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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
BIOATIVAS (CITOLISINA E LECTINA) DA PEÇONHA DO
PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri (BLOCH, 1789).
FILIPE ANDRICH
ORIENTADORA: PROFa DRa MARIA ELENA DE LIMA PEREZ GARCIA
CO-ORIENTADORA: PROFa DRa SUELY GOMES DE FIGUEIREDO (UFES)
BELO HORIZONTE, OUTUBRO DE 2009
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ii
FILIPE ANDRICH
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
BIOATIVAS (CITOLISINA E LECTINA) DA PEÇONHA DO
PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri (BLOCH, 1789).
Tese apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Ciências Biológicas:
Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial para obtenção
do título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elena de Lima Perez Garcia
Co-orientadora: Profa. Dra. Suely Gomes de Figueiredo
BELO HORIZONTE – MINAS GERAIS
2009
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iii
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Venenos e Toxinas Animais do
Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais e
no Laboratório de Química de Proteínas do Departamento de Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal do Espírito Santo, com apoio financeiro das seguintes instituições:
- Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);
- Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Toxinas (INCTTOX)
- Fundação Ezequiel Dias (FUNED);
- Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP);
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG);
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Espírito Santo (FAPES).
iv
Gostaria de dedicar este trabalho e agradecer especialmente:
Aos meus queridos pais, Aldo e Maria do Carmo, por ser o pilar de minha vida, pelo
Amor incondicional, pela força, impulso, companheirismo e carinho para vencer todas
as dificuldades que surgem em meu caminho.
A minha querida família, Thiago e Patrícia, André, Mariana, Marcelo e Isabella, pela
amizade que o tempo não apaga e companheirismo.
A meus queridos tios, José Jerônimo (in memoriam) e Bader, e queridos primos,
Nicolai, Thaíse, Jan e Jerônimo, que me acolheram de braços abertos, com muito
carinho e anelos de me ajudar.
A minha querida Estrela, Dayane, por sempre me dar o melhor de seu coração, orientar
meus pensamentos, me inspirar a lutar e alegrar cada pequenino momento da minha
vida.
A Mariela e Suellen, que mesmo sem conhecê-las, me proporcionaram momentos de
reflexão e revalorização do que realmente importa na vida...
Nada deste trabalho teria sido concretizado sem vocês! Um beijo grande e um abraço
carinhoso do Filipe!
v
"A arte de vencer se aprende nas derrotas."
(Simón Bolívar)
vi
AGRADECIMENTOS:
A Deus, por todas as oportunidades, por toda ajuda que recebo na vida, que
mesmo sem merecer, me oferece a cada dia de minha vida! Obrigado pelo
Conhecimento e por todas suas maravilhosas formas de manifestação.
À Maria Elena e Suely, por cada momento compartilhado, pela orientação
objetiva, por acreditarem no nosso audacioso projeto e em minha pessoa! Mas,
sobretudo, pelo carinho e maravilhosa convivência que tivemos ao longo destes anos!
Obrigado por me ajudarem a formar como cientista e ser humano! Adoro vocês!!!!
À Juliana Carnielli, Juliana Silva Cassoli e Pedro Henrique Lemos. Com certeza,
vocês são parte fundamental deste trabalho e me deram suporte em todos experimentos!
Obrigado por seu apoio, amizade e dedicação.
Ao Dr. Michael Richardson, pela boa vontade, conhecimentos, dicas e, é claro,
pelas muitas semanas de seqüenciamento de nossas proteínas. À Dra. Marta do
Nascimento Cordeiro, pelas instruções, por ter gentilmente disponibilizado a infra-
estrutura do seu laboratório para realização de experimentos, pela responsabilidade e
carinho que sempre expressou à minha pessoa.
Ao Roberto Queiroga Lautner e Cibele Rocha-Resende pela amizade e boa
disposição na realização dos ensaios cardiovasculares. Ao Prof. Robson Augusto Souza
dos Santos por ter gentilmente disponibilizado a infra-estrutura do seu laboratório para
realização de experimentos.
À Gabriela Gontijo Montandon e Viviane por toda amizade, ajuda e gentileza
nos experimentos de mitogenicidade. Agradeço especialmente ao Prof. Alfredo Goes,
que disponibilizou a infra-estrutura de seu laboratório para realização destes
experimentos e pacientemente esperou a purificação da lectina.
Ao Jamil, por ter quebrado todos os galhos de meu doutorado! Sem sua ajuda,
certamente ele não iria terminar! Valeu James!!! Ao Prof. Marcelo Santoro, por ceder
gentilmente alguns reagentes e pelas dicas na qualificação. Ao Alexandre e Marcos
Aurélio, por todas as trocas de idéias e ajuda na purificação da lectina!
vii
Ao Prof. Hélder Mauad, pelas instruções e por ter gentilmente disponibilizado a
infra-estrutura do seu laboratório para realização dos experimentos cardiovasculares. À
querida prima Karla Nívea Sampaio, por ter iniciado e perseverado nos ensaios
cardiovasculares com a peçonha do peixe-escorpião. Ao Hélio, Luciana e Diego pela
ajuda nas canulações!
Ao Mário, figura única, que com muita boa vontade coletou os peixes-escorpião
para nosso trabalho. Obrigado também à Rosângela que ajudou nas coletas. Com toda
certeza, vocês foram muitíssimo importantes para realização deste trabalho!
À Karla de Santana Evangelista (Bonitona), Markus, Hannes e família, Alletta e
todos do laboratório de matriz extracelular (atualmente em Frankfurt) e do Institut für
Physiologische Chemie ünd Pathobiochemie (Universitätsklinikum Münster)! E
também a todos os amigos da Alemanha, que mesmo distantes estão guardados em meu
coração... Não dá para esquecer os momentos que passamos juntos! Danke Schön!!!!
Aos amigos do LVTA, que são muitos descrever aqui, mas cada um com sua
forma de ser e companheirismo tem um espaço em meu coração. Obrigado pela
amizade, troca de idéias e cada momento de convivência! Ao Agenor, Rodrigo, Breno e
Adriano por todos os experimentos de espectrometria de massas. Agradeço em especial
ao Daniel, que me ajudou bastante no HPLC, e Rosângela, pelas ajudas nas matrículas
da PG! Também ao Tiago Feltrim, que me apoiou e ajudou bastante em vários
experimentos.
Aos amigos do Laboratório de Química de Proteínas (UFES), Helena, Léo,
Thiago, Amábia, Olavo, Fernanda, pela ajuda nos experimentos e momentos divertidos.
E também à Linda e Rafael, que apesar de não estarem mais lá, me ajudaram bastante!
Aos amigos do Laboratório de Químicas de Proteínas da FUNED, Alcides,
Andrew, Ana, Bárbara, Carol, Edinéia, Siléa que sempre foram muito agradáveis e
prestativos! Também agradeço à Márcia e Eládio por gentilmente me acolherem quando
precisei fazer cromatografias e testes bioquímicos...
Aos professores da pós-graduação, pela confiança em nosso trabalho e estímulos
para aprender e ir adiante. De igual maneira, agradeço aos funcionários da pós-
graduação, em especial à Celinha e Cíntia, por terem feito todo meio de campo na
secretaria quando precisei.
viii
Aos amigos da pós-graduação, Flávio, Gustavo, Bruno, Adriana, Patrícia, Marco
Túlio, Gonzaga, pela amizade e muita dor de cabeça que passamos nas disciplinas.
Ao Julinho e Dona Zulema, por todo apoio técnico, ajuda com os animais e
amizade durante todos estes anos... Agradeço também ao Carlos da Parasitologia, pela
boa vontade em coletar sangue de coelho muitas vezes!
Aos funcionários do Departamento de Ciências Fisiológicas da UFES, Nino,
Elias, Maria Helena, Sônia, Edson, Erli, Flávio e Evaldo, pelos muitos galhos
quebrados. À Profa. Estér M. Nakamura Palácios, por sua dedicação e auxílio para
iniciar o Doutorado.
Aos funcionários e dirigentes da FUNED, Dona Alice, Dário, Ana Valentim,
Thaís, Consuelo, por permitirem meu acesso aos laboratórios, e, é claro, pelo carinho e
apoio para que este doutorado saísse!
Aos Professores Debora, Vera, Jane, Luís Alexandre, Cristiane, Renata, Cláudio,
Adriana, Clésio, Lilian e Bete por todo conhecimento, carinho e dedicação em ajudar
minha pessoa. Também gostaria de agradecer aos amigos do CEA, pelos alegres
momentos que passamos juntos e o apoio nas dificuldades.
Aos amigos, Débora, Rodrigo e Alex, pelos momentos divertidos, pelas provas
que estudamos juntos e sua amizade!
Às professoras da banca, que se gentilmente aceitaram estudar e contribuir para
esta enorme tese... Obrigado pela compreensão e paciência, pois demorei a entregá-la!
À todos familiares e também a todos que nos ajudaram de alguma forma...
Obrigado por estarem sempre juntos comigo! Se não está aqui, saiba que não é menos
importante por causa disto... Desculpe-me porque o tempo é sempre curto e a memória
falha.
UM GRANDE ABRAÇO PARA TODOS E MAIS UMA VEZ, MUITO
OBRIGADO!!!
ix
Sumário
Lista de figuras ............................................................................................................................ xiii
Lista de tabelas ............................................................................................................................ xv
Lista de abreviaturas .................................................................................................................. xvi
Resumo ........................................................................................................................................ xx
Abstract ..................................................................................................................................... xxii
1. Introdução ............................................................................................................................... 1
1.1. A pesquisa sobre peçonhas animais ...................................................................................... 1
1.2. Peixes peçonhentos: classificação e distribuição .................................................................. 2
1.3. O aparato peçonhento dos Scorpaenídeos ........................................................................... 4
1.4. A diversidade de toxinas encontradas em peçonhas de peixes ............................................ 9
1.5. Toxicidade e letalidade das peçonhas de peixes ................................................................. 12
1.6. As principais ações farmacológicas das peçonhas de peixes .............................................. 13
1.6.1. Ação inflamatória e algésica ............................................................................................. 13
1.6.2. Ação neurotóxica .............................................................................................................. 14
1.6.3. Ação cardiovascular .......................................................................................................... 15
1.6.4. Ação hemolítica e citotóxica ............................................................................................. 19
1.7. Citolisinas de peçonhas de peixes ....................................................................................... 22
1.8. Lectinas: definição e propriedades biológicas ..................................................................... 27
1.8.1. Lectinas encontradas em microrganismos ....................................................................... 28
1.8.2. Lectinas de origem vegetal ............................................................................................... 30
1.8.3. Lectinas de origem animal ................................................................................................ 32
1.9. Classificação das lectinas animais ....................................................................................... 35
1.10. Origem, estrutura e evolução do CRD das lectinas tipo C.................................................. 39
1.11. Lectinas encontradas em secreções peçonhentas e mucosas .......................................... 45
1.12. A peçonha do peixe-escorpião preto Scorpaena plumieri ................................................. 46
1.13. Justificativa ........................................................................................................................ 47
1.14. Objetivos ........................................................................................................................... 48
2. Material .................................................................................................................................. 50
2.1. Reagentes ............................................................................................................................ 50
2.2. Animais ................................................................................................................................ 50
2.2.1. Peixes ................................................................................................................................ 51
2.2.2. Ratos e coelhos ................................................................................................................. 51
x
3. Métodos ................................................................................................................................. 53
3.1. Obtenção da peçonha ......................................................................................................... 53
3.2. Dosagem de proteína .......................................................................................................... 53
3.3. Purificação das proteínas com atividade citolítica e hemaglutinante da peçonha de
Scorpaena plumieri ...................................................................................................................... 55
3.3.1. Fracionamento da peçonha bruta de S. plumieri por cromatografia de filtração em gel
convencional e identificação das frações ativas de interesse .................................................... 55
3.3.2. Continuidade do processo de purificação da citolisina .................................................... 55
3.3.2.1. Cromatografia de troca iônica em sistema de moderada pressão ............................... 55
3.3.2.2. Cromatografia de troca iônica em sistema de alta pressão .......................................... 56
3.3.2.3. Cromatografia de filtração em gel em sistema de moderada pressão ......................... 57
3.3.3. Continuidade do processo de purificação da hemaglutinina ........................................... 57
3.3.3.1. Cromatografia de filtração em gel em sistema de moderada pressão ......................... 57
3.3.3.2. Resolução de isoformas da hemaglutinina purificada por cromatografia de fase reversa
em sistema de alta pressão ........................................................................................................ 58
3.4. Caracterização bioquímica das proteínas purificadas ......................................................... 58
3.4.1. Determinação do grau de pureza e massa molecular ...................................................... 58
3.4.1.1. Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS ................................................................... 58
3.4.1.2. Cromatografia de gel filtração ...................................................................................... 60
3.4.1.3. Espectrometria de massas ............................................................................................ 60
3.4.1.4. Cromatografia de fase reversa em sistema de alta pressão .......................................... 61
3.4.2. Determinação da presença de carboidratos ..................................................................... 62
3.4.3. Determinação da estrutura primária ............................................................................... 63
3.4.3.1. Redução e alquilação ..................................................................................................... 63
3.4.3.2. Clivagens enzimáticas da enzima reduzida e alquilada .................................................. 63
3.4.3.3. Determinação da seqüência de aminoácidos ................................................................ 64
3.5. Caracterização farmacológica das proteínas purificadas .................................................... 64
3.5.1. Ensaio de atividade hemolítica direta .............................................................................. 65
3.5.1.1. Preparação da suspensão de eritrócitos ........................................................................ 65
3.5.1.2. Mapeamento da atividade hemolítica ........................................................................... 65
3.5.1.3. Determinação da EC
50
.................................................................................................... 66
3.5.1.4. Ensaios de proteção ...................................................................................................... 66
3.5.1.5. Determinação do percentual de hemólise causado pela peçonha ou toxina ............... 67
3.5.2. Reatividade vascular ......................................................................................................... 67
3.5.2.1. Preparação dos anéis de aorta ...................................................................................... 67
xi
3.5.2.2. Protocolo experimental ................................................................................................. 68
3.5.3. Ensaio de hemaglutinação ............................................................................................... 68
3.5.4. Atividade mitogênica sobre células mononucleares humanas ........................................ 69
3.5.5. Agregação plaquetária ..................................................................................................... 71
3.5.6. Análise estatística dos dados ............................................................................................ 71
4. Resultados .............................................................................................................................. 73
4.1. Purificação ........................................................................................................................... 73
4.1.1. Primeira etapa: cromatografia de filtração em gel em coluna de Sephacryl S200 HR .... 73
4.1.2. Continuidade da purificação da citolisina presente na peçonha de Scorpaena plumieri 76
4.1.2.1. Segunda etapa: cromatografia de troca aniônica em coluna MonoQ 5/5 HR .............. 76
4.1.2.2. Terceira etapa: cromatografia de troca aniônica em coluna MiniQ 4.6/5 PE ............... 76
4.1.2.3. Quarta etapa: cromatografia de filtração em gel em coluna Superose 12 10/30 GL ... 76
4.1.3. Continuidade da purificação da hemaglutinina presente na peçonha de Scorpaena
plumieri ....................................................................................................................................... 79
4.1.3.1. Segunda etapa: cromatografia de filtração em gel em coluna Superose 12 ................ 79
4.1.3.2. Terceira etapa: cromatografia de fase reversa em coluna Source 5ST ......................... 79
4.2. Caracterização bioquímica das proteínas purificadas ......................................................... 87
4.2.1. Análise da homogeneidade e da massa molecular .......................................................... 87
4.2.2. Determinação de carboidratos ......................................................................................... 92
4.2.3. Reatividade cruzada de Sp-CTx com antisoro contra peçonha de peixes-pedra ............. 92
4.2.4. Seqüenciamento N-terminal ............................................................................................ 92
4.2.5. Estrutura primária ............................................................................................................ 98
4.3. Caracterização Farmacológica de Sp-CTx .......................................................................... 100
4.3.1. Atividade hemolítica ....................................................................................................... 100
4.3.2. Reatividade vascular ....................................................................................................... 100
4.4. Caracterização farmacológica de Sp-Lec ........................................................................... 107
4.4.1. Hemaglutinação ............................................................................................................. 107
4.4.2. Agregação plaquetária ................................................................................................... 107
4.4.3. Atividade mitogênica sobre leucócitos ...................................................................... 107
5. Discussão .............................................................................................................................. 109
5.1. Purificação da toxina citolítica .......................................................................................... 110
5.2. Caracterização bioquímica de Sp-CTx ............................................................................... 115
5.3. Caracterização farmacológica de Sp-CTx ........................................................................... 118
5.4. Purificação da lectina tipo C .............................................................................................. 122
xii
5.5. Caracterização bioquímica de Sp-Lec ................................................................................ 126
5.6. Caracterização farmacológica de Sp-Lec ........................................................................... 131
6. Considerações finais ............................................................................................................ 133
7. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 135
8. Anexos ................................................................................................................................... 159
Anexo I - Curva de calibração para estimativa da massa molecular de Sp-CTx por cromatografia
de filtração em gel. .................................................................................................................... 159
Anexo II - Curva de calibração para estimativa da massa molecular de Sp-CTx por SDS-PAGE.
................................................................................................................................................... 160
Anexo III - Resumos em Congresso ........................................................................................... 161
Anexo IV - Artigo submetido ao Toxicon ................................................................................... 169
Anexo V - Artigo publicado no periódico Toxicon (não relacionado à tese) ............................. 196
Anexo VI - Capitulo de livro publicado ...................................................................................... 199
xiii
Lista de Figuras
Figura 1. ESPÉCIMES REPRESENTANTES DOS PRINCIPAIS GÊNEROS DE PEIXES PEÇONHENTOS
DA FAMÍLIA SCORPAENIDAE. ...................................................................................................... 3
Figura 2. O PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri. .................................................................... 5
Figura 3. APARATO PEÇONHENTO DO PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri. .......................... 7
Figura 4. ILUSTRAÇÃO DO MODO DE INOCULAÇÃO DA PEÇONHA DE PEIXES, COMO EXEMPLO
O PEIXE PEDRA ............................................................................................................................. 8
Figura 5. PRINCIPAIS TIPOS DE LECTINAS ANIMAIS. .................................................................. 36
Figura 6. GRUPOS DE LECTINAS TIPO C E SEUS DOMÍNIOS ESTRUTURAIS. ............................... 38
Figura 7. ESQUEMA DA EVOLUÇÃO DOS DOMÍNIOS SEMELHANTES ÀS LECTINAS TIPO C (CTLD).
..................................................................................................................................................... 40
Figura 8. ESTRUTURA DO DOMÍNIO DE RECONHECIMENTO DE CARBOIDRATO (CRD) DAS
LECTINAS TIPO C. ....................................................................................................................... 42
Figura 9. SITIO DE RECONHECIMENTO DE CARBOIDRATOS DOS CRDs. .................................... 43
Figura 10. PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri. ..................................................................... 52
Figura 11. EXTRAÇÃO DA PEÇONHA. .......................................................................................... 54
Figura 12. FLUXOGRAMA DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE Sp-CTx e Sp-Lec A PARTIR DA
PEÇONHA DE Scorpaena plumieri. ............................................................................................. 74
Figura 13. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FILTRAÇÃO EM GEL DA FRAÇÃO SOLÚVEL DA
PEÇONHA DO PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri. ............................................................... 75
Figura 14. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE TROCA ANIÔNICA DA FRAÇÃO CF-I. ...................... 77
Figura 15. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE TROCA ANIÔNICA DA FRAÇÃO CF-II. ..................... 78
Figura 16. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FILTRAÇÃO EM GEL DA FRAÇÃO CF-III. .................... 80
Figura 17. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DA PEÇONHA DE Scorpaena plumieri (SPB), DAS FRAÇÕES
CITOLÍTICAS SEMI-PURIFICADAS (CF-I, CF-II E CF-III) E DA CITOLISINA ISOLADA (Sp-CTx) SOBRE
ERITRÓCITOS DE COELHO. .......................................................................................................... 82
Figura 18. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FILTRAÇÃO EM GEL DA FRAÇÃO V. .......................... 83
Figura 19. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA DE Sp-Lec. ..................................... 84
Figura 20. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA DE Sp-CTx. ..................................... 88
Figura 21. PERFIL ELETROFORÉTICO (SDS-PAGE) DA PEÇONHA BRUTA DE Scorpaena plumieri E
DAS FRAÇÕES OBTIDAS NAS DIVERSAS ETAPAS DE PURIFICAÇÃO DA CITOLISINA. ................... 89
Figura 22. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-CTx. .................................................................. 90
Figura 23. PERFIL ELETROFORÉTICO (SDS-PAGE) DA FRACAO V E DA HEMAGLUTININA
PURIFICADA DA PEÇONHA DE Scorpaena plumieri (Sp-Lec). ..................................................... 91
Figura 24. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec. .................................................................. 93
Figura 25. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec I (A) e II (B). ............................................... 94
xiv
Figura 26. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec III (A) e IV (B). ............................................ 95
Figura 27. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec V (A) e VI (B). ............................................. 96
Figura 28. REATIVIDADE DO ANTIVENENO DA PEÇONHA DE PEIXE-PEDRA (SFAV) COM A
PEÇONHA DE Scorpaena plumieri (SPB) E Sp-CTx. ..................................................................... 97
Figura 29. SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE Sp-Lec V. ............................................................. 99
Figura 30. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE Sp-CTx SOBRE ERITRÓCITOS DE COELHO. .................. 101
Figura 31. EFEITO DE SFAV E DA TRIPSINIZAÇÃO DE HEMÁCIAS NA ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE
Sp-CTx. ...................................................................................................................................... 102
Figura 32. EFEITO DE Sp-CTx SOBRE ANÉIS ISOLADOS DE AORTA DE RATO. ........................... 103
Figura 33. EFEITO RELAXANTE INDUZIDO POR Sp-CTx EM ANÉIS ISOLADOS DE AORTA DE
RATOS. ...................................................................................................................................... 104
Figura 34. EFEITO DO INIBIDOR (L-NAME) DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE (NOS) NO
RELAXAMENTO INDUZIDO POR Sp-CTx EM ANÉIS DE AORTA ISOLADOS DE RATOS. .............. 105
Figura 35. EFEITO DO INIBIDOR DE CICLOOXIGENASES (INDOMETACINA) NO RELAXAMENTO
INDUZIDO POR Sp-CTx EM ANÉIS ISOLADOS DE AORTA DE RATOS. ........................................ 106
Figura 36. EFEITO DA PHA, FRAÇÃO V e Sp-Lec SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE LEUCÓCITOS
HUMANOS. ............................................................................................................................... 108
Figura 37. COMPARAÇÃO DOS ESPINHOS DAS NADADEIRAS DORSAIS DE DIFERENTES GÊNEROS
DE PEIXES PEÇONHENTOS DA FAMÍLIA SCORPAENIDAE. ......................................................... 114
Figura 38. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA HEMAGLUTINAÇÃO PRODUZIDA POR
LECTINAS. ................................................................................................................................. 123
Figura 39. ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE Sp-Lec V COM A DE OUTRAS
LECTINAS TIPO C. ...................................................................................................................... 128
xv
Lista de tabelas
TABELA I. ALGUMAS PROPRIEDADES DAS PEÇONHAS DE PEIXES E DAS TOXINAS PURIFICADAS.
..................................................................................................................................................... 10
TABELA II. SUMÁRIO DOS TIPOS DE LECTINAS. .......................................................................... 37
TABELA III. PURIFICAÇÃO DE Sp-CTx (Scorpaena plumieri Cytolytic Toxin) A PARTIR DA
PEÇONHA DO PEIXE-ESCORPIÃO. ............................................................................................... 81
TABELA IV. PURIFICAÇÃO DE Sp-Lec (Scorpaena plumieri Lectin) A PARTIR DA PEÇONHA DO
PEIXE-ESCORPIÃO. ...................................................................................................................... 85
TABELA V. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS E ABUNDÂNCIA RELATIVA DAS ISOFORMAS DE Sp-Lec.
..................................................................................................................................................... 86
TABELA VI. COMPARAÇÃO DAS PROPRIEDADES ESTRUTURAIS E POTÊNCIA HEMOLÍTICA DE Sp-
CTx COM AS DE CITOLISINAS/TOXINAS PURIFICADAS DE PEÇONHAS DE PEIXES. ................... 117
TABELA VII. COMPARAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS DE Sp-Lec V COM AS DE LECTINAS TIPO C DE
PEIXES. ...................................................................................................................................... 130
xvi
Lista de Abreviaturas
aa Resíduo de aminoácido
ACN Acetonitrila
ADP Difosfato de adenosina
ANOVA Análise de variância
ATP Trifosfato de adenosina
CF-I Fração citolítica I
CF-II Fração citolítica II
CF-III Fração citolítica III
ConA Concanavalina A
CRDs Domínios de reconhecimento de carboidrato
CTLDs Domínios semelhantes às lectinas do tipo C
CTLPs Proteínas contendo domínios semelhantes às lectinas do tipo C
Da Dalton
DMEM Meio águia modificado da Dubelcco
DL
50
Dose Letal mediana
DTT Ditiotreitol
EAC Carcinomas ascíticos de Ehrlich
EC
50
Metade da concentração máxima efetiva
EDDnp Etilenodiamina 2,4-dinitrofenil
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA Ensaio imuno adsorvente com enzima ligada
EPM Erro padrão da média
FPLC Rápida cromatografia líquida de proteínas
xvii
Gal Galactose
Glc Glicose
GNA Aglutinina da campânula branca
HA Hemaglutinina
HPLC Cromatografia líquida de alta pressão
H
2
S Gás sulfídrico
Man Manose
GlcNAc N-acetil-glicosamina
GalNAc N-acetil-galactosamina
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
i.v. Intravenoso
i.p. Intraperitoneal
kDa Quilodalton
LDL Lipoproteína de baixa densidade
L-NAME N
G
-nitro-L-arginina metil éster
MALDI-TOF Ionização/dessorpção a laser assistida por matriz-tempo de vôo
MBP-A Proteína A ligante de manose
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MS Espectrometria de massas
MTT Metiltetrazólio
m/z relação massa/carga
NaCl Cloreto de sódio
neoVTX neoverrucotoxina
NK Células natural killer
xviii
NO Óxido nítrico
NOLA N-nitro-L-arginina
NOS Óxido nítrico sintase
PAS Ácido periódico-reagente de Schiff
PB Tampão fosfato de sódio
PBS Tampão fosfato de sódio com salina
Peptídeo FV Peptídeo purificado da peçonha de peixe-leão
PHA Aglutinina do feijão vermelho
PNA Aglutinina do amendoim
PRP Plasma rico em plaquetas
PPP Plasma pobre em plaquetas
RA Reduzida e alquilada
SA-HT Toxina hemorrágica purificada da peçonha de Scatophagus argus
SBA Aglutinina das sementes de soja
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
SFAV Antiveneno contra peçonha de peixes-pedra
SFHYA1 Hialuronidase A1 purificada da peçonha de peixe-pedra
SPB Solução da peçonha bruta
Sp-CTx Toxina citolítica purificada da peçonha de Scorpaena plumieri
Sp-GP Protease gelatinolítica purificada da peçonha de Scorpaena plumieri
Sp-H Hialuronidase purificada da peçonha de Scorpaena plumieri
Sp-Lec Lectina purificada da peçonha de Scorpaena plumieri
SNARE Receptor protéico de ligação a proteína de fusão sensível a N-
etilmaleimida solúvel
SNTX Stonustoxina
TBS Tampão Tris-HCl contendo salina
xix
TEMED N,N,N’,N’ – tetrametiletilenodiamina
TFA Ácido trifluoroacético
TLY Trachynilysina
TmC4-47.2 Toxina purificada da peçonha de Thalassophryne maculosa
TNF Fator de necrose tumoral
Toxina-PC Toxina purificada da peçonha de Plotosus canius
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
VTX Verrucotoxina
VVA Aglutinina da ervilha peluda
WGA Aglutinina do gérmen de trigo
xx
Resumo
Este trabalho contribui para a parcial caracterização bioquímica e farmacológica
de duas proteínas bioativas da peçonha do peixe-escorpião do Atlântico Scorpaena
plumieri: uma toxina citolítica, Sp-CTx, e uma lectina tipo C, Sp-Lec. A citolisina foi
purificada pela combinação de cromatografias de filtração em gel e de troca iônica.
Estudos físico-químicos indicam que Sp-CTx é uma glicoproteína de 121kDa dimérica,
apresentando subunidades de aproximadamente 65kDa. Esta proteína exibe potente
atividade hemolítica sobre eritrócitos lavados de coelho (EC
50
= 0,46nM), a qual foi
fortemente reduzida após tratamento com anti-soro preparado contra a peçonha de
peixes-pedra (SFAV). Esta reatividade cruzada foi confirmada por western-blotting. Em
anéis de aorta isolados de rato e pré-contraídos com fenilefrina, Sp-CTx (0,001-1nM)
causou resposta bifásica: uma fase inicial relaxante concentração- e endotélio-
dependente, seguida de uma fase contrátil. A atividade vasorelaxante foi abolida por L-
NAME, demonstrando o envolvimento de óxido nítrico na resposta. Subseqüentemente,
uma proteína com atividade hemaglutinante sobre eritrócitos lavados de coelho, Sp-Lec,
foi purificada do extrato do aparato peçonhento de S. plumieri por duas cromatografias
de filtração em gel. Análise de Sp-Lec por cromatografia de fase reversa e por
espectrometria de massas (MALDI-TOF) evidenciou seis componentes com semelhante
retenção (39,2-42,2% ACN) e massas moleculares (15.850-16.981Da), sugerindo que se
tratam de isoformas. A seqüência de aminoácidos de um destes compostos, Sp-Lec V,
foi determinada e exibiu significantes similaridades com lectinas tipo C encontradas no
muco cutâneo de peixes. Esta molécula também apresenta o motivo QPD em sua
estrutura primária, sugerindo ligação específica à β-D-galactose. Em contraste a outras
lectinas tipo C, a atividade de Sp-Lec foi independente de íons Ca
+2
. Além disso, esta
lectina induziu a proliferação de células mononucleares de sangue periférico humano
xxi
(PBMCs). Em conclusão, este trabalho descreve, pela primeira vez, o isolamento de
uma proteína citolítica/vasoativa de uma peçonha de peixe-escorpião e de uma lectina
tipo C do extrato do aparato peçonhento de um peixe. Os dados sugerem que Sp-CTx
exibe similaridades estruturais e funcionais com toxinas hemolíticas de peixes pedra,
previamente publicadas. Estudos futuros poderão contribuir para elucidar o papel destas
proteínas no aparelho venenífero do peixe-escorpião e suas conseqüências nos acidentes
humanos, abrindo perspectivas para a descoberta de novas proteínas que podem
apresentar potenciais aplicações farmacológicas, ou constituírem ferramentas úteis para
estudos em Farmacologia.
Palavras-chave: Peçonha de peixe-escorpião, Scorpaena plumieri, citolisina, proteína
vasoativa, lectina tipo C.
xxii
Abstract
This work describes the partial pharmacological and biochemical
characterization of two bioactive proteins from the venom of the Atlantic scorpionfish
Scorpaena plumieri: a cytolytic toxin, Sp-CTx, and a C-type lectin, Sp-Lec. The
cytolysin has been purified by gel filtration and anion exchange chromatographies.
Physicochemical studies have indicated Sp-CTx as a dimeric glycoprotein of 121kDa
with subunits of about 65kDa. Such protein has proved to have a potent hemolytic
activity on washed rabbit erythrocytes (EC
50
0.46nM), whose effect was strongly
reduced after treatment with antivenom raised against stonefish venom. This cross-
reactivity has been confirmed by western-blotting. Sp-CTx (0.001-1nM) has caused a
biphasic response on phenylephrine pre-contracted rat aortic rings: an endothelium- and
concentration-dependent relaxation phase followed by a contractile phase. The
vasorelaxant activity has been abolished by L-NAME, demonstrating the involvement
of nitric oxide on the response. Subsequently, a protein with hemagglutinating activity
(Sp-Lec) upon washed rabbit erythrocytes was purified from the venom apparatus
extract of the S. plumieri by two gel filtration chromatographies. Analyses of Sp-Lec by
reverse phase chromatography and mass spectrometry (MALDI-TOF) showed six
components with very similar retention (39.2-42.2% ACN) and molecular masses
(15,850-16,981Da), being probably isoforms. The amino acid sequence of one of these
compounds, Sp-Lec V, showed that this protein exhibits significant sequence
similarities with C-type lectins from the mucous skin secretion of other fish. This
protein also presents a QPD motif, suggesting specific binding to β-D-galactose. In
contrast to other C-type lectins the activity of Sp-Lec was independent of Ca
+2
.
Additionally, this lectin induced proliferation of human periferic blood mononuclear
cells (PBMCs). In conclusion, we report, for the first time, the isolation of a
xxiii
cytolytic/vasoactive protein (Sp-CTx) from scorpionfish venom and of a C-type lectin
from a fish venom apparatus. The data suggest structural and functional similarities
between Sp-CTx and previously published stonefish hemolytic toxins. Further studies
will contribute to elucidate the role of these proteins on fish venom apparatus and their
consequences in human accidents, opening perspectives to the discovery of novel
proteins which could present potential pharmacological applications, or constitute
useful tools to studies in Pharmacology.
Key words: Scorpionfish venom, Scorpaena plumieri, cytolysin, vasoactive protein, C-
type lectin.
1
1. Introdução
1.1. A pesquisa sobre peçonhas animais
Animais peçonhentos de diferentes filos desenvolveram poderosas peçonhas,
arsenais químicos, substâncias capazes de atordoar, paralisar ou matar outros
organismos (McCormick e Meinwald, 1993). A peçonha pode ter papel essencial para o
ataque, a captura, e para a digestão do alimento, ou contribuir para a defesa do animal
contra predadores ou agressores (Russell, 1996). O interesse inicial no estudo de
peçonhas era principalmente terapêutico, devido à gravidade e ao número relativamente
alto dos acidentes. Entretanto, a busca exclusiva de tratamento para o envenenamento
destes estudos foi substituída pela pesquisa de moléculas biologicamente ativas
presentes nestas peçonhas, as quais apresentam potencial como fonte de agentes
farmacológicos e/ou terapêuticos e também como instrumentos de investigação de
mecanismos moleculares implicados em suas ações.
De maneira geral, as peçonhas animais consistem de uma mistura complexa de
substâncias de composição química diversificada e variado espectro de ação
farmacológica. Dentre estas substâncias encontram-se enzimas, neurotransmissores,
ácidos nucléicos, sais, monoaminas, toxinas protéicas, toxinas não-protéicas e outros
compostos orgânicos ainda não identificados (Figueiredo, 1995; Mebs, 2002).
Há muitas pesquisas caracterizando química e farmacologicamente peçonhas de
animais terrestres (serpentes, escorpiões e aranhas). Entretanto, o estudo de peçonhas de
animais marinhos, particularmente peixes, está apenas iniciando. Este fato baseia-se,
principalmente, na dificuldade da captura dos espécimes marinhos (Khoo, 2002), da
extração da peçonha e também pelas pesquisas se concentrarem em venenos de espécies
terrestres, que apresentam maior interesse epidemiológico (Church e Hodgson, 2002a).
2
Outro importante fator limitante da pesquisa é a natureza lábil destas peçonhas
(Schaeffer et al., 1971; Carrijo et al., 2003).
Portanto, as peçonhas de animais marinhos representam uma fonte ainda
inexplorada de novos compostos farmacológicos que despertam interesse por seu
potencial terapêutico e/ou como ferramentas de estudo de sistemas biológicos (Church e
Hodgson, 2002a).
1.2. Peixes peçonhentos: classificação e distribuição
Um grande número de animais peçonhentos e venenosos é encontrado em
ambientes aquáticos distribuídos por todo o mundo. Dentre estes animais, os peixes
peçonhentos despertam especial interesse, pois representam mais de 50% dos
vertebrados peçonhentos e comumente estão envolvidos em acidentes com humanos
(Russell, 1965; Church e Hodgson, 2002a; Haddad Jr. et al., 2003; Smith e Wheeler,
2006).
Os peixes peçonhentos mais perigosos pertencem à família Scorpaenidae, e, de
acordo com a morfologia do aparato peçonhento, são classificados em três gêneros
principais (figura 1): Pterois (peixes-leão), Synanceja (peixes-pedra) e Scorpaena
(peixes-escorpião) (Russell, 1965; Keegan e Macfarlane, 1963), os quais podem ser
considerados como subfamílias: Pteroinae, Synanceinae e Scorpaeninae (Eschmeyer,
1998). Os peixes pedra e escorpião são animais de movimentos lentos, e costumam ser
encontrados em mimetismo com ambientes rochosos e arenosos pelos mares tropicais e
temperados de todo o mundo (Russell, 1965; Maretic, 1988; Haddad Jr., 2000).
Os peixes-leão e os peixes-pedra (dos gêneros Pterois e Synanceja) são
encontrados na região Indo-Pacífica, não ocorrendo no Oceano Atlântico (Haddad Jr. et
Figura 1.
ESPÉCIMES REPRESENTANTES DOS
PEIXES PEÇONHENTOS DA FAMÍLIA SCORPAENIDAE. (A)
leão). (B) Synanceja
(peixes
Sharkdivers, 2009. (B)
Redsea
A
B
C
ESPÉCIMES REPRESENTANTES DOS
PEIXES PEÇONHENTOS DA FAMÍLIA SCORPAENIDAE. (A)
Pterois
(peixes
-pedra). (C) Scorpaena (peixes-escorpião)
. Fontes: (A)
Redsea
, 2009 (C) Bolhas, 2009.
3
PRINCIPAIS GÊNEROS DE
Pterois
(peixes-
. Fontes: (A)
4
al., 2003). Entretanto, no Brasil são encontrados espécimes de oito gêneros da família
Scorpaenidae (Nomura, 1984; Carvalho-Filho, 1999), sendo que somente peixes do
gênero Scorpaena estão associados com envenenamentos em seres humanos (Haddad
Jr., 2000). Segundo Figueiredo e Menezes (1980), as espécies do gênero Scorpaena
encontradas na costa brasileira são:
- S. plumieri Bloch, 1789;
- S. brasiliensis Cuvier, 1829;
- S. grandicornis Cuvier e Vallenciennes, 1829;
- S. Isthmensis Meek e Hildebrand, 1928;
- S. dispar Longley e Hildebrand, 1940.
A espécie S. plumieri (figura 2), cuja peçonha é objeto de estudo do presente
trabalho, é uma das mais comuns da costa brasileira (Figueiredo e Menezes, 1980;
Carvalho-Filho, 1999), ocorrendo também na Flórida, Golfo do México, Bahamas,
Caribe e Bermudas (Humann, 1994). Este peixe-escorpião, popularmente conhecido
como moréia-atí ou mangangá, é o mais venenoso do litoral brasileiro, sendo
responsável por muitos acidentes ocorridos com pescadores e mergulhadores. Assim
como outros peixes peçonhentos, os animais desta espécie têm o hábito de permanecer
imóveis e parcialmente escondidos por longos períodos de tempo e são comumente
encontrados dentro ou perto de rochas, recifes de coral ou algas marinhas, com os quais
costumam se camuflar de maneira muito eficaz (Russel, 1965; Schaeffer et al., 1971;
Khoo, 2002), o que predispõe a ocorrência de acidentes (Haddad Jr., 2000).
1.3. O aparato peçonhento dos Scorpaenídeos
Figura 2. O PEIXE-
ESCORPIÃO S
habitat, próximo a rochas,
corais e algas. A coloração de sua pele
microrganismos colonizadores da mesma
Starfish, 2009.
A
B
ESCORPIÃO S
corpaena plumieri. Fotos
de espécimes em seu
corais e algas. A coloração de sua pele
(A),
juntamente com
microrganismos colonizadores da mesma
(B), permitem sua
camuflagem.
5
de espécimes em seu
juntamente com
camuflagem.
Fonte:
6
Os peixes peçonhentos usam sua peçonha primariamente para propósitos defensivos
(Church e Hodgson, 2002a). O aparato peçonhento destes animais é constituído por
espinhos (figura 3) encontrados nas nadadeiras dorsais (11-17), pélvicas (2) e anais (3)
(Haddad Jr. et al., 2003). Alguns peixes apresentam espinhos operculares e/ou peitorais
(Williamson, 1995), ocorrendo relato de apenas uma espécie (Meiacanthus
nigrolineatus) com dentes caninos inoculadores de peçonha (Fishelson, 1974); espinhos
caudais são encontrados em arraias (Haddad Jr., 2000). O complexo secretor da peçonha
é encontrado nas cavidades anterolaterais dos espinhos, os quais são envolvidos por
membranas tegumentares (Russell, 1965; Smith e Wheeler, 2006).
O envenenamento ocorre quando a vítima pisa ou manipula o peixe: a bainha
tegumentária é deslocada para baixo, os espinhos tornam-se eretos e perfuram a pele da
vítima, liberando a peçonha no ferimento (figura 4) (Russell, 1965; Schaeffer et al.,
1971; Gwee et al., 1994; Hahn e O’Connor, 2000; Church e Hodgson, 2002; Khoo,
2002; Haddad Jr. et al., 2003). Os sintomas mais pronunciados do envenenamento são
dor excruciante e edema. No entanto, estas peçonhas também desencadeiam potentes
desordens sobre o sistema cardiorrespiratório, produzindo distúrbios
eletrocardiográficos, arritmias, taquicardia, hipotensão e dificuldades respiratórias
(Russell, 1965; Carlson et al., 1971; Abdun-Nur et al., 1981; Gwee et al., 1994; Garnier
et al., 1995). Em casos severos, o envenenamento pode levar a fatalidades (Austin et al.,
1961; Saunders et al., 1962).
Geralmente, o tratamento é sintomático e os efeitos locais são parcialmente
revertidos por imersão do membro afetado em água quente. Às vezes é necessário o uso
de infiltrações anestésicas ou mesmo de opiáceos (Haddad Jr., 2000). No caso de
envenenamento com peçonhas de peixes-pedra (Synanceja spp.), as quais são reportadas
Figura 3
. APARATO PEÇONHENTO DO PEIXE
(A) Espinhos dorsais envolvidos por membranas tegumentares. (B) Espinhos dissecados
mostrando o tecido cinzento no qual se encontram as glândulas produtoras da p
(setas)
. Fonte: Haddad Jr., 2000.
A
B
. APARATO PEÇONHENTO DO PEIXE
-ESCORPIÃO S
corpaena plumieri
(A) Espinhos dorsais envolvidos por membranas tegumentares. (B) Espinhos dissecados
mostrando o tecido cinzento no qual se encontram as glândulas produtoras da p
. Fonte: Haddad Jr., 2000.
7
corpaena plumieri
.
(A) Espinhos dorsais envolvidos por membranas tegumentares. (B) Espinhos dissecados
mostrando o tecido cinzento no qual se encontram as glândulas produtoras da p
eçonha
8
Figura 4. ILUSTRAÇÃO DO MODO DE INOCULAÇÃO DA PEÇONHA DE
PEIXES, COMO EXEMPLO O PEIXE PEDRA. Adaptado de Smith (2006).
9
como as mais tóxicas dentre as peçonhas de peixes (Russell, 1965; Khoo, 2002), pode
ser necessária terapia com antisoro específico (Stonefish Antivenom - SFAV), disponível
comercialmente na Austrália (Gwee et al., 1994).
1.4. A diversidade de toxinas encontradas em peçonhas de peixes
Assim como descrito para peçonhas de animais terrestres, as peçonhas de peixes
consistem de uma miríade de moléculas/substâncias biologicamente ativas, incluindo
proteínas enzimáticas e não-enzimáticas, peptídeos, aminas biogênicas e substâncias
ainda desconhecidas. Grande parte das toxinas bioativas são proteínas termolábeis de
alta massa molecular, o que dificulta sua purificação e estudo (Garnier et al., 1995;
Church e Hodgson, 2002a). Conseqüentemente, poucas proteínas (cerca de uma dúzia)
foram purificadas com sucesso a partir destas peçonhas e caracterizadas molecularmente
(tabela I). Esta quantidade é pequena quando considerado o número de peixes
peçonhentos já descritos (Church e Hodgson, 2002a; Smith e Wheeler, 2006; Figueiredo
et al., 2009).
Uma grande variedade de atividades enzimáticas foi descrita em peçonhas de
peixes, dentre as quais estão incluídas a esterásica (Perrière et al., 1988; Garnier et al.,
1995; Hopkins e Hodgson, 1998; Khoo et al., 1992), fosfodiesterásica (Khoo et al.,
1992; Hopkins e Hodgson, 1998), colinesterásica (Haavaldsen e Fonnum, 1963; Khoo
et al., 1992), fosfatásica (Hopkins e Hodgson, 1998), hialuronidásica (Khoo et al., 1992;
Garnier et al., 1995; Hopkins e Hodgson, 1998; Ng et al., 2005; Cassoli et al, 2008) e
peptidásica (Khoo et al., 1992; Garnier et al., 1995; Haddad Jr. et al., 2004; Carrijo et
al., 2005; Andrich, 2005). Apesar da peçonha da arraia dulcícola Potamotrygon falkneri
apresentar componentes com atividade fosfolipásica (Haddad Jr. et al., 2004), a maioria
dos peixes peçonhentos parece desprovida deste tipo de enzima em suas secreções
10
TABELA I. ALGUMAS PROPRIEDADES DAS PEÇONHAS DE PEIXES E DAS TOXINAS PURIFICADAS.
Família
Espécie DL
50
da peçonha* Toxinas Aspectos estruturais Atividade descrita Seqüência N-terminal Referências
Scorpaenidae Synanceja horrida
Peixe-pedra Indiano
0,30µg /kg (i.v.)
0,36µg /kg (i.v.)
1,60µg/g (i.p.)
SNTX 148kDa
2 subunidades
α 79kDa (702aa)
β 71kDa (699aa)
pI 6,9
Letalidade
DL
50
17ng/g (i.v.)*
Cardiovascular
vasorelaxante (EC
50
133ng/mL)
hipotensiva
Hemolítica (EC
50
60ng/mL)**
Neuromuscular
Nociceptiva
Edematogênica
α Bloqueado
β
1
PSDILVVAAL
10
11
GRPFTLGMLY
20
21
DARNDKLIPG
30
Poh et al. (1991)
Khoo et al. (1992)
Low et al. (1993)
Low et al. (1994)
Khoo et al. (1995)
Sung et al. (2002)
SFHYA1 52kDa
Glicosilada
pI 9,2
Hialuronidásica
1
LPWTDPPLHP
10
Poh et al. (1992)
Ng et al. (2005)
Synanceja trachynis
Peixe-pedra estuarino
1,60mg/kg (i.p.) TLY 158kDa
2 subunidades
α 76kDa
β 83kDa
Letalidade
Cardiovascular
Hemolítica (EC
50
2,5-3,3ng/mL)**
Neuromuscular
Edematogênica
α Bloqueado
β
1
PSDILVVAAL
10
11
GRPFTLGMLY
20
21
DARNDKLIPG
30
Kreger (1991)
Colasante et al. (1996)
Sauviat et al. (2000)
Synanceja verrucosa
Peixe-pedra de recifes
2,50µg/g (i.v.) VTX 322kDa
Glicosilada
4 subunidades
2α 83kDa
2β 78kDa (695aa)
Letalidade
DL
50
<40ng/g (i.v.)*
Cardiovascular
hipotensiva
Hemolítica (EC
50
5,5ng/mL)**
α nd***
β
1
PSDILVVAAL
10
11
GRPFTLGMLY
20
21
DARNDKLIPG
30
Garnier et al. (1995)
Garnier et al. (1997a,b)
neoVTX 166kDa
2 subunidades
α 75kDa (702aa)
β 80kDa (699aa)
Letalidade
Hemolítica (EC
50
83ng/mL)**
α Bloqueado
β
1
PSDILVVAAL
10
11
GRPFTLGMLY
20
21
DARNDKLIPG
30
Ueda et al. (2006)
Pterois volitans
Peixe-leão
42,50µg/kg (i.p.) Peptídeo FV 7,6kDa Inibe crescimento de células
tumorais in vitro
Induz seletivamente apoptose em
células tumorais
- Sri Balasubashini et al.
(2006a,b)
Scorpaena plumieri
Peixe-escorpião
0,28mg/kg (i.v.) Sp-GP
80kDa Proteolítica (gelatinolítica) Bloqueado Carrijo et al. 2005
Sp-H 77kDa
Glicosilada
Hialuronidásica
1
APADKVAWGV
10
11
KKXKLLXKXXXVMA
24
Cassoli (2008)
11
Trachinidae
Trachinus draco
Peixe-aranha maior
1,80µg/g (i.v.)
Dracotoxina
105kDa
Letalidade
Hemolítica (EC
50
3ng/mL)**
Neuromuscular
-
Chhatwal e Dreyer (1992a,b)
Trachinus vipera
Peixe-aranha menor
- Trachinina 324kDa
Glicosilada
4 subunidades
idênticas (81kDa)
Letalidade
DL
50
<0,1µg/g (i.v.)*
- Perriere et al. (1988)
Tetrarogidae Nothestes robusta
Bullrout
- Nocitoxina 170kDa Nociceptiva - Hahn e O’Connor (2000)
Plotosidae Plotosus canius
Peixe-gato Indiano
3,90mg/kg (i.p.) Toxina-PC 15kDa Letalidade
DL
50
225µg/kg (i.v.)*
- Auddy et al (1994)
Auddy et al (1995)
Scatophagidae Scatophagus argus
Peixe-pintado
9,30mg/kg (i.v.)
9,80mg/kg (i.p.)
SA-HT 18kDa Neuromuscular
Hemorrágica (em estomago)
Nociceptiva
Edematogênica
- Karmakar et al., 2004
Muhuri et al., 2005
Batrachoididae Thalassophryne maculosa
Peixe-sapo
4,93mg/kg (i.p.) TmC4-47.2 15.161Da
15.154Da
Neuromuscular
Miotóxica
- Sosa-Rosales (2005a,b)
Thalassophryne nattereri
Peixe-sapo brasileiro
4,54mg/kg (i.p.) Família
Natterina
(1,2,3 e 4)
≈35-38kDa Proteolítica (cininogenásica)
Edematogênica
Nociceptiva
- Magalhães et al. (2005)
Lopes-Ferreira et al. (1998)
Lopes-Ferreira et al. (2004)
* em camundongos.
** sobre eritrócitos de coelho.
*** nd, não determinada.
Família
Espécie DL
50
da peçonha* Toxinas Aspectos estruturais Atividade descrita Seqüência N-terminal Referências
Continuação
12
peçonhentas (Shiomi et al., 1989; Khoo et al.,1992; Hopkins et al., 1994; Lopes-
Ferreira et al.,1998; Hopkins e Hodgson, 1998; Hahn e O’Connor, 2000; Cassoli,
comunicação pessoal).
Além dos constituintes protéicos, as peçonhas de muitos peixes contêm
mediadores químicos e componentes de baixa massa molecular, incluindo
catecolaminas (Haavaldsen e Fonum, 1963; Garnier et al., 1996; Church e Hodgson,
2000b), acetilcolina ou substâncias colinomiméticas (Rodrigues, 1972; Cohen e Olek,
1989; Church e Hodgson, 2000a), histamina (Haavaldsen e Fonum, 1963, Muhuri et al.,
2004), 5-hidroxitriptamina (Russel e Van Harreveld, 1954; Fenner et al., 1989; Hopkins
et al., 1997), e triptofano (Garnier et al., 1996). Ademais, foi encontrada na peçonha de
Pterois volitans uma toxina de 327Da (Nair et al., 1985). Estas pequenas moléculas
parecem ter importantes implicações nas atividades farmacológicas das peçonhas de
peixes.
1.5. Toxicidade e letalidade das peçonhas de peixes
A avaliação da letalidade e da toxicidade de peçonhas de peixes demonstra
variação de intensidade quanto a estas atividades entre as espécies de peixes (tabela I).
As peçonhas de peixes-pedra (Synanceja) são altamente tóxicas, ou mesmo letais,
quando comparados com as peçonhas de peixes dos gêneros Scorpaena e Pterois. Sua
DL
50
em camundongos é comparável à de peçonhas de serpentes (Ohsaka, 1979). A
utilização de diferentes métodos experimentais de extração e de armazenamento, ou o
uso de venenos liofilizados ou recém-extraídos, são fatores que dificultam as
comparações de toxicidade/letalidade entre estas peçonhas, considerando-se a
instabilidade das mesmas.
13
1.6. As principais ações farmacológicas das peçonhas de peixes
Estudos sobre as propriedades biológicas das peçonhas revelaram uma gama de
atividades farmacológicas, dentre as quais se destacam a letal, inflamatória,
neuromuscular, cardiovascular e citolítica. Entretanto, os estudos dedicados ao
isolamento das toxinas bioativas responsáveis por estes efeitos são escassos quando
comparado aos de outros animais peçonhentos (Church e Hodgson, 2002a; Smith e
Wheeler, 2006; Figueiredo et al., 2009). Este fato pode ser explicado devido à extrema
labilidade das peçonhas de peixes (Russell, 1965; Carlson et al., 1971; Kreger, 1991;
Church e Hodgson, 2002a; Haddad Jr. et al., 2003; Carrijo et al., 2005; Smith e
Wheeler, 2006) e à dificuldade em estabelecer condições experimentais que
conservem/estabilizem as atividades farmacológicas dos seus componentes (Schaeffer et
al., 1971; Church e Hodgson, 2002a).
1.6.1. Ação inflamatória e algésica
Como já foi mencionando anteriormente, os sintomas clínicos mais
pronunciados em acidentes com peixes peçonhentos são a dor e o edema. Lima e
colaboradores (2003) demonstraram a presença de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6) na
resposta inflamatória local aguda induzida pela peçonha de Thalassophryne nattereri
em patas de camundongos; entretanto, apenas um fraco influxo de leucócitos foi
observado (Lima et al., 2003). A redução dos efeitos nociceptivos e edematogênicos
induzidos pela peçonha de T. nattereri, após administração do inibidor de calicreína
tecidual fenilacetil-FSR-EDDnp, indica que proteases possuem um importante papel na
mediação da atividade inflamatória desta peçonha (Lopes-Ferreira et al., 2004). De fato,
Magalhães e colaboradores (2005) identificaram uma nova classe de cininogenases,
nomeadas Natterinas, nas glândulas de peçonha deste peixe peçonhento (tabela I).
14
Proteínas algésicas também foram purificadas das peçonhas de peixes (tabela I):
Nocitoxina, uma proteína monomérica com massa molecular aproximada de 170kDa,
foi isolada da peçonha de Nothestes robusta e relatada como responsável por grande
parte da dor induzida pela peçonha bruta (Hanh e O’Connor, 2000). Uma toxina
hemorrágica de 18kDa, denominada SA-HT, foi isolada da peçonha do peixe-pintado
Scatophagus argus e também mostrou atividade nociceptiva e edematogênica,
(Karmakar et al., 2004).
1.6.2. Ação neurotóxica
Além de causar dor e de desencadear respostas inflamatórias locais, alguns
sintomas clínicos observados após o envenenamento por peixes são evidentes sinais de
neurotoxicidade. Alguns destes sintomas neurotóxicos, incluindo paralisia dos membros
inferiores, fraqueza muscular, parada respiratória, ereção de pelos, movimentos
rotacionais e violentas convulsões, foram observados após administração das peçonhas
de Pterois volitans (Nair et al., 1985), Scorpaena plumieri (Carrijo et al., 2005), T.
nattereri (Lopes-Ferreira et al., 1998), G. marmoratus (Kelynack, 1977), Plotosus
lineatus (Fahim et al., 1996), Synanceja trachynis (Sutherland e Tiballs, 2001) e S.
verrucosa (Breton et al., 2002) experimentalmente em animais. De acordo com Church
e Hodgson (2002a), existem algumas similaridades nos efeitos neuromusculares
induzidos pelas peçonhas de peixes:
i. todas as peçonhas atuam pré- e pós-juncionalmente para produzirem
despolarização das membranas celulares;
ii. esta atividade parece não ser dependente da presença de cátions divalentes
no fluido extracelular;
15
iii. estas ações parecem estar relacionadas com componentes citolíticos
presentes na peçonha.
1.6.3. Ação cardiovascular
A ação farmacológica mais potente descrita para as peçonhas de peixes é sobre o
sistema cardiovascular. Estas peçonhas induzem alterações cardiovasculares in vivo e in
vitro por efeitos no coração e em vasos sanguíneos. As respostas cardiovasculares
evocadas parecem resultar, ao menos em parte, da ação direta e/ou indireta (liberação de
autacóides endógenos) dos componentes da peçonha sobre receptores adrenérgicos e/ou
muscarínicos (Church e Hodgson, 2002a; Figueiredo et al., 2009).
As peçonhas de peixe-pedra de recifes Synanceja verrucosa (Abe et al., 1996),
peixe-gato Indiano Plotosus canius (Auddy et al., 1994) e peixe-pintado Scatophagus
argus (Muhuri et al., 2004) induzem respostas inotrópicas positivas em preparações
cardíacas isoladas de diferentes espécies. Contrariamente, a peçonha de Pterois volitans
causa diminuição concentração-dependente da força e da freqüência cardíaca de
corações isolados de moluscos e de rãs (Cohen e Olek, 1989). Estes efeitos foram
atribuídos à presença de acetilcolina em concentrações micromolares no extrato bruto
da peçonha, visto que o pré-tratamento com acetilcolinesterase aboliu as ações cardíacas
(Cohen e Olek, 1989). Entretanto, resultados obtidos por Carlson e colaboradores
(1971) demonstraram que a resposta inotrópica negativa inicial induzida pela peçonha
de Scorpaena guttata não está relacionada com a presença de mediadores químicos de
baixa massa molecular presentes na peçonha deste peixe, mas sim indiretamente por
componentes protéicos termolábeis, já que esta resposta foi abolida após a depleção dos
estoques atriais de acetilcolina por hemicolíneo (Carlson et al., 1971).
16
Entretanto, uma característica comumente observada em preparações
cardiovasculares para as peçonhas de peixes é a indução de respostas bifásicas, as quais
têm sido atribuídas a um complexo balanço de componentes bioativos nestas peçonhas.
Estudos usando corações isolados de ratos mostraram que as peçonhas do peixe-
escorpião Scorpaena guttata (Carlson et al., 1971), do peixe-soldado Gymnapistes
marmoratus (Hopkins e Hodgson, 1998), do peixe-pedra estuarino Synanceja trachynis
(Church e Hodgson, 2000a) e do peixe-leão Pterois volitans (Church e Hodgson,
2002b) produziram respostas inotrópicas bifásicas consistindo de uma fase inicial de
decréscimo seguida por um aumento na força de contração. Respostas cronotrópicas
bifásicas, caracterizadas por um decréscimo inicial seguido de um aumento da
freqüência de contração, também foram obtidas usando as peçonhas de G. marmoratus
(Hopkins e Hodgson, 1998) e S. guttata (Carlson et al., 1971), enquanto as peçonhas de
P. volitans (Church e Hodgson, 2002b) e S. trachynis (Church e Hodgson, 2000a)
apresentaram respostas com uma única fase de aumento da freqüência cardíaca.
Subseqüentes investigações sobre os efeitos inotrópicos revelaram que tanto a fase
negativa transiente quanto a fase positiva foram reduzidas após tratamento com
antagonistas de receptores muscarínicos e de agentes bloqueadores de β-adrenoceptores,
respectivamente (Carlson et al., 1971; Hopkins e Hodgson, 1998; Church e Hodgson,
2000a; 2002b). Os efeitos positivos desencadeados pela peçonha de S. trachynis não
foram afetados pela depleção prévia dos estoques de monoaminas pela reserpina,
sugerindo uma ação direta sobre β-adrenoceptores (Church e Hodgson, 2000a). A
presença de noradrenalina e dopamina na peçonha bruta dos peixes-pedra Synanceja
horrida e S. verrucosa, descrita por Garnier e colaboradores (1996), corrobora estes
dados. Contrariamente, o aumento da força de contração induzido pelas peçonhas de S.
guttata e G. marmoratus foram abolidos com o tratamento com reserpina, o que sugere
17
uma ação indireta da peçonha sobre os β-adrenoceptores devido a componentes que
liberam catecolaminas endógenas (Carlson et al., 1971; Hopkins e Hodgson, 1998).
Estudos in vitro realizados com as peçonhas de Gymnapistes marmoratus e
Pterois volitans em artérias coronárias de porco pré-contraídas com U46619, um
composto mimético de tromboxano A
2
, mostraram que estas peçonhas induziram
relaxamento dos vasos de maneira dependente da concentração e do endotélio (Church e
Hodgson, 2001; 2002b). Respostas semelhantes foram observadas quando as peçonhas
de G. marmoratus e Synanceja trachynis foram aplicadas a anéis aórticos de rato pré-
contraídos com fenilefrina (Hopkins e Hodgson, 1998; Church e Hodgson, 2000). O
tratamento com atropina produziu inibição da resposta relaxante induzida pela peçonha
de S. trachynis em aorta de ratos, e converteu a resposta contrátil independente de
endotélio em artérias de porco em uma resposta relaxante (Church e Hodgson, 2000),
mostrando evidências adicionais de que as peçonhas de peixes atuam em nível de
receptores muscarínicos.
Alguns estudos têm demonstrado que a resposta vasodilatadora dependente de
endotélio induzida por peçonhas de peixes pode estar relacionada com a liberação
endotelial de óxido nítrico (NO). Church e Hodgson (2002b) demonstraram que a
remoção dos íons Ca
+2
extracelulares e a inibição da síntese de NO por NOLA (N
ω
-
nitro-L-arginina) atenuaram, significantemente, o relaxamento de artérias coronárias de
porco evocado pela peçonha de Pterois volitans. Hopkins e Hodgson (1998) também
demonstraram que a resposta relaxante produzida por G. marmoratus, em anéis aórticos
isolados de rato, também foi inibida pelo pré-tratamento do tecido com NOLA.
Tem sido relatado que a hipotensão é um dos sintomas clínicos observados nos
casos de envenenamento grave de seres humanos por peçonhas de peixes. Respostas
18
hipotensivas em animais experimentais também têm sido descritas para as peçonhas de
peixes. Em coelhos anestesiados, as peçonhas de Synanceja horrida e Pterois volitans
induziram efeito hipotensivo, o qual foi parcialmente atribuído à vasodilatação
periférica, já que a freqüência cardíaca dos animais não foi afetada (Saunders et al.,
1959; 1962). A peçonha do peixe-pedra de recifes Synanceja verrucosa produziu uma
queda imediata da pressão arterial em ratos anestesiados (Abe et al., 1996). Resposta
depressora semelhante também foi demonstrada para as peçonhas do peixe-gato Árabe
Arius thalassinus (Thulesius et al., 1983) e do peixe-pintado Scatophagus argus
(Muhuri et al., 2004) em ratos anestesiados. O efeito induzido pela peçonha deste
último foi abolido por mepiramina, sugerindo que receptores histamínicos estão
envolvidos na resposta observada (Muhuri et al., 2004).
Assim como para as ações in vitro reportadas anteriormente, as peçonhas de
peixes comumente desencadeiam respostas bifásicas em ensaios in vivo, que resultam
do balanço de respostas hipertensoras e hipotensoras (Church e Hodgson, 2002a). Este
tipo de resposta (bifásica) foi observado usando as peçonhas de G. marmoratus
(Hopkins e Hodgson, 1998), P. volitans (Church e Hodgson, 2002b), S. trachynis
(Weiner, 1959), S. horrida (Austin et al., 1961), Scorpaena guttata (Carlson et al.,
1973), S. plumieri (Andrich, 2005) e T. draco (Russell e Emery, 1960) em uma
diversidade de animais anestesiados (ratos, gatos, coelhos e cães).
A peçonha de Pterois volitans produziu efeito bifásico em ratos anestesiados,
consistindo de um aumento transitório seguido por uma queda sustentada da pressão
arterial média, com alterações negligenciáveis na freqüência cardíaca (Church e
Hodgson, 2002b). A atropina atenuou significantemente o efeito depressor da peçonha,
sugerindo atividade sobre receptores muscarínicos. Entretanto, a posterior adição de
19
prasozina (antagonista seletivo dos receptores α
1
-adrenérgicos) revelou outro
componente depressor da resposta, o qual atua independentemente dos receptores α
1
-
adrenérgicos e muscarínicos. Tal componente da resposta foi abolido por tratamento
com soro anti-Synanceja, sugerindo que este efeito é mediado por uma toxina protéica
da peçonha (Church e Hodgson, 2002b).
As peçonhas dos peixes-escorpião Scorpaena plumieri (Andrich, 2005) e
Scorpaena guttata (Coats et al., 1980) provocaram um efeito hipertensivo dose-
dependente em ratos anestesiados utilizando-se doses sub-letais, o qual foi seguido de
severa hipotensão em doses letais. Entretanto, quando a peçonha de S. guttata foi
administrada a gatos, coelhos e cães, foi observado um efeito hipotensor inicial seguido
por um período de aumento da pressão arterial (Carlson et al., 1973).
Ambas as peçonhas de Gymnapistes marmoratus e Synanceja trachynis
induziram, em ratos anestesiados, respostas bifásicas caracterizadas por uma fase inicial
depressora com uma subseqüente fase pressora (Hopkins e Hodgson, 1998; Church e
Hodgson, 2000; 2001). A fase depressora desenvolvida após a administração da
peçonha de G. marmoratus foi significativamente diminuída após tratamento com
indometacina (inibidor de ciclooxigenases) e NOLA (inibidor de oxido nítrico sintases,
NOS), indicando que a vasodilatação periférica é responsável por este efeito (Hopkins e
Hodgson, 1998). A resposta induzida por G. marmoratus não foi afetada pelo
tratamento com prasozina e atropina (Hopkins e Hodgson, 1998), esta última aboliu a
fase depressora e a primeira atenuou a fase pressórica da resposta induzida pela peçonha
de S. trachynis (Church e Hodgson, 2000a).
1.6.4. Ação hemolítica e citotóxica
20
Uma das propriedades mais marcantes compartilhada pelas peçonhas de peixes é
a de provocar hemólise in vitro. Efeito citolítico sobre eritrócitos foi demonstrado para
as peçonhas de Arius thalassinus (Thulesius et al., 1983), Plotosus lineatus (Auddy et
al., 1995) Trachinus draco (Chhatwal e Dreyer, 1992a), Thalassophryne nattereri
(Lopes-Ferreira et al., 1998; Lopes-Ferreira et al., 2001), Pterois volitans, P. lunulata,
P. antennata, Dendrochirus zebra, Inimicus japonicus (Shiomi et al. 1989), Nothestes
robusta (Hanh e O’Connor, 2000; Sivan et al., 2007), Synanceja horrida (Khoo et al.
1992), S. trachynis (Kreger, 1991), S. verrucosa (Garnier et al.,1995), Scorpaena
plumieri (Carrijo et al., 2005; Andrich, 2005) e S. guttata (Carlson et al., 1971). A
atividade hemolítica destas peçonhas é seletiva para eritrócitos de algumas espécies
(espécie-específica), sendo muito potente em eritrócitos de coelho. Os eritrócitos
humanos, de galinha e suínos são totalmente resistentes, e fraca atividade hemolítica é
observada em eritrócitos de camundongos e de bovinos (Shiomi et al., 1989; Kreger,
1991; Chhatwal e Dreyer, 1992a).
Considerando-se a aparente ausência de atividade fosfolipásica do tipo A
2
nas
peçonhas de peixes, a ação hemolítica/citolítica induzida por estas peçonhas parece ser
resultante da ação direta de seus componentes sobre membranas celulares (Shiomi et al.,
1989; Khoo et al., 1992; Hopkins et al., 1994; Lopes-Ferreira et al., 1998; Hopkins e
Hodgson, 1998; Hahn e O’Connor, 2000; Sivan et al., 2007). Chhatwal e Dreyer
(1992a) sugeriram que a atividade hemolítica da peçonha de Trachinus draco é
precedida pela ligação do componente hemolítico a um receptor protéico exposto na
superfície das hemácias. Um mecanismo para a atividade hemolítica foi sugerido para
toxinas citolíticas purificadas de peçonhas de peixes, o qual está descrito na seção 1.7.
21
Além do efeito sobre hemácias, algumas peçonhas de peixes são capazes de
induzir efeito citolítico/citotóxico sobre outros tipos celulares, particularmente sobre
células musculares (Lopes-Ferreira et al., 2001) e células tumorais (Fahim et al., 1996;
Soprani, 2008).
Lopes-Ferreira e colaboradores (2001) demonstraram que a peçonha do niquim
(Thalassophryne nattereri) induz danos musculares agudos em camundongos,
caracterizados por desorganização miofibrilar, perda da linha Z e escassas regiões de
hipercontração, provocando regeneração muscular deficiente. A peçonha deste peixe-
sapo também afetou a viabilidade de células mononucleares J774A1 em cultura (Lima
et al., 2003) e induziu efeito citolítico em plaquetas, células endoteliais (Lopes-Ferreira
et al., 2002) e mioblastomas murinos C2C12 em cultura (Lopes-Ferreira et al., 2001).
A peçonha do peixe-gato P. lineatus é citotóxica para diversos tipos de célula,
incluindo células tumorais ascíticas de Ehrlich cultivadas, as quais constituem um
modelo usual de crescimento tumoral (Fahim et al., 1996). Satoh e colaboradores
(2002) verificaram que as peçonhas do peixe-escorpião Hypodytes rubripinnis e do
peixe-pedra Synanceja verrucosa afetaram o ciclo e sobrevivência celular de
esplenócitos e células leucêmicas P388 murinas. Sri Balasubashini e colaboradores
(2006a) relataram pela primeira vez a atividade anticancerígena de peçonhas de peixe
em um modelo de câncer in vivo. Estes autores demonstraram efeitos antitumoral,
hepatoprotetor e antimetastático da peçonha do peixe-leão (Pterois volitans), a qual
induz apoptose em carcinomas ascíticos de Ehrlich (EAC) pela ativação da caspase-3
em camundongos xenotransplantados. Um peptídeo de 7,6kDa purificado a partir desta
peçonha (peptídeo FV, tabela I) apresenta atividade antiproliferativa sobre células
cultivadas Hep2 e HeLa (Sri Balasubashini et al., 2006b). Recentemente, foi
22
demonstrado que a peçonha de S. plumieri possui potente efeito antitumoral dependente
da concentração em células cultivadas de glioblastoma murino (RT2) e células tumorais
ascíticas de Ehrlich (Soprani, 2008). A peçonha bruta reduz significativamente o
metabolismo celular e induz alterações morfológicas, tais como a redução do volume
citoplasmático e formato celular arredondado. Em concentrações mais elevadas, a
peçonha também inibiu a adesão e proliferação celular. Estes resultados sugerem que o
efeito antitumoral desencadeado pela peçonha deste peixe-escorpião seja mediado pela
indução de apoptose (Soprani, 2008).
1.7. Citolisinas de peçonhas de peixes
Vários estudos demonstram que tanto a toxicidade quanto algumas das
atividades farmacológicas induzidas pelas peçonhas de peixes, principalmente a
edematogênica e cardiovascular, parecem resultar da ação do componente protéico
citolítico presente nestas peçonhas (Weiner, 1959; Kreger, 1991, Khoo, 2002). Esta
hipótese é corroborada pela demonstração de que as atividades hemolítica, letal e de
aumento da permeabilidade vascular da fração hemolítica da peçonha de Synanceja
trachynis foram neutralizadas pelo soro anti-Synanceja (Kreger, 1991). Além disso,
alguns autores sugerem que estas toxinas “perturbadoras” de membrana poderiam afetar
o comportamento normal das células endoteliais e a função cardíaca, desencadeando
influxo de íons Ca
+2
e uma conseqüente ativação da cascata de síntese de óxido nítrico
(NO), levando ao vasorelaxamento e à hipotensão (Low et al., 1993; Chen et al., 1997;
Church e Hodgson, 2002). Intrigados com a multifuncionalidade destes componentes,
alguns pesquisadores dedicaram-se ao isolamento e caracterização destas citolisinas.
De maneira geral, estas citolisinas são proteínas diméricas de alta massa
molecular (~150kDa) e têm sido purificadas de peçonhas de peixes-pedra (gênero
23
Synanceja): Stonustoxina (SNTX, Stonefish National University of Singapore) de S.
horrida (Poh et al., 1991); Trachynilysina (TLY) de S. trachynis (Colasante et al.,
1996); Verrucotoxina (VTX) e neo-Verrucotoxina (neoVTX) ambas de S. verrucosa
(Garnier et al., 1995; Ueda et al., 2006). Estas toxinas são as proteínas mais estudadas
de peçonhas de peixes e algumas de suas características estruturais e propriedades
farmacológicas têm sido descritas (Poh et al., 1991; Kreger, 1991; Low et al., 1993;
Low et al., 1994; Khoo et al., 1995; Garnier et al., 1995; Ghadessy et al., 1996;
Colasante et al., 1996; Chen et al., 1997; Garnier et al., 1997a,b; Sauviat et al., 2000;
Sung et al., 2002; Ouanounou et al., 2002; Khoo, 2002; Ueda et al., 2006; Liew et al.,
2007).
A primeira proteína purificada de peçonhas de peixes e caracterizada em nível
molecular foi SNTX de S. horrida, a qual constitui cerca de 9% do total de proteínas da
peçonha bruta. Esta citolisina de 148kDa é composta por duas subunidades: α (71kDa) e
β (79kDa), associadas através de interações não-covalentes (Poh et al., 1991; Gadhessy
et al., 1996). A atividade hemolítica de SNTX tem sido atribuída à formação de poros
nas membranas celulares, e o modelo carpet-like foi proposto para explicar esse efeito
(Chen et al., 1997). Além do efeito citolítico, SNTX apresenta um amplo espectro de
atividades biológicas: indução e inibição da agregação plaquetária, atividade sobre
junções neuromusculares, aumento da permeabilidade vascular/indução de edema, e
vasorelaxamento dependente de endotélio, sendo a causa primária de morte atribuída à
hipotensão acentuada causada por esta toxina (Poh et al., 1991; Low et al., 1993; Khoo
et al., 1995). Curiosamente, Liew e colaboradores (2007) demonstraram que o gás
sulfídrico (H
2
S) pode agir sinergicamente com NO na efetuação do relaxamento
evocado por SNTX.
24
O fator citolítico e letal da peçonha de S. trachynis (TLY) também é uma
proteína heterodimérica (α 76kDa, β 83kDa), com massa molecular de 158kDa em sua
forma nativa (Kreger, 1991; Colasante et al., 1996). TLY estimula a liberação de
acetilcolina de vesículas sinápticas em terminais neuromotores (junções
neuromusculares) (Colasante et al., 1996) e terminais nervosos colinérgicos atriais,
promovendo efeito inotrópico negativo e alterações na atividade de vários canais de
transporte catiônico no músculo cardíaco atrial de rãs (Sauviat et al., 2000). Já a adição
de concentrações nanomolares de TLY em células cromafins evoca sustentada exocitose
de catecolaminas de vesículas de maneira dependente de SNARE (Soluble N-
ethylmaleimide-sensitive fusion protein Attachment Protein REceptor) (Meunier et al.,
2000; Ouanounou et al., 2002). Estes autores ainda relataram que o influxo de Ca
+2
extracelular, e a conseqüente mobilização dos estoques de Ca
+2
intracelular, são
necessários para a secreção induzida por TLY, e sugeriram um mecanismo baseado em
sua atividade formadora de poros (Meunier et al., 2000; Ouanounou et al., 2002). Assim
como para SNTX (Chen et al., 1997), a ação desta citolisina sobre membranas
lipídicas/celulares parece seguir o modelo carpet-like (Mattei et al., 2000; Ouanounou
et al., 2002), predizendo a existência de um limiar de toxina ligada para permear a
membrana e estabilizar a estrutura dos poros (Shai, 1995).
Duas diferentes citolisinas (VTX e neoVTX) foram isoladas da peçonha de S.
verrucosa. NeoVTX também é um proteína tóxica de alta massa molecular (166kDa),
apresentando subunidades de 75kDa (α) e 80kDa (β) (Ueda et al., 2006). VTX, ao
contrário das outras toxinas descritas, é uma glicoproteína tetramérica de 322kDa,
exibindo duas subunidades α (83kDa) e duas β (78kDa) (Garnier et al., 1995). Esta
hemolisina exerce efeitos inotrópico e cronotrópico negativos em músculo cardíaco
atrial de rã, os quais podem ser atribuídos à inibição dos canais para Ca
+2
e à abertura de
25
canais para K
+
sensíveis ao ATP (Garnier et al., 1997a). Além do mais, VTX também
induz potente efeito hipotensor em ratos anestesiados, levando os animais ao óbito
poucos minutos após sua administração (Garnier et al., 1995).
A estrutura primária de ambas as subunidades de SNTX e neoVTX, assim com
da subunidade β de VTX, foi deduzida através da clonagem e seqüenciamento do cDNA
codificante destas proteínas (Gadhessy et al., 1996; Garnier et al., 1997b; Ueda et al.,
2006). A comparação destas estruturas revelou importantes informações estruturais
sobre estas toxinas:
i. as subunidades α e β são homólogas (cerca de 50% de identidade),
sugerindo que foram originadas de um ancestral comum (Gadhessy et al.,
1996);
ii. a subunidade α apresenta N-terminal bloqueado (Poh et al., 1991;
Colasante et al., 1996; Ueda et al., 2006);
iii. todas apresentam elevado grau de identidade: a subunidade α de neoVTX
apresenta 87% de identidade com sua correspondente de SNTX; já sua
subunidade β apresenta, respectivamente, 90% e 96% de identidade com
as subunidades β de VTX e SNTX (Ueda et al., 2006);
iv. as seqüências primárias destas citolisinas não apresentam homologia
significativa com aquelas de proteínas depositadas em bases de dados
(Gadhessy et al., 1996).
Embora a seqüência de aminoácidos completa de TLY não tenha sido
determinada, os primeiros 37 resíduos N-terminais da subunidade β foram idênticos aos
relatados para as outras três toxinas (Colasante et al., 1996; tabela I). Esta elevada
26
semelhança estrutural explica o similar espectro de atividades farmacológicas das
citolisinas de peixes-pedras (tabela I).
Apesar das citolisinas das peçonhas de peixes-pedra serem as mais estudadas e
bem descritas, toxinas citolíticas, apresentando ou não estruturas semelhantes, também
estão presentes na secreção peçonhenta de peixes pertencentes a outros gêneros, e
mesmo de diferentes famílias (tabela I). Fatores letais denominados Trachinina
(324kDa) e Dracotoxina (105kDa) também foram purificados a partir das peçonhas dos
peixes-aranha (família Trachinidae) Trachinus vipera (Perrière et al., 1988) e Trachinus
draco (Chhatwal e Dreyer, 1992b), respectivamente. Apesar de Trachinina apresentar
uma estrutura tetramérica (quatro subunidades de 81kDa) similar à demonstrada para
VTX (Garnier et al., 1995), esta glicoproteína mostrou-se altamente instável e sua
atividade hemolítica não foi testada (Perrière et al., 1988). Distintamente, a estrutura da
Dracotoxina não se dissocia em subunidades. Este polipeptídeo causa despolarização de
membrana e sua atividade hemolítica é espécie-específica: sendo muito potente em
eritrócitos de coelho, menos potente em eritrócitos de rato, fracamente efetivo e
inefetivo em eritrócitos de camundongos/bovinos e humanos/cobaia/galinha,
respectivamente (Chhatwal e Dreyer, 1992b). Além dos efeitos hemolíticos,
Dracotoxina também provoca lise de granulócitos de coelho e gato (Chhatwal e Dreyer,
1992b). Estes autores ainda demonstraram que o efeito hemolítico da Dracotoxina
ocorre mesmo a 4°C e deve-se à interação com a glicoforina da membrana de eritrócitos
(Chhatwal e Dreyer, 1992b), ao contrário da citolisina de Staphylococcus aureus (que
também é altamente hemolítica para eritrócitos de coelho), cuja hemólise não ocorre à
baixas temperaturas e que se liga ao colesterol das células animais (Freer, 1982).
Diferentemente das toxinas relacionadas, a hemolisina purificada da peçonha de
Plotosus canius (família Plotosidae), Toxina-PC, possui massa molecular mais baixa
27
(15kDa). Esta proteína foi tóxica para camundongos (DL
50
0,23mg/kg i.v.) e produziu
parada cardíaca em sapos e coração isolado de cobaia, sendo este efeito não afetado pela
administração prévia de atropina ou propanolol (Auddy et al., 1995).
Em estudos anteriores, nosso grupo de pesquisa demonstrou que a peçonha do
peixe Scorpaena plumieri apresenta propriedades farmacológicas semelhantes às
descritas para as citolisinas encontradas em peçonhas de outros peixes, como: atividade
tóxica/letal, hemolítica e cardiovascular (Carrijo et al., 2005; Andrich, 2005). Estes
relatos constituem importantes evidências de que toxina similar poderia estar presente
na peçonha deste peixe-escorpião. Estas informações preliminares motivaram-nos a
estudar a atividade citolítica e cardiovascular desta peçonha.
1.8. Lectinas: definição e propriedades biológicas
As lectinas constituem uma classe de proteínas não-enzimáticas de estrutura
diversificada cujo nome é derivado do latim “legere”, que significa escolher/selecionar
(Boyd e Shapleigh, 1954 apud Sharon e Lis, 2004), uma alusão à sua peculiar
característica de se ligar a carboidratos de forma específica e reversível (Sharon e Lis,
1972; Barondes, 1988; Sharon, 1993; Singh et al., 1999). São moléculas amplamente
distribuídas em microrganismos, plantas e animais e cuja origem não é imunológica
(Sharon e Lis, 1972). Muitas destas moléculas se agregam formando oligômeros
diméricos, triméricos ou estruturas mais complexas (Drickamer, 1993; Singh et al.,
1999; Hakanson e Reid, 2000). Estes agregados aumentam a “avidez” das lectinas pelos
ligantes (Cummings e McEver, 2009) e também possibilita a aglutinação células
adjacentes que apresentem glicoconjugados na superfície de suas membranas celulares
(Barondes, 1988; Hakanson e Reid, 2000).
28
A descoberta das lectinas foi atribuída a Stillmark (1888) ao observar os efeitos
aglutinantes do extrato de sementes de mamona (Ricinus communis) sobre eritrócitos de
diferentes espécies de animais (revisado por Franz, 1988). Posteriormente, muitas outras
substâncias hemaglutinantes foram descobertas em extratos vegetais, razão pela qual
estas proteínas foram inicialmente chamadas de “hemaglutininas” ou
“fitohemaglutininas” (Sharon e Lis, 2007). No entanto, depois que sua propriedade de
reconhecimento de açúcares/glicanos foi revelada (Sumner e Howell, 1936 apud Sharon
e Lis, 2004), percebeu-se que estas moléculas com intrigantes efeitos não estavam
exclusivamente associadas a tecidos/organismos vegetais, mas sim presentes
ubiquamente por toda natureza (Singh et al., 1999). O possível papel fisiológico das
lectinas tem intrigado investigadores desde sua descoberta, principalmente aquelas
extraídas de plantas, as quais por muitos anos foram virtualmente as únicas conhecidas
(Etzler, 1986; Sharon e Lis, 2004).
1.8.1. Lectinas encontradas em microrganismos
As lectinas apresentam importante papel nas interações patogênicas entre alguns
microrganismos e tecidos de hospedeiros (Slifkin e Doyle, 1990), auxiliando no
organotropismo de determinadas doenças infecciosas (Singh et al., 1999).
O mais antigo e talvez o melhor caracterizado sistema de reconhecimento
lectina-carboidrato é o que rege a interação do vírus Influenza com suas células-alvo
(Paulson, 1985; Wiley e Skehel, 1987). A hemaglutinina destes vírus é uma
glicoproteína transmembrana oligomérica que possui várias isoformas (H1-H16) e
reconhece o ácido N-acetil-neuramínico (ácido siálico) presente na superfície celular,
sendo esta ligação um evento fundamental para o início da infecção (Sharon e Lis,
1989). Cada subunidade desta lectina é composta por duas cadeias polipeptídicas, HA1
29
e HA2 (36 e 26kDa, respectivamente), unidas covalentemente por pontes dissulfeto.
Estas subunidades associam-se de maneira não-covalente formando trímeros na
superfície viral (Sharon e Lis, 1989). Os vírus de linhagens que infectam seres humanos
apresentam hemaglutininas H1, H2 ou H3, com especificidade para α-NeuAc(2→6)Gal,
enquanto que a linhagem aviária exibe hemaglutininas do tipo H5 reconhecendo α-
NeuAc(2→3)Gal (Vlasak et al., 1988). A comparação da estrutura primária entre
hemaglutininas dos isolados humanos e aviários revelou que o resíduo 226 da cadeia
HA tem papel determinante na conformação estrutural/espacial do sítio de
reconhecimento de carboidratos e, conseqüentemente, na especificidade destas
hemaglutininas/lectinas (Weis et al., 1988). A substituição do resíduo de leucina 226
por glutamina altera a especificidade da hemaglutinina de isolados humanos para
ligações α(2→3), idêntica à exibida pela hemaglutinina dos aviários (Weis et al., 1988).
Muitos membros da família Enterobacteriaceae têm lectinas em seu pili,
constituindo organelas essenciais para sua adesão ao epitélio intestinal, levando a
infecções nos tratos urinário e gastrointestinal (Sharon, 1987; Karlsson, 1989; Ofek e
Sharon, 1990). A adesão de Helicobacter pylori ao epitélio gástrico é mediada por
moléculas adesivas com especificidade para ácido siálico (Logan, 1996). Linhagens de
Escherichia coli apresentando diferentes tipos de fímbrias expressam lectinas com
especificidades variadas (Nicolson, 1976; Rademacher, 1988): as que exibem fímbrias
tipo 1 ligam-se à manose, enquanto que, aquelas com fímbrias tipo G, tipo P e tipo S
são específicas para N-acetil-glicosamina, Gal-α(1→4)-Gal e α-NeuAc(2→3)-Gal,
respectivamente (Ofek e Sharon, 1990; Saarela et al., 1995). A ocorrência de moléculas
adesivas/lectinas com diferentes especificidades para carboidratos em um mesmo
microrganismo pode explicar a versatilidade de infecções que podem causar e também
as dificuldades para tratá-las (Singh et al., 1999).
30
O agente etiológico causador da amebíase humana, Entamoeba histolytica, que
provoca disenteria por invasão e rompimento de células da mucosa intestinal (Mirelman
e Ravdin, 1987; Ravdin, 1989), apresenta pelo menos duas lectinas: uma específica para
oligômeros (1→4) de N-acetil-glicosamina (Kobiler e Mirelman, 1981; Rosales-Encima
et al., 1987), e outra para galactose e N-acetil-galactosamina (Petri Jr., 1989). Esta
última é uma proteína de 260kDa composta por duas subunidades (170 e 35kDa) unidas
por pontes dissulfeto, sendo a cadeia pesada primariamente responsável pela mediação
dos efeitos adesivos (Petri Jr., 1989). Durante infecções crônicas, as lectinas podem
contribuir para ligação do parasita a outras células e tecidos, especialmente a
hepatócitos (Mirelman, 1987).
1.8.2. Lectinas de origem vegetal
As lectinas desempenham importante papel protetor na defesa dos organismos
vegetais contra insetos e microrganismos fitopatogênicos. Janzen et al. (1976)
demonstraram que alimentando besouros bruquídeos com dieta contendo lectina de
feijão preto ocasiona a morte de suas larvas. Efeito inseticida também foi demonstrado
para as lectinas do gérmen de trigo Triticum aestivum (WGA), da campânula branca
Galanthus nivialis (GNA) e das sementes da jaqueira Artocarpus heterophyllus
(Jacalina) (Sharon e Lis, 2004). Barkai-Golan e colaboradores (1978) observaram que
as aglutininas do amendoim (PNA), da soja (SBA) e WGA inibem a esporulação dos
fungos Trichoderma viride, Penicilium notatum e Aspergillus niger. Além do possível
papel defensivo/protetivo, interações carboidrato-proteína mediadas por lectinas
também têm sido observadas no reconhecimento molecular entre Bradyrhizobium
japonicum e raízes de soja (Dennis et al., 1987; Boonjawat et al., 1991; Ho, 1992),
constituindo evidência de que a associação simbiótica, altamente específica entre
bactérias fixadoras de nitrogênio e raízes de leguminosas, poderia ser mediada por
31
interação direta entre carboidratos da superfície das bactérias, ou eventualmente
lipopolissacarídeos, e lectinas presentes nas raízes (Etzler, 1986; Goldstein e Poretz,
1986).
Entretanto, as propriedades biológicas mais notáveis descritas para as lectinas
vegetais foram reveladas por ensaios utilizando células animais.
As investigações sobre a especificidade das hemaglutininas vegetais levaram a
elucidação das bases estruturais de antígenos associados ao sistema ABO (Sharon e Lis,
2004). Em estudos utilizando-se lectinas de sementes de feijão-de-lima (Phaseolus
lunatus) e de Lotus tetragonolobus, Morgan e Watkins (1950 apud Morgan e Watkins,
2000) concluíram que α-N-acetil-D-galactosamina e α-L-fucose são os açúcares que
conferem, respectivamente, especificidade aos grupos A e H(O).
Nowel (1960) demonstrou que a lectina do extrato de feijão vermelho
(Phaseolus vulgaris), a qual é conhecida como Phytohemaglutinin (PHA), é capaz de
induzir hemaglutinação e também estimular mitose em linfócitos tipo T. De maneira
semelhante, a Concanavalina A (ConA) do feijão-de-porco Canavalia ensiformis
(Sabato et al., 1987), a Jacalina das sementes de jaca Artocarpus heterophyllus (Pineau
et al., 1990) e a aglutinina (VVA) da ervilhaca peluda Vicia villosa (Abrignani e
Cammisuli, 1988) também foram reportadas como agentes mitogênicos para linfócitos
T. Adicionalmente, Aub e colaboradores (1963; 1965), Burger (1968), Inbar e Sachs
(1969), Sela e colaboradores (1970) observaram que as lectinas WGA, ConA e SBA
aglutinam preferencialmente células malignas, demonstrando que as mudanças
observadas nos açúcares de superfície de células podem estar associadas com o
desenvolvimento de câncer.
32
1.8.3. Lectinas de origem animal
Nos animais, diversos oligossacarídeos estão conjugados a proteínas e lipídeos
expostos na superfície celular, como também podem ser encontrados em proteínas
secretadas à matriz ou fluidos extracelulares (Rademacher et al., 1988). Além do
potencial de modificar a atividade das moléculas nas quais estão anexados, os
carboidratos atuam como moléculas codificadoras de informações biológicas (Sharon,
1975; 1980; Hughes, 1983; Cook, 1986) e servem como importantes marcadores de
diferenciação celular, desenvolvimento, estados patológicos e possível alvo de drogas
(Hakomori, 1984; Fukuda, 1985; Feizi, 1985; Muramatsu, 1988; Rademacher et al.,
1988; Jepson et al., 1996; Hussain et al., 1997). Muitas vezes, o reconhecimento de
sacarídeos por lectinas é necessário para manifestação dos efeitos finais da glicosilação,
constituindo um evento mediador de vários fenômenos celulares, em processos
fisiológicos e patológicos (Drickamer, 1993; Singh et al., 1999).
A primeira função fisiológica descrita para lectinas em organismos animais foi a
de depuração de glicoproteínas do sistema circulatório após a remoção de resíduos
terminais de ácido siálico (Ashwell e Morell, 1974; Ashwell e Harford, 1982). Nos
hepatócitos de coelho, a molécula receptora de asialoglicoproteínas (ou hepático)
responsável por esta função é uma lectina oligomérica com duas subunidades (40 e
48kDa) que se liga especificamente a galactose e N-acetil-D-galactosamina. Ambas as
subunidades estão inseridas na membrana celular através de uma porção hidrofóbica de
aproximadamente 25 resíduos de aminoácido (Sumiya et al., 1991; Lasky et al., 1989;
Johnston et al., 1989), e a região responsável pelo reconhecimento de carboidratos está
exposta ao ambiente extracelular (Ashwell e Morell, 1974; Ashwell e Harford, 1982).
Após a ligação das ramificações de açúcares ao receptor, ocorre a endocitose do
complexo receptor-glicoproteína; então, os ligantes são direcionados através de
33
vesículas endossômicas para os lisossomas, onde são degradados (Drickamer, 1988).
Distintamente, o receptor de proteínas velhas em aves somente reconhece glicoproteinas
que se ligam especificamente em cadeias oligossacarídicas com unidade de N-acetil-
glicosamina não-protegidas por unidade de acido siálico terminal (Kawasaki e Ashwell,
1977; Ashwell e Harford, 1982).
O reconhecimento celular de carboidratos por lectinas também desempenha um
importante papel na patogênese de carcinomas. Alguns estudos revelaram que as
moléculas de oligossacarídeos de glicoproteínas (Monsigny et al., 1988) e glicolipídeos
(Hakomori, 1981; 1984; 1985) da superfície celular são alteradas após a transformação
maligna de células normais. A inibição da glicosilação protéica (Datema et al., 1987),
bem como a modificação dos oligossacarídeos conjugados nas moléculas de superfície
das células (Irimura et al., 1981; Schaf-Lafontaine et al., 1985; Humphries et al, 1986a;
1986b) impossibilitaram células malignas de colonizarem determinados órgãos-alvo. De
fato, existem evidências demonstrando que linhagens celulares exibindo alto potencial
metastático apresentam um aumento na expressão de lectinas em sua superfície (Raz et
al., 1986). Além disso, as lectinas também atuam nos mecanismos anti-proliferativos
empregado por células do sistema imunitário. Oda e colaboradores (1988)
demonstraram que lectinas de superfície de membrana exibindo subunidades de 45-
60kDa que se ligam à galactose e N-acetil-D-galactosamina estão relacionadas com a
habilidade de distinguir células tumorais de sadias exibida por macrófagos ativados de
camundongos.
Lectinas das células de defesa podem também mediar a ligação e fagocitose de
microrganismos que apresentam açúcares complementares em sua superfície. Por
exemplo, a fagocitose de Aspergillus fumigatus (Kan e Bennett, 1988), Klebsiella
pneumoniae (Athamna, 1989a; 1989b), Pseudomonas aeruginosa (Speert et al., 1988) e
34
promastigotas de Leishmania donovani (Blackwell, 1985) por macrófagos encontrados
em diferentes tecidos de camundongos, cobaias e humanos, é mediada por ligação à
lectina específica para manose e N-acetil-glicosamina de macrófagos. De maneira
semelhante, lectinas específicas para galactose e N-acetil-galactosamina de macrófagos
peritoneais de camundongos provavelmente estão envolvidas no reconhecimento e
fagocitose de tripomastigotas do parasita Trypanosoma cruzi, organismo causador da
doença de Chagas (Araujo-Jorge e De Souza, 1988). Este processo, chamado
lectinofagocitose, pode ser importante na imunidade inata e na depuração de bactérias
de hospedeiros não-imunes e imunodeficientes ou em locais pobres em opsoninas de
indivíduos imunocompetentes, como medula renal e cavidade peritoneal (Ofek e
Sharon, 1988).
O processo de rolamento dos linfócitos também envolve a interação adesiva
(lectinas) destas células com o endotélio ou vênulas pós-capilares. Esta interação foi
avaliada por experimentos in vivo, os quais demonstraram que a ligação de linfócitos
humanos e de camundongos a seções congeladas de linfonodos singênicos foi inibida
por carboidratos: L-fucose, D-manose-6-fosfato, fucoidina e polissacarídeo rico em
fosfomanose de leveduras (Stoolman e Rosen, 1983; Rosen e Stoolman, 1987). A
fucoidina também bloqueou a migração de linfócitos para linfonodos, indicando que o
reconhecimento entre linfócitos e células dos órgãos linfóides também é baseado em
interações lectina-carboidrato. A lectina responsável por esta interação foi purificada de
baço de camundongos e caracterizada como uma glicoproteína de 90kDa, a qual
apresenta alto grau de homologia com lectinas encontradas na membrana de células
hepáticas de galinha, rato e homem (Lasky et al., 1989; Stoolman, 1989; Siegelman et
al., 1989).
35
1.9. Classificação das lectinas animais
As lectinas de origem animal formam um amplo e diversificado grupo de
moléculas cuja atividade de ligação a açúcares está associada com módulos protéicos de
110-140 resíduos de aminoácidos, denominados Domínios de Reconhecimento de
Carboidratos - CRDs, Carbohydrate Recognition Domains (Drickamer, 1993; Sharon,
1993; Cummings e McEver, 2009). De acordo com a estrutura dos CRDs, as lectinas
animais são classificadas em oito grupos principais (alguns estão mostrados na figura
5): a família da calnexina, tipo M, tipo L, tipo P, tipo C, tipo R, tipo I ou singlecs, tipo S
ou galectinas (Drickamer, 2006). Grupos adicionais de lectinas animais que apresentam
papéis complementares àqueles bem estabelecidos para outras famílias de lectinas têm
sido descritos e incluem as F-box, ficolinas, semelhantes à quitinase, tipo F e
intelectinas (Drickamer, 2006). A tabela II mostra algumas das principais características
exibidas pelos diferentes tipos de lectinas animais.
As lectinas tipo C constituem o grupo mais heterogêneo de lectinas animais, já
que os CRDs tipo C podem estar associados com uma diversa gama de domínios
protéicos (Drickamer, 1993); algumas são proteínas solúveis e outras são proteínas
transmembranares. Estas moléculas possuem inúmeras funções biológicas, como a
constituição da matriz extracelular (proteoglicanos), adesão de moléculas e defesa
humoral; muitas são consideradas como receptores endocíticos (Drickamer, 1993). As
lectinas do tipo C apresentam como característica comum a dependência de íons Ca
+2
para a ligação ao carboidrato (Sharon, 1993), diferentemente das lectinas tipo S ou P, as
quais são classificadas de acordo com o carboidrato a que se ligam (tabela II). A classe
das lectinas tipo C é subdividida em dezessete grupos (figura 6), dentre os quais estão
incluídos: o grupo das Collectinas (III), lectinas exibindo domínio semelhante ao
colágeno próximo à região N-terminal, as quais são responsáveis pela aglutinação e
Figura 5.
PRINCIPAIS TIPOS DE LECTINAS ANIMAIS.
esquemática da estrutura e do(s) domínio(s) de um exemplo de cada tipo de lectina.
Os domínios de reco
nhecimento de carboidratos (CRD
tipo C; (GL) lectina tipo S; (MP)
são (EG) domínio semelhante
imunoglobulina C2-set
; (TM)
complemento.
O número dos domínios
de uma mesma família.
Fonte: Drickamer, 2006.
PRINCIPAIS TIPOS DE LECTINAS ANIMAIS.
Representação
esquemática da estrutura e do(s) domínio(s) de um exemplo de cada tipo de lectina.
nhecimento de carboidratos (CRD
s) mostrados são: (CL)
tipo C; (GL) lectina tipo S; (MP)
lectina tipo P; (IL) lectina
tipo I. Outros domínios
são (EG) domínio semelhante
à EGF (Endothelium growth factor
); (IG2)
; (TM)
região transmembrana; e (C3)
repetição regulatória do
O número dos domínios
diferentes do
CRD pode variar entre membros
Fonte: Drickamer, 2006.
36
Representação
esquemática da estrutura e do(s) domínio(s) de um exemplo de cada tipo de lectina.
s) mostrados são: (CL)
lectina
tipo I. Outros domínios
); (IG2)
domínio
repetição regulatória do
CRD pode variar entre membros
37
TABELA II. SUMÁRIO DOS TIPOS DE LECTINAS.
Tipos de Lectinas Ligantes sacarídicos Localização subcelular Exemplos de funções
Calnexina Glc
1
Man
9
Retículo endoplasmático Triagem de proteínas no retículo endoplasmático.
M Man
8
Retículo endoplasmático Degradação de glicoproteínas associada ao retículo endoplasmático.
L Vários Retículo endoplasmático,
Complexo de Golgi
Triagem de proteínas no retículo endoplasmático.
P Manose 6-fosfato, outros Vias secretórias Triagem de proteínas pós-Golgi, tráfego de glicoproteínas, degradação de
glicoproteínas associada ao reticulo endoplasmático, segmentação enzimática.
C Vários Membrana celular,
extracelular
Adesão celular (selectinas), depuração de glicoproteínas, imunidade inata
(collectinas).
Galectinas
β
-Galactosídeos
Citoplasma, extracelular Ligação cruzada de glicanos na matriz extracelular.
I Ácido siálico Membrana celular Adesão celular.
R Vários Complexo de Golgi,
membrana celular
Segmentação enzimática, reciclagem de glicoproteína hormônio.
F-box GlcNAc
2
Citoplasma Degradação de glicoproteínas mal-enoveladas.
Ficolinas GlcNAc, GalNAc Membrana celular,
extracellular
Imunidade inata.
Semelhantes à quitinase Quitooligosacarídeos Extracelular Metabolismo de colágeno (YKL-40).
F Oligosacarídeos terminados
em fucose
Extracelular Imunidade inata.
Intelectinas Gal, galactofuranose,
pentoses
Extracelular, membrana
celular
Imunidade inata. Fertilização e embriogênese.
Fonte: Drickamer, 2006.
Figura 6.
GRUPOS DE LECTINAS TIPO C E SEUS DOMÍNIOS ESTRUTURAIS.
(A) Dezessete grupos são mostrados, definidos por suas relações filogenéticas e
seus domínios estruturais.
(B)
estruturas oligoméricas, mostradas como estruturas em forma de cruz e bouquet. Cada
um dos domínios é nomeado como indicado
natural killer
; (CTLD) domínio semelhante
manose; (SP-A e SP-D)
proteínas
do complemento.
Fonte: Cummings e McEver, 2009.
A
GRUPOS DE LECTINAS TIPO C E SEUS DOMÍNIOS ESTRUTURAIS.
(A) Dezessete grupos são mostrados, definidos por suas relações filogenéticas e
(B)
Proteínas pertencentes ao grupo III (coll
ectinas
estruturas oligoméricas, mostradas como estruturas em forma de cruz e bouquet. Cada
um dos domínios é nomeado como indicado
na legenda.
(DC) célula dendrítica; (NK)
; (CTLD) domínio semelhante
à lectinas
tipo C; (MBP) proteína ligante de
proteínas
surfactante do tipo A e D
; (CCP) proteína de controle
Fonte: Cummings e McEver, 2009.
B
38
GRUPOS DE LECTINAS TIPO C E SEUS DOMÍNIOS ESTRUTURAIS.
(A) Dezessete grupos são mostrados, definidos por suas relações filogenéticas e
por
ectinas
) formam
estruturas oligoméricas, mostradas como estruturas em forma de cruz e bouquet. Cada
(DC) célula dendrítica; (NK)
tipo C; (MBP) proteína ligante de
; (CCP) proteína de controle
39
aumento da depuração de patógenos invasores, constituindo uma valiosa ferramenta do
sistema inato de defesa (Hakanson e Reid, 2000); o grupo das Selectinas (IV),
moléculas envolvidas na adesão de leucócitos a células endoteliais e migração dos
mesmos para tecidos linfóides ou inflamados (Drickamer, 1993; Sharon, 1993); e o
grupo VII, o qual consiste simplesmente de CRDs tipo C isolados. Lectinas deste último
grupo são encontrados no pâncreas (deCaro et al., 1987; Iovana et al., 1991) e em
peçonhas de serpentes (Chen e Tsai, 1995; Polgár et al., 1997; Morita et al., 2005).
1.10. Origem, estrutura e evolução do CRD das lectinas tipo C
Como já descrito anteriormente, a propriedade de ligação das lectinas tipo C aos
carboidratos está associada com domínios modulares, designados CRDs dependentes de
Ca
+2
ou tipo C (Drickamer, 1993). Estes domínios possuem uma conformação protéica
única similar a outros domínios que não necessariamente ligam a açúcares, chamados C
Type Lectin-like Domains ou CTDLs (Drickamer, 1999; Morita, 2005; Drickamer,
2006; Cummings e McEver, 2009). Alguns CTDLs se ligam a moléculas protéicas ou
lipídicas e comumente estas interações são independentes de íons Ca
+2
(Drickamer,
1999; Cummings e McEver, 2009). Atualmente, é assumido que os CRDs tipo C
resultaram da evolução dos CTLDs (Drickamer, 1999), a partir dos quais também se
originaram as proteínas anti-congelantes, as proteínas ligantes de fatores de coagulação,
os receptores ou ligantes MHC de células natural killer e muitas outras moléculas
apresentando similar arquétipo estrutural. A figura 7 mostra um esquema de evolução
dos CTDLs proposto por Drickamer (1999).
O CRD tipo C consiste de um domínio protéico compacto com
aproximadamente 110-130 resíduos de aminoácidos, sendo 14 destes altamente
conservados e 18 conservados apenas em caráter, os quais são muito importantes para o
Figura 7.
ESQUEMA
DA EVOLUÇÃO DOS DOMÍNIOS SEMELH
LECTINAS TIPO C (CTLD). A evolução convergente dos domínios
topologia de en
ovelamento está indicada no ápice
mostrada para enfatizar que propriedades como
apenas de um subgrupo de domínios. Asteriscos denotam módulos com enovelamento
similar, mas seqüências
não correlatas.
lipoprotein; NK,
natural killer
DA EVOLUÇÃO DOS DOMÍNIOS SEMELH
ANTES ÀS
LECTINAS TIPO C (CTLD). A evolução convergente dos domínios
com similar
ovelamento está indicada no ápice
.
A evolução divergente dos CTDL
mostrada para enfatizar que propriedades como
ligação a íons Ca
+2
e carboidratos são
apenas de um subgrupo de domínios. Asteriscos denotam módulos com enovelamento
não correlatas.
IgE, imunoglobulina E; LDL,
low density
natural killer
. Fonte: Drickamer, 1999.
40
ANTES ÀS
com similar
A evolução divergente dos CTDL
s é
e carboidratos são
apenas de um subgrupo de domínios. Asteriscos denotam módulos com enovelamento
low density
41
estabelecimento da configuração estrutural única encontrada neste tipo de módulo
(figura 8) (Drickamer, 1993; Weis e Drickamer, 1996; Cummings e McEver, 2009).
Os segmentos amino- e carbóxi-terminais estão emparelhados e formam uma
dupla fita de folha β antiparalela, a qual está seqüencialmente conectada a uma região
secundária não-regular (duplo loop), duas α-hélices e uma tripla fita de folha β
antiparalela (figura 9; Cummings e McEver, 2009). Duas pontes dissulfeto, uma
conectando o C-terminal ao segmento inicial do CRD, e outra unindo porções mais
internas da região C-terminal, são indispensáveis para a estruturação básica do
arquétipo, sendo altamente conservadas (Drickamer, 1993; Cummings e McEver, 2009).
No entanto, na porção N-terminal de muitas CTLD’s pode ser encontrada uma ponte
adicional unindo cisteínas separadas por 10 resíduos de aminoácido, formando uma
estrutura em forma de “grampo de cabelo” (Drickamer, 1999).
Os CRD’s tipo C normalmente possuem dois sítios de ligação para Ca
+2
(Mullin
et al., 1994), sendo a atividade ligante ao carboidrato associada principalmente com o
sítio 2 (região C-terminal) (Anostario e Huang, 1995). Os íons Ca
+2
estabilizam os loops
irregulares do terço superior da estrutura e estão diretamente envolvidos na interação
com o ligante (Drickamer, 1993; 1999). Conseqüentemente, a descomplexação dos
cátions (ocasionadas por alterações do pH ou pela presença de agentes seqüestrantes)
provoca alterações conformacionais, prejudicando o reconhecimento dos carboidratos
(Drickamer, 1993; Cummings e McEver, 2009). Conforme mencionado anteriormente,
as interações com proteínas e/ou carboidratos mediadas pelos CTLD’s nem sempre são
dependentes de Ca
+2
, podendo ocorrer a ausência destes íons nestas estruturas
(Drickamer, 1999; Kogelberg e Feizi, 2001; Tasumi et al., 2002).
42
A B
Figura 8. ESTRUTURA DO DOMÍNIO DE RECONHECIMENTO DE
CARBOIDRATO (CRD) DAS LECTINAS TIPO C. (A) Seqüência do CRD da
proteína A ligante de manose de ratos (MBP-A) alinhada com a seqüência contendo os
resíduos característicos dos CRD’s tipo C (Weis et al., 1991). Os resíduos conservados
estão indicados por sua respectiva abreviatura de uma letra, enquanto resíduos
conservados em caráter são indicados por: O, que contêm oxigênio; Ф, aromático; θ,
alifático; e Ω, aromático ou alifático. Os aminoácidos que compõem os sítios 1 e 2 para
ligação aos íons Ca
+2
estão denotados como 1 e 2, respectivamente. As duas pontes
dissulfeto características destes domínios também estão mostradas. (B) Diagrama
mostrando os elementos de estrutura secundária do CRD da proteína ligante de manose.
As esferas verdes 1 e 2 representam os íons Ca
+2
. As pontes dissulfeto estão mostradas
em amarelo. Fontes: Weis et al., 1992; Drickamer, 1993.
1
2
43
A
B
Figura 9. SITIO DE RECONHECIMENTO DE CARBOIDRATOS DOS CRDs. (A)
Ligação de manose ao motivo EPN da MBP-A nativa. Átomos de carbono, nitrogênio, e
oxigênio são mostrados como esferas brancas, cinza e pretas, respectivamente. Linhas
pontilhadas representam ligações de coordenações ao Ca
+2
(– – –) e ligações de
hidrogênio (----). (B) Ligação de galactose a uma MBP-A mutante, que apresenta o
motivo QPDWG no sítio de reconhecimento. Fontes: Weis et al., 1992; Kolatkar e
Weis, 1996.
44
Os resíduos de aminoácido com cadeias laterais contendo grupos carbonila (i.e.,
Asp, Glu, Asn e Gln) são comumente encontrados em coordenação com Ca
+2
, os quais
podem se ligar diretamente a açúcares na presença deste cátion divalente, levando à
formação de um complexo ternário entre o açúcar/glicano, o íon Ca
+2
do sítio 2 e
aminoácidos do CRD (figura 9, Cummings e McEver, 2009), o qual é estabilizado por
interações não-covalentes (ligações de hidrogênio, forças de van der Waals ou
interações hidrofóbicas) (Lemieux, 1989; Bourne et al., 1990; Quiocho, 1990; Sharon e
Lis, 1990; Bundle e Young, 1992).
A partir da análise estrutural do CRD tipo C da proteína A ligante de manose de
rato (Weis et al., 1991; 1992), foi possível obter uma melhor compreensão do papel dos
resíduos conservados nos CRD’s tipo C. Os resíduos Glu 193, Asn 205 e Asp 206, em
conjunto com Gln 185 e Asp 187, estão envolvidos na coordenação do íon Ca
+2
no sítio
2. Os resíduos 185 e 187 participam diretamente na ligação com o carboidrato (figura
9). Comumente, a seqüência Glu-Pro-Asn (resíduos 185, 186 e 187) é encontrada em
CRD’s que ligam açúcares com grupos hidroxilados dos C3 e C4 em conformação
equatorial (manose ou derivados da glicose - N-acetilglicosamina e fucose). Os CRD’s
que ligam galactose e N-acetilgalactosamina (3-hidroxil equatorial e 4-hidroxil axial)
são caracterizados pelo motivo Gln-Pro-Asp nas posições equivalentes (Lee et al., 1991;
Sharon, 1993). Estas observações sugerem que o posicionamento/arranjo destas cadeias
laterais contendo amida e carboxilato são importantes para a especificidade dos CRDs
tipo C (Drickamer, 1992; 1993; Sharon, 1993). No entanto, foi relatado que mesmo
CRD’s com semelhante especificidade podem interagir com moléculas de carboidratos
de maneira diferenciada (Drickamer, 1999), evidenciando que a disposição espacial dos
aminoácidos circundantes e a conseqüente conformação/formato do sítio de ligação
também contribuem para a especificidade inerente de determinado CRD (Sharon, 1993).
45
1.11. Lectinas encontradas em secreções peçonhentas e mucosas
Grande parte das lectinas animais está presente internamente em tecidos ou
ancorada à membrana plasmática, mas algumas destas proteínas são secretadas e
encontradas no muco cutâneo e em peçonhas de alguns animais (Polgár et al., 1997;
Tasumi et al., 2002).
O muco cutâneo desempenha importante papel nos animais aquáticos,
especialmente em peixes, pois atua simultaneamente como lubrificante, facilitando a
locomoção destes animais, e constitui uma barreira mecânica e bioquímica contra
ataques de patógenos (Alexander e Ingram, 1992), uma característica semelhante às das
lectinas protetoras/defensivas encontradas em plantas (Janzen et al., 1976; Barkai-Golan
et al., 1978). Várias lectinas já foram isoladas do muco cutâneo de peixes (Tasumi et
al., 2002), porém o papel destas neste tipo de secreção ainda não foi totalmente
esclarecido. Especula-se que estejam envolvidas nos mecanismos humorais de defesa
promovendo a aglutinação de bactérias, impedindo sua colonização na superfície da
pele e penetração no corpo do peixe (Suzuki et al., 2003).
Entretanto, o papel das lectinas em alguns tipos de peçonhas animais é bem
conhecido. Por exemplo, Convulxin e Agkicetin, lectinas tipo C isoladas das peçonhas
de Crotalus durissus terrificus (Polgár et al., 1997) e Agkistrodon acutus (Chen e Tsai,
1995), respectivamente, alteram a hemostasia: enquanto a primeira é um potente
agonista de agregação plaquetária e atua via receptor de colágeno p62/GPVI (Polgár et
al., 1997), a última é antagonista da aglutinação plaquetária induzida pelo fator de von
Willebrand (Chen e Tsai, 1995).
Recentemente, Evangelista (2009) purificou da peçonha de Scorpaena plumieri
uma lectina do tipo B homóloga à puflectina, encontrada no muco cutâneo do baiacu
46
(Takifugu rubripes), e a lectina GNA, de Galanthus nivalis. Magalhães e colaboradores
(2004) identificaram por análise genônica uma lectina do tipo C nas glândulas
veneníferas do niquim (Thalassophryne nattereri). Entretanto, não existem relatos de
purificação de lectinas do tipo C a partir de peçonhas de peixes.
1.12. A peçonha do peixe-escorpião preto Scorpaena plumieri
Em 2003, Haddad Jr. e colaboradores descreveram as manifestações clínicas
(locais e sistêmicas) observadas em 14 acidentes humanos com o peixe-escorpião S.
plumieri. Os principais sintomas observados foram dor intensa e irradiada, adenopatia
precoce na raiz do membro afetado, edema, eritema, náuseas, vômitos, febre, agitação,
mal-estar, sudorese, diarréia, taquicardia, arritmias e hipotensão arterial (Haddad Jr.,
2000; Haddad Jr. et al., 2003). Não foram relatados óbitos.
Em um estudo pioneiro, nosso grupo de pesquisa descreveu algumas
propriedades biológicas da peçonha de Scorpaena plumieri, as quais são semelhantes às
relatadas para outros peixes peçonhentos (Carrijo et al., 2005). A peçonha bruta (SPB)
recém-extraída produziu hemólise concentração-dependente em eritrócitos de coelhos.
Quando injetada em ratos anestesiados, a SPB induziu um aumento imediato da pressão
arterial (7-76% dos valores basais) em doses sub-letais (14-216µg/kg i.v.), a qual foi
seguida por severa hipotensão (queda inicial e rápida de 24% dos valores basais seguida
de uma diminuição gradativa até atingir a zero mmHg) em doses letais (338µg/kg i.v.).
A dose letal mediana (DL
50
i.v.) em camundongos foi de 0,28mg/kg. A análise
eletroforética da peçonha de S. plumieri revelou a presença de componentes protéicos
com massas moleculares variando de 15 a 300kDa. Assim como descrito para as
peçonhas de outros peixes, as atividades farmacológicas da peçonha de S. plumieri são
perdidas com o armazenamento, o que sugere a presença de componentes bioativos
47
instáveis (termolábeis) e/ou degradação proteolítica dos mesmos. De fato, atividade
proteolítica sobre fibrinogênio e gelatina foi identificada nesta peçonha (Andrich, 2005).
Uma protease gelatinolítica (Sp-GP) de 80kDa foi isolada desta peçonha e apresentou
homologia principalmente com proteínas de aclimatação (WAP’s) e metalo-proteinases
de matriz extracelular (MMP’s). Esta foi a primeira descrição do isolamento e
caracterização de uma protease em peçonhas de peixes marinhos.
1.13. Justificativa
A pesquisa sobre peçonhas de peixes tem sido dedicada principalmente aos
peixes-pedra (para revisão, veja Khoo, 2002) e apenas um pequeno número de estudos a
respeito da composição e atividades biológicas dos peixes-escorpião (gênero
Scorpaena) é encontrado na literatura (Carlson et al., 1971; 1973; Schaeffer et al., 1971;
Carrijo et al., 2005; Boletini-Santos et al., 2008). Para melhor conhecimento a respeito
destas intrigantes e inexploradas peçonhas, este trabalho deu continuidade ao estudo da
peçonha do peixe-escorpião preto do Atlântico Scorpaena plumieri (Bloch, 1789), e
teve como objetivo o isolamento e a caracterização (bioquímica e farmacológica) de
proteínas bioativas da mesma. Neste caso, foram obtidas e estudadas duas proteínas:
A. Proteína hemolítica/citolítica (Sp-CTx), focando seus efeitos vasculares e
identificação de semelhanças estruturais com toxinas encontradas em peçonhas
de outros peixes.
B. Proteína hemaglutinante/lectina (Sp-Lec), focando seus efeitos sobre células
sanguíneas (eritrócitos e leucócitos) e identificação de semelhanças estruturais
com lectinas de outros animais.
O conhecimento das atividades farmacológicas destas proteínas, bem como o
estudo de seus mecanismos de ação, poderão concorrer para o esclarecimento do papel
48
das mesmas no envenenamento humano pela peçonha de Scorpaena plumieri. Além
disto, estas moléculas poderão ser úteis como ferramentas para o melhor entendimento
do modo de ação de citolisinas e de lectinas.
1.14. Objetivos
OBJETIVO GERAL:
Estabelecer um modelo experimental para a purificação de proteínas bioativas de
interesse da peçonha do peixe-escorpião Scorpaena plumieri e caracterizar algumas
destas moléculas quanto as suas propriedades bioquímicas e atividades farmacológicas.
No decorrer das purificações, algumas frações foram pré-selecionadas para este estudo,
baseando-se em ensaios preliminares (seqüenciamento parcial da estrutura primária de
proteínas das frações ou pelas atividades biológicas que estas provocavam) que
indicavam as mesmas como possíveis moléculas citolíticas ou hemaglutinantes. Os
objetivos específicos foram:
A. Citolisina
1. Purificar a citolisina descrita na peçonha de Scorpaena plumieri através da
combinação de métodos cromatográficos convencionais e de alto desempenho.
2. Determinar suas propriedades bioquímicas: massa molecular (nativa e de suas
subunidades), presença de açúcares conjugados e seqüência N-terminal.
3. Verificar semelhanças da citolisina purificada com toxinas encontradas nas
peçonhas de outros peixes através de reatividade cruzada com anti-soro
específico e por comparação de suas seqüências N-terminais.
4. Determinar sua potência hemolítica.
5. Avaliar sua atividade sobre vasos isolados, incluindo sua capacidade relaxante e
dependência de fatores endoteliais.
49
B. Lectina
1. Identificar frações da peçonha de Scorpaena plumieri com atividade
hemaglutinante.
2. Purificar esta hemaglutinina/lectina através da combinação de sistema
cromatográficos de moderada e alta pressão.
3. Determinar suas propriedades bioquímicas: massa molecular, presença de
isoformas (isolectinas) e estrutura primária.
4. Identificar similaridades estruturais desta proteína com lectinas tipo C e CTLDs.
5. Avaliar sua ação aglutinante sobre eritrócitos e plaquetas.
6. Verificar sua ação mitogênica sobre leucócitos de sangue periférico.
50
2. Material
2.1. Reagentes
Os padrões protéicos de calibração foram obtidos da Pierce (Rockford, EUA), Bio-
Rad (Califórnia, EUA) e Bruker Daltonics (Billerica, EUA). O antiveneno comercial
utilizado contra a peçonha de peixes-pedra Synanceja trachynis (SFAV, StoneFish
AntiVenom) foi adquirido da Commonwealth Serum Laboratories (Melbourne, Austrália).
Os concentradores protéicos Centricon YM-10 foram adquiridos da Millipore
(Massachusetts, EUA). Os reagentes utilizados nas cromatografias foram de grau HPLC
procedentes da J.T. Baker e Merck. A resina Sephacryl S200 HR e as colunas (MonoQ HR
(0,5 x 5cm), MiniQ PE (0,46 x 5cm) e Superose 12 GL (1,0 x 30cm) foram adquiridas da
GE Life Sciences (Uppsala, Suécia). As membranas de diálise foram obtidas da Sigma (St.
Louis, EUA). Os demais reagentes utilizados neste trabalho foram de qualidade analítica,
procedentes da Merck, Sigma, Bio-Rad e Vetec. As soluções utilizadas nas cromatografias
foram preparadas em água purificada em sistema milli-Q, enquanto as utilizadas em outros
experimentos foram preparadas em água destilada.
2.2. Animais
Todos os procedimentos foram conduzidos respeitando-se as normas de proteção
aos animais, de acordo com o recomendado pelo Comitê Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA) e certificado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) sob o número 006-2009.
51
2.2.1. Peixes
Os exemplares (média de 4 a 7 por extração) de peixe-escorpião Scorpaena plumieri
(figuras 2 e 10A) foram capturados por mergulhadores licenciados pelo IBAMA (Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis), com auxílio de puçá
manual, em locais de águas rasas, próximo de rochas e recifes de coral na baía de Vitória-
ES; foram mantidos em aquário com água marinha e suprimento adequado de oxigênio, até
sua identificação e extração da peçonha. A identificação dos espécimes foi feita pela
visualização de manchas brancas sobre coloração negra na região axilar das nadadeiras
peitorais, as quais são características desta espécie (figura 10C).
2.2.2. Ratos e coelhos
Os ratos da linhagem Wistar (220-250g), utilizados nos experimentos (vasculares),
foram cedidos pelo Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas (CEBIO) da
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os coelhos da raça Nova Zelândia,
utilizados para coleta de sangue (2,5-3,0kg), foram mantidos no Biotério do Laboratório de
Venenos e Toxinas Animais (LVTA) situado no mesmo instituto. Os animais foram
mantidos em gaiolas com livre acesso à água e ração em ambientes com controle de
temperatura e luminosidade (ciclos claro e escuro de 12 em 12 horas).
Figura 10. PEIXE-ESCORPIÃO S
corpaena plumieri.
eretos. (B) Nadadeira anal e espinhos anais. (C) M
características desta espécie.
A
B
corpaena plumieri.
(A) Vista lateral de um exemplar coletado na ilha de Vitória
eretos. (B) Nadadeira anal e espinhos anais. (C) M
anchas brancas sobre coloração negra na região axilar das nadadeiras peitorais, as quais são
C
52
(A) Vista lateral de um exemplar coletado na ilha de Vitória
- ES, com os espinhos dorsais
anchas brancas sobre coloração negra na região axilar das nadadeiras peitorais, as quais são
53
3. Métodos
3.1. Obtenção da peçonha
A peçonha foi extraída dos espinhos dorsais e anais dos peixes de acordo o método
Batch, desenvolvido por Schaeffer et al. (1971). Os espinhos foram removidos dos peixes,
previamente anestesiados por resfriamento (-20°C), e fatiados manualmente com auxílio de
alicate; os fragmentos foram transferidos para um frasco contendo água ultrapura (4°C) e
manualmente homogeneizados para solubilização da peçonha. Todo o processo foi
realizado em banho de gelo. O extrato foi centrifugado a 14.000g por 30 minutos a 4ºC para
remoção de partículas insolúveis. O sobrenadante obtido corresponde à fração solúvel da
peçonha bruta (SPB), a qual foi imediatamente utilizada nos ensaios hemolíticos ou
submetida ao fracionamento. O processo de extração da peçonha de Scorpaena plumieri
está mostrado na figura 11.
3.2. Dosagem de proteína
O conteúdo de proteínas da SPB e das amostras obtidas nas etapas de fracionamento
foi determinado pelo método de Lowry et al. (1951), utilizando-se soro albumina bovina
como padrão. Em algumas amostras, devido à pequena quantidade de material protéico
obtido, o conteúdo protéico foi estimado pela relação entre a absorbância a 280nm e 260nm
(Kalckar, 1947).
A
B
Figura 11.
EXTRAÇÃO DA PEÇONHA. (A) Remoção dos espinhos dorsais do peixe. (B) Seccionamento dos
espinhos.
(C) Homogeneização dos espinhos fatiados em água purificada. (D) Fração solúvel da peçonha bruta
(SPB).
C
D
EXTRAÇÃO DA PEÇONHA. (A) Remoção dos espinhos dorsais do peixe. (B) Seccionamento dos
(C) Homogeneização dos espinhos fatiados em água purificada. (D) Fração solúvel da peçonha bruta
54
EXTRAÇÃO DA PEÇONHA. (A) Remoção dos espinhos dorsais do peixe. (B) Seccionamento dos
(C) Homogeneização dos espinhos fatiados em água purificada. (D) Fração solúvel da peçonha bruta
55
3.3. Purificação das proteínas com atividade citolítica e hemaglutinante da peçonha de
Scorpaena plumieri
O processo de purificação dos componentes protéicos com atividade citolítica e
hemaglutinante da peçonha bruta envolveu uma série de etapas de cromatografia líquida.
As atividades foram monitoradas nos eluatos obtidos de todas etapas utilizando-se ensaios
hemolíticos e aglutinantes sobre eritrócitos de coelho, conforme descrito nos itens 3.5.1.2. e
3.5.3., respectivamente.
3.3.1. Fracionamento da peçonha bruta de S. plumieri por cromatografia de filtração em gel
convencional e identificação das frações ativas de interesse
Imediatamente após a extração da peçonha, uma amostra da SPB foi aplicada em
coluna de Sephacryl S200 HR (2,0 x 120cm), equilibrada e eluída com tampão fosfato de
sódio (PB) 10mM pH 7,5 contendo 0,4M NaCl. A cromatografia foi conduzida a 4°C, com
fluxo de 10mL/hora, coletando-se frações de 2,5mL. O conteúdo protéico das frações
eluídas foi estimado pela leitura da absorbância a 280nm.
As frações com atividade hemolítica foram agrupadas (CF-I) e armazenadas a 4ºC
até seu posterior fracionamento. As frações hemaglutinantes foram agrupadas (V),
dialisadas contra água destilada a 4ºC, liofilizadas e estocadas a -20ºC até seu uso ou
fracionamento.
3.3.2. Continuidade do processo de purificação da citolisina
3.3.2.1. Cromatografia de troca iônica em sistema de moderada pressão
56
A concentração salina (NaCl) da fração ativa proveniente da etapa anterior, CF-I, foi
ajustada para 0,1M por diluição em PB 20mM pH 8,0. Posteriormente, a solução resultante
foi filtrada em membrana de 0,22µm e aplicada em coluna MonoQ HR (0,5 x 5cm),
previamente equilibrada com PB 20mM NaCl 0,1M pH 8,0 (4ºC) na plataforma FPLC,
Fast Protein Liquid Chromatography (Äkta Explorer, GE Life Sciences).
Após a adsorção do material à coluna, a cromatografia foi desenvolvida com um
gradiente segmentado (linear) do eluente (PB 20mM NaCl 0,4M pH 8,0), segundo o
programa: 0-20min: 0% eluente; 20-30min: 30% eluente; 30-80min: 80% eluente; 80-
85min: 100% eluente). O fluxo foi de 1mL/min, coletando-se frações de 1mL. As proteínas
foram detectadas pela absorvância à 214nm. As frações eluídas foram testadas quanto à
atividade hemolítica (item 3.5.1.2.), e as frações ativas foram agrupadas (CF-II).
3.3.2.2. Cromatografia de troca iônica em sistema de alta pressão
O material ativo obtido na etapa anterior (CF-II) foi diluído conforme descrito no
item anterior e submetido à cromatografia de troca aniônica em sistema HPLC, High
Pressure Liquid Chromatography (Äkta Explorer, GE Life Sciences).
A amostra foi aplicada em coluna MiniQ PE (0,46 x 5cm), previamente equilibrada
com PB 20mM NaCl 0,1M pH 8,0 (4ºC). As proteínas foram eluídas da coluna usando o
mesmo tampão do passo anterior (NaCl 0,4M em PB 20mM pH 8,0), porém executando-se
um gradiente mais lento de introdução de sal (0-10min: 0% eluente, 10-60min: 50%
eluente, 60-70min: 100% eluente). O fluxo foi de 0,83mL/min com frações de 0,4mL; as
proteínas foram detectadas pela absorção a 214nm.
57
As frações com atividade hemolítica (item 3.5.1.2) foram agrupadas (CF-III) e
concentradas à 4ºC utilizando-se recipientes Centricon YM-10.
3.3.2.3. Cromatografia de filtração em gel em sistema de moderada pressão
O material ativo proveniente da etapa anterior, CF-III, foi submetido à
cromatografia de filtração em gel em sistema FPLC (Äkta Explorer).
A cromatografia foi desenvolvida em coluna Superose 12 GL (1,0 x 30cm),
equilibrada e eluída com PB 20mM NaCl 0,3M pH 7,4 (4ºC). O fluxo foi de 0,4mL/min,
coletando-se frações de 0,2mL. As proteínas foram detectadas pela absorção a 214nm. As
frações citolíticas foram agrupadas e a amostra resultante foi denominada Sp-CTx.
Posteriormente, Sp-CTx foi concentrada como descrito na etapa anterior (item 3.3.2.2.),
estabilizada com glicerol (10% v/v) e armazenada a 4ºC até seu uso.
3.3.3. Continuidade do processo de purificação da hemaglutinina
3.3.3.1. Cromatografia de filtração em gel em sistema de moderada pressão
Amostras dialisadas contra água e liofilizadas da fração V provenientes da
cromatografia inicial de filtração em gel (item 3.3.1.) foram ressuspendidas em solução de
formiato de amônio 0,15M pH 6,3, centrifugadas a 10000rpm por 10min, e o sobrenadante
submetido à cromatografia de filtração em gel em sistema FPLC (Äkta Explorer). A
cromatografia foi desenvolvida em coluna Superose 12 GL (1,0 x 30cm), a qual foi
equilibrada e eluída com solução de formiato de amônio (0,15M pH 6,3). A separação foi
conduzida à temperatura ambiente (22ºC) com fluxo de 0,4mL/min, coletando-se frações de
0,4mL. As proteínas foram detectadas pela absorção a 214nm. As frações hemaglutinantes
58
foram agrupadas e a amostra resultante foi denominada Sp-Lec. Posteriormente, Sp-Lec foi
liofilizada e armazenada a -20ºC até seu uso.
3.3.3.2. Cromatografia de fase reversa em sistema de alta pressão
Amostras de 94µg da proteína hemaglutinante foram submetidas à cromatografia de
fase reversa de alta perfomance (HPLC) em coluna Source 5ST (0,46 x 15cm), previamente
equilibrada com solução de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% em acetronitrila (ACN) 2%,
em sistema Äkta Explorer. As proteínas foram eluídas utilizando-se um gradiente
segmentado do eluente (0,1% TFA em ACN 60%) segundo o seguinte programa: 0-10min:
0% eluente; 10-30min: 25% eluente; 30-60min: 70% eluente; 60-70min: 100% eluente. O
fluxo utilizado foi de 1mL/min. A eluição foi monitorada para absorção a 214nm.
3.4. Caracterização bioquímica das proteínas purificadas
3.4.1. Determinação do grau de pureza e massa molecular
A homogeneidade e a massa molecular das proteínas purificadas foram
avaliadas/determinadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, cromatografia de gel
filtração e espectrometria de massas. O grau de pureza de Sp-CTx e a abundância relativa
das isoformas de Sp-Lec foram quantificados por cromatografia de fase reversa.
3.4.1.1. Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS
A eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS foi realizada conforme descrito por
Laemmli (1970), utilizando-se um mini-sistema de eletroforese (Bio-Rad) com placas de
10,0cm de comprimento por 8,2cm de largura.
59
Os géis de separação (8, 10 ou 17%) foram preparados a partir de uma solução de
acrilamida-bisacrilamida em água (29,2: 0,8%), contendo 0,1% SDS p/v, 0,1% persulfato
de amônio p/v, 0,1% temed v/v e 0,375M Tris-HCl pH 8,8. O gel de concentração com
0,75mm de espessura foi preparado a 4% a partir da mesma solução de acrilamida-
bisacrilamida, contendo as mesmas proporções de SDS, temed e persulfato de amônio do
gel de separação, e Tris-HCl 0,0625M pH 6,8.
Amostras de proteínas variando entre 0,5 e 20µg, de acordo com a adequação,
foram solubilizadas em tampão Tris-HCl 0,125M pH 6,8 contendo 4% SDS p/v, 20%
glicerol p/v e 1% azul de bromofenol p/v, na ausência ou presença de 4% β-mercaptoetanol
v/v (condições não-redutoras e redutoras, respectivamente). Estas soluções foram incubadas
a 100°C por cinco minutos e, após a aplicação da amostra, a eletroforese foi conduzida à
temperatura ambiente (50V por 1h e, posteriormente, 100V até o término da corrida).
Utilizou-se Tris-HCl 0,025M, glicina 0,2M, contendo 0,1% de SDS, pH 8,3 como tampão
de corrida.
Para revelação das proteínas nos géis, utilizou-se (1) azul de coomassie ou (2)
nitrato de prata:
(1) o gel foi imerso por 30 minutos em solução 0,25% de azul de coomassie
(R-250) em metanol: ácido acético: água (5: 1: 5) e o descoramento foi
feito em metanol: ácido acético: água (1: 2: 19);
(2) o gel foi fixado com metanol : ácido acético : água (25 : 6 : 19) contendo
formaldeído 0,015% v/v por 1h, e lavado com água destilada (3 vezes
durante 20min). Em seguida, este foi tratado por 1min com solução de
60
tiossulfato de sódio 0,04% p/v, e novamente lavado com água destilada
(3 vezes durante 20min) e incubado com solução de nitrato prata (AgNO
3
0,1% p/v contendo formaldeído 0,028% v/v). Após rápida lavagem com
água destilada, as bandas protéicas foram reveladas usando solução de
Na
2
CO
3
6% p/v contendo formaldeído 0,019% v/v e tiossulfato de sódio
0,0008% p/v. Após a visualização das bandas, a reação foi paralisada
pela adição da solução fixadora sem formaldeído.
Os marcadores de massa molecular utilizados foram misturas contendo miosina
(200kDa), β-galactosidase (116kDa), fosforilase b (97kDa), soroalbumina bovina (66kDa),
ovalbumina (45kDa), anidrase carbônica (31kDa), inibidor de tripsina da soja (21kDa),
lisozima (14kDa) e aprotinina (6,5kDa). As massas moleculares foram estimadas pela
interpolação de uma plotagem semi-logarítimica linear da massa molecular pela distância
de migração relativa.
3.4.1.2. Cromatografia de gel filtração
A massa molecular da citolisina purificada, em sua forma nativa, foi estimada por
cromatografia de gel filtração em coluna Superose 12 GL (1,0 x 30cm), equilibrada e eluída
com PB 20mM NaCl 0,3M pH 7,4 (4ºC), com fluxo de 0,4mL/min. Os padrões protéicos
utilizados para calibração da coluna foram: β-amilase (200kDa), soralbumina bovina
(66kDa), ovalbumina (45kDa) e citocromo c (12,5kDa). As massas moleculares foram
estimadas pela interpolação de uma plotagem semi-logarítimica linear da massa molecular
pelo volume de eluição relativo.
3.4.1.3. Espectrometria de massas
61
As análises por espectrometria de massas (MS) ou tandem MS foram realizadas em
espectrômetro MALDI-TOF-TOF AutoFlex III (Bruker Daltonics) no modo positivo/linear
controlado pelo software Flex-Control. A calibração do aparelho foi realizada usando
Protein Calibration Standard I e II (Bruker Daltonics) como referência. As amostras foram
depositadas em placa MTP AnchorChip 400/384 (Bruker Daltonics) conjuntamente com a
matriz orgânica (ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico ou ácido sinapínico). Após a secagem, as
amostras foram submetidas à análise utilizando-se freqüência de laser entre 50-60%. Os
dados foram adquiridos nas janelas massa/carga (m/z) de 5-20kDa e/ou 20-200kDa e
analisados utilizando o software Flex-Analysis (Bruker Daltonics).
3.4.1.4. Cromatografia de fase reversa em sistema de alta pressão
Para o cálculo do grau de pureza da citolisina purificada (Sp-CTx), foi realizada
cromatografia de fase reversa de alta perfomance (HPLC) em coluna Source 15ST (0,46 x
10cm), previamente equilibrada com solução de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% em
acetronitrila (ACN) 2%, usando sistema Shimadzu LC-10. As proteínas foram eluídas
utilizando-se gradiente segmentado do eluente (0,1% TFA em ACN), segundo o seguinte
programa: 0-10min: 0% eluente; 10-70min: 60% eluente; 70-75min: 100% eluente. O fluxo
utilizado foi de 2mL/min. A eluição foi monitorada pela absorção a 214nm. O percentual de
pureza foi calculado pela relação entre a área integrada sob o pico principal (Sp-CTx) e a
área total do cromatograma.
Para o cálculo da abundância relativa das isoformas da hemaglutinina purificada
(Sp-Lec), foi realizada cromatografia de fase reversa conforme descrito no item 3.3.3.2. O
62
percentual de abundância foi determinado pela relação entre o conteúdo protéico obtido
para cada isoforma e o conteúdo protéico total (somatório das isoformas).
3.4.2. Determinação da presença de carboidratos
A presença de carboidratos na citolisina purificada (Sp-CTx) foi avaliada
utilizando-se a coloração com reagente Ácido Periódico-Schiff (PAS) em géis de
poliacrilamida (item 3.4.1.1.), de acordo com Fairbanks et al. (1971).
Após a eletroforese, o gel foi fixado em solução de ácido acético : metanol : água
(10 : 35 : 55) por 1 a 2 horas e incubado com solução de ácido periódico (H
5
IO
6
0,7% p/v)
por 1h. Após breve lavagem com água destilada, o gel foi incubado em solução de Na
2
S
7
O
5
0,2% p/v por 10min, ficando com coloração amarelada. A solução de Na
2
S
7
O
5
foi trocada e
aguardou-se a descoloração do gel. Em seguida, este foi imerso no reagente de Schiff (i) até
o aparecimento de bandas de coloração rósea, indicativo da presença de glicoproteínas.
i. Preparo do reagente de Schiff
Cerca de 800mL de água destilada foram aquecidos até 100ºC e adicionaram-se 4g
de fuccina básica, agitando-se durante 5min. Após resfriamento da solução em banho de
gelo até aproximadamente 50ºC, adicionaram-se 90mL de HCl 1M. A solução acidificada
foi novamente resfriada (25ºC), foram adicionados 6,8g de metabissulfito de sódio
(Na
2
S
7
O
5
) e a solução resultante foi incubada a 4ºC overnight em ambiente escuro.
Posteriormente, procedeu-se a remoção de componentes insolúveis por adsorção com
carvão ativado (20g) e filtração. O reagente obtido foi armazenado em frasco âmbar a 4ºC
até seu uso.
63
3.4.3. Determinação da estrutura primária
3.4.3.1. Redução e alquilação
A redução de pontes dissulfeto da proteína purificada, passo preliminar para o
seqüenciamento, foi realizada com β-mercaptoetanol. Os grupos –SH formados eram
bloqueados através de alquilação com vinilpiridina, de acordo com o método descrito por
Henschen (1986).
Uma amostra da proteína isolada liofilizada (~1mg) foi dissolvida em 1mL de
tampão Tris-HCl 0,6M pH 8,6 contendo 6M de guanidina, e em seguida foram adicionados
30µl de β-mercaptoetanol sob fluxo de nitrogênio. A solução foi incubada à 50ºC por 4
horas. A seguir, foram acrescentados 40µl de vinilpiridina e a amostra foi incubada sob
fluxo constante de nitrogênio a 37ºC durante duas horas, na ausência de luz. A amostra
reduzida e S-alquilada (RA) foi purificada por cromatografia de fase reversa em coluna
analítica Vydac C
18
(0,46 x 25cm, HPLC). A coluna foi previamente equilibrada com
solução aquosa de TFA 0,1%, e as proteínas eluídas utilizando-se gradiente linear de 0 a
60% v/v do eluente (TFA 0,1% em acetonitrila) durante 120 minutos, com fluxo de
1mL/min. As proteínas eluídas foram detectadas a 214nm e coletadas manualmente. A
amostra purificada reduzida e alquilada (proteína-RA) foi liofilizada para utilização nas
etapas posteriores do seqüenciamento.
3.4.3.2. Clivagens enzimáticas da enzima reduzida e alquilada
64
Amostras de ~500µg da proteína-RA foram submetidas a processos de hidrólise
enzimática, utilizando-se tripsina e protease V8 de Staphylococcus aureus, seguindo a
metodologia descrita por Aitken et al. (1989).
As amostras foram solubilizadas em 200ul de uréia 8M. Em seguida, adicionaram-
se 1,8mL de bicarbonato de amônio 0,1M pH 7,9 e 10µl de solução de 1mg/mL de tripsina
ou protease V8 em bicarbonato de amônio 0,1M pH 7,9. As soluções resultantes foram
incubadas com agitação intermitente a 37°C durante 4 horas (tripsina) e 24 horas (protease
V8). Decorrido o tempo de incubação de digestão enzimática, fez-se imediatamente a
separação dos fragmentos peptídicos resultantes por cromatografia de fase reversa em
coluna analítica Vydac C
18
Smallpore (0,46 x 25cm, HPLC). A coluna foi previamente
equilibrada com solução aquosa de TFA 0,1%, e as proteínas eluídas utilizando um
gradiente linear de 0 a 60% v/v do eluente (TFA 0,1% em acetonitrila) durante 120
minutos, com fluxo de 1mL/min. Os fragmentos protéicos foram detectados a 214nm,
coletados manualmente e liofilizados para posterior seqüenciamento dos aminoácidos N-
terminais.
3.4.3.3. Determinação da seqüência de aminoácidos
Para determinação da seqüência de aminoácidos, amostras da proteína-RA intacta
(200 e 500pmoles) e dos fragmentos obtidos por hidrólise enzimática foram submetidas à
degradação automática de Edman, usando um seqüenciador automático de proteínas
(Shimadzu PPSQ-21), segundo as especificações do fabricante.
3.5. Caracterização farmacológica das proteínas purificadas
65
3.5.1. Ensaio de atividade hemolítica direta
A atividade hemolítica foi testada sobre eritrócitos de coelho, os quais são altamente
sensíveis às peçonhas de peixes (Shiomi et al., 1989; Kreger, 1991), de acordo com o
método descrito por Habermann et al. (1981) com algumas modificações.
3.5.1.1. Preparação da suspensão de eritrócitos
O sangue do coelho foi coletado por punção cardíaca e imediatamente misturado
com solução anticoagulante de Alsever (glicose 2,05%, cloreto de sódio 0,42%, citrato tri-
sódico 0,8%, ácido cítrico 0,055% em água destilada; Alsever e Ainslie, 1941) na
proporção 1:1. Para obtenção das hemácias, uma alíquota do sangue não-coagulado foi
diluída (1:10 v/v) em solução salina (NaCl 0.15M) e centrifugada a 3000g por 3min. O
sobrenadante foi descartado e as hemácias foram ressuspendidas em salina e novamente
centrifugadas (3000g por 3min). Este procedimento foi repetido por três vezes ou até a
obtenção de um sobrenadante incolor. As células lavadas foram ressuspendidas em salina
(para mapeamento cromatográfico) ou tampão fosfato com salina (PBS) (determinações dos
valores de EC
50
) de maneira a obter uma suspensão 2% (v/v).
Para os ensaios utilizando eritrócitos tripsinizados, uma alíquota da suspensão de
hemácias obtida foi incubada com tripsina (1mg/mL) a 37°C durante 1h e, em seguida,
lavada como descrito acima.
3.5.1.2. Mapeamento da atividade hemolítica
A atividade hemolítica das frações obtidas nas etapas cromatográficas foi avaliada
por incubação de alíquotas de 2-25µL das frações (contidas em 1mL de salina) com 100µL
66
da suspensão de eritrócitos ressuspendida em salina a 25ºC durante 10min. Em seguida, as
misturas foram centrifugadas a 14.000g (1min, 25ºC) e a hemoglobina liberada foi
detectada por medida da densidade óptica do sobrenadante a 540nm em espectrofotômetro.
Os ensaios foram realizados em duplicata.
3.5.1.3. Determinação da EC
50
A EC
50
(concentração efetiva necessária para induzir hemólise de 50% dos
eritrócitos em suspensão) das frações hemolíticas agrupadas nas diferentes etapas
cromatográficas, assim como da peçonha bruta de S. plumieri, foi determinada por
incubação de concentrações crescentes (0,1-10.000ng/mL) das amostras (contidas em
200µL de PBS) com 22µL de suspensão de eritrócitos de coelho lavados com PBS (pH 7,4)
a 37ºC durante 30min. Em seguida, as misturas foram centrifugadas a 14.000g (1min, 25ºC)
e a hemoglobina liberada foi detectada por medida da densidade óptica do sobrenadante a
540nm em leitor de ELISA (espectrofotômetro para placas de 96 poços). Os ensaios foram
realizados em triplicata.
3.5.1.4. Ensaios de proteção
Os efeitos protetores do anti-soro desenvolvido contra a peçonha de peixes-pedra
(SFAV) e os efeitos da clivagem das proteínas de superfície das hemácias também foram
avaliados sobre a hemólise induzida por Sp-CTx.
Uma quantidade de toxina suficiente para induzir o EC
50
de atividade hemolítica
sobre eritrócitos lavados de coelho (0,46nM) foi pré-incubada com SFAV (1U:2µg de
proteína) ou PBS durante 10min a 25°C. Em seguida, a atividade citolítica residual foi
67
executada como descrito para as determinações de EC
50
(item 3.5.1.3) sobre eritrócitos
tripsinizados (item 3.5.1.1.) e não-tripsinizados.
3.5.1.5. Determinação do percentual de hemólise causado pela peçonha ou toxina
Os resultados foram expressos como percentual de hemólise, calculado pela relação
entre a absorção do sobrenadante dos tubos teste (eritrócitos incubados com a peçonha ou
toxina) e dos tubos controle positivo (eritrócitos incubados em água destilada, 100%
hemólise).
3.5.2. Reatividade vascular
Para avaliar os possíveis efeitos da citolisina purificada (Sp-CTx) sobre preparações
vasculares, sua atividade foi avaliada sobre anéis de aorta de rato pré-contraídos com
fenilefrina.
3.5.2.1. Preparação dos anéis de aorta
Os anéis de aorta foram preparados conforme descrito por Santos et al. (2003).
Ratos Wistar machos (220-250g) foram decapitados e a aorta torácica foi dissecada. Após a
remoção do tecido circundante, a aorta foi cortada em anéis de aproximadamente 4mm de
comprimento, os quais foram suspensos em banho de órgãos (volume de 10mL) contendo
solução de Krebs-Henseleit (NaCl 118mM, NaHCO
3
23,8mM, KCl 4,83mM, KH
2
PO
4
0,96mM, MgSO
4
1,20mM,
HEPES 12,5mM, glicose 5,0mM e CaCl
2
1,53mM, pH 7,4),
aerada com mistura carbogênica (5% CO
2
em oxigênio). Um transdutor de força-
deslocamento (Ugo Basile, modelo 7006) foi acoplado ao sistema para medição de força
isométrica. Todos os experimentos foram realizados a 37 ± 1ºC, e a preparação foi
68
submetida a uma tensão basal de 1,0-1,5g. Para realização de experimentos com endotélio
intacto, foram tomadas precauções para não danificar o mesmo. Nos experimentos com
anéis de aorta desprovidos de endotélio funcional, este foi removido através de fricção com
uma haste metálica na luz do vaso.
3.5.2.2. Protocolo experimental
A atividade vasorelaxante de Sp-CTx foi ensaiada em anéis de aorta com endotélio
íntegro e desprovido de endotélio funcional, pré-contraídos pela administração de
concentrações submáximas de fenilefrina (0.1µM). Amostras de Sp-CTx foram adicionadas
em concentrações crescentes e acumulativas (0.0001–1nM) após a resposta à fenilefrina ter
estabilizado. Para verificar a participação de produtos derivados do endotélio sobre a
resposta vasorelaxante induzida por Sp-CTx, foram realizados experimentos na presença de
N
G
-Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME, 1µM), o qual foi adicionado ao banho 20min
antes da adição de fenilefrina. Como controle para os protocolos acima relacionados, um
anel aórtico de cada rato foi simultaneamente monitorado para os efeitos de Sp-CTx. O
efeito vasodilatador de Sp-CTx foi expressado como percentual de decréscimo da máxima
contração induzida pela fenilefrina.
Para verificar a integridade do endotélio dos vasos, acetilcolina (10µM) foi
adicionada ao banho após a contração induzida por fenilefrina ter atingido um plateau. O
endotélio foi considerado “íntegro” quando um relaxamento de 80% foi atingido após a
administração de acetilcolina, e considerado “desnudo” quando o relaxamento foi menor
que 10% (Santos et al., 2003).
3.5.3. Ensaio de hemaglutinação
69
A atividade hemaglutinante de frações purificadas da peçonha de Scorpaena
plumieri foi avaliada sobre eritrócitos de coelho, rato e humano (tipo B), os quais foram
lavados conforme descrito no item 3.5.1.1. Os ensaios de aglutinação foram realizados em
placas de microtitulação contendo 96 poços com fundo cônico, o que possibilita a
visualização do sedimento das hemácias que não se aglutinam.
Os poços foram preenchidos com 50µl tampão Tris-HCl 20mM NaCl 0,15M pH 7,5
(TBS), ou então TBS contendo ions Ca
+2
(10mM) ou TBS contendo agente quelante
(EDTA 1mM). Em seguida, foram acrescidos de 50µl da amostra nos primeiros poços das
fileiras. A amostra foi então diluída serialmente, com agitação e transferência de 50µl para
o poço seguinte até o penúltimo poço da fila. Terminadas as diluições, foram adicionados
50µl da suspensão de eritrócitos a 2,5 % (v/v).
As placas foram mantidas em repouso por aproximadamente 1 hora à temperatura
ambiente (25ºC). A concentração mínima que permite visualizar os eritrócitos aglutinados
foi denominada título hemaglutinante.
3.5.4. Atividade mitogênica sobre células mononucleares humanas
Para avaliação da atividade mitogênica de frações hemaglutinantes purificadas,
foram utilizadas PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) humanas, obtidas por
centrifugação do sangue em presença de um gradiente de densidade formado por Ficoll-
Hypaque, segundo Diniz e colaboradores (1999). O sangue foi obtido de pacientes
voluntários, sãos e que não estavam tomando medicamentos no período de 10dias.
70
As células foram cultivadas em placas de 96 poços (2x10
5
células por poço) em
meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementadas com 10% de soro AB
+
humano inativado. Diferentes concentrações da fração V (30, 60, 125, 250 e 375µg/mL),
obtida na primeira etapa de fracionamento, e da lectina purificada Sp-Lec (2, 4 e 8µM),
foram ressuspendidas em tampão estéril, e adicionadas aos poços contendo PBMCs. Cada
estímulo foi realizado em triplicata e as células foram incubadas por 120h em estufa a 37
º
C,
com 5% de CO
2
. O aumento da viabilidade celular (atividade mitogênica) resultante foi
comparado com o da fitoemaglutinina do feijão vermelho Phaseolus vulgaris (PHA 0,12;
0,50; e 1nM – controle positivo) e das células suplementadas somente com o meio (controle
negativo).
A viabilidade celular foi avaliada pela reação de redução do substrato
metiltetrazólio (MTT, solúvel em água e com coloração amarelada) em cristais de formazan
(composto insolúvel em água e com coloração azulada) por desidrogenases presentes nas
mitocôndrias das células viáveis, segundo método descrito por Mosmann e colaboradores
(1983).
Após as 120h de incubação, o meio de cultura de cada poço foi retirado e foram
adicionados 105µL de novo meio de cultura basal e 85µL de solução de MTT 5mg/mL. A
placa foi novamente incubada em estufa com 5% de CO
2
a 37°C por 2 horas e, em seguida,
as células foram observadas em microscópio óptico para a visualização dos cristais de
formazan. Foram acrescentados em cada poço 55µL de solução de SDS 10% em HCl e a
placa foi mantida overnight a 25°C (temperatura ambiente) para solubilização dos cristais.
Em seguida, foi procedida a leitura da absorbância dos sobrenadantes a 595nm em leitor
automático de microplacas (Elx800, Bio-Tek, Instruments Inc.).
71
3.5.5. Agregação plaquetária
A atividade da lectina purificada da peçonha de Scorpaena plumieri (Sp-Lec)
também foi avaliada sobre plaquetas humanas.
Amostras de sangue venoso, de um doador voluntário, foram coletadas em tubos
contendo anticoagulante (citrato de sódio 3,2%) e os elementos figurados foram
sedimentados por centrifugação (100g, 10min, a 4°C). O sobrenadante obtido, plasma rico
em plaquetas (PRP), foi coletado e transferido para outro tubo. O sedimento restante, foi
centrifugado a 1500g por 10 minutos a 4°C para extrair o plasma pobre em plaquetas
(PPP).
A agregação plaquetária foi induzida pela adição de adenosina difosfato (ADP),
potente agonista da agregação plaquetária via receptores purinérgicos P2Y
1
e P2cyc. Como
controle positivo do ensaio, amostras de 450uL do PRP e também 450uL do PPP foram
incubadas com 10µg de ADP a 37°C sob agitação por 10min. Amostras liofilizadas da
lectina purificada (0,63µM; 1,25µM; 2,5µM e 5,0µM) foram solubilizadas em 50µL de
tampão HEPES 20mM NaCl 50mM pH 7,5 e, em seguida, submetidos ao teste de indução e
inibição de agregação plaquetária, respectivamente, na ausência e na presença de ADP. O
efeito foi registrado em agregômetro (Platelet Aggregation Chromogenic Kinetic System,
modelo PACKS-04, Helena Laboratories, Beaumont, Texas) acoplado a um sistema de
aquisição de dados.
3.5.6. Análise estatística dos dados
72
Os resultados dos ensaios farmacológicos foram apresentados como média ± erro
padrão da média (EPM), e o número de experimentos foi referido como “n”. Os dados
foram comparados por análise de variância em duas vias (ANOVA) utilizando pós-teste de
Bonfferroni (software Prisma 4.0). As diferenças estatísticas foram fixadas como sendo
significativas para *p<0,05.
73
4. Resultados
4.1. Purificação
Através de um processo compreendendo várias etapas cromatográficas, duas
proteínas bioativas, Sp-CTx (Scorpaena plumieri Cytolytic Toxin) e Sp-Lec (Scorpaena
plumieri Lectin), foram isoladas da peçonha de S. plumieri. O fluxograma que resume o
isolamento destas toxinas está mostrado na figura 12.
4.1.1. Primeira etapa: cromatografia de filtração em gel em coluna de Sephacryl S200
HR
A cromatografia de filtração molecular em sistema convencional foi utilizada
como passo inicial de purificação e originou sete grupos protéicos principais (I-VII,
figura 13). Nesta etapa, foram detectadas frações protéicas com as duas atividades de
interesse (hemolítica e hemaglutinante).
A segunda fração, nomeada CF-I (Cytolytic Fraction I), exibiu atividade
citolítica contra eritrócitos lavados de coelho e representou 22% do total de proteína da
peçonha bruta aplicada na coluna (tabela III). O EC
50
para a atividade hemolítica da
fração CF-I foi 431ng/mL (figura 17), a qual foi 1,6 vezes mais hemolítica que a
peçonha bruta. Já a fração V apresentou atividade hemaglutinante sobre eritrócitos
lavados de coelho, com concentração mínima aglutinante de 16µg/mL, e representou
9% do total de proteína da peçonha bruta aplicada na coluna (tabela IV).
Fração I
Fração II
(CF-I)
Q1 Q2 Q3
Q4
Q5A
(CF
Q5Aa
Fração III
Figura 12. FLUXOGRAMA DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE Sp
As atividades hemolítica e hemaglutinante foram monitoradas nas etapas cromatográficas de acordo com os itens 3.5.1. e 3.5.3.
respectivamente. CF, Cytolytic Fraction; Sp-
CTx,
Filtração
em gel
em S
uperose 12 GL
Troca Aniônica em MonoQ HR
Troca Aniônica em MiniQ PE
Fração Solúvel da Peçonha Bruta (SPB)
Q5
(CF-II)
Q5A
(CF
-III)
Q5Ab
(Sp-CTx)
Q5B
Q6
Fração III
Fração IV
Fração V
S1 S2
(Sp
Sp-Lec I Sp-Lec II Sp-Lec III
Figura 12. FLUXOGRAMA DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE Sp
-CTx e Sp-
Lec A PARTIR DA PEÇONHA
As atividades hemolítica e hemaglutinante foram monitoradas nas etapas cromatográficas de acordo com os itens 3.5.1. e 3.5.3.
CTx,
Scorpaena plumieri Cytolytic Toxin; Sp-Lec,
Scorpaena plumieri
Filtração
em gel
em Sephacryl S200 HR
Fração V
S3
(Sp
-Lec)
Sp-Lec IV Sp-Lec V Sp-Lec VI
S4 S5
Fração VI
Fração
VII
Lec A PARTIR DA PEÇONHA
DE Scorpaena plumieri.
As atividades hemolítica e hemaglutinante foram monitoradas nas etapas cromatográficas de acordo com os itens 3.5.1. e 3.5.3.
,
Scorpaena plumieri
Lectin.
em Sephacryl S200 HR
Filtração em gel em Superose 12 GL
Fase Reversa em Source 5ST
75
0 100 200 300
0.0
0.5
1.0
1.5
0
25
50
75
100
(CF-I)
I
II
III
IV
V
VI
VII
Tubos (n°
°°
°)
A280nm (
)
% Hemólise (-
-)
Figura 13. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FILTRAÇÃO EM GEL DA FRAÇÃO
SOLÚVEL DA PEÇONHA DO PEIXE-ESCORPIÃO Scorpaena plumieri. Coluna de
Sephacryl S 200 HR (2,0 x 120cm), equilibrada e eluída com tampão fosfato de sódio
10mM pH 7,5 contendo NaCl 0,4M, a 4°C. Amostra: fração solúvel da peçonha
(49,2mg de proteínas). O fluxo foi de ~10mL/hora com frações de 2,5mL/tubo. O
conteúdo protéico do eluato foi detectado pela leitura da absorbância a 280nm e 2µL das
frações foram ensaiados para atividade citolítica. CF-I e V representam frações com
atividade hemolítica e hemaglutinante, respectivamente.
76
4.1.2. Continuidade da purificação da citolisina presente na peçonha de Scorpaena
plumieri
4.1.2.1. Segunda etapa: cromatografia de troca aniônica em coluna MonoQ 5/5 HR
Para a segunda etapa de purificação de Sp-CTx utilizou-se cromatografia de
troca aniônica em coluna MonoQ em um sistema cromatográfico Fast Protein Liquid
Chromatography (FPLC). Este processo separou CF-I em seis frações principais (figura
14) e somente o pico protéico eluído com aproximadamente 0,24M de NaCl continha o
fator citolítico. Esta fração, chamada CF-II e cujo EC
50
foi 132ng/mL (figura 17),
representou 6,5% da atividade hemolítica da peçonha total (tabela III).
4.1.2.2. Terceira etapa: cromatografia de troca aniônica em coluna MiniQ 4.6/5 PE
Subseqüentemente, CF-II foi fracionada em coluna MiniQ, a qual apresenta
maior resolução que a utilizada na etapa anterior, em sistema de cromatografia líquida
de alta pressão (HPLC, High Pressure Liquid Chromatography), o que resultou em duas
frações protéicas principais (figura 15). No entanto, somente a primeira (eluída com
uma concentração aproximada de 0,1M de NaCl), apresentou atividade sobre eritrócitos
de coelho. Esta fração, denominada CF-III, foi 10,6 vezes mais potente que a peçonha
bruta (EC
50
65ng/mL) (tabela III; figura 17).
4.1.2.3. Quarta etapa: cromatografia de filtração em gel em coluna Superose 12 10/30
GL
A fração ativa obtida na etapa anterior (CF-III) foi submetida à cromatografia de
filtração em gel em sistema FPLC. Neste processo obteve-se um pico protéico simétrico
77
0 25 50 75
0
200
400
600
0
25
50
75
100
Q5 (CF-II)
Q1
Q2
Q3
Q4
Q6
Volume (mL)
mAU 214nm (
)
% Eluente (---)
% Hemólise (-
-)
Figura 14. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE TROCA ANIÔNICA DA FRAÇÃO
CF-I. Coluna de troca aniônica MonoQ HR (0,5 x 5cm, FPLC) equilibrada com tampão
fosfato de sódio 20mM pH 8,0 contendo NaCl 100mM mantido em banho de gelo. As
proteínas foram eluídas da coluna com gradiente segmentado usando o eluente (tampão
fosfato de sódio 20mM pH 8,0 contendo NaCl 400mM). Amostra: CF-I (1,7mg). O
fluxo foi de 1mL/min com frações de 1mL. O conteúdo protéico do eluato foi detectado
pela leitura da absorbância a 214nm e 7µL de cada fração foram ensaiados para
atividade citolítica em eritrócitos lavados de coelho. CF-II, frações ativas agrupadas.
78
0 20 40 60
0
50
100
150
0
25
50
75
100
Q5A (CF-III)
Q5B
Volume (mL)
mAU 214nm (
)
% Eluente (---)
% Hemólise (-
-)
Figura 15. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE TROCA ANIÔNICA DA FRAÇÃO
CF-II. Coluna de troca aniônica MiniQ PE (0,46 x 5cm, HPLC) equilibrada com tampão
fosfato de sódio 20mM pH 8,0 contendo NaCl 100mM mantido em banho de gelo. As
proteínas foram eluídas da coluna com gradiente linear do eluente (tampão fosfato de
sódio 20mM pH 8,0 contendo NaCl 400mM). Amostra: CF-II (100µg). O fluxo foi de
0,83mL/min com frações de 0,4mL. O conteúdo protéico do eluato foi detectado pela
leitura da absorbância a 214nm e 10µL das frações ensaiados para atividade citolítica
em eritrócitos lavados de coelho. CF-III, frações com atividade citolítica.
79
cujas frações apresentaram atividade específica (hemolítica) constante, sugerindo a
homogeneidade da amostra (figura 16). Este material foi chamado Sp-CTx (Scorpaena
plumieri Cytolytic Toxin) e sua atividade foi mantida por até 4 semanas quando
armazenado a 4ºC em PB 20mM NaCl 0,3M pH 7,4 contendo glicerol 10% (v/v).
4.1.3. Continuidade da purificação da hemaglutinina presente na peçonha de Scorpaena
plumieri
4.1.3.1. Segunda etapa: cromatografia de filtração em gel em coluna Superose 12
A fração com atividade hemaglutinante (V) obtida na cromatografia de filtração
molecular (figura 13) foi posteriormente fracionada por outra cromatografia de filtração
em gel (sistema FPLC), o que levou à separação de cinco subfrações (S1 a S5) (figura
18). Somente as frações S1 e S3 induziram hemaglutinação em eritrócitos de coelho
(dados não mostrados). A fração S3 foi escolhida para dar continuidade ao
fracionamento da atividade hemaglutinante devido à maior quantidade de material
obtido. Esta fração foi denominada Sp-Lec (Scorpaena plumieri Lectin) e representou
3,2% do total de proteína da peçonha bruta aplicada na coluna (tabela IV).
4.1.3.2. Terceira etapa: cromatografia de fase reversa em coluna Source 5ST
A fração hemaglutinante Sp-Lec (figura 18) foi submetida a cromatografia de
fase reversa em sistema HPLC. Este processo separou esta amostra em seis grupos
protéicos distintos, Sp-Lec I-VI (figura 19), os quais apresentaram similar
retenção/interação com a coluna (tabela V, % ACN para eluição). Estas frações não
foram testadas para aglutinação de eritrócitos devido à pequena quantidade de material
obtido. As principais frações protéicas obtidas, Sp-Lec III e Sp-Lec V, representam,
80
0 8 16 24
0
500
1000
1500
0
25
50
75
100
Q5Ab (Sp-CTx)
A
BC
D
Q5Aa
Volume (mL)
mAU 214nm (
)
% Hemólise (-
-)
Figura 16. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FILTRAÇÃO EM GEL DA FRAÇÃO
CF-III. Coluna Superose 12 GL (1,0 x 30cm, FPLC), equilibrada e eluída com tampão
fosfato de sódio 20mM pH 7,4 contendo NaCl 0,3M mantido em banho de gelo.
Amostra: CF-III (92µg). O fluxo foi de 0,4mL/min com frações de 0,2mL. O conteúdo
protéico do eluato foi detectado pela absorbância a 214nm e 20µL das frações foram
ensaiados para atividade citolítica em eritrócitos lavados de coelho. As setas sobre o
cromatograma indicam o volume de eluição de marcadores de massa molecular: (A) β-
amilase (200kDa), (B) soroalbumina bovina (67kDa), (C) ovoalbumina (45kDa) e (D)
citocromo C (12,5kDa). Sp-CTx, frações citolíticas agrupadas. A massas molecular da
proteína purificada (Sp-CTx) foi estimada pela interpolação de uma plotagem semi-
logarítimica linear da massa molecular pelo volume de eluição relativo (Anexo I).
81
TABELA III. PURIFICAÇÃO DE Sp-CTx (Scorpaena plumieri Cytolytic Toxin) A PARTIR DA PEÇONHA DO PEIXE-ESCORPIÃO.
Etapa de
Purificação
Fração
Hemolítica
Figura de
Referência
Recuperação
Protéica (mg)
EC
50
(ng/mL)
Recuperação de
Atividade (EC
50
)
Fator de
Purificação
Rendimento
(%)
Peçonha bruta (SPB) - - 84,26 688 122471 1,0 100,0
1ª. Sephacryl S200 HR
CF-I 13 18,53 431 42993 1,6 35,1
2ª. MonoQ HR CF-II 15 1,06 132 8030 5,2 6,6
3ª. MiniQ PE CF-III 16 0,18 65 2769 10,6 2,3
4ª. Superose 12 GL Sp-CTx 17 0,07 56 1250 12,3 1,0
Figura 17
. ATIVIDADE HEMOLÍTICA D
(SPB), DAS FRAÇÕES CITOLÍTICAS SEMI
E DA CITOLISINA ISOLADA (Sp
amostras, em d
iferentes concentrações
2% (v/v) em PBS por 30min a 37
de hemólise (detectada pela absorção a 540nm da hemoglobina liberada) por
comparação com controle positivo (hemácias incubadas c
símbolos
representam a média ± erro padrão da média de ensa
. ATIVIDADE HEMOLÍTICA D
A PEÇONHA DE
Scorpaena plumieri
(SPB), DAS FRAÇÕES CITOLÍTICAS SEMI
-PURIFICADAS (CF-I, CF-
II E CF
E DA CITOLISINA ISOLADA (Sp
-CTx) S
OBRE ERITRÓCITOS DE COELHO.
iferentes concentrações
,
foram incubadas com suspensão de eritrócitos
2% (v/v) em PBS por 30min a 37
˚C. O
s resultados foram expressos como porcentagem
de hemólise (detectada pela absorção a 540nm da hemoglobina liberada) por
comparação com controle positivo (hemácias incubadas c
om água destilada). Os
representam a média ± erro padrão da média de ensa
io realizado em triplicata.
82
Scorpaena plumieri
II E CF
-III)
OBRE ERITRÓCITOS DE COELHO.
As
foram incubadas com suspensão de eritrócitos
s resultados foram expressos como porcentagem
de hemólise (detectada pela absorção a 540nm da hemoglobina liberada) por
om água destilada). Os
io realizado em triplicata.
83
0 8 16 24
0
500
1000
1500
2000
2500
S1
S2
S3 (Sp-Lec)
S4
S5
Volume (mL)
mAU 214nm (
)
Figura 18. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FILTRAÇÃO EM GEL DA FRAÇÃO
V. Coluna Superose 12 GL (1,0 x 30cm, FPLC), equilibrada e eluída com solução de
formiato de amônio 0,15M pH 6,3. Amostra: Fração V (~1mg), obtida na primeira etapa
de fracionamento. O fluxo foi de 0,4mL/min com frações de 0,4mL. O conteúdo
protéico do eluato foi detectado pela leitura da absorbância a 214nm. O mapeamento da
atividade hemaglutinante sobre eritrócitos lavados de coelho está mostrado acima do
gráfico; as barras horizontais delimitam as frações com atividade aglutinante. O gráfico
inserido mostra o perfil cromatográfico obtido em uma escala menor.
6 12 18 24
0
50
100
150
200
S1
S2
S3 (Sp-Lec)
S4
S5
Volume (mL)
mAU 214nm (
)
84
0 10 20 30 40 50
0
25
50
75
100
0
20
40
60
I
II
III
IV
VI
V
Volume (mL)
mAU 280nm (
)
% ACN (---)
Figura 19. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA DE Sp-Lec.
Coluna Source 5ST (0,46 x 15cm) equilibrada com TFA 0,1% em ACN 2%. As
proteínas foram eluídas utilizando-se um gradiente linear de 35-45% de TFA 0,1% em
acetonitrila a 23˚C. Amostra: Sp-Lec (94µg). O fluxo foi de 1mL/min. O conteúdo
protéico do eluato foi detectado pela leitura da absorbância a 214nm.
85
TABELA IV. PURIFICAÇÃO DE Sp-Lec (Scorpaena plumieri Lectin) A PARTIR DA PEÇONHA DO PEIXE-ESCORPIÃO.
Etapa de Purificação Fração Hemaglutinante Figura de Referência
Recuperação Protéica (mg)
Atividade Hemaglutinante Mínima (µg/mL)
Peçonha bruta (SPB) - - 49,21 Não possui, provoca hemólise.
1ª. Sephacryl S200 HR Fração V 13 4,45 16,0
2ª. Superose 12 GL S1 18 0,01 < 0,5
S3 (Sp-Lec) 1,58 500,0
3ª. Source 5 ST Sp-Lec I 19 0,01 *nd
Sp-Lec II 0,20 *nd
Sp-Lec III 0,56 *nd
Sp-Lec IV 0,24 *nd
Sp-Lec V 0,47 *nd
Sp-Lec VI 0,10 *nd
*nd, não determinada.
86
TABELA V. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS E ABUNDÂNCIA RELATIVA DAS ISOFORMAS DE Sp-Lec.
*nd, não determinada
Isoforma % ACN para Eluição Massa Molecular (Da) Seqüência N-terminal Abundância Relativa (%)
Sp-Lec I 36,8 15.850,89 *nd 0,7
Sp-Lec II 37,4 16.981,21 *nd 12,4
Sp-Lec III 38,0 16.975,71 DAEPPXGPAE 35,7
Sp-Lec IV 39,0 16.970,45 *nd 15,2
Sp-Lec V 39,4 16.835,74 TAEPPSPAEEXAAVKME 29,8
Sp-Lec VI 40,0 16.842,16 Bloqueado 6,2
87
respectivamente, 1,1 e 1,0% do total de proteína da peçonha bruta aplicada na coluna
(tabela IV).
4.2. Caracterização bioquímica das proteínas purificadas
4.2.1. Análise da homogeneidade e da massa molecular
A homogeneidade das preparações das proteínas purificadas foi avaliada por
cromatografia de fase reversa, SDS-PAGE e espectrometria de massas. Os dois últimos
métodos, em conjunto com a cromatografia de filtração molecular, também foram
utilizados para determinar as massas moleculares de Sp-CTx e Sp-Lec.
Um grau de pureza de 98% foi calculado para a amostra de Sp-CTx por
cromatografia de fase reversa-HPLC (figura 20). A análise de Sp-CTx por SDS-PAGE
(figura 21) revelou a presença de uma banda protéica difusa de 73kDa em condições
não-redutoras. O espectro obtido por MALDI-TOF mostra a presença de três curvas
distintas com relações massa/carga (m/z) de aproximadamente 33.000, 65.000 e 132.000
(figura 22). Entretanto, a massa molecular de Sp-CTx foi estimada em 121kDa por
cromatografia de filtração em gel (figura 17). A análise conjunta destes dados sugere
que Sp-CTx é uma proteína de 121kDa constituída de duas subunidades de
aproximadamente 65kDa, as quais são unidas por ligações não-covalentes.
Análise da fração Sp-Lec por SDS-PAGE mostrou a presença de uma banda
protéica larga com migração equivalente a 11kDa (condições não-redutoras) e 22kDa
(condições redutoras) (figura 23B). A análise de Sp-Lec por espectrometria de massas
(MALDI-TOF) mostra a presença de sinais com relações massa/carga (m/z) de
aproximadamente 16800, 17000 e 17200 (janela 10-20kDa) e 25.000, 34.000, 51.000 e
88
0 25 50 75
0
100
200
300
400
0
25
50
75
100
Tempo (min)
mA214nm (
)
% ACN (---)
Figura 20. PERFIL DA CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA DE Sp-CTx.
Coluna Source 15ST (10 x 0,46cm, HPLC), equilibrada com TFA 0,1% ACN 2%. A
cromatografia foi desenvolvida com gradiente linear de 0-60% de TFA 0,1% em
acetonitrila a 23˚C. Amostra: Sp-CTx (40µg). O fluxo foi de 2mL/min. O conteúdo
protéico do eluato foi estimado pela leitura da absorvância a 214nm. O grau de pureza
foi determinado pelo cálculo da área do pico principal (Sp-CTx) em relação a área total
do cromatograma.
89
Figura 21. PERFIL ELETROFORÉTICO (SDS-PAGE) DA PEÇONHA BRUTA DE
Scorpaena plumieri E DAS FRAÇÕES OBTIDAS NAS DIVERSAS ETAPAS DE
PURIFICAÇÃO DA CITOLISINA. Gel: 8% de acrilamida. (A) Peçonha bruta (20µg);
(B) CF-I (12µg); (C) CF-II (9µg); (D) CF-III (6µg); (E/F) Sp-CTx (4µg). As bandas
protéicas foram reveladas com azul de coomassie (gel à esquerda) e Acido
periódico/reativo de Schiff (PAS, gel à direita). Os marcadores protéicos utilizados (M,
7µg) foram: miosina (200kDa), β-galactosidase (116kDa), fosforilase b (97kDa),
soroalbumina bovina (66kDa) e ovoalbumina (45kDa). A massa molecular de Sp-CTx
foi estimada pela interpolação de uma plotagem semi-logarítimica linear da massa
molecular pela distância de migração relativa (Anexo II).
kDa
200
116
97
66
45
M A B C D E
F
90
20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000
0
50
100
150
200
131704.57
65251.29
33144.47
Intensidade (a.u.)
m/z
Figura 22. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-CTx. Os sinais m/z observados no
espectro de massas correspondem, respectivamente da esquerda para a direita, à
proteína [M+2H]
2+
, [M+H]
+
e 2[M+H]
+
(dímero). O sinal de 65251,29Da corresponde à
subunidade de Sp-CTx.
91
Figura 23. PERFIL ELETROFORÉTICO (SDS-PAGE) DA FRACAO V E DA
HEMAGLUTININA PURIFICADA DA PEÇONHA DE Scorpaena plumieri (Sp-Lec).
(A) Amostra de 30µg da fração V (a) submetida à análise eletroforética em condições
não-redutoras. (B) Amostras de 10µg de Sp-Lec submetidos à análise eletroforética em
condições não-redutoras (b) e redutoras (c). Os géis A (10% de acrilamida) e B (17% de
acrilamida) foram corados com azul de coomassie e nitrato de prata, respectivamente.
Os marcadores protéicos de massa molecular (M, ~7µg) utilizados foram: miosina
(200kDa), β-galactosidase (116kDa), fosforilase b (97kDa), soroalbumina bovina
(66kDa), ovoalbumina (45kDa), anidrase carbônica (31kDa), inibidor de tripsina de soja
(21kDa), lisozima (14kDa) e aprotinina (6,5kDa).
A
B
M b c M
kDa
200
116
97
66
45
31
21
14
6,5
M a
kDa
66
45
31
92
68.000 (janela 20-70kDa) (figura 24). Como foi descrito anteriormente (item 4.1.3.2), a
análise de Sp-Lec por cromatografia de fase reversa (HPLC) revelou a presença de seis
grupos protéicos distintos com similar retenção (figura 19). Estes componentes
apresentaram massas moleculares muito semelhantes quando analisados por
espectrometria de massas, entre 15.850 e 16.900Da (figuras 25, 26 e 27).
4.2.2. Determinação de carboidratos
Após a eletroforese em SDS-PAGE, Sp-CTx foi corada com o reagente para
revelação de carboidratos (ácido periódico-Schiff), apresentando uma tênue banda de
coloração rósea (figura 21F).
4.2.3. Reatividade cruzada de Sp-CTx com antisoro contra peçonha de peixes-pedra
Utilizando a técnica de western blotting, verificou-se que a citolisina purificada
da peçonha do peixe-escorpião Scorpaena plumieri é reconhecida pelo antiveneno
comercial contra a peçonha de peixe-pedra australiano Synanceja trachynis (SFAV),
conforme demonstrado na figura 28.
4.2.4. Seqüenciamento N-terminal
As seqüências N-terminais de amostras de Sp-CTx, Sp-Lec III, Sp-Lec V foram
determinadas por seqüenciamento automático das proteínas nativas. Os resíduos
identificados foram, respectivamente, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 39. Nenhum sinal foi obtido
quando Sp-Lec VI foi submetido à degradação de Edman.
i. Sp-CTx: XHQVGHGDHGGHKDH
ii. Sp-Lec III: DAEPPXGPAE
iii. Sp-Lec V: DAEPPSPAEEXAAVKMESXGDDWLYIDENRKVKYFXTXK
93
33760.266
50688.471
25292.823
67314.349
0
500
1000
1500
2000
2500
Intens. [a.u.]
20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 55000 60000 65000
m/z
16990.727
0
500
1000
1500
2000
2500
Intens. [a.u.]
10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 17000 18000
m/z
Figura 24. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec. Os sinais m/z observados nos espectros de massas nas janelas (A) 10-20kDa e (B) 20-
70kDa correspondem, respectivamente da esquerda para a direita, às proteínas (A) [M+H]
+
e (B) 1,5[M+H]
+
, 2[M+H]
+
, 3[M+H]
+
e 4[M+H]
+
.
16847.549
17193.009
17.193,009
16.847,549
25.292,823
50.688,471
67.314,349
33.760,266 16.990,727
A B
94
7907.610
15850.890
* I\0_M14\1\1SLin
0
50
100
150
200
Intens. [a.u.]
6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
16981.209
8491.681
5660.424
* II\0_M15\1\1SLin
0
2000
4000
6000
Intens. [a.u.]
6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
Figura 25. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec I (A) e II (B). Os sinais m/z observados nos espectros de massas correspondem,
respectivamente da esquerda para a direita, às proteínas [M+2H]
2+
e [M+H]
+
em (A) e [M+3H]
3+
, [M+2H]
2+
e [M+H]
+
em (B).
15.850,890
5.660,424
8.491,681
16.981,209 7.907,610
A
B
95
8484.361
16975.710
5655.652
* IIID\0_N6\1\1SLin
0
1000
2000
3000
4000
Intens. [a.u.]
6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
8484.272
16970.446
5656.719
* IVD\0_N8\1\1SLin
0
500
1000
1500
2000
Intens. [a.u.]
6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
Figura 26. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec III (A) e IV (B). Os sinais m/z observados nos espectros de massas correspondem,
respectivamente da esquerda para a direita, às proteínas [M+3H]
3+
, [M+2H]
2+
e [M+H]
+
.
5.656,719
16.970,446
16.975,710
5.655,652
8.484,272 8.484,361
A
B
96
16835.739
8415.236
5608.373
* VD\0_O6\1\1SLin
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4
x10
Intens. [a.u.]
6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
16842.156
8444.578
5641.031
* VI\0_M24\1\1SLin
0
1000
2000
3000
4000
Intens. [a.u.]
6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
Figura 27. ANÁLISE POR MALDI-TOF-MS DE Sp-Lec V (A) e VI (B). Os sinais m/z observados nos espectros de massas correspondem,
respectivamente da esquerda para a direita, às proteínas [M+3H]
3+
, [M+2H]
2+
e [M+H]
+
.
8.444,578
5.641,031
8.415,236
5.608,373
16.835,739 16.842,156
A
B
97
Figura 28. REATIVIDADE DO ANTIVENENO DA PEÇONHA DE PEIXE-PEDRA
(SFAV) COM A PEÇONHA DE Scorpaena plumieri (SPB) E Sp-CTx. As proteínas
foram separadas por SDS-PAGE em condições não-redutoras (gel 8% de acrilamida),
transferidas para membrana de nitrocelulose, tratadas com SFAV (1:500) e anticorpo
contra IgG de cavalo conjugado com peroxidase (1:1000). A revelação foi feita com
diaminobenzidina e 4-cloro-1-naftol em presença de peróxido de hidrogênio. A
migração dos marcadores protéicos de massa molecular (β-galactosidase – 116kDa,
fosforilase b – 97kDa, soroalbumina bovina – 66kDa e ovoalbumina – 45kDa) está
mostrado à esquerda (M).
M SPB Sp-CTx
kDa
116
97
66
45
98
4.2.5. Estrutura primária
Seqüências internas de Sp-Lec V foram obtidas pelo seqüenciamento de
fragmentos de digestão com tripsina (T) e protease V8 de Staphylococcus aureus (V).
Estas clivagens geraram, respectivamente, nove e quatro fragmentos principais,
numerados de acordo com sua eluição na separação por cromatografia de fase reversa
(coluna Vydac C
18
Smallpore)
.
As seqüências N-terminais encontradas para estes
peptídeos foram:
i. T14: YFETPK
ii. T18a: DAEPPSPAEECAAVK
iii. T18b: MWIGAGR
iv. T22: LPFM(V)CA
v. T25: SEGETQNIDGSDFDYAK
vi. T27: TFQEAQDHCESEDGNLVAMHTEFQK
vii. T29: MESCGDDWLYIDENR
viii. T32/33: YVVA(L)CLSWIY(S)NH(P)K
ix. T33/34: GGQPDNFGGNEDCI(K)EANFIDWGYLNDV(A)E(V)CSEK
i. V17a: TPKTFQE
ii. V17b: KLPFMCA
iii. V21: SCGDDWLYIDE
iv. V32: FQKYVVACLSWIYNHKLHRMWIGAGRSE
A estrutura primária foi definida pela análise de sobreposição de aminoácidos
dos fragmentos obtidos. A figura 29 mostra a montagem da estrutura obtida.
99
Figura 29. SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE Sp-Lec V. Os traços (azul) indicam resíduos de aminoácidos obtidos por seqüenciamento N-
terminal da proteína reduzida e alquilada. As linhas pontilhadas (verde e vermelha) indicam fragmentos derivados de digestões enzimáticas com
tripsina (T) e protease V8 de Staphylococcus aureus (V).
T
22
T18
T
29
T1
4
T
27
T
32/
T
33
T1
8
T
25
T
33/34
V17
V17
V
32
V
2
1
100
4.3. Caracterização Farmacológica de Sp-CTx
4.3.1. Atividade hemolítica
A figura 30 mostra a curva concentração-resposta obtida para a atividade
hemolítica de Sp-CTx. A EC
50
para esta toxina foi de 0,46nM (56ng/mL) (tabela III). A
atividade hemolítica de Sp-CTx foi parcialmente reduzida (24%) quando os eritrócitos
utilizados foram submetidos à clivagem com tripsina, e drasticamente reduzida (90%)
quando esta citolisina foi pré-tratada com anti-soro preparado contra peçonha de peixes-
pedra (SFAV) (figura 31).
4.3.2. Reatividade vascular
A figura 32A mostra a resposta induzida por Sp-CTx (0,0001-1nM) em
preparações de anéis de aorta de rato pré-contraídos com 0,1µM de fenilefrina.
Verificou-se que esta toxina produziu um efeito bifásico, caracterizado por uma fase
vasorelaxante seguida por uma fase de vasoconstrição. A resposta relaxante não foi
observada nos ensaios utilizando vasos com endotélio desnudo, enquanto que a fase
contrátil ainda pode ser observada (figura 32B). A resposta relaxante induzida foi
concentração-dependente (figura 33).
O pré-tratamento com L-NAME (1µM) aboliu o efeito vasorelaxante induzido
por Sp-CTx nos anéis aórticos (figura 34). Entretanto, a indometacina (1µM) não
alterou significativamente esta resposta (figura 35).
101
Figura 30. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE Sp-CTx SOBRE ERITRÓCITOS DE
COELHO. Sp-CTx, em diferentes concentrações, foi incubada com suspensão de
eritrócitos 2% (v/v) em PBS por 30min a 37˚C. Os resultados foram expressos como
porcentagem de hemólise (detectada pela absorção a 540nm da hemoglobina liberada)
por comparação com controle positivo (hemácias incubadas com água destilada). Os
pontos (•) representam a média ± erro padrão da média de ensaio realizado em triplicata.
10
-13
10
-12
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
10
-7
0
25
50
75
100
% Hemólise
Sp-CTx (M)
102
PBS + EN PBS + ET SFAV + EN
0
10
20
30
40
Sp-CTx
% Hemólise
Figura 31. EFEITO DE SFAV E DA TRIPSINIZAÇÃO DE HEMÁCIAS NA
ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE Sp-CTx. Amostras de Sp-CTx (0,46nM = EC
50
)
foram pré-tratadas por 10min a 25 ºC com PBS ou SFAV (1U/2ug) e incubados por
30min a 37ºC com suspensão de eritrócitos 2% (v/v) não-tripsinizados (EN) e
tripsinizados (ET). Os resultados foram expressos como porcentagem de hemólise
(detectada pela absorção a 540nm da hemoglobina liberada) por comparação com
controle positivo (hemácias incubadas com água destilada). Os resultados representam a
média ± erro padrão da média de ensaio realizado em triplicata.
103
Figura 32. EFEITO DE Sp-CTx SOBRE ANÉIS ISOLADOS DE AORTA DE RATO.
Traçado típico representativo dos grupos (n=7) mostrando a resposta induzida por
administração de concentrações crescentes de Sp-CTx (setas, iniciando em 0,1pM até
atingir concentração final de 1nM) em anel de aorta com endotélio íntegro (A) e
desnudo (B) de rato Wistar pré-contraído com fenilefrina 0,1µM (▲).
A
B
104
-13 -12 -11 -10 -9
-5
0
5
10
15
20
25
Endotélio íntegro n=7
Endotélio desnudo n=7
*
*
*
*
*
*
*
Log [Sp-CTx] (M)
% Relaxamento
Figura 33. EFEITO RELAXANTE INDUZIDO POR Sp-CTx EM ANÉIS ISOLADOS
DE AORTA DE RATOS. Curvas concentração-resposta de Sp-CTx em anéis de aorta
pré-contraídos com fenilefrina (0,1µM) com endotélio íntegro (○) e desnudo (●). Os
valores foram expressos como média ± erro padrão da média (n=7) e diferenças foram
consideradas significativas quando *p<0,05 (ANOVA-duas vias e pós-teste de
Bonfferroni).
105
-13 -12 -11 -10 -9
-5
0
5
10
15
20
25
Com L-NAME n=6
Sem L-NAME n=6
*
*
*
*
*
*
*
Log [Sp-CTx] (M)
% Relaxamento
Figura 34. EFEITO DO INIBIDOR (L-NAME) DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO
SINTASE (NOS) NO RELAXAMENTO INDUZIDO POR Sp-CTx EM ANÉIS DE
AORTA ISOLADOS DE RATOS. Curvas concentração-resposta de Sp-CTx em anéis
de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com fenilefrina (0,1µM) na presença (●) e
na ausência (○) de inibidor não-seletivo da NOS (L-NAME, 1µM). Os valores foram
expressos como média ± erro padrão da média (n=6) e diferenças foram consideradas
significativas quando *p<0,05 (ANOVA-duas vias e pós-teste de Bonfferroni).
106
-13 -12 -11 -10 -9
-5
0
5
10
15
20
25
Com Indometacina n=4
Sem Indometacina n=4
Log [Sp-CTx] (M)
% Relaxamento
Figura 35. EFEITO DO INIBIDOR DE CICLOOXIGENASES (INDOMETACINA)
NO RELAXAMENTO INDUZIDO POR Sp-CTx EM ANÉIS ISOLADOS DE
AORTA DE RATOS. Curvas concentração-resposta de Sp-CTx em anéis de aorta pré-
contraídos com fenilefrina (0,1µM) na presença (○) e na ausência (●) de inibidor de
ciclooxigenases (indometacina, 1µM). Os valores foram expressos como média ± erro
padrão da média (n=4) e diferenças foram consideradas significativas quando *p<0,05
(ANOVA-duas vias e pós-teste de Bonfferroni).
107
4.4. Caracterização farmacológica de Sp-Lec
4.4.1. Hemaglutinação
A toxina hemaglutinante purificada da peçonha de Scorpaena plumieri, Sp-Lec,
foi capaz de induzir aglutinação de eritrócitos de coelhos em concentrações iguais ou
superiores a 500µg/mL (30µM). Entretanto, esta proteína não induziu efeito aglutinante
sobre hemácias de ratos e humanos (tipo B) (dados não-mostrados).
A atividade aglutinante sobre eritrócitos de coelhos não foi alterada por íons
Ca
+2
(10mM) em concentrações elevadas, nem por agentes redutores (DTT 2mM) ou
quelantes (EDTA 1mM) (dados não-mostrados).
4.4.2. Agregação plaquetária
O efeito aglutinante de Sp-Lec também foi avaliado sobre plaquetas humanas.
Esta toxina não foi capaz de induzir agregação sobre plasma rico em plaquetas e
também não afetou a agregação de plaquetas induzida por ADP (dados não-mostrados).
4.4.3. Atividade mitogênica sobre leucócitos
A atividade mitogênica da fração V e de Sp-Lec foi avaliada sobre células
mononucleares humanas de sangue periférico. A fitohemaglutinina purificada do extrato
do feijão Phaseolus vulgaris, PHA, foi utilizada como controle positivo. Após 120h de
tratamento, foi verificado que tanto a fração semi-purificada (V; figura 36B) quanto Sp-
Lec (figura 36C) induziram aumento da viabilidade destes leucócitos.
108
Controle 0,12 0,25 0,50 1,00
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
PHA (nM)
A595nm
Controle 30 60 125 250 375
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Fracao V ( µ
µµ
µg/mL)
A595nm
Controle 2 4 8
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Sp-Lec ( µ
µµ
µM)
A595nm
Figura 36. EFEITO DA PHA, FRAÇÃO V e Sp-Lec SOBRE A VIABILIDADE
CELULAR DE LEUCÓCITOS HUMANOS. (A) A hemaglutinina do feijão Phaseolus
vulgaris (PHA), (B) a fração V e (C) Sp-Lec foram incubadas, em diferentes
concentrações, com células mononucleares de sangue periférico (2x10
5
células por
poço) em meio DMEM suplementado com 10% de soro AB
+
humano inativado. A taxa
de sobrevida foi medida pela redução do MTT (A595nm). Como controle negativo,
foram utilizadas células incubadas somente com soro. As barras representam a média ±
erro padrão da media de ensaios (PHA, n=4; Fração V e Sp-Lec, n=2) realizados em
triplicata.
A
B
C
109
5. Discussão
Os estudos de peçonhas animais têm ocupado um lugar de destaque na
farmacodinâmica contemporânea, pois têm revelado moléculas com potencial para
tratamento de diferentes afecções e distúrbios (Gribkoff et al., 2001; De Lima et al.,
2009). Nas ultimas três décadas, foram obtidos grandes avanços na caracterização de
toxinas de animais peçonhentos, os quais possibilitaram o desenvolvimento de novos
fármacos com funções variadas, de anticoagulantes a antiangiogênicos (Grgic et al.,
2005; Smith e Wheeler, 2006). Além disso, ao desequilibrar a homeostase, estas
moléculas desempenham papel importante para a investigação dos sistemas biológicos
envolvidos nos seus efeitos, e muitas são reconhecidas como ferramentas/sondas
farmacológicas de grande utilidade.
No litoral do Brasil, o peixe-escorpião preto ou mangangá (Scorpaena plumieri)
é o mais perigoso (Haddad Jr. et al., 2003). Os sintomas observados em
envenenamentos humanos foram reproduzidos por inoculação da peçonha em animais
experimentais, provocando severos efeitos locais (dor, edema e hemorragia) e
sistêmicos, incluindo nítidos sinais de neurotoxicidade (movimentos descontrolados,
aumento na micção, defecação e salivação), alterações cardiovasculares e respiratórias
(Carrijo et al., 2005), assim como um potente efeito inflamatório nos pulmões,
induzindo infiltração neutrofílica e a produção de citocinas, quimiocinas e
metaloproteinases de matriz mesmo quando a peçonha foi injetada intraplantarmente
(Boletini-Santos et al., 2008). Duas enzimas, uma proteolítica (Carrijo et al., 2005) e
uma hialuronidásica (Cassoli, 2008), foram isoladas da peçonha deste peixe e parecem
estar relacionadas com a perda da integridade dos tecidos/matriz extracelular e a
conseqüente dispersão dos componentes bioativos para outros tecidos (Andrich, 2005).
110
Entretanto, pouco se conhece sobre o papel dos componentes bioativos não-enzimáticos
desta peçonha no envenenamento e/ou nas respostas experimentais observadas.
Em busca de uma maior compreensão sobre os efeitos destes componentes, o
presente trabalho apresenta dados inéditos sobre a peçonha do peixe-escorpião do
Atlântico Scorpaena plumieri, descrevendo o isolamento e caracterização bioquímica e
farmacológica parciais de duas novas proteínas bioativas: uma toxina citolítica (Sp-
CTx) e uma lectina tipo C (Sp-Lec).
5.1. Purificação da toxina citolítica
Embora muitos organismos marinhos, incluindo linguados, peixes-sabão, peixes-
gato, peixes-pedra e peixes-escorpião, produzam polipeptídeos e proteínas citolíticas
(Carlson et al., 1971; Hashimoto e Oshima, 1972; Shier, 1988; Kreger, 1991; Khoo et
al., 1992; Garnier et al., 1995; Carrijo et al., 2005), poucos esforços têm sido realizados
para isolar e caracterizar estas moléculas. É bem conhecido e descrito na literatura que
grande parte das atividades farmacológicas das peçonhas de peixes (e.g., hemolítica,
neuromuscular e cardiovascular) são induzidas por um mesmo componente citolítico
instável (Weiner, 1959; Kreger, 1991, Khoo, 2002). A instabilidade se deve à
termolabilidade destas proteínas de alta massa molecular, e também à presença de
enzimas proteolíticas, as quais hidrolisam estas e outras toxinas bioativas das peçonhas
(Schaeffer et al., 1971; Perrière et al., 1988; Garnier et al., 1995; Church e Hodgson,
2002a; Carrijo et al., 2005). Neste contexto, a peçonha de Scorpaena plumieri não é
uma exceção, ocorrendo perdas consideráveis de suas propriedades cardiovascular,
tóxica, hemolítica e edematogênica após apenas algumas horas de extração ou mesmo
quando a solução da peçonha é estocada à baixas temperaturas (4° e -20°C) ou
liofilizada (Carrijo et al., 2005; Andrich, 2005). Apesar destas dificuldades, utilizando
111
um procedimento baseado em quatro etapas cromatográficas (figuras 13, 14, 15 e 16;
tabela III) realizadas em baixas temperaturas (4ºC), em pH levemente alcalino (valores
entre 7,4-8,0) e mantendo-se a concentração salina (NaCl) de tampões e de amostras
entre 0,1 e 0,4M, uma citolisina vasoativa foi isolada em sua forma nativa a partir da
peçonha do peixe-escorpião S. plumieri (figuras 2 e 10), a qual foi nomeada Sp-CTx (S.
plumieri Cytolytic Toxin).
Em cada etapa do processo de purificação de Sp-CTx, as frações citolíticas
foram identificadas por ensaio sobre eritrócitos lavados de coelho, os quais são
altamente sensíveis às peçonhas de peixes (Shiomi et al., 1989; Kreger, 1991). O
fracionamento inicial da peçonha de S. plumieri foi o mesmo realizado por Carrijo e
colaboradores (2005), utilizando-se uma coluna de filtração em gel convencional
(Sephacryl S200 HR; faixa de separação entre 5 e 250kDa). Entretanto, neste trabalho
foi utilizada uma coluna com maior capacidade (2,0cm de diâmetro interno ao invés de
1,1cm), o que aumentou significantemente a resolução do fracionamento das proteínas
da peçonha. Neste procedimento, sete picos principais foram obtidos (I a VII, figura
13), e mostrou-se que a atividade citolítica estava associada com a fração II (CF-I).
Apesar de ter eluído na parte inicial da cromatografia, a fração ativa ainda possuía
contaminantes de baixa massa molecular (figura 21B), o que sugere algum tipo de
interação química ou agregação entre as proteínas da peçonha.
O fracionamento subseqüente de CF-I por cromatografia de troca aniônica em
sistema FPLC (coluna MonoQ) resultou na eluição das frações hemolíticas (CF-II) na
parte descendente do pico protéico principal (figura 14), com aproximadamente 0,24M
de NaCl em pH 8,0. Um passo cromatográfico adicional de troca aniônica, porém
usando coluna para sistema de alta pressão (MiniQ 4.6/50 PE), aumentou a resolução e
112
separou CF-II em duas frações protéicas principais (figura 15). A atividade hemolítica
sobre eritrócitos de coelho estava associada com o primeiro pico protéico (CF-III), o
qual eluiu com uma concentração de NaCl de aproximadamente 0,1M em pH 8,0. A
análise desta fração por SDS-PAGE revelou a presença de uma banda protéica
principal, de aproximadamente 73kDa, e outra menos intensa de alta massa molecular
(figura 21D). Visando separar estes compostos, CF-III foi submetida à etapa de
exclusão molecular em sistema FPLC. Como pode ser observado na figura 16, grande
parte deste material eluiu como um pico simétrico, cujas frações apresentaram atividade
específica constante, sugerindo que o fator citolítico foi isolado com sucesso. De fato,
este material migrou como uma banda única no gel de poliacrilamida contendo SDS e
foi homogêneo quando analisado por espectrometria de massas (figuras 21E e 22),
confirmando que a citolisina da peçonha do peixe-escorpião, designada como Sp-CTx,
foi obtida em alto grau de pureza.
Sp-CTx foi 12,3 vezes mais hemolítica (EC
50
56ng/mL) que a peçonha bruta do
peixe-escorpião (EC
50
688ng/mL) (figura 17). Entretanto, somente 1% da atividade
hemolítica total aplicada na primeira etapa cromatográfica foi recuperada no processo
de purificação. A atividade e o rendimento das frações agrupadas em todos os passos
cromatográficos estão descritos na tabela III. Este baixo rendimento pode ser justificado
principalmente pela alta instabilidade de Sp-CTx, pois durante o processo observamos
perda substancial de atividade citolítica e/ou precipitação de proteínas das amostras
após:
i. dessalinização,
ii. liofilização,
iii. agitação vigorosa,
113
iv. congelamento (-20°C) e descongelamento,
v. longo período de armazenamento a 4°C,
vi. e estocagem em tampões com concentração salina (NaCl) inferior ou igual a
0,15M.
Outros aspectos que podem estar relacionados com o baixo rendimento obtido
são o aparato peçonhento relativamente primitivo dos peixes-escorpião e o método de
extração da peçonha utilizado. Em comparação aos peixes-pedra, as glândulas de
peçonha dos peixes-escorpião são menos desenvolvidas e não possuem ductos
secretores evidentes, tornando difícil sua extração e obtenção da secreção peçonhenta
(figura 37) (Russell, 1965; Goudey-Perrière e Perrière, 1998; Smith e Wheeler, 2006).
Estes fatores nos levaram a escolher o método “batch” para extração da peçonha (figura
11), o qual possibilita a obtenção de uma maior quantidade de proteína e um extrato
menos instável em um curto período de tempo (Schaeffer et al., 1971). Entretanto, este
processo aumenta o número de substancias protéicas contaminantes, pois todo aparato
peçonhento (compreendendo o tecido secretor da peçonha, tecido conectivo, espinhos,
bainha tegumentária e a secreção mucosa cutânea) é homogeneizado em solução,
demandando a execução de etapas cromatográficas adicionais e, conseqüentemente,
mais tempo para o isolamento da citolisina, o que aumenta a probabilidade de perda de
atividade desta molécula instável. Afortunadamente, quando Sp-CTx foi concentrada e
armazenada a 4ºC em PB 20mM NaCl 0,3M pH 7,4 contendo glicerol (10% v/v), sua
atividade foi mantida por até quatro semanas.
114
Figura 37. COMPARAÇÃO DOS ESPINHOS DAS NADADEIRAS DORSAIS DE
DIFERENTES GÊNEROS DE PEIXES PEÇONHENTOS DA FAMÍLIA
SCORPAENIDAE. (A) Representação esquemática da nadadeira dorsal de um peixe-
pedra. A seta indica a localização dos espinhos dorsais. (B) Morfologia dos espinhos
dos peixes pertencentes aos gêneros Pterois, Scorpaena e Synanceja, respectivamente
os peixes-leão, peixes-escorpião e peixes-pedra. Todos são cobertos por bainhas
tegumentares; a seta indica a glândula peçonhenta bem desenvolvida dos peixes-pedra.
Fonte: Starfish, 2009.
Pterois Scorpaena Synanceja
A
B
115
5.2. Caracterização bioquímica de Sp-CTx
A massa molecular de Sp-CTx nativa foi estimada em 121kDa por cromatografia
de exclusão molecular (figura 16). Entretanto, nas análises por SDS-PAGE, esta
proteína migrou como uma banda de massa molecular aparente de 73kDa (figura 21E).
Estes dados, em conjunto com aquele relativo ao sinal m/z de 65.251 ± 650Da obtido no
espectro de massas (figura 22), sugerem que esta toxina citolítica é uma proteína
dimérica, cujas subunidades apresentam aproximadamente 65kDa ([M+H]
+
, figura 22) e
que estão unidas por interações não-covalentes ou fracas, as quais são rompidas sob as
condições desnaturantes da técnica de SDS-PAGE. Os demais sinais observados no
espectro de massas (33.145 e 131.705Da) correspondem, respectivamente, à molécula
duplamente carregada ([M+2H]
2+
) e à dimerização das subunidades (2[M+H]
+
). Ao
contrário das citolisinas heterodiméricas das peçonhas de peixes-pedra, não foi possível
observar a completa separação das subunidades de Sp-CTx por SDS-PAGE. A presença
de uma banda protéica difusa (figura 21E), e também a variação de ± 650Da observada
no sinal do íon parental ([M+H]
+
; figura 22), podem ser resultantes da superposição de
subunidades com massas moleculares semelhantes e não nos permitiram determinar se
Sp-CTx é um homo- ou hetero-dímero. Semelhante situação foi descrita para a
determinação da massa molecular da neoVTX por SDS-PAGE. Os resultados iniciais
obtidos por Shiomi e colaboradores (1993) revelaram a presença de uma banda protéica
de 90kDa, sugerindo uma composição monomérica para esta toxina. Posteriormente, o
mesmo grupo de pesquisa (Ueda et al., 2006) demonstrou a resolução de duas bandas
protéicas com massas moleculares semelhantes (α 75kDa, β 80kDa), comprovando a
natureza dimérica desta citolisina. Contrariamente a neo-VTX (Ueda et al., 2006), Sp-
CTx foi sensível à reação para coloração de carboidratos (figura 21F), revelando sua
natureza glicoprotéica. Glicoproteínas citolíticas e/ou tóxicas também foram
116
encontradas nas peçonhas de Trachinus vipera (Perrière et al., 1988) e Synanceja
verrucosa (Garnier et al., 1995).
As características químicas exibidas por Sp-CTx são semelhantes àquelas
descritas para as citolisinas purificadas de peçonhas de peixes-pedra: SNTX, o fator
letal de 148kDa da peçonha do peixe-pedra Indiano Synanceja horrida (Poh et al.,
1991), é composto de duas subunidades distintas (α 71kDa, β 79kDa); TLY, a toxina
neurosecretória de 158kDa encontrada na peçonha do peixe-pedra estuarino S.
trachynis, é uma proteína heterodimérica apresentando subunidades de 76kDa (α) e
83kDa (β) (Colasante et al., 1996). Dois fatores hemolíticos foram purificados da
peçonha do peixe-pedra de recifes (S. verrucosa): neoVTX (Ueda et al., 2006), que é
uma toxina de 166kDa exibindo também natureza dimérica (α 75kDa, β 80kDa), e VTX
(Garnier et al., 1995), uma glicoprotéina tóxica/hipotensiva possuindo massa molecular
de 322kDa, organizada em uma estrutura tetramérica - duas subunidades α (83kDa) e
duas β (78kDa). A tabela VI resume as propriedades estruturais de toxinas citolíticas e
letais purificadas de peçonhas de peixes.
Além das semelhanças químicas, o reconhecimento de Sp-CTx pelo antiveneno
contra peçonha de peixes-pedra (SFAV), verificado por western blotting (figura 28),
oferece evidência que as citolisinas das peçonhas de peixes-escorpião e de peixes-pedra
possuem determinantes antigênicos comuns. Adicionalmente, SFAV também neutraliza
parcialmente os efeitos tóxicos, hemolíticos e/ou cardiovasculares evocados pelas
peçonhas do peixe-soldado Gymnapistes marmoratus (Church e Hodgson, 2001), do
peixe-escorpião Inimicus japonicus (Shiomi et al., 1989) e dos peixes-leão dos gêneros
Pterois e Dendrochirus (Shiomi et al., 1989; Church e Hodgson, 2002b). Todas estas
observações de reatividade cruzada corroboram com a hipótese de que mesmo peixes
117
TABELA VI. COMPARAÇÃO DAS PROPRIEDADES ESTRUTURAIS E POTÊNCIA HEMOLÍTICA
DE Sp-CTx COM AS DE CITOLISINAS/TOXINAS PURIFICADAS DE PEÇONHAS DE PEIXES.
a
Atividade hemolítica sobre eritrócitos de coelho.
b
A massa precisa de cada subunidade de Sp-CTx não foi determinada.
c
Nd, Não determinado.
Toxina
Espécie de peixe-
peçonhento
Massa
Molecular (kDa)
Número de
Subunidades
Massa Molecular das
Subunidades (kDa)
Glico-
silação
Hemólise
EC
50
(ng/mL)
a
Referências
Sp-CTx Scorpaena plumieri 121 2 65
b
Sim 56 Presente trabalho
SNTX Synanceja horrida 148 2 α 71; β 79 Não 60
Poh et al., 1991
Khoo et al., 1995
Ghadessy et al., 1996
TLY Synanceja trachynis 158 2 α 76; β 83 Nd
c
2.5-3.3 Colasante et al., 1996
VTX Synanceja verrucosa 322 4 α 83; β 78 Sim 5.5 Garnier et al., 1995
neoVTX Synanceja verrucosa 166 2 α 75; β 80 Não 83 Ueda et al., 2006
Dracotoxina
Trachinus draco
105
1
105
Nd
c
3
Chhatwal
e
Dreyer, 1992b
Trachinina
Trachinus vipera
324
4
81
Sim
Nd
c
Perrière
et al.
, 1988
118
pertencentes à diferentes famílias possuem propriedades tóxicas similares e poderiam
compartilhar moléculas e toxinas semelhantes (Saunders, 1960; Russell, 1965; Shiomi
et al., 1989; Church e Hodgson, 2002a).
5.3. Caracterização farmacológica de Sp-CTx
Sp-CTx exibiu potente atividade hemolítica direta (EC
50
56ng/mL = 0.46nM)
em eritrócitos lavados de coelho (figuras 17 e 30; tabela III), a qual foi comparável a
hemólise induzida por SNTX (EC
50
60ng/mL; Khoo et al., 1995) e neoVTX (EC
50
83ng/mL; Ueda et al., 2006). No entanto, os valores de EC
50
determinados para TLY
(2,5-3,3ng/mL; Colasante et al., 1996), VTX (5,5ng/mL; Garnier et al., 1995) e
Dracotoxina (3ng/mL; Chhatwal and Dreyer, 1992), os fatores hemolíticos e letais
respectivamente das peçonhas dos peixes Synanceja trachynis, S. verrucosa e Trachinus
draco, foram 10-20 vezes menor do que o encontrado para Sp-CTx, sugerindo maior
atividade destas toxinas. Entretanto, é difícil comparar a potência hemolítica destas
toxinas utilizando-se o valor de EC
50
devido às variações nas condições utilizadas no
ensaio hemolítico (temperatura de incubação, quantidade de células usadas e o tempo de
exposição dos eritrócitos à ação da toxina). Apesar do mecanismo de hemólise de Sp-
CTx não ter sido investigado no presente trabalho, tanto a redução do efeito citolítico de
Sp-CTx (figura 31) quanto a reatividade cruzada com SFAV (figura 28) indicam que
esta citolisina compartilha epitopos similares aos das toxinas de peixes-pedra, e poderia
atuar de maneira semelhante a estas, induzindo a formação de poros na membrana dos
eritrócitos (Chen et al., 1997; Ouanounou et al., 1999). Além disto, esta citolisina
parece depender, ao menos parcialmente, da ligação a receptores protéicos da
membrana das células para induzir seus efeitos tóxicos (figura 31), assim como descrito
para a Dracotoxina, a qual se liga a glicoforina dos eritrócitos de coelhos e provoca
119
hemólise (Chhatwal e Dreyer, 1992b), e a SNTX, que interage com receptores de
substância P para indução de seus efeitos vasculares (Sung et al., 2002).
Como mencionado anteriormente, tem sido especulado que a atividade citolítica
das toxinas hemolíticas poderia ser responsável pelas respostas cardiovasculares
induzidas pelas peçonhas de peixes, já que estas toxinas “perturbadoras” de membrana
poderiam afetar o comportamento normal das células endoteliais e a função cardíaca,
desencadeando influxo de íons Ca
+2
e uma conseqüente ativação da cascata de síntese
de óxido nítrico (NO), levando ao vasorelaxamento e à hipotensão (Low et al., 1993;
Chen et al., 1997; Church e Hodgson, 2002a). Esta possibilidade nos instigou a
investigar os efeitos de Sp-CTx em preparações vasculares.
Sp-CTx produziu uma resposta bifásica em preparações de anéis de aorta de
ratos, a qual foi caracterizada por uma fase inicial relaxante seguida por uma fase
contrátil (figura 32A). Entretanto, o efeito relaxante induzido pela proteína purificada
não foi observado após remoção do endotélio (figuras 32B e 33), sugerindo que a
liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio estão envolvidos nesta resposta.
Como mostrado na figura 33, a atividade relaxante induzida por Sp-CTx foi
concentração-dependente. Um significativo decréscimo da tensão aórtica foi verificado
após administração da toxina em concentrações picomolares, o que demonstra a potente
atividade relaxante desta molécula. Entretanto, a resposta contrátil induzida por Sp-CTx
foi observada utilizando uma quantidade de toxina três ordens de magnitude maior
(1nM), e ocorreu mesmo em vasos com endotélio desnudo (figura 32B). Estas respostas
vasculares são similares aquelas reportadas por Low e colaboradores (1993), que
verificaram que aproximadamente 3nM (400-500ng/mL) de SNTX (fator hemolítico,
vasorelaxante e hipotensivo isolado da peçonha de Synanceja horrida) também causou
120
reposta bifásica. Apesar da concentração de Sp-CTx necessária para induzir o efeito
vasorelaxante (1pM, figura 33) ser menor que a descrita para SNTX (10ng/mL = 68pM;
Sung et al., 2002), a citolisina de S. plumieri não alcançou o mesmo nível de extensão
de relaxamento que o exibido pela citolisina de S. horrida (EC
50
133ng/mL = 0.9nM;
Sung et al., 2002), o que sugere uma menor potência relaxante da toxina do peixe-
escorpião.
Ensaios subseqüentes avaliaram a participação da síntese de prostanóides e de
produtos derivados do endotélio sobre o efeito relaxante induzido por Sp-CTx. Nos
anéis de aorta tratados com indometacina, aparentemente a resposta vasodilatadora não
foi afetada (figura 35), sugerindo que a via das ciclooxigenases não está envolvida no
efeito vasorelaxante induzido pela citolisina do peixe-escorpião. Entretanto, o inibidor
não-seletivo da NO sintase, L-NAME, aboliu a vasodilatação evocada por Sp-CTx
(figura 34), oferecendo clara evidência da mediação por NO nos efeitos vasculares de
Sp-CTx. Este potente relaxamento dependente de endotélio e envolvendo NO,
observado sob ação da Sp-CTx, poderia explicar a vasodilatação periférica e a
hipotensão observadas tanto experimentalmente, em ensaios in vivo usando a peçonha
de Scorpaena plumieri (Carrijo et al., 2005; Gomes, comunicação pessoal), quanto
clinicamente, em vítimas de envenenamento por peixes-escorpião (Haddad Jr., 2000).
Similar mediação por NO foi comprovada para os efeitos cardiovasculares in vivo
induzidos pelas peçonhas de Pterois volitans (Church e Hodgson, 2002b), Gymnapistes
marmoratus (Hopkins e Hodgson, 1998) e também para SNTX (Low et al., 1993).
Apesar dos dados de caracterização dos efeitos vasculares de Sp-CTx
concordarem com os descritos para SNTX (Low et al., 1993), é necessário salientar que
as respostas relaxantes nos anéis de aorta de rato, obtidas para a citolisina purificada no
121
presente trabalho, foram observadas no auge da contração induzida por fenilefrina
(0,1µM), a qual normalmente é seguida por um período de diminuição da tensão aórtica
e estabilização da mesma. Portanto, é possível que o vasorelaxamento por nós
observado nas respostas utilizando Sp-CTx seja decorrente deste fenômeno/artefato
relaxante causado pela fenilefrina, ou decorra da sobreposição dos efeitos relaxantes de
Sp-CTx com o da estabilização da contração pela fenilefrina. Visando clarificar estes
pontos recém-descobertos sobre a ação vascular induzida por Sp-CTx, novos
experimentos estão em andamento. Apesar do efeito vasorelaxante de Sp-CTx ainda
estar sob análise, a resposta contrátil parece realmente ocorrer, já que experimentos
controle com a administração de veículo não exibem tal fase de contração (dados não
mostrados). Estes dados concordam com os recentemente obtidos para peçonha bruta de
Scorpaena plumieri no mesmo tipo de preparação, na qual foi observado um forte efeito
constrictor utilizando concentrações de 20-100µg/mL (dados não-mostrados; n = 3).
Portanto, Sp-CTx poderia estar contribuindo para o efeito contrátil da peçonha do peixe-
escorpião em questão, corroborando com a hipertensão transiente observada em ratos
anestesiados (Andrich, 2005). Em um recente trabalho publicado por nosso grupo de
pesquisa (Gomes et al., 2009), foi observado o aumento da força de contração bem
como da freqüência cardíaca em preparações isoladas de coração de rato, as quais
parecem ser mediadas por adrenoceptores do tipo α e β. Estes dados também
corroboram com àqueles observados em animais experimentais (in vivo) e poderão
ajudar na compreensão dos efeitos da peçonha de Scorpaena plumieri no
envenenamento humano.
Como descrito anteriormente, o efeito vasorelaxante evocado por citolisinas de
peçonhas de peixes poderia resultar de sua atividade formadora de poros (Low et al.,
1993; Chen et al., 1997; Church e Hodgson, 2002a). No entanto, alguns autores
122
mostraram que a cardiotoxicidade destas toxinas perturbadoras de membranas pode
depender da interação/ligação de tais moléculas com receptores protéicos. Sung e
colaboradores (2002) sugeriram que o componente da resposta vasorelaxante induzida
por SNTX ocorre através da ligação da toxina aos receptores de substância P de células
endoteliais, causando influxo subseqüente de Ca
+2
, produção de NO e ativação de canais
para K
+
. Também foi demonstrado que a peçonha de S. verrucosa (numa preparação
contendo aproximadamente 40-50% de verrucotoxina, VTX), p-VTX (um complexo
mais estável da verrucotoxina), e TLY mediam seus efeitos também por modulação da
atividade de canais iônicos para Ca
+2
e/ou K
+
(Garnier et al., 1997; Sauviat et al., 2000;
Yazawa et al., 2007; Wang et al., 2007). Entretanto, investigações farmacológicas
adicionais são necessárias para determinar os mecanismos moleculares envolvidos nas
respostas (cardio)vasculares induzidas por Sp-CTx. A elucidação do mecanismo de ação
desta molécula será uma valiosa ferramenta para entender seu papel nas manifestações
clínicas de envenenamento por Scorpaena plumieri.
5.4. Purificação da lectina tipo C
A segunda parte deste trabalho descreve a identificação e purificação de uma
lectina tipo C do extrato protéico dos espinhos do peixe escorpião S. plumieri. Como já
descrito as lectinas são moléculas protéicas ubiquamente distribuídas na natureza,
encontradas em microorganismos, vegetais e vários tecidos animais e algumas também
foram descritas em peçonhas de animais (Sharon e Lis, 1972; Chen e Tsai, 1995; Polgár
et al., 1997; Morita et al., 2005). A maioria absoluta das lectinas de secreções
produzidas por glândulas veneníferas de serpentes descritas são do tipo C (dependentes
de Ca
+2
) ou CTLPs (C type lectin like proteins) (Chen e Tsai, 1995; Polgár et al., 1997;
Morita et al., 2005). Porém, até recentemente estas moléculas aglutinantes (figura 38)
123
Figura 38. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA HEMAGLUTINAÇÃO
PRODUZIDA POR LECTINAS. Fonte: de Santana, 2004.
124
não haviam sido pesquisadas em peçonhas de peixes. Entretanto, em um recente
trabalho nosso grupo de pesquisa identificou e caracterizou nesta peçonha uma lectina
tipo B, denominada Plumieribetina (Evangelista, 2009). O fato destas moléculas não
terem sido estudadas antes pode ser justificado pela presença de potentes toxinas
hemolíticas, que dificultam/mascaram a detecção do efeito aglutinante característico das
lectinas/hemaglutininas na peçonha dos peixes. Ensaios preliminares realizados em
nosso laboratório foram inefetivos para identificar o efeito aglutinante da peçonha bruta
do peixe-escorpião Scorpaena plumieri sobre eritrócitos de coelho, ocorrendo severa
hemólise destas células em suspensão (in vitro) (Carrijo et al., 2005; Andrich, 2005).
Considerando-se que a hemólise mascarava o possível efeito hemaglutinante da
peçonha, após a separação da fração hemolítica (CF-I) por filtração molecular, a
atividade hemaglutinante pôde ser identificada.
A proteína com atividade aglutinante da peçonha de S. plumieri, denominada Sp-
Lec (Scorpaena plumieri Lectin) foi purificada através de duas etapas cromatográficas
de filtração em gel (figuras 13 e 18; tabela IV), sendo o processo acompanhado pela
indução de aglutinação em eritrócitos de coelho. A caracterização bioquímica de Sp-Lec
sugere que se trata de uma lectina do tipo C que apresenta seis isoformas (isolectinas).
A primeira etapa cromatográfica (figura 13) utilizada para a purificação da
hemaglutinina da peçonha de Scorpaena plumieri foi idêntica à utilizada para o
isolamento da toxina citolítica (filtração molecular convencional em coluna de
Sephacryl S 200 HR - ver fluxograma de purificação; figura 12). Esta cromatografia foi
efetiva em separar a atividade aglutinante da hemolítica. A atividade aglutinante sobre
eritrócitos de coelho estava associada com a fração V, constituída por proteínas de
massa molecular na faixa de 11kDa (figura 23A) e a atividade hemolítica com a fração
125
II (CF-I), a qual contém principalmente moléculas de alta massa molecular (45-200kDa,
figura 21B).
A análise da homogeneidade da fração V por SDS-PAGE mostrou a presença de
duas bandas protéicas (figura 23A). Tentativas de fracionamento para separação destes
componentes por cromatografias de troca aniônica (coluna MonoQ), de interação
hidrofóbica (coluna Phenyl-Sepharose) e de afinidade (coluna N-acetil-
galactosamina/Sepharose) foram inefetivas. Estes dados sugerem que provavelmente
estas proteínas apresentam características físico-químicas semelhantes. Entretanto, esta
fração foi resolvida em cinco grupos protéicos (S1 a S5, figura 18) quando submetida à
cromatografia de exclusão molecular em coluna Superose 12, sistema FPLC. Somente
as frações S1 (maior massa molecular) e S3 apresentavam atividade aglutinante (figura
18).
Uma estimativa da massa molecular das frações S1 e Sp-Lec por cromatografia
de filtração em gel (figura 18) revelou que S1 apresenta massa molecular cerca de 30
vezes maior que a de Sp-Lec nativa (~21-25kDa). Considerando o dado acima, e
também a ausência de proteínas de alta massa molecular na fração V (obtida por
filtração molecular; figura 23A), pode-se sugerir que a fração S1 resulte da agregação
de várias moléculas de Sp-Lec, formando uma estrutura multimérica com um potente
efeito aglutinante. Entretanto, estudos adicionais são necessários para comprovar esta
hipótese.
Apesar da significativa atividade hemaglutinante de S1, a fração S3, que foi
nomeada Sp-Lec (Scorpaena plumieri Lectin), foi escolhida para dar continuidade ao
processo de caracterização devido a maior quantidade de proteína obtida (tabela IV).
126
5.5. Caracterização bioquímica de Sp-Lec
A análise por SDS-PAGE de Sp-Lec mostra a presença de uma única banda
larga de aproximadamente 11kDa e 22kDa na ausência e presença de agentes redutores
(figura 23B), respectivamente, o que sugere homogeneidade da amostra obtida. A
alteração de migração verificada sob condições redutoras pode ser decorrente do
rompimento de ponte(s) dissulfeto intracadeia, fazendo com que a proteína adquira uma
conformação não-globular, gerando um aumento do volume hidrodinâmico e retardando
sua migração. Retardo na migração de amostras submetidas à redução tem sido
observado para muitas proteínas (Felicori et al., 2003; Carrijo et al., 2005).
Quando Sp-Lec foi analisada por espectrometria de massas, vários sinais m/z se
sobrepuseram na região de 17000Da (figura 24A), sugerindo que proteínas com
semelhantes massas moleculares estão presentes nesta fração. Entretanto, a procura de
massas na janela de 20-70kDa demonstra a presença de sinais m/z de 34000, 51000 e
68000Da (figura 24B), evidenciando que Sp-Lec é capaz de formar oligômeros.
Potencial de oligomerização é uma característica comumente exibida por lectinas
(Drickamer, 1993; Singh et al., 1999; Hakanson e Reid, 2000), e alguns autores
demonstram que esta agregação aumenta a potência da atividade hemaglutinante
(Barondes, 1988; Hakanson e Reid, 2000). Estes dados estão de acordo com nossa
hipótese de que a fração S1 resulta da agregação de monômeros de Sp-Lec, formando
um agregado com alta atividade aglutinante (tabela IV).
Devido a observação de vários sinais m/z para Sp-Lec por espectrometria de
massas, esta fração foi submetida à cromatografia de fase reversa (figura 19) e foi
resolvida em seis grupos protéicos principais (Sp-Lec I-VI), os quais apresentaram
tempo de retenção muito próximos (eluidas na faixa de 36,8-40,0% de ACN). Os perfis
127
de massa obtidos demonstram a homogeneidade destas amostras (figuras 25 a 27) e
valores de massa molecular entre 15.851 a 16.976Da (ver tabela V). O N-terminal de
Sp-Lec III e V foram determinados por seqüenciamento da proteína nativa e as
seqüências obtidas apresentam alta homologia entre si (tabela V); infelizmente não foi
possível determinar o N-terminal das outras frações. A isolectina Sp-Lec VI foi
resistente à degradação química de Edman, sugerindo que o resíduo N-terminal estava
bloqueado. Sp-Lec II e IV não foram submetidas ao seqüenciamento N-terminal, devido
à pequena quantidade de material obtido (tabela V). Considerando-se este conjunto de
dados (similaridade no tempo de retenção, na massa molecular e homologia na região
N-terminal) e a observação da inefetividade de alguns processos cromatográficos em
separar a fração V, sugere-se que Sp-Lec I a VI são isoformas (isolectinas).
Possivelmente, as diferenças de massas observadas devem-se a pequenas diferenças em
sua composição de aminoácidos e/ou modificações pós-traducionais. A existência de
isolectinas também foi descrita no gérmen de trigo WGA (1, 2 e 3), no muco das
guelras da enguia Anguilla japonica (eCL-1 e eCL-2) e para lectinas do soro de
Verasper variegatus (Mistry et al., 2001).
Grande parte da seqüência primária de Sp-Lec V foi determinada pelo
seqüenciamento do N-terminal e pela sobreposição de fragmentos obtidos por digestão
enzimática (figura 29). Buscas por similaridades no banco de dados UniProt mostraram
que Sp-Lec V possui identidade com proteínas pertencentes à família das lectinas tipo
C, dentre as quais destacam-se: eCL-2 (35%) e eCL-1 (34%), isoladas do muco das
guelras da enguia Anguilla japonica; isoforma 2 da lectina do soro de Verasper
variegatus (33%); membro número 12 da subfamília das collectinas (camundongo Mus
musculus; 33%), precursor de proteína ligante de lipopolissacarídeos encontrado na
hemolinfa de baratas (Periplaneta americana; 33%) receptor tipo 2 de manose de
128
Sp-Lec V 1 DAEPPSPAEECAAVKMESCGDDWLYIDENRKV 32
CRD --------Ω
Sp-Lec V 33 KYFETPK-TFQEAQDHCESEDGNLVAMHTEFQKYVVACLS-------WIYNHKLH--RMWIG 84
eCL-2 42 KHFDLLK-NWREAESHCMTQGGHLASVHSNVEYEFLRELI-------KASDPWDS--IIWIG 93
eCL-1 42 KHFDLLK-NWREAEFYCMIRGGHLASVHSNVEYQFLRELN-------KASDPQDS--MFWIG 93
Nattectin 44 T-FHRGSMDWASAEAACIRKGGNLASIHNRREQNFITHLI-------HKLSGENR--RTWIG 95
AJL-2 46 YLHVAEKKTWLDAELNCLHHGGNLASEHSEDEHQFLKDLHKGSDDPFWIGLSAVHEGRSWL- 106
CRD ---------Ф--θ---C------θ--θ-O--E--Ωθ-----------------------ФθG
Sp-Lec V 85 AG--RSEGETQNIDGSDFDYAK--GGQPDNFGGNEDCIEANFIDWGYLNDVECSEKLPFMCA 142
eCL-2 94 LTDIQKEGTWVWSDGSAVDFTTWDSKQPDNWQGNEDCVHANVPEQKNWNDMSCSESYRFICA 155
eCL-1 94 LTDIRKEGTWVWSDGSAVDFTTWNPGQPDDWQGNEDCVHANVPEQKNWNDVDCSTPYRFICA 155
Nattectin 96 GNDAVKEGMWFWSDGSKFNYKGWKKGQPDKHVPAEHCAETNFKG-AFWNNALCKVKRSFLCA 156
AJL-2 107 ----WSDGTSASAEG-DFSMWN--PGEPNDAGGKEDCVHDNYGGQKHWNDIKCDLLFPSICV 161
CRD θ--------Ф----G----Ω--W---ZP------EOCθ-Ω-----G-WND--C-----Ω-C-
Figura 39. ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE Sp-Lec V COM A DE OUTRAS LECTINAS TIPO C. Marcações em amarelo
indicam resíduos de aminoácido idênticos em todas as seqüências; marcações em cinza mostram resíduos idênticos aos de Sp-Lec V. Os quatro resíduos Cys
que formam duas pontes dissulfeto conservadas estão marcados com asterisco. O motivo conservado para ligação ao carboidrato está em negrito. Na seqüência
característica do Domínio de Reconhecimento de Carboidrato (CRD) das Lectinas tipo C, os resíduos conservados estão indicados por sua respectiva
abreviatura de uma letra, enquanto resíduos conservados em caráter são indicados por: O, que contêm oxigênio; Ф, aromático; θ, alifático; e Ω, aromático ou
alifático. Espaços (-) foram inseridos para otimizar a identidade. Referências: eCL-2 e eCL-1 (Mistry et al., 2001); Nattectin (Magalhães et al., 2004); AJL-2
(Tasumi et al., 2002); CRD (Drickamer, 1993). As buscas de homologia em bancos de dados de proteínas (Selistre-de-Araújo e Ramos, 2007) foi realizado pelo
programa BLAST.
*
*
* *
129
Danio rerio (32%); lectina tipo C ligante de manose de Oncorhynchus mykiss (29%);
precursor de Nattectina do peixe-sapo niquim (Thalassophryne nattereri; 29%);
precursor da proteína ligante de manose AJL-2 do muco cutâneo da enguia Anguilla
japonica (27%), dentre outras. A similaridade de Sp-Lec V com lectinas descritas acima
é uma forte evidência que esta molécula pode ser considerada uma lectina do tipo C.
Com exceção de AJL-2, cuja atividade é independente da presença de Ca
+2
(Tasumi et
al., 2002), todas as moléculas encontradas em tecidos animais que possuem um domínio
de reconhecimento de carboidratos (CRD) necessitam da presença deste cátion divalente
para sua atividade aglutinante (Jomori e Natori, 1991). A figura 39 mostra o
alinhamento de Sp-Lec V com outras lectinas tipo C e algumas características de
lectinas encontradas em tecidos de peixes, com maior identidade a Sp-Lec V, estão
listadas na tabela VII.
A estrutura primária de Sp-Lec V apresenta 10 dos 14 resíduos de aminoácidos
invariáveis e 17 dos 18 resíduos conservados (figura 29) do Domínio de
Reconhecimento de Carboidratos das Lectinas tipo C (CRD, figuras 9 e 39). Segundo o
arquétipo estrutural destes domínios, quatro cisteínas estão envolvidas em pontes
dissulfeto conservadas. Resíduos de cisteína com posições semelhante pode ser
observado na estrutura da Sp-Lec V, (figura 39, asteriscos) o que pode indicar que esta
lectina também apresenta estas pontes intracadeia. Sp-Lec V também apresenta um
motivo QPD (figuras 29 e 39, resíduos 107-109) em sua estrutura, o qual é
característico de lectinas ligantes de galactose (Drickamer, 1993; Kolathar e Weis,
1996). Uma diferença de 700Da foi verificada entre a massa molecular de Sp-Lec V
determinada por MALDI-TOF-MS (16.835,74Da, figura 27A e tabela V) e a calculada
pela seqüência de aminoácidos (16.135,68Da), sugere que a seqüência obtida não está
130
TABELA VII. COMPARAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS DE Sp-Lec V COM AS DE LECTINAS TIPO C DE PEIXES.
* peptídeo sinal.
** deduzido por homologia.
*** nd, não determinada.
Lectina Espécie
Tecido de
origem
Subunidades
% Identidade
com Sp-Lec V
Ligante Atividade Referencias
Sp-Lec V
Scorpaena
plumieri
Aparato
peçonhento
16.835Da
1 (142aa)
- **Galactose Independente Ca
+2
Presente trabalho
eCL-2
Anguilla
japônica
Células mucosas
das guelras
1 (*22aa + 141aa)
35 Galactose Dependente Ca
+2
Mistry et al., 2001
eCL-1
Anguilla
japônica
Células mucosas
das guelras
1 (*22aa + 141aa)
34 Galactose Dependente Ca
+2
Mistry et al., 2001
Nattectin
Thalassophryne
nattereri
Glândula
de peçonha
1 (156aa)
29 **Galactose ***nd
Magalhães et al., 2004
AJL-2
Anguilla
japônica
Muco cutâneo
2x 15870Da
(*24aa + 142aa)
27 Lactose Independente Ca
+2
Tasumi et al., 2002
131
completa e/ou esta lectina é uma glicoproteina. Entretanto, na seqüência obtida não é
possível observar sítios potenciais de N-glicosilação (NxT ou NxS).
5.6. Caracterização farmacológica de Sp-Lec
Apesar de ter falhado na indução de agregação de plaquetas humanas, Sp-Lec
induziu a aglutinação de eritrócitos de coelho, entretanto foi necessário uma alta
concentração da lectina (0,5mg/mL; 30µM) nas condições do ensaio. Devido à baixa
quantidade de material protéico obtido, o teste da atividade aglutinante de cada uma das
isoformas isoladas não foi realizado. Semelhante à AJL-2, lectina tipo C isolada do
muco cutâneo da enguia japonesa Anguilla japonica (Tasumi et al., 2002), a atividade
hemaglutinante de Sp-Lec (tabela VII) foi independente da presença de íons Ca
+2
livres,
ocorreu mesmo em presença de agentes quelantes (EDTA). Devido a independência de
íons Ca
+2
para a manutenção da estrutura do CRD e atividade de Sp-Lec,
podemossugerir que Sp-Lec integra a superfamília das CTLPs (C type lectin like
proteins). A presença do motivo QPD em sua estrutura sugere que esta lectina é
especifica para galactose (tabela VII). Entretanto, estudos estão em andamento para
determinar a especificidade de ligação a carboidratos desta proteína.
Um teste preliminar foi realizado para verificar o potencial mitogênico da Sp-
Lec. Assim como as lectinas PHA do feijão vermelho Phaseolus vulgaris (Nowel,
1960), Concanavalina A do feijão-de-porco Canavalia ensiformis (Sabato et al., 1987),
Jacalina das sementes de jaca Artocarpus heterophyllus (Pineau et al., 1990) e a
aglutinina da ervilhaca peluda Vicia villosa (Abrignani e Cammisuli, 1988), foi
verificado que Sp-Lec induz a proliferação de leucócitos mononucleares (figura 36C),
sugerindo que a lectina purificada possui também potencial mitogênico, apesar de sua
potencia ser cerca de 3 ordens de magnitude menor que a experimentalmente
132
determinada para PHA (figura 36A). Entretanto, é bem estabelecido que PHA
reconhece uma grande variedade de carboidratos (Slifkin e Doyle, 1990), o que sugere
uma menor especificidade desta lectina.
Este é o primeiro relato da identificação e da purificação de uma lectina tipo C
de peçonhas de peixes, apesar da seqüência de Nattectina, uma proteína homóloga a
lectinas do tipo C, ter sido identificada por análise genômica das glândulas peçonhentas
do peixe Thalassophryne nattereri (Magalhães et al., 2004). Considerando a homologia
estrutural de Sp-Lec com lectinas de muco cutâneo de peixes, e também o modo de
extração da peçonha, que envolve o seccionamento e a trituração do espinho inteiro
(compreendendo o tecido secretor da peçonha, espinhos, membrana tegumentar e sua
secreção cutânea mucosa), é possível que Sp-Lec seja originada do muco e tenha sido
extraída conjuntamente com proteínas da peçonha. Experimentos adicionais são
necessários para determinar a real origem desta lectina. Devido a homologia de Sp-Lec
com proteínas ligantes de lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos, a atividade aglutinante
de Sp-Lec sobre patógenos bacterianos poderá ser alvo de estudos futuros.
133
6. Considerações finais
Neste trabalho nós isolamos e caracterizamos duas novas proteínas bioativas a
partir do extrato bruto da peçonha de um peixe-escorpião (Scorpaena plumieri): Sp-
CTx, uma toxina altamente citolítica e vasoativa; e Sp-Lec, uma proteína
hemaglutinante homóloga a lectinas do tipo C.
Um processo de purificação, envolvendo quatro etapas cromatográficas, foi
estabelecido com sucesso para obtenção da citolisina do peixe-escorpião em sua forma
nativa. Estruturalmente, Sp-CTx é uma glicoproteína de alta massa molecular (121kDa)
constituída por duas subunidades (≈65kDa), a qual compartilha epítopos similares aos
exibidos pelas toxinas hemolíticas de peixes-pedra. Semelhante a estas toxinas, a
citolisina do peixe-escorpião exibe diferentes atividades biológicas, incluindo um forte
efeito hemolítico direto (EC
50
= 0,46nM) e potente atividade vasorelaxante dependente
de endotélio e NO (em concentrações ≥ 1pM). Mesmo sob condições controladas de
armazenamento, Sp-CTx mostrou-se instável, ocorrendo significante perda das
atividades biológicas desta citolisina durante o processo de fracionamento, o que explica
o baixo rendimento obtido. Tentativas de otimizar o processo de purificação estão em
progresso, visando-se recuperar maiores quantidades de Sp-CTx para sua completa
caracterização química e farmacológica.
Durante o estabelecimento do processo de isolamento da toxina citolítica,
também foi identificada uma fração protéica com atividade hemaglutinante nesta
peçonha. A proteína responsável por esta atividade, Sp-Lec, foi purificada pela
combinação de duas etapas cromatográficas de filtração em gel. Posterior
fracionamento por cromatografia de fase reversa e análises por espectrometria de
massas demonstraram que Sp-Lec consiste de uma mistura de seis isoformas (Sp-Lec I-
134
VI), as quais apresentam massas moleculares de aproximadamente 16900Da.
Estruturalmente, Sp-Lec V apresenta estrutura primária semelhante a de lectinas
encontradas em muco de peixes, e exibe um domínio semelhante ao de reconhecimento
de carboidratos das lectinas tipo C e CTLPs (C Type Lectin Like Proteins). Apesar de
ter falhado na indução de agregação plaquetária, Sp-Lec induziu a aglutinação de
eritrócitos de coelho (concentrações ≥ 0,5mg/mL = 30µM) de maneira independente de
íons Ca
+2
livre, assim como descrito para algumas CTLPs. Estes dados sugerem que Sp-
Lec integra a superfamília das CTLPs. Em experimentos preliminares, foi demonstrado
que esta proteína é capaz de induzir mitose em células mononucleares de sangue
periférico (2-8µM). Entretanto, investigações adicionais são necessárias para determinar
as funções biológicas desta toxina, assim como sua real origem: a peçonha, ou o muco
cutâneo de Scorpaena plumieri.
Os dados apresentados fornecem informações relevantes para conhecimento e
compreensão dos efeitos tóxicos da peçonha de S. plumieri. Os modelos experimentais
estabelecidos são importantes para estudos futuros desta peçonha e de outros peixes
marinhos, abrindo perspectivas para a descoberta de novas proteínas que podem
apresentar potenciais aplicações farmacológicas, ou constituírem ferramentas úteis para
estudos em Farmacologia.
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159
y = -4,1634x + 3,0367
R² = 0,9839
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
8. Anexos
Anexo I - Curva de calibração para estimativa da massa molecular de Sp-CTx por
cromatografia de filtração em gel.
Volume total da coluna Superose 12: 23,56mL
Volume vazio da coluna Superose 12: 8,24mL (determinado com Blue dextran:
2.000kDa)
Massa molecular dos marcadores protéicos utilizados:
β-Amilase: 200kDa
Soroalbumina bovina (BSA): 66kDa
Ovoalbumina: 45kDa
Citocromo C: 12,5kDa
Massa molecular estimada da proteína purificada (nativa):
Sp-CTx: 121kDa
β
-
Amilase
Sp
-
CTx
BSA
Ovoalbumina
Citocromo C
Eluição relativa
(Kav)
Log (Massa Molecular)
160
y = -1,0001x + 2,4492
R² = 0,9899
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Anexo II - Curva de calibração para estimativa da massa molecular de Sp-CTx por
SDS-PAGE.
Massa molecular dos marcadores protéicos utilizados:
β-Amilase: 200kDa
β-Galactosidase: 116kDa
Fosforilase b: 97kDa
Soroalbumina bovina (BSA): 66kDa
Massa molecular aparente da proteína purificada:
Sp-CTx: 73kDa
M
obilidade
relativa (Rf)
Log (Massa Molecular)
β
-
Amilase
Fosforilase b
β
-
Galactosidase
Sp
-
CTx
BSA
161
Os seguintes trabalhos foram originados com os resultados obtidos neste trabalho:
Anexo III - Resumos publicados em anais de congressos e encontros
1. ANDRICH, F., LEMOS, P. H., LAUTNER, R. Q., SANTOS, R. A. S., SANTOS, A.
V., PIMENTA, A. M. C., MEDEIROS, E. F., de LIMA, M. E., FIGUEIREDO, S. G.
Purification and characterization of a vasoactive cytolysin from scorpionfish venom
(Scorpaena plumieri). In: XVI World Congress of the International Society on
Toxinology e X Congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia, 2009, Cabo de
Santo Agostinho-Recife.
2. ANDRICH, F., CARNIELLI, J. B. T., FELTRIM, T. H. L., CASSOLI, J.S.,
PIMENTA, A. M. C., CORDEIRO, M. N., RICHARDSON, M., FIGUEIREDO, S. G.,
de LIMA, M. E. Purification of a C-type lectin from scorpionfish (Scorpaena plumieri)
venom apparatus. In: XVI World Congress of the International Society on Toxinology e
X Congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia, 2009, Cabo de Santo Agostinho-
Recife.
3. ANDRICH, F., CARNIELLI, J. B. T., CASSOLI, J.S., PIMENTA, A. M. C., DEL
BIANCO PEIXOTO, K., CORDEIRO, M. N., RICHARDSON, M., de LIMA, M. E.,
FIGUEIREDO, S. G. Purification of a protein with hemagglutinating activity from
scorpionfish venom (Scorpaena plumieri). In: XXXVII Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq)., 2008, Águas de Lindóia - SP.
4. ANDRICH, F., FAITANIN, R. D., ROCHA-RESENDE, C., LIMA CARDOSO, F.,
SAMPAIO, K. N., MAUAD, H., SANTOS, R. A. S., FIGUEIREDO, S. G., de LIMA,
M. E. Purification of cytolitic protein(s) with cardiovascular activity from scorpionfish
venom (Scorpanea plumieri). In: XXXVII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq)., 2008, Águas de Lindóia - SP.
5. ANDRICH, F., FELTRIM, T. H. L., ROCHA-RESENDE, C., SAMPAIO, K. N.,
MAUAD, H., SANTOS, R. A. S., FIGUEIREDO, S. G., de LIMA, M. E. Purificação e
caracterização de uma proteína citolítica e com ação cardiovascular a partir da peçonha
do peixe-escorpião Scorpaena plumieri. In: XVI Encontro de Pesquisa em Fisiologia e
Farmacologia, 2008, Belo Horizonte - MG.
6. ANDRICH, F., FAITANIN, R. D., ROCHA-RESENDE, C., SAMPAIO, K. N.,
MAUAD, H., SANTOS, R. A. S., FIGUEIREDO, S. G., de LIMA, M. E. Purification of
cytolitic protein with cardiovascular activity from scorpionfish venom (Scorpanea
plumieri). In: IX Encontro de Pesquisa do Instituto de Ciências Biológicas e IV
Encontro Anual de Pesquisa em Bioquímica e Imunologia, 2008, Belo Horizonte, MG.
7. ANDRICH, F., CARNIELLI, J.B.T., LAUTNER, R.Q., SANTOS, R.A.S., DOS
SANTOS, A.V., PIMENTA, A.M.C., MONTANDON, G.G., GOES, A.M.,
RICHARDSON, M., CORDEIRO, M.N., FIGUEIREDO, S.G., DE LIMA, M.E.
Characterization of two bioactive proteins, cytolysin and lectin, from Scorpaena
plumieri fish venom. In: XVII Encontro de Pesquisa em Fisiologia e Farmacologia,
2009, Belo Horizonte - MG.
162
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A VASOACTIVE CYTOLYSIN FROM
SCORPIONFISH VENOM (Scorpaena plumieri).
Andrich, F.
1,2
, Lemos, P.H.
2
, Lautner, R.Q.
3
, Santos, R.A.S.
3
, Santos, A.V.
1,4
, Pimenta, A.M.C.
1,4
,
Medeiros, E.F.
5
, de Lima, M.E.
1
, Figueiredo, S.G.
2
1 Depto. Fisiologia e Biofísica, Depto. Bioquímica e Imunologia – Lab. Venenos e Toxinas Animais,
ICB/UFMG, Belo Horizonte-MG.
2 Lab.Química de Proteínas, DCS-UFES, Vitória-ES.
3 Lab. Hipertensão, Depto. Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG, Belo Horizonte–MG.
4 Núcleo de Biomoléculas, Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB/UFMG, Belo Horizonte-MG.
5 Depto. Química, CCE-UFES, Vitória-ES.
It is known that venoms of fish belonging to Scorpaenidae family possess hemolytic and cardiovascular
properties, and both effects seem to be a result of the action of a single component of the venom. Up to
date, attempts to purify the compound responsible for these effects from scorpionfish venoms were
unsuccessful due to the high instability inherent to fish venoms. In this work we describe the purification
of a vasoactive and cytolytic protein from the venom of the scorpionfish Scorpaena plumieri. The
cytolysin (Sp-CTx) was purified from the crude venom by combination of four chromatographic steps:
Gel filtration on Sephacryl S200, anion-exchange on MonoQ and on MiniQ, and Gel filtration on
Superose 12. The molecular mass of the purified protein was 131,412.27Da (MALDI-TOF-MS). Two
polypeptide chains (74 and 84kDa) were detected when Sp-CTx was submitted to SDS-PAGE. This
protein exhibited potent hemolytic activity on washed rabbit erythrocytes (EC
50
0.42nM), which was
strongly reduced after treatment with stonefish antivenom (SFAV). The cross-reactivity of Sp-CTx with
SFAV was confirmed by western-blotting. The purified protein caused a biphasic response on
phenylephrine pre-contracted rat aortic rings, characterized by an endothelium-dependent relaxation
phase followed by an endothelium-independent contractile phase (1nM). The relaxant response was
abolished after pre-treatment of the vascular preparation with nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME).
This is the first report of purification of a cytolytic/vasoactive protein from scorpionfish venom. Sp-CTx
showed several properties in common to toxins from stonefish venoms, suggesting that scorpionfish and
stonefish venoms possess compounds with structural similarities.
Finnancial Support: CAPES, CNPq, FAPEMIG.
Key words: Scorpionfish, purification, cytolysin, vasoactive protein.
163
PURIFICATION OF A C-TYPE LECTIN FROM SCORPIONFISH (Scorpaena plumieri)
VENOM APPARATUS.
Andrich, F.
1,2
, Carnielli, J.B.T.
2
, Feltrim, T.H.L.
1
, Cassoli, J.S.
1
, Pimenta, A.M.C.
1
, Cordeiro, M.N.
3
,
Richardson, M.
3
, Figueiredo, S.G.
2
, de Lima, M.E.
1
1 Depto. Fisiologia e Biofísica, Depto. Bioquímica e Imunologia – Lab. Venenos e Toxinas Animais,
ICB/UFMG, Belo Horizonte-MG, Brazil.
2 Lab.Química de Proteínas, DCS-UFES, Vitória-ES, Brazil.
3
Centro de Pesquisa Carlos Ribeiro Diniz, FUNED, Belo Horizonte-MG, Brazil.
Lectins, which are carbohydrate-binding proteins of non-immunologic origin and do not display catalytic
function, are found widely distributed in bacteria, plants and animals. Most animal lectins are found to
exist internally, but some are also secreted and found in venoms (e.g., snakes) or skin mucus, especially
in fish. In this work we describe the purification of a lectin from the venom apparatus (comprising the
venom containing tissue, spines, integumentary sheath and its mucous secretion) extract of the
scorpionfish Scorpaena plumieri. A fraction with hemagglutinating activity (FHem) upon washed rabbit
erythrocytes was purified from the extract by two gel filtration chromatographies: Sephacryl S200 and
Superose 12/FPLC. When FHem was submited to reverse phase chromatography and mass spectrometry
(ESI-Q-TOF) analyses, four components with very similar retention (34.2-36.6%ACN) and molecular
masses (16,839-16,997Da) were detected, suggesting that they are isoforms. Amino acid sequence of one
of these compounds (142 residues, which represents 96% of the total mass) was determined by automated
sequencing of the intact protein and peptides resulting from trypsin and S. aureus V8 protease digestion.
This protein exhibits significant sequence similarities with C-type lectins from the mucous cells of the
gills and skin mucus of the eel Anguilla japonica. This sequence presents a QPD motif suggesting
specific binding to β-D-galactose. In contrast to other C-type lectins the activity of FHem was
independent of Ca
+2
. Additionaly, the presence of reducing agent (DTT) increases its activity (8 fold).
This is the first report of purification of a C-type lectin from a fish venom apparatus extract. Further
studies will help to elucidate the exact origin of this lectin: either scorpionfish venom or its skin mucous
secretion.
Financial support: CNPq, CAPES, PROBRAL (DAAD/CAPES), FAPEMIG, FUNED.
Key words: Scorpaena plumieri, fish venom, purification, C-type lectin.
164
PURIFICATION OF A PROTEIN WITH HEMAGGLUTINATING ACTIVITY FROM
SCORPIONFISH VENOM (Scorpaena plumieri).
Andrich, F.
1,2
; Carnielli, J.B.T.
2
; Cassoli, J.S.
1,2
;Pimenta, A.M.C.
1
;Del Bianco Peixoto, K .
1
;Cordeiro,
M.N.
3
;Richardson, M.
3
de Lima, M.E.
1
,Figueiredo, S.G.
2
1 Departamento de Fisiologia e Biofísica, Departamento de Bioquímica e Imunologia
- Laboratório de Venenos e Toxinas Animais, ICB/UFMG, Belo Horizonte-MG, Brazil.
2 Laboratório de Química de Proteínas, DCS-UFES, Vitória-ES, Brazil.
3
Centro de Pesquisa Carlos Ribeiro Diniz, FUNED, MG, Brazil.
The scorpionfish, Scorpaena plumieri, is a venomous fish which belongs to Scorpaenidae family. Stings
by the scorpionfish are quite common and extremely painful, accompanied by swelling and erytema. An
initial characterization of the properties of this venom showed the presence of hemolytic and enzymatic
activities. In this work we describe the purification of a C-type lectin from scorpionfish venom. A fraction
with hemagglutinating activity upon washed rabbit erythrocytes was obtained from the whole venom
through a combination of two gel filtration chromatographies: Sephacryl S200 and Superose 12/FPLC.
Analysis of the purified fractions by reversed phase chromatography showed the presence of four
components with very close retention (34.2-36.6%ACN) and similar molecular masses (16,839-
16,997Da), leading us to suppose that they are isoforms of the same protein. The complete amino acid
sequence of one of these compounds was determined by automated sequencing of the intact protein and
peptides resulting from enzymatic digestion. This protein (142 residues) exhibits significant sequence
similarities with C-type lectins. This is the first report of detection and purification of a protein with
hemagglutinating activity from S. plumieri venom. Further investigations will help to elucidate the role of
this compound on scorpionfish envenomation.
Key words: Scorpaena plumieri, fish venom, C-type lectin.
Financial support: CNPq, CAPES, PROBRAL (DAAD/CAPES), FAPEMIG, FUNED.
165
PURIFICATION OF CYTOLYTIC PROTEIN(S) WITH CARDIOVASCULAR ACTIVITY
FROM SCORPIONFISH VENOM (Scorpaena plumieri).
Andrich, F.
1,4
,Faitanin, R.D.
4
, Rocha-Resende, C.
1
, Lima-Cardoso, F.
1
, Sampaio, K.N.
2
, Mauad, H.
2
,
Santos, R.A.S.
3
, Figueiredo, S.G.
4
, de Lima, M.E.
1
1 Departamento de Fisiologia e Biofísica, Departamento de Bioquímica e Imunologia - Laboratório de
Venenos e Toxinas Animais, ICB/UFMG, Belo Horizonte - MG, Brazil.
2
Laboratório de Regulação Central da Pressão Arterial, DCS-UFES, Vitória-ES, Brazil.
3
Laboratório de Hipertensão, Depto. de Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG, Belo Horizonte –MG, Brazil.
4
Laboratório de Química de Proteínas, DCS-UFES, Vitória-ES, Brazil.
We describe the hemolytic and cardiovascular effects of purified proteins from Scorpaena plumieri
scorpionfish venom, and the partial neutralization of its effects by the use of Stonefish Antivenom
(SFAV). Sub-lethal doses (13,5-216µg/kg) of the crude venom induced an increase in mean arterial blood
pressure, on anaesthetized rats, which was followed by severe hypotension at lethal doses (338µg/kg). As
described previously, the venom showed cytolytic properties against washed rabbit erythrocytes. Two
hemolytic proteins (F5H1 and F5H2) were purified from the crude venom extract by combination of two
chromatographic steps: Gel filtration (Sephacryl S200 HR) and anion-exchange (MonoQ 5/5 HR). These
proteins, and the semi-purified fraction F5 (pooled on the first chromatography), were highly hemolytic to
washed rabbit erythrocytes with an EC
50
of about 350ng (F5H1 and F5H2) and 700ng (F5). Both F5 and
F5H2 caused potent dose-dependent, cardiovascular alterations, characterized by an immediate increase
followed by a more sustained decrease of mean arterial blood pressure of non-anaesthetized rats.
Interestingly, both the cardiovascular and hemolytic properties of fraction F5 were attenuated by the use
of SFAV. The cross-reactivity of SFAV with the purified proteins was confirmed by western-blotting.
This is the first report of purification of cytolytic/cardiovascular active proteins from a scorpionfish
venom. The data presented suggest that scorpionfish and stonefish venoms share pharmacological
properties and may have compounds (proteins) with structural similarities.
Key words: Scorpionfish venom, cytolysin, cardiovascular activity.
Finnancial Support: CAPES, CNPq, DAAD/CAPES (PROBRAL), FAPEMIG.
166
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA PROTEÍNA CITOLÍTICA E COM
ACAO CARDIOVASCULAR A PARTIR DA PEÇONHA DO PEIXE-ESCORPIÃO
Scorpaena plumieri.
Filipe Andrich
1,4**
, Tiago HL Feltrim
1*
, Cibele Rocha-Resende
1*
, Karla N Sampaio
2
, Hélder Mauad
2
,
Robson AS Santos
3
, Suely G Figueiredo
4
, Maria E de Lima
1
1 Lab. Venenos e Toxinas Animais, Depto. Fisiologia e Biofísica, Depto. Bioquímica e Imunologia,
ICB/UFMG
2 Lab. Regulação Central do Sistema Cardiovascular, Depto. Ciências Fisiológicas, CCS-UFES
3 Lab. Hipertensão, Depto. Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG
4 Lab.Química de Proteínas, CCS-UFES
Objetivos: Neste trabalho nós descrevemos a purificação de uma proteína citolitica a partir da peçonha
do peixe-escorpião Scorpaena plumieri e verificamos efeitos cardiovasculares in vivo de frações
purificadas.
Métodos: A estratégia de purificação envolveu cromatografias de: Gel filtração em Sephacryl S200, troca
aniônica em MonoQ 5/5 e MiniQ 4.6/5, e Gel filtração em Superose 12. O grau de pureza e massa
molecular foram estimados por eletroforese em gel de poliacrilamida. Os testes citolíticos foram
realizados utilizando eritrócitos de coelho lavados. Os efeitos cardiovasculares sobre a pressão arterial
média (PAM) e freqüência cardíaca foram avaliados em ratos Wistar acordados.
Resultados: A proteína alvo deste estudo foi purificada da peçonha de Scorpaena plumieri pela
combinação de quatro etapas cromatográficas. Trata-se de um heterodimero composto por cadeias de 74 e
84kDa e altamente hemolítico (EC
50
= 55ng/mL). Frações semi-purificadas causaram potente alterações
cardiovasculares, caracterizadas por um aumento imediato da PAM seguido por uma diminuição mais
sustentada da mesma (dose-dependente). Os efeitos cardiovasculares e citoliticos foram atenuados pelo
uso de anti-soro preparado contra peçonha de peixes-pedra (SFAV).
Conclusões: Este é o primeiro relato de purificação de uma proteína citolítica e com ação cardiovascular
de peçonha de peixes-escorpião. A neutralização dos efeitos farmacológicos de frações purificadas por
SFAV sugerem similaridades na composição das peçonhas de peixes-escorpião e peixes-pedra.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, DAAD/CAPES (PROBRAL), FAPEMIG.
167
PURIFICATION OF CYTOLYTIC PROTEIN WITH CARDIOVASCULAR ACTIVITY
FROM SCORPIONFISH VENOM (Scorpaena plumieri).
Andrich, F.
1,4
, Faitanin, R.D.
4
, Rocha-Resende, C.
1
, Sampaio, K.N.
2
, Mauad, H.
2
, Santos, R.A.S.
3
,
Figueiredo, S.G.
4
, de Lima, M.E.
1
1 Depto. Fisiologia e Biofísica, Depto. Bioquímica e Imunologia – Lab. Venenos e Toxinas Animais,
ICB/UFMG, Belo Horizonte-MG.
2 Lab. Regulação Central do Sistema Cardiovascular, DCS-UFES, Vitória-ES.
3 Lab. Hipertensão, Depto. Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG, Belo Horizonte–MG.
4 Lab.Química de Proteínas, DCS-UFES, Vitória-ES.
It is known that venoms of fish belonging to Scorpaenidae family possess hemolytic and cardiovascular
properties, and both effects seem to be a result of the action of a single component of the venom. Up to
date, the attempts to purify the compound responsible for these effects from scorpionfish venoms were
unsuccessful, due to the high instability inherent to fish venoms. In this work we describe the
cardiovascular effects induced by Scorpaena plumieri fish venom and the purification of a cytolytic
protein. Sub-lethal doses (14-216µg/kg) of the crude venom induced an increase in mean arterial blood
pressure (MAP) on anaesthetized rats, which was followed by severe hypotension at lethal doses
(338µg/kg). A protein (Sp-CTx) was purified from the crude venom by combination of four
chromatographic steps: Gel filtration on Sephacryl S200, anion-exchange on MonoQ 5/5 and on MiniQ
4.6/5, and Gel filtration on Superose 12. SDS-PAGE analysis of Sp-CTx showed a single proteic band
with estimated molecular weight of 75kDa. The purified protein and the semipurified fractions F5 and
F5Q (from the first and second chromatographic steps) were highly hemolytic to washed rabbit
erythrocytes. Both F5 and F5Q fractions caused potent cardiovascular alterations, characterized by an
immediate increase followed by a more sustained decrease of MAP of non-anaesthetized rats (dose-
dependent). The cardiovascular and hemolytic properties of fraction F5 were attenuated by the use of
stonefish antivenom (SFAV) and the cross-reactivity of SFAV with the purified proteins was confirmed
by western-blotting. This is the first report of purification of cytolytic/cardiovascular active proteins from
a scorpionfish venom. The data presented suggest that scorpionfish and stonefish venoms share
pharmacological properties and may have compounds with structural similarities.
Finnancial Support: CAPES, CNPq, DAAD/CAPES (PROBRAL), FAPEMIG.
168
CHARACTERIZATION OF TWO BIOACTIVE PROTEINS, CYTOLYSIN AND
LECTIN, FROM Scorpaena plumieri FISH VENOM.
Andrich F
1**
, Carnielli
2**
JBT, Lautner
1**
RQ, Santos
1
RAS, dos Santos
3
AV, Pimenta
3
AMC,
Montandon
1**
GG, Goes
3
AM, Richardson
4
M, Cordeiro
4
MN, Figueiredo
2
SG, de Lima
1,3
ME.
1
Dept. Fisiol. e Biof., ICB/UFMG.
2
Dept. Ciênc. Fisiol., UFES.
3
Dept. Bioq. e Imun., ICB/UFMG.
4
Centro Pesq. e Desenv., FUNED-MG.
Aim: This work describes a partial pharmacological and biochemical characterization of two
proteins from the venom of scorpionfish S. plumieri: a cytolytic toxin, Sp-CTx, and a C-type
lectin, Sp-Lec.
Methods and Results: The cytolysin has been purified by gel filtration and anion exchange
chromatographies. Physicochemical studies have indicated Sp-CTx as a dimeric glycoprotein of
121kDa with subunits of about 65kDa. Such protein has proved to have a potent hemolytic
activity on washed rabbit erythrocytes (EC
50
0.46nM), whose effect was strongly reduced after
treatment with antivenom raised against stonefish venom. Sp-CTx (1nM) caused a biphasic
response on phenylephrine pre-contracted rat aortic rings: an endothelium- and dose-dependent
relaxation phase followed by a contractile phase. The vasorelaxant activity has been abolished
by L-NAME, demonstrating the involvement of NO on the response. The hemagglutinating
protein (Sp-Lec) was purified by two gel filtration steps. Chemical analyses of Sp-Lec revealed
six components with very similar retention (39.2-42.2% ACN) and molecular masses (15,850-
16,981Da), being probably isoforms. The amino acid sequence of one of these compounds
showed significant similarities with C-type lectins and presents a QPD motif, suggesting
specific binding to β-D-galactose. However, the activity of Sp-Lec was Ca
+2
-independent.
Additionally, this lectin induced proliferation of human peripheral blood mononuclear cells.
Conclusion: We report here, for the first time, the isolation of a cytolytic/vasoactive protein
from scorpionfish venom and of a C-type lectin from a fish venom apparatus. Further studies
will contribute to elucidate the role of these proteins in human envenomation with this fish.
Financial support: CAPES, FAPEMIG, CNPq, INCTTOX.
169
Anexo IV - Artigo submetido ao Toxicon
Manuscrito relatando a purificação e caracterização parcial da citolisina da peçonha do
peixe-escorpião (Sp-CTx). Considerado publicável em 15-10-2009 no periódico de
circulação internacional Toxicon (atualmente em fase de revisão).
ANDRICH, F., CARNIELLI, J.B.T., CASSOLI, J.S., LAUTNER, R.Q., SANTOS
R.A.S., PIMENTA, A.M.C., de LIMA, M.E., FIGUEIREDO, S.G. A potent vasoactive
cytolysin isolated from Scorpaena plumieri scorpionfish venom.
170
A POTENT VASOACTIVE CYTOLYSIN ISOLATED FROM Scorpaena plumieri
SCORPIONFISH VENOM
Andrich, F.
1,2
, Carnielli, J.B.T.
2
, Cassoli, J.S.
1,2
, Lautner, R.Q.
3
, Santos R.A.S.
3
, A.M.C.
Pimenta
1
, M.E. de Lima
1
, S.G. Figueiredo
2,*
1 Departamento de Fisiologia e Biofísica, Departamento de Bioquímica e Imunologia –
Laboratório de Venenos e Toxinas Animais (LVTA), ICB/UFMG, Av. Antônio Carlos, 6627,
31270-901, Belo Horizonte-MG, Brasil.
2 Departamento de Ciências Fisiológicas – Laboratório de Química de Proteínas (LQP),
CCS/UFES, Av. Marechal Campos, 1468, 29040-090, Vitória-ES, Brasil.
3 Departamento de Fisiologia e Biofísica – Laboratório de Hipertensão, ICB/UFMG, Av.
Antônio Carlos, 6627, 31270-901, Belo Horizonte-MG, Brasil.
*Corresponding author. Tel. +55 27 3335 7349; fax +55 27 3335 7342. E-mail address:
suelygfi@cbm.ufes.br (Suely Gomes de Figueiredo).
171
Abstract
A new vasoactive cytolytic toxin, referred to as Sp-CTx, has been purified from the
venom of the scorpionfish Scorpaena plumieri by a combination of gel filtration and anion
exchange chromatographies. Physicochemical studies have indicated that Sp-CTx is a dimeric
glycoprotein comprising subunits of approximately 65kDa. Such protein has proved to possess a
potent hemolytic activity on washed rabbit erythrocytes (EC
50
0.46nM), whose effect was
strongly reduced after treatment with antivenom raised against stonefish venom - Synanceja
trachynis (SFAV). This cross-reactivity has been confirmed by western-blotting. At nanomolar
levels, Sp-CTx has caused a biphasic response on phenylephrine pre-contracted rat aortic rings,
characterized by an endothelium- and dose-dependent relaxation phase followed by a contractile
phase. The vasorelaxant activity has been abolished by L-NAME, demonstrating the
involvement of nitric oxide on the response. We report here the first isolation of a
cytolytic/vasoactive protein from scorpionfish venom and the data provided suggest structural
and functional similarities between Sp-CTx and previously published stonefish hemolytic
toxins.
Key words: Scorpionfish venom, Scorpaena plumieri, cytolysin, vasoactive protein.
172
1. Introduction
A large number of venomous and poisonous animals are found in aquatic environments
worldwide. Among these, venomous fishes awake special interest, since they represent more
than 50% of the venomous vertebrates and are often involved in human accidents (Russell,
1965; Church and Hodgson, 2002a; Haddad Jr. et al., 2003; Smith and Wheeler, 2006). The
most dangerous venomous fishes known belong to the Scorpaenidae family and, according to
the morphology of the venom apparatus, they are classified in three main genus: Pterois
(lionfishes), Synanceja (stonefishes) and Scorpaena (scorpionfishes) (Keegan and Macfarlane,
1963; Russell, 1965). These fishes are widely distributed in tropical and temperate shallow
waters, and they are usually slow-moving animals found disguised in the environment (near
rocks, reefs or plants), which is a predispositioning factor to human accidents (Russell, 1965;
Maretic, 1988; Haddad Jr., 2000). Such fish possess 11-17 dorsal, 2 pelvic, and 3 anal fin spines
(Haddad Jr. et al., 2003), and the venom secretory complex is found lying within the spine
anterolateral grooves (Russell, 1965; Smith and Wheeler, 2006). All venomous fishes use their
venoms primarily for defensive purposes (Church and Hodgson, 2002a).
Envenomation occurs when the victim treads on or handles the fish and has the skin
perforated by the spine, which releases the venom into the wound (Russell, 1965; Schaeffer et
al., 1971; Gwee et al., 1994; Hahn and O’Connor, 2000; Church and Hodgson, 2002a; Khoo,
2002; Haddad Jr. et al., 2003). Usually, excruciating pain and edema are the most pronounced
symptoms of such poisoning. However, these venoms also triggers potent disorders upon the
cardiorespiratory system, producing electrocardiographic disturbances, arrhythmias,
tachycardia, hypotension and respiratory difficulties (Russell, 1965; Carlson et al., 1971;
Abdun-Nur et al., 1981; Gwee et al., 1994; Garnier et al., 1995). In severe cases, envenomation
can lead to fatalities (Austin et al., 1961; Saunders et al., 1962).
The in vitro cytolytic activity upon erythrocytes is a common property exhibited by
piscine venoms (Carlson et al., 1971; Thulesius et al., 1983; Shiomi et al., 1989; Kreger, 1991;
Chhatwal and Dreyer, 1992a; Khoo et al., 1992; Garnier et al., 1995; Lopes-Ferreira et al.,
1998; Hahn and O’Connor, 2000; Carrijo et al., 2005). The venoms of Plotosus lineatus (Fahim
et al., 1996), Scorpaena plumieri (Soprani, 2008) and Thalassophryne nattereri (Lopes-Ferreira
et al., 2001) have also showed cytolytic properties against other cell types. The
hemolytic/cytolytic action seems to result from a direct action of venom compounds on cell
membranes, since most fish venoms are devoid of the phospholipase A
2
activity (Shiomi et al.,
1989; Khoo et al., 1992; Hopkins et al., 1994; Lopes-Ferreira et al., 1998; Hopkins and
Hodgson, 1998; Hahn and O’Connor, 2000).
173
Both hemolysis and lethal activities, induced by certain fish venoms, have been proved
to result from the action of a single proteic compound of such venoms (Kreger, 1991). These
hemolytic toxins have been isolated from stonefish venoms (genus Synanceja): Stonustoxin
(SNTX) of S. horrida (Poh et al., 1991); Trachynilysin (TLY) of S. trachynis (Colasante et al.,
1996); Verrucotoxin (VTX) and neoverrucotoxin (neoVTX) both of S. verrucosa (Garnier et al.,
1995; Ueda et al., 2006). Such toxins possess structural similarities and their molecular masses
are about 150kDa, comprising two subunits (α and β, molecular mass between 71-83kDa each).
VTX, unlike the other toxins, is a 322kDa tetrameric glycoprotein presenting 2α and 2β subunits
(Garnier et al., 1995). Similarly to crude venoms, these multifunctional proteins also affect the
cardiovascular system, producing hypotension, vasorelaxation (Low et al., 1993; Garnier et al.,
1995) and negative inotropic and chronotropic effects (Garnier et al., 1997; Sauviat et al.,
2000).
The extreme lability of fish venoms (Russell, 1965; Schaeffer et al., 1971; Perrière et
al., 1988; Kreger, 1991; Church and Hodgson, 2002a; Haddad Jr. et al., 2003; Carrijo et al.,
2005; Smith and Wheeler, 2006) and the difficulty in establishing experimental conditions that
conserve/stabilize the pharmacological activities of existing compounds (Schaeffer et al., 1971;
Shiomi et al., 1989; Church and Hodgson, 2002a) have discouraged research on piscine
venoms. Only few studies have been dedicated to the isolation of toxins from fish venoms as
compared to those related to other venomous animals (Church and Hodgson, 2002a; Figueiredo
et al., 2009).
Fish venom research has been mainly devoted to stonefishes (for a revision, see Khoo,
2002) and only few studies concerned with the composition and biological activities of
scorpionfish venoms (genus Scorpaena) are found in the literature (Carlson et al., 1971; 1973;
Schaeffer et al., 1971; Carrijo et al., 2005). In a previously published study, we have
demonstrated that the venom of the Atlantic scorpionfish Scorpaena plumieri exhibits several
characteristics in common to other venomous fishes, including lethal, cardiovascular and
hemolytic activities (Carrijo et al., 2005). In this work, we report, for the first time, the isolation
and partial characterization of a vasoactive and cytolytic toxin (Sp-CTx) from the venom of a
scorpionfish.
2. Materials and methods
2.1. Materials
Sephacryl S200 HR and columns (MonoQ 5/50 HR, MiniQ 4.6/50 PE and Superose 12
10/30 GL) were purchased from GE Life Sciences (Uppsala, Sweden). Protein calibration
174
standards came from Pierce (Rockford, USA), Bio-Rad (California, USA) and Bruker Daltonics
(Billerica, USA). The commercial stonefish antivenom (SFAV) was obtained from CSL
(Melbourne, Australia). The peroxidase-labeled anti-horse IgG preparation, diaminobenzidine
and 4-chloro-1-naphthol came from Sigma (St. Louis, USA), and Centricon YM-10
concentrators from Millipore (Massachusetts, USA). All other reagents were of analytical grade.
2.2. Venom extraction
Scorpionfish specimens of S. plumieri (10-26cm in length) were collected in shallow
sea shore in the state of Espírito Santo, Brazil, and kept alive in oxygenated seawater aquarium.
Capturing such fishes was authorized by the Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis – IBAMA (the Brazilian public agency for environment affairs).
The venom from fin stings was extracted according to the batch method previously described by
Schaeffer et al. (1971). The protein concentration was determined by the method developed by
Lowry et al. (1951), using bovine serum albumin as standard.
2.3. Cytolytic activity
Assessment of cytolytic activity was performed using a modification of the said method
carried out by Habbermann et al. (1981) on washed rabbit erythrocytes, which are highly
sensitive to fish venoms (Shiomi et al., 1989; Kreger, 1991).
Rabbit blood was collected by cardiac puncture and mixed with Alsever’s solution (1:1
ratio). Washed erythrocyte suspension (2% v/v) in saline or phosphate buffered saline (PBS)
was incubated and samples were examined. After incubation, intact erythrocytes were removed
by centrifugation (14,000g, 1min), and the amount of hemoglobin released into the supernatant
fluids was determined by measuring its optical density at 540nm. The results were expressed as
a percentage of total hemolysis, which was determined by incubating the erythrocyte suspension
in distilled water.
The cytolytic activity of each chromatographic fraction was assayed by incubation of a
protein sample, adjusted to 1mL with saline, with 100µL of the saline erythrocytes suspension
during 10min at room temperature (25ºC). The assays were carried out in duplicate. For
determining EC
50
(concentration of protein causing hemolysis of 50% of erythrocytes in
suspension), the whole venom and the pooled hemolytic fractions (0.1-10000ng/mL) were
diluted to a final volume of 200µL in PBS (pH 7.4) and incubated with 22µL of PBS-washed
rabbit erythrocyte suspension (30min at 37ºC). The assays were carried out in triplicate.
175
The protective effect of the antiserum raised against stonefish venom (Synanceja
trachynis; SFAV) upon the hemolysis induced by Sp-CTx was also evaluated. An amount of
toxin necessary to induce one EC
50
of hemolytic activity upon washed rabbit erythrocytes
(56ng/mL) was pre-incubated with SFAV (1U:2µg of protein) for 10min at 25°C. The residual
cytolytic activity was further executed as previously described for the EC
50
determinations.
2.4. Isolation of the vasoactive cytolysin (Sp-CTx)
The isolation of Sp-CTx was achieved in four chromatography steps, carried out at 4°C.
Proteins were detected by monitoring the absorbance at 214 or 280nm and cytolytic fractions
were identified by hemolytic assay (item 2.3.).
Initially, the fresh crude venom (49.2mg of protein) from 5 fishes in 6.9mL of distilled
water was fractioned by conventional gel filtration chromatography on a Sephacryl S200
column (120 x 2cm), equilibrated and eluted with sodium phosphate buffer (PB) 10mM
containing NaCl 0.4M, pH 7.5, at flow rate of 10mL/h and fractions of 2.5mL. The cytolytic
fractions (named CF-I) were pooled and its salt concentration was adjusted to 0.1M with PB
20mM pH 8.0. Using a FPLC system, samples of this material (1.7mg) were loaded on a
MonoQ anion exchange column, which was equilibrated with PB 20mM NaCl 0.1M pH 8.0 and
eluted with a segmented gradient of NaCl (0.1-0.4M) at 1mL/min flow rate with fractions of
1mL. The hemolytic fractions were combined (CF-II).
Aliquots of 100µg of CF-II were further submitted to high pressure anion exchange
chromatography on a MiniQ column, using a HPLC system. Both the sample preparation and
buffers used were the same as those described in the previous step. However, the proteins were
eluted with a shallower gradient at a flow rate of 0.83mL/min, and 0.4mL fractions were
collected. The active fractions were pooled (CF-III) and concentrated using Centricon YM-10
devices at 4ºC.
As for the last step, samples of 92µg of the CF-III fraction, in a final volume of 0.2mL,
were subjected to gel filtration on Superose 12 column (FPLC), equilibrated and eluted with PB
20mM NaCl 0.3M pH 7.4 at a 0.4mL/min flow rate with 0.2mL fractions. The cytolytic
fractions were pooled (Sp-CTx), concentrated as mentioned above, stabilized with glycerol
(10% v/v) and stored at 4ºC until required.
2.5. Chemical analyses
2.5.1. Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
176
The polyacrilamyde gels were prepared on 8 x 10 x 0.075cm plates and SDS-PAGE
was carried out using the method developed by Laemmli (1970). Samples were pretreated using
2.5% SDS in 100mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing 0.2% bromophenol blue and 20%
glycerol at 100ºC for 5min. The gels were stained using coomassie brilliant blue R-250 or
Periodic Acid-Schiff (Fairbanks et al., 1971). The molecular masses were estimated by a
relative mobility method, comparing the migration of the obtained bands with that from a
mixture of protein molecular markers (myosin - 200kDa, β-galactosidase - 116kDa,
phosphorylase b - 97kDa, bovine serum albumin - 66kDa, ovalbumin - 45kDa, carbonic
anhydrase - 31kDa, soybean trypsin inhibitor - 21kDa, lysozyme - 14kDa, and aprotinin -
6.5kDa).
2.5.2. Mass Spectrometry
Mass Spectrometry analyses were performed on a MALDI-TOF-TOF AutoFlex III
(Bruker Daltonics, Billerica, USA) instrument in positive/linear mode (laser frequency 50-60%,
m/z range 20-200kDa) and using sinapinic acid as matrix. Data analyses were performed by
using the Flex-Analysis software (Bruker Daltonics).
2.6. Cross-reactivity with Stonefish Antivenom
Sp-CTx was submitted to SDS-PAGE on an 8% gel under non-reducing conditions. The
toxin was electrotransferred (4ºC, overnight) onto a nitrocellulose membrane, which was further
blocked with PBS-Tween 20 (0.3% v/v). After washing the membrane with PBS-Tween 20
(0.05% v/v), it was probed (1.5h, 25ºC) with SFAV diluted in PBS (1:500) and another washing
step was performed. The bound antibodies were probed (1h, 25ºC) with a diluted peroxidase-
labeled anti-horse IgG preparation (1:1000 in PBS), using hydrogen peroxide as substrate in the
presence of diaminobenzidine and 4-chloro-1-naphthol.
2.7. Assay of aortic rings
All procedures were conducted in accordance with the Biomedical Research Guidelines
for the Care and Use of Laboratory Animals (1996), as stated by the Brazilian College of
Animal Experimentation (COBEA)/006-2009. Male Wistar rats weighing between 220 and
250g were used.
The preparation of aortic rings was obtained as previously described by Santos et al.
(2003) with few modifications. The vasorelaxant activity of Sp-CTx was measured in isolated
rat aortic rings with or without functional endothelium pre-contracted to the same tension level
(approximately 1.0g of tension) induced by submaximal concentrations of phenylephrine (0.1
177
µM). Sp-CTx was added in increasing cumulative concentrations (0.0001–1nM) after the
response to phenylephrine had stabilized. In order to verify the participation of endothelium-
derived products in the relaxant effect of Sp-CTx, experiments were performed in the presence
of N
G
-Nitro-L-Arginine Methyl Ester (L-NAME, 10µM), added to the bath 20min prior to the
addition of phenylephrine. Another vessel ring from each rat was simultaneously monitored for
Sp-CTx effects alone for controlling all the above-mentioned protocols. The vasodilator effect
of Sp-CTx was expressed as a percentage decrease in maximal contraction induced by
phenylephrine.
2.8. Statistical analyses
Cytolytic and vascular results are presented as mean ± S.E.M. Two-way analysis of
variance (ANOVA) with post-test Bonferroni multiple comparisons were used to compare
concentration–response curves obtained in aortic rings. All statistical analyses were considered
significant when P < 0.05.
3. Results and discussion
Although many marine organisms, including flatfish, soapfish, catfish, stonefish and
scorpionfish, produce cytolytic polypeptides and proteins (Carlson et al., 1971; Hashimoto and
Oshima, 1972; Shier, 1988; Kreger, 1991; Khoo et al., 1992; Garnier et al., 1995; Carrijo et al.,
2005), little efforts have been done to biochemically assess isolation as well as chemically
characterize these cytolysins. Essentially, this is due to the extreme lability of fish venom toxins
as their biological properties are lost during storage (Schaeffer et al., 1971; Perrière et al., 1988;
Garnier et al., 1995; Church and Hodgson, 2002a; Carrijo et al., 2005). Their instability have
made it difficult to study piscine venoms, and this may be explained by the easily denatured
higher-molecular-mass proteins found in these venoms and also by the presence of proteolytic
enzymes, which hydrolyzes other bioactive venom proteins (Perrière et al., 1988; Garnier et al.,
1995; Abe et al., 1996; Carrijo et al., 2005). Despite such difficulties, we have isolated, in its
native form, a vasoactive cytolysin from the venom of the scorpionfish Scorpaena plumieri
(figure 1), named Sp-CTx (S. plumieri Cytolytic Toxin), using a procedure based on four
chromatographic steps carried out at low temperatures (4ºC), at slightly basic pH (values
between 7.4-8.0) and maintaining the salt (NaCl) concentration of the buffers and samples
between 0.1 and 0.4M.
The first step of the purification procedure, a conventional gel filtration
chromatography, was similar to that already described by Carrijo et al. (2005). As measured by
absorbance at 280nm, seven pronounced peaks, numbered I through VII (figure 2A), were
178
eluted and tested for cytolytic activity against washed rabbit erythrocytes. The hemolytic
compounds were recovered in the second peak and this material was named CF-I (Cytolytic
Fraction I). Subsequent fractionation of CF-I by anion exchange chromatography on a MonoQ
5/5 HR column resulted in eluting the hemolytic fractions (CF-II) in the descendent part of the
main protein peak (figure 2B), using approximately 0.24M of NaCl. An additional anion
exchange chromatography step, using a MiniQ 4.6/50 PE high pressure (HPLC) column,
improved the resolution and further separated CF-II into two main proteic fractions (figure 2C).
The hemolytic activity on rabbit erythrocytes was associated with the first protein peak (CF-III),
which eluted at a NaCl concentration of approximately 0.1M. Examination of this fraction by
SDS-PAGE revealed the presence of a major protein band of approximately 73kDa and a minor
high molecular mass compound (figure 3A). In order to separate these compounds, CF-III was
further submitted to FPLC size exclusion chromatography. As observed in figure 2D, a
symmetrical peak with fractions possessing constant specific hemolytic activity was obtained,
suggesting that cytolytic factor was successfully isolated. In fact, this material migrated as a
single band in the SDS-PAGE gel and was homogenous by MS criteria (figure 3, A and C),
confirming that the scorpionfish venom cytolysin, designated as Sp-CTx, was obtained in high
degree of purity.
Sp-CTx was 12.3 fold more hemolytic (EC
50
56ng/mL) than the crude scorpionfish
venom (EC
50
688ng/mL; figure 4). However, only 1% of the total hemolytic activity loaded in
the first chromatographic step was recovered. The yields and activity (EC
50
) of the fractions
obtained in all chromatographic steps are given in table I. The low yield rates achieved in the
purification procedure can be mainly justified by the high instability of Sp-CTx, since a
substantial loss of cytolytic activity and/or precipitation of the proteins towards sample
desalting, lyophilization, vigorous shaking, freezing and thawing, large storage period at 4°C
and storage using buffers with less than 0.15M NaCl (data not shown) were observed. Other
important aspect that should be signaled is the relatively primitive venom apparatus of the
scorpionfishes when compared to those from stonefishes. Scorpionfish venom glands are less
developed and do not possess evident venom ducts, making its extraction difficult and yielding
lower amounts of venomous secretion (Russell, 1965; Goudey-Perrière and Perrière, 1998;
Smith and Wheeler, 2006). These factors lead us to choose the batch method for venom
extraction, which implies in excising and gentle homogenizing spines in solution. This method
was reported to yield higher amounts of protein and a less unstable venom extract (Schaeffer et
al., 1971). However, this makes purification of Sp-CTx onerous, since proteins from tissues
other than venomous glands can also be extracted (Carlson et al., 1971), requiring more
chromatographic steps to be taken and, in this way, increasing the probability of activity loss of
unstable molecules. Nevertheless, Sp-CTx activity was maintained up to four weeks after
179
purification when it was stored at 4ºC in PB 20mM NaCl 0.3M pH 7.4 containing glycerol
(10% v/v).
An estimation of Sp-CTx native molecular mass, performed by size exclusion
chromatography, showed that the purified protein possess 121kDa (figure 2D). However, in
SDS-PAGE gel, Sp-CTx migrated as a band with an apparent molecular mass of 73kDa (figure
3A). Taken together, these data suggest that this cytolytic toxin is a dimeric protein whose
subunits are associated via some non-covalent interactions. The molecular mass of 65,251 ±
650Da m/z obtained in the Sp-CTx mass spectrum (figure 3C) corroborates this hypothesis.
Unlike stonefish heterodimeric cytolysins (Poh et al., 1991; Garnier et al., 1995; Colasante et
al., 1996; Ueda et al., 2006), we could not observe a complete separation of Sp-CTx subunits in
the SDS-PAGE gel. The presence of a diffuse protein band (figure 3A), as well as a broad signal
observed in the mass spectrum (figure 3C), could be overcome by superposition of subunits
with close molecular masses and this do not allow us to determine whether Sp-CTx is a homo-
or hetero-dimeric protein. In addition, Sp-CTx was amenable to the Periodic Acid-Schiff
staining (data not shown), revealing its glycoproteic nature. Cytolytic and/or toxic glycoproteins
were also found in the venoms of Trachinus vipera (Perrière et al., 1988) and Synanceja
verrucosa (Garnier et al., 1995).
The chemical characteristics exhibited by Sp-CTx resemble those of the cytolysins
purified from stonefish venoms, as follows: SNTX, the 148kDa lethal factor from the venom of
the Indian stonefish Synanceja horrida (Poh et al., 1991) is composed of two distinct subunits
(α 71kDa, β 79kDa); TLY, the 158kDa neurosecretory toxin found in the venom of the estuarine
stonefish S. trachynis, is a heterodimeric protein presenting subunits of 76kDa (α) and 83kDa
(β) (Colasante et al., 1996). Two hemolytic factors were described in the reef stonefish (S.
verrucosa) venom: neoVTX (Ueda et al., 2006), which is a 166kDa toxin exhibiting also
dimeric nature (α 75kDa, β 80kDa); and VTX (Garnier et al., 1995), a toxic/hypotensive
glycoprotein possessing molecular mass of 322kDa, organized in a tetrameric scaffold - two α
(83kDa) and two β (78kDa) subunits. Table II summarizes the structural features of cytolytic
and lethal toxins purified from piscine venoms. The recognition of Sp-CTx by Synanceja
antivenom, verified by western blotting analysis (figure 3B), gave evidence that - beyond the
chemical resemblance - scorpionfish and stonefish venom cytolysins are antigenically
comparable. A partial neutralization of toxic, hemolytic and/or cardiovascular effects, evoked
by the venoms of soldierfish Gymnapistes marmoratus (Church and Hodgson, 2001), devil
stinger Inimicus japonicus (Shiomi et al., 1989) and lionfish of the genera Pterois and
Dendrochirus (Shiomi et al., 1989; Church and Hodgson, 2002b), was also achieved using
SFAV. All these cross-reactivity observations corroborate the hypothesis that even fishes
180
belonging to different genera possess similar toxic properties and could share toxins and
molecules with similar structures (Saunders, 1960; Russell, 1965; Shiomi et al., 1989; Church
and Hodgson, 2002a).
Sp-CTx exhibited a potent direct hemolytic activity (EC
50
56ng/mL = 0.46nM) upon
washed rabbit erythrocytes (figure 4; table I), which is comparable to the hemolysis induced by
SNTX (EC
50
60ng/mL; Khoo et al., 1995) and neoVTX (EC
50
83ng/mL; Ueda et al., 2006).
Conversely, EC
50
values determined for TLY (2.5-3.3ng/mL; Colasante et al., 1996), VTX
(5.5ng/mL; Garnier et al., 1995) and Dracotoxin (3ng/mL; Chhatwal and Dreyer, 1992),
hemolytic and lethal toxins, which were isolated, respectively, from Synanceja trachynis, S.
verrucosa and Trachinus draco fish venoms, were 10-20 fold lower than that found for Sp-CTx,
suggesting a higher hemolytic activity of these toxins. However, it is difficult to establish a
comparison among them, since the variations in the hemolytic assay conditions (incubation
temperature, the amount of cells used and the time of exposure of erythrocytes to toxin action)
could account for such differences in the potency reported. Although the mechanism of the Sp-
CTx-induced hemolysis was not investigated in the present work, both cross-reactivity (figure
3B) and reduction of the Sp-CTx cytolytic effect (figure 4, inset) by SFAV suggest that Sp-CTx
shares similar epitopes with stonefish toxins and could act in a similar way, inducing pore
formation throughout the erythrocyte membrane (Chen et al., 1997; Ouanounou et al., 2002).
It has been speculated that cytolytic activity from hemolytic toxins could be responsible
for the cardiovascular responses induced by fish venoms, since these membrane-perturbing
toxins could affect the normal behavior of endothelial cells and cardiac function, triggering Ca
+2
influx and thus activating the nitric oxide (NO) synthesis pathway, leading to vasorelaxing and
hypotension (Low et al., 1993; Chen et al., 1997; Church and Hodgson, 2002a). This possibility
has prompted us to investigate the effects of Sp-CTx on vascular preparations.
Sp-CTx induced a biphasic response on intact rat aortic ring preparations, which was
characterized by an initial relaxation phase followed by a contractile phase (figure 5A).
However, the relaxant effect induced by the purified protein was abolished after endothelial
denudation (figure 5B), suggesting that the release of endothelium-derived relaxing factors is
involved in this response. As showed in figure 5B, the Sp-CTx-induced vasorelaxing was dose-
dependent, leading to a significant decrease of the aortic tension even at picomolar levels. This
observation demonstrated the high vasorelaxant activity of this molecule. In contrast, the Sp-
CTx-induced contractile response was achieved using higher doses (1nM) and could be
observed even in endothelium-denuded vessels (data not shown). The findings in these vascular
preparations were remarkably similar to those reported by Low et al. (1993), who found that
approximately 3nM (400-500ng/mL) of SNTX (hemolytic, vasorelaxing and hypotensive factor
181
isolated from Synanceja horrida venom) caused a biphasic response. Albeit the Sp-CTx
concentration necessary to induce the vasorelaxing effect (1pM, figure 5B) was even lower than
that described for SNTX (10ng/mL = 68pM; Sung et al., 2002), we could not achieve the same
extension level of relaxation as that exhibited by the S. horrida cytolysin (EC
50
133ng/mL =
0.9nM; Sung et al., 2002), which suggests a lower relaxant potency of the scorpionfish
cytolysin.
In order to examine the participation of endothelium-derived products in the relaxant
effect induced by Sp-CTx, aortic rings were treated with L-NAME before assessing the Sp-CTx
vasorelaxation. This nonselective NO synthase inhibitor blunted the vasodilation evoked by Sp-
CTx (figure 5C), offering evidence of a NO mediation in vascular effects of the scorpionfish
cytolysin. As previously suggested for Pterois volitans (Church and Hodgson, 2002b) and
Gymnapistes marmoratus (Hopkins and Hodgson, 1998) Scorpaenid fish venoms and also for
SNTX (Low et al., 1993), the potent endothelium- and NO-dependent relaxation observed using
Sp-CTx on in vitro vascular preparations may contribute to peripheral vasodilation, which
would explain the marked hypotension reported experimentally on in vivo assays using
Scorpaena plumieri venom (Carrijo et al., 2005; Helena Lima Gomes, personal communication)
and also clinically on victims of scorpionfish envenomation (Haddad Jr., 2000). It was
previously mentioned that the vasorelaxing effect evoked by fish venom cytolysins may result
from its pore-forming activity (Low et al., 1993; Chen et al., 1997; Church and Hodgson,
2002a). Nevertheless, some authors showed that the cardiovascular toxicity caused by these
membrane-disturbing toxins may depend on the interaction/binding of such molecules to protein
receptors. Sung et al. (2002) postulated that a component of the vasorelaxing response induced
by SNTX occurs through the binding of the toxin to the substance P receptors of endothelial
cells, causing subsequent production of NO and activation of K
+
channels. It was reported that
S. verrucosa venom (in a preparation containing approximately 40-50% of verrucotoxin, VTX),
p-VTX (a more stable proteic complex of verrucotoxin), and TLY mediate their effects also by
modulation of Ca
+2
and/or K
+
ion channels activity (Garnier et al., 1997; Sauviat et al., 2000;
Yazawa et al., 2007; Wang et al., 2007). However, further pharmacological investigations are
necessary to access the molecular functioning of Sp-CTx and understand its action upon the
cardiovascular system.
In conclusion, we have isolated, for the first time, a vasoactive cytolysin from a
scorpionfish venom and the data presented enhance our understanding of the S. plumieri toxic
effects. The purification process has successfully obtained the scorpionfish cytolysin in native
form, albeit in low yield. Structurally, Sp-CTx is a high molecular mass glycoprotein with two
subunits and shares similar epitopes to the stonefish hemolytic toxins. Like these toxins, the
182
scorpionfish cytolysin exhibited different biological activities, including a direct hemolytic
effect and potent endothelium- and NO-dependent vasorelaxant activity. However, it has proved
to be a very unstable molecule, even under optimal storage conditions. Attempts to optimize the
purification process are in progress, aiming to recover higher amounts of Sp-CTx and complete
its characterization. Elucidating the mechanism of action of this molecule will be a valuable tool
to understand its role on the clinical manifestations of envenoming by Scorpaena plumieri.
4. Acknowledgments
This work was supported by CNPq (process 477514/06-5), FAPEMIG, CAPES (Probral
250/06), FINEP (Rede Proteoma Nacional) and INCTTOX (Instituto Nacional de Ciência e
Tecnologia em Toxinas). The authors are indebted to: M.L.B. Goze for capturing the fishes used
to extract the venom; J.S. Oliveira (LVTA) for his advising in the purification procedure; A.V.
Santos for MS analyses (Núcleo de Biomoléculas, UFMG); J.S. Oliveira (LEFQP), J.C. Reis
and P.H. Lemos for technical support.
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Captions of Figures
Figure 1. The Atlantic black scorpionfish Scorpaena plumieri. (A) Picture of a medium size
specimen with erected dorsal spines, which was collected in the island of Vitória, Espírito
Santo, Brazil. (B) Anal fin and stings. (C) White spots on black background in the axillary
region of the pectoral fins, a characteristic sign of this specie.
Figure 2. Chromatographic profiles showing the cytolytic toxin (Sp-CTx) isolation from S.
plumieri venom. (A) Gel filtration chromatography of S. plumieri crude venom (49.2mg) on
Sephacryl S200 column. (B) Anion exchange chromatography of the Cytolytic Fraction I (CF-I,
1.7mg) on MonoQ column. (C) Anion exchange chromatography of CF-II (100µg) on MiniQ
column. (D) Gel filtration chromatography of CF-III (92µg) on Superose 12 column. The
molecular masses of calibration marker proteins (β-amilase - 200kDa, bovine serum albumin -
67kDa, ovoalbumin - 45kDa, and cytochrome c - 12.5kDa) are indicated at their elution
volumes above the chromatogram (D). For a detailed procedure description, see item 2.4.
188
Figure 3. Chemical analyses of Sp-CTx and cross-reactivity with SFAV. (A) SDS-PAGE profile
in an 8% gel showing the progress of the purification of Sp-CTx: (a) molecular mass markers,
(b) S. plumieri crude venom, 20µg; (c) CF-I, 12µg; (d) CF-II, 9µg; (e) CF-III, 6µg; (f) Sp-CTx,
4µg. The gel was stained with coomassie blue. (B) Western-blot of Sp-CTx using antiserum
raised against stonefish venom - SFAV (Synanceja trachynis). The migration of molecular mass
standards is indicated on the left. (C) MALDI-TOF mass spectrum of Sp-CTx in positive/linear
mode.
Figure 4. Concentration-response hemolysis curves of the whole S. plumieri venom and Sp-
CTx. Representative results of three experiments; symbols and bars represent the mean from
triplicate determinations. Inset: the effect of the pre-treatment with antivenom raised against
stonefish - SFAV (1U/2µg for 10min at 25°C) on the hemolysis induced by 0.46nM (EC
50
) of
Sp-CTx.
Figure 5. Effects of Sp-CTx on isolated rat aortic rings. (A) Typical response profile induced by
bath application of Sp-CTx (arrows, 0.0001-1nM) in rat aortic rings pre-contracted with
phenylephrine (▲) in the presence of intact endothelium. (B) Influence of the functional
endothelium and (C) the L-NAME pre-treatment on the relaxant effect of Sp-CTx. Results are
expressed as percentage decrease in maximal contraction induced by phenylephrine (0.1µM).
Asterisks (*) indicate statistically significant differences between treatments and control (p <
0.05).
Tables
Table I – Purification of Scorpaena plumieri Cytolytic Toxin (Sp-CTx) from scorpionfish
venom.
Table II – Structural features and hemolytic potency of cytolysins/toxins purified from fish
venoms.
189
Figure 1
A
B C
190
Figure 2
0 8 16 24
0
500
1000
1500
0
25
50
75
100
Sp-CTx
200.0
67.0
45.0
12.5
Volume (mL)
mA214nm (
)
% Hemolysis (-
-)
D
B
0 25 50 75
0
200
400
600
0
25
50
75
100
CF-II
Volume (mL)
mA214nm (
)
% Eluent (---)
% Hemolysis (-
-)
C
0 20 40 60
0
50
100
150
0
25
50
75
100
CF-III
Volume (mL)
mA214nm (
)
% Eluent (---)
% Hemolysis (-
-)
A
0 100 200 300
0.0
0.5
1.0
1.5
0
25
50
75
100
(CF-I)
I
II
III
IV
V
VI
VII
Tubes
A280nm (
)
% Hemolysis (-
-)
191
Figure 3
A
kDa
200
116
97
66
45
a b c d e f
kDa
116
97
66
45
B
C
20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000
0
50
100
150
200
131704.57
65251.29
33144.47
Intensity (a.u.)
m/z
192
S. plumieri venom
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 100000
0
25
50
75
100
Sp-CTx
% Hemolysis
Concentration (ng/mL)
0
10
20
30
40
Sp-CTx
Alone
Sp-CTx
+ SFAV
% Hemolysis
Figure 4
193
C
B
A
Figure 5
194
Table 1
Purification
step
Hemolytic
fraction
Figure
Reference
Protein
Recovery (mg)
EC
50
(ng/mL)
Activity
Recovery (EC
50
)
Purification
factor
Yield
(%)
Soluble venom - - 84.26 688 122471 1.0 100.0
Sephacryl S200 CF-I 2A 18.53 431 42993 1.6 35.1
MonoQ CF-II 2B 1.06 132 8030 5.2 6.6
MiniQ CF-III 2C 0.18 65 2769 10.6 2.3
Superose 12 Sp-CTx 2D 0.07 56 1250 12.3 1.0
195
Table 2
a
Hemolytic activity against rabbit erythrocytes.
b
The precise mass of each Sp-CTx subunit was not determined.
c
Nd, Not determined.
Toxin
Venomous
fish specie
Molecular
Mass (kDa)
Number
of Subunits
Molecular Mass of
the Subunits (kDa)
Glyco-
silation
Hemolysis
EC
50
(ng/mL)
a
References
Sp-CTx Scorpaena plumieri 121 2 65
b
Yes 56 Present work
SNTX Synanceja horrida 148 2 α 71; β 79 No 60
Poh et al., 1991
Khoo et al., 1995
Ghadessy et al., 1996
TLY Synanceja trachynis 158 2 α 76; β 83 Nd
c
2.5-3.3 Colasante et al., 1996
VTX Synanceja verrucosa 322 4 α 83; β 78 Yes 5.5 Garnier et al., 1995
neoVTX Synanceja verrucosa 166 2 α 75; β 80 No 83 Ueda et al., 2006
Dracotoxin Trachinus draco 105 1 105 Nd
c
3 Chhatwal and Dreyer, 1992b
Trachinine Trachinus vipera 324 4 81 Yes Nd
c
Perrière et al., 1988
196
Anexo V - Artigo publicado no periódico Toxicon (não relacionado à tese)
Apesar de não ter envolvido diretamente os resultados do presente trabalho, um outro
manuscrito foi publicado no periódico Toxicon (atualmente in press):
GOMES, H.L., ANDRICH, F., MAUAD, H., SAMPAIO, K.N., de LIMA, M.E.,
FIGUEIREDO, S.G., MOYSÉS, M.R. Cardiovascular effects of scorpionfish
(Scorpaena plumieri) venom.
197
Cardiovascular effects of scorpionfish (Scorpaena plumieri) venom.
Helena L. Gomes
a
, Filipe Andrich
a,b
, Hélder Mauad
a
, Karla N. Sampaio
c
, Maria Elena De
Lima
b
, Suely G. Figueiredo
a#.
, Margareth R. Moysés
a.
a
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Espírito Santo, Av. Marechal Campos, 1468, 29040-090 Vitória, ES,
Brazil
b
Departamento de Fisiologia e Biofísica, Laboratório de Venenos e Toxinas Animais, Depto. de
Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG, Av. Antônio Carlos, 6627-
Pampulha, Caixa Postal 486-31270-901 Belo Horizonte, MG, Brazil
c
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal
do Espírito Santo, Av. Marechal Campos, 1468, 29040-090 Vitória, ES, Brazil
#
Corresponding author. Address: Departamento de Ciências Fisiológicas, Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo, Av. Marechal Campos, 1468, 29040-090,
Vitória, ES, Brazil. Tel: + 55 27 33357349; fax: + 55 27 33357342. email address:
suelygfi@cbm.ufes.br.
198
Abstract
The aim of the present study was to investigate the cardiovascular activity of Scorpaena
plumieri venom in both in vivo and in vitro models. In anesthetized rats, doses of the venom
(14-216 µg protein/kg) induced a transient increase in the mean arterial pressure. However at
higher dose (338 µg protein/kg) this effect was followed by a sudden hypotension and the
animal evolved to death. The heart rate was temporarily increased and followed by bradycardia
using doses ≥108µg/kg. In isolated rat hearts the crude venom (5 - 80 µg protein) produced
dose-dependent positive ventricular chronotropic, inotropic, lusitropic and coronary
vasoconstriction responses. Partial purification of an active fraction (CF, cardiovascular
fraction) which reproduced the cardiovascular effects induced by crude venom on isolated
hearts was achieved by conventional gel filtration chromatography. Adrenergic blockades,
prazosin and propranolol, significantly attenuated these responses. The coronary
vasoconstriction response to CF was also attenuated by chemical endothelium denudation. In
conclusion, the data showed that Scorpaena plumieri fish venom induces disorders in the
cardiovascular system. It also suggests that α
1
and β-adrenergic receptors, and the vascular
endothelium, are involved at least partially, in these cardiac effects.
Key words: Scorpaena plumieri, fish venom, cardiovascular activity, adrenergic receptor.
199
Anexo VI - Capítulo de livro publicado
Capítulo revisando as propriedades bioquímicas e farmacológicas das peçonhas de
peixes, publicado em livro de circulação internacional.
FIGUEIREDO, S.G., ANDRICH, F., LIMA, C., LOPES-FERREIRA, M., HADDAD
Jr., V. Venomous fish: a brief overview. In: de Lima, M.E., Pimenta, A.M.C., Martin-
Eauclaire, M.F., Zingali R., Rochat, H. (Orgs.), Animal toxins: State of the art.
Perspectives on health and biotechnology, Editora UFMG, Belo Horizonte - MG, pp.
73-95. 2009.
VENOMOUS FISH
A brief overview
Su e l y Go m e S d e Fi G u e i r e d o
F
i l i p e An d r i c h
cA r l A li m A
mô n i c A lo p e S -Fe r r e i r A
V
i d A l hA d d A d Jr.
ABSTRACT
Animal venoms have brought out great interest during the past decades mainly as a
subject of important research in an eort to nd novel physiological tools and pharmaceu-
ticals. However, most venom bioprospecting has focused on terrestrial animals. In comparison
with terrestrial groups, venomous sh have been largely ignored as a source of potential
drugs. Venomous sh occur in marine and freshwater environments worldwide, and they are
commonly associated with human injuries. Clinical and pharmacological studies indicate
that sh venoms display lethal, neuromuscular, cytolytic, inammatory and neurotoxic
activities and pronounced cardiovascular eect. e extreme lability of toxins has made
research on sh venoms dicult. erefore, biochemical assessment through isolation and
chemical characterization of venom constituents has been scarcely undertaken, which has
rendered them to be poorly characterized. ese venoms comprise toxic proteins, among
which there is a wide variety of enzymes, such as hyaluronidase, proteases, aminopepti-
dases, cholinesterase, phosphatases, phosphodiesterase and other esterases. Other active
components in sh venoms are biogenic amines, such as histamine, catecholamines and
acetylcholine. Fish venoms are reviewed in this chapter.
Animal_FINAL.indb 73 18/5/2009 09:00:06
74
Animal Toxins
1. INTRODUCTION
A large number of venomous and poisonous sh are encountered in freshwater and
marine environments worldwide. ey are often involved in human accidents and can
cause severe injuries. Like venoms of terrestrial animals, sh venoms show enormous
diversity and complexity of pharmacologically active components.
Venomous sh have glandular structures producing venoms and apparatuses capable
to inoculate such secretions, as n rays, bony stings, body spines or teeth.
[1, 2]
Conversely, a
poisonous sh can store/produce toxins that are accumulated in some tissues, such as
skin, liver, reproductive system or muscles, which makes it unable of active inoculation.
[1, 2]
Fish most commonly associated with human injuries belong to families described
as follows: Dasyatidae, Gymnuridae, Myliobatidae and Rhinopteridae (marine
stingrays), Ariidae (marine catsh), Scorpaenidae (scorpionsh and lionsh), Synan-
ceiidae (stonesh) and Batrachoididae (toadsh). In a freshwater environment, shes
from Pimelodidae (freshwater catsh) and Potamotrygonidae (freshwater stingrays)
families are the most important ones.
[1-9]
New studies about venomous sh and their toxins have been carried out, not only
because of clinical problems in humans, but also for the possibility of discovering new
active substances of immense pharmacological potential.
Clinical manifestations of accidents with venomous sh include pain, edema, erythema
and occasional skin necrosis. Systemic manifestations, such as respiratory and cardiac
eects, are mainly observed in envenomations caused by the Scorpaenidae and Synan-
ceiidae families.
Fish venoms comprise toxic proteins and a wide variety of enzymes as hyaluronidase,
proteases, aminopeptidases, cholinesterase, phosphatases, phosphodiesterase and other
esterases. Other active components in sh venoms are biogenic amines, such as histamine,
catecholamines and acetylcholine.
Due to some technical difficulties and their extreme lability, these venoms have
remained unexplored, but they are a potential source for future discovery and develop-
ment of new biologically active molecules with potential application in medicine. In
this chapter, we discuss chemical and physiopharmacological properties of sh venoms
as well as some clinical, toxicological, epidemiological and morphological features of
the venomous sh.
2. CLINICAL MANIFESTATIONS OF INJURIES
CAUSED BY VENOMOUS FISH
Venomous sh convey venom toxins through dierent means as n rays, caudal bony
stings and spines in preopercular or dorsal position, linked to venom glandular tissue
(Figure 1). Mechanisms of envenomations vary among species, with respect to dierent
injection apparatuses and venomous glandular tissue of dierent morphology, causing
dierent risks and points of inoculation in the human body. So, there are not uniform
measures of prevention and treatment, compared to those which can be taken after
accidents with snakes or spiders.
[1-9]
Anti-venom serum is produced only for the treat-
ment of injuries caused by Synanceja genus (the stonesh).
Animal_FINAL.indb 74 18/5/2009 09:00:06
75
Part 1 – Toxins from Marine Animals
2.1. MARINE FISH
e marine stingrays are cartilaginous sh that present one to four bony-like stings
in caudal position, constituted of vasodentine. Stingrays are bentonic fish and
injuries commonly occur when the victim step on an animal. By whipping with the tail
in a defense mechanism, this kind of sh introduces its stings deeply into the victim’s
tissue. e stings of some stingrays can reach up to 20 cm in length. ey are covered
with an epithelial sheath, which breaks upon penetration into the victim. Consequently,
the venom, which is stored in a thick gland mass, ows into the wound along the sting
grooves.
Figure 1 – (a) Marine stingrays (Aetobatus
narinari and Dasyatis sp) and their caudal
venomous stings. (b) Marine catsh with
details of the dorsal and pectoral bony
stings. (c) The toadsh Thalassophryne
nattereri and hollow venomous spines
in preopercular and dorsal positions. (d)
Scorpaena plumieri, the black scorpionsh
of Atlantic Ocean. This sh has grooved rays
of ns with venomous tissues that can cause
severe envenomation in humans. (e) The
freshwater stingrays of the Potamotrygonidae
family provoke intense local envenomation
and the cutaneos necrosis is very common.
Photograph: Vidal Haddad Junior
(a)
(b)
(c)
(d) (e)
Animal_FINAL.indb 75 18/5/2009 09:00:08
76
Animal Toxins
Envenoming caused by marine stingrays is severe, leading to intense pain, local edema
and erythema and systemic manifestations associated with pain, as malaise and cold
sweating. Chronic ulcers can be a result of the sting. Deaths have been reported when
stings penetrate in the chest of the victim.
Catsh are the most important sh associated with human injuries, both in marine
or freshwater environment.
[9]
Injuries occur when shermen handle sh and shrimps
in their nets and when swimmers step on the sh discarded on beaches by amateur or
professional shermen.
Marine catshes cause injuries through serrated bony stings localized in anterior
position to dorsal and pectoral ns, which can be locked in extended position, thus
increasing the risk of serious accidents. e stings are covered by an integumentary
sheath with glandular venomous tissue. This epithelium is broken when the sting
penetrates into the victim and it releases the venom in the wound. e victim suers
from intense pain, blanching at the point of the puncture as well as malaise and vomits
and occasionally local skin necrosis.
[1, 2, 5]
e envenomation is considered of mild gravity, but it bears the risk of serious compli-
cations, as sting breaking and retention of fragments cause severe bacterial infections.
e most venomous sh in the world belong to the Scorpaenidae and Synanceiidae
families. e stonesh (Synanceja), lionsh (Pterois) and true scorpionsh (Scorpaena)
provoke the majority of severe envenomations in humans. Stonesh of the Pacic and
Indian Oceans cause very serious envenoming, and dozens of death reports are due to
consequential complications.
[5]
e venom apparatus of these families are composed by 12-13 rays of the dorsal n,
three rays of the anal n and two rays of the pelvis spines.
[3, 6]
Envenoming causes intense, excruciating pain. ere are discrete alterations at the
point of the puncture(s) and the signs and symptoms are systemic. It is possible to
observe malaise, fever, regional adenopathy, respiratory and cardiac dysfunctions,
hallucinations and seizures. In a series of 23 injuries, all patients complained of intense
pain and systemic eects, conrming the gravity of envenomation.
[3, 6]
The toadfish of the Thalassophryne genus possess the most sophisticated venom
apparatus known in sh. ese sh stay motionless in sandy or muddy bottoms and
they are numerous in estuarine areas, causing accidents when stepped on in shallow
waters. e venom is inoculated through a system of two dorsal and two pre-opercular
hollow spines when a basal and well-constituted unique gland comes under pressure
and deeply injects its content into the victim. e envenoming caused by toadsh causes
intense pain, local erythema, edema, and albeit rarely, cutaneous necrosis. It does not
cause systemic manifestations, beyond those associated with pain.
[4]
2.2. FRESHWATER FISH
e freshwater catsh are Siluriform sh and are common around the world. A great
number of sh of this order presents bony stings in anterior position of dorsal and
pectoral ns, but only some species produce venoms. e venom is localized in an
intertegumental sheath that covers the sting. en, venom ows into the wound when
the sheath is broken upon sting penetration. e anatomical structures and mechanism
of envenomation are very similar to those observed in marine catsh. Sting penetration
and venom inoculation cause intense pain, edema and erythema. e painful process is
intense and fades away after nearly 6 hours, but complications are common, caused by
retention of sting fragments or bacterial infections.
Animal_FINAL.indb 76 18/5/2009 09:00:08
77
Part 1 – Toxins from Marine Animals
e rays of the Potamotrygonidae family are uniquely adapted to freshwater environment.
ere are three genuses of freshwater stingrays and the most important one with respect
to number of species and cases of human envenomation is the genus Potamotrygon.
Freshwater stingrays are currently spreading throughout the South American freshwater
system. e mechanism of envenomation and clinical manifestations are similar to that
related to marine stingrays.
[5]
3. CHEMICAL COMPOSITION OF FISH VENOMS
Like venoms of terrestrial venomous animals, sh venoms dier enormously in their
composition. ey are diverse and complex chemical mixtures containing a variety of
biologically active components as proteins, enzymes, peptides, biogenic amines and
other unknown substances, which could interact with physiological systems and result
in pharmacological actions. Proteins appear to be the main components.
[10]
Biochemical
analyses of sh venoms identied numerous proteins with a large amount of molecular
mass ranging from ≅ 10 to 800kDa.
Attempts to purify proteins from fish venoms have been largely unsuccessful, due
essentially to the instability of these venoms.
[11]
Nearly a dozen proteins have been
successfully puried from venomous sh species, and some of these have been charac-
terized at the molecular level. Table 1 shows proteins isolated from sh venoms until
2008. is number is small in comparison with the amount of venomous sh. Structural
features of them are even scarcer.
Nearly 200 species have been reported as venomous sh.
[4, 12]
Nevertheless, in contrast
to previous estimate, Smith and Wheeler,
[13]
in recent phylogenetic analyses grounded
on 1.1 million aligned base pairs from sh tissues, suggest that up to 1,200 shes in 12
clades should be assumed venomous.
A search in databanks (UniProtKB/Swiss-Prot and UniProtKB/TrEMBL) for pri-
mary structures reveals scarce information on sh venoms (11 entries), while hundreds
of entries were founded for scorpions, spiders and snakes toxins. ese data conrm the
discrepancy between venom studies of these animals.
In addition to proteic constituents, some other active compounds have been described
concerning sh venoms, such as biogenic amines (norepinephrine (NE), dopamine
(DA), tryptophan (Trp) and 5-hydroxytryptamine (5-HT)). e venom of stoneshes
(Synanceja genus) contains catecholamines (NE, DA) and Trp.
[14, 15]
e venom of the
soldiersh Gymnapistes marmoratus contains 5-HT and/or 5-HT like substance.
[16]
e
presence of acetylcholine or cholinomimetic have been suggested in S. trachynis, P. volitans
and Potamotrygon motoro venoms
[17, 18]
and serotonin in venoms of marine stingrays.
[19]
A
non-proteinaceus toxin (MM 327Da) was described in the venom of the lionsh Pterois
volitans.
[20]
ese small molecules have also important implications for venom activity.
4. VENOM EXTRACTION AND STABILITY
Some factors make studies of sh venoms dicult. erefore, little biochemical assess-
ment has been undertaken on isolation as well as chemical characterization of venom
constituents.
Capturing sh and obtaining their venom extracts are dicult tasks. But the major
diculty is their extreme lability. Biological properties are lost during the storage, a
Animal_FINAL.indb 77 18/5/2009 09:00:08
78
Animal Toxins
characteristic of these venoms.
[12]
Factors such as pH,
[21]
temperature,
[21]
freezing and
thawing and changes in dilution aect their stability;
[22]
lyophilization
[21]
induces loss
of toxicity and biological properties. e stability is achieved, at least in part, storing
the venom extract at -70 or -196
o
C,
[23]
by precipitation with ammonium sulfate
[22]
or
addition of glycerol.
[24, 25]
at instability has been explained by the easily denatured
higher-molecular-weight-mass proteins, which are found in these venoms, and also it
could be associated with the presence of proteolytic enzymes, which hydrolyze other
bioactive venom proteins.
[11, 23, 26]
is could explain the notable eect of elevated tem-
peratures which relief the pain of the victims. However, this is not the only explana-
tion. One of the authors reported that in some situations pain returns when patients
take the aected point ohot water. It is possible that hot water could be a palliative
treatment for vasoconstriction induced by the venom, by counteracting its eects with
vasodilatation.
Table 1
Fish venoms toxicity and properties of puried proteins
Family Specie LD
50
of the
venom in mice
Toxin puried Structural
aspects
Described
activity
References
Synanceiidae Synanceja
horrida
Indian
stonesh
300 ng/kg (i.v.)
0.36 µg/kg (i.v.)
1.6 µg/g (i.p.)
Stonustoxin
(SNTX)
148 kDa
comprising
two
subunits
α (71 kDa)
and β (79
kDa), pI
6.9
Lethal toxin
– LD
50
17ng/g
(i.v. mouse).
Cardiovascular,
hemolytic,
neuromuscular,
nociceptive,
edematogenic.
[27, 28, 29,
30]
SFHYA1 52 kDa
Glycopro-
tein, pI 9.2
Hyaluronidase. [31, 32]
Synanceja
trachynis
Estuarine
stonesh
1.6 mg/kg (i.p.) Trachynilysin
(TLY)
158 kDa
comprising
two
subunits
α (76 kDa)
and β (83
kDa), pI
5.7
Lethal toxin.
Cardiovascu-
lar, hemolytic,
neuromuscular,
edematogenic.
[33, 34, 35]
Animal_FINAL.indb 78 18/5/2009 09:00:09
79
Part 1 – Toxins from Marine Animals
Synanceja
verrucosa
Reef
stonesh
2.5 µg/g (i.v.) Verrucotoxin
(VTX)
322 KDa
comprising
four
subunits
2α (83 kDa)
and 2β (78
kDa) Glyco-
protein
Lethal toxin –
LD50 < 40 ng/g
(i.v. mouse).
[11]
Cardiovascular,
hemolytic.
Neoverrucotoxin
(neoVTX)
166 kDa
comprising
two
subunits
α (75 kDa)
and β (80
kDa)
Lethal toxin.
Hemolytic.
[36]
Scorpaenidae Pterois
volitans
Lionsh
42.5 µg/kg (i.p.) FV peptide 7.6 kDa Inhibit cancer
cell growth in
vitro.
Selectively
induce
apoptosis in
cancer cell.
[37, 38]
Scorpaena
plumieri
Atlantic
black
Scorpionsh
0.28 mg/kg (i.v.) Sp-GP 80 kDa Proteolytic
(Gelatinolytic).
[23]
Sp-H 76.92 kDa,
Glycopro-
tein
Hyaluronidase. [39]
Trachinidae Trachinus
draco
Greater
weeversh
1.8 µg/g (i.v.) Dracotoxin 105 kDa Lethal toxin. [22, 40]
Hemolytic,
neuromuscular.
Trachinus
vipera C.V
Lesser
weeversh
- Trachinine 324 kDa
comprising
four identi-
cal subunits
(81 kDa)
each
Lethal toxin –
LD
50
< 0.1µg/g
(i.v. mouse).
[41]
Tetrarogidae Notesthes
robusta
Bullrout
- Nocitoxin 170 kDa Nociceptive. [42]
Plotosidae Plotosus
canius
Indian
catsh
3.9 mg/kg (i.p.) Toxin-PC 15 kDa Lethal toxin -
LD
50
225µg/kg
(i.v. mice).
Cardiotoxic,
hemolytic,
neuromuscular.
[43, 44]
Family Specie
LD
50
of the
venom in mice
Toxin puried
Structural
aspects
Described
activity
References
(continued)
Animal_FINAL.indb 79 18/5/2009 09:00:09
80
Animal Toxins
Some methods are normally used to extract venom from venomous spines:
[21, 47, 49, 50,
52]
(i) aspiration – the integumentary sheath is stripped o the spine base and venom is
collected from glandular grooves by suction; (ii) trituration – spines are removed, tritu-
rated and their contents solubilized in water or 10% glycerol solution; (iii) dissection
of venom glands from spines and its homogenization in buer saline; (iv) extraction by
pressure – venom is extracted from the openings at the tip of spines by applying pres-
sure at their bases.
5. PHARMACOLOGICAL STUDY OF
WHOLE VENOMS
e complexity of sh venoms is evident from a number of dierent components
found, which are responsible for a variety of pharmacological activities. Results from
clinical, pharmacological and biochemical studies indicate that fish venoms cause:
excruciating and persistent local pain; local tissue edema and necrosis of skin tissue;
increase in the spontaneous release of neurotransmitters; depolarization of muscle cells;
muscle twitches, incoordination and paralysis; hypotension and respiratory and cardiac
failure, besides possessing cytolytic and enzymatic activities.
Based on similarities in physiological actions, antigenic identity and phylogenetic
analysis, it has been suggested that sh venoms share similar components,
[13, 53]
prob-
ably as a result of evolution so as to fulll a common purpose.
5.1. LETHALITY
Assessments of the lethality and toxicity of crude sh venoms have demonstrated an
intense variation among sh specimens. e stonesh venoms (Synanceja) are highly
and even lethally toxic when compared with those venoms of the genus Scorpaena and
Pterois. eir LD
50
in mice is comparable to that of snake venoms.
[54]
e use of dierent
Scatophagidae Scatophagus
argus
Spotted
buttersh
9.3 mg/kg (i.v.)
9.8 mg/kg (i.p.)
SA-HT 18 kDa Neuromuscular,
hemorrhagic
(on stomach),
nociceptive,
edematogenic
[45, 46]
Batrachoididae Thala-
ssophryne
maculosa
Toadsh
4.93 mg/kg (i.p.) TmC4-47.2 15,161 Da
15,154 Da
Neuromuscular,
miotoxic
[47, 48]
Thala-
ssophryne
nattereri
Brazilian
Toadsh
4.54 mg/kg (i.p.) Natterin family
1, 2, 3, 4
~ 35 -
38kDa
Proteolytic
(Kininogenasic).
Edematogenic,
nociception
[49, 50, 51]
Family Specie
LD
50
of the
venom in mice
Toxin puried
Structural
aspects
Described
activity
References
(conclusion)
Animal_FINAL.indb 80 18/5/2009 09:00:09
81
Part 1 – Toxins from Marine Animals
experimental methods of extraction and storage or the use of lyophilized or freshly
extracted venoms is a factor that impedes toxicity/lethality comparisons. e Table 1
shows the LD
50
of some sh venoms.
5.2. INFLAMMATORY RESPONSE
Experimental studies performed with T. nattereri or T. maculosa venoms showed that
low doses of the venom (0.3 µg/animal) induce local eects in mice, such as nociception
and edema, similar to that described in humans, independently of the presence of
hemorrhagic, phospholipasic A2 or coagulant activities.
[47, 50]
e histological analysis of
the lesion provoked by the T. nattereri venom in the gastrocnemius muscle evidenced
acute mionecrosis, presence of thrombi, a scarce inltrate of polymorphonuclear leukocytes
and macrophages, and partially impaired skeletal muscle regeneration.
[55]
Fibrin depots
and thrombus formation followed by complete venular and transient arteriolar stasis was
also observed after application of both venoms in cremaster muscle of mice.
[47, 56]
Recently, local acute inammatory response induced by the T. nattereri venom was
characterized.
[57]
Cytokines, e.g. TNF-α, IL-1β and IL-6, were observed in footpad
of mice, but only a weak leukocyte influx was detected. The immediate treatment
of accidents with this kind of venomous sh has been the administration of local anes-
thetics or analgesics, resulting in slight decrease of envenomation symptoms.
[58]
Anti-inflammatory drugs used in patients stung by T. nattereri (dexamethasone,
indomethacin, cyproheptadine – a serotonin antagonist and L-NAME – nitric oxide
synthase inhibitor) are not ecient in reducing their clinical symptoms, which are only
reduced by the tissue kallikrein inhibitor phenylacetyl-FSR-EDDnp (TKI).
[51]
e eciency of tissue kallikrein inhibitor in nociception and the edema induced by
T. nattereri venom indicate that protease activity plays a major role, and this should be
considered to achieve ecient treatments for accidents with humans.
[59]
Sting venom of the Cathorops spixii catsh was recently studied by Junqueira et al
[52]
who demonstrated the venom capacity to induce leukocyte inltration into peritoneal
cavity of mice, which is characterized by the neutrophils and macrophages influx.
Magalhães et al.,
[60]
described that both stingrays Potamotrygon cf. scobina and P. g r.
orbignyi venoms induced signicant edematogenic and nociceptive responses in mice,
which are reduced when the venom is incubated at 37
o
or 56
o
C. e inammatory
activity of both venoms was conrmed in mice, which showed an increase of leukocytes
rolling and of cells adhering to the endothelium of cremaster muscle after their applica-
tion. The necrotizing activity induced by both venoms of stingray species was more
vigorous (two-fold) when these venoms were injected added with their respective mu-
cus, indicating that proteins present in epithelial mucus secretion synergize with their
toxic eect. Recently, a vasoconstrictor peptide named Orpotrin, which shows similarity
with 97–105 residues of creatine kinase (CK), was identied in the Potamotrygon gr.
Orbignyi venom.
[61]
Algesic proteins have also been puried from some sh venoms. Nocitoxin – a toxin
responsible for signicant pain induced by the whole venom – has been puried from
the bullrout (Notesthes robusta) venom. It is a single monomeric protein with 169.8 – 174.5
kDa and has been demonstrated to have a potential use in clinical pain research.
[42, 62]
A hemorrhagic toxin (SA-HT, 18 kDa) that also has nociceptive and edemato-
genic activity was isolated from the spotted buttersh (Scatophagus argus) of the family
Scatophagidae.
[45]
Animal_FINAL.indb 81 18/5/2009 09:00:09
82
Animal Toxins
5.3. NEUROMUSCULAR AND
NEUROCHEMICAL EFFECTS OF FISH VENOMS
In addition to inicting pain and triggering an inammation response at the site of
injury, some clinical symptoms observed after sh envenomations are an evident sign
of neurotoxicity, a consequence of the disturbance of nerve terminal function and/or
synaptic transmisson.
Several neurotoxic symptoms including paralysis of hind limbs, muscular weakness,
respiratory cessation, erection of hair, rotational movements and violent convulsions
were observed when the venoms of P. volitans;
[20]
Scorpaena plumieri;
[23]
T. nattereri;
[50]
G. marmoratus;
[63]
P. lineatus;
[64]
Synanceja trachynis
[65]
and S. verrucosa
[66]
were adminis-
tered in experimental animals. According to Church and Hodgson,
[12]
there are some
similarities in neuromuscular eects presented by piscine venoms: (i) all venoms seem
to act both pre- and postjunctionally to produce depolarization of cell membrane (ii)
it does seem to be dependent on the presence of divalent ions in the extracellular uid;
(iii) it is very likely that neuromuscular and cytolytic activities from sh venoms are
related.
e crude venom of greater weever sh Trachinus draco cause membrane depolariza-
tion in rat brain cortex synaptosomes. This crude venom action is enhanced in the
presence of extracellular Ca
+2
. However, this effect was unaffected by elevating
extracellular K
+
and was found to be resistant to K
+
, Na
+
channel blockade (tetrodo-
toxin, 4-aminopyridine and tetraethylammonium) and ouabain, indicating no
involvement of Na
+
, K
+
channels or Na
+
-K
+
ATPase.
[22]
Plotosus canius venom induced contractions in several smooth muscle preparations:
(a) ileum and colon of guinea pig; and (b) fundus, uterus and ileum of rat. On isolated
guinea pig ileum (GPI), the venom produced contraction that was not antagonized by
atropine and mepyramine, but was partially inhibited by methysergide and associated
with a residual contraction which was abolished by prostaglandin receptor blocker.
These results indicate that both serotonin and prostaglandins are involved in the
contractile effect.
[43]
Furthermore, the venom produced irreversible blockade of
electrically induced twitch response on isolated rat phrenic nerve diaphragm and chick
biventer cervicis preparations.
[43]
The neuromuscular toxicity of Synanceja trachynis venom was characterized by
electrophysiological and electron microscopic examination of isolated murine and frog
nerve-skeletal muscle preparations.
[33]
Low concentrations of venom acted presynaptically
by causing release and depletion of neurotransmitter from the nerve terminal. is
response required the presence of either Ca
2+
or Mg
2+
; it was resistant to tetrodotoxin
(Na+ channel –independent) and to botulinum neurotoxin, indicating the release of
acetylcholine via a non-exocitotic mechanism. However, higher concentrations
of venom acted both postsynaptically and presynaptically, and caused irreversible
depolarization of muscle cells and pathological changes with damage to nerve
terminals and muscle bers.
[33]
Studies developed by Hopkins et al.
[67]
using stonefish (Synanceja trachynis) venom
investigated the eect of: (a) cyclooxygenase and neuronal uptake inhibitors; (b) blockage of
receptors (adrenergic, nicotinic and muscarinic, histamine, angiotensin II, leukotriene
D4, thromboxane A2 and neurokinin-1); and (c) noradrenergic transmitter depletion
on venom-induced contractile responses in GPI and rat isolated vas deferens. The
results obtained suggested that stonesh venom may cause the release of acetylcholine,
substance P, and cyclooxygenase products and/or contain components which act directly
at the receptors of these molecules. It was also demonstrated that the venom appears
Animal_FINAL.indb 82 18/5/2009 09:00:09
83
Part 1 – Toxins from Marine Animals
to contain a compound that is a substrate for neuronal uptake and has a direct action
at alpha 1-adrenoceptors.
[67]
A similar study investigated the mechanism behind
the contractile responses elicited by the venom of the soldierfish G. marmoratus in
GPI and longitudinal smooth muscle (LSM) preparations.
[16]
Atropine (muscarinic
receptor antagonist) and indomethacin (cyclooxygenase inhibitor) signicantly inhibited
responses on LSM. However, these responses were not aected by histamine receptor
antagonist (mepyramine), by angiotensin-converting enzyme inhibitor (captopril) or
neurokinin-1 receptor antagonist. Contractile responses in GPI were not significantly
aected by the antagonists of thromboxane A2/prostaglandin H2, leukotriene
and angiotensin AT1 receptors and also by the ganglion-blocking drug
mecamylamine or by incubation with cholinesterase. ese results suggest that soldiersh
venom may stimulate the release of acetylcholine to act at muscarinic receptors on guinea-
pig gastrointestinal smooth muscle. The venom also appears to cause the release of
cyclooxygenase products, such as prostaglandins, which may play a role in enhancing the
pain-producing activity of a range of inammatory mediators.
[16]
It was demonstrated that the venom of Synanceja horrida may aect neurotransmitter
synthesis through inhibition of uptake of transmitter precursors and may also stimulate
the release of acetylcholine in rat brain synaptosomes. ese results suggest that the
venom interfere with the synthesis and release of neurotransmitter from the nerve
terminal.
[27]
e wide range of neurotoxic eects, observed in mice after intracranial injection of
stonefish Synanceja verrucosa venom, seems not to be exerted by adrenergic or cho-
linergic pathways.
[66]
Furthermore, the authors also found that a K
+
ATP channel blocker
potentiated this eect and concluded that Verrucotoxin, a K
+
ATP opener toxin puried
from this venom
[11, 68]
is not implied in venom neurotoxicity either.
[66]
e venom of the lionsh P. volitans induced muscle brillation followed by blockade of
neuromuscular transmission in stimulated frog pectoris muscle preparations.
[17]
Bursts
of transient depolarizations were recorded at the muscle endplate shortly after venom
addition that correlated in time with the duration of venom-induced muscle brillation.
is activity remained after venom treatment with exogenous acetylcholinesterase and
was unaected by Na
+
channel blockage, suggesting that it does not disturb synaptic
transmission but can increase the release and cause depletion of acetylcholine stores
from the nerve terminal.
[17]
e crude venoms of G. marmoratus, P. volitans and S. trachynis display pronounced
neuromuscular activity in the chick biventer cervicis muscle. Tubocurarine, a nicotinic
receptor blocker, did not aect the contractile response to either G. marmoratus or P.
volitans venoms, but produced slight inhibition of the response to S. trachynis venom.
ese results, together with the evidence of venom induced acetylcholine release from
neuromuscular junction,
[33, 34]
suggest that this activity may be due to the transmitter-
releasing properties rather than to the presence of acetylcholine in these venoms.
[69]
e
eects from all three venoms are due in part to an increase in intracellular Ca
2+
, possibly
via the formation of pores in the cellular membrane, which could cause necrosis under
certain conditions.
[69]
Crude Thalassophryne maculosa venom depolarized frog muscle irreversibly. Inter-
estingly, the depolarizing effect induced by TmC4-47.2, a toxin purified from this
venom, was completely reversed at lower doses, but only partially reversible at higher
doses. is toxin appears to have selectivity for skeletal muscle and promotes activation of
Ca
2+
channels in both skeletal muscle and nerve endings. e TmC4-47.2 also induced
myonecrosis on murine gastronemius muscle.
[48]
Animal_FINAL.indb 83 18/5/2009 09:00:09
84
Animal Toxins
e lethal toxins (see section 5.6) TLY, SNTX, Dracotoxin and Toxin-PC, puried
from the venoms of stonesh (S. trachynis and S. horrida), greaterweever sh (Trachinus
draco) and Indian catsh (Plotosus canius), respectively, are implied in neuromuscular
eects displayed by crude venoms.
[28, 33, 34, 40, 44 70]
5.4. HEMOLYTIC AND CYTOTOXIC ACTIVITIES
Almost all sh venoms exhibited high in vitro hemolytic activity, and it has been
demonstrated that this activity is species-specic.
[22, 29, 35]
Strong hemolytic eect on
erythrocytes have been demonstrated in Synanceja verrucosa,
[11]
Trachinus draco,
[22]
Scorpaena plumieri,
[23]
T. nattereri,
[50, 55]
P. volitans
[71]
and S. guttata
[72]
venoms.
e hemolytic action of these venoms is very specic for rabbit erythrocytes. e
erythrocytes from human, pig and chicken are totally resistant and weak hemolytic
activity is observed on mice and cattle erythrocytes.
[22, 35, 71]
Because of lack of phospho-
lipase A2 activity in sh venoms, this hemolytic action on erythrocytes can be seen as a
direct haemolysis.
[27]
Chhatwal and Dreyer
[22]
suggested that the hemolytic activity of
the Trachinus draco venom is preceded by the binding of the hemolytic component to
a protein receptor on the surface of erythrocytes. A hemolytic activity mechanism has
been suggested for hemolytic toxins puried from sh venoms (see section 5.6).
Some works have demonstrated that sh venoms are also cytolytic to other cell types,
particularly muscle cells, and cytotoxic to a number of cell types, including tumor cells.
e venom of the oriental catsh P. lineatus is cytotoxic to a number of cell types
including cultured Ehrlich ascitis tumor cells, which are a common model of tumor
growth.
[64]
e venoms of the scorpionsh Hypodytes rubripinnis and stonesh Synanceja verrucosa
has been assayed on splenocytes and murine P388 leukemic cells. It was found that
both venoms aect cell cycle and cell survival.
[73]
Sri Balasubashini et al.
[37]
reported for
the rst time the anticancer eect of sh venom in vivo cancer model. ese authors
demonstrated the antitumor, hepatoprotective and antimetastatic eects of the lionsh
(Pterois volitans) venom, which induces apoptosis in Ehrlich’s ascitis carcinoma (EAC)
in xenografted mice by activating caspase-3, which was evidenced by nuclear fragmen-
tation. A peptide (7.6 kDa) puried from this venom displays antiproliferative activity
on cultured Hep2 and HeLa cells.
[38]
More recently it has been demonstrated that the S. plumieri venom possess potent
antitumoral effect on cultured murine glioblastoma cells (RT2) and Ehrlich
ascites tumor cells in a dose-dependent manner.
[74]
e venom signicantly reduces
metabolism and induces morphological alterations, such as reduction of cytoplasmatic
volume and rounded cell shape. At higher concentrations, the venom also inhibited
cell adhesion and proliferation. These results suggest that the antitumor effect of
this venom can be mediated by apoptosis induction.
[74]
These data indicate the
biotechnological potential of fish venoms as source of templates for the design of
anticancer pharmaceuticals.
5.5. CARDIOVASCULAR ACTIVITY OF FISH VENOMS
e most potent pharmacological activity exhibited by sh venoms is that on the
cardiovascular system. Cardiovascular activity has been the main focus of sh venom
research and studies have demonstrated that these venoms cause profound alterations
on the cardiovascular system in vitro and in vivo.
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85
Part 1 – Toxins from Marine Animals
e response pattern elicited by certain sh venom may vary according to the cardio-
vascular preparation, procedures used to store the venom and the concentration/dose of
the venom administrated.
[12]
Both in vivo and in vitro cardiovascular eects evoked by sh venoms seem to be a
result, at least in part, of a direct and/or indirect (release of endogenous autacoids)
action of venom compounds mainly on muscarinic and/or adrenergic receptors. e
release of endothelial nitric oxide and modulation of the function of ion channels may
also be involved.
5.5.1. In vitro effects on isolated heart
Fish venoms commonly cause profound cardiovascular disorders and disturb the
cardiac function, producing increase and/or decrease of force of contraction and/or heart
rate.
Single phase positive inotropic responses were reported for the venoms of the reef
stonesh Synanceja verrucosa,
[26]
the Indian catsh Plotosus canius
[43]
and the spotted
buttersh Scatophagus argus
[75]
on isolated heart preparations of dierent species. An
increase in heart rate was also reported when P. canius and S. argus venoms were tested
in guinea pig auricle
[43]
and toad heart,
[75]
respectively.
Oppositely, the venom of Pterois volitans produced a negative inotropic response when
high doses were tested on isolated sh heart
[76]
and caused a dose-dependent chrono-
tropic and inotropic decrease on isolated clam and frog hearts.
[17]
e negative eects
described were attributed to the presence of micromolar concentrations of acetylcholine
in the venom extract, since pretreatment with acetylcholinesterase abolished the cardiac
actions.
[17]
is direct muscarinic action contrasts with the results achieved by Carlson
et al.;
[72]
these authors showed an initial negative inotropic response on isolated rat heart
that was indirectly caused by S. guttata venom labile compounds, since it was abolished
after depletion of endogenous atrial acetylcholine stores with hemicholinium.
[72]
Due to the complex balance of active venom compounds, biphasic responses in
cardiovascular preparations are a very common feature displayed by sh venoms. Studies
using rat isolated heart showed that the venoms of the scorpionsh Scorpaena guttata,
[72]
soldierfish Gymnapistes marmoratus,
[77]
estuarine stonefish Synanceja trachynis
[78]
and
lionsh Pterois volitans
[25]
produced a biphasic inotropic response consisting of an initial
decrease followed by an increase in contraction force. With respect to rate of the cardiac
muscle contraction, biphasic chronotropic responses, characterized by an initial decrease
followed by an increase of heart rate, were obtained using G. marmoratus
[77]
and S. guttata
[72]
venoms, while P. volitans
[25]
and S. trachynis
[78]
venoms showed single positive phase
response. Further investigations on the inotropic effects revealed that the transient
negative and the positive phases, respectively, were reduced after pretreatment with mus-
carinic receptor antagonists and β-adrenoceptor blocking agents.
[25, 72, 77, 78]
e positive
eects elicited by S. trachynis venom was unaected by prior depletion of monoam-
ine stores with reserpine, suggesting a direct action at β-adrenoceptors.
[78]
e presence
of noradrenaline and other biogenic amines in the crude venoms of the stonefish
Synanceja horrida and S. verrucosa described by Garnier et al.
[14]
supports this data.
Conversely, the increase in force of both venoms of S. guttata and G. marmoratus were
abolished with reserpine treatment, which suggests an indirect action of the venom at
β-adrenoceptors due to components that release endogenous cathecolamines.
[72, 77]
Interestingly, another characteristic of sh venoms described in the literature is the
change in response pattern according to the cardiovascular preparation or venom dose
used. For example, the venom of S. argus caused a decrease of both amplitude and rate of
Animal_FINAL.indb 85 18/5/2009 09:00:09
86
Animal Toxins
contraction on isolated guinea pig heart
[75]
and P. volitans venom produced an inotropic
increase when low doses were tested on sh hearts.
[76]
In addition to the interactions with autonomic receptors, electrophysiological
studies revealed that modulation of ion channels activity could be involved in the
cardiac disorders provoked by fish venoms. Sauviat et al.
[79]
showed that Synanceja
verrucosa venom produced a positive inotropic eect on frog atrial heart muscle which
was dose-dependently inhibited by propanolol. is is related to a venom-mediated
increase of both Ca
+2
and the delayed outward K
+
currents of isolated atrial myocytes.
Recent works using the patch clamp method investigated the eects of S. verrucosa
venom (in a preparation containing approximately 40-50% of verrucotoxin – VTX) on
changes in the voltage or current in guinea pig ventricular myocytes.
[80, 81]
e results
obtained by the authors suggest that the venom inhibits K
ATP
current through the
muscarinic M
3
receptor-PKC pathway
[80]
and modulates Ca
+2
channel activity through
the β-adrenoceptor-cAMP-PKA pathway.
[81]
5.5.2. In vitro effects on isolated blood vessels
Besides the eects elicited on cardiac muscle, sh venoms also aects the blood vessel
function. In vitro studies carried out with Gymnapistes marmoratus and Pterois volitans
venoms on precontracted porcine coronary arteries showed that these venoms induced
a dose- and endothelium-dependent relaxation of vessels.
[25, 53]
Similar responses were
also observed when G. marmoratus and S. trachynis venoms were applied to precon-
tracted rat isolated aortae.
[77, 78]
e pretreatment with atropine produced inhibition of
the relaxation response induced by Synanceja trachynis venom on rat isolated aortae and
converted the endothelium- independent contractile response on porcine arteries into a
relaxation response,
[78]
showing additional evidences that sh venoms act at muscarinic
receptors level.
Some studies demonstrated that this endothelium-dependent vasodilatation exhibited by
sh venoms in isolated blood vessels may be related to the endothelial release of NO
(nitric oxide). e removal of extracellular Ca
+2
ions and inhibition of NO synthesis
with NOLA (N
ω
-nitro-L-arginine) signicantly attenuated the relaxation on porcine
coronary arteries elicited by P. volitans venom.
[25]
In addition, the relaxant response
produced by G. marmoratus on precontracted rat isolated aortae was inhibited by
pretreatment of the tissue with NOLA,
[77]
demonstrating that NO synthesis is
involved in the response.
5.5.3. In vivo cardiovascular responses
Hypotension has been reported as a clinical manifestation of major Scorpaenidae sh
envenomation in humans. e eects of sh venoms in vivo have been the focus of
many studies and results demonstrated that they exert potent cardiovascular changes,
which are a function of their eects on both blood vessels and heart.
[12]
e cardiovas-
cular activity was rst shown in experimental animals by Bottard
[82, 83]
apud Church and
Hodgson
[12]
using the venom of the Indian stonesh S. horrida.
Marked hypotensive responses have been described for some sh venoms. A hypoten-
sive eect of the venom of the Indian stonesh Synanceja horrida in anaesthetized
rabbits was reported, which was attributed, at least in part, to peripheral vasodilatation
since the heart rate remained unaected.
[24]
e venom of the lionsh Pterois volitans
also produced hypotension in anaesthetized rabbits.
[84]
e venoms of the scorpionsh
Scorpaena plumieri and the reef stonesh Synanceja verrucosa produced an immediate
decrease in blood pressure in anaesthetized rat.
[23, 26]
A depressor response was also
Animal_FINAL.indb 86 18/5/2009 09:00:09
87
Part 1 – Toxins from Marine Animals
demonstrated for the venoms of the Arabian catfish Arius thallasinus
[85]
and the
spotted buttersh Scatophagus argus
[75]
on guinea pig. e eect exhibited by the latter
was abolished by mepyramine, suggesting that histamine receptors or some hista-
mine-like compounds present in the venom are involved in the response observed.
[75]
In contrast, a hypertensive response was described for the venoms of the catsh Plotosus
canius and the stonesh S. trachynis when injected in rat, and this eect was antagonized
by α-adrenergic blockade. However, the initial pressor response observed, using the S.
trachynis venom, was followed by a more sustained pressoric phase.
[43, 86]
As to the in vitro actions reported earlier, fish venoms commonly develop biphasic
responses in vivo, as a result of a balance of both depressor and pressor responses.
[12]
ese
biphasic responses were observed by using the venoms of Gymnapistes marmoratus,
[77]
Pterois volitans,
[25]
Synanceja trachynis,
[87]
S. horrida,
[88]
Scorpaena guttata,
[89]
S.
plumieri
[90]
and Trachinus draco
[91]
in a variety of anaesthetized animals (rats, cats,
rabbits and dogs).
e venom of the lionsh Pterois volitans produced a biphasic eect consisting of an
initial pressor response followed by a sustained depressor response in anaesthetized rat.
[25]
While atropine potentiated the initial increase in arterial blood pressure, further
addition of prazosin (α1-adrenergic antagonist) restored the original response to the
venom, unmasking another depressor component of the response, which was not due to
activation of either muscarinic receptors or α1-adrenoceptors.
[25]
A dose-dependent hypertensive effect at sub-lethal doses, which was followed by
severe hypotension at lethal doses, were observed after injection of the venoms from
Scorpaena plumieri
[90]
and Californian scorpionsh Scorpaena guttata in anaesthetized
rats.
[92]
However, arterial hypotension followed by a period of increased pressure was
reported when S. guttata venom was administrated in anaesthetized cats, rabbits and
dogs.
[89]
Both Gymnapistes marmoratus and Synanceja trachynis venoms induced, in anaesthetized
rats, a response characterized by an initial depressor phase with a subsequent pressor
phase.
[53, 77, 78]
The depressor phase elicited by G. marmoratus venom was significantly
inhibited by the cyclooxigenase inhibitor indomethacin and the NO-synthase
inhibitor NOLA, indicating that peripheral vasodilatation is responsible for this eect.
[77]
While the response induced by G. marmoratus venom was unaected by prazosin and
atropine treatment,
[77]
the latter abolished the depressor phase and the former attenuated the
pressoric phase of the response produced by S. trachynis venom.
[78]
As described previously, Hopkins et al.
[86]
also demonstrated a pressoric response using
S. trachynis venom. Nevertheless, when compared with other studies,
[53, 78]
the venom
batch used by these authors lacked the initial depressor/negative phase on both in vivo
and in vitro experiments. It is possible that these variable responses to dierent venom
preparations (batches) may be a consequence of the high instability of sh venoms
[17]
and dierent venom storage conditions used by the authors. e change of the response
pattern, observed between the cardiovascular responses evoked by lyophilized and freshly
milked venom of S. trachynis,
[78]
also corroborates with this hypothesis.
In spite of the diversity of actions on the cardiovascular system described for fish
venoms, some data demonstrated that most of the cardiovascular responses (in vitro and
in vivo) exhibited by G. marmoratus and P. volitans venoms were sensitive to treatment
with stonesh antivenom – SFAV.
[25, 53]
It is known that many pharmacological properties exhibited by sh venoms can be
traced back to the action of a single compound/protein present in the crude extract.
erefore, there are studies correlating the cardiovascular activity of some sh venoms
to certain lethal/toxic factor and some of them have been dedicated to the isolation of
these proteins.
Animal_FINAL.indb 87 18/5/2009 09:00:10
88
Animal Toxins
5.6. LETHAL TOXINS PURIFIED FROM FISH VENOMS
ere is evidence in the literature that cytolytic, neurotoxic and hypotensive activities
of the stonesh venoms can be ascribed to the action of a single “protein lethal factor”.
[93]
is hypothesis was corroborated by a demonstration that the hemolytic, lethal and
vascular permeability-increasing activities of Synanceja trachynis venom were inacti-
vated by the use of stone sh antivenom.
[35]
is lethal factor is a high molecular mass
protein and has been puried from venoms of the S. horrida (stonustoxin – SNTX –
Stonesh National University of Singapore), S. trachynis (trachynilysin – TLY) and S.
verrucosa (verrucotoxin VTX).
[11, 29, 34]
ese toxins are the best-studied proteins from
sh venoms and a few structural features and pharmacological properties have been de-
scribed.
[11, 29, 34, 35, 93]
Similar hemolytic protein also appears to be present in scorpionsh
S. plumieri venom.
[23, 90]
e rst protein from sh venom puried and characterized at the molecular level
was SNTX from S. horrida, which represents 9% of total protein in the crude venom.
is 148kDa protein is composed of two subunits of 71kDa (α subunit) and 79kDa
(β subunit) associated via non-covalent interactions.
[29, 94]
Although SNTX exhibits a
multitude of biological activities (hemolysis, vascular permeability, platelet aggregation,
edema induction, neuromuscular and endothelial vasorelaxation), the primary cause of
death by this toxin is attributed to marked hypotension.
[27, 28, 30]
Sung et al.
[95]
postulated
that a component of SNTX-mediated vasorelaxation is via binding of either SNTX or
release substance P (SP) to the SP endothelial receptor cells; the occupation of such
receptors causes an inux of Ca
2+
, subsequent production of NO and activation of K
+
channels thus leading to vasorelaxation. Interestingly, Liew et al.
[96]
demonstrated that
H
2
S may act synergistically with NO in eecting SNTX-induced relaxation.
TLY, the lethal component from S. trachynis venom was puried and, like SNTX,
it comprises two subunits (α 76kDa; β 83kDa) and it has a similar molecular mass
of 158 kDa.
[34, 35]
TLY has negative inotropic activity, and it selectively stimulates the
acetylcholine release from small clear synaptic vesicles at motor nerve terminals, with
alterations of various cationic transport channels.
[34, 97]
Unlike the case of motor nerve
endings, TLY mediates soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment
protein receptor (SNARE)-dependent release of catecholamines of large core vesicles
from chroman cells via external and stored Ca
2+
.
[98]
e hemolytic activity of the
SNTX and TLY has been attributed to pore formation, and the “carpet-like” model
has been proposed to explain this eect.
[99, 100]
is model predicts the existence of a
threshold amount of bound toxin for membrane permeation and instability of pore
structure.
Two different lethal factors (VTX and neoVTX) were isolated from S. verrucosa
venom. e neoVTX is also a 166KDa dimeric protein with α (75 kDa) and β (80kDa)
subunits.
[36]
However, unlike SNTX, TLY and neoVTX, the VTX is a 322kDa
tetrameric glycoprotein and presents 2α (83 kDa) and 2β (78 kDa) subunits.
[11]
VTX
exerts a negative inotropic and chronotropic eect in (frog) atrial heart muscle, which
might be attributed to inhibition of calcium channels and to the opening of ATP-
sensitive K
+
channels.
[68]
It also induced a hypotensive eect in anaesthetized rats.
[11]
e complete amino acid sequence of the α and β subunits of lethal toxins (SNTX,
VTX and neoVTX) have been deduced by cloning and sequencing of the cDNA
encoding them.
[36, 68, 94, 101]
These toxins have very similar amino acid sequences ac-
cording to the predicted structure from cDNA sequencing. The subunits α and β
of SNTX have approximately 50% sequence homology to each other.
[94]
Identity of the
neoVTX β-subunit with the reported VTX β-subunit is 90%, lower than that (96%)
with the SNTX β-subunit.
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89
Part 1 – Toxins from Marine Animals
e complete amino acid sequence of TLY is not yet known. However, the rst 37
amino acid residues of the β-subunit determined were identical to those reported for the
β-subunit of SNTX.
[34]
ese toxins share no signicant homology with the amino acid
sequences of other proteins in databases. e structural similarities of these lethal toxins
can explain the similarity in the lethality (LD
50
values – Table 1) and cross-reactivity of
these toxins.
Lethal fractions named Trachinine (324kDa) and Dracotoxin (105kDa) were also
puried from weevershes Trachinus vipera
[41]
and Trachynus draco
[40]
venoms, respec-
tively. Dracotoxin is a membrane depolarizing and hemolytic protein. It has been
suggested that this toxin probably interacts with glycophorin in the erythrocyte mem-
brane, rather than binding to cholesterol.
[40]
However, a lethal toxin, “Toxin-PC”, of low
molecular mass (15kDa) and cardiovascular eect was puried from the Plotosus canius
venom. It produced cardiac arrest on isolated toad and guinea pig hearts, and this eect
was not counteracted by prior administration of neither atropine nor propanolol.
[44]
5.7. ENZYMATIC ACTIVITIES
Fish venoms displayed a signicant hyaluronidase activity as found in P. falkneri,
[5]
S. plumieri,
[39]
P. motoro,
[5, 102]
Synanceja trachynis,
[103]
Gymnapistes marmoratus
[103]
and
Synanceja horrida
[27]
venoms. e level of hyaluronidase activity in stonesh venoms is
comparable to those present in different snake venoms.
[27, 31]
Proteolytic activi-
ties on gelatin and casein were found in the S. plumieri,
[23]
P. falkneri
[5]
and alassophryne
maculosa
[47]
venoms. Proteinases with thrombin-like and kininogenase activities have been
detected in S. horrida
[27]
and alassophryne nattereri.
[51]
e presence of these enzymes could be responsible for some pathological activities
triggered by piscine venoms or could contribute to local and systemic eects observed in
envenomations. e local events caused by sh stings, an intense local pain, besides edema,
erythema and necrosis, suggest extracellular matrix (ECM) disturbances, which can be
associated with proteases and hyaluronidases present in these venoms. In addition, some
authors related the activity of these enzymes to the spreading of venom toxicity in stone-
sh and stingray envenomations.
[5, 104]
erefore, such enzymes are considered important
spreading factors due to its ability to hydrolyze connective tissue in ECM.
Local clinical symptoms induced by Potamotrygon falkneri and Dasyatis guttata were
partially related with enzymatic toxins present in these venoms.
[5, 105]
It has also been
speculated that the proteolytic activities in T. draco venom can interfere in the coagulation
process.
[106]
Some other enzymatic activities have also been described in sh venoms. Stonesh
venoms (Synanceja horrida and S. trachynis) exhibited acetylcholinesterase, phosphodi-
esterase, 5’nucleotidase, arginine esterase, arginine amidase, esterase and aminopeptidases
activities.
[11, 27, 103]
Esterase, acid phosphatase and alkaline phosphatase are present in
soldiersh Gymnapistes marmoratus venom.
[103]
Phospholipase, 5’-nucleotidase and acid
phosphatase were also detected in stingray P. motoro venom.
[102]
No detectable quantities
of phospholipase A2 activity were found in G. marmoratus,
[103]
Synanceja trachynis,
[67]
alassophryne maculosa,
[47]
T. nattereri
[50]
venoms.
Despite the many enzymatic activities already described in fish venoms, only four
enzymes have been isolated and/or characterized at the molecular level (Table 1).
Hyaluronidase has been isolated from stonefish S. horrida (SFHYA1) and scor-
pionfish S. plumieri (SpH) venoms.
[31, 32, 39]
SFHYA1 is an endo-beta-N-acetylglu-
cosaminidase specic for hyaluronate of 62kDa.
[31, 107]
Like SpH this enzyme is a single
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90
Animal Toxins
chain glycoprotein, which did not contain any hemorrhagic or lethal activities.
[31, 39]
The cDNA of SFHYA1 has been elucidated and it encodes a polypeptide of 477
amino acids; and the mature toxin is a polypeptide composed of 449 residues containing
three potential N-glycosylation sites.
[32]
The N-terminal sequence of the SFHYA1
of puried native protein (LPWTDPPLHP) was consistent with that deduced from
the sequence of the cloned cDNA. e SFHYA1 closely resembles the testicular-type
PH-20 family of hyaluronidases and present a 20% similarity with the bee venom
hyaluronidase.
[32, 93]
The first protease isolated from fish venoms was a gelatinolytic enzyme (Sp-GP)
puried from S. plumieri venom, which is a single chain protein with molecular mass of
80kDa and has a blocked N-terminal residue.
[23]
A new class of kallikrein-like proteins was isolated from Thalassophryne nattereri
venom. These proteins were able to induce edema and nociception as well as
to cleave human kininogen and kininogen-derived fragments thus releasing kallidin
(Lys-bradykinin). Aminoacid sequences of natterins were obtained by a transcriptomic
analysis using a cDNA library constructed from venom glands.
[49]
5.8. NEUTRALIZATION OF
TOXIC ACTIVITIES BY ANTIVENOMS
The problem of envenomation caused by fish is serious and probably very com-
mon. In spite of a low death risk, the problem of morbidity leading to economic
and social problems for the victims, especially for shermen, persists. Fish belonging
to the Scorpaenidae and Synanceiidae families cause the most severe envenomations,
including human deaths. On the other side, local envenoming manifestations caused
by toadsh, stingrays and catsh can be very important, causing acute consequences as
excruciating pain and severe inammation or sequels as bacterial infections and chronic
ulcers.
[1]
e only antivenom commercial available is against stonesh S. trachynis (SFAV); it
is a horse Fab’2 preparation made by CSL (Commonwealth Serum Laboratories) in
Melbourne – Australia.
[108]
It is effective in neutralizing all known clinical effects
of serious S. trachynis envenomation, destroying the lethal, vascular permeability-increasing
and hemolytic properties of the venom.
[109]
In addition, there is evidence that SFAV
neutralizes the pharmacological eects of other sh venoms, such as Pterois volitans,
P. lunulata, P. antennata, Dendrochirus zebra, S. verrucosa and Gymnapistes marmoratus.
[71, 109]
For example, the endothelium-dependent relaxation in porcine coronary arteries, the
positive chronotropic response in rat paced left atria and the biphasic response in
anaesthetized rat produced by Gymnapistes marmoratus venom were abolished by
SFAV.
[53]
However, stonesh antivenom did not react with the crude venom of bullrout
(N. robusta) or its algesic protein, nocitoxin.
[42]
e eectiveness of SFAV in neutralizing
the activity of some other piscine venoms is explained by the notion that venomous sh
belonging to dierent genera may share similar venom compounds.
[12]
Evidences supporting the in vitro ecacy of T. nattereri antivenom were initially
demonstrated using the antiserum produced in rabbits.
[110]
In a recent study, Grund
et al.
[111]
also reported that lower doses of T. nattereri venom mixed with adjuvant
stimulate a 1 and 2 response in mice, with a notable IL-5 production and specic
IgG1 and total IgE isotypes secretion. More recently, Piran-Soares et al.
[112]
detected,
the persistence of high levels of specific IgG against venom in patients 6 months
after accidents caused by T. nattereri. ese authors conrmed the in vitro neutralizing
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91
Part 1 – Toxins from Marine Animals
capacity of T. nattereri anti-venom for toxic eects and thereafter showed that neutralizing
antibodies obtained in a persistent immune response in mice are more eective against
nociception and necrosis, including edematous reaction.
Specic antiserums against venom of Trachinus draco, Scorpaena scrofa, S. porcus and
S. ustulata were obtained by immunizing rabbits. e venom of scorpionshes present
antigenic identity, but the toxins from weeversh and scorpionsh were antigenically
dierent.
[113]
Antiserum against Scatophagus argus venom, obtained by immunization of
rabbits, neutralized its lethality, but not pro-inammatory and hemorrhagic activities.
Inammatory and hemorrhagic eects were reduced by cyprohepatadine, indomethacin
and BW 755 demonstrating that these local eects of S. argus venom are mediated
through release of mediators.
[46]
In some points, it is necessary to develop new antivenoms not solely to minimize the
risk of death, the only parameter used today, but also for the population benet.
6. BIOTECHNOLOGICAL APPROACHES
AND CONCLUDING REMARKS
e study of venom components, clinical toxin manifestations in human beings and
potential development of new drugs is just beginning. is research area has advanced in
the last thirty years, especially as for the identication of potentially dangerous species,
mechanisms of envenomation and toxins responsible for the eects. Nowadays, however,
it is important that the toxins and venoms are not only identied and separated into
their groups. e potential use of such dierent groups of pharmacologically active sub-
stances is enormous and should be exploited. We are currently passing from the curiosity
searching stage to the real research stage, a fact reinforced by the increasing number of
venomous sh identied today. Getting acquainted with venoms and seeking how to
prevent accidents are not enough. It is necessary to search new antivenom against
envenomation accidents caused by some sh species. It is also important to understand
the mechanism of action of these toxins and it is vital that this new knowledge be
employed for the development of new drugs.
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