ads:
RESFRIAMENTO E CRIOPRESERVAÇÃO DE
SÊMEN DO PEIXE TELEÓSTEO PIABANHA
Brycon insignis
THICIANA BARBOSA DO AMARAL
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
THICIANA BARBOSA DO AMARAL
RESFRIAMENTO E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DO PEIXE
TELEÓSTEO PIABANHA Brycon insignis
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de
concentração em Reprodução de Peixes, para a
obtenção do título de “Mestre”.
Orientadora
Profª. Dra. Ana Tereza de M. Viveiros-Leal
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2009
ads:
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Amaral, Thiciana Barbosa do.
Resfriamento e criopreservação de sêmen de peixe teleósteo
Piabanha (Brycon insignis) / Thiciana Barbosa do Amaral. – Lavras
: UFLA, 2009.
51 p. : il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2009.
Orientador: Ana Tereza Mendonça Viveiros-Leal.
Bibliografia.
1. Preservação. 2. Protocolo de congelamento. 3. Motilidade
espermática. 4. Soluções imobilizadoras. 5. Soluções ativadoras. I.
Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 639.3748
THICIANA BARBOSA DO AMARAL
RESFRIAMENTO E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DO PEIXE
TELEÓSTEO PIABANHA Brycon insignis
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigências do Programa de
Pós- Graduação em Ciências Veterinárias, área de
concentração em Reprodução de Peixes, para a
obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 28 de setembro de 2009
Prof. Dr. João Bosco Barreto Filho UFLA
Prof. Dr. Rilke Tadeu Fonseca de Freitas UFLA
Dr. Marcelo de Castro Leal Utrecht University
Profª. Dra Ana Tereza de Mendonça Viveiros-Leal
UFLA
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Ana Viveiros, pela orientação, sabedoria e
ensinamentos que estarão presentes sempre em minha vida.
Aos meus pais, Carlos e Neuza, e minha irmã Patrícia, obrigada pelo
apoio e compreensão.
Agradeço à Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de
Medicina Veterinária, pela oportunidade; ao CNPq, pela bolsa de estudos e à
Fapemig e a ANEEL, pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.
À equipe de trabalho, Ariane F. Nascimento, Alexandre N. Maria,
Athalita E. Piva e Nathália Nonato, por tornarem possível a conclusão deste
trabalho. Em especial, às amigas Laura Helena Órfão e Ziara A. Isaú, pelo
valioso auxílio nos momentos mais importantes. À minha querida Gilvaine C.
Lucas, pela ajuda e acolhimento nessa fase de minha vida. Ao amigo Renato N.
Pereira, pela colaboração nas análises estatísticas.
À Companhia Energética do Estado de São Paulo (CESP), Estação de
Piscicultura de Paraibuna, pela disponibilização dos reprodutores e instalações e
à equipe: Danilo Caneppele, Lúcia Cancio, Benedito P. Barros, Ielzo Luis da
Silva, Milton Miranda Rosa, Júlio Cesar, Vicente de Paula Martins e Willian
Trindade, pelo auxílio e colaboração valiosos.
Aos amigos distantes, mas sempre presentes no coração, Ana Paula
Fulan, Natascha Almeida e João Fernando Carvalho, pela enorme amizade e
carinho.
SUMÁRIO
RESUMO...............................................................................................................i
ABSTRACT ...................................................................................................... iiii
CAPÍTULO 1......................................................................................................01
1 Introdução Geral ..............................................................................................02
2 Referências Bibliográficas......................................................................... ......08
CAPÍTULO 2: Resfriamento de sêmen do peixe teleósteo piabanha
(Brycon insignis): efeito de diluidores, gentamicina, osmolaridades e
ativadores...................................................................................................... ......09
1 Resumo.............................................................................................................10
2 Abstract..................................................................................... .......................11
3 Introdução......................................................................................................112
4 Material e Métodos........................................................................................ ..13
5 Análise estatística ............................................................................................17
6 Resultados..................................................................................................... ...17
7 Discussão..........................................................................................................25
8 Referências Bibliográficas............................................................................ ...29
CAPÍTULO 3: Criopreservação de sêmen do peixe teleósteo piabanha
(Brycon insigis): efeito de diluidores, crioprotetores, temperatura de
descongelamento e soluções ativadoras..............................................................33
1 Resumo.............................................................................................................34
2 Abstract.......................................................................................................... ..35
3 Introdução....................................................................................................... .36
4 Material e Métodos......................................................................................... .38
5 Análise Estatística............................................................................................41
6 Resultados....................................................................................................... .42
7 Discussão..........................................................................................................46
8 Referências Bibliográficas.............................................................................. .48
CAPÍTULO 4: Considerações Finais..................................................................50
RESUMO
AMARAL, Thiciana Barbosa do. Resfriamento e criopreservação de sêmen
do peixe teleósteo piabanha Brycon insignis. 2009. 51 p. Dissertação
(Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Federal de Lavras, Lavras,
MG.
1
A piabanha (Brycon insignis) é uma espécie de peixe nativa da bacia do
rio Paraíba do Sul, hoje considerada espécie vulnerável. A sobrevivência dessa
espécie encontra-se bastante ameaçada pela poluição do rio Paraíba, decorrente
do lançamento de esgoto doméstico, industrial e agropecuário, como também
pela introdução do dourado (Salminus maxillosus), um voraz predador. No que
se refere à sua utilização, é considerada espécie de alto valor comercial e muito
apreciada pela resistência à captura com anzol, na pesca esportiva. Este trabalho
foi realizado com o objetivo de desenvolver um protocolo de preservação de
sêmen de piabanha por meio dos processos de resfriamento a 4ºC-6ºC e
criopreservação. Para o desenvolvimento do protocolo de resfriamento de
sêmen, foram utilizados diluidores simples (NaCl e glicose) combinados ou não
com gentamicina e diluidores complexos (BTS
®
e Androstar
®
), em diferentes
osmolaridades. A motilidade, vigor e duração espermática foram avaliados nos
dias 0, 2 e 4 do resfriamento e a ativação feita com NaCl 0,29% e NaHCO
3
1%.
Para o desenvolvimento do protocolo de congelamento de sêmen, oito meios de
congelamento, compostos de quatro diluidores (NaCl, glicose, BTS
®
e M III
®
),
dois crioprotetores (DMSO e metilglicol), duas temperaturas de
descongelamento (30º e 60ºC) e dois ativadores (NaCl 0,29% e NaHCO
3
1%)
foram testados. O sêmen foi congelado em palhetas de 0,5 mL em vapor de
nitrogênio a -170ºC e armazenado em nitrogênio líquido. A motilidade, o vigor e
a duração espermática foram avaliados após o descongelamento. Durante os
experimentos de resfriamento, todas as amostras diluídas e o controle possuíam
alta qualidade no dia zero de armazenamento. No dia 2, a gentamicina foi
benéfica quando acrescida à solução de NaCl e não à solução de glicose. Apenas
as amostras diluídas em BTS
®
e Androstar
®
atingiram motilidade acima de 50%,
vigor espermático acima de 1,9 e duração espermática acima de 50 segundos.
Quando esta etapa do experimento foi repetida, as maiores motilidades (60-63%)
e duração (111-117 s) foram observadas nas amostras diluídas em Androstar
®
322 e 362 mOsm e no sêmen controle. A qualidade espermática em todas as
1
Orientadora: Profa. Ana Tereza de Mendonça Viveiros-Leal – UFLA (Orientadora).
i
amostras foi maior quando o ativador NaHCO
3
1% foi utilizado. No dia 4, todas
as amostras diluídas apresentaram baixa motilidade (0%-10%). Durante os
experimentos de congelamento, as maiores taxas de motilidade pós-
descongelamento foram observadas quando o sêmen foi criopreservado em
metilglicol (76-88%), comparado ao DMSO (23%-59%) e o NaHCO
3
1% foi
melhor ativador que o NaCl 0,29% apenas quando o DMSO foi utilizado como
crioprotetor. Os diluidores e as temperaturas de descongelamento não tiveram
efeito na motilidade espermática após o descongelamento. Nenhum dos
diluidores testados prolongou a qualidade espermática do sêmen de piabanha por
mais de 2 dias de armazenamento. No entanto, o sêmen pode ser congelado, com
sucesso, em qualquer um dos diluidores testados, combinado com o metilglicol.
Utilizando essa metodologia, o sêmen descongelado possui ótima qualidade,
porém, experimentos de fertilização ainda são necessários.
ii
ABSTRACT
AMARAL, Thiciana Barbosa do. Cooling storage and cryopreservation of
teleost fish piabanha Brycon insignis sperm. 2009. 51 p. Dissertation (Master
in Veterinary Science) – Universidade Federal de Lavras, Lavras.
1
Piabanha (Brycon insignis) is a native species of Paraíba do Sul River
Basin, and is presently set as vulnerable. The survival of this specie is threatened
by pollution of the river, caused by domestic, industrial and agricultural
discharge, and by the introduction of the feral jaw characin (Salminus
maxillosus). Piabanha is high-priced market and very appreciated for sport
fishing. The aim of this study was to develop a protocol for sperm preservation
of piabanha, both by cooling at 4ºC -6ºC and by freezing. To develop a cooling
protocol for sperm, simple extenders (NaCl and glucose) combined or not with
gentamycin, and complex extenders (BTS
™
and Androstar
™
) in different
osmolalities were tested. Motility, quality score and motility duration was
evaluated after 0, 2 and 4 days after cooling and sperm motility was activated
with NaCl 0.29% and NaHCO
3
1%. To develop a freezing protocol for sperm,
eight freezing media composed of four extenders (NaCl, glucose, BTS
™
and M
III
™
) and two cryoprotectants (dimethylsulphoxide-DMSO and methylglycol),
two thawing temperatures (30 and 60°C) and two activation media (NaCl 0.29%
and NaHCO
3
1%) were tested. Sperm was frozen in 0.5-mL straws in nitrogen
vapor at -170°C and stored in liquid nitrogen. Motility, quality score and
motility duration was evaluated after thawing. During the cooling experiments,
all diluted and control samples possessed high quality on day 0 of storage. On
day 2, the addition of gentamycin was beneficial when added to NaCl solution
but not glucose solution. Only samples diluted in BTS
™
and in Androstar
™
yielded motility above 50%, quality score above 1.9 and motility duration above
50 s. When this part of experiment was repeated, highest motility (60-63%) and
duration (111-117 s) were observed on samples diluted in Androstar
™
at 322 and
362 mOsm, and in control samples. Sperm quality in all samples was higher
when NaHCO
3
1% was used as activation medium. On day 4, all diluted samples
yielded low quality (0-10% motility). During the freezing experiments, the
highest post-thaw motility rates were observed when sperm was cryopreserved
in methylglycol (76-88%), compared to DMSO (23-59%), and NaHCO
3
1% was
a better activation medium than NaCl 0.29% only when DMSO was used as
cryoprotectant. Extenders and thawing temperatures had no effect on post-thaw
sperm motility. None of the extenders tested prolonged sperm quality of
piabanha beyond two days of storage. On the other hand, sperm can be
1
Advisor: Profa. Ana Tereza de Mendonça Viveiros-Leal – UFLA.
iii
successfully frozen in any of the extenders tested combined with methylglycol.
Using this methodology, thawed sperm possess great quality, but fertilization
trial is still needed.
iv
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO GERAL
1
INTRODUÇÃO GERAL
A necessidade de estabelecer técnicas mais refinadas de preservação de
sêmen de peixes confronta-se com questões ecológicas e econômicas da
atualidade. O Brasil apresenta grande diversidade de espécies nativas e de
recursos genéticos que não são encontrados naturalmente, fora da América do
Sul. A destruição das matas ciliares, o aumento da demanda alimentar, a
introdução de espécies exóticas, a pesca predatória, a construção de barragens de
hidrelétricas interferindo no comportamento migratório dos peixes e a poluição
dos ecossistemas aquáticos têm ocasionado a diminuição e a extinção de
populações de espécies de importância econômica (Oliveira, 2007).
Com o crescimento da piscicultura comercial, muitas espécies de peixes
facilmente encontradas em rios são criadas em cativeiros, nos quais, muitas
vezes, não encontram condições adequadas para a reprodução. Isso acontece,
principalmente, com aquelas espécies que têm a característica de migrar em
determinados meses do ano, quando passam por estímulos hormonais e
ambientais, até chegarem às calhas dos rios ou nos grandes afluentes, onde
ocorre a desova. Muitas dessas espécies, conhecidas como peixes de piracema,
têm grande importância comercial e são produzidas em grande quantidade,
enquanto outras, devido à sobrepesca ou outras ações antropogênicas têm seu
número cada vez mais diminuído (Sale, 1985).
Piabanha é a denominação regional de espécie de peixe de água doce,
caracterizada por suas escamas prateadas, pertencente à família Characidae,
subfamília Bryconinae, gênero Brycon, classificada como Brycon insignis por
Steindachner, em 1877 (Fowler, 1950). É considerada uma espécie de grande
porte, atingindo de 8 a 10 kg de peso, aproximadamente (Nomura, 1984; Santos,
2
1987; Pereira, 1986). Considerado atualmente um peixe raro, é encontrado
somente nas cabeceiras dos rios e na foz do rio Paraíba do Sul (Figura 1).
FIGURA 1 Bacia do rio Paraiba do Sul
Possui o abdômen róseo e o dorso prateado. A mandíbula é projetada
para a frente e a cabeça é achatada, duas características gerais de peixes
predadores. Quanto ao hábitat, aparece em corredeiras, principalmente no tombo
das cachoeiras (Figura 2).
O período reprodutivo da espécie estende-se de dezembro a fevereiro. O
macho está apto a se reproduzir no segundo ano de vida, quando alcança cerca
de 20 cm de comprimento, e a fêmea, a partir do terceiro ano de vida, após
atingir 25 cm de comprimento total (Salgado et al., 1997). A fecundação dos
óvulos é externa e a desova ocorre quando o nível das águas está em ascensão
em virtude das chuvas de verão. A incubação dos ovos é realizada em lagoas
marginais ou em áreas de remanso, onde os alevinos encontram alimento e
refúgio para seu desenvolvimento. A sobrevivência dessa espécie encontra-se
bastante ameaçada pela poluição do rio Paraíba, decorrente do lançamento de
esgoto doméstico, industrial e agropecuário, como também pela introdução do
3
dourado (Salminus maxillosus), um voraz predador. Esses fatores
comprometeram seriamente a perpetuação dessas espécies (Shimoda, 2004).
FIGURA 2 Exemplar adulto de piabanha (Brycon insignis)
Quanto ao hábito alimentar, a piabanha é ictiófaga e insetívora quando
jovem, e herbívora e frugívora quando adulta. Durante a larvicultura da piabanha
é comum verificar-se canibalismo entre indivíduos, o que pode reduzir
substancialmente o número de alevinos produzidos. Para minimizar as perdas,
normalmente são utilizadas larvas de outras espécies de peixe, como o curimbatá
(Prochilodus lineatus), que servem como alimento para as piabanhas.
No que se refere a sua utilização, é considerada espécie de alto valor
comercial e muito apreciada pela resistência à captura com anzol na pesca
esportiva. A exploração para fins comerciais é ainda praticamente inexistente,
tendo as estações de piscicultura com criação de piabanhas apenas fins
conservacionistas.
Dentre as estações, tem-se a da CESP, localizada em Paraibuna, SP, e a
do Projeto Piabanha, em Itaocara, RJ. Esta última tem desenvolvido projetos
para aperfeiçoamento da produção de alevinos, que são utilizados para
repovoamento no rio Paraíba do Sul.
4
As estratégias para evitar a redução de recursos pesqueiros incluem o
desenvolvimento de técnicas de reprodução artificial, de larvicultura e
alevinagem, de coleta e preservação de sêmen. Essas estratégias podem também
ser utilizadas na produção comercial de peixes. Além disso, as técnicas de
preservação do sêmen podem auxiliar em programas de melhoramento genético
e para a formação de um banco para conservação dos recursos genéticos
(Viveiros et al., 2008).
Outras vantagens da preservação de sêmen são permitir a troca de
material genético entre os laboratórios de reprodução e reduzir o número de
reprodutores, diminuindo assim os custos de produção e eliminando problemas
de assincronia da maturidade gonadal, quando machos e fêmeas não estão
preparados simultaneamente, além do estabelecimento de programas de
hibridização utilizando espécies com períodos reprodutivos diferentes (Viveiros,
2005).
A estocagem dos espermatozoides pode ser realizada a curto prazo, por
horas ou dias em temperatura de refrigeração (4ºC), ou a longo prazo, por meio
do congelamento em nitrogênio líquido, a -196ºC, mantendo, assim, a
viabilidade dos gametas por tempo indefinido (Carolsfeld & Harvey, 1999).
O resfriamento de sêmen é um método prático e simples para uso na
rotina de pisciculturas e programas de preservação de espécies em risco de
extinção, além de facilitar as trocas de materiais genéticos entre as fazendas
produtoras de pescados. No entanto, a técnica ainda é pouco utilizada, devido,
principalmente, ao curto período de armazenamento, evidenciado por baixas
taxas de motilidade espermática. A elaboração de um protocolo de resfriamento
de sêmen, principalmente de espécies nativas, tem se mostrado específica para
cada espécie, tanto para a duração do período de estocagem quanto para os
diluidores utilizados. Os espermatozoides de peixes são imóveis no plasma
seminale. Esta característica favorece sua preservação em curto prazo, já que
5
eles não requerem energia para locomoção. Uma solução diluidora deve ser
utilizada no processo de resfriamento, pois a diluição diminui a competição dos
espermatozoides por oxigênio e espaço (Carolsfeld & Harvey, 1999).
Para ser criopreservado, o sêmen precisa ser diluído em meio contendo
diluidor e crioprotetor intracelular. Os diluidores são soluções de sais ou de
carboidratos que ajudam a manter a viabilidade das células durante o
congelamento e que permitem que os crioprotetores intracelulares ou
extracelulares atinjam o interior e a superfície dos espermatozoides, protegendo-
os das crioinjúrias.
Os estudos realizados no Brasil com peixes tropicais são pouco
numerosos e apontam para a necessidade de maior aprofundamento nas
pesquisas para se estabelecerem técnicas de preservação de sêmen que melhor se
adaptem a cada espécie.
Assim, este trabalho foi realizado com o objetivo de desenvolver um
protocolo de preservação de sêmen de piabanha (Brycon insignis) a curto e a
longo prazo, estabelecendo uma metodologia adequada à espécie. O trabalho
está estruturado em dois capítulos: o primeiro, sobre resfriamento de sêmen, no
qual o objetivo foi avaliar a eficiência de soluções imobilizadoras (diluidores) de
sêmen, acrescidas ou não de gentamicina (experimento 1) e em diferentes
osmolaridades (experimento 2), em prolongar a qualidade dos espermatozoides
durante o processo de resfriamento de sêmen em piabanha (Brycon insignis); no
segundo, de criopreservação, o objetivo foi avaliar o efeito de diluidores, agentes
crioprotetores, temperatura de descongelamento e soluções ativadoras da
motilidade espermática no processo de criopreservação do sêmen de piabanha
Brycon insignis.
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAROLSFELD, J.; HARVEY, B. Conservação de recursos energéticos de
peixes: teoria e prática. Victoria: World Fisheries Trust, 1999.
FOWLER, H. W. Os peixes de água doce do Brasil. Arquivos de Zoologia, São
Paulo, v. 6, p.333-340, 1950.
NOMURA, H. Dicionário dos peixes do Brasil. Brasília: Editerra, 1984. 482 p.
OLIVEIRA, A. V.; VIVEIROS, A. T. M.; MARIA, A. N., FREITAS, R. T. F.;
ISAÚ, Z. A. Sucesso do resfriamento e congelamento de sêmen de pirapitinga
Brycon nattereri.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Belo Horizonte, v.
59, n. 6, p. 1509-1515, dez. 2007.
PEREIRA, R. Peixes de nossa terra. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. 129p.
SALE, M. J. Aquatic ecosystem response to flow modification: an overview of
the issues. In: OLSON, E. W. (Ed.). Proceeding of the symposium on small
hydropower and fisheries. Bethesda: American Fisheries Society, 1985. p. 25-
31.
SALGADO, A. F. G.; CHAIN, M. G.; GIRARDI, L.; FARIA, C. A. A
conservação da piabanha (Brycon insignis) na Bacia do Rio Paraíba do Sul.
São Paulo: CESP, 1997. p. 1-28. (Relatório Técnico- CESP).
SANTOS, E. Peixes de água doce (vida e costumes dos peixes do Brasil). 4.
ed. Belo Horizonte: Itatiaia, 1987.
SHIMODA, E. Análise e criopreservação do sêmen da piabanha Brycon
insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae). 2004. 121 p. Tese
(Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, Goytacazes.
VIVEIROS, A. T. M. Criopreservação de sêmen de peixes. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 16., 2005, Goiânia, GO.
Palestras... Goiânia: CBRA, 2005. CD-ROM.
7
VIVEIROS, A. T. M.; ÓRFÃO, L. H.; MARIA, A. N.; ALLAMAN, I. B. A
simple, inexpensive and successful freezing method for curimba Prochilodus
lineatus (Characiformes) semen. Animal Reproduction Sicence, Amsterdam, v.
112, n. 3/4, p. 293-300, June 2009.
8
CAPÍTULO 2
RESFRIAMENTO DE SÊMEN DO PEIXE TELEÓSTEO PIABANHA
(Brycon insignis): EFEITO DE DILUIDORES, GENTAMICINA,
OSMOLARIDADES E ATIVADORES
9
1 RESUMO
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a eficiência de
soluções imobilizadoras (diluidores) de sêmen, acrescidas ou não de gentamicina
(experimento 1) e em diferentes osmolaridades (experimento 2), em prolongar a
qualidade dos espermatozoides durante o processo de resfriamento em piabanha
(Brycon insignis). No experimento 1, foram testados quatro diluidores simples
(NaCl, NaCl-gentamicina, glicose e glicose-gentamicina) e dois mais
complexos, à base de glicose, sais e gentamicina (BTS
®
e
Androstar
®
). Uma
alíquota do sêmen foi mantida sem diluição (controle). As taxas de motilidade,
vigor (0 a 5) e duração espermática foram avaliados nos dias 0, 2 e 4 de
resfriamento, após ativação com as soluções de NaCl 0,29% e de NaHCO
3
1%.
No experimento 2, os diluidores BTS
®
e Androstar
®
foram avaliados em
diferentes osmolaridades. O BTS
®
foi avaliado em 316, 356 (padrão) e 396
mOsm; o Androstar
®
foi avaliado em 282, 322 (padrão) e 362 mOsm. A
qualidade dos espermatozoides foi avaliada como no experimento 1 e apenas a
solução de NaHCO
3
1% foi utilizada como ativador. Em ambos os
experimentos, todas as amostras de sêmen diluído e controle apresentavam
excelente qualidade no dia 0 do resfriamento. No dia 2 do experimento 1, apenas
as amostras diluídas em BTS
®
e Androstar
®
apresentavam motilidade
espermática acima de 50%, vigor acima de 1,9 e duração acima de 50 segundos.
A qualidade espermática em todas as amostras foi superior quando o NaHCO
3
1% foi utilizado como ativador. A gentamicina foi benéfica apenas quando
adicionada à solução de NaCl e a amostra ativada com NaHCO
3
1%. No dia 4,
todas as amostras de sêmen apresentavam baixa qualidade (0%-9% motilidade).
No dia 2 do experimento 2, as melhores taxas de motilidade (60%-63%) e
duração da motilidade (111-117 segundos) foram observadas nas amostras
diluídas em Androstar
®
a 322 e 362 mOsm e no sêmen controle. No dia 4, todas
as amostras de sêmen diluído apresentavam baixa qualidade (0%-10%
motilidade); o sêmen controle, entretanto, apresentava motilidade de 43%.
Nenhum dos diluidores testados prolongou a qualidade dos espermatozoides de
piabanha, além de dois dias sob refrigeração. O diluidor Androstar
®
na
osmolaridade padrão parece manter as condições de armazenamento mais
estáveis, entretanto, é recomendado testar outros diluidores de sêmen e avaliá-
los quanto à fertilidade do sêmen diluído e refrigerado.
10
2 ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the efficiency of immobilizing
solutions (extenders) enriched or not with gentamycin (experiment 1) and in
different osmolalities (experiment 2), on prolonging sperm quality during the
refrigerated storage of piabanha (Brycon insignis). In experiment 1, four simple
extenders (NaCl, NaCl-gentamycin, Glucose and Glucose-gentamycin) and two
more complex extenders composed of glucose, salts and gentamycin (BTS
™
and
Androstar
™
) were tested. An aliquot of sperm was kept undiluted and served as
control. Motility rate, quality score (0 to 5) and motility duration were evaluated
on days 0, 2 and 4 of refrigerated storage after activation with NaCl 0.29% and
NaHCO
3
1%. In experiment 2, BTS
™
and Androstar
™
were further evaluated
under different osmolalities. BTS
™
was evaluated at 316, 356 (standard) and 396
mOsm; Androstar
™
was evaluated at 282, 322 (standard) and 362 mOsm. Sperm
quality was evaluated as described on experiment 1, and NaHCO
3
1% was used
as activation medium only. In both experiments, all diluted and control samples
possessed high quality on day 0 of storage. On day 2 of experiment 1, only
samples diluted in BTS
™
or Androstar
™
yielded motility above 50%, quality
score above 1.9 and motility duration above 50 s. Sperm quality in all samples
was higher when NaHCO
3
1% was used as activation medium. Gentamycin was
beneficial only when added to NaCl solution and activated with NaHCO
3
1%.
On day 4, all samples possessed low quality (0-9% motility). On day 2 of
experiment 2, the highest motility rates (60-63%) and duration (111-117 s) were
obsered on samples diluted in Androstar
™
at 322 and 362 mOsm, and in control
samples. On day 4, all diluted samples yielded low quality (0-10% motility);
control samples, however, yielded 43% motility. None of the extenders tested
prolonged sperm quality of piabanha beyond two days of storage. The extender
Androstar
™
at its standard osmolality seems to keep more stable the
environmental storage conditions. It is recommended, however, to test other
sperm extenders and test the fertilizing capacity of diluted and stored sperm.
11
3 INTRODUÇÃO
Novas biotecnologias, visando à maior eficiência na reprodução animal,
vêm sendo desenvolvidas. Em peixes, muitas dessas técnicas se aplicam à
reprodução artificial e à preservação de sêmen. As técnicas de preservação de
sêmen facilitam a reprodução artificial, contribuem em programas de
melhoramento e conservação genética e na redução do número de reprodutores.
O resfriamento de sêmen é um método prático e simples para uso na
rotina de pisciculturas e programas de preservação de espécies em risco de
extinção, além de facilitar as trocas de materiais genéticos entre as fazendas
produtoras de pescados. No entanto, é uma técnica ainda pouco utilizada,
devido, principalmente, ao curto período de armazenamento do sêmen resfriado,
evidenciado por baixas taxas de motilidade espermática.
A elaboração de um protocolo de resfriamento de sêmen, principalmente
de espécies nativas, tem se mostrado específica para cada espécie, tanto para a
duração do período de estocagem quanto para os diluidores usados. Os
espermatozoides de peixes são imóveis no plasma seminal e esta característica
favorece a sua preservação a curto prazo, já que eles não estarão utilizando
energia para locomoção.
No processo de resfriamento de sêmen, uma solução diluidora deve ser
utilizada, pois a diluição diminui a competição dos espermatozoides por
oxigênio e espaço (Carolsfeld & Harvey, 1999). Os fatores determinantes do
sucesso do resfriamento são a redução da temperatura, o fornecimento e a troca
de gases, a prevenção do desenvolvimento bacteriano e a prevenção da
dessecação (Stoss & Donaldson, 1982). O armazenamento prolongado, em
condições de resfriamento, pode afetar profundamente a qualidade dos
espermatozoides, uma vez que condições anaeróbicas associadas à contaminação
microbiana reduzem a motilidade e a viabilidade espermáticas (Rurangwa et al.,
2004).
12
Em outro estudo, o sêmen de piracanjuba (Brycon orbignyanus) foi
resfriado por até 7 dias, apresentando motilidade espermática em torno de 40%,
quando diluído em solução de NaCl-tris ou NaCl 1,2% (Maria et al., 2006) e o
de pirapitinga (Brycon nattereri) foi resfriado, com sucesso, por 7 dias, quando
diluído em BTS
®
, com motilidade de 70% (Oliveira et al., 2007).
Entre as várias espécies de peixes migradores do rio Paraíba do Sul,
encontra-se a piabanha (Brycon insignis), hoje considerada um peixe raro. A
sobrevivência dessa espécie encontra-se bastante ameaçada pela poluição do rio
Paraíba decorrente do lançamento de esgoto doméstico, industrial e
agropecuário, como também pela introdução do dourado (Salminus maxillosus),
um voraz predador. Estes fatores comprometeram seriamente a perpetuação
dessas espécies. Durante a larvicultura da piabanha, é comum verificar-se
canibalismo entre indivíduos, o que pode reduzir substancialmente o número de
alevinos produzidos. Para minimizar as perdas, normalmente, são utilizadas
larvas de outras espécies de peixe, como o curimbatá, que servem como
alimento para as piabanhas.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a eficiência de
soluções imobilizadoras (diluidores) de sêmen, acrescidas ou não de gentamicina
(Experimento 1) e dessas soluções em diferentes osmolaridades (Experimento
2), durante o processo de resfriamento, em piabanha Brycon insignis. A
qualidade do sêmen foi avaliada quanto à motilidade subjetiva, vigor
espermático e duração da motilidade espermática, durante 72 horas de
resfriamento.
4 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido durante o período reprodutivo (janeiro e
fevereiro) da espécie. Foram utilizados machos de piabanha Brycon insignis,
13
provenientes da Estação de Piscicultura da Companhia Energética de São Paulo
(CESP), Paraibuna, SP. Os animais que possuíam a papila urogenital hiperêmica
e que liberavam sêmen sob leve massagem abdominal foram selecionados. Após
a seleção, os machos receberam uma única dose de extrato bruto de hipófise de
carpa (3 mg/kg do peso corporal) para induzir a espermiação. Depois de 8 horas,
o sêmen de cada animal foi coletado individualmente, de acordo com o manejo
da estação. A coleta foi realizada em tubos de ensaio, evitando-se a
contaminação do sêmen com água, sangue ou urina. Imediatamente após a
coleta, o sêmen foi avaliado em microscopia de luz, como explicado a seguir.
4.1 Avaliação seminal
Imediatamente após a coleta, foram verificadas as seguintes
características seminais: volume, concentração (câmara hematimétrica Neubauer
“Improved”), pH do sêmen (medidor de pH portátil digital LT Lutron PH – 206)
e osmolaridade (semimicro osmômetro K 7400 Knauer, Alemanha). A
motilidade espermática foi avaliada em 5 µL de sêmen colocados em lâminas e
levadas ao microscópio óptico (modelo L1000, Bioval, Jiangbei, China)
previamente focalizado em 400 x. Todas as amostras apresentavam
espermatozoides imóveis, demonstrando que o sêmen não havia sido
contaminado por água ou urina. Nas quatorze amostras sem contaminação, a
motilidade espermática foi, então, induzida com NaCl 0,29% (Maria et al.,
2006) na diluição 1:5 e subjetivamente determinada. Para vigor espermático,
foram atribuídos escores variando de 1 (intensidade de movimento muito lento
dos espermatozoides) a 5 (intensidade de movimento muito rápido dos
espermatozoides), segundo Mounib et al. (1968).
Durante todo o procedimento, o sêmen foi mantido em tubos de ensaio
em banho de gelo (15±2ºC).
14
4.2 Experimentos
4.2.1 Experimento 1: Diluidores de sêmen com diferentes formulações
Sêmen de 7 machos foi individualmente adicionado, 1:10 (v/v; em um
volume total de 4,0 mL/amostra), em cada um dos diluidores descritos na Tabela
1. Os diluidores testados foram selecionados, baseando-se em estudos anteriores
realizados com peixes da mesma família Characidae (Viveiros et al., 2009;
Maria et al., 2006). Além dos diluidores BTS
®
e Androstar
®
, os diluidores NaCl
e glicose foram testados também após a adição de sulfato de gentamicina (Neo
Gentamicin
®
, Neo Química, Brasil) em uma concentração de 0,25 mg/mL do
diluidor.
TABELA 1 Composição química dos diluidores testados durante o resfriamento
de sêmen de piabanha Brycon insignis.
Diluidores
Componentes
(g)
a
NaCl
NaCl-
gentamicina Glicose
Glicose-
gentamicina BTS
®
b
Androstar
® b
Glicose
-- -- 5,00 5,00 4,00 2,65
Citrato de
sódio -- -- -- -- 0,63 0,44
EDTA
-- -- -- -- 0,13 0,26
Sulfato
gentamicina -- 0, 025 -- 0, 025 0,02 0,03
KCl
-- -- -- -- 0,08 --
NaHCO
3
-- -- -- -- 0.13 0,54
NaCl
1,2 1,2 -- -- -- --
Tris
-- -- -- -- -- 0,08
mOsm
373 369 308 300 356 322
a
Componentes foram diluídos em água deionizada, em um volume final de 100 mL
b
Doação da empresa Minitüb® (Tiefenbach/Landshut, Alemanha)
BTS
®
: Beltsville Thawing Solution®
15
Todos os diluidores tiveram o pH ajustado para 7,6, um dia antes do
experimento ser realizado. Uma alíquota de sêmen de cada macho foi mantida
sem diluição (controle). O sêmen diluído e o controle foram levados ao
refrigerador (4-6ºC) em tubos de ensaio de 10 mL. As taxas de motilidade e o
vigor espermático foram avaliados nos dias 0, 2 e 4 após a refrigeração,
conforme descrito para o sêmen fresco. A duração da motilidade espermática foi
avaliada utilizando-se um cronômetro, o qual era acionado quando o meio
ativador era misturado à amostra de sêmen e terminava aos 120 segundos ou
quando apenas 10% dos espermatozoides ainda estavam se movendo, nos dias 0,
2 e 4 após a refrigeração.
Foram testadas duas soluções ativadoras da motilidade do sêmen: NaCl
0,29% e NaHCO
3
1%.
4.2.2 Experimento 2: Diluidores de sêmen com diferentes osmolaridades
As diferentes osmolaridades foram obtidas adicionando-se mais ou
menos água deionizada às soluções de BTS
®
e Androstar
®
. O pH dos diluidores
foi ajustado como descrito no experimento 1. O sêmen de outros sete machos foi
individualmente adicionado, nos diluidores Androstar
®
e BTS
®
, da mesma forma
descrita para o experimento 1. Para o diluidor BTS
®
, as osmolaridades testadas
foram 356 (osmolaridade inicial, medida assim que a solução foi preparada), 316
(40 mOsm abaixo da sua osmolaridade inicial) e 396 ( 40 mOsm acima da sua
osmolaridade inicial). O mesmo foi feito para o diluidor Androstar
®
, porém, sua
osmolaridade inicial era 322 mOsm e as outras osmolaridades estudadas, 282 e
362 mOsm, respectivamente.
Uma alíquota de sêmen de cada macho foi mantida sem diluição
(controle). O sêmen diluído e o controle foram levados ao refrigerador (4º-6ºC),
em tubos de ensaio de 10 mL. As taxas de motilidade, vigor e duração
espermática foram avaliadas nos dias 0, 2 e 4 após a refrigeração. A solução de
16
NaHCO
3
1% foi utilizada como ativadora. Este experimento foi conduzido em
delineamento em blocos casualizados (1 bloco = 1 macho), com parcelas
subdivididas no tempo.
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as variáveis observadas (taxa de motilidade, duração espermática e
vigor), o resíduo de cada modelo foi testado para distribuição normal. Os valores
de motilidade que não apresentaram distribuição normal foram transformados
em arc sen √y/100; os valores da duração da motilidade espermática
transformados pelo procedimento Box & Cox (1964) e, para os valores de vigor
espermático, a transformação foi √vigor+ 1,0, para a normalização. Então, os
dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo
teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade, utilizando-se f o software R, versão,
2.7.1 (R Core Development Team, 2008).
6 RESULTADOS
6.1 Avaliação seminal
O peso corporal dos peixes e as características seminais estão descritos
na Tabela 2.
17
TABELA 2 Peso dos machos e características do sêmen fresco de piabanha
Brycon insignis.
Características n
o
machos Média±DP Mín-Máx
Peso corporal (g) 14 300±35 245-370
Volume (mL) 14 5,5±2 3-8,5
Espermatozoides x 10
9
mL 14 28±7,5 12-39
pH 7 8,4±0,2 8,1-8,6
Osmolaridade (mOsm/kg) 14 366±15 348-395
Motilidade (%) 14 98±4 90-100
Vigor (1-5) 14 4±0,6 3-5
Vigor: escala 1-5 (1: intensidade de movimento muito lento dos
espermatozoides; 5: intensidade de movimento muito rápido dos
espermatozoides)
6.1.1 Experimento 1: Diluidores de sêmen com diferentes formulações
Na análise da motilidade espermática, o sêmen diluído em todos os
diluidores e testados imediatamente (dia 0) produziu taxas em torno de 90%
(Tabela 3). Após o segundo dia de resfriamento, a motilidade em torno de 50%
foi observada apenas nas amostras diluídas em BTS
®
e Androstar
®
. Baixas
motilidades foram observadas nas amostras diluídas ou sem diluição (controle),
após 4 dias de resfriamento. A taxa de motilidade do sêmen resfriado sem
diluição diminuiu significativamente a 2%, no dia 4.
18
TABELA 3 Motilidade espermática (expressa em %; média±DP; n = 7 peixes)
do sêmen de piabanha Brycon insignis diluído em diferentes
diluidores e resfriado a 4º-6ºC, por até 4 dias.
Resfriamento (dias)
Diluidor Ativador 0 2 4
NaCl 84±5
A a
3±5
D b
0
A b
NaCl-gentamicina 91±7
A a
4±5
D b
0
A b
Glicose NaCl 0,29% 93±5
A a
0
D b
0
A b
Glicose-gentamicina 94±8
A a
0
D b
0
A b
BTS
®
90±11
A a
53±21
A b
3± 5
A c
Androstar
®
86±10
A a
50±27
A b
9±19
A c
Controle 93±11
A a
24±26
C b
1±4
A b
NaCl 96±5
A a
14±13
C b
1±4
A b
NaCl-gentamicina 96±8
A a
33±30
B b
0
A c
Glicose NaHCO
3
1% 90±15
A a
0
D b
0
A b
Glicose-gentamicina 91±15
A a
0
D b
0
A b
BTS
®
91±9
A a
53±18
A b
3±5
A c
Androstar
®
94±5
A a
67±11
A b
4±5
A c
Controle 96±5
A a
44±26
B b
3±5
A c
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não
diferem entre si, pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
BTS
®
e Androstar
®
: para formulação, consultar Tabela 1
Para o vigor espermático, o sêmen diluído em todos os diluidores e
testados imediatamente (dia 0) obteve vigor em torno de 4 (Tabela 4). Após o
segundo dia de resfriamento, vigor em torno de 1,1-2,6 foi observado nas
amostras diluídas em BTS
®
, Androstar
®
, NaCl-gentamicina e no sêmen sem
diluição (controle).
19
TABELA 4 Vigor espermático (expresso na escala 1-5; média±DP; n = 7
peixes) do sêmen de piabanha Brycon insignis diluído em
diferentes diluidores e resfriado a 4º-6ºC, por até 4 dias.
Resfriamento (dias)
Diluidor Ativador 0 2 4
NaCl 3,7±0,5
A a
0,3±0,5
D b
0
A b
NaCl-gentamicina 3,6±1,0
A a
0,3±0,5
D b
0
A b
Glicose NaCl 0,29% 3,7±0,8
A a
0
D b
0
A b
Glicose -gentamicina 4,3±1,0
A a
0
D b
0
A b
BTS
®
2,7±1,0
B a
2,0
B a
0
A b
Androstar
®
2,4±0,8
B a
1,9±1,1
B a
0,3±0,8
A b
Controle 3,7±1,0
A a
1,0±1,0
C b
1,0±1,3
A b
NaCl 4,0±1,0
A a
1,4±1,8
C b
0,3±0,8
A b
NaCl-gentamicina 4,9±0,4
A a
2,0±1,5
B b
0
A c
Glicose NaHCO
3
1%
4,7±0,5
A a
0
D b
0
A b
Glicose-gentamicina 4,7±0,5
A a
0
D b
0
A b
BTS
®
4,3±1,1
A a
2,9±0,7
A b
0,3±0,8
A c
Androstar
®
4,4±0,5
A a
3,3±0,8
A b
0,3±0,8
A c
Controle 4,4±0,8
A a
2,3±1,1
B b
0,9±1,5
A c
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
BTS
®
e Androsta
®
: para formulação, consultar Tabela 1
Vigor: escala 1-5 (1: intensidade de movimento muito lento dos espermatozoides; 5:
intensidade de movimento muito rápido dos espermatozoides)
Na duração da motilidade espermática, os maiores valores (120
segundos) foram observados no dia 0, quando o sêmen estava diluído em
qualquer um dos diluidores estudados e ativado com NaHCO
3
1%, ou diluído
em glicose (104 segundos), glicose-gentamicina (109 segundos), NaCl (97
segundos), NaCl-gentamicina (99 segundos) e no sêmen sem diluição (controle),
20
quando ativado com NaCl 0,29% (Tabela 5). Após o segundo dia de
resfriamento, o sêmen sem diluição obteve a duração de 120 segundos, quando
ativado com NaHCO
3
1%. O sêmen diluído em BTS
®
, Androstar
®
e NaCl-
gentamicina também produziu duração espermática alta (97-108 segundos),
quando ativado com NaHCO
3
1%. Após 2 e 4 dias de resfriamento, a duração da
motilidade espermática do sêmen resfriado em glicose e glicose-gentamicina e
ativado com NaHCO
3
1% ou NaCl 0,29% diminuiu significativamente a 0.
TABELA 5 Duração da motilidade espermática (expressa em segundos;
média±DP; n = 7 peixes) do sêmen de piabanha Brycon insignis
diluído em diferentes diluidores e resfriado a 4º-6ºC, por até 4 dias.
Ativador Resfriamento (dias)
Diluidor 0 2 4
NaCl 97±24
A a
3±5
D b
2±4
B b
NaCl- gentamicina 99±23
A a
4±5
D b
0
B b
Glicose NaCl 0,29% 104±23
A a
0
D b
0
B b
Glicose -gentamicina 109±14
A a
0
D b
0
B b
BTS
®
87±20
B a
57±15
B b
3±5
B c
Androstar
®
81±20
B a
50±19
C b
10±22
B c
Controle 120
A a
40±44
B b
0
B c
NaCl 120
A a
86±58
B b
17±45
B c
NaCl-gentamicina 120
A a
103±45
A a
0
B b
Glicose NaHCO
3
1% 120
A a
0
D b
0
B b
Glicose-gentamicina 117±7,5
A a
0
D b
0
B b
BTS
®
120
A a
108±30
A a
34±58
A b
Androstar
®
120
A a
97±27
A a
51±64
A b
Controle 120
A a
120
A a
34±58
A b
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
BTS
®
e Androstar
®
: para formulação, consultar Tabela 1
21
6.1.2 Experimento 2: Diluidores de sêmen com diferentes osmolaridades
A motilidade do sêmen diluído e resfriado a 4º-6ºC está apresentada na
Tabela 6. O sêmen diluído em todas as soluções apresentou motilidade
espermática alta (92%-97%), semelhante ao sêmen não diluído (controle), no dia
0. Após dois dias do resfriamento, foi observada uma redução na motilidade
espermática após ativação, em todas as amostras diluídas e não diluídas. As
maiores motilidades (60%-63%) foram observadas no sêmen não diluído e nas
amostras diluídas em Androstar
®
322 e 362 mOsm. Todas as amostras diluídas
em BTS
®
apresentaram baixa motilidade (4%-10%). No 4º dia do resfriamento,
o sêmen não diluído apresentou a maior motilidade (43%). A motilidade de
todas as amostras diluídas variou entre 0% e 10%.
Os diluidores testados foram capazes de manter alto o vigor espermático
imediatamente após a diluição, no dia 0 (Tabela 7). No segundo dia, o sêmen
diluído em Androstar
®
322 e 362 mOsm teve vigor espermático superior (3,4-
3,6) ao do sêmen não diluído (controle) e diluído nas outras soluções (0,9-2,8).
No dia 4 do resfriamento, apenas o sêmen não diluído (controle) apresentou
vigor espermático acima de 2.
Na duração da motilidade espermática, o sêmen diluído em todos os
diluidores e o sêmen controle (não diluído), testados imediatamente (dia 0),
produziram duração de, no mínimo, 120 segundos (Tabela 8). No segundo dia,
apenas o sêmen diluído em Androstar
®
322 e 362 mOsm e o sêmen controle
mantiveram alta a duração da motilidade espermática (111-117 segundos),
enquanto o sêmen diluído em BTS
®
316 e 396 mOsm, devido à baixa taxa de
motilidade espermática (abaixo de 10%), não foi avaliado quanto à duração da
motilidade. Após 4 dias de resfriamento, apenas o sêmen diluído em Androstar
®
322 mOsm e o sêmen controle apresentavam duração de motilidade (21-77
segundos).
22
TABELA 6 Motilidade espermática (expressa em %; média±DP; n = 7 peixes)
do sêmen de piabanha Brycon insignis diluído em diferentes
diluidores e resfriado a 4º-6ºC, por até 4 dias.
Resfriamento (dias)
Diluidores Osmolaridades 0 2 4
BTS
®
316 94±5
A a
4±5
C b
0
B b
BTS
®
356 92±11
A a
10±6
C b
0
B b
BTS
®
396 94±5
A a
7±5
C b
0
B b
Androstar
®
282 96±5
A a
34±23
B b
1±4
B c
Androstar
®
322 96±5
A a
60±15
A b
10±11
B c
Androstar
®
362 97±5
A a
63±18
A b
3±5
B c
Controle 100
A a
60±26
A b
43±28
A c
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
BTS
®
e Androstar
®
: para formulação, consultar Tabela 1
23
TABELA 7 Vigor espermático (média±DP; n = 7 peixes) do sêmen de piabanha
Brycon insignis diluído em diferentes diluidores e resfriado a
4º-6ºC, por até 4 dias.
Resfriamento (dias)
Diluidores Osmolaridades 0 2 4
BTS
®
316 3,1±0,4
C a
0,9±1,2
C b
0
C c
BTS
®
356 3,7±0,5
C a
2,0±1,0
B b
0
C c
BTS
®
396 4,8±0,4
A a
1,1±0,9
C b
0
C c
Androstar
®
282 4,4±0,5
B a
2,8±0,9
B b
0,1±0,3
C c
Androstar
®
322 4,4±0,8
B a
3,6±0,8
A b
1,1±1,3
B c
Androstar
®
362 4,7±0,5
A a
3,4±0,8
A b
0,3±0,4
C c
Controle 4,0
B a
2,4±0,5
B b
2,3±0,7
A b
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
BTS
®
e Androstar
®
: para formulação, consultar Tabela 1
TABELA 8 Duração da motilidade espermática (expressa em segundos; média
± DP; n = 7 peixes) do sêmen de piabanha Brycon insignis diluído
em diferentes diluidores e resfriado a 4º-6ºC, por até 4 dias.
Resfriamento (dias)
Diluidores Osmolaridades 0 2 4
BTS
®
316 120
A a
- -
BTS
®
356 120
A a
7±19
C b
0
B b
BTS
®
396 120
A a
- -
Androstar
®
282 120
A a
73±56
B b
0
B c
Androstar
®
322 120
A a
116±8
A a
21±38
B b
Androstar
®
362 120
A a
117±7
A a
0
B b
Controle 120
A a
111±23
A a
77±45
A b
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
BTS
®
e Androstar: para formulação, consultar Tabela 1
24
7 DISCUSSÃO
7.1 Características seminais da piabanha
No presente trabalho, alguns parâmetros físico-químicos do sêmen
fresco da piabanha foram avaliados. A motilidade espermática, observada após
ativação com NaCl 0,29%, foi de 98%, estando bem próximo de 100%, como
descrito para a pirapitinga (Brycon nattereri) (Oliveira et al., 2007).
Foi observada, neste estudo, uma concentração espermática de 28 x 10
9
espermatozoides/mL de sêmen após hipofisação de dose única de extrato bruto
de hipófise de carpa, próximo à encontrada para a mesma espécie, 24,38 x 10
9
espermatozoides/mL (Shimoda, 2004). Em pirapitinga, outra espécie de Brycon,
a média de concentração foi de 30 x 10
9
espermatozoides/mL (Oliveira et al.,
2007), enquanto na piracanjuba, a concentração obtida foi de 5,88 x 10
9
espermatozoides/mL (Maria et al., 2006). Neste trabalho, foi coletado um
volume médio de 5,5 mL. Em piracanjuba, foi encontrado volume médio
superior a 15 mL (Maria et al., 2006), enquanto que, em pirapitinga, o volume
médio foi de 7,6 mL (Oliveira et al., 2007).
Pode-se observar, de maneira geral, que as espécies de peixes que
produzem sêmen de maior volume também produzem sêmen de menor
concentração espermática. O volume do sêmen e a concentração espermática
encontrados nas diferentes espécies de peixes são bastante variáveis. É
importante o conhecimento desses valores para que se possa avaliar a qualidade
do sêmen coletado e, com isso, otimizar sua utilização no processo de
fertilização artificial (Viveiros, 2005). Além disso, os dados de concentração
espermática permitem que seja determinado o número mínimo de
espermatozoides por óvulo, durante o processo de fertilização. Dessa forma,
pode-se melhorar a eficiência reprodutiva dos machos, maximizando a sua
utilização.
25
7.2 Diluidores de sêmen com diferentes formulações
No presente trabalho, foram avaliados dois grupos de soluções
diluidoras: as soluções simples (NaCl e glicose, com e sem acréscimo de
gentamicina) e as soluções complexas (BTS
®
e Androstar
®
, em sua formulação
padrão e em diferentes osmolaridades). No grupo de soluções simples, o sêmen
diluído nas soluções de glicose (acrescida ou não de gentamicina) e NaCl
(acrescida ou não de gentamicina) teve comportamento semelhante logo após a
diluição. A motilidade foi reduzida a zero para o sêmen diluído em glicose e
glicose-gentamicina no dia 2, e a motilidade do sêmen diluído em NaCl e NaCl-
gentamicina reduzida a 9% e 19%, respectivamente, também no dia 2. Especula-
se que a diminuição da motilidade no sêmen diluído em glicose e glicose-
gentamicina seja devido às baixas osmolaridades (308 e 300, respectivamente),
quando comparadas ao sêmen diluído nos outros diluidores, com osmolaridades
entre 322 e 356 mOsm. No resfriamento de sêmen de pirapitinga (Brycon
nattereri), o sêmen diluído em solução de BTS
®
produziu a maior motilidade de
48% até sete dias de resfriamento (Oliveira et al., 2007). Em piracanjuba, o
sêmen diluído na solução de NaCl 1,2% foi viável por até sete dias de
resfriamento, com motilidade de 37% (Maria et al., 2006).
Neste experimento, o sêmen diluído em BTS
®
e Androstar
®
, até o dia 2
de resfriamento, apresentou taxa de motilidade e vigor espermático superior ao
sêmen não diluído (controle) e diluído nas outras soluções avaliadas. Para a
duração espermática, o sêmen diluído em BTS
®
e Androstar
®
, até o dia 2 de
resfriamento, apresentou altos valores (50-108 segundos) em relação ao sêmen
não diluído (controle 40- 120 segundos) estando dentro do valor encontrado para
Brycon orbgnyanus (56 segundos), (Viveiros & Godinho, 2009). Pelos
resultados obtidos, observa-se que a diluição, em uma solução que preserve a
duração da motilidade espermática, permite o resfriamento do sêmen por até
26
dois dias, aumentando também o volume de sêmen, o que pode auxiliar na rotina
de pisciculturas.
A presença de bactérias pode diminuir a qualidade do sêmen por
produção de enzimas extracelulares e por consumo de oxigênio (Jenkins &
Tiersch, 1997). Assim, o uso de antibióticos poderia aumentar o tempo de
armazenamento do sêmen, por prevenir o crescimento bacteriano. A adição de
antibióticos nos diluidores de sêmen durante o resfriamento tem sido pouco
estudada em peixes. Neste trabalho, as soluções de NaCl e glicose, acrescidas
de gentamicina, não foram capazes de manter alta a taxa de motilidade
espermática até o segundo dia de resfriamento. Porém, quando a gentamicina foi
adicionada ao diluidor NaCl, as taxas de motilidade, vigor e duração espermática
tiveram sensível melhora, quando comparados somente ao diluidor NaCl sem a
adição da gentamicina. No resfriamento de sêmen de piracanjuba diluído na
solução de NaCl- tris e de NaCl 1,2%, não houve diferença entre o sêmen
diluído em solução acrescida ou não de gentamicina, porém, os autores sugerem
que doses maiores de gentamicina possam ser efetivas (Maria et al., 2006).
Ainda no resfriamento de sêmen de piracanjuba, avaliando-se a solução
diluidora de NaCl-tris associada a diferentes concentrações de gentamicina
(0,01; 0,1; 0,5 e 1,0 mg/mL), observou-se que amostras de sêmen acrescidas de
gentamicina apresentaram maior motilidade espermática em relação ao controle
no dia 4. No sêmen diluído em meios que continham as concentrações de
gentamicina de 0,1, 0,5 e 1,0 mg/mL, foram observadas motilidades superiores a
24%, até o dia 6 de resfriamento e não houve crescimento bacteriano (Isaú,
2006). No presente estudo, a diluição do sêmen em NaCl e glicose, acrescido ou
não de sulfato de gentamicina na concentração de 0,25 mg/mL, não produziu
resultados satisfatórios durante o resfriamento de sêmen de piabanha Brycon
insignis. Porém, uma superioridade do diluidor NaCl-gentamicina foi observada
27
em relação ao NaCl, quando o sêmen foi ativado com a solução de NaHCO
3
1%,
para os parâmetros estudados ( motilidade, vigor e duração espermática).
7.3 Diluidores de sêmen com diferentes osmolaridades
Como foi visto neste trabalho, as osmolaridades de 322 e 362 da solução
de Androstar
®
e o sêmen não diluído (controle- 358 mOsm) proporcionaram as
maiores taxas de motilidade espermática até o segundo dia de resfriamento.
Essas osmolaridades do Androstar
®
estão muito próximas à do sêmen controle
(não diluído).
A osmolaridade ideal da solução diluidora pode ser diretamente
dependente da osmolaridade do sêmen. Não há relatos, na literatura, da
osmolaridade do plasma seminal em peixes nativos. No presente estudo, a
osmolaridade encontrada para o sêmen fresco de piabanha foi 366±15 mOsm. A
osmolaridade, ou pressão osmótica, tem influência sobre a motilidade
espermática, sendo a ativação dos espermatozoides parcial ou totalmente
dependente da iso ou da hipotonicidade da solução diluente em relação ao
plasma seminal (Shimoda, 1999). Em salmonídeos, a alta pressão osmótica (400
mOsmol/kg) inibe a motilidade do espermatozoide (Turdakov, 1970; Morisawa
& Suzuki, 1980).
No presente trabalho, o sêmen diluído na solução de Androstar
®
foi
viável por até dois dias, apresentando motilidade espermática de 63%, sem a
necessidade de adição de qualquer crioprotetor. Os diluidores BTS
®
e o
Androstar
®
foram testados pela primeira vez durante o resfriamento de sêmen de
piabanha. O diluidor BTS
®
não demonstrou, neste experimento, ser tão eficiente
quanto no experimento 1, no qual, até o dia 2 de resfriamento, apresentou taxas
de motilidade em torno de 50%, provavelmente devido aos diferentes animais
utilizados nos experimentos. O diluidor Androstar
®
mostrou ser eficiente na
manutenção da motilidade espermática, até dois dias de resfriamento. Além das
28
causas citadas anteriormente, podem existir outras, responsáveis pelo curto
período de viabilidade espermática, tais como consumo de oxigênio, déficit de
nutrientes, enzimas e toxinas liberadas pela morte celular e fatores genéticos
relacionados à sobrevida dos espermatozoides (requerimentos da espécie),
quando comparados a outros Brycons.
O diluidor Androstar
®
se destacou em relacao ao BTS
®
na manutenção
da motilidade espermática, vigor e duração da motilidade até dois dias de
resfriamento. Embora o BTS
®
também tenha, em sua composição, 80% de
glicose, essa superioridade do Androstar
®
em manter alta a motilidade
espermática pode ser devido à presença de uma maior quantidade de sulfato de
gentamicina na sua composição e também à presença de tris, que tem, entre
outras, a função de potencializar a ação da gentamicina e do EDTA.
Outras osmolaridades devem ser testadas no resfriamento de sêmen de
piabanha para que o período de armazenamento possa ser prolongado para além
de dois dias.
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALAVI, S. M. H.; COSSON, J. Sperm motility in fishes: (I) effects of
temperature and pH. Cell Biology International, London, v. 29, n. 2, p. 101-
110, Feb. 2005.
BOITANO, S.; OMOTO, C. K. Trout sperm swimming patterns: role of
intracellular Ca2+. Cell Motil and the Cytoskeleton, Saint Paul, v. 21, n. 1, p.
74-82, 1992.
BOX, G. E. P.; COX, D. R. An analysis of transformations. Journal of the
royal statistical society, New York, v. 26, p. 42, n. 2, 1964
CAROLSFELD, J.; HARVEY, B. Conservação de recursos energéticos de
peixes: teoria e prática. Victoria: World Fisheries Trust, 1999.
29
FRESNEDA, A.; LENIS, G.; AGUDELO, E.; ANGEL, M. O. Espermiación
inducida y crioconservación de semen de Cachama Blanca (Piaractus
brachypomus). Revista Colombiana Ciencias Pecuarias, Medellín, v. 17, p.
46-52, 2004. Suplemento.
GONZÁLEZ, O. E.; DÍAZ, J.; LARA, R. Criopreservación de semen en
algunas especies de peces tropicales de importancia económica y comercial
de la orinoquia colombiana (Piaractus brachypomus, Pseudoplatystoma
fasciatum): Fase 1, Proyecto del CIC UJTL-INPA. Bogotá: [s. n.], 1998.
GONZÁLEZ, O. E.; FRESNEDA, A. Criopreservación de semen en algunas
especies de peces tropicales de importancia económica y comercial de la
orinoquia colombiana (Piaractus brachypomus, Pseudoplatystoma
fasciatum): Fase 2, Proyecto del CIC UJTL-INPA. Bogotá: [s. n.], 2000.
ISAÚ, Z. A. População bacteriana, motilidade espermática e fertilidade de
sêmen de piracanjuba Brycon orbignyanus (VALENCIENNES, 1849)
submetido ao resfriamento. 2006. 94 p. Dissertação (Mestrado em Ciências
Veterinárias ) – Universidade Federal de Lavras, Lavras.
JENKINS, J. A.; TIERSCH, T. R. A preliminary bacteriological study of
refrigerated channel catfish sperm. Journal World Aquaculture Society, Baton
Rouge, v. 28, n. 3, p. 282-288, Sept. 1997.
LAHNSTEINER, F.; BERGER, B.; WEISMANN, T.; PATZNER, R. A.
Determination of semen quality of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by
sperm motility, seminal plasma parameters, and spermatozoal metabolism.
Aquaculture, Amsterdam, v. 163, n. 1/2, p. 163-181, Apr. 1998.
MARIA, A. N.; VIVEIROS, A. T.; M.; FREITAS, R. T. F.; OLIVEIRA, A. V.
Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon
orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost fish. Aquaculture,
Amsterdam, v. 260, n. 1/4, p. 298-306, Sept. 2006.
MARQUES, S. Preservação a curto prazo do sêmen de teleósteos
neotropicais de água doce. 2001. 83 p. Dissertação (Mestrado em Zoologia) –
Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Belo Horizonte.
MORAES, G. F. Resfriamento e congelamento do sêmen de piau-açu
(Leporinus macrocephalus). 2004. 68 p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia)
– Universidade Federal de Lavras, Lavras.
30
MORISAWA, M.; SUZUKI, K. Osmolality and potassium ion: their roles in
initiation of sperm motility in teleosts. Science, Washington, v. 210, n. 4474, p.
1145-1147, 1980.
MOUNIB, N. S.; HWANG, P. C.; IDLER, D. R. Cryogenic preservation of
Atlantic cod (Gadus morhua) sperm. J
ournal of the Fisheries Research
Board
of Canada, Ottawa, v. 25, p. 2623-2632, 1968.
NAVARRO, O. J.; SANTAMARÍA, Y. M. V.; CASALLAS, P. E. C.
Evaluación de cinco protectores para la crioconservación de semen de Cachama
Blanca (Piaractus brachypomus). ). Revista Colombiana Ciencias Pecuarias,
Medellín, v. 17, p. 53-59, 2004. Suplemento.
OLIVEIRA, A. V.; VIVEIROS, A. T. M.; MARIA, A. N., FREITAS, R. T. F.;
ISAÚ, Z. A. Sucesso do resfriamento e congelamento de sêmen de pirapitinga
Brycon nattereri.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Belo Horizonte, v.
59, n. 6, p. 1509-1515, dez. 2007.
R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: a language and environment for
statistical computing. Vienna: R foundation for statistical computing, 2008.
Disponível em : <http://www.r-project.org>. Acesso em: 10 abr. 2009.
RURANGWA, E.; KIME, D. E.; OLLEVIER, F.; NASH, J. P. The
measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured
fish. Review article. Aquaculture, Amsterdam, v. 234, n. 1/4, p. 1-28, May
2004.
SHIMODA, E. Análise e criopreservação do sêmen da piabanha Brycon
insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae). 2004. 121 p. Tese
(Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, Goytacazes.
SHIMODA, E. Caracterização física, química e microscópica do sêmen do
pacu Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887. 1999. 54 p. Dissertação
(Mestrado) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
Goytacazes.
STOSS, J.; DONALDSON, E. M. Preservation of fish gametes. In:
INTERNATIONAL SYMPOSIUM REPRODUCTION PHYSIOLOGY FISH,
1982, Wageningen. Proceedings... Wageningen: [s. n.], 1982. p. 114-122.
31
SUQUET, M.; DREANNO, C.; FAUVEL, C.; COSSON, J.; BILLARD, R.
Cryopreservation of sperm in marine fish. Aquaculture Research, Oxford, v.
31, n. 3, p. 231-243, Mar. 2000.
TURDAKOV, A. F. Effect of various concentrations of Ringer Solution on trout
sperm behaviour.
Dopovidi Akademiji Nauk Ukrainskoirsr. Serie B.
Geologicni, himicni ta biologicni nauki
, Kiev, v. 74, p.20-24, Jan. 1970.
VIVEIROS, A. T. M. Criopreservação de sêmen de peixes. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 16., 2005, Goiânia, GO.
Palestras... Goiânia: CBRA, 2005. CD-ROM.
VIVEIROS, A. T. M.; GODINHO, H. P. Sperm quality and cryopreservation of
Brazilian freshwater fish species: a review. Fish Physiology and Biochemistry,
Amsterdam, v. 35, n. 1, p. 137-150, Mar. 2009.
VIVEIROS, A. T. M.; ÓRFÃO, L. H.; MARIA, A. N.; ALLAMAN, I. B. A
simple, inexpensive and successful freezing method for curimba Prochilodus
lineatus (Characiformes) semen. Animal Reproduction Sicence, Amsterdam, v.
112, n. 3/4, p. 293-300, June 2009.
32
CAPÍTULO 3
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DO PEIXE TELEÓSTEO
PIABANHA (Brycon insignis): EFEITO DE DILUIDORES,
CRIOPROTETORES, TEMPERATURA DE DESCONGELAMENTO
E SOLUÇÕES ATIVADORAS
33
1 RESUMO
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de
diluidores, agentes crioprotetores, temperatura de descongelamento e
soluções ativadoras da motilidade espermática no processo de
criopreservação do sêmen de piabanha Brycon insignis. No experimento 1,
foram avaliados oito meios de congelamento compostos pela combinação de
quatro diluidores (NaCl, glicose, BTS
®
e M III
®
) e dois crioprotetores
(dimetilsulfóxido-DMSO e metilglicol). O sêmen foi congelado em vapor de
nitrogênio a -170°C e armazenado em nitrogênio líquido. A motilidade
espermática foi avaliada após descongelamento a 60°C e ativação com NaCl
0,29% e NaHCO
3
1%. No experimento 2, foram avaliados quatro meios de
congelamento compostos pelos diluidores do experimento 1 e metilglicol. O
sêmen foi descongelado a 30ºC e a 60ºC, ativado com os mesmos ativadores
e a qualidade avaliada quanto à motilidade, ao vigor (escala de 0 a 5) e à
duração da motilidade. No experimento 1, as maiores taxas de motilidade
espermática foram observadas no sêmen criopreservado em metilglicol
(76%-88%), em relação ao DMSO (23%-59%). Não houve efeito dos
diluidores na motilidade e o NaHCO
3
1% foi melhor ativador do que o NaCl
0,29% apenas quando o DMSO foi utilizado como crioprotetor. No
experimento 2, não houve efeito dos diluidores, das temperaturas de
descongelamento e nem dos ativadores na motilidade espermática (59%-
70%). De maneira geral, os maiores escores de vigor espermático foram
observados nas amostras descongeladas a 30ºC e ativadas com NaHCO
3
1%.
A duração da motilidade espermática foi mais longa (95-120 segundos)
quando o ativador NaHCO
3
1% foi utilizado. O sêmen de piabanha pode ser
congelado em meio contendo qualquer um dos quatro diluidores testados,
combinados ao metilglicol. O descongelamento deverá ser feito a 30ºC e a
motilidade deverá ser ativada com NaHCO
3
1%. Dessa forma, o sêmen
descongelado apresentará ótima qualidade, mas ainda deverá ser testado
quanto à capacidade de fertilizar ovócitos.
34
2 ABSTRACT
The aim of this work was to test the effects of extenders,
cryoprotectant agents, thawing temperatures and activation media on the
cryopreservation process of piabanha Brycon insignis sperm. On experiment
1, eight freezing media composed of four extenders (NaCl, glucose, BTS
™
and M III
™
) and two cryoprotectants (dimetilsulphoxide-DMSO and
methylglycol) were tested. Sperm was frozen in nitrogen vapor at -170°C and
stored in liquid nitrogen. Sperm motility was evaluated after thawing at 60ºC
and activated with NaCl 0.29% and NaHCO
3
1%. In experiment 2, four
freezing media composed of the same extenders tested on experiment 1 and
methylglycol were evaluated. Sperm was thawed at 30ºC and 60ºC, activated
with the same activation media and sperm quality was evaluated in terms of
motility rate, quality score (0 to 5) and motility duration. In experiment 1,
the highest motility rates were observed when sperm was cryopreserved in
methylglycol (76-88%), compared to DMSO (23-59%). There was no effect
of extenders on motility, and NaHCO
3
1% was a better activation medium
than NaCl 0.29% only when DMSO was used as cryoprotectant. In
experiment 2, there was no effect of extenders, thawing temperatures or
activation media on post-thaw sperm motility (59-70%). In general, the
highest quality scores were observed when sperm was thawed at 30ºC and
activated with NaHCO
3
1%. Motility duration was longer (95-120 s) when
NaHCO
3
1% was used as activation medium. Piabanha sperm can be frozen
in a medium composed of any of the four extenders tested, and methylglycol.
Thawing should be carried out at 30ºC and motility should be activated with
NaHCO
3
1%. Using this methodology, thawed sperm possess great quality,
but fertilization trial is still needed.
35
3 INTRODUÇÃO
Muitas espécies de peixes tropicais realizam migrações no período
reprodutivo. Essas espécies migram para os locais de desova e esse processo
caracteriza a piracema, que acontece quando, pelas condições climáticas e
estímulos hormonais, os peixes se encontram aptos para a reprodução (Godinho
& Godinho, 1994). A construção de barragens interrompe este ciclo reprodutivo
e, juntamente com o assoreamento de rios e a pesca predatória, prejudica a
sobrevivência dessas espécies, como a piabanha (Brycon insignis) que se
encontra bastante ameaçada pela poluição do rio Paraíba do Sul, decorrente do
lançamento de esgoto doméstico, industrial e agropecuário, como também pela
introdução do dourado (Salminus maxillosus), um voraz predador. Estes fatores
comprometeram seriamente a perpetuação dessa espécie. No que se refere à sua
utilização, é considerada espécie de alto valor comercial e muito apreciada pela
resistência à captura com anzol na pesca esportiva. A exploração para fins
comerciais é ainda praticamente inexistente, tendo as estações de piscicultura
com criação de piabanhas apenas fins conservacionistas (Shimoda, 2004).
A criopreservação do sêmen é uma alternativa para otimizar a
reprodução durante o período da piracema. Dessa maneira, é possível formar um
banco de sêmen dessa espécie, aumentando a variabilidade genética dos
estoques por meio de permuta de material genético entre as estações de
piscicultura. Outro benefício da criopreservação é a eliminação do problema da
assincronia da maturidade gonadal entre machos e fêmeas (Viveiros, 2005).
Alguns trabalhos envolvendo a criopreservação de sêmen de peixes da
família Bryconidae, já foram descritos, lançando protocolos efetivos para o
congelamento do sêmen de piracanjuba (Bedore, 1999; Carolsfeld et al., 2003;
Maria et al., 2006) e de pirapitinga (B. nattereri) (Oliveira et al., 2007).
36
Para ser criopreservado, o sêmen precisa ser diluído em meio contendo
diluidor e crioprotetor intracelular. Os diluidores são soluções de sais ou de
carboidratos que ajudam a manter a viabilidade das células durante o
congelamento e permitem que os crioprotetores intracelulares ou extracelulares
atinjam o interior e a superfície dos espermatozoides. Os diluidores devem
manter os espermatozoides imóveis e ser estéreis (Carolsfeld & Harvey, 1999).
Os crioprotetores intracelulares são substâncias que protegem os
espermatozoides durante o processo de congelamento. Eles reduzem o ponto de
congelamento do meio extracelular, atenuam os efeitos deletérios dos cristais de
gelo e regulam a velocidade de desidratação das células, reduzindo os danos
causados pela alta concentração de soluto durante o congelamento lento
(Viveiros, 2005). O dimetil sulfóxido (DMSO) é um dos mais utilizados no
sêmen de peixes. O metilglicol ainda é pouco estudado neste processo e foi
utilizado pela primeira vez em Brycons por Maria et al. (2006), na
criopreservação de sêmen de piracanjuba, e na pirapitinga por Oliveira et al.
(2007).
Os espermatozoides de peixe são imóveis no testículo e no líquido
seminal (Leung & Jamieson, 1991). Para a ativação dos espermatozoides dos
peixes de água doce, é necessário o contato com uma solução de pressão
osmótica menor que a do sêmen. Comumente, são utilizadas soluções de cloreto
de sódio e bicarbonato de sódio em baixas concentrações, além da água
destilada.
Este estudo foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito dos
diluidores, dos crioprotetores e das temperaturas de descongelamento na
eficiência do processo de criopreservação e das soluções ativadoras da
motilidade, vigor e duração espermática do sêmen de piabanha Brycon insignis.
Visando obter um protocolo para utilização na rotina de laboratórios de
reprodução e formação de um banco de sêmen nas estações de piscicultura,
37
facilitando o manejo da piabanha, uma espécie considerada ameaçada de
extinção.
4 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido durante o período reprodutivo (janeiro e
fevereiro) da espécie. Foram utilizados machos de piabanha Brycon insignis
provenientes da Estação de Piscicultura da Companhia Energética de São Paulo
(CESP), Paraibuna, SP. Os animais que possuíam a papila urogenital hiperêmica
e que liberavam sêmen sob leve massagem abdominal foram selecionados. Após
a seleção, os machos receberam uma única dose de extrato bruto de hipófise de
carpa (3 mg/kg do peso corporal) para induzir a espermiação. Depois de 8 horas,
o sêmen de cada animal foi coletado individualmente, de acordo com o manejo
da estação. A coleta foi realizada em tubos de ensaio, evitando-se a
contaminação do sêmen com água, sangue ou urina.
4.1 Avaliação inicial do sêmen
Imediatamente após a coleta, 5 µL de sêmen de cada macho foram
colocados em lâminas e levadas ao microscópio óptico (modelo L1000, Bioval,
Jiangbei, China) previamente focalizado em 400 x. Todas as amostras (n= 18)
apresentavam espermatozoides imóveis, demonstrando que o sêmen não havia
sido contaminado por água ou urina. A motilidade espermática foi, então,
induzida com NaCl 0,29%, na proporção 1:5 e subjetivamente determinada
utilizando-se uma escala de 0% a 100%. Para vigor espermático, foram
atribuídos escores variando de 1 (intensidade de movimento muito lento dos
espermatozoides) a 5 (intensidade de movimento muito rápido dos
espermatozoides), segundo Mounib et al. (1968). As amostras de sêmen foram
38
avaliadas ainda quanto ao volume, à concentração espermática (câmara
hematimétrica Neubauer “Improved) e osmolaridade (semimicro osmômetro K
7400 Knauer, Alemanha). Durante todo o procedimento, o sêmen foi mantido
em tubos de ensaio em banho de gelo (15±2ºC).
4.2 Experimentos
4.2.1 Experimento 1 – Diluidores, crioprotetores e ativadores
O sêmen de dez machos foi diluído em um dos oito meios de
congelamento, compostos pelas combinações de 4 diluidores x 2 crioprotetores.
Os diluidores testados foram escolhidos com base nos bons resultados obtidos
em estudos anteriores com piracanjuba (Maria et al., 2006), pirapitinga (Oliveira
et al., 2007) e curimba (Viveiros et al., 2009):
39
TABELA 1 Composição química dos diluidores testados durante a
criopreservação de sêmen de piabanha Brycon insignis.
Diluidores
Componentes (g)
a
NaCl Glicose BTS
®
b
MIII
®
b
Glicose -- 5,00 4,00 5,34
Citrato de sódio -- -- 0,63 0,18
EDTA -- -- 0,13 0,18
Sulfato
gentamicina
-- -- 0,02 0,03
KCl -- -- 0,08 --
NaHCO
3
-- -- 0.13 0,25
NaCl 0,9 -- -- --
Tris -- -- -- --
mOsm 285 308 356 367
a
Componentes foram diluídos em água deionizada, em um volume final de 100 mL
b
Doação da empresa Minitüb
®
(Tiefenbach/ Landshut, Alemanha)
BTS
®
: Beltsville Thawing Solution
®
M III
®
: Merck III
®
Os crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO - (CH
3
)
2
SO) e metilglicol
(CH
3
O(CH2)2OH) foram adicionados separadamente em cada diluidor, 30
minutos antes da adição do sêmen. O sêmen diluído foi envasado em palhetas de
0,5 mL (n=3 palhetas/meio/macho), vedadas com esferas e acondicionadas em
raques, que foram colocadas em botijão de vapor de nitrogênio (dry-shipper,
Cheng Du YDH-8), à temperatura de -170ºC. Após 24 horas, as raques foram
armazenadas em nitrogênio líquido (Cheng Du YDS-20). As palhetas foram
descongeladas em banho-maria, a 60°C, por 8 segundos (Maria et al., 2006) e a
motilidade espermática foi imediatamente ativada com duas diferentes soluções
ativadoras: NaCl 0,29% (50 mM) e NaHCO
3
1% (119mM). A avaliação da
motilidade espermática foi feita como descrita para o sêmen fresco.
40
4.2.2 Experimento 2 – Diluidores, temperaturas de descongelamento e
ativadores
Baseando-se nos resultados obtidos no experimento 1, o sêmen de oito
machos foi diluído em um dos quatro diluidores testados anteriormente e
criopreservado somente em metilglicol.
Os mesmos procedimentos realizados para o congelamento do sêmen
foram utilizados neste experimento. As palhetas foram descongeladas em banho-
maria, a 60°C, por 8 segundos e a 30º C, por 16 segundos. Além da análise da
motilidade, o vigor e a duração espermática também foram analisados,
imediatamente após a ativação com as duas diferentes soluções ativadoras do
experimento 1. A avaliação da motilidade e do vigor espermático foi feita como
descrita para o sêmen fresco. A duração da motilidade espermática foi avaliada
utilizando-se um cronômetro, o qual era iniciado quando o meio ativador era
misturado à amostra de sêmen e interrompido aos 120 segundos ou quando
apenas 10% das células espermáticas ainda estavam se movendo.
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as variáveis observadas (taxa de motilidade, duração espermática e
vigor), o resíduo de cada modelo foi testado para distribuição normal. Os valores
que não apresentaram distribuição normal foram transformados por meio do
procedimento Box & Cox (1964) para a normalização. Então, os dados foram
submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-
Knott, a 5% de probabilidade, utilizando-se f o software R, versão, 2.7.1 (R Core
Development Team, 2008).
41
6 RESULTADOS
O peso e as características do sêmen fresco dos 18 machos de piabanha
estão apresentados na Tabela 2.
TABELA 2 Peso dos machos e características do sêmen fresco de piabanha
Brycon insignis.
Características n
o
machos Média ± DP Mín- Máx
Peso corporal (g) 18 296±28 230-305
Motilidade (%) 18 99±5 80-00
Vigor (1-5) 8 5±0,5 4-5
Volume (mL) 8 4±0,7 2-5
Espermatozoides x 10
9
mL 8 17±7 6-34
Osmolaridade (mOsm/kg) 8 350±13 332-375
Vigor: escala 1-5 (1: intensidade de movimento muito lento dos espermatozoides; 5:
intensidade de movimento muito rápido dos espermatozoides)
6.1 Experimento 1- Diluidores, crioprotetores e ativadores
Os dados referentes à motilidade espermática do sêmen criopreservado
nos oito meios testados, ativados com os dois ativadores e descongelados na
temperatura de 60ºC, estão apresentados na Tabela 3.
O sêmen criopreservado em metilglicol combinado a qualquer um dos
quatro diluidores produziu as maiores taxas de motilidade espermática (76%-
88%) em relação às amostras criopreservadas em DMSO (23%-59%),
independentemente do ativador utilizado.
42
TABELA 3 Motilidade espermática (expressa em %; média±DP; n = 3 palhetas
x 10 peixes) do sêmen de piabanha Brycon insignis criopreservado.
Ativador
Diluidor Crioprotetor NaCl 0,29% NaHCO
3
1%
NaCl 46±17
B b
57±17
B a
Glicose DMSO 45±23
B b
59±18
B a
BTS
®
23±17
C b
40±24
C a
M III
®
43±21
B b
53±22
B a
NaCl 82±15
A a
88±7
A a
Glicose Metilglicol 77±17
A a
79±14
A a
BTS
®
77±9
A a
80±8
A a
M III
®
77±14
A a
76±15
A a
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minuscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott- Knott, a 5% de probabilidade
6.2 Experimento 2 - Diluidores, temperaturas de descongelamento e
ativadores
Os dados referentes à motilidade espermática, ao vigor e à duração da
motilidade do sêmen criopreservado nos 4 meios testados e ativados com os dois
ativadores estão apresentados na Tabela 4.
Com relação à análise de motilidade espermática, observou-se que o
sêmen criopreservado em qualquer um dos quatro diluidores testados apresentou
taxas de motilidade semelhantes, quando descongelado tanto na temperatura de
30º como na de 60ºC e ativado com qualquer um dos dois ativadores.
Os maiores escores de vigor para o sêmen criopreservado em qualquer
uma das quatro soluções diluidoras foi observado após o descongelamento a
30°C e ativado com NaHCO
3
1% (3,5-4,3) e para o sêmen criopreservado em
NaCl e glicose (3,2 e 3,3, respectivamente), ativado com NaCl 0,29%. À
temperatura de 60°C, os maiores escores foram observados para o sêmen
43
criopreservado em NaCl (4,0) ativado com NaHCO
3
1% e em glicose (3,3)
ativado com NaCl 0,29%.
A duração da motilidade espermática foi prolongada em todos os
diluidores testados, independente da temperatura de descongelamento (30º ou
60ºC) pela utilização do ativador NaHCO
3
1% em relação ao NaCl 0,29%. As
amostras de sêmen que apresentaram maior duração de motilidade foram aquelas
criopreservadas em BTS
®
, M III
®
e glicose (113-120 segundos) descongeladas à
temperatura de 30ºC, ativadas com NaHCO
3
1%. As amostras de sêmen que
apresentaram menor duração foram aquelas criopreservadas em NaCl (69-86
segundos) ativadas com NaCl 0,29%, nas temperaturas de descongelamento de
60º e 30ºC, respectivamente.
44
TABELA 4 Motilidade espermática, vigor e duração da motilidade espermática
do sêmen de piabanha Brycon insignis criopreservado.
Ativador
NaCl 0,29% NaHCO
3
1%
Diluidores T
o
C
Motilidade (%)
NaCl 70±19,4 74±12,8
Glicose 30 63±22,6 70±21,2
BTS
®
57±27,1 67±20, 4
M III
®
61±16,8 66±21,4
NaCl
61±24,3 59±27,1
Glicose 60 68±19,3 71±14,2
BTS
®
62±24,5 59±24,8
M III
®
60±28,0 66±20,4
Vigor (1-5) *
NaCl 3,2±1,0
A a
3,8±0,6
A a
Glicose 30 3,3±1,3
A a
4,3±0,9
A a
BTS
®
2,3±1,0
B b
3,7±0,9
A a
M III
®
2,5±1,1
B b
3,5±0,8
A a
NaCl 2,6±0,6
B b
4,0±0,7
A a
Glicose 60 3,3±0,8
A a
2,7±1,1
B b
BTS
®
2,6±0,6
B a
3,0±1,0
B a
M III
®
2,5±0,7
B b
3,1±1,1
B a
Duração (segundos)
NaCl 86±24
B b
116±13
A a
Glicose 30 107±23
A b
120
A a
BTS
®
85±37
B b
113±17
A a
M III
®
84±24
B b
113±20
A a
NaCl 69±26
C b
95±36
B a
Glicose 60 83±23
B b
114±15
A a
BTS
®
79±25
B b
107±26
A a
M III
®
87±31
B b
109±18
A a
Médias com a mesma letra maiúscula na coluna e minuscula na linha não diferem entre
si, pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade
* Vigor: escala 1-5 (1: intensidade de movimento muito lento dos espermatozoides; 5:
intensidade de movimento muito rápido dos espermatozoides)
Os dados estão expressos como médias±DP; n = 3 palhetas x 8 peixes)
45
7 DISCUSSÃO
7.1 Diluidores, crioprotetores e ativadores
No presente trabalho, os diluidores testados se mostraram eficientes para
a criopreservação do sêmen de piabanha Brycon insignis. A elaboração de um
meio para o congelamento de sêmen tem como um dos pontos importantes a
associação de um diluidor (solução aquosa) e de um crioprotetor. Neste estudo, o
crioprotetor metilglicol se mostrou mais eficiente na manutenção da motilidade
espermática (76-88%), em relação ao crioprotetor DMSO (23-59%). A escolha
de um meio de congelamento de sêmen capaz de proteger os espermatozoides
tem se mostrado espécie-específica. O uso de metilglicol como crioprotetor
intracelular de sêmen de peixe ainda é pouco comum e foi testado pela primeira
vez em sêmen de piracanjuba (Brycon orbignyanus) (Maria et al., 2006). Outros
pesquisadores encontraram bons resultados na criopreservação, utilizando
metilglicol como crioprotetor, comparado ao DMSO (Maria et al., 2006;
Oliveira et al., 2007). O sêmen de pirapitinga, B. nattereri (Oliveira et al., 2007)
e piracanjuba, B. orbignyanus (Maria et al., 2006), criopreservado em BTS
®
e
metilglicol, apresentou taxas de motilidade espermática de 72% e 70%,
respectivamente. Esse é o primeiro relato do uso do metilglicol como
crioprotetor intracelular em sêmen de piabanha, apresentando excelentes
resultados nas taxas de motilidade.
7.2 Diluidores, temperaturas de descongelamento e ativadores
No presente estudo, não houve diferença significativa nos parâmetros
motilidade, vigor e duração espermática, quando o sêmen foi descongelado nas
temperaturas testadas (30º e 60ºC), embora os maiores valores de vigor e
duração da motilidade tenham sido observados após o descongelamento à
temperatura de 30ºC. Alguns estudos sugerem que possa ocorrer desnaturação
46
das enzimas na área periférica das palhetas, antes que o sêmen no interior da
palheta esteja descongelado, causada por elevada temperatura (80ºC) do banho-
maria (Cabrita et al., 2001; Lahnsteiner et al., 1997). Para o sêmen
criopreservado de Brycon nattereri, foram testadas as temperaturas de 50ºC e
60ºC, contudo, não foi observada diferença significativa na motilidade
espermática. Valores acima de 66% foram observadas no sêmen congelado em
BTS
®
com o crioprotetor metilglicol (Oliveira et al., 2007).
Após o descongelamento, foram observados altos valores de vigor e
duração espermática quando o sêmen foi ativado com NaHCO
3
1%, em relação
ao sêmen ativado com NaCl 0,29%. Em espécies de peixes de água doce, a
motilidade dos espermatozoides é iniciada quando o sêmen entra em contato
com a água, pela diminuição da osmolaridade (Carolsfeld & Harvey, 1999). A
diferença existente entre a baixa pressão osmótica da água em relação ao plasma
seminal é essencial para iniciar a motilidade espermática nessas espécies
(Godinho, 2000).
Várias soluções são utilizadas para ativar a motilidade espermática do
sêmen de peixes após descongelamento e pode-se inferir que há uma interação
entre a solução crioprotetora usada e o ativador (Carolsfeld & Harvey, 1999).
Os resultados obtidos neste estudo sugerem que o sêmen de piabanha
pode ser criopreservado em qualquer um dos quatro diluidores testados
acrescidos de metilglicol de forma satisfatória. A solução de glicose e NaCl,
pela facilidade de ser encontrada no mercado na forma comercial, é viável e
prática, já que é encontrada em farmácias a um baixo custo, esterilizada e pronta
para ser utilizada. O sêmen deve ser descongelado à temperatura de 30º C, por
ser mais fácil de ser mantida no banho-maria, comparada à temperatura de 60ºC
e a ativação feita com NaHCO
3
1%, por produzir maior escore para vigor
espermático e maior tempo de duração da motilidade espermática, em relação ao
NaCl 0,29%.
47
Experimentos de fertilização devem ser realizados com sêmen
criopreservado de piabanha, para que a efetividade desse processo possa ser
confirmada.
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BEDORE, A. G. Características criopreservação do sêmen de pacu-caranha
(Piaractus mesopotamicus) e de piracanjuba (Brycon orbignyanus). 1999.
53p. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular) – Universidade Federal de
Minas Gerais, Belo Horizonte
BOX, G. E. P.; COX, D. R. An analysis of transformations. Journal of the
Royal Statistical Society, London, v. 26, n. 2, p. 42, 1964
CABRITA, E.; ROBLES, V.; ALVAREZ, R.; HERRÁEZ, M. P.
Cryopreservation of rainbow trout sperm in large volume straws: application to
large scale fertilization. Aquaculture, Amsterdam, v. 201, n. 3/4, p. 301-314,
Oct. 2001.
CAROLSFELD, J.; HARVEY, B. Conservação de recursos energéticos de
peixes: teoria e prática. Victoria: World Fisheries Trust, 1999.
CAROLSFELD, J.; GODINHO, H. P.; ZANIBONI FILHO, E.; HARVEY, B. J.
Cryopreservation of sperm in Brazilian migratory fish conservation. Journal of
Fish Biology, Oxford, v. 63, n. 2, p. 472-489, Aug. 2003.
GODINHO, H. P. Criopreservação de sêmen de peixes. Informe Agropecuário,
Belo Horizonte, v. 21, n. 203, p. 16-20, mar./ abr. 2000.
GODINHO, H. P.; GODINHO, A. L. Ecology and conservation of fish in
southeastern Brazilian river basins submitted to hydroelectric impoundments.
Acta Limnologica Brasiliensia, Rio de Janeiro, v. 5, n. 1, p. 187-197, jan. 1994.
LAHNSTEINER, F.; WEISMANN, T.; PATZNER, R. A. Methanol as
cryprotectant and the suitability of 1, 2 and 5 mL straws for cryopreservation of
semen from salmonid fishes. Aquaculture Research, Oxford, v. 28, n. 6, p.
471-479, June 1997.
48
LEUNG, L. K. P. Principles of biological cryopreservation. In: JAMIESON, B.
G. M. (Ed.). Fish evolution and systematics: evidence from Spermatozoa.
Cambridge: Cambridge University Press, 1991. cap. 19, p. 230-244.
MARIA A. N.; VIVEIROS A. T. M.; FREITAS R. T. F.; OLIVEIRA, A. V.
Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon
orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost fish. Aquaculture,
Amsterdam, v. 260, n. 1/4, p. 298-306, Sept. 2006.
MOUNIB, N. S.; HWANG, P. C.; IDLER, D. R. Cryogenic preservation of
Atlantic cod (Gadus morhua) sperm. J
ournal of the Fisheries Research
Board
of Canada, Ottawa, v. 25, p. 2623-2632, 1968.
OLIVEIRA, A. V.; VIVEIROS, A. T. M.; MARIA, A. N., FREITAS, R. T. F.;
ISAÚ, Z. A. Sucesso do resfriamento e congelamento de sêmen de pirapitinga
Brycon nattereri.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Belo Horizonte, v.
59, n. 6, p. 1509-1515, dez. 2007.
R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: a language and environment for
statistical computing. Vienna: R foundation for statistical computing, 2008.
Disponível em: <http://www.r-project.org>. Acesso em: 10 abr. 2009.
SHIMODA, E. Análise e criopreservação do sêmen da piabanha Brycon
insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae). 2004. 121p. Tese
(Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, Goytacazes.
VIVEIROS, A. T. M. Criopreservação de sêmen de peixes. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 16., 2005, Goiânia, GO.
Palestras... Goiânia: CBRA, 2005. CD-ROM.
VIVEIROS, A. T. M.; GODINHO, H. P. Sperm quality and cryopreservation of
Brazilian freshwater fish species: a review. Fish Physiology and Biochemistry,
Amsterdam, v. 35, n. 1, p. 137-150, Mar. 2009
49
CAPÍTULO 4
CONSIDERAÇÕES FINAIS
50
A piabanha é considerada uma espécie de alto valor comercial e muito
apreciada pela resistência à captura com anzol na pesca esportiva. A exploração
para fins comerciais é ainda praticamente inexistente, tendo as estações de
piscicultura com criação de piabanhas apenas fins conservacionistas. Diante
dessas circunstâncias, existe uma demanda crescente por técnicas práticas e
apuradas de preservação de gametas que facilitem a fertilização artificial desses
animais para repovoamento dos rios e sua criação em cativeiro.
Por meio dos estudos de resfriamento, o sêmen de piabanha pode
manter-se viável, com motilidade em torno de 63%, por até dois dias, diluído em
solução de Androstar
®
,
encontrada na forma comercial, em sua osmolaridade
padrão (322 mOsm) ou na osmolaridade de 362 mOsm. Essas osmolaridades do
Androstar
®
estão muito próximas à do sêmen não diluído (controle- 358 mOsm).
O uso de sêmen diluído e resfriado facilita o manejo das pisciculturas e permite
o uso eficiente pelo aumento do volume de sêmen utilizado, possibilitando a
troca de material genético entre as estações reprodutivas de piscicultura.
Durante o processo de criopreservação, o sêmen de piabanha pode ser
congelado em qualquer um dos quatro diluidores testados, acrescidos de
metilglicol de forma satisfatória. A solução de glicose e NaCl, pela facilidade
de ser encontrada no mercado na forma comercial é viável e prática, já que é
encontrada em farmácias a um baixo custo, esterilizada e pronta para ser
utilizadas. O sêmen deve ser descongelado à temperatura de 30º C, por ser mais
fácil de ser mantida no banho-maria, comparada à temperatura de 60ºC e a
ativação feita com NaHCO
3
1%, por produzir maior escore para vigor
espermático e maior tempo de duração da motilidade espermática, em relação ao
NaCl 0,29%. Experimentos de fertilização devem ser realizados com sêmen
resfriado e criopreservado de piabanha, para que a efetividade desse processo
possa ser confirmada.
51
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
