( PDF ) Desenvolvimento de um sistema por imagem de fluorescência óptica para uso médico-odontológico

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE SÃO CARLOS

MARDOQUEU MARTINS DA COSTA

Desenvolvimento de um sistema por

imagem de fluorescência óptica para uso

médico-odontológico

São Carlos

2010

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MARDOQUEU MARTINS DA COSTA

Desenvolvimento de um sistema por imagem de fluorescência óptica para uso

médico-odontológico

São Carlos

2010

Dissertação apresentada a Escola de

Engenharia de São Carlos da Universidade

de São Paulo, para obtenção do Título de

Mestre em Engenharia Elétrica

Área de Concentração: Processamento de

Sinais e Instrumentação

Orientadora: Profa. Dra. Liliane Ventura

Folha de aprovação

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho principalmente aos meus pais e meus irmãos que

sempre me apoiaram durante o desenvolvimento deste trabalho. Sem vocês não

conseguiria chegar até aqui. Muito Obrigado a vocês.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Luis Gabriel da Costa e Ana Maria Martins da Costa, pelo apoio

incondicional, desde a graduação até o presente momento, em meu mestrado. Sei que sem

vocês não estaria aqui, e não seria a pessoa que sou hoje. Obrigado meus pais, por herdar

de vocês a paciência, e a persistência que um trabalho destes exige. Obrigado meus pais

por tudo o que já fizeram por mim e o que ainda irão fazer. Obrigado pelo amor que me

deram. Amo muito vocês.

Aos meus irmãos Micael e Miguel também pelo apoio que me deram. Obrigado por vocês

serem meus irmãos e estarem presentes em minha vida. Amo muito vocês.

A minha namorada, Adriana também pelo apoio e paciência durante toda a graduação e no

mestrado. Amo muito você minha querida.

Ao professor Vanderlei Bagnato, pelo apoio e confiança em meu trabalho. Por perceber meu

amadurecimento e perseverança durantes esses 5 anos de trabalho em conjunto.

A Cristina Kurachi por me orientar e pelos “puxões de orelha”, que às vezes preciso, desde

quando iniciei meus trabalhos no laboratório de biofotônica

A minha orientadora Liliane, pela gentileza que me fez, ao aceitar ser minha orientadora e

pela paciência que teve durante esta fase de minha vida.

A equipe da Dra. Ana Gabriela Salvio pelo apoio na realização dos experimentos no hospital

Amaral Carvalho. Obrigado Dra. Gabriela, Beatriz, Valentina.

Aos grandes companheiros do laboratório de biofotônica que me ajudaram diretamente e

indiretamente em meu trabalho. Tenho que agradecer muito a vocês, Natalia (“Vou ti

contar”), Carla (“Mobileti acelerada”), Everton (botinho), Dirceu (Boizão), Emery (Merezinho -

Grande companheiro), Rosane (Rô), Juliana (Ju), Gustavo (Gaúcho), Gustavo (Grilinho),

Sebastião (Tatu), Jeison (Magrelo), Lilian (Lili), Alessandra (Alê), Maristela (Mari), Fernando

(Florez), Paula (Paulinha), Ruy, Daniel Malta, Raquel, Jussaira e Dennis.

Ao pessoal do LIEPO que sempre me deram grande ajuda quando se tratava de eletrônica.

Obrigado João, Denis, Leandro, Zé e Daniel.

Ao pessoal do LAT que sempre forneceram matérias de eletrônica e me auxiliaram.

Obrigado Orlando, Ezequiel, Igor, Alezandre, Leila, Valter e Henrique.

Ao pessoal da oficina mecânica, que me ajudaram no desenvolvimento de peças. Obrigado

Evaldo, Leandro e Gilberto.

Ao pessoal da secretaria do grupo de óptica por estarem sempre dispostos a ajudar.

Obrigado Isabel, Bene e Juliano.

Ao pessoal da secretaria da pós-graduação da EESC por estarem sempre dispostos a

ajudar. Obrigado Jussara e Marisa.

Ao CNPq pelo suporte financeiro na forma de bolsa, sem esta não seria possível

desenvolver meu trabalho.

A FAPESP pelo suporte financeiro de projetos financiados no grupo de óptica, onde realizei

grande parte deste trabalho.

A MM Optics pelo suporte no desenvolvimento da parte mecânica deste projeto.

FELICIDADE REALISTA

A princípio bastaria ter saúde, dinheiro e amor, o que já é um pacote

louvável, mas nossos desejos são ainda mais complexos. Não basta que a gente

esteja sem febre: queremos, além de saúde, ser magérrimos, sarados, irresistíveis.

Dinheiro? Não basta termos para pagar o aluguel, a comida e o cinema: queremos a

piscina olímpica e uma temporada num SPA cinco estrelas.

E quanto ao amor? Ah, o amor... Não basta termos alguém com quem

podemos conversar, dividir uma pizza e fazer sexo de vez em quando. Isso é pensar

pequeno: queremos AMOR, todinho maiúsculo. Queremos estar visceralmente

apaixonados, queremos ser surpreendidos por declarações e presentes

inesperados, queremos jantar a luz de velas de segunda a domingo, queremos sexo

selvagem e diário, queremos ser felizes assim e não de outro jeito. É o que da ver

tanta televisão. Simplesmente esquecemos de tentar ser felizes de uma forma mais

realista. Ter um parceiro constante pode ou não ser sinal de felicidade. Você pode

ser feliz solteiro, feliz com uns romances ocasionais, feliz com um parceiro, feliz sem

nenhum. Não existe amor minúsculo, principalmente quando se trata de amor-

próprio.

Dinheiro é uma benção. Quem tem, precisa aproveitá-lo, gastá-lo, usufruí-lo.

Não perder tempo juntando, juntando, juntando. Apenas o suficiente para se sentir

seguro, mas não aprisionado. E se a gente tem pouco, e com este pouco que vai

tentar segurar a onda, buscando coisas que saiam de graça, como um pouco de

humor, um pouco de fé e um pouco de criatividade. Ser feliz de uma forma realista e

fazer o possível e aceitar o improvável. Fazer exercícios sem almejar passarelas,

trabalhar sem almejar o estrelado, amar sem almejar o eterno. Olhe para o relógio:

hora de acordar. É importante pensar-se ao extremo, buscar lá dentro o que nos

mobiliza, instiga e conduz, mas sem exigir-se desumanamente. A vida não é um

jogo onde só quem testa seus limites é que leva o prêmio. Não sejamos vítimas

ingênuas desta tal competitividade. Se a meta esta alta demais, reduza-a. Se você

não está de acordo com as regras, demita-se. Invente seu próprio jogo. Faça o que

for necessário para ser feliz. Mas não se esqueça que a felicidade e um sentimento

simples, você pode encontrá-la e deixá-la ir embora por não perceber sua

simplicidade. Ela transmite paz e não sentimentos fortes, que nos atormenta e

provoca inquietado no nosso coração. Isso pode ser alegria, paixão, entusiasmo,

mas não felicidade.

Mário Quintana

RESUMO

COSTA, M.M. (2010) Desenvolvimento de um sistema por imagem de

fluorescência óptica para uso médico-odontológico. 96f. Dissertação (Mestrado)

- Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos,

2010.

A técnica de fluorescência óptica tem sido aplicada em diversas áreas médicas,

como no acompanhamento da degradação de drogas e na detecção de câncer, por

apresentar alta sensibilidade, simplicidade e rapidez na obtenção de dados. A

avaliação não-invasiva e não-destrutiva é um grande atrativo que esta técnica

oferece para o diagnóstico clínico. Assim, o objetivo deste projeto consistiu no

desenvolvimento de um sistema de fluorescência óptica por imagem de campo

amplo e avaliação do sistema no monitoramento da fotodegradação da

Protoporfirina XI, utilizada na Terapia Fotodinâmica (TFD), e na visualização da

presença de microrganismos presentes na microbiota bucal. O sistema desenvolvido

é constituído de um sistema óptico, mecânico, eletrônico e de detecção. O sistema

óptico é composto por LEDs de alta intensidade, com emissão centrada em 405nm e

450nm e 3 filtros ópticos: 1. passa-banda: utilizado na excitação; 2. dicróico; e 3.

passa-alta: utilizados para excitação e emissão da fluorescência. O sistema

mecânico foi desenvolvido em alumínio, possuindo as funções de dissipação de

calor do sistema de iluminação e estrutural. O sistema eletrônico possui a função de

controle e fornecimento de energia ao sistema de iluminação. O sistema de

detecção é composto por uma câmera CCD e fotográfica, acoplada ao sistema de

fluorescência desenvolvido. Um dos principais fatores para obtenção de bons sinais

de fluorescência é a potência óptica obtida no sistema de iluminação, que neste

caso foi de 200 mW. Outro fator é o comprimento de onda da iluminação; neste

sistema foi obtida uma banda de iluminação muito eficaz entre 390 nm e 460 nm. O

sistema de filtros proporcionou um sinal de fluorescência bastante satisfatório, bem

como um bom contraste na visualização das imagens de fluorescência. Com este

sistema foi possível acompanhar a fotodegradação da Protoporfirina IX, em função

do tempo de iluminação durante a TFD. Proporcionou-se, assim, uma nova

ferramenta para o avanço na avaliação da dosimetria da TFD, podendo otimizar e

personalizar a TFD para cada paciente, já que o sistema desenvolvido permite a

visualização da presença do agente fotossensível na terapia. Outra contribuição

relevante do trabalho alcançada foi a visualização da presença de microrganismos

da microbiota bucal, já que estes são os grandes responsáveis pelas doenças

bucais como é o caso da cárie dental. Desta forma, conclui-se que foi possível

desenvolver um sistema para auxílio da dosimetria na TFD e na visualização de

microrganismos presentes na microbiota bucal. O sistema desenvolvido se mostrou

compacto, agregando iluminação e visualização, tornando-o num protótipo com

interface para uso clínico. O protótipo foi testado em pacientes para a visualização

da microbiota bucal, tratamento de pré-câncer de pele e de vulva.

Palavras-chave: Imagem de fluorescência, Fotodegradação, Protoporfirina IX,

Câncer de pele, Biofilme bucal

ABSTRACT

COSTA, M.M. (2010) Development of an Optical Fluorescence Imaging system

for medical use. 96f. Dissertação (Mestrado) – Escola de Engenharia de São

Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2010.

Optical fluorescence has been applied to several medical areas, as to monitor drug

degradation and cancer detection, due to its high sensitivity, simplicity and fast

response. Non-invasive and non-destructive assessment of tissues using this

technique is very attractive for clinical diagnosis. Hence, the aim of was the

development of an optical fluorescence wide-field imaging system, and the

evaluation of its performance on monitoring protoporphyrin IX (PpIX) during

Photodynamic Therapy (PDT), and one visualization of microrganisms present in oral

microbiota. The developed device is composed by optical, mechanical, electronic,

and detection systems. Optical system is composed by high-intensity light-emitting

diodes (LED), with emission centered at 405 nm and 450 nm, and 3 optical filters: a

bandpass filter for excitation; and set of dichroic and long wave pass filter, for

fluorescence excitation and emission. The mechanical system was built in aluminum

for structural and ilumination systems heat dissipation. The electronic system

provides the control of the illumination system. The detection system is composed by

a CCD and a conventional didgital camera, coupled to the developed device. One of

the main factors for good fluorescence signals is the achieved optical power – in our

case, it was of 200 mW. Another factor is excitation wavelength; for this system, a

very efficient illumination band was achieved between 390-460 nm. The optical filters

allowed a very satisfying fluorescence signal, with good contrast for fluorescence

images visualization. The developed system enabled the monitoring of PpIX

photobleaching as a function of illumination time during PDT. Therefore, a new tool to

improve PDT dosimetry is offered by the use this system, allowing a more

customized dosimetry each patient, since the device allows visualization of the

photosensitive agent during the therapy. Visualization of oral microrganisms was also

achieved, which was another relevant contribution of the developed instrumentation

because they are the main cause of oral diseases such as caries. Thus the

development of a system to both improve PDT dosimetry and oral microrganisms

visualization was achieved as a compact device, joining illumination and

visualization. These characteristics shows a good interface for clinical use. The

prototype was tested in patients for oral microbiota visualization, and skin/vulva pre-

cancer lesions treatment.

Keywords: Fluorescence imaging, Photobleaching, Protoporphyrin IX, Skin cancer,

Oral biofilm

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Sistema de imagens multiespectrais de fluorescência e

refletância ............................................................................... 26

Figura 2 - Sistema VELscope ................................................................. 27

Figura 3 - Sistema QLF .......................................................................... 28

Figura 4 - Diagrama simplificado de Jablonski mecanismo básico de

fluorescência ..........................................................................

Figura 5 - Esquema hipotético de níveis de energia mostrando os

processos de absorção e de fluorescência e os

correspondentes espectros .................................................... 30

Figura 6 - Espectros de absorção (A) e de emissão (B) de algumas

biomoléculas .......................................................................... 32

Figura 7 - Espectro da lâmpada de vapor de mercúrio .......................... 34

Figura 8 - Espectro da lâmpada de xenônio ........................................... 35

Figura 9 - Espectros das lâmpadas de mercúrio e de metal-halóide ..... 36

Figura 10 -

Espectros de emissão de LEDs comerciais ........................... 37

Figura 11 -

Esquema do arranjo típico de filtros utilizados para detecção

de fluorescência .....................................................................

Figura 12 -

Espectro de transmissão dos filtros ópticos utilizados em

fluorescência ..........................................................................

Figura 13 -

Espectro do LED ultravioleta EDEV-3LA1 ............................ 43

Figura 14 -

Dimensões do LED EDEV-3LA1 ........................................... 43

Figura 15 -

Espectro do LED azul LD W5AP-3V8A-35 ............................ 45

Figura 16 -

Dimensões do LED azul LD W5AP-3V8A-35 ......................... 45

Figura 17 -

Disposição dos filtros ópticos do sistema .............................. 47

Figura 18 -

Filtro passa-banda largura de banda de 65nm centrada em

420nm ....................................................................................

Figura 19 -

Espectro de transmissão do filtro passa-banda (420nm) ....... 48

Figura 20 -

Filtro dicróico – reflete a iluminação de 390nm 460nm e

transmite a banda de emissão de fluorescência da amostra . 49

Figura 21 -

Espectro de transmissão do filtro dicróico ............................. 49

Figura 22 -

Filtro anti-reflexo ..................................................................... 50

Figura 23 -

Espectro de transmissão do filtro anti-reflexo ........................ 51

Figura 24 -

Filtro passa-alto ..................................................................... 51

Figura 25 -

Espectro de transmissão do filtro passa-alto ........................ 52

Figura 26 -

Espectro de transmissão dos filtros utilizados ....................... 53

Figura 27 -

Esquema de lente retirado do catálogo da Polimer Optics .... 53

Figura 28 -

Esquema e desenhos do refletor ........................................... 54

Figura 29 -

Lente e refletor utilizados no sistema de iluminação .............. 54

Figura 30 -

Arranjo de lentes e refletor ..................................................... 55

Figura 31 -

Montagem da óptica em bancada .......................................... 56

Figura 32 -

Projeto mecânico do sistema ................................................. 57

Figura 33 -

Projeto do sistema final (mecânica e ótica) ............................ 58

Figura 34 -

Sistema de dissipação de calor .............................................. 59

Figura 35 -

Eletrônica desenvolvida para o sistema de fluorescência ..... 60

Figura 36 -

Caixa de controle do sistema de iluminação .......................... 61

Figura 37 -

Câmera CCD para aquisição de imagens .............................. 62

Figura 38 -

Câmera fotográfica SONY H50 .............................................. 62

Figura 39 -

Acoplamento da câmera com o sistema ................................ 63

Figura 40 -

Sistema principal .................................................................... 64

Figura 41 -

Sistema de fluorescência com aquisição de imagens ............ 65

Figura 42 -

LEDs utilizados para compor o espectro da lâmpada ............ 66

Figura 43 -

Espectro de transmissão do filtro utilizado no sistema de

iluminação .............................................................................. 66

Figura 44 -

Espectro obtido com a composição de dois LEDs. A – LEDs

com intensidades diferentes; B – LEDs com mesma

intensidade ............................................................................. 67

Figura 45 -

Região de interesse para sistemas de fluorescência ............ 67

Figura 46 -

Sistema de iluminação: (a) Vista frontal (b) Vista lateral; (c e

d) Vista superior; Diversas vistas da iluminação .................... 68

Figura 47 -

Medidor de potência óptica ................................................... 69

Figura 48 -

Imagem de fluorescência do Photogem (vermelho) e

Riboflavina (verde)................................................................. 70

Figura 49 -

Imagem de fluorescência de bactérias .................................. 71

Figura 50 -

Aparelho de tratamento de Queratose Actínica – Kerato PDT

................................................................................................ 73

Figura 51 -

Imagens de fotodegradação da PpIX em função do tempo –

Sem processamento .............................................................. 76

Figura 52 -

Imagens de fotodegradação da PpIX em função do tempo –

Com processamento .............................................................. 77

Figura 53 -

Gráfico de fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação ................................................................................ 78

Figura 54 -

Imagens de fluorescência – Antes do inicio do tratamento .... 79

Figura 55 -

Imagens de fluorescência – No inicio do tratamento – 0

minutos ................................................................................... 79

Figura 56 -

Imagens de fluorescência – No final do tratamento – 40

minutos ................................................................................... 80

Figura 57 -

Gráfico comparativo – Com e sem linha de base .................. 81

Figura 58 -

Sistema de tratamento do HPV .............................................. 84

Figura 59 -

Fotodegradação da PpIX – sem processamento ................... 86

Figura 60 -

Fotodegradação da PpIX – Imagens processadas ................ 87

Figura 61 -

Gráfico de fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação ............................................................................... 88

Figura 62 -

Dentes com colonização de bactérias ................................... 90

Figura 63 -

Língua com colonização de bactérias .................................... 90

Figura 64 -

Imagem de diferenciação de materiais através de

fluorescência – A- imagem com iluminação branca e B –

imagem de fluorescência ....................................................... 91

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Principais características do LED EDEV-3LA1 ....................................... 44

Tabela 2 – Principais características do LED azul LD W5AP-3V8A-35 .................... 46

Tabela 3 – Valores de potência óptica do sistema de iluminação ............................ 69

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 23

1.1 A FLUORESCÊNCIA DE TECIDOS BIOLÓGICOS ............................................ 28

1.2 IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA ...................................................................... 31

1.2.1 Iluminação utilizada em fluorescência ......................................................... 33

1.2.1.1 Lâmpadas ...................................................................................................... 34

1.2.1.2 LEDs .............................................................................................................. 36

1.2.2 Filtros utilizados em imagens de fluorescência .......................................... 37

1.3 APLICAÇÕES DE IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA ......................................... 40

2 OBJETIVO ............................................................................................................. 42

3 MATERIAL E MÉTODO ......................................................................................... 42

3.1 DESCRIÇÃO DO SISTEMA ................................................................................ 42

3.1.1 Óptica .............................................................................................................. 42

3.1.1.1 Sistema de Iluminação por LEDs .................................................................. 42

3.1.1.2 Filtros ............................................................................................................. 46

3.1.1.3 Lentes ............................................................................................................ 53

3.1.1.4 Montagem da óptica em bancada ................................................................. 56

3.1.2 Mecânica ......................................................................................................... 57

3.1.2.1 Parte estrutural .............................................................................................. 57

3.1.2.2 Dissipação ..................................................................................................... 58

3.1.3 Eletrônica ........................................................................................................ 59

3.1.3 Aquisição das imagens .................................................................................. 61

3.2 SISTEMA COMO UM TODO ............................................................................... 63

3.2.1 Sistema principal ............................................................................................ 63

3.2.2 Sistema principal com aquisição de imagens ............................................. 64

3.3 CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA .................................................................... 65

3.3.1 Iluminação ...................................................................................................... 65

3.3.2 Potência óptica .............................................................................................. 68

3.3.3 Teste do sistema de imagem ........................................................................ 70

4 RESULTADOS ...................................................................................................... 72

4.1 FOTODEGRADAÇÃO DA PROTOPORFIRINA IX-QUERATOSE ACTÍNICA .... 72

4.1.1 Material e método .......................................................................................... 72

4.1.2 Resultados e discussão ................................................................................ 75

4.1.3 Conclusão ...................................................................................................... 82

4.2 FOTODEGRADAÇÃO DA PROTOPORFIRINA IX – HPV .................................. 82

4.2.1 Material e método .......................................................................................... 82

4.2.2 Resultados e discussão ................................................................................ 85

4.2.3 Conclusão ...................................................................................................... 89

4.3 VISUALIZAÇÃO DE COLONIAS MICROBIANAS ORAIS .................................. 89

5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO .............................................................................. 91

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 93

1 INTRODUÇÃO

O câncer é geralmente definido como um crescimento irregular e

desordenado das células que têm o seu material genético modificado e que podem

sofrer mutações desencadeadas por processos externos como substâncias

químicas, tabagismo e radiação (1).

Segundo a OMS (Organização Mundial da Saúde) o câncer é um dos

principais fatores que levam a população mundial a óbito e que provocou a morte de

7,4 milhões de mortes em 2004 e que estes números continuarão crescendo

chegando a 12 milhões de pessoas em 2012. Dentre os tipos de câncer de maior

freqüência entre homens e mulheres são possíveis de destacar o de pulmão (1,3

milhões de mortes / ano), estômago (803 000 óbitos), colo e reto (639 000 óbitos),

fígado (610 000 óbitos) e mama (519 000 óbitos). Entre os homens os tipos de

câncer de maior freqüência são os de pulmão, estômago, fígado, cólon e reto,

esôfago e próstata e entre as mulheres são o de mama, pulmão, estômago, cólon e

reto e cervical (2,3).

Para o Brasil, segundo estimativas levantadas pelo INCA (Instituto Nacional

de Câncer) em 2010, o câncer terá uma incidência de quase meio milhão de

pessoas onde entre os homens, o de maior freqüência será o de próstata, seguido

pelo pulmão, estômago e cólon e reto. Entre as mulheres, o de maior freqüência

será o de mama, seguido pelo colo do útero, cólon e reto, estômago e pulmão (4).

O Brasil é um país populoso e com grande dimensão, localizado próximo da

linha do equador onde a incidência solar é bastante alta. Como resultado a

população apresenta um alto índice de câncer de pele, o principal tipo na população

brasileira e que acometerá cerca de 113.850 novos casos no ano de 2010, segundo

o INCA. Se levarmos em consideração a população mundial este numero

ultrapassou a casa de mais de 2 milhões de casos em 2008 segundo a OMS.

Diante deste grande número de casos de câncer, algumas medidas devem

ser tomadas para redução destes números como ações preventivas e educacionais,

divulgação dos males causados pelo consumo de tabaco, álcool e pela exposição

excessiva ao sol. É necessário também investimentos na área de pesquisa do

câncer para uma detecção mais precoce e o tratamento mais efetivo.

Para o câncer o padrão ouro para o diagnóstico dessas lesões é o resultado

histopatológico. Uma amostra tecidual da lesão é removida (biópsia) e o material é

processado para fixação e coloração para análise em microscopia de luz. As

características celulares e teciduais são avaliadas e o diagnóstico é dado

comparando-se as diferenças com o padrão normal. O procedimento atual de

diagnóstico depende da experiência e habilidade do avaliador no reconhecimento

das alterações decorrentes do processo de carcinogênese, tanto do clínico ou

cirurgião na detecção das lesões, como do patologista ao avaliar as lâminas

histológicas.

As técnicas ópticas para a detecção de neoplasias vêm sendo apresentadas

como técnicas auxiliares para o diagnóstico extremamente atrativas, por

apresentarem o potencial de discriminação tecidual através de uma análise segura,

não-invasiva e com resposta rápida, além de apresentar uma menor influência do

avaliador no resultado final do diagnóstico. A composição bioquímica e a estrutura

influenciam as interações da luz com o tecido biológico, assim um tecido sadio e

uma lesão neoplásica apresentarão características ópticas distintas. Alterações

celulares e teciduais decorrentes do desenvolvimento maligno modificam os

fenômenos ópticos e o monitoramento da fluorescência, reflectância, absorbância,

pode constituir uma importante ferramenta de detecção.

Recentemente, técnicas que utilizam fluorescência têm sido propostas como

promissores métodos de avaliação de diversos tecidos, com base nas propriedades

ópticas e na sensibilidade dessas técnicas em captar a fluorescência emitida por

fluoróforos endógenos presentes nos tecidos. A avaliação não-invasiva e não-

destrutiva é um grande atrativo que a fluorescência oferece para o diagnóstico

clinico.

A espectroscopia de fluorescência é um exemplo de técnica óptica, que tem

diversas aplicações como, por exemplo, no auxílio de diagnóstico de lesões

neoplásicas em tecidos (5,6), na detecção de tecido dental cariado (7), dentre várias

outras aplicações. Em todas essas aplicações a técnica vem mostrando

sensibilidade suficiente para diferenciar as variações teciduais.

A fluorescência por imagem de campo amplo é outra técnica que apresenta o

potencial de aumentar o poder de discriminação de tecidos, podendo constituir uma

importante ferramenta de detecção de lesões como câncer bucal (8,9). Ao contrário

da espectroscopia que fornece uma análise pontual, as técnicas por imagem de

campo amplo podem contribuir para a detecção de lesões ocultas e para o

delineamento das margens de lesões (10).

Diversos grupos de pesquisa estão investindo na busca de novas técnicas e

no desenvolvimento de equipamentos para o diagnóstico mais fácil e precoce do

câncer, dentre essas técnicas a fluorescência tem um grande potencial de aplicação

para detecção óptica como auxiliar no diagnóstico do câncer [2-14].

Nesta busca por novos equipamentos que utilizam fenômenos ópticos para o

diagnóstico de câncer podemos destacar alguns trabalhos como de D. Roblyer e

colaboradores que desenvolveram um sistema de imagens multiespectrais, baseado

em fluorescência e refletância para a detecção e delineamento de neoplasias orais

(11-13). Neste sistema apresentado na Figura 1 é possível obter imagens de

autofluorescência com vários tipos de excitações e que mostrou bastante efetividade

na detecção de lesões neoplásicas.

Figura 1 - Sistema de imagens multiespectrais de fluorescência e refletância (14)

Outro sistema, que já possui uma vertente comercial e que foi desenvolvido

pelo British Columbia Cancer Agency e apresentado por P.M. Lane e colaboradores

que também é baseado em fluorescência para a detecção de câncer na cavidade

oral (15-18). O sistema é chamado de VELScope (Visually Enhanced Lesion scope)

que é um dispositivo para exame visual da mucosa oral. O sistema possui uma fonte

de iluminação baseado em uma lâmpada de metal halóide que emite uma banda de

iluminação entre o ultravioleta e azul que excita o tecido da mucosa oral e então o

clínico é capaz de visualizar as diferentes fluorescências, através de filtros, e que

ajuda a diferenciar o tecido normal e anormal. Até o momento este é o único

dispositivo aprovado pelo FDA (U.S. Food and Drug Administration), que é um órgão

regulador e certificador similar a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária).

O sistema VELscope auxilia no diagnóstico de lesões da mucosa bucal que podem

não ser aparentes ou visíveis com iluminação branca convencional e que auxilia os

cirurgiões a determinar a margem adequada para a excisão cirúrgica do tumor. As

imagens das lesões utilizando o sistema VELscope geralmente aparecem como uma

área irregular e escura que contrasta com a área saudável cujo o padrão normal de

fluorescência é na região do verde.

Na Figura 2 é mostrado o sistema VELscope e as imagens que são possíveis

de se visualizar com este sistema.

Figura 2 - Sistema VELscope (19)

Outro sistema baseado em fluorescência, agora utilizando para outra

aplicação foi desenvolvido por G. K. Stookey e colaboradores e a empresa Inspektor

Research Systems, o sistema é chamado de QLF (Quantitative Light-Induced

Fluorescence). Este sistema também possui uma fonte de iluminação baseado em

uma lâmpada que emite uma banda de iluminação entre o ultravioleta e azul que

excita, neste caso, o dente, onde o objetivo deste sistema é através de fluorescência

detectar a desmineralização do dente, podendo assim detectar cáries recentes

através de uma diminuição do sinal de fluorescência. Com este sistema também é

possível visualizar biofilme microbiano baseado em sua fluorescência (20-25).

Na Figura 3 é mostrado o sistema QLF e as imagens que são possível de se

visualizar com este sistema.

Figura 3 - Sistema QLF (26)

Neste trabalho iremos explorar técnicas ópticas com o uso da fluorescência

para diagnóstico e com o objetivo de se desenvolver um sistema que possa coletar

este sinal de fluorescência, assim será necessário compreender o que é o fenômeno

físico de fluorescência e os componentes necessários para a coleta deste fenômeno,

onde os principais itens para este desenvolvimento serão descritos, em maior

detalhe, abaixo.

1.1 A FLUORESCÊNCIA DE TECIDOS BIOLÓGICOS

Todas as técnicas ópticas empregadas para discriminação de tecidos

biológicos são baseadas na avaliação de pelo menos um fenômeno da interação luz

com tecido, um desses casos é a fluorescência. Para se falar de fluorescência é

necessário entender o que acontece quando incidimos luz, neste caso luz visível,

sobre tecidos biológicos.

A luz visível, ou seja, a radiação eletromagnética, que corresponde à região

espectral entre 400 e 700nm, possui uma determinada energia. Uma unidade desta

radiação eletromagnética é denominada fóton. Quando a energia do fóton é

suficientemente grande para excitar os elétrons das moléculas dos tecidos

biológicos, para um estado de energia maior que o estado fundamental (absorção de

fótons), o elétron excitado pode perder energia, por emissão espontânea, emitindo

fótons de menor energia até voltar ao estado fundamental (Figura 4). Um exemplo

comum é o caso em que o átomo é excitado por luz ultravioleta e emite fótons de luz

visível. Este processo é chamado de fluorescência (27,28).

Figura 4 - Diagrama simplificado de Jablonski - mecanismo básico de fluorescência (28)

De modo simplificado, a luz com um determinado comprimento de onda

(excitação) é absorvida pelo tecido, e re-emitida em um segundo maior comprimento

de onda (emissão) de menor energia (Figura 5). No processo de fluorescência, a

energia absorvida é sempre maior do que a emitida, uma vez que existem outras

formas não-radiativas de perda de energia, tais como vibração e calor.

Figura 5 - Esquema hipotético de níveis de energia mostrando os processos de absorção e de

fluorescência e os correspondentes espectros (28)

A principal característica da fluorescência emitida é que ela só depende da

característica eletrônica da molécula que a emitiu, uma vez que depende das

bandas de energia. Assim, a fluorescência pode ser reconhecida como uma

assinatura própria da molécula, podendo ser empregada como uma ferramenta de

identificação de moléculas. Uma vez que cada composto tem uma fluorescência

bem característica (que depende da luz utilizada para promover a excitação), é

possível diferenciá-lo dentre outros compostos.

No caso de tecidos biológicos, a fluorescência, ou seja, a luz re-emitida e

detectada na superfície do tecido é resultante da contribuição de diversos fluoróforos

(grupos químicos que podem converter a luz absorvida em fluorescência), além dos

espalhadores (estruturas que alteram a direção do fóton incidente, mas conservam

sua energia) e absorvedores locais (grupos químicos que absorvem luz e não

produzem fluorescência). O que se observa é uma banda de emissão bastante

larga. A fluorescência coletada contém a contribuição de todos os fluoróforos

excitados pelo comprimento de onda escolhido, mas apenas parte dos fótons que

puderam ser coletados na superfície do tecido, e que não foram absorvidos por

outros cromóforos.

1.2 IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA

Para o estudo da fluorescência de tecidos biológicos, primeiramente é preciso

conhecer as regiões de absorção destas amostras, que neste trabalho estão

localizadas na região do ultravioleta e azul, ou seja, entre 390nm a 460nm, assim

proporcionando um sinal de fluorescência acima de 480nm.

Na Figura 6 é possível observar o espectro de absorção de algumas

biomoléculas encontradas na região de interesse de 390nm a 460nm. Algumas

dessas biomoléculas são Flavinas, Lipo-Pigmentos e Porfirinas (6).

Figura 6 - Espectros de absorção (A) e de emissão (B) de algumas biomoléculas (6)

Diante dos espectros de absorção é escolhida qual será a fonte de iluminação

responsável pela excitação dessas biomoléculas. Para se obter a máximo sinal de

fluorescência dessas amostras, as fontes de iluminação devem ser escolhidas de

maneira que o pico máximo de absorção da amostra seja excitado pelo respectivo

comprimento de onda de máxima absorção.

Para a obtenção de imagens de fluorescência existem diversos equipamentos

que podem coletar a fluorescência de amostras microscópicas, que é o caso dos

microscópios de fluorescência e confocal, que são utilizados principalmente na

visualização da fluorescência de células com auxílio de marcadores fluorescentes.

As imagens macroscópicas são obtidas com sistemas de fluorescência de campo

amplo, que são utilizados para visualização de lesão de câncer de pele, câncer

bucal (9,10,29-31), etc.

Sistemas para visualização de fluorescência, seja macroscópico ou

microscópico, são basicamente constituídos por dois sistemas, o sistema de

excitação do material, ou seja, um sistema de iluminação; e um sistema de detecção

associado a filtros, que irá revelar o sinal de fluorescência da amostra. A seguir

serão descritos os principais sistemas de iluminação e de filtros para a visualização

de fluorescência.

1.2.1 Iluminação utilizada em fluorescência

Os sistemas de fluorescência utilizam diversas fontes de iluminação para

excitação das amostras. Estes sistemas geralmente utilizam LASER, Lâmpadas e

LEDs como fonte de excitação. Como nesse estudo estamos interessados em

imagem de campo amplo, optamos pelo uso dos emissores LED para a obtenção de

uma área uniforme de iluminação, adequada para as aplicações propostas. Além

disso, a possibilidade de composição de cores com os diversos LEDs disponíveis no

mercado e o custo comparado aos lasers, tornam os emissores LEDs bastante

atrativos para a montagem do nosso sistema.

Para obtermos a banda de iluminação escolhida é necessária a utilização de

lâmpadas ou LEDs, assim serão descritos abaixo as principais lâmpadas e LEDs

utilizados como fonte de iluminação de sistemas de fluorescência.

1.2.1.1 Lâmpadas

1 - Lâmpadas a Vapor de Mercúrio – As lâmpadas de vapor de mercúrio são

bastante utilizadas em microscopia de fluorescência e ainda são consideradas umas

das melhores iluminações para esta aplicação, especialmente quando o pico de

absorção dos fluoróforos coincide com as linhas de emissão de maior intensidade

emitidas pela lâmpada de mercúrio.

Na Figura 7 é possível observar o espectro de emissão das lâmpadas a vapor

de mercúrio, bem como os seus picos característicos (32).

Figura 7 - Espectro da lâmpada de vapor de mercúrio(32)

2 - Lâmpada de Xenônio – A lâmpada de xenônio possui um largo e continuo

espectro de emissão na região do visível de 400 a 700nm (Figura 8). Esta possui

restritas aplicações, que requerem simultâneas excitações de múltiplos fluoróforos

aplicadas à microscopia de fluorescência (32).

Figura 8 - Espectro da lâmpada de xenônio(32)

3 - Lâmpada de metal-halóide – Lâmpadas de metal-halóide estão surgindo

rapidamente como substituição das lâmpadas de mercúrio e xenônio nas aplicações

que envolvem microscopia de fluorescência. Estas exibem um alto desempenho,

quando comparadas às lâmpadas de mercúrio e xenônio.

Na Figura 9 é feita uma comparação entre o espectro de emissão da lâmpada

a vapor de mercúrio, linha cinza, e o espectro de emissão da lâmpada de metal-

halóide, linha verde. Nesta figura é possível observar que ambos os espectros

possuem linhas de emissão bem definidas. Porém, o espectro de emissão da

lâmpada de metal-halóide possui maior intensidade, sendo uma das vantagens

desta comparada à lâmpada a vapor de mercúrio. Outra vantagem é o tempo de

vida útil dessas lâmpadas: o da vapor de mercúrio é de aproximadamente 200 horas

e o da lâmpada de metal-halóide é de 2000 horas.

Figura 9 - Espectros das lâmpadas de mercúrio e de metal-halóide (33)

1.2.1.2 LEDs

Diodo Emissor de Luz

A mais promissora tecnologia para iluminação de sistemas de fluorescência

de imagens de campo amplo é o Light-Emitting Diode (LED), ou seja, Diodo Emissor

de Luz. Este versátil dispositivo semicondutor possibilita todas as características de

iluminação de lâmpadas utilizadas em sistemas de fluorescência, com a vantagem

de serem mais eficientes relativamente ao consumo de energia, tamanho muito

reduzido - quando comparado com lâmpadas - e possuem uma vida útil muito longa,

superior a 100.000 horas de uso (34).

Figura 10 - Espectros de emissão de LEDs comerciais (35).

1.2.2 Filtros utilizados em imagens de fluorescência

Os instrumentos de imagens de fluorescência devem apresentar filtros ópticos

(18,32). Um típico sistema possui 3 filtros básicos: 1. passa-banda: utilizado na

excitação; 2. dicróico; e 3. passa-alta: utilizado na emissão da fluorescência.

Na Figura 11 é demonstrado o esquema básico do arranjo de filtros utilizado

para detecção de fluorescência.

Figura 11 - Esquema do arranjo típico de filtros utilizados para detecção de fluorescência

A escolha dos filtros que irá compor a montagem básica do sistema de

detecção de fluorescência é baseada no espectro de absorção da amostra e no seu

espectro de emissão.

Na Figura 12 é demonstrada, de uma maneira simplificada, como são

sugeridos os espectros de transmissão dos filtros utilizados, levando em

consideração os espectros de absorção e emissão da amostra a ser analisada (36).

Figura 12 - Espectro de transmissão dos filtros ópticos utilizados em fluorescência

O filtro sugerido utilizado na excitação é definido pelo pico máximo de

absorção da amostra, como mostrado na Figura 12. Geralmente é utilizado um filtro

passa-banda na excitação, a fim de transmitir apenas os comprimentos de onda de

maior absorção dos fluoróforos da amostra, e refletir ou absorver os demais

comprimentos de onda, que estão fora do pico máximo de absorção, assim

minimizando a excitação de outras fontes de fluorescência que não são de interesse.

O filtro utilizado na emissão ou detecção da fluorescência segue os mesmos

critérios de seleção do filtro de excitação (Figura 12). Tipicamente é utilizado um

filtro passa-alto ou passa-banda, que transmite somente os comprimentos de onda

de emissão, emitidos pelos fluoróforos e bloqueia toda a luz indesejável desta

banda, especialmente a banda de excitação. Um dos fatores da utilização destes

filtros é o espalhamento da luz nos comprimentos de onda empregados na excitação

que é mais intenso do que a fluorescência, assim deve ser removido antes da

detecção.

Os filtros dicróicos, ou beamsplitters, são posicionados a 45º em relação à

iluminação e são escolhidos para refletir os comprimentos de onda da excitação e

transmitir os comprimentos de onda de emissão da amostra. Para que se tenha uma

máxima eficiência com relação à quantidade de luz que chegará a amostra e a

máxima eficiência de fluorescência que será detectada, o espectro de transmissão

do filtro dicróico deverá estar entre o espectro de transmissão do filtro de emissão e

excitação.

1.3 APLICAÇÕES DE IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA

Sistemas capazes de fazer a detecção de fluorescência são utilizados para as

mais diversas aplicações. Neste trabalho serão exploradas duas aplicações, a fim de

se validar a eficácia clínica do sistema de imagem de fluorescência desenvolvido. A

primeira aplicação é a detecção de fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica e a

segunda é a visualização de biofilme microbiano na boca.

A primeira aplicação é relacionada à terapia fotodinâmica (TFD) que emprega

a combinação de luz visível com um agente fotossensível, gerando espécies

citotóxicas as células (37). Esta técnica tem sido utilizada em diversos tipos de

tratamentos como na infecção genital por Papilomavírus humano (HPV), infecções

locais bacterianas e câncer de pele (38,39). No entanto é necessário melhorar a

instrumentação e o protocolo clínico para aprimorar o desenvolvimento desta

técnica.

Um dos agentes utilizados na TFD é o ácido 5-aminolevulínico (5 - ALA), que

é precursor na biossíntese da Protoporfirina XI que é o agente fotossensível (40). A

eficácia da TFD é dependente da concentração e da profundidade da Protoporfirina

XI no tecido. Assim surge a necessidade da verificação da presença e do

acompanhamento da formação da Protoporfirina XI no tecido, assim como de sua

fotodegradação durante a TFD, que é uma importante informação para a dosimetria.

A segunda aplicação é relacionada à visualização de biofilme em superfície

dental, está diretamente relacionado a problemas de saúde como cárie e doença

periodontal.

Pesquisas na área odontológica têm constatado que os biofilmes orais são

comunidades microbianas com uma grande diversidade de bactérias (41).

Recentemente, estudos vêm demonstrando uma relação entre a saúde bucal

precária e doenças sistêmicas devido a alguns componentes da microbiota bucal

(41,42). Estes componentes podem ser tanto patógenos periodontais, quanto

bactérias oportunistas, que também colonizam o biofilme. O biofilme pode ser

evidenciado quando da utilização de parâmetros adequados de iluminação e

visualização, facilitando a identificação e o monitoramento do controle microbiano

pelo profissional clínico.

Diante destes dois problemas foi proposto, neste trabalho, o desenvolvimento

de um sistema portátil, que facilite tanto a visualização da fluorescência da

protoporfirina IX durante o tratamento por TFD, quanto à visualização da

fluorescência da microbiota bucal. No entanto, é importante ressaltar que, o

equipamento desenvolvido pode ser empregado em outras aplicações como na

detecção de câncer de pele e câncer de boca onde estas aplicações serão

exploradas em trabalhos futuros.

O acompanhamento da formação e da degradação da Protoporfirina XI

promoverá a otimização do tempo de início e fim da iluminação necessário na TFD

promovendo um tratamento mais eficaz. A melhor visualização da microbiota bucal

poderá reduzir o número de problemas de saúde relacionados com os

microrganismos presentes na microbiota bucal.

2 OBJETIVO

O principal objetivo deste projeto é o desenvolvimento de um sistema de

fluorescência óptica por imagem de campo amplo.

Os objetivos secundários envolvem a avaliação do sistema no monitoramento

da degradação da Protoporfirina XI utilizada na TFD e a visualização da presença de

microrganismos presentes na microbiota bucal.

3 MATERIAL E MÉTODO

3.1 DESCRIÇÃO DO SISTEMA

O projeto consistiu de quatro partes principais, descritas em detalhes a seguir:

Óptica, Mecânica, Eletrônica e Aquisição de imagens.

3.1.1 Óptica

3.1.1.1 Sistema de Iluminação por LEDs

Para o desenvolvimento do sistema de iluminação, e que este atendesse a

banda de absorção de interesse, que é de 390nm a 460nm, foram utilizados dois

tipos de LEDs de alta intensidade. A escolha dos LEDs para serem utilizados como

fonte de iluminação foi feita pelas vantagens que os LEDs possuem, em relação às

lâmpadas: alta intensidade óptica, dispositivos muito compactos e vida útil longa.

O primeiro LED utilizado é fabricado pela EDISON, empresa Taiwandesa com

distribuidores no Brasil. Na Figura 13 é mostrado o espectro do LED ultravioleta

modelo EDEV-3LA1, este espectro foi obtido utilizando um espectrômetro USB 2000

(Ocean Optics, USA).

350 400 450 500 550 600 650 700 750

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Intensidade (u.a.)

Comprimento de onda (nm)

Figura 13 - Espectro do LED ultravioleta EDEV-3LA1

Na Figura 14 é possível observar as dimensões do LED ultravioleta utilizado.

Figura 14 - Dimensões do LED EDEV-3LA1 (43)

As principais características do LED ultravioleta estão demonstradas na

Tabela 1 (44).

Para o desenvolvimento deste sistema as principais características levadas

em consideração na escolha deste LED foram o comprimento de onda centrado em

405nm e potência radiométrica de 350 mW.

Tabela 1 - Principais características do LED EDEV-3LA1

Parâmetros Valores Unidades

Corrente 700 mA

Tensão 4,3 V

Temperatura de operação -30 ~ +110 °C

Temperatura de junção 125 °C

Potência Radiométrica 350 mW

Comprimento de onda (pico) 405 nm

Ângulo de emissão 140 graus

O segundo LED utilizado é fabricado pela OSRAM, empresa America com

distribuidores no Brasil. Na Figura 42 é mostrado o espectro do LED azul modelo LD

W5AP-3V8A-35, este espectro foi obtido utilizando um espectrômetro USB 2000

(Ocean Optics, USA).

350 400 450 500 550 600 650 700 750

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Intensidade (u.a.)

Comprimento de onda (nm)

Figura 15 - Espectro do LED azul LD W5AP-3V8A-35

Na Figura 43 é possível observar as dimensões do LED azul utilizado.

Figura 16 - Dimensões do LED azul LD W5AP-3V8A-35 (45)

As principais características do LED azul estão demonstradas na Tabela 2

(45). Para o desenvolvimento deste sistema as principais características levadas em

consideração na escolha deste LED foram o comprimento de onda centrado em

450nm e potência radiométrica de 1250 mW.

Tabela 2 - Principais características do LED azul LD W5AP-3V8A-35

Parâmetros Valores Unidades

Corrente 1,4 A

Tensão 3,5 V

Temperatura de operação -40 ~ +150 °C

Temperatura de junção 160 °C

Potência Radiométrica 1250 mW

Comprimento de onda (pico) 450 nm

Ângulo de emissão 140 graus

3.1.1.2 Filtros

Para o desenvolvimento deste sistema foi necessária a utilização de quatro

filtros ópticos, relacionados a seguir, com o objetivo de se obter a melhor

visualização das imagens de fluorescência de interesse. O arranjo dos filtros está

ilustrado na Figura 17.

Figura 17 - Disposição dos filtros ópticos do sistema

1 - Filtro Passa-banda (Single-band Bandpass Filter)

O primeiro filtro utilizado foi o filtro passa-banda (Figura 18), que possui as

dimensões de 25mm de diâmetro e 3mm de espessura. Este filtro foi personalizado

e produzido pela empresa Proteon (Empresa nacional) para atender a esta

determinada aplicação.

Figura 18 - Filtro passa-banda - largura de banda de 65nm centrada em 420nm.

Este filtro possui uma largura de banda de 65nm centrada em 420nm onde é

transmitindo apenas a banda de interesse da iluminação de 390nm a 460nm. Na

Figura 19 é mostrado o espectro de transmissão do filtro passa-banda. Este

espectro e dos demais filtros foram obtidos através de um espectrofotômetro modelo

CARY 50 UV-VIS (Varian, USA).

350 400 450 500 550 600 650 700 750

100

Transmissão (%)

Comprimento de onda (nm)

Figura 19 - Espectro de transmissão do filtro passa-banda (420nm).

A utilização do filtro passa-banda se fez necessário devido ao fato do LED

450 possuir uma banda relativamente larga, acima de 460nm. Assim, se este filtro

não fosse utilizado o sinal de fluorescência da amostra seria mascarado pela

iluminação do LED 450, o que prejudicaria na qualidade das imagens obtidas.

2 - Filtro Dicróico (45° Dichroic Beamsplitters)

O segundo filtro utilizado foi o filtro dicróico (Figura 20) que possui as

dimensões de 25mm de altura, 35mm de largura e 1mm de espessura. Este filtro foi

personalizado e produzido pela empresa Semrock (USA), para atender a esta

determinada aplicação.

Figura 20 - Filtro dicróico – reflete a iluminação de 390nm - 460nm e transmite a banda de

emissão de fluorescência da amostra

O espectro de transmissão do filtro dicróico é mostrado na Figura 21. Este

filtro é utilizado para refletir a iluminação de 390nm a 460nm e transmitir a banda de

emissão de fluorescência da amostra.

350 400 450 500 550 600 650 700 750

100

Transmissão (%)

Comprimento de onda (nm)

Figura 21 - Espectro de transmissão do filtro dicróico

O filtro dicróico foi projetado de maneira a transmitir as bandas de 480-560nm

e 625nm – 800nm e refletir as bandas de 350nm – 460nm e 560nm-625nm.

O principal objetivo de o filtro dicróico possuir estas determinadas

características de transmissão se deve ao fato da fluorescência de interesse estar

localizada nas bandas de 480-560nm, ou seja, fluorescência no verde; e na banda

de 625nm – 800nm, fluorescência no vermelho. Em relação à reflexão do filtro, o

interesse na banda de 350nm-460nm é a reflexão da luz, que irá excitar a amostra; e

a reflexão da banda de 560nm-625nm se faz necessária, pois esta banda representa

a banda de fluorescência localizada no amarelo, que não é de interesse. Evitando

essa banda é possível ter um maior contraste nas amostras, e obter melhores

imagens de fluorescência.

3 - Filtro Anti-reflexo

O terceiro filtro utilizado foi o filtro anti-reflexo (Figura 22), que possui

dimensões de 25mm de diâmetro e 1mm de espessura. Este filtro produzido pela

empresa Proteon, para atender a esta determinada aplicação.

Figura 22 - Filtro anti-reflexo

Na Figura 23 é possível observar o espectro de transmissão do filtro anti-

reflexo, que possui a característica de transmitir 95% da fluorescência que será

coletada pelo sistema.

Este filtro foi utilizado pra proteger os demais filtros da entrada de partículas

no sistema de filtros, pois este estará o mais próximo da amostra analisada.

400 450 500 550 600 650 700 750

100

Transmissão (%)

Comprimento de onda (nm)

Figura 23 - Espectro de transmissão do filtro anti-reflexo

4 - Filtro Passa-alto (Long Wave Pass Filters)

O quarto filtro utilizado foi o passa-alto (Figura 24), que possui dimensões de

25 mm de diâmetro e espessura de 2 mm. Este filtro, modelo GG 475 foi produzido

pela empresa Proteon para atender a esta determinada aplicação.

Figura 24 - Filtro passa-alto

Na Figura 25 é possível observar o espectro de transmissão do filtro passa-

alto, que possui a característica de absorver a banda de 350nm-475nm e transmitir a

banda de 475nm-800nm, ou seja tem a função de absorver os comprimento de onda

do sistema de iluminação e transmitir apenas a banda de emissão de fluorescência

da amostra.

350 400 450 500 550 600 650 700 750

100

Transmissão (%)

Comprimento de onda (nm)

Figura 25 - Espectro de transmissão do filtro passa-alto

Com estes quatro tipos de filtros foi possível obter imagens de fluorescência

com boa eficiência, obtendo-se imagens com boa qualidade e de bom contraste.

Na Figura 26 é possível observar o espectro de transmissão dos filtros passa-

banda, passa-alto e dicróico, cujo conjunto demonstra as características de

transmissão e reflexão, proporcionando um bom sinal de fluorescência.

350 400 450 500 550 600 650 700 750

100

Trasmissão (%)

Comprimento de onda (nm)

Filtro Passa-banda

Filtro Passa-alto

Filtro Dicróico

Figura 26 - Espectro de transmissão dos filtros utilizados

3.1.1.3 Lentes

O sistema de iluminação é composto por “uma lente” e um refletor. A “lente”

utilizada (Polimer Optics, England) é um conjunto de 7 lentes agrupadas. Na Figura

27 é mostrado um esquema de como estão dispostas estas lentes formando uma

lente única, que possuí a função de focalização dos LEDs azuis.

Figura 27 - Esquema de lente retirado do catálogo da Polimer Optics

O refletor utilizado foi gentilmente doado pela empresa brasileira DirectLight

Indústria e Comércio de Produtos Eletroluminescentes Ltda, com sede em São

Carlos. Na Figura 28 é mostrado o desenho esquemático e suas dimensões, e este

possui a função de focalização do LED ultravioleta.

Figura 28 - Esquema e desenhos do refletor

Na Figura 29 são mostrados a lente e o refletor utilizados no sistema de

iluminação.

Figura 29 - Lente e refletor utilizados no sistema de iluminação

Para que fosse possível obter uma intensidade de iluminação alta foi

necessário fazer uma combinação de lentes e refletor. Na Figura 30 é mostrada esta

combinação, que consiste na retirada da lente central do conjunto de lentes da

Polimer Optics. No centro das lentes inseriu-se um refletor, pois as lentes da Polimer

Optics são de acrílico e este material absorve uma grande parte da intensidade do

LED ultravioleta.

Uma alternativa para este problema seria a confecção das lentes com outros

materiais que não absorvam na região do ultravioleta, como o quartzo.

Figura 30 - Arranjo de lentes e refletor

Para o sistema de iluminação foi necessária a utilização de seis LEDs azuis,

ao redor de um LED ultravioleta. Esta quantidade de LEDs proporciona um calor

excessivo, pois o LED ultravioleta possui potência elétrica de 3W e o azul, 5 W,

totalizando no sistema 33 W de potência elétrica, em seu máximo de potência

óptica.

3.1.1.4 Montagem da óptica em bancada

O desenvolvimento do sistema de imagens de fluorescência passou por uma

etapa fundamental, que foram os testes em bancada ou testes em mesa óptica.

Na Figura 31 é possível visualizar uma das montagens feitas na mesa óptica,

bem como os componentes ópticos utilizados, tais como filtros e lentes.

Na mesa óptica foram realizados diversos testes: potência óptica do sistema

de iluminação; escolha dos filtros a serem utilizados; arranjo espacial dos filtros; e

testes de otimização e dimensionamento, a fim de se compactar o sistema.

Projetou-se, então, a parte estrutural do sistema (parte mecânica do projeto).

Figura 31 - Montagem da óptica em bancada

3.1.2 Mecânica

3.1.2.1 Parte estrutural

O projeto mecânico do sistema desenvolvido foi inteiramente projetado no

software SolidWorks (Dassault Systemes S.A., França), que oferece um sistema de

simulação e projeção 3D, facilitando o desenvolvimento e visualização da execução

do projeto.

Depois da simulação, o projeto mecânico foi executado na oficina mecânica

do Instituto de Física da USP de São Carlos.

O desenho 3D do projeto mecânico é apresentado na Figura 32.

Figura 32 - Projeto mecânico do sistema.

Na Figura 33 apresenta o sistema de imagens de fluorescência, partes

mecânicas e óticas.

Figura 33 - Projeto do sistema final (mecânica e ótica)

3.1.2.2 Dissipação

O sistema de iluminação possui uma potência elétrica alta, gerando um calor

excessivo e que precisa ser dissipado. Houve a necessidade, então, de se construir

um dissipador de calor, mostrado na Figura 34.

O sistema de dissipação é composto pelo dissipador, feito em alumínio, e um

cooler, que auxilia na troca calor gerado pelo sistema de LEDs.

Figura 34 - Sistema de dissipação de calor

3.1.3 Eletrônica

O objetivo do sistema de eletrônica é o controle e ajuste da intensidade

individual de cada conjunto de LEDs, ou seja, fornecer tensão e corrente ao conjunto

de 6 LEDs azuis e um LED ultravioleta separadamente. Isso possibilitará ao usuário

ajustar a intensidade luminosa de cada conjunto de LEDs, a cada determinada

aplicação.

No sistema de iluminação os 6 LEDs azuis foram ligados em série,

necessitando para sua alimentação tensão de 21V e 1,4A de corrente. O LED

ultravioleta requer 4,3V e 0,7A.

Para fornecer estes níveis de tensão e corrente foram utilizadas duas fontes

comerciais (MGS Eletrônica LTDA, Brasil), uma das fontes de 18V e outra de 5V,

ambas com corrente de 3A.

Dissipador

Lente

As duas fontes foram ligadas em série, proporcionando 23V e 3A, suficientes

para o sistema de iluminação. Assim, foi possível desenvolver a fonte que faz a

regulagem da corrente, que será fornecida a cada conjunto de LEDs, possibilitando

o controle da intensidade luminosa.

Na Figura 35 é mostrada a eletrônica desenvolvida para o sistema de

fluorescência, onde são destacadas as fontes de alimentação de tensão e corrente.

Figura 35 - Eletrônica desenvolvida para o sistema de fluorescência

Um invólucro final para o protótipo foi confeccionado, para interface com o

usuário – o clínico.

Na Figura 36 é mostrada a caixa onde se encontra a eletrônica do sistema. É

possível observar o controle de intensidade do conjunto de LEDs azuis e LED

ultravioleta.

Fonte 18 V, 3A

Fonte 5 V, 3A

Fonte de Corrente

Figura 36 - Caixa de controle do sistema de iluminação

3.1.3 Aquisição das imagens

O sistema de visualização de fluorescência foi idealizado e desenvolvido,

preliminarmente, para operar sem a necessidade de câmera, pois a visualização é

feita através do próprio olho humano. Com a necessidade de registro das imagens

digitalizadas para posterior análise e processamento, foi necessária a utilização de

uma câmera CCD e uma câmera fotográfica acoplada ao sistema desenvolvido.

A câmera utilizada é uma câmera USB CCD modelo DBK 31AU03.AS (The

Imaging Source, Alemanha), como mostrado na Figura 37. Esta câmera possui

algumas características como, resolução de 1024x768 pixel, controle do tempo de

exposição de 1ms até 30s e de ganho.

Figura 37 - Câmera CCD para aquisição de imagens

A câmera fotográfica utilizada foi uma câmera semi-profissinal Sony Cyber-

shot modelo DSC-H50 (Sony Corporation, Japão) como mostrado na Figura 37. Esta

câmera possui algumas características como, resolução de 3456 x 2592 pixel (9,1

Megapixels) e objetiva Carl Zeiss 31-465mm com zoom óptico de 15x.

Figura 38 - Câmera fotográfica SONY H50

Na Figura 39 é mostrado um desenho esquemático do acoplamento da

câmera CCD com o sistema desenvolvido.

Figura 39 - Acoplamento da câmera com o sistema

3.2 SISTEMA COMO UM TODO

3.2.1 Sistema principal

Na Figura 40 é possível visualizar o sistema principal montado com todos os

componentes descritos acima. O sistema principal possui a característica de ser

compacto facilitando seu manuseio.

Figura 40 - Sistema principal

3.2.2 Sistema principal com aquisição de imagens

Na Figura 41 é apresentado o sistema de fluorescência em conjunto com a

aquisição de imagens.

Figura 41 - Sistema de fluorescência com aquisição de imagens

3.3 CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA

3.3.1 Iluminação

Com a utilização destes dois tipos de LEDs (Figura 42) - com comprimento de

onda centrado em 405nm (LED ultravioleta) e 450nm (LED azul) - e o filtro passa-

banda - cujo o espectro de transmissão é mostrado na Figura 43 -, pode-se obter o

espectro da iluminação de interesse do sistema que foi desenvolvido, como

mostrado na Figura 44.

350 400 450 500 550 600 650 700 750

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Intensidade (u.a.)

Comprimento de onda (nm)

Figura 42 - LEDs utilizados para compor o espectro da lâmpada

350 400 450 500 550 600 650 700 750

100

Transmissão (%)

Comprimento de onda (nm)

Figura 43 - Espectro de transmissão do filtro utilizado no sistema de iluminação

Figura 44 - Espectro obtido com a composição de dois LEDs. A – LEDs com intensidades

diferentes; B – LEDs com mesma intensidade

Uma das grandes vantagens da utilização de LEDs para se compor espectros

de interesse é a possibilidade de se alterar a intensidade de cada LED de maneira

independente, assim tem-se um resultado com o mesmo espectro de uma lâmpada

como mostrado na Figura 45 (quadrado em vermelho) podendo ainda alterá-lo de

maneira que melhor atenda uma determinada aplicação.

Figura 45 - Região de interesse para sistemas de fluorescência

Na Figura 46 são mostrados o sistema de iluminação bem como as

características de iluminação obtidas com a combinação dos LEDs, filtro, lentes e

refletor.

Figura 46 - Sistema de iluminação: (a) Vista frontal (b) Vista lateral; (c e d) Vista superior;

Diversas vistas da iluminação

Na Figura 46 é possível observar uma característica fundamental que um

sistema de iluminação utilizado em fluorescência deve possuir que é a uniformidade.

Esta característica contribui significativamente na qualidade das imagens de

fluorescência.

3.3.2 Potência óptica

Uma das caracterizações necessárias, a este sistema, é a potência

radiométrica ou potência óptica (em mW), fornecida pelos LEDs.

Para esta caracterização foi utilizado o medidor de potência modelo

FieldMaster (Coherent, USA) e o sensor térmico modelo LM-10 HTD (Coherent,

USA).

O sensor possui as seguintes características, 16mm de diâmetro, 1mW de

resolução até 10W de potência máxima de operação e pode-se medir a faixa de

comprimentos de onda de 250 a 10600nm.

Figura 47 - Medidor de potência óptica

Na Tabela 3 é possível observar os valores obtidos do sistema. Estes valores

são extremamente satisfatórios, pois proporcionam boas imagens de fluorescência.

Tabela 3 - Valores de potência óptica do sistema de iluminação

Conjunto Valores Unidades

LED ultravioleta 50 mW

LED azul 200 mW

Total 250 mW

3.3.3 Teste do sistema de imagem

Com o objetivo deste projeto é visualização da PpIX, uma porfirina endógena,

e visualização de colônias microbianas, foram realizadas duas caracterizações de

imagens para validar, através de testes in vitro se o sistema seria capaz de atender

os objetivos propostos.

O primeiro teste é mostrado na Figura 48, onde se observa a imagem de

fluorescência obtida com o sistema. Esta imagem possui dois compostos

misturados, o primeiro é uma porfirina utilizada em TFD - o Photogem -, que pode

ser visualizado pela sua fluorescência na região do vermelho, muito similar a

fluorescência da PpIX. O segundo composto é a vitamina B2 ou Riboflavina,

utilizada nos procedimentos de crosslinking em córneas humanas para a estagnação

do ceratocone. A fluorescência da riboflavina é visualizada ao centro, cuja

fluorescência está situada na região do verde, a qual é bem similar a fluorescência

da pele.

Figura 48 - Imagem de fluorescência do Photogem (vermelho) e Riboflavina (verde)

O segundo teste pode ser visualizado na Figura 49. Esta imagem foi obtida a

partir do crescimento de culturas bacterianas em placa de ágar. Na figura é possível

observar algumas bactérias provenientes da região bucal e que foram cultivadas.

Elas possuem fluorescência na região do verde e outras bactérias possuem

fluorescência na região do vermelho.

Na Figura 49 observa-se uma bactéria que possui fluorescência na região do

vermelho, indicando que estas bactérias produzem Protoporfirina IX.

Figura 49 - Imagem de fluorescência de bactérias

Com este dois experimentos in vitro foi possível validar o sistema

desenvolvido já que as imagens obtidas se mostraram de excelente qualidade e que

possibilitavam diferenciar e evidenciar a fluorescência tanto da PpIX quanto de

bactérias produtoras de PpIX.

4 RESULTADOS

As várias aplicações do sistema desenvolvido neste trabalho serão

detalhadamente apresentadas nesta seção.

4.1 FOTODEGRADAÇÃO DA PROTOPORFIRINA IX-QUERATOSE ACTÍNICA

O experimento de fotodegradação da PpIX é uma parceria entre o Instituto de

Física de São Carlos – IFSC/USP e a equipe da Dra. Ana Gabriela Sálvio, médica

do Hospital Amaral Carvalho em Jaú – SP, hospital referência no tratamento de

câncer.

Este experimento faz parte do projeto de mestrado de Valentina Soffner Jorge

Bonilha, aluna do Programa de Pós Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento, do

Curso de Biotecnologia Médica – Hemocentro de Botucatu, da Universidade

Estadual Paulista – UNESP, cujo projeto é intitulado de “Tratamento de Queratose

Actínica Disseminada Através da Terapia Fotodinâmica”

4.1.1 Material e método

Para o acompanhamento da fotodegradação da PpIX foram incluídos 9

pacientes com Queratose Actínica intensa, localizadas em braços, antebraços e

mãos, atendidos no Departamento de Pele do Hospital Amaral Carvalho. Os

pacientes/acompanhantes foram orientados nas formas verbal e escrita, onde

assinaram um termo de consentimento Livre e Esclarecido.

As medicações utilizadas, aplicadas pela Dra. Ana Gabriela, foram o Ácido 5-

aminolevulínico (5-ALA) (FSUESCC “NIOPIIK” B SADAVAYAd. 1K4, Moscou,

Rússia) na concentração de 15% em emulsão de água QSP, Nipagen 0,5,

Propileroglicerol 5%, Nipasol 0,05%, Polowax N,S 18%, manipulado pela farmácia

autorizada pela Instituição.

O aparelho (protótipo) que foi utilizado para a irradiação foi desenvolvido pelo

Grupo de Óptica, Laboratório de Biofotônica e Laboratório de Apoio Técnico (LAT)

do Instituto de Física de São Carlos. Ele é denominado Kerato PDT e está

apresentado na figura 50. Este sistema é constituído por LEDs, com comprimento de

onda centrado em 630 nm, que estão dispostos em placas de alumínio que cobrem

toda região do braço, antebraço e mãos. O sistema possui controle de regulagem

de intensidade dos LEDs máxima de 60mW/cm

, que foi a utilizada neste

experimento.

Figura 50 - Aparelho de tratamento de Queratose Actínica – Kerato PDT

Para o acompanhamento da fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação, foi utilizado o sistema desenvolvido de imagens de fluorescência e uma

câmera fotográfica -SONY H50- acoplada ao sistema, para registro das imagens.

Todas as imagens foram obtidas com uma lente macro, de 74mm, e utilizou-se o

aumento óptico da câmera de 6x. Como consequência deste aumento, o campo de

visão foi de apenas 2,0 cm.

O procedimento de TFD em pacientes com Queratose Actínica iniciava-se

com a documentação do paciente e demarcação das lesões com uma caneta

hidrográfica. Após a demarcação, eram feitas fotografias das lesões utilizando luz

branca, sem o auxílio do sistema. Subseqüentemente, eram feitas fotografias de

fluorescência com o sistema desenvolvido.

Para realizar o procedimento, foi realizada curetagem em ambos os membros

superiores. Em seguida, foi feita uma limpeza com água destilada e foram

administrados 3,0 gramas em cada membro superior, por via tópica de ALA. Em

seguida, os membros foram cobertos por filme plástico de PVC, envolvidos por papel

alumínio, e finalmente cobertos com atadura de crepe.

Após o tempo de permanência de 2 horas com ALA, foi feita a limpeza dos

membros, retirando todo medicamento tópico da pele, e o paciente encaminhado

para o aparelho Kerato PDT para inicialização da iluminação da TFD.

O tempo de irradiação utilizado foi de 40minutos, resultando em uma fluência

de 144J/cm

O paciente recebeu uma medicação oral para analgesia, conforme prescrição

feita pela médica responsável, 10 minutos antes do início do TFD. Ao término do

procedimento, o paciente e/ou acompanhante receberam orientações verbais e por

escrito sobre o uso de fotoprotetor, emolientes e medicações analgésicas.

Antes de se iniciar a irradiação, eram feitas imagens com iluminação branca e

com o sistema de fluorescência, aqui considerada como tempo 0 minutos.

A fim de se acompanhar a fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação, foram feitas imagens com o sistema de fluorescência, em tempos de 0

minutos, ou seja, antes da irradiação e após o início da irradiação em tempos de 2, 4

6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos. Todas as imagens de fluorescência foram

obtidas em uma sala escura, para que a iluminação ambiente não interferisse nas

imagens de fluorescência capturadas. A cada aquisição de imagem, a irradiação do

sistema Kerato PDT foi interrompida.

Para a quantificação da fotodegradação da PpIX foram selecionadas 30

lesões, onde cada lesão possui um conjunto de 12 imagens de fluorescência que

correspondem aos tempos de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 minutos de

irradiação.

As imagens de fluorescência selecionadas passaram por um algoritmo de

quantificação da PpIX escrito em Matlab

7.5 (The MathWorks, USA). O algoritmo

consiste basicamente na quantificação de intensidade da matriz de cores R da

imagem RGB.

4.1.2 Resultados e discussão

A sequência de imagens da fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação é mostrada na Figura 51, onde a sequência de imagens é representada

de A a L como os tempos de coleta das imagens de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30,

35 e 40 minutos durante a irradiação, consecutivamente.

A sequência de imagens da Figura 51 representa as imagens de

fluorescência sem processamento, onde a região do verde é devido, principalmente,

à autofluorescência da pele. A fluorescência na região do vermelho é devido à PpIX.

Na Figura 51 é observado que a fluorescência na região do vermelho, ou seja,

fluorescência da PpIX vai diminuindo em função do tempo de irradiação,

evidenciando os processos de fotodegradação da PpIX.

Figura 51 - Imagens de fotodegradação da PpIX em função do tempo – Sem processamento

0 min.

min.

Na Figura 52 é mostrada a sequência de imagens utilizando o algoritmo de

processamento escrito em Matlab, evidenciando a fluorescência da PpIX.

Figura 52 - Imagens de fotodegradação da PpIX em função do tempo – Com processamento

Por processamento das imagens, foi quantificado a intensidade de

fluorescência da PpIX. Para cada conjunto de 12 imagens, foi calculada a

intensidade de uma região selecionada. Em seguidas, foram normalizadas pelo

máximo de intensidade de fluorescência, que corresponde ao tempo 0.

min.

Na Figura 53 é apresentado o gráfico de fotodegradação da PpIX em função

do tempo de irradiação das 30 lesões selecionadas. Observa-se um decaimento

exponencial em função do tempo de irradiação.

No protocolo empregado, para as lesões de Queratose Actínica, o tempo de

15 minutos de irradiação indica estar associado com a degradação de quase a

totalidade da PpIX formada no tecido.

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intensidade Normalizada (u.a.)

Tempo (min.)

Fotodegradação PpIX

Ajuste teórico

Figura 53 - Gráfico de fotodegradação da PpIX em função do tempo de irradiação

No gráfico da Figura 53, observa-se que a fotodegradação se estabiliza com

intensidade ao redor de 0,5, o que pode levar a uma interpretação equivocada de

que não ocorreu toda a fotodegradação da PpIX. Este equívoco pode ser resolvido

utilizando a autofluorescência da pele como linha de base.

Na sequência de imagens, antes da aplicação da pomada com ALA, da

Figura 54, tem-se em A uma imagem com iluminação branca, onde uma lesão de

Queratose Actínica se localiza ao centro; em B, tem-se a imagem de

autofluorescência da lesão; e, em C, tem-se uma imagem apenas com a

componente do vermelho da imagem B. Na imagem C é evidenciado que a

autofluorescência da pele também apresenta uma pequena porção de fluorescência

na região do vermelho.

Figura 54 - Imagens de fluorescência – Antes do inicio do tratamento

Na sequência de imagens, após 2 horas da aplicação da pomada com ALA,

da Figura 55, tem-se em A uma imagem com iluminação branca; em B, a imagem de

fluorescência da lesão marcada em vermelho pela fluorescência da PpIX; e, em C,

uma imagem apenas com a componente do vermelho da imagem B. Na imagem C

fica evidente que há uma grande fluorescência da PpIX na região do vermelho.

Figura 55 - Imagens de fluorescência – No inicio do tratamento – 0 minutos

Na sequência de imagens, após 40 minutos de irradiação, da Figura 55,

temos em A uma imagem com iluminação branca; em B, a imagem de fluorescência

da lesão marcada por uma pequena fluorescência na região do vermelho pela

fluorescência da PpIX; e, em C , uma imagem apenas com a componente do

vermelho da imagem B. Na imagem B e C fica evidente que ocorreu a

fotodegradação da PpIX em função da irradiação e que ainda existe uma pequena

fluorescência na região do vermelho.

Figura 56 - Imagens de fluorescência – No final do tratamento – 40 minutos

Tendo como base que a quantificação da PpIX é dada pela fluorescência na

região do vermelho e evidenciando que existe uma pequena fluorescência na região

do vermelho das imagens antes da aplicação da pomada a base de ALA, (Figura 54,

imagens B e C, onde esta fluorescência não é de interesse nesta quantificação) é,

então, necessário subtrair esta fluorescência das imagens de fotodegradação da

PpIx em função do tempo de irradiação, para que não seja entendido erroneamente

que toda a PpIX foi degradada.

No gráfico da Figura 57 tem-se o monitoramento da fotodegradação da PpIX,

que corresponde aos pontos quadrados de A. Observa-se que não existe mais uma

diminuição de intensidade a partir de 10 minutos, onde a intensidade se estabiliza ao

redor de 0,4. Fazendo a quantificação da fluorescência na região do vermelho da

imagem antes da aplicação da pomada a base de ALA e, subtraindo das imagens de

todos os tempos de irradiação, tem-se, então, um novo gráfico de fotodegradação

dado na Figura 57, como círculos.

Evidencia-se desta forma que provavelmente ocorreu a degradação de toda a

PpIX superficial produzida pelo tecido.

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intensidade Normalizada (u.a.)

Tempo (min.)

A - Fotodegradação PpIX

B - Fotodegradação PpIX

Ajuste teórico - A

Ajuste teórico - B

Figura 57 - Gráfico comparativo – Com e sem linha de base

O estudo da fotodegradação da PpIX em função do tempo de irradiação é de

extrema importância para a dosimetria na TFD, pois como são apresentados nos

gráficos de fotodegradação, a partir de 10 minutos de irradiação provavelmente toda

a PpIX foi degradada. Sendo assim, não seria mais necessário mais 30 minutos de

irradiação já que o procedimento de TFD só é efetivo no momento em que os 3

elementos básicos da terapia estão presentes, ou seja, o agente fotosensibilizador,

que neste caso é a presença de PpIX,; a fonte de irradiação; e o oxigênio molecular.

No momento que um destes itens deixa de existir, a terapia não tem mais efeito.

Diante destes dados, é possível planejar uma terapia com maior efetividade,

já que os dados apontam que não seria necessário o tempo de irradiação de 40

minutos, empregando a irradiância do equipamento, e sim a terapia poderia ter sido

realizada com apenas 10 minutos de irradiação, trazendo grandes vantagens para o

paciente.

4.1.3 Conclusão

Com este experimento foi possível evidenciar que a partir de 10 minutos de

irradiação toda a PpIX foi degradada, empregando o protocolo, mostrando que o

sistema de imagens de fluorescência desenvolvido pode ser utilizado como uma

ferramenta de extrema importância para o estudo da dosimetria do tratamento da

Queratose Actínica por TFD.

4.2 FOTODEGRADAÇÃO DA PROTOPORFIRINA IX – HPV

Este trabalho faz parte do projeto financiado pelo CNPq Processo nº 551201-

2007, que pretende desenvolver e implementar a TFD no tratamento ambulatorial de

lesões em vulva, vagina e ânus causadas por Papilomavírus humano (HPV). Trata-

se de estudo do tipo caso-controle, que se iniciou em junho de 2008.

4.2.1 Material e método

O projeto foi analisado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(HC-FMRP/USP), em sua 265ª Reunião Ordinária, realizada em 28 de abril de 2008

e enquadrado na categoria APROVADO, de acordo com o Processo HCRP no

2079/2008. Também foi aprovado pelo Conselho de Ensino, Pesquisa e Extensão do

Centro Universitário de Araraquara, em reunião realizada dia 11 de setembro de

2008, Ofício 33/2008-CIEPesquisa/UNIARA.

A seleção das pacientes está sendo consecutiva e não aleatória. Estão sendo

selecionadas pacientes encaminhadas ao Ambulatório do Setor de Moléstias Infecto-

Contagiosas em Ginecologia e Obstetrícia (SEMIGO) devido ao diagnóstico de

infecção pelo HPV (clínica e/ou subclínica) portadoras ou não da infecção pelo HIV e

também do Posto de Saúde do Jardim Paulstano associado à Faculdade de

Medicina da UNIARA, em Araraquara.

O objetivo do projeto é o desenvolvimento e a implantação da TFD no

tratamento ambulatorial do condiloma acuminado. Foi selecionado um grupo de 10

pacientes que apresentavam lesões clínicas HPV induzidas (condilomas),

confirmadas previamente por biópsia e exame anátomo-patológico das lesões.

Todas as pacientes são assistidas pelo Ambulatório do Setor de Moléstias Infecto-

Contagiosas em Ginecologia e Obstetrícia e pelo Ambulatório de Genitoscopia da

UBS Jardim Paulistano da cidade de Araraquara-SP e submetidas ao protocolo de

seguimento onde são realizadas sorologias para as DST (ELISA HBsAg, ELISA Anti

HCV, VDRL e ELISA Anti HIV), coleta da colpocitologia tríplice, colposcopia e

vulvoscopia.

Para a aplicação da TFD, foi desenvolvido um sistema de iluminação

utilizando LEDs emitindo em 630nm, acoplados à dispositivos anatômicos

especialmente projetados para cada caso (patente INPI registro no

000022076297595). Esses dispositivos foram desenvolvidos no Laboratório de

Apoio Tecnológico (LAT, IFSC/USP) onde passaram por testes de conformidades

dos equipamentos eletromédicos. Este dispositivo desenvolvido para tratamento do

HPV pode ser visualizado na Figura 58.

Figura 58 - Sistema de tratamento do HPV

As pacientes foram submetidas previamente à aplicação de pomada à base

de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) sobre as lesões, permanecendo de 4 a 6 horas

sob o efeito desta medicação e, após este período foram submetidas às unidades de

iluminação, utilizando-se os LED, por aproximadamente 20 minutos. A intensidade

utilizada foi de aproximadamente 150 mW/cm

Para o acompanhamento da fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação, foi utilizado o sistema desenvolvido de imagens de fluorescência e uma

câmera fotográfica SONY H50, acoplada ao sistema para registro das imagens.

Todas as imagens foram tiradas com uma lente macro 74 milímetros e utilizou-se o

aumento óptico da câmera de 6x, como anteriormente.

A fim de se acompanhar a fotodegradação da PpIX em função do tempo de

irradiação foram feitas imagens com o sistema de fluorescência em tempos de 0

minutos, ou seja, antes da irradiação e após o início da irradiação em tempos de 2, 4

6, 8 minutos. Todas as imagens de fluorescência foram obtidas em uma sala escura,

para que a iluminação ambiente não mascarasse as imagens de fluorescência

capturadas. A cada aquisição de imagem a irradiação do sistema de tratamento do

HPV era interrompida.

Para a quantificação da fotodegradação da PpIX foi selecionada 1 lesão, onde

esta possui um conjunto de 5 imagens de fluorescência, que correspondem aos

tempos de 0, 2, 4, 6 e 8 minutos de irradiação.

As imagens de fluorescência selecionadas passaram por um algoritmo de

quantificação da PpIX, escrito em Matlab

7.5 (The MathWorks, USA). O algoritmo

consiste basicamente na quantificação de intensidade da matriz de cores R da

imagem RGB.

4.2.2 Resultados e discussão

A sequência de imagens da fotodegradação da Protoporfirina IX (PpIX), em

função do tempo de irradiação é mostrada na Figura 59, onde a sequência de

imagens é representada de A a F: A representa uma imagem utilizando iluminação

branca, e de B a F os tempos de coleta das imagens de 0, 2, 4, 6, 8 minutos durante

a irradiação, respectivamente.

A sequência de imagens da Figura 59, de B a F, representa as imagens de

fluorescência sem processamento, onde a fluorescência na região do verde é

relativa à autofluorescência da pele e a fluorescência na região do vermelho é

relativa à PpIX.

Na Figura 59 é observado que a fluorescência na região do vermelho, ou seja,

fluorescência da PpIX vai diminuindo em função do tempo de irradiação,

evidenciando os processos de fotodegradação da PpIX.

Figura 59 - Fotodegradação da PpIX – sem processamento

min.

Na Figura 60 é mostrada a sequência de imagens utilizando o algoritmo de

processamento escrito em Matlab, onde é mostrada somente a fluorescência da

PpIX.

Figura 60 - Fotodegradação da PpIX – Imagens processadas

min.

Com a utilização do processamento das imagens foi quantificado a

intensidade de fluorescência da PpIX. Para o conjunto de 5 imagens, onde foi

calculada a intensidade de toda a imagem, após o cálculo da intensidade, estas

foram normalizadas pelo máximo de intensidade de fluorescência, que corresponde

ao tempo 0.

Na Figura 61 é mostrado o gráfico de fotodegradação da PpIX em função do

tempo de irradiação da lesão selecionada, onde a fotodegradação decai

exponencialmente com o tempo de irradiação, que está ao redor de 8 minutos de

irradiação, evidenciando que após 8 minutos de irradiação toda a PpIX foi

degradada.

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Fotodegradação da PpIX

Ajuste teórico

Intensidade (u.a.)

Tempo (min)

Figura 61 - Gráfico de fotodegradação da PpIX em função do tempo

4.2.3 Conclusão

Os dados obtidos com o experimento de fotodegradação da PpIX no

tratamento do HPV por TFD são similares aos dados obtidos no trabalho de

fotodegradação da PpIX para tratamento da Queratose Actínica por TFD,

evidenciando que o sistema de imagens de fluorescência desenvolvido também

pode ser utilizado nos trabalhos da dosimetria da TFD para o tratamento do HPV.

4.3 VISUALIZAÇÃO DE COLONIAS MICROBIANAS ORAIS

Este experimento faz parte do projeto de mestrado de Vitor Hugo Panhoca ,

aluno do Programa de Pós Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento, do Curso

de Biotecnologia, da Universidade Federal de São Carlos – UFSCar, cujo projeto é

intitulado de “Efeitos da Terapia Fotodinâmica no controle bacteriano na superfície

dentária comparando uso de pastilha e spray contendo fotossensibilizador”.

O sistema desenvolvido visa o auxílio do profissional da odontologia na

identificação do biofilme oral, aqui foram explorados apenas alguns dados obtidos já

que o projeto ainda está em andamento, assim serão apresentados alguns

resultados e futuras aplicações deste sistema.

A Figura 62 mostra a colonização por bactérias nos dentes, através da

imagem de fluorescência na região do vermelho, indicado pelas setas. Esta imagem

foi realizada após 36 horas da última escovação do voluntário. Esta colonização se

deve a não higienização, promovendo o processo de proliferação de bactérias.

Figura 62 - Dentes com colonização de bactérias

Na Figura 63 observa-se pela imagem de fluorescência na região do

vermelho, a colonização por bactérias na região da língua, devido à não

higienização. Esta imagem foi obtida após 36 horas da última escovação.

Figura 63 - Língua com colonização de bactérias

Outra aplicação que poderá ser explorada com o sistema é a identificação e

visualização de outros materiais presentes na região bucal, tais materiais podem ser

resinas oriundas de restaurações, prótese dentaria e outros matérias.

Essa diferenciação é possível através da fluorescência de cada composto, um

exemplo desta diferenciação é apresentado na Figura 64, onde na Figura 64 - A

temos uma imagem utilizando iluminação branca e na Figura 64 – B temos uma

imagem de fluorescência. Na imagem de fluorescência é possível identificar uma

fluorescência bem acentuada na região do verde dada pelos dentes naturais que

estão na borda da imagem e a ausência de fluorescência nos 3 dentes ao centro,

que são próteses.

Figura 64 - Imagem de diferenciação de materiais através de fluorescência – A- imagem com

iluminação branca e B – imagem de fluorescência

5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

O desenvolvimento do sistema de imagem de fluorescência mostrou-se ser

um protótipo auxiliar para tratamentos realizados por terapia fotodinâmica.

Foi ainda possível desenvolver um sistema compacto, agregando iluminação

e visualização, tornando-o num protótipo com interface para uso clínico.

Um dos principais fatores para obtenção de bons sinais de fluorescência é a

potência óptica do sistema de iluminação, que neste caso foi de 250mW. Outro fator

é o comprimento de onda da iluminação obtido, com uma banda de iluminação

eficaz de 390nm a 460nm e que possui boa uniformidade para excitação das

amostras. O sistema de filtros ofereceu um excelente sinal de fluorescência, bem

como um bom contraste.

Com este sistema foi possível acompanhar a fotodegradação da PpIX em

função do tempo de iluminação durante a TFD tanto para a TFD aplicada para

Queratose Actínica, quanto para TFD aplicado no tratamento do HPV. Assim,

proporcionando uma nova ferramenta extremamente importante para o avanço da

dosimetria da TFD, podendo otimizar e personalizar a TFD para cada paciente, já

que o sistema desenvolvido permite a visualização da presença do agente

fotossensível na Terapia.

Outro ponto de extrema importância também alcançado foi a visualização da

presença de microrganismos da microbiota oral, já que estes são os grandes

responsáveis pelas doenças bucais como é o caso da cárie dental.

Desta forma, conclui-se que um novo protótipo, para o auxílio efetivo da

visualização do biofilme bucal e indispensável para dosimetria em técnicas de

terapia fotodinâmica foi desenvolvido neste trabalho.

REFERÊNCIAS

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absorção de ácido 5-aminolevulínico para Terapia Fotodinâmica do câncer

de pele: avaliação in vitro e in vivo da permeação e retenção cutâneas.

73f.Tese(Doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.

2. BOYLE, P.; LEVIN, B. (2008). World cancer report. Lyon: IARC.

3. STEWART, B.W.; P. KLEIHUES (2003). World Cancer Report. Lyon: IARC.

4. INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER(2009). Estimativa 2010: incidência de

câncer no Brasil. Rio de Janeiro: INCA.

5. BADIZADEGAN, K. et al. (2004). Spectroscopic diagnosis and imaging of

invisible pre-cancer. Faraday Discuss, v.126, p. 265-79;

6. WAGNIERES, G.A.; STAR, W.M.; WILSON, B.C. (1998). In vivo fluorescence

spectroscopy and imaging for oncological applications. Photochemistry

Photobiology, v.68, n.5, p. 603-32.

7. MELLER, C. et al., (2006). A new in vivo method for measuring cáries activity

using quantitative light-induced fluorescence. Caries Research, v.40, n.2, p. 90-

8. ROBLYER, D. et al., (2008). Multispectral optical imaging device for in vivo

detection of oral neoplasia. Journal Biomedical Optics, v.13, n.2, p. 024019.

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