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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CÂMPUS DE BOTUCATU
SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA B
6
EM DIETAS PRÁTICAS E
PURIFICADAS NO DESEMPENHO PRODUTIVO E RESPOSTA
HEMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO SUBMETIDA A ESTÍMULO
TÉRMICO
CAROLINE PELEGRINA TEIXEIRA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Zootecnia como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
BOTUCATU – SP
Dezembro – 2009
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CÂMPUS DE BOTUCATU
SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA B
6
EM DIETAS PRÁTICAS E
PURIFICADAS NO DESEMPENHO PRODUTIVO E RESPOSTA
HEMÁTICA DA TILÁPIA DO NILO SUBMETIDA A ESTÍMULO
TÉRMICO
CAROLINE PELEGRINA TEIXEIRA
Zootecnista
ORIENTADORA: Profa. Dra. MARGARIDA MARIA BARROS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Zootecnia como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
BOTUCATU – SP
Dezembro – 2009
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i
DEDICATÓRIA
Aos meus pais,
João Paulo e Fátima, que são a minha inspiração,
razão do meu existir e seguir em frente todos
os dias da minha vida. Agradeço tudo que
fizeram e ainda fazem por mim.
Amo muito vocês!!!
Aos meus irmãos, João Paulo e Cristiane,
que são a minha alegria e gargalhadas.
Amo demais!!
Às minhas avós, Rosa (
in memorian
) e Célia,
pelo carinho e incentivo.
Ao meu amor, namorado, companheiro,
grande incentivador, profissional exemplar, Vitor
Amo você por demais de fora da quantia!!!
ii
AGRADECIMENTOS
À Deus pela minha vida, por ter nascido numa família maravilhosa, por estar
rodeada de pessoas iluminadas e que me ajudaram nessa caminhada e estarão sempre ao
meu lado;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela
concessão da bolsa de estudos;
À minha orientadora, Profa. Dra. Margarida Maria Barros, pelo incentivo,
ensinamentos, paciência, dedicação irrestrita, amizade e oportunidade de convivência,
porque além de ser excelente profissional é um ser humano iluminado;
Ao Prof. Dr. Luiz Edivaldo Pezzato, pelos ensinamentos, amizade, incentivo e
exemplo de profissional;
À minha amiga e colega de profissão, Raquel Abdallah da Rocha, que me
apresentou à minha orientadora e me ajudou a realizar esse sonho;
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Padovani, Departamento de Bioestística, pela
atenção e auxílio na realização das análises estatísticas;
À Guabi por confeccionar o suplemento mineral e vitamínico utilizado em nosso
estudo;
À toda a equipe do Laboratório de Nutrição de Organismos Aquáticos –
AquaNutri; Igo Gomes Guimarães, Vivian Gomes dos Santos, Rosangela do
Nascimento Fernandes, Graciela Pessoa Martins, Ademir Calvo Fernandes Junior, João
Fernando Albers Koch, Altevir Signor, André Moreira Bordinhon, Fernando Kojima
Nakagome, Daniel de Magalhães Araújo, Luis Gabriel Quintero Pinto, Blanca Stella
Pardo Gamboa, Renan de Mattos Botelho, Érica Fernandes Paris Martins, Flavia Mota
Damasceno, Pedro Luiz Pucci Figueiredo de Carvalho, Rafael Lopes da Silva, e
iii
William Ferdinand Koptian Senske, pela amizade, respeito, auxílio na realização desse
trabalho e experiências compartilhadas;
Aos professores e funcionários do Departamento de Melhoramento e Nutrição
Animal pelo auxílio e amizade;
Aos funcionários e amigos da Seção de Pós-graduação da FMVZ, Posto de
Serviço Lageado, Seila Cristina Cassineli Vieira, Danilo José Teodoro Dias e Carlos
Pazini Junior pela atenção e auxílios prestados;
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ/UNESP, Botucatu,
pela oportunidade e privilégio que tive em realizar o experimento nesta instituição;
Aos meus amigos Fernanda Cristina Breda, Andréia Márcia de Almeida Soares
(Dezza), Fernanda Dornellas Penna, Ana Camila Pelegrina Pavanelli, Daniella
Aparecida Berto, Fabyola Barros de Carvalho, Ana Cristina Stradiotti, Lúcio Vilela
Carneiro Girão, Gustavo do Vale Polycarpo, Érica Sernagiotto, Ana Beatriz (Gansa)
pela amizade, companheirismo e presença em todos os momentos;
Ao meu companheiro Vitor Barbosa Fascina por ter me apoiado e se mantido ao
meu lado em todos os momentos, pela paciência e amor;
A todos que de alguma maneira contribuíram com este trabalho, MUITO
OBRIGADA!!
iv
SUMÁRIO
CAPÍTULO I 1
CONSIDERAÇÕES INICIAIS ......................................................................................... 2
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 15
CAPÍTULO II ............................................................................................................... 18
SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA B
6
EM DIETAS PRÁTICAS E
PURIFICADAS NO DESEMPENHO PRODUTIVO E RESPOSTA HEMÁTICA
DA TILÁPIA DO NILO SUBMETIDA A ESTÍMULO TÉRMICO ............................. 19
Resumo. ........................................................................................................................... 19
Abstract. .......................................................................................................................... 20
Introdução ....................................................................................................................... 21
Material e Métodos ....................................................................................................... 232
Resultados ....................................................................................................................... 26
Discussão ........................................................................................................................ 28
Referências Bibliográficas .............................................................................................. 34
Tabela 1. Composição químico-bromatológica e o percentual dos ingredientes das
dietas experimentais práticas........................................................................................... 39
Tabela 2. Composição químico-bromatológica e o percentual dos ingredientes das
dietas experimentais purificadas ..................................................................................... 40
Tabela 3. Tabela 3. Média e desvio padrão de ganho de peso (GP), consumo de ração
(CR), conversão alimentar aparente (CAA), taxa de crescimento específico (TCE),
taxa de eficiência protéica (TEP), taxa de retenção protéica (TRP) e sobrevivência
(SOB) de juvenis de tilápia do Nilo alimentadas com dietas práticas e purificadas
suplementadas com níveis crescentes de vitamina B
6
..................................................... 41
Tabela 4. Média e desvio padrão do número de eritrócitos (Erit), porcentagem de
hematócrito (Htc), taxa de hemoglobina (Hb), volume corpuscular médio (VCM) e
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) de juvenis de tilápia do
Nilo alimentadas com dietas práticas e purificadas e suplementadas com níveis
crescentes de vitamina B
6
e submetidos a estímulo térmico ........................................... 42
Tabela 5. Média e desvio padrão de proteína plasmática total (PPT), albumina
(ALB), globulina (GLOB) e relação albumina/globulina (ALB:GLOB) de juvenis de
tilápia do Nilo alimentadas com dietas práticas e purificadas e suplementadas com
níveis crescentes de vitamina B
6
e submetidos a estímulo térmico ................................ 43
v
Tabela 6. Mediana e valores mínimo e máximo de número absoluto leucócitos
(LEUC), linfócitos (LF), neutrófilos (NT) e monócitos (MN) de juvenis de tilápia do
Nilo alimentadas com dietas práticas suplementadas com níveis crescentes de
vitamina B
6
e submetidos a estímulo pelo calor ............................................................. 44
IMPLICAÇÕES ............................................................................................................ 45
CAPÍTULO I
2
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Vitaminas
As vitaminas são um grupo de compostos orgânicos complexos que se
apresentam em pequenas quantidades nos alimentos, são essenciais para o equilíbrio
orgânico animal e promovem sinais de deficiência em caso de ausência. São necessárias
em pequenas quantidades na dieta para a manutenção da saúde, crescimento e
reprodução normal do organismo (McDowell, 1989).
As vitaminas são divididas em duas classes básicas de acordo com o tipo de
substância em que estas são solúveis, sendo lipossolúveis e hidrossolúveis; portanto,
solúveis em solventes orgânicos e solúveis em água, respectivamente. Algumas
vitaminas agem como cofatores enzimáticos (vitaminas A, K, B
6
, B
12
e C, tiamina,
niacina, riboflavina, biotina, ácido pantotênico e folato), mas nem todos os cofatores
enzimáticos são vitaminas. Algumas têm função antioxidante (vitaminas C e E) e outras
agem como cofatores nas reações metabólicas de oxidação-redução (vitaminas E, K, e
C, niacina, riboflavina e ácido pantotênico) (Combs, 1998).
Vitamina B
6
As três formas de ocorrência natural da vitamina B
6
são a piridoxina (álcool), o
piridoxal (aldeído) e a piridoxamina (amina); estas formas são metabolizadas à piridoxal
fosfato no organismo animal. O piridoxal fosfato é a forma metabolicamente ativa da
vitamina e participa como coenzima, principalmente no metabolismo de proteínas.
Os compostos de vitamina B
6
são absorvidos por difusão passiva, principalmente
no jejuno e íleo. A capacidade de absorção é grande; existem relatos da habilidade
animal de absorver quantidades na ordem de duas a três vezes maiores que sua demanda
fisiológica. A força motriz para que ocorra a absorção da vitamina B
6
parece ser a
fosforilação e a ligação com proteínas, que ocorrem na mucosa intestinal e sangue
(Combs, 1998).
Os compostos da vitamina B
6
são absorvidos pelo intestino na forma
defosforilada. O intestino delgado é rico em fosfatase alcalina para a reação de
3
defosforilação do piridoxal fosfato e piridoxamina fosfato. Após a absorção, estes
compostos são fosforilados na mucosa jejunal pela enzima piridoxal quinase e
transportados na corrente sanguínea ligados à proteínas plasmáticas. A piridoxina e
piridoxamina fosforiladas são então oxidadas à piridoxal fosfato no fígado (McDowell,
1989).
O piridoxal atravessa as membranas celulares mais facilmente que o piridoxal
fosfato, provavelmente por esta ser a forma mais facilmente capturada pelos tecidos,
sugerindo funções das fosfatases como retenção intracelular e, talvez, também, a captura
da vitamina. Após a captura pela célula, a vitamina é fosforilada pela enzima piridoxal
quinase, sendo a forma predominante nos tecidos. No organismo, são armazenadas
pequenas quantidades de vitamina B
6
, principalmente sob a forma piridoxal fosfato, e
em menor quantidade sob a forma de piridoxamina fosfato. Os principais reservatórios
da vitamina são o fígado, cérebro, rim, baço e músculo, onde se encontram ligados a
várias proteínas (McDowell, 1989). Menos de 0,1% do total da vitamina B
6
corporal
está presente no plasma sanguíneo sob a forma de piridoxal fosfato, normalmente em
concentração menor que 1mmol, ligado a proteínas (principalmente a albumina
plasmática e hemoglobinas nos eritrócitos) por meio de bases Schiff (Combs, 1998).
A vitamina B
6
é comumente encontrada no sangue na forma de piridoxal fosfato,
que é majoritariamente proveniente do metabolismo hepático. Este composto está
contido em eritrócitos e frequentemente é usado como parâmetro de condição
nutricional da vitamina B
6
. A reserva corporal total de vitamina B
6
em humanos é
estimado em aproximadamente 1,0 mol, sendo a maioria (80,0 a 90,0%) encontrada em
músculos na forma de piridoxal fosfato, convertido pela enzima glicogênio fosforilase
(Combs, 1998).
A vitamina B
6
é interconvertida metabolicamente por reações de
fosforilação/defosforilação, oxidação/redução e aminação/deaminação (Figura 1). A
vitamina não fosforilada penetra a membrana celular mais facilmente que seu análogo
fosforilado; aparentemente, a fosforilação é importante forma de reter a vitamina
intracelularmente. A enzima hepática piridoxal quinase fosforila a piridoxina, o
piridoxal e a piridoxamina produzindo os correspondentes fosfatos, e estes, antes de
atravessar a membrana celular, são defosforilados pela fosfatase alcalina em vários
tecidos (fígado, cérebro e intestino). A forma reduzida (piridoxina ou piridoxal) pode
4
ser oxidada pela enzima piridoxal desidrogenase, produzindo piridoxal fosfato, que
também pode ser aminado ou transaminado (Combs, 1998).
Figura 1: Interconversões da vitamina B
6
(Murray, 2008)
A enzima limitante no metabolismo da vitamina B
6
é a piridoxal fosfato oxidase,
que exige a riboflavina-5’-fosfato para sua síntese. Por esta razão, a privação de
riboflavina pode reduzir a conversão de piridoxina e piridoxamina à coenzima ativa
piridoxal fosfato. O fígado é o órgão central para o metabolismo da vitamina, pois
contém todas as enzimas envolvidas nas interconversões. As principais formas da
vitamina B
6
neste órgão são o piridoxal fosfato e a piridoxina fosfato, que são mantidas
em concentrações intracelulares constantes, em reservatórios endógenos que não são
facilmente acessíveis para as moléculas recém-formadas. Posteriormente, um segundo
reservatório, que é facilmente mobilizado para conversão metabólica, é liberado para o
sangue (Combs,1998).
O excesso de coenzimas B
6
acarreta em defosforilação destas pela fosfatase
alcalina, resultando em piridoxal que pode ser reutilizado, ou em oxidação pelo aldeído
oxidase e/ou NAD dependente desidrogenase, resultando em ácido piridóxico
(McDowell, 1989). A ligação do piridoxal fosfato à albumina protege a coenzima da
degradação na circulação. No fígado, esta é defosforilada e oxidada provavelmente pelo
FAD dependente aldeído (piridoxal) oxidase bem como a NAD dependente aldeído
5
desidrogenase, para produzir o ácido-4’-piridóxico. O ácido piridóxico é o produto final
do metabolismo, podendo ser recuperado qualitativamente na urina de indivíduos
(Combs, 1998).
Níveis urinários de ácido piridóxico são inversamente proporcionais à ingestão
de proteína; esse efeito parece ser maior em fêmeas do que em machos. De qualquer
modo, o ácido piridóxico não é detectado na urina de indivíduos deficientes em
vitamina B
6
, tornando essa avaliação ferramenta para conhecimento da reserva corpórea
da vitamina (Combs, 1998).
Fontes de Vitamina B
6
A vitamina B
6
é vastamente distribuída nos alimentos, ocorrendo em grandes
concentrações em ingredientes de origem animal e vegetal. Grande porção de vitamina
B
6
em muitos alimentos está ligada à proteínas por meio de grupo amino de resíduos de
lisina e cistina. A vitamina também é encontrada nas formas quelatadas em pequenas
quantidades nos alimentos, principalmente nos de origem animal. Nos grãos de cereais,
as concentrações de vitamina B
6
ocorrem primariamente no gérmen e extrato
aleurônico; entretanto, em consequência do refino dos grãos para a produção de farinha,
muitas dessas frações são removidas, diminuindo substancialmente as concentrações da
vitamina nestes alimentos (Combs, 1998).
As formas químicas da vitamina B
6
variam nos alimentos: os vegetais possuem
maior quantidade de piridoxina; já os ingredientes de origem animal têm mais piridoxal
e piridoxamina. Nos alimentos, a vitamina B
6
é instável em meio neutro ou alcalino,
particularmente quando exposta ao calor e à luz. A piridoxina é mais estável que o
piridoxal ou piridoxamina e as perdas durante o cozimento variam entre 0 a 40%,
dependendo da fonte de vitamina B
6
(Combs, 1998).
A vitamina B
6
dos alimentos, quase na sua totalidade, não está disponível
biologicamente. O piridoxal possui baixa disponibilidade, em ratos estima-se entre 20,0
a 30,0 % de disponibilidade dessa forma química, já em humanos, os valores aumentam
para 58,0%. A presença da piridoxina quelatada reduz sua biodisponibilidade. Esta pode
ser quelatada a peptídeos durante o processamento, cozimento ou digestão dos
alimentos (Combs, 1998).
6
Funções metabólicas da vitamina B
6
A vitamina B
6
ou piridoxina age como componente de várias enzimas,
envolvidas no metabolismo de proteínas, lipídeos e carboidratos, participando,
particularmente, em vários aspectos do metabolismo protéico (McDowell, 1989). A
forma metabolicamente ativa da vitamina B
6
é o piridoxal fosfato, utilizado como
coenzima de inumeras enzimas, a maioria envolvida no metabolismo de aminoácidos.
O numeroso grupo de enzimas dependentes dessa piridoxina inclui as
aminotransferases, que na sua maioria utiliza o α-cetoglutarato como receptor do
grupamento amino. Outras enzimas dependentes do piridoxal fosfato incluem as
descarboxilases, racemases e enzimas que catalisam alterações em aminoácidos de
cadeia secundária. Além disso, no metabolismo de aminoácidos o piridoxal fosfato
também serve como coenzima para as fosforilases e como modulador da estrutura
protéica (Combs, 1998).
A transferência de grupos amino ocorre via intermediários enzima-associados do
piridoxal fosfato. O sítio ativo da aminotransferase “em repouso” contém piridoxal
fosfato covalentemente ligado a um ε-amino grupo de um resíduo de lisina, que forma
parte da cadeia de aminoácidos da transferase. O complexo é, posteriormente,
estabilizado por ligações iônicas e hidrofóbicas. A ligação –CH=N– é chamada de base
Schiff. O carbono se origina do grupo aldeído do piridoxal fosfato e o nitrogênio é
doado pelo resíduo de lisina. Quando um substrato aminoácido pronto para ser
metabolizado, se aproxima do sítio ativo, seu grupo amino desloca o ε-amino grupo da
lisina e uma ligação de base Schiff é formada com o amino grupo do aminoácido
substrato. Nesse ponto, a molécula derivada do piridoxal fosfato não está ligada
covalentemente à enzima, mas está presa ao sítio ativo somente por interações iônicas e
hidrofóbicas entre ela e a proteína. A ligação de base Schiff envolvendo o aminoácido
substrato está em equilíbrio tautomérico entre uma aldimina, -CH=N- CHR
2
, e uma
cetimina, -CH
2
-N=CR (Devlin, 1998).
A hidrólise da cetimina libera um α-cetoácido, tornando o amino grupo parte da
estrutura da piridoxamina. O reverso do processo é agora possível: um α-cetoácido
reage com o grupo amino, a dupla ligação migra, e então, a hidrólise libera um
7
aminoácido. O piridoxal fosfato agora refaz sua base Schiff com a enzima “em
repouso”. A maioria das reações que necessitam de piridoxal fosfato envolve
transaminação, mas a capacidade da base Schiff de transferir elétrons entre átomos
diferentes permite que esse co-fator participe quando outros grupos, como as carboxilas,
devem ser eliminados (Lehninger et al., 1995).
As enzimas dependentes do piridoxal fosfato atuam na biossíntese de
neurotransmissores como a serotonina (pela triptofano decarboxilase), epinefrina e
norepinefrina (pela tirosina carboxilase) e γ-aminobutírico (importante fonte de energia
para o cérebro) pela glutamato decarboxilase; do vasodilatador e constritor de músculos
lisos histamina (pela histidina decarboxilase) e precursor porfirrina para o heme (ácido
δ-aminolevulínico sintetase) (Combs, 1998).
O piridoxal fosfato tem papel proeminente no metabolismo do triptofano e
muitas enzimas nessa via são dependentes deste composto. A quinureninase é afetada
pela deficiência da vitamina B
6
, enzima que remove a alanina do 3-hidroxiquinurenina
no metabolismo do triptofano. Além disto, a quinureninase catalisa a reação análoga
utilizando a quinurenina não hidroxilada como substrato, produzindo o análogo não
hidroxilado do 3-hidroquinurenina, o ácido antralínico. Aminotransferases dependentes
de B
6
também são capazes de metabolizar a quinurenina e 3-hidroquinurenina,
produzindo os ácidos quinurênico e xanturênico, respectivamente (Combs, 1998). Pelo
fato de outras aminotransferases terem maior afinidade de ligação com o piridoxal
fosfato do que a quinureninase, a privação da vitamina B
6
reduz primariamente a
atividade desta enzima, prejudicando a conversão metabólica do triptofano à niacina,
aumentando a produção de ácido xanturênico, que é eliminado pela urina (Devlin,
1998).
A vitamina B
6
é necessária para que haja liberação de glicose a partir do
glicogênio, pois atua como coenzima da glicogênio fosforilase. Esta enzima catalisa a
primeira etapa de degradação de glicogênio, reação na qual o fosfato inorgânico é usado
na clivagem de uma ligação glicosídica α-1,4, gerando glicose 1-fosfato (Devlin, 1998).
Por esta razão, mais da metade da vitamina B
6
corpórea está nos músculos e na
glicogênio fosforilase (Combs, 1998).
A enzima serina palmitoil-transferase, necessária para a biossíntese de
esfingolipídeos, tem como cofator o piridoxal fosfato, assim como outras enzimas
8
envolvidas na síntese de fosfolipídeos. O piridoxal fosfato parece ter função moduladora
sobre receptores de hormônios esteróides, inibindo a indução da tirosina
aminotransferase por glicocorticóides, provavelmente formando ligações de base Schiff
com o sítio de ligação do DNA do complexo de esteróides receptores, inibindo a ligação
ao DNA e deslocando o complexo do núcleo (Combs, 1998).
A vitamina B
6
atua no suporte da competência imune; porém, esta ação não está
bem elucidada. Estudos com animais e humanos têm demonstrado efeitos de privação
de vitamina B
6
nas respostas imunes humoral (diminuição na produção de anticorpos) e
mediadas por células (linfocitofilia, redução de respostas de hipersensibilidade
retardada, redução de células T citotóxicas e diminuição na produção de citocina). Esses
efeitos podem ser relacionados às atividades diminuídas de muitas enzimas dependentes
de piridoxal fosfato, tais como serina transhidroximetilase e timidilato sintetase,
diminuindo o metabolismo do carbono-1 e a síntese de DNA (Combs, 1998; Devlin,
1998).
A hemoglobina é uma proteína conjugada, composta por uma proteína simples, a
globulina, e por um núcleo prostético, do tipo porfirina, chamado heme, cujo principal
componente químico é o ferro. Dentre as vitaminas do complexo B essenciais para a
eritropoiese destaca-se a piridoxina (Feldman et al., 2000). Esta vitamina está envolvida
no primeiro passo da síntese do ácido aminolevulínico (ALA), que é a condensação de
resíduo de glicina com resíduo de succinil CoA, e que ocorre pela ação da ALA
sintetase, enzima dependente do piridoxal fosfato (Kaneko et al., 1997). Esta enzima
controla a etapa velocidade limitante da síntese do heme em todos os tecidos (Figura 2).
A modulação da atividade da ALA sintetase determina a quantidade dos substratos que
serão desviados para a biossíntese do heme. O heme, e também a hematina, agem como
repressor da síntese da ALA sintetase e como inibidor da sua atividade (Devlin, 1998).
A exigência em piridoxina elucida a anemia responsiva a deficiência desta
vitamina (Feldman et al., 2000). Portanto, a ausência ou a concentração inadequada da
piridoxina, pode prejudicar a síntese de eritrócitos, afetando a saúde do animal. A
anemia é descrita, segundo Feldman et al. (2000), como sendo a diminuição da
habilidade do sangue em suprir concentrações adequadas de oxigênio para os tecidos
desenvolverem as funções metabólicas adequadamente. Além destas funções a vitamina
B
6
age na formação de anticorpos e transporte de aminoácidos (McDowell, 1989).
9
Figura 2. Síntese da hemoglobina (Feldman et al., 2000)
Hematologia, Nutrição e Estresse
O sangue, tecido líquido, móvel, do tipo conjuntivo, está em equilíbrio com
praticamente todos os outros tecidos, constituindo uma das grandes forças
homeostáticas do organismo (Kalashnikova, 1986). Distribui calor, transporta gases
respiratórios, nutrientes e produtos de excreção, além de atuar na defesa do organismo.
A aplicação da hematologia em pesquisa animal é bem aceita e considerada como
procedimento de rotina em métodos de diagnóticos (Ranzani-Paiva e Silva-Souza,
2004).
10
Ao longo da história evolutiva, os peixes tiveram cerca de 300 milhões de anos
para desenvolver o conjunto de adaptações, a fim de manter a homeostase orgânica na
interação com os ambientes. Hoje, tanto nos ambientes naturais como nos artificiais, os
peixes vêm sendo expostos à condições ambientais e orgânicas cada vez mais
desafiadoras do ponto de vista biológico. Tais condições têm efeitos negativos na saúde,
crescimento, reprodução e sobrevivência desses animais e podem resultar inclusive em
mudanças populacionais. Em termos gerais, estresse é o estado orgânico produzido pela
condição ambiental ou mesmo pela condição orgânica, que induzem a mudanças
fisiológicas e bioquímicas acima dos níveis normais (Val et al., 2004). Assim, em
peixes, a presença, quantidade e proporção das diferentes células no sangue periférico
refletem o estado fisiológico do organismo, em um dado momento ou durante
determinado período da vida (Ranzani-Paiva e Silva-Souza, 2004).
O estado nutricional do animal, consequência direta e indireta da quantidade e
qualidade dos nutrientes presentes e disponíveis na ração, tornou-se objetivo de
pesquisas para desenvolver estratégias nutricionais que influenciem, positivamente, a
saúde e resistência orgânica dos peixes. Embora a importância da nutrição para a
manutenção da higidez dos peixes seja evidente, os questionamentos ainda superam os
resultados conclusivos nesta linha de pesquisa (Barros et al., 2006).
As rações, adequadamente formuladas, são compostas, principalmente, por
macronutrientes (proteínas, lipídeos e carboidratos) e micronutrientes (vitaminas e
minerais). Embora ambas as classes de nutrientes possam afetar a saúde dos peixes,
algumas vitaminas e minerais têm sido mais estudados. As exigências nutricionais
ficam melhor evidenciadas na condição de ausência do nutriente na ração, sendo os
sinais clínicos mais facilmente identificáveis. No entanto, sabe-se que não só a ausência,
mas também a sub-dosagem e o excesso de nutrientes podem ser detrimentais à saúde
dos peixes (Barros et al., op. cit.).
Modificações consideradas discretas na formulação das rações podem não causar
sinais visíveis de alterações. Porém, podem influenciar a resistência a doenças e colocar
os peixes em condição de deficiência marginal. Frequentemente é difícil diagnosticar a
causa de deficiências nutricionais, porque a exigência quantitativa dos nutrientes está
determinada, especificamente, para crescimento. Mudanças fisiológicas seguidas de
11
diferentes condições de estresse (nutricional, físico, químico, dentre outros) são
detectadas por meio da avaliação de parâmetros sanguíneos como: eritrograma,
leucograma, proteína plasmática total, globulinas, imunoglobulinas, eletrólitos e
hormônios. Eritropoiese e leucopoiese anormais têm sido detectadas na ausência e ou
concentrações insuficientes de diversos nutrientes na ração (Barros et al., 2006).
O uso de parâmetros hematológicos, como indicadores de saúde, foi proposto
por Hesser (1960). Porém, esta técnica tem sido modestamente utilizada em sistemas de
produção. Contudo, Ranzani-Paiva e Silva-Souza (2004) ressaltaram que avaliações
sanguíneas relacionadas à respostas fisiológicas dos peixes têm sido mais
frequentemente adotadas por pesquisadores.
Vários autores encontraram relação direta entre variações do quadro hemático e
temperatura da água. Assim, Ranzani-Paiva e Godinho (1986) constataram que, no rio
Mogi-Guaçu – SP, Prochilodus scrofa apresenta valores mais altos para a porcentagem
de hematócrito e número de eritrócitos no inverno. Embora a taxa de hemoglobina tenda
a permanecer constante durante as estações do ano, a concentração de hemoglobina
corpuscular média (CHCM) sofre acentuada redução no inverno. Pastor (1983) afirmou
que o aumento do hematócrito, relacionado à diminuição da temperatura, pode
significar resposta fisiológica ao estresse causado por essa diminuição com a reposição
excedendo a taxa de mortalidade das células sanguíneas.
Val (1986), por outro lado, verificou que Colossoma macropomum do rio
Solimões – AM apresenta aumento do número de eritrócitos e taxa de hemoglobina com
a elevação da temperatura da água, e que a porcentagem de hematócrito e os índices
hematimétricos não sofreram alteração. A elevação dos valores hemáticos em altas
temperaturas pode representar necessidade de aumentar a captação de O
2
em períodos
de baixas concentrações deste gás, prevalecentes em águas mais quentes. Assim, a
variação sazonal observada em peixes selvagens corresponde, nestas condições, ao
padrão normal (Ranzani-Paiva e Silva-Souza, 2004).
12
Estresse em peixe
A tendência atual de intensificação dos sistemas de produção de peixes, visando
maior produção e lucro por área, propicia o aparecimento de doenças nesses animais.
Isso ocorre principalmente em função da deterioração da qualidade da água como
consequência da superlotação, comprometendo diretamente a saúde dos animais. Essa
condição de criação exige, dos profissionais da aquicultura, maior conhecimento dos
sistemas de defesa dos peixes, a fim de minimizar os efeitos nocivos, inerentes deste
sistema de produção. Igualmente, tornou-se fundamental otimizar o sistema de defesa
dos peixes, sendo que a melhora da resposta imune, via nutrição, se apresenta como
alternativa atraente e possível (Barros et al., 2006).
Na aquicultura variações de temperatura da água são frequentes e a adaptação a
esta situação faz parte da fisiologia dos peixes. Porém, a intensificação da produção
torna essas variações fator crítico relacionado ao estresse, com consequente supressão
do sistema imune. Ao deparar com o agente estressor, os peixes são capazes de acionar
diversos ajustes nos vários níveis de organização biológica, como forma de minimizar
os efeitos orgânicos impostos e manter, assim, suas funções biológicas. Ao perceber
alterações ambientais ou fisiológicas, o animal desencadeia ajustes, começando
normalmente com mudança de comportamento. Em termos gerais, as respostas a
agentes estressores podem ser classificadas em respostas primárias, secundárias e
terciárias (Iwama et al., 1999).
O uso de estratégias nutricionais que favoreça o mecanismo de defesa dos peixes
tem demonstrado grande importância para a obtenção de peixes saudáveis. Os animais
resultantes desta técnica se tornam mais capazes em reagir ao impacto de alterações
ambientais e ataque de agentes oportunistas, isto com maiores chances de sobrevivência
(Torrecillas et al., 2007). Desta forma, é preciso que os peixes possuam condições
nutricionais saudáveis para construir seu próprio sistema de defesa e, assim, torná-los
aptos a responder aos desafios impostos.
São consideradas estratégias nutricionais, o uso de nutrientes e compostos, em
quantidades adequadas, que possam permitir o crescimento desejado com melhores
condições de higidez (Barros et al., 2006). O uso de estratégias nutricionais exige
13
conhecimento das exigências nutricionais, baseado na saúde e crescimento dos peixes.
Evidências têm indicado que, a maioria, se não todos, nutrientes dietários essenciais,
bem como, o manejo alimentar, influenciam a resistência às doenças (Webster, 2007).
Exigência e sinais clínicos de deficiência
A exigência de vitamina B
6
pode ser afetada por diversos fatores, tais como
espécie, sexo, idade, estádio de maturação gonadal, função fisiológica, componentes
dietários e flora intestinal, entre outros. Algumas espécies de peixes têm demonstrado
exigência dietária de piridoxina para crescimento e hematopoiese normais, incluindo
salmonídeos (Halver, 1957; Phillips e Livingston, 1965), bagre do canal (Dupree,
1966), carpa comum (Ogino, 1965), e yellowtail (Sakaguchi et al., 1969). Em peixes, a
deficiência de vitamina B
6
tem sido associada à diminuição do ganho de peso, anorexia,
edema, tetania, convulsões, forma epileptiforme e outras desordens neurológicas
(Halver, 1989).
Lim et al. (1995) observaram que 3,0 mg de piridoxina/kg da dieta foi suficiente
para máximo crescimento, eficiência alimentar, sobrevivência e prevenção de vários
sinais de deficiência em tilápias híbridas vermelhas. Mohamed (2001) observou sinais
de deficiência de vitamina B
6
como anorexia, letargia, tetania, convulsões e hemorragias
no intestino e fígado em dietas ausentes de piridoxina em bagre indiano
(Heteropneustes fossilis) e concluiu que a exigência deste peixe para o máximo
crescimento foi de 3,21 mg de piridoxina/kg da dieta e para manutenção de parâmetros
sangüíneo normais de 3,4 mg/kg da dieta.
Kissil et al. (1981) determinaram para o gilthead seabream (Sparus auratas) de
tamanhos diferentes, o nível de 1,97 mg de piridoxina/kg da dieta. No entanto, estes
autores observaram que este nível não proporcionou atividade suficiente da alanina
aminotransferase, indicando que o nível proposto de exigência deva estar aquém das
necessidades do animal, embora não apresentando sinais clínicos de deficiência. De
acordo com Lovell (1998) sinais de deficiência desenvolvem–se rapidamente nos
peixes, incluindo desordens nervosas como hipersensibilidade a ruídos, falta de
coordenação no nado, convulsões, tetania quando manejados, desenvolvimento de
14
coloração azul-esverdeada da pele do bagre do canal (Ictalurus punctatus) e edema,
exoftalmia e lesões na pele na carpa comum (Cyprinus carpio).
Andrews e Murai (1979), estudando a exigência de piridoxina para o bagre do
canal, determinaram que esta espécie necessita aproximadamente 3,0 mg/kg da dieta
para crescimento máximo. Estes autores observaram ainda, efeito deletério nos
parâmetros hematológicos de níveis elevados de piridoxina (20 mg/kg da dieta) como
anemia microcítica e normocrômica. Albrektsen et al. (1993) testaram dietas práticas
com níveis crescente de vitamina B
6
para salmão do Atlântico e o desafiaram com a
bactéria Aeromonas salmonicida. Concluiram que a vitamina não melhorou a resistência
à bactéria e que o crescimento, mortalidade e hematologia também não foram afetados
pela suplementação.
Segundo Devlin (1998), a necessidade de vitamina B
6
na dieta é diretamente
proporcional ao conteúdo protéico, devido ao grande número de aminotransferases
dependentes de piridoxal fosfato. Deste modo, Hilton (1989) sugeriu que,
possivelmente, a interação entre a vitamina B
6
e os níveis de proteína na dieta poderia
ocorrer em peixes, por estes animais possuírem maior exigência em proteína que a
maioria das espécies de animais domésticos. Este autor enfatizou ainda, que os peixes,
por possuírem maior exigência de proteína, possivelmente teriam maior exigência para a
vitamina B
6
. Shiau e Hsieh (1997) concluíram que para juvenis de tilápia híbrida quanto
maior a concentração de proteína dietária, maior será a necessidade de suplementação
de vitamina B
6
.
Com base nessas informações, esta pesquisa se apresenta em um capítulo
intitulado:
Capítulo II – “Suplementação de vitamina B
6
em dietas práticas e purificadas no
desempenho produtivo e resposta hematológica da tilápia do Nilo submetida a estímulo
térmico”. A redação deste capítulo foi realizada de acordo com as normas de publicação
da revista Journal of Applied Aquaculture.
15
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6
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18
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Estadual Paulista, 2007. p. 21-34.
CAPÍTULO II
20
Suplementação de vitamina B
6
em dietas práticas e purificadas no desempenho
produtivo e resposta hemática da tilápia do Nilo submetida a estímulo térmico
RESUMO – A pesquisa teve por objetivo avaliar a suplementação de vitamina B
6
em
dietas práticas (Estudo – I) e purificadas (Estudo – II) sobre o desempenho produtivo e
resposta hemática da tilápia do Nilo submetida a estímulo térmico. O período
experimental foi de 91 dias, Estudo – I, e 84 dias, Estudo - II. No Estudo – I, 192
alevinos com peso médio inicial de 8,41 ± 0,22 g, foram distribuídos aleatoriamente em
32 tanques-rede de 200L (quatro tanques-rede/ aquário de 1000 L). No Estudo – II, 140
alevinos com peso médio inicial de 6,32 ± 0,16 g, foram distribuídos em 28 aquários de
50L. Foram avaliadas oito dietas, sendo quatro práticas e quatro purificadas com níveis
crescentes de piridoxina (0,0; 5,0; 10,0 e 20,0 mg de piridoxal HCl /kg da dieta). Ao
final do período experimental os peixes foram pesados e a ração quantificada para a
avaliação do desempenho produtivo (ganho de peso, consumo de ração, conversão
alimentar aparente, taxa de eficiência proteica, taxa de crescimento específico, taxa de
retenção proteica e porcentagem de sobrevivência). Posteriormente, foram efetuadas as
análises hematológicas dos peixes (contagem de eritrócitos, porcentagem de
hematócrito, taxa de hemoglobina e confecção de lâminas de extensão sanguínea). Em
seguida, 48 peixes foram transferidos para a sala de desafio, distribuídos em 24 aquários
de 40 L (dois peixes/ aquário) e submetidos por três dias ao estímulo térmico (32ºC).
Após este período, foram realizadas as mesmas análises hematológicas feitas
anteriormente. Os peixes alimentados com dietas não suplementadas de piridoxina
apresentaram menor ganho de peso e baixa retenção de proteína na carcaça. Sinais
clínicos de deficiência de piridoxina como apatia, natação errática e hipersensibilidade
foram observados em peixes alimentados com dieta purificada não suplementada, que,
além de estarem anêmicos, apresentaram baixa porcentagem de sobrevivência. A
presença de níveis adequados de vitamina B
6
é essencial para o adequado crescimento e
higidez da tilápia do Nilo e a exigência é de 5,0 mg de piridoxina /kg da dieta.
Palavras chave: desempenho produtivo, hematologia, piridoxina, proteína, temperatura
21
VITAMIN B
6
REQUIREMENT OF NILE TILAPIA FED PRACTICAL AND
PURIFIETS DIETS: PERFORMANCE AND HEMATOLOGICAL RESPONSES
ABSTRACT – The aim of this study was to evaluate the vitamin B
6
supplementation in
practical and purifiet diets on growth performance and hematological response of Nile
tilapia subimitted to heat stress. The 91-day and 84-day trials were undertaken out, to
evaluate the effect of vitamin B
6
on hematological parameters and plasma protein
plasma of Nile tilapia. 192 Nile tilapia fingerlings with approximately 8 g weight were
randomly stocked into 32 200L-aquaria and fed practical diets, and 140 fingerlings with
6 g weight were randomly stocked into 28 50L-aquaria fed diets containingraded levels
of vitamin B
6
(0, 5, 10 and 20 mg pyridoxal HCl/kg diet). At the end of the
experimental period, fish and diets were weighed to evaluate weight gain, feed intake,
feed conversion ratio, survival, specific growth rate, protein efficiency ratio and protein
retention. Afterward, fish were bled and sample collected to evaluate hematological
parameters. After these analyses the fish were transferred to the challenge room and
distribuited into 48 aquaria, remaining at temperature of 32ºC during three days. At the
end, the same hematological analyses were performed. Fish fed the non-supplemented
diet showed reduced weight gain and protein retention. Clinical signs of vitamin B
6
deficiency observed of fish fed purified diet non-supplemented resting and abnormal
swimming, behavior and hypersensibility, anemia and low survival were observed.
Vitamin B
6
requirement of Nile tilapia is 5.0 mg pyridoxal/kg diet.
Key words: growth performance, hematology, pyridoxine, protein, temperature.
22
INTRODUÇÃO
A nutrição de peixes tem se desenvolvido globalmente, de forma a acompanhar
o crescimento global da aquicultura. No entanto, o aumento no desenvolvimento desta
área de conhecimento da Zootecnia tem se fixado principalmente na energia, proteína
aminoácidos e ácidos graxos e suas respostas sobre o desempenho dos peixes mais
cultivados no Brasil. Alia-se a isto, a necessidade de produzir dietas que proporcionem
peixes com maior resistência a fatores estressantes, sendo comum considerar apenas as
respostas sobre o desempenho produtivo nos estudos de determinação das exigências
nutricionais.
Estudos abordando a exigência em vitamina têm sido conduzidos utilizando
dietas purificadas ou semipurificadas de forma a reduzir a influência de fatores
extrínsecos. Apesar de serem mais precisos, seus resultados geralmente são
imprevisíveis quando extrapolados para condições práticas. Desta forma, a utilização de
ingredientes convencionais e o processo de extrusão na confecção das dietas em estudos
convencionais em vitaminas podem tornar as condições mais reais, visto as condições
experimentais serem semelhantes àquelas utilizadas no processo de produção comercial
de tilápias (Guimarães, 2009).
Vários são os aspectos a serem avaliados numa ração os quais, em função da
participação metabólica, podem determinar o preparo do peixe para transpor situações
adversas. As vitaminas são elementos essências para a vida, e a maioria possui em sua
estrutura compostos nitrogenados, os quais o organismo não é capaz de sintetizar.
Portanto, a ausência ou concentrações inadequadas destes elementos na alimentação
provocam manifestações de carência no organismo (Devlin, 1998).
A vitamina B
6
é uma vitamina hidrossolúvel, e suas formas de ocorrência natural
são a piridoxina, piridoxal e piridoxamina. As três formas são eficientemente
convertidas pelo organismo em piridoxal fosfato, forma metabolicamente ativa
necessária para a síntese, catabolismo e interconversão de aminoácidos (Devlin, 1998).
Dentre as vitaminas do complexo B essenciais para a eritropoiese, destacam-se a
piridoxina, folato, riboflavina, niacina, tiamina e cianocobalamina (Feldman et al.,
2000). O primeiro passo na síntese da hemoglobina é a formação do ácido
aminolevulínico a partir do succinato (ciclo de Krebs) e da glicina. A vitamina B
6
atua,
23
nesta fase, como cofator da enzima aminolevulínico sintetase, ALA-sintetase (Kaneko
et al., 1997). A exigência em piridoxina elucida a anemia responsiva na deficiência
desta vitamina (Feldman et al., 2000). Portanto, a ausência ou a concentração
inadequada da piridoxina, podem prejudicar a síntese deste composto, afetando à saúde
do animal. A anemia é descrita, segundo Feldman et al. (2000), como sendo a
diminuição da habilidade do sangue em suprir concentrações adequadas de oxigênio
para os tecidos que permitam desenvolver as funções metabólicas adequadamente.
Mudanças fisiológicas seguidas de diferentes condições de estresse, nutricional,
físico, químico, dentre outros, são detectadas por meio da avaliação de parâmetros
sanguíneos como: eritrograma, leucograma, proteína plasmática total, globulinas,
imunoglobulinas, eletrólitos e hormônios. Eritropoiese e leucopoiese anormais têm sido
detectadas na ausência e ou concentrações insuficientes de diversos nutrientes na ração
(Barros et al., 2006).
Com base no exposto, esta pesquisa teve por finalidade avaliar a suplementação
de níveis crescentes de piridoxina, em dietas práticas e purificadas, no desempenho
produtivo e na resposta hemática da tilápia do Nilo submetida a estímulo térmico.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na UNESP – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Melhoramento e
Nutrição Animal, Laboratório de Nutrição de Organismos Aquáticos – AquaNutri,
Câmpus de Botucatu.
Foram utilizados alevinos de tilápia do Nilo, inicialmente alojados em
aquários de 250 L, para seleção e distribuição nos aquários experimentais. Os peixes
foram alimentados com dieta prática isenta de suplementação de piridoxina durante
15 dias antes do início do experimento com objetivo de depletar as reservas de
vitamina B
6
. No início da pesquisa, 20 peixes foram amostrados para a análise de
matéria seca e proteína total da carcaça. Estes peixes foram anestesiados por imersão
em solução alcoólica de benzocaína à 67 mg/L de água até completa sedação e
morte.
24
No Estudo - I (dietas práticas), os alevinos com peso médio de 8,41 ± 0,22 g
foram distribuídos em 32 tanques-rede (quatro tanques-rede/ aquário de 1000 L),
com capacidade de 200 L e com densidade de seis peixes por tanque-rede. No
Estudo – II (dietas purificadas), os alevinos com peso médio de 6,32 ± 0,16 g foram
distribuídos em 28 aquários de 50 L com densidade de cinco peixes por aquário. Os
aquários utilizados eram dotados de sistema de recirculação de água, com
aquecimento controlado por sistema digital integrado e temperatura da água
constante (26,0 ± 0,5°C). A água do sistema era acoplada a central de aeração e
filtragem físico-biológica, a qual manteve sua qualidade e possibilitou dez
renovações diárias. O arraçoamento foi feito até saciedade aparente quatro vezes ao
dia (8h00, 11h00, 14h00, 17h00), de forma a não haver sobra nos aquários.
As dietas foram balanceadas de acordo com os valores de proteína e
aminoácidos digestíveis determinados por Furuya et al. (2001) e Guimarães et al.
(2008), sendo os demais valores utilizados de acordo com os coeficientes de
digestibilidade da energia e nutrientes dos alimentos determinados por Pezzato et al.
(2002). As rações práticas e purificadas foram formuladas para atender a exigência em
28,0% de proteína digestível e 3000 kcal/kg de ração em energia digestível. O
suplemento vitamínico e mineral adicionado era isento de vitamina B
6
, e a fonte
utilizada da vitamina foi o cloridrato de piridoxina com 96% de atividade (Tabelas 1 e
2).
Foram avaliadas dietas práticas e purificadas com quatro níveis de
suplementação de piridoxina, que constituíram os tratamentos: dieta controle ausente de
suplementação de piridoxina; suplementada com 5,0 mg de piridoxina HCl/kg;
suplementada com 10,0 mg de piridoxina HCl/kg da dieta e suplementada com 20,0 mg
de piridoxina HCl/kg da dieta.
As dietas elaboradas, após a pesagem e homogeneização dos ingredientes, foram
acrescidas de água a 55,0°C, na proporção de 25% do peso total da mistura.
Posteriormente, a mistura foi processada em extrusor de rosca simples de forma a se
obter grânulos com diâmetro aproximado de 4,0 mm e desidratada em estufa de
ventilação forçada de ar à 55,0°C, durante 12h.
Diariamente foi medida a temperatura da água e, semanalmente, o pH, teor de
oxigênio dissolvido e amônia total. Os aquários foram sifonados mensalmente nos dois
25
primeiros meses e depois de 60 dias foram sifonados quinzenalmente, para manter a
qualidade da água. Ao final de 91 dias (Estudo – I), e 84 dias (Estudo – II), foram
determinados os valores de ganho de peso (GP), consumo de ração (CR), conversão
alimentar aparente (CAA), taxa de sobrevivência (SOB), taxa de eficiência protéica
(TEP), taxa de crescimento específico (TCE) e taxa de retenção protéica (TRP). Após a
pesagem dos animais, foram realizadas as análise hematológicas, antes e após o
estímulo térmico. O conteúdo de proteína bruta, matéria seca, extrato etéreo e cinzas das
dietas foram determinados de acordo com os protocolos da AOAC (1995). A vitamina
B
6
nas dietas foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência – HPLC.
Para a avaliação dos parâmetros hematológicos foram retirados aleatoriamente
seis peixes por tratamento dentre os tanques-redes (Estudo - I) e aquários (Estudo - II).
Os peixes foram anestesiados (benzocaína, 1g/15 L de água) e, após estarem
completamente sedados, foram realizadas as coletas de sangue por punção vaso caudal,
com seringa de 1,0 mL banhada com anticoagulante, EDTA a 3,0%.
A contagem do número de eritrócitos (Erit) foi realizada pelo método do
hemocitômetro em câmara de Neubauer, utilizando-se Azul de Toluidina Merck
a
0,01%, diluído em solução fisiológica 0,9%, em pipeta de Thoma na proporção 1:200.
A taxa de hemoglobina (Hb) foi determinada pelo método da cianometahemoglobina,
utilizando-se kit comercial Hemoglobina Analisa Diagnóstica
, para determinação
colorimétrica. A porcentagem de hematócrito (Htc) foi obtido utilizando-se o método do
microhematócrito. As variáveis acima apresentadas foram avaliadas utilizando-se as
técnicas descritas por Jain (1986). Foram determinados os índices hematimétricos
volume corpuscular médio [VCM = (Htc/eritrócitos) x 10] e concentração de
hemoglobina corpuscular média [CHCM = (Hb/Htc) x100], úteis na classificação
morfológica das anemias e avaliação da resposta eritropoiética (Wintrobe, 1934).
A diferenciação dos leucócitos foi realizada em extensão sanguínea, corada com
May-Grünwald Giemsa (Rosenfeld, 1947). Para tal, as lâminas foram previamente
limpadas, desengorduradas e devidamente identificadas (duas lâminas/peixe). Após a
confecção essas foram acondicionadas em caixas apropriadas e posteriormente coradas
utilizando-se técnica descrita por Jain (1986). A contagem diferencial foi realizada em
microscópio utilizando-se aumento 100X. Foram contadas 200 células, estabelecendo-
se o percentual de cada componente celular de interesse.
26
A proteína plasmática total (PPT) foi mensurada por meio do uso de refratômetro
manual de Goldberg, pela quebra do capilar de microhematócrito logo acima da camada
de leucócitos, após a leitura do hematócrito. Para a análise de albumina foram utilizadas
as mesmas amostras de sangue colhidas para o hemograma. Estas foram centrifugadas
em centrífuga refrigerada Eppendorf
a 3000 rpm durante 10 minutos para obtenção do
plasma. A quantidade de albumina (ALB)foi determinada pelo método do verde de
bromocresol utilizando-se kit comercial Albumina Analisa Diagnóstica
, para
determinação colorimétrica. De posse dos resultados de albumina e proteína plasmática
total foi então determinada a quantidade de globulina (GLOB) no plasma e a relação
albumina:globulina (ALB:GLOB).
Após as avaliações hematológicas, os peixes foram transferidos para a sala
experimental de desafio por temperatura, que era composto de 24 aquários de 40 L, com
filtros individualizados e aeração. Foram distribuídos aleatoriamente 48 peixes, na
densidade de dois peixes por aquário. O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado com oito tratamentos e seis repetições, sendo cada peixe considerado uma
repetição.
Após a distribuição dos peixes, a temperatura da água dos aquários foi
aumentada gradativamente para 32,0ºC, acima do conforto térmico para a espécie,
permanecendo neste valor por três dias. Ao final desse período foram avaliados os
mesmos parâmetros hematológicos do momento anterior ao estímulo.
Os dados de ganho de peso médio, taxa de crescimento específico, taxa de
eficiência protéica e taxa de retenção protéica foram submetidos à técnica de análise de
variância para o modelo com um fator, complementada com teste de comparações
múltiplas de Tukey. Os dados de conversão alimentar aparente (CAA) e sobrevivência
(SOB) foram submetidos ao teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, complementado
com as comparações múltiplas de Dunn (Zar, 1999). Os dados de hematologia foram
submetidos à análise de variância para o modelo de medidas repetidas em grupos
independentes (Johnson e Wichern, 2002).
27
RESULTADOS
Os parâmetros físico-químicos da água: pH, oxigênio dissolvido (mg/L), amônia
total (mg/L) , e alcalinidade (mg de CaCO
3
/ L) foram: 7,0 ± 0,5; 7,05 ± 0,15; 0,11 ±
0,07; 100,00 ± 10,00, respectivamente. Os parâmetros de qualidade da água foram
adequados e recomendados para a espécie em estudo de acordo com Boyd (1996).
Os valores de GP, CR, CAA, TEP, TRP e SOB, para as dietas práticas e
purificadas, estão apresentados na Tabela 3. Os peixes alimentados com as dietas
não suplementadas (prática e purificada) apresentaram menor ganho de peso em
relação aos alimentados com as dietas suplementadas. Os peixes alimentados com
dieta prática suplementada com 10,0 mg de piridoxina apresentaram maior ganho de
peso. Os peixes alimentados com dietas práticas apresentaram maior ganho de peso
e consumo de ração que os que alimentados com dietas purificadas.
Os peixes alimentados com dieta purificada isenta de suplementação
apresentaram pior conversão alimentar aparente em relação aos peixes que
receberam dietas purificadas suplementadas e dietas práticas, suplementadas ou não.
A suplementação de vitamina B
6
não influenciou a taxa de eficiência proteica dos
animais alimentados com dietas práticas. Já nos animais arraçoados com dieta
purificada ausente de suplementação estes índices foram menores.
A suplementação de piridoxina favoreceu a taxa de retenção proteica, sendo
que a inclusão de 10,0 e 20,0 mg de piridoxina/kg nas dietas prática e purificada,
respectivamente, determinaram maior retenção proteica nos peixes. Para
porcentagem de sobrevivência, peixes alimentados com dieta purificada ausente de
suplementação apresentaram menores valores em relação aos alimentados com
dietas purificas e suplementadas com piridoxina e quando comparado com dieta
prática não suplementada.
Na Tabela 4 estão apresentados os valores médios de Erit, Htc, Hb, VCM e
CHCM, na fase anterior (Fase I) e posterior (Fase II) ao estímulo térmico.
A suplementação de piridoxina nas dietas práticas não influenciou o número de
eritrócitos dos peixes antes do estímulo térmico. Porém, peixes alimentados com dietas
purificadas ausentes de piridoxina apresentaram menor número de eritrócitos, antes e
após o estímulo térmico. A porcentagem de hematócrito aumentou em peixes
28
alimentados com dietas prática após o estímulo térmico; apenas os animais arraçoados
com dieta suplementada com 20 mg de piridoxina/ kg apresentaram valores menores
para este parâmetro. Os peixes alimentados com dieta purificada ausente de
suplementação apresentaram baixa porcentagem de hematócrito em relação às dietas
purificadas suplementadas e dieta prática ausente de suplementação.
A taxa de hemoglobina de peixes alimentados com dietas práticas não foi
influenciada pela suplementação de piridoxina. Entretanto, os animais arraçoados com
dieta purificada ausente de suplementação apresentaram menor valor, tanto quando
comparados com os peixes alimentados com dietas purificadas suplementadas, como
quando comparados com os alimentados com dieta prática ausente de piridoxina.
O índice hematimétrico, VCM, não foi influenciado pela suplementação de
piridoxina nas diferentes dietas e momentos. Os animais alimentados com dietas
práticas suplementadas apresentaram maior valores de CHCM apenas no momento
anterior ao estímulo térmico. Quando alimentados com dietas purificadas houve
aumento do CHCM após o estímulo, com exceção dos peixes alimentados com dietas
suplementadas com 20 mg de piridoxina/kg.
A Tabela 5 apresenta a quantidade de PPT, ALB, GLOB e relação A:G de
tilápias alimentadas com dietas práticas e purificadas suplementadas com vitamina B
6
antes e após o estímulo térmico. A suplementação de piridoxina não influenciou a
proteína plasmática total, albumina, globulina e relação A:G dos peixes alimentados
com dietas prática e purificada no momento anterior ao estímulo.
Após o estímulo térmico, os valores de PPT e ALB dos peixes alimentados com
dieta prática suplementada com 20 mg de piridoxina/kg apresentaram-se menores. A
ausência de suplementação na dieta prática causou aumento da PPT nos animais em
relação ao momento anterior ao estímulo e aos peixes alimentados com dieta purificada
isenta de suplementação. A GLOB e a relação A:G não foram influenciadas nem pela
suplementação de vitamina B
6
nem pelo estímulo térmico.
Na Tabela 6 estão apresentadas as medianas da quantidade de leucócitos totais
(LEUC), monócitos (MN), neutrófilos (NT) e linfócitos (LF) de tilápias alimentadas
com dietas práticas e purificadas e níveis crescentes de piridoxina e submetidas a
estímulo térmico. A suplementação de piridoxina não influenciou a quantidade de
leucócitos totais, linfócitos, neutrófilos e monócitos. Após o estímulo térmico, peixes
29
alimentados com dieta prática e suplementada com 5,0 mg de piridoxina/kg
apresentaram menor número de neutrófilos e monócitos. De modo geral, após estímulo
térmico, peixes alimentados com dietas práticas apresentaram maiores valores de
células brancas que peixes alimentados com dietas purificadas.
DISCUSSÃO
Em peixes, o metabolismo e armazenamento de glicogênio são limitados, a
maioria da glicose necessária para a produção de energia provém das proteínas (De
Silva e Anderson, 1995). A forma metabolicamente ativa da vitamina B
6
, piridoxal
fosfato (PLP), é essencial para a produção de energia a partir de aminoácidos, porque
ativa inúmeras aminotransferases, e também pode ser considerada a vitamina de
liberação de energia, pois atua como coenzima da glicogênio fosforilase. Esta enzima
catalisa a primeira etapa de degradação de glicogênio, reação na qual o fosfato
inorgânico (PLP) é usado na clivagem da ligação glicosídica α-1,4, gerando glicose 1-
fosfato (Devlin, 1998).
O desempenho dos animais em ambos os estudos foram afetados pelo nível de
vitamina B
6
suplementado na dieta. Os peixes alimentados com a dieta isenta de
suplementação de piridoxina apresentaram menor ganho de peso, provavelmente,
devido ao comprometimento do metabolismo de aminoácidos e catálise do glicogênio
(Combs, 1998). Apesar do ganho de peso dos peixes alimentados com as dietas práticas
e purificadas apresentarem comportamento semelhante os peixes alimentados com as
dietas purificadas ganharam em média 51,0% menos peso que os alimentados com as
dietas purificadas. Isto, provavelmente, ocorreu devido à baixa palatabilidade da ração,
que diminuiu significativamente o consumo dos peixes por dietas purificadas (46,0%
menor que o consumo das dietas práticas).
A conversão alimentar foi prejudicada em peixes alimentados com dietas
purificadas isentas de vitamina B
6
. Comportamento semelhante foi observado para a
taxa de eficiência protéica, devido à menor deposição de proteína. A suplementação de
piridoxina nas dietas (prática e purificada) proporcionou maior retenção de proteína na
carcaça. Resultados similares foram observados para tilápia híbrida (Shiau e Hsieh,
30
1997) quando estudadas as exigências de piridoxina com diferentes concentrações de
proteína dietária.
Apesar de não ter sido observado efeito significativo sobre a taxa de eficiência
proteica, a suplementação de piridoxina em peixes alimentados com dietas práticas
proporcionou melhores valores para estes parâmetros. A porcentagem de sobrevivência
dos animais que receberam dietas purificadas foi significativamente afetada pela
ausência da vitamina B
6
, chegando a 20%. Baixas taxas de sobrevivência têm sido
relatadas em peixes alimentados com dietas isentas de suplemetação de piridoxina
(Andrews e Murai, 1979; Mohamed, 2001; Huang et al., 2006).
A deficiência de vitamina B
6
em animais e humanos conduz a mudanças
comportamentais, funções sensoriais como hipoacusia (perda de audição) e
hipopselafesia (perda do tato) e outras desordens do sistema nervoso como convulsões e
distúrbios motores (Schaeffer, 1987; Baxter, 2003). O desenvolvimento dessas
anormalidades é consequência do mau funcionamento do sistema nervoso afetado pela
deficiência de vitamina B
6
(Schaeffer, 1987; Groziak e Kirksey, 1990; Wei et al., 1999),
que é evidenciado pelo fato de que neurotransmissores como dopamina, noraepinefrina,
ácido γ-aminobutírico (GABA), serotonina e taurina serem sintetizados por enzimas
dependentes de piridoxal fosfato (Guilarte, 1989; Dakshinamurti, 1990).
Na presente pesquisa, os animais arraçoados com dietas purificadas e ausentes
de suplementação de piridoxina, após a segunda semana do início do período
experimental, apresentaram sinais clínicos de deficiência tais como apatia, natação
errática e hipersensibilidade. Tais sinais também foram observados por Huang et al.
(2006) em Epinephelus coioides deficientes em vitamina B
6
. Apesar das análises não
acusarem a presença de piridoxina nas dietas práticas não suplementadas, o mesmo não
ocorreu em animais arraçoados com estas dietas. Na literatura valores para maior
desempenho produtivo e manutenção dos parâmetros hematológicos foram descritos
para carpa comum, 5,4 mg/ kg (Ogino, 1965); red seabream (5,0 a 6,0 mg/ kg) (Takeda
e Yone, 1971); turbot (1,0 a 2,5 mg/ kg) (Adron et al., 1978); bagre do canal (3,0 mg/
kg) (Andrews e Murai, 1979), gilthead seabream (1,97 mg/ kg) (Kissil et al., 1981) e
bagre indiano (3,21 mg/ kg) (Mohamed, 2001).
Além dos sinais clínicos de deficiência de vitamina B
6
observados, alta taxa de
infecção por organismos patogênicos foram notados nos animais na avaliação post
31
mortem. Esses efeitos podem ser relacionados às atividades diminuídas de várias
enzimas dependentes de piridoxal fosfato, tais como serina transhidroximetilase e
timidilato sintetase, diminuindo o metabolismo do carbono-1 e a síntese de DNA, que
atua na diferenciação de células do sistema imune (Combs, 1998; Devlin, 1998).
Uma hipótese para a diferença na porcentagem de sobrevivência e detecção de
sinais clínicos de deficiência entre os animais alimentados com a dieta prática e
purificada ausente de suplementação de vitamina B
6
seria que, ainda que os sinais
clínicos observados nos animais alimentados com a dieta ausente de suplementação de
vitamina B
6
sejam correlatos a esta deficiência, é necessário ressaltar que, o consumo de
ração por esses animais foi 46,0% menor se comparado com os animais que receberam
a ração prática não suplementada com piridoxina. Isto demonstra que o baixo consumo
de ração pode ter determinado não só a deficiência de vitamina B
6
, porém dos demais
nutrientes necessários para o crescimento e saúde dos peixes, o que culminou na baixa
porcentagem de sobrevivência e possível infecção por agentes patógenos. O maior
período de arraçoamento (15 dias) com a dieta prática ausente de suplementação de
piridoxina invalida a hipótese de maior reserva desta vitamina para os peixes que
receberam esta ração. Outra possível explicação para esta diferença seria a provável
síntese desta vitamina pelas bactérias do trato digestório, porém a literatura descreve
esta ação somente para animais que desenvolvem coprofagia (Combs, 1998), o que
também invalida esta hipótese.
O estudo dos componentes do sangue e suas funções tem sido importante
ferramenta para o conhecimento das condições de equilíbrio orgânico normal e
patológico. Por meio da hematologia é possível determinar a influência de condições
nutricionais e ambientais, que possam alterar a higidez dos peixes, colaborando no
diagnóstico de condições adversas (Ranzani-Paiva e Silva-Souza, 2004) e na
compreensão da relação entre as características sanguíneas e a saúde dos peixes e sua
associação com o ambiente (Tavares-Dias et al., 1999).
As características hematológicas dos peixes hígidos apresentam ampla variação
em função de fatores internos e externos. Desta forma, para se utilizar estes parâmetros
como instrumento de diagnóstico de possíveis patologias é preciso, inicialmente,
conhecer os valores normais, considerando-se a amplitude de variação fisiológica destes
e as características de cada espécie em cada local (Ranzani-Paiva e Silva-Souza, 2004).
32
Nesta pesquisa, a suplementação com piridoxina, em dietas purificadas, manteve
o eritrograma dos peixes dentro dos parâmetros normais, definido por Feldman et al.
(2000) para a espécie: 1,91-2,83 x 10
6
/µL, 27-37 % e 7,0-9,8 g/dL para número de
eritrócitos, porcentagem de hematócrito e taxa de hemoglobina, respectivamente. Em
pesquisas realizadas, sob mesmas condições laboratoriais e com a mesma espécie,
definiram a faixa de valores normais entre 1,82-1,98 x 10
6
/µL, 26-29 % e 6,9-8,5 g/dL
para número de eritrócitos, porcentagem de hematócrito e taxa de hemoglobina,
respectivamente (Barros et al., 2009).
Os peixes alimentados com dietas purificadas e não suplementadas com
piridoxina apresentaram valores hematológicos abaixo do considerado normal para a
tilápia sadia, caracterizando anemia normocítica hipocrômica. Esses resultados
corraboram com os obtidos para garoupa (Mohamed et al., 2001; Huang et al., 2006),
podendo-se admitir que a manutenção das funções hematopoiéticas normais exige níveis
adequados dos nutrientes e micronutrientes, como a vitamina B
6
, que é necessária para
produção normal de células vermelhas (Feldman et al., 2000).
Patos, suínos e cães alimentados com dietas não suplementadas com vitamina B
6
apresentaram anemia (Scott et al., 1976). Em peixes, a marcada redução no número de
eritrócitos foi observada em salmão Chinook (Halver, 1957), salmão coho (Smith,
1967), truta arco-íris (Smith et al., 1974) e Heteropneustes fossilis (Mohamed, 2001)
alimentados com dietas isentas de piridoxina. Valores abaixo do considerado normal
para a porcentagem de hematócrito também foram observados em tilápia vermelha
híbrida (Lim et al., 1995) quando alimentada com dietas não suplementadas.
A enzima ALA sintetase, que é dependente de piridoxal fosfato, controla a
velocidade da síntese do heme em todos os tecidos. A modulação da atividade da ALA
sintetase determina a quantidade dos substratos que serão desviados para a biossíntese
do heme (Devlin, 1998). Desta forma, a ausência de suplementação de vitamina B
6
na
dieta purificada prejudicou a síntese de hemoglobina nos peixes, pela ativação
insuficiente da enzima e, por consequência, queda na síntese do heme e diminuição
significativa do número de eritrócitos sintetizados.
Em dietas purificadas as necessidades nutricionais dos animais são atendidas por
meio de ingredientes de grau analítico puros. Desta forma é possível minimizar fatores
da dieta que interferem na hipótese (Guimarães, 2009), o que não acontece quando são
33
utilizadas dietas formuladas com ingredientes integrais como farelos e grãos, que são
ricos em vitamina B
6
(Lebiedzińska e Szefer, 2006), entretanto quando passam por
processo de extrusão, os níveis podem diminuir consideravelmente (Lassen et al., 2002;
Martin-Belloso e Lianos-Barriobero, 2001).
As análises de HPLC feitas na dieta prática ausente de suplementação de
vitamina B
6
, não detectaram a presença da vitamina e, apesar disto, o perfil
hematológico dos peixes alimentados com essa dieta apresentou-se dentro da faixa de
normalidade para a espécie. Uma hipótese para esta resposta seria que o tempo de 91
dias não foi suficiente para determinar anemia pela ausência de piridoxina. A diferença
de perfil hematológico entre os peixes alimentados com a dieta purificada e prática
ausente de suplementação de B
6
pode ser explicada pelo baixo consumo da ração
purificada, o qual foi em média 46,0% inferior e, por consequência, refletiu na
capacidade de manutenção do perfil hematológico.
Comparando-se o perfil hematológico antes e após o estímulo térmico, notou-se
que, apesar da suplementação de piridoxina não o ter influenciado, ocorreu aumento da
eritropoiese em 3,87% (prática) e 8,84% (purificada) em peixes alimentados com dietas
não suplementadas, possivelmente na tentativa de compensar fisiologicamente o
estresse sofrido devido à menor disponibilidade de oxigênio dissolvido na água (Val et
al., 2004), em decorrência da alta temperatura (32ºC), e na tentativa de retorno à
homeostase.
A alta temperatura imposta aos peixes alimentados com as rações práticas e
purificadas não determinou a liberação de células imaturas (VCM), demonstrando que
os peixes, mesmo sob condições adversas, continuaram a liberar células de tamanho
considerado normal para a tilápia segundo Feldman et al.(2000). A concentração de
hemoglobina corpuscular média reflete as respostas da taxa de hemoglobina e
porcentagem de hematócrito e, portanto, seguem a tendência destes e podem ser
considerados constantes. Vale ressaltar que os valores apresentados pelos peixes são
considerados normais para a espécie (Feldman et al., op. cit.).
Nesta pesquisa a série branca, apesar de não ter sido influenciada pelos
tratamentos, diminuiu discretamente nos peixes alimentados com dietas ausentes de
suplementação após o estímulo térmico. O número de leucócitos dos peixes alimentados
34
com dietas purificadas foi em média 56% menor do que os animais alimentados com
dietas práticas, provavelmente causado pelo menor consumo de ração destes animais.
A imunidade inata é mais pronunciada em peixes, essa primeira linha de defesa é
composta por neutrófilos e macrófagos (Tizard, 2002). Diminuição significativa no
número de neutrófilos foi observada após o estímulo térmico em peixes alimentados
com dieta isenta de suplementação de piridoxina. Porém, peixes alimentados com dieta
prática não suplementada apresentaram discreto aumento deste parâmetro,
provavelmente por estes animais se encontrarem em condição fisiológica melhor do que
os alimentados com dietas purificadas. Isto demonstra que o baixo consumo de ração
pode ter determinado não só a deficiência de vitamina B
6
, mas também a baixa
porcentagem de sobrevivência e possível infecção por agentes patógenos.
As moléculas de anticorpos (imunoglobulinas) são glicoproteínas com quatro
cadeias polipeptídicas, sendo dois tipos de cadeias diferentes, com duas cópias idênticas
de cada. No tipo mais comum de imunoglobulina, IgG, as cadeias H têm
aproximadamente 440 aminoácidos, e as cadeias menores apresentam cerca de 220
aminoácidos (Devlin, 1998). Alguns dos aminoácidos que compõem essas cadeias têm
como cofator enzimático o piridoxal fosfato, tais como: cisteína, serina, treonina e
metionina (transmetilação), suprimindo, desta forma o sistema imune específico de
animais deficientes em vitamina B
6
(Combs, 1998). A variação de temperatura da água
é considerada um dos principais fatores estressores aos peixes. Como consequência,
pode-se relatar ainda o aumento da suscetibilidade a patógenos oportunistas (Falcon,
2007).
O comprometimento da resistência orgânica em peixes sob condições de estresse
tem sido também avaliado por meio da concentração de proteína plasmática. A proteína
plasmática total refere-se à fração albumina e globulina presente no plasma ou soro
sanguíneo. Estas duas classes de proteínas do soro são produzidas no fígado, sendo a
primeira, a fração mais abundante e responsável pelo transporte de nutrientes e
manutenção do equilíbrio osmótico do sangue, enquanto a fração globulina está
envolvida nos mecanismos de defesa do animal. Em monogástricos, a restrição dietética
de proteína pode causar hipoproteinemia e hipoalbumineia, mas as concentrações de
globulina normalmente não sofrem alterações (Thomas, 2000). Alterações significativas
nos valores de PPT e ALB após o desafio térmico podem refletir possível condição de
35
estresse dos animais. Isto possivelmente seria confirmado, por alterações significativas
no leucograma dos peixes, se o período sob condições de alta temperatura fosse maior
que três dias. Esta hipótese está embasada na tendência demonstrada pelos valores do
leucograma após o desafio.
Conclui-se que a exigência de vitamina B
6
para o crescimento normal e higidez
da tilápia do Nilo é de 5,0 mg de piridoxina /kg de dieta prática.
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th
ed. New Jersey: Prentice Hall.
39
Tabela 1. Composição químico-bromatológica e o percentual dos ingredientes
das dietas experimentais práticas
Ingrediente (%)
0,0
mg/kg
5,0
mg/kg
10,0
mg/kg
20,0
mg/kg
Farelo soja
62,20
62,20
62,20
62,20
Fubá milho
4,00
4,00
4,00
4,00
Quirera de arroz
24,00
23,995
23,99
23,98
Óleo de peixe
1,00
1,00
1,00
1,00
Óleo de soja
1,00
1,00
1,00
1,00
Celulose
0,70
0,70
0,70
0,70
Dl-metionina
0,45
0,45
0,45
0,45
Treonina
0,25
0,25
0,25
0,25
Fosfato bicálcico
5,99
5,99
5,99
5,99
Vitamina B
6
(96%)
0,00
0,0048
0,0096
0,0192
Vitamina C (35,0%)
0,04
0,04
0,04
0,04
Sal comum
0,10
0,10
0,10
0,10
Suplemento vitamínico
a
0,15
0,15
0,15
0,15
Suplemento mineral
b
0,10
0,10
0,10
0,10
BHT
c
0,02
0,02
0,02
0,02
Composição proximal
d
Energia Bruta (kcal/kg)
4414
4485
4525
4598
Proteína Bruta (%)
37,33
37,32
38,16
37,88
Umidade (%)
7,00
7,30
8,00
7,90
Extrato etéreo (%)
1,09
1,30
1,20
1,21
Cinzas (%)
10,22
10,43
10,15
10,34
Piridoxina (analisado)
(mg/kg da dieta)
nd
5,0
11,0
22,0
a
Suplemento vitamínico, níveis de garantia por kg da dieta: vitamina A, 16060 UI; vitamina D3, 4510 UI; vitamina E,
250 UI; vitamina K, 30 mg; vitamina B1, 32 mg; vitamina B2, 32 mg; pantotenato de cálcio, 80 mg; niacina, 170 mg;
biotina, 10 mg; ácido fólico, 10 mg; vitamina B12, 32 µg.
b
Suplemento mineral, níveis de garantia por kg da dieta:
Na2SeO3, 0,7 mg; MnO, 50mg; ZnO, 150 mg; FeSO
4
, 150 mg; CuSO
4
, 20 mg; CoSO
4
, 0,5 mg; I
2
Ca, 1 mg.
c
antioxidante Butil hidroxitolueno.
d
analisado.
40
Tabela 2. Composição químico-bromatológica e o percentual dos ingredientes
das dietas experimentais purificadas
Ingrediente (%)
0,0
mg/kg
5,0
mg/kg
10,0
mg/kg
20,0
mg/kg
Albumina
30,00
30,00
30,00
30,00
Gelatina
6,75
6,75
6,75
6,75
Amido de milho
47,18
47,175
47,17
47,16
Óleo de peixe
3,00
3,00
3,00
3,00
Celulose
6,00
6,00
6,00
6,00
Sal mineral
0,10
0,10
0,10
0,10
Vitamina C (35%)
0,05
0,05
0,05
0,05
Fosfato bicálcico
6,65
6,65
6,65
6,65
Vitamina B
6
(96%)
0,00
0,0048
0,0096
0,0192
Suplemento vitamínico
a
0,15
0,15
0,15
0,15
Suplemento mineral
b
0,10
0,10
0,10
0,10
BHT
c
0,02
0,02
0,02
0,02
Composição proximal
d
Energia Bruta (kcal/kg)
4480
4581
4463
4452
Proteína Bruta (%)
35,19
36,29
35,82
36,25
Umidade (%)
6,10
5,90
5,70
6,00
Extrato etéreo (%)
1,95
1,75
2,09
2,29
Cinzas (%)
7,64
5,57
7,92
8,01
Piridoxina (analisado)
(mg/kg da dieta)
nd
15,0
37,0
82,0
a
Suplemento vitamínico, níveis de garantia por kg da dieta: vitamina A, 16060 UI; vitamina D3, 4510 UI; vitamina E,
250 UI; vitamina K, 30 mg; vitamina B1, 32 mg; vitamina B2, 32 mg; pantotenato de cálcio, 80 mg; niacina, 170 mg;
biotina, 10 mg; ácido fólico, 10 mg; vitamina B12, 32 µg.
b
Suplemento mineral, níveis de garantia por kg da dieta:
Na2SeO3, 0,7 mg; MnO, 50mg; ZnO, 150 mg; FeSO
4
, 150 mg; CuSO
4
, 20 mg; CoSO
4
, 0,5 mg; I
2
Ca, 1 mg.
c
antioxidante Butil hidroxitolueno.
d
analisado.
41
Tabela 3. Média e desvio padrão de ganho de peso (GP), consumo de ração (CR), conversão alimentar aparente (CAA),
taxa de crescimento específico (TCE), taxa de eficiência protéica (TEP), taxa de retenção protéica (TRP) e sobrevivência
(SOB) de juvenis de tilápia do Nilo alimentadas com dietas práticas e purificadas suplementadas com níveis crescentes de
vitamina B
6
.
Vitamina B
6
1
(mg)
Prática
GP
(g)
CR
(g)
CAA
TEP
(%)
TRP
(%)
SOB
(%)
0,0
101,81 ± 7,18 aB
156,66 ± 2,62 aB
1,56 ± 0,27 aA
2,35 ± 0,32 aA
38,75 ± 1,32 aB
85,41 ± 28,77 aB
5,0
132,27 ± 23,16 abB
166,49 ± 7,21 aB
1,31 ± 0,33 aA
2,86 ± 0,56 aB
45,88 ± 1,65 bB
95,84 ± 11,77 aA
10,0
135,51 ± 31,60 bB
163,78 ± 4,50 aB
1,34 ± 0,64 aA
2,99 ± 0,77 aB
51,02 ± 1,68 cB
87,50 ± 29,20 aA
20,0
119,85 ± 27,49 abB
150,19 ± 9,09 aB
1,32 ± 0,31 aA
2,84 ± 0,62 aB
49,79 ± 1,19 cB
97,90 ± 5,90 aA
Vitamina B
6
1
(mg)
Purificada
GP
CR
CAA
TEP
TRP
SOB
0,0
49,68 ± 5,26 aA
87,06 ± 0,89 aA
1,95 ± 0,31 bB
2,04 ± 0,27 aA
27,79 ± 0,78 aA
28,57 ± 10,69 aA
5,0
62,54 ± 9,40 bA
86,99 ± 0,83 aA
1,41 ± 0,11 aA
2,56 ± 0,21 bA
37,64 ± 1,95 bA
82,86 ± 29,28 bA
10,0
62,07 ± 10,43 bA
83,37 ± 2,79 aA
1,38 ± 0,21 aA
2,64 ± 0,37 bA
39,98 ± 1,63 bA
94,29 ± 9,76 bA
20,0
65,74 ± 8,55 bA
87,25 ± 1,08 aA
1,34 ± 0,17 aA
2,69 ± 0,34 bA
43,94 ± 1,31 cA
97,14 ± 18,00 bA
1
Níveis de suplementação de vitamina B
6
em mg kg
-1
de dieta.
Letras minúsculas comparam os diferentes níveis de piridoxina.
Letras maiúsculas comparam as diferentes dietas dentro dos níveis de piridoxina.
42
Tabela 4. Média e desvio padrão do número de eritrócitos (Erit), porcentagem de hematócrito (Htc), taxa de hemoglobina (Hb), volume corpuscular
médio (VCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) de juvenis de tilápia do Nilo alimentadas com dietas práticas e purificadas e
suplementadas com níveis crescentes de vitamina B
6
e submetidos a estímulo térmico.
Erit
(10
6
/µL)
Htc
(%)
Hb
(dL)
VCM
(fL)
CHCM
(%)
Vitamina B
6
1
Prática
Fase I
2
Fase II
3
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
0,0
2,23 ± 0,26 aAα
2,32 ± 0,27 aAα
30,00 ± 4,67 aAα
31,93 ± 2,47 abAα
6,76 ± 1,25 aAα
7,49 ± 0,66 aAα
134,45 ± 18,20 aAα
138,56 ± 11,00 aAα
22,28 ± 1,98 aAα
23,47 ± 1,06 aAα
5,0
2,30 ± 0,38 aAα
2,18 ± 0,40 aAα
31,31 ± 3,54 aAα
32,38 ± 3,55 abAα
7,04 ± 0,67 aAα
7,48 ± 0,74 aAα
138,15 ± 15,27 aAα
152,02 ± 29,20 aAα
22,57 ± 1,83 abAα
23,19 ± 1,50 aAα
10,0
2,16 ± 0,22 aAα
2,23 ± 0,33 aAα
30,86 ± 3,08 aAα
34,36 ± 6,35 bAα
7,52 ± 0,87 aAα
7,74 ± 1,11 aAα
143,54 ± 11,11 aAα
156,02 ± 32,58 aAα
24,37 ± 1,41 bAα
22,70 ± 2,14 aAα
20,0
2,18 ± 0,35 aAα
2,02 ± 0,36 aAα
30,00 ± 3,15 aAα
29,75 ± 6,16 aAα
7,15 ± 0,64 aAα
6,94 ± 1,79 aAα
139,03 ± 9,85 aAα
149,51 ± 29,83 aAα
23,91 ± 1,40 abAα
23,12 ± 1,85 aAα
Vitamina B
6
1
Purificada
0,0
1,65 ± 0,16 aAβ
1,81 ± 0,40 aAβ
23,90 ± 2,88 aAβ
25,40 ± 3,36 aAβ
5,42 ± 0,70 aAβ
5,88 ± 0,49 aAβ
144,62 ± 15,88 aAα
143,44 ± 20,94 aAα
22,70 ± 0,96 aAα
23,33 ± 1,81 abAα
5,0
2,24 ± 0,32 bAα
2,36 ± 0,41 aAα
30,13 ± 4,03 bAα
32,56 ± 5,75 bAα
7,05 ± 1,03 bAα
7,24 ± 0,95 bAα
135,48 ± 16,90 aAα
139,58 ± 20,72 aAα
23,39 ± 1,02 aAα
22,50 ± 2,38 aAα
10,0
1,86 ± 0,39 abAα
2,26 ± 0,20 aAα
26,07 ± 4,22 abAβ
31,00 ± 2,99 abAα
6,00 ± 0,94 abAβ
7,04 ± 0,58 abAα
142,04 ± 18,34 aAα
137,43 ± 7,23 aAα
23,02 ± 1,00 aAα
22,78 ± 1,32 abAα
20,0
2,00 ± 0,24 abAα
2,22 ± 0,28 aAα
28,33 ± 2,07 abAα
27,92 ± 3,12 abAα
6,83 ± 0,67 abAα
6,84 ± 1,00 abAα
142,26 ± 8,95 aAα
126,65 ± 12,96 aAβ
24,13 ± 2,03 aAα
24,49 ± 2,01 bAα
1
Níveis de suplementação de vitamina B
6
em mg kg
-1
de dieta.
2
Fase I: antes do estímulo térmico.
3
Fase II: após o estímulo térmico.
Letras minúsculas: comparação de níveis de vitamina B
6
fixado o momento.
Letras maiúsculas: comparação de momento dentro de tratamento.
Letras gregas: comparação das diferentes dietas dentro dos níveis de piridoxina.
43
Tabela 5. Média e desvio padrão de proteína plasmática total (PPT), albumina (ALB), globulina (GLOB) e relação
albumina/globulina (ALB:GLOB) de juvenis de tilápia do Nilo alimentadas com dietas práticas e purificadas e
suplementadas com níveis crescentes de vitamina B
6
e submetidos a estímulo térmico.
1
Níveis de suplementação de vitamina B
6
em mg kg
-1
de dieta.
2
Fase I: antes do estímulo térmico.
3
Fase II: após o estímulo térmico.
Letras minúsculas: comparação de níveis de vitamina B
6
fixado o momento.
Letras maiúsculas: comparação de momento dentro de tratamento.
Letras gregas: comparação das diferentes dietas dentro dos níveis de piridoxina.
PPT
(mg/dL)
ALB
(mg/dL)
GLOB
(mg/dL)
ALB:GLOB
Vitamina B
6
1
Prática
Fase I
2
Fase II
3
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
0,0
2,93 ± 0,49 aAα
3,50 ± 0,46 bBα
0,95 ± 0,27 aAα
1,06 ± 0,17abAα
1,98 ± 0,46 aAα
2,44 ± 0,44 aAα
0,51 ± 0,21 aAα
0,45 ± 0,11 aAα
5,0
2,89 ± 0,35 aAα
3,34 ± 0,40 abAα
0,95 ± 0,13 aAα
1,04 ± 0,26 abAα
1,94 ± 0,37 aAα
2,31 ± 0,51 aAα
0,51 ± 0,11 aAα
0,49 ± 0,25 aAα
10,0
2,96 ± 0,68 aAα
3,43 ± 0,45 abAα
0,99 ± 0,13 aAα
1,25 ± 0,47 bAα
1,97 ± 0,60 aAα
2,18 ± 0,55 aAα
0,55 ± 0,21 aAα
0,67 ± 0,52 aAα
20,0
2,71 ± 0,45 aAα
2,96 ± 0,59 aAα
0,99 ± 0,20 aAα
0,85 ± 0,21 aAα
1,72 ± 0,41 aAα
2,11 ± 0,66 aAα
0,61 ± 0,22 aAα
0,46 ± 0,26 aAα
Vitamina B
6
1
Purificada
0,0
2,75 ± 0,86 aAα
2,98 ± 0,25 aAβ
0,81 ± 0,12 aAα
0,85 ± 0,09 aAα
2,22 ± 0,57 aAα
2,03 ± 0,33 aAα
0,38 ± 0,11 aAα
0,43 ± 0,11 aAα
5,0
3,25 ± 0,32 aAα
3,46 ± 0,51 aAα
0,75 ± 0,13 aAα
0,83 ± 0,09 aAα
2,51 ± 0,33 aAβ
2,63 ± 0,51 aAα
0,30 ± 0,07 aAα
0,33 ± 0,08 aAα
10,0
2,95 ± 0,41 aAα
3,29 ± 0,32 aAα
0,74 ± 0,14 aAα
0,83 ± 0,11 aAβ
2,21 ± 0,37 aAα
2,46 ± 0,31 aAα
0,34 ± 0,08 aAβ
0,34 ± 0,07 aAα
20,0
3,12 ± 0,40 aAα
3,36 ± 0,10 aAα
0,83 ± 0,11 aAα
0,85 ± 0,06 aAα
2,32 ± 0,38 aAβ
2,51 ± 0,09 aAα
0,37 ± 0,08 aAα
0,34 ± 0,03 aAβ
44
Tabela 6. Mediana e valores mínimo e máximo de número absoluto leucócitos (LEUC), linfócitos (LF), neutrófilos (NT) e monócitos
(MN) de juvenis de tilápia do Nilo alimentadas com dietas práticas suplementadas com níveis crescentes de vitamina B
6
e submetidos a
estímulo pelo calor.
1
Níveis de suplementação de vitamina B
6
em mg kg
-1
de dieta.
2
Fase I: antes do estímulo térmico.
3
Fase II: após o estímulo térmico.
Letras minúsculas: comparação de níveis de vitamina B
6
fixado o momento.
Letras maiúsculas: comparação de momento dentro do tratamento.
Letras gregas: comparação das diferentes dietas dentro dos níveis de piridoxina.
LEUC
(10
4
céls/µL)
LF
(10
4
céls/µL)
NT
(10
4
céls/µL)
MN
(10
4
céls/µL)
Vitamina B
6
1
Prática
Fase I
2
Fase II
3
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
Fase I
Fase II
0,0
24,15 aAα
(15,00 – 27,50)
21,85 aAα
(16,50 – 30,60)
21,47 aAα
(13,36 – 24,75)
18,15aAα
(13,69 – 28,92)
1,75 aAα
(0,90 – 3,66)
1,67 aAα
(0,60 – 3,92)
0,82 aAα
(0,24 – 2,22)
0,66 aAα
(0,46 – 1,57)
5,0
22,60 aAα
(15,30 – 28,40)
23,45 aAα
(13,80 – 29,50)
17,87 aAα
(12,39 – 24,75)
21,53 aAα
(12,28 – 28,18)
2,14 aBα
(1,21 – 4,19)
1,23 aAα
(0,44 – 3,83)
1,14 aBα
(0,12 – 1,86)
0,68 aAα
(0,22 – 0,88)
10,0
19,98 aAα
(13,10 – 22,80)
21,50 aAα
(15,60 – 25,90)
18,54 aAα
(12,12 – 21,09)
20,25 aAα
(11,54 – 20,98)
1,18 aAα
(0,39 – 2,65)
0,84 aAα
(0,65 – 3,88)
0,59 aAα
(0,26 – 1,57)
0,65 aAα
(0,11 – 1,43)
20,0
18,40 aAα
(12,90 – 29,10)
22,55 aAα
(16,60 – 27,40)
15,14 aAα
(10,97 – 24,34)
19,38 aAα
(15,60 – 24,66)
2,72 aBα
(1,04 – 5,53)
1,23 aAα
(0,58 – 2,70)
0,57 aAα
(0,09 – 2,91)
0,79 aAα
(0,19 – 1,76)
Vitamina B
6
1
Purificada
0,0
12,35 aAα
(8,80 – 19,00)
12,10 aAα
(6,45 – 18,10)
11,42 aAβ
(7,66 – 18,53)
11,68 aAβ
(5,45 – 17,38)
0,88 aAα
(0,19 – 1,80)
0,61 aAα
(0,29 – 1,24)
0,31 aAα
(0,26 – 0,45)
0,19 aAβ
(0,09 – 0,39)
5,0
11,23 aAβ
(5,15 – 21,30)
11,78 aAβ
(7,70 – 18,60)
10,66 aAα
(4,84 – 20,87)
11,30 aAβ
(7,05 – 17,58)
0,36 aAβ
(0,21 – 0,68)
0,40 aAα
(0,27 – 0,65)
0,21 aAβ
(0,10 – 0,43)
0,30 aAα
(0,15 – 0,37)
10,0
13,95 aAα
(8,25 – 21,05)
15,95 aAβ
(8,55 – 19,00)
12,76 aAα
(7,55 – 19,87)
13,80 aAα
(7,74 – 18,24)
0,55 aAα
(0,29 – 0,87)
0,59 aAα
(0,17 – 1,28)
0,31 aAα
(0,05 – 0,84)
0,69 aAα
(0,09 – 1,11)
20,0
10,83 aAβ
(7,90 – 16,00)
12,93 aAβ
(6,15 – 18,10)
10,17 aAα
(7,23 – 15,52)
11,83 aAβ
(5,69 – 16,92)
0,42 aAβ
(0,16 – 0,87)
0,72 aAα
(0,18 – 0,81)
0,24 aAα
(0,08 – 0,45)
0,36 aAα
(0,22 – 0,57)
45
IMPLICAÇÕES 1
2
A piridoxina desempenha função importante no metabolismo de proteínas e na 3
eritropoiese de peixes. Portanto, as rações devem atender as recomendações mínimas 4
dessa vitamina para a manutenção da higidez e desenvolvimento da tilápia do Nilo; 5
6
O processo de cozimento à alta pressão, umidade e temperatura pode causar 7
degradação das vitaminas em suplementos e ingredientes, este processo frequentemente 8
é utilizado por indústrias em rações comerciais para peixes. A maioria das pesquisas 9
com vitamina B
6
para peixes são desenvolvidas utilizando-se rações purificadas. Nesta 10
pesquisa, utilizou-se tanto rações purificadas como práticas, sendo que o uso de rações 11
práticas aproximou-se da realidade das indústrias, possibilitando considerar a 12
estabilidade da fonte de vitamina após o seu processamento, de forma que estivesse 13
presente no produto final; 14
15
Em toda a produção a relação custo/benefício do produto a ser utilizado deve ser 16
considerada. No processo industrial de criação de peixes, a ração representa parte 17
considerável do custo total de produção, e apesar de serem utilizadas em pequenas 18
quantidades, as vitaminas são nutrientes onerosos. Portanto, as rações devem ser 19
formuladas de acordo com a fase de vida do animal, melhorando desta forma, os índices 20
zootécnicos e determinando o sucesso econômico da produção. Esta adequação 21
representa valores maiores destes nutrientes, como a piridoxina, na fase larval, com 22
posterior diminuição da exigência com o crescimento dos peixes. 23
24
A ausência de sinais clínicos e anemia em peixes alimentados com dieta prática 25
isenta de suplementação de piridoxina, provavelmente, deve-se ao período experimental 26
(91 dias), levando-se em consideração a alta variabilidade da meia vida dos eritrócitos 27
de peixes (50 a 150 dias). Possivelmente, estudos com períodos experimentais mais 28
longos possam evidenciar sinais clínicos e anemia em animais alimentados com dietas 29
práticas não suplementadas com vitamina B
6
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