entre o aumento da concentração do SFB e a média do
número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. ......... 64
Figura 14: Embriões submetidos a técnica do corante lipofílico Sudan Black B
dos diferentes grupos experimentais in vitro e grupo Controle in vivo................ 65
Figura 15: Embriões frescos dos diferentes grupos submetidos a técnica de
TUNEL. ...................................................................................................................... 69
x
Figura 16: Embriões aquecidos dos diferentes grupos submetidos a técnica de
TUNEL. ...................................................................................................................... 70
Figura 17: Efeito do SFB e PES sobre a média (± erro padrão) da porcentagem
de apoptose, em relação ao número total de células, dos blastocistos frescos e
aquecidos.. ................................................................................................................ 72
Figura 18: Efeito principal do SFB sobre a porcentagem de apoptose, em
relação ao número total de células, dos blastocistos frescos e aquecidos. ....... 73
Figura 19: Relação entre a concentração do SFB e a média da porcentagem
de células apoptóticas dos blastocistos frescos e aquecidos .............................. 74
Figura 20: Efeito principal do PES sobre a porcentagem de apoptose, em
relação ao número total de células, dos blastocistos frescos e aquecidos. ....... 75
Figura 21: Relação entre a média do número de gotas lipídicas citoplasmáticas
pequenas, médias e grandes e a média da porcentagem de células apoptóticas
dos embriões PIV frescos ........................................................................................ 76
Figura 22: Relação entre a média do número de gotas lipídicas citoplasmáticas
pequenas, médias e grandes e a média da porcentagem de células apoptóticas
dos embriões PIV aquecidos ................................................................................... 76
Figura 23: Relação entre a média da porcentagem células apoptóticas dos
blastocistos frescos e a média da porcentagem de células apoptóticas dos
blastocistos aquecidos. ............................................................................................ 77
xi
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................... xiii
ABSTRACT ....................................................................................................... xv
1- INTRODUÇÃO ..............................................................................................17
2- REVISÃO DE LITERATURA .........................................................................20
2.1- Sensibilidade do embrião PIV à criopreservação .................................. 20
2.2- Acúmulo lipídico embrionário ................................................................ 21
2.2.1- SUPLEMENTAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO EMBRIONÁRIO COM
SORO FETAL BOVINO ............................................................................ 21
2.2.2- METABOLISMO ENERGÉTICO EMBRIONÁRIO........................... 23
2.3- Uso de reguladores metabólicos no cultivo embrionário........................... 27
2.3.1- ÁCIDO ETILENODIAMINO TETRA-ACÉTICO (EDTA) .................. 28
2.3.2- AZIDA DE SÓDIO (NaN
3
) ............................................................... 29
2.3.3- CERULENIN ................................................................................... 31
2.3.4- 2,4 DINITROFENOL (DNP) ............................................................ 32
2.3.5- ETOSSULFATO DE FENAZINA (PES) .......................................... 33
2.4- Criopreservação de embriões ............................................................... 35
2.5- Apoptose ............................................................................................... 38
3- OBJETIVOS ..................................................................................................42
4- HIPÓTESES .................................................................................................44
5- MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................46
5.1- Delineamento experimental ................................................................... 46
5.2- Reagentes utilizados ............................................................................. 47
5.3- Maturação in vitro (MIV) ........................................................................ 47
5.4- Fertilização in vitro (FIV)........................................................................ 47
5.5- Cultivo in vitro (CIV)............................................................................... 48
5.6- Produção in vivo de embriões ............................................................... 49
5.7- TUNEL (Terminal deoxinucleotil transferase Uracil Nick End Labeling) 50
5.8- Quantificação de lipídeos ...................................................................... 51
5.9- Vitrificação ............................................................................................. 52
5.10- Aquecimento e re-cultivo dos embriões............................................... 53
5.11- Análise Estatística ............................................................................... 53
6- RESULTADOS ..............................................................................................56
xii
6.1- Produção embrionária ........................................................................... 56
6.2- Acúmulo Lipídico ................................................................................... 58
6.3- Apoptose celular e criotolerância embrionária ....................................... 66
7- DISCUSSÃO .................................................................................................79
8-CONCLUSÕES ..............................................................................................89
9- CONSIDERAÇÕES FINAIS ..........................................................................91
10- PERSPECTIVAS FUTURAS .......................................................................94
11- BIBLIOGRAFIA ...........................................................................................96
xiii
SUDANO, M. J. Efeito do soro fetal bovino e do etossulfato de fenazina sobre
o acúmulo lipídico, apoptose e resposta à vitrificação em embriões bovinos
produzidos in vitro. Botucatu, 2010. 107p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações
de soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de fenazina (PES), no meio de cultivo
durante a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. Em um experimento
fatorial 4x3, quatro concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%), e três períodos
de exposição ao PES (Controle, a partir do 60 horas – PES D2,5, e a partir 96
horas – PES D4, de cultivo) foram avaliados sobre o desenvolvimento, acúmulo
lipídico, criotolerância, e apoptose celular de embriões frescos e aquecidos.
Tomando a fertilização in vitro como referência (D0), no D7 uma amostra dos
embriões foi submetida a coloração de Sudan Black B (quantificação do conteúdo
lipídico, n=15-60), e a técnica de TUNEL (apoptose, n=15-134). Os demais
embriões (n=2647) foram vitrificados, para posterior aquecimento e re-cultivo em
SOFaa a 10% de SFB por 12 horas. Passado este período, os embriões
aquecidos foram avaliados quanto a re-expansão da blastocele e submetidos a
técnica de TUNEL. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida do
teste de Tukey, ou Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn. Para análise da
correlação foi utilizado o teste de correlação linear de Pearson. Foi adotado o
nível de significância de 5%. A elevação da suplementação do SFB no meio de
cultivo embrionário aumentou (P<0,05) o número de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. Além disso, esta elevação do
SFB reduziu (P<0,05) a taxa de re-expansão dos embriões vitrificados e
aumentou (P<0,05) a taxa de apoptose dos embriões frescos e aquecidos. A
adição do PES ao meio de cultivo a partir do D2,5 e a partir do D4 reduziram
(P<0,05) o acúmulo lipídico nos embriões bovinos PIV. O uso do PES a partir
do D2,5 prejudicou (P<0,05) o desenvolvimento embrionário e não favoreceu
(P>0,05) a criotolerância embrionária. Entretanto, a exposição dos embriões a
este fármaco a partir do D4 não afetou (P>0,05) o desenvolvimento
embrionário e aumentou (P<0,05) a sobrevivência embrionária após a
xiv
vitrificação. Os resultados deste experimento indicam que o aumento do
acúmulo lipídico apresenta uma forte correlação com a taxa de apoptose em
embriões frescos, e uma moderada correlação com o aumento da taxa de
apoptose em embriões após a vitrificação. Porém, o fator que apresentou a
correlação mais elevada com a taxa de apoptose após a criopreservação foi a
taxa de apoptose dos embriões frescos.
Palavras- chave: Embriões bovinos, etossulfato de fenazina, soro fetal bovino,
criotolerância, apoptose, acúmulo lipídico.
xv
SUDANO, M. J. Effect of fetal calf serum and phenazine ethosulfate on
lipid accumulation, apoptosis and vitrification response of in vitro
produced bovine embryos. Botucatu, 2010. 107p. Dissertação (Mestrado) –
School of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu city, São Paulo
State University.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of four FCS concentrations
and the use of phenazine ethosulfate (PES) in the culture media during in vitro
production (IVP) of bovine embryos. In a 4x3 factorial experimental design, four
FCS concentrations (0%, 2,5%, 5% and 10%), and three PES exposure periods
(control, after 60 hours - PES D2,5, and after 96 hours - PES D4, of embryo
culture) were evaluated by embryo development, lipid accumulation,
cryotolerance, and fresh and warmed apoptosis. Taking the in vitro fertilization
as reference (D0), a sample of D7 embryos was submitted to Sudan Black B
stain (lipid content, n=15-60), and to TUNEL reaction (apoptosis, n=15-134).
The remaining embryos (n=2647) were vitrified / warmed and re-cultured in
SOFaa with 10% of FCS for 12 hours. After this period, re-expansion and
warmed apoptosis rate were determined. For statistical analysis, data were
tested using ANOVA followed by Tukey´s test, or Kruskal-Wallis followed by
Dunn´s test. For correlation analysis Pearson correlation test was used. It was
adopted the significance level of 5%. The raise of FCS concentration increased
(P<0.05) the number of small, medium and large cytoplasmic lipid droplets.
Moreover, this raise of FCS reduced (P<0.05) the re-expansion rate and
increased (P<0.05) the fresh and warmed apoptosis rate. The addition of PES
in the culture media from D2,5 and D4 reduced (P<0.05) the lipid accumulation.
The use of PES from D2,5 affected (P<0.05) embryo development and did not
improve (P>0.05) cryotolerance. However, the PES treatment that started at D4
did not affect (P>0.05) embryo development and increased (P<0.05) embryo
survival after vitrification. The increase of lipid accumulation had a strong and a
moderate correlation with fresh and warmed apoptosis, respectively. However,
the fresh apoptosis rate had a very strong correlation with the warmed
apoptosis rate.
Key Words: bovine embryos, phenazine ethosulfate, fetal calf serum,
cryotolerance, apoptosis, lipid accumulation.
INTRODUÇÃO
17
1- INTRODUÇÃO
Atualmente, o Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo,
ultrapassando 200 milhões de cabeças (IBGE, 2006). Neste contexto, estudos
sobre biotecnologias capazes de aperfeiçoar a produção estão em franca
ascensão, principalmente no que se refere às biotécnicas da reprodução.
O país se encontra em uma situação privilegiada, sendo líder mundial e
referência na PIV de embriões bovinos. Em 2005, realizou cerca de 130 mil
transferências de embriões bovinos PIV, o que equivale a 48% de toda
movimentação mundial. Devido sua grande capacidade de produção de
descendentes, uma vez atendida a demanda interna, a PIV deverá voltar-se ainda
mais para o mercado externo, particularmente pela posição do país como
referência em genética bovina adaptada aos trópicos, o que exigirá um grande
esforço da pesquisa para superar algumas limitações ainda inerentes à técnica,
principalmente na questão da criopreservação dos embriões (VIANA e
CAMARGO, 2007).
No entanto, uma característica que persiste no mercado nacional é o
predomínio das transferências realizadas a “fresco” tanto na TE convencional
quanto na PIV (VIANA e CAMARGO, 2007), em função dos resultados
insatisfatórios obtidos com a criopreservação dos embriões zebuínos e taurinos,
atingindo taxas de concepção inferiores a 30% (HASLER et al., 2003).
As técnicas de conservação de embriões em nitrogênio líquido são utilizadas
em rotina para embriões PIV. Entretanto, um protocolo crioprotetor eficiente para
esses embriões bovinos ainda não foi estabelecido, sendo este tema amplamente
discutido dentro da área da biotecnologia da reprodução animal. A técnica mais
promissora até o momento consiste na vitrificação. Esta metodologia é usada,
principalmente por permitir aos meios de criopreservação uma passagem direta do
estado líquido para o estado vitrificado sem que haja cristalização deste meio,
tendo como objetivo principal, prevenir danos causados pelo frio, evitando a
formação de cristais de gelo.
A criopreservação visa manter o metabolismo celular em estado de
quiescência, tornando possível a conservação de células por tempo
indeterminado. Desde o primeiro sucesso na criopreservação de embriões de
mamíferos (WHITINGHAM et al., 1972), é conhecido que os embriões advindos
18
de sistemas de produção in vitro são mais sensíveis à criopreservação do que
embriões produzidos in vivo (LEIBO e LOSKUTOFF, 1993). Tal fato pode estar
relacionado a algumas diferenças entre os embriões provenientes das duas
técnicas. Dentre estas parece ser particularmente importante o maior conteúdo
lipídico encontrado em embriões PIV.
Estudos comprovam que o meio de cultivo embrionário é um fator
determinante na qualidade dos blastocistos (RIZOS et al., 2003), e que a
suplementação do meio de cultivo com soro fetal bovino (SFB) parece estar
intimamente associado ao aumento do conteúdo lipídico do embrião PIV (ABE et
al., 2002; RIZOS et al., 2002).
Como os embriões produzidos in vitro possuem uma grande sensibilidade às
baixas temperaturas provenientes da congelação, o procedimento de vitrificação
está sendo cada vez mais pesquisado com o objetivo de aumentar as taxas de
sobrevivência desses embriões para posterior utilização. Porém, o
aperfeiçoamento oriundo das mudanças da técnica de criopreservação é obtido
até certo ponto, exigindo-se também, uma mudança do próprio embrião frente a
sua elevada sensibilidade à criopreservação (SEIDEL Jr, 2006).
Recentemente, diversos trabalhos sugerem um novo conceito no cultivo
embrionário, o uso de fármacos não fisiológicos como reguladores metabólicos
(SEIDEL Jr, 2006; DE LA TORREZ-SANCHEZ et al., 2006b; BARCELÓ-
FIMBRES e SEIDEL Jr, 2007a). A suplementação do meio de cultivo com esses
reguladores metabólicos alterariam o metabolismo embrionário visando diminuir o
acúmulo lipídico, produzindo um embrião de melhor qualidade e com uma maior
resistência aos processos de criopreservação, resultando conseqüentemente,
num aumento das taxas de sobrevivência embrionária e de concepção dos
embriões criopreservados.
Frequentemente, a morfologia embrionária e as taxas de clivagem e de
blastocistos têm sido critérios utilizados para avaliação da competência
embrionária (ALIKANI et al., 2002). Entretanto, com o advento de novas
biotecnologias, tem-se tornado claro que a competência embrionária pode ser
severamente comprometida sem alterações morfológicas perceptíveis. A
viabilidade do embrião pode ser mensurada de outras maneiras, tais como testes
de crioresistencia, imunocitoquímica, biologia molecular e do padrão de expressão
gênica (WRENZYCKI et al., 2004).
REVISÃO DE
LITERATURA
20
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1- Sensibilidade do embrião PIV à criopreservação
Ao longo da década passada, houve um grande avanço na produção in vitro
de embriões bovinos (GARDNER e LANE, 2002), no entanto, ainda persistem
diversas dificuldades na aplicação comercial desta biotecnologia. Uma das
principais limitações está relacionada com anormalidades morfológicas e
metabólicas do embrião PIV, o que o torna mais sensível a criopreservação,
dificultando a sua conservação e comércio (KHURANA e NIEMANN, 2000).
Diversos estudos indicam que os embriões bovinos produzidos in vitro não
sobrevivem à criopreservação como os produzidos in vivo. O grande acúmulo
lipídico nos embriões PIV é associado com sua baixa capacidade de
criopreservação (ABE et al., 2002), provocando resultados insatisfatórios após a
inovulação destes, com taxas de concepção abaixo de 30% (HASLER, 2003).
Este conceito foi demonstrado primeiro em embriões suínos, em que a
criotolerância foi aumentada com a retirada das gotas lipídicas a partir de uma
microcirurgia dos embriões nos estágios iniciais de clivagem (NAGASHIMA et al.,
1995) e com alterações nas propriedades da zona pelúcida (POLLARD e LEIBO,
1994).
Zigotos bovinos fertilizados in vitro, mas cultivados in vivo tiveram a mesma
criotolerância que os embriões produzidos inteiramente in vivo (RIZOS et al.,
2002; LONERGAN et al., 2003). Entretanto, os embriões produzidos inteiramente
in vitro têm a menor criotolerância (RIZOS et al., 2002; LONERGAN et al., 2003),
sugerindo que a redução na criotolerância parece estar associada às alterações
nas condições do cultivo embrionário bem como a quantidade de lipídios dos
embriões.
O mecanismo específico em que o acúmulo lipídico em embriões produzidos
in vitro altera a sua criotolerância é desconhecido, no entanto, está relacionado
com o conteúdo de lipídio citoplasmático (ABE et al., 2002). De acordo com
Seidel Jr (2006), um possível mecanismo para a redução da criotolerância dos
embriões PIV é a peroxidação dos lipídios, que é acentuada pelo processo de
criopreservação, resultando num aumento dos radicais livres oriundos da
deteriorização de lipídios poliinsaturados (BEITZ, 1996). Portanto, a elevação do
21
conteúdo lipídico nos embriões pode aumentar a produção de radicais livres
estimulando o processo de morte embrionária (BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL Jr,
2007b).
Outra possível explicação é que o uso do SFB pode promover a incorporação
de ácidos graxos saturados e colesterol na membrana embrionária, fazendo com
que ela fique menos permeável e mais rígida, explicando a grande
susceptibilidade do embrião PIV frente à criopreservação (BARCELÓ-FIMBRES e
SEIDEL JR, 2007b).
2.2- Acúmulo lipídico embrionário
Nos mamíferos, os ácidos graxos são sintetizados no citosol celular
lipogênico a partir da Acetil-CoA, uma substância que pode originar-se de
carboidratos e aminoácidos, bem como de ácidos graxos. A Acetil-CoA em uma
seqüência de reações origina o palmitato, o principal ácido graxo produzido
(BEITZ, 1996; NELSON e COX, 2005). Através de reações de alongamento,
dessaturação e hidroxilação, outros ácidos graxos são formados a partir de
modificações do palmitato (BEITZ, 1996; NELSON e COX, 2005).
Nos embriões produzidos in vitro ainda não se sabe ao certo como é que
ocorre o acúmulo de lipídio citoplasmático, no entanto, acredita-se que este
acúmulo ocorra em função da suplementação do meio de cultivo com SFB
(ABE et al., 2002; MUCCI et al., 2006; BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR,
2007b), ou então devido a uma anormalidade do metabolismo energético
embrionário (“Crabtree effect”), levando a um desbalanço das vias metabólicas
(DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006a).
2.2.1- SUPLEMENTAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO EMBRIONÁRIO COM
SORO FETAL BOVINO
A maioria dos meios usados para o desenvolvimento embrionário contém soro
ou albumina sérica bovina (BSA) como fonte de proteína. É esperado que o soro
forneça substrato energético, aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento e
quelantes de metais pesados, entretanto, a presença e a concentração desses
componentes variam entre as diferentes partidas (MUCCI et al., 2006).
22
Apesar de o SFB ter propriedades desejáveis, sua utilização tem sido
associada à ocorrência da síndrome do neonato grande (large offspring syndrome)
(LAZZARI et al., 2002), alterações metabólicas e acúmulo excessivo de lipídio
(ABE et al., 2002; MUCCI et al., 2006; BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR,
2007b), anormalidades nas organelas (ABE et al., 1999, 2002), incluindo
degeneração mitocondrial (DORLAND et al., 1994), ocorrência prematura da
formação da blastocele (HOLM et al., 2002), e redução da sobrevivência
embrionária após o descongelamento (RIZOS et al., 2002; ABE et al., 2002;
MUCCI et al., 2006).
O SFB pode ser ainda fonte de vírus patogênicos, e normas internacionais de
transporte de embriões estão voltadas para a eliminação de produtos de origem
animal dos meios embrionários (BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b).
Diversos estudos demonstraram que o soro possui um efeito bifásico. A
presença do soro pode inibir as primeiras divisões da clivagem, enquanto que
posteriormente ele pode acelerar o desenvolvimento embrionário até o estágio de
blastocisto (RIZOS et al., 2002, 2003; ENRIGHT et al., 2000).
O mecanismo e a fonte do acúmulo lipídico citoplasmático em embriões
bovino cultivados na presença de soro ainda não estão esclarecidos. Especulam-
se alguns mecanismos que explicariam este evento, dentre eles pode-se citar: a)
as lipoproteínas presentes no soro poderiam ser internalizadas pelas células
embrionárias aumentando o conteúdo lipídico citoplasmático (SATA et al., 1999;
ABE e HOSHI, 2003), b) a presença do soro alteraria a β-oxidação em função de
uma disfunção mitocondrial (DORLAND et al., 1994; CROSIER et al., 2001; ABE
et al., 2002), e c) o embrião seria induzido a realizar uma neo-síntese de
triglicerídeos em função da presença do soro (RAZEK et al., 2000).
Sabe-se que os triglicerídeos são os lipídios mais comuns inclusos nas
células, e que o seu acúmulo nos embriões é oriundo da presença de SFB
(FERGUSON e LEESE 1999). Estima-se que blastocistos bovinos oriundos de
sistemas de cultivo com a suplementação de 10% SFB possuam 62 ng de
triglicerídeos, já os oriundos de sistemas livres de soro possuem apenas 36 ng
(FERGUSSON E LEESE, 1999), sugerindo-se que a fonte dos lipídios sejam as
próprias lipoproteínas do soro (ABE et al., 2002).
Sata et al., (1999) demonstraram que a suplementação de 5% de soro no
meio de cultivo resulta no aumento da composição dos ácidos graxos
23
saturados palmítico e esteárico, e os monoinsaturados oléico e palmitoléico,
em blastocistos bovinos.
A presença de grandes quantidades de gotas lipídicas em embriões PIV em
meios suplementados com soro, provavelmente prejudica os mecanismos
celulares responsáveis pelo reparo da membrana plasmática após a
criopreservação. A adição de soro pode promover a incorporação de ácidos
graxos saturados na membrana plasmática, induzindo provavelmente a mudanças
na composição da membrana plasmática, fazendo ela se tornar mais rígida, e
incapaz de resistir à criopreservação (MUCCI et al., 2006).
Comparando a produção in vitro com a produção in vivo de embriões bovinos,
elas exibem diferenças estruturais que podem ter sido resultado do sistema de
cultivo utilizado. Alguns autores sugerem que o aumento no conteúdo lipídico dos
embriões PIV é oriundo da suplementação do meio de cultivo com soro (ABE et
al., 2002; RIZOS et al., 2002) ou ainda resultante do metabolismo insuficiente da
mitocôndria através da inabilidade de metabolizar complexos lipídicos através da
β-oxidação (DORLAND et al., 1994).
A utilização de meios quimicamente definidos, sem a adição do SFB ou BSA,
é uma alternativa para a produção in vitro de embriões bovinos visando à retirada
de produtos de origem animal do meio de cultivo e o aumento da sobrevivência
embrionária após a vitrificação (KESKINTEPE AND BRACKETT, 1996). Barceló-
Fimbres e Seidel Jr (2007b) demonstraram que também é possível a PIV de
embriões bovinos na ausência de SFB sem afetar a produção ou qualidade dos
blastocistos, assim como foi observado por Mucci et al. (2006), em que embriões
bovinos cultivados na ausência de soro tiveram melhores taxas de sobrevivência
embrionária após a vitrificação.
2.2.2- METABOLISMO ENERGÉTICO EMBRIONÁRIO
As células animais podem produzir energia gerando adenosina trifosfato
(ATP) basicamente por duas vias metabólicas: a) conversão da glicose em
piruvato, através da glicólise, e b) oxidação dos substratos piruvato ou
oxalacetato, via ciclo de Krebs/fosforilação oxidativa (BEITZ, 1996; NELSON e
COX, 2005).
24
Geralmente, embriões durante o período de desenvolvimento inicial, pré-
compactação, são dependentes da fosforilação oxidativa via oxidação do
piruvato e aminoácidos para gerar ATP necessário (THOMPSON et al., 2000).
Entretanto, existe uma mudança na importância da glicólise no período de
compactação e formação da blastocele, aumentando a sua contribuição para a
produção de ATP (THOMPSON et al., 2000) (Figura 1).
Durante o desenvolvimento inicial, o metabolismo energético é
relativamente baixo. Estima-se que aproximadamente 90% de todo ATP é
derivado da oxidação, principalmente via fosforilação oxidativa (THOMPSON et
al., 1996). Já no estágio de compactação e formação da blastocele, a demanda
por ATP aumenta para acompanhar o aumento da síntese protéica
(THOMPSON et al., 1998) e da atividade dos sistemas de transportes de íons,
destacando a bomba de Na
+
/K
+
envolvida na formação da blastocele
(THOMPSON et al, 2000).
O aumento na demanda de ATP causa um aumento no consumo de
substratos, incluindo oxigênio e piruvato (THOMPSON et al., 1996),
aminoácidos (PARTRIDGE e LEESE, 1996), e glicose (THOMPSON et al.,
1996). Porém, em embriões de ruminantes a maioria da glicose é metabolizada
no estágio de blastocisto via glicólise, sendo o lactato o produto final
(THOMPSON et al., 2000). Apenas uma pequena quantidade de glicose é
oxidada na via da pentose-fosfato para a formação de ribose, em vez da via do
ciclo de Krebs (THOMPSON et al., 1996).
25
Figura 1: Representação da contribuição relativa da glicólise no estágio de
desenvolvimento inicial (a) e na compactação embrionária e formação da
blastocele (b). Nota-se que no estágio inicial do desenvolvimento (a) o
consumo da glicose é reduzido sendo representado por uma linha menos
destacada, enquanto que o piruvato é o substrato preferencial. Por outro lado
em (b), a utilização da glicose nos estágios de compactação e formação da
blastocele aumenta, assim como o uso do piruvato, acompanhando o aumento
da demanda de ATP neste estágio de desenvolvimento. Adaptado Thompson
(2000).
Outro fator envolvido no controle do metabolismo energético embrionário é
o oxigênio (HARVEY et al., 2002). O oxigênio é essencial para a conversão de
ADP em ATP na fosforilação oxidativa, sendo um receptor de elétrons na
cadeia de transporte de elétrons. Entretanto, o uso do oxigênio como um
substrato energético também resulta na produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS), particularmente o âniom superóxido (O
2
-
) e o radical hidroxila
(OH
-
). As ROS são altamente ativas como receptores de elétrons, e capazes
de tirar elétrons de outras moléculas que, por sua vez, se tornam radicais livres
(HARVEY et al., 2002).
A concentração de O
2
no oviduto é de aproximadamente 8% (LEESE,
1995) e parece que o ambiente uterino tem ainda uma menor concentração de
O
2
(FISCHER e BAVISTER, 1993). Portanto, os embriões encontram uma
26
redução no gradiente de O
2
com o seu progresso ao longo do trato reprodutivo
(HARVEY et al., 2002) e, de acordo com Leese (1995), durante o estágio de
implantação inicial, condições de hipóxia e até anóxia estão presentes (Figura
2), indicando um ambiente mais favorável para a atividade glicolítica no útero
(HARVEY et al., 2002).
Figura 2: Modelo hipotético do gradiente de O
2
nos estágios das primeiras
clivagens (desenvolvimento inicial) e pós-compactação durante o
desenvolvimento embrionário in vivo. Nas primeiras clivagens os blastômeros,
individualmente, encontram um gradiente mínimo de O
2
. Entretanto, no estágio
de pós-compactação os embriões encontram no útero uma concentração de O
2
muito reduzida (hipóxia), podendo ser potencializado devido à relação espacial
dos blastômeros (anóxia). Adaptado Harvey et al.(2002).
Segundo Gardner et al. (2000) o metabolismo da glicose nos estágios de pré
e pós-compactação é anormal em embriões produzidos in vitro, apresentando o
“Crabtree effect”, definido por Bavister (1995) como sendo um excesso da
metabolização da glicose, via glicólise, com uma conseqüente inibição da
fosforilação oxidativa nos embriões produzidos in vitro.
Diferentemente do observado in vitro, os embriões produzidos in vivo não
apresentam esta alteração do perfil metabólico da glicose, já que no ambiente
fisiológico acredita-se que exista um regulador natural da glicólise inibindo este
processo (BAVISTER, 1995).
27
Porém, nas condições do cultivo in vitro, os embriões perdem este regulador
natural da glicólise e mostram excesso na atividade da via glicolítica e, na
presença de grande tensão de oxigênio, a metabolização da glicose aumenta
ainda mais (glicólise aeróbica) (KHURANA e NIEMANN, 2000).
Embriões que metabolizam uma grande quantidade de glicose podem
comprometer a sua capacidade de desenvolvimento (KRISHER et al., 1999). Uma
possível explicação é que sob estas condições, uma quantidade muito pequena
de glicose é destinada para a via pentose-fosfato, já que esta via tem um
importante papel na biossíntese embrionária (WALES e HUNTER 1990),
fornecendo ao embrião a nicotinamida-adenina-dinucleotídeo reduzida (NADPH);
que atua na síntese das membranas celulares e possui função antioxidante
reduzindo a glutationa intracelular; e a ribose-5-fosfato, que é requerida para a
síntese dos ácidos nucléicos (BEITZ, 1996; NELSON e COX, 2005).
A estimulação excessiva da glicólise pode levar ao aumento da
concentração dos precursores da síntese de proteínas e lipídios (RIEGER et
al., 2002), favorecendo, não apenas a síntese protéica, mas também a
formação de lipídios citoplasmáticos nos embriões produzidos in vitro (DE LA
TORRE-SANCHEZ et al., 2006a). Além disso, a ocorrência da glicólise em
excesso pode resultar no desbalanço do estado de redução-oxidação dos
embriões (BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007a), levando ao distúrbio da
função mitocondrial e resultando no acúmulo lipídico embrionário (DORLAND et
al., 1994).
2.3- Uso de reguladores metabólicos no cultivo embrionário
De acordo com SEIDEL Jr (2006) há duas maneiras para melhorar a
sobrevivência embrionária após a criopreservação. a) Uma maneira é modificando
os métodos de criopreservação, por exemplo, variando a concentração e o tipo do
crioprotetor, estudando diferentes tempos e temperaturas dos procedimentos de
criopreservação, e usando aditivos como açúcares e surfactantes. Apesar de
geralmente essas mudanças levarem à melhora na sobrevivência embrionária, o
avanço na criotolerância do embrião frente às mudanças dos métodos de
criopreservação é limitado. b) Uma maneira alternativa é a mudança do próprio
embrião, tornando-os mais resistentes à criopreservação.
28
Um novo conceito do cultivo embrionário é a utilização de compostos não
fisiológicos para regular o metabolismo embrionário e favorecer o seu
desenvolvimento. Isto inclui a adição de agentes farmacológicos ao meio de
cultivo para corrigir aberrações do perfil metabólico dos embriões (DE LA TORRE-
SANCHEZ et al., 2006b).
Dentre os reguladores metabólicos já estudados pode-se citar: o ácido
etilenodiamino tetra-acético (EDTA), a azida de sódio (NaN
3
), o cerulenin, o 2,4
dinitrofenol (DNP) e o etossulfato de fenazina (PES) (DE LA TORRE-SANCHEZ et
al., 2006a).
2.3.1- ÁCIDO ETILENODIAMINO TETRA-ACÉTICO (EDTA)
Talvez o melhor exemplo de regulador metabólico seja o ácido
etilenodiamino tetra-acético (EDTA), um quelante não seletivo de cátions
divalentes utilizado durante o desenvolvimento embrionário (THOMPSON,
2000).
A adição do EDTA ao meio de cultivo reduz a glicólise em embriões no
estágio de desenvolvimento inicial e evita o efeito prejudicial do excesso de
glicose nos embriões jovens de diversas espécies (OLSON e SEIDEL JR, 2000).
Thompson et al. (1992) relataram que quando as concentrações in vitro de
glicose são maiores que as in vivo, o desenvolvimento embrionário inicial é
retardado ou bloqueado. Isto é associado com o “Crabtree effect”, em que a
fosforilação oxidativa é inibida durante uma alta e anormal taxa glicolítica
(BAVISTER, 1995).
Anteriormente, este efeito era controlado com a redução da concentração
ou eliminação da glicose do meio de cultivo (CHATOT et al., 1989). Entretanto,
esta condição não é fisiológica, já que a glicose é encontrada no fluído do
lúmen do trato reprodutivo (GARDNER, 1998).
A suplementação do EDTA no meio de cultivo estimula a produção de
blastocistos, possivelmente porque inibe a glicólise se ligando aos íons de Mg
++
,
uma vez que estes íons são necessários para as enzimas quinases envolvidas na
glicólise (LANE e GARDNER, 1997) (Figura 3).
Porém, a suplementação do EDTA é favorável apenas quando introduzido
durante o desenvolvimento inicial, em que altas taxas glicolíticas comprometem
29
o desenvolvimento embrionário (THOMPSON, 2000). Segundo Olson e Seidel
Jr (2000), a suplementação do meio de cultivo com 3-5 µM de EDTA no estágio de
desenvolvimento inicial aumenta em 13% as taxas de desenvolvimento
embrionário.
2.3.2- AZIDA DE SÓDIO (NaN
3
)
A NaN
3
é um agente inibitório da enzima 3-citocromo oxidase da cascata de
transporte de elétrons que aumenta o desenvolvimento embrionário por regular a
produção mitocondrial de ATP (DE LA TORRE-SANCHEZ e SEIDEL JR, 2002;
MACHÁTY et al., 2001; THOMPSON et al., 2000) (Figura 3). De La Torre-
Sanchez et al. (2006b) propuseram que a sua utilização no estágio de pós-
compactação embrionária favorece a utilização da glicose pela via pentose-fosfato
ao invés da glicólise.
30
Figura 3: Mecanismo de ação do EDTA, NaN
3
, Cerulenin, DNP e PES. 1-
EDTA indisponibilizando os íons de Mg
++
das enzimas glicolíticas. 2- NaN
3
bloqueia a enzima 3-citocromo oxidase no complexo IV da cadeia de transporte de
elétrons. 3- Cerulenin inibindo a síntese de ácidos graxos (SAG). 4- DNP se
ligando a prótons e dissipando o gradiente de H
+
do espaço intermembrana da
mitocôndria formado pela cadeia de transporte de elétrons. 5- PES oxida o
NADPH em NADP
+
estimulando a via Pentose-Fosfato (PPP). Fonte: Adaptado
Barceló-Fimbres e Seidel Jr (2007a).
A azida de sódio pode ser também benéfica ao embrião, por favorecer um
estado mais apropriado de redução-oxidação (THOMPSON et al., 2000). Segundo
Harvey et al. (2002), uma alteração da redução-oxidação devido a condições
inadequadas de cultivo, provavelmente modifica a produção de ATP e também
pode ter efeitos nocivos na expressão gênica, com conseqüências no
desenvolvimento embrionário após a transferência.
De acordo com Thompson et al. (2000), a adição da NaN
3
no cultivo
embrionário aumenta o consumo da glicose sem um aumento significativo na
produção de lactato via glicólise, o que sustenta a idéia de que a inibição parcial
da produção mitocondrial de ATP cria um estado de redução-oxidação mais
31
favorável, e isso em parte aumenta a disponibilidade de produtos intermediários
da metabolização da glicose para outras vias biossintéticas como a via da
pentose-fofato.
Concentrações não tóxicas de NaN
3
(5-10 µM) presentes no meio de cultivo
do quinto ao sétimo dia de desenvolvimento (pós-compactação embrionária)
estimularam o desenvolvimento embrionário, aumentando a proporção de
mórula compacta e blastocisto de 50% para 60%, com um aumento similar na
qualidade dos embriões transferíveis (40% para 50%) (THOMPSON et al.,
2000).
No trabalho realizado por Macháty et al. (2001) o uso de 10-20 µM NaN
3
no
meio de cultivo durante a compactação embrionária de embriões suínos (no 4°
dia de cultivo) possui efeito favorável, provavelmente pela contribuição da
produção glicolítica de ATP vs. produção mitocondrial de ATP, estabelecendo
um estado apropriado de redução-oxidação o que favorece o metabolismo da
glicose. Porém, a freqüência de formação de blastocisto suíno não aumentou
significativamente com o uso de NaN
3
, mas constatou-se um aumento na
média do número de células por embrião (MACHÁTY et al., 2001).
De La Torre-Sanchez et al. (2006b) verificaram que o uso de 27 µM de
NaN
3
no estágio de pós-compactação embrionária reduz a utilização da
glicose via glicólise, mas não resultou em uma redução do acúmulo lipídico
embrionário, assim como não aumentou o uso da glicose pela via da pentose-
fosfato, apesar de obterem taxas de produção de blastocisto ao redor de 41%.
Acredita-se que a dose de 27 µM de NaN
3
foi alta e resultou em um desbalanço
no estado de redução-oxidação, provocando um distúrbio na função
mitocondrial favorecendo o acúmulo lipídico embrionário (DE LA TORRE-
SANCHEZ et al., 2006b).
2.3.3- CERULENIN
O cerulenin é uma micotoxina que inibe a síntese de lipídios e reduz a
produção de ATP, como já foi relatado em neurônios (LANDREE et al., 2004
apud BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007a) (Figura 3). No entanto, segundo
Barceló-Fimbres e Seidel Jr (2007a), o uso desta micotoxina para a redução do
acúmulo de lipídios em embriões bovinos não é eficaz devido ao fato da cerulenin
32
ser tóxica para os embriões, uma vez que a dose não tóxica para o embrião (1
µg/mL) não é capaz de bloquear a síntese de ácidos graxos. A dose de 3 µg/mL
de cerulenin reduz em 32% a produção de blastocistos e, aumentando a dose de
cerulenin para 10 ou 50 µg/mL, leva a degeneração de todos os embriões
(BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007a).
2.3.4- 2,4 DINITROFENOL (DNP)
O DNP é um ácido fraco lipofílico que se liga a prótons no espaço
intermembrana da mitocondria e inibe severamente a produção mitocondrial de
ATP, separando o transporte de elétrons do fluxo de prótons (RIEGER et al.,
2002), como resultado, a energia da transferência de elétrons não pode ser usada
para a síntese de ATP, inibindo a fosforilação oxidativa (VOET e VOET, 1995
apud BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007a) (Figura 3).
Isto favorece o metabolismo da glicose sem ocasionar efeitos tóxicos ao
embrião (THOMPSON et al., 2000; DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006b). O
mecanismo exato dos efeitos benéficos do DNP não está totalmente esclarecido.
Acredita-se que a inibição parcial da produção mitocondrial de ATP pode induzir a
um estado mais suave de redução-oxidação do embrião que favorece o
metabolismo glicolítico (MACHÁTY et al., 2001), porém a glicose é utilizada de
outras maneiras sem ser a produção de lactato (THOMPSON e PETERSON,
2000).
De La Torre-Sanchez et al. (2006b) propuseram que a utilização do DNP no
estágio de pós-compactação embrionária favorece a utilização da glicose pela via
pentose-fosfato ao invés da glicólise.
Existem relatos de efeitos positivos do uso do DNP durante o período de
cultivo embrionário em diferentes espécies e em várias concentrações
(BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007a). Em embriões bovinos 10-30 µM de
DNP aumentam o consumo de glicose (THOMPSON et al., 2000; DE LA TORRE-
SANCHEZ et al., 2006a), aumentam o número de células dos embriões
(THOMPSON et al., 2000), e aumentam a taxa de produção de blastocistos
(THOMPSON et al., 2000; DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006b). Entretanto,
embriões bovinos cultivados em 90 µM de DNP possuem um desenvolvimento
mais lento e uma aparência mais escura do que os embriões produzidos em
33
doses menores (10-30µM) (DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006b). Já em uma
dose de 100 µM de DNP reduz o desenvolvimento embrionário, e em uma dose
de 1.000 µM de DNP bloqueia o desenvolvimento embrionário (THOMPSON et
al., 2000).
Segundo Macháty et al. (2001) a utilização de DNP no meio de cultivo no
estágio de compactação embrionária de embriões suínos, além de aumentar as
taxas de produção de blastocisto, aumenta também o número de células por
embrião, fato este sendo parcialmente atribuído à produção de blastocistos de
maior qualidade com a adição de 100 µM de DNP.
De acordo com Barceló-Fimbres e Seidel Jr (2007a), a adição de 30 µM de
DNP no estágio de pós-compactação embrionária reduziu significativamente o
acúmulo lipídico citoplasmático dos embriões quando comparados ao grupo
controle sem regulador metabólico. No entanto, De La Torre-Sanches et al.
(2007b) não observaram redução do acúmulo lipídico com a adição da mesma
dose de DNP no mesmo estágio embrionário, sugerindo um excesso de
desacoplamento da fosforilação oxidativa e interrupção da função mitocondrial dos
embriões.
Rieger et al. (2002), utilizando a dose de 10 µM de DNP, além de obterem um
aumento no metabolismo glicolítico (via glicólise) e oxidativo (via ciclo de Krebs)
dos embriões, observaram um aumento do desenvolvimento embrionário,
atribuindo este fato a inibição parcial ou desacoplamento da fosforilção oxidativa
que reduz a produção de espécies reativas de oxigênio, facilitando o
desenvolvimento embrionário.
2.3.5- ETOSSULFATO DE FENAZINA (PES)
O PES é um redutor de elétrons do NADPH, oxidando o NADPH em NADP
+
(nicotinamida-adenina-dinucleotídeo oxidada), o que estimula a via pentose-
fosfato. O NADP
+
ativa as duas primeiras reações enzimáticas na fase oxidativa
desta via, convertendo a glicose-6-fosfato em 6-fosfogluconato, e o 6-
fosfogluconato em ribose-5-fosfato (BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b)
(Figura 3). Segundo Dufrasnes et al. (1993) um aumento na ordem de 10 vezes
na utilização da glicose, na via pentose-fosfato induzido pelo PES, reduz a
glicólise em 50%.
34
A adição de PES no período pós-compactação pode induzir a um maior
balanço na utilização da glicose por estimularem a via pentose-fosfato e,
conseqüentemente, aumentar a produção e qualidade dos embriões bovinos
produzidos in vitro (DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006a).
Estes redutores já foram usados para oócitos de rato (DOWNS et al., 1998) e
embriões bovinos (DE LA TORREZ-SANCHEZ et al., 2006b) e, além de estimular
a via pentose-fosfato, eles também diminuem a produção de lipídio (DE LA
TORRE-SANCHEZ et al., 2006a), pois com a oxidação do NADPH, torna-o
indisponível para a produção lipídica, já que esta coenzima é requerida para a
biossíntese de vários lipídios, particularmente os ácidos graxos de cadeia longa
(BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b).
Segundo De La Torre-Sanchez et al. (2006a), a adição de PES na
concentração de 0,9µM no meio de cultivo, no estágio de pós-compactação
embrionária, teve um efeito tóxico. Entretanto, menores doses de PES (0,1 e 0,3
µM) não tiveram diferença com relação à taxa de produção de blastocisto, massa
celular interna e número de células quando comparadas com o grupo Controle em
que não foi utilizado nenhum regulador metabólico.
Em outro trabalho, De La Torre-Sanchez et al. (2006b) relataram que com o
tratamento dos embriões PIV com 0,3 µM PES obtiveram um acúmulo lipídico
significativamente menor quando comparado com o grupo DNP ou NaN
3
e o
Controle in vitro, mas o acúmulo lipídico do grupo PES também foi maior que o
Controle in vivo, em que teve menor acúmulo de lipídio citoplasmático. Da mesma
maneira, Barceló-Fimbres e Seidel Jr (2007a) utilizando 0,3 µM de PES obtiveram
um menor acúmulo de lipídio citoplasmático quando comparado com o grupo
Controle, e o grupo suplementado com 1 ou 3 µg/mL de cerulenin.
Recentemente, Gajda et al. (2008) estudando a qualidade embrionária de
embriões suínos, observaram que o uso de 0,025-0,075 µM de PES em embriões
no estágio de 1-2 células além de melhorar o desenvolvimento embrionário,
resultou no aumento da qualidade do embrião, levando a redução da incidência de
apoptose nos embriões tratados com PES.
Confirmando o efeito benéfico do PES, Barceló-Fimbres e Seidel Jr (2007b)
observaram que a adição de PES ao meio de cultivo aumentou a sobrevivência
embrionária após o congelamento convencional ou vitrificação (P<0,05; 92, 85 e
60% de sobrevivência, para os grupos PES, Controle e 10% SFB,
35
respectivamente), fato este atribuído a redução do conteúdo lipídico citoplasmático
do embrião resultante da utilização do PES no estágio de pós-compactação
embrionária.
2.4- Criopreservação de embriões
A criopreservação visa manter o metabolismo celular em estado de
quiescência, tornando possível a conservação dos embriões por tempo
indeterminado. Desta maneira, a criopreservação possibilita a programação da
utilização dos embriões, o transporte longo, como em casos de importações e
exportações, e a formação de bancos genéticos.
O processo de criopreservação de embriões envolve: a exposição aos
crioprotetores, o congelamento a temperaturas inferiores a zero, o
armazenamento, o descongelamento e a posterior diluição e remoção dos
crioprotetores com conseqüente retorno a um ambiente fisiológico que permitirá o
desenvolvimento (ALVARENGA et al., 2007).
Um dos mais importantes princípios da criopreservação reside na
necessidade de se remover o máximo possível de água das células antes de se
proceder a sua congelação. Se esta desidratação não ocorrer, grandes cristais de
gelo se formarão lesando severamente a estrutura intracelular. No entanto, a
remoção demasiada de água das células também pode ser deletéria (SEIDEL JR
Jr., 1986). Desta forma a curva de congelamento deve ser ótima para permitir uma
remoção de água eficiente, prevenindo a crioinjúria por formação de cristais de
gelo, e ao mesmo tempo minimizar o efeito tóxico da exposição à alta
concentração de solutos (CAMPOS-CHILLÒN et al., 2006).
Independentemente da técnica, todos os métodos de criopreservação
necessitam de crioprotetores que possuem a função de proteger as células e
tecidos durante a congelação e a descongelação. Sabe-se que o papel dos
crioprotetores é reduzir o ponto de solidificação das soluções durante a
congelação aumentando assim a taxa de sobrevivência das células (LEIBO et al.,
1973).
De acordo com as propriedades de difusão através das membranas
biológicas, os crioprotetores podem ser divididos em duas categorias:
intracelulares (solutos orgânicos responsáveis por proteger as organelas das
36
células durante a congelação, como por exemplo, o glicerol, dimetilsulfóxido
(DMSO), metanol, etanol, etilenoglicol (EG) etc) e extracelulares
(macromoléculas e açúcares cuja função é reduzir a formação de gelo, facilitar
a desidratação das células e proteger a membrana celular durante o
aquecimento, como por exemplo a glicose, lactose, sacarose, galactose,
polivinilpirrolidona (PVP), Ficoll 70, etc) (NIEMANN, 1991).
A maioria dos embriões bovinos obtidos in vivo é criopreservado pela técnica
de congelamento tradicional (PALASZ e MAPLETOFT, 1996), uma vez que esta
vem possibilitando resultados satisfatórios com taxas de concepção próximas de
40% (RODRIGUES et al., 2007). Por outro lado, os melhores resultados obtidos
após a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro são, geralmente,
através da técnica de vitrificação (MUCCI et al., 2006; NEDANBALE et al., 2004).
De acordo com VAJTA (1997), a vitrificação é definida como a solidificação de
uma solução à baixa temperatura sem formação de cristais de gelo. Isso pode ser
conseguido através do aumento da viscosidade da solução associado à alta
velocidade de resfriamento e aquecimento.
Comparando as duas técnicas, o congelamento lento é uma tentativa de
manutenção do equilíbrio entre danos osmóticos e tóxicos utilizando baixas
concentrações de crioprotetores, e controlando a formação de cristais de gelo
através do congelamento do meio extracelular e desidratação do embrião
(ALVARENGA et al., 2007).
Em contraste, a estratégia de vitrificação é mais radical, pois é baseada na
eliminação total da formação de cristais de gelo. As altas concentrações de
crioprotetores aumentam os danos osmóticos e tóxicos. No entanto, a alta
velocidade de resfriamento e aquecimento resulta em uma rápida passagem
através da temperatura de 0ºC, o que minimiza os danos causados pelo
resfriamento. Como a vitrificação é uma técnica relativamente nova e não foi
padronizada até agora, existem diversos protocolos os quais apresentam
diferentes detalhes técnicos (KASAI, 1996; PALASZ e MAPLETOFT, 1996).
Nos protocolos de vitrificação, o EG associado a outros crioprotetores não
permeáveis tem se tornado a combinação mais comumente utilizada (HOCHI et
al., 1996; MARTINO et al., 1996). Um agente crioprotetor não permeável comum é
a sacarose, a qual exerce um efeito osmótico significante, sendo portanto,
empregada na re-hidratação após o descongelamento. Na presença de sacarose,
37
a estabilidade da membrana de oócitos é drasticamente aumentada após
exposição prolongada a altas concentrações de EG (SZELL e SHELTON, 1986;
TODOROV et al., 1993; RAYOS et al., 1994).
A vitrificação é uma alternativa para a criopreservação, a qual pode minimizar
os danos pelo aumento nas taxas de congelamento e aquecimento. A “Open
Pulled Straw” (OPS) e o “cryoloop” têm sido utilizados para promover taxas de
congelamento e aquecimento muito rápidas. Além disso, o uso de técnicas ultra-
rápidas de criopreservação como a vitrificação, melhora a sobrevivência do
embrião PIV, e pode ajudar reduzir grande parte dos custos. A vitrificação não
requer nenhum equipamento especial e pode ser facilmente adaptada à rotina
(BARIL et al., 2001).
As técnicas de vitrificação utilizando baixos volumes de meios como o
“cryoloop” e a OPS tem a desvantagem de não se adaptarem a protocolos de
transferência direta dos embriões, uma vez que após o descongelamento os
embriões necessitam passar por soluções de reidratação para posteriormente
envasá-los e proceder a inovulação.
Eldridge-Panuska et al. (2005), desenvolveram uma técnica para
vitrificação de embriões eqüinos a qual permite a transferência direta dos
embriões. Neste experimento os embriões foram vitrificados em solução
contendo 3,4M glicerol + 4,6M etilenoglicol e acondicionados em palhetas de
0,25 ml contendo bolhas laterais com 0,5M de galactose. Após o
descongelamento os embriões foram transferidos para receptoras com taxa de
prenhez de 78% (28/36).
Da mesma maneira em embriões bovinos, Campos-Chillòn et al. (2006)
desenvolveram a técnica de vitrificação direta passando os embriões em
solução de 5M de EG e depois em solução contendo 7M de EG, 18% de
Ficoll e 0,5M de galactose para finalmente serem acondicionados em palhetas
de 0,25 mL separados por bolhas e colunas laterais de solução de 1M de
galactose. Nesse trabalho, os autores obtiveram taxas de 82% re-expansão e
60% eclosão dos blastocistos PIV após a vitrificação (n=6, num total de 63
embriões). Já com embriões produzidos in vivo a taxa de re-expansão e
eclosão foi de 95% (n=20).
38
2.5- Apoptose
Existem dois processos de morte celular distintos, a necrose e a apoptose. A
necrose é o resultado de uma injúria que afeta um grande grupo de células,
causando edema celular e ruptura de membrana que provocam uma resposta
inflamatória em tecidos sadios adjacentes. Em contraste, a apoptose afeta células
isoladas, não compromete tecidos próximos e não possui uma resposta
inflamatória associada (HARDY, 1999).
A apoptose é uma forma altamente conservadora de morte celular que
desempenha um importante papel no desenvolvimento embrionário e na
homeostase celular, atuando como um mecanismo de controle de qualidade para
remover células que estão danificadas, não funcionais, anormais, e em número
excessivo (JACOBSON et al., 1997; MEIER et al., 2000; PAULA-LOPES e
HANSEN, 2002).
Uma série consecutiva de fases, morfologicamente distintas, está envolvida
no processo de apoptose (Figura 4). Inicialmente a cromatina se agrega em uma
grande massa compacta granular, o citoplasma condensa e as membranas
nuclear e citoplasmática ficam grosseiramente recuadas (HARDY, 1999). O
núcleo sofre fragmentação, ocorre a formação de vesículas na membrana celular,
compostas por fragmentos nucleares e algumas organelas, denominadas
corpúsculos apoptóticos. Esses corpúsculos apoptóticos são rapidamente
reconhecidos e englobados por fagócitos e/ou células adjacentes onde são
degradados e reciclados (BETTS e KING, 2001).
As características morfológicas da morte celular por apoptose, como a
condensação da cromatina, marginalização e fragmentação nuclear, são visíveis
nos estágios de mórula e blastocisto produzidos tanto in vitro como in vivo
(GJORRET et al., 2003). Essas mudanças nucleares são observadas em 70-80%
dos embriões produzidos in vitro de ratos (HANDYSIDE e HUNTER, 1986) e
humanos (HARDY, 1999) e em praticamente todos os blastocistos bovinos
(BYRNE et al., 1999).
Através da reação de TUNEL é possível a detecção in situ de células
apoptóticas pela marcação da fragmentação oligonucleossomal do DNA gerado
pela atividade de DNAases endógenas (eventos bioquímicos – Figura 4) durante
o processo de apoptose (GJORRET et al., 2003).
39
Figura 4: Representação esquemática dos eventos morfológicos e
bioquímicos envolvidos no processo da apoptose (Adaptado Hardy, 1999).
A apoptose espontânea é primeiramente observada nos embriões bovinos no
estágio de 8-16 células, período coincidente com a ativação do genoma
embrionário (MATWEE et al., 2000). A exposição dos embriões a ambientes
adversos pode aumentar o número de células apoptóticas em resposta ao
estresse ocasionado, como no caso de estresse térmico (PAULA-LOPES e
HANSEN, 2002), e de condições desfavoráveis do meio de cultivo embrionário
(HARDY, 1999).
Em diversas espécies a apoptose nos embriões é concentrada nas células da
massa celular interna (MCI). Um exemplo são os blastocistos de camundongos
produzidos in vivo lavados do trato reprodutivo da fêmea, onde a porcentagem de
células mortas na MCI está ao redor de 10%, enquanto que nas células do
trofoblasto é de apenas 3% (HARDY e HANDYSIDE, 1996). A apoptose na MCI
pode regular a proliferação celular desde que o número de células da MCI chegue
a um platô em estágios avançados de blastocistos sem uma redução na divisão
celular mitótica (HANDYSIDE e HUNTER, 1986).
40
De acordo com Byrne et al. (1999) a concentração da apoptose na MCI de
embriões bovinos está relacionada a um aprimorado controle de qualidade celular,
uma vez que a MCI é de extrema importância por essa linhagem de células dar
origem ao feto. Além disso, é possível que em estágios mais avançados de
desenvolvimento, a apoptose na MCI atinja um limiar para evitar a formação de
trofoblasto ectópico nas camadas germinativas iniciais (Byrne et al., 1999).
Basicamente, a apoptose pode ocorrer por duas vias, a via extrínseca e a
intrínseca. A via extrínseca é caracterizada pela ativação de receptores de morte
(receptor Fas) presentes na membrana plasmática das células como ocorre com o
ligante-Fas (Fas-L) quando se liga a seu receptor Fas (SHARMA, 2000). A via
intrínseca da apoptose é dependente da mitocôndria, uma vez que é um
reservatório de diversas proteínas apoptogênicas como é o caso do citocromo c
que promove a liberação de fatores ativadores de caspase, mudanças no
transporte de elétrons, perda do potencial de membrana mitocondrial, alteração no
estado de redução-oxidação celular e participação na família de proteínas BCL-2
pró e anti-apoptóticas (GREEN e REED, 1998; PARONE et al., 2002).
Existem duas famílias de proteínas que estão envolvidas na regulação da
apoptose, a família das caspases, que media processos proteolíticos, e aquelas
que regulam a atividade das caspases, a família da B cell leukemia/lynphoma 2
(BCL-2) (MESQUITA, 2005). Esta família de proteínas é composta por 15 genes,
distribuídos em dois subgrupos, os anti-apoptóticos (BCL-2, BCL-X
L
, BCL-W,
MCL-1, AL) e pró-apoptóticos (BAX, BAK, BOK, BIK, BLK, HRK, BNIP
3
, BIM,
BAD, BID, BCL-X
S
), além de proteínas pró-apoptóticas que contém o domínio BH3
da família BCL-2 que são responsáveis pela indução da apoptose (ITM2B)
(DHARAP et al., 2006; YANG e RAJAMAHENDRAN, 2002).
Para Mesquuita (2005) o que determina a sobrevivência de uma célula é a
habilidade dos supressores da apoptose em inibirem a ação dos indutores do
processo. Portanto, a concentração relativa das proteínas pró e anti-
apoptóticas é que definirá a sobrevivência ou morte das células. Nesse
contexto, Lonergan et al. (2003) sugeriram a relação do padrão de expressão
dos genes Bax/BCL-2 como indicador da tendência para apoptose ou
sobrevivência dos embriões. Além disso, o índice de células embrionárias em
apoptose indica a qualidade dos blastocistos produzidos (BYRNE et al., 1999).
OBJETIVOS
42
3- OBJETIVOS
3.1- Avaliar o desenvolvimento embrionário bovino in vitro com a
suplementação de diferentes concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%),
assim como após a adição do etossulfato de fenazina (PES) ao meio de cultivo a
partir do D2,5 e D4 (considerando D0 como a fertilização).
3.2- Quantificar as gotas lipídicas citoplasmáticas dos embriões oriundos dos
diferentes grupos experimentais com a coloração de Sudan Black B no 7º dia após
a fertilização.
3.3- Avaliar a ocorrência de apoptose, através da técnica de TUNEL, nos
embriões PIV frescos produzidos nos diferentes grupos experimentais.
3.4- Analisar a viabilidade embrionária após a vitrificação / aquecimento dos
embriões PIV na presença de diferentes concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e
10%), bem como daqueles tratados com PES (Controle, PES D2,5 e PES D4),
através da observação da taxa de re-expansão da blastocele e da ocorrência da
apoptose (técnica de TUNEL).
3.5- Realizar a comparação das variáveis, acúmulo lipídico citoplasmático, e
as porcentagens de apoptose fresco, de re-expansão e de apoptose aquecida,
entre os grupos experimentais in vitro e o grupo Controle in vivo
3.6- E finalmente, estabelecer uma relação entre os parâmetros acúmulo
lipídico vs porcentagem de apoptose dos embriões frescos, acúmulo lipídico vs
porcentagem de apoptose dos embriões aquecidos, e porcentagem de apoptose
fresco vs porcentagem de apoptose aquecido.
HIPÓTESES
44
4- HIPÓTESES
4.1- A elevação da concentração de SFB no meio de cultivo embrionário
aumenta o desenvolvimento embrionário, e a utilização do PES a partir do D2,5 e
D4 não afeta o desenvolvimento embrionário.
4.2- Com a elevação da concentração do SFB aumenta o acúmulo lipídico
citoplasmático, entretanto, o uso do PES (a partir do D2,5 ou D4) reduz o
conteúdo lipídico dos embriões bovinos PIV.
4.3- A porcentagem de apoptose nos embriões frescos é aumentada com a
elevação da concentração do SFB, no entanto, a adição do PES ao meio de
cultivo não altera a porcentagem de apoptose fresco.
4.4- A sobrevivência embrionária após a vitrificação é diminuída pela
elevação da concentração de SFB, e aumentada com a adição do PES a partir
do D2,5 ou D4, com uma maior sobrevivência para o grupo PES D2,5.
4.5- O grupo Controle in vivo, quando comparado aos grupos experimentais in
vitro, possui o menor acúmulo lipídico citoplasmático, menor porcentagem de
apoptose fresco e aquecido e a maior porcentagem de re-expansão.
4.6- Quanto maior o acúmulo lipídico citoplasmático maior a porcentagem de
apoptose dos embriões frescos e aquecidos, assim como quanto maior a
porcentagem de apoptose dos embriões frescos maior a porcentagem de
apoptose dos embriões aquecidos.
MATERIAL E
MÉTODOS
46
5- MATERIAL E MÉTODOS
5.1- Delineamento experimental
O presente estudo utilizou um delineamento experimental em fatorial 4 x 3,
sendo quatro concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%), e três períodos de
exposição ao PES (sem adição do PES – Grupo Controle, 0,3 µM de PES
iniciado após 60 horas de cultivo – PES D2,5, e após de 96 horas de cultivo- PES
D4). Um total de 4320 oócitos oriundos de ovários de animais de abatedouro, a
maioria com origem da raça Nelore (Bos taurus indicus), foram utilizados para
realização de 12 réplicas testando as diferentes concentrações de SFB e o uso do
regulador metabólico sobre o desenvolvimento embrionário, acúmulo lipídico
citoplasmático, apoptose celular dos embriões frescos e criotolerância frente à
vitrificação (Figura 5).
Figura 5: Delineamento Experimental em fatorial 4x3.
47
5.2- Reagentes utilizados
Todos as substâncias utilizadas foram adquiridas da Sigma (Sigma–Aldrich
Corp., St. Louis, MO), exceto quando especificada.
5.3- Maturação in vitro (MIV)
Ovários de abatedouro, predominantemente de vacas da raça Nelore (Bos
taurus indicus) foram utilizados para a obtenção dos oócitos de folículos com
diâmetro entre 2 a 8 mm. Foram utilizados somente oócitos que apresentaram
três ou mais camadas compactas de células do cumulus e com coloração
homogênea.
Os oócitos selecionados foram maturados in vitro (MIV) em estufa com
umidade saturada a 38,5
o
C, com 5% de CO
2
em ar, por 22 a 24 horas. Foram
utilizadas placas de Petri contendo gotas cobertas por óleo mineral com 30
oócitos por gota de 90µl de meio TCM 199 com sais de Earle (Gibco 31.100;
Grand Island, NY, EUA) e L-glutamina suplementado com 10% SFB, 0,2 mM
piruvato de sódio, 5mg/mL LH (Lutropin-V
®
, Vetrepharm, Ontário, Canadá),
1mg/mL FSH (Pluset
®
, Calier, Barcelona, Espanha), e 100 mg/mL de
estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina.
5.4- Fertilização in vitro (FIV)
Ao final do período de maturação, grupos de 30 oócitos foram transferidos
para gotas de 90 µl com meio de fertilização cobertas por óleo mineral. Os
oócitos foram submetidos à FIV com o sêmen de uma única partida e de um
mesmo touro da raça Nelore (Bos taurus indicus). Os espermatozóides foram
selecionados pelo método de Percoll e a concentração foi ajustada para 2x10
6
espermatozóides/mL. A fertilização ocorreu em meio HTF (Irvine Scientific,
Santa Ana, USA) acrescido de 5mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos, Sigma
A-8806), 0,2mM de piruvato, 30µg/mL de heparina, 18µM de penicilamina,
10µM de hipotaurina, e 1,8µM de epinefrina, 100mg/mL de estreptomicina e
100UI/mL de penicilina, sendo incubados os oócitos e espermatozóides em
48
estufa, sob as mesmas condições da MIV, por aproximadamente 18 horas. O
dia da fertilização foi considerado o dia zero (D0).
5.5- Cultivo in vitro (CIV)
Decorridas às 18 horas de FIV, os possíveis zigotos foram desnudados e
transferidos para placas de cultivo em gotas de 90µL do meio (30
estruturas/gota) cobertas de óleo mineral em estufa com umidade saturada e
atmosfera de 5% de CO
2,
5% O
2
e 90% N
2
. O cultivo embrionário foi realizado
no meio SOFaa acrescido de 2,7mM de mio-inositol, 0,2mM de piruvato, com
0%, 2,5%, 5% ou 10% de SFB, 5mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos- Sigma
A-8806), 100mg/mL de estreptomicina e 100UI/mL de penicilina. Após 60 horas
de cultivo, ou seja, 2,5 dias após a fertilização (D2,5), a clivagem foi checada e
as estruturas que não se encontravam clivadas foram descartadas.
Os embriões foram então transferidos para novas gotas de 90µL contendo
os respectivos meios de cultivo, ou seja com 0%, 2,5%, 5% ou 10% de SFB.
Entretanto, neste momento (60 horas após início do cultivo - D2,5) foi
adicionado ou não 0,3µM de PES (Sigma - P4544), formando-se os grupos
Grupo 0%, Grupo 0%+PES D2,5, Grupo 2,5%, Grupo 2,5% + PES D2,5, Grupo
5%, Grupo 5% + PES D2,5, Grupo 10% e Grupo 10% + PES D2,5 (Figura 5).
Foram utilizadas as mesmas condições de cultivo anteriores. No D4, após 96
horas de cultivo, realizou-se mais uma troca de meio, respeitando os
respectivos meios de cultivo anteriores utilizados para cada grupo, porém,
novamente com a adição ou não de PES, ou seja, meio SOFaa com 0%, 2,5%,
5% ou 10% de SFB, com adição ou não de 0,3µM de PES a partir do D2,5 e a
partir do D4 formando os grupos Grupo 0%, Grupo 0% + PES D2,5, Grupo 0% +
PES D4, Grupo 2,5%, Grupo 2,5% + PES D2,5, Grupo 2,5% + PES D4, Grupo
5%, Grupo 5% + PES D2,5, Grupo 5% + PES D4, Grupo 10% e Grupo 10% +
PES D2,5, Grupo 10% + PES D4 (Figura 5). Os embriões permaneceram
nestas condições de cultivo até o 7° dia (D7), momento este em que foi
avaliada a porcentagem de produção de blastocisto, com base no número total
de oócitos que foram colocados para maturar e de estruturas clivadas, e
atribuído escores com relação ao estágio de desenvolvimento (Blastocisto
inicial - 5, Blastocisto - 6, Blastocisto Expandido- 7, Blastocisto Eclodido-8), e
49
grau de qualidade (grau I - excelente- 1, grau II -regular- 2, grau III - pobre- 3 e
grau IV - estrutura degenerada– 4), de acordo com a classificação do manual
da International Embryo Transfer Society (1998). As eventuais mórulas foram
descartadas.
Após avaliação da produção embrionária, uma amostra dos embriões foram
submetidos a técnica de TUNEL (n=15-134) e a coloração de Sudan Black B
(n=15-60) para quantificação de lipídeos citoplasmáticos. O restante dos embriões
foi vitrificado (n=2647).
5.6- Produção in vivo de embriões
Para o Controle in vivo foram realizadas colheitas de embriões em sete
vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus), adultas, cíclicas, não lactantes e
com boa condição corporal (escore entre 5 e 7, numa escala de 1 a 9, de
acordo com Richards et al., 1986).
O protocolo superovulatório (P36LH48) foi baseado no proposto por
Nogueira & Barros (2003). Em um dia aleatório do ciclo estral (D0) as vacas
receberam um implante auricular com 3mg de norgestomet (Crestar®, Intervet,
Brasil) e 2,0 mg de benzoato de estradiol (Estrogin®, Farmavet, Brasil) pela via
intramuscular (IM). A partir do D4 as vacas receberam 200 mg de FSHp
(Folltropin-V, Bioniche, Brasil) IM duas vezes ao dia em doses decrescentes
(40%, 30%, 20%, e 10%), e no D6 foram administradas duas doses IM de
150µg de cloprostenol sódico (Ciosin®, Schering-Plough, Brasil) com 12 horas
de intervalo. O implante foi retirado 36 horas após a primeira aplicação de
PGF
2α
, e foi administrado 12,5mg de LH (Lutropin-V®, Bioniche, Brasil) IM 48
horas após a primeira dose de PGF
2α
. As doadoras foram inseminadas
artificialmente em tempo fixo 12 e 24 horas após a aplicação de LH, com a
mesma partida de sêmen de um único touro da raça Nelore com fertilidade
conhecida e previamente utilizado na FIV dos grupos experimentais in vitro.
A colheita dos embriões foi realizada por lavagem uterina com solução
salina tamponada com fosfato (PBS, Nutricell, Brasil) por meio da técnica não
cirúrgica no D16 pela manhã (7,5 dias após a primeira inseminação artificial).
Uma amostra dos embriões foi submetida a técnica de TUNEL (n=15) e a
coloração de Sudan Black B (n=15). O restante dos embriões foi vitrificado (n=15).
50
5.7- TUNEL (Terminal deoxinucleotil transferase Uracil Nick End
Labeling)
Uma amostra dos blastocistos frescos e aquecidos (no mínimo, n= 20 / grupo)
foi submetida a técnica de TUNEL que identifica in situ, a fragmentação
internucleossômica do DNA, evento este resultante da apoptose. Esta avaliação
foi realizada com o “Kit in Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein” (Roche® - 11
684 795 910, Mannheim, Alemanha).
Os embriões foram lavados com PBS acrescido de 1mg/mL de polivinil-
pirolidona (PVP) e fixados em paraformoldeído 4% durante 1 hora em temperatura
ambiente. Após a lavagem em PBS acrescido de 0,1% PVP, os embriões foram
permeabilizados em solução 0,1% de triton X-100 e 0,1% citrato de sódio em PBS
durante 1 hora em temperatura ambiente e lavados em PBS acrescido de 0,1%
PVP. Grupos de embriões fixados e permeabilizados foram subdivididos em 3
grupos: Controles positivos, negativos e amostras experimentais. O Controle
positivo foi tratado com 1U/µL DNase (Promega, M6101, Madison, EUA) em
solução com 400 mM de TRIS-HCL, 50mM de MgCL
2
e água ultrapura por 1 hora
a 37ºC. Após lavagem, o Controle positivo e as amostras foram incubadas em
microgotas da mistura de reagentes de TUNEL do Kit (Mix TUNEL), contendo a
proporção de 10% de solução enzimática (enzima terminal deoxinucleotídil
transferase - TdT) com 90% de solução marcadora (conjugado fluorescente de d-
UTP) por 1 hora a 37ºC no escuro, em câmera úmida. O Controle negativo foi
incubado em microgotas apenas com solução marcadora na ausência da solução
enzimática para conferir a marcação. Após a lavagem em PBS/PVP, Controles e
amostras foram submetidos a um contraste para visualização do DNA com
solução de Hoechst 33342 (concentração final 1mg/mL) e glicerol em uma lâmina
histológica com lamínula e foram analisados em microscópio de fluorescência.
Com filtro de excitação de 450-490 nm e de emissão de 515 nm os núcleos
fluorescentes em verde (isotiocianato de fluoresceína - FITC) foram considerados
as células TUNEL positivas, ou seja, apresentaram o DNA fragmentado. Com filtro
de excitação de 365 nm e de emissão de 420 nm os núcleos fluorescentes em
azul (Hoechst 33342) indicaram a presença e a localização do núcleo das células.
Para a contagem do número de células apoptóticas (coradas em verde) e número
51
total de células (coloração azul) foi utilizado o programa ImageJ 1.41o (Wayne
Rasband National Institutes of Health, EUA). Com base nestes dados, foi feito o
cálculo da porcentagem de ocorrência da apoptose (número de células
apoptóticas em relação ao número total de células do embrião).
5.8- Quantificação de lipídeos
Uma amostra dos blastocistos (no mínimo, n= 15 / grupo) foi selecionada
aleatoriamente ao longo das réplicas do experimento e submetida à coloração de
Sudan Black B (Sigma S-0395) para quantificação das gotas lipídicas
citoplasmáticas dos embriões oriundos dos diferentes grupos.
Os embriões foram fixados em solução de 10% formalina em mPBS com pH
7,4 por 2 horas em temperatura ambiente, posteriormente foram lavados em
água destilada com 0,05% PVA, e depois transferidos para uma gota de etanol
50% em água. Após 2 minutos, os embriões foram corados em quatro gotas de
1% de Sudan Black B (p/v) em solução de etanol 70% por 1- 2 minutos.
Posteriormente, os embriões foram lavados três vezes em etanol 50%, sendo 5
minutos cada vez, e logo em seguida em 0,05% de PVA em água destilada
também por 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram montadas com gotas de
10µL de glicerol para colocar os embriões e cobri-las com lamínulas, para
finalmente, serem lidas em microscópio de luz com aumento de 600x.
Visando a estimativa da quantidade de gotas de lipídeo em cada embrião
foi montada uma grade com cinco quadrados de 1600 µm
2
, cada um, no
Software AutoCAD 2000 (Autodesk, Inc., Califórnia, E.U.A.), sendo
subdivididos por linhas, alternadas em pontilhadas ou contínuas, a cada 5µm
(Figura 6). Para a quantificação lipídica as gotas lipídicas citoplasmáticas foram
classificadas em pequenas (menor que 2µm), médias (entre 2 e 6µm) e grandes
(maiores que 6µm) (adaptado de Abe et al., 2002), e posteriormente, foi contado
o número de gotas de cada categoria presentes em cada quadrado de 1600 µm
2
.
Em seguida, foi calculada a média dos cinco quadrados para cada categoria
por embrião. Os dados do acúmulo lipídico estão apresentados em número de
gotas lipídicas por 1000µm
2
. Considerando a média do diâmetro de 1, 4 e 8 µM
para as gotas pequenas, médias e grandes, respectivamente, e levando em
52
consideração que a comparação deve ser feita através do volume, uma gota
lipídica grande equivale a 8 médias e 512 pequenas.
Figura 6: Grade para quantificação lipídica dos embriões através da coloração
de Sudan Black B.
5.9- Vitrificação
Para a vitrificação dos embriões, utilizou-se a técnica “two step” com
transferência direta descrita por Campos-Chilon et al. (2006). Os embriões D7
(blastocistos grau 1 e 2) foram lavados em uma solução de manutenção (SM)
(Vigro-Bioniche) e transferidos para 500µL da solução de vitrificação - SV1 (5M
de etilenoglicol em SM) durante 3 minutos. Posteriormente, os embriões foram
colocados em uma gota de 10µL da solução de vitrificação - SV2 (7M
etilenoglicol em SM + 0,5M de galactose + 18% peso/volume de Ficoll 70) por
45 segundos. Logo após, foi montada a palheta de 0,25mL contendo 1cm de
solução de galactose (SG) (1M galactose em SM) + 0,5 cm de ar + 7cm de SG
+ 0,5 cm de ar + gota de SV2 com os embriões + 0,5 cm de ar + a SG até o
final da palheta (Figura 7). As palhetas permaneceram por 1 minuto no vapor
53
de N
2
líquido para posteriormente serem mergulhadas no mesmo. Foi realizado
a vitrificação em grupos de cinco a 10 blastocistos por palheta, exceto no grupo
Controle in vivo onde foram vitrificados três blastocistos por palheta.
Figura 7: Montagem das palhetas de vitrificação.
5.10- Aquecimento e re-cultivo dos embriões
As palhetas de vitrificação foram retiradas do N
2
líquido e mantidas por 10
segundos no ar e depois por 15 segundos em água a 35-37°C. As palhetas de
vitrificação foram agitadas levemente para misturar as colunas dos meios de
vitrificação. Posteriormente, os embriões foram lavados e submetidos ao re-
cultivo em gotas de meio SOFaa acrescido de 10% de SFB, 2,7mM de mio-
inositol, 0,2 mM de piruvato, 5mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos- Sigma A-
8806), 100 mg/mL de estreptomicina e 100 UI/mL de penicilina cobertos com
óleo mineral em estufa com umidade saturada e atmosfera de 5% de CO
2,
5%
O
2
e 90% N
2
durante o período de 12 horas para que o embriões retomassem o
seu desenvolvimento. Passado o período de re-cultivo, os embriões foram
avaliados quanto a taxa de re-expansão e posteriormente foram submetidos a
técnica de TUNEL. A sobrevivência embrionária foi definida como a re-
expansão da blastocele e posterior reduzida taxa de apoptose.
5.11- Análise Estatística
Para análise estatística, as variáveis dependentes expressas em
porcentagem (clivagem, blastocisto/oócitos, blastocisto/clidados, de re-
expansão, apoptose) foram transformadas por arcoseno (transformação
arcoseno √y/100), para posterior realização da análise de variância (ANOVA)
seguida do teste de Tukey. A comparação da porcentagem de apoptose dos
embriões frescos com a dos aquecidos foi realizada com a ANOVA seguida do
teste de Bonferroni. Os dados são apresentados não transformados.
54
As variáveis dependentes discretas (número de gotas lipídicas pequenas
médias e grandes, estágio de desenvolvimento, grau de qualidade embrionária,
número total de células, número de células apoptóticas) foram submetidas ao
teste de aderência de Kolmogorov e Smirnov, em seguida, se os dados
passaram no teste de normalidade, foram analisados por ANOVA seguido do
Teste de Tukey, caso contrário, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis seguido do
teste de Dunn.
Foi realizada a análise da correlação linear de Pearson entre os diferentes
parâmetros (Acúmulo lipídico vs porcentagem de Apoptose fresco, Acúmulo
lipídico vs porcentagem de Apoptose aquecido, e Porcentagem de Apoptose
fresco vs Porcentagem de Apoptose aquecido). A relação dos parâmetros
(concentração de SFB vs Acúmulo lipídico, concentração SFB vs porcentagem
de Apoptose fresco, e concentração de SFB vs porcentagem de Apoptose
aquecido) foi realizada através da análise de regressão.
Os efeitos principais são apresentados na ausência de interação
significativa entre as diversas concentrações de SFB e os momentos da adição
do PES. Para todos os testes foi adotado o nível de significância de 5%
(P<0,05).
RESULTADOS
56
6- RESULTADOS
6.1- Produção embrionária
O uso do SFB e PES não afetou (P>0,05) a taxa de clivagem. No entanto,
o grupo que utilizou 0% de SFB e PES a partir do D2,5 produziu menos
blastocistos por oócito e também por estruturas clivadas (P<0,05) do que os
grupos 2,5% PES D4, 10% Controle e 10% PES D4 (Tabela 1). O grupo 0%
PES D4 apresentou um atraso (menor estágio) no desenvolvimento
embrionário (P<0,05) em comparação com os grupos 2,5% (Controle, PES
D2,5 e PES D4), 5% (Controle e PES D4) e 10% (PES D2,5 e PES D4). Além
disso, a análise do grau de qualidade embrionária mostrou que o grupo 0%
PES D2,5 foi inferior (P<0,05) aos grupos 2,5% PES D4 e 10% PES D4
(Tabela 1).
57
Tabela 1: Média (± erro padrão) das diferentes concentrações de soro fetal
bovino (SFB) e do uso do etossulfato de fenazina (PES) sobre porcentagem de
clivagem, de blastocistos/ oócitos, de blastocistos/ estruturas clivadas, e os
escores do estágio de desenvolvimento e grau de qualidade dos blastocistos
bovinos produzidos in vitro no D7 de cultivo.
Tratamentos
Desenvolvimento
Parâmetros de Qualidade
[SFB]
PES
Oócitos
%
Clivagem
**
%
Blastocistos/
oócitos
**
%
Blastocistos/
clivados
**
Estágio
Desenvolvimento
*
Grau
Qualidade
*
Controle
360 86,1±3,6 34,5±5,4
ab
40,1±5,9
ab
6,4±0,1
ab
3,0±0,1
bc
0% PES D2,5
360 88,9±2,4 25,4±4,4
a
28,6±4,9
a
6,4±0,1
ab
3,1±0,1
b
PES D4
360 85,1±3,1 31,5±2,7
ab
37,0±3,2
ab
6,2±0,1
a
3,0±0,1
bc
Controle
360 84,6±2,6 41,2±3,4
ab
48,7±3,9
ab
6,8±0,1
b
2,8±0,1
bc
2,5% PES D2,5
360 81,9±3,6 34,0±3,9
ab
41,5±4,4
ab
6,7±0,1
b
2,9±0,1
bc
PES D4
360 80,3±2,3 50,2±2,7
b
62,5±3,3
b
6,8±0,1
b
2,5±0,1
c
Controle
360 88,4±2,6 41,4±6,1
ab
46,8±6,6
ab
6,7±0,1
b
2,9±0,1
bc
5% PES D2,5
360 83,7±2,9 36,8±3,5
ab
44,0±4,0
ab
6,6±0,1
ab
2,9±0,1
bc
PES D4
360 86,8±1,9 43,3±3,6
ab
49,9±4,1
ab
6,7±0,1
b
2,8±0,1
bc
Controle
360 88,8±1,9 50,8±6,1
b
57,2±6,7
b
6,5±0,1
ab
2,8±0,1
bc
10% PES D2,5
360 86,9±3,0 43,7±4,6
ab
50,3±5,1
ab
6,8±0,1
b
2,7±0,1
bc
PES D4
360 85,4±2,9 47,1±3,6
b
55,2±4,1
b
6,8±0,1
b
2,5±0,1
c
ab
Médias com sobrescritos incomuns, na mesma coluna, diferem (P<0,05).
**
N=12.
*
N=91-183.
Estágio de desenvolvimento embrionário - Escore: Blastocisto inicial-5; Blastocisto-6; Blastocisto
Expandido-7, Blastocisto Eclodido-8. Grau de qualidade embrionária - Escore: Grau I (excelente)-1; Grau
II (regular)-2; Grau III (pobre)-3; Grau IV (degenerado)-4.
Como efeito principal do SFB e PES, a taxa de clivagem também não
diferiu (P>0,05) entre as diversas concentrações do soro (0%, 2,5%, 5 e 10%),
nem tão pouco com a adição do regulador metabólico (Controle, PES D2,5 e
PES D4). A porcentagem de produção de blastocistos (por oócitos e estruturas
clivadas) e o escore de desenvolvimento embrionário foram elevados com a
suplementação do SFB (P<0,05), inclusive o soro reduziu (P<0,05) o escore do
grau de qualidade dos embriões (Tabela 2).
58
Tabela 2: Efeito principal do soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de
fenazina (PES) sobre a média (± erro padrão) da porcentagem de clivagem, de
blastocistos/ oócitos, de blastocistos/ estruturas clivadas, e os escores do
estágio de desenvolvimento e grau de qualidade dos blastocistos bovinos
produzidos in vitro no D7 de cultivo.
Respostas
Desenvolvimento Parâmetros de Qualidade
Oócitos
%
Clivagem
**
%
Blastocistos/
oócitos**
%
Blastocistos/
clivados
**
Estágio
Desenvolvimento
*
Grau
Qualidade
*
SFB
0% 1080 86,7±1,7 30,5±2,5
a
35,2±3,0
a
6,3±01
a
3,0±0,1
a
2,5% 1080 82,3±1,6 41,8±2,4
b
50,8±2,9
b
6,8±0,1
b
2,8±0,1
b
5% 1080 86,3±1,4 40,5±2,6
b
46,9±3,1
b
6,7±0,1
b
2,8±0,1
b
10% 1080 87,0±1,5 47,2±2,8
b
54,3±3,3
b
6,7±0,1
b
2,7±0,1
b
PES
Controle 1440 87,0±1,3 42,0±2,8
B
48,3±3,3
B
6,6±0,1
2,9±0,1
B
PES D2,5 1440 85,4±1,5 35,0±2,3
A
41,0±2,8
A
6,6±0,1
2,8±0,1
A
PES D4 1440 84,4±1,3 43,0±2,0
B
51,0±2,5
B
6,6±0,1
2,9±0,1
B
ab; AB
Médias com sobrescritos incomuns, na mesma coluna, diferem (P<0,05).
**
N=12,
*
N=329-510.
Estágio de desenvolvimento embrionário - Escore: Blastocisto inicial-5; Blastocisto-6; Blastocisto
Expandido-7, Blastocisto Eclodido-8. Grau de qualidade embrionária - Escore: Grau I (excelente)-1; Grau
II (regular)-2; Grau III (pobre)-3; Grau IV (degenerado)-4.
A utilização do regulador metabólico PES a partir do D2,5 reduziu (P<0,05)
a taxa de produção de blastocistos e o escore do grau de qualidade dos
embriões, porém, não afetou o estágio de desenvolvimento embrionário
comparando-se aos grupos Controle e PES D4. Já a adição do PES a partir do
D4 não alterou (P>0,05) a porcentagem de produção de blastocisto, escore do
estágio de desenvolvimento e grau de qualidade dos embriões (Tabela 2).
6.2- Acúmulo Lipídico
A elevação da concentração de SFB no meio de cultivo embrionário induziu
ao aumento (P<0,05) no número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas,
médias e grandes (Figuras 8, 9, 10, 11, e 14) em embriões bovinos produzidos
in vitro. Além disso, o aumento da porcentagem do SFB, presente no meio de
cultivo, apresentou elevados coeficientes de determinação com o aumento do
59
número médio de gotas lipídicas pequenas (R
2
=0,726), médias (R
2
=0,954) e
grandes (R
2
=0,976) (Figura 13).
Figura 8: Média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas (<2µm) dos diferentes grupos dos embriões bovinos
produzidos in vitro no D7 de cultivo. (a, b, c) refere-se a diferença entre o grupo
Controle; (A, B, C) refere-se a diferença entre o grupo PES D2,5; e (α, β, γ)
refere-se a diferença entre o grupo PES D4; dentre as concentrações de SFB e
o grupo Controle in vivo. (P<0,05). N=15.
A adição do PES não reduziu (P>0,05) a média de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas com a elevação da concentração do SFB (Figura 8).
Porém, a adição do PES, tanto a partir do D2,5 como do D4, reduziu (P<0,05) o
acúmulo de gotas lipídicas médias com a elevação do SFB comparado ao
grupo Controle (Figura 9).
60
Figura 9: Média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas médias (2-6µm) dos diferentes grupos dos embriões bovinos
produzidos in vitro no D7 de cultivo. (a, b, c, d, e) refere-se a diferença entre o
grupo Controle; (A, B, C, D) refere-se a diferença entre o grupo PES D2,5; e (α,
β, γ) refere-se a diferença entre o grupo PES D4; dentre as concentrações de
SFB e o grupo Controle in vivo. (*) Indica diferença significativa entre os grupos
Controle, PES D2,5 e PES D4 dentre as concentrações 2,5%, 5% e 10% de
SFB. (P<0,05). N=15.
O acúmulo de gotas lipídicas grandes foi reduzido (P<0,05) pela adição do
PES a partir do D2,5 em todas as concentrações de soro, quando comparados
ao grupo Controle. Adicionalmente obteve-se um menor acúmulo lipídico do
que no grupo onde o PES foi adicionado no D4 em presença de10% de SFB.
Da mesma maneira, a adição do regulador metabólico a partir do D4, reduziu
(P<0,05) o acúmulo de gotas lipídicas grandes na presença de 5% e 10% de
soro (Figura 10).
61
Figura 10: Média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas grandes (>6µm) dos diferentes grupos dos embriões bovinos
produzidos in vitro no D7 de cultivo. (a, b, c, d) refere-se a diferença entre o
grupo Controle; (A, B, C, D) refere-se a diferença entre o grupo PES D2,5; e (α,
β, γ, δ) refere-se a diferença entre o grupo PES D4; dentre as concentrações
de SFB e o grupo Controle in vivo. (*, **) Indica diferença entre os grupos
Controle, PES D2,5 e PES D4 dentre as concentrações 0%, 2,5%, 5% e 10%
de SFB. (P<0,05). N=15
Como se pode constatar, na Figura 11, o efeito principal do SFB foi
aumentar (P<0,05) o acúmulo das gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas,
médias e grandes. Já, o efeito principal da adição do PES a partir do D2,5 foi a
redução da média do número de gotas lipídicas pequenas, médias e grandes,
comparando-se ao grupo Controle, além de também reduzir o acúmulo de
gotas lipídicas grandes comparado ao grupo PES D4 (Figura 12).
62
Figura 11: Efeito principal das diferentes concentrações de soro fetal
bovino (0%, 2,5%, 5% e 10%) sobre a média (± erro padrão) do número de
gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas (<2µm), médias (2-6µm) e grandes
(>6µm) dos embriões bovinos produzidos in vitro no D7 de cultivo. (a, b, c, d, e)
indica diferença (P<0,05) entre os grupos nas categorias de gotas pequenas,
médias e grandes. N=45 - grupos 0%, 2,5%, 5% e 10%. N=15 - grupo Controle
in vivo.
A utilização do PES a partir do D4 também foi capaz de reduzir (P<0,05) o
acúmulo lipídico citoplasmático das gotas médias e grandes, porém não alterou
(P>0,05) o número de gotas pequenas quando comparado ao grupo Controle
(Figura 12).
63
Figura 12: Efeito principal dos grupos Controle, PES D2,5 e PES D4 sobre
a média (± erro padrão) do número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas
(<2µm), médias (2-6µm) e grandes (>6µm) dos embriões bovinos produzidos in
vitro no D7 de cultivo. (a, b, c, d) indica diferença (P<0,05) entre os grupos nas
categorias de gotas pequenas, médias e grandes. N=60 - Grupos Controle,
PES D2,5 e PES D4. N=15 - grupo Controle in vivo.
Apesar da diminuição da concentração do SFB e do uso do PES
resultarem numa redução do acúmulo lipídico citoplasmático, o grupo Controle
in vivo foi o qual apresentou o menor acúmulo lipídico (Figuras 8, 9, 10, 11, 12
e 14).
64
Figura 13: Relação entre o aumento da concentração do soro fetal bovino e
a média do número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas, médias e
grandes dos embriões bovinos produzidos in vitro no D7 de cultivo. R
2
–
Coeficiente de determinação.
Na Figura 14 são apresentadas as fotos dos blastocistos submetidos a
técnica do corante lipofílico Sudan Black B dos diferentes grupos experimentais
in vitro e do grupo Controle in vivo. Esta imagem ilustra o aspecto morfológico
das gotas lipídicas, indicando um aumento destas de acordo com a elevação
da concentração de soro utilizada, bem como uma diminuição com o uso do
PES.
y = 1,313x + 11,73
R² = 0,976
y = 2,103x + 21,01
R² = 0,954
y = 1,591x + 42,70
R² = 0,726
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Número de Gotas Lipídicas
Soro Fetal Bovino (%)
Grande (>6µm)
Média (2
-
6µm)
Pequena (<2µm)
65
Figura 14: Embriões bovinos submetidos à técnica do corante lipofílico
Sudan Black B dos diferentes grupos experimentais in vitro e grupo Controle in
vivo. Pontos com coloração negra são referentes, de acordo com o diâmetro,
as gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas (<2µm), médias (2-6 µm) e
grandes (>6 µm). Aumento de 600x.
66
6.3- Apoptose celular e criotolerância embrionária
Não foi observada diferença (P>0,05) com relação ao número total de
células entre os grupos de blastocistos frescos, assim como entre os aquecidos
(Tabela 3). No entanto, foi observada uma redução no número de células
devido ao processo de vitrificação e aquecimento, reduzindo de 26,1 a 49,6% o
número total de células em blastocistos aquecidos nos grupos experimentais
(respectivamente para os grupos 0% PES D4 e 10% Controle) e de 12,9 % no
grupo Controle in vivo, quando comparado a embriões frescos (Tabela 3).
Tabela 3: Média (± erro padrão) do número total de células e de células
apoptóticas dos blastocistos bovinos frescos e aquecidos, e da porcentagem de
Re-expansão dos diferentes grupos.
Tratamentos
EMBRIÕES FRESCOS
EMBRIÕES
AQUECID
OS
[SFB] PES
N° Células
Células
apoptóticas
N° Células
Células
apoptóticas
Embriões
Vitrificados
%
Re-Expansão
Controle 123.6±6.0 18.9±3.2
ab
91.4±6,9 37,6±3,0
ab
99 85,9±4,0
bcd
0% PES D2,5 138.7±5.7 24.6±3.2
abc
97.3±10,1 35,4±5,4
ab
56 92,9±5,0
abc
PES D4 133.7±9.2 19.4±3.0
abc
98.8±4,9 32,5±1,9
ab
78 92,9±5,0
ab
Controle 129.6±10.3
23.9±3.1
abc
98.1±4,3 42,1±4,5
abcd
113 74,3±3,2
cde
2,5% PES D2,5 142.9±11.5
25.5±2,5
abc
95.5±9,3 50,2±6,2
bcd
87 85,2±4,6
abcde
PES D4 142.9±8.2 26.1±7.1
abc
98.5±8,8 36,1±3,6
abc
146 85,2±4,4
abcde
Controle 144.8±14.3
31.1±8.8
abc
91.9±5,2 45,8±4,2
bcd
114 70,5±4,4
de
5% PES D2,5 129.6±16.6
31.5±4.6
abc
73.9±4,1 46,0±3,9
bcd
97 75,2±2,7
bcde
PES D4 146.4±11.0
26.1±5.8
abc
90.1±9,6 36,0±2,8
abc
121 88,3±4,8
abcd
Controle 144.8±11.6
43.1±6.7
c
81.9±8,8 58,3±4,7
cd
148 57,2±6,6
e
10% PES D2,5 148.5±13.7
44.0±4.8
bc
74.9±9,3 60,3±5,2
d
122 66,3±4,6
de
PES D4 154.0±9.2 39.4±7.0
bc
91.4±7,4 46,3±6,9
bcd
135 78,4±4,4
abcde
Controle in vivo
*
127.9±6.5
8.1±1.5
a
111.3±7,1 17,5±2,1
a
15 93,3±6,7
a
abcd
Média com sobrescritos incomuns, na mesma coluna, diferem (P<0,05). N=20-42,
*
N=5-15,
67
A menor (P<0,05) taxa de re-expansão foi observada no grupo 10%
Controle comparado aos grupos 0% (Controle, PES D2,5, PES D4), 5% PES
D4 e Controle in vivo. Além disso, a porcentagem de re-expansão dos grupos
10% PES D2,5 e 5% Controle foi menor (P<0,05) que a dos grupos 0% PES
D2,5, 0% PES D4 e Controle in vivo. Os demais grupos não diferiram (P>0,05)
entre si (Tabela 3).
O número de células apoptóticas observado nos blastocistos frescos foi
maior (P<0,05) no grupo 10% Controle quando comparado ao grupo 0%
Controle e Controle in vivo, não se constatando diferença (P>0,05) entre os
demais grupos (Tabela 3). Já com relação ao número de células apoptóticas
dos blastocistos aquecidos, pode-se observar maior ocorrência (P<0,05) no
grupo 10% PES D2,5 quando comparado aos grupos 0% (Controle, PES D2,5,
PES D4), 2,5% PES D2,5, 5% PES D4 e Controle in vivo (Tabela 3).
Com o aumento da concentração do SFB no meio de cultivo embrionário
pode-se verificar, como efeito principal, um aumento (P<0,05) na média do
número de células apoptóticas tanto em blastocistos frescos como aquecidos
(Tabela 4), e uma redução (P<0,05) na porcentagem de re-expansão após o
aquecimento. Além disso, o número total de células por blastocisto após o
aquecimento do grupo 10% foi inferior (P<0,05) ao grupo Controle in vivo
(Tabela 4).
O efeito principal da adição do regulador metabólico PES a partir do D2,5
ou D4 não afetou (P>0,05) o número total de células nos blastocistos frescos,
ou número total de células apoptóticas nos embriões frescos quando
comparado ao grupo Controle, sendo, no entanto, inferior (P<0,05) ao grupo
Controle in vivo (Tabela 4). O número total de células dos blastocistos
aquecidos dos grupos Controle, PES D4 e Controle in vivo foram similares
(P>0,05), porém a adição do PES a partir do D2,5 reduziu (P<0,05) o número
de células após o aquecimento (Tabela 4).
Ainda com relação ao efeito principal do PES, foi observado um aumento
(P<0,05) no número de células apoptóticas dos blastocistos aquecidos
submetidos ao tratamento do PES a partir do D2,5, comparando-se ao grupo
Controle in vivo e PES D4 (Tabela 4).
68
Tabela 4: Efeito principal do soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de
fenazina (PES) sobre a média (± erro padrão) do número total de células e
células apoptóticas dos blastocistos bovinos frescos e aquecidos, e da
porcentagem de re-expansão.
Respostas
EMBRIÕES FRESCOS EMBRIÕES AQUECIDOS
N° Células
Células
apoptóticas
N° Células
Células
apoptóticas
N° Embriões
Vitrificados
% Re-
Expansão
SFB
0% 131,6±4,1 20,8±1,8
ab
95,1±4,5
ab
35,7±2,2
b
233 90,5±2,7
a
2,5% 136,0±5,9 25,1±2,3
b
97,6±4,0
ab
42,0±2,8
b
346 81,6±2,5
b
5% 141,0±8,2 29,7±3,6
b
83,4±3,9
ab
43,2±2,4
b
332 78,0±2,8
bc
10% 148,8±6,5 42,2±3,6
c
81,1±5,3
b
56,8±3,2
c
405 67,3±3,5
c
Controle in vivo
*
127,9±6,5 8,1±1,5
Aa
111,3±7,1
Aa
17,5±2,1
Aa
15 93,3±6,7
aA
PES
Controle 136,6±5,5 30,1±3,2
B
90,2±3,6
AB
46,1±2,4
BC
474 72,0±3,0
C
PES D2,5 138,2±6,2 31,1±2,2
B
83,0±4,6
B
49,1±2,9
C
362 79,9±2,8
B
PES D4 144,8±4,7 28,4±3,3
B
94,7±3,8
AB
37,7±2,2
B
480 86,2±2,4
AB
(a, b, c) refere-se a diferença entre médias, na mesma coluna, dos grupos 0%, 2,5%, 5%
e 10% de SFB e (A, B, C) refere-se a diferença entre as médias, na mesma coluna, dos grupos
Controle, PES D2,5, e PES D4; comparados ao grupo Controle in vivo. (P<0,05). N=73-134,
*
N=5-15.
A redução do número total de células nos blastocistos frescos, comparado aos
blastocistos aquecidos, variou de 34,5 a 39,9%, em relação ao efeito principal do
uso do PES, e 27,7 a 45,0%, em relação ao efeito principal da elevação da
concentração de SFB. Ambas as reduções foram maiores que os 12,9% de perda
de células apresentada pelo grupo Controle in vivo (Tabela 4). O grupo Controle,
foi o que apresentou a menor (P<0,05) taxa de re-expansão após o aquecimento,
comparado aos grupos PES D2,5, PES D4 e Controle in vivo. Além disso, a taxa
de re-expansão do grupo PES D4 não diferiu (P>0,05) do grupo Controle in vivo
(Tabela 4). Tanto o efeito da elevação da concentração do SFB como a adição do
PES no meio de cultivo embrionário pode ser observada nas Figuras 15 e 16, em
que se visualiza o número total de núcleos (corados em azul) e a ocorrência de
apoptose (núcleos fragmentados corados em verde), através da técnica de
TUNEL, dos blastocistos fresco e aquecidos, respectivamente. Vale se ressaltar o
predomínio da ocorrência da apoptose nas células da MCI nos embriões frescos,
e distribuída aleatoriamente nas células dos aquecidos.
69
Figura 15: Embriões bovinos frescos dos diferentes grupos submetidos à
técnica de TUNEL. A coloração verde (FITC) indica o DNA fragmentado de
células apoptóticas. Os núcleos corados em azul (Hoescht) representam o
número total de células. A coloração azul e verde que aparecem no citoplasma
é background. Aumento de 400x.
70
Figura 16: Embriões bovinos vitrificados / aquecidos dos diferentes grupos
submetidos à técnica de TUNEL. A coloração verde (FITC) indica o DNA
fragmentado de células apoptóticas. Os núcleos corados em azul (Hoescht)
representam o número total de células. A coloração azul e verde que aparecem
no citoplasma é background. Aumento de 400x.
71
Na figura 17 A, pode-se observar que a elevação da concentração do SFB
levou a um aumento (P<0,05) da média da porcentagem de ocorrência de
apoptose nos blastocistos frescos do grupo Controle. Porém, a elevação do
soro não afetou (P>0,05) a porcentagem de ocorrência de apoptose nos
embriões frescos tanto do grupo PES D2,5 e PES D4.
Da mesma forma, o acréscimo do SFB aumentou a porcentagem de
ocorrência de apoptose nos blastocistos aquecidos nos grupos Controle e PES
D2,5, no entanto, não influenciou (P>0,05), as a taxa de apoptose no grupo
PES D4, sendo que neste grupo foi observada uma redução (P<0,05) da
porcentagem de células em apoptose após o aquecimento, em relação aos
grupos Controle e PES D2,5, com o uso de 10% de SFB (Figura 17 B).
O grupo Controle in vivo, apresentou a menor porcentagem de ocorrência
de apoptose com relação aos outros grupos, independentemente de ser fresco
ou aquecido (Figuras 17 A e B).
72
Figura 17: Efeito do soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de fenazina
(PES) sobre a média (± erro padrão) da porcentagem de apoptose, em relação
ao número total de células, dos blastocistos bovino frescos (A) e aquecidos (B)
produzidos in vitro ou in vivo. (a, b, c) refere-se a diferença entre o grupo
Controle; (A, B, C, D) refere-se a diferença entre o grupo PES D2,5; e (α, β)
refere-se a diferença entre o grupo PES D4; dentre as concentrações de SFB e
o grupo Controle in vivo. (P<0,05). N= 20-42, exceto Controle in vivo N=15.
73
Figura 18: Efeito principal do soro fetal bovino (SFB) sobre a porcentagem
de apoptose, em relação ao número total de células, dos blastocistos bovino
frescos e aquecidos produzidos in vitro ou in vivo. (a, b, c) refere-se a diferença
entre os grupos frescos; (A, B, C, D) refere-se a diferença entre os grupos
vitrificados/ aquecidos; (P<0,05). (
*
) indica diferença entre fresco e
vitrificado/aquecido dentre as diferentes concentrações de SFB (P<0,001).
N=73-84, exceto Controle in vivo N=15.
Como efeito principal, a elevação da concentração do SFB aumentou a
porcentagem de ocorrência de apoptose tanto dos blastocistos frescos como
aquecidos (Figuras 18 e 19). Além disso, a porcentagem de apoptose dos
embriões aquecidos foi superior (P<0,001) a dos embriões frescos
independente das concentrações de SFB (Figura 18).
74
Figura 19: Relação entre a concentração do soro fetal bovino e a média da
porcentagem de células apoptóticas dos blastocistos bovino produzidos in vitro
frescos e aquecidos. R
2
– Coeficiente de determinação.
Em contrapartida, a porcentagem de apoptose dos embriões aquecidos do
grupo Controle in vivo não diferiu (P>0,05) da porcentagem de apoptose fresco,
além disto, este grupo foi o grupo que apresentou a menor taxa de apoptose
celular comparado aos demais (Figuras 18 e 20).
y = 1,395x + 14,39
R² = 0,979
y = 3,264x + 35,96
R² = 0,992
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4 6 8 10
Apoptose (%)
Soro Fetal Bovino (%)
Fresco
Aquecido
75
Figura 20: Efeito principal do etossulfato de fenazina (PES) sobre a
porcentagem de apoptose, em relação ao número total de células, dos
blastocistos bovinos frescos e aquecidos produzidos in vitro ou in vivo. (a, b)
refere-se a diferença entre os grupos frescos; (A, B, C) refere-se a diferença
entre os grupos aquecidos; (P<0,05). (
*
) indica diferença entre fresco e
aquecidos dentre os grupos Controle, PES D2,5 e PES D4 (P<0,001). N= 82-
134, exceto Controle in vivo
*
N=15.
Já o efeito principal da adição do PES a partir do D2,5 ou D4 não alterou
(P>0,05) a porcentagem de apoptose dos blastocistos frescos, quando
comparados ao grupo Controle. Porém, a adição do PES a partir do D4,
reduziu (P<0,05) a ocorrência de apoptose nos embriões aquecidos, quando
comparados aos grupos Controle e PES D2,5 (Figura 20). Além disso, a
porcentagem de apoptose dos embriões aquecidos também foi superior
(P<0,05) a dos frescos (Figura 20).
76
Figura 21: Relação entre a média do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas (r=0,81; P=0,0008), médias (r=0,80; P=0,0009) e
grandes (r=0,75; P=0,0034) e a média da porcentagem de células apoptóticas
dos embriões bovinos frescos. R
2
– Coeficiente de determinação.
Figura 22: Relação entre a média do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas (r=0,71; P<0,0001), médias (r=0,70; P<0,0001) e
grandes (r=0,63; P<0,01) e a média da porcentagem de células apoptóticas dos
embriões bovinos aquecidos. R
2
– Coeficiente de determinação.
y = 0,690x + 7,860
R² = 0,555
y = 0,487x + 5,295
R² = 0,645
y = 0,477x - 3,432
R² = 0,656
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10 20 30 40 50 60 70
Apoptose Fresco (%)
Gotas Lipídicas
Grandes (>6µm)
Médias (2
-
6µm)
Pequenas (<2µm)
y = 1,738x + 16,98
R² = 0,541
y = 1,147x + 13,38
R² = 0,563
y = 1,104x - 8,388
R² = 0,592
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 10 20 30 40 50 60 70
Apoptose Aquecido (%)
Gotas Lipídicas
Grandes (>6µm)
Médias (2
-
6µm)
Pequenas (<2µm)
77
Na Figura 21, pode-se observar uma forte correlação e coeficiente de
determinação entre o acúmulo de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas
(r=0,81 e R
2
=0,656; P=0,0008), médias (r=0,80 e R
2
=0,645; P=0,0009) e
grandes (r=0,75 e R
2
=0,555; P=0,0034) sobre a ocorrência da apoptose celular
em embriões frescos.
Da mesma forma, pode-se observar na Figura 22, uma moderada
correlação e coeficiente de determinação entre o acúmulo de gotas lipídicas
citoplasmáticas pequenas (r=0,71 e R
2
=0,592; P=0,0058), médias (r=0,69 e
R
2
=0,563; P=0,0079) e grandes (r=0,62 e R
2
=0,541; P=0,0223) sobre a
ocorrência da apoptose celular em embriões aquecidos.
Figura 23: Relação entre a média da porcentagem células apoptóticas dos
blastocistos bovino frescos e a média da porcentagem de células apoptóticas
dos blastocistos bovino aquecidos (r=0,94; P<0,0001). R
2
– Coeficiente de
determinação.
No entanto, apesar da média do número de gotas lipídicas apresentar uma
correlação considerável com a apoptose celular em embriões aquecidos
(Figuras 23), a maior correlação e coeficiente de determinação foi observada
entre a porcentagem de apoptose fresco e a porcentagem de apoptose dos
embriões aquecidos (r=0,94 e R
2
=0,878; P<0,0001).
y = 2,324x + 2,222
R² = 0,878
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35
Apoptose Aquecido (%)
Apoptose Fresco (%)
DISCUSSÃO
79
7- DISCUSSÃO
O Brasil possui uma posição estratégica no mercado mundial de produção de
bovinos. Atualmente possuímos o maior rebanho comercial do mundo com
aproximadamente 200 milhões de cabeças (IBGE, 2006), e ainda, somos líderes e
referência mundial na PIV de embriões bovinos (VIANA e CAMARGO, 2007).
Marca esta alcançada devido a grande adaptação da raça Nelore frente as
mudanças que foram ocorrendo ao longo das décadas passadas para o avanço
dos resultados da técnica de PIV (GARDNER e LANE, 2002).
No entanto, no mercado nacional, predomina o uso de transferências
realizadas com embriões frescos (VIANA e CAMARGO, 2007), uma vez que as
taxas de concepção oriundas da inovulação de embriões criopreservados ainda
são insatisfatórias (HASLER, 2003). Associado a isso, os embriões PIV possuem
uma maior susceptibilidade a criopreservação do que os produzidos in vivo, o que
frequentemente, é associado com o grande conteúdo lipídico presente nestes
embriões (ABE et al., 2002; MUCCI et al., 2006).
Com o intuito de colaborar na superação dos desafios inerentes a
criopreservação de embriões PIV, este experimento objetivou testar o uso de
diferentes concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%) e a adição do regulador
metabólico PES, a partir do D2,5 e D4, no meio de cultivo embrionário visando a
produção de embriões com melhor resposta ao processo de vitrificação. Os
resultados do presente estudo indicaram que a adição do SFB no meio de
cultivo aumentou a porcentagem de produção de blastocistos (por oócitos e por
estruturas clivadas) e o escore de desenvolvimento embrionário, no entanto,
sem alteração da taxa de clivagem (Tabela 2).
Segundo a literatura, a presença do SFB pode inibir as primeiras divisões da
clivagem, enquanto que posteriormente ele pode acelerar o desenvolvimento
embrionário até o estágio de blastocisto (RIZOS et al., 2002, 2003; ENRIGHT et
al., 2000). Neste trabalho, apesar de o SFB não afetar a taxa de clivagem, tanto a
porcentagem de produção de blastocistos como o escore do grau de
desenvolvimento embrionário foram favorecidos pela presença deste componente,
concordando com o estudo de Van Wagtendonk et al. (1997). Entretanto os
resultados do presente experimento diferem dos obtidos por Mucci et al. (2006)
e Barceló-Fimbres & Seidel Jr (2007b) que não verificaram diferenças, com
80
relação ao uso do soro, tanto em relação as taxas de clivagem como de produção
de blastocistos utilizando a suplementação de 0, 5 ou 10% de SFB,
respectivamente.
Alguns autores relataram que a suplementação do soro aumenta o número
de células por embrião aumentando conseqüentemente, a sua qualidade (VAN
WAGTENDONK et al. 1997; FOULADI-NASHTA et al., 2005; MUCCI et al.,
2006). Entretanto, outros autores não observaram este efeito (GOMEZ e DIEZ,
2000) ou verificaram um efeito negativo sobre o número total de células e
qualidade embrionária (BYRNE et al., 1999; SUDANO et al., 2008). No
presente experimento, a suplementação do SFB não alterou o número total de
células dos embriões (Tabela 3 e 4).
Esta variação de resultados encontrados na literatura indica que o efeito do
soro sobre a produção, desenvolvimento e qualidade embrionária é complexo.
Além disso, deve-se considerar que a variação dos resultados pode ter ocorrido
devido as diferenças inerentes aos sistemas de cultivo embrionário utilizado em
cada trabalho, fazendo-se necessário mais estudos e padronização dos
sistemas de cultivo para aprofundar os conhecimentos relevantes a este tema.
O PES é um regulador metabólico que inibe a síntese de ácidos graxos e
favorece a via pentose-fosfato por oxidar o NADPH em NADP
+
(BARCELÓ-
FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b). A adição de 0,3 µM deste regulador no meio de
cultivo a partir do dia D2,5 não afetou a taxa de clivagem e o escore do estágio de
desenvolvimento embrionário. Porém, a adição do mesmo a partir do D2,5 reduziu
a porcentagem de produção de blastocistos / oócitos e blastocistos / estruturas
clivadas.
Já a adição do PES no meio de cultivo a partir do D4 não alterou as
porcentagens de clivagem, blastocistos / oócitos, blastocistos / estruturas clivadas,
e os escores do estágio de desenvolvimento e grau de qualidade embrionária
quando comparado ao grupo Controle sem a adição deste regulador (Tabela 2).
No trabalho de De La Torre-Sanchez et al. (2006a), apesar da adição de PES
na concentração de 0,9 µM no meio de cultivo, a partir do D2,5, apresentar um
efeito tóxico, doses menores de PES (0,1 e 0,3 µM) não apresentaram diferença
com relação à taxa de produção de blastocisto, massa celular interna e número de
células quando comparadas com o grupo Controle.
81
Da mesma maneira, Gajda et al. (2008) estudando a qualidade embrionária
de embriões suínos, observaram que o uso de 0,025-0,075 µM de PES no meio
de cultivo com embriões no estágio de duas células além de melhorar o
desenvolvimento embrionário, resultou no aumento da qualidade levando a
redução de 25% da incidência de apoptose nos embriões tratados com PES.
Os embriões PIV, apresentam um maior acúmulo lipídico citoplasmático
quando comparado a embriões oriundos da produção in vivo. Este fato pode ser
comprovado nas Figuras 8, 9, 10, 11, 12 e 14, estando em consenso com a
literatura (FAIR et al., 2001; DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006b).
Entretanto, a causa do elevado conteúdo lipídico dos embriões PIV ainda não
é totalmente conhecida. Acredita-se que este acúmulo possa ocorrer em função
da suplementação do meio de cultivo com SFB (ABE et al., 2002; MUCCI et al.,
2006; BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b), ou então devido a uma
anormalidade do metabolismo energético embrionário, levando a um desequilíbrio
das vias metabólicas (DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006a).
No presente experimento foi possível observar, claramente, que a elevação da
concentração do SFB no meio de cultivo embrionário afeta diretamente o acúmulo
lipídico citoplasmático (Figuras 8, 9, 10, 11, 14), e possui um alto coeficiente de
determinação com o aumento do número de gotas lipídicas pequenas, médias e
grandes (Figura 13). Estes resultados concordam com a literatura, uma vez que
o acúmulo lipídico em embriões PIV é maior com a suplementação de 5% (ABE
et al., 2002; GEORGE et al., 2008) ou 10% (BARCELO-FIMBRES e SEIDEL
JR, 2007a) de SFB, quando comparados a meios livres de soro.
De fato, estima-se que blastocistos bovinos oriundos de sistemas de cultivo
com a suplementação de 10% SFB possuam 62 ng de triglicerídeos, sendo que
os oriundos de sistemas livres de soro possuem apenas 36 ng (FERGUSSON
e LEESE, 1999). Sata et al. (1999) demonstraram que a suplementação de 5%
de soro no meio de cultivo resulta no aumento da composição dos ácidos
graxos saturados palmítico e esteárico, e os monoinsaturados oléico e
palmitoléico em blastocistos bovinos.
Especulam-se alguns mecanismos que explicariam o acúmulo lipídico devido
a suplementação do SFB no meio de cultivo, dentre eles pode-se citar: a) as
lipoproteínas presentes no soro poderiam ser internalizadas pelas células
embrionárias aumentando o conteúdo lipídico citoplasmático (SATA et al., 1999;
82
ABE e HOSHI, 2003), b) a presença do soro alteraria a β-oxidação em função de
uma disfunção mitocondrial (DORLAND et al., 1994; CROSIER et al., 2001; ABE
et al., 2002), e c) o embrião seria induzido a realizar uma neo-síntese de
triglicerídeos em função da presença do soro (RAZEK et al., 2000).
Por outro lado, o acúmulo lipídico também pode ocorrer devido uma alteração
do metabolismo energético, originando um aumento expressivo dos precursores
da síntese lipídica, e um desbalanço do estado de redução-oxidação afetando o
metabolismo mitocondrial o que prejudica a metabolização de complexos lipídicos
através da β-oxidação (DORLAND et al., 1994; DE LA TORRE-SANCHEZ et al.,
2006a).
Visando regular o metabolismo embrionário e propiciar um equilíbrio das vias
metabólicas para reduzir o acúmulo lipídico, foi adotado o uso do fármaco PES no
meio de cultivo a partir do D2,5 e D4 a fim de inibir a síntese de ácidos graxos e
favorecer a metabolização do substrato energético através da via da pentose e
fosfato (DE LA TORRE-SANCHEZ et al., 2006a; b; BARCELO-FIMBRES e
SEIDEL JR, 2007a; b).
A adição do PES ao meio de cultivo foi eficiente em reduzir o acúmulo de
lipídios citoplasmáticos em embriões PIV, uma vez que a utilização deste fármaco,
no período de pós-compactação embrionária, proporcionou uma redução
expressiva do número de gotas lipídicas (Figura 12). Entretanto, mesmo com o
uso do PES, a redução do conteúdo lipídico dos embriões PIV não se equiparou
ao Controle in vivo, o qual apresentou o menor acúmulo lipídico (Figuras 12, 13 e
14). Observação semelhante também foi constatada por DE LA TORRE-
SANCHEZ et al. (2006b).
A adição do PES a partir do D2,5, proporcionou uma redução mais
pronunciada no conteúdo lipídico embrionário, diminuindo o número de gotas
lipídicas pequenas, médias e grandes em relação ao grupo Controle, além de
também reduzir o número de gotas grandes em relação ao grupo PES D4 (Figura
12). Já o uso do PES a partir do D4 reduziu a média do número de gotas lipídicas
citoplasmáticas médias e grandes, porém, não diminui o número de gotas
pequenas.
Em trabalhos de outros grupos de pesquisa, já foi constatada a atuação
efetiva do PES na redução do acúmulo lipídico embrionário. No estudo de De La
Torre-Sanchez et al. (2006b), o tratamento dos embriões PIV com 0,3 µM PES a
83
partir do D2,5 possibilitou um acúmulo lipídico menor quando comparado com o
grupo DNP ou NaN
3
e o Controle in vitro. Da mesma maneira, Barceló-Fimbres e
Seidel Jr (2007a) utilizando 0,3 µM de PES obtiveram um menor acúmulo de
lipídio citoplasmático quando comparado com o grupo Controle, e o grupo
suplementado com 1 ou 3 µg/mL de cerulenin.
A duração do período de exposição do embrião ao PES é decisiva no que se
refere ao acúmulo lipídico (Figura 12), uma vez que uma exposição mais curta a
este regulador resultou em uma menor redução do acúmulo lipídico. No entanto,
um fator a se considerar nesta redução lipídica menos intensa do grupo PES D4
comparado ao PES D2,5, é o provável maior conteúdo lipídico prévio presente no
embrião no início do período de exposição a este fármaco (D4).
Sabe-se que existe um aumento do número de gotas lipídicas citoplasmáticas
médias e grandes nos estágios de dois e de oito células até o estágio de mórula,
que é o estágio onde ocorre o maior acúmulo lipídico embrionário em meios
suplementados com soro (ABE et al., 2002). Este fato coincide exatamente, com o
período de exposição do PES a partir do D4, iniciando a sua atuação em embriões
com maior acúmulo lipídico prévio do que a partir do D2,5, o que provavelmente,
reflete numa redução mais branda do acúmulo lipídico nos embriões oriundo deste
tratamento.
O motivo da importância dada pela literatura ao acúmulo lipídico embrionário
é a aparente redução da criotolerância embrionária (RIZOS et al., 2002; ABE et
al., 2002; MUCCI et al., 2006; BARCELO-FIMBRES & SEIDEL JR, 2007b). Além
disso, o acúmulo lipídico está relacionado com a apoptose celular (Figura 20).
A porcentagem de ocorrência de apoptose observada nos embriões frescos
apresentou uma forte correlação e coeficiente de determinação (Figura 20) com a
média do número de gotas lipídicas pequenas, médias e grandes, ou seja, quanto
maior o acúmulo lipídico embrionário maior a ocorrência de apoptose nos
embriões frescos PIV.
A apoptose é definida como uma forma altamente conservada de morte
celular e desempenha um importante papel no desenvolvimento embrionário e na
homeostase celular, atuando como um mecanismo de controle da qualidade
celular através da remoção de células danificadas, anormais, não funcionais, e em
número excessivo (JACOBSON et al., 1997; PAULA-LOPES e HANSEN, 2002).
84
Apesar da apoptose ser considerada um mecanismo endógeno, benéfico para
melhora da qualidade embrionária (PAULA-LOPES e HANSEN, 2002), uma alta
incidência deste processo é associada com a redução da viabilidade embrionária
(BYRNE et al., 1999).
Uma das formas de quantificação da apoptose é através da reação de
TUNEL, que possibilita a detecção in situ de células apoptóticas, pela marcação
da fragmentação oligonucleossomal do DNA geradas pela atividade de DNAases
endógenas durante o processo de apoptose (GJORRET et al., 2003).
No presente experimento a elevação do SFB aumentou a média da
porcentagem de apoptose nos embriões frescos e aquecidos (Figuras 15, 18 e
19), assim como também aumentou a média do número de células apoptóticas,
sem alterar o número total de células por blastocisto frescos (Tabela 4). Estes
resultados estão de acordo com o estudo realizado por Byrne et al. (1999) onde
também se pode observar que a adição de 10% de SFB no meio de cultivo
provocou o aumento da porcentagem de apoptose (4%) comparado ao grupo sem
a suplementação de soro (2,5%).
A adição do PES a partir do D2,5 ou D4 não afetou a média da porcentagem
de apoptose (Figura 20 e 15), a média do número de células apoptóticas e a do
número total de células por blastocisto fresco (Tabela 4), comparado ao grupo
Controle. Fato este, concorda com o observado em blastocistos suínos
submetidos ao tratamento com o PES nos quais o número total de células e
porcentagem de apoptose também não foi afetado (GAJDA et al., 2008).
Independente da concentração do SFB ou da adição do PES, o grupo
Controle in vivo possui a menor média da porcentagem de apoptose, e do número
de células apoptóticas (Tabela 4, e Figuras 15, 18 e 20), como descrito por Gjorret
et al. (2003) em que os embriões produzidos in vivo apresentaram uma menor
porcentagem de apoptose que o embrião PIV (5,4% vs 8,9%, respectivamente).
Além disso, a ocorrência de apoptose após a vitrificação / aquecimento não diferiu
da dos embriões frescos, evidenciando a maior criotolerância e qualidade destes
embriões. Como se pode observar na Figura 15, a maior incidência de apoptose
se deu nas células da massa celular interna quando comparado as do trofoblasto,
característica esta já descrita anteriormente em camundongos (HARDY e
HANDYSIDE, 1996) e bovinos (BYRNE et al., 1999), afetando em torno de 10%
das células da MCI e apenas 4% das do trofoblasto.
85
Acredita-se que esta maior ocorrência de apoptose na MCI seja para a
remoção de células lesadas, em excesso, e que não são necessárias ou
competentes para o desenvolvimento do concepto, atuando como um rigoroso
controle da qualidade na MCI uma vez que essa linhagem de células originará o
feto (BYRNE et al., 1999).
Todos os processos que desencadeiam alguma forma de estresse ao embrião
são apontados como causas da ocorrência de apoptose, como por exemplo, o
estresse térmico (PAULA-LOPES e HANSEN, 2002; HANSEN, 2007), estresse
oxidativo (GUERIN et al., 2001), o estresse devido a condições desfavoráveis do
sistema de cultivo, destacando-se a composição do meio (DEVREK e HARDY,
1997; MOLEY et al., 1998) e o estresse devido a criopreservação dos embriões.
No presente trabalho, foi possível constatar o estresse gerado pela
criopreservação dos embriões. Observou-se um aumento da porcentagem de
ocorrência de apoptose após a vitrificação / aquecimento nos grupos
experimentais in vitro comparado aos embriões dos respectivos grupos frescos
(Figuras 18 e 20). Além disso, diferente do que ocorre com os embriões frescos,
em que a apoptose se concentra nas células da MCI, nos embriões aquecidos
pode-se constatar uma distribuição aleatória da incidência da apoptose (Figura
16), afetando tanto as células da MCI como do trofoblasto, comprovando a
redução da qualidade embrionária frente ao processo de vitrificação (Marquez et
al., 2005). Outro aspecto relevante é a redução do número total de células
apresentada pelos embriões aquecidos após a vitrificação quando comparado ao
número de células dos embriões frescos (Tabelas 3 e 4), fato este associado com
o processo de degeneração celular, fazendo com que estas células não sejam
coradas pelos corantes nucleares fluorescentes em função dos danos associados
ao estresse sofrido pelos embriões durante a criopreservação.
De acordo com a literatura, a adição do SFB no meio de cultivo embrionário
reduz a criotolerância embrionária (RIZOS et al., 2002; ABE et al., 2002; MUCCI et
al., 2006; BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b). De fato, como observado
na Tabela 4 e Figura 18, não só a adição, mas também, a elevação da
concentração do SFB reduziu a criotolerância embrionária expressa através da
diminuição da taxa de re-expansão, e confirmada com o aumento da taxa de
apoptose nos embriões aquecidos. Além disso, a adição do SFB reduziu o número
86
total de células, e aumentou o número de células apoptóticas dos blastocistos
aquecidos (Tabela 4).
Em contrapartida, adição do PES, a partir do D4, aumentou a taxa de re-
expansão (Tabela 4) e reduziu a porcentagem de apoptose nos embriões
aquecidos (Figura 20). Porém, a adição do PES, a partir do D2,5, apesar de
aumentar a taxa de re-expansão em relação ao grupo Controle (Tabela 4),
aumentou também o número de células apoptóticas (Tabela 4), mas sem
alteração da porcentagem de apoptose dos embriões aquecidos (Figura 20).
Talvez, a maior exposição dos embriões ao PES, a partir do D2,5, tenha
alterado o equilíbrio do estado de redução-oxidação pela possibilidade de ter
atuado como uma NADPH oxidase provocando um aumento na produção das
ROS devido a oxidação do NADPH (GEISZT e LETO, 2004), uma vez que esta
coenzima desempenha um grande papel na redução da glutationa intracelular
(GARDNER e LANE, 1997), um importante antioxidante para o embrião (RIEGER,
1992). Associado a isto, a maior sensibilidade dos embriões criopreservados às
ROS (GUERIN et al., 2001) pode ter potencializado este efeito e originado uma
maior incidência de apoptose neste tratamento. Outra hipótese pode estar
relacionada a elevada redução do conteúdo lipídico, induzida por esta droga,
comprometendo a síntese das membranas celulares e desencadeando o
processo de apoptose.
Barceló-Fimbres e Seidel Jr (2007b) observaram que a adição de PES, a
partir do D2,5, ao meio de cultivo aumentou a sobrevivência embrionária após
congelamento convencional ou vitrificação (92
a
, 85
b
e 60
c
% de sobrevivência,
para os grupos PES, Controle e 10% SFB, respectivamente; P<0,05), contrariando
os resultados obtidos no presente estudo com relação ao grupo PES D2,5, mas
concordando com os resultados do uso da droga a partir do D4.
Aparentemente, a principal causa da reduzida criotolerância apresentada
pelos embriões PIV, atribuída pela literatura, é o seu excessivo acúmulo lipídico
citoplasmático (RIZOS et al., 2002; ABE et al., 2002; MUCCI et al., 2006;
BARCELÓ-FIMBRES e SEIDEL JR, 2007b). Concordando com estas
observações, no presente experimento foi observada uma moderada correlação e
coeficiente de determinação entre a média do número de gotas lipídicas
pequenas, médias e grandes com a média da taxa de apoptose dos embriões
aquecidos (Figura 22). Além disso, existe uma forte correlação e coeficiente de
87
determinação entre a elevação da média do número de gotas lipídicas pequenas,
médias e grandes com a porcentagem de apoptose nos embriões frescos (Figura
21). No entanto, a maior correlação e coeficiente de determinação foi observada
entre a média de apoptose dos embriões frescos e a média da apoptose dos
embriões aquecidos (Figura 23). A partir desses dados, ressalta-se a grande
importância da qualidade dos embriões para a sua viabilidade após a
criopreservação.
Apesar disso, um dado conflitante está presente nas figuras 10 e 17B,
tomando-se como base a concentração de 10% de SFB em ambas as figuras,
onde o uso do PES a partir do D2,5 reduziu consideravelmente a média do
número de gotas lipídicas grandes tanto em relação ao grupo Controle como ao
grupo PES D4 (Figura 10), mas, ao invés de reduzir a taxa de apoptose dos
embriões aquecidos, a exposição ao PES a partir do D2,5 aumentou a apoptose
em relação ao grupo PES D4 (Figura 17B).
Na literatura, existem algumas controvérsias considerando a relação do
acúmulo lipídico com a criotolerância de embriões produzidos in vivo assim como
as observadas no presente estudo com embriões PIV. Apesar das mórulas serem
o estágio embrionário, notadamente, com o maior acúmulo lipídico (ABE et al.,
2002), no estudo conduzido por Rodrigues et al. (2007) foi constatado que são
exatamente esses embriões que possuem a maior taxa de concepção após
descongelação e inovulação em receptoras. E ainda, apesar dos embriões
taurinos (Bos taurus taurus) produzidos in vivo apresentarem maior acúmulo de
lipídio citoplasmático que os zebuínos (Bos taurus indicus), são os embriões
taurinos que se mostram mais resistentes ao processo de vitrificação (VISINTIN
et al., 2002).
Tanto os dados apresentados neste trabalho como os referenciados na
literatura (VISINTIN et al, 2002; RODRIGUES et al., 2007) dão subsídio para
questionar a real contribuição do acúmulo lipídico sobre a criotolerância
embrionária e indagar se o acúmulo lipídico não é uma conseqüência de uma
série de eventos depreciativos da qualidade dos embriões PIV, tais como os
efeitos nocivos da suplementação do SFB no meio de cultivo, o desequilíbrio do
estado de redução-oxidação do metabolismo e o aumento das ROS, que
culminariam na grande sensibilidade do embrião PIV frente a criopreservação.
CONCLUSÕES
89
8-CONCLUSÕES
8.1- A elevação da suplementação do SFB no meio de cultivo favoreceu o
desenvolvimento embrionário. O uso do PES a partir do D2,5 prejudicou a
produção de blastocistos, entretanto, quando adicionado a partir do D4 não
apresentou nenhum efeito deletério.
8.2- Com a elevação da concentração do SFB houve um aumento do
acúmulo lipídico citoplasmático, porém, o uso do PES (a partir do D2,5 ou D4)
reduziu o conteúdo lipídico dos embriões bovinos PIV.
8.3- A porcentagem de apoptose nos embriões frescos foi aumentada com a
elevação da concentração do SFB, no entanto, a adição do PES ao meio de
cultivo, tanto a partir do D2,5 como do D4, não alterou a porcentagem de apoptose
fresco.
8.4- A sobrevivência embrionária após a vitrificação foi diminuída pela
elevação da concentração de SFB, e aumentada com a adição do PES apenas
a partir do D4. O tratamento realizado com PES iniciando no D2,5 não
aumentou a criotolerância embrionária.
8.5- Independente da retirada do SFB e do uso do PES no meio de cultivo
embrionário, o grupo Controle in vivo apresentou o menor acúmulo lipídico, a
menor porcentagem de apoptose fresco, e a maior sobrevivência após a
vitrificação.
8.6- O aumento do acúmulo lipídico embrionário possui uma forte
correlação com o aumento da taxa de apoptose dos embriões frescos, e uma
moderada correlação com o aumento da taxa de apoptose dos embriões
aquecidos. No entanto, a maior correlação foi observada entre a porcentagem
de apoptose fresco e a porcentagem de apoptose dos embriões aquecidos.
CONSIDERAÇÕES
FINAIS
91
9- CONSIDERAÇÕES FINAIS
O maior obstáculo para uma ampla disseminação da produção in vitro de
embriões bovinos está associado com a grande sensibilidade apresentada por
estes embriões frente às técnicas de criopreservação. Os embriões PIV não
toleram a criopreservação como os produzidos in vivo, e segundo a literatura
essa reduzida criotolerância está associada com a presença de um grande
acúmulo lipídico citoplasmático.
O presente trabalho estudou maneiras de aumentar a sobrevivência
embrionária após a vitrificação através da análise de diferentes concentrações
de soro fetal bovino (0, 2,5, 5 e 10%) e da exposição ao regulador metabólico
etossulfato de fenazina em três períodos distintos (Controle – sem exposição
ao PES; PES D2,5 – exposição a partir de 60 horas do cultivo; PES D4 –
exposição a partir de 96 horas de cultivo). Foi constatado que a redução da
concentração do SFB no meio de cultivo embrionário e a adição do PES a
partir do D4 aumentam a sobrevivência embrionária após a vitrificação, sendo,
o tratamento com 2,5% de SFB e a adição do PES a partir do D4 o que obteve
o maior equilíbrio entre produção e criotolerância embrionária.
A suplementação do SFB na concentração de 2,5% propiciou uma elevada
produção embrionária sem afetar sua sobrevivência após a vitrificação, uma
vez que obteve taxas de apoptose dos embriões aquecidos após a
criopreservação comparáveis as apresentada pelo grupo sem o uso do SFB no
meio de cultivo embrionário.
Além disso, contrariando a literatura, foi possível constatar que a qualidade
embrionária, expresso em porcentagem de apoptose, é mais determinante do
que o acúmulo lipídico citoplasmático para a sobrevivência dos embriões PIV
após a vitrificação. Fato este fornece subsídios para questionar a real
contribuição do acúmulo lipídico para a reduzida criotolerância apresentada por
estes embriões, e ainda, indagar se o acúmulo lipídico não é uma conseqüência
de uma série de eventos depreciativos da qualidade dos embriões PIV ao longo
do cultivo in vitro, tais como os efeitos nocivos da suplementação do SFB no meio
de cultivo, o desequilíbrio do estado de redução-oxidação do metabolismo e
aumento da concentração das espécies reativas de oxigênio (ROS), que além de
92
culminar no acúmulo lipídico resultam na grande sensibilidade do embrião PIV
frente às técnicas de criopreservação.
Aparentemente, a adição do PES a partir do D4 favoreceu um maior equilíbrio
do estado de redução-oxidação, que associado a concentrações reduzidas de
SFB proporcionaram o aumento da criotolerância embrionária devido,
provavelmente, uma redução do estresse oxidativo sofrido por estes embriões,
que por sua vez, tiveram maior condição de suportar o estresse ocasionado pelo
processo de criopreservação. Por outro lado, o uso do PES a partir do D2,5, assim
como a suplementação de elevadas concentrações de SFB, possivelmente,
alteraram o equilíbrio do estado de redução-oxidação (devido a uma oxidação
excessiva do NADPH, sabidamente uma coenzima que desempenha funções
biossintéticas importantes tais como a atuação na síntese de membranas
celulares e função antioxidante, reduzindo a glutationa intracelular), e ocasionou
uma disfunção mitocondrial (alterando o processo de β-oxidação),
respectivamente, resultando em um grande estresse oxidativo em função da
elevação das ROS.
PERSPECTIVAS
FUTURAS
94
10- PERSPECTIVAS FUTURAS
Com objetivo de melhorar a criopreservação dos embriões PIV e
compreender a real contribuição do acúmulo lipídico citoplasmático para a
redução da sua criotolerância, alguns estudos devem ser realizados:
1) Estudar o estresse oxidativo sofrido pelos embriões PIV ao longo do
período de cultivo embrionário e após o processo de vitrificação e aquecimento,
através da quantificação dos ROS presentes no meio de cultivo, pelo padrão de
expressão de genes alvos marcadores do estresse oxidativo e pelo uso de
agentes antioxidantes;
2) Avaliar as diferenças morfológicas e ultra-estuturais entre os embriões
produzidos in vitro e in vivo das subespécies Bos taurus indicus e Bos taurus
taurus visando elucidar as diferenças com relação a criotolerância destes
embriões.
3) Estabelecer a comparação do padrão da expressão gênica entre os
embriões produzidos in vitro e in vivo das subespécies Bos taurus indicus e
Bos taurus taurus visando esclarecer as diferenças com relação a
criotolerância destes embriões.
4) Avaliar as taxas de concepção dos embriões criopreservados e
compará-los com os parâmetros in vitro de sobrevivência após a vitrificação,
tais como taxa de re-expanção, eclosão e apoptose;
5) Testar outras técnicas de criopreservação e estudar o perfil de ácidos
graxos dos ao longo de todas as fases de desenvolvimento embrionário;
6) Analisar e pontuar os danos causados pela criopreservação dos
embriões, avaliando as características morfológicas, ultra-estruturais e
moleculares antes e após o processo de criopreservação.
BIBLIOGRAFIA
96
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