( PDF ) Filogenia Molecular das Jabuticabas: Elucidando relações evolutivas e identidade genérica de um fruto genuinamente brasileiro

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CIRO DE SOUSA

FILOGENIA MOLECULAR DAS JABUTICABAS: ELUCIDANDO RELAÇÕES

EVOLUTIVAS E IDENTIDADE GENÉRICA DE UM FRUTO GENUINAMENTE

BRASILEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação Stricto Sensu em Ciências

Genômicas e Biotecnologia da Universidade

Católica de Brasília, como requisito parcial

para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Genômicas e Biotecnologia.

Orientador: Dr. Eduardo Gomes Gonçalves

Co-orientadora: Dra. Rosane Garcia

Collevatti.

Brasília

2009

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Dissertação de autoria de Ciro de Sousa, intitulada “FILOGENIA MOLECULAR

DAS JABUTICABAS: ELUCIDANDO RELAÇÕES EVOLUTIVAS E IDENTIDADE

GENÉRICA DE UM FRUTO GENUINANEMENTE BRASILEIRO” apresentada como

requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da

Universidade Católica de Brasília em 6 de novembro de 2009, defendida e aprovada pela

banca examinadora abaixo assinada:

_________________________________________________

Prof. Dr. Eduardo Gomes Gonçalves

Orientador

Universidade Católica de Brasília – UCB

_________________________________________________

Prof. Dr. David John Bertioli

Examinador Interno

Universidade Católica de Brasília – UCB

Universidade de Brasília – UnB

_________________________________________________

Prof. Dra. Lilian Gimenes Giugliano

Examinador Externo

Universidade de Brasília – UnB

Brasília

2009

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Dedico este trabalho aos meus familiares, em

especial a minha mãe, Maria de Fátima, e a

minha avó, Maria Eva, pelo carinho e apoio

permanente para que eu continuasse os

estudos.

AGRADECIMENTO

Assumindo o risco de esquecer alguém essencial que de alguma forma possa ter

contribuído para o término deste trabalho, nem que fosse por deixar o ambiente do laboratório

mais descontraído, aliviando o clima de estresse que em certas ocasiões pairava sobre nós,

aqui se encontra uma lista de pessoas que não posso deixar de agradecer:

Primeiramente, a Deus e a Virgem Maria, minhas fontes insubstituíveis de paz;

Meus familiares, em especial minha mãe, Maria de Fátima, e a minha avó, Maria

Eva (segunda mãe), por terem me dado todo o tipo de apoio para que eu continuasse

com os estudos, e os meus irmãos: Luana e Pedro, pela ajuda e compreensão.

Meu orientador, Eduardo Gomes Gonçalves, que ao longo destes seis anos de

parceria, desde a iniciação científica, tem sido uma pessoa formidável, sem seu

incentivo certamente não teria feito o mestrado;

Minha orientadora, Rosane Garcia Collevatti, pela sua solidariedade intelectual,

muito do que aprendi devo a você. Obrigado por toda a confiança depositada em

mim;

Além da professora: Carolyn Elinore Barnes Proença, por ter me ajudado na

compreensão do confuso “complexo Plinia”;

Os professores David Bertioli e Renato Caparroz, pelas dicas e ajuda com o Staden;

Alessandra Reis pelas valiosas dicas e por te me ajudado a lidar com o MegaBace,

toda vez que tinha um problema;

Meus eternos amigos, Susana, João Paulo, Hugo, Weuller e Laurinha, que na

verdade são muito mais que amigos são irmãos;

Minha namorada, Nara Neri, por todo carinho e compreensão;

Aos amigos que fiz ao longo deste tempo de pós, Aline, Patty, Camila, Suelen,

Lucas, Vírgilio, Leonardo, Rodrigo, Thais (Loira), Isabel, Maíra, Marcela, Baby,

Francisca, Viviane, Flavinha, Glaucia, Marco, Janaína, Ediene, Valéria, Luciano,

Marina, Raquel, pessoas inesquecíveis com as quais tive o privilégio de dividir

situações memoráveis;

A todos os funcionários, em especial a Ida, Fábio, André e Willian;

Por fim, a todos aqueles que deveriam, mas pela minha falta de memória, não foram

citados.

RESUMO

Referência: SOUSA, Ciro. Filogenia Molecular das Jabuticabas: Elucidando relações

evolutivas e identidade genérica de um fruto genuinamente brasileiro. 2009. 61 pp. Curso de

Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, Brasília-DF, 2009.

As jabuticabas (ou “jaboticabas”) são frutas bastante apreciadas no Brasil,

especialmente nos estados do Sudeste e Centro-oeste, onde não podem faltar em pomares

caseiros. São frutas essencialmente brasileiras, apenas ocasionalmente cultivadas em países

vizinhos. Apesar de sua produção ser essencialmente artesanal e voltada para o mercado

informal, grandes quantidades desta fruta são consumidas nos poucos períodos que se

encontram disponíveis. Programas de melhoramento genético são quase ausentes,

principalmente pela taxonomia complexa e a pela escassez de estudos genéticos.

Tradicionalmente, as jabuticabas são classificadas no gênero Myrciaria (como M. jaboticaba,

M. cauliflora e M. trunciflora), mas alguns autores as consideram como pertencentes ao

gênero Plinia. A dificuldade de circunscrição genérica torna-se ainda maior quando o gênero

Paramyrciaria é incorporado, formando um complexo de difícil delimitação usando dados

morfológicos. Estudos recentes usando dados moleculares demonstram que os gêneros

Myrciaria e Plinia, juntamente com Neomitranthes e Siphoneugena, formam um grupo

monofilético denominado “Complexo Plinia”. Uma vez que os estudos existentes não foram

capazes de sugerir de forma conclusiva uma circunscrição para as espécies cultivadas de

jabuticabas, sugere-se aqui uma abordagem molecular utilizando um marcador plastidial

(matK) e um nuclear (ITS). As abordagens filogenéticas testadas foram Máxima Parsimônia e

Análise Bayesiana, com resultados essencialmente similares. Para tanto, 67 acessos

pertencentes ao grupo foram obtidos em campo ou à partir de coleções vivas, compreendendo

as jabuticabas comestíveis e grupos próximos (Siphoneugena, Neomitranthes, Myrciaria e

Plinia), além de grupos externos. As árvores filogenéticas derivadas de cada compartimento

genômico mostraram-se divergentes em detalhes, demonstrando que os marcadores têm

histórias evolutivas levemente distintas. Em ambas as análises, as jabuticabeiras amostradas

(M. jaboticaba, M. truncifolia e M. cauliflora) surgiram como um único clado, ainda que em

nenhuma das espécies tradicionalmente reconhecidas tenha se mostrado monofilética. Outro

aspecto de interesse é que o grupo que inclui as espécies usualmente aceitas em Myrciaria

sensu stricto (incluindo a espécie tipo do gênero, Myrciaria tenella) também surge como um

clado isolado das jabuticabas cultivadas em ambas as análises, estando tão distante das

jabuticabeiras comestíveis quanto de qualquer outro gênero amostrado do “complexo Plinia”,

enquanto a espécie-tipo de Paramyrciaria (P. delicatula) surge também em um clado

relativamente isolado. Um terceiro aspecto digno de nota é que as espécies reconhecidas

como pertencentes ao gênero Plinia surgiram espalhadas em diferentes clados do “complexo

Plinia” (e mesmo fora deste, como Plinia hatschbachiana), indicando que Plinia pode ser um

gênero polifilético. Estes resultados obtidos alertam que, ainda que o “complexo Plinia”

mostre-se como um clado bem definido nas análises em nível subfamiliar e tribal, a

circunscrição dos gêneros componentes demanda mais atenção, principalmente no que diz

respeito ao posicionamento de Plinia. Um aumento na amostragem do gênero Plinia, bem

como a inclusão da espécie-tipo do gênero Plinia (P. pinnata) são imprescindíveis para a

elucidação definitiva da identidade genérica das jabuticabeiras cultivadas. Por fim, acredita-

se que esta análise prospectiva das relações genéticas entre as jabuticabeiras cultivadas e seus

parentes selvagens possa ser usada com sucesso como uma linha base confiável para

programas de melhoramento genético de uma fruta genuinamente brasileira.

Palavras-chave: Jabuticaba. Filogenia. Myrciaria. Plinia. matK. ITS.

ABSTRACT

The jabuticabas (or jaboticabas) are much appreciated fruits in Brazil especially in

the Southwestern and Central-western states where they are always present in gardens and

orchards. They are essentially Brazilian fruits, infrequently cultivated in other countries.

Although its production is essentially non-commercial, large amounts of these fruits are

consumed during its short fruiting period. There are virtually no breeding programs, mainly

because of the complex taxonomy and poor genetic characterization. Traditionally, the

jabuticabas are defined as belonging to Myrciaria (mainly as M. jaboticaba, M. cauliflora and

M. truncifilora), but a few authors consider them as belonging to the genus Plinia. Its

circumscription becomes more complex when the genus Paramyrciaria is considered,

forming a complex that is rather hard to define using morphological data. Recent studies

using molecular data demonstrate that the genera Myrciaria and Plinia, together with

Neomitranthes and Siphoneugena, form a monophyletic group denoted “Plinia complex”.

Since previous studies were not able to establish a conclusive circumscription for the

cultivated jaboticabas, we used a molecular approach using both a plastidial (matK) and a

nuclear (ITS). Both Maximum Parsimony and Bayesian Analysis approaches were used, with

essentially similar results. Sixty seven accessions from this group were obtained from field

trips or living collections, including edible jabuticabas and allied groups (Siphoneugena,

Neomitranthes e Plinia), together with outogroups. The trees obtained from each genomic

compartment has proven to be slightly different, suggesting a possible distinct evolutionary

story. In both analysis, the sampled jaboticaba species (M. jaboticaba, M. trunciflora and M.

cauliflora) appeared in a single clade, although none of the sampled species appeared as

monophyletic individually. Another interesting aspect is that the group containing the species

usually accepted in Myrciaria sensu lato (including the type species of the genus, M. tenella)

also appeared as distantly related to cultivated jaboticaba as any other sampled genera from

the “Plinia complex”, whereas the type-species of Paramyrciaria (P. delicatula) also appears

in an isolated clade. A third noteworthy aspect is that the species recognized as belonging to

the genus Plinia appeared scattered among different clades of the “Plinia complex” (and even

out ot if, as P. hatschbachiana) suggesting that Plinia could be a polyphyletic genus. These

obtained results are clear enough to indicate that the “Plinia complex” may be well defined in

subfamiliar and subtribal approaches, but lacks better studies on generic circumscription,

specially concerning the genus Plinia. A broader sampling of Plinia, as well as the inclusion

of P. pinnata, the type-species of this genus are both necessary prerequisites for the ultimate

elucidation of the generic identity of the cultivated jabuticabas. Finally, we believe that this

prospective analysis about the genetic relationships of the cultivated jabuticabas and their

wild relatives can be successfully used as the first guideline for future breeding programs of

this genuinely Brazilian fruit.

Keyword: Jabuticaba, Phylogenetic, Myrciaria, Plinia, matK, ITS.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Árvore de consenso stricto de 90 igualmente parcimoniosas árvores com 1701

passos, encontrada a partir da busca heurística do matK mais dados do espaçador. A

distribuição dos indels informativos são mapeados na árvore: m = indel do matK; s = indel do

espaçador. ................................................................................................................................. 17

Figura 2 – Árvore de consenso stricto resultante da análise de parcimônia com sucessivas

pesagens e análise Bayseana dos dados obtidos pelos marcadores ITS, ETS, psbA-trnH e

matK. Os valores de bootstrap acima de 50% são mostrados acima dos ramos; clados não

recuperados dentro das análises Bayesianas são marcados com setas. ..................................... 20

Figura 3 - A) Jabuticabeira (Myrciaria cauliflora); B) jabuticabas; C) jabuticabeira

(Myrciaria sp.) na época de floração. ....................................................................................... 22

Figura 4 - Representação do posicionamento do matK. ........................................................... 25

Figura 5 - Representação do posicionamento do ITS................................................................ 26

Figura 6 - Disposição dos genes 18S, 5.8S e 28S, intercalados pelo ITS, exemplificando uma

região paráloga. NTS, nontranscribed spacer, ETS, external transcribed spacer, ITS, internal

transcribed spacer. ................................................................................................................... 26

Figura 7 - Árvore de consenso stricto derivada da análise de parcimônia para o marcador

nuclear ITS. Para os ramos com índices de bootstrap acima de 50%, o valor foi indicado

acima de cada ramo. Os principais clados foram denominados: 7A, 7B, 7C e 7D. As espécies

marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências nucleotídicas foram retiradas do Genbank.

.................................................................................................................................................. 36

Figura 8 - Árvore consenso derivada da análise bayesiana, para o marcador nuclear ITS. Para

os ramos com índices de probabilidade posterior acima de 50%, o valor foi indicado abaixo de

cada ramo. Os principais clados foram denominados: 8A, 8B, 8C, 8D e 8E. As espécies

marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências nucleotídicas foram retiradas do Genbank.

.................................................................................................................................................. 38

Figura 9 - Árvore de consenso derivada da análise parcimônia, para o marcador plastidial

matK. Nos ramos com índices de bootstrap acima de 50%, o valor foi indicado acima de cada

ramo. Os principais clados foram denominados: 9A, 9B, 9C, 9D e 9E. As espécies marcadas

com um asterisco (*) não possuem voucher, nem origem. Aquelas marcadas com dois

asteriscos (**), suas seqüências nucleotídicas foram retiradas do Genbank. ........................... 40

Figura 10 – Árvore de consenso derivada da análise bayesiana, para o marcador plastidial

matK. Nos ramos com índices de probabilidade posterior acima de 50%, o valor foi indicado

abaixo de cada ramo. Os principais clados foram denominados: 10A, 10B, 10C, 10D, 10E e

10F. As espécies marcadas com um asterisco (*) não possuem voucher, nem origem. Aquelas

marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências nucleotídicas foram retiradas do Genbank.

.................................................................................................................................................. 42

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Agrupamentos intrafamiliares de Myrtaceae de acordo com diferentes autores.

Táxons associados com as subfamílias Myrtoideae, Leptospermoideae e Psiloxyloideae são

indicados pela tonalidade de sombreamento, claro, intermediário e escuro respectivamente . 15

Tabela 2 - Histórico dos agrupamentos da tribo Myrteae de acordo com diferentes autores. Os

táxons associados com as subtribos descritas por Berg, Myrciinae, Eugeniinae e Myrtinae, são

indicados com as tonalidades de cores clara, intermediária e escura respectivamente. ........... 19

Tabela 3 - Espécies utilizadas na análise filogenética. ............................................................. 29

Tabela 4 - Espécies utilizadas na análise filogenética, retiradas do NCBI ............................... 31

Tabela 5 - Lista de primers utilizados nas reações de amplificação e seqüenciamento do gene

matK e do espaçador intergênico ITS . ..................................................................................... 32

Tabela 6 - Sumário dos marcadores matK e ITS. ...................................................................... 34

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% Porcentagem

ºC Grau Celsius

µg Micrograma

µl Microlitro

µM MicroMolar

bs Bootstrap

BSA Albumina de Soro Bovino

CI Índice de Consistência

DNA Ácido Desoxirribonucléico

dNTP Desoxirribonucléico Trifosfato

HI Índice de Homoplasia

ng Nanograma

M Molar

pp Probabilidade posterior

ILD Incongruence Length Difference

ITS Internal Transcribed Spacer

NCBI National Center for Biotechnology Information

matK Maturase K

MgCl2 Cloreto de Magnésio

mM MiliMolar

PCR Reação em cadeia de polimerase

RAPD DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente

RC Índice de Consistência Reescalonado

RI Índice de Retenção

Taq Thermus aquaticus

TBR Tree Bisection-Reconnection

U Unidade

SUMÁRIO

1. Introdução ......................................................................................................................... 14

1.1. Família Myrtaceae .................................................................................................... 14

1.2. Tribo Myrtae ............................................................................................................. 18

1.3. Identidade genérica das jabuticabeiras ..................................................................... 21

1.4. Filogenia Molecular .................................................................................................. 25

2. Objetivos ........................................................................................................................... 28

2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................ 28

2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................ 28

3. Material e Métodos ........................................................................................................... 29

3.1. Material amostrado .................................................................................................... 29

3.2. Extração e quantificação do DNA ............................................................................. 31

3.3. Reações de amplificação ............................................................................................ 31

3.4. Sequenciamento ......................................................................................................... 32

3.5. Alinhamento ............................................................................................................... 32

3.6. Análises filogenéticas ................................................................................................ 33

3.6.1. Teste de Incongruência ........................................................................................ 33

3.6.2. Máxima Parcimônia ............................................................................................. 33

3.6.3. Inferência Bayesiana ............................................................................................ 33

4. Resultados ......................................................................................................................... 34

4.1. Marcador nuclear (ITS) .............................................................................................. 34

4.1.1. Análise de Parcimônia ......................................................................................... 34

4.1.2. Análise Bayesiana ................................................................................................ 37

4.2. Marcador plastidial (matK) ........................................................................................ 39

4.2.1. Análise de Parcimônia ......................................................................................... 39

4.2.2. Análise Bayesiana ................................................................................................ 41

5. Discussão .......................................................................................................................... 43

5.1. Incongruência entre os compartimentos genômicos. ................................................. 43

5.2. Análise Filogenética .................................................................................................. 44

6. Conclusão .......................................................................................................................... 49

7. Bibliografia ....................................................................................................................... 50

1. INTRODUÇÃO

1.1. FAMÍLIA MYRTACEAE

A família Myrtaceae compreende cerca de 100 gêneros, onde estão incluídas

aproximadamente 3000 espécies, sendo a maior família da ordem Myrtales (Judd et al., 2002;

Sousa & Lorenzi, 2005). A família possui centros de diversidade na Austrália, sudeste da Ásia

e na América tropical, mas com pouca representação na África (Wilson et al., 2001; Judd et

al., 2002).

Do ponto de vista econômico, destacam-se vários gêneros pertencentes à família,

pelo fornecimento de madeira e celulose (Eucalyptus), valor ornamental e paisagístico devido

a características florais (Myrtus, Eucalyptus, Callistemon, Melaleuca, Leptospermum e

Rhodomyrtus) e as espécies frutíferas amplamente apreciadas, como a goiabeira (Psidium

guajava), jabuticabeira (Myrciaria cauliflora e outras espécies do gênero), pitangueira

(Eugenia uniflora), cabeludinha (Plinia glomerata), cambuci (Campomanesia phaea),

guabirobeira (Campomanesia ssp.), araçá (Psidium cattleyanum), cereja-natural (Eugenia

cerasiflora), do jambo (Syzygium sp.) e do jambolão (Syzygium cumini), estas duas últimas

exóticas (Judd et al, 2002; Sousa & Lorenzi, 2005).

Possuem também um valor expressivo na riqueza, abundância de indivíduos e área

basal na ocupação de áreas por florestas secundárias na região amazônica (Carim et al., 2007)

e em formações savânicas, como o cerrado (Castro et al., 1999). Aparecem também com

destaque na Floresta Atlântica e a Floresta da Restinga, onde as espécies de Eugenia,

Marlierea, Gomidesia e Myrcia e outros gêneros são muito comuns, representando

freqüentemente a família com maior número de espécies (Sousa & Lorenzi, 2005). Dentro de

um levantamento realizado por Oliveira-Filho & Fontes (2000) a família foi a que possuía

mais representantes em área da Floresta Atlântica chuvosa, Floresta Atlântica Semi-decídua e

no Cerrado.

As Myrtaceae podem ser distinguidas pela combinação das seguintes

características: elevado número de estames, onde os conectivos possuem freqüentemente uma

glândula na extremidade, ovário ínfero com placentas axilares ou parietais profundamente

intrusivas, testa da semente transformada em asas ou com estruturas variadas. O tegumento

pode ser coriáceo, pétreo ou membranoso (Wilson et al., 2001; Judd et al., 2002).

Abordagens recentes têm apresentado a família como monofilética (Wilson et al.,

2005). No entanto na classificação intrafamiliar existe uma considerável discordância entre

autores no que diz respeito à circunscrição de gêneros e espécies (Lucas et al., 2005).

Vários autores procuraram por uma classificação que melhor estabelecesse uma

relação entre as espécies dentro de Myrtaceae (Tabela 1). No final da última década, adotava-

se a classificação utilizada por Johnson & Briggs (1984), na qual a família dividia-se em duas

sub-famílias: Leptospermoideae e Myrtoideae, segundo características dos frutos.

Leptospermoideae apresentaria frutos secos enquanto que Myrtoideae, frutos carnosos

(Johnson & Briggs, 1984). Dentro de cada subfamília foi estabelecido uma estrutura informal

de alianças e sub-alianças (equivalente a tribos e subtribos) relacionando os gêneros (Johnson

& Briggs, 1984).

Tabela 1 - Agrupamentos intrafamiliares de Myrtaceae de acordo com diferentes autores. Táxons associados com

as subfamílias Myrtoideae, Leptospermoideae e Psiloxyloideae são indicados pela tonalidade de sombreamento,

claro, intermediário e escuro respectivamente.

De Candolle ex

Schlechtendahl

(1826–7)

Niedenzu

(1893)

Kausel

(1956)

Schmid

(1980)

Johnson & Briggs

(1984)

Wilson & al.

(2005)

Tribo

Leptospermeae

Subfamília

Leptospermoideae

Família

Leptospermaceae

Subfamília

Leptospermoideae

Subfamília

Leptospermoideae

Tribo

Chamaelaucieae

Subfamília

Chamaelaucoideae

Tribo

Myrteae

Subfamília

Myrtoideae

Família

Myrtaceae

Subfamília

Myrtoideae

Subfamília

Myrtoideae

Subfamília

Myrtoideae

Tribo

Barringtonieae

Família

Lecythidaceae

(excluídos de

Myrtaceae)

Tribo

Lecythideae

Subfamília

Psiloxyloideae

Subfamília

Psiloxyloideae

Incluindo 3 grupos:

Incluindo 15 tribos

Osbornia Eucalypteae, Kanieae, Leptospermeae, Lindsayomyrteae, Lophostemoneae,

Melaleuceae, Metrosidereae, Osbornieae, Syncarpieae, Tristanieae, Xanthostemoneae,

Chamelaucieae, Backhousieae

“Myrtoideae sensu stricto” Myrteae, Syzygieae

A aliança “Acmena”

Adaptado: Lucas et al. (2007)

Apesar de todos os esforços desprendidos por gerações de mirtólogos, os

caracteres morfológicos empregados para manter as subfamílias e as alianças, tais como

características do fruto, embrião, cotilédone, indumento e inflorescência, foram ao longo do

tempo se mostrando frágeis demais para sustentá-los (Wilson et al., 1994).

A partir daí, o emprego dos dados moleculares possibilitou o aprimoramento na

compreensão das relações filogenéticas entre os grupos. Wilson e colaboradores (2001) foram

os primeiros a propor uma hipótese filogenética molecular utilizando seqüências do gene

maturase K (matK), em torno de toda a família Myrtaceae. As análises até então conduzidas

abordavam grupos restritos dentro da família (O’Brien et al., 2000; Lam et al., 2002). Além

Myrtoideae

Psiloxyloideae

Leptospermoideae

da análise filogenética molecular, Wilson et al. (2001) também fizeram uma reavaliação dos

dados morfológicos e anatômicos comumente utilizados na dedução de grupos intrafamiliares

e refez uma análise filogenética com estes dados. A estimativa filogenética obtida derivada

dos dados morfológicos e anatômicos é pobremente resolvida e pouco sustentada, enquanto

que os moleculares foram eficientes na determinação de onze grupos robustos dentro de

Myrtaceae, no entanto a relação entre eles é pouco resolvida ou não pode ser sustentada

(Wilson et al., 2001).

Análises posteriores utilizando o mesmo marcador plastidial matK, com número

maior de espécies, reconheceu na família Myrtaceae duas subfamílias: Myrtoideae e

Psiloxyloideae (Wilson et al., 2005). Os gêneros que segundo Johnson & Briggs (1984)

compunham Leptospermoideae passariam a integrar a subfamília Myrtoideae (Figura 1), que

somados aos gêneros já existentes formariam quinze tribos: Chamelaucieae, Leptospermeae,

Lindsayomyrteae, Syncarpieae, Eucalypteae, Myrteae, Syzygieae, Tristanieae, Metrosidereae,

Backhousieae, Kanieae, Melaleuceae, Osbornieae, Lophostermoneae e Xanthostemoneae

(Wilson et al., 2005). Enquanto que a subfamília Psiloxyloideae foi composta pelas tribos:

Heteropyxideae e Psiloxyleae (Wilson et al., 2005).

Figura 1 - Árvore de consenso stricto de 90 igualmente parcimoniosas árvores com 1701 passos, encontrada a

partir da busca heurística do matK mais dados do espaçador. A distribuição dos indels informativos são

mapeados na árvore: m = indel do matK; s = indel do espaçador.

Adaptado: Wilson et al. (2005)

1.2. TRIBO MYRTAE

A Tribo Myrteae (sensu Wilson et al., 2005; Myrtaceae) compreende cerca de

2500 espécies representadas dentro de 49 gêneros (World Checklist of Myrtaceae, 2006). A

tribo é morfologicamente distinta das outras 14 tribos dentro da subfamília Myrtoideae

(Wilson et al., 2005) pela combinação dos seguintes caracteres: frutos indeiscentes e

carnosos, sistema vascular transeptal e a presença de tricomas uni ou pluricelulares (Wilson et

al., 2001).

Segundo Lucas et al. (2007), a tribo Myrteae é composta por seis grandes grupos:

Plinia, Myrcia, Myrceugenia, Myrteola, Pimenta, e Eugenia. Integram o grupo Plinia os

gêneros: Neomitrantrantes, Siphoneugena, Plinia e Myrciaria (Lucas et al., 2007). Estes

podem ser identificados dos outros grupos pelas seguintes características: cotilédones

carnosos, plano-convexos, não fusionados completamente, testa da semente macia; média de

nove óvulos por ovário; óvulos em um único ponto no septo, usualmente abaixo do ponto

médio ou inseridos ao longo de sua parte inferior (Lucas et al., 2007).

Os gêneros que compõem o grupo Plinia inicialmente foram reconhecidos como

pertencendo a subtribo Eugeniinae, junto com os gêneros do grupo Eugenia (Berg, 1857;

Landrum & Kawasaki, 1997). Devido a características embrionárias peculiares às espécies

dos grupos Plinia e Eugenia, De Candolle´s (1828) acreditou que estas espécies mereciam ser

tratadas como um grupo distinto, sendo que anos mais tarde, Berg (1857) reconheceu este

grupo como subtribo Eugeniinae. Desde então esta classificação tem sido adotada por muitos

autores no estudo das espécies deste complexo, apesar de outros estudos terem sido

conduzidos na tentativa de esclarecer as relações entre estas e outras subtribos. Um breve

histórico pode ser acompanhado na Tabela 2.

Apesar da morfologia do embrião sugerir que as espécies da subtribo Eugeniinae

deveriam ser mantidas unidas, outros dados morfológicos levantados por Landrum &

Kawasaki (1997) já insinuavam que os gêneros: Neomitrantrantes, Siphoneugena, Plinia e

Myrciaria deviam pertencer a um grupo distinto.

Tabela 2 - Histórico dos agrupamentos da tribo Myrteae de acordo com diferentes autores. Os táxons associados

com as subtribos descritas por Berg, Myrciinae, Eugeniinae e Myrtinae, são indicados com as tonalidades de

cores clara, intermediária e escura respectivamente.

Adaptado: Lucas et al. (2007)

Análises moleculares subseqüentes utilizando marcador nuclear ITS (Internal

Transcribed Spacer) não suportavam o monofiletismo da subtribo Eugeniinae (Salywon et al.,

2004). Estes resultados corroboram também com análise filogenética realizada por Lucas e

colaboradores (2005) que além do marcador nuclear ITS, utilizaram também o plastidial psbA-

trnH. Dentro desta última análise as espécies de Siphoneugena e Myrciaria aparecem unidas

em um clado, enquanto que as espécies de Eugenia aparecem unidas em outro clado

reforçando a hipótese que a subtribo Eugeniinae sensu Berg (1857) é parafilética (Lucas et al.,

2005).

Myrciinae

Eugeniinae

Myrtinae

Diante disso a reclassificação dos gêneros da Tribo Myrteae (sensu Wilson et al.,

2005) proposta por Lucas et al. (2007) parece ser a que melhor relaciona os gêneros da tribo

(Figura 2).

Figura 2 - Árvore consenso stricto resultante da análise de parcimônia com sucessivas pesagens e análise

Bayseana dos dados obtidos pelos marcadores ITS, ETS, psbA-trnH e matK. Os valores de bootstrap acima de

50% são mostrados acima dos ramos; clados não recuperados dentro das análises Bayesianas são marcados com

setas.

Adaptado: Lucas et al. (2007).

1.3. IDENTIDADE GENÉRICA DAS JABUTICABEIRAS

Essencialmente brasileiras, as jabuticabeiras (usualmente referidas ao gênero

Myrciaria O.Berg) são oriundas do Centro-Sul do Brasil (Figura 3A), apresentando diferentes

arquiteturas, portes e tipos de frutos em muitas regiões. São comumente cultivadas do

extremo sul ao extremo norte do Brasil (Manica, 2000), pois possuem extraordinária

capacidade de adaptação a diversos climas (Chiarelli, et al., 2005; Balerdi et al., 2006).

Apreciadas pelos tradicionais frutos comestíveis (Figura 3B), caracterizados como

um bacídeo globoso de 20 a 30 mm de diâmetro, com uma polpa macia, esbranquiçada e

suculenta, de sabor ligeiramente acídulo, circundada por um epicarpo fino e com quatro

sementes embebidas (Barros et al., 1996; Mota et al., 2002), as jabuticabas possuem grande

qualidade nutricional (Silveira et al., 2006).

Os frutos destas espécies são uma rica fonte de compostos fenólicos, dentre eles a

antocianina (Terci, 2004) caracterizada por apresentar propriedades antioxidantes, auxiliando

na prevenção de doenças (Scalbert & Williamson, 2000). Em cada 100g do fruto (mais ou

menos 15 unidades) aproximadamente são encontradas 60 mg de fósforo, 12,8 mg de

vitamina C, 9 mg de cálcio, 2,4 mg de vitamina B

e 1,26 mg de ferro (Meletti, 2000; Oliveira

et al., 2003).

A peculiaridade da sua floração e conseqüente frutificação (Figura 3C), geralmente

desde as raízes, estendendo-se pelo tronco, ramos e galhos delgados, lhe confere rara beleza,

por esta razão também é considerada uma árvore ornamental, podendo ser potencialmente

utilizada em projetos de paisagismo (Meletti, 2000).

Possui ampla aceitação na preparação de licores, Javinne (análogo ao vinho da

uva), sucos, geléias (que se conserva por vários anos), compostas e vinagre (Andersen &

Andersen, 1988; Manica, 2000). Além disso, o bagaço do fruto ainda pode ser utilizado na

produção de uma farinha que quando fermentada torna-se uma rica fonte de fibras, proteínas e

minerais, constituída de partículas finas com aroma característico do fruto (Ascheri et al.,

2006).

Figura 3 - A) Jabuticabeira (Myrciaria cauliflora); B) jabuticabas; C) jabuticabeira (Myrciaria sp.) na época de

floração.

Fonte: 3A - (

http://www.jabuticabeira.com.br/images/_%20002_jpg.jpg); 3B -

(

http://heartgarden.com.au/images/Jaboticaba.jpg); 3C - (http://niltonloriano.blog.uol.com.br/images/2-

jabuticabeira.jpg).

Além das jabuticabas, espécies como o “camu-camu” (também referido ao gênero

Myrciaria) tem despertado interesse, principalmente da indústria farmacêutica, pelo seu alto

teor de vitamina C (Villachica, 1996), embora os frutos não sejam apropriados para o

consumo in natura devido à acidez da polpa.

As jabuticabeiras e outras espécies do mesmo gênero possuem presença

significativa em inventários realizados em remanescentes de mata atlântica (Rolin et al.,

2006; Konrath & Mondim, 2007), floresta amazônica (Ivanauskas et al., 2004) e no cerrado

(Romagnolo & Souza, 2004; Walter, 2006; Aragão & Conceição, 2008).

Apesar de serem amplamente apreciadas pelo povo brasileiro, de possuir potencial

econômico devido a características nutricionais e produtivas, e de compor áreas de

preservação ambiental, o estudo sobre as jabuticabeiras e espécies afins tem sido limitado

devido à falta de conhecimento sistemático sobre o grupo.

Atualmente as jabuticabeiras e espécies afins são tidas como pertencendo ao

gênero Myrciaria, no entanto a delimitação taxonômica do gênero tem sido considerada

bastante controversa (Landrum & Kawasaki, 1997). A circunscrição dos gêneros Myrciaria e

Plinia é considerada por alguns autores dúbia (Sobral, 1993; Nic Lughadha & Proença, 1996).

Conforme usualmente referido, o gênero Myrciaria ocorre desde o México e do Caribe

estendendo-se até o norte da Argentina, com cerca de 30 espécies, fortemente concentradas no

Brasil, principalmente na região sudeste (Landrum & Kawasaki, 1997). São reconhecidas

dentro do grupo “Plinia” (sensu Lucas et al., 2007) pela combinação das seguintes

características: sementes com cotilédones soldados; cálice decíduo depois da antese;

bractéolas conadas no terço inferior do comprimento; flores geralmente glabras;

inflorescências em glomérulos axilares (Sobral, 1993).

Já o gênero Plinia, conforme usualmente aceito, ocorre desde América Central e

do Caribe até o Brasil, e possui cerca de 20 espécies (Landrum & Kawasaki, 1997). São

caracterizadas dentro do grupo “Plinia” (sensu Lucas et al., 2007) por possuírem: sementes

com cotilédones separados; cálice persistente; bractéolas separadas, pilosas ou não;

inflorescências em glomérulos axilares ou racemos axilares ou caulinares (Sobral, 1993).

Um problema inicial é que, seguindo este critério de identificação,

aproximadamente dezesseis tidas como Myrciaria deveriam passar a ser reconhecidas como

Plinia (Sobral, 1993). Dentre estas espécies estão as jabuticabeiras (Sobral, 1993;

NicLughadha & Proença, 1996).

O estudo dos padrões de nervação das folhas (onde a amostragem incluía cinco

espécies dos gêneros Plinia e Myrciaria), não forneceu subsídios para a delimitação

taxonômica de ambos (Cardoso & Sajo, 2006). Todas as espécies apresentaram padrão

camptódromo-broquidódromo, onde as espécies Myrciaria cuspidata, Myrciaria delicatula e

Plinia rivularis possuíam nervação última marginal incompleta enquanto que Myrciaria

tenella e Plinia trunciflora a possuíam em forma de arco (Cardoso & Sajo, 2006). Destas

cinco espécies, apenas Plinia trunciflora possui nervura intramarginal (Cardoso & Sajo,

2006).

A análise citogenética das espécies: Myrciaria delicatula (DC.) O.Berg; Myrciaria

tenella L.; Myrciaria sp; Plinia cauliflora L. e Plinia glomerata L., conduzida por Costa

(2004) também não foi suficiente para encontrar caracteres adicionais que pudessem

distinguir melhor as espécies pertencentes a cada gênero. Não houve variação no número

cromossômico destas espécies, todas apresentaram 22 cromossomos (Costa, 2004). Myrciaria

trunciflora em estudos subseqüentes apresentou 48 cromossomos (Silveira et al., 2006). A

comparação entre cariótipos das espécies Myrciaria delicatula, Myrciaria tenella e Plinia

cauliflora, mostrou padrão muito semelhante não ajudando desta forma a resolver os

problemas taxonômicos desses gêneros (Costa & Forni-Martins, 2007).

Alguns autores sugerem a possibilidade de Myrciaria ser dividida em dois

gêneros: Myrciaria e Paramyrciaria (Rotman, 1982; Sobral, 1991-93). Estes podem ser

separados devido aos cotilédones que no primeiro aparecem fundidos enquanto que no

segundo aparecem claramente separados (Sobral, 1991-93). Porém esta característica é

considerada insuficiente para sustentar esta divisão (Mcvaugh, 1968; Landrum & Kawasaki,

1997). Além disso, análises posteriores feitas por Sobral (2006), mostram claramente que os

cotilédones das espécies de Myrciaria podem variar de separados para fundidos na mesma

planta.

Além da dificuldade na delimitação do gênero Myrciaria, suas espécies embora

classificadas morfologicamente, apresentam pouca aceitação pela comunidade científica pela

extensa generalização das suas várias espécies (Silveira et al., 2006). Atualmente são

reconhecidas como jabuticaba as espécies: Myrciaria jabuticaba, com frutos pequenos de

pedúnculo escuro, Myrciaria cauliflora, com frutos grandes e sésseis e ainda um forma

conhecida como Myrciaria trunciflora (Silveira et al., 2006).

Dentre as espécies que passariam a ser consideradas Plinia devido aos caracteres

morfológicos está Myrciaria cauliflora (Sobral, 1993), porém dados moleculares exibiram

Myrciaria cauliflora fortemente relacionada com Myrciaria floribunda, separada da Plinia

pauciflora que aparece em um clado unida com espécies de Siphoneugena e Neumitranthes

(Lucas et al., 2007).

A caracterização morfológica e molecular utilizando a técnica de RAPD (DNA

Polimórfico Amplificado Aleatoriamente) com material de herbário revelou que espécies de

jabuticabas reconhecidas como Myrciaria jabuticaba e Myrciaria cauliflora, podem ser

agrupadas em mais duas espécies além das citadas, Myrciaria coronata e Myrciaria

phitrantha, evidenciando sobre o ponto de vista taxonômico a falta de conhecimento sobre

estas espécies (Pereira et al., 2005).

Concluindo, apesar de todo o avanço no que diz respeito ao conhecimento

filogenético do grupo, a identidade genérica das plantas tradicionalmente conhecidas como

“jabuticabeiras” ainda não pôde ser elucidada, assim como a definição dos grupos

considerados mais próximos.

1.4. FILOGENIA MOLECULAR

Apesar das limitações ainda presentes nos métodos filogenéticos, as filogenias

moleculares têm esclarecido relações entre vários grupos, os quais antes eram tidos como

controversos pelas filogenias clássicas, causando desta forma uma profunda reorganização da

biodiversidade conhecida (APG, 2003). Atualmente diversos estudos vêm sendo conduzidos

utilizando-se desta ferramenta, para tentar restabelecer a origem e o grau de parentesco de

grandes grupos (Qui et al., 2000; Soltis et al., 2002; Hilu et al., 2003; Halanych, 2004), assim

como os grupos mais restritos (Chat et al., 2004; Lohmann, 2006; Gonçalves et al., 2007).

No estudo sistemático das plantas, o gene da maturase K (matK) tem sido

amplamente recomendado para resolver relações filogenéticas dos mais restritos até os mais

amplos níveis taxonômicos (Johnson & Soltis, 1994; Hilu & Liang, 1997; Hilu et al., 2003).

A região (Figura 4) possui cerca de 1500 pares de base e fica localizado dentro do intron trnK

no cloroplasto (Hilu & Liang, 1997).

Figura 4 - Representação do posicionamento do matK.

Dos marcados utilizados no estudo filogenético, o matK quando comparado com

outros marcadores plastidiais (como rbcL e trnL-F, por exemplo), além de apresentar sinal

filogenético maior, contribui com mais caracteres parcimoniosos e conseqüentemente pode-se

obter uma árvore filogenética mais robusta (Muller et al., 2006). Além disso, o matK destaca-

se dos outros marcadores no estudo sistemático das angiospermas, por apresentar elevadas

taxas de substituição nucleotídica, mutações não sinônimas e eventos de inserção e deleção

(Johnson & Soltis, 1994; Hilu & Liang, 1997).

As altas taxas de caracteres variáveis e as mutações não sinônimas estão

associadas a distribuições das substituições nucleotídicas que geralmente acontecem na

terceira base do códon, enquanto que no matK ocorrem com freqüência similar nas três bases

(Barthet & Hilu, 2007).

Com o propósito de fortalecer as árvores filogenéticas dando-lhes maior suporte,

dados de regiões do DNA ribossomal tem sido incorporados nas análises. O marcador

molecular nuclear mais comumente utilizado para reconstruir filogenias de plantas no nível

intrafamiliar é o ITS (Internal Transcribed Spacer) (Baldwin et al., 1995). Dentro de um

levantamento realizado por Alvarez & Wendel (2003) nas revistas mais proeminentes revelou

que nos últimos cinco anos que antecedem a publicação, 66% dos artigos inclui seqüências do

ITS, e 34% da hipóteses filogenéticas publicadas tem sido baseadas exclusivamente nas

seqüências do ITS.

O ITS (Figura 5) é um espaçador intergênico localizado entre os genes 18S e 28S,

englobando o gene 5,8S. Possui cerca de 500 a 600 pares de base em angiospermas, incluindo

o gene 5,8S (Baldwin et al., 1995). O uso intenso do ITS tem sido associado a um conjunto de

características peculiares ao marcador, tais como: herança biparental, simplicidade,

universalidade dos primers, uniformidade intragenômica, variabilidade intergenômica e

limitação funcional mínima (Alvarez & Wendel, 2003).

Figura 5 - Representação do posicionamento do ITS.

No entanto, dentro do DNA ribossomal, podem ser facilmente encontrados genes

parálogos (Figura 6). Em plantas, muitos são reconhecidos no estudo do ITS e de outras

regiões nucleares (Dubcovsky & Dvorák, 1995; Alvarez & Wendel, 2003). Parálogos são

genes relacionados (Figura 6) resultado de um evento de duplicação dentro de um genoma

(Alberts et al., 2004).

Figura 6 - Disposição dos genes 18S, 5.8S e 28S, intercalados pelo ITS, exemplificando uma região paráloga.

NTS, nontranscribed spacer, ETS, external transcribed spacer, ITS, internal transcribed spacer.

Fonte: (

http://en.wikipedia.org/wiki/Ribosomal_DNA).

Os parálogos podem comprometer a reconstrução filogenética das espécies em

estudo, pois a taxa de mutação entre os dois genes pode ser diferente (Bucker IV et al., 1997;

Alvarez & Wendel, 2003). Simulações realizadas indicam que análises filogenéticas

utilizando genes parálogos raramente geram uma árvore filogenética coesa (Sanderson &

Doyle, 1992; Chase et al., 2005).

Entretanto, outros estudos têm demonstrado que regiões gênicas que apresentam

várias cópias no genoma de um indivíduo, como os genes parálogos, dificilmente evoluem

independentemente (Dover & Coen, 1981). Uma grande similaridade foi observada entre

seqüências nucleotídicas de genes repetitivos quando comparados dentro uma espécie (Elder

& Turner, 1995). Quando as mesmas seqüências foram comparadas com as de outras espécies

foi diagnosticado um nível de divergência elevado (Elder & Turner, 1995). Este processo

molecular que leva a homogeneização das seqüências de DNA que apresentam múltiplas

cópias dentro da mesma espécie ficou conhecido como “Concerted Evolution” (Elder &

Turner, 1995).

Dois mecanismos são sugeridos como principais responsáveis pela conservação

deste processo: conversão do gene e permuta (crossing-over) desigual entre cromátides

(Schlotterer & Tautz, 1994).

Apesar das limitações do espaçador intergênico ITS, o seu uso, assim como o gene

matK, possui ampla aceitação para trabalhos filogenéticos. Possuem regiões bem conservadas

que podem ser amplificadas por uma ampla variedade de primers, além de regiões não tão

conservadas, potencialmente informativas na determinação das relações filogenéticas entre as

espécies (Stoeckle, 2003). Além disso, têm sido potencialmente utilizados nas estimativas

filogenética propostas para a família Myrtaceae (O’Brien et al, 2000; Wilson et al, 2001; Lam

et al, 2002; Lucas et al., 2005; Wilson et al, 2005; Lucas et al., 2007). Ambos marcadores

têm sido sugeridos como promissores para serem utilizadas em projetos DNA barcoding

(Stoeckle, 2003).

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral deste trabalho consiste em propor uma hipótese filogenética para

o complexo Plinia – Myrciaria, subsidiando a circunscrição dos grupos envolvidos neste

complexo, além de identificar a identidade genérica das populares jabuticabas. Com

resultados obtidos pretende-se fornecer um suporte sistemático adequado para o complexo,

proporcionado desta maneira subsídios para futuros programas de melhoramento genético e

desenvolvimento de cultivares mais regulares e produtivos das jabuticabas.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Verificar o grau de parentesco entre os gêneros do complexo Plinia (Myrciaria,

Paramyrciaria, Plinia, Siphoneugena e Neomitranthes) usando o máximo de espécies e

cultivares possíveis.

 Verificar a legitimidade da delimitação morfológica dos gêneros Myrciaria e Plinia

confrontando-os com dados moleculares.

 Elucidar a identidade genérica das jabuticabas, observando a disposição filogenética

das espécies tradicionalmente consumidas com esta denominação.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAL AMOSTRADO

Ao todo, foram utilizadas 67 espécies, conforme listado na Tabela 3. Amostras em

gel de sílica foram gentilmente coletadas pela equipe do Instituto Plantarum de Estudos da

Flora. Foram também utilizadas espécies com seqüências de DNA disponíveis no NCBI

(Tabela 4). Coletas e identificações foram realizadas por Harri Lorenzi e pelo fruticultor e

colecionador de espécies nativas Marco Túlio Cortes de Lacerda (ambos autores do livro

Frutas Brasileiras e Exóticas Cultivadas), além da equipe do Instituto Plantarum. Voucheres

destes materiais encontram-se em análise por Carolyn E.B. Proença (UnB).

A amostragem visava obter o maior número possível de amostras de

jabuticabeiras, desde as formas mais usuais (referidas como M. cauliflora, M. trunciflora e M.

jaboticaba) até as jabuticabas “caipiras” (M. aureana, M. phitrantha, M. oblongata, etc). Até

pelo caráter de prospecção trazido por esta primeira abordagem molecular para este grupo

específico, mesmo espécies não identificadas de jabuticabeiras foram incluídas. Além disso,

buscou-se trazer o maior número possível de espécies de Myrciaria sensu stricto, além de

Plinia e outros grupos do complexo Plinia.

Tabela 3 - Espécies utilizadas na análise filogenética.

GÊNERO ESPÉCIE VOUCHER

ORIGEM

Eugenia Eugenia monosperma Vell. 2116 - RT Iguape - SP

Psidium Psidium sp. 2166 - RT Piracicaba - SP

Marlierea Marlierea tomentosa Cambess. 2073 - RT

Santana do Paraíso - MG

Marlierea sucrei G.M. Barroso & Peixoto sem voucher

Sooretama - ES

Siphoneugena Siphoneugena widegreniana O. Berg 124 - RS Sem identificação

Neomitranthes

Neomitranthes gembalae (D. Legrand) D. Legrand 2202 -RT Sem identificação

Myrciaria aureana Mattos 1045 - ML Duque de Caxias - RJ

Myrciaria aureana Mattos sem voucher

Dona Euzébia – MG

Myrciaria aureana Mattos sem voucher

Sooretama - ES

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg 6404 - HL Una - BA

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg ML - 1004 Campinas - SP

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg ML - 1007 Mococa - SP

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg ML - 1008 Mococa - SP

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg ML - 1009 Limeira - SP

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg 2071 - RT Fervedouro - MG

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg 2175 - RT Santa Tereza - ES

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg 2087 - RT Cataguases - MG

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg 2077 - RT

Santana do Paraíso - MG

Myrciaria coronata Mattos ML - 1026 Barbacena - MG

Myrciaria Myrciaria coronata Mattos ML - 1010 Limeira - SP

Myrciaria cuspidata O. Berg 6350 - HL Ibiraiaras - RS

Continuação da tabela 3.

*Myrciaria delicatula (DC.) O. Berg sem voucher

Ibiraiaras - RS

Myrciaria ferruginea O. Berg sem voucher

Sooretama - ES

*Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G.M. Barroso ex Sobral

sem voucher

Brumadinho - MG

Myrciaria floribunda (H. West ex Willd.) O. Berg sem voucher

Ibiraiaras - RS

Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg ML - 1003 Campinas - SP

Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg ML - 1006 Mococa - SP

Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg sem voucher

Açucena - MG

Myrciaria oblongata Mattos sem voucher

Sem identificação

Myrciaria oblongata Mattos sem voucher

Sem identificação

Myrciaria phitrantha (Kiaersk.) Mattos ML - 1002 Campinas - SP

Myrciaria phitrantha (Kiaersk.) Mattos ML - 1005 Campinas - SP

Myrciaria phitrantha (Kiaersk.) Mattos 2167 - RT Piracicaba - SP

Myrciaria plinioides D. Legrand 6432 - HL Ibiraiaras - RS

Myrciaria spirito-santensis Mattos 2051 - RT Sooretama - ES

Myrciaria spirito-santensis Mattos 2058 - RT Malacacheta - MG

*Myrciaria strigipes O. Berg 2050 - RT Sooretama - ES

Myrciaria tenella (DC.) O. Berg sem voucher

Sooretama - ES

Myrciaria trunciflora O. Berg 2152 - RT

São Mateus do Sul - PR

Myrciaria trunciflora O. Berg 2108 - RT Iporanga - SP

Myrciaria trunciflora O. Berg 2113 - RT Jacupiranga - SP

Myrciaria trunciflora O. Berg 2153 - RT

São Mateus do Sul - PR

Myrciaria trunciflora O. Berg 6354 - HL Osório - RS

Myrciaria vexator McVaugh 1051 - ML Duque de Caxias - RJ

Myrciaria Myrciaria sp. 2172 - RT Vargem Alta - ES

Myrciaria sp. 2066 - RT Manhuaçu - MG

Myrciaria sp. 2157 - RT Sem identificação

Myrciaria sp. 2174 - RT Santa Tereza - ES

Myrciaria sp. 6389 - HL Taperoá - BA

Myrciaria sp. 6415 - HL Jussari - BA

Myrciaria sp. 6386 - HL Cachoeira - BA

Myrciaria sp. 6391 - HL Ibirapitanga - BA

Myrciaria sp. 6393 - HL Ibirapitanga - BA

Myrciaria sp. 6369 - HL Ondina - BA

Myrciaria sp. 6387 - HL Cachoeira - BA

Myrciaria sp. 6388 - HL Taperoá - BA

Myrciaria sp. 6392 - HL Ibirapitanga - BA

Myrciaria sp. sem voucher

Ilhéus - BA

Myrciaria sp. 1001 - ML Jaboticabal - SP

Myrciaria sp. sem voucher

Dona Euzébia - MG

Plinia brchybotrya (D. Legrand) Sobral 2504 - RT Sem identificação

Plinia edulis (Vell.) Sobral sem voucher

Sete Barras - SP

Plinia hatschbachii (Mattos) Sobral 1050 - ML Duque de Caxias - RJ

Plinia Plinia nana Sobral 2211 - RT Felício dos Santos

Plinia renatiana Barroso & Peixoto sem voucher

Sooretama - ES

Plinia rivularis (Cambess.) Rotman 2106 - RT Itapetininga - SP

Plinia sp. 6416 - HL Jussari - BA

* Espécies atribuídas ao gênero Paramyrciaria sensu Sobral (1991)

Tabela 4 - Espécies utilizadas na análise filogenética, retiradas do NCBI

Espécie Marcador

N° do GenBank

Eucalyptus globulus subsp. globulus matK AY780259

Eucalyptus globulus subsp. globulus ITS AF058467

Plinia pauciflora ITS AM489411

Neomitranthes cordifolia ITS AM489410

Siphoneugena densiflora ITS AM489412

Siphoneugena guifolyleana ITS AM234085

3.2. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

O DNA foi extraído pelo método CTAB (Doyle & Doyle, 1987), modificado para

o uso em sistema FastPrep® (Krackeler Scientific, Inc.). Tal metodologia já foi previamente

testada nos laboratórios da Universidade Católica de Brasília, com excelentes resultados. O

DNA total foi testado quanto a sua integridade por visualização em gel de agarose a 0,7-1%.

A solução de DNA foi então aliquotada e mantida a -20

C para análises posteriores.

3.3. REAÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO

Para as reações de amplificação, desenvolvidas em um volume de 20 µl,

empregou-se: 9 ng de DNA, 3 µM de cada primer, 2 unidades de Taq polimerase, 2X tampão

de reação (10mM Tris-HCl; pH8,3; 50mM KCl), 2,5 mg/ml de BSA (Albumina de Soro

Bovino) e 200µM de dNTP. As reações ocorreram nas seguintes condições: 94° por dois

minutos (1 ciclo), 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto (30 ciclos),

72°C por 10 minutos (1 ciclo) e 4°C por tempo indeterminado.

Os produtos de PCR foram purificados com fosfatase alcalina de camarão (SAP) e

Exonuclease I (Exo) na proporção de 9:1. Foi utilizado 1 µl da solução de ExoSAP para cada

5µl do produto de PCR.

Os primers utilizados para as reações de amplificação e seqüenciamento estão

listados na tabela 5.

Tabela 5 - Lista de primers utilizados nas reações de amplificação e seqüenciamento do gene matK e do

espaçador intergênico ITS .

Primer Sequencia nucleotídica Fonte

matK

2288R AACTAGTCGGATGGAGTAG Steele & Vilgalys (1994)

1398F ATACTTCGACTTTCTTGTGT O'Brien et al. (2000)

2519R TTTACGAGCCAAAGTTTTAA Gadek et al. (1996)

2516F TATGCACTTGCTCATGATCA Gadek et al. (1996)

2520R GATCCTTCCTGGTTGAAACCAC Gadek et al. (1996)

6F TCTSCGTAASCAATCTTCTC Pell (2004)

ITS

75F TATGCTTAAACTCAGCGGG Desfeux & Lejeune (1996)

92R AAGGTTTCCGTAGGTGAAC Desfeux & Lejeune (1996)

17SE ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG

Sun et al. (1994)

26SE TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC

Sun et al. (1994)

5.8S ACGACTCTCGGCAAC Sun et al. (1994)

5.8R GCGTGACGCCCAGGC Sun et al. (1994)

3.4. SEQUENCIAMENTO

As reações de seqüenciamento foram processadas no seqüenciador automático

MegaBace, utilizando DYEnamic ET DYE Terminator Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare).

Para cada reação utilizou-se 4 µl de “sequencing reagent premix”, 2 µl de primer a 1 mM, 2

µl de água e 60 a 100 ng do DNA purificado, com as seguintes condições para PCR: 95°C por

20 segundos, 55°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto (30 vezes).

Logo após o termino da reação de PCR, o DNA foi purificado com etanol, de

acordo com as recomendações sugeridas pelo fabricante.

3.5. ALINHAMENTO

Os fragmentos das seqüências obtidas, sense e antisense, foram montadas no

desempenhados automaticamente utilizando-se o software Clustal X (Thompson et al., 1994),

otimizados manualmente seguindo as diretrizes propostas por Kelchner (2000). Eventos de

inserção/deleção foram codificados como sugerido por Simmons & Ochoterena (2000) e

inseridos no final da matriz de seqüências apenas para análise de Máxima Parcimônia.

3.6. ANÁLISES FILOGENÉTICAS

3.6.1. Teste de Incongruência

Foi utilizado o teste de ILD (Incongruence Length Difference) (Farris et al., 1994),

para estimar o grau de congruência da combinação dos dados fornecidos pelos marcadores

moleculares (ITS e matK). Para realizar está análise utilizou-se o programa PAUP v.4.0b10

(Swofford, 2002).

Caracteres não informativos foram excluídos da análise (Lee, 2001), que consistiu

de 10000 réplicas. O índice de significância adotado foi o proposto por Cunningham (1997)

que rejeita a hipótese de combinação dos dados quando P ≤ 0,01 (Gonçalves et al., 2007).

3.6.2. Máxima Parcimônia

O programa PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2002) foi usado para a análise de

parcimônia, com caracteres de peso igual e tratados como não ordenados (Fitch, 1971). As

análises consistiram de 1000 replicatas usando “random sequence addition”. Permutações de

ramos foram realizadas por meio do algoritmo “tree bisection-reconnection” (TBR), salvando

as 20000 árvores mais parcimoniosas (opção MULTREES ativada) e usando “accelerated

character transformation” (ACCTRAN). O suporte dos clados foi obtido com 10.000

replicatas de “bootstrap”, mantendo apenas uma única árvore por replicata. Valores de

“Bootstrap” abaixo de 70% foram considerados pouco suportados, valores entre ≥70% e

<90% foram considerados moderadamente suportados e ≥90% foram considerados fortemente

suportados, conforme sugerido por Shaffer et al. (1997).

3.6.3. Inferência Bayesiana

A seleção de modelos de evolução molecular foi realizada pelo programa não

publicado MrModelTest 2.2 (© J.A.A.Nylander, 2004), uma versão modificada do Modeltest

3.06 (Posada & Crandall, 1998). O “teste hierárquico de razão de verossimilhança” (hLRT)

foi utilizado para selecionar o melhor modelo.

A análise de Inferência Bayesiana (BI) (Huelsenbeck & Ronquist, 2001) foi

realizada usando o programa MrBayes 2.01 (© John P. Huelsenbeck & Fredrik Ronquist,

2001). Cadeias Markov-Monte Carlo foram utilizadas e as árvores obtidas antes da

estabilização das verossimilhanças foram desprezadas. Probabilidades posteriores ≥95%

foram consideradas como um suporte robusto para os clados (Gonçalves et al., 2007).

4. RESULTADOS

As medidas de apoio estatístico para a análise de parcimônia dos marcadores matK

e ITS estão sumarizados na Tabela 3. As árvores consenso geradas na análise de parcimônia

do marcador ITS exibiram melhor resolução quando comparadas com as do matK, mas vale

salientar que para análise do ITS foram utilizadas um número menor de espécies. Árvores

filogenéticas oriundas da analise bayesiana exibiram índices de suporte superior aos da

parcimônia, porém a análise bayesiana do marcador ITS mostrou-se pobremente resolvida. Os

resultados das análises divergiram em alguns pontos quando comparadas entre si.

O teste de ILD detectou um índice significativo (P=0,0002) que rejeita a hipótese

da analise com os dados combinados. Por esta razão assim como: Reeves et al. (2001);

Muschner (2005), o conjunto de dados obtidos para cada marcador foi trabalhado

isoladamente.

Tabela 6 - Sumário dos marcadores matK e ITS.

matK ITS

de caracteres

1473 571

N° de caracteres variáveis

101 83

N° de caracteres informativos para parcimônia

65 60

N° de passos

236 239

Índice de Consistência (CI)

0,737 0,707

Índice de Retenção (RI)

0,81 0,680

Índice de Consistência reescalonado (RC)

0,597 0,481

Índice de homoplasia (HI)

0,263 0,293

4.1. MARCADOR NUCLEAR (ITS)

A matriz alinhada utilizada continha 571 caracteres, abrangendo grande parte dos

espaçadores ITS1 e ITS2, além de todo o gene 5,8S.

As árvores consenso geradas pelas análises de parcimônia e bayesiana (Figura 7 e

8) foram essencialmente similares nos clados apicais, mas variou no posicionamento dos

clados basais.

4.1.1. Análise de Parcimônia

Foram utilizados 571 caracteres dos quais 83 variaram, mas somente 60 foram

informativos para parcimônia. As 20000 árvores mais parcimoniosas tinham 239 passos, com

os valores de CI = 0, 707; RI = 0, 680; RC = 0,481; HI = 0,293. A árvore filogenética de

consenso stricto derivada da análise de parcimônia apresenta boa resolução interna, porém

com baixo índice de suporte. No cladograma (Figura 7), o “complexo Plinia” surge como

grupo monofilético e apresenta dois clados principais, denominados neste estudo como 7A e

7D. Dentro clado 7A podem ainda ser reconhecidos dois clados menores: 7B e 7C.

Marlierea tomentosa surgiu sem muita resolução próxima ao grupo externo

Eucalyptus globulus subsp. globulus. Subseqüente a M. tomentosa encontra-se o clado 7A

suportado com baixo índice de suporte (< 50% bs), porém com boa resolução interna. Dentro

de um dos seus clados, 7B, estão agrupadas as jabuticabeiras comumente cultivadas

(Myrciaria jabuticaba, M. trunciflora e M. cauliflora), assim como as jabuticabas menos

comuns , M. aureana e M. phitrantha, além de Eugenia monosperma. A resolução interna

deste clado é baixa, além de ser pobremente sustentado (< 50% bs). Um aspecto interessante é

que nenhuma das espécies de jabuticaba com mais de um acesso amostrado formou um grupo

monofilético isoladamente.

Aparecendo como grupo irmão do clado 7B tem-se o 7C, o qual apresenta-se bem

resolvido, mas fracamente suportado (< 50% bs). Dentro deste estão inclusas as espécies

amostradas de Plinia (que inclui P. rivularis, P. renatiana, P. edulis, P. pauciflora),

Neomitranthes cordifolia, Siphoneugena densiflora e S. guilfoyleiana. Dentre estas espécies,

unidas com altos índices de suporte estão as Siphoneugena e Neomitranthes (89% bs), e com

98% bs estão P. rivularis, P. renatiana.

Reunidas no clado 7D, formando um grupo monofilético, estão outro grupo das

espécies do gênero Myrciaria, o que põe o gênero como parafilético. O clado surge com

resolução regular e agrupa as espécies: Myrciaria sp., M. strigipes, M. ferruginea, M. tenella,

M. floribunda e M. cuspidata.

Figura 7 - Árvore de consenso stricto derivada da análise de parcimônia para o marcador nuclear ITS. Para os

ramos com índices de bootstrap acima de 50%, o valor foi indicado acima de cada ramo. Os principais clados

foram denominados: 7A, 7B, 7C e 7D. As espécies marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências

nucleotídicas foram retiradas do Genbank.

4.1.2. Análise Bayesiana

A árvore filogenética obtida a partir da análise bayesiana (Figura 8) apresentou

resolução inferior à obtida pela parcimônia, mostrando-se também pobremente sustentada.

Dois clados principais emergem desta árvore, intitulados como 8A e 8E.

Saindo junto com o grupo externo tem-se o clado 8E, onde as espécies

Siphoneugena densiflora e S. guilfoyleiana aparecem num mesmo clado pouco sustentado

(67% pp).

Neomitranthes cordifolia aparece na base do cladograma junto com o grupo

externo Eucalyptus globulus subsp. globulus. Logo em seguida, fracamente suportado (62%

pp) e com baixa resolução interna, surge o clado 8A. Dentro deste clado, Plinia edulis e P.

pauciflora aparecem sem muita resolução dentro de uma politomia, seguidas por três clados:

8B, 8C e 8D.

Agrupadas no clado 8B, medianamente sustentadas (79% pp), estão as

jabuticabeiras (Myrciaria jabuticaba, M. trunciflora e M. cauliflora), junto com: Marlierea

tomentosa, Plinia sp., Eugenia monosperma, , M. aureana e M. phitrantha.

Unidas no clado 8C estão outras espécies do gênero Myrciaria. Este clado

apresenta-se bem resolvido, formando um grupo monofilético, mas, assim como os outros

clados, com poucos clados internos fortemente suportados.

Robustamente sustentadas (100% pp), Plinia rivularis e P. renatiana aparecem

relacionadas dentro do clado 8D. Ao contrário da análise de parcimônia, as espécies do

gênero Plinia aqui não surgem reunidas dentro de um clado.

Figura 8 - Árvore consenso derivada da análise bayesiana, para o marcador nuclear ITS. Para os ramos com

índices de probabilidade posterior acima de 50%, o valor foi indicado abaixo de cada ramo. Os principais clados

foram denominados: 8A, 8B, 8C, 8D e 8E. As espécies marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências

nucleotídicas foram retiradas do Genbank.

4.2. MARCADOR PLASTIDIAL (matK)

A matriz do matK utilizada continha 1473 caracteres. Nas análises foram utilizadas

quase toda a seqüência nucleotídica do matK, faltando apenas 120 bases para completa-lá a

partir da extremidade 3’, para todas as espécies amostradas. Além disso, foram utilizadas 189

bases do intron TrnK, que antecede a extremidade 5’ do matK.

Assim como na análise do marcador ITS, as árvores filogenéticas geradas a partir

das análises de parcimônia e bayesiana (Figura 9 e 10) apresentaram vários pontos em

comum, como também divergiram em alguns aspectos.

4.2.1. Análise de Parcimônia

Dos 1473 caracteres, 101 variaram, porém apenas 65 foram informativos para a

parcimônia. As 20000 árvores mais parcimoniosa tiveram 236 passos, com CI = 0,737; RI =

0,81; RC = 0,597; HI = 0,263.

A partir da análise de parcimônia obteve-se uma árvore filogenética (Figura 9)

com uma boa resolução interna, porém com índices de suporte ainda baixos.

Nesta análise, um aspecto surpreendente é o surgimento de Plinia hatschbachii em

uma politomia que também inclui Eucalyptus. Os outros grupos supostamente externos

utilizados (Psidium sp., Marlierea tomentosa e Marlierea sucrei) surgem em seguida, também

sem muita resolução na porção basal do cladograma logo depois do grupo externo. Com

exceção de Plinia hatschbachii, todas as outras espécies amostradas do “complexo Plinia”

surgem em um único clado (9A+9E). O clado 9A surge com boa resolução interna, mas

fracamente suportado (< 50% bs). Dentro do clado 9A foi possível reconhecer três clados

menores: 9B, 9C e 9D, além de Plinia rivularis, que aparece isolada.

As jabuticabeiras comestíveis surgem todas no clado 9B, que tem como grupo

basal Plinia edulis. Além das jaboticabas, surgem também neste clado: Plinia nana e Eugenia

monosperma. Conforme já visto nas análises com o marcador ITS, aqui também se repete o

aspecto de que nenhuma das espécies com mais de um acesso amostrado surge como um

grupo monofilético.

O clado 9C mostra-se fortemente suportado (100% bs), e é formado apenas por

Siphoneugena widegreniana e Neomitranthes gembalae. O clado 9D aparece logo em

seguida, apresentando também elevado índice de suporte, unindo Myrciaria sp. (2157-RT) e

M. delicatula, cujo basiônimo também foi a espécie tipo de Paramyrciaria.

O clado 9E surge com as espécies restantes de Myrciaria (Myrciaria tenella, M.

cuspidata, M. ferruginea, M. vexator, M. plinioides, M. strigipes e M. glazioviana), além duas

espécies de Plinia.

Figura 9 - Árvore de consenso derivada da análise parcimônia, para o marcador plastidial matK. Nos ramos com

índices de bootstrap acima de 50%, o valor foi indicado acima de cada ramo. Os principais clados foram

denominados: 9A, 9B, 9C, 9D e 9E. As espécies marcadas com um asterisco (*) não possuem voucher, nem

origem. Aquelas marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências nucleotídicas foram retiradas do Genbank.

4.2.2. Análise Bayesiana

Com a análise bayesiana foi possível obter um cladograma (Figura 10) que se

assemelha bastante ao da parcimônia, divergindo em detalhes da topologia. A árvore

apresentou boa resolução, mas novamente com baixos índices de suporte.

Os supostos grupos externos sugiram um pouco melhores resolvidos que na

análise de parcimônia, mas repete-se aqui o surgimento de Plinia hatschbachii junto a uma

espécie de Psidium, na base do cladograma. Marlierea tomentosa e M. sucrei aparecem

dentro de uma politomia, como grupos irmãos do clado contendo o restante das espécies do

“complexo Plinia” (com excessão de P. hatschbachii). Dentro do “complexo Plinia”, foi

possível reconhecer três clados principais, denominados: 10A, 10E e 10F. O clado 10A surge

primeiro, com baixo índice de suporte, mas com três clados internos definidos:10B, 10C,

10D. As espécies que integram cada um destes clados foram as mesmas observadas nos

subclados: 9B, 9C, 9D respectivamente. O subclado 10B mantém a baixa resolução interna e

o fraco índice de suporte observado em 9B, como também o índice de suporte elevado de 9C

e 9D é mantido para 10C (100% pp) e 10D (100% pp).

O clado 10E mantém exatamente a mesma constituição interna do clado 9E,

mostrando-se bem resolvido, porém sem significativo índice de suporte. Um dado observado

nesta abordagem que não foi obtido na parcimônia foi o clado 10F que sai junto com o grupo

externo, unindo Plinia hatschbachii e Psidium sp. (64% pp).

Figura 10 - Árvore de consenso derivada da análise bayesiana, para o marcador plastidial matK. Nos ramos com

índices de probabilidade posterior acima de 50%, o valor foi indicado abaixo de cada ramo. Os principais clados

foram denominados: 10A, 10B, 10C, 10D, 10E e 10F. As espécies marcadas com um asterisco (*) não possuem

voucher, nem origem. Aquelas marcadas com dois asteriscos (**), suas seqüências nucleotídicas foram retiradas

do Genbank.

5. DISCUSSÃO

5.1. INCONGRUÊNCIA ENTRE OS COMPARTIMENTOS GENÔMICOS.

O elevado índice de incongruência obtido a partir do teste ILD (P=0,0002) para

análise conjunta dos marcadores matK e ITS, sugere que as partições sejam considerados

individualmente até que mais informações estejam disponíveis (Cunningham, 1997). A

combinação de dados não congruentes pode gerar uma árvore filogenética que não retrata a

correta história evolutiva da tribo, ou pode diminuir a precisão filogenética em relação às

partições tratadas individualmente (Bull et al., 1993; Cunningham, 1997).

Índices de incongruência significativos, para análises moleculares, podem indicar a

incidência de processos biológicos tais como: duplicação de gene, introgressão e hibridização

na espécie (Page & Homes, 1998). Os genes oriundos de eventos como estes interferem nas

análises filogenéticas pelas possíveis histórias evolutivas diferentes, assim como diferenças

nas taxas de substituição nucleotídica (Page & Homes, 1998; Barker & Lutzoni, 2002). Neste

contexto o teste de IDL tornou-se um procedimento padrão nas análises filogenéticas

envolvendo dois ou mais fragmentos de genes distintos (Ramirez, 2006).

Hibridização e introgressão são os fenômenos que mais comumente ocorrem em

plantas, pois exercem um papel importante na sua diversificação e evolução (Rieseberg, 1997;

Soltis & Soltis, 1999). Porém, em análises com dados combinados, tanto em plantas quanto

em animais, topologias conflitantes podem ser observadas quando o indivíduo amostrado é de

origem híbrida (Normark & Lanteri, 1998; Kim & Donoghue, 2008).

Estudos realizados por Kim & Donoghue (2008) utilizando três marcadores

plastidiais (matK, psbA e trnL-F) e um nuclear (ITS) demonstram altos índices de

incongruência quando os marcadores plastidiais foram combinados com o ITS. Não houve

índice significativo que rejeitasse a análise conjunta dos marcadores plastidiais. Além disso,

as topologias oriundas da combinação do matK, psbA e trnL-F quando comparadas com a do

ITS mostraram-se contraditórias em vários aspectos. Os autores (Kim & Donoghue, 2008)

atribuem estes resultados a possível ocorrência de eventos de hibridização.

Dentro de outra abordagem filogenética, desta vez utilizando o DNA mitocondrial,

além do plastidial e nuclear (Tsutsui et al., 2009), o teste de ILD apresentou resultados

significativos, rejeitando a combinação dos dados . Desta vez os marcadores plastidial e

nuclear mostraram-se congruentes. Análises filogenéticas realizadas com estes marcadores

isoladamente obtiveram topologias muito similares. Contudo, as disparidades foram

diagnosticadas quando adicionado o DNA mitocondrial, o qual apresentou uma topologia

distinta a dos outros marcadores. Sugeriu-se como possível causa para esta divergência

eventos de introgressão (Tsutsui et al., 2009).

Rieseberg et al. (1996) relatam no seu trabalho, duas listas, uma com 61 títulos

que apontam índices significativos de incongruência devido a introgressão e a na segunda, 17

casos de incongruência atribuídos a hibridização. Também pode ser encontrada, de forma

resumida, uma terceira lista com detalhes de como essa informação pode ser usada para

elucidar a verdadeira história filogenética do organismo (Rieseberg et al., 1996).

Vários autores têm questionado a veracidade dos resultados obtidos a partir do

teste ILD, utilizado neste trabalho (Yoder et al., 2001; Ramirez, 2006). Outros, porém,

advogam a seu favor, remendando o seu uso (Cunningham, 1997; Hipp et al., 2004). Dentro

de uma avaliação realizada para medir o grau de eficácia dos testes estatísticos de

incongruência mais comumente utilizados concluiu-se que o teste de ILD obteve o melhor

desempenho em prever quando o conjunto de dados pode ser combinado (Cunningham,

1997).

Os resultados aqui apresentados demonstram uma pequena incongruência,

especialmente no que concerne ao posicionamento das espécies amostradas de Plinia e na

posição relativa das Myrciaria sensu stricto. Supondo verdadeira tal incongruência detectada

pelo teste IDL, este aspecto certamente denota as diferenças geradas por eventos de

reticulação sobre a linhagem plastidial e a linhagem nuclear. Altos índices de reticulação

seriam bem esperados em Myrtaceae neotropicais, que são bastante uniformes em morfologia

floral (Nic Lughadha & Proença, 1996) e tendem a florescer na mesma época do ano (Lorenzi

et al., 2006).

5.2. ANÁLISE FILOGENÉTICA

Ambos os marcadores utilizados apresentaram baixa variabilidade genética para o

grupo estudado. Esta alta similaridade genética pode ser decorrente da recente e rápida

especiação dentro da tribo ou por uma diminuição na taxa de divergência causada por outros

fatores (Lucas et al., 2007).

As árvores filogenéticas obtidas através da análise bayesiana mostraram-se melhor

sustentadas quando comparadas com as da análise de parcimônia, o que corrobora com

estudos realizados por outros autores (Alfaro et al., 2003; Erixon et al., 2003). A medida de

suporte bootstrap comumente utilizada na análise de parcimônia necessita de variabilidade

genética elevada para que possa chegar a árvore que melhor explique as relações filogenéticas

e evolutivas da tribo. Enquanto que as probabilidades posteriores, medida adotada pela análise

bayesiana, fornece altos valores de suporte para topologias que delimitam bem as relações

evolutivas e filogenéticas, necessitando de poucos caracteres (Alfaro et al., 2003). No entanto

a medida bootstrap por ser mais conservativa é menos propensa a dar suporte a árvores

filogenéticas que não retratem a correta história evolutiva do grupo (Douady et al, 2003).

Na comparação realizada entre as árvores filogenéticas obtidas para os marcadores

ITS e matK, observou-se pontos visivelmente divergentes, dando robustez a convicção de que

os marcadores tem histórias evolutivas distintas, hipótese já apontada pelo teste de IDL.

Processos de reticulação possivelmente contribuíram para discordâncias entre as topologias

obtidas (Koblmüller et al., 2007).

As estimativas filogenéticas obtidas nas análises dos gêneros Myrciaria, Plinia,

além de outros grupos próximos, ainda que preliminar, mostraram-se bastante promissoras no

sentido dos resultados apresentados concordarem com que vem sendo proposto por outros

autores utilizando dados morfológicos (Sobral, 1991; 1993). Assim como em estudos

moleculares prévios (Mazine, 2006) o presente conjunto de resultados suporta a conclusão

que Myrciaria e Plinia, conforme aceitos na taxonomia corrente, não são monofiléticos.

Sobral (1993) sugeriu que as espécies tidas como Myrciaria, que apresentem

cálice persistente depois da antese e bractéolas separadas, fossem transferidas para Plinia,

pois estas características são peculiares ao gênero. Neste contexto estão inseridas todas as

jabuticabeiras, incluindo as mais usualmente cultivadas (M. cauliflora, M. trunciflora e M.

jaboticaba) e as chamadas jaboticabeiras “caipiras” (M. aureana, M. phytrantha, M.

oblongata, etc). As espécies que apresentam estas características, amostradas neste estudo,

aparecem reunidas dentro de um clado tanto nas análises de parcimônia quanto na bayesiana,

para ambos os marcadores. Unidas às jabuticabeiras estão as espécies Plinia nana e P. edulis

(só amostradas para o marcador matK) e Eugenia monosperma, que surge dentro deste clado

nas análises com ambos os marcadores. O material desta última espécie foi posteriormente

dissecado e realmente parece que a descrição em Eugenia pode ter sido um erro (Lorenzi,

com.pess.).

As Myrciaria que apresentam características típicas ao gênero, isto é, cálice

descíduo depois da antese e bractéolas conadas no terço inferior do comprimento,

denominadas neste estudo como “Myrciaria típicas”, foram agrupadas dentro de um clado

distinto ao das jabuticabeiras. Este conjunto de dados concerne perfeitamente com a proposta

de Sobral (1993) e foi corroborada por nossos resultados.

Além disso, estudos moleculares recentes (Mazine, 2006; Lucas et al., 2007)

evidenciam a proximidade das espécies do gênero Plinia com as dos gêneros Neomitranthes e

Siphoneugena. Dentro desta abordagem as espécies amostradas destes dois últimos gêneros

surgem unidas em um subclado, dentro do clado onde estão as jabuticabeiras. Tornando-se

mais um indicativo que leva-nos a supor que as jabuticabeiras e espécies próximas devam

passar a compor o gênero Plinia.

Contudo, apesar dos fortes indícios que apontam para a transferência das

jabuticabeiras e espécies afins para Plinia, o presente conjunto de resultados ainda não pode

de forma conclusiva apoiar esta mudança. Isto deve-se ao fato das espécies do gênero Plinia

utilizadas nesta análise surgirem distribuídas em diferentes clados, o que pode indicar que

trata-se de um grupo polifilético. Enquanto que P. nana e P. edulis surgem dentro do clado

das jabuticabeiras, Plinia sp. (6416-HL) e P. brachybotrya aparecem relacionadas com as

Myrciaria típicas e Plinia hatschbachii sequer surge fazendo parte do “complexo Plinia”.

Plinia rivularis, na análise do marcador plastidial, surge fora dos clados, sozinha,

estudos preliminares têm questionado sua a manutenção dentro do gênero (Landrum &

Kawasaki, 1997). A espécie possui uma particularidade morfológica que não é comum ao

gênero, seu cálice é aberto com quatro lóbulos bem definidos que se abrem regularmente

(Landrum & Kawasaki, 1997).

Landrum & Kawasaki (1997) expõem o caráter duvidoso do gênero Plinia, que

segundo os autores é definido arbitrariamente e que estudos adicionais são necessários para

esclarecer melhor seus limites. Deduções que se tornam mais evidentes quando observados os

resultados apresentados nesta abordagem (matK), assim como outras descritas anteriormente

(Mazine, 2006).

Diante destas evidencias, faz-se necessário uma re-circunscrição das espécies

conhecidas do gênero Plinia, para que se possa desta forma estabelecer melhor seus limites. A

inclusão das espécies provenientes de Myrciaria de forma conclusiva só seria possível se a

espécie tipo, Plinia pinnata, fosse amostrada e estivesse ocorrido dentro do clado das

jabuticabeiras. Infelizmente não foi possível conseguir material desta espécie em tempo hábil

para as análises, já que sua ocorrência conhecida é o Caribe e o extremo norte da América do

Sul.

Myrciaria floribunda apresenta características morfológicas das Myrciaria típicas,

no entanto, na análise do matK, aparece dentro do clado das jabuticabeiras. Indicando a

possibilidade dos caracteres: cálice descíduo depois da antese e bractéolas conadas no terço

inferior do comprimento, terem surgido independentemente para esta espécie.

Sobral (1991; 1993) propunha ainda que dentro de Myrciaria poderia ser

reconhecido um novo gênero denominado Paramyrciaria, baseando-se no grau de soldadura

dos cotilédones, os quais para o novo gênero seriam livres enquanto que para Myrciaria

seriam soldados. Ademais, segundo o autor (Sobral, 1991) Myrciaria delicatula seria a

espécie tipo para Paramyrciaria. Porém o próprio autor se contradiz (Sobral, 2006)

considerando o caráter dúbio para a sustentação do gênero, assim como outros autores

(Mcvaugh, 1968; Landrum & Kawasaki, 1997).

A hipótese de M. delicatula ser a espécie tipo de um novo gênero segregado das

Myrciaria, justificaria seu posicionamento neste estudo, que surge dentro de um clado unida

fortemente (100% pp, 94% bs) com uma espécie desconhecida de Myrciaria sp. (2157-RT),

tão isolado das outras Myrciaria como de qualquer outro grupo amostrado. Diante disso,

pode-se reconsiderar a proposta abandonada por vários autores (Mcvaugh, 1968; Landrum &

Kawasaki, 1997; Sobral, 2006) de que Paramyrciaria pode se tratar de uma divisão válida, e

que pode comporta espécies tidas como Myrciaria. Na análise com ITS, como a espécie que

seria a tipo não foi amostrada para este marcador, não se pode inferir com clareza se esta é

realmente uma divisão válida. Contudo, Myrciaria sp. (2157-RT) que estava fortemente

relacionada a M. delicatula (93% bs, 100% pp), nas análises referentes ao matK, compõe o

clado das Myrciaria típicas nas análises de ITS. Isso demonstra que os marcadores

moleculares utilizados neste estudo têm histórias evolutivas distintas.

Outras espécies que também possuem cotilédones livres, e que integrariam o

gênero Paramyrciaria (Sobral, 1991), M. glazioviana e M. strigipes aparecem unidas (<50%

bp, 72% pp) dentro do clado das Myrciaria típicas. Podendo ser um indício que este caracter

tenha evoluído independentemente mais de uma vez. Desta forma, em nível de morfologia, o

grau de soldadura dos cotilédones não é suficiente para distinguir Paramyrciaria de

Myrciaria, por ser homoplástico. Faz-se necessário uma exploração mais detalhada em busca

de caracteres adicionais.

A localização de Eugenia monosperma no clado das jabuticabeiras é notável,

como já citado anteriormente. Isto porque, em abordagens filogenéticas recentes (Lucas et al.,

2005; Mazine, 2006; Lucas et al., 2007), não ouve casos em que espécies de Eugenia

partilhassem o mesmo clado que Myrciaria e Plinia. Porém em nenhuma delas Eugenia

monosperma foi amostrada. A utilização de mais espécies do gênero Eugenia, inclusive da

espécie tipo, Eugenia uniflora L., faz-se relevante para esclarecer melhor seu posicionamento.

De qualquer forma, Eugenia monosperma surgiu dentro do clado das jabuticabas nas análises

de ambos os marcadores.

Apesar de as jabuticabeiras e espécies próximas estarem unidas, o clado apresenta

baixa resolução interna. Não fica evidente o limite taxonômico a nível molecular das espécies,

pois ao invés dos indivíduos da mesma espécie estarem agrupadas no mesmo subclado,

mesclam-se com os de outras espécies, o que reforça a hipótese de origem evolutiva recente e

provavelmente alto grau de reticulação. Com base neste conjunto de resultados, torna-se

insustentável a manutenção das jabuticabeiras e espécies correlacionadas dentro do gênero

Myrciaria. No entanto, alocar estas espécies para o gênero Plinia, não pode ser amparada por

este estudo, pelo fato de Plinia pinnata não ter sido amostrada e por as outras Plinia estarem

constituindo um clado, ainda que próximo, porém distinto ao das jabuticabeiras.

Outro dado relevante observado foi a associação de Siphoneougena e

Neomitranthes. Na análise de ITS, Siphoneugena densiflora e S. guilfoyleiana surgiram

juntas, tendo como grupo irmão Neomitranthes cordifolia. Estes gêneros são separados

apenas pelo hipanto que se abre ao longo do anel estaminal em Siphoneugena enquanto que

em Neomitranthes ele persiste (Landrum & Kawasaki, 1997). Mc Vaugh (1968) acredita que

esta diferença é insignificante para separação dos gêneros. Proença (1990) concorda, no

entanto considera a fusão destes gêneros prematura, pois se tratam de gêneros ainda pouco

conhecidos. Como apenas três espécies dos gêneros foram amostradas neste estudo, qualquer

posição tomada pela união ou não dos gêneros seria precipitada.

Plinia rivularis que aparece com pouca resolução nas análises do matK, nas do ITS

está dentro do clado das Plinia, unida com P. renatiana (98% bs, 100% pp), indicando que o

cálice aberto com quatro lóbulos bem definidos que se abrem regularmente podem ser

decorrente de uma reversão.

Apesar das relevantes deduções que podem ser extraídas deste trabalho, na

compreensão deste complexo, que podem ser utilizados como ponto de partida para uma

reavaliação taxonômica do grupo, é necessário enfatizar seu caráter preliminar. Mais

seqüências nucleotídicas serão adicionadas onde objetiva-se esclarecer além do

posicionamento das jabuticabeiras, os limites do confuso gênero Plinia, e suas relações com

os Neomitranthes e Siphoneugena. Além disso, faz-se necessário ampliar a amostragem no

suposto gênero Paramyrciaria e também incluir o gênero recém-descrito Algrizea (Proença et

al., 2006).

6. CONCLUSÃO

As topologias derivadas das análises de cada compartimento genômico mostraram-

se divergentes em alguns pontos, o que pode ser um indício de que os marcadores têm

histórias evolutivas distintas. Esta possibilidade justifica-se também pelo elevado índice de

incongruência obtido pelo teste IDL. Eventos de reticulação podem ser atribuídos como

possível causa das diferenças observadas entre as topologias.

Apesar das diferenças, todos os resultados obtidos apontam para o não

monofiletismo dos gêneros: Plinia e Myrciaria em suas concepções. As jabuticabeiras (M.

jaboticaba, M. truncifolia e M. cauliflora), assim como outras espécies referidas ao gênero

Myrciaria, mas que possuem cálice persistente depois da antese e bractéolas separadas

surgem unidas dentro de um único clado separado das demais em todos os cladogramas

gerados.

Reunidas em um clado isolado, estão as Myrciaria que possuem cálice decíduo

depois da antese e bractéolas conadas (incluindo a espécie tipo do gênero, Myrciaria tenella).

Nas análises onde foi empregado o marcador ITS este grupo surge como monofilético.

Ademais, este clado apresenta-se tão distante das jabuticabeiras quanto de qualquer outro

gênero amostrado do “complexo Plinia”.

Com base neste conjunto de resultados torna-se insustentável a manutenção das

jabuticabeiras e espécies correlatas dentro do gênero Myrciaria. O posicionamento de

Myrciaria delicatula, que surge dentro de um clado desconexo aos outros, leva-nos a

reconsiderar a hipótese abandona vários autores, da existência do gênero Paramyrciaria, e

esta espécie pode ser reintroduzida como a tipo para este novo gênero.

Outro aspecto relevante foi as espécies do gênero Plinia terem surgido espalhadas

em vários clados do “complexo Plinia”, incluindo a porção basal do cladograma, onde Plinia

hatschbachii sai junto com o grupo externo. Evidenciando, desta forma, um caráter

polifilético do grupo.

Uma abordagem onde seja incluído um número maior de espécies do gênero

Plinia, bem como a da espécie-tipo P. pinnata, torna-se essencial para esclarecer os limites

taxonômicos deste gênero, bem como elucidar a definitiva da identidade genérica das

jabuticabeiras cultivadas.

Ainda que preliminar, acredita-se que esta análise prospectiva das relações

genéticas entre as jabuticabeiras cultivadas e seus parentes selvagens possa ser usada com

sucesso como uma linha base confiável para programas de melhoramento genético das

jabuticabas.

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