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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”
SELEÇÃO DE FUNGOS CAPAZES DE HIDROLISAR BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR PRÉ-TRATADO
Denise de Souza Machado
Dissertação apresentada para a obtenção
do título de Mestre em Ciências. Área de
concentração: Ciência e Tecnologia de
Alimentos
Piracicaba
2009
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Denise de Souza Machado
Engenheira Agrônoma
SELEÇÃO DE FUNGOS CAPAZES DE HIDROLISAR BAGAÇO DE
CANA-DE-AÇÚCAR PRÉ-TRATADO
Orientadora:
Profª. Dra. Marília Oetterer
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em
Ciências. Área de concentração: Ciência e Tecnologia de
Alimentos
Piracicaba
2009
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Machado, Denise de Souza
Seleção de fungos capazes de hidrolisar bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado / Denise
de Souza Machado. - - Piracicaba, 2009.
87 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2009.
Bibliografia.
1. Bagaços 2. Cana-de-açúcar 3. Fungos - Seleção 4. Hidrólise I. Título
CDD 664.1228
M149s
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
À luz da minha vida, Victoria
Ao meu marido Alexandre
4
5
AGRADECIMENTOS
À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, pela excelente formação que
me proporcionou.
Ao Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição pela oportunidade de
ingressar no curso de mestrado.
A Capes, pela concessão da bolsa de estudos.
À minha orientadora, Profª Dra. Marília Oetterer, pelo apoio, incentivo e, acima
de tudo, por sua amizade.
À Profª Dra. Sandra Helena da Cruz, minha co-orientadora, pela paciência e
convivência agradável durante o mestrado.
Ao Prof. Dr. André Alcarde, pela amizade e gentileza neste período.
Aos funcionários do Setor de Açúcar e Álcool do Departamento de Agroindústria,
Alimentos e Nutrição, pela inestimável colaboração.
A Marcelo Corrêa, pelo auxílio nas análises estatísticas dos experimentos.
Ao Prof. Dr. Labate e Juliano Bragato, pelo auxílio nas análises de açúcares.
As minhas amigas de curso, Carla, Paulinha, Luciana, Alessandra, Adna,
Carlinha, pelo carinho e amizade.
À Vivian Pietrobon, pelo apoio e amizade.
À Juliana, pela eterna amizade.
Aos meus pais, José Carlos e Maria Aparecida, pelo apoio e incentivo nos
momentos mais difíceis.
Ao meu marido Alexandre, pelo amor incondicional.
À minha filha Victoria, razão da minha vida.
6
7
SUMÁRIO
RESUMO.......................................................................................................................... 9
ABSTRACT .................................................................................................................... 11
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... 13
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... 15
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17
1.1 OBJETIVO ................................................................................................................... 18
1.1.1 Objetivo Geral ....................................................................................................... 18
1.1.2 Objetivos Específicos ............................................................................................ 18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................ 19
2.1
COMPOSIÇÃO DAS CÉLULAS VEGETAIS .......................................................................... 19
2.2 COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ............................................................ 20
2.3 HIDRÓLISE DO MATERIAL LIGNOCELULÓSICO .................................................................. 23
2.3.1 Hidrólise por explosão a vapor .............................................................................. 24
2.3.2 Hidrólise ácida ....................................................................................................... 26
2.3.3 Hidrólise enzimática .............................................................................................. 29
2.3.4 Fungos lignocelulolíticos ....................................................................................... 37
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 41
3.1 MICRORGANISMOS ...................................................................................................... 41
3.1.1 Preparação do inóculo........................................................................................... 42
3.2
PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR ..................................................... 42
3.3 HIDRÓLISE DO BAGAÇO PELOS FUNGOS ......................................................................... 43
3.3.1 Otimização das condições de hidrólise ................................................................. 44
3.3.2 Análise dos açúcares obtidos ................................................................................ 46
3.4
CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO POR MICROSCOPIA DE LUZ .............................................. 47
3.4.1 Análises do colmo da cana-de-açúcar por microscopia de luz .............................. 48
3.4.2 Hidrólise do bagaço ............................................................................................... 48
3.4.3 Preparação das amostras para microscopia ......................................................... 48
3.4.4 Coloração e confecção de lâminas histológicas .................................................... 49
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 50
4.1
HIDRÓLISE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PRÉ-TRATADO PELOS FUNGOS A. NIGER, P.
CHRYSOSPORIUM
, PLEUROTUS ERYNGII, P. OSTREATUS, P. SAJOR-CAJU E T. REESEI ............. 50
8
4.2
OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE DE BMA POR T. REESEI .............................. 55
4.3 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE DE BMA POR P. CHRYSOSPORIUM ............... 62
4.4 QUANTIFICAÇÃO DE AÇÚCARES POR HPAE-PAD .......................................................... 68
4.5 CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO HIDROLISADO POR MICROSCOPIA DE LUZ ......................... 71
4.5.1 Colmo de cana-de-açúcar ..................................................................................... 71
4.5.2 Bagaço de cana-de-açúcar ................................................................................... 73
5 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 80
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 81
9
RESUMO
Seleção de fungos capazes de hidrolisar bagaço de
cana-de-açúcar pré-tratado
O bagaço de cana-de-açúcar, um dos resíduos gerados durante a produção de
açúcar, é composto basicamente por celulose (41 – 44 %), hemicelulose (25 – 27 %) e
lignina (20 – 22 %); cerca de dois terços da energia existente na cana-de-açúcar está
contida no bagaço e na palha. Diversos processos utilizam o bagaço excedente, mas
principalmente para produção de energia. No entanto, devido à grande quantidade de
bagaço e palha que ainda sobram no processo estes materiais podem ser utilizados
como fonte de celulose para obtenção de etanol. Para tanto, se faz necessária a
hidrólise do bagaço e da palha a fim de se obter um hidrolisado que possa ser
fermentado por leveduras industriais. A hidrólise do bagaço pode ocorrer por explosão a
vapor, hidrólise química com ácidos ou álcalis ou hidrólise enzimática entre outros
processos; a hidrólise química pode gerar compostos que são inibidores do processo
fermentativo enquanto a hidrólise enzimática é um processo bastante oneroso visto não
existir no Brasil a produção de enzimas para este fim. Por outro lado, se a hidrólise for
efetuada somente com o próprio fungo, o processo pode ser lento. Neste contexto, este
trabalho visou utilizar bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratado por explosão a vapor e
pré-tratado com ácido como substrato para selecionar fungos capazes de hidrolisar o
bagaço a açúcares potencialmente fermentáveis por leveduras industriais. Foram
realizados experimentos em uma etapa preliminar para selecionar dentre seis linhagens
de fungos o(s) mais apto(s) para produção de açúcares redutores. E, experimentos
fatoriais 2
2
para otimização das condições de hidrólise para os fungos selecionados na
etapa anterior. Os fungos Trichoderma reesei e Phanerochaete chrysosporium foram
selecionados para hidrolisar bagaço moído pré-tratado por ácido em cinco dias de
incubação. A análise de variância (ANOVA) possibilitou gerar modelos validados e,
superfícies de resposta para liberação de açúcares redutores e hexoses na hidrólise
pelos fungos selecionados. As superfícies de resposta indicaram faixas ótimas de
temperatura e concentração de ácido (32,19°C/1,09%) para liberação de açúcares
redutores por T. reesei e, (32,6°C/1,06%) para P. chrysosporium.
Palavras-chave: Bagaço; Cana-de-açúcar; Hidrólise; Enzima; Etanol; Ácido; Fungo
10
11
ABSTRACT
Selection of fungi able to hydrolyze bagasse sugar cane pre-treated
The bagasse from sugar cane, a waste generated during the production of sugar,
is composed primarily of cellulose (41 - 44%), hemicellulose (25 - 27%) and lignin (20 -
22%), about two thirds of energy in existing sugar cane is contained in the bagasse and
straw. Several processes using bagasse surplus, but mainly for energy production.
However, due to the large amount of bagasse and straw still left in these materials can
be used as a source of cellulose to obtain ethanol. Thus, it is necessary to hydrolysis of
bagasse and straw in order to obtain a hydrolyzate that can be fermented by yeast
industry. Hydrolysis of bagasse can occur for a steam explosion, hydrolysis with acid or
alkali chemical or enzymatic hydrolysis and other processes, the hydrolysis may
generate chemical compounds that are inhibitors of the fermentation process while the
enzymatic hydrolysis process is very costly as there is in Brazil the production of
enzymes for this purpose. Furthermore, if the hydrolysis is carried out only with the
fungus itself, the process can be slow. In this context, this work aimed to use crushed
sugar cane, pre-treated by steam explosion and pre-treated with acid as a substrate to
select fungi able to hydrolyze the bagasse potentially fermentable sugars for the yeast
industry. Experiments were carried out in a preliminary step to select among six strains
of fungi as suitable for production of reducing sugars. And, 2² factorial experiments to
optimize the conditions of hydrolysis for selected fungi in the previous step. The fungi
Trichoderma reesei and Phanerochaete chrysosporium were selected to hydrolyze
milled bagasse pre-treated by acid in five days of incubation. The analysis of variance
(ANOVA) allowed generate validated models and response surfaces for the release of
reducing sugars and hexose hydrolysis by the selected fungi. The areas of response
indicated bands optimum temperature and concentration of acid (32.19°C/1.09%) for
release of reducing sugars by T. reesei, and (32.6°C/1.06%) for P. chrysosporium.
Keywords: Bagasse; Sugar cane; Hydrolysis; Enzyme; Ethanol; Acid; Fungus
12
13
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DE CELULOSE, HEMICELULOSE E LIGNINA EM BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
SEM PRÉ
-TRATAMENTO. ...................................................................................................................20
TABELA 2- FAIXAS DE ESTUDO DAS VARIÁVEIS INDEPENDENTES EM ANÁLISE NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
FATORIAL DO TIPO
2
2
. ......................................................................................................................45
TABELA 3- VALORES CODIFICADOS E CONFIGURAÇÃO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO DE OTIMIZAÇÃO DAS
CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE OBTIDAS NO PLANEJAMENTO FATORIAL DO TIPO
2
2
.....................................46
TABELA 4- COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO UTILIZADO NESTE TRABALHO. ...................................................................50
TABELA 5- AÇÚCARES REDUTORES (G/L) LIBERADOS NA HIDRÓLISE DO BAGAÇO MOÍDO PRÉ-TRATADO COM H2SO4
(0,5%) (BMA) POR FUNGOS. ...........................................................................................................51
TABELA 6- AÇÚCARES REDUTORES (G/L) LIBERADOS NA HIDRÓLISE DO BAGAÇO PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A
VAPOR
(BEV) POR FUNGOS. ............................................................................................................52
TABELA 7- AÇÚCARES REDUTORES (G/L) LIBERADOS NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO MOÍDO PRÉ-TRATADO
POR ÁCIDO
(BMA) E BAGAÇO PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR (BEV) POR FUNGOS. ................53
TABELA 8- RESULTADOS DO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES (AR) E
HEXOSES DURANTE O CULTIVO DE
T. REESEI EM BAGAÇO DE CANA MOÍDO E PRÉ-TRATADO POR ÁCIDO
(BMA) ............................................................................................................................................56
TABELA 9- COEFICIENTES DE REGRESSÃO PARA A RESPOSTA DE AÇÚCARES REDUTORES NO PLANEJAMENTO
FATORIAL PARA
T. REESEI ................................................................................................................57
TABELA 10- ANOVA PARA A LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES NO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA T. REESEI.
......................................................................................................................................................57
TABELA 11- COEFICIENTES DE REGRESSÃO PARA A RESPOSTA DE HEXOSES NO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA T.
REESEI
. ...........................................................................................................................................60
TABELA 12- ANOVA PARA A LIBERAÇÃO DE HEXOSES NO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA T. REESEI. .................60
TABELA 13- RESULTADOS DO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES (AR) E
HEXOSES DURANTE O CULTIVO DE
P. CHRYSOSPORIUM EM BAGAÇO DE CANA MOÍDO E PRÉ-TRATADO POR
ÁCIDO
(BMA) ..................................................................................................................................62
TABELA 14- COEFICIENTES DE REGRESSÃO PARA A RESPOSTA DE AÇÚCARES REDUTORES NO PLANEJAMENTO
FATORIAL PARA
P. CHRYSOSPORIUM ................................................................................................64
TABELA 15- ANOVA PARA A LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES NO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA P.
CHRYSOSPORIUM
. ...........................................................................................................................64
14
TABELA 16- COEFICIENTES DE REGRESSÃO PARA A RESPOSTA DE HEXOSES NO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA
P.CHRYSOSPOIRUM. ....................................................................................................................... 66
TABELA 17- ANOVA PARA A LIBERAÇÃO DE HEXOSES NO PLANEJAMENTO FATORIAL PARA P.CHRYSOSPORIUM. . 67
TABELA 18. CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES FUCOSE, ARABINOSE, GALACTOSE, GLICOSE, XILOSE, PENTOSES (C5),
HEXOSES
(C6) E AÇÚCARES TOTAIS EM BAGAÇO MOÍDO PRÉ-TRATADO HIDROLISADO POR T. REESEI EM
TRATAMENTO FATORIAL
2². .............................................................................................................. 69
TABELA 19- CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES FUCOSE, ARABINOSE, GALACTOSE, GLICOSE, XILOSE, PENTOSES (C5),
HEXOSES
(C6) E AÇÚCARES TOTAIS EM BAGAÇO MOÍDO PRÉ-TRATADO (BMA) HIDROLISADO POR
P.CHRYSOSPORIUM EM TRATAMENTO FATORIAL 2². .......................................................................... 70
15
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- AÇÚCARES REDUTORES LIBERADOS DURANTE CULTIVO DE BAGAÇO DE CANA MOÍDO E PRÉ-TRATADO
POR ÁCIDO
(BMA) E INCUBADOS COM FUNGOS A 29ºC. .....................................................................51
FIGURA 2- AÇÚCARES REDUTORES LIBERADOS DURANTE CULTIVO DE BAGAÇO PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A
VAPOR COM FUNGOS
. ......................................................................................................................53
FIGURA 3- AÇÚCARES REDUTORES LIBERADOS NA HIDRÓLISE DE BAGAÇO MOÍDO PRÉ-TRATADO POR ÁCIDO E
BAGAÇO PRÉ
-TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR E INCUBADOS COM FUNGOS. ....................................54
FIGURA 4- SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES POR T. REESEI. ....................58
FIGURA 5- CURVAS DE ENTORNO PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES POR T. REESEI. ..........................59
FIGURA 6- SUPERFÍCIE DE REPOSTA PARA LIBERAÇÃO DE HEXOSES POR T. REESEI. ...........................................61
FIGURA 7- CURVAS DE ENTORNO PARA LIBERAÇÃO DE HEXOSES POR T. REESEI. ...............................................61
FIGURA 8- SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES POR P. CHRYSOSPORIUM. ....65
FIGURA 9- CURVAS DE ENTORNO PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES POR P. CHRYSOSPORIUM. ...........65
FIGURA 10- SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA LIBERAÇÃO DE HEXOSES POR P. CHRYSOSPORIUM ........................67
FIGURA 11- CURVAS DE ENTORNO PARA LIBERAÇÃO DE HEXOSES POR P. CHRYSOSPORIUM. ..............................68
FIGURA 12- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO FEIXE VASCULAR EM CORTE TRANSVERSAL DO COLMO DE CANA-
DE-AÇÚCAR APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E SAFRANINA (1%). A CELULOSE ESTÁ EM
AZUL E A LIGNINA EM VERMELHO
. (FL = FLOEMA; FB = FIBRAS; LPX = LACUNAS DE PROTOXILEMA E MX =
METAXILEMA
). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 10X. .........................................................................72
FIGURA 13- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO FEIXE VASCULAR EM CORTE LONGITUDINAL DO COLMO DE CANA-
DE- AÇÚCAR APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E SAFRANINA (1%). A CELULOSE ESTÁ
COLORIDA EM AZUL E A LIGNINA EM VERMELHO
. (FL = FLOEMA; XL = XILEMA). MICROSCÓPIO ZEISS,
AUMENTO
10X. ................................................................................................................................72
FIGURA 14- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE CELULOSE (AZUL) E LIGNINA (VERMELHO) OBTIDAS
DE BAGAÇO DE CANA
-DE-AÇÚCAR TRATADO COM H
2
SO
4
APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E
SAFRANINA (1%). (CL=CELULOSE; LG= LIGNINA). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. .....................73
FIGURA 15- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE CELULOSE (AZUL) E LIGNINA (VERMELHO) OBTIDAS
DE BAGAÇO DE CANA
-DE-AÇÚCAR TRATADO COM H
2
SO
4
APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E
SAFRANINA (1%). (CL=CELULOSE; LG= LIGNINA). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. .....................74
FIGURA 16- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE CELULOSE (AZUL) E LIGNINA (VERMELHO) OBTIDAS
DE BAGAÇO DE CANA
-DE-AÇÚCAR TRATADO COM H
2
SO
4
APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E
SAFRANINA (1%). (CL=CELULOSE; LG= LIGNINA). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. .....................75
16
FIGURA 17- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE CELULOSE (AZUL) PRESENTES NO BAGAÇO PRÉ-
TRATADO COM H
2
SO
4
E HIDROLISADO POR P. CHRYSOSPORIUM APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA
(1%) E SAFRANINA (1%). (CL=CELULOSE). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. .............................. 76
FIGURA 18- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE CELULOSE (AZUL) PRESENTES NO BAGAÇO PRÉ-
TRATADO COM H
2
SO
4
E HIDROLISADO POR P. CHRYSOSPORIUM APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA
(1%) E SAFRANINA (1%). (CL=CELULOSE). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. .............................. 76
FIGURA 19- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE CELULOSE (AZUL) PRESENTES NO BAGAÇO PRÉ-
TRATADO COM H
2
SO
4
E HIDROLISADO POR P. CHRYSOSPORIUM APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA
(1%) E SAFRANINA (1%). (CL=CELULOSE). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. .............................. 77
FIGURA 20- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE LIGNINA (VERMELHO) PRESENTES NO BAGAÇO PRÉ-
TRATADO COM H
2
SO
4
E HIDROLISADO POR T. REESEI APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E
SAFRANINA (1%). (LG=LIGNINA). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. ............................................. 78
FIGURA 21- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE LIGNINA (VERMELHO) PRESENTES NO BAGAÇO PRÉ-
TRATADO COM H
2
SO
4
E HIDROLISADO POR T. REESEI APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E
SAFRANINA (1%). (LG=LIGNINA). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. ............................................. 78
FIGURA 22- FOTOMICROGRAFIA EVIDENCIANDO AS FIBRAS DE LIGNINA (VERMELHO) PRESENTES NO BAGAÇO PRÉ-
TRATADO COM H
2
SO
4
E HIDROLISADO POR T. REESEI APÓS COLORAÇÃO COM AZUL DE ASTRA (1%) E
SAFRANINA (1%). (LG=LIGNINA). MICROSCÓPIO ZEISS, AUMENTO 20X. ............................................. 79
17
1 INTRODUÇÃO
O bagaço e a palha de cana-de-açúcar são resíduos gerados durante a produção
de açúcar e etanol. Devido às grandes quantidades produzidas, diversos estudos estão
sendo realizados visando a utilização deste excedente, como: co-geração de
eletricidade a partir de bagaço, utilização do bagaço como ração animal, indústria de
móveis, plásticos biodegradáveis (SEBRAE, 2005). Diversos destes processos
necessitam de uma modificação da biomassa vegetal para serem utilizados e vários
estudos estão sendo realizados neste sentido (MORAIS, CAMPANA FILHO, 1999).
Desde a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool) em 1975, cujo
objetivo era incentivar a produção de etanol usando como matéria-prima a cana-de-
açúcar como opção para reduzir as despesas causadas com a necessidade de importar
petróleo (TEIXEIRA et al., 1997); o Brasil, tecnologicamente, tem se destacado como o
país mais avançado na produção e no uso de etanol como combustível, seguido pelos
EUA. Atualmente, a produção mundial de etanol é de, aproximadamente, 40 bilhões de
litros; supõe-se que cerca de 25 bilhões de litros sejam utilizados para fins energéticos.
Na safra 2007/08 o Brasil produziu 494 milhões de toneladas de cana com uma
produção de 31 milhões de toneladas de açúcar e 22 bilhões de litros de etanol (UNICA,
2009). Em 2008 existiam 386 indústrias em atividade, com 249 unidades mistas, isto é,
produzindo açúcar e etanol, 122 destilarias produzindo somente etanol e 15 usinas
produzindo somente açúcar (MAPA, 2009). O etanol é utilizado em mistura com
gasolina no Brasil, EUA, México, Índia, Argentina, Colômbia e no Japão (ÁLCOOL-
ETANOL BRASILEIRO, 2006).
O uso de etanol como combustível automotivo é de grande vantagem e levou a
eliminação de compostos de chumbo na gasolina, a redução das emissões de CO, a
eliminação de S (enxofre) e material particulado, e emissões de compostos orgânicos
menos tóxicos e menos reativos fotoquimicamente (BIOTECH BRASIL, 2006).
Cerca de dois terços da energia existente na cana-de-açúcar está contida no
bagaço e na palha, e através do procedimento de hidrólise, seria possível utilizá-la
(BIOTECH BRASIL, 2006).
Com o emprego dessa tecnologia o Brasil tem possibilidade de aumentar em
30% a sua produção do combustível líquido, e assim o aproveitamento da cana-de-
18
açúcar seria quase total, sem necessidade de aumentar a área de plantio, favorecendo
toda a escala produtiva e, acima de tudo, preservando o meio ambiente, uma das
preocupações de toda a sociedade (BIOTECH BRASIL, 2006).
1.1 Objetivo
1.1.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve por objetivo selecionar fungos capazes de hidrolisar o
bagaço de cana-de-açúcar utilizando bagaço pré-tratado por explosão a vapor e bagaço
moído pré-tratado com ácido.
1.1.2 Objetivos Específicos
Ö Selecionar, entre os fungos Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei,
Pleurotus sajor-caju, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii e Aspergillus niger, o
mais apto a hidrolisar bagaço de cana-de-açúcar;
Ö Comparar a liberação de açúcares após hidrólise por fungos de bagaço moído
pré-tratado com ácido ou bagaço pré-tratado por explosão a vapor;
Ö Determinar o menor tempo no qual os fungos liberem as maiores quantidades de
açúcares redutores no processo de hidrólise;
Ö Determinar qual a melhor resposta da interação entre temperatura e
concentração de ácido para a liberação de açúcares redutores e hexoses no
processo de hidrólise;
Ö Caracterizar o bagaço de cana-de-açúcar por microscopia de luz.
19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O bagaço de cana-de-açúcar, obtido na saída do último terno de moendas, é
aproveitado historicamente pelas usinas e outras unidades industriais como insumo
energético para produção de vapor e eletricidade mediante a queima em caldeiras. No
entanto, para cada três toneladas de cana é gerada uma tonelada de bagaço,
quantidade mais que suficiente para que o bagaço possa ser utilizado como matéria-
prima na obtenção de outros produtos, como furfural, carvão ativado, produtos
moldados, alimentação animal e outros (SEBRAE, 2005).
Com a atual busca mundial por biocombustíveis a partir de fontes renováveis, a
cana-de-açúcar é uma das principais fontes de matéria-prima, nesse caso, para
produção de etanol carburante, produto de grande demanda. Por isso, o bagaço de
cana-de-açúcar pode ser uma alternativa para o aumento da produção do etanol sem a
necessidade de aumentar a área plantada de cana. No entanto, a produção de etanol a
partir de bagaço envolve a hidrólise das fibras de celulose para obtenção de açúcares
fermentescíveis.
Segundo Rossell (2006), cada tonelada de bagaço de cana-de-açúcar
hidrolisado pode resultar, potencialmente, em 186 litros de etanol, sendo 123 litros
obtidos da fermentação das hexoses e 63 litros da fermentação das pentoses.
2.1 Composição das células vegetais
As células vegetais apresentam a parede celular como uma de suas mais
significativas características. A parede celular é fundamentalmente formada por
microfibrilas de celulose, imersas em uma matriz contendo polissacarídeos não
celulósicos, as hemiceluloses e pectinas. A microfilbrila de celulose tem de 10 a 25 nm
de diâmetro, comprimento indeterminado e, 30 a 100 moléculas de celulose que se
unem paralelamente por meio de pontes de hidrogênio e mostram um arranjo ordenado
responsável por sua cristalinidade e birrefringência (KRAUS et al, 2006).
Lignina é um polímero amorfo complexo composto de unidades fenilpropano (C9)
unidas por diferentes tipos de ligações. Essa irregularidade do polímero é conseqüência
do mecanismo de sua biossíntese que é dado através do acoplamento de várias formas
de ressonância de radicais livres (FENGEL, WEGENER, 1984). Os precursores diretos
20
da lignina são três alcoóis conhecidos como Lignois, e derivam do ácido chiquímico:
coniferil, sinapil e álcool p-cumaril (SCATENA, SCREMIN-DIAS, 2006). O crescimento
das moléculas de lignina ocorre nos espaços entre as microfibrilas de celuloses e
cadeias de hemiceluloses na parede celular num processo conhecido como lignificação
(GLAZER, NIKAIDO, 1995; NOGUEIRA, 1990).
A cana-de-açúcar, da família das gramíneas, é uma monocotiledônea, portanto
sua anatomia apresenta vasos condutores distribuídos em feixes. Os feixes libero-
lenhosos se distribuem de maneira irregular e, encontram-se envolvidos por fibras de
esclerênquima. O xilema ou lenho é constituído por células mortas, alongadas,
dispostas topo a topo em séries longitudinais formando colunas contínuas ou tubos e
seu principal componente é a lignina. O tecido liberino, também designado floema ou
líber é constituído por células vivas parenquimatosas e seu principal componente é
celulose (APPEZATO-DA-GLÓRIA; CARMELLO-GUERREIRO, 2006).
2.2 Composição do bagaço de cana-de-açúcar
Os materiais lignocelulósicos são compostos por celulose, hemicelulose e lignina,
em diferentes concentrações, dependendo do material analisado. A composição do
bagaço de cana-de-açúcar, resíduo lignocelulolítico gerado durante a produção de
açúcar e álcool tem sido analisado e estudado exaustivamente (Tabela 1).
Tabela 1- Composição centesimal de celulose, hemicelulose e lignina em bagaço de cana-de-açúcar sem
pré-tratamento
Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Referência
37 ND* 24,6 AGUIAR, MENEZES, 2000
32-48 19-24 23-32 BANERJEE, PANDEY, 2002
46,86 27,50 26,27 CANILHA et al., 2007
38,6 23 23 EERE, 2007
34,4 22,4 20,3 GOMES, 1985
54,55 26,75 10,44 PIETROBON, 2008
41-44 25-27 20-22 SEBRAE, 2005
43,8 25,8 22,1 ROCHA, 2009
46,6 25,2 20,7 ROSSEL, 2006
ND: não determinado
21
A análise de 50 amostras de bagaço de cana de açúcar provenientes de diversas
procedências foi realizada por Rocha (2009), tendo sido obtido 43,8% de celulose,
25,8% de hemicelulose e 22,1% de lignina total. No entanto, segundo o Departamento
de Energia dos EUA o bagaço de cana-de-açúcar proveniente da variedade Saccharum
spp., a mais utilizada no Brasil, possui 23% de lignina total, 23% de hemicelulose e
38,6% de celulose, o que origina glucanas (38,6%), xilanas (20,4%), arabinanas (1,7%)
e outras (menos que 1%) (EERE, 2007). Além de celulose, hemicelulose e lignina, o
bagaço de cana de açúcar contém pequenas quantidades de outros compostos
classificados conjuntamente como componentes estranhos (SEBRAE, 2005).
Canilha et al. (2007) estudando bagaço in natura, através de análises por
cromatografia líquida de alta eficiência, determinou as frações dos açúcares celobiose
(3,34%), glicose (46,20%), xilose (24,21%), arabinose (1,70%), e componentes como
hidroximetilfurfural (0,30%) e furfural (1,25%) no bagaço de cana-de-açúcar.
Aguiar e Menezes (2000), em estudos com A. niger IZ-9, determinaram as
frações de celulose (37%) e lignina (24,6%) em bagaço de cana-de-açúcar sem
tratamento. Enquanto o bagaço pré-tratado por NaOH 4% apresentou 60,5 % de
celulose e 10,7% de lignina, o bagaço pré-tratado por NaOH 4%, ácido fosfórico e vapor
resultou em teores de 66,5% de celulose e 10% de lignina.
Gomes (1985) determinou teores de 34,4% de celulose, 22,4% de hemicelulose
e 20,3% de lignina em bagaço seco e moído, sem pré-tratamento. Em bagaço pré-
tratado por hidróxido de sódio (NaOH 4%), os teores obtidos foram 5,9% de celulose,
25,2% de hemicelulose e 12,7% de lignina na fração solúvel resultante do pré-
tratamento alcalino e, 37,2% de celulose, 11% de hemicelulose e 24,8% de lignina na
fração insolúvel. Em bagaço pré-tratado por explosão a vapor, os teores apresentados
foram: 0% de celulose, 39% de hemicelulose, 3,1% de lignina na fração solúvel e, 52%
de celulose, 15,7% de hemicelulose e 22,3% de lignina na fração insolúvel do pré-
tratamento ácido.
Pietrobon (2008) apresentou resultados de teores de 54,55% de celulose,
26,75% de hemicelulose e 10,44% de lignina em bagaço de cana-de-açúcar sem pré-
tratamento. Em bagaço pré-tratado por ácido sulfúrico (0,5%) os teores obtidos foram
69,77% de celulose, 2,24% de hemicelulose e 17,61% de lignina, enquanto o bagaço
22
pré-tratado por hidróxido de cálcio (3%) apresentou teores de 62,38%, 12,50% e 9,96%
para celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente.
A celulose, principal componente da parede celular da fibra, é um polissacarídeo
linear, constituído por um único tipo de açúcar (homopolímero), ou seja, unidades de
glicose unidas por ligações α(1-4). A celulose está localizada nas paredes das fibras,
sendo que uma parte apresenta-se na forma amorfa e a outra (maior parte) na forma
cristalina. Sua fórmula molecular bruta é (C
6
H
10
O
5
)n, onde n representa o número de
moléculas de glicose (meros) que compõem a cadeia e pode assumir um valor de até
15.000 unidades (SCATENA, SCREMIN-DIAS, 2006). O valor de n tem uma relação
direta com o grau de polimerização da celulose e este por sua vez, com a resistência
física da mesma. As hemiceluloses também são polissacarídeos, porém diferem da
celulose por serem constituídas de vários tipos de açúcar (heteropolímero), além de
serem polímeros ramificados e de cadeia mais curta de baixa massa molecular,
intimamente ligados com a própria celulose. Dentre estes açúcares estão: xilose,
manose, arabinose, galactose e outros. A lignina é um polímero amorfo, de composição
química complexa, que confere firmeza e rigidez ao conjunto de celulose. Apresenta
natureza aromática predominante, é insolúvel em água e muito resistente a reação
química devido ao seu elevado peso molecular (BETINI, 2006; CELULOSE ONLINE,
2007; COELHO, NASCIMENTO, 2008).
A celulose contém duas frações: uma amorfa (facilmente hidrolisável) e, outra
cristalina (muito resistente à hidrólise). Isto faz com que este tipo de material necessite
de pré-tratamento, com ácido diluído (~2%) ou explosão a vapor para o aproveitamento
eficiente de materiais lignocelulósicos (OLIVERIO, HILST, 2004).
As hemiceluloses também são polissacarídeos, porém diferem da celulose por
serem constituídas de vários tipos de açúcar, além de serem polímeros ramificados e
de cadeia mais curta de baixa massa molecular, intimamente ligados com a própria
celulose. Dentre estes açúcares estão: xilose, manose, arabinose, galactose e outros. A
lignina é um polímero amorfo, de composição química complexa, que confere firmeza e
rigidez ao conjunto de celulose. Apresenta natureza aromática predominante, é
insolúvel em água e muito resistente a reação química devido ao seu elevado peso
molecular (BETINI, 2006; CELULOSE online, 2007).
23
2.3 Hidrólise do material lignocelulósico
A utilização da glicose proveniente de materiais lignocelulósicos ocorre após a
hidrólise da celulose. Diversos processos de hidrólise estão sendo estudados e
empregados em nível de pesquisa quanto em escala industrial para fins diversos.
A hidrólise (sacarificação) quebra as ligações por pontes de hidrogênio nas
frações de hemicelulose e de celulose em seus componentes do açúcar: pentoses e
hexoses. Estes açúcares podem então ser fermentados a etanol. No entanto, em muitos
casos, um pré-tratamento se faz necessário, este se refere à solubilização e à
separação de um ou mais componentes principais da biomassa - hemicelulose,
celulose, lignina e extrativos - para permitir que a biomassa sólida remanescente esteja
mais acessível a um tratamento químico ou biológico.
Existem vários métodos disponíveis de pré-tratamento ou combinações de
métodos. O pré-tratamento físico quebra o tamanho das fibras pela moagem ou
processamento aquoso/vapor. O pré-tratamento físico usado geralmente pelos
produtores de milho para produção de etanol é a moagem, o que reduz o tamanho da
semente do milho, facilitando a hidrólise enzimática. Os métodos usados para materiais
celulósicos requerem pré-tratamentos físicos muito mais intensos tais como a explosão
a vapor (GRAF; KOEHLER, 2000).
Os métodos químicos mais utilizados: ácido diluído, álcali, solvente orgânico,
amônia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono ou outros produtos químicos para gerar
uma biomassa mais digerível pelas enzimas. Os pré-tratamentos biológicos são usados
às vezes em combinação com tratamentos químicos para solubilizar a lignina a fim de
deixar a celulose mais acessível à hidrólise e a fermentação (GRAF, KOEHLER, 2000).
Dos métodos químicos, o hidróxido de sódio é um dos mais estudados (GOMES, 1985;
MARTÍN et al., 2007b; PIETROBON, 2008). Sua aplicação resulta na quebra da
estrutura da lignina, hidratação e inchamento da celulose e redução do grau de
cristalinidade, aumentando a digestibilidade do material celulósico.
Pietrobon (2008) realizou a hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré tratado
por ácido ou por álcali, utilizando enzimas comerciais. E, verificou que a hidrólise
enzimática em bagaço pré-tratado por ácido foi quase duas vezes superior ao pré-
tratamento alcalino e, seis vezes maior quando comparado ao bagaço sem pré-
24
tratamento (controle). Isto confirma a importância do pré-tratamento do bagaço no
processo de hidrólise enzimática.
Martín et al. (2008), realizaram experimentos de hidrólise em uma mistura de
trevo e azevém com fermentação simultânea para conversão dos açúcares em etanol.
Avaliaram condições de temperatura (175 – 195°C) e de pressão (0,3 – 1,2 MPa) para
identificar e quantificar os componentes das frações sólida e líquida deste material e o
potencial de conversão enzimática. A oxidação úmida (WO) tem sido utilizada com
sucesso para hidrolisar diversos materiais lignocelulósicos tais como: palha de trigo
(BJERRE et al. 1996; KLINKE et al., 2002), palha de milho (VARGA et al., 2003),
resíduos domésticos orgânicos (LISSENS et al., 2004), bagaço de cana-de-açúcar
(MARTÍN et al., 2006, 2007a), mandioca, palha de arroz e amendoim (MARTÍN,
THOMSEN, 2007d).
Dentre os diversos métodos para hidrólise da celulose foram utilizados neste
estudo os processos para hidrolisar o bagaço de cana: explosão a vapor, ácido diluído e
fungos. Estes estão detalhados a seguir.
2.3.1 Hidrólise por explosão a vapor
A explosão a vapor é um método de pré-tratamento de grande interesse atual
(MARTÍN et al., 2007b). Este processo modifica física e quimicamente os resíduos
lignocelulósicos, permitindo o fracionamento nos três principais polímeros que os
constituem: hemicelulose, que permanece no hidrolisado, a lignina, que pode ser
separada com metanol, etanol ou hidróxido de sódio (NaOH) e, a celulose, encontrada
na porção insolúvel (GOMES, 1985). Este pré-tratamento pode ser realizado utilizando
diferentes temperaturas e tempos. Quanto mais tempo e temperatura forem aplicados
ao bagaço maior é o rendimento em açúcares redutores, no entanto, maior será
também a formação de compostos como furfural e 5-hidroximetilfurfural (HMF) que são
inibidores da fermentação (MARTÍN et al., 2007c). Gomes (1985) utilizando altas
temperaturas (185-260°C) observou a formação de ácido acético a partir de grupos
acetil termolábeis presentes na hemicelulose, que catalisa a hidrólise da hemicelulose e
sua solubilização em água. Por outro lado, se a explosão a vapor é realizada a altas
pressões, seguida de rápida descompressão através de orifício e da remoção da lignina
25
com álcalis ou álcool, o resíduo é altamente suscetível à hidrólise enzimática por
enzimas celulolíticas (CUNHA, 1999).
Apesar da explosão a vapor ser considerada o mais eficiente entre os métodos
de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar pesquisados, pode ocorrer durante
este processo a formação de compostos que podem afetar negativamente a
fermentabilidade dos hidrolisados. Cunha (1999) verificado que no processo de
explosão a vapor são produzidas substâncias inibidoras da β-glicosidase, do complexo
de celulases do Trichoderma reesei e, também inibem o crescimento de alguns
microrganismos fermentadores, tais como Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas
mobilis e Klebsiella pneumonia.
Rodrigues-Zuñiga et al. (2008) avaliaram a produção de celulases e xilanases de
Aspergillus niger, utilizando como substrato bagaço de cana-de-açúcar in natura e
quimicamente tratado mediante os processos de explosão a vapor e hidrólise ácida e
alcalina. Verificaram que os melhores resultados foram obtidos com o bagaço pré-
tratado por explosão a vapor, e que a geração de inibidores como furfural e
hidroximetilfurfural pode ser a causa da baixa produtividade enzimática no bagaço pré-
tratado por ácido e álcali.
Domingues et al. (2008) realizaram experimentos de hidrólise de bagaço de
cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, nos quais compararam enzimas
comerciais e enzimas de T. reesei obtidas por fermentação em estado sólido (FES).
Observaram maior concentração de açúcares redutores totais (ART) e glicose no
bagaço hidrolisado pelas enzimas obtidas de T. reesei por FES em comparação com as
enzimas comerciais.
Olivieri et al. (2008) hidrolisaram enzimaticamente diferentes materiais
lignocelulósicos previamente tratados por metodologias distintas. Os resultados para a
hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar indicaram que o pré-tratamento por explosão a
vapor em presença de um catalisador ácido resultou em 88% de hidrólise da celulose.
Rendimentos inferiores foram observados para o bagaço pré-tratado por explosão a
vapor sem catalisador (55%) e para as amostras sem tratamento (12%). Resultados
equivalentes foram obtidos para a hidrólise de eucalipto, em que as amostras com
granulometria entre 20 e 100 μm apresentaram rendimentos de 88% e, amostras de
pinus, com granulometria entre 30 e 45 mesh apresentaram rendimentos de 10%.
26
Observaram que as condições específicas de moagem apresentaram resultados tão
eficientes quanto à explosão a vapor em presença de catalisador ácido. Verificaram
aumento no rendimento de hidrólise com a diminuição do tamanho da partícula do
bagaço e da madeira.
Pitarelo et al. (2008) estudaram o efeito do ácido fosfórico sobre o pré-tratamento
a vapor do bagaço de cana-de-açúcar e sua suscetibilidade à hidrólise enzimática. O
pré-tratamento por explosão a vapor se revelou eficiente para aumentar a bioconversão
de materiais lignocelulósicos, sendo que a utilização de um catalisador ácido aumenta a
recuperação total das frações pré-tratadas, assim como a suscetibilidade dos resíduos
insolúveis à hidrólise enzimática. Neste estudo, o bagaço pré-tratado por explosão a
vapor catalisado por ácido fosfórico se apresentou mais acessível à hidrólise enzimática
com rendimento de 80% para a sacarificação da celulose em 8 horas de reação.
2.3.2 Hidrólise ácida
A hidrólise de biomassa por ácido diluído é, de longe, a tecnologia mais antiga
para converter biomassa em etanol. A hidrólise de materiais celulósicos para obtenção
de etanol vem sendo estudada desde 1819 quando Braconnot descobriu que soluções
ácidas eram capazes de dissolver a celulose com a posterior conversão dos
polissacarídeos em açúcares. Suas experiências eram conduzidas com ácido sulfúrico
95% a frio num primeiro estágio e, em seguida com ácido sulfúrico diluído a quente
(COLETÂNEA, 1981).
O primeiro processo comercial para produção de etanol a partir de madeira foi
feito na Alemanha em 1898. Este processo envolveu o uso de ácido diluído para
hidrolisar a celulose para glicose, e foi capaz de produzir 76 litros de etanol por tonelada
de resíduos de madeira. Os alemães logo desenvolveram um processo industrial
otimizado para render cerca de 190 litros por tonelada de biomassa. Este processo logo
encontrou caminho para os Estados Unidos, resultando em duas plantas comerciais
operando no sul durante a I Guerra Mundial. Estas plantas usavam o que foi chamado
de "O Processo Americano" — hidrólise com ácido sulfúrico diluído em um estágio.
Embora os rendimentos fossem metade daquele obtido com o processo alemão original
(95 litros de etanol), os benefícios do processo americano foram maiores. Uma queda
27
na produção de madeira forçou o fechamento das plantas após o final da I Guerra
Mundial. Enquanto isto, uma pequena, mas constante pesquisa sobre hidrólise com
ácido diluído continuou nos USDA's Forest Products Laboratory (EERE, 2007).
Mas, foi durante a Segunda Guerra Mundial que o processo aconteceu em
escala industrial utilizando a madeira como substrato. Após a guerra as pesquisas
cessaram, somente sendo retomadas na década de 70, devido à crise mundial do
petróleo. Em vários países foram feitas tentativas de se obter em escala industrial o
etanol a partir de materiais lignocelulósicos. No entanto, todos os processos se
mostraram onerosos ou ineficientes na conversão da biomassa em açúcares
fermentescíveis (COLETÂNEA, 1981).
Dentre os processos pesquisados estão os que utilizavam ácido concentrado
(80%) e os processos que utilizavam ácido diluído (0,4-0,5%). Os processos com ácido
sulfúrico concentrado apresentavam vantagens como alto rendimento em etanol e a
possível recuperação do ácido e de produtos derivados da hidrólise como o furfural,
mas desvantagens como o enorme gasto energético e o alto consumo de ácido e de
sulfato de cálcio (para a neutralização), eram limitantes para a adoção do processo em
escala industrial (SAVARD, 1962).
Por tudo isto, os processos com ácido diluído foram os mais pesquisados. Na
França, foram desenvolvidos dois processos utilizando ácido sulfúrico diluído- Junien e
Meunier- e um processo com ácido clorídrico diluído- Melle-Boinot. Este consistia em
quatro ataques sucessivos da matéria lignocelulósica em condições crescentes de
temperatura e pressão. A biomassa era atacada pelo ácido (0,4%) numa autoclave (5
kg/cm²) durante 15 minutos, sendo o hidrolisado esgotado a cada novo ataque. Por fim,
quatro hidrolisados eram obtidos podendo ser reunidos para fermentação. Dos
processos utilizando ácido diluído, apenas o Scholler e o Madison foram operados
industrialmente. No processo Scholler a percolação era realizada em bateladas
consecutivas até que a concentração de açúcares baixasse a níveis determinados. No
processo Madison, a hidrólise passou a ser realizada por percolação contínua, o que
diminuiu o tempo de digestão e o gasto energético, a decomposição do açúcar formado
foi menor, pois ficava menos tempo em contato com o ácido, o que resultou em maior
rendimento em etanol (SAVARD, 1962).
28
Martín et al. (2007c) investigaram o pré-tratamento com ácido diluído na hidrólise
de bagaço de cana-de-açúcar, cascas de arroz, cascas de amendoim e caules de
mandioca. Identificaram açúcares redutores como xilose, glicose, arabinose e galactose
em todos os hidrolisados, enquanto que manose foi encontrada apenas nos
hidrolisados de cascas de amendoim e caules de mandioca. As hemicelulases atingiram
alto grau de hidrólise e, altas concentrações de glicose foram encontradas nos
hidrolisados de casca de arroz, provavelmente, devido à hidrólise do amido do grão que
permaneceu aderido à casca. Cascas de amendoim e caules de mandioca renderam
baixas quantidades de açúcares redutores, indicando que as condições não foram
severas o suficiente para hidrolisar as hemiceluloses nestes materiais. Todos os
hidrolisados foram facilmente fermentados por Saccharomyces cerevisiae. O ácido
diluído aumentou em 2,7 a 3,7 vezes a ação da enzima no bagaço de cana-de-açúcar.
No entanto, durante a hidrólise ácida, compostos inibidores de fermentação são
formados, como compostos aromáticos, principalmente fenólicos, furaldeídos como
furfural e hidroximetilfurfural, ácidos alifáticos (fórmico, levulínico, acético) (MARTÍN et
al., 2007c). Remover ou diluir estes compostos melhora a fermentabilidade dos
hidrolisados. Vários métodos de detoxificação têm sido descritos e os efeitos na
composição química dos hidrolisados lignocelulósicos têm sido investigados (MARTÍN
et al., 2007c).
Segundo Rossell (2006), os esforços têm sido concentrados na fase do pré-
tratamento ou hidrólise, e a questão da remoção dos compostos inibidores da
fermentação tem sido relegada.
Considerando que os custos de manipulação da matéria-prima, produtos
químicos e necessidades energéticas são altos, devem ser realizados esforços para
utilização completa de todas as frações da matéria celulósica, principalmente da lignina,
que representa cerca de 20% da matéria seca. A lignina dificulta o processo de hidrólise
e sua quebra por via ácida libera compostos nocivos para a fermentação como o furfural
(FINGERUT, 2007).
Apesar disto, diversos autores propõem diferentes concentrações de ácido para
hidrolisar o bagaço (TORGET et al., 2000; MARTÍN et al., 2007b, 2007c).
Uma alternativa para que a lignina seja degradada sem a formação destes
compostos é a via enzimática, onde o fungo produz a enzima que quebra a lignina por
29
rota diferente da ácida, resultando em compostos não inibidores da fermentação.
Diferentes estratégias estão sendo estudadas para a produção de etanol a partir
de materiais lignocelulósicos: hidrólise e fermentação em separado – é a concepção
tradicional, na qual a hidrólise da celulose, após o pré-tratamento do material
lignocelulósico, ocorre antes da fermentação. Nesse processo, conhecido como SHF-
Separated Hydrolysis and Fermentation, pode ocorrer a inibição parcial das celulases
pelo acúmulo de celobiose (DRISSEN et al., 2009); sacarificação e fermentação
simultâneas – a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação ocorrem
simultaneamente. Os açúcares resultantes da hidrólise da celulose são fermentados por
leveduras comerciais evitando a inibição das enzimas lignocelulolíticas. No entanto, as
condições ideais para a ação das enzimas não são as mesmas necessárias para os
microrganismos fermentadores. Estudos têm sido feitos para que se consiga enzimas
que atuem nas mesmas condições de pH e temperatura da fermentação alcoólica. Este
processo é conhecido por SSF – Simultaneous Saccarification and Fermentation
(DRISSEN et al.,2009).
2.3.3 Hidrólise enzimática
A utilização de enzimas para o processamento de biomassa para etanol é
relativamente recente. Enquanto a química de obtenção de açúcares a partir de
madeira tem em torno de dois séculos de pesquisa e desenvolvimento e 100 anos de
desenvolvimento de processos, as enzimas para hidrólise enzimática somente contam
com 50 anos de esforços sérios.
A hidrólise da celulose pelos fungos (CARLILE; WATKINSON, 1994; GRIFFIN,
1994; PAPAGIANNI, 2004) se dá através de enzimas conhecidas como celulases.
Assim, são produzidos açúcares, fonte básica de energia para os fungos, por
degradação de parte das fibras de celulose. As celulases podem diminuir o
comprimento e o diâmetro das fibras de celulose. Um ataque fúngico preliminar facilita a
abertura das fibras da madeira por métodos mecânicos (SACHS et al., 1990). A
produção de celulases pelos fungos é lenta, porém de custo potencialmente baixo.
Somente após a Segunda Guerra Mundial foi identificado que um dos mais
importantes organismos produtores de celulases era o Trichoderma reesei. Entretanto,
30
apenas na metade da década de 60 foi descoberto que preparações de enzimas
extracelulares poderiam ser obtidas preferencialmente por T. reesei (EERE, 2007).
O maior desafio para a tecnologia do etanol de segunda geração é a redução
dos custos de produção do complexo enzimático, cujo problema pode ser resolvido com
a disponibilidade de variantes genéticos, ou através da modificação do processo
fermentativo, ou ambos. Segundo Pozzan et al. (2008), uma linhagem que apresenta
potencial para hidrólise de materiais lignocelulósicos é a 9A02S1 de Penicillium
echinulatum, que foi obtida por mutagênese selecionada em placa de Petri. Custos e
rapidez são fatores fundamentais quando se trata de problemas dessa ordem de
grandeza. O programa norte-americano do álcool inclui o desenvolvimento de novos
fungos por engenharia genética para que a eficiência na produção de celulases seja
aumentada (EERE, 2007).
No caso do bagaço, que possui aproximadamente 40% de celulose, a hidrólise
pode ser realizada por enzimas produzidas por fungos específicos. Os organismos mais
efetivos na biodegradação dos materiais lignocelulósicos na natureza são os fungos de
decomposição branca e os de decomposição parda. A grande maioria desses
organismos pertence à classe Basidiomycota, sendo que ascomicetos e os fungos
mitospóricos normalmente são classificados como fungos de decomposição branca
(podem degradar lignina e polissacarídeos, porém em velocidades muito baixas)
(FERRAZ et al., 1991; FERRAZ; DURÁN, 1995; RODRIGUEZ et al., 1997).
Dentre estes decompositores, temos os basidiomicetos Phanerochaete
chrysosporium, Pleurotus sajor-caju, Pleurotus ostreatus e Pleurotus eryngii que são
considerados fungos de podridão branca e seu mecanismo de decomposição envolve
as enzimas lignina peroxidases (LiPs), as manganês peroxidases (MnPs) e as lacases
(BOGAN; LAMAR, 1996), o que, segundo Matheus e Okino (1998), os tornam capazes
de utilizar fontes complexas de carbono, sendo assim responsáveis pela degradação da
celulose, hemicelulose e lignina em moléculas menores até CO
2
e H
2
O. Outro fungo
bastante usado é o ascomiceto Aspergillus niger, que possui a capacidade de degradar
a celulose transformando-a através da ação do complexo celulolítico e hemicelulolítico
(AGUIAR; MENEZES, 2000; BETINI, 2006).
Tais fungos decompositores possuem enzimas que atuam de forma cooperativa,
causando hidrólise completa de celulose até glicose. As endoglucanases rompem a
31
molécula de celulose ao acaso e liberam fragmentos menores que servem de substrato
para as exo-glucanases. As exo-glucanases hidrolisam, pelas pontas, os fragmentos de
menor massa molecular e as β-glicosidases hidrolisam a celobiose até glicose
(FERRAZ, 2004).
Há séculos os fungos filamentosos vêm sendo utilizados pela humanidade na
produção de alimentos, bebidas e fármacos. Entretanto, a exploração do imenso
potencial desses microrganismos como produtores de uma vasta gama de enzimas
extracelulares de aplicação industrial (catalases, amilases, celulases, xilanases,
peroxidases, invertases, pectinases, queratinases, lipases e proteases, entre outras)
somente se tornou possível com o avanço do conhecimento de sua fisiologia,
bioquímica e genética. Torres et al. (2008) apontam para o potencial de aplicação
industrial de diversas espécies entre elas Aspergillus niger e Trichoderma reesei.
As etapas envolvidas na degradação microbiana da celulose ainda não estão
totalmente esclarecidas, mas já se sabe que são produzidas como um sistema multi-
enzimático, compreendendo basicamente três enzimas que agem sinergisticamente na
hidrólise da celulose: as endoglucanases, que clivam randomicamente o polímero de
celulose, alterando rapidamente seu grau de polimerização, as celobiohidrolases, que
hidrolisam o polímero nos terminais não-redutores, liberando celobiose, e as celobiases
(β-gicosidase), que são responsáveis pela clivagem de cadeias pequenas, tanto de
celooligossacarídeos à celobiose, até glicose, que poderá então ser utilizada nas
diversas vias metabólicas do microrganismo (GARCIA-CAMPAYO, 1990 apud
COELHO; NASCIMENTO, 2008).
A produção de celulases por fungos é amplamente disseminada na natureza,
incluindo uma grande variedade de espécies dos fungos do gênero Trichoderma,
Penicillium e Aspergillus. As celulases vêm sendo alvo freqüente de pesquisas desde a
década de 1950, quando Elwin Reese publicou diversos trabalhos utilizando o fungo
Trichoderma viride, que teve sua classificação alterada para T. reesei, em sua
homenagem. A cepa selvagem T. reesei QM6a, isolada em 1951 por Reese, produzia
um sistema de celulases ativo, capaz de hidrolisar a celulose cristalina completamente.
No entanto, a quantidade de celulases produzidas por essa cepa era insuficiente para o
uso industrial. Por isso, trabalhos envolvendo mutagênese foram desenvolvidos para a
32
obtenção de cepas com alta capacidade de produzir e excretar celulases (RYU;
MANDELS, 1980).
O fungo T. reesei é, provavelmente, o microrganismo cujo sistema celulolítico foi
mais investigado entre os fungos filamentosos, juntamente com Aspergillus, devido ao
seu grande potencial de aplicação industrial. Entretanto, as preparações enzimáticas
brutas provenientes deste fungo apresentam um desbalanceamento entre as atividades
FPase e CMCase com relação à atividade de β-glicosidase, já que a produção de β-
glicosidase nas culturas de Trichoderma é baixa. Assim sendo, as preparações de
celulases de Trichoderma devem ser suplementadas com β-glicosidases produzidas por
fungos do gênero Aspergillus (GHOSH; GHOSH, 1992).
De acordo com Priest (1983) citado por Pietrobon (2008), as enzimas
extracelulares podem ser induzidas, parcialmente induzidas ou constitutivas (enzima
produzida constantemente, sob qualquer condição fisiológica). Compostos de baixo
peso molecular são capazes de induzir a produção de uma determinada enzima. É o
caso da síntese do complexo enzimático da celulase por T. reesei que é induzida pela
presença de celulose. Enquanto a celobiose e celobiopentose são considerados
indutores pobres, a soforose (β-1,2 dissacarídeo de glicose), que apresenta uma
hidrólise mais lenta, é considerada um efetivo indutor do complexo enzimático das
celulases.
O sistema celulolítico da maioria das linhagens selvagens de T. reesei precisa
ser induzido pela presença do substrato, sendo também suscetível à repressão
catabólica em presença de fontes de carbono de fácil metabolização, como glicose.
Embora a celobiose seja citada como indutor de celulases, a soforose, um dissacarídeo
de glicose, mesmo presente em baixas concentrações, é capaz de induzir a produção
de celulases em níveis superiores com relação à indução observada pela celobiose. A
lactose, utilizada como substrato industrial para produção de celulases, foi citada como
indutora (MANDELS et al., 1962 apud BON et al., 2008).
Segundo Vitti (1988) citado por Aguiar e Menezes (2000), açúcares como
glicose, sacarose, maltose e arabinose não induzem a formação de celulase total por
Aspergillus fumigatus. Altos níveis da enzima celulolítica foram observados quando
celulose insolúvel foi usada como fonte de carbono.
33
A regulação por glicose da produção de enzimas extracelulares tem sido muito
estudada e é bem conhecido o efeito repressor deste açúcar na produção de várias
enzimas como celulases, amilases e invertase. Recentemente, a regulação por
nitrogênio passou a despertar interesse devido ao efeito negativo do sulfato de amônio
na produção de algumas enzimas como ligninases, peroxidases e particularmente
glicoamilase produzida por Aspergillus awamori (BON; WEBB, 1993 apud BON et al.,
2008). Fontes de nitrogênio chamadas de preferenciais, ricas ou de fácil metabolismo,
como o íon amônio, a glutamina, a asparagina e a mistura de aminoácidos e peptídeos
presentes na peptona e em outros concentrados proteicos comerciais, são repressoras
da produção de diversas enzimas. Ao contrário, prolina e uréia, ornitina e alantoína,
entre outros, chamadas de fatores não preferenciais, pobres ou de difícil metabolismo,
são fontes de nitrogênio não repressoras e, portanto, o seu uso favorece, em geral, a
produção de enzimas (ADRIO, 2003).
Segundo Lopes et al. (2008), que estudaram a produção de celulases por
Trichoderma em bagaço de cana-de-açúcar, a presença de glicose resultante da
hidrólise do bagaço pode inibir a atividade enzimática deste fungo. Isto explicaria em
parte, a constância do valor da atividade enzimática de 0,042 UI nos períodos de 72, 86
e 120 horas.
Flutuações nas atividades enzimáticas durante o crescimento de um fungo
podem ser devidas a diversos fatores como: variação do pH pode causar inativação de
algumas enzimas e estimular a secreção de outras; algumas formas de enzimas podem
sofrer ataque proteolítico preferencial; durante o crescimento do fungo estas enzimas
podem ser adsorvidas pelos substratos insolúveis e serem liberadas após a exaustão
da celulose (SILVA et al., 2007).
Indutores da síntese de celulases incluem celulose, derivados de celulose,
celobiose, soforose e lactose. A resposta das células fúngicas aos diferentes indutores
varia dependendo da concentração e tipo de indutor (GONG; TSAO, 1975 apud
AGUIAR, MENEZES, 2000).
Segundo Pandey (1992), uma cultura de A. niger pode produzir cerca de vinte
tipos diferentes de enzimas tais como celulases, xilanases, poligacturonase, α-
galactosidase, α-amilase, glucoamilase, β-glucosidase, protease ácida, e, a enzima
produzida depende do tipo de substrato da hidrólise.
34
Segundo Menezes et al. (1991) citados por Aguiar e Menezes (2000), a atividade
celulolítica de linhagens fúngicas, como A. niger, desenvolvidas em bagaço de cana-de-
açúcar foi superior às cultivadas em carboximetilcelulose e papel de filtro. Estes autores
sugeriram que estas linhagens produzem a fração exoglucanase, uma vez que o
bagaço é uma celulose in natura e não havia recebido qualquer tratamento químico, o
que exigiria ação da fração pré-hidrolítica da exoglucanase antes de ser hidrolisada
pelas outras frações endoglucanase e β-glicosidase.
Menezes et al. (2007) identificaram os açúcares produzidos na hidrólise de farelo
de arroz por Pleurotus sp. que foram glicose, frutose, celobiose, maltose, xilose e
arabinose. Estes autores mostraram o seguinte perfil do hidrolisado para a degradação
da matriz celulósica: avicelase (0,09 U/mL), carboximetilcelulase (0,07 U/mL), β-
glicosidase (0,62 U/mL), lacase (1,60 U/L), manganês peroxidase (16,32 U/L) e xilanase
(0,40 U/mL). Ainda, três classes de enzimas estão envolvidas na biodegradação da
celulose em glucossacarídeos. As celobiohidrolases, que liberam celobiose de celulose
microcristalina. As β-glicosidases que degradam os oligossacarídeos em glicose. Todas
estas classes de enzimas têm sido frequentemente identificadas na maioria dos fungos.
ABD-EL-NASSER et al. (1997) citados por Aguiar e Menezes (2000), testaram
Phanerochaete chrysosporium e Coriolus versicolor quanto à sua capacidade de
produzir xilanase e celulase em resíduos agrícolas: bagaço de cana-de-açúcar tratado e
não tratado, palha de trigo, espigas de milho, cascas de arroz e celulose em pó.
Observaram que bagaço de cana-de-açúcar tratado, palha de trigo e espigas de milho
promoveram maior indução enzimática.
Lacase e manganês peroxidase foram as principais enzimas oxidativas
encontradas nos hidrolisados do resíduo de laranja. A produção de lacase (56 U/g
substrato) foi maior no substrato com umidade inicial de 85%. A produção de manganês
peroxidase (6,5 U/g substrato), não foi afetada pela variação da umidade. O mesmo
ocorreu com as enzimas xilanase, endoglucanase, β-xilosidase e β-glicosidase.
Segundo estes autores, Pleurotus ssp. exibem baixas atividades xilanolíticas e
celulolíticas durante o estágio anamórfico de desenvolvimento, pois crescem,
principalmente, em substratos altamente lignificados como a madeira e serragem, além
de produzirem enzimas ligadas à polimerização da lignina (ALEXANDRINO et al.,
2007).
35
Alexandrino et al. (2007) observaram que o fungo Pleurotus utilizou ativamente
os açúcares redutores como fonte de carbono nos primeiros cinco dias, mas que após
este período, a quantidade de açúcares redutores permaneceu constante, sugerindo
que os açúcares estivessem sendo produzidos a partir da hidrólise dos polissacarídeos
presentes no substrato. Estes autores relataram que a produção das enzimas lacase e
manganês peroxidase depende do crescimento do fungo. Máxima atividade de lacase
(75 U/g) foi obtida em 15 dias de cultivo e de manganês peroxidase (6,8 U/g) em 30
dias de cultivo.
Machado et al. (2005) avaliaram a produção de enzimas lignocelulolíticas por
125 fungos basidiomicetos tropicais em estudo de descoloração do corante azul
brilhante de Remazol. Das linhagens pesquisadas, 96 apresentaram crescimento
micelial e descoloração superiores a uma cepa de Phanerochaete chrysosporium usada
como referência.
Em experimentos com linhagens do fungo Pleurotus sp., para produção de
enzimas utilizando como substrato bagaço de cana-de-açúcar, Silva et al. (2007)
observaram que nos sete primeiros dias de incubação não houve crescimento micelial
significativo. E somente, após o décimo segundo dia de incubação foi possível perceber
algum crescimento do fungo no substrato utilizado. Estes autores observaram também
que as atividades das enzimas celulolíticas (avicelase e carboximeticelulase) foram
baixas e presentes somente aos sessenta dias de incubação. As enzimas
lignocelulolíticas lacase e manganês peroxidase apresentaram máxima atividade aos
trinta dias e lignina peroxidase aos sessenta dias. No geral, as linhagens estudadas
apresentaram baixas atividades de todas as enzimas avaliadas.
O sistema enzimático mais promissor para o processo de sacarificação da
celulose cristalina é do Trichoderma (PERES; MELO, 1995). Trichoderma é um fungo
de crescimento rápido, daí a vantagem de sua utilização como agente de biocontrole
em larga escala.
Sanjar Kar et al. (2006), pesquisaram a produção de xilanases por T. reesei e,
citaram que este fungo é muito utilizado para a produção de enzimas por não se tratar
de um fungo patogênico e capaz de produzir elevados níveis de enzimas extracelulares,
além de ser facilmente cultivado. Segundo Grigorevski-Lima et al. (2008), o fungo
Trichoderma sp 676 tem a capacidade de crescer e produzir CMCase, FPase e β-
36
glicosidase utilizando bagaço de cana-de-açúcar como fonte de nutrientes. Neste
estudo, concluíram que o bagaço foi mais vantajoso que o farelo de trigo apresentando
resultados cinco vezes maiores em relação à produção de CMCase e duas vezes
maiores em relação à FPase. No entanto, a produção de CMCase e FPase foi maior no
bagaço sem tratamento quando comparado ao pré-tratado por explosão a vapor.
Rajarathnam e Bano (1987) citados por Silva et al. (2007) observaram que
espécies de Pleurotus não se desenvolveram bem sobre o bagaço de cana-de-açúcar
e, justificaram devido a incapacidade metabólica do fungo em utilizar a sacarose
presente no bagaço. Sturion (1994) citado por Silva (2007) relatou que a degradação da
lignina por Pleurotus sp. através da lacase é maior durante a fase de colonização do
substrato pelo micélio. A quebra da lignina permite a liberação de celulose e
hemicelulose nesta primeira fase de desenvolvimento fúngico, facilitando o acesso
enzimático biodegradativo das celulases e hemicelulases.
Segundo Bettio et al. (2008), que verificaram a importância da granulometria do
substrato para produção de celulases, o tamanho da partícula de celulose influencia a
produção das diferentes enzimas. As maiores médias de produção enzimática foram
observadas no cultivo com partículas de celulose com tamanho entre 106 μm e 150 μm.
Zheng et al. (2002) realizaram uma série de experimentos de hidrólise enzimática
com bagaço de cana-de-açúcar, utilizando meio aquoso em substituição à solução
tampão. Os resultados indicaram que quando o meio aquoso foi utilizado o valor de pH
do hidrolisado se manteve estável em 4,8. O rendimento em açúcares redutores foram
os mesmos obtidos nos experimentos quando uma solução tampão foi usada.
Concluíram que a produção de enzimas em meio aquoso sob condições diversas é
viável.
O valor de pH do meio de cultura é parâmetro de fundamental importância e
também deve ser otimizado, de forma a proporcionar um bom crescimento celular e
elevados rendimentos em produto, devendo-se levar em conta a preservação da
atividade biológica da enzima. Se a produção da enzima de interesse não for associada
ao crescimento celular, o valor do pH ótimo da etapa de crescimento pode ser diferente
daquele da etapa de produção do biocatalisador (FERRARA et al., 2006).
Kamida et al. (2005) pesquisaram a biodegradação de efluente têxtil por
Pleurotus sajor-caju com o objetivo de verificar o envolvimento das enzimas
37
lignocelulolíticas neste processo. Estes autores relataram que efluente têxtil misturado
com bagaço de cana-de-açúcar sofreu processo de total descoloração por este fungo
em 14 dias de incubação. As enzimas lacase e peroxidase tiveram comportamentos
similares, com pico de produção em 9 dias de incubação. A produção destas enzimas
ocorreu durante a fase exponencial de crescimento do fungo, após à ação das enzimas
celulolíticas, enquanto que a enzima manganês peroxidase apresentou pico de
produção no décimo segundo dia.
2.3.4 Fungos lignocelulolíticos
Fungos são organismos eucarióticos não fotossintéticos, possuindo parede
celular, com algumas exceções. Os fungos se reproduzem por meio de esporos.
Dentre os fungos xilófagos se destacam os basidiomicetos por apresentarem
significativa produção de enzimas oxidativas (peroxidases e lacases) durante o
crescimento micelial (fase vegetativa) e/ou na formação dos basidiomas.
Os basidiomicetos são capazes de degradar, em vários níveis, a madeira
provocando manchas, emboloramentos, rachaduras e outras formas de degradação.
Colônias de fungos proliferam com relativa facilidade sobre materiais
lignocelulolíticos. Estes microrganismos possuem um sistema que lhes permitem
extrair, deste tipo de substrato, princípios fundamentais para sua subsistência. De fato,
os fungos são microrganismos produtores de um sistema enzimático complexo, capaz
de degradar substâncias químicas de estrutura complexa (como as que compõem a
madeira), de modo a produzir moléculas mais simples e mais facilmente assimiláveis.
Existe um grande número de fungos capazes de degradar eficientemente alguns
constituintes da madeira. Em função dos mecanismos de degradação, estes fungos
podem ser classificados como: de decomposição branca e de decomposição parda
(BRITO et al., 2004).
Os fungos de decomposição parda geram um resíduo enriquecido em lignina,
pois são responsáveis, principalmente, pela degradação de polissacarídeos, enquanto
os de decomposição branca promovem a degradação de compostos lignocelulósicos ou
pela remoção simultânea de todos os componentes, ou pela remoção seletiva de lignina
e polioses, mantendo a celulose praticamente intacta (AGOSIN et al. 1990; FERRAZ et
al., 2000 apud PIETROBON, 2008).
38
O P. chrysosporium é um fungo de decomposição branca muito utilizado em
estudos de remediação de efluentes, em função da sua capacidade para produzir uma
grande diversidade de enzimas. Esse microrganismo tem sido utilizado na degradação
de muitas substâncias recalcitrantes, dificilmente degradadas em condições naturais
como compostos organoclorados, principalmente devido à produção de significativas
quantidades de lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase (MnP) (BRITO, 2004).
Segundo Alexandrino et al. (2007), Pleurotus ssp. formam um grupo de
cogumelos com alto valor nutricional, possuindo diversas propriedades terapêuticas e
aplicações biotecnológicas. São chamados de fungos de podridão branca, por
degradarem eficientemente a lignina, polímero fenólico recalcitrante encontrado nos
vegetais. Tal habilidade se deve ao fato de produzir diversas enzimas lignocelulolíticas,
principalmente lacases e manganês peroxidase.
Os fungos filamentosos são os organismos mais utilizados nos processos de
fermentação no estado sólido (FES), devido à sua grande capacidade de crescer na
ausência de água livre e apresentarem versatilidade em suas aplicações, além de sua
facilidade de adaptação e manipulação (COSTA, 1996 apud SPIER, 2005).
O crescimento do microrganismo para produção de enzimas de interesse está
diretamente relacionado à disponibilidade das substâncias para suas necessidades
nutricionais. Água, fontes de carbono e energia, nitrogênio e oxigênio são algumas das
necessidades comuns a todos os microrganismos. Os microrganismos necessitam
ainda de elementos minerais, tais como fósforo, enxofre, potássio, cálcio, magnésio,
ferro e, em alguns casos, cloro. Requerem, também, os chamados elementos traços
que desempenham importante papel como constituintes de enzimas e coenzimas. Estes
últimos incluem manganês, cobre, zinco, molibdênio, cromo, níquel, cobalto e boro, e
são, em geral, necessários em pequenas quantidades (JENNINGS, 1988 apud BON et
al., 2008).
O potencial para metabolizar fontes de carbono varia entre os microrganismos.
De modo geral, os compostos orgânicos da natureza, incluindo desde os chamados
compostos C1 (CO, CO
2
, formaldeído, metanol, metilamina) até as macromoléculas
complexas (amido, proteínas, lipídeos, celulose, hemicelulose, lignina, ácidos
nucleicos), podem ser utilizados como fonte de carbono e energia, desde que os
microrganismos possuam os sistemas enzimáticos extra e intracelulares e de transporte
39
adequados. As macromoléculas são inicialmente convertidas extracelularmente a
subunidades menores por enzimas hidrolíticas, sendo então, transportadas para o
interior da célula e metabolizadas em vias catabólicas e/ou anabólicas (MADIGAN et al.,
2000 apud BON et al., 2008).
A maioria dos estudos de biodegradação de madeira in vitro, por fungos de
podridão branca, foi realizada com P. chrysosporium. Abreu et al. (2007) citaram que
fungos decompositores de madeira necessitam, como pré-requesito para degradação
da lignina, baixa concentração de nitrogênio no substrato, uma vez que o nitrogênio é
um elemento crítico para microrganismos, pois participa da composição de proteínas,
ácidos nucleicos, aminoácidos, enzimas e coenzimas necessárias para o crescimento
celular e, consequentemente, para a densidade micelial.
Uma relação C:N de 103:1 em discos de eucalipto favoreceu maior
desenvolvimento do fungo basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus comparado ao fungo
Pleurotus ostreatus, que necessita de uma relação C:N menor (30:1) (ABREU et al.,
2007).
As características físico-químicas do meio de cultivo são de fundamental
importância, não apenas para o crescimento celular como também para o rendimento
em produto. Isto ocorre porque as células são capazes de responder aos estímulos
químicos e físicos do meio externo através de mecanismos bioquímicos que regulam a
expressão gênica e a fisiologia do microrganismo e, por extensão, seu desempenho na
formação do produto desejado. Esses mecanismos são acionados, dentre outros
fatores, por indutores, ativadores, inibidores e repressores (MADIGAN et al., 2000 apud
BON et al., 2008).
Pandey (1992) ressalta a importância do conteúdo adequado de umidade no
substrato, visto que a alta umidade resulta na diminuição da porosidade do substrato
dificultando a contaminação por bactérias. Ao contrário, baixos níveis de umidade levam
a um crescimento pobre e baixa acessibilidade ao nutriente.
Com relação ao crescimento de fungos filamentosos, este autor cita que altos
valores de atividade de água (aw) do meio favorecem a germinação de esporos ou o
crescimento micelial, enquanto valores baixos de aw estimulam a esporulação.
A temperatura exerce influência no crescimento micelial e consequente
frutificação dentro ou sobre a madeira. As exigências de temperatura variam de acordo
40
com as diferentes classes de fungos. A temperatura de 25°C não é adequada ao
crescimento micelial dos fungos. A velocidade do crescimento micelial é maior em razão
do aumento da temperatura (CASTRO et al., 2006).
Castro et al. (2006), que estudaram a degradação da madeira por basidiomicetos
em faixa de temperatura de 35 a 40°C, relataram a capacidade de adaptação desses
organismos a diferentes temperaturas. Estes autores constataram que 35°C foi a
temperatura ótima para o crescimento micelial, e que a 25°C não houve um bom
crescimento micelial para os fungos testados.
Rendimentos ótimos de α-amilase foram alcançados entre 30 e 37°C para
Aspergillus sp., 30°C para A. niger (COSTA, 1996 apud SPIER, 2005). A. niger cresce a
25°C até 37°C, mas pode crescer a 45°C, enquanto que A. terreus não cresce a 45°C,
sendo a temperatura ótima para seu crescimento 25°C. A espécie Chrysosporium
cresce de 25 a 40°C. (GRIFFIN, 1994). Espécies de Trichoderma crescem entre 25 e
30°C (FISHER, 2001).
Segundo Weiland (1988) citado por Silva et al. (2007), a maioria dos fungos
basidiomicetos cresce melhor em temperaturas entre 20 e 30°C e que o controle da
temperatura do desenvolvimento fúngico é fator chave na regulação da fermentação
semi-sólida para a otimização dos processos de deslignificação.
Dentre os fatores que podem influenciar a biodegradação de material
lignocelulósico estão a procedência, a espécie e a idade das madeiras utilizadas.
Madeiras velhas apresentam maior teor de extrativos que inibem o crescimento
microbiano e, consequentemente, a biodegradação deste tipo de material.
Tuor et al. (1995) citados por Abreu et al. (2007) relataram que bactérias podem
favorecer o crescimento de fungos decompositores. Neste caso, os fungos produzem
compostos de baixo peso molecular (compostos aromáticos) que são utilizados pelas
bactérias, enquanto estas auxiliam o fungo construindo túneis ou cavidades
promovendo a erosão do material lignocelulósico.
41
3 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho experimental foi desenvolvido no Setor de Açúcar e Álcool do
Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição (LAN) da Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ / USP).
Os experimentos foram realizados em três etapas:
etapa preliminar – delineamento em blocos utilizando seis fungos e dois
pré-tratamentos de bagaço; as linhagens dos fungos foram inoculadas no
bagaço pré-tratado por ácido e no bagaço pré-tratado por explosão a
vapor. Todos os frascos foram incubados a 28°C por 5, 10, 15 e 20 dias.
otimização das condições de hidrólise – delineamento fatorial 2² - os
fungos e pré-tratamento selecionados na etapa preliminar foram
submetidos a estudos da influência das variáveis temperatura e
concentração de ácido na variável concentração de açúcares redutores e
hexoses.
caracterização do bagaço – paralelamente à etapa de otimização, foram
realizados experimentos de caracterização do bagaço de cana-de-açúcar.
O bagaço pré-tratado por ácido sulfúrico (H
2
SO
4
, 0,5%) foi inoculado com
os fungos selecionados e incubados a 28°C por 5 dias, com a finalidade
de se observar como as fibras do bagaço se apresentariam após o
processo de hidrólise.
3.1 Microrganismos
Os fungos utilizados neste estudo foram selecionados entre as linhagens da
Coleção de Cultura do Setor de Açúcar e Álcool do Departamento de Agroindústria,
Alimentos e Nutrição (LAN) da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
(ESALQ/USP). As linhagens foram mantidas em meio sólido MEA (extrato de levedo -
2g/L; extrato de malte – 20g/L e ágar – 29g/L). Os fungos utilizados foram: Aspergillus
42
niger IZ-9, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus,
Pleurotus sajor-caju e Trichoderma reesei.
3.1.1 Preparação do inóculo
Uma suspensão de esporos/micélios foi obtida a partir de 30 mL de água
destilada adicionados a cada garrafa de vidro contendo as diferentes linhagens
cultivadas em meio MEA; com o auxílio de bastão de vidro foi homogeneizada a massa
esporogênica e micelial. Para os fungos T. reesei e A. niger foi obtido, por meio deste
procedimento, uma solução micelial e para os fungos P. chrysosporium, P. sajor-caju,
P. ostreatus e P. eryngii foi obtida uma solução de esporos.
A fração não utilizada da solução de esporos/micélios foi autoclavada e
descartada e, a cada ensaio foi preparada uma nova solução de esporos/micélio.
3.2 Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar
Para a seleção dos fungos foram utilizados, como substrato, dois tipos de pré-
tratamento do bagaço de cana-de-açúcar: bagaço moído e adicionado de ácido
sulfúrico (0,5%) e bagaço pré-tratado por explosão a vapor.
O bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor à temperatura de
200°C por 7 minutos, 15 kg de pressão e descompressão lenta, proveniente da Usina
Vale do Rosário - Orlândia/SP, foi gentilmente cedido pelos Profs. Dr. Adilson Roberto
Gonçalves e George J. M. Rocha (Escola Engenharia de Lorena - EEL/USP). Portanto,
o bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BEV) utilizado foi previamente tratado na
usina e fornecido para este trabalho.
O bagaço de cana-de-açúcar integral, proveniente de usinas da região de
Piracicaba, após secagem ao sol foi submetido à moagem em moinho de martelos,
MARCONI MA 090, no Laboratório de Micotoxinas do LAN, e pré-tratamento por ácido
sulfúrico (H
2
SO
4
0,5%). Portanto, nesta etapa do trabalho o bagaço foi moído e pré-
tratado com ácido (BMA).
43
3.3 Hidrólise do bagaço pelos fungos
Com o objetivo de selecionar o fungo capaz de hidrolisar o bagaço de cana-de-
açúcar pré-tratado e definir o tempo de crescimento para liberação máxima de açúcares
redutores foram realizados experimentos com o bagaço pré-tratado por explosão a
vapor (BEV) e bagaço moído pré-tratado com ácido (BMA) com posterior inoculação
dos fungos A. niger, P. chrysosporium, P. eryngii, P. ostreatus, P. sajor-caju e T. reesei,
em ambos os bagaços pré-tratados.
Frascos Erlenmeyer contendo 10 g de bagaço moído e 50 mL de ácido sulfúrico
(H
2
SO
4
) 0,5%, foram esterilizados em autoclave a 121ºC e 1 atm por 20 minutos. O
bagaço BMA foi neutralizado com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2%.
Os frascos contendo 5 g de bagaço BEV e 10 mL de água destilada foram
submetidos à autoclavagem a 121°C e 1 atm por 20 minutos.
No preparo das amostras houve somente o processo de esterilização em comum
para ambos os pré-tratamentos: explosão a vapor (BEV) e moído com ácido (BMA).
Após resfriamento, os frascos Erlenmeyer contendo o bagaço BMA e bagaço
BEV foram inoculados com 3 mL e 1,5 mL, respectivamente, de uma suspensão de
esporos/micélios (aproximadamente 10
7
esporos ou micélio/mL) e incubados a 28°C.
O experimento foi conduzido de forma a analisar os períodos de incubação: 5,
10, 15 e 20 dias. Após cada período foi obtido o licor resultante da hidrólise
(hidrolisado), adicionando a cada frasco, contendo bagaço BMA, 100 mL de água
destilada e, 65 mL a cada frasco com bagaço BEV. Os frascos foram mantidos sob
agitação por 30 minutos em temperatura ambiente, para extração dos açúcares. Em
seguida, a concentração de açúcares redutores (AR) nos hidrolisados foi determinada
pelo método do ácido 3,5- dinitrossalicílico (MILLER, 1959).
Para os experimentos com bagaço BEV foram utilizadas 5 g de bagaço, 1,5 mL
de inóculo e 65 mL de água destilada, isto é, metade do que foi utilizado para bagaço
BMA. Este procedimento foi necessário para manter a mesma proporção de inóculo e
água visto que a quantidade disponível de bagaço BEV era menor que a quantidade de
bagaço moído.
Esta etapa preliminar foi conduzida a partir de um planejamento experimental em
quatro blocos (ensaios). Em cada bloco foi analisados o efeito das variáveis
44
independentes (substrato, fungo, tempo, substrato*fungo, substrato*tempo,
fungo*tempo, substrato*fungo*tempo) sobre a variável de resposta ou dependente (AR
= açúcares redutores). As análises estatísticas dos dados foram realizadas no
programa SAS – Statistical Analysis System (SAS INSTITUTE, 1990) utilizando o
procedimento GLM. Foram realizadas as análises de variância e como a interação das
variáveis independentes foi significativa, foram realizados os desdobramentos das
análises com aplicação do Teste de Tukey.
3.3.1 Otimização das condições de hidrólise
Nesta fase de otimização das condições de hidrólise, os fungos e pré-tratamento
selecionados na etapa preliminar foram submetidos a estudos da influência das
variáveis temperatura e concentração de ácido sobre a variável concentração de
açúcares redutores e hexoses.
Segundo Barros-Neto et al. (2003), o planejamento fatorial é utilizado para
analisar como determinados fatores influenciam determinadas respostas. Consiste em
selecionar um número fixo de níveis e para cada uma das variáveis requer a condução
de experimentos para as possíveis combinações dos níveis dos fatores. Dessa forma,
para n
1
níveis do fator 1, n
2
do fator 2 e, n
k
do fator k, o planejamento terá no mínimo n
1
x n
2
x . . .x n
k
experimentos e será chamado de fatorial n
1
x n
2
x...x n
k
. O planejamento
em que as variáveis são analisadas em dois níveis (superior + e inferior -) é o mais
simples e utilizado. O planejamento de dois níveis e k variáveis requer a condução de 2
x 2 x ...x 2 = 2
k
ensaios diferentes.
O planejamento fatorial foi a ferramenta utilizada para otimização das condições
de cultivo dos fungos selecionados na etapa preliminar de hidrólise do bagaço pré-
tratado. Para a avaliação foi aplicado um planejamento experimental fatorial do tipo 2
2
.
As faixas de trabalho utilizadas são as apresentadas na Tabela 2, compreendendo os
pontos inferior (-1), superior (+1) e axiais (+α e -α).
Nesta etapa foram avaliadas a influência das variáveis independentes,
concentração de H
2
SO
4
e temperatura, sobre as variáveis dependentes, concentração
de açúcares redutores (analisada pelo método do DNS) e concentração de açúcares
totais e hexoses (analisada por cromatografia líquida).
45
A faixa de temperatura utilizada variou de limite inferior em 28°C e limite superior
em 40°C (CASTRO et al., 2006; FISHER, 2001; GOMES, 1985; GRIFFIN, 1994). Com
relação à concentração de ácido, optou-se por não ultrapassar o limite superior de 1,2%
(GOMES, 1985), pois não se pretendia um processo de hidrólise ácida e sim um pré-
tratamento que possibilitasse a desestruturação do bagaço. Entenda-se por
desestruturação a abertura das fibras de lignina e celulose permitindo o acesso à
última.
Tabela 2- Faixas de estudo das variáveis independentes em análise no planejamento experimental
fatorial do tipo 2
2
Variável independente
Nível de variação
-1,41 -1 0 +1 +1,41
[H
2
SO
4
] (%) 0,1 0,26 0,65 1,04 1,2
Temperatura (°C)
28 29,8 34 38,3 40
A Tabela 3 apresenta o delineamento experimental aplicado. A avaliação dos
resultados foi feita pelo método de superfície de resposta e análise de regressão
múltipla, com o objetivo de avaliar o efeito de cada variável sobre o teor de açúcares
redutores produzidos e a concentração de hexoses (açúcares C6).
O ensaio foi efetuado em ordem aleatória, segundo o procedimento determinado
por Barros-Neto et al. (2003) e Rodrigues & Iemma (2005). Os aplicativos “Statistica
Release 5” e SAS (Statistical Analysis System) foram utilizados para o tratamento dos
dados.
46
Tabela 3- Valores codificados e configuração experimental para o estudo de otimização das condições de
hidrólise obtidas no planejamento fatorial do tipo 2
2
Ensaio Níveis das variáveis codificados Temperatura (°C) [ácido] (%, v/v)
1
-1 -1 29,8 0,260
2
+1 -1 38,3 0,260
3
-1 +1 29,8 1,04
4
+1 +1 38,3 1,04
5
-1,41 0 28,0 0,650
6
+1,41 0 40,0 0,650
7
0 -1,41 34,0 0,100
8
0 +1,41 34,0 1,20
9-12
0 0 34,0 0,650
A determinação das condições ótimas foi realizada através de técnicas de
planejamento fatorial e análise de superfícies de resposta. A análise dos resultados
através da ANOVA (análise de variância) permitiu a elaboração de um modelo
matemático quadrático para correlacionar as respostas desejadas em função dos
parâmetros estatisticamente significativos, gerando superfícies de resposta que
forneceram informações sobre as faixas mais adequadas.
Para cada ensaio do planejamento fatorial, frascos Erlenmeyer contendo 10 g de
bagaço moído e 50 mL de ácido sulfúrico foram autoclavados a 121°C e 1 atm por 20
minutos. Após resfriamento foram inoculados com 3 mL de uma suspensão de
esporos/micélios (aproximadamente 10
7
esporos ou micélios/mL) dos fungos
previamente selecionados na etapa anterior. A seguir, foram incubados em BOD –
Biochemical Oxygen Demand - (mod. TE-39) (TABELA 3).
3.3.2 Análise dos açúcares obtidos
Após diferentes condições de incubação o licor obtido foi analisado quanto a
concentração de açúcar (AR) através do método do ácido 3,5 – dinitrosalicílico, DNS
(MILLER, 1959).
47
Com o objetivo de identificar os açúcares presentes no licor resultante da
hidrólise do bagaço moído pelos fungos selecionados, e também quantificar estes
açúcares, utilizou-se o método da cromatografia líquida.
Amostras dos hidrolisados obtidos nos ensaios de otimização das condições de
hidrólise (item 3.3.2) foram transferidas para tubos Eppendorf e mantidas a - 20°C até a
análise.
No momento da análise as amostras, após descongelamento, foram
centrifugadas por 10 minutos a 10.000 rpm, em seguida procedeu-se a quantificação do
conteúdo de monossacarídeos via HPAEC-PAD - (High Performance Anion Exchange
Chromatography with Pulsed Amperometric Detection), ajustando o equipamento de
acordo com Bragatto (2007).
As curvas de concentração para cada monossacarídeo foram construídas de
acordo com o perfil cromatográfico das amostras com os referidos padrões: D-Fucose,
D-Arabinose, D-Galactose, D-Glicose, D-Xilose, todos da Sigma
®
. As quantificações
foram realizadas com o auxílio do equipamento ICS 2500, HPLC Dionex® equipado
com DS50 gradiente; detector amperométrico ED50 com eletrodo de ouro e um
amostrador automático AS50. O eluente de arraste utilizado foi 4 mM de NaOH e o
eluente de limpeza foi de 200 mM de NaOH, com fluxo de 1 mL.min
-1
, pressão no
sistema de aproximadamente 1500 psi. As amostras foram injetadas com volume de 25
μL determinado pelo loop de amostragem. A coluna utilizada foi a de troca aniônica
Dionex® CarboPac PA1 (4 x 250 mm) com coluna-guarda CarboPac PA1 (4 x 50 mm),
e o detector amperométrico associado ao eletrodo de ouro foi ajustado com os
seguintes potenciais: +100 mV (0 a 200 ms), +100 mV de integração (200 a 400 ms), -
2000 mV (410 a 420 ms), +600 mV (430 ms) e -100 mV (440 a 500 ms) (BRAGATTO,
2007).
3.4 Caracterização do bagaço por microscopia de luz
Paralelamente aos estudos de otimização das condições de hidrólise para os
fungos selecionados na etapa preliminar, foram conduzidos experimentos para
caracterização do bagaço pelo método de microscopia de luz.
48
Para caracterizar o bagaço de cana-de-açúcar foram analisados cortes
longitudinais e transversais do colmo da cana e bagaço pré-tratado com ácido e
hidrolisado pelos fungos T. reesei e P. chrysosporium.
3.4.1 Análises do colmo da cana-de-açúcar por microscopia de luz
Amostras do colmo de cana-de-açúcar em cortes longitudinais e transversais
foram analisadas após o preparo de lâminas histológicas com o objetivo de avaliar os
feixes condutores (xilema e floema), com constituição básica de lignina e celulose,
respectivamente.
Cortes do colmo foram realizados com navalha e transferidos para uma solução
de ácido acético glacial e peróxido de hidrogênio 1:1 e mantidos em estufa a 60°C por
48 horas para alvejar, isto é, retirada dos pigmentos vegetais. O material foi lavado
abundantemente com água destilada, e corado com Astrablau (Azul de Astra e Fucsina
Básica (1:1) por 3 minutos. As lâminas histológicas semi-permanentes foram
preparadas com glicerina e seladas com esmalte incolor. As lâminas histológicas foram
analisadas em microscópio de luz (ZEISS-JENEMED2) aumento de 10 vezes, com as
imagens capturadas na mesma escala micrométrica com câmera SAMSUNG (SDC-
313) no Laboratório de Morfogênese e Biologia Reprodutiva de Plantas, Depto. de
Ciências Biológicas da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.
3.4.2 Hidrólise do bagaço
Frascos Erlenmeyers contendo 10 g de bagaço de cana-de-açúcar e 50 mL de
H
2
SO
4
(0,5%) após autoclavagem a 121ºC e 1 atm por 20 minutos foram inoculados
com uma suspensão micelial do fungo T. reesei ou com suspensão de esporos de P.
chrysosporium. Após 5 dias de incubação a 28°C foram retiradas alíquotas contendo
um grama de bagaço hidrolisado para as análises de microscopia.
3.4.3 Preparação das amostras para microscopia
Às alíquotas de 1 grama de bagaço hidrolisado foi adicionada uma solução
contendo ácido acético glacial (98%) e peróxido de hidrogênio (98%) na proporção de
49
1:1 até a total imersão da amostra. Esta preparação foi transferida para estufa a 60°C e
incubada por 48 horas para dissociação do material. Após o período de dissociação as
amostras foram submetidas a sucessivas lavagens com água destilada em papel filtro
Whatman nº1 até total retirada da solução de ácido acético e peróxido de hidrogênio. As
alíquotas foram recolhidas do papel filtro com espátula e mantidas em água destilada
sob refrigeração para posterior processo de coloração.
3.4.4 Coloração e confecção de lâminas histológicas
Para a coloração das amostras foram utilizados os corantes Azul de Astra (1%)
para corar celulose e Safranina (1%) para corar lignina. Cada amostra foi corada com
Safranina por 2 minutos, e em seguida com Azul de Astra por 8 minutos. Entre os
processos a amostra foi lavada para retirada do excesso de corante.
As lâminas histológicas semi-permanentes foram montadas com uma pequena
quantidade da amostra corada, uma gota de glicerina, colocação da lamínula, e seladas
com esmalte incolor. As lâminas histológicas foram analisadas em microscópio de luz
(ZEISS-JENEMED2) aumento de 20 vezes, com as imagens capturadas na mesma
escala micrométrica com câmera SAMSUNG (SDC-313).
50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O bagaço de cana-de-açúcar utilizado neste trabalho foi submetido à moagem e
pré-tratamento ácido, sendo denominado BMA (bagaço moído pré-tratado por ácido) e
uma amostra foi pré-tratada por explosão a vapor (BEV) (Tabela 4). O pré-tratamento
por explosão a vapor é um procedimento realizado pelas usinas com o objetivo de
aumentar a digestibilidade do bagaço para alimentação de ruminantes. Estes bagaços
foram analisados por Pietrobon (2008) e por Rocha (2009).
Tabela 4- Composição do bagaço utilizado neste trabalho
Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Referência
BMA 54,55 26,75 10,44 PIETROBON, 2008
BEV 51,7 8,9 34,3 ROCHA, 2009
4.1 Hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado pelos fungos A. niger, P.
chrysosporium, Pleurotus eryngii, P. ostreatus, P. sajor-caju e T. reesei
O bagaço integral sem pré-tratamento (controle) apresentou concentração de
açúcares redutores (AR) de 0,01 g/L enquanto o bagaço moído pré-tratado por H
2
SO
4
(0,5%) (BMA) sem o cultivo com fungo (controle) liberou 13,42 g/L de AR.
Em diferentes períodos de cultivo dos fungos A. niger, P. chrysosporium, P.
eryngii, P. ostreatus, P. sajor-caju e T. reesei em BMA foram analisadas as
concentrações de açúcares resultantes. Após 5 dias de cultivo do fungo T. reesei em
bagaço BMA foi liberado 18,60 g AR/L (Tabela 5). Esta foi a maior concentração de
açúcares redutores, liberada por este fungo, em até 20 dias de cultivo, apesar de
estatisticamente os valores obtidos para 5, 15 e 20 dias não apresentarem diferença
estatística significativa (Figura 1). Por outro lado, o cultivo com P. chrysosporium liberou
15,33 g/L, em 5 dias, o que estatisticamente não difere, em 5% de significância, do
valor observado para o T. reesei.
O cultivo dos fungos em bagaço BMA, após 10, 15 e 20 dias de cultivo, não
apresentaram diferença significativa, embora os fungos P. eryngii, P. ostreatus e P.
sajor-caju tenham apresentado bom desempenho aos 20 dias.
51
Tabela 5- Açúcares redutores (g/L) liberados na hidrólise do bagaço moído pré-tratado com H2SO4
(0,5%) (BMA) por fungos
Fungo
Tempo (dias)
5 10 15 20
A. niger
13,48 Ba 16,41 Aa 15,42 Aa 14,16 Aa
P. chrysosporium
15,33 ABab 12,61 Ab 12,89 Ab 17,94 Aa
P. eryngii
13,26 Bb 13,51 Ab 13,04 Ab 17,94 Aa
P. ostreatus
12,45 Ba 12,82 Aa 12,88 Aa 16,19 Aa
P. sajor-caju
12,81 Ba 12,80 Aa 13,92 Aa 16,19 Aa
T. reesei
18,60 Aa 13,90 Ab 14,55 Aab 14,34 Aab
Nota: Médias seguidas pelas mesmas letras, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não
diferem entre si de acordo com o Teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
0 5 10 15 20
0,0
8
10
12
14
16
18
20
A. niger P. ostreatus
P. eryngii T. reesei
P. chrysosporium P. sajor-caju
Açúcar redutor (g/L)
Tempo de cultivo (dias)
Figura 1- Açúcares redutores liberados durante cultivo de bagaço de cana moído e pré-tratado por ácido
(BMA) e incubados com fungos a 29ºC
Estudo semelhante foi realizado com o bagaço pré-tratado por explosão a vapor,
BEV. O controle, sem o cultivo com os fungos liberou 3,13 g/L de açúcares redutores e
52
o BEV cultivado pelos fungos A. niger, P. chrysosporium, P. eryngii, P. ostreatus, P.
sajor-caju e T. reesei (Figura 2) não apresentou diferença significativa com relação a
liberação de açúcar redutor, até 15 dias (Tabela 6). Entre os fungos analisados ocorreu
diferença significativa após 20 dias de cultivo, com o P. chrysosporium e P. ostreatus,
devido a diminuição de cerca de 50% do AR observado para cada fungo.
Mesmo apresentando desempenho inferior ao apresentado com o BMA (Tabela
5), aos 5 dias T. reesei apresentou a maior concentração de açúcares redutores (3,39
g/L) liberados, seguido pelo A. niger com 3,29 g/L.
O T. reesei apresentou diminuição na concentração dos açúcares a partir do 5º
dia, assim como na hidrólise de bagaço moído (Tabela 5). Enquanto o A. niger mostra
certa constância em seus resultados no bagaço pré-tratado por explosão a vapor
(Tabela 6).
Tabela 6- Açúcares redutores (g/L) liberados na hidrólise do bagaço pré-tratado por explosão a vapor
(BEV) por fungos
Fungo
Tempo (dias)
5 10 15 20
A. niger
3,29 Aa 3,19 Aa 3,25 Aa 3,45 Aa
P. chrysosporium
3,25 Aa 2,68 Aa 2,26 Aab 1,46 Cb
P. eryngii
3,15 Aa 2,95 Aa 2,73 Aa 3,02 Aa
P. ostreatus
3,28 Aa 2,84 Aa 2,72 Aab 1,67 BCb
P. sajor-caju
2,98 Aa 3,04 Aa 2,79 Aa 3,37 Aa
T. reesei
3,39 Aa 2,69 Aa 2,58 Aa 2,71 ABa
Nota: Médias seguidas pelas mesmas letras, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não
diferem entre si de acordo com o Teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
53
0 5 10 15 20
0,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
A. niger P. ostreatus
P. eryngii T. reesei
P. chrysosporium P. sajor-caju
Açúcar redutor (g/L)
Tempo de cultivo (dias)
Figura 2- Açúcares redutores liberados durante cultivo de bagaço pré-tratado por explosão a vapor com
fungos
As quantidades de açúcares redutores liberados durante cultivo do bagaço pré-
tratado por explosão a vapor foram 5 a 10 vezes menores que os obtidos na hidrólise
do bagaço BMA (Tabela 7).
Tabela 7- Açúcares redutores (g/L) liberados na hidrólise enzimática do bagaço moído pré-tratado por
ácido (BMA) e bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BEV) por fungos
Fungo
Tempo (dias)
5 10 15 20
BMA BEV BMA BEV BMA BEV BMA BEV
A. niger
13,48a 3,29 b 16,41a 3,19 b 15,42a 3,25 b 14,16a 3,45b
P. chrysosporium
15,33a 3,25 b 12,61a 2,68 b 12,89a 2,26 b 17,94a 1,46 b
P. eryngii
13,26a 3,15 b 13,51a 2,95 b 13,04a 2,73b 17,94a 3,02 b
P. ostreatus
12,45a 3,28 b 12,82a 2,84 b 12,88a 2,72 b 16,19a 1,67 b
P. sajor-caju
12,81a 2,98 b 12,80a 3,04 b 13,92a 2,79 b 16,19a 3,37 b
T. reesei
18,60a 3,39 b 13,90a 2,69 b 14,55a 2,58 b 14,34a 2,71 b
Nota: Médias seguidas pelas mesmas letras, minúsculas nas linhas, não diferem entre si de acordo com
o Teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
54
Figura 3- Açúcares redutores liberados na hidrólise de bagaço moído pré-tratado por ácido e bagaço pré-
tratado por explosão a vapor e incubados com fungos
No BEV, após 20 dias de cultivo, os fungos P. chrysosporium e P. ostreatus,
apresentaram um consumo maior de AR (Figura 2) diferentemente do BMA (Figura 1),
onde os fungos foram responsáveis pela liberação de AR. Isto pode ser explicado pelo
fato que o pré-tratamento por explosão a vapor torna os açúcares mais acessíveis aos
fungos. Desse modo, os açúcares disponíveis são utilizados pelos fungos, como fonte
de carbono, para o seu desenvolvimento. Enquanto no bagaço moído (BMA) há
necessidade dos fungos produzirem enzimas que degradem a celulose para obtenção
dos nutrientes básicos para seu crescimento (ABREU et al., 2007; JENNINGS, 1988
apud BON et al., 2008; MADIGAN et al., 2000 apud BON et al., 2008); neste caso, o
tempo requerido é maior e isto favoreceu a . A inibição de enzimas pela presença de
glicose, resultante deste pré-tratamento, pode ser também a causa do baixo rendimento
observado (MANDELS et al., 1962 apud BON et al., 2008; PRIEST, 1983 apud
PIETROBON, 2008; VITTI, 1988 apud AGUIAR, MENEZES, 2000).
55
A partir dos resultados obtidos nesta etapa foi possível selecionar os fungos e o
tipo de pré-tratamento do bagaço que apresentaram melhor desempenho no processo
de hidrólise, isto é, maior concentração de açúcares redutores no menor tempo
analisado, que foram T. reesei e P. chrysosporium em 5 dias de cultivo em bagaço
moído e pré-tratado com ácido.
Como mencionado anteriormente, P. eryngii, P. ostreatus e P. sajor-caju
apresentaram resultados superiores de açúcares redutores aos 20 dias em bagaço
BMA. No entanto, para que o processo de hidrólise possa se tornar industrialmente
viável não poderá levar 20 dias para a liberação dos açúcares. Assim sendo, 5 dias foi o
tempo de incubação selecionado como mais adequado para a continuidade dos
experimentos.
4.2 Otimização das condições de hidrólise de BMA por T. reesei
A otimização das condições de hidrólise de bagaço moído pré-tratado por ácido
(BMA) e cultivado por linhagens de T. reesei ou P. chrysosporium por 5 dias, foi
realizada através de experimentos em um planejamento fatorial 2
2
. Nesta combinação
foram avaliadas as influências das variáveis independentes, concentração de ácido
(H
2
SO
4
, 0,1 a 1,2%, v/v) e temperatura (28 a 40ºC), sobre as variáveis dependentes,
concentração de açúcares redutores (pelo método do DNS) e hexoses (por
cromatografia líquida), resultando em 12 tratamentos.
As concentrações de açúcares redutores (AR) e hexoses obtidas após o cultivo
de T. reesei em BMA nos experimentos em planejamento fatorial estão apresentadas
na Tabela 8.
56
Tabela 8- Resultados do planejamento fatorial para liberação de açúcares redutores (AR) e hexoses
durante o cultivo de
T. reesei em bagaço de cana moído e pré-tratado por ácido (BMA)
Ensaio
Temperatura
(°C)
[H
2
SO
4
]
(%, v/v)
AR
(1)
(g/L)
Hexoses
(2)
(g/L)
1º 29,8 0,26 7,39 0,1330
2º 38,3 0,26 7,90 0,1507
3º 29,8 1,04 19,66 0,6790
4º 38,3 1,04 18,36 0,8096
5º 28 0,65 15,77 0,2704
6º 40 0,65 15,41 0,2620
7º 34 0,1 3,17 0,0832
8º 34 1,2 20,42 0,6189
9º 34 0,65 16,94 0,2975
10º 34 0,65 17,10 0,3797
11º 34 0,65 16,94 0,3218
12º 34 0,65 16,94 0,1953
Nota:
(1)
método do DNS (MILLER, 1959).
(2)
método da cromatografia líquida - HPAE-PAD (BRAGATTO, 2007).
A análise de variância do planejamento fatorial para T. reesei possibilitou a
obtenção de um modelo quadrático para a liberação de açúcares redutores e hexoses
em função da temperatura e da concentração de ácido na hidrólise do bagaço por T.
reesei.
O modelo codificado otimizado (Equação 1) para a liberação de açúcares
redutores foi validado pela análise de variância (ANOVA) (Tabelas 9 e 10). O
coeficiente de correlação obtido (R² = 0,99) e o teste F para a liberação de açúcares
redutores foram válidos a 95% de confiança.
Os dados experimentais ajustados pela equação 1 demonstram que as variáveis,
temperatura e concentração de ácido, afetaram a resposta, sendo que o termo linear da
concentração de ácido apresentou maior coeficiente absoluto (+47,4962).
57
AR = -55,4063 +3,0970T + 47,4962A - 0,0435T
2
– 17,7162A
2
– 0,2745TA (1)
Onde:
AR = açúcares redutores (g/L);
T = temperatura (°C);
A= concentração de ácido (%).
Tabela 9- Coeficientes de regressão para a resposta de açúcares redutores no planejamento fatorial para
T. reesei
Fatores
Coeficientes
de
Regressão
Erro
Padrão
t(6) p-valor
Limite de
coeficiente
-95%
Limite de
Coeficiente
+95%
Média -55,4063 8,524803 -6,4994 0,000632 -76,2657 -34,5468
Temp (L) 3,0970 0,488012 6,3464 0,000717 1,9030 4,2912
Temp (Q) -0,0435 0,007098 -6,1219 0,000868 -0,0608 -0,0261
Ácido (L) 47,4962 3,510714 13,5289 0,000010 38,9057 56,08866
Ácido (Q) -17,7162 0,844473 -20,9790 0,000001 -19,7826 -15,6499
Temp x Ácido -0,2745 0,097625 -2,8120 0,030677 -0,5134 -0,0356
R
2
= 0,99
Através desta análise, é possível observar que tanto o efeito da temperatura
quanto o efeito do ácido foram muito significativos na liberação de açúcares redutores
na hidrólise do bagaço por T. reesei (Tabela 10).
Tabela 10- ANOVA para a liberação de açúcares redutores no planejamento fatorial para T. reesei
Fonte de
variação
Graus de
Liberdade
Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
F
calculado
p-valor
Temperatura 3 4,972174 1,657391 15,82 0,0030**
Ácido 3 324,496623 108,165541 1032,70 <0,0001**
** muito significativo a 5% de significância
58
A análise da superfície de resposta e as curvas de entorno geradas (Figuras 4 e
5) indicam valores de ponto crítico, temperatura (32,19°C) e concentração de ácido
(1,09%), para um ponto estacionário máximo de liberação de açúcares redutores de
20,35 g/L.
Figura 4- Superfície de resposta para liberação de açúcares redutores por
T. reesei
59
Figura 5- Curvas de entorno para liberação de açúcares redutores por
T. reesei
Os resultados da liberação de hexoses também foram avaliados
estatisticamente, obtendo-se o modelo codificado em função da temperatura e da
concentração de ácido apresentado na Equação 2. Este foi validado pela análise de
variância (Tabelas 11 e 12), pelo coeficiente de correlação (R² = 0,86) e valores de F.
Com o modelo codificado validado pela ANOVA foi possível se obter a superfície de
resposta e curvas de entorno (Figuras 6 e 7).
HEX = 1,4437 – 0,0743T – 0,4785A + 0,0009T
2
+ 0,3968A
2
+ 0,0174TA (2)
Onde:
HEX = açúcares redutores (g/L);
T = temperatura (°C);
A= concentração de ácido (%).
60
Tabela 11- Coeficientes de regressão para a resposta de hexoses no planejamento fatorial para T. reesei
Fatores
Coeficientes
de
Regressão
Erro
Padrão
t(6) p-valor
Limite de
coeficiente
-95%
Limite de
Coeficiente
+95%
Média 1,443707 3,066365 0,470820 0,654398 -6,05942 8,946830
Temp (L) -0,74344 0,175537 -0,423521 0,686677 -0,50387 0,355181
Temp (Q) 0,000987 0,002553 0,386370 0,712553 -0,00526 0,007234
Ácido (L) -0,478553 1,262801 -0,378962 0,717765 -3,56852 2,611409
Ácido (Q) 0,396828 0,303756 1,306404 0,239256 -0,34644 1,140093
Temp x Ácido 0,017421 0,035116 0,496115 0,637461 -0,06850 0,103346
R
2
= 0,86
Tabela 12- ANOVA para a liberação de hexoses no planejamento fatorial para
T. reesei
Fonte de
variação
Graus de
Liberdade
Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
F
calculado
p-valor
Temperatura 3 0,007835 0,002612 0,19 0,8981*
Ácido 3 0,508428 0,169476 12,47 0,0055**
*não significativo a 5% de significância
**muito significativo a 5% de significância
É possível observar que o efeito da temperatura não foi significativo a 95% de
confiança e, que o efeito do ácido foi muito significativo, a 95% de confiança, na
liberação de hexoses na hidrólise do bagaço por T. reesei.
A análise da superfície de resposta e as curvas de entorno (Figuras 6 e 7)
geradas pelos aplicativos indicam valores de ponto crítico, temperatura (40,18°C) e
concentração de ácido (-0,28%), para um ponto estacionário mínimo de liberação de
hexoses de 0,018 g/L.
61
Figura 6- Superfície de reposta para liberação de hexoses por T. reesei
Figura 7- Curvas de entorno para liberação de hexoses por T. reesei
62
4.3 Otimização das condições de hidrólise de BMA por P. chrysosporium
A Tabela 13 apresenta os resultados da hidrólise do bagaço moído por P.
chrysosporium no planejamento fatorial onde a temperatura e a concentração de ácido
influenciaram o desempenho do fungo neste processo.
Tabela 13- Resultados do planejamento fatorial para liberação de açúcares redutores (AR) e hexoses
durante o cultivo de
P. chrysosporium em bagaço de cana moído e pré-tratado por ácido (BMA)
Ensaio
Temperatura
(°C)
[H
2
SO
4
]
(%)
AR
(1)
(g/L)
Hexoses
(2)
(g/L)
1º 29,8 0,26 7,66 0,1011
2º 38,3 0,26 7,70 0,1314
3º 29,8 1,04 18,49 0,5283
4º 38,3 1,04 17,39 0,5647
5º 28 0,65 15,52 0,3506
6º 40 0,65 15,31 0,2378
7º 34 0,1 3,09 0,0619
8º 34 1,2 19,96 0,4299
9º 34 0,65 16,77 0,3623
10º 34 0,65 16,40 0,2122
11º 34 0,65 16,56 0,1929
12º 34 0,65 16,35 0,3666
Nota:
(1)
método do DNS (MILLER, 1959).
(2)
método da cromatografia líquida - HPAE-PAD (BRAGATTO, 2007).
Os resultados obtidos pelo método do DNS foram superiores comparados com
os obtidos por cromatografia (Tabela 13). Segundo Pietrobon (2008), a metodologia de
quantificação por cromatografia líquida apresenta maior acuidade quando comparada
com a metodologia por DNS, pois os açúcares são quantificados separadamente, e
também pelo fato do detector amperométrico ter sido programado para determinar
apenas carboidratos. O hidrolisado deve ser tratado para a retirada de compostos que
63
possam ser reduzidos para que não interfiram na análise por DNS. Segundo Rivers et
al. (1983) citados por Pietrobon (2008), compostos como 5-hidroximetilfurfural e furfural
podem fornecer grupos redutores reativos e, conseqüentemente, interferirem na
coloração do hidrolisado. Aldeídos de baixo peso molecular também fornecem grupos
redutores reativos que podem levar a erros quantitativos significativos (Rivers et al.,
1983 apud Pietrobon, 2008).
A utilização das técnicas de planejamento experimental foi uma ferramenta muito
valiosa, pois o reduzido número de ensaios, quando comparado aos delineamentos
tradicionais, permitiu não somente uma redução do tempo necessário para a condução
do estudo, como também uma redução no consumo de reagentes e solventes nas
análises. A qualidade dos dados gerados, por sua vez, possibilitou a obtenção de
conclusões mais completas, pois foi possível avaliar os efeitos e interações das
variáveis em estudo.
A partir dos resultados de açúcares redutores e hexoses observados durante
cultivo de P. chrysosporium em bagaço moído pré-tratado por ácido (BMA) (Tabela 13)
e utilizando os aplicativos “Statistic Release 5” e SAS, foram obtidos os valores dos
efeitos de cada parâmetro (temperatura e concentração de ácido) sobre a liberação de
açúcares redutores e hexoses durante a hidrólise. Realizou-se a análise da influência
dos parâmetros para as duas respostas.
Os dados do planejamento fatorial foram submetidos a uma análise de variância
(Tabela 14), análise de regressão e teste F (Tabela 15). Observa-se que o coeficiente
de correlação obtido (R² = 0,99) e o teste F para a liberação de açúcares redutores
foram válidos a 95% de confiança.
Os dados experimentais ajustados pela equação 3 demonstram que as variáveis,
temperatura e concentração de ácido, afetaram a resposta, sendo que o termo linear da
concentração de ácido apresentou maior coeficiente absoluto (+43,0501).
AR= - 48,6341 + 2,7758T + 43,0501A – 0,0397T
2
– 17,5812A
2
– 0,1749TA (3)
Onde:
AR = açúcares redutores (g/L);
T = temperatura (°C);
A= concentração de ácido (%).
64
Tabela 14- Coeficientes de regressão para a resposta de açúcares redutores no planejamento fatorial
para
P. chrysosporium
Fatores
Coeficientes
de
Regressão
Erro
Padrão
t(6) p-valor
Limite de
coeficiente
-95%
Limite de
Coeficiente
+95%
Média -48,6341 16,73497 -2,9061 0,027117 -89,5831 -7,6851
Temp (L) 2,7758 0,95801 2,8974 0,027426 0,4316 5,1200
Temp (Q) -0,0397 0,01393 -2,8499 0,029185 -0,0738 -0,0056
Ácido (L) 43,0501 6,89185 6,2465 0,000780 26,1864 59,9139
Ácido (Q) -17,5812 1,65778 -10,6053 0,000041 -21,6376 -13,5247
Temp x Ácido -0,1749 0,19165 -0,9129 0,396514 -0,6439 0,2940
R
2
= 0,99
Tabela 15- ANOVA para a liberação de açúcares redutores no planejamento fatorial para P.
chrysosporium.
Fonte de
variação
Graus de
Liberdade
Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
F
calculado
p-valor
Temperatura 3 3,854969 1,284990 3,18 0,1058**
Ácido 3 291,855878 97,285293 241,02 <0,0001**
**muito significativo a 5% de significância.
As Figuras 8 e 9 apresentam a superfície de resposta e curvas de entorno para
os resultados da influência das variáveis independentes, temperatura e concentração
de ácido, sobre a variável dependente – concentração de açúcares redutores.
A tendência das curvas mostra os valores de ponto crítico, temperatura (32,6°C)
e concentração de ácido (1,06%), para um ponto estacionário máximo de liberação de
açúcares redutores de 19,48 g/L.
65
Figura 8- Superfície de resposta para liberação de açúcares redutores por P. chrysosporium
Figura 9- Curvas de entorno para liberação de açúcares redutores por P. chrysosporium
66
Os resultados da liberação de hexoses também foram avaliados
estatisticamente, obtendo-se o modelo codificado em função da temperatura e da
concentração de ácido apresentado na equação 4.
Os dados experimentais ajustados pela equação 4 demonstram que as variáveis,
temperatura e concentração de ácido, afetaram a resposta, sendo que o termo linear da
concentração de ácido apresentou maior coeficiente absoluto (+ 0,429).
HEX = 1,4676 – 0,0836T + 0,4297A + 0,0011T
2
– 0,0214A
2
+0,0012TA (4)
Onde:
HEX = açúcares redutores (g/L);
T = temperatura (°C);
A= concentração de ácido (%).
Este modelo foi validado pela análise de variância, pelo coeficiente de correlação
(R² = 0,82) (Tabelas 16 e 17), e valores de F. Com o modelo codificado validado pela
ANOVA foi possível se obter a superfície de resposta e curvas de entorno (Figuras 10 e
11) para liberação de hexoses.
Tabela 16- Coeficientes de regressão para a resposta de hexoses no planejamento fatorial para
P.chrysospoirum
Fatores
Coeficientes
de
Regressão
Erro
Padrão
t(6) p-valor
Limite de
coeficiente
-95%
Limite de
Coeficiente
+95%
Média 1,467648 2,510980 0,584492 0,580186 -4,67650 7,611796
Temp (L) -0,083632 0,143744 -0,581814 0,581877 -0,43536 0,268096
Temp (Q) 0,001178 0,002091 0,563356 0,593605 -0,00394 0,006294
Ácido (L) 0,429783 1,034081 0,415619 0,692144 -2,10052 2,960087
Ácido (Q) -0,021462 0,248739 -0,086283 0,934049 -0,63011 0,587181
Temp x Ácido 0,001220 0,028755 0,042412 0,967547 -0,06914 0,071581
R
2
= 0,82
67
Tabela 17- ANOVA para a liberação de hexoses no planejamento fatorial para P.chrysosporium
Fonte de
variação
Graus de
Liberdade
Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
F
calculado
p-valor
Temperatura 3 0,003953 0,001318 0,14 0,9292*
Ácido 3 0,238797 0,079599 8,76 0,0130**
*não significativo a 5% de significância
**muito significativo a 5% de significância
As Figuras 10 e 11 apresentam a superfície de resposta e curvas de entorno
para os resultados da influência das variáveis independentes, temperatura e
concentração de ácido, sobre a variável dependente – concentração de hexoses.
A tendência das curvas mostra os valores de ponto crítico, temperatura (29,4°C)
e concentração de ácido (10,73%), para um ponto estacionário de sela para a liberação de
hexoses de 2,52 g/L.
Figura 10- Superfície de resposta para liberação de hexoses por
P. chrysosporium
68
Figura 11- Curvas de entorno para liberação de hexoses por
P. chrysosporium
4.4 Quantificação de açúcares por HPAE-PAD
A análise de açúcares por cromatografia líquida (HPAEC – PAD), com a
finalidade de identificar os tipos de açúcares presentes no hidrolisado e quantificar
estes açúcares liberados a partir da hidrólise do bagaço moído pré-tratado com H
2
SO
4
(0,5%) pelos fungos T. reesei e P. chrysosporium após 5 dias de incubação, identificou
os açúcares fucose, arabinose, galactose, glicose e xilose tanto nos experimentos com
T. reesei (Tabela 18) como para P. chrysosporium (Tabela 19).
Fucose, galactose e glicose são açúcares com seis carbonos (C6) em sua
molécula e denominados hexoses. Enquanto, arabinose e xilose são açúcares com
cinco carbonos (C5) em sua molécula e recebem nome de pentoses.
Analisando os resultados obtidos com o T. reesei (Tabela 18) se observa uma
maior concentração de pentoses no 3º ensaio (11,0070 g/L) e 8º ensaio (9,1976 g/L)
resultantes da hidrólise do bagaço moído a 29,8°C e H
2
SO
4
em concentração de 1,2%
e, hidrólise a 34°C e H
2
SO
4
a
1,2%, respectivamente.
69
Com referência às hexoses, os ensaios que resultaram em maior concentração
foram 3º, 4º e 8º. No 4º ensaio a temperatura utilizada foi 38,3°C e a concentração de
ácido 1,04%.
Verificou-se que o 3º ensaio (29,8°C/1,04%) resultou em uma maior
concentração de açúcares totais (11,6860 g/L), seguido do 8º ensaio (34°C/1,2%) com
concentração de 9,8165 g/L.
Tabela 18- Concentração de açúcares fucose, arabinose, galactose, glicose, xilose, pentoses (C5),
hexoses (C6) e açúcares totais em bagaço moído pré-tratado hidrolisado
por T. reesei em
tratamento fatorial 2²
Ensaio
(°C/[H
2
SO
4
])
Fucose
g/L
Arabinose
g/L
Galactose
g/L
Glicose
g/L
Xilose
g/L
Pentoses
g/L
Hexoses
g/L
Açúcares
Totais g/L
1º(29,8/0,26) 0,0089 1,0953 0,0909 0,0332 1,6589 2,7542 0,1330 2,8871
2º(38,3/0,26) 0,0063 1,0906 0,1073 0,0371 2,3706 3,4611 0,1507 3,6119
3º(29,8/1,04) 0,0152 1,5811 0,2855 0,3782 9,4259 11,0070 0,6790 11,6860
4º(38,3/1,04) 0,0104 1,0129 0,2694 0,5297 7,9378 8,9508 0,8096 9,7603
5º(28,0/0,65) 0,0074 0,7551 0,1503 0,1127 6,0442 6,7993 0,2704 7,0697
6º(40,0/0,65) 0,0099 1,0795 0,1575 0,0946 5,8479 6,9274 0,2620 7,1894
7º (34,0/0,1) 0,0062 1,0964 0,0575 0,0196 0,4174 1,5137 0,0832 1,5969
8º (34,0/1,2) 0,0115 1,3187 0,2415 0,3659 7,8789 9,1976 0,6189 9,8165
9º(34,0/0,65) 0,0078 0,8857 0,1646 0,1251 5,9320 6,8176 0,2975 7,1151
10º(34,0/0,65) 0,0093 1,2888 0,2050 0,1654 7,0121 8,3008 0,3797 8,6805
11º(34,0/0,65) 0,0092 0,8934 0,1737 0,1389 7,2439 8,1373 0,3218 8,4591
12º(34,0/0,65) nd 0,4858 0,1048 0,0905 5,0602 5,5460 0,1953 5,7412
Nos resultados obtidos por P. chrysosporium (Tabela 19) na hidrólise do bagaço
moído observou-se que as condições do 3º (29,8°C/1,04%) e 4º ensaios
(38,3°C/1,04%) contribuíram para as maiores concentrações de pentoses, 10,1501 e
70
10,0279 g/L, respectivamente. Para as hexoses com 0,5283, 0,5647 e 0,4299 g/L, 3º, 4°
e 8° ensaios, as mesmas condições que T. reesei.
Tabela 19- Concentração de açúcares fucose, arabinose, galactose, glicose, xilose, pentoses (C5),
hexoses (C6) e açúcares totais em bagaço moído pré-tratado (BMA) hidrolisado por
P.chrysosporium em tratamento fatorial 2².
Ensaio
(°C/[H
2
SO
4
]*
Fucose
g/L
Arabinose
g/L
Galactose
g/L
Glicose
g/L
Xilose
g/L
Pentoses
g/L
Hexoses
g/L
Açúcares Totais
g/L
1º(29,8/0,26) 0,0096 1,0743 0,0915 nd 1,3145 2,3888 0,1011 2,4899
2º(38,3/0,26) nd 0,7684 0,0980 0,0334 1,9176 2,6860 0,1314 2,8174
3º(29,8/1,04) 0,0112 1,2475 0,2287 0,2884 8,9026 10,1501 0,5283 10,6785
4º(38,3/1,04) 0,0099 1,3412 0,2370 0,3178 8,6867 10,0279 0,5647 10,5926
5º(28,0/0,65)
0,0070 1,1532 0,1918 0,1518 6,8441 7,9973 0,3506 8,3479
6º(40,0/0,65)
0,0072 0,8447 0,1408 0,0898 5,6258 6,4705 0,2378 6,7082
7º (34,0/0,1)
0,0055 0,8798 0,0463 0,0100 0,2044 1,0841 0,0619 1,1460
8º (34,0/1,2)
0,0060 0,8432 0,1747 0,2493 7,4076 8,2508 0,4299 8,6807
9º(34,0/0,65)
0,0089 1,1012 0,1972 0,1562 7,6240 8,7252 0,3623 9,0875
10º(34,0/0,65)
0,0081 0,5278 0,1154 0,0887 5,0941 5,6219 0,2122 5,8341
11º(34,0/0,65)
0,0073 0,4692 0,1068 0,0788 4,6844 5,1536 0,1929 5,3465
12º(34,0/0,65)
0,0146 1,1820 0,2009 0,1511 7,5313 8,7133 0,3666 9,0798
P. chrysosporium (Tabela 19) liberou menor concentração de hexose que T.
reesei (Tabela 18), nos mesmos ensaios considerados.
71
4.5 Caracterização do bagaço hidrolisado por microscopia de luz
Como mencionado anteriormente, este estudo, que visou a caracterização do
bagaço hidrolisado pelos fungos selecionados na etapa preliminar, foi conduzido
paralelamente à etapa de otimização das condições de hidrólise.
A finalidade desta etapa foi caracterizar o bagaço integral pré-tratado com ácido
e hidrolisado pelos fungos T. reesei e P. chrysosporium por meio da coloração das
fibras de celulose e lignina e observação de lâminas por microscopia de luz.
Optou-se por realizar este experimento utilizando os fungos selecionados na
etapa preliminar por um período de hidrólise de 5 dias, e em bagaço integral.
4.5.1 Colmo de cana-de-açúcar
Amostras de colmo de cana-de-açúcar em cortes longitudinais e transversais
foram analisadas após coloração das lâminas (Figuras 12 e 13).
A metodologia utilizada para o preparo das amostras possibilitou a dissociação
das fibras permitindo sua visualização, sem afetar a estrutura da fibra. Todas as
imagens obtidas mostram a coloração da celulose em azul e da lignina em vermelho.
Na Figura 12, observa-se a organização dos vasos condutores, floema e xilema,
como a celulose e a lignina estão dispostas nestes feixes em corte transversal do
colmo. O mesmo pode ser visto na Figura 13 em corte longitudinal.
72
Figura 12- Fotomicrografia evidenciando feixe vascular em corte transversal do colmo de cana-de-açúcar
após coloração com Azul de Astra (1%) e Safranina (1%). A celulose está em azul e a lignina
em vermelho. (Fl = floema; Fb = fibras; Lpx = lacunas de protoxilema e Mx = metaxilema).
Microscópio Zeiss, aumento 10x
Figura 13- Fotomicrografia evidenciando feixe vascular em corte longitudinal do colmo de cana-de-
açúcar após coloração com Azul de Astra (1%) e Safranina (1%). A celulose está colorida em
azul e a lignina em vermelho. (Fl = floema; Xl = xilema). Microscópio Zeiss, aumento 10x
10 µm
10 µm
Fl
Xl
73
4.5.2 Bagaço de cana-de-açúcar
Devido ao bagaço de cana-de-açúcar ser pouco estudado em relação a sua
constituição anatômica, não existe protocolo de preparação pré-estabelecido, para a
coloração e preparação de lâminas histológicas. Portanto, a metodologia foi adaptada
para este tipo de material e após vários testes de dissociação e coloração foram
definidos tempo e concentração de reagentes e corantes ideais.
O bagaço de cana-de-açúcar tratado com H
2
SO
4
foi submetido à coloração com
Azul de Astra e Safranina (Figuras 14, 15 e 16). É possível observar a presença de
celulose (azul) e lignina (vermelho) pela coloração das fibras.
Na Figura 14, é possível identificar, pelo método de coloração utilizado, um
pacote de fibras de lignina e de celulose.
Figura 14- Fotomicrografia evidenciando as fibras de celulose (azul) e lignina (vermelho) obtidas de
bagaço de cana-de-açúcar tratado com H
2
SO
4
após coloração com Azul de Astra (1%) e
Safranina (1%). (Cl=celulose; Lg= lignina). Microscópio Zeiss, aumento 20x
10 µm
Cl
Lg
74
A Figura 15 apresenta uma fibra de celulose e outra de lignina no bagaço pré-
tratado por H
2
SO
4
após coloração com os corantes Azul de Astra e Safranina.
Figura 15- Fotomicrografia evidenciando as fibras de celulose (azul) e lignina (vermelho) obtidas de
bagaço de cana-de-açúcar tratado com H
2
SO
4
após coloração com Azul de Astra (1%) e
Safranina (1%). (Cl=celulose; Lg= lignina). Microscópio Zeiss, aumento 20x
Na Figura 16 observa-se um pacote de fibras de celulose e lignina em lâmina
com bagaço pré-tratado e submetido a coloração com Azul de Astra e Safranina.
10 µm
Cl
Lg
75
Figura 16- Fotomicrografia evidenciando as fibras de celulose (azul) e lignina (vermelho) obtidas de
bagaço de cana-de-açúcar tratado com H
2
SO
4
após coloração com Azul de Astra (1%) e
Safranina (1%). (Cl=celulose; Lg= lignina). Microscópio Zeiss, aumento 20x
O bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H
2
SO
4
e hidrolisado por P.
chrysosporium após 5 dias foi submetido a coloração com Azul de Astra e Safranina
(Figuras 17, 18 e 19). As ligninases que este fungo produz em maior quantidade que as
celulases atacam a lignina num primeiro momento, tornando desse modo, as fibras de
celulose expostas ao ataque das celulases posteriormente. Sendo a lignina degradada
antes da celulose, portanto, solubilizada, é possível visualizar as fibras de celulose que
restaram.
A deslignificação seletiva é comprovada pela literatura, que afirma que este
fungo apresenta preferência pela degradação da lignina e o material adquire aspecto
fibroso-esbranquiçado em decorrência da decomposição de até 97% da lignina e
acúmulo de celulose (KIRK, FARRELL, 1987; LEONTIEVSKY et al., 2000; PALMIERI et
al., 2000).
Na Figura 17 é clara a presença de celulose e a ausência de lignina indicando
que o P. chrysosporium foi mais ativo que o T. reesei na degradação das fibras de
lignina no período de cinco dias de hidrólise do bagaço. A mesma condição pode ser
observada nas Figuras 18 e 19.
10 µm
Cl
Lg
76
Figura 17- Fotomicrografia evidenciando as fibras de celulose (azul) presentes no bagaço pré-tratado
com H
2
SO
4
e hidrolisado por P. chrysosporium após coloração com Azul de Astra (1%) e
Safranina (1%). (Cl=celulose). Microscópio Zeiss, aumento 20x
Figura 18- Fotomicrografia evidenciando as fibras de celulose (azul) presentes no bagaço pré-tratado
com H
2
SO
4
e hidrolisado por P. chrysosporium após coloração com Azul de Astra (1%) e
Safranina (1%). (Cl=celulose). Microscópio Zeiss, aumento 20x
10 µm
10 µm
Cl
Cl
77
Figura 19- Fotomicrografia evidenciando as fibras de celulose (azul) presentes no bagaço pré-tratado
com H
2
SO
4
e hidrolisado por P. chrysosporium após coloração com Azul de Astra (1%) e
Safranina (1%). (Cl=celulose). Microscópio Zeiss, aumento 20x
O bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H
2
SO
4
e hidrolisado por T. reesei
após 5 dias foi submetido a coloração com Azul de Astra e Safranina (Figuras 20, 21 e
22). Devido à coloração observa-se que a celulose do bagaço foi hidrolisada pelo fungo,
restando as fibras de lignina. O pré-tratamento ácido proporciona a exposição da
celulose ao ataque das celulases produzidas por este fungo.
Quando se diz que a celulose foi hidrolisada significa que as celulases do fungo
quebraram a molécula em unidades de glicose, que é uma molécula solúvel e passível
de fermentação.
Observa-se na Figura 20 a presença de fibras de lignina que restaram após a
hidrólise do bagaço pelo T. reesei. O mesmo ocorre nas Figuras 21 e 22.
10 µm
Cl
78
Figura 20- Fotomicrografia evidenciando as fibras de lignina (vermelho) presentes no bagaço pré-tratado
com H
2
SO
4
e hidrolisado por T. reesei após coloração com Azul de Astra (1%) e Safranina
(1%). (Lg=lignina). Microscópio Zeiss, aumento 20x
Figura 21- Fotomicrografia evidenciando as fibras de lignina (vermelho) presentes no bagaço pré-tratado
com H
2
SO
4
e hidrolisado por T. reesei após coloração com Azul de Astra (1%) e Safranina
(1%). (Lg=lignina). Microscópio Zeiss, aumento 20x
10 µm
10 µm
Lg
Lg
79
Figura 22- Fotomicrografia evidenciando as fibras de lignina (vermelho) presentes no bagaço pré-tratado
com H
2
SO
4
e hidrolisado por T. reesei após coloração com Azul de Astra (1%) e Safranina
(1%). (Lg=lignina). Microscópio Zeiss, aumento 20x
Visto que todas as lâminas preparadas foram submetidas ao mesmo processo de
coloração, pode-se inferir que a ausência de celulose ou lignina se deve, basicamente,
à hidrólise enzimática que estes fungos foram capazes de realizar no bagaço de cana-
de-açúcar.
10 µm
Lg
80
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos na etapa preliminar possibilitaram selecionar os fungos T.
reesei e P. chrysosporium, pois apresentaram melhor desempenho no processo de
hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar, isto é, maior concentração de açúcares
redutores em um período de 5 dias. Quanto ao pré-tratamento, o processo de hidrólise
pelos fungos apresentou resultados superiores em bagaço moído pré-tratado por ácido
em comparação com o bagaço pré-tratado por explosão a vapor.
A etapa de otimização das condições de hidrólise de 5 dias em bagaço moído
permitiu observar que temperatura e concentração de ácido afetaram a produção de
açúcares redutores e hexoses pelos fungos T. reesei e P. chrysosporium. A análise da
superfície de resposta indicou uma produção máxima de açúcares redutores de 20,35
g/L para T. reesei e, 19,48 g/L para P. chrysosporium. A produção máxima de hexoses
foi de 0,018 g/L e 2,52 g/L para T. reesei e P. chrysosporium, respectivamente.
Concentração de ácido apresentou maior influência nas respostas obtidas que
temperatura.
Quanto à caracterização do bagaço, P. chrysosporium apresentou maior
habilidade em degradar lignina antes da celulose no período de 5 dias de hidrólise, e T.
reesei apresentou grande habilidade em degradar celulose no mesmo período. Foi
possível, através do método de coloração e produção de lâminas histológicas
observadas por microscopia de luz, constatar a degradação da celulose e da lignina do
bagaço de cana-de-açúcar no processo de hidrólise enzimática.
81
REFERÊNCIAS
ABD-EL-NASSER, N. H.; HELMY, S. M.; EL GAMAL, A. A. Formation of enzymes by
biodegradation of agricultural wastes with rot fungi. Polymer Degradation and
Stability, London, v. 55, n.7, p. 249-255, 1997.
ABREU, L. D.; MARINO, R. H.; MESQUITA, J. B.; RIBEIRO, G. T. Degradação de
madeira de eucalyptus sp. Por basidiomicetos de podridão branca. Arquivos do
Instituto Biológico, São Paulo, v. 74, n. 4, p. 321-328, 2007. Disponível em:
<http://www.biologico.sp.gov.br/docs/arq/v74_4/abreu.pdf>. Acesso em: 19 jun. 2009.
ADRIO, J. L.; DEMAIN, A. L. Fungal biotechnology. International Microbiology,
Barcelona, v. 6, n. 3, p. 191-199, 2003.
AGOSIN, E.; BLANCHETTE, R. A.; SILVA, H.; LAPIERRE, C.; CEASE, K. R.; IBACH,E.;
RABAD, A. R.; MUGA, P. Characterization of palo podrido, a natural process of
delignification in wood. Applied and Environmental Microbiology, Saint Paul, v. 56, p.
65-74, 1990.
AGUIAR, C.L.; MENEZES, T.J.B. Produção de celulases e xilanase por Aspergillus
niger IZ-9 usando fermentação submersa sobre bagaço de cana-de-açúcar. Boletim
Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, Curitiba, v. 18, n. 1, p. 57-70,
2000.
ÁLCOOL - ETANOL BRASILEIRO. Cartilha BiodieselBr. Boletim 235. Disponível em:
<www.biodieselbr.com.> Acesso em: 27 ago. 2006.
ALEXANDRINO, A. M.; FARIA, H. G.; SOUZA, C. G. M.; PERALTA, R. M.
Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por
Pleurotus ostreatus (Jack:Fr). Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 27, n.
2, p. 364-368, 2007. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/cta/v27n2/25.pdf>. Acesso
em: 25 fev. 2009.
APPEZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. (Ed.) Anatomia
vegetal. 2. ed. Viçosa: UFV, 2006. 438 p.
BANERJEE R, PANDEY A. Bio-industrial application of sugarcane bagasse: A
technological perspective. International Sugar Journal, Glamorgan, v. 104, n.1238, p.
64-70, 2002.
BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I.S.; BRUNS, R.E. Como fazer experimentos –
pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria. 2. ed. Campinas: Ed. UNICAMP,
2003. 401p.
BETINI, J.H.A. Estudos comparativos de xilanases produzidas por três espécies
de Aspergilus visando a aplicação no biobranqueamento de polpa de celulose
para fabricação de papel. 2006. 114 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) –
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
82
BETTIO, M.; REIS, L.; MENEGOL, D.; MICHALSKI, E. Z.; CAMASSOLA, M.; DILLON,
A. J. P. Influência da granulometria da celulose na produção de xilanases e celulases
por Penicillium echinulatum. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA
ENZIMÁTICA, 8, 2008, Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de Janeiro: UFRJ, 2008,
p. 171.
BIOTECHBRASIL: Biotecnologia pode impulsionar a produção de álcool no Brasil.
2006. Disponível em: <http://www.biotechbrasil.bio.br/2006/08/10/a-biotecnologia-pode-
impulsionar-a-producao-de-alcool-no-brasil/>. Acesso em: 27 ago. 2006.
BJERRE, A.B., OLESEN, A.B., FERNQVIST, T., PLÖGER, A., SCHMIDT, A.S.,. Pretreatment of
wheat straw using combined wet oxidation and alkaline hydrolysis resulting in convertible cellulose and
hemicelluloses. Biotechnology Bioengeneering, New York, v. 49, p. 568-577,1996. Disponível em:
<http://www3.interscience.wiley.com/journal/71002965/abstract?cretry=1&sretry=0>. Acesso em: 16
jun. 2009.
BOGAN, B.W.; LAMAR, R.T. Polyclic aromatic hydrocarbon-degrading capabilities of
Phanerochaete laevis HHB-1625 and its extracellular ligninolytic enzymes. Applied and
Environmental Microbiology, Saint Paul, v. 62, n. 5, p. 1597-1603, May 1996.
BON, E. P. S.; GOTTSCHALK, L.M.F.; SÁ-PEREIRA, P.;ROSEIRO, J. C.; FERRARA,
M. A. Bioprocessos para produção de enzimas. In: BON, E. P. S.; FERRARA, M. A.;
CORVO, M. L. Enzimas em biotecnologia: produção, aplicações e mercado. Rio de
Janeiro: Interciência: UFRJ: CAPES: FAPERJ: FCT [Portugal], 2008, cap. 5, p. 95-122.
BON, E. P. S.; WEBB, C. Glucoamylase production and nitrogen nutrition in Aspergillus
awamori. Applied Biochemistry Biotechnology, Clifton, v. 39, n. 40, p. 349-369, 1993.
BRAGATTO, J. Avaliação da composição química da parede celular de plantas de
tabaco (Nicotiana tabacum) que superexpressam o gene ugdh de soja, que
codifica a enzima UDP-glicose desidrogenase (EC 1.1.1.22). 2007. 74 p. Dissertação
(Mestrado em Genética) - Escola Superior de Agricultura “Luiz e Queiroz”, Piracicaba,
2007.
BRITO, N. N.; ZAMORA, P. P.; OLIVEIRA NETO, A. L.; DE BATTISTI, A.;
PATERNIANI, J. E. S.; PELEGRINI, R. T. Utilização de fungos na remediação de
efluentes industriais. In: FÓRUM DE ESTUDOS CONTÁBEIS, 4, 2004. Rio Claro.
Resumos IV Fórum de estudos contábeis. Rio Claro: Faculdades Integradas
Claretianas, 2004. p. 144.
CANILHA, L.; CARVALHO, W.; ROCHA, G. J. M.; ALMEIDA E SILVA, J.B.; GIULIETTI, M.
Caracterização do bagaço de cana-de-açúcar in natura, extraído com etanol ou ciclohexano/etanol.
Disponível em: <http://www.abq.org.br/cbq/2007/trabalhos/11/11-570-713.htm>. Acesso em: 15 jul.
2009.
CARLILE, M.J., WATKINSON, S.C., The Fungi. 2
nd
ed., San Diego: Academic Press 1994,
428 p.
83
CASTRO, N. F.; ARAÚJO, J. N.; CORDEIRO, M. S. C.; SOUZA, W. S. B. Estudo do
ótimo de temperatura para crescimento de fungos xilófagos em meio de cultura. In:
REUNIÃO ANUAL DA SBPC, 58, 2006, Florianópolis. Disponível
em:<www.sbpcnet.org.br/livro/58ra/senior/resumos/resumo_3389.html>. Acesso em: 25
jan. 2009.
CELULOSE ONLINE. Introdução ao Processo de Obtenção da Celulose. Disponível em:
< www.celuloseonline.com.br > Acesso em: 20 mar. 2007.
COELHO, R. R. R.; NASCIMENTO, R. P. Seleção de actinomicetos produtores de
enzimas de interesse biotecnológico. In: BON, E. P. S.; FERRARA, M. A.; CORVO, M.
L. Enzimas em biotecnologia: produção, aplicações e mercado. Rio de Janeiro:
Interciência: UFRJ: CAPES: FAPERJ: FCT [Portugal], 2008, cap.4, p. 71-94.
COLETÂNEA. Estado-da-arte da produção de etanol a partir da madeira. Coletânea/
Tecnologia da produção de etanol a partir de materiais celulósicos. Brasília, 1981, v. 1
COSTA, J.A.V. Estudo da produção de amiloglucosidase por aspergillus níger nrrl
3122 em fermentação semi-sólida de farelo de arroz.1996. 203 p. Tese (Doutorado
em Engenharia de Alimentos)- Universidade Estadual de Campinas, Campinas,1996.
CUNHA, H. C. M. Caracterização do bagaço de cana pré-tratado por explosão a
vapor: identificação de inibidores potenciais de processos fermentativos e
enzimáticos. 1999. 101 p. Dissertação (Mestrado em Química)- Faculadade de
Engenharia Química de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 1999. Disponível
em:<http://bd.eel.usp.br/tde_busca/processaPesquisa.php?listaDetalhes%5B%5D=17&
processar=Processar>. Acesso em: 13 jul. 2009.
DOMINGUES, D. R., KLEMZ, J. G. D.; ALCÂNTARA, S. R. Hidrólise enzimática do
bagaço de cana-de-açúcar em meio semi-sólido: Comparação entre enzimas
comerciais e produzidas por FES. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA
ENZIMÁTICA. 8, 2008, Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de Janeiro: UFRJ, p.
189.
DRISSEN, R. E. T.; MAAS, R. H. W.; TRAMPER, J.; BEEFTINK, H. H.
Modelling ethanol production from cellulose: separate hydrolysis and fermentation
versus simultaneous saccarification and fermentation. Biocatalysis and
Biotransformation, London v. 27, n. 1, p. 27-35, 2009. Disponível
em:<http://www.informaworld.com/smpp/content~db=all?content=10.1080/10242420802
564358>. Acesso em: 23 abr. 2009.
EERE. Enzymatic Hydrolysis Technology Background. Disponível em:
<www1.eere.energy.gov/biomass/technology_background.html> Acesso em: 15 mar.
2007.
FENGEL, D.; WEGENER G., Wood: Chemistry, ultrastructure, reactions. Berlim, 1984.
613 p. Disponível em:< http://catalogue.nla.gov.au/Record/876242>. Acesso em: 16 jul.
2009.
84
FERRARA, M. A.; SEVERINO, N. M. B.;MANSURE, J. J.; MARTINS, A. S.; OLIVEIRA,
E. M. M.; SIANI, A. C.; PEREIRA, Jr., N. TORRES, F. A.; BON, E. P. S. Asparaginase
production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces
cerevisiae ASP3 gene. Enzyme Microbiology Technololgy, Atlanta, v. 39, n. 7, p.
1457-1463, 2006.
FERRAZ, A. Fungos decompositores de materiais lignocelulósicos. In: ESPOSITO, E. &
AZEVEDO, J.L. (Org.). Biologia de Fungos. Caxias do Sul: EDUCS 2004, p. 215-242.
FERRAZ, A.; BAEZA, J.; DURAN, N. Softwood Biodegradation by an ascomycete
Chrysonilia-Sitophila (TFB 27441-strain).
Letters in Applied Microbiology
, Oxford, v.
13, n.2, p. 82-86, 1991.
FERRAZ, A.; DURÁN, N. Lignin Degradation During Softwood Decaying by the
ascomycete Chrysonilia-Sitophila.
Biodegradation
, Dordrecht, v. 6, n. 4, p. 265-274,
1995.
FERRAZ, A.; PARRA, C.; FREER, J.; BAEZA, J.; RODRÍGUEZ, J. Caracterization of
White zones produced on Pinus radiata wood chips by Ganoderma australe and
Ceriporiopsis subvermispora. World Journal of Microbiology and Biotechnology,
Oxford, v. 16, p. 641-645, 2000.
FINGERUT, J. Caracterização do material lignocelulósico. 2006. Disponível em:
<http://www.inovacao.unicamp.br/etanol/report/Hidr%F3lise%20Fingerut%20Apresenta
%E7%E3o.pdf>. Acesso em: 13 jun. 2009.
FISHER, F. Micologia: fundamentos e diagnósticos. Rio de Janeiro: Ed. Revinter, 2001.
337 p.
GALBE, M.; ZACCHI, G. Pretreatment of materials for efficient bioethanol production. Advances
Biochemistry Engineering Biotechenology, v. 108, p. 41-65, 2007. Disponível em:
<resources.metapress.com/pdf-preview.axd?code=g06542h0h4q738q6&size=smal>. Acesso em:
25 maio 2009.(Não está ainda no texto).
GHOSH, B. K.; GHOSH, A. Degradation of cellulose by fungal cellulose. In:
WINKELMANN, G. (Ed.). Microbial Degradation of Natural Products, New York:
Wiley VCH, 1992. 421 p.
GLAZER, A. N.; NIKAIDO, H. Microbial biotechnology: fundamentals of applied
microbiology. New York: Ed. W.H. Freeman and Company, 1995. cap. 10, p.335-357
GOMES, R. J. H. C. Sacarificação da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar e
sua fermentação por Pachysolen tannophilus. 1985. 137 p. Tese (Doutorado em
Ciências dos Alimentos)- Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade de Campinas, Campinas, 1985, Disponível
em:<http://www.fea.unicamp.br/alimentarium/ver_documento.php?did=67>. Acesso
em 14 mar. 2009.
85
GRAF, A.; KOEHLER, T. Overview of Cellulose-Ethanol Production Technology. In.
_____________Oregon cellulose-ethanol study. An evaluation of the potential for
ethanol production in Oregon using cellulose-based feedstocks. 2000. Apêndice B, p.
57-60. Disponível em: <http://www.inovacao.unicamp.br/etanol/report/inte-hidrolise-
oregon.pdf> Acesso em: 22 mar. 2007.
GRIFFIN D.H. Fungal Physiology, 2
nd
ed., New York: Wiley-Liss, 1994, 458 p.
GRIGOREVSKI-LIMA, A. L.; OLIVEIRA, M. M. Q.; BON, E. P.S.; COELHO, R. R. R.
Avaliação do uso de resíduos agroindustriais para a produção de celulases pelo fungo
Trichoderma sp. 676. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA,
8, 2008, Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de Janeiro: UFRJ, 2008, p. 168.
JENNINGS, D. H. Inorganic nutrition. In: BERRY, D. R. (Ed.). Physiology of industrial
fungi. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1988, 285 p.
KAMIDA, H. M.; DURRANT, L. R.; MONTEIRO, R. T. R.; ARMAS, E. D. Biodegradação de
efluente têxtil por Pleurotus saqjor-caju. Química Nova, São Paulo, v. 28, n. 4, p. 629-632,
2005. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422005000400014>. Acesso em: 22 fev. 2009.
KAR, S.; MANDAL, A.; MOHAPATRA, P. K.; MONDAL, K. C.; PATI, B. R. Production of
cellulase-free xylanase by Trichoderma reesei SAF3. Brazilian Journal of
Microbiology, São Paulo, v. 37, n. 4, p. 462-464, 2006. Disponível em:
<www.scielo.br/pdf/bjm/v37n4/v37n4a11.pdf>. Acesso em: 16 jun. 2009.
KIRK, T. K.; FARRELL, R. L. Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin.
Annual Review of Microbiology, v.41, p.465-505, 1987. Disponível em:
<http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146%2Fannurev.mi.41.100187.002341>.
Acesso em: 24 maio 2009.
KLINKE, H.B., AHRING, B.K., SCHMIDT, A.S., THOMSEN, A.B. Characterization of
degradation products from alkaline wet oxidation of wheat straw. Bioresource
Technology, Essex, v. 82, p. 15–26, 2002. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6V2444TPKY53&_user
=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=9583
91436&_rerunOrigin=scholar.google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_
userid=10&md5=91680476facf8e38be39e1b0200c0be5>. Acesso em: 19 abr. 2009.
KNAUF, M.; MONIRUZZAMAN, M. Lignocellulosic biomass processing: A perspective.
International Sugar Journal, Glamorgan, v. 106, n. 1263, p. 147-150, 2004. Disponível
em: <www.genencor.com/.../international%20sugar%20journal%20(april%202004).pdf>. Acesso
em: 17 maio 2009.
KRAUS, J.; LOURO, R. RP.; ARDUIN, M.; ESTELITA, M. E. A Célula Vegetal. In.
APPEZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. (Ed.) Anatomia
Vegetal. 2. ed. Viçosa: UFV, 2006. p 32-67.
86
KUMAR, P.; BARRET, D. M.; DELWICHE, M. J.; STROEVE, P. Methods for
pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis biofuel production.
Industrial & Engineering Chemistry Research, Washington, v. 48, n. 8, p. 3713-3729,
2009. Disponível em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ie801542g>. Acesso em 19
jul. 2009.
LEONTIEVSKY, A. A.; MYASOEDOVA, N. M.; BASKUNOV, B. P.; EVANS, C. S.; GOLOVLEVA,
L. A.; Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by the white rot fungi Panus tigrinus and Coriolus
versicolor. Biodegradation, Dordrecht, v.11, p. 331-240, 2000. Disponível em:
<http://www.ingentaconnect.com/content/klu/biod/2000/00000011/00000005/00310458?crawler=tr
ue>. Acesso em: 16 abr. 2009.
LISSENS, G., KLINKE, H., VERSTRAETE, W., AHRING, B., THOMSEN, A.B. Wet oxidation of organic
household waste enriched with wheat straw for simultaneous saccharification and fermentation into ethanol.
Environment Technology, v. 25, p. 647–655, 2004. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6V244SN8V2B2&_user=10&_rdoc=1&_f
mt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=958394714&_rerunOrigin=google&_ac
ct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e90d9f564a2e13236e82439cc55f8773>.
Acesso em: 12 jul. 2009.
LOPES, D. O.; CELLIGOI, M. A. P. C.; VARGAS, L. H. M.; BUZATO, J. B. Produção de
celulase por Trichoderma da Amazônia T676 em fermentação em estado sólido de
bagaço de cana. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA, 8,
2008, Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de Janeiro: UFRJ, 2008, p. 168-169.
MACHADO, K. M. G., MATHEUS, D. R.; BONONI, V. L. R. Ligninolytic enzymes production
and remazol brilliant blue r decolorization by tropical brazilian basidiomycetes fungi. Brazilian
Journal of Microbiology, São Paulo, v. 36, p. 246-252, 2005. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S151783822005000300008&lng=pt&
nrm=iso>. Acesso em: 17 jun. 2009.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. (Eds.). Brock Biology of
Microrganisms. 10
th
ed., New Jersey: Pearson-Prentice Hall, 2003,1012 p.
MANDELS, M.; PARRISH, F. W.; REESE, E. T. Sophorose as an inducer of cellulose in
Trichoderma viride. Journal of Bacteriology, v. 83, n. 2, p. 400-408, 1962. Disponìvel
em: <http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=277742>. Acesso em:
03 jul. 2009.
MAPA - MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Relação das unidades produtoras
cadastradas no departamento de cana-de-açúcar e agroenergia. Disponível em:
http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/page/mapa/servicos/usinas_destilarias/usin
as_cadastradas/ups_15-05-2009_0.pdf. Acesso em: 28 maio 2009.
MARTÍN, C., GONZÁLEZ, Y., FERNÁNDEZ, T., THOMSEN, A.B.,. Investigation of
cellulose convertibility and ethanolic fermentation of sugarcane bagasse pretreated by
wet oxidation and steam explosion. Journal Chemistry Technology Biotechnology, v.
81, n. 10 p. 1669–1677, 2006. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1002/jctb.1586>.
Acesso em: 20 maio 2009.
87
MARTÍN, C., KLINKE, H., THOMSEN, A.B. Wet oxidation as a pretreatment method for
enhancing the enzymatic convertibility of sugarcane bagasse. Enzyme Microbiology
Technology, v. 40, p. 426–432. 2007a. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TG14KCXF8C5&_use
r=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=958
403473&_rerunOrigin=scholar.google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&
_userid=10&md5=fa37c95f8d2167a759f920a0e198f208>. Acesso em: 22 jul. 2009.
MARTIN, C.; ALMAZÁN, O.; MARCET, M.; JONSSON, L.J. A study of three strategies
for improving the fermentability of sugarcane bagasse hydrolysates for fuel ethanol
production. International Sugar Journal, Glamorgan, v. 109, n. 1267, p. 33-39, 2007.
MARTIN, C.; ALMAZÁN, O.; MARCET, M.; JONSSON, L.J. A study of three strategies
for improving the fermentability of sugarcane bagasse hydrolysates for fuel ethanol
production. International Sugar Journal, Glamorgan, v. 109, n. 1267, p. 33-39, 2007b.
MARTÍN, C.; ALRIKSSON, B.; SJÖDE, A.; NILVEBRANT N.; JÖNSSON, L. J.; Dilute
sulfuric acid pretreatment of agricultural and agro-industrial residues for ethanol
production. Applied Biochemistry and Biotechnology, Clifton, v. 136-140, p. 339-352,
2007c. Disponível em: <http://www.springerlink.com/content/d55715wrnj366088/>.
Acesso em: 18 abr. 2009.
MARTÍN, C.; THOMSEN, A. B. Wet oxidation pretreatment of lignocellulosic residues of
sugarcane, rice, cassava and peanuts for ethanol production. Journal of Chemical
Technology & Biotechnology, Oakland, v. 82, n. 2, p. 174-181, 2007d. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1002/jctb.1648>. Acesso em: 20 maio 2009.
MARTÍN, C.; THOMSEN, M. H.; HAUGGAARD-NIELSEN, H.; THOMSEN, A. B.; Wet oxidation
pretreatment, enzymatic hydrolysis and simultaneous saccarification and fermentation of clover-
ryegrass mixtures. Bioresource Technology, Essex, v. 99, p. 8777-8782, 2008. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleListURL&_method=list&_ArticleListID=9339561
09&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=856a59
88621de4d571629e8bc3a7f712>. Acesso em: 14 ago. 2009.
MATHEUS, D.R. & OKINO, L.K. Utilização de basidiomicetos em processos
biotecnológicos. In: BONONI, V.L.R. (Org) Zigomicetos, Basidiomicetos e
Deuteromicetos. Noções básicas de taxonomia e aplicações biotecnológicas. 2ª ed.
São Paulo: Instituto de Botânica, Secretaria de Estado do Meio Ambiente, cap. 4, p. 69 -139,
1998.
MENEZES, C. R.; SILVA, I. S.; INÁCIO, K. R.; FARIA, A. F.; CARBONE, B. J. L.; DURRANT,
L.R. Geração de açúcares fermentáveis para a indústria de etanol através da hidrólise enzimática
provinda de Pleurotus sp BCCB068 em matriz de celulose. Disponível em:
<http://www.cori.unicamp.br/centenario2008/2007/completos/a37%20%20geracao%20de%20acuca
res%20fermentaveis%20para%20a%20industria%20de%20etanol.pdf>. Acesso em: 22 abr. 2009.
MENEZES, T. J. B., HENNIES, P. T. Influência do pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar
com peróxido alcalino e hidróxido de sódio no sistema celulolítico de A. níger. Coletânea ITAL,
Campinas, v. 21, n. 2, p. 213-219, 1991.
88
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry, Washington, v 31, p. 426-428, 1959.
MORAIS, L.C.; CAMPANA FILHO, S.P. Carboximetilação de Polpas de Bagaço de
Cana-de-Açúcar e Caracterização dos Materiais Absorventes Obtidos. Polímeros, São
Carlos, vol. 9, n. 4, p. 46-51,1999.
NOGUEIRA, R. F. P. Síntese e degradação de composto-modelo de lignina por
Chrysonilia sitophila (T F B 27441). 1990. 93 p. Dissertação (Mestrado em Química).
Universidade Estadual de Campinas, Campinas.1990.
OLIVERIO, J. L.; HILST, A. G. P. DHR – Dedini Hidrólise Rápida (Dedini Rapid
Hydrolysis) – Revolutionary process for producing alcohol from sugarcane bagasse.
International Sugar Journal, Glamorgan, v. 106, n. 1263, p. 168-172, 2004.
OLIVIERI, R. R. B.; OLIVEIRA, R., PROTECTOR, L.; GOTTSCHALK, L. M. F.; BOM, E.
P. S. Análise de materiais lignocelulósicos pré-tratados para a obtenção de açúcares
fermentáveis mediante hidrólise enzimática. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE
TECNOLOGIA ENZIMÁTICA, 8, 2008, Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de
Janeiro: UFRJ, 2008, p. 190-191.
PALMIERI G.; GIARDINA P; BIANCO C; SCALONI A; CAPASSO A; SANNIA, G.
Copper induction of laccase isoenzymes in the lignolytic fungus Pleurotus ostreatus.
Applied and Environmental Microbiology, Saint Paul, v. 66, p. 920-924, 2000.
Disponível em: <http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=91923>.
Acesso em: 11 mar. 2009.
PANDEY, A. Recent Process Development in Solid State Fermentation. Process
Biochemistry, Washington, v.27, p. 109-117, 1992.
PAPAGIANNI, M., Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelial
process. Biotecnology Advances, London, v. 22, p. 189-259, 2004.
PERES, E.; MELO, I. S.; Variabilidade entre isolados de Trichoderma harzianum. I –
Aspectos citológicos. Scientia Agricola, Piracicaba v. 52, n. 1, p. 56-59, 1995.
Disponível em: <www.scielo.br/pdf/sa/v52n1/09.pdf>. Acesso em: 17 jul. 2009.
PIETROBON, V. C. Hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com ácido e
álcali utilizando enzimas microbianas comerciais. 2008. 66 p. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia Agrícola) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2008.
PITARELO, A. P.; ALESSANDRE, T.; RAMOS, L. P. Efeito do ácido fosfórico sobre o
pré-tratamento a vapor do bagaço de cana-de-açúcar e sua suscetibilidade à hidrólise
enzimática. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA, 8, 2008,
Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de Janeiro: UFRJ, 2008, p. 230-231.
89
PRIEST, F. G. Enzime synthesis: regulation and process of secretion by
microorganisms. In: FOGARY, W. F. (Ed.). Microbial Enzymes and Biotechnology,
London: Academic Press, 1983, p. 319-366.
RAJARATHNAM, S.; BANO, Z. Pleurotus, Mushrooms. Part I – A morphology, life cicle
taxonomy, breeding and cultivation. Culture Collection and Research Center – Food
ScienceNutrition, Hsinchu, n. 26, p. 157-311, 1987. Disponível
em:<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3322683>. Acesso em: 23 jun. 2009.
RIVERS, D. B.; GRACHECK, S. J.; WOODFORD, L. C. Limitations of the DNS assay for
reducing sugars from Saccharified lignocellulosics. Biotechnology and
Bioengineering, New York, v. 26, p. 800-802,1983.
ROCHA, G. J. M. Metodologia analítica para bagaço e palha de cana. In: WORKSHOP
PROGRAMA BIOETANOL, 3, 2009. Anais Bioetanol. Brasília: Bioetanol, 2009. 1 CD-
ROM.
RODRIGUES, M.I.; LEMMA, A.F. Planejamento de experimentos e otimização de
processos: uma estratégia seqüencial de planejamentos. Campinas: Casa do Pão Ed,
2005. 325p.
RODRIGUEZ, J.; FERRAZ, A.; NOGUEIRA, R.F.; FERRER, I; ESPOSITO, E.; DURAN
N. Lignin biodegradation by the ascomycete Chrysonilia sitophila. Applied
Biochemistry and Biotechnology, Clifton, v. 62, n. 3, p. 233-42. 1997.
RODRIGUEZ-ZUÑIGA, U. F.; LEMO, V.; FARINAS, C. S.; BERTUCCI NETO, V.;
COURI, S. Produção de celulases por fermentação semi-sólida do bagaço de cana
submetido a diferentes pré-tratamentos. In: SEMINÁRIO BRASILEIRO DE
TECNOLOGIA ENZIMÁTICA, 8, 2008, Rio de Janeiro. Resumos Enzitec. Rio de
Janeiro: UFRJ, 2008, p. 175.
ROSSELL, C.E.V. O setor sucroalcooleiro e a produção de etanol. 2006. Disponível em:
<www.cori.unicamp.br/BrasilJapao3/Palestras/carlos_rossell.ppt>. Acesso em: 07 jan.
2009.
RYU, D. D. Y.; MANDELS, M. Cellulases: byosynthesis and applications. Enzyme
Microbial Technology, London, v. 2, n. 2, p. 91-102, 1980.
SACCHS, I.B.; LEATHAM, G.F.; MYERS, G.C.; WEGNER, T.H. Distinguishing characteristics of
biomechanical pulp, Tappi Journal, Norcross, v. 73, n. 9, p. 249-254, 1990, p. 249-254. Disponível em:
<http://www.fao.org/agris/search/display.do?f=./1991/v1703/US9104065.xml;US9104065>. Acesso em: 14
abr. 2009.
SAS INSTITUTE. SAS users guide: statistic. 6. ed. Cary: SAS Institute, 1990. 584 p.
SAVARD, J. Hydrolysis of wood. Drevar: Centre technique forestier tropical - CTFT,
1962. 69 p. (Publicação nº 3)
90
SCATENA, V. L.; SCREMIN-DIAS, E. Parênquima, Colênquima e Esclerênquima. In.
APPEZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. (Ed.) Anatomia
vegetal. 2 ed. Viçosa: UFV, 2006. p 109-119.
SEBRAE - O novo ciclo da cana: estudo sobre a competitividade do sistema
agroindustrial da cana-de-açúcar e prospecção de novos empreendimentos. Brasília:
Ed. IEL/NC, 2005. 344p.
SILVA, K. R. I.; DURRANT, L. R.; MENEZES, C. R. Produção de enzimas
lignocelulolíticas por fungos basidiomicetos de degradação branca cultivados em
bagaço de cana-de-açúcar através de fermentação semi-sólida. 2007. In: WORKSHOP
INTERNACIONAL BRASIL-JAPÃO EM BIOCOMBUSTÍVEL, MEIO AMBIENTE E
NOVOS PRODUTOS DA BIOMASSA, 5, 2007, Campinas, Disponível em:
<http://www.cori.unicamp.br/centenario2008/2007/completos/a21%20%20producao%20
de%20enzimas%20lignoceluloliticas%20por%20fungos.pdf>. Acesso em: 20 jun. 2009.
SPIER, M. R. Produção de enzimas amilolíticas fúngicas α-amilase e amiloglucosidase
por fermentação no estado sólido. 2005. 178 p. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de
Alimentos) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2005,. Disponível em: <
dspace.c3sl.ufpr.br/.../Dissertação%20de%20Mestrado%20%20Michele%20Rigon%20Spier.
pdf>. Acesso em: 18 mar. 2009.
STURION, G. L. Utilização da folha de bananeira como substrato para o cultivo de
cogumelos comestíveis (Pleurotus spp.). 1994. 147p. Dissertação (Mestrado em
Ciências dos Alimentos). Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade
de São Paulo. Piracicaba, 1994..
TEIXEIRA, C.G.; JARDINE, J.G.; BEISMAN, D.A. Utilização do sorgo sacarino como
matéria-prima complementar à cana-de-açúcar para obtenção de etanol em
microdestilaria. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 17, n. 3, p. 248-251,
1997.
TORGET, R.W.; KIM, J.S.; LEE, Y.Y. Fundamental aspects of dilute acid
hydrolysis/fractionation kinetics of hardwwood carbohydrates. 1. Cellulose Hydrolysis.
Industrial & Engineering Chemistry Research, Washington, v. 39, p. 2817-2825,
2000.
TUOR, U.; WINTERHALTER, K.; FIECHTER, A. Enzymes of white-rot-fungi involved in
lignin degradation and ecological determinants for wood decay. Journal of
Biotechnology. Amsterdam, v.41, n. 1, p. 1-17, 1995. Disponível em:
<linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/016816569500042O>. Acesso em: 14 abr. 2009.
UNICA - União da indústria de cana-de-açúcar. Disponível em:< http://www.unica.com.br/>.
Acesso em: 8 mar. 2009.
VARGA, E., SCHMIDT, A.S., RÉCZEY, K., THOMSEN, A.B., Pretreatment of corn
stover using wet oxidation to enhance enzymatic digestibility. Applied Biochemistry
Biotechnology, Clifton, v. 104, p. 37–50, 2003. Disponível em:
<http://www.springerlink.com/content/mk224004054l4x05/>. Acesso em: 24 jul. 2009.
91
VITTI, L. S. S. Condições de produção e atividade da celulase do fungo
Aspergillus SP e seus mutantes isolados de bagaço de cana. 1988. 108 p.
Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade
de São Paulo, Piracicaba,1988,
WEILAND, P. Principle of solid state fermentation. In: ZADRAZIL, F.; REINIGER, P. (Ed.). Treatment of
lignocellulosics with white-rot-fungi. Amsterdam :Elsevier Applied Science, p. 64-76, 1988. Disponível
em: <http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=19891348744>. Acesso em: 15 mar.
2009.
WOOD, T. M.; GARCÍA-CAMPAYO, V. Enzymology of cellulose degradation.
Biodegradation, Dordrecht, v. 1, n. 2-3, p. 147-161, 1990.
ZHENG, C.; LEI, Y.; YU, Q.; LUI, X.; HUAN, K. Enzymatic hydrolysis of waste sugarcane bagasse in
water media. Envirommental Technology, London, v. 23, p. 1009-1016, 2002. Disponível
em:<http://www.informaworld.com/smpp/content~db=all?content=10.1080/0959333230861839>.
Acesso em: 12 maio 2009.
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