( PDF ) Avaliação andrológica e ultrassonográfica de testículos e próstatas de cães (Canis familiaris Linnaeus, 1758) da raça beagle, alimentados com três rações comerciais de qualidades diferentes

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS JABOTICABAL

AVALIAÇÃO ANDROLÓGICA E ULTRASSONOGRÁFICA

DE TESTÍCULOS E PRÓSTATAS

DE CÃES (Canis familiaris – LINNAEUS, 1758) DA RAÇA

BEAGLE, ALIMENTADOS COM TRÊS RAÇÕES

COMERCIAIS DE QUALIDADES DIFERENTES.

Valeska Rodrigues

Médica Veterinária

JABOTICABAL-SP- BRASIL

Dezembro de 2009

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS JABOTICABAL

AVALIAÇÃO ANDROLÓGICA E ULTRASSONOGRÁFICA

DE TESTÍCULOS E PRÓSTATAS

DE CÃES (Canis familiaris – LINNAEUS, 1758) DA RAÇA

BEAGLE, ALIMENTADOS COM TRÊS RAÇÕES

COMERCIAIS DE QUALIDADES DIFERENTES.

VALESKA RODRIGUES

Orientador: PROF. DR. GILSON HÉLIO TONIOLLO

Tese apresentada a Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias, UNESP, Câmpus de

Jaboticabal, como parte das exigências para

obtenção do título de Doutor em Cirurgia

Veterinária.

JABOTICABAL-SP

2009

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DADOS CURRICULARES DA AUTORA

VALESKA RODRIGUES- nascida aos 10 dias do mês de março de 1979,

na cidade de Guarulhos, SP. Cursou o primeiro e segundo grau em escola pública,

sendo aprovada no vestibular para o curso de Medicina Veterinária, em fevereiro

de 1999. Obteve a graduação de médica veterinária na Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias – UNESP- Câmpus de Jaboticabal, em dezembro de 2003,

sendo a 5ª colocada na classificação geral da turma de formandos do curso, além

de obter a nota máxima de sua Instituição, no Exame Nacional de Cursos do MEC,

realizado em 2003. Obteve o título de Mestre em Cirurgia Veterinária, em julho de

2006, sob orientação do prof. Dr. Gilson Hélio Toniollo, na Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias – UNESP- Câmpus de Jaboticabal

"Nós seres humanos, estamos na natureza para auxiliar o

progresso dos animais, na mesma proporção que os anjos estão

para nos auxiliar. Portanto quem chuta ou maltrata um animal é

alguém que não aprendeu a amar"

Chico Xavier

Dedicatória

A minha mãe Josefa Moreira Rodrigues que sempre me apoiou e

defendeu.

Ao meu pai André Luiz Rodrigues (

in memorian

), que lutou

muito, mas infelizmente não pode estar presente na finalização

dessa tese. Mas em espírito tenho certeza que ainda me

acompanha.

Aos meus irmãos Anadege Rodrigues, André Luiz Rodrigues

Junior e Sarah Cristina Rodrigues, por me acompanharem de

longe, mas torcendo para que tudo desse certo.

Ao meu amor André Luis Borges, que apesar de muitos

obstáculos, está presente novamente em minha vida.

Ao professor e orientador Gilson Hélio Toniollo, que me guiou ao

longo desses anos e hoje conseguimos mais essa vitória.

Aos meus bichos de estimação: Fire, Sophie, Juninho e Winny, os

quais muitas vezes foram deixados de lado para que eu pudesse

realizar esse trabalho.

Dedico

Agradecimentos

A Deus por ter me dado garra e coragem para enfrentar obstáculos na vida e

vencê-los.

A FAPESP pelo apoio financeiro, sem o qual este trabalho teria mais dificuldades

em ser desenvolvido.

Ao professor Aulus Cavalieri Carciofi, mentor deste trabalho, assim como aos

pós graduandos, residentes e funcionários do laboratório de nutrição envolvidos

no projeto, por todo apoio. Agradeço também as empresas conveniadas ao

Laboratório de pesquisa em Nutrição e doenças nutricionais de cães e gatos, do

Departamento de Clínica e Cirurgia da FCAV UNESP/Jaboticabal pelo apoio, em

especial a Guabi que é um dos grandes parceiros atualmente.

A professora Maria Denise Lopes, Fabiana Ferreira de Souza e professor

Frederico Ozanam Papa, pelos ensinamentos passados, muito importantes para

a realização desse trabalho. O agradecimento estende-se a todos do

departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ

UNESP/Botucatu.

Aos professores Francisco Guilherme Leite e Paulo Henrique Franceschini,

pela grande ajuda, assim como a todos o departamento de Reprodução Animal da

FCAV UNESP/Jaboticabal.

Aos amigos de profissão: Diogo José Cardilli, Carolina Franchi João, Fabiana

Azevedo Voorwald, Caio de Faria Tiosso, Lizandra Amoroso, Ana Gabriela

Valério, Denise Claudia Tavares, Michele Garcia Medeiros, João Humberto

Teotônio de Castro, Juliana Borges, Patrícia Rotta Lopes, Leandro Luis

Martins, Rogério Vieira da Silva, Viviane Helena Chirinéa, Luciana Paes

Macedo, Marco Augusto Machado da Silva, Kellen de Sousa Oliveira pela

amizade e ajuda durante essa jornada.

As amigas Elzylene Léga, Mildre Loraine Pinto por participarem de momentos

bons e ruins com amizade e compreensão. Agradeço a amizade de todos os

funcionários da clínica veterinária Bichos e Caprichos Jaboticabal/SP.

Ao professor Jeffrey Frederico Lui e família pela grande ajuda a comunidade,

com seus trabalhos humanitários e em saúde animal.

Aos meus tios, primos, avó, pelo apoio e incentivo.

Aos amigos distantes Davidson Valsirolli, Georgedson Valsirolli, Eduardo,

Sandra F. Sales, Emerson Fernandes, Érica Noronha e Alexandre Monteiro,

Danilo Gama Martins pelo apoio e perdão pela distância física (não afetiva) que

nos separou.

Ao Prof. Dr. João Ademir de Oliveira, pela valiosa colaboração nas análises

estatísticas.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Muito obrigada.

Sumário

Lista de abreviaturas ............................................................................................ ii

Lista de tabelas .................................................................................................... iv

Lista de figuras .................................................................................................... vi

Resumo ............................................................................................................... viii

Abstract ................................................................................................................ ix

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 2

2.1 Avaliação e congelação do sêmen ................................................................ 2

2.1.1- Histórico ................................................................................................. 2

2.1.2 Avaliação da qualidade do sêmen .......................................................... 2

2.1.3 Congelação de sêmen ............................................................................ 7

2.2 Análise ultrassonográfica .............................................................................. 8

2.3 Nutrição ......................................................................................................... 8

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 10

3.1 Composição do grupo experimental ............................................................ 10

3.2 Colheita do sêmen ...................................................................................... 11

3.3 Análise do ejaculado ................................................................................... 11

3.3.1 Análises microscópicas ......................................................................... 11

3.4 Criopreservação do sêmen ......................................................................... 12

3.4.1-Avaliação do sêmen criopreservado ..................................................... 13

3.5 Mensuração e avaliação ultrassonográfica de testículos e próstata ........... 13

3.6 Análise estatística ......................................................................................... 13

4. RESULTADOS ................................................................................................. 15

5. DISCUSSÃO..................................................................................................... 32

6. CONCLUSÃO ................................................................................................... 38

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 39

Lista de abreviaturas

• ABNT: Associação Brasileira de Normas Técnicas

• ALT: Alanina aminotransferase

• BAS: leucócitos basófilos

• Caract.: característico

• CASA: Computer assisted semen analyser

• cel: células

• cm: centímetro

• dL: decilitro

• EOS: leucócitos eosinófilos

• FA: fosfatase alcalina

• FSH: hormônio folículo estimulante

• g: grama

• GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas

• h: horas

• Hb: hemoglobina

• He: hemácias

• Ht: hematócrito

• IA: Inseminação artificial

• LANA: Laboratório de nutrição animal

• LEU: leucócitos

• LH: hormônio luteinizante

• LINF: leucócitos linfócitos

• mg: miligrama

• mL: mililitro

• MON: leucócitos monócitos

• mov: movimento

• NB: leucócitos neutrófilos bastonetes

• NS: leucócitos neutrófilos segmentados

iii

• PT: proteína total

• ROS: espécies reativas de oxigênio

• sptz: espermatozóides

• TRIS: hidroximetil amino metano

• µg: micrograma

• µL: microlitro

Lista de tabelas

Tabela 1- Níveis de garantia dos produtos fornecidos aos animais durante o

estudo, A (Econômica), B (Premium) e C (Super premium) e análise química,

Jaboticabal/SP, 2009. ................................................................................................. 16

Tabela 2- Parâmetros médios do sêmen de cães da raça Beagle,

alimentados com três rações comerciais (A: Econômica, B: Premium, C:

Super Premium), Jaboticabal/SP, 2009. ............................................................... 18

Tabela 3- Médias e desvios padrão de motilidade espermática (%),

vigor(0-10), concentração (espermatozóides X 10

/mL),

espermatozóides totais no ejaculado (X 10

) e defeitos na morfologia

espermática (%), de cães da raça Beagle, tratados com três rações

comerciais, Jaboticabal/SP, 2009. ........................................................................ 26

Tabela 4- Principais parâmetros do sêmen canino, pós-descongelação,

de cães da raça Beagle, tratados com três diferentes rações comercias

(A: Econômica, B: Premium, C: Super Premium), Jaboticabal/SP, 2009. ............. 28

Tabela 5- Médias e desvios padrão de motilidade espermática (%),

movimento progressivo (%) e defeitos na morfologia espermática (%),

do sêmen pós-descongelação, de cães da raça Beagle, alimentados

com três rações comerciais (A: Econômica, B: Premium, C: Super

Premium), Jaboticabal/SP, 2009........................................................................... 29

Tabela 6- Medidas do testículo direto (D) e esquerdo (E) de cães da

raça Beagle, obtidas com paquímetro, alimentados com três rações

comercias (A: Econômica, B: Premium, C: Super Premium),

Jaboticabal/SP, 2009. ........................................................................................... 29

Tabela 7- Biometria de próstata dos cães da raça Beagle, tratados com

três rações comercias diferentes (A: Econômica, B: Premium, C: Super

Premium), obtidas por exame ultrassonográfico, Jaboticabal/SP, 2009. .............. 30

Tabela 8- Análise Hematológica média dos animais, dentro de cada

grupo experimental, Jaboticabal/SP, 2009. .......................................................... 48

Tabela 9- Análise dos parâmetros bioquímicos médios, dentro de cada

grupo experimental, Jaboticabal/SP, 2009. .......................................................... 48

Tabela 10- Análise média da urina dos animais, dentro de cada grupo

experimental, Jaboticabal/SP, 2009. ..................................................................... 49

Tabela 11- Idade dos cães da raça Beagle que compuseram o grupo

experimental, Jaboticabal/SP, 2009. ..................................................................... 49

Tabela 12- Componentes do diluente para o sêmen canino elaborado

por ROTA et al. (1997) - ROTA A., STRÖM B., LINDE-FORSBERG C.,

RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ H. Effects of Equex STM paste on viability of

frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38ºC.

Theriogenology 1997; 47: 1093-1101. .................................................................. 50

Lista de figuras

Figura 1- Imagem fotográfica da colheita de sêmen de cão da raça

Beagle, pela técnica da manipulação digital, com auxílio de tubo

coletor cônico adaptado a um funil. ............................................................................... 16

Figura 2- Representação gráfica das médias de motilidade

espermática (x 10

-2

%) do sêmen de cães da raça Beagle (1 a 8),

durante o período de tratamento com três rações comerciais (A:

Econômica, B: Premium e C: Super Premium). ............................................................. 20

Figura 3- Representação gráfica do vigor espermático (notas de 0 a

10) do sêmen de cães da raça Beagle (1 a 8), durante o período de

tratamento com três rações comerciais(A: Econômica, B: Premium e

C: Super Premium). ....................................................................................................... 21

Figura 4- Representação gráfica das médias de concentração

espermática (n

de espermatozóides X 10

/mL) do sêmen de cães

da raça Beagle (1 a 8), durante o período de tratamento com três

rações comerciais(A: Econômica, B: Premium e C: Super Premium). ........................... 22

Figura 5- Representação gráfica das médias de defeitos

espermáticos totais (x 10

-2

%) do sêmen de cães da raça Beagle (1 a

8), durante o período de tratamento com três rações comerciais(A:

Econômica, B: Premium e C: Super Premium). ............................................................. 23

Figura 6- Representação gráfica das médias de defeitos

espermáticos secundários (x 10

-2

%) do sêmen de cães da raça

Beagle (1 a 8), durante o período de tratamento com três rações

comerciais(A: Econômica, B: Premium e C: Super Premium). ...................................... 24

vii

Figura 7- Fotomicrografia das lâminas de sêmen canino coradas pelo

método de Karras modificado, ao exame microscópico de luz

(Objetiva de 100X, sob imersão em óleo). Em A, a seta indica o

defeito espermático de microcefalia. Em B, a seta indica

destacamento de acrossomo em espermatozóide com deformidade

de cabeça (diminuída). Em C, espermatozóides normais. Em D, seta

preta indica defeito de acrossomo, e a vermelha indica gota

citoplasmática proximal. Em E, a seta preta indica cauda fortemente

enrolada e a vermelha, destacamento de acrossomo. Em F, as setas

indicam caudas fortemente enroladas com gota............................................................ 25

Figura 8- Imagem fotográfica do botijão criogênico contendo N

líquido, para estoque das amostras de sêmen congelado. ............................................ 27

Figura 9- Imagem fotográfica do aparelho Hamilton Thorn (HTR

analyser, Hamilton Thorn Research, Berverly, EUA), durante análise

computadorizada do sêmen canino, pós descongelação. ............................................. 27

Figura 10- Imagem fotográfica do exame ultrassonográfico de

próstata (A) e testículo (B), de cães da raça Beagle, tratado com três

rações comercias diferentes.Em A, a seta amarela indica o corte

transversal da uretra prostática. Em B, as setas pretas indicam o

mediastinum testis. ........................................................................................................ 31

viii

Avaliação andrológica e ultrassonográfica de testículos e

próstatas de cães (Canis familiaris – Linnaeus, 1758) da raça

Beagle, alimentados com três rações comerciais de qualidades

diferentes

Resumo

O crescimento acelerado na produção de alimentos para cães e gatos

nem sempre é acompanhado pelo aumento de sua qualidade. Os

desequilíbrios alimentares são diretamente responsáveis ou

predispõem a inúmeras doenças ósseas, metabólicas e podem ser

potenciais causadores de alterações testiculares, com reflexo na

fertilidade de cães. Mediante isso, objetivou-se: avaliar as possíveis

alterações de testículos e da próstata, por meio de exame

ultrassonográfico, de cães alimentados com três diferentes dietas,

analisar a qualidade do sêmen fresco e congelado ao longo dos

tratamentos; verificar possíveis correlações entre rações fornecidas e

variáveis reprodutivas analisadas. Oito cães da raça Beagle, adultos,

foram selecionados e condicionados a colheita de sêmen. Três grupos

de cães receberam rações comerciais distintas, a cada cinco meses.

Transcorrido esse período, as rações foram trocadas de modo que, ao

final de 15 meses, todos os grupos receberam três dietas diferentes. A

cada 15 dias, o sêmen foi colhido e avaliado e, a cada troca de ração,

foram realizadas avaliações ultrassonográficas de próstata e testículos,

além da congelação do sêmen. As médias das variáveis, em cada

grupo, nos três períodos, foram analisadas por meio de comparação

emparelhada (teste t). Não existiu diferença (p>0,05) das análises

andrológicas frente as rações utilizadas, de modo que os tipos de

rações utilizadas não interferiram positiva ou negativamente na

qualidade seminal dos animais tratados.

Palavras chave: cães, avaliação andrológica, nutrição

Andrological evaluation of Beagle canine semen and

ultrasonography of testis and prostate, fed with three commercial

foods

Abstract

: The accelerate raise of the production of food for pets

worldwide sometimes do not lead to increased food quality. Alimentary

imbalances may be directly associated to several bone and metabolic

diseases. Testicular degeneration and infertility may also be observed.

Regarding the influence of the nutritional imbalance on the reproductive

performance, the aim of the present study was: evaluate the quality of

canine fresh semen and testis an prostate by means ultrasonography

treated with three different types of commercial food for dogs. Eight

adult Beagles were selected and conditioned to semen sampling. Three

groups of dogs received three different types of dog food, every five-

month intervals. After this period, the kind of dog food was changed. In

the end of 15 months, all dogs were fed with all the types of dog food.

Semen samples were obtained every 15-days interval and semen

analysis were performed. The mean values of the variables were

evaluated in the three periods by means of the t test. There was no

significant difference (p>0,05) regarding the semen analysis among the

different types of dog food. The types of dog food did not influence the

quality of the semen of the animals in the present study during each

experimental period.

Key words: dog, andrological evaluation, nutrition

1. INTRODUÇÃO

A domesticação do cão e sua manutenção como animal de estimação

resultou, num processo de seleção gradativo e contínuo. Achados arqueológicos

indicam que o cão doméstico existe há pelo menos 14 mil anos e que, sua

domesticação ocorreu inicialmente na Europa e Ásia Ocidental, muito antes das

outras espécies animais (JOHNSTON, 2000; WILLS & ROBINSON, 2000). A

valorização desse processo ajudou a definir diferentes padrões raciais hoje

conhecidos (RODRIGUES, 1997). Para isso, o homem vem tentando promover o

melhoramento genético na criação de cães, usando inúmeras técnicas, dentre as

quais pode-se destacar as biotécnicas reprodutivas. Com a aquisição do

conhecimento do homem sobre os fenômenos da natureza, à partir do século

XVIII na Europa, iniciou-se a aplicação de biotécnicas na reprodução dos cães e o

desenvolvimento de novas raças (WILLS & ROBSON,2000).

Dentre as biotécnicas, a que vem oferecendo maiores subsídios para a

difusão do material genético na criação de cães, é a inseminação artificial,

associada intimamente com a tecnologia de sêmen (SILVA, 2001). A utilização do

sêmen canino, refrigerado ou criopreservado, permite a troca de material genético

de alto valor zootécnico em localidades distantes, bem como o armazenamento

desse material por períodos indefinidos (LINDE-FORSBERG & FORSBERG,

1989). Tendo em vista a influência da nutrição na função reprodutiva nas

diferentes espécies e, a valorização das criações de animais de companhia,

especificamente dos cães da raça Beagle, objetivou-se com este estudo:

1- Identificar possível variação na qualidade do sêmen, de acordo com

o tipo de ração (Econômica: A, Premium: B e Super Premium: C),

oferecida.

2- Identificar possível variação no tamanho e ecogenicidade testicular e

prostática ao exame ultrassonográfico, conforme a dieta

3- Avaliar a qualidade do sêmen após o processo de criopreservação e

correlacionar com os tratamentos alimentares efetuados.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Avaliação e congelação do sêmen

2.1.1- Histórico

Os primeiros estudos relacionados à inseminação artificial e conservação do

sêmen, na espécie canina, foram realizados por Lázaro Spallanzani no final do

século XVIII (ENGLAND, 1993). Porém, esses estudos ficaram estagnados por

longo período, devido maior interesse em animais de produção, como ruminantes

e suínos. Somente em 1954, ROWSON conseguiu notificar a primeira congelação

de sêmen canino com sucesso e, em 1969, SEAGER retomou os estudos e

obteve a primeira gestação em cadela, utilizando sêmen criopreservado. Inúmeros

estudos em reprodução de cães têm sido realizados, principalmente nas últimas

duas décadas. O interesse nessa espécie cresceu e os criadores vêm

requisitando mais serviços especializados, direcionados a animais de alto valor

zootécnico ou afetivo. No Brasil, a primeira notificação de sucesso em

inseminação artificial (IA), com sêmen canino congelado, foi realizada há pouco

mais de duas décadas, com obtenção de seis filhotes saudáveis da raça Boxer

(VASKE et al., 1981). Desde então, inúmeros trabalhos vem sendo realizados a

respeito do processamento de sêmen canino. Recentemente, SANTOS (2004)

apresentou resultados de 70% de nascimento após inseminação artificial com

sêmen congelado diluído em meio a base deTRIS (hidroximetil amino metano).

Existem várias técnicas para congelação de sêmen nas diferentes espécies.

No cão, pode-se utilizar diluidores à base de água de coco (ACP-106

)

(CARDOSO et al., 2007), porém o TRIS é utilizado com maior freqüência, com

bons resultados.

2.1.2 Avaliação da qualidade do sêmen

A avaliação da qualidade do sêmen compreende as características físico-

químicas, macro e microscópicas. Para colheita do ejaculado canino podem ser

utilizados dois métodos. O primeiro consiste na massagem do pênis (estimulação

digital), que foi o empregado por Spallanzani em suas experiências e continua

sendo preferido por alguns autores que afirmam obter sêmen de melhor

qualidade. O segundo método é o que utiliza a vagina artificial. Para um bom êxito

no trabalho, é indispensável um período de adaptação do animal, condicionando-o

ao procedimento. Algumas vezes, faz-se necessária a presença de uma fêmea em

estro ou secreção vaginal obtida por suabe, para que o macho possa cheirá-lo, e

assim excitar-se (FELDMAN & NELSON, 1996).

O ejaculado canino é dividido em três frações diferenciadas. A primeira é a

fração pré-espermática, de origem prostática, que possui aspecto aquoso e

transparente, com volume variando de 0,5 a 5 mL. A segunda fração é rica em

espermatozóides, com coloração variando de branco leitoso a translúcido,

dependendo da concentração de células, e o volume varia entre 1 a 4 mL

(JOHNSTON et al., 2001). A terceira fração é também de origem prostática, com

aspecto aquoso e transparente e volume entre 2,5 a 80 mL, com função de

facilitar o transporte espermático pela cervix e aumentar o volume do ejaculado

(ENGLAND & ALEN, 1992).

O número total de espermatozóides num ejaculado canino varia de 300

milhões a 2 bilhões, dependendo da raça, idade e freqüência de colheita

(JOHNSTON et al., 2001).

2.1.2.1 Avaliação de motilidade e vigor espermáticos

Segundo DERIVAUX (1980), a avaliação da motilidade espermática é

definida com o percentual de espermatozóides móveis em uma amostra de sêmen

e o vigor é a intensidade de seu movimento. Apesar da relação desse parâmetro

com a capacidade fecundante do espermatozóide canino não estar totalmente

elucidada, atualmente, a maioria dos pesquisadores ainda utiliza a motilidade

como principal parâmetro para a avaliação de diluentes, crioprotetores e técnicas

de criopreservação do sêmen canino (IVANOVA-KICHEVA et al., 1997; SILVA et

al., 2003).

A avaliação da motilidade espermática deve ser realizada imediatamente

após a colheita ou descongelação do sêmen, com auxílio de microscopia óptica de

luz (SEAGER & FLETCHER, 1972), em microscópio de contraste de fase ou em

analisador computadorizado (HTR-IVOS ANALYSER,Hamilton Thorn Research).

A vantagem do analisador está na avaliação da característica do movimento

espermático, se progressivo, retrógrado, velocidade espermática, velocidade em

linha reta, curvilínea e linearidade dos espermatozóides (IGUER-OUADA &

VERSTEGEN, 2001).

Deve-se avaliar o vigor espermático, que é a intensidade da motilidade

exibida pelos espermatozóides móveis. Para isso, utilizam-se classificações que

variam conforme o autor, com escalas que vão de 0 a 10 (PLATZ & SEAGER,

1977).

Apesar da grande utilização, a motilidade não é um parâmetro totalmente

confiável para predizer a capacidade fecundante de uma amostra de sêmen. A

presença de espermatozóides imóveis na amostra não implica que estejam

mortos. Em outras espécies, já foi comprovada a presença de espermatozóides

estruturalmente intactos, porém imóveis após descongelação (JANUSKAUSKAS

et al., 1995), que podem voltar a apresentar movimento, pela adição de

substâncias estimulantes como a cafeína (LARSSON e EINARSSON, 1976). Por

outro lado, espermatozóides que apresentem uma motilidade de boa qualidade,

após descongelação, podem ser incapazes de fertilizar um oócito caso

apresentem danos acrossomais (STROM et al., 1997). Assim, apesar da

motilidade não ser um parâmetro indicativo de mensuração de espermatozóides

vivos ou mortos, fornece informação de um fator necessário para a capacidade

fertilizante do espermatozóide, pois a motilidade é a manifestação de sua

competência estrutural e funcional (PEÑA-MARTINEZ, 2004).

Além disso, por ser uma avaliação subjetiva, a motilidade sofre influências

como, por exemplo, da temperatura do local onde está sendo realizada e

habilidade do avaliador, levando a elevada variabilidade entre laboratórios

(IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001).

2.1.2.2 Avaliação da morfologia espermática

A avaliação da morfologia espermática é um outro parâmetro importante. No

entento, até o momento, não foi descrita evidência de relação entre morfologia

espermática e fertilidade no cão. Há poucos trabalhos que descrevem uma

possível relação, porém com resultados conflitantes (OETTLÉ & SOLEY, 1985;

RENTON et al., 1986; PLUMMER et al., 1987). OETTLÉ (1993) relatou que, a

medida que o percentual de espermatozóides anormais aumenta, a fertilidade é

reduzida, sendo observado que quando a proporção de espermatozóides

morfologicamente normais está abaixo de 60%, a fertilidade é adversamente

afetada.

Diversas classificações foram propostas para a morfologia espermática.

SEAGER (1986) sugere a classificação das alterações morfológicas espermáticas

como: primárias, quando relacionadas a problemas oriundos da produção

espermática no testículo; secundárias, quando relacionados aos problemas

causados durante a maturação espermática no epidídimo, ou oriundas dos

processos de manipulação do sêmen, como diluição, resfriamento, congelação ou

descongelação. OETTLÉ (1993) sugere a classificação de acordo com os danos

que as alterações causam à função espermática, nomeando tais alterações como

defeitos maiores ou menores. Já outros autores classificam as alterações de

acordo com a região espermática afetada, sendo defeitos de cabeça, peça

intermediária ou cauda (SILVA et al., 2003).

Segundo o Manual para Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal,

do CBRA- Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998), a proporção de

defeitos maiores e menores no sêmen de cão deve ser no máximo de 20%, não

devendo o total de defeitos maiores ser superior a 10%.

Para possibilitar a avaliação da morfologia espermática, pode-se fazer uso de

diversos corantes, tais como Eosina-Nigrosina (DOTT & FOSTER, 1972),

Spermac® (OETTLÉ, 1993), Rosa Bengala (RODRIGUES, 1997), Giemsa

(CARDOSO et al., 2003), Hematoxilina-Eosina (SILVA et al., 2003) Karras

modificado por PAPA et al. (1988). Entretanto, é necessário enfatizar que nem

todas as alterações acrossomais podem ser identificadas pela microscopia comum

(RODRIGUES, 1997), sendo sugerido o emprego de outras técnicas mais

eficientes, como a microscopia eletrônica (SILVA, 2005).

A integridade de membrana espermática não só é importante para o

metabolismo espermático, como também para o sucesso da fertilização do oócito.

Para a avaliação dessa integridade podem ser utilizadas sondas fluorescentes

(técnica descrita por HARRISON & VICKERS, 1990 e modificada por CUNHA et

al., 1996, para utilização em cães). Esse tipo de técnica é capaz de avaliar a

presença de rupturas na membrana espermática como resultado de lesão celular.

As colorações fluorescentes permitem a avaliação espermática tanto pela

microscopia de fluorescência, quanto pela citometria de fluxo.

2.1.2.3 Análise computadorizada

A análise computadorizada (CASA) vem sendo utilizada para minimizar a

subjetividade nas análises de sêmen, em diversas espécies animais, incluindo o

cão (IGUER-OUADA & VERSEGEN, 2001).

Diversos aparelhos são descritos para a realização da CASA, dentre estes

podemos destacar: Hamilton Thorn (HTR analyser, Hamilton Thorn Research,

Berverly, EUA), Cell Soft Computer Videomicrography System (Cryo Resources

LTDA, Nova York, EUA) e o Sperm Quality Analyser (SQA II, Medical Electronic

Systems LTDA- Tirat Carmel, Israel).

A CASA permite avaliação objetiva e precisa das células móveis, além de

definir a qualidade do movimento dos espermatozóides. Os dados obtidos por

esse método correspondem a centenas de mensurações espermáticas individuais,

fornecendo informações sobre qualidade média da motilidade em uma amostra de

sêmen (GÜNZEL-APEL et al., 1993).

A análise computadorizada é utilizada também como um meio de classificar

algumas sub-populações de espermatozóides. Utilizando imagens digitalizadas de

cada célula espermática, as máquinas são aptas a analisar, por processamento

algorítmico, as propriedades dos movimentos dos espermatozóides. Os

parâmetros mais comumente reportados no CASA são velocidade retilínea,

curvilínea (VERSTEGEN et al., 2002)

2.1.3 Congelação de sêmen

Apesar da inseminação artificial (IA) em cães domésticos ter crescido nas

últimas décadas, os estudos realizados ainda não proporcionam um modelo

eficiente para a criopreservação do cão doméstico e canídeos silvestres,

ameaçados de extinção.

Em 1949, a descoberta da ação crioprotetora do glicerol, por POLGE et al.,

proporcionou significante impacto na metodologia da criopreservação de células.

A partir daí, o procedimento de criopreservação das células espermáticas vem

sendo empregado na espécie canina. Atualmente, a maioria das notificações

científicas (ROTA et al., 1999, TSUTSUI et al., 2000), refere-se gestação

alcançada utilizando-se diluentes à base de TRIS, gema de ovo e glicerol.

Os diluentes para congelação de sêmen devem possuir nutrientes como

fonte de energia (glicose, glicina), tampão contra mudanças de pH (TRIS- ácido

cítrico, TES- citrato), possuir osmolaridade e concentração de eletrólitos

fisiológicas, antibióticos para prevenção de crescimento bacteriano (penicilina,

estreptomicina, neomicina, amicacina), gema de ovo e leite para proteção contra o

choque térmico durante a refrigeração, e possuir crioprotetores (glicerol,

etilenoglico) para reduzir danos aos espermatozóides resultantes da congelação e

descongelação (LINDE – FORSBERB, 1991; ENGLAND, 1993; BATEMAN, 2001).

A utilização de detergentes biológicos no diluente também tem sido descrita por

vários autores, como o “Equex STM paste” (PEÑA & LINDE-FORSBERG, 2003;

MARTINS, 2005) e “Orvus ES Paste” (NIZAŃSKI et al.;2001).

Vários períodos de refrigeração e congelação têm sido descritos para

canídeos (FONTBONNE & BADINAND, 1993; SILVA et al., 1996), sendo

dependentes do método de envasamento (ROTA, 1998). Rota et al. (2005)

concluíram que o método da curva de congelação lenta do sêmen canino

apresentou melhores resultados na preservação de membrana espermática,

quando comparado com o método de congelação rápida em nitrogênio (sem

resfriamento inicial). HORI et al. (2006) compararam a congelação em N

líquido

rápida e lenta, com a permanência do sêmen a 5, 7 e 10 cm da coluna de N

, a -

C ,por 5, 10 e 15 minutos. Os melhores resultados foram do grupo que ficou a

7 cm do nível de N

líquido por 10 minutos.

2.2 Análise ultrassonográfica

A ultrassonografia em modo B, devido ao seu desenvolvimento técnico e

abrangência de indicações, traz vantagens significativas à exploração animal

(FERNANDES, 1996). Trata-se de uma técnica não invasiva e rápida, sendo

utilizada em medicina veterinária há muitos anos, incluindo a avaliação de

próstata, além de outros órgãos do aparelho reprodutor masculino. PECHMAN

& EILTS (1987) identificaram as estruturas anatômicas do trato reprodutivo de

touros por meio de ultrassonografia em modo B. Segundo CARVALHO (2004),

o modo B é conhecido como “modo de brilho” ou “modo bidimensional”. Neste

tipo de representação, a intensidade do eco é visibilizada como um ponto

luminoso em um monitor. Quanto maior a reflexão da onda sonora, mais

intenso o brilho do ponto luminoso. As diferentes intensidades de brilho

determinam, em uma escala de cinza, diversas ecogenicidades, variando de

anecóico a hiperecóico.

2.3 Nutrição

No Brasil estima-se que existam aproximadamente 38 milhões de animais de

estimação. Destes, 27 milhões são cães e 11 milhões são gatos. O comércio de

produtos destinados a estes animais está em crescimento, tanto no mercado

nacional quanto no mercado mundial, sendo a alimentação o segmento

responsável pelos maiores investimentos. Porém, este crescimento acelerado na

produção de alimentos para cães e gatos nem sempre é acompanhado pelo

aumento de sua qualidade, isto é, existem no Brasil inúmeras fábricas de ração

entretanto poucas se preocupam realmente com a saúde dos animais.

Os desequilíbrios alimentares são diretamente responsáveis ou predispõe a

inúmeras doenças ósseas, metabólicas e podem ser potenciais causadores de

degeneração testicular, resultando em possível infertilidade em cães (FELDMAN &

NELSON, 1996). Sabe-se que, principalmente as deficiências de vitaminas e

minerais podem causar transtornos reprodutivos e podem levar a esterilidade. A

deficiência de vitamina A interfere na liberação de hormônios gonadotróficos,

diminuição da espermatogênese, da esteroidogênese, culminando com

degeneração testicular, acúmulo de lípides em túbulos seminíferos e células de

Leydig. A vitamina E pode prevenir a degeneração testicular e sua deficiência

também interfere na reprodução, porém o seu papel na fertilidade de machos

ainda é obscuro (HAFEZ & HAFEZ, 2003).

Os efeitos de restrições nutricionais sobre a fertilidade são mais perceptíveis

nas fêmeas que nos machos. Os animais jovens em crescimento são muito mais

susceptíveis ao estresse nutricional do que os adultos. Nos machos, deficiências

nutricionais atrasam a puberdade e prejudicam a produção e as características do

sêmen. Além disso, a nutrição afeta mais a função endócrina do que a função

espermatogênica dos testículos. Fatores nutricionais comuns englobam

deficiências calóricas, protéicas e vitamínicas, porém os minerais e os agentes

tóxicos também podem ser importantes (HAFEZ & HAFEZ, 2003).

Os efeitos da subnutrição podem ser corrigidos nos animais adultos, o que

não acontece com os animais jovens, devido aos danos permanentes provocados

no epitélio germinativo dos testículos, durante o crescimento. A obesidade e a

superalimentação reduzem a libido e a atividade sexual em carneiros, cachaços e

touros, em especial nos dias quentes (HAFEZ & HAFEZ, 2003).

Existem poucas informações referentes aos efeitos de deficiências minerais

sobre as funções reprodutivas masculinas. Em touros, tem-se suspeitado da

deficiência de iodo como causa de libido insuficiente e características seminais

insatisfatórias. Nota-se melhoria da produção espermática e da fertilidade após

alimentação suplementada com cobre, cobalto, zinco e manganês nesta mesma

espécie (HAFEZ & HAFEZ, 2003).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Composição do grupo experimental

Foram selecionados oito cães da raça Beagle, sadios, machos, adultos,

idade média entre 2 a 5 anos, peso médio de 14 kg, do canil do Laboratório de

Pesquisa em Nutrição e Doenças Nutricionais de cães e gatos, do Departamento

de Clínica e Cirurgia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e

Veterinárias-FCAV UNESP/ Jaboticabal, condicionados para a colheita de sêmen.

O grupo de cães foi homogêneo quanto a idade, peso e origem. O ambiente onde

os cães estavam alojados foi o mesmo para todos, sendo canis individuais, com

acesso diário a área gramada. Os cães foram vacinados e desverminados

regularmente conforme o protocolo utilizado pelo Hospital Veterinário “Governador

Laudo Natel”, além de serem realizados exames clínicos (exame físico completo)

e laboratoriais (avaliações de sangue e urina) ao final de cada período de

tratamento.

Os cães foram divididos em três grupos, cada um recebeu uma ração

durante cinco meses. Ao final desse período, as rações foram trocadas, para que

os cães recebessem todos os tipos ao final de 15 meses. As dietas utilizadas

durante o experimento foram compostas por três rações comerciais com

composição e níveis nutricionais diferentes. Amostras das rações (A: Econômica,

B: Premium, C: Super-premium), foram guardadas e conservadas em freezer a -

10°C, para posterior analise no Laboratório de Nutrição Animal (LANA), do

Departamento Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária da

UNESP-Jaboticabal.

Os cães foram alimentados uma vez ao dia e a quantidade oferecida

calculada pelo Serviço de Nutrição Clinica do Hospital Veterinário “Governador

Laudo Natel”, para a manutenção do peso dos animais. O tratador não poderia

informar qual ração cada cão estava consumindo, evitando qualquer influência na

avaliação do sêmen.

3.2 Colheita do sêmen

A colheita de sêmen foi realizada em ambiente tranqüilo, pelo método da

estimulação digital (mão enluvada), utilizando um funil devidamente limpo,

adaptado a tubo coletor cônico de 15 mL. Anteriormente a colheita, o pênis foi

higienizado com uma gaze ou compressa seca, para evitar contaminação das

amostras. Os primeiros jatos do ejaculado foram descartados, sendo a segunda e

terceira frações espermáticas colhidas juntas. As colheitas foram realizadas em

média a cada 15 dias.

3.3 Análise do ejaculado

Imediatamente após a colheita, o ejaculado foi mantido em banho-maria a

temperatura de 37ºC e analisado macro e microscopicamente. A cada período de

tratamento, amostras de sêmen de cada cão foram congeladas. O volume foi

avaliado pela leitura direta da graduação do tubo coletor. O pH foi mensurado

utilizando-se fita para avaliação de pH. A fita impregnada uniformemente pela

amostra de sêmen era analisada após 30 segundos, e comparada com a tira de

calibragem das fitas colorimétricas, com variação de 0 a 14 (Universalindikator pH

0-14, Merck®).

3.3.1 Análises microscópicas

Motilidade e Vigor

Para avaliação da motilidade espermática, uma gota de sêmen fresco foi

colocada entre lâmina e lamínula, pré-aquecidas a 37ºC, e observada em

microscópio de contraste de fase, em aumento de 100X. Foi avaliada a

porcentagem de células com movimento progressivo.

O vigor foi analisado nessa mesma amostra, durante a visualização da

motilidade, quanto a intensidade do movimento progressivo dos espermatozóides,

pelo escore de 0 (nenhum movimento) a 10 (movimento retilíneo).

Concentração Espermática

Para determinação da concentração espermática (número de

espermatozóides/ mL) foi realizada a diluição do sêmen em 1:20, sendo 50 µL de

ejaculado e 950 µL de água destilada ou formol salina tamponado a 10%. Essa

diluição foi utilizada para preencher a câmara hematocitométrica de “Neubauer”.

Após sedimentação das células espermáticas, a leitura foi realizada em

microscópio de contraste de fase, em um aumento de 400X, e o número de

células contadas e expressas em espermatozóides por mL.

Morfologia Espermática

Esfregaços foram confeccionados com o sêmen, em lâmina de vidro, fixados

em formol salina durante 10 minutos em banho-maria a 37ºC, secos em

temperatura ambiente e armazenados. Posteriormente, as lâminas foram coradas

pelo método de Karras modificado (PAPA et al., 1988); foram contadas 200

células, em microscópio, num aumento de 1000X (imersão), sendo as alterações

morfológicas classificadas em defeitos primários e secundários.

3.4 Criopreservação do sêmen

Em pelo menos uma colheita de cada fase dos tratamentos,foi realizada a

congelação do sêmen dos cães.

Após serem feitas as análises macro e microscópicas, o ejaculado era

centrifugado a 800g, por 10 minutos. O plasma seminal foi descartado e o pellet

obtido no fundo do tubo, foi ressuspenso em meio diluente elaborado por Rota et

al. (1997), (Tabela 12 do anexo).

A diluição do sêmen foi realizada para concentração mínima de 40 X 10

espermatozóides móveis/ mL. O sêmen diluído foi então envasado em palheta de

0,5 mL, lacrada com álcool polivinílico, identificada devidamente e levada a um

refrigerador, com temperatura constante de 5ºC, por uma hora.

A congelação das palhetas foi inicialmente feita em vapor de nitrogênio. As

palhetas foram mantidas sob o vapor, posicionadas a 6 cm da coluna de

nitrogênio líquido (N

), em uma caixa de isopor apropriada, durante 20 minutos.

Após esse período, as palhetas foram mergulhadas no N

líquido e,

posteriormente, armazenadas em botijão criogênico.

3.4.1-Avaliação do sêmen criopreservado

A descongelação das palhetas foi realizada em banho-maria a 70ºC, por 8

segundos, conforme estudo de Martins (2005). Logo em seguida, foram realizadas

novas avaliações do sêmen, sendo incluída a avaliação computadorizada (CASA),

utilizando o equipamento Hamilton Thorn (HTR analyser, Hamilton Thorn

Research, Berverly, EUA), no departamento de Reprodução Animal da FMVZ

UNESP/ Botucatu, além da avaliação da morfologia espermática conforme

descrito anteriormente para o sêmen fresco. Foram avaliadas as sub-populações

quanto ao tipo de movimento, velocidade, linearidade, amplitude lateral.

3.5 Mensuração e avaliação ultrassonográfica de testículos e

próstata

A mensuração testicular de cada animal foi realizada a cada 5 meses, com

auxílio de paquímetro, sendo a primeira antes do início e a última no último dia do

tratamento. Foi também realizada a avaliação ultrassonográfica dos testículos no

final do tratamento, verificando ecogenicidade de parênquima. A avaliação

prostática foi realizada juntamente com a ultrassonografia dos testículos, para

avaliação do parênquima destes órgãos.

3.6 Análise estatística

A analise de variância de medidas repetidas foi o método estatístico utilizado

para avaliar as variáveis estudadas. As médias das variáveis de cada grupo, nos

três períodos, foram comparadas por meio do teste de Tukey, sendo o valor de

p<0,05 considerado significante. Devido ao coeficiente de variação alto, algumas

variáveis foram transformadas (logaritmo), porém os resultados foram os mesmos.

4. RESULTADOS

A adaptação dos cães em baias individuais foi de maio de 2007, sendo um

período de três meses considerado mínimo (anteriormente viviam juntos em

piquetes na zona rural), com acesso diário ao solário e gramado a cada 2 dias. O

resultado dessa adaptação foi satisfatório, sendo o trabalho conduzido conforme o

esperado. Os cães iniciaram a dieta com ração comercial Premium, igual para

todos, uma vez que comiam rações diversas, anteriormente ao experimento. A

fase de adaptação nutricional e ambiental foi realizada no mesmo período.

O condicionamento à colheita de sêmen foi iniciado em julho deste ano de

2007, sendo a estimulação feita semanalmente, até resposta dos cães. Observou-

se que os mais jovens foram condicionados mais rapidamente. O inicio da

avaliação do sêmen foi em agosto, sendo considerado como controle, antes do

início dos tratamentos.

No início de agosto, os cães foram avaliados clínico e laboratorialmente, 7 dos

8 cães apresentavam hemoparasitose. Assim, antes do início do tratamento com

as rações, os cães receberam medicamentos apropriados, recomendados por

docente do departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária da FCAV/UNESP de

Jaboticabal, com boa evolução após 25 dias do diagnóstico da afecção. Os

resultados médios dos exames laboratoriais durante o experimento, realizados

após avaliação clínica dos cães, encontram-se nas tabelas 8 a 10 do apêndice. A

idade dos animais encontra-se na tabela 11 do apêndice.

O início da alimentação com as três rações comerciais foi realizada no dia

01/10/07. A pessoa responsável pela avaliação andrológica não era informada

sobre a ração que cada cão estava ingerindo. A partir dessa data, a avaliação

passou a ser experimental, com amostras já congeladas na primeira fase. As

colheitas de sêmen foram realizadas a cada 15 dias. A troca da ração foi realizada

a partir do dia 01/03/2008 e a terceira mudança a partir do dia 01/08/2008. Na

tabela 1, seguem os níveis de garantia fornecidos no rótulo das rações e a análise

bromatológica comparada aos níveis de garantia fornecidos pelos fabricantes.

Tabela 1- Níveis de garantia dos produtos fornecidos aos animais durante o

estudo, A (Econômica), B (Premium) e C (Super premium) e análise

química, Jaboticabal/SP, 2009.

Níveis de garantia

Composição química

Nutrientes

Ração A Ração B

Ração C

Ração A Ração B Ração C

Umidade

12 12 12 9,35±1,0 8,84±0,8 8,35±0,5

Proteína

Bruta

18 19 26 14,56±1,53 19,11±1,0 25,85±0,7

Extrato

Etéreo

6 7,5 15 9,78±1,4 9,11±0,9 14,11±0,7

Fibra Bruta

6 5 3 3,40±0,9 3,10±0,5 3,42±1,0

Matéria

Mineral

12 9 7 8,37±1,5 7,51±0,6 5,87±0,9

Cálcio (

Ca)

2 2 1,6 1,64±0,26 2,0±0,14 078±0,12

Fósforo (P)

0,7 0,8 0,9 1,02±0,16 1,17±0,5 0,67±0,09

Ca/P

2,85 2,5 1,77 1,5±0,5 1,7±0,4 1,15±0,3

A avaliação andrológica dos cães incluiu a análise de sêmen fresco,

avaliação por palpação e inspeção, além de medida dos testículos e avaliação

ultrassonográfica de testículos e próstata. A colheita de sêmen foi realizada pela

técnica de manipulação digital (figura 1), em media a cada 15 dias, com auxilio de

tubo coletor cônico de 15 mL e funil. Devido a alterações do ejaculado, algumas

amostras foram descartadas.

Figura 1- Imagem fotográfica da colheita de sêmen de cão da raça Beagle, pela

técnica da manipulação digital, com auxílio de tubo coletor cônico

adaptado a um funil.

Ao longo do experimento, foram realizadas 246 colheitas, sendo em média, 10

colheitas por animal em cada período de tratamento.

As médias dos dados obtidos estão representadas na tabela 2, a seguir, e

análise estatística apresentada na tabela 3. A representação gráfica dos

resultados encontram-se nas figuras 2 a 6, e a morfologia espermática na figura 7.

Tabela 2- Parâmetros médios do sêmen de cães da raça Beagle, alimentados com três rações comerciais (A:

Econômica, B: Premium, C: Super Premium), Jaboticabal/SP, 2009.

Ração

Animal Cor Odor Volume

(mL)

Motilidade

(%)

Vigor

(0-10)

pH Concentração

(sptz X

/mL)

Sptz

totais

(x 10

)

Defeitos

primários

(%)

Defeitos

secundários

(%)

Defeitos

Totais

(%)

(Billy)

L caract 1,47 87 8 6-7

347,9 416,97

0.09 5,5 5,6

B L caract 1,61 81 7,44 6-7

257,4 289,61

0 4,6 4,6

C L caract 1,28 88 8,36 6-7

267,2 331,93

0 2,3 2,3

(Biscoito)

L caract 1,87 78 7,09 6-7

226,0 362,1 0 8,8 8,8

B L caract 2,0 80 7,33 6-7

262,9 476,6 0 4,2 4,2

C L caract 2,39 82 7,55 6-7

337,5 742,7 0 2,3 2,3

(Bolero)

L caract 1,59 66 5,82 6-7

226,5 354,9 0 3,7 3,7

B L caract 1,38 80 7,78 6-7

169 222,4 0 2,4 2,4

C L caract 1,18 83 7,36 6-7

220,6 217,8 0 2,6 2,6

(Chorão)

L caract 1,57 67 6,44 6-7

236,1 283,8 0 3,9 3,9

B L caract 1,17 70 6,45 6-7

182,8 211,5 0 3,0 3,0

C L caract 1,29 65 6,0 6-7

225,9 277,5 0 4,9 4,9

(Chapéu)

L caract 1,74 79 7,11 6-7

246,0 315,3 0 5,7 5,7

B L caract 1,29 82 7,64 6-7

223,9 263,7 0 4,2 4,2

C L caract 1,38 79 7,0 6-7

174,3 247,1 0,22 7,1 7,32

(Piano)

L caract 1,69 88 7,89 6-7

307,2 489,3 0 5,0 5,0

B L caract 2,06 89 8,27 6-7

268,5 528,1 0,09 4,0 4,09

C L caract 1,53 88 8,27 6-7

278,0 381,5 0 6,7 6,7

continua

(Rancho)

L caract 3,52 90 8,45 6-7

222,6 714,5 0 2,5 2,5

B L caract 2,94 85 7,72 6-7

155,8 444,4 0 4,1 4,1

C L caract 3,18 88 8,0 6-7

206,2 605,4 0 3,2 3,2

(Tang)

L caract 1,48 88 8,45 6-7

333,2 481,6 0 4,7 4,7

B L caract 1,32 89 8,0 6-7

389,0 455,3 0 5,1 5,1

C L caract 1,2 90 8,0 6-7

454,5 490,1 0 9,8 9,8

L: leitoso

continuação

Figura 2- Representação gráfica das médias de motilidade espermática (x 10

%) do sêmen de cães da raça Beagle (1 a 8), durante o período de

tratamento com três rações comerciais (A: Econômica, B: Premium e

C: Super Premium).

Figura 3- Representação gráfica do vigor espermático (notas de 0 a 10) do

sêmen de cães da raça Beagle (1 a 8), durante o período de

tratamento com três rações comerciais(A: Econômica, B: Premium e

C: Super Premium).

Figura 4- Representação gráfica das médias de concentração espermática (n

de espermatozóides X 10

/mL) do sêmen de cães da raça Beagle

(1 a 8), durante o período de tratamento com três rações

comerciais(A: Econômica, B: Premium e C: Super Premium C).

Figura 5- Representação gráfica das médias de defeitos espermáticos totais (x

-2

%) do sêmen de cães da raça Beagle (1 a 8), durante o período

de tratamento com três rações comerciais(A: Econômica, B: Premium

e C: Super Premium).

Figura 6- Representação gráfica das médias de defeitos espermáticos

secundários (x 10

-2

%) do sêmen de cães da raça Beagle (1 a 8),

durante o período de tratamento com três rações comerciais(A:

Econômica, B: Premium e C: Super Premium).

A B

C D

Figura 7-

Fotomicrografia das lâminas de sêmen canino coradas pelo método de

Karras modificado, ao exame microscópico de luz (Objetiva de 100X,

sob imersão em óleo). Em A, a seta indica o defeito espermático de

microcefalia. Em B, a seta indica destacamento de acrossomo em

espermatozóide com deformidade de cabeça (diminuída). Em C,

espermatozóides normais. Em D, seta preta indica defeito de

acrossomo, e a vermelha indica gota citoplasmática proximal. Em E, a

seta preta indica cauda fortemente enrolada e a vermelha,

destacamento de acrossomo. Em F, as setas indicam caudas

fortemente enroladas com gota.

Tabela 3- Médias e desvios padrão de motilidade espermática (%), vigor(0-10),

concentração (espermatozóides X 10

/mL), espermatozóides totais

no ejaculado (X 10

) e defeitos na morfologia espermática (%), de

cães da raça Beagle, tratados com três rações comerciais,

Jaboticabal/SP, 2009.

Parâmetro

Ração A

(Econômica)

Ração B

(Premium)

Ração C (Super

Premium)

Motilidade (%)

80,6 ±11,00 A 82,3 ±10,00 A 82,8 ±9,80 A

Vigor

10)

7,42 ±1,24 A 7,58 ±1,04 A 7,56 ±1,03 A

Concentração

(sptz X 10

/mL)

268,57 ±146,7 A 239,32 ±168,7 A 269,96 ±138,1 A

Esp

ermatozóides

totais (X 10

)

432,04 ±212,04 A 363,80 ±232,8 A 409,13 ±232,9 A

Defeitos

espermáticos (%)

5,0 ±3,4 A 3,9 ±1,8 A 4,7 ±6,0 A

* Médias com letras diferentes nas linhas, diferem significativamente pelo teste

de Tukey (p< 0,05).

Para a congelação, depois de obtida a concentração espermática, o sêmen foi

centrifugado, e o “pelet” resultante diluído em meio diluidor já descrito

(composição descrita na tabela 12 do apêndice). A concentração final foi de no

mínimo 40 X 10

sptz/mL e congeladas em palhetas de 0,5 mL. As amostras

foram estocadas em botijão criogênico para posterior avaliação (figura 8). As

amostras foram levadas ao Departamento de Reprodução Animal da

FMVZ/UNESP de Botucatu, para serem descongeladas, submetidas a análise

computadorizada (CASA) (figura 9) e realização de esfregaços com o sêmen

descongelado, para verificar a morfologia espermática pós-descongelação. Os

resultados obtidos estão representados na tabela 4 e a análise estatística na

tabela 5.

Os resultados da biometria dos testiculos, com auxílio de paquímetro, estão

representados na tabela 6. Um dos cães apresentava assimetria testicular (o

testículo direito era menor que o contralateral), porém não foi retirado do grupo

experimental. A avaliação ultrassonográfica de próstata e testículos foi realizada

no ao laboratório de Radiologia do Hospital Veterinário Laudo Natel, da

FCAV/UNESP de Jaboticabal (figura 10). As medidas das próstatas dos cães

obtidas estão representadas na tabela 7.

Figura 8- Imagem fotográfica do botijão criogênico contendo N

líquido, para

estoque das amostras de sêmen congelado.

Figura 9- Imagem fotográfica do aparelho Hamilton Thorn (HTR analyser,

Hamilton Thorn Research, Berverly, EUA), durante análise

computadorizada do sêmen canino, pós descongelação.

Tabela 4- Principais parâmetros do sêmen canino, pós-descongelação, de cães da raça Beagle, tratados com três

diferentes rações comercias (A: Econômica, B: Premium, C: Super Premium), Jaboticabal/SP, 2009.

Ração

Animal

Motilidade

(%)

Movimento

Progressivo

(%)

Velocidade (% espermatozóides)

Morfologia (%)

Rápida

Média

Lenta

Estático

defeitos

secundários(%)

defeitos

primários(%)

(Billy)

66 50 53 13 32 2 4 0

38 15 19 19 59 3 3 0

41 25 27 14 54 5 4 0

(Biscoito)

23 16 17 6 34 43 6 0

36 31 32 4 53 11 4 0

36 22 28 8 57 8 5 0

(Bolero)

51 39 40 11 43 6 3 0

49 40 42 7 45 6 3 0

24 16 16 8 53 23 2 0

(Chorão)

20 9 10 10 58 2 3 0

35 21 23 12 63 2 2 0

51 34 36 16 44 4 3 0

(Chapéu)

44 19 22 23 52 4 6 0

34 15 16 18 48 18 3 0

41 17 18 23 51 8 6 0

(Piano)

48 24 29 19 50 2 6 0

24 12 12 12 68 8 4 0

38 13 14 24 51 11 2 0

(Rancho)

43 26 30 13 56 1 3 0

34 16 19 15 64 2 2 0

47 19 22 25 53 0 4 0

(Tang)

52 32 38 15 47 0 8 0

29 16 18 11 68 3 4 0

40 30 34 6 57 3 4 0

Tabela 5- Médias e desvios padrão de motilidade espermática (%), movimento

progressivo (%) e defeitos na morfologia espermática (%), do sêmen

pós-descongelação, de cães da raça Beagle, alimentados com três

rações comerciais (A: Econômica, B: Premium, C: Super Premium),

Jaboticabal/SP, 2009.

Parâmetros

Ração A

(Econômica)

Raç

ão B

(Premium)

Ração C (Super

Premium)

Motilidade (%)

43,37 ±15,00 A 34,87 ±7,00 A 39,75 ±7,90 A

Movimento

progressivo (%)

26,87 ±24,00 A 20,75 ±90 A 22 ±7,20 A

Defeitos

espermáticos (%)

4,87 ±1,00 A 3,12 ±0,80 B 3,75 ±1,30 AB

* Médias com letras diferentes nas linhas, diferem pelo teste de Tukey (p< 0,05).

Tabela 6- Medidas do testículo direto (D) e esquerdo (E) de cães da raça

Beagle, obtidas com paquímetro, alimentados com três rações

comercias (A: Econômica, B: Premium, C: Super Premium),

Jaboticabal/SP, 2009.

Ração

Animal

Testículo direito

Testículo esquerdo

Comprimento

(cm)

Largura (cm)

Comprimento

(cm)

Largura (cm)

A 1

(Billy)

4,5 3,5 4 3

B 4,5 3,5 4 3,5

C 4,5 3,5 4 3

A 2

(Biscoito)

4 3,5 4 3

B 4 3,5 4 3,5

C 4 3,5 4 3

A 3

(Bolero)

4 3 4 3,5

B 4 3,5 4 3,5

C 4 3 4 3,5

A 4

(Chorão)

2,5 2 4 3,5

B 2,5 2 4 3,5

C 2 2 5 3,5

A 5

(Chapéu)

4,5 4 4 3

B 4,5 4 4 3

C 4,5 3,5 4 3

A 6

(Piano)

4 3,5 4 3

B 4 3,5 4 3

C 4 3 4 3

A 7

(Rancho)

4,5 3 4,5 3,5

B 5 4 4,5 4

C 5 4 4,5 4

A 8

(Tang)

4 3 4 3

B 4 3,5 4 3

C 4 3,5 4 3

Tabela 7- Biometria de próstata dos cães da raça Beagle, tratados com três

rações comercias diferentes (A: Econômica, B: Premium, C: Super

Premium), obtidas por exame ultrassonográfico, Jaboticabal/SP,

2009.

Ração

Animal

Testículo direito

Testículo esquerdo

Comprimento

(cm)

Largura

(cm)

Profundidade

L (cm)*

Profundidade

T (cm)**

A 1

Billy

2,42 3,29 2,05 1,98

B 1,68 3,29 2,85 1,98

C 2,3 3,3 2,9 2,1

A 2

Biscoto

3,01 3,18 2,00 1,70

B 2,97 3,57 3,47 3,88

C 3,1 3,2 3,5 3,7

A 3

Bolero

3,17 3,00 1,83 2,31

B 2,79 2,53 3,5 3,35

C 2,89 3,2 3,5 3,3

A 4

Chorão

3,35 3,2 1,8 3,0

B 2,50 3,00 1,50 1,67

C 3,25 3,18 1,74 2,93

A 5

Chapéu

3,4 2,5 1,9 3,1

B 2,90 3,74 3,07 2,54

C 3,34 2,46 1,91 3,01

A 6

Piano

2,5 3,7 3,4 2,2

B 2,33 3,11 1,88 2,44

C 2,34 3,78 3,41 1,84

A 7

Rancho

3,55 2,45 2,12 3,41

B 3,6 2,6 2,2 3,5

C 2,50 3,29 2,30 2,10

A 8

Tang

1,44 2,45 2,78 2,72

B 2,1 2,6 2,8 2,9

C 1,69 2,52 1,54 1,04

* Profundidade L: longitudinal

** Profundidade T: transversal

Figura 10- Imagem fotográfica do exame ultrassonográfico de próstata (A) e

testículo (B), de cães da raça Beagle, alimentados com três rações

comercias diferentes.Em A, a seta amarela indica o corte transversal

da uretra prostática. Em B, as setas pretas indicam o mediastinum

testis.

O exame ultrassonográfico de alguns cães indicou certa hiperplasia

prostática, compatível com a idade dos cães. As alterações encontradas não

interferiam no experimento, pois a qualidade do sêmen, nestes indivíduos, não

foi alterada.

5. DISCUSSÃO

No início do relacionamento homem-cão, os cães tinham função

essencialmente de trabalho, principalmente em caçadas. Com o passar do

tempo estes animais passaram a desempenhar uma função de companhia. No

Brasil estimava-se em 2003 que existiam aproximadamente 38 milhões de

animais de estimação, destes, 27 milhões são cães e 11 milhões são gatos

(HAFEZ & HAFEZ, 2003). Os produtos destinados a estes animais estão em

crescimento, tanto no mercado nacional quanto no mercado mundial, sendo a

alimentação o segmento responsável pelos maiores investimentos (CARCIOFI,

2003).

O potencial do mercado brasileiro está muito além dos resultados obtidos,

tendo um consumo potencial de 4,11 milhões de toneladas/ano. Hoje há 32

milhões de cães, 19,5 milhões de pássaros, 16 milhões de gatos, 7,5 milhões de

peixes e 2 milhões outros. Esses números levam o Brasil, no mercado mundial,

ao segundo lugar em população de cães e gatos, o sétimo lugar em população

de animais de companhia, o segundo em volume de produção e o sétimo em

faturamento. Porém, hoje, os alimentos industrializados têm um abastecimento

de 1,78 milhão de toneladas, o que representa apenas 43,32% da demanda total

de alimentos (ANFAL Pet, 2008)

Desde 1994, anualmente a Associação Americana de Controladores de

Alimentos (AAFCO, 2003), vem publicando suas recomendações nutricionais

para cães e gatos. Nestas recomendações foram levados em consideração

fatores como: variabilidade na composição nutricional dos ingredientes,

especialmente derivados de origem animal, variação analítica de resultados

laboratoriais, biodisponibilidade dos nutrientes presentes nos ingredientes em

uso, interações nutricionais, margem de segurança para diferenças entre

indivíduos e raças, perdas em processamento e estocagem. Em função das

considerações acima recomendações foram levados em consideração os fatores

enumerados acima, as recomendações da AAFCO são mais apropriadas na

formulação e avaliação de alimentos comerciais (CARCIOFI, 2003).

O maior volume de ração comercializado no Brasil é representado pelos

produtos de baixo custo (de combate ou mais recentemente nomeados

econômicos), cujo principal objetivo é a venda. Para serem fabricados utilizam

ingredientes mais baratos, possuem processamento padrão e se adequam

apenas a análise de rótulos. Apresentam, normalmente, baixa digestibilidade,

baixos teores de proteína e gordura, altos teores de fibra e levam o animal a

produzir quantidade elevada de fezes.

Alimentos premium constituem as marcas fortes dos fabricantes, que

investem em “marketing”, cujo apelo principal é a palatabilidade e a

digestibilidade. São produzidos com ingredientes de melhor qualidade.

Apresentam digestão intermediária e sua adequação nutricional é acessada por

análises químicas mais detalhadas a algumas vezes pelo teste de digestibildade

in vivo.

Os produtos super premium, tem como foco principal à qualidade. São

produzidos com ingredientes especiais e com atribuições e funções específicas

no conjunto da fórmula, mediante processamento diferenciado, tornando-os mais

onerosos. Apresentam maior densidade nutricional (alta proteína, gordura e

energia), digestibilidade e palatabilidade (CARCIOFI, 2003).

Os desequilíbrios alimentares são diretamente responsáveis ou predispõem

a inúmeras doenças ósseas e metabólicas como a obesidade, diabetes melitus e

dermatopatias. É importante o uso de alimentos de boa qualidade, pois este

oferece equilíbrio nutricional e regularidade obtida entre as refeições. Cães e

gatos necessitam de 40 a 45 nutrientes que devem ser ingeridos em

quantidades adequadas e proporções corretas.

As funções reprodutivas, nas diversas espécies de mamíferos, parecem

sofrer mais com as restrições ou excessos alimentares em jovens que nos

adultos. As restrições energética e protéica podem resultar em danos gonadais e

neuronais permanentes nos jovens. Em adultos, pode ocorrer diminuição da

secreção de andrógenos e da qualidade do sêmen, porém esses efeitos são

temporários; com a correção da dieta, funções reprodutivas retornam a

normalidade (BROWN, 1994). Tendo em vista a importância da nutrição na

qualidade do sêmen das diversas espécies de animais, o cão pode ser utilizado

como modelo experimental, por seu fácil manejo.

Os cães utilizados foram selecionados por serem de faixa etária próxima

(adultos), uma vez que a qualidade seminal poderia ser diferente em animais

muito jovens ou velhos. FELDMAN & NELSON (1996) evidenciaram que vários

fatores interferem na qualidade do sêmen, dentre eles estão: idade (animais

jovens apresentam maior número de espermatozóides defeituosos, que diminui

conforme se tornam maduros), frequencia de ejaculação (exaustão das reservas

do epidídimo levando a diminuição da concentração espermática), tamanho dos

testículos (correlação entre tamanho de testículos e concentração espermática),

doenças pré-existentes sistêmicas ou genito-urinárias, trauma, estresse,

desordens endócrinas na secreção de testosterona, FSH, LH, GnRH, além da

época do ano.

Cada animal passou previamente por seleção que consistiu de avaliação

clínica. No período das colheitas, o estado geral do animal foi novamente

observado, para descartar possíveis causas de alterações nos parâmetros

seminais, que não fosse pelo tratamento. O tempo de cada tratamento (cinco

meses) poderia influenciar pelo menos dois ciclos espermáticos. Possíveis

deficiências nutricionais que afetam a reprodução poderiam alterar a qualidade

do sêmen desses cães. Todos os tipos de ração foram ingeridas ao longo do

ano, evitando um possível efeito de sazonalidade na qualidade do sêmen,

conforme descrevem FELDMAN e NELSON (1996) e HAFEZ & HAFEZ (2003),

apesar de MARTINS (2005) concluir em seu trabalho que os parâmetros

seminais pré e pós congelação não se alteram com a época do ano.

No decorrer dos anos, diversos testes foram desenvolvidos para avaliar a

qualidade das amostras seminais nas diferentes espécies. Porém, apenas

recentemente as relações entre os mesmos estão sendo aos poucos

desvendadas (HERRERA et al., 2004; QUINTERO-MORENO et al. 2004). A

metodologia utilizada nesse trabalho é recomendada por diversos autores como

MARTINS (2005), CHIRINÉA (2008) e reproduzida mundialmente. Os

parâmetros macroscópicos e microscópicos do sêmen foram avaliados. Para

isso, foi estabelecido um limite mínimo de qualidade para uso das amostras de

cada animal, de acordo com os valores observados dos mesmos.

Apesar de um dos cães apresentar um dos testículos menor que o

contralateral (testículo direito do animal Chorão), e este não foi excluído do

grupo experimental. A avaliação do sêmen desse animal refletiu pouco na

qualidade do sêmen, comparado com os outros cães e, em média, aceitável.

Todos os valores da análise do sêmen obtidos encontraram-se dentro da

faixa normal descrita para a espécie canina, ao longo do experimento (OETTLÉ,

1993; JOHNSTON et al., 2001).

Os cães que compuseram o grupo experimental apresentavam qualidade

de sêmen considerado bom, com médias de motilidade e vigor em torno de 80%

e 7,5, respectivamente. O sêmen congelado apresentou grande queda na

motilidade, mas isso ocorreu nos três grupos de tratamento, ou seja,

provavelmente foi influenciado pela técnica de congelação. Os resultados de

motilidade pós-descongelação tiveram média de 40%, diferente dos autores

CHIRINÉA (2008) 78%; PENA E LINDE-FORSBERG (2000) 65% e MARTINS

(2005) próximo de 50%. Objetivou-se com este trabalho avaliar a influência da

nutrição na qualidade do sêmen fresco e congelado, e para isso, a técnica de

congelação foi padronizada, de acordo com a técnica descrita por MARTINS

(2005), com algumas modificações.

O vigor no sêmen fresco foi avaliado de forma subjetiva, por pontuação,

conforme sugere a literatura consultada (FELDMAN & NELSON, 1996; CBRA,

1998; JOHNSTON et al., 2001, MARTINS, 2005, CHIRINÉA, 2008). O

equivalente para o sêmen congelado foi a avaliação da porcentagem de células

móveis em movimento progressivo avaliados pela técnica computadorizada

(CASA). Os resultados obtidos também foram baixos, porém não variaram entre

os grupos de rações, conforme as tabelas 4 e 5. O método de avaliação

computadorizada (CASA) apresenta resultados de forma mais objetiva, retirando

o efeito do observador (RIJSSELAERE et al., 2005).

A concentração espermática variou pouco ao longo dos tratamentos, não

apresentando diferenças significativas. Segundo Oéttle (1993), existe correlação

positiva entre motilidade, vigor e concentração e negativa com defeitos de

morfologia, na avaliação da qualidade do sêmen. Essa informação condiz com

os resultados encontrados neste trabalho, apesar de não termos realizado

análises para confirmar tal correlação, observamos que os melhores resultados

apresentavam alta concentração, boa motilidade e vigor, e menor quantidade de

defeitos de morfologia.

O exame morfológico dos espermatozóides mostrou um número baixo de

defeitos, sendo 99% defeitos secundários (edema ou destacamento de

acrossomo, cabeça e cauda livre, gotas citoplasmáticas, cauda enrolada ou

fortemente enrolada). Alguns desses defeitos encontrados podem ser causados

pela manipulação, choque térmico e processo de congelação. Defeitos,

principalmente os de cabeça, podem afetar a fertilidade, porém alguns deles

podem ser compensados com o aumento na concentração espermática durante

o processo de IA. Porém, alguns defeitos não são compensados com esse

procedimento (MOCÉ & GRAHAM, 2008). Os valores obtidos dos cães avaliados

foram aceitáveis. Segundo critérios do Manual para Exame Andrológico e

Avaliação de Sêmen Animal, do CBRA- Colégio Brasileiro de Reprodução

Animal (1998). Os defeitos primários encontrados não passaram de 1%.

Tanto no sêmen fresco quanto no congelado foram baixos os defeitos

encontrados, em média não passaram de 10% do total de células examinadas.

Em dois animais, numa colheita apenas, esse número passou a

aproximadamente 26%, porém foi um caso isolado, provavelmente causado pela

manipulação do material (a maioria dos defeitos encontrados constituía-se de

cauda enrolada).

Dentre os efeitos deletérios da criopreservação do sêmen, danos no

acrossomo são os mais frequentes (MARTINS-BESSA et al., 2008). Para

diminuir esses danos, vários diluentes foram testados, assim como a adição de

substâncias como vitaminas, proteínas, que possuem efeito antioxidante. As

membranas dos espermatozóides dos mamíferos são ricas em ácido graxos poli-

insaturados, que são sensíveis as espécies reativas de oxigênio (ROS), que

causa danos por peroxidação lipídica (SHEWEITA et al., 2005; MARTINS-

BESSA et al., 2008). Neste trabalho, o diluente utilizado foi o mesmo para todos

os grupos de ração, ou seja, tentou-se avaliar o efeito da qualidade da ração na

criopreservação do sêmen canino. Observou-se que existiu diferença entre as

rações A (Econômica) e B (Premium), tendo a segunda menor quantidade de

alterações morfológicas que a primeira. O outro tipo de ração (Super premium)

não diferiu de A, nem de B. Pode-se sugerir um possível efeito dos componentes

das rações interferindo na congelabilidade do sêmen. Apesar dessa diferença, a

quantidade de defeitos encontrada foi pequena, sendo considerada dentro da

normalidade, segundo o manual do CBRA (1998).

A avaliação ultrassonográfica de testículos e próstata foi compatível com as

descrições da literatura. Possíveis alterações nos exames poderiam influenciar

na qualidade do sêmen, o que não ocorreu. A próstata apresenta o parênquima

com ecogenicidade variável, semelhante a do baço, aspecto difusamente

grosseiro. O tamanho varia com a idade, raça, maturidade sexual e processos

patológicos (CARVALHO, 2004). O exame ultrassonográfico também pode ser

utilizado para aspiração direta em biópsia de lesões identificadas (FELDMAN &

NELSON, 1996).

O exame dos testículos, tanto a avaliação ultrassonográfica quanto as

medidas foram compatíveis com a idade dos animais, com exceção de um dos

cães, ao exame, o testículo menor apresentava menor ecogenicidade

comparado ao contralateral Já nos outros cães, os testículos apresentaram

parênquima homogêneo, com fina cápsula hiperecogênica (túnica albugínea) e

uma estrutura linear delgada, hiperecogênica central, orientada

longitudinalmente, chamada mediastinum testis (mediastino ou linha mediastinal)

que é a extensão fibrosa da túnica albugínea (CARVALHO, 2004).

6. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos no presente estudo permite-se concluir que:

1- A análise da qualidade do sêmen fresco, de cães da raça Beagle, adultos,

alimentados com três rações comerciais, não revelou diferença nos parâmetros

avaliados, sugerindo que todas foram nutricionalmente completas e balanceadas

2- A análise do sêmen congelado, não foi diferente nos três tratamentos, nos

parâmetros motilidade e movimento progressivo.

3- Animais alimentados com a ração Premium apresentaram menos defeitos de

morfologia espermática do sêmen pós descongelamento, que a ração

Econômica, porém não diferiu da ração Super premium.

4- Ao longo do tratamento, não foram observadas diferenças no exame

ultrassonográfico de próstata e testículos, assim como suas medidas,

permanecendo compatíveis com a idade dos cães.

5- Nos cães adultos utilizados neste experimento, tratados por cinco meses com

cada ração, não existiu interferência positiva ou negativa da dieta na qualidade

do sêmen.

7. REFERÊNCIAS

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APÊNDICE

Tabela 8- Análise Hematológica média dos animais, dentro de cada grupo

experimental, Jaboticabal/SP, 2009.

Contagem Global

Ração A Ração B Ração C

He (cel/mm

) 7220,0 ± 249,2

7484,2 ± 291,0

7341,1± 218,2

Leu (cel/mm

) 11011,1±249,2

8201,6 ± 1275,6

9944,4 ± 838,17

Hb (g/dL) 15,5 ± 0,3

16,1 ± 0,2

16,0 ± 0,5

Ht (%) 45,8 ± 1,5

47,3 ± 1,4

46,4 ± 1,5

Plaquetas

(cel/mm

)

212500,0 ±

15417,1

223555,5 ±

14449,9

192000,0 ±

14950,8

Contagem Diferencial

Basófilos 0,4 ± 1,5

0,2 ± 0,2

0,4 ± 0,2

Eosinófilos 8,5 ± 0,9

6,2 ± 0,86

4,3 ± 1,0

Neutrófilos Bast. 1,4 ± 0,8

1,6 ± 0,6

0,7 ± 0,3

Neutrófilos Seg. 62,3 ± 2,4

60,8 ± 2,5

63,2 ± 2,5

Linfócitos 25,2 ±1,6

28,0± 2,2

28,8± 1,9

Monócitos 2,2 ± 0,4

2,2 ± 0,7

2,3 ± 0,40

Não houve diferenças estatísticas entre os grupos, todos se encontram dentro dos

valores de normalidade para cães.

Tabela 9- Análise dos parâmetros bioquímicos médios, dentro de cada grupo

experimental, Jaboticabal/SP, 2009.

Ração A Ração B Ração C

ALT (U/dL) 29,6 ± 6,0

31,1 ± 4,0

48,1 ± 9,64

Creatinina

(mg/dL)

0,95 ± 0,0

0,90± 0,0

0,94 ± 0,0

FA (U/L) 52,7 ± 8,4

53,2 ± 8,1

58,8 ± 8,6

PT (g/dL) 6,5 ± 0,1

6,6 ± 0,2

7,0 ± 0,3

Albumina (g/dL) 3,0 ± 0,1

3,1 ± 0,0

3,2 ± 0,0

Uréia (mg/dL) 28,2 ± 4,3

38,7± 5,9

32,9 ± 3,2

* - Médias diferentes pelo teste T-Pareado (p<0,05).

Tabela 10- Análise média da urina dos animais, dentro de cada grupo

experimental, Jaboticabal/SP, 2009.

Urinálise

Ração A Ração B Ração C

Densidade 1019 ± 0,0

1026± 0,0

1,034 ± 0,0

pH 7,5 ± 0,3

7,0 ± 0,3

5, 7± 0,2

Sedimentoscopia

Pt (mg/dL) 0,38±0,16

0,22±0,08

0,27±0,14

He () 0,05±0,05

0,05±0,05

0,27±0,08

Leu () 1,44±0,32

1,33±0,32

1,66±0,46

Cilindros

Granulosos

0,05±0,05

0,16±0,08

0,16±0,11

Fosfato Triplo 1,55±0,81

1,27±0,65

0±0

Céls. Epiteliais de

Transição

1,22±0,26

0,83±0,20

1,44±0,24

a,b – médias sem uma letra em comum na mesma linha são diferentes pelo

teste de Tukey (p<0,05)

A, B – médias sem uma letra em comum na mesma linha são diferentes pelo

teste de Kruskal-Wallis (p<0,05)

Tabela 11- Idade dos cães da raça Beagle que compuseram o grupo

experimental, Jaboticabal/SP, 2009.

Beagles (idades até 02/05/2008)

Nome

Idade

Defeitos espermáticos totais

(média %)

Piano 3A e 5meses 5,2

Rancho 3A e 11meses 3,3

Biscoito 4A e 5 meses 5,1

Bolero 4A e 5 meses 2,9

Tang 4A e 8 meses 6,5

Chapéu 4A e 8 meses 5,8

Chorão 6A e 5 meses 3,9

Billy 6A e 10 meses 4,2

Tabela 12-

Componentes do diluente para o sêmen canino elaborado por ROTA

et al. (1997) - ROTA A., STRÖM B., LINDE-FORSBERG C.,

RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ H. Effects of Equex STM paste on viability

of frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38ºC.

Theriogenology 1997; 47: 1093-1101.

Componentes Quantidade

TRIS 2,4 g

Ácido Cítrico.H

O 1,4 g

Glicose 0,8 g

Glicerol 7 mL

Benzil penicilina 0,06 g

Sulfato de Estreptomicina 0,1 g

Gema de ovo 20 mL

Equex STM paste (Nova Chemical Sales,

Scituate, Inc., MA, USA)

1 mL

Água Ultra-pura (Milli Q) Completar para 100 mL

pH: 6,48

Osmolaridade: 1370 mOsm

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