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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Programa de Pós-graduação em Neurociências
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE NEPH EM CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
DIFERENCIADAS PARA O FENÓTIPO NEURONAL IN VITRO
MARIA CECILIA KOHLER
Florianópolis
2009
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MARIA CECILIA KOHLER
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE NEPH EM CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
DIFERENCIADAS PARA O FENÓTIPO NEURONAL IN VITRO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Neurociências da Universidade
Federal de Santa Catarina, como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre.
Orientador: PROF.DR. MARCIO ALVAREZ SILVA
Florianópolis
2009
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu orientador, prof.Dr. Márcio Alvarez Silva
por aceitar me orientar no aprendizado experimental, por dispor de suas horas
preciosas para me ensinar. Fazendo parte dessa mesma equipe, prof
a
.Dra. Andréa
Trentin, esse trabalho não seria possível sem as suas dedicações e competências,
muito obrigada.
É muita pretensão quem pensa que realiza seu trabalho sozinho, portanto
agradeço a todos os integrantes do laboratório. Não vou citar nome por nome, cada
um de vocês sabe da sua real contribuição para a conclusão dessa dissertação.
Muitos me auxiliaram diretamente ou indiretamente durante essa jornada, mas todos
com igual importância, pois nossos “happy hours” foram essenciais para tornar
minha estada longe de casa mais suportável.
Não posso deixar de mencionar a minha gratidão às mães doadoras, pois
essa obra não se concretizaria apenas com a nossa vontade, era preciso que muitos
acreditassem nela e em nós.
São muitas as pessoas que passam por nós, mas apenas as que nos amam
compreendem por vezes, nossa ausência, nosso desafeto, nossa ingratidão. Pai,
Mãe, muito obrigada por tudo e desculpa alguma coisa.
Rafa, meu namorado, agradeço pelos bons dias que não retribuí, pelos
beijos que não lhe correspondi, pelas várias tarefas que reivindicou para me atender,
pelas vezes que não atendi os seus pedidos tão carinhosos por companhia, enfim
pelo amor inesgotável, sem cobranças que sempre me dedicou.
Minha única, inigualável, maravilhosa maninha, Ana, obrigada por sempre
acreditar em mim. Quantas horas de conversas no skype me incentivando sempre
com aqueles discursos positivos. Saudades, volta logo.
Aos meus “velhos” amigos quero crer que estive em pensamento, pois sei
que muito tenho culpa pelo nosso afastamento. Neste momento, é inevitável a
vontade de poder voltar atrás, e com isso, talvez, ter dado mais valor às amizades,
sabendo com isso abdicar por alguns momentos das horas de estudo. É pela
compreensão da minha maneira de ser que só tenho a agradecer por vocês
existirem em minha vida.
Sendo assim, espero que todo esforço tenha valido a pena!
“Somente a esperança em um futuro mais promissor pode gerar força
no presente. Portanto, é fundamental que a visão do seu dia de
amanhã não seja a de mais um dia que o mundo vai lhe dar, mas sim
a de um dia em que o mundo lhe ofereceu mais uma oportunidade de
realizar algo que lhe dê satisfação e felicidade.”
(César Romão)
RESUMO
Além do papel essencial no desenvolvimento e nutrição fetal, a placenta humana
oferece uma fonte de células tronco (CTs). CTs são definidas como células
indiferenciadas com capacidade de autorrenovação e potencial para diferenciarem-
se em pelo menos dois fenótipos. Essas características podem provar sua utilidade
em terapia celular com aplicações clínicas. Contudo, sabe-se que para diferenciação
in vitro das CTs são necessários alguns fatores indutivos que são utilizados de
acordo com o fenótipo desejado. Quando busca-se um fenótipo neuronal, já bem
descrito na literatura, o ácido trans-retinóico (ATRA) é uma excelente escolha. As
ações do ácido retinóico (AR) são mediadas por receptores nucleares, os quais
controlam a transcrição de genes através de diferentes elementos ligantes. Durante
o desenvolvimento do sistema nervoso, muitas proteínas de membrana estão
envolvidas nos vários processos biológicos das células neuronais. Um grupo dessas
proteínas que tem sido pouco estudada, é a da família NEPH, sendo composta por
três tipos: NEPH1; NEPH2 e NEPH3. Todos os membros da família NEPH são
expressos no córtex renal porém, vários estudos relatam a expressão de neph1 e
neph2 em diversos outros tecidos que apóiam a hipótese dessa expressão estar
envolvida na diferenciação neuronal. No presente estudo realizamos a indução
química das CTs mesenquimais derivadas da placenta humana (CTMph) ao fenótipo
neuronal através da utilização de ATRA e -mercaptoetanol, visando analisar a
expressão de neph no processo de diferenciação. As CTMph apresentaram
marcadores imunofenotípicos de células indiferenciadas e de células tronco
mesenquimais (CTMs) com morfologia fibroblastóide característica. As CTMph
tratadas in vitro apresentaram redução desses marcadores, além da mudança
morfológica semelhante ao fenótipo neuronal, incluindo prolongamentos. Quanto a
expressão de nestina, gene relacionado ao fenótipo neuronal, a expressão
imunofenotípica não apresentou relevância estatística, mas uma tendência a
diminuir os seus níveis quando comparadas ao controle (CTL). Por imunocitoquímica
analisamos a expressão de neurofilamento (NF), um marcador de neurônio
diferenciado. A expressão de NF diminuiu estatisticamente nas primeiras 24 horas
nas CTMph tratadas em relação ao CTL. Porém, permaneceu essa tendência de
redução sem significância estatística. Quanto a análise da expressão de neph1 e 2,
por RT-PCR, essa expressão parece diminuir nas CTMph tratadas. Os resultados
encontrados são consistentes com uma diferenciação neuronal, onde sugerimos que
a expressão de neph pode estar relacionada a manutenção das CTMph em um
estado indiferenciado ou até mesmo manutenção de um progenitor neuronal mais
diferenciado.
Palavras-chave: Células tronco; Células tronco mesenquimais derivadas da
placenta humana; Ácido trans-retinóico; neph 1; neph 2; neph3..
ABSTRACT
Human placenta plays a fundamental and essential role in fetal development and
nutrition. This rudiment may also function as a reserve of stem cells (SCs). SCs are
undifferentiated cells with self renewal capacity and capable of differentiating at least
into two different tissues. These features could be useful for future cell therapy-based
applications. However, SCs differentiation in vitro is induced by inductive factors that
are used in accordance with the desired phenotype. To differentiate into neuronal
phenotype under experimental cell culture conditions, the all trans retinoic acid
(ATRA) is an excellent choice. The actions of retinoic acid (AR) are mediated by
nuclear receptors that control the trascription of target genes. During the nervous
system development many membrane proteins are involved in biological processes.
A group of proteins poorly studied, are proteins of NEPH family, being composed of
three types: NEPH1, NEPH2 and NEPH3. All the members of NEPH family are highly
expressed in the renal cortex, however some studies describe the expression of
neph1 and neph2 in other tissues as well in brain during development, that supports
the hypothesis of these proteins may be involved in neuronal differentiation. In our
study we induced morphological changes in mesenchymal SCs derived from human
placenta (MSChp) to neuronal phenotype, with ATRA and -mercaptoethanol,
focusing the expression of neph in these model of differentiation. MSChp presented
markers of pluripotent cells, like other MSCs. MSChp treated in vitro with ATRA
presented decrease of these markers and similar morphological changes to neuronal
phenotype, displaying neurites. When analyzed by RT-PCR the nestin expression
dropped in MSChp treated with ATRA when compared to control cultures (CTL). The
immunophenotype expression of nestin did diminish when compared to the CTL.
Were performed Immunocytochemistry for the expression of the marker of mature
neurons: neurofilament (NF). Its expression diminished in first the 24 hours in the
MSChp treatment of ATRA whem compared to the CTL. RT-PCR showed that the
expression of neph1 and neph2, diminished in the MSChp treated with ATRA. These
results are consistent with a neuronal differentiation. We suggest that the expression
of neph may be related the maintenance of the MSChp in a indifferentiated state or
that its expression may hold the maintenance of a neuronal progenitor phenotype.
Keywords: Stem cells; Human placenta mesenchymal stem cells; All trans retinoic
acid; neph 1; neph 2; neph3.
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA: Análise de variância
AR: Ácido retinóico CTs:
ATRA: Ácido trans-retinóico
CEAH: Células epiteliais amnióticas humanas
CEMAH: Células estromais mesenquimais amnióticas humanas
CEMCH: Células estromais mesenquimais coriônicas humanas
CT: Célula tronco
CTCH: Células trofoblásticas coriônicas humanas
CTEc: Células tronco embrionárias de camundongos
CTEh: Células tronco embrionárias de humanos
CTEs: Células tronco embrionárias
CTHs: Células tronco hematopoiéticas
CTL: Controle
CTMph: Células tronco mesenquimais derivadas da placenta humana
CTMs: Células tronco mesenquimais
CTNs: Células tronco neurais
CTs: Células tronco
CTSs: Células tronco Somáticas
DAPI: 4’,6- diamidino-2-fenilindol dihidroclorido
DMSO: Dimetilsulfóxido
EDTA: Ácido etileno-dinitrilo-tetracético
FITC: Fluoresceína isotiocianato
GAPDH: Gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase
hEEN: Enolase específica de neurônios humano
IgSF: Superfamília das imunoglobulinas (immunoglobulin superfamily)
IMDM: Iscove´s Modified Dulbecco´s Medium
NF: Neurofilamento
PBS: Salina tamponada por fosfato
RAR: Receptor ácido retinóico
RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa
RXR: Receptor X retinóide
SBF: Soro bovino fetal
SMA: Actina de músculo liso
SNC: Sistema Nervoso Central
TCLE: Termo de consentimento livre e esclarecido
TXRD: Texas Red
UFC-F: Unidade Formadora de Colônia-Fibroblastóide
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Regiões da placenta humana. .................................................................... 12
Figura 2. Característica da autorrenovação de CTs por divisão simétrica e
assimétrica.. .............................................................................................................. 13
Figura 3. Origem e potencialidade das CTs. ............................................................. 14
Figura 4. Morfologia das CTMs in vitro obtidas da placenta humana. ....................... 16
Figura 5: Regiões distintas da placenta humana e células que as caracterizam. ..... 19
Figura 6. Diagrama dos possíveis mecanismos de diferenciação das CTSs. ........... 20
Figura 7. Efeitos do AR na formação de homodímeros e heterodímeros, na
regulação gênica para fenótipo adipocítico. .............................................................. 22
Figura 8. Esquema da região da placenta coletada para cultura de CTMs. .............. 26
Figura 9. Morfologia das CTMph. .............................................................................. 31
Figura 10. Expressão de marcadores de CTs indiferenciadas e mesenquimais, em
CTMph. ..................................................................................................................... 32
Figura 11. Morfologia das CTMph após indução ao fenótipo neuronal. .................... 32
Figura 12. Expressão de marcadores de CTs indiferenciadas e mesenquimais, em
CTMph e CTMph tratadas.. ....................................................................................... 33
Figura 13. Expressão de nestina em CTMph e CTMph tratadas. .............................. 34
Figura 14. Quantificação da expressão de CTMph tratadas nestina positivas. ......... 35
Figura 15. Expressão de nestina nas CTMph tratadas em diferentes tempos de
cultura. ...................................................................................................................... 35
Figura 16. Quantificação da expressão de CTMph tratadas, neurofilamento positivas
.................................................................................................................................. 36
Figura 17. Expressão de neurofilamento nas CTMph tratadas em diferentes tempos
de cultura................................................................................................................... 37
Figura 18. Expressão da família de genes neph em CTMph e CTMph tratadas. ...... 38
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
1.1 PLACENTA HUMANA ......................................................................................... 11
1.1.1 Desenvolvimento e estrutura anatômica ...................................................... 11
1.2 CÉLULAS TRONCO ........................................................................................... 12
1.2.1 Características ................................................................................................ 12
1.2.2 Células tronco embrionárias ......................................................................... 14
1.2.3 Células tronco somáticas .............................................................................. 15
1.2.4 Células tronco mesenquimais ....................................................................... 15
1.2.5 Células tronco obtidas de placenta humana ............................................... 17
1.3 DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO IN VITRO .................................... 20
1.3.1 Ácido retinóico ............................................................................................... 21
1.3.2 Papel dos genes neph na diferenciação neural ........................................... 23
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 25
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 25
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 25
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 26
3.1 PLACENTA HUMANA ......................................................................................... 26
3.2 ISOLAMENTO E CULTURA DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE
PLACENTA ............................................................................................................... 27
3.3 DIFERENCIAÇÃO NEURONAL DAS CTMS PELO TRATAMENTO COM ÁCIDO
TRANS-RETINÓICO E Β-MERCAPTOETANOL ....................................................... 27
3.4 ANÁLISE IMUNOCITOQUÍMICA E FENOTÍPICA ............................................... 28
3.5 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE VIA TRANSCRIPTASE REVERSA
(RT-PCR) .................................................................................................................. 28
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 30
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 31
4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO OBTIDAS DE PLACENTA
HUMANA ................................................................................................................... 31
4.2 EFEITO DA INDUÇÃO NEURONAL NAS CTMph .............................................. 32
4.2.1 Análise morfológica ....................................................................................... 32
4.2.2 Análise da expressão gênica e imunofenotípica ......................................... 33
4.3 INFLUÊNCIA DA FAMÍLIA DE GENES NEPH NA DIFERENCIAÇÃO DAS
CTMph PARA O FENÓTIPO NEURONAL ................................................................ 37
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 39
5.1 EFEITO DA INDUÇÃO NEURONAL NAS CTMph .............................................. 40
5.2 INFLUÊNCIA DA FAMÍLIA DE GENES NEPH NA DIFERENCIAÇÃO DAS
CTMph PARA O FENÓTIPO NEURONAL ................................................................ 43
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 47
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 48
ANEXO A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) ..................... 54
11
1 INTRODUÇÃO
1.1 PLACENTA HUMANA
1.1.1 Desenvolvimento e estrutura anatômica
Em humanos, após a fertilização, por volta do sexto-sétimo dia o blastocisto
é implantado e inicia o desenvolvimento da placenta. Neste estágio o blastocisto é
achatado e composto de uma parede externa, o trofoblasto. A cavidade blastocística
é composta por um pequeno grupo de células maiores, a camada celular interna,
que dará origem ao embrião, cordão umbilical e epitélio amniótico (PAROLINI et al.,
2008).
Já no oitavo-nono dia após a fertilização, as células trofoblásticas
proliferam, gerando uma forma de trofoblasto bilaminar. O exterior das duas
camadas transforma-se em sincíciotrofoblasto pela fusão de células
trofoblásticas, visto que as células internas (citotrofoblásticas) permanecem
temporariamente sem fundir. Esses citotrofoblastos proliferando e o
sincíciotrofoblasto formam um sistema de trabéculas intermediárias a colunas
hemáticas. A partir dessas trabéculas são originadas as primeiras vilosidades
que são distribuídas por toda a periferia da membrana coriônica. As
vilosidades em contato com o decídua basal proliferam para dar forma ao
córion (PAROLINI et al., 2008). Essa rápida proliferação trofoblástica e
desenvolvimento do saco coriônico e das vilosidades coriônicas caracterizam
o início do desenvolvimento da placenta (MOORE; PERSAUD, 2008) (Figura
1).
Ao final da terceira semana, o arranjo anatômico necessário para as
trocas fisiológicas entre a mãe e o feto, já está estabelecido (MOORE;
PERSAUD, 2000).
Após o seu completo desenvolvimento, a placenta humana apresenta uma
12
forma discóide, com diâmetro variável entre 15 e 20 centímetros e uma espessura
entre dois e três centímetros (PAROLINI et al., 2008).
Além do papel essencial no desenvolvimento e nutrição fetal, a placenta
humana oferece uma fonte de células tronco (CTs) (PAROLINI et al., 2008).
Figura 1. Regiões da placenta humana. Relação do córion viloso (parte fetal da placenta) com o
decídua basal (parte materna da placenta).
Fonte: Adaptado de Moore e Persaud (2008).
1.2 CÉLULAS TRONCO
1.2.1 Características
CTs são definidas como células indiferenciadas com capacidade de
autorrenovação e obrigatoriamente apresentam potencial para diferenciarem-se em
pelo menos dois fenótipos. A característica de autorrenovação é mantida tanto por
divisões simétricas quanto assimétricas. Quando há divisão simétrica, as duas novas
células geradas, células filhas, são idênticas à célula tronco (CT) de origem ou
precursora; na divisão assimétrica, somente uma célula será idêntica a CT de origem
e a outra seguirá na via para a diferenciação (ULLOA-MONTOYA et al., 2005). A via
para diferenciação envolve primeiramente a diferenciação de uma célula filha
subsequente denominada de célula progenitora, a qual prolifera antes da
13
diferenciação propriamente dita. Devido à sua multiplicação durante a fase de
proliferação, os progenitores são frequentemente denominados de células em
trânsito de amplificação (Figura 2) (RAFF, 2003).
Figura 2. Característica da autorrenovação de CTs por divisão simétrica e assimétrica. a) CTs
(laranja) apresentam a característica de autorrenovação e proliferação de células diferenciadas
(verde). b-d) Mecanismos de manutenção de um balanço de CTs e uma progênie de células
diferenciadas. b) Divisão celular assimétrica, na qual a CT gera uma CT filha e uma destinada a
diferenciação. c) Divisão celular simétrica: na qual a CT divide-se simetricamente, gerando duas CTs
filhas ou duas células diferenciadas. d) Combinação das divisões celulares: CTs podem dividir-se
tanto simetricamente quanto assimetricamente.
Fonte: Adaptado de Morrison e Kimble (2006).
As CTs podem ser divididas em dois grandes grupos conforme o tecido de
origem das mesmas, em: Células Tronco Embrionárias (CTEs) e Células Tronco
Somáticas (CTSs). CTSs são originadas dos mais diversos tecidos adultos e fetais,
após a fase de gastrulação, enquanto CTEs são derivadas da massa interna do
blastocisto do embrião (Figura 3A) (TAUPIN, 2006).
Conforme a potencialidade de diferenciação, as CTs são classificadas em
pluripotente ou multipotente. As CTEs são células pluripotentes porque podem
originar todas as células do embrião, ou seja, são capazes de originar as três
camadas germinativas: mesoderme, ectoderme e endoderme, porém não são
consideradas totipotentes, pois não possuem a capacidade de gerar os tecidos extra
embrionários necessários para o desenvolvimento fetal. Já as CTSs são CTs que
dão origem a mais de um fenótipo sendo caracterizadas como multipotentes (Figura
3B) (RAFF, 2003; ULLOA-MONTOYA; VERFAILLIE; HU, 2005; TAUPIN, 2006).
14
Figura 3. Origem e potencialidade das CTs. A) CTEs: CTs originadas da camada interna do
blastocisto, pluripotentes. B) CTSs: CTs originadas de tecidos fetais e adultos, multipotentes.
Fonte: Mingroni-Netto e Dessen (2009).
1.2.2 Células tronco embrionárias
Como anteriormente descrito, CTEs são células originadas da camada
interna do blastocisto, capazes de diferenciarem-se em células das três camadas
germinativas, sendo pluripotentes (ULLOA-MONTOYA et al., 2005; YEN et al.,
2005). Primeiramente estas células foram obtidas de camundongos e mais
recentemente de humanos (MARTIN, 1981; THOMSON et al., 1995; THOMSON et
al., 1998). Um aspecto marcante destas células tronco embrionárias de
camundongos (CTEc) após expansão e manutenção destas in vitro, foi a capacidade
de reintegrar a embriogênese quando injetadas antes da implantação do embrião,
produzindo uma progênie diferenciada funcional em todos os tecidos e órgãos
(SMITH, 2001 apud ULLOA-MONTOYA et al., 2005). Em princípio, células tronco
embrionárias de humanos (CTEh) podem ser capazes de produzir os mesmos
resultados, contudo, por razões éticas, ainda não foi possível demonstrar. Porém, o
que tem sido demonstrado é que tanto a injeção com CTEc quanto de CTEh, em
animais adultos, geram tumores de diferentes tipos, denominados de teratomas
(WOBUS; HOLZHAUSEN, 1984 apud ULLOA-MONTOYA et al., 2005). A presença
de células das três camadas germinativas nestes tumores comprova a
pluripotencialidade destas células .
É imprescindível a conquista da eliminação dessa gênese tumoral para
alcançar uma aplicação terapêutica destas células. Bem como, exclusão de
A
B
15
problemas éticos que limitam sua utilização em decorrência de serem células
originadas da camada celular interna do blastocisto.
1.2.3 Células tronco somáticas
As CTSs são também denominadas de células tronco adultas e atendem a
todos os critérios que caracterizam uma CT. Porém, tanto a capacidade de
autorrenovação quanto o potencial de diferenciação são mais restritos do que nas
CTEs (ULLOA-MONTOYA et al., 2005).
Dentre os vários tipos de CTSs, as células tronco hematopoiéticas (CTHs)
são as mais bem estudadas. Sendo que se conhece já a descrição hierárquica do
sistema hematopoiético com marcadores de superfície caracterizados para os
progenitores e os oito tipos de células sanguíneas diferenciadas (ULLOA-MONTOYA
et al., 2005).
Um número considerável de outras CTSs, têm sido estudadas, dentre elas:
Células tronco neurais (CTNs) (GAGE, 2000 apud ULLOA-MONTOYA et al., 2005);
Células tronco mesenquimais (CTMs) diferenciando-se em fibroblastos,
osteoblastos, condroblastos, adipócitos e músculo esquelético (PITTENGER;
MACKAY et al., 1999; PROCKOP, 1997; FRIDENSHTEIN, 1982 apud ULLOA-
MONTOYA et al., 2005); Células tronco gastrointestinais (POTTEN, 1998); Células
tronco epidermais (WATT, 1998); entre outras.
1.2.4 Células tronco mesenquimais
Um dos mais extensivos estudos de populações multipotentes de CTSs, têm
sido de CTMs obtidas da medula óssea (PITTENGER; MACKAY, 1999 apud YEN et
al., 2005).
A medula óssea apresenta dois tipos de CTSs: As Células Tronco
Hematopoiéticas (CTHs), que são responsáveis em formar a linhagem sanguínea; e
as Células Tronco Não Hematopoiéticas, também denominadas de CTMs,
16
responsáveis pela manutenção do estroma medular (células diferenciadas:
adipócitos, células endoteliais e fibroblastos) (ZHANG et al., 2004; ABDEL AZIZ et
al., 2007).
Como descrito CTMs in vitro, além de formar o estroma medular podem se
diferenciar em outros fenótipos, como: adipócitos, cardiomiócitos, células epiteliais,
células gliais, hepatócitos, miócitos, osteoblastos e neurônios (FRIEDENSTEIN et
al., 1974; CAPLAN, 1994; DEANS et al., 2000; MINGUELL et al., 2000; PITTENGER
et al., 2004, CHAMBERLAIN et al., 2007; OHNISHI et al., 2007 apud IN 'T ANKER et
al., 2004; PITTENGER et al., 1999 apud ZHANG et al., 2004; REYES et al., 2001).
Alexander Friedenstein e Maureen Owen foram os primeiros a utilizar CTMs
em transplantes de animais em laboratório. Em seus estudos, observaram que a
CTMs quando plaqueadas em baixas densidades rapidamente aderem ao plástico e
são facilmente separadas das células hematopoiéticas não aderentes por repetidas
lavagens. Em condições apropriadas de cultura, CTMs são derivadas de um
progenitor comum que formam colônias, a Unidade Formadora de Colônia-
Fibroblastóide (UFC-F). Sendo, por fim, determinada a seguinte definição de CTMs
obtidas da medula óssea in vitro, são rapidamente aderentes e clonogênicas, e
capazes de extensa proliferação (BIANCO et al., 2001).
As CTMs obtidas da medula óssea apresentam duas possíveis morfologias,
uma alongada semelhante aos fibroblastos e outra mais poligonal semelhante a
células epiteliais (Figura 4) (BIANCO et al., 2001).
Figura 4. Morfologia das CTMs in vitro obtidas da placenta humana. A) Forma poligonal das
CTMs. B) Forma achatada, fibroblastóide das CTMs.
Fonte: Adaptado de Muraglia, Cancedda e Quarto (2000).
Quanto aos marcadores de superfície celular que não estão presentes nas
CTMs, há um consenso. Sendo os seguintes: CD11b (marcador celular imune);
A
B
17
CD45 (marcador de todas as células hematopoiéticas); CD34 (marcador primitivo de
célula tronco hematopoiética) raramente expresso em CTMs humanas porém,
positivo em CTMs de camundongo; CD31 (marcador de células hematopoiéticas e
endoteliais); CD117 (marcador celular/progenitor tronco hematopoiético). Porém,
não há um marcador positivo específico para as CTMs da medula óssea (KOLF et
al., 2007).
Conforme revisão de Kolf, Cho e Tuan (2007), a combinação de Stro-1 e
CD106, formam um marcador humano para CTMs. Mas não se pode esquecer que
esta expressão é muito variável com as condições in vitro, como por exemplo,
comportamento da expressão durante a expansão da cultura. Existe um consenso
na literatura sobre a expressão de genes específicos envolvidos na autorrenovação
das CTMs que preservam o estágio indiferenciado: Oct-4; Sox-2 e Rex-1 (KOLF et
al., 2007). Sendo assim, a caracterização de CTMs in vitro, através de marcadores
de superfície, é difícil e deve ser feito através de uma combinação de diferentes
moléculas para avaliar a identidade da CTM.
Em contrapartida, as CTMs provenientes da medula óssea adulta são
escassas e diminuem consideravelmente com a idade (FUKUCHI et al., 2004; IN 'T
ANKER et al., 2004). Estima-se que as CTMs representam de 0,01-0,0001% da
população das células nucleadas da medula óssea humana de adultos (MIAO et al.,
2006).
Recentes estudos demonstraram outras fontes de CTMs, com diferente
frequência e variada capacidade de diferenciação. Essas fontes incluem: rins,
pulmões e fígado; e tecidos fetais, tais como: sangue do cordão umbilical, fígado
fetal e placenta (BATTULA et al., 2007).
1.2.5 Células tronco obtidas de placenta humana
Vários grupos têm voltado suas atenções para a placenta humana como
uma possível fonte de CTs devido a alguns fatores existentes neste tecido. Primeiro,
pelo fato da placenta ser originada durante os primeiros estágios do
desenvolvimento embrionário, reforça a possibilidade deste tecido conter células
com algum grau de plasticidade, similar à células dos estágios mais precoces do
18
desenvolvimento embrionário, a partir das quais derivam. Segundo, pelo fato da
placenta ser fundamental para a manutenção da tolerância feto-materna durante a
gestação, sugere-se que células presentes neste tecido apresentam características
imunomodulatórias. Assim, estas células poderão ser capazes de diferenciarem-se
em diferentes tipos celulares e ainda, serem utilizadas em enxertos alogênicos
(EVANGELISTA et al., 2008).
A hipótese de que o tecido da placenta apresenta células pluripotentes é
devido a placenta ser originada antes da fase de gastrulação e às células
embrionárias pré-gastrulação apresentarem o potencial para diferenciação em
diferentes linhagens (EVANGELISTA et al., 2008).
Há quatro regiões distintas na placenta humana com populações de células
diferentes. A região epitelial amniótica apresenta células epiteliais amnióticas
humanas (CEAH); região mesenquimal amniótica contém células estromais
mesenquimais amnióticas humanas (CEMAH); região mesenquimal coriônica com
células estromais mesenquimais coriônicas humanas (CEMCH) e por fim, a região
trofoblástica coriônica comporta células trofoblásticas coriônicas humanas (CTCH)
(Figura 5). Essas células originadas de diferentes camadas, apresentam uma
plasticidade variável. Sendo que, na literatura essa plasticidade tem sido utilizada
para descrever células isoladas da placenta. Porém, nem todas as células derivadas
desse tecido foram claramente evidenciadas quanto as características marcantes de
CTs: autorrenovação e diferenciação fenotípica. Interessantemente CTs obtidas das
diferentes regiões da placenta apresentam características semelhantes à células
estromais mesenquimais derivadas de medula óssea, sendo elas, CEMAH e
CEMCH (PAROLINI et al., 2008).
19
Figura 5: Regiões distintas da placenta humana e células que as caracterizam.
Fonte: Adaptado de Marcus e Woodbury (2008).
No primeiro Workshop Internacional de Células Tronco Derivadas da
Placenta, em 2007, foram definidos alguns critérios para classificar as células tronco
mesenquimais derivadas da placenta humana (CTMph), sendo os seguintes:
aderência ao plástico, formação de UFC-F, expressão de marcadores de superfície
como: CD90; CD73; CD105; origem fetal e capacidade de diferenciação em uma ou
mais linhagens, incluindo osteogênica, adipogênica, condrogênica, e
vascular/endotelial (PAROLINI et al., 2008).
As CTMph apresentam características morfológicas semelhantes as
provenientes da medula óssea humana, e representam linhagens de células
provenientes da placenta por apresentarem marcadores de superfície celular
correspondentes a essas linhagens. E ainda, expressam vários genes, incluindo
marcadores de hemangioblastos, progenitores de CTHs e célula endotelial, similares
aos das CTMs provenientes da medula óssea humana (FUKUCHI et al., 2004).
Estudos recentes, tem demonstrado que as CTMph quando cultivadas,
possuem a capacidade de diferenciação em dois ou mais fenótipos tais como,
osteócitos e condrócitos (FUKUCHI et al., 2004; MIAO et al., 2006), tanto em
neurônios como em células gliais (ZHANG et al., 2004;ZHANG et al., 2006).
Sendo assim, a placenta humana é uma atrativa e importante fonte de CTs
multipotentes, já que este é um tecido temporário e descartado logo após o parto.
Embora a placenta não apresente células tronco com o mesmo potencial de
proliferação e diferenciação das CTEs, são ainda originadas do feto e sua
plasticidade pode ser superior, em muitos aspectos, às CTSs (YEN et al., 2005).
20
1.3 DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO IN VITRO
Os mecanismos reguladores que determinam quando uma CT irá
diferenciar-se, são ainda usualmente desconhecidos, mas em princípio, isto pode
depender da interação célula-célula, e/ou dos fatores do microambiente (WATT;
HOGAN, 2000; SPRANDING et al., 2001 apud RAFF, 2003).
Por mais que não se saiba ao certo, quais os agentes reguladores desses
mecanismos, algumas teorias são propostas, tais como: transdiferenciação,
desdiferenciação e fusão celular.
A teoria da transdiferenciação é um mecanismo pelo qual o potencial das
CTs pode contribuir para tipos celulares de diferentes linhagens. Esta conversão de
linhagem ocorre diretamente pela ativação de um programa de diferenciação que
não estava sendo expresso, para alterar a linhagem específica da célula (Figura 6A).
Porém, a mudança de diferenciação a uma linhagem específica pode ocorrer pelo
mecanismo da desdiferenciação, ou seja, a célula retorna ao nível mais
indiferenciado (multipotente) e agora sim, poderá diferenciar em uma nova linhagem
(Figura 6B) (WAGERS; WEISSMAN, 2004).
E por fim, a teoria da fusão celular, defende que células diferentes se unem
e essa nova célula formada sofre subsequente transdiferenciação (Figura 6C)
(YAMAGUCHI et al., 2006).
Figura 6. Diagrama dos possíveis mecanismos de diferenciação das CTSs. CTSs (Círculo
laranja); CTs pluripotentes (Círculo azul) e Células diferenciadas (Círculo vermelho e hexágono
verde). A) Teoria da transdiferenciação. B) Teoria da desdiferenciação. C) Teoria da fusão celular.
Fonte: Adaptado de Wagers e Weissman (2004).
21
Contudo, sabe-se que para diferenciação in vitro das CTMs são necessários
alguns fatores indutivos que são utilizados de acordo com o fenótipo desejado.
Para a indução do fenótipo neuronal, um dos objetivos deste trabalho, como
bem descrito na literatura, utiliza-se o Ácido trans- retinóico (ATRA). Conforme
Zhang et al. (2006), o ATRA em altas concentrações induz as CTMs ao fenótipo
neural e reprime a diferenciação em linhagens mesodermais.
1.3.1 Ácido retinóico
As ações do ácido retinóico (AR) são mediadas por receptores nucleares, os
quais controlam a transcrição de genes através de diferentes elementos ligantes. Há
duas famílias distintas desses receptores: Receptor ácido retinóico (RAR) ativados
pelo all-trans e 9-cis ácido retinóico (os dois maiores isômeros naturais do AR) e
Receptor X retinóide (RXR) responsivo somente ao 9-cis ácido retinóico (MILLS et
al.,1996; MARK; GHYSELINCK; CHAMBON, 2009). Os dois isômeros do AR são
encontrados in vivo, porém o mais abundante é o all-trans-AR (ATRA). Enquanto o
13-cis-AR é detectado em baixas concentrações, tanto em camundongos quanto
humanos, o 9-cis-AR nunca foi detectado in vivo (ZIOUZENKOVA; PLUTZKY, 2008).
Os receptores nucleares para AR apresentam uma estrutura modular com
seis diferentes domínios. A família RAR consiste em três subtipos de receptores:
RAR-α, RAR-β e RAR-γ. Assim como a família RAR, a família RXR também
apresenta três isotipos genéticos (MARK; GHYSELINCK; CHAMBON, 2009).
A complexidade das vias de sinalização do AR é decorrente, pelo menos in
vitro, da ligação de RAR aos seus elementos responsivos, resultarem na formação
tanto de homodímeros quanto de heterodímeros (Figura 7) (MARK; GHYSELINCK;
CHAMBON, 2009).
22
Figura 7. Efeitos do AR na formação de homodímeros e heterodímeros, na regulação gênica
para fenótipo adipocítico.
Fonte: Adaptado de Ziouzenkova e Plutzky (2008).
O ATRA e seus derivados são essenciais tanto para o desenvolvimento
embrionário, quanto para o crescimento e diferenciação de muitos tipos celulares em
organismos adultos (MILLS et al.,1996; ROSS et al., 2000).
A ativação de genes que contém elementos responsivos ao ácido retinóico
estão envolvidos em diversos processos biológicos interconectados, tais como:
embriogênese, crescimento e diferenciação celular (ROSS et al., 2000).
Alguns estudos têm relatado a influência do ATRA na indução do fenótipo
neural de CTMs. Yamaguchi et al. (2006) revelaram que a utilização de uma
combinação de fatores indutivos, incluindo ATRA, promoveu a expressão de genes e
marcadores relacionados com o fenótipo neuronal e supressão dos marcadores
mesodermais em células mesenquimais de medula óssea de camundongos. Ainda,
o ATRA induziu paralelamente, apoptose e diferenciação das células sobreviventes
em uma linhagem de células neuronais olfatórias imortalizadas (LAKARD et al.,
2007). Em outro estudo, em uma linhagem de CTNs, o ATRA foi capaz de induzir a
expressão de transportadores de aminoácidos do Sistema Nervoso Central (SNC)
(BIANCHI et al., 2008).
23
Assim, o ATRA parece ser um importante sinal indutivo extrínseco na
diferenciação neural in vitro.
1.3.2 Papel dos genes neph na diferenciação neural
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, muitas proteínas de
membrana estão envolvidas nos vários processos biológicos das células neuronais,
tais como diferenciação celular, migração neuronal, orientação axonal e formação
sináptica. Sendo que a própria manutenção e função neuronal requer vários
processos regulatórios de diferenciação neural (ROUGON; HOBERT, 2003). Para
esses processos há o envolvimento de diferentes proteínas de membrana, sendo
uma delas a superfamília das imunoglobulinas (immunoglobulin superfamily- IgSF)
(ROUGON; HOBERT, 2003; TAMURA et al., 2005).
A identificação e caracterização dos genes que codificam proteínas de
membrana IgSF ajudarão no melhor entendimento dos mecanismos moleculares de
muitos processos biológicos importantes e poderão oferecer-nos meios de
intervenção nestes processos pelo desenvolvimento de moléculas que interagem
com proteínas IgSF (SUN et al., 2003).
Um grupo dessas proteínas pertencente à classe das IgSF que tem sido
pouco estudada, é a da família NEPH, sendo composta por três tipos: NEPH1;
NEPH2 e NEPH3. Todos os membros da família NEPH são expressos no córtex
renal (SELLIN et al., 2003).
NEPH1 contém cinco domínios extracelulares tipo imunoglobulina, é
abundantemente presente nos rins e sua ausência em camundongos resulta em
proteinúria grave e morte pós natal precoce (DONOVIEL et al., 2001; HUBER et al.,
2003). Ainda, a expressão de neph1 é encontrada nas membranas fetais e placenta
de ratos (BEALL et al., 2005).
A expressão de mkirre (homólogo do gene neph2, em mamíferos) em
células estromais de medula óssea de camundongos, é responsável pela
manutenção das CTHs em um estágio indiferenciado (UENO et al., 2003; GERKE et
al., 2005). Sendo que, em camundongos adultos mkirre é detectado nas células
estromais da medula óssea e cérebro, tanto no desenvolvimento quanto na fase
24
adulta, e não nos músculos esqueléticos (UENO et al., 2003; TAMURA et al., 2005).
Ainda, tem sido demonstrado que o mKirre é expresso em neurônios
primários sensoriais durante o desenvolvimento de órgãos sensoriais como cóclea,
gânglios trigeminais, retina e epitétio olfatório (MORIKAWA et al., 2007). O mRNA de
mKirre é largamente expresso em populações neuronais tanto no cérebro de
embriões, quanto no cérebro adulto, em regiões onde novas sinapses se formam
(TAMURA et al., 2005). O mRNA de Kirrel3 (também homólogo do gene neph2, em
mamíferos) é expresso em células do gânglio da raiz dorsal durante o
desenvolvimento em camundongos, sugerindo um papel importante na geração de
conexões sinápticas (KOMORI et al., 2008)
Kirrel2 (homólogo do gene neph3, em mamíferos) codifica uma proteína com
cinco domínios tipo Ig que é predominantemente expressa no pâncreas (SUN et al.,
2003; GERKE et al., 2005)
Com base nessas observações, há uma forte evidência que a expressão
destes genes possa estar envolvida na diferenciação neuronal, assim como no
desenvolvimento e formação de rede sináptica.
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Analisar a expressão de neph no processo de diferenciação das CTMph
tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol para indução de fenótipo neuronal.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Observar mudanças morfológicas nas CTMs submetidas a tratamento
químico com ATRA e β-Mercaptoetanol;
b) Verificar a expressão de marcadores neuronais nas CTMs, em células
controle e tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol, através da técnica de
imunocitoquímica e de RT-PCR;
c) Observar a expressão de neph nas CTMs, em culturas controle e tratadas
com ATRA e β-Mercaptoetanol, em diferentes tempos, através da técnica
de RT-PCR.
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 PLACENTA HUMANA
A placenta foi obtida através da colaboração com o Hospital Universitário da
Universidade Federal de Santa Catarina (HU/UFSC), no qual pacientes saudáveis
doaram suas placentas, após concordância com o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE) (Anexo A). O TCLE teve como objetivo esclarecer às doadoras,
a linha de pesquisa, a segurança e seriedade com que esta foi realizada. Os
procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos – UFSC, através de número de protocolo 198/03-CEPSH/PRPG.
A placenta foi coletada e armazenada em recipiente estéril, contendo salina
tamponada por fosfato (PBS) e encaminhada para cultura no Laboratório de
Neurobiologia e Hematologia Celular e Molecular-UFSC. Para a realização das
culturas, utilizamos apenas a região da placenta localizada na parte fetal do anexo
embrionário, próxima ao cordão umbilical (Figura 8).
Figura 8. Esquema da região da placenta coletada para cultura de CTMs. A região destacada no
quadrado é utilizada para cultura de CTMph.
Fonte: Adaptado de Berkow (2009).
27
3.2 ISOLAMENTO E CULTURA DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE
PLACENTA
A placenta foi dissociada mecanicamente e digerida enzimaticamente com
pancreatina e tripsina, por aproximadamente 20 minutos, em temperatura ambiente.
O tecido dissociado homogeneamente foi submetido à centrifugação (500g) durante
cinco minutos e o pellet ressuspenso em IMDM (Iscove´s Modified Dulbecco´s
Medium, Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab),
penicilina/estreptomicina (ambas Invitrogen) conforme orientações do fabricante.
Logo após, as células foram plaqueadas em garrafas de cultura de 25 cm
2
(Corning)
e mantidas em estufa úmida, a 37°C e ar atmosférico suplementado com 5% de
CO
2
. Após três dias, o meio de cultura foi trocado e as células não aderidas
descartadas. A troca do meio ocorreu periodicamente (três-quatro dias), sempre
havendo remoção das células não aderentes, selecionando assim, as CTMs por sua
adesão ao plástico.
Após duas semanas de cultura, quando a monocamada estava confluente
(80 a 90%), as células aderentes foram retiradas usando solução de 0,05% tripsina
(Invitrogen) e 0,1 M ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (Invitrogen), em
seguida lavadas com PBS e re-plaqueadas na concentração de 1x10
5
células/mL em
IMDM suplementado com 10% de SBF e penicilina/estreptomicina (passagem 1).
3.3 DIFERENCIAÇÃO NEURONAL DAS CTMS PELO TRATAMENTO COM ÁCIDO
TRANS-RETINÓICO E Β-MERCAPTOETANOL
Usamos células com passagem superior a cinco, em nossos experimentos.
As células foram plaqueadas em placas de 35mm (Corning). Após 24 horas, as
células foram tratadas com 1 µM ATRA (Calbiochem) e 100 µM de β-
Mercaptoetanol (Sigma) e mantidas por 24 horas (hs); 48hs e 72hs. Como controle,
as células foram tratadas com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) utilizado
para diluir o ATRA, no mesmo volume usado no tratamento com ATRA e β-
Mercaptoetanol.
28
3.4 ANÁLISE IMUNOCITOQUÍMICA E FENOTÍPICA
As culturas foram fixadas com 4% paraformaldeído (Sigma) e submetidas à
reação de imunocitoquímica, utilizando-se marcadores específicos para os fenótipos
neuronais.
As células foram fixadas com paraformaldeído 4% durante 30 minutos em
temperatura ambiente, sendo lavadas posteriormente com PBS. Tais células foram
permeabilizadas com Triton X-100 durante 20 minutos e lavadas três vezes com
PBS Tween-20 (ambos Sigma). Sítios não específicos foram bloqueados com 10%
de SBF. Logo após, estas células forma incubadas overnight, a 20°C, com
anticorpos primários específicos humanos. Após serem lavadas com PBS Tween-20,
as células foram incubadas com anticorpo secundário durante uma hora, em
temperatura ambiente.
O núcleo das células foi visualizado com o corante nuclear 4’,6- diamidino-2-
fenilindol dihidroclorido (DAPI). Para identificação de precursores de neurônios
usamos o anticorpo primário anti-nestina (Santa Cruz). Para a identificação dos
neurônios, utilizamos o anticorpo anti-neurofilamento (Sigma). Utilizamos anticorpos
secundários anti-imunoglobulinas específicas de camundongo ou coelho, ligados à
fluoresceína isotiocianato (FITC) ou ao Texas Red (TXRD) (ambos Sigma). A
fluorescência foi observada em microscópio de fluorescência Olympus IX71.
3.5 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE VIA TRANSCRIPTASE REVERSA
(RT-PCR)
As culturas foram preparadas segundo os procedimentos descritos
anteriormente e após respectivos tempos de tratamento (24hs; 48hs e 72hs) foram
analisadas as expressões de genes, através da extração de RNA total para ensaios
de RT-PCR. O meio de cultura foi removido e os RNAs totais destas amostras
extraídos utilizando reagente TRIZOL
TM-
(Invitrogen), de acordo com as orientações
do fabricante. A fita de DNA complementar (cDNA) foi sintetizada a partir do RNA
total, obtido pela extração do RNA, utilizando um Kit para transcrição reversa:
29
ThermoScript RT-PCR System (Promega), conforme especificações do fabricante.
Para a RT-PCR foi utilizado o cDNA sintetizado. Estudamos a expressão dos gene:
neph, assim como de genes marcadores de células tronco indiferenciadas: Nanog e
Oct4; células tronco mesenquimais: CD90; e neuronais: Nestina e Enolase
específica de neurônios humano (hEEN) . Utilizamos primers específicos para estas
reações conforme tabela 1. As amostras foram desnaturadas a 94°C/cinco minutos,
seguida por ciclo de 94°C/30 segundos para desnaturação), 54-62°C/um minuto
dependendo do primer
(temperatura de anelamento), 72°C por três minutos para
extensão, por 35 ciclos.
Os resultados foram normalizados utilizando-se como
padrão interno à expressão de gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH). Os
produtos foram separados em gel a 2 % de agarose (Invitrogen), corado com
brometo de etídio (Sigma), e fotografado.
Tabela 1 – Sequência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a detecção
dos RNAm por RT-PCR.
Primer
Sequência
Temperatura de
anelamento (
0
C)
CD90
Sense: GAGAATACCAGCAGTTCACCCATC
Anti sense: AGGATCTCTGCACTGGAACTTGAG
58
Enolase específica de
neurônios humano
Sense: TGAACACAGACGCTATGCGCTCAG
Anti sense: CACCTTTATGTGAGTGGACACAGA
59
GAPDH
Sense: ATGAGGTCCACCACCCTGTT
Anti sense: ATCACTGCCACCCAGAAGAC
60
Nanog
Sense: TGCAAATGTCTTCTGCTGAGAT
Anti sense: GTTCAGGATGTTGGAGAGTTC
54
Neph 1
Sense: CTGCCACCATCATCTGGTTC
Anti sense: GTGCTGACATTGGTGCTTCC
56,3
Neph 2
Sense: CATCATCTCCAGCACCCAGA
Anti sense: TGCCATAAGGACGAGGAAGG
56,6
Neph 3
Sense: ATTTCCTGCAACAGCCAGA
Anti sense: CAGGGTTAAGGTGCTCTCCA
55,6
Nestina
Sense: CAGCTGGCGCACCTCAAGATG
Anti sense: AGGGAAGTTGGGCTCAGGACTGG
62
Oct4
Sense: CTCCTGAAGCAGAAGAGGATCAC
Anti sense: CTTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA
58
30
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os experimentos foram realizados em triplicata e a ocorrência de diferenças
significativas entre os grupos estudados foi verificada através da análise de variância
(ANOVA). Nos casos em que houve diferença significativa, o teste de Bonferroni foi
utilizado. Em todas as medidas a significância estatística foi considerada para
valores de p < 0,05.
31
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS TRONCO OBTIDAS DE PLACENTA
HUMANA
Para nosso estudo utilizamos a placenta como tecido fonte de células tronco,
as CTMph. Ao isolarmos e cultivarmos essas células, conforme metodologia
descrita, observamos uma intensa proliferação. Porém, com aumento no número de
passagens essa taxa de proliferação diminui, mantendo culturas viáveis até no
máximo a passagem 15.
As CTMph de passagem inferior à cinco, apresentaram tanto morfologia
fibroblastóide quanto mais poligonal (Figura 9A) . Enquanto as CTMph de passagem
superior a cinco, demonstraram predomínio da morfologia fibroblastóide (Figura 9B).
Figura 9. Morfologia das CTMph. Fotografias representativas em microscópio de contraste de fase,
de CTMph. A) CTMph de passagem 1. As setas indicam as diferentes morfologias. B) CTMph de
passagem 10. Aumento: 100X.
Em relação a expressão fenotípica, através de RT-PCR, observamos a
expressam de CD90, marcador de CTMs; Nanog e Oct-4, marcadores de células
indiferenciadas (Figura 10A-D).
A multipotencialidade das CTMph foi descrita pelo grupo de pesquisa do
laboratório, em trabalho submetido. As CTMph foram capazes de diferenciar em
adipócito, condrócito e osteócito (MARTINI, 2008).
B
A
32
Figura 10. Expressão de marcadores de CTs indiferenciadas e mesenquimais, em CTMph.
Fotografias representativas de produtos de RNA mensageiro em gel de agarose, evidenciando a
expressão de marcadores de CTMs (CD90) (A) e de CTs indiferenciadas Nanog (B) e Oct4 (C).
GAPDH: padrão interno (D).
4.2 EFEITO DA INDUÇÃO NEURONAL NAS CTMph
4.2.1 Análise morfológica
Para indução do fenótipo neuronal utilizamos CTMph com passagem igual
ou superior a cinco. Essas CTMph foram tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol
durante 24hs, 48hs e 72hs.
As CTMph apresentaram mudanças morfológicas, ainda no período de 24
horas de tratamento, permanecendo durante todos os tempos de cultura, ou seja,
durante 48hs e 72hs. As células tornaram-se menores, apresentando
prolongamentos, semelhantes a neuritos que caracterizam uma morfologia neuronal
(Figura 11A-B).
Figura 11. Morfologia das CTMph após indução ao fenótipo neuronal. Fotografias representativas
em microscópio de contraste de fase, de CTMph. A) Células Controle. Aumento: 100X. B) CTMph
tratadas com ATRA e -mercaptoetanol, 24 horas. Setas indicam neuritos in vitro. Aumento 400X.
A
A
A
B
A
B
Pares de base (Pb)
286 Pb
398 Pb
B
CD90
Nanog
Oct-4
GAPDH
225 Pb
419 Pb
A
A
B
D
C
33
4.2.2 Análise da expressão gênica e imunofenotípica
Após observarmos as alterações morfológicas nas CTMph tratadas com
indutores neuronais, verificamos os níveis de expressão tanto de genes relacionados
a células indiferenciadas e CTM, quanto ao fenótipo neuronal.
Observamos que nas CTMph tratadas parece ocorrer uma redução na
expressão de marcadores como CD90, Nanog e Oct4, quando comparados com
células na presença apenas do veículo e células controle, em todos os períodos de
tratamento em cultura (Figura 12A-D).
Figura 12. Expressão de marcadores de CTs indiferenciadas e mesenquimais, em CTMph e
CTMph tratadas. Fotografias representativas de produtos de RNA mensageiro em gel de agarose,
evidenciando a expressão de marcadores de CTMs (CD90) (A) e de CTs indiferenciadas, Nanog (B) e
Oct4 (C), em 1. CTMph tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol durante 24 horas; 2. CTMph em
DMSO durante 24 horas; 3. CTM durante 24 horas; 4. CTMph tratadas com ATRA e β-
Mercaptoetanol durante 48 horas; 5. CTMph em DMSO durante 48 horas; 6. CTM durante 48 horas;
7. CTMph tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol durante 72 horas; 8. CTMph em DMSO durante 72
horas; 9. CTM durante 72 horas. GAPDH: padrão interno (D).
Portanto, as células tratadas para o fenótipo neuronal apresentaram uma
tendência a diminuir a expressão de marcadores de células indiferenciadas e CTMs.
Sendo assim, avaliamos a expressão de gene precurssor neural (nestina) e neurônio
diferenciado (hEEN).
Tanto as CTMph, quanto as CTMph tratadas expressaram nestina, mas
nestas a expressão parece ser menor (Figura 13A-B). A expressão de hEEN não foi
observada em nenhuma das condições experimentais (dados não demonstrados).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Pares de Base
(Pb)
419 Pb
398 Pb
286 Pb
225 Pb
A
B
C
D
34
Figura 13. Expressão de nestina em CTMph e CTMph tratadas. Fotografias representativas de
produtos de RNA mensageiro em gel de agarose, evidenciando a expressão de precursor neural,
Nestina (A) em 1. CTMph tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol durante 24 horas; 2. CTMph em
DMSO durante 24 horas; 3. CTM durante 24 horas; 4. CTMph tratadas com ATRA e β-
Mercaptoetanol durante 48 horas; 5. CTMph em DMSO durante 48 horas; 6. CTM durante 48 horas;
7. CTMph tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol durante 72 horas; 8. CTMph em DMSO durante 72
horas; 9. CTM durante 72 horas. GAPDH: padrão interno (B).
A partir daqui, como tanto as CTMph submetidas a indução do fenótipo
neuronal quanto as células controle intrigantemente expressaram nestina, fomos
investigar as diferenças na quantidade, bem como o comportamento morfológico de
expressão.
Nossos resultados, através de imunocitoquímica, demonstraram que não
houve significância estatística no número de CTMph tratadas positivas para nestina
quando comparadas com as células controle. As CTMph apresentaram expressão
próxima a 100% em todas as condições experimentais, apresentando uma tendência
a diminuir a expressão nas CTMph tratadas (Figura 14). Tanto as CTMph
apresentaram uma marcação perinuclear, quanto as CTMph tratadas durante todos
os períodos de tratamento. E ainda, claramente houve uma mudança morfológica
nas CTMph induzidas ao fenótipo neuronal. Essas células perderam a morfologia
fibroblastóide característica de CTMs e adquiriram uma forma mais arredondada
com prolongamentos, assemelhando-se ao fenótipo neuronal (Figura 15).
208 Pb
225 Pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
B
Pares de Base
(Pb)
A
35
Nestina
24 hs
48 hs
72 hs
0
25
50
75
100
ATRA
DMSO
CTM
% Células Nestina +
Figura 14. Quantificação da expressão de CTMph tratadas nestina positivas. Representação
gráfica da quantidade de células que expressam nestina após 24, 48 e 72 horas. Foram analisadas
imagens de imunofluorescência de 20 campos de cada condição de cultura em três experimentos
independentes. Estatística por ANOVA duas vias seguido do teste de Bonferroni.
Figura 15. Expressão de nestina nas CTMph tratadas em diferentes tempos de cultura.
Fotografias representativas de imunofluorescência para nestina, precursor neural. Em vermelho
células nestina. Em azul núcleo celular. Células nestina positivas - 24 horas de tratamento (A).
Células nestina positivas - 24 horas - Veículo (B). Células nestina positivas - 24 horas - Controle (C).
Células nestina positivas - 48 horas de tratamento (D). Células nestina positivas - 48 horas - Veículo
(E). Células nestina positivas - 48 horas - Controle (F). Células nestina positivas - 72 horas de
tratamento (G). Células nestina positivas - 72 horas - Veículo (H). Células nestina positivas - 72 horas
- Controle (I). Setas indicam neuritos in vitro. Aumento: 200X.
A
E
F
H
I
B
C
D
F
E
G
H
I
36
Até o momento constatamos que CTMph tratadas parecem reduzir a
expressão de marcadores de células indiferenciadas e CTMs. Ainda, há uma
tendência em diminuir a expressão gênica de precurssor neural, nestina, mas sem
significância estatística na marcação imunofenotípica. Porém, apresentam
morfologia neuronal . Sendo assim, surgiu-nos a dúvida: Pode ter ocorrido
diferenciação neuronal em grandes proporções que expliquem essas reduções?
Para tentarmos resolver nossa hipótese, avaliamos a expressão de uma marcador
de neurônio diferenciado, neurofilamento (NF) através de imunocitoquímica.
A expressão de NF foi evidenciado tanto nas CTMph tratadas quanto nas
células controle. Nas primeiras 24 horas, essa expressão nas CTMph tratadas é
estatisticamente menor quando comparadas com as CTMph na presença apenas do
veículo e com as CTMph controle. Apesar da inexistência de significância estatística,
as CTMph tratadas nos dois períodos seguintes apresentam uma tendência em
diminuir a expressão de neurofilamento quando comparadas aos controles (Figura
16). Da mesma forma que na expressão de nestina, as CTMph tratadas mantém o
mesmo padrão de marcação que as CTMph, apresentaram também mudança
morfológica na marcação de NF (Figura 17).
Figura 16. Quantificação da expressão de CTMph tratadas, neurofilamento positivas.
Representação gráfica da quantidade de células que expressam neurofilamento após 24, 48 e 72
horas. Foram analisadas imagens de imunofluorescência de 20 campos de cada condição de cultura
em três experimentos independentes. Estatística por ANOVA duas vias seguido do teste de
Bonferroni.
37
Figura 17. Expressão de neurofilamento nas CTMph tratadas em diferentes tempos de cultura.
Fotografias representativas de imunofluorescência para neurofilamento, neurônio diferenciado. Em
verde células neurofilamento positivas. Em azul: núcleo celular. Células neurofilamento positivas - 24
horas de tratamento (A). Células neurofilamento positivas - 24 horas - Veículo (B). Células
neurofilamento positivas - 24 horas - Controle (C). Células neurofilamento positivas - 48 horas de
tratamento (D). Células neurofilamento positivas - 48 horas - Veículo (E). Células neurofilamento
positivas - 48 horas - Controle (F). Células neurofilamento positivas - 72 horas de tratamento (G).
Células neurofilamento positivas - 72 horas - Veículo (H). Células neurofilamento positivas - 72 horas
- Controle (I). Setas indicam neuritos in vitro. Aumento: 200X.
4.3 INFLUÊNCIA DA FAMÍLIA DE GENES NEPH NA DIFERENCIAÇÃO DAS
CTMph PARA O FENÓTIPO NEURONAL
Como descrito na literatura, há inúmeras proteínas da família das IgSF
envolvidas no processo de diferenciação neuronal, sendo uma delas ainda pouco
estudada, a família NEPH.
Para comprovar nossa hipótese de que a família de genes neph esta
A
B
C
G
D
E
F
H
I
38
envolvida nesse importante processo de diferenciação celular, utilizamos a técnica
de RT-PCR. Verificamos que tanto neph1 quanto neph2, são expressos nas
CTMph. Porém, essa expressão parece ser suprimida após o tratamento de indução
ao fenótipo neuronal (Figura 18A-C). A expressão de neph3 não foi detectada em
nenhuma condição experimental (dados não demonstrados).
Figura 18. Expressão da família de genes neph em CTMph e CTMph tratadas. Fotografias
representativas de produtos de RNA mensageiros em gel de agarose, evidenciando a expressão de
gene neph1 (A) e neph2 (B), em 1. CTMph tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol durante 24 horas;
2. CTMph em DMSO durante 24 horas; 3. CTM durante 24 horas; 4. CTMph tratadas com ATRA e β-
Mercaptoetanol durante 48 horas; 5. CTMph em DMSO durante 48 horas; 6. CTM durante 48 horas;
7. CTMph tratadas com ATRA e β-Mercaptoetanol durante 72 horas; 8. CTMph em DMSO durante 72
horas; 9. CTM durante 72 horas. GAPDH: padrão interno (C).
Pares de base
(Pb)
447 Pb
399 Pb
225 Pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
B
C
39
5 DISCUSSÃO
Tecidos extra embrionários como a placenta, quando utilizados como
reservatórios de CTs oferecem muito mais vantagens do que outras fontes dessas
células como, fontes de CTEs e CTSs. Após o nascimento esses tecidos extra
embrionários são rotineiramente descartados, não apresentando problemas éticos
como os decorrentes do uso de outras fontes de CTs. A natureza dessas células
facilitam o isolamento e eliminam o risco a pacientes doadores. Ainda, esses
tecidos são abundantes e de fácil manipulação, aumentando teoricamente o número
de CTs que podem ser isoladas (MARCUS; WOODBURY, 2008).
Nessa mesma linha de discussão, CTEs requerem destruição do embrião
humano e estão associadas com alta taxa de indução tumoral (teratomas). Também,
as CTSs apresentam aspecto negativo quanto ao risco que apresentam de infecção
viral ao doador e diminuem sua quantidade e capacidade de diferenciação com o
aumento da idade do doador. O fato da placenta ser um tecido originado durante o
desenvolvimento embrionário sustenta a hipótese de que esse tecido possa conter
células com plasticidade semelhantes as CTEs (EVANGELISTA et al., 2008).
As CTMph são obtidas a partir da dissociação do tecido da placenta e
posterior seleção através da sua aderência ao plástico, técnica essa largamente
utilizada para o isolamento de CTMs. Não surpreendentemente, CTMph expressam
numerosos marcadores de superfície mesenquimal, incluindo CD29 e CD44
(MARCUS; WOODBURY, 2008). Vários grupos de pesquisa, identificaram que
CTMph dissociadas e cultivadas em meio contendo soro, são células
CD90/CD105/CD71 positivas e CD34/CD45 negativas, consistente com o fenótipo
de CTMph (YEN et al., 2005; EVANGELISTA et al., 2008). Nossos estudos
corroboram para essa ideia, no qual verificamos a expressão de CD90.
CTMph apresentam morfologia fibroblastóide e são altamente proliferativas
in vitro, podendo ser mantidas por pelo menos 20 passagens. Em condições
permissivas in vitro, as CTMph podem diferenciar em osteoblastos e adipócitos
(MARCUS; WOODBURY, 2008). Outros estudos demonstram uma maior variedade
de diferenciação, podendo as CTMph diferenciar nas três linhagens germinativas:
ectoderme (neural), mesoderme (músculo esquelético, cardiomiócito e endotelial) e
endoderme (pancreática) (PAROLINI et al., 2008). A partir dessas duas
40
características apresentadas pelas CTMph, proliferação e multipotencialidade, há
comprovação que essas células formam populações verdadeiras de CTs (MARCUS;
WOODBURY, 2008). Nossos resultados evidenciaram essas propriedades acima
especificadas, na qual obtivemos culturas que foram mantidas até 15 passagens. E
ainda, a multipotencialidade foi comprovada por outro trabalho realizado pelo nosso
grupo de pesquisa, submetido à publicação. As CTMph foram capazes de diferenciar
em adipócito, condrócito e osteócito quando submetidas aos meios permissivos a
estas condições (MARTINI, 2008).
Conforme descrito por vários autores, a manutenção da multipotencialidade
das CTMph pode ser indicada pela expressão de alguns genes embrionários
específicos, SSEA-3,SSEA-4 e Oct-4 (EVANGELISTA et al., 2008; PAROLINI et al.,
2008). Em nosso estudo verificamos a expressão de Oct-4 e Nanog nas CTMph.
Sendo que o potencial multidiferenciado das CTMph foi demonstrado pela expressão
de marcador neural (nestina) e actina de músculo liso (SMA) porém sem
diferenciação espontânea durante a expansão das culturas (dados não publicados,
JEREMIAS, 2009).
Consistente com nossos resultados, as CTMph inicialmente apresentam
duas morfologias distintas: uma população com característica fibroblastóide e outra
mais poligonal, semelhante a epitelial. Com aumento no número de passagens, a
população epitelial rapidamente desaparece adquirindo uma morfologia homogênea
fibroblastóide (YEN et al., 2005; MIAO et al., 2006; PAROLINI et al., 2008).
5.1 EFEITO DA INDUÇÃO NEURONAL NAS CTMph
São numerosos os estudos tanto em in vitro quanto in vivo que demonstram,
em particular, a diferenciação de CTMs em células neurais (MARESHI et al., 2006;
SCINTU et al., 2006).
Sabe-se, porém, que são necessários fatores indutivos adequados ao
fenótipo desejado. Já extensamente descrito na literatura, o ATRA apresenta papel
importante durante a embriogênese. Sendo sua ação imprescindível para o
desenvolvimento neural nas fases iniciais do desenvolvimento do sistema nervoso
central de mamíferos (LAKARD et al., 2007).
41
Nós utilizamos a associação de duas substâncias químicas, ATRA e -
mercaptoetanol, já conhecidas classicamente como indutores neurais. A morfologia
das CTMph mudaram logo após as 24 horas, adquirindo uma forma menor e com
prolongamentos, semelhante ao fenótipo neuronal. Estudo de Mareshi et al. (2006),
corrobora com nossos resultados, onde verificaram que CTMh após poucas horas
de incubação com -mercaptoetanol, formaram prolongamentos finos e alongados.
Em uma linhagem de células neuronais olfatórias imortalizadas a adição de 10L de
ATRA induziu um aumento no número de células bipolares já após 24 horas da
indução (LAKARD et al., 2007).
Contraditório, em outro trabalho de indução das CTMph ao fenótipo
neuronal, a morfologia semelhante a neurônio só foi evidenciada após seis-14 dias
desta indução (YEN et al., 2005). Da mesma forma, CTMs induzidas ao fenótipo
neuronal, onde houve a presença de ATRA na indução química, apresentaram após
cinco-seis dias, corpos celulares esféricos com processos bipolares até multipolares
(YAMAGUCHI et al., 2006). Outro trabalho, onde células CTMs foram tratadas com
ATRA e -mercaptoetanol, também não houve essa rápida e dramática mudança
morfológica. As mudanças morfológicas só foram visualizadas após três dias de
tratamento (SCINTU et al., 2006).
Concomitante com a mudança morfológica, as CTMph parecem diminuir a
expressão de genes relacionados a CTM (CD90) e a células indiferenciadas (Oct-4 e
Nanog). Avaliamos ainda, a expressão de nestina (precurssor neural) e observamos
uma tendência na diminuição da expressão desse gene nas células induzidas ao
fenótipo neuronal. Evidenciando assim, uma possível diferenciação das CTMph.
Como suporte a esta interpretação, outros pesquisadores observaram que nas
condições experimentais com -mercaptoetanol , ao realizarem análise por PCR em
tempo real, houve redução gênica para nestina, NF, MAP2 e GFAP nas CTMs
(MARESHI et al., 2006). Em outro estudo, a imunomarcação tanto de CTMs obtidas
da medula óssea e as CTMs induzidas com ATRA para a diferenciação neuronal,
foram positivas para nestina, NF e MAP2 (ZHANG et al., 2006).
Para Scintu et al. (2006), CTMs tratadas com ATRA e -mercaptoetanol não
apresentaram mudanças nos níveis na marcação para nestina em relação ao
controle, por RT-PCR. Mas, o ATRA leva a uma diminuição significativa de
vimentina, enquanto os níveis de GFAP, NF e hEEN não foram modificados.
42
Nossos resultados até o momento suportam a hipótese de uma
diferenciação neuronal, para a confirmação da mesma avaliamos se houve mudança
quantitativa e qualitativa na marcação para precursor neural (nestina) e neurônio
diferenciado (NF). Quanto a imunomarcação de nestina, não houve mudança
estatística mas parece haver uma tendência a diminuir a quantidade de células
nestina positivas das CTMph tratadas quando comparadas ao controle. Continuaram
apresentando a mesma morfologia. Da mesma forma, outro trabalho que induziu
CTMs ao fenótipo neuronal através da utilização de ATRA e -mercaptoetanol ,
observou a marcação constitutiva nas CTMs para nestina e o tratamento parece não
influenciar essa marcação (SCINTU et al., 2006). Esta diferença funcional pode ser
um reflexo da origem da CTM utilizada nos trabalhos experimentais. Possivelmente
uma conseqüência do microambiente ao qual a CTM está inserida em diferentes
tecidos, visto que apesar de ser encontrada em diferentes tecidos as CTMs
apresentam diferenças funcionais significativas (SILVA; CHAGASTELLES; NARDI,
2006)
Por outro lado, no trabalho de Mareschi et al. (2006), as CTMs após 24
horas, expressaram imunomarcação de aproximadamente 50% para nestina. Em
estudo de Yamaguchi et al. (2006), as CTMs induzidas com ATRA, como uma das
substâncias químicas utilizadas para o fenótipo neuronal, apresentaram 56% de
imunorreatividade contra nestina.
Se as CTMph tratadas apresentam aparente redução de marcadores
mesenquimais, indiferenciados bem como precurssor neural (nestina), concomitante
com morfologia neuronal, pode ter ocorrido diferenciação neuronal em proporções
que expliquem essas reduções? Para tentar resolver essa hipótese, avaliamos a
marcação de NF (marcador de neurônio diferenciado).
Intrigantemente, as CTMph apresentaram uma redução estatística na
marcação de NF nas primeiras 24 horas de tratamento quando comparadas ao
controle. Não permanecendo essa diferença estatística, mas uma tendência na
diminuição dessa marcação, sendo que a mudança morfológica permaneceu.
Partilhando mesma ideia, no trabalho de Yamaguchi et al. (2006), não houve
imunorreatividade contra NF nas CTMs induzidas quimicamente.
Em contrapartida, estudo de CTMs induzidas ao fenótipo neuronal com
ATRA e -mercaptoetanol, o tratamento determinou forte expressão de GFAP e NF
nessas células após sete dias de incubação (SCINTU et al., 2006).
43
Contrariamente ao interpretado, essa mudança morfológica e diferenciação
podem ser decorrentes de uma rápida formação de corpos constritos e após as 24
horas essas células parecem altamente estressadas com uma paralela diminuição
na quantidade celular (MARESCHI et al., 2006).
Nós não realizamos ensaios de viabilidade celular ou de proliferação celular,
o que não nos permite afirmar se o tratamento modificou a taxa mitótica da célula.
Em nosso modelo experimental, através da marcação com DAPI, parece que houve
um declínio no número de células em função do tempo, 24, 48 e 72 horas quando
incubadas com -mercaptoetanol, e com ATRA. Foi demonstrado que CTMs
tratadas com -mercaptoetanol tiveram uma redução na proliferação entretanto
quando tratadas com ATRA não foram observados efeitos significativos (MARESCHI
et al., 2006). Novamente, estas diferenças experimentais podem ser derivadas das
diferentes fontes de CTMs utilizadas nos experimentos.
Para Mareschi et al. (2006), as mudanças morfológicas e imunomarcações
para marcadores neurais das CTMs após indução química podem ser devido à
toxicidade celular, retração celular e mudanças no citoesqueleto. Ainda, tem sido
discutido qual o papel do tratamento de CTMs com agentes indutores, incluindo
DMSO, pois o mesmo pode determinar vários eventos, como morte celular
(YAMAGUCHI et al., 2006). Independente dessa discussão, tem sido observado o
uso crescente desses indutores nos ensaios de diferenciação celular, assim como
teste de fármacos.
5.2 INFLUÊNCIA DA FAMÍLIA DE GENES NEPH NA DIFERENCIAÇÃO DAS
CTMph PARA O FENÓTIPO NEURONAL
Apesar de nossos resultados demonstrarem que as CTMph expressam
genes de CTMs, de estágio indiferenciado e apresentam morfologia fibroblastóide, a
diferenciação neuronal, obtida com indutores foi avaliada com base na expressão
protéica e sua morfologia. Não avaliamos a funcionalidade, que tem sido um
requisito importante para caracterizar a diferenciação neuronal (MARESCHI et al.,
2006). Entretanto nossa abordagem experimental sugere fortemente uma resposta
ao ATRA que tem sido um indutor neuronal importante através da indução de genes
44
regulatórios (YAMAGUCHI et al., 2006). Assim, as CTMph são capazes de
responder ao tratamento, possivelmente através da modificação na expressão de
genes regulatórios importantes para o equilíbrio entre o estado de CT e célula
precursora/diferenciada. Como para Yamaguchi et al. (2006) é difícil determinar o
exato mecanismo pelo qual as CTMs diferenciam-se em células neuronais, mas é
imprescindível que o perfil gênico seja alterado para determinar esse fenótipo. Em
nosso trabalho, avaliamos se a família de genes neph poderia se alterar durante o
curso da diferenciação, sugerindo um papel relevante dessas proteínas durante a
indução com ATRA para o fenótipo desejado.
Nos nossos resultados, as CTMph expressaram tanto neph1 quanto neph2,
porém não neph3. Quando essas células foram submetidas à indução neuronal,
essa expressão foi quase suprimida em todos os tempos de cultura avaliados.
Todas as três proteínas, NEPH1, NEPH2 e NEPH3, apresentam uma
arquitetura comum com cinco dominínios Ig, dentre estes um é domínio
transmembrana e outro citoplasmático. Essa arquitetura sugere que participam de
interações adesivas com outras células ou matriz extracelular. Nos resultados deste
grupo de pesquisa, todos os três genes foram detectados por RT-PCR em uma
linhagem de célula podócito glomerular humana (SELLIN et al., 2003).
O gene neph1 é expresso nas membranas fetais e placenta de ratos, onde
os autores sugerem um papel potencial deste, na regulação do transporte de
proteínas através do feto para o compartimento da mãe (BEALL et al., 2005).
Em trabalho de Ueno et al. (2003), foi demonstrado que a proteína NEPH2
apresenta alguma função na regulação da manutenção das CTHs pelas células
estromais. Essas células estromais apresentam um domínio extracelular de NEPH2,
porém o mecanismo pelo qual neph2 suportam as CTHs é desconhecido.
Ainda, foi observada a expressão de neph2 em várias regiões do cérebro de
camundongos adultos. Essa expressão foi grande na camada glomerular e células
mitrais do bulbo olfatório, e na camada glomerular do cerebelo, regiões onde a
formação sináptica ocorre durante a idade adulta. Da mesma forma, foi intensa a
expressão de neph2 no bulbo olfatório de neonatos, onde há intensa formação
sináptica. Enquanto a expressão foi declinando no giro denteado do hipocampo de
adultos, condizente com a redução de sinapses nessa fase. A sinaptogênese ocorre
nas células granulares com início em P4, sendo completada aproximadamente até
P25. Em resumo, esse padrão temporal de expressão de neph2 pode contribuir para
45
a formação de sinpase em cérebro de camundongos o qual é comparado com o
papel de IrreC-rst em invertebrados. Também, nessas regiões essa expressão
parece estar envolvida na migração neuronal em direção a projeção axonal e,
portanto formação de sinapse (TAMURA et al., 2005).
Em drosófilas o gene homólogo IrreC-rst apresenta atividade de adesão
celular, apresentando um papel crítico na composição do olho e desenvolvimento da
antena. O que posiciona as células e as mantém em contato célula-célula. Portanto,
uma possível, porém ainda não comprovada função de neph2, é a influência deste
nas funções das células pancreáticas pela manutenção da propriedade de contato
célula-célula e comunicação das ilhotas através dessa atividade de adesão celular
(SUN et al., 2003).
O gene neph3, é expresso fortemente em células pancreáticas, essa
expressão restrita foi intensamente avaliada, visto que nesse trabalho vários tecidos
humanos foram analisados, incluindo a placenta. No desenvolvimento do cérebro de
camundongo sua expressão também é observada. As várias linhagens de células
oriundas do cérebro e de retinoblastoma apresentam a expressão de neph3, além
do pâncreas, assim como outros tecidos neuroendócrinos tais como a glândula
hipófise, Além do desenvolvimento, a expressão de neph3 é observado no curso de
doenças (SUN et al., 2003).
Estas observações sugerem um papel importante da família NEPH para a
manutenção do estado de diferenciação e adesão célula-célula. Possivelmente
modificações nos níveis dessas proteínas podem remeter a célula a um estado de
diferenciação alterado. Portanto consideramos relevante uma abordagem mais
profunda no papel do NEPH para indução de diferenciação de CTMph.
A utilização da placenta sob muitos aspectos deve ser considerada.
Normalmente é um tecido que tem como destino o expurgo após o parto. Sendo
assim não existe um impedimento ético na sua utilização sob ponto de vista clínico.
CTs advindas de um tecido de origem fetal, de fácil acesso e sem implicações éticas
e legais é de grande importância.
Tem sido demonstrado que CTMs isoladas de placenta assim como de
cordão umbilical apresentam baixo risco de rejeição pelo sistema imune já que as
células têm potencial imunossupressor e, portanto baixa antigenicidade (LE BLANC;
RINGDEN, 2007; CHO et al., 2008)
O potencial de utilização de CTMph é relevante, visto que nossos estudos
46
sugerem uma plasticidade das mesmas para diferenciação em células neuronais
com possível utilidade nas crescentes desordens neurológicas até o momento sem
cura como, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas.
47
6 CONCLUSÕES
A partir dos nossos resultados concluímos:
a) CTMph apresentam marcadores de células indiferenciadas e
mesenquimais; ainda, apresentam morfologia fibroblastóide e
multipotencialidade, caracterizando-as como verdadeiras CTs;
b) As CTMph apresentam constitutivamente marcadores neurais como,
nestina e neurofilamento;
c) O ATRA foi capaz de induzir a diferenciação das CTMph nesse modelo
experimental;
d) No nosso modelo experimental as CTMph induzidas ao fenótipo neuronal,
apresentaram morfologia característica;
e) As CTMph parecem ser sensíveis a variações nos níveis gênicos de
marcadores indiferenciados (Nanog e Oct4); de CTMs (CD90); e
precursor neural (Nestina);
f) Uma possível função dos genes, neph1 e neph2, é a manutenção de
CTMph em um estágio indiferenciado;
g) Outra função que pode ser atribuída aos genes, neph1 e neph2, seria
uma intrínseca regulação de progenitores pré destinados ao fenótipo
neuronal.
48
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54
ANEXO A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
LABORATÓRIO DE NEUROBIOLOGIA E HEMATOLOGIA CELULAR
E MOLECULAR, BEG-CCB, UFSC
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
TÍTULO DO PROJETO: Expansão ex vivo de células tronco mesenquimais e
hematopoéticas de placenta/cordão umbilical: efeitos do nicho.
PESQUISADOR RESPONSÁVEL (ORIENTADOR): Prof. Dr. Marcio Alvarez da Silva
PESQUISADOR PRINCIPAL: Aloisio Luiz Benedetti, Talita da Silva Jeremias, Maria
Cecilia Kohler, Rossana Simão.
Você está sendo convidado para participar da pesquisa : Expansão ex vivo de
células tronco mesenquimais e hematopoéticas de placenta/cordão umbilical: efeitos
do nicho, sob a responsabilidade do pesquisador Responsável Prof. Dr. Marcio
Alvarez da Silva (orientador) e dos Pesquisadores Principais: Aloisio Luiz Benedetti,
Talita da Silva Jeremias, Maria Cecilia Kohler e Rossana Simão.
Nesta pesquisa nós estamos buscando entender como células tronco
mesenquimais (CTMs) obtidas do cordão umbilical/placenta podem ser utilizadas
para aumentar o número de outras células tronco como as encontradas no sangue
do cordão umbilical, as células tronco hematopoéticas.
O TCLE será obtido por um dos pesquisadores responsáveis que serão os
profissionais que isolarão e farão a manutenção das CTMs obtidas da placenta.
Na sua participação você será convidado a doar a placenta com um pedaço
do cordão umbilical para que esta pesquisa possa ser conduzida. Iremos isolar as
CTMs de placenta para estudar como poderemos manipular in vitro no Laboratório
de Neurobiologia Celular e Molecular. As células obtidas serão utilizadas
exclusivamente neste trabalho, não serão utilizadas para outros fins ou
comercializadas. Neste sentido somente os profissionais envolvidos terão acesso ao
material doado.
Em nenhum momento você será identificado. Os resultados da pesquisa
serão publicados e ainda assim a sua identidade será preservada.
Você não terá nenhum gasto e ganho financeiro por participar na pesquisa.
Neste procedimento não existem riscos para o paciente nem para o recém
nato. Em nenhum momento serão utilizados procedimentos invasivos.
Você é livre para desistir de participar a qualquer momento deste Projeto, sem
nenhum prejuízo para o senhor(a).
Uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ficará com o
senhor(a).
Se você tiver alguma dúvida em relação ao estudo ou não quiser mais fazer
parte do mesmo, pode entrar em contato pelo telefone: (48) 3721 6905/5553,
Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular ou (48)99803643, nos fins de
semana.
Se você estiver de acordo em participar desta pesquisa, garantimos que o
material celular obtido, será confidencial e somente será utilizado neste trabalho,
podendo ser congelado para posterior avaliação dentro do projeto que foi
explicado acima.
55
Pesquisador Responsável:
_____________________
Pesquisador Principal:
Eu ____________________________________, fui esclarecido (a) sobre a
Pesquisa “Expansão ex vivo de células tronco mesenquimais e hematopoéticas de
placenta/cordão umbilical: efeitos do nicho.” e aceito participar do projeto
voluntariamente, após ter sido devidamente esclarecido. Concordo com a doação de
parte e/ou totalidade da placenta e cordão umbilical.
Florianópolis, _______ de __________________________ de 200___.
Assinatura:_____________________________________________RG:______
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