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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
“Desenvolvimento de uma Metodologia para o Controle de Qualidade
de Medicamento Injetável, sem Violação da Ampola, usando
Espectroscopia NIR e Técnicas Quimiométricas”
Por:
Fátima Aparecida Castriani Sanches
Fátim a A parecida Castriani SanchesFátim a A parecida Castriani Sanches
Fátim a A parecida Castriani Sanches
João Pessoa/PB - Brasil
2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
“Desenvolvimento de uma Metodologia para o Controle de Qualidade
de Medicamento Injetável, sem Violação da Ampola, usando
Espectroscopia NIR e Técnicas Quimiométricas”
Fátim a A parecida Castriani Sanches
Fátim a A parecida Castriani SanchesFátim a A parecida Castriani Sanches
Fátim a A parecida Castriani Sanches
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1º Orientador (a): Prof. Dr. Mário César Ugulino de Araújo
2º Orientador (a): Prof
a
. Dra. Elaine Cristina Lima do Nascimento
Bolsista:
João Pessoa – Novembro/2009.
ads:
S211d Sanches, Fátima Aparecida Castriani.
Desenvolvimento de uma metodologia para o controle de
qualidade de medicamento injetável, sem violação da
ampola, usando espectroscopia NIR e técnicas quimiométri-
cas / Fátima Aparecida Castriani Sanches.- João Pessoa,
2009.
72f. : il.
Orientadores: Mário César Ugulino de Araújo, Elaine
Cristina Lima do Nascimento
Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCEN
1. Química Analítica. 2. Medicamento injetável – controle
de qualidade. 3. Espectroscopia. 4. NIR. 5. Quimiometria.
UFPB/BC CDU: 543(043)
À Deus, pai misericordioso,que em sua
infinita bondade, nunca me desamparasse.
À minha querida família, principalmente,
à meus amados filhos, como incentivo,
com muito amor,
dedico .
AGRADECIMENTOS
Ao meu bondoso e amado Pai, Senhor e Deus meu, por tudo.
Ao professor Mário Ugulino, por me acolher no LAQA; pelas orientações
ministradas na vida acadêmica e mestrado; pelos conhecimentos transmitidos; pelos
conselhos; pelo respeito e amizade cedidos.
À professora Regiane de Cássia, por ter me iniciado na pesquisa científica; por
estar sempre por perto; pelo carinho, respeito, conhecimento e amizade cedidos.
À Elaine Cristina e à Claudete Fernandes, pela co-orientação em fases distintas
de minha dissertação; pela ajuda prestada e conhecimentos transmitidos; pela amizade.
Ao CNPq, pela bolsa concedida.
Às indústrias farmacêuticas: Isofarma e Farmace.
Aos farmacêuticos dos hospitais da cidade de João Pessoa, em especial, à
Adelaide e à Lorena.
Aos professores Edvan Cirino, Teresa Saldanha e Célio Pasquini, pelos
conhecimentos transmitidos; pelas conversas enriquecedoras em momentos de dúvidas e
de idéias eminentes.
Aos professores e amigos do Departamento de Farmácia, Departamento de
Química e da Pós Graduação, pelos conhecimentos ministrados. E aos amigos de outros
laboratórios de pesquisa, principalmente, à estimada amiga Ladjane Sodré.
Aos amigos do LAQA de ontem e de hoje, principalmente à Josenita e ao
Williame, por me aturarem e me aconselharem em diversos momentos.
Aos meus pais, em especial à minha querida mãe, uma verdadeira fonte de
inspiração, por quem sinto muito orgulho, admiração e respeito.
À minha irmã Madalena, por tudo. Saiba que hoje eu cheguei até aqui,
literalmente, graças a você.
À Nira e João, pelo carinho, amor e respeito que sempre nos dedicaram.
À minha sogra, pela ajuda prestada com as crianças e por me ajudar em
momentos de precisão.
Ao meu esposo Valter Adriano, pela paciência e sabedoria transmitidas em
momentos rudes. Pelo incentivo prestado em momentos de desânimo e tristeza. Pelo
infindo amor a mim concedido.
Aos meus queridos filhos, pela compreensão de tantos momentos ausentes; pelos
abraços e beijinhos carinhosos; por me darem essa alegria inigualável de ser sua mãe.
Carinhosamente, eu agradeço.
O sábio que sabia quase tudo.
Certa vez um sábio, que atravessava um rio de barco,
perguntou ao barqueiro: "Diga-me uma coisa, você conhece
botânica?" O barqueiro olhou surpreso para o sábio e respondeu:
"Não, senhor, não sei o que é isso". E o sábio continuou: "Você não
sabe botânica, a ciência que estuda as plantas? Que pena! Você
perdeu parte da sua vida". O barqueiro continuava remando rio a
dentro, e, em seguida o sábio perguntou se ele conhecia um pouco
de astronomia. O pobre barqueiro coçou a cabeça e disse: "Não
senhor; não sei o que é Astronomia". "Astronomia é a ciência que
estuda os astros, o espaço, as estrelas", explicou o grande sábio.
"Que pena! Você perdeu parte de sua vida sem saber o que é
Astronomia". E o sábio foi perguntando a respeito de cada ciência:
física, química, teologia, filosofia. De nada o barqueiro sabia. E o
sábio sempre terminava o seu refrão. "Que pena! Você perdeu parte
de sua vida". De repente, o barco bateu contra uma pedra, partiu-se
e começou a afundar; e o barqueiro perguntou ao sábio: "O senhor
sabe nadar?" "Não, não sei" respondeu o sábio. "Que pena, o
senhor perdeu toda a sua vida".
Existem muitas pessoas preparadas por cursos acadêmicos,
conquistaram seus grandes títulos, falam diversos idiomas, são
eruditos de nossa época, mas sem conhecer o Senhor Jesus, nada o
salvará na hora da morte. De nada valem milhares de livros se o
leitor não fizer uso da Bíblia, a carta de Deus para os homens.
Sábio é aquele que vive com Cristo neste mundo e no além.
Emerson Alves
SUMÁRIO
i
ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................... iii
ÍNDICE DE TABELAS ...................................................................................................vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................... vii
RESUMO . .................................................................................................................... viii
ABSTRACT .................................................................................................................... ix
CAPÍTULO I ....................................................................................................................
1.INTRODUÇÃO ...........................................................................................................2
1.1 Caracterização do problema ..................................................................................2
1.2 Medicamentos injetáveis.........................................................................................4
1.3 Dipirona sódica ......................................................................................................5
1.4 Metodologias de análise da dipirona sódica injetável...........................................7
1.5 Espectrometria na região do infravermelho próximo (NIR) ..................................8
1.6 Quimiometria........................................................................................................12
1.7 Métodos de reconhecimento de padrão................................................................16
1.7.1 PCA...............................................................................................................16
1.7.2 SIMCA ...........................................................................................................19
1.7.2.i Análise Screening.......................................................................................22
1.8 Calibração multivariada ......................................................................................22
1.8.1 PLS ................................................................................................................25
1.8.2 MLR...............................................................................................................27
1.8.2.1 ASA .......................................................................................................28
1.8.2.2 GA.........................................................................................................29
1.8.2.3 SPA .......................................................................................................29
1.8.2.4 SW.........................................................................................................30
1.9 Objetivo.................................................................................................................31
1.9.1 Objetivos específicos .....................................................................................31
CAPÍTULO II ...................................................................................................................
2. EXPERIMENTAL ........................................................................................................33
2.1 Metodologia e estratégia de ação.........................................................................33
2.1.1 Obtenção das Amostras e preparação das soluções padrão.........................33
2.1.2 Instrumentação..............................................................................................34
2.1.3 Confecção dos suportes para os medicamentos............................................34
SUMÁRIO
ii
2.1.4 Estudos físicos das ampolas de vidro............................................................35
2.1.5 Aquisição dos espectros ................................................................................36
2.1.6 Programas estatísticos ..................................................................................37
CAPÍTULO III .................................................................................................................
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES.................................................................................39
3.1 Seleção da região espectral de trabalho ..............................................................39
3.2 Atribuição das bandas dos espectros NIR............................................................41
3.3 Pré-Processamento dos dados espectrais.............................................................42
3.4 Aplicação de uma análise de componentes principais (PCA)..............................42
3.5 Análise Screening .................................................................................................44
3.6 Resultado da aplicação dos modelos ...................................................................48
3.6.1 Modelo PLS1 ................................................................................................49
3.6.2 Modelo MLR-SPA .........................................................................................50
3.6.3 Modelo MLR-ASA .........................................................................................52
3.6.4 Modelo MLR-SW ..........................................................................................55
3.6.5 Modelo MLR-GA ..........................................................................................57
CAPÍTULO IV ..................................................................................................................
4. CONCLUSÕES............................................................................................................61
4.1 Propostas futuras..................................................................................................62
CAPÍTULO V....................................................................................................................
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................64
ÍNDICE DE FIGURAS
iii
Figura 1
Fórmula estrutural da dipirona sódica.......................................................................
6
Figura 2
Determinação da transmitância de uma amostra.......................................................
10
Figura 3
Exemplo da conversão das variáveis em novos eixos no espaço
multidimensional.......................................................................................................
16
Figura 4
Exemplo de modelos SIMCA.....................................................................................
19
Figura 5
Predição com um modelo SIMCA.............................................................................
20
Figura 6
Representação de matrizes de dados (X e Y)............................................................
24
Figura 7
Espectrômetro Perkin Elmer FT-IR modelo GX.......................................................
34
Figura 8
Suporte das ampolas de medicament
os adaptado no compartimento de medidas
do espectrômetro NIR................................................................................................
35
Figura 9
Estudo de absorção da radiação NIR
pelas ampolas de
vidro...........................................................................................................................
35
Figura 10
Sistema para registro dos espectros NIR
dos medicamentos injetáveis sem
violação da ampola. A: Espectrômetro NIR; B: Suporte das ampolas acoplado a
o
suporte do espectrofotômetro; C
: Amostra de dipirona sódica injetável afixada em
seu suporte.................................................................................................................
36
Figura 11
Registro do sinal do branco (ampol
a com água para
injetáveis)..................................................................................................................
39
Figura 12
Espectros bruto das amostras e padrões na região NIR
entre 666 a 2500
nm..............................................................................................................................
39
Figura 13
Espectros brutos das amostras e padrões na região NIR
entre 884 a 1320
nm..............................................................................................................................
40
Figura 14
Atribuição das bandas dos espectro-NIR
para uma amostra de dipirona sódica
injetável.....................................................................................................................
41
Figura 15
Perfis das curvas resultante do pré-
processamento em relação aos espectros
originais.....................................................................................................................
42
Figura 16
Gráfico dos escores da PCA dos espectros pré-
processados das amostras
comerciais e de padrões de dipirona sódica. Onde P48 (em vermelho), P50
(em
verde), P52
(em rosa), indica os padrões nas respectivas concentrações de 48, 50
e 52% (m/v), e A (em azul) indica as
amostras
comerciais.................................................................................................................
43
Figura 17
Gráfico de influência das amostras comerciais (A) e dos
padrões de dipirona
sódica (P)...................................................................................................................
44
ÍNDICE DE FIGURAS
iv
Figura 18
Gráfico da variância explicada de X versus o número de componentes do modelo
SIMCA.......................................................................................................................
45
Figura 19
Gráfico de Coomans do modelo SIMCA
. Onde, em vermelho estão as amostras do
conjunto de treinamento
e, em verde estão as amostras do conjunto de
predição.....................................................................................................................
46
Figura 20
Gráfico de Coomans para o modelo SIMCA
construído para a faixa de 45 a 55%
(m/v). Onde, em vermelho estão as amostras do conjunto de calibração/validação
e, em verde estão as amostras do conjunto de predição............................................
48
Figura 21
Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação
do modelo PLS1........................................................................................................
49
Figura 22
Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição
do modelo PLS1........................................................................................................
50
Figura 23
Variação do RMSEV
(% m/v) em função do número de variáveis inclusas no
modelo MLR-SPA......................................................................................................
50
Figura 24
Gráfico do espectro NIR de u
ma amostra de dipirona sódica, indicando
aproximadamente a localização das variáveis selecionadas pelo algoritmo
SPA............................................................................................................................
51
Figura 25
G
ráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação
do modelo MLR-SPA.................................................................................................
52
Figura 26
Gráfico do valor predito versus o valor de re
ferência para o conjunto de predição
do modelo MLR-SPA.................................................................................................
52
Figura 27
Variação do RMSEV (% m/v)
em função do número de variáveis espectrais
selecionadas pelo ASA..............................................................................................
53
Figura 28
Gráfico do espectro NIR
de uma amostra de dipirona sódica, indicando
aproximadamente a localização variáveis selecionadas pelo algoritmo
ASA............................................................................................................................
53
Figura 29
Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de
validação
do modelo MLR-ASA.................................................................................................
54
Figura 30
Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de
predição
do modelo MLR-ASA...............................................................................................
54
Figura 31
Gráfico do espectro NIR
de uma amostra de dipirona sódica, indicando
aproximadamente a localização variáveis selecionadas pelo modelo MLR-
SW..............................................................................................................................
55
ÍNDICE DE FIGURAS
v
Figura 31
Gráfico
do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação
do modelo MLR-SW..................................................................................................
56
Figura 33
Gráfico
do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição
do modelo MLR-SW..................................................................................................
56
Figura 34
Gráfico do espectro NIR
de uma amostra de dipirona sódica, indicando
aproximadamente a localização variáveis selecionadas pelo modelo MLR-
GA..............................................................................................................................
57
Figura 35
Gráfico
do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação
do modelo MLR-GA..................................................................................................
58
Figura 36
Gráfico do valor predito versus o valor
de referência para o conjunto de predição
do modelo MLR-GA..................................................................................................
58
ÍNDICE DE TABELAS
vi
Tabela 1. Regiões espectrais do Infravermelho................................................................9
Tabela 2. Número de amostras respectivas concentrações, lotes e mês/ano de
validade...........................................................................................................................33
Tabela 3. Análise Screening de todas as amostras de dipirona do conjunto de validação
e previsão........................................................................................................................46
Tabela 4. Análise Screening das amostras de dipirona comerciais do conjunto predição,
usando o modelo SIMCA construído para a faixa de 45 a 55 % (m/v)............................47
Tabela 5. Valores de RMSEV, RMSEP e correlação linear de validação e de previsão
dos modelos.....................................................................................................................59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
vii
AINES Antiinflamatórios Não Esteróide
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASA Algoritmo da Busca Angular
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
F
Cal
Valor Calculado para o Teste F
F
Crit
Valor Crítico para o Teste F
FT-IR Infravermelho-Transformada de Fourier
GA Algoritmo Genético
HCA Análise Hierárquica de Classes
ICP-OES Espectroscopia de Emissão Ótica por Plasma Indutivamente Acoplado
iPLS Regressão por Mínimos Quadrados Parciais por Intervalo
K-NN Proporção do Vizinho mais Próximo
KS Kennard-Stone
LEDs Diodos Emissores de Luz
MLR Regressão Linear Multipla
MSC Correção de Espalhamento Multiplicativo
NIR Infravermelho Próximo
PC Componentes Principais
PCA Análise por Componentes Principais
PLS Regressão por Mínimos Quadrados Parciais
QSAR Relação Quantitativa de Estrutura/Atividade
RMSEV Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático de Validação
RMSEP Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático de Previsão
SIMCA Modelagem Independente Flexível por Analogias de Classes
SPA Algoritmo das Projeções Sucessivas
SPXY Partição do Conjunto de Amostras Baseado nas Distancias Conjuntas X-y
SW Stepwise
VIF Fator de Inflação da Variância
UV-VIS Ultravioleta e Visível
MIR Infravermelho Médio
FAR Infravermelho Distante
LW-NIR Infravermelho Próximo de Ondas Longas
SW-NIR Infravermelho Próximo de Ondas Curtas
viii
RESUMO
Título: Desenvolvimento de uma Metodologia para o Controle de Qualidade de
Medicamento Injetável, sem Violação da Ampola, usando Espectroscopia
NIR e Técnicas Quimiométricas.
Autor: Fátima Aparecida Castriani Sanches
1
º
Orientador (a): Prof. Dr. Mário César Ugulino de Araújo
2
º
Orientador (a): Profa. Dra. Elaine Cristina Lima do Nascimento
Neste trabalho, é proposta uma nova metodologia que utiliza a combinação da
espectrometria no infravermelho próximo (NIR) com métodos quimiométricos de
análise multivariada para a determinação do teor de princípio ativo em um medicamento
de uso parenteral. O medicamento utilizado neste estudo foi a dipirona sódica injetável.
Para construção dos modelos de calibração multivariada foram empregadas amostras
padrão de dipirona sódica preparadas no laboratório e amostras comerciais. Os espectros
NIR foram registrados, pré-tratados e utilizados para a construção de modelos de
reconhecimento de padrões e calibração multivariada. Para a análise inicial dos dados,
uma análise exploratória foi realizada a partir de modelos PCA. Em seguida, modelos
SIMCA foram elaborados e utilizados para uma análise Screening das amostras,
empregando um nível de confiança de 95%. Essas análises serviram para constatar que
todas as amostras (comerciais e preparadas no laboratório) poderiam ser utilizadas na
composição dos conjuntos de calibração, validação e predição, empregados no
desenvolvimento da metodologia. Para a seleção das amostras dos conjuntos utilizou-se
o algoritmo SPXY. Inicialmente, o conjunto de calibração contendo amostras comerciais
e as preparadas no laboratório foi empregado na construção de modelos de calibração
multivariada PLS1, MLR-SPA, MLR-SW, MLR-ASA e MLR-GA. Esses modelos foram
validados usando um conjunto de teste e foram aplicados para a determinação do teor de
dipirona usando um conjunto de predição. Os resultados mostraram que todos os
modelos apresentaram erros de previsão satisfatórios com relação ao método de
referência, sendo bastante promissores para a predição do teor de dipirona sódica em
medicamentos injetáveis. Como a metodologia proposta utiliza um processo não
invasivo, não é necessário um tratamento prévio das amostras, nenhum reagente foi
usado, e uma freqüência analítica relativamente elevada de análise é alcançada.
Palavras Chaves: Controle de qualidade, medicamentos injetáveis, espectroscopia
NIR, quimiometria.
ix
ABSTRACT
Title: Development of a Methodology for Quality Control of Injection Drug, without violation of
the ampoule, using NIR spectroscopy and chemometric techniques.
In this work, a new methodology is proposed that uses a combination of Near Infrared
Spectroscopy (NIR) with chemometric methods of multivariate analysis for the determination of
active ingredient in parenteral drug. The drug used in this study was dipyrone. To create the models
of multivariate calibration, standard samples of dipyrone prepared in laboratory and commercial
samples were used. NIR spectra were recorded, pre-processed and used to build models of pattern
recognition and multivariate calibration. For the initial analysis of data, an exploratory analysis was
performed from PCA models. Then, SIMCA models were developed and used for Screening
analysis of the samples, at a confidence level of 95%. These tests served to confirm which set of
samples (commercial and prepared in the laboratory) could be used in the composition of sets of
calibration, validation and prediction employed in the development of the methodology. For the
selection of samples from the sets we used the SPXY algorithm. Initially, the calibration set
containing commercial and prepared in the laboratory samples was used to build PLS1, MLR-SPA,
SW-MLR, MLR-ASA and MLR-GA multivariate calibration models. These models were validated
using a test set and applied to the determination of dipyrone using a prediction set. The results
showed that all models presented satisfactory prediction errors with respect to the reference method,
and it is very promising for predicting the dipyrone content in drugs injection. As the proposed
methodology uses a non invasive process it is not necessary a previous treatment of the samples, no
reagent was used, and a relatively high analytical rate is achieved.
Keywords: quality control, injectable drugs, NIR spectroscopy, chemometrics.
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
CAPÍTULO I
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 Caracterização do problema
A administração parenteral de medicamentos é uma prática muito comum na rotina
hospitalar
[1]
. Estima-se que cerca de 40% de todos os medicamentos dispensados nos hospitais
sejam injetáveis, sendo esta, uma das formas que exige maior qualidade e integridade dos
medicamentos administrados, visto que dela dependem a saúde e até a vida dos pacientes. Sabe-se,
porém, que as condições de transporte e armazenamento dos medicamentos (por exemplo,
exposição a luz, umidade, etc.), na maioria dos hospitais brasileiros, estão longe das ideais
preconizadas pelos fabricantes e pelos órgãos de fiscalização
[2]
. Este problema acarreta graves
conseqüências na qualidade do medicamento, mesmo que este esteja dentro do prazo de validade
[3]
.
Embora a maioria das indústrias farmacêuticas operem com padrões de qualidade
estabelecidos internacionalmente, muitos dos medicamentos produzidos ainda chegam a alguns
mercados fora desses padrões
[4]
. Além disso, há o caso de indústrias que, visando maiores lucros,
falsificam uma diversa gama de medicamentos. A falsificação pode ser realizada pela a adulteração
das formulações farmacêuticas, seja pela remoção total ou parcial do princípio ativo, pela troca
deste por outras substâncias, ou pela troca ou remoção de excipientes caros importantes na
formulação. Há casos de falsificação que ocorrem por meio de roubo de cargas ou lotes de
medicamentos, seguido de adulteração no nome da indústria produtora, ou no prazo de validade do
medicamento, ou ainda pela inserção de substâncias ilícitas ao próprio medicamento (esses casos de
adulteração já ocorreram com o medicamento Viagra®, o que fez com que o fabricante Pfizer
mudasse a embalagem do produto)
[5]
.
A falsificação e o roubo de medicamentos são problemas mundiais
[6]
. Estas práticas são tão
lucrativas que grandes quadrilhas tem se formado e se especializado nessas operações
[7]
.
Entre 1997 e 1998, o Ministério da Saúde chegou a registrar 172 casos de falsificação,
provocando questionamentos na sociedade sobre a qualidade e a segurança dos produtos
comercializados nacionalmente
[8]
. Várias medidas foram adotadas pelo governo a partir dessa crise,
destacando a modificação da lei que tornou a falsificação um crime hediondo e a aprovação da
Política Nacional de Medicamentos, que garante à população o acesso a medicamentos seguros e
eficazes, ações reforçadas com a criação da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
em 1999. Logo após a criação da ANVISA, entre 1999 e 2003, apenas sete falsificações foram
confirmadas
[8]
. Entretanto, as apreensões de remédios falsos e contrabandeados cresceram 315% de
2005 a 2008
[7]
, e esses produtos chegaram a farmácias e a hospitais públicos e privados
[7]
.
CAPÍTULO I
3
De acordo com dados do Ministério da Justiça, a adulteração de medicamentos movimenta
10 bilhões de dólares ao ano
[9]
. Para se ter idéia da gravidade do problema, de janeiro a março de
2009, a ANVISA retirou do mercado mais de 170 toneladas de medicamentos, sem registros,
falsificados ou com prazo de validade vencido
[9,10]
. E ao final do primeiro semestre de 2009, a
ANVISA em conjunto com a Polícia Federal apreenderam 316 toneladas de medicamentos
[7]
. Um
aumento expressivo quando comparado a 2008, onde foi aprendido 45,5 toneladas
[7]
. Dentre os
medicamentos que estão sendo falsificados estão: Glivec®, Voltaren®, Ponstan®, Terramicina®,
Viagra®, Cialis®, Citotec®, Novalgina®, entre outros
[6,7]
.
Para se determinar todos os parâmetros de qualidade em um processo industrial,
normalmente, precisa-se de um grande número de análises. Atualmente, a maioria destas análises é
realizada empregando métodos instrumentais, sendo as metodologias mais comumente utilizadas no
controle de qualidade de fármacos: a espectrometria na região do ultravioleta e visível (UV-Vis) e a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
[11]
. Estes métodos são lentos e trabalhosos, pois
envolvem muita manipulação analítica (extração da amostra, preparação freqüente de reagentes e
soluções de calibração, etc), são relativamente dispendiosos, pois requerem o uso de solventes e
reagentes caros, precisam de pessoal qualificado para a manipulação analítica, produzem resíduos
prejudiciais ao meio ambiente, são invasivas e destroem as amostras durante as análises. Em função
de seu custo de operação e de manutenção, essas análises são realizadas apenas em forma de
amostragem, tanto nas etapas de produção (doseamento e produto final), como na fiscalização.
Deste modo não se tem um acompanhamento da vida útil do medicamento, desde a sua produção
até o momento imediatamente anterior a sua administração no paciente. E é justamente nesse
ínterim que os medicamentos estão sujeitos a decomposição e degradação do seu princípio ativo, o
que leva à perda de suas propriedades terapêuticas
[12]
.
Este trabalho propõe o desenvolvimento de uma metodologia analítica para o controle de
qualidade de medicamentos injetáveis líquidos, sem a violação da embalagem, utilizando
espectrometria na região do infravermelho próximo (NIR)
[13-17]
e técnicas quimiométricas
[18,19]
. O
fármaco escolhido como ponto de partida para este estudo foi a dipirona sódica injetável, por se
tratar de um medicamento comercial de alto consumo na clínica médico/hospitalar devido a sua alta
eficácia no tratamento de dores agudas, fracas e medianas, seu baixo custo, ampla e ubíqua
disponibilidade, e boa margem de segurança.
A técnica proposta permite realizar medições de parâmetros de qualidade deste
medicamento injetável, de forma não destrutiva/não invasiva
[15]
, sem qualquer violação física ou
química das amostras em suas embalagens, permitindo a identificação de possíveis produtos
CAPÍTULO I
4
adulterados e/ou não conformes com os valores especificados pelas indústrias farmacêuticas
produtoras.
Com esta metodologia espera-se oferecer à sociedade brasileira uma maior garantia de seus
direitos à saúde e promoção da mesma, contando com um controle mais rápido e efetivo de seus
medicamentos.
1.2 Medicamentos injetáveis
Consideram-se preparações injetáveis as soluções, suspensões e emulsões estéreis de
substâncias medicamentosas em veículos aquosos, oleosos ou outros apropriados para serem
administrados por via parentérica
[20]
. Essa forma de administração de fármacos é muito eficiente,
pois disponibiliza o princípio ativo diretamente na corrente sanguínea proporcionado uma ação
terapêutica mais rápida e eficaz
[12]
.
Embora em pleno século XVII tenham sido feitas aplicações medicamentosas por via
intravenosa no homem, relatando-se mesmo casos de transfusão de braço a braço, que foram
proibidas em 1668
[20,21]
, pode-se dizer que a utilização da via parenteral só se difundiu depois dos
trabalhos de Wood
[22-27]
, que em 1856, injetou pela primeira vez uma solução de sulfato de atropina
mediante o uso de um aparelho também novo, a seringa de Pravaz
[22-28]
. A técnica de injeção
chegou três anos mais tarde à França, onde a sua expansão se procedeu a partir dos trabalhos
realizados por Behier
[20,21,28]
.
Posteriormente, Limousin sugeriu o condicionamento físico em pequenos recipientes e a sua
esterilização pelo calor, tendo a nova forma farmacêutica sido aceita em todo o mundo e passando a
vir inscrita em todas as farmacopéias
[20,21]
.
As preparações injetáveis são medicamentos que se introduzem diretamente nos tecidos,
portanto exercem uma ação geral. Assim, compreende-se que a sua obtenção impõe condições
rigorosas de controle, cuja dupla finalidade é a verificação da sua perfeita tolerância para os tecidos
e inocuidade total no organismo
[20,21,29]
. Naturalmente que a primeira propriedade que todas as
preparações injetáveis devem apresentar é a de serem estéreis
[20,21,29-31]
. Além desta característica,
há, consoante o tipo de injetável e a via de administração, outras qualidades extremamente
importantes. Assim, as preparações em veículo aquoso (soluções, dispersões coloidais, suspensões e
emulsões de fase aquosa externa) devem ser isotônicas, apresentar pH próximo da neutralidade e ser
apirogênicas, enquanto que as que são feitas utilizando um veículo oleoso deverão ser preparadas
com óleos isentos de acidez
[20,21,29]
.
CAPÍTULO I
5
Para detectar os potenciais problemas, a indústria farmacêutica realiza freqüentemente testes
sobre a preparação, reconstituição ou estabilidade dos medicamentos injetáveis, para o controle de
qualidade dos medicamentos, para assegurar uma formulação correta e eficaz. Dentre os testes
realizados, encontramos: teste de esterilidade (contagem microbiológica e pesquisa de patógenos),
doseamento, determinação da massa média, dureza, determinação do volume médio, friabilidade,
pH, teste de pirogênios, teste de desintegração, teste de dissolução, toxicidade aguda, uniformidade
de doses unitárias, umidade, viscosidade e identificação da substância ativa
[20,21,29]
.
O uso destas
informações é a chave que assegura a integridade da dosagem das formas farmacêuticas.
Quando se prepara medicamentos injetáveis é de particular importância a escolha de
recipiente adequado que irá contê-los. Como é sabido, as ampolas ou frascos que se empregam são
geralmente de vidro, eventualmente substituído por diversos materiais plásticos, como o polietileno
ou o cloreto de polivinilo.
Os recipientes de vidro utilizados podem ser incolores ou corados. O vidro corado destina-se
a proteger os medicamentos da ação da luz, sendo indicado quando o medicamento se altera nessas
circunstâncias. A coloração é conferida aos vidros pela junção de diversos metais (crômio – que
confere a cor verde, e o ferro e manganésio – que originam cores que vão do âmbar ao amarelo).
Nas modernas farmacopéias e formulários indica-se o vidro de cor âmbar, desde que este satisfaça
os ensaios de transparência
[20,21]
.
Qualquer que seja, o material utilizado para a confecção dos recipientes de
acondicionamento, não deve reagir com os líquidos medicamentosos neles contidos. Isto significa
que esses materiais, além de outras qualidades, devem apresentar alta resistência aos líquidos
medicamentosos o que, na maioria dos casos, traduz-se por uma elevada resistência hidrolítica.
Deve-se ainda considerar o seu tapamento, que geralmente, é feito por fusão, quando se trata de
vidro, podendo ainda ser realizado mediante rolhas de borracha, de teflon, de elastômeros,
etc.
[20,21,29]
.
1.3 Dipirona sódica
A dipirona sódica ou Metamizol é um analgésico, antipirético, antiinflamatório sintético
extraído do alcatrão (anilina), pertencente ao grupo da pirazolona (antipirina, aminopirina,
fenilbutazona, oxfenbutazona)
[32]
. É classificada como analgésico-antiinflamatório não esteroidal
(AINE), dotada de efeitos diversos em função da dose empregada que pode ser baixa (< 10 mg.kg
-1
)
para ação antipirética; mediana (15-30 mg.kg
-1
) para ação analgésica e alta (> 50 mg.kg
-1
) para
CAPÍTULO I
6
ações antiinflamatória e antiespasmódica. Em ratos, em doses muito elevadas (> 200 mg.kg
-1
)
apresenta efeito anticonvulsivante
[32-35]
.
Sua fórmula molecular é C
13
H
17
N
3
O
4
S, sua Massa Molar é 311, 35 g.mol
-1
, e seu nome
químico é [(2,3-dihidro-1,5-dimetil-3-oxo-2-fenil-1H-pirazol-4-il) metilamino] metanosulfonato. A
Figura 1 ilustra sua fórmula estrutural.
Figura 1 – Fórmula estrutural da dipirona sódica.
Foi introduzida no Brasil em 1922, sob o nome de novalgina®. Sua comercialização cresceu
mundialmente até a década de 70, quando foram relatados graves casos de agranulocitose: uma
condição clínica de déficit imunológico potencialmente fatal (7 a 25%), que exigia suspensão do
tratamento e atendimento médico de urgência com potentes antibióticos. A maioria dos países do
Hemisfério Norte, Suécia (1974), EUA (1977), Austrália e Japão proscreveram a dipirona do
receituário a não ser no mercado veterinário, por haver disponibilidade no receituário médico de
AINES substitutos menos tóxicos para tratamento da dor (paracetamol, salicilatos, cetorolac,
clomifênio, etc.)
[41]
. No entanto, o Brasil e diversos outros países não suspenderam sua
comercialização e mantiveram seu uso até os dias atuais. Atualmente, a incidência estimada da
agranulocitose é aceitável, pois oscila entre 0,2 a 2 casos por milhão de pessoas por dia de uso.
Além disso, há outras drogas com maior risco de provocar agranulocitose como o antipsicótico
clozapina com incidência de 8 casos para cada 1000 pacientes após 6 meses de tratamento
[32,36-40]
.
Ela continua sendo prescrita na Rússia, Brasil, Índia e em muitos outros países sul-
americanos, caribenhos, africanos e asiáticos. A dipirona (Hoechst & Merck ) é um dos principais
analgésicos da terapêutica brasileira
[41]
, ocupando 31,8% do mercado. O paracetamol vem em
segunda colocação com 29,7%, e o acido acetilsalicílico em terceiro lugar com 27,1%
[41]
.
A dipirona é o analgésico de preferência em 50% dos usuários de hospitais públicos em São
Paulo
[42]
. A maior parte das vendas (em torno de 80%) ocorre sem prescrição médica, representando
um papel importante na condenável auto-medicação, apesar da ANVISA incluí-la na lista de tarja
vermelha (venda sob prescrição médica)
[32,40,42,43]
.
CAPÍTULO I
7
É comercializada em diferentes formulações farmacêuticas (comprimidos, gotas,
supositórios e injetáveis), podendo ser administrada pelas vias: Oral, retal, intramuscular (glúteo) e
intravenosa.
Sabe-se que, dentre essas formulações citadas, a que exige uma atenção especial e maior
cuidado é a injetável, que devido à via de administração, oferece maior risco a saúde.
1.4 Metodologias de análise da dipirona sódica injetável
O método oficial (farmacopeico) de análise de dipirona é o Método Clássico de Titulação
Iodométrica
[44,45]
. Neste método, a reação química se processa lentamente e a análise torna-se
trabalhosa porque há a necessidade de se manter uma temperatura abaixo de 15°C (banho de gelo);
ele é dispendioso pois gera gasto com os reagentes químicos necessários para a preparação e
padronização das soluções de trabalho. Além disso, a solução de iodo apresenta um problema de
instabilidade por exposição ao ar livre.
Diversos procedimentos são descritos na literatura para determinação de dipirona em
formulações farmacêuticas. Vassileva-Alexandrova e Shishmanov
[46]
propuseram um procedimento
para determinação de dipirona baseado na reação desse fármaco com o reagente cloreto de
neotetrazólio, produzindo um composto amarelo solúvel em meio de etanol-HCl. O método
mostrou-se bastante seletivo e preciso na determinação de dipirona em produtos farmacêuticos.
Sakiara et al.
[47]
desenvolveram um método baseado na oxidação seletiva da dipirona na
presença de ácido sulfúrico, promovendo a formação de formaldeído, que reage com o ácido
cromotrópico produzindo um composto violeta, monitorado espectrofotometricamente em 575 nm.
Pereira et al.
[48]
desenvolveram um sistema por injeção em fluxo para a geração de íons I
3
-
Os íons triiodeto gerados em linha, ao reagirem com a dipirona injetada no sistema, oxidam o grupo
metanossulfônico do fármaco a sulfato. O consumo de íons I
3
-
pela dipirona provoca um decréscimo
da absorbância do complexo triiodeto-amido que é monitorado espectrofotometricamente em 580
nm.
Senyuva et al.
[49]
utilizaram a Cromatografia Líquida de fase invertida para a determinação
de dipirona em formulações sólidas e líquidas. Já Perez-Ruiz et al.
[50]
, se valeram da análise em
fluxo com determinação fluorométrica.
A determinação espectrofotométrica proposta por Qureshi et al.
[51]
baseia-se na redução de
íons Fe(III) por ação da dipirona e subseqüente complexação dos íons Fe(II) com 1,10- fenantrolina,
que produz um complexo vermelho, monitorado em 500 nm. Esse mesmo grupo de pesquisadores
desenvolveu outro procedimento onde a dipirona foi oxidada por uma solução de iodato de potássio
CAPÍTULO I
8
em meio ácido, produzindo um composto de coloração amarela, monitorado
espectrofotometricamente em 460 nm
[52]
.
Marcolino-Jr et al.
[53]
, realizaram a determinação turbidimétrica de dipirona em fluxo
utilizando um reator contendo cloreto de prata imobilizado em resina poliéster, Neste trabalho, um
reator em fase sólida contendo AgCl foi inserido em um sistema de análise por injeção em fluxo de
linha única, para atuar como fonte de íons Ag
+
, e aplicado na determinação de dipirona (esse
procedimento baseou-se na propriedade redutora da dipirona). Os íons Ag
+
contidos no reator eram
reduzidos pela dipirona a Ag
0
que era então, detectada turbidimetricamente em 425 nm, e a
concentração de dipirona injetada no sistema era proporcional à quantidade de Ag
0
gerada.
Vários outros métodos são descritos na literatura para determinação de dipirona por detecção
espectrofotométrica
[54-58]
, fluorimétrica
[50]
, eletroquímica
[59-61]
, por quimiluminescência
[62-64]
e
CLAE
[65-69]
. Entretanto, alguns desses procedimentos envolvem diversas etapas analíticas, são de
alto custo, enquanto outros são trabalhosos e/ou requerem profissionais com boa capacitação para o
seu desenvolvimento.
Como visto, tanto o método de referência como qualquer outro método de análise conhecido
até o momento, exige a violação da embalagem dos medicamentos injetáveis e o consumo deste
durante a análise, além de necessitar de muita atenção e manipulação analítica.
Para superar estes inconvenientes, é que se propõe o desenvolvimento de métodos analíticos
usando a espectrometria NIR
[13-17]
para a análise deste medicamento. Esta metodologia permite a
realização de análises das amostras diretamente em suas embalagens (ampolas ou frascos), evitando
a destruição das amostras e diminuindo drasticamente a sua manipulação pelos analistas.
1.5 Espectrometria na região do infravermelho próximo (NIR)
A radiação NIR compreende a região usualmente delimitada entre os comprimentos de onda
de 780 a 2500 nm do espectro eletromagnético. Nesta região as ocorrências de transições
eletrônicas são raras. De fato, as ocorrências espectrais observadas nesta região se devem quase que
totalmente às bandas de absorção relacionadas aos sobretons de transições fundamentais que
ocorrem no infravermelho médio e as combinações de transições que ocorrem também naquela
região
[15]
. A Tabela 1 mostra as regiões espectrais do infravermelho, que é convencionalmente
dividido em três regiões: infravermelho próximo (NIR), médio (Middle Infrared - MIR) e distante
(Far Infrared – FAR)
[70]
.
CAPÍTULO I
9
Tabela 1 - Regiões espectrais do Infravermelho.
Intervalos das regiões
Região
Comprimentos de Onda (µm)
Números de Onda (cm
-1
) Freqüência (Hz)
NIR
0,78 a 2,5 12.800 a 4.000 3,8 x 10
14
a 1,2 x 10
14
MIR
2,5 a 50 4.000 a 200 1,2 x 10
14
a 6,0 x 10
12
FAR
50 a 1000 200 a 10 6,0 x 10
12
a 3,0 x 10
11
Em geral, os espectros NIR estão associados a grupos funcionais que apresentam ligação
muito polarizada como C-H, N-H, O-H e S-H.
As ocorrências espectrais na região NIR são caracterizadas por apresentarem intensidade
fraca, cerca de 10 a 100 vezes inferiores àquelas observadas no MIR e FAR
[15]
. No entanto, estas
ocorrências são mais susceptíveis ao ambiente dos átomos participantes da ligação química, o que,
de certa forma, aumenta a seletividade de técnicas analíticas baseadas na espectroscopia NIR
[15]
. A
diminuição de sensibilidade devida às transições fracas observadas, não se constitui em grande
desvantagem, uma vez que fontes de radiação intensas e detectores de alta eficiência estão
disponíveis para uso nesta região de comprimentos de onda. Por outro lado, o fato das ocorrências
não apresentarem alta intensidade, permite o uso da técnica em amostras nas quais um alto teor de
água se encontra presente. Assim, a espectroscopia NIR tem permitido determinar água em
glicerina, hidrazina, Freon, membranas orgânicas e acetona, além de constituir um valioso método
de análise das misturas de aminas aromáticas
[71]
.
A determinação de umidade em amostras de
produtos agrícolas é uma aplicação rotineira da técnica NIR
[72]
.
A região do NIR é acessível com óptica de quartzo, vantagem que se associa à maior
sensibilidade dos respectivos detectores e maior intensidade das fontes luminosas
[70]
. Com o uso de
instrumental apropriado, as medidas espectroscópicas na região NIR podem ser utilizadas
analiticamente de forma igual à que se emprega na espectroscopia UV-vis, através de medidas de
transmitância/absorbância. A absorção da radiação atenua o feixe de acordo com a lei de Beer
[70]
,
ou seja, à medida que a luz atravessa um meio contendo um analito que absorve, um decréscimo de
intensidade ocorre na proporção que o analito é excitado (Figura 2). A transmitância T da solução é
a razão entre a potência radiante do feixe transmitido (I
t
) e a potência radiante do feixe incidente
(I
0
).
CAPÍTULO I
10
Figura 2 - Determinação da transmitância de uma amostra. Onde: b = caminho óptico do meio; α = absortividade molar
do analito; c = concentração da espécie absorvente.
A complexidade e o alto grau de sobreposição das bandas que ocorrem na região NIR
impede, na maioria das vezes, a utilização da absorbância medida em um único comprimento de
onda como parâmetro analítico na determinação da concentração de uma dada espécie. No entanto,
a relação entre concentração e medida espectroscópica continua sendo regida pela lei de Beer
[70]
.
Para a realização de análises químicas baseadas na espectroscopia NIR, dois tipos básicos de
equipamentos podem ser utilizados: espectrômetros ou fotômetros. Os espectrômetros NIR são
equipamentos normalmente grandes, utilizados para registrar espectros de uma amostra em toda a
faixa espectral do NIR. Por conta dessa característica, são equipamentos caros utilizados por centros
de pesquisa ou por laboratórios de indústrias de grande porte financeiro. Logo, não são
equipamentos desenvolvidos para a análise de campo. Por sua vez, os fotômetros NIR são
equipamentos muito mais baratos, porém eles são construídos para se trabalhar com um número
discreto de pequenas regiões espectrais (os comprimentos de onda) distribuídas ao longo da faixa do
NIR. Estes comprimentos de onda são isolados empregando filtros ópticos, cuja banda espectral
passante isolada é em geral muito larga, o que prejudica a precisão e a qualidade dos fotômetros
NIR. Fotômetros NIR de boa qualidade e muito mais simples podem ser construídos usando diodos
emissores de luz (LED)
[73,74 ]
.
Dispõe-se, atualmente, de um grande número de espectrômetros que operam na faixa do
infravermelho próximo. A complexidade pode variar desde os mais simples, que empregam filtros
de interferência na seleção de poucos comprimentos de onda, até os mais sofisticados, que
empregam as técnicas multiplexadas como os de transformada de Fourier e de Hadamard. Os
instrumentos que empregam filtros óptico-acústicos sintonizáveis têm se tornado populares devido,
principalmente, à sua robustez, que possibilita o uso do espectrofotômetro para monitoração em
linha nos processos industriais. Os detectores mais empregados são os de sulfeto de chumbo que
apresentam desempenho adequado nesta faixa de comprimento de onda, principalmente quando
resfriados com o uso de elementos tipo Peltier. Os detectores de InAs e GaInAs têm sido bastante
CAPÍTULO I
11
empregados nos instrumentos de varredura mais modernos, devido à exigência de respostas rápidas
para permitir varreduras de amplas regiões espectrais a taxas tão elevadas quanto 500 nm s
-1
.
Os espectros NIR podem ser relacionados tanto as propriedades químicas qualitativas
[75,76]
e
quantitativas
[76-78]
, como as propriedades físicas (viscosidade, densidade, bem como a presença de
pequenas partículas sólidas ou qualquer material estranho, perceptível ou não ao olho humano, nos
medicamentos injetáveis).
A espectroscopia NIR tem sido potencialmente aplicada à solução de diversos problemas
analíticos, sendo uma realidade nos mais variados setores da cadeia produtiva. Por exemplo, o
Canadá certifica o teor de proteína totais dos grãos de cereais exportados utilizando medidas de
espectros NIR diretamente nos grãos
[79]
e calibração multivariada, em um procedimento que não
requer mais do que alguns minutos para ser efetuado. Comparando este método com o método de
referência usado para a mesma finalidade, o Método de Kjehldal
[80]
, fica evidente a importância de
se desenvolver metodologias analíticas, simples, baratas, que não destruam a amostra e não
produzam resíduos químicos prejudiciais ao homem e ao meio-ambiente
[81]
. O método Kjehldal usa
digestão ácida drástica da amostra empregando mercúrio ou selênio como catalisador, seguida de
destilação e a titulação da amônia produzida.
Esta técnica também vem sendo empregada na indústria de fármacos
[15,72]
, polímeros
[15,72]
e
produtos petroquímicos
[72,82]
, e produtos agrícolas em geral
[72,82,84]
.
No contexto da análise de medicamentos, a maioria dos trabalhos publicados é com formas
farmacêuticas sólidas
[72]
. A popularidade da técnica cresceu muito a partir de 1986
[72]
, ano em que
Ciurczak e Maldacker
[85]
publicaram o uso NIR na análise de misturas de formulação de
comprimidos de aspirina, butalbital, e cafeína, com suas concentrações variando num intervalo de
0%(ausência de principio ativo) e de 90 a 110%. Neste experimento, espectros de placebos eram
subtraídos do espectro da composição completa, gerando espectros muito próximos aos das
drogas
omitidas.
Em 1997, Candolfi et al.
[86]
estudaram as fontes de variação na medição NIR de
comprimidos
e cápsulas. As fontes de variação estudadas foram a repetibilidade de medição, o
posicionamento da amostra,
variabilidade do dia-a-dia, objetos de
variabilidade dentro de um lote, e
de modo contínuo avaliaram a variabilidade dos lotes. Este trabalho
deu um dos primeiros indícios
da importância do posicionamento da amostra.
O primeiro trabalho publicado sobre análise de comprimidos diretamente em suas
embalagens foi o de Dempster et al.
[87]
onde foram utilizadas três configurações de amostragem
para investigar a classificação da droga presente. Na primeira configuração era necessária a
CAPÍTULO I
12
remoção do comprimido do blister, na segunda abordagem, os comprimidos foram analisados
através da embalagem de plástico usando a janela espectrômetro, e no terceiro arranjo, os
comprimidos foram analisados através da embalagem blister de plástico com uma sonda de fibra
óptica.
Em 2000 Moffat et al.
[88]
demonstraram que o método de análise NIR preenche os critérios
estabelecidos pela ICH-Q2
[89,90]
. Critérios como: exatidão, precisão, especificidade, limite de
detecção, limite de quantificação, linearidade, intervalo, robustez e adequação do sistema de teste,
demonstraram ser adequados para uso em testes de rotina. Este trabalho foi o ponto de partida para
a validação da metodologia baseado NIR para análise de medicamentos
[72]
.
Atualmente, métodos analíticos baseados na espectroscopia NIR estão sendo empregados
como método de referência na Europa e em alguns países, onde já estão sendo incorporados à
farmacopeia oficial
[91]
.
Embora a espectroscopia NIR já esteja se consagrando e sendo aplicada em diversos
segmentos da indústria farmacêutica
[72]
, até o presente momento, poucas foram as aplicações
publicadas sobre o seu uso para a análise de medicamentos injetáveis
[72]
, e destas nenhuma sugere a
análise de injetáveis sem a violação física da ampola.
Devido à grande quantidade de dados gerados, a alta sobreposição espectral e baixa
intensidade dos sinais, este estudo é muito complexo, e para que uma metodologia baseada na
espectroscopia NIR possa ser implementada com eficácia, é necessária a utilização da
quimiometria
[18,19]
. A combinação da espectroscopia NIR com técnicas quimiométricas de análise
multivariada, tem possibilitado o desenvolvimento de metodologias bastante promissoras para o
controle de qualidade de medicamentos injetáveis, entre outros motivos, por determinar tanto as
propriedades químicas (qualitativas e quantitativas), como as propriedades físicas das amostras, de
forma não-invasiva, pouco laboriosa, rápida e precisa, sem necessidade de qualquer tratamento
químico, ou seja, sem destruição das amostras
[15,72]
.
1.6 Quimiometria
Quimiometria é a aplicação de métodos estatísticos ou matemáticos em dados de origem
química (química orgânica, analítica ou medicinal) de natureza multivariada
[92]
. A Sociedade
Internacional de Quimiometria (International Chemometrics Society - ICS) propõe a seguinte
definição: “Quimiometria é a ciência relacionada a medidas realizadas em um sistema ou processo
químico, obtendo informações sobre o estado do sistema através da aplicação de métodos
matemáticos ou estatísticos”
[93]
.
CAPÍTULO I
13
Muita ênfase tem sido dada aos sistemas multivariados, nos quais se pode medir muitas
variáveis simultaneamente, ao se analisar uma amostra qualquer. Nesses sistemas, a conversão da
resposta instrumental no dado químico de interesse, requer a utilização de técnicas de estatística
multivariada, álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas se constituem no momento na
melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição do máximo de informação sobre
o sistema
[92]
.
A organização do conjunto de dados em análises multivariada são geralmente
apresentados em uma matriz, onde as linhas desta matriz representam o conjunto das amostras e as
colunas, das variáveis medidas. A matriz pode ser representada graficamente num espaço
multidimensional, onde cada variável medida corresponde a uma dimensão do espaço e cada
amostra um ponto no espaço
[18,94,95]
.
No contexto de análise de medicamentos injetáveis usando espectroscopia NIR, dois grupos
de técnicas quimiométricas
[18]
podem ser utilizados: O grupo das técnicas de reconhecimento de
padrão
[96]
(sessão 1.7) e o grupo das técnicas de calibração multivariada
[97]
(sessão 1.8). Entretanto,
devido a natureza dos dados, um pré-processamento pode ser necessário antes de realizar o seu
processamento.
O pré-processamento
[18]
pode ser definido como qualquer manipulação matemática feita
com o conjunto de dados. Há um número considerável de técnicas disponíveis na espectroscopia
NIR para ajudar os usuários com a interpretação qualitativa e quantitativa dos espectros
[98]
. O pré-
processamento é usado para remover ou reduzir fontes irrelevantes de variação e tratar as matrizes
de dados para tornar os cálculos melhor condicionados antes da modelagem. Ao ser aplicado, altera
os dados originais. A escolha da técnica de pré-processamento dos dados adequada é uma etapa
crítica para o êxito de uma análise de dados
[18]
.
Para que se execute um bom pré-processamento é necessário que haja interação entre pré-
processamento e o exame dos dados, e que se conheça as características (como a precisão das
análises) e o comportamento dos dados
[18]
.
As técnicas de pré-processamento de dados podem ser divididas basicamente em dois tipos:
(a) pré-processamento de dados aplicado às amostras e (b) pré-processamento de dados aplicado às
variáveis.
(a) Pré-processamento de dados aplicado às amostras –
Neste caso são aplicadas técnicas
que operem em uma amostra de cada vez e sob todas as variáveis. Dentre as técnicas de pré-
processamento nas amostras temos: normalização, ponderação, suavização e correções de linha de
base.
CAPÍTULO I
14
A normalização coloca todas as amostras em uma mesma escala dividindo-as por uma
constante, para remover variações sistemáticas das amostras. Nesta técnica três constantes podem
ser usadas: normalização por unidade de área (que divide cada elemento do vetor amostra pela sua
norma-1), normalização por unidade de comprimento (que divide cada elemento do vetor amostra
pela norma-2), e normalização fazendo a máxima intensidade igual a 1 ( que divide cada elemento
do vetor pela norma infinita, definida como o máximo valor, em absoluto, do vetor)
[18]
. Um outro
tipo de normalização é a
Normalização Variável Padrão
(SNV). A SNV
[99]
é uma linha de
transformação orientada para os centros das escalas dos espectros individuais. Funciona como um
auto-escalonamento nas amostras, onde na escala vertical, cada espectro é centrado em zero e varia
de cerca de -2 a 2. Basicamente o SNV uniformiza cada espectro, utilizando apenas os dados de
cada espectro individualmente
[99]
.
A ponderação de amostras é uma técnica de pré-processamento que dá a algumas amostras
maior peso nas análises em relação a outras, deste modo enfatiza uma amostra sobre as demais. Esta
técnica é utilizada para remover variações sistemáticas nas amostras, e para isso, atribui-se as
amostras consideradas mais importantes pesos proporcionais a sua importância para o modelo, e
multiplica-se cada elemento do vetor amostra pelo seu peso
[18]
.
Já a suavização é uma técnica de pré-processamento utilizada para reduzir a variação
randômica presente em um conjunto de dados
[100]
. Esta técnica é usada para reduzir
matematicamente o ruído aleatório e aumentar a relação sinal/ruído. A suavização normalmente
reduz o número de variáveis, e pode eventualmente, remover informações úteis.
Existem diversos tipos de suavização, entre eles temos: Suavização por média
[18]
; por média
móvel
[18]
; por mediana móvel
[18]
; por polinômio móvel
[18]
; por transformada de Fourier
[18]
; e por
transformada de Wavelet
[18]
. Entretanto, neste trabalho iremos abordar apenas a suavização por
polinômio móvel, também conhecida por Método de Savitzky-Golay
[101]
.
No Método de Savitzky-Golay
[101]
, um polinômio de baixa ordem, pré-definido, é ajustado,
por mínimos quadrados, aos pontos de uma janela. Tanto a ordem do polinômio, como o tamanho
da janela, são estabelecidos por um usuário. O uso do método de Savitzky-Golay resulta na
eliminação de (tamanho da janela - 1)/2 pontos em cada extremidade do vetor. A escolha do número
de ponto é uma etapa crítica, uma vez que, ao se escolher um número elevado pontos pode-se
remover informações relevantes, e ao se escolher um número pequeno de pontos, o ruído pode
ainda permanecer nos dados espectrais.
Além de ruído aleatório, as medidas podem conter variações sistemáticas não relacionadas
com a investigação química, denominadas de feições da linha de base, que podem dominar a análise
CAPÍTULO I
15
se não forem removidas. As feições de linha de base podem ser removidas usando modelos
explícitos tais como: derivativos (usando derivadas de primeira e segunda ordem), e correção do
fator multiplicativo do sinal (MSC)
[18]
.
Os métodos derivativos (primeira e segunda derivada) não se baseiam na identificação dos
pontos de linha de base, sendo muito útil em casos onde a linha de base é difícil de identificar. Com
as operações de derivação dos espectros, as informações contidas nos diferentes comprimentos de
onda são geralmente acentuadas
[100]
. Dentre os métodos derivativos conhecidos, pode-se citar:
derivação por simples diferença móvel (onde a simples diferença entre pontos adjacentes é usada
para estimar a 1ª derivada, a 2ª e sucessivas derivadas); derivação por diferença de média móvel
(onde uma janela é selecionada e a diferença entre médias móveis é tomada); e derivação pelo
método de Savitzky-Golay (onde, na suavização ajusta-se um polinômio a uma janela móvel do
sinal resposta e o ponto central da janela é estimado pelo polinômio. Na derivação por esse método
é usado o valor estimado pela derivada do polinômio da janela)
[18]
. Deve-se ter cuidado com a
qualidade dos espectros aos quais deseja-se aplicar o calculo das derivadas, uma vez que não só os
sinais espectrais, como também os ruídos, tornam-se acentuados.
O MSC é uma técnica que pode ser generalizada como uma correção de sinal multiplicativa.
Foi desenvolvida para corrigir as variações devidas ao espalhamento da luz para as medidas NIR de
reflectância difusa
[18,100]
. Mesmo com o uso da técnica, o espectro pré-processado continua a
assemelhar-se ao espectro original, não prejudicando a sua interpretação
[18]
.
(b) Pré-processamento de dados aplicado às variáveis -
Para se realizar este pré-
processamento faz-se uso de técnicas que operam em uma variável de cada vez e sob todas as
amostras. Usualmente, três tipos de pré-processamento são aplicados: centragem dos dados na
média, escalonamento e auto-escalonamento
[18,94]
.
Na centragem dos dados na média
[18]
calcula-se o valor médio para cada variável e o valor
de cada elemento da coluna é subtraído pelo seu respectivo valor médio, resultando numa matriz,
onde todas as colunas possuem média zero. Como a centragem na média geralmente não prejudica a
análise dos dados, e sempre colabora para a resolução de problemas presentes nos mesmos, é por
isso, usada como configuração padrão em alguns pacotes computacionais para cálculos
estatísticos
[18]
.
No escalonamento
[18]
, cada elemento de uma linha é dividido pelo desvio padrão da sua
respectiva variável, de modo que a variância se torne unitária e as variáveis passem a ser expressas
em unidades de desvio padrão.
CAPÍTULO I
16
O auto-escalonamento
[18]
consiste em centralizar os dados na média e, em seguida, efetuar o
escalonamento. Desta forma, as variáveis terão médias zero e desvios padrão igual a um.
Tanto o escalonamento quanto o auto-escalonamento é utilizado quando se pretende atribuir
os mesmos pesos às variáveis do sistema de investigação, mas para dados espectroscópicos, estes
dois últimos métodos não são comumente utilizados devido a possibilidade de maximizar
informações irrelevantes (ruído)
[18]
.
1.7 Métodos de Reconhecimento de Padrão
As técnicas quimiométricas de reconhecimento de padrões baseiam-se na busca de
semelhanças, ou agrupamentos de amostras, a partir da similaridade entre elas ou a partir de
diferenças em suas propriedades físicas ou químicas, o que permite também identificação de
amostras anômalas. Dentre essas técnicas, estão as não supervisionadas
[18]
: Análise de
Componentes Principais (PCA) e Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA), que servem para a
análise exploratória dos dados, ou seja, são usados apenas para examinar similaridades ou
diferenças entre amostras, bem como para identificar a formação de padrões no espaço
multidimensional.; e as supervisionadas
[18]
: Modelagem Independente e Flexível por Analogia de
Classe (SIMCA) e Método do K-ésimo Vizinho mais Próximo (KNN), que servem para classificação
das amostras ou agrupamento das mesmas em classes de acordo com suas características
[18,94-96]
.
Neste trabalho serão aplicadas apenas as técnicas PCA e SIMCA.
1.7.1 PCA
A PCA é uma ferramenta exploratória projetado por Karl Pearson
[102]
em 1901 para
identificar as tendências desconhecidas em um conjunto de dados. É um dos métodos estatísticos
mais usados quando se pretendem analisar dados multivariados
[103]
. O algoritmo foi introduzido em
1933 pelo psicólogo H. Hotelling
[104]
, daí às vezes é chamado Transformada Hotelling
[104]
.
A análise por componentes principais (PCA) é um dos métodos mais comuns empregados na
análise de informações
[92,105]
, sendo principalmente utilizada pela sua capacidade de compressão
dos dados em função da existência de correlação entre diversas variáveis medidas, permitindo a
transformação de um conjunto de variáveis originais, intercorrelacionadas, num novo conjunto de
variáveis não correlacionadas
[106 ]
. Para isso, faz-se uso de operações matriciais para se obter novas
coordenadas das amostras em outro sistema de eixos, denominados de fatores ou componentes
principais (PC)
[18,94,95,107]
, que seja mais conveniente para a análise de dados. A construção dos
CAPÍTULO I
17
novos eixos é feita a partir da combinação linear do conjunto de variáveis originais, sendo estes
eixos sempre ortogonais entre si
[18,94,95,107]
.
Assim, quando aplicamos um algoritmo de PCA num conjunto de variáveis, como em
espectros no infravermelho, o conjunto original destas variáveis é substituído por um novo conjunto
de variáveis (as PC), o qual pode ser facilmente reconstruído a partir da combinação linear das
variáveis originais (espectros)
[106]
.
A vantagem do uso desta técnica baseia-se num princípio relativamente simples: ao
descorrelacionar os dados, elimina-se a parte da informação redundante em cada dimensão. Os
benefícios resultantes são vários: os dados podem ser descritos de uma forma mais concisa, certas
características escondidas dos dados podem vir a luz depois de transformadas, e a distribuição dos
dados pode ser representada (aproximadamente) pelas densidades individuais de cada dimensão
[108]
.
Muitos aplicativos disponíveis utilizam a técnica de decomposição do valor singular
(SVD)
[109]
para obter as PC, sendo neste caso a primeira componente principal (PC1) definida na
direção (eixo) de maior variância do conjunto de variáveis originais
[106]
. De forma decrescente em
termos de variação são definidas as demais componentes principais, porém estas serão sempre
ortogonais a PC1 e entre si. Assim, um sistema que seja reduzido a 3 PC (PC1, PC2 e PC3) se
assemelha ao sistema cartesiano de coordenadas, em que todos os eixos são linearmente
independentes
[106]
.
Por exemplo, observe na Figura 3 um conjunto hipotético de pontos no espaço euclidiano,
descrito pelas coordenadas x1 e x2. Para a conversão no novo sistema de coordenadas, a primeira
componente principal (u1, que é o autovetor com o maior autovalor) corresponde a uma linha que
passa através da média e minimiza a soma do erro quadrado com esses pontos. A segunda
componente principal (u2) segue o mesmo princípio, sendo ortogonal a primeira componente e
apresentando o segundo maior autovalor. A operação prossegue até que todas as novas coordenadas
sejam estabelecidas
[109,110]
.
Figura 3. Exemplo da conversão das variáveis em novos eixos no espaço multidimensional.
CAPÍTULO I
18
Cada autovalor indica a porção da variância que está correlacionada com cada
autovetor
[109,110]
. Assim, a soma de todos os valores próprios é igual à soma do quadrado da
distância com os seus pontos de média, dividido pelo número de dimensões. A PCA,
essencialmente, gira o conjunto de pontos em torno de sua média, a fim de alinhar as primeiras
componentes principais
[109,110]
. Isso move a variação tanto quanto possível para as primeiras
dimensões (usando uma transformação linear), ficando as primeiras componentes individualmente
responsáveis pela variância das observações, e neste sentido, representam-nas mais claramente
[108]
.
Estes novos eixos representam as direções com máxima variabilidade, na ordem da maior para
menor variância de PC
1
para PC
n
. Os valores restantes nas últimas dimensões tendem a ser
altamente correlacionados e podem ser descartados com perda mínima de informação química uma
vez que as PC iniciais é que são as responsáveis por explicar a maior proporção da variação total
associada ao conjunto original
[108]
.
Para um conjunto de espectros NIR, inicialmente a matriz de dados X (m x n), onde m
corresponde ao número de amostras (espectros) e n ao número de variáveis (freqüências do
espectro), é decomposta em 3 outras matrizes, U, S e V
[92]
, conforme a expressão:
X = USVt (1)
As colunas de U e V são ortogonais. A matriz V corresponde a contribuição de cada variável
nas PC, e nada mais é do que o cosseno do ângulo entre o eixo da variável e o eixo da PC que varia
entre os valores de -1 a 1
[106]
. A matriz V é conhecida como a matriz dos pesos, onde a primeira
coluna contém os pesos de PC1 e assim por diante. O produto U x S corresponde as coordenadas
das amostras com relação as PC (obtidas pelo produto da matriz de dados pela matriz dos pesos). A
matriz U é denominada de matriz dos escores e define a nova localização das amostras de X no
vetor espaço, e S é matriz diagonal, cujos elementos (valores singulares) contêm informações sobre
a quantidade de variância que cada componente principal descreve. A matriz S é importante na
determinação da dimensionalidade intrínseca da matriz de dados, podendo os analistas definir
quantas PC ou fatores devem ser utilizados para análises posteriores
[106]
.
A PCA é freqüentemente usada para a redução de dimensionalidade por ter a distinção de ser
a transformação linear ideal para manter o subespaço que tem a maior variância
[109,110]
.
Com o método PCA é possível
[18]
:
• Mostrar de que forma uma amostra é diferente da outra;
• Identificar quais variáveis contribuem mais para estas diferenças;
CAPÍTULO I
19
• Identificar quais variáveis contribuem de forma correlacionadas ou independentemente uma
da outra;
• Detectar padrão de amostras (agrupamentos);
• Distinguir informação útil de ruído;
• Identificar amostras anômalas (outliers), etc.
1.7.2 SIMCA
O SIMCA é um método de reconhecimento de padrão supervisionado, utilizado para
classificação de amostras futuras. O método SIMCA
[111]
usa PCA para modelar a forma e a posição
do objeto formado pelas amostras no espaço linha para definição de uma classe. No SIMCA um
modelo multidimensional é construído para cada classe e a classificação de amostras de predição é
efetuada determinando dentro de qual classe a amostra está situada. Para isso, um número ótimo de
componentes principais é determinado independentemente para cada classe e o modelo final é
obtido através da definição da fronteira entre cada PCA modelado
[106,112]
. Como conseqüência, uma
hipercaixa com tantas dimensões quantas forem o número de PC mais adequados para cada classe é
obtida.
Figura 4. Exemplo de modelos SIMCA.
CAPÍTULO I
20
Para modelar ou delimitar as fronteiras onde estão localizadas as amostras, é utilizado um
conjunto de treinamento contendo amostras de todas as classes e cuja identidade de cada amostra
deste conjunto é conhecido a priori. As fronteiras de cada classe são modeladas ou delimitadas
usando apenas as amostras daquela classe conhecida no conjunto de treinamento
[106,112]
. Uma vez
definidas as hipercaixas é importante verificar se existem classes com sobreposição. A Figura 4
apresenta uma simples exemplificação de modelos SIMCA hipotéticos, para duas classes de
amostras distintas.
O poder de discriminação dos modelos SIMCA se baseia na não existência de sobreposição
entre duas classes diferentes, bem como na maior distância interclasses possível
[112]
. A classificação
de uma amostra externa àquelas empregadas na modelagem SIMCA se baseia nas diferentes
projeções possíveis no espaço dos escores avaliando-se se a mesma encontra-se dentro das
fronteiras definidas para a respectiva classe em todas as projeções obtidas
[112]
. Assim, na predição
de um modelo SIMCA a amostra é classificada como pertencente à classe se apresentar variância
dentro de um valor crítico determinado pelo modelo. Este valor crítico é função do valor da
proximidade de uma amostra “X” em relação à fronteira da caixa tridimensional construída pelo
modelo SIMCA. Para melhor entendimento sobre o calculo do valor crítico, observe um modelo
hipotético na Figura 5, onde se pretende fazer a predição de uma amostra X.
Figura 5. Predição com um modelo SIMCA.
O primeiro passo é encontrar o valores de a, b e c, onde “a” corresponde à proximidade de
X em relação à fronteira da caixa tridimensional, “b” é a distância entre a fronteira e a projeção de
X na PCA e “c” o resíduo da PCA
[18, 94,95, 113]
. O valor de a pode ser obtido pela Equação 2.
a
2
= b
2
+ c
2
(2)
CAPÍTULO I
21
O cálculo das distâncias a, b e c determina se uma amostra desconhecida pertence à classe
definida pelo seu modelo SIMCA. Após calcular o valor de a, este é dividido pela variância da
classe para formar um valor calculado, F
cal
. Utiliza-se, então, o teste F onde um valor critico, F
crit
, é
escolhido empiricamente ou a partir de uma tabela do teste F. Se o F
cal
for menor do que o valor
crítico adotado, a amostra desconhecida pode ser classificada como pertencente à classe
[18, 94,95, 113]
.
Portanto, a atribuição de uma amostra teste a uma dada classe é baseada na projeção da
mesma no espaço dos escores e sua distância das fronteiras da classe em questão. Isto é repetido
para todas as classes e no final, se os modelos não tiverem poder de discriminação suficiente, a
amostra pode ser membro de mais de uma classe.
Se uma amostra é classificada em mais de uma classe, as medidas ou os modelos SIMCA
não são potencialmente discriminantes. Se uma amostra não é classificada como membro de uma
das classes do conjunto de treinamento, ela pode pertencer a uma outra classe ou pode ainda ser
uma amostra anômala em relação ao conjunto de treinamento por ser suficientemente diferente do
conjunto de dados. As amostras anômalas podem ocorrer devido a um erro nas medidas, ou devido
ao surgimento de uma ou mais amostras que sofreram um fenômeno químico anômalo ou
desconhecido
[18]
.
O resultado da classificação SIMCA fornecido pelo programa Unscrambler® apresenta,
como configuração padrão, uma tabela de asteriscos, onde a presença dos mesmos representa que a
amostra avaliada está em conformidade com o modelo elaborado, e a ausência representa a não-
conformidade
[99]
. Outra forma de apresentação do resultado por este programa computacional é pela
ilustração gráfica, seja pelo gráfico de Coomans, pelo gráfico Si versus Hi, ou pelo gráfico Si/S0
versus Hi. O gráfico de Coomans
[99]
mostra as distâncias ortogonais dos novos objetos para dois
modelos diferentes ao mesmo tempo. Ele estabelece os limites de sociedade da classe para ambos os
modelos, de modo que se pode ver se uma amostra é susceptível de pertencer a uma classe, a
ambas, ou a nenhuma. O gráfico Si versus Hi
[99]
mostra os limites utilizados para a classificação,
usando o desvio-padrão residual (Si) e a distância da nova amostra ao centro do modelo (Hi). O
gráfico Si/S0 versus Hi
[99]
mostra o mesmo que o Si versus Hi, mas as distâncias são medidas em
relação à distância média do modelo.
O SIMCA é um método bem estabelecido na literatura e é largamente utilizado para
classificação de amostras em conjuntos de dados com alta dimensionalidade. Tem sido aplicado
com sucesso em diferentes matrizes, incluindo: medicamentos
[114]
, alimentos
[115]
, cosméticos
[116]
,
entre outras
[117]
.
CAPÍTULO I
22
Ao se comparar o método PCA com o SIMCA, pode-se dizer que a PCA simplesmente
define um sistema de coordenadas no qual as amostras estão representadas, sendo esta utilizada
apenas para análise exploratória dos dados, e não para classificação. Já o SIMCA utiliza os eixos
definidos por estes sistemas de coordenadas, estabelecendo fronteiras sendo usado justamente para
classificar amostras. O uso destas técnicas quimiométricas de reconhecimento de padrões permite
realizar uma análise Screening dos medicamentos analisados, baseadas na busca de semelhanças, ou
agrupamentos de amostras, a partir da similaridade entre os espectros NIR.
1.7.2.i Análise Screening
A análise Screening caracteriza-se como um método que envolve a interação do analista em
uma ou mais etapas de um processo analítico auxiliando nas decisões (sim ou não, presente ou
ausente, positivo ou negativo, continue ou pare, etc.)
[118-120]
. É uma modalidade que vem ganhando
grande destaque na Química Analítica por poder ser incluída dentro do contexto de análise prévia
de amostras
[121-123]
. O termo análise Screening incorpora um conjunto de interesses analíticos, não
sendo possível encontrar na literatura uma definição inequívoca. Contudo, esse termo pode ser
genericamente entendido como: um processo preliminar de análise condicionante da escolha e
aplicação de rotas ou decisões posteriores
[118-120,123-125]
.
A análise Screening ganhou importância devido ao aumento da demanda de análises que
operam com redução de custos operacionais, e da necessidade de se reduzir o descarte de reagentes
que contaminam significativamente o meio ambiente
[121-123]
. Esta modalidade auxilia a
implementação de métodos modernos que forneçam resultados rápidos, que evitem procedimentos
analíticos desnecessários e reduzam ao mínimo o número de determinações qualitativas e
quantitativas.
1.8 Calibração multivariada
Os métodos de análise multivariada são assim chamados, pois, em caso do emprego das
técnicas espectroscópicas no infravermelho, é possível manipular dados de absorbância espectral
associados a mais de uma freqüência ao mesmo tempo. Estes métodos têm recentemente tornado
possível modelar propriedades químicas e físicas de sistemas simples e complexos a partir de seus
dados espectroscópicos
[15]
. As análises qualitativas e quantitativas de medicamentos, utilizando
espectroscopia na região do infravermelho, expandiram-se a partir do momento em que os dados
gerados por um espectrofotômetro FT-IR puderam ser digitalizados, habilitando os métodos
estatísticos na resolução de problemas da análise química
[15]
.
CAPÍTULO I
23
A possibilidade de utilizar várias freqüências do espectro tem aumentado o tipo de amostras
que podem ser analisadas por espectroscopia no infravermelho
[15,126]
.
O processo de calibração multivariada baseado em dados espectrais consiste em construir
um modelo matemático que relacione as medidas de absorbância, ao longo dos espectros, com os
parâmetros de interesse (concentrações das espécies em análise, acidez, viscosidade, índice de
refração, etc.) nas amostras
[72,92,127]
.
O processo de calibração multivariada é constituído basicamente de três fases: a calibração,
a validação e a predição. O objetivo da fase de calibração é produzir um modelo matemático para
relacionar a saída do sinal de um instrumento às propriedades das amostras, quer seja relacionar os
dados espectrais com os valores de concentração obtidos por um método de referência
[100]
. Na fase
de calibração são construídos os modelos matemáticos e na fase de validação estes modelos são
validados usando ferramentas estatísticas de diagnóstico (como: o gráfico dos pesos, o gráfico dos
resíduos, o gráfico de influência, o teste F, etc...). Na fase de predição, os modelos matemáticos
validados são usados para predizer as concentrações ou propriedades de amostras desconhecidas,
porém de mesma natureza das amostras dos conjuntos de calibração e validação.
Durante a construção dos modelos de calibração multivariada, duas metodologias podem ser
utilizadas: A validação cruzada e a série de teste
[18]
. Na metodologia série de teste usa-se três
conjuntos de amostras separadamente, sendo um para calibração, um para a validação e um para a
predição do modelo. A escolha da quantia de amostras que irá compor cada conjunto não é algo pré-
definido, podendo-se usar, por exemplo, 50% do banco de dados das amostras para calibrar o
modelo, 25% para validação e 25% para predição
[18]
. Já na metodologia de validação cruzada, usa-
se dois conjuntos de amostras, sendo um conjunto para calibração e validação do modelo, e um
conjunto para predição. Durante a construção do modelo uma amostra é escolhida de forma
aleatória e separada do conjunto de calibração e usada para validar o modelo. Esta operação se
processa de forma que todas as amostras do conjunto sejam testadas e o melhor resultado seja
escolhido. Para esta metodologia também não há uma especificação da quantidade de amostras que
se deve utilizar para compor cada conjunto, podendo-se usar, por exemplo, 70% do banco de dados
das amostras para calibrar e validar o modelo e 30% para predição
[18]
.
Na construção de modelos de calibração multivariada, os dados espectrais de natureza
multivariada (Figura 6) são representados numa matriz X, de dimensão (n x m), onde n representa o
número de amostras cujos espectros foram medidos e m representa o número de variáveis ou de
comprimentos de ondas em que as absorbâncias foram medidas. Os parâmetros de interesse são
CAPÍTULO I
24
representados pela matriz Y de dimensão (n x p), onde p são os parâmetros a serem estimados pelos
modelos construídos
[92]
.
Figura 6. Representação de matrizes de dados (X e Y).
Os espectros NIR obtidos fornecem valores quantitativos dos componentes da amostra
analisada. Tais informações químicas precisam ser ajustadas a modelos matemáticos que permitam
fazer previsões de casos não experimentados na prática
[100]
, e para isso são empregadas técnicas
estatísticas multivariadas. Dentre os métodos mais empregados na calibração multivariada podemos
citar a regressão por mínimos quadrados parciais - PLS (sessão 1.8.1), e a regressão linear múltipla -
MLR (sessão 1.8.2).
Para a construção de bons modelos de calibração multivariada, um importante problema
deve ser levado em consideração: a seleção de um subconjunto representativo em um conjunto
grande de amostras
[128-131]
. Como a construção dos modelos deve ser feita de forma a se obter
modelos precisos e parcimoniosos, é necessário escolher as amostras mais significativas de cada
conjunto. Usam-se, geralmente, algoritmos para a seleção de amostras (calibração, validação e
predição). Dois algoritmos se tornaram de grande valia na seleção desses conjuntos, o Algoritmo
Kennard-Stone (KS)
[132]
e o Algoritmo de partição do conjunto de amostras baseado nas distancias
conjuntas X-Y (SPXY)
[133]
.
O Algoritmo KS
[132]
busca selecionar um subconjunto significativo em um conjunto de N
amostras. Para assegurar a uniformidade de distribuição de cada subconjunto ao longo do espaço de
dados X (respostas instrumentais), o algoritmo KS segue o procedimento por etapas de modo que
uma nova seleção é feita nas regiões do espaço longe das amostras já selecionadas
[132]
. Para este
propósito, o algoritmo emprega a distância Euclidiana d
x
(a,b) entre os vetores X de cada par (a,b)
de amostras, como mostrado na Equação 3:
;)]()([),(
1
2
∑
=
−=
J
j
bax
jXjXbad
a,b ∈[1,N] (3)
CAPÍTULO I
25
Para dados espectrais, X
a
(j) a X
b
(j) são as respostas instrumentais no j-ésimo comprimento
de onda para as amostras a e b, respectivamente, e J denota o número de comprimentos de onda no
espectro. A seleção começa tomando o par (a
1
,a
2
) de amostras nas quais a distância d
x
(a
1
,a
2
) é
maior, subseqüentemente, o algoritmo seleciona a amostra que exibe a maior distância em relação a
uma amostra já selecionada. O procedimento é repetido até que o número de amostras requerido
seja encontrado
[132]
.
O algoritmo SPXY
[133]
, é uma extensão do algoritmo KS que leva em consideração tanto as
diferenças de X quanto as de Y no cálculo das distâncias inter-amostras.
Este algoritmo calcula cada distância d
x
(a,b) (Equação 3) e cada distância d
y
(a,b) (Equação
4), soma as distâncias de X com Y e normaliza dividindo d
x
(a,b) e d
y
(a,b) pelos seus valores
máximos no conjunto de dados (Equação 5).
;)(),(
2
babay
yyyybad −=−=
a,b∈[1,N] (4)
;
),(max
),(
),(max
),(
),(
],1[,x],1[,
x
x
bad
bad
bad
bad
bad
yNba
y
Nba
y
∈∈
+=
a, b ∈ [1,N] (5)
1.8.1 PLS
A regressão PLS é um método de análise de fatores, introduzida por H.Wold
[134]
, que busca
estabelecer uma relação entre a matriz de dados de uma dada resposta instrumental, como os
espectros NIR (matriz X), com a matriz de dados de uma informação de interesse, como a
concentração de um determinado analito (matriz Y)
[135-137]
. Ambas as matrizes são decompostas em
novas variáveis denominadas variáveis latentes, fatores ou componentes principais, a partir de duas
matrizes de variações: Pesos e escores. Os espectros originais podem ser considerados como
combinações lineares das variações dos espectros (pesos) onde os escores representam a
contribuição de cada espectro original
[100]
. O modelo final consiste, basicamente, em se encontrar a
melhor relação linear entre os escores das duas matrizes.
De uma forma geral, para se entender o funcionamento do PLS
[138]
, consideremos a
Equação 6:
Y = X b (6)
CAPÍTULO I
26
onde Y é a propriedade de interesse (concentração, por exemplo), b é o vetor de regressão e X
refere-se aos espectros das amostras representadas por uma matriz onde as colunas são os valores de
absorbância para cada comprimento de onda e as linhas referem-se às amostras.
A dificuldade de encontrar o modelo para determinar a propriedade de interesse está em
encontrar o valor de b, uma vez que a matriz X
T
X não é inversível devido à redundância das
variáveis. A regressão de componentes principais elimina esta redundância pela construção de uma
nova matriz U com colunas que são combinações lineares das colunas originais em X
[138]
. Esta
matriz tem o mesmo número de linhas que X, mas um número menor de colunas. Usando a matriz
U, um novo modelo pode ser escrito (Equação 7).
y = Ub (7)
Várias maneiras podem ser utilizadas para construir a matriz U. A análise de componentes
principais (PCA)
[139]
é um eficiente método para encontrar uma combinação linear de variáveis. A
matriz U é a matriz de escores do PCA, a qual define a localização das amostras relativas umas as
outras no vetor espaço. Essa matriz de escores pode ser encontrada pela decomposição SVD:
X = USV
T
(8)
onde V é a matriz contendo os pesos e S é a matriz diagonal com os valores singulares.
Para determinar U, pode-se então usar a propriedade ortonormal:
U = RVS
-1
(9)
No PLS, a covariância das medidas com as concentrações são usadas em adição à variância
em X para gerar U. É um processo iterativo, no qual se otimiza ao mesmo tempo a projeção das
amostras sobre os pesos para a determinação dos escores e o ajuste por uma função linear dos
escores da matriz X aos escores de y (lembrando que y é um vetor de respostas da propriedade de
interesse obtida por metodologia padrão, de modo a minimizar os desvios)
[138]
.
A partir da matriz U
PLS
, é possível resolver a Equação 10 para o vetor de regressão b:
y = U
PLS
bb
prev
(10)
CAPÍTULO I
27
Construído o modelo de calibração, este é usado para fazer a estimativa do parâmetro em
novas amostras. Os procedimentos de seleção do número ótimo de fatores e de validação dos
modelos são interligados, sendo o número ótimo de componentes àquele que resultar num modelo
com melhor capacidade preditiva
[138]
.
O algoritmo dos mínimos quadrados parciais iterativos não-lineares (NIPALS) é um
algoritmo eficiente para extrair os vetores de pesos a partir dos espectros, na ordem decrescente de
suas contribuições à variância nos espectros de calibração
[140]
, é o adotado pelo programa
Unscrambler® para realizar este cálculo
[99]
.
Dentre os vários métodos de calibração multivariada, o PLS é particularmente útil quando
nem todas as substâncias espectroscopicamente ativas são conhecidas e o número de variáveis é
grande
[127]
.
A aplicação da quimiometria apresentou um avanço significativo com a utilização do
método PLS. Com o uso deste método, muitos problemas de cálculo puderam ser superados e
variadas aplicações analíticas começaram a surgir
[141]
.
1.8.2 MLR
MLR
[142]
é uma técnica que busca estabelecer uma relação linear entre o sinal analítico e a
concentração aplicando o método dos mínimos quadrados. O modelo MLR pode ser obtido a partir
de uma matriz X de respostas instrumentais, e dos dados de um vetor y que contém as
concentrações (ou outra propriedade) obtidas por um método de referência das amostras. Cada
variável dependente de y é expressa como uma combinação linear das variáveis independentes da
matriz X por intermédio da expressão:
y=Xb (11)
onde o vetor b contém os coeficientes da regressão, que são calculados por mínimos quadrados a
partir da pseudoinversa de X:
b=(X
T
X)
-1
X
T
y (12)
onde -1 e T representam a inversão e transposição da matriz, respectivamente.
Com o modelo determinado, as concentrações de novas amostras podem ser estimadas a
partir da seguinte equação:
y
prev
= X
*
b (13)
onde X
*
representa a matriz de dados para as novas amostras.
CAPÍTULO I
28
Os modelos MLR são mais simples e mais fáceis de interpretar que os modelos PLS, porque
os modelos PLS executam uma regressão em variáveis latentes que em geral, não têm significado
físico. Por outro lado, para a construção de modelos MLR o número de amostras deve ser igual ou
superior ao número de variáveis
[18]
. Uma vez que o modelo consiste na resolução de um sistema de
equações lineares simultâneas, essa condição tem que ser satisfeita. Caso contrário, o sistema torna-
se indeterminado. Um problema importante em calibração MLR é que a matriz (X
T
X) pode não ser
inversível ou promover a propagação de erros quando existir forte correlação ou multicolinearidade
entre as variáveis
[137]
. Uma vez que, a inclusão de variáveis redundantes pode ter vários efeitos
potencialmente danosos, ainda que as variáveis adicionais não influenciem diretamente o
desempenho do modelo
[18]
. Em função disso, os modelos MLR são mais dependentes de uma boa
escolha das variáveis espectrais. A seleção dos comprimentos de onda que resultem na máxima
precisão ainda é uma tarefa desafiadora, principalmente quando os espectros possuem uma forte
sobreposição e têm características distintivas imperceptíveis, como é o caso da espectroscopia UV-
Vis.
Várias técnicas de seleção de variáveis têm sido propostas na literatura para selecionar
conjuntos de variáveis não redundantes e mais informativas para calibração multivariada, e os
algoritmos adotados por nosso grupo de trabalho são: Algoritmo da Busca Agular (ASA)
[143]
,
Algoritmo Genético (GA)
[145]
, Algoritmo das Projeções Sucessivas (SPA)
[149]
, Algoritmo Stepwise
(SW)
[157]
.
1.8.2.1 ASA
O ASA
[143]
é uma técnica que busca minimizar a correlação e a multicolinearidade entre as
variáveis da matriz de respostas instrumentais. O ASA calcula os cossenos dos ângulos entre os
vetores associados às variáveis definidas no espaço das amostras e aplica um procedimento
mínimo-máximo para construir cadeias de variáveis minimamente correlacionadas. Num conjunto
de dados centrados na média (comum nos métodos de regressão multivariada e também utilizado no
ASA), o valor do cosseno é, matematicamente, igual a correlação entre duas variáveis. Para remover
a colinearidade restante entre as variáveis, o ASA descarta as variáveis mais colineares por
intermédio do Fator de Inflação da Variância (VIF) que fornece uma medida da multicolinearidade
entre as variáveis, selecionando as que apresentem valores abaixo de um determinado limiar
[143,144]
.
A combinação ASA-VIF possibilita a seleção de um conjunto de variáveis minimamente
correlacionadas e sem multicolinearidade, permitindo a seleção das variáveis mais informativas
CAPÍTULO I
29
com relação à matriz Y por intermédio da menor raiz quadrada do erro médio quadrático de
previsão – RMSEP, para um conjunto independe de amostras.
1.8.2.2 GA
O GA
[145]
, muito utilizado em calibração multivariada, é um algoritmo que utiliza operadores
matemáticos para simular processos da evolução, inspirados em mecanismos de seleção natural
proposta por Charles Darwin. Este algoritmo modela uma solução para um problema específico em
uma estrutura de dados como a de um cromossomo e aplica operadores que re-combinam estas
estruturas preservando informações críticas, de modo que selecione variáveis aleatoriamente,
mantendo-se menos susceptível a soluções locais
[146-148]
.
Numa utilização mais abrangente do termo, um algoritmo genético é qualquer modelo
baseado em população que utiliza operadores de seleção e re-combinação para gerar novos pontos
amostrais em um espaço de busca
[146-148]
.
Uma implementação do algoritmo genético começa com uma população (geralmente
randômica) de cromossomos. Estas estruturas são então avaliadas para gerar oportunidades
reprodutivas de forma que, cromossomos que representam uma solução "melhor" tenham maiores
chances de se reproduzirem do que os que representam uma solução "pior". A definição de uma
solução melhor ou pior é tipicamente relacionada à população atual
[145-148]
. O uso de um gerador
randômico para criar uma população inicial de cromossomos antes da otimização serve para evitar
influência tendenciosa. A evolução é realizada por meio de gerações. A cada geração, a adaptação
de cada solução na população é avaliada, e alguns indivíduos são selecionados para a próxima
geração, podendo ainda ser recombinados ou mutados para formar uma nova população de modo a
melhorar gradativamente a adaptação. A função de adaptação é avaliada mediante a construção de
modelos MLR, cujo valor é calculado como o inverso do RMSEP obtido
[145]
. A nova população
então é utilizada como entrada para a próxima iteração do algoritmo.
Muitos algoritmos genéticos foram introduzidos por pesquisadores de uma perspectiva
experimental, e destes, a maior parte tinham interesse de utilizar o algoritmo genético como uma
fermenta de otimização
[146-148]
.
Entretanto, muito embora o GA realize uma procura aleatória, devido à sua natureza
estocástica, normalmente os resultados das seleções das variáveis dependentes não são
reprodutíveis.
CAPÍTULO I
30
1.8.2.3
SPA
O SPA
[149]
é uma técnica de seleção de variáveis que utiliza operações simples num espaço
vetorial para minimizar problemas de colinearidade. Este algoritmo mostrou-se eficiente para
seleção de variáveis espectrais, no contexto da calibração multivariada, especificamente quando
aplicado ao MLR.
O algoritmo SPA compreende basicamente três etapas. Inicialmente, o algoritmo seleciona
subconjuntos de variáveis com base no critério de minimização da multicolinearidade. Esses
subconjuntos são obtidos de acordo com uma seqüência de operações de projeções aplicadas nas
colunas da matriz de calibração
[149]
. Posteriormente, o melhor subconjunto é escolhido de acordo
com um critério que avalia a habilidade de predição de um modelo MLR a partir de uma série de
testes, tal como o PRESS. A estatística PRESS
[137]
é uma medida de validação obtida pela
eliminação de cada observação, uma por vez, e prevendo-se esse valor dependente com o modelo de
regressão estimado a partir das demais observações. Por fim, o subconjunto escolhido é submetido a
um procedimento de eliminação para determinar se alguma variável poderá ser removida sem perda
significante da capacidade de predição, e para isso calcula-se o RMSEP
[149]
.
Após a apresentação inicial do SPA, muitos trabalhos científicos foram publicados com
diferentes modificações e aplicações, incluindo UV-Vis
[149,150]
, ICP-OES
[151]
, espectrometria
NIR
[152-154]
, QSAR
[155]
e classificação
[156]
.
1.8.2.4 SW
O algoritmo Stepwise
[157]
é um método para seleção, que determina dentre um universo de
potenciais variáveis explicativas, uma combinação que deve compor o modelo a ser utilizado. Esta
técnica remonta à década de 1970
[158]
. Nele, a importância que cada variável independente
apresenta dentro de um dado modelo é investigada. Para isso, as variáveis são excluídas ou
adicionadas ao modelo de acordo com algum critério pré-estabelecido
[159]
. Algumas versões
ligeiramente diferentes deste algoritmo podem ser encontradas na literatura
[157-162]
.
O método Stepwise determina que variáveis ou quais variáveis dentre o conjunto de
variáveis independentes especificadas serão realmente usadas para a regressão, e em qual ordem
elas serão introduzidas, começando com as variáveis forçadas, e continuando com as outras
variáveis e conjuntos de variáveis, uma a uma
[157]
. Posteriormente, o algoritmo seleciona, das
variáveis preditoras remanescentes, a variável ou conjunto de variáveis que produz a maior redução
na variância dos resíduos (não-explicada) da variável dependente, a menos que a sua contribuição
ao F-calculado total para a regressão permaneça abaixo de um nível especificado. O algoritmo
CAPÍTULO I
31
avalia depois de cada passo se a contribuição de qualquer variável ou conjunto de variáveis já
inclusas cai abaixo de um nível especificado, senão estas serão eliminadas da regressão
[157]
.
Em outras palavras, o algoritmo Stepwise procura, passo a passo, uma variável independente
não presente na equação de regressão que possui a menor probabilidade de F. As variáveis já na
regressão são removidas se a sua probabilidade de F tornar-se muito grande. O algoritmo termina
quando não há mais variáveis elegíveis para inclusão ou remoção
[161,162]
.
1.9 Objetivo
Este trabalho tem como objetivo propor diferentes modelos quimiométricos aplicando
seleção de variáveis e calibração multivariada a espectros NIR, para a determinação do teor do
principio ativo de um medicamento injetável diretamente em seus recipientes, sem violá-los.
1.9.1 Objetivos específicos
Para que os objetivos fossem atingidos foi necessário:
• Adquirir amostras comerciais de um medicamento injetável utilizado na clínica
médico/hospitalar (o medicamento escolhido foi a dipirona sódica injetável);
• Desenvolver uma técnica para aquisição de espectros NIR diretamente nas ampolas dos
medicamentos injetáveis;
• Elaborar modelos quimiométricos de calibração multivariada a partir dos espectros NIR
registrados;
• Aplicar os modelos de calibração multivariada em espectros NIR de amostras comerciais do
medicamento injetável e verificar a capacidade preditiva de cada modelo.
CAPÍTULO II
EXPERIMENTAL
CAPÍTULO II
33
2. EXPERIMENTAL
2.1 Metodologia e estratégia de ação
A seguir serão apresentadas informações acerca do método utilizado no desenvolvimento
deste trabalho.
2.1.1 Obtenção das amostras e preparação das soluções padrão
O fármaco escolhido para as análises foi a dipirona sódica injetável 1g/2mL (500 mg/mL),
comercializada em frasco ampola de 2 mL de coloração âmbar. A opção por esse medicamento se
deu pelo fato de se tratar de um medicamento comercial de alto consumo na clínica
médico/hospitalar, devido ás suas propriedades intrínsecas, tais como: alta eficácia no tratamento de
dores agudas, fracas e medianas, baixo custo, ampla e ubíqua disponibilidade, e boa margem de
segurança. Além disso, esse medicamento é intensamente comercializado no mercado brasileiro
[41]
.
Em função da extrema dificuldade de se obter uma grande quantidade de amostras de
hospitais procedentes de um único laboratório farmacêutico, optou-se pela obtenção das amostras
diretamente de uma indústria farmacêutica, dado que neste caso, também teríamos em mãos
medicamentos recém produzidos e dentro dos padrões de qualidade requeridos. Assim, foram
gentilmente fornecidas pelo fabricante Isofarma Industrial Farmacêutica, com sede na cidade de
Euzébio, Estado do Ceará, 64 amostras (8 amostras de 8 lotes diferentes), e seus respectivos laudos.
A Tabela 2 apresenta o número de amostras (N
o
A), com suas respectivas concentrações de dipirona
sódica injetável (CDSI) determinadas segundo o método de referência oficial, os códigos dos lotes
(CL), e mês/ano de validade (M/A) de acordo com os laudos fornecidos pelo fabricante.
Tabela 2 – Número de amostras com suas respectivas concentrações, lotes e mês/ano de validade.
N
o
A
CDSI (% m/v)
CL M/A N
o
A
CDSI (% m/v)
CL M/A
8
50,27 HR541 Dez/2008
8
52,72 HR545 Dez/2008
8
51,67 HR542 Dez/2008
8
50,97 HR546 Dez/2008
8
52,90 HR543 Dez/2008
8
52,02 HR549 Dez/2008
8
49,92 HR544 Dez/2008
8
50,98 HR550 Dez/2008
Para a construção dos modelos quimiométricos, soluções padrão foram preparadas com o
princípio ativo: dipirona sódica, de grau analítico (99,2% m/m) adquirido em farmácias de
manipulação de João Pessoa-PB.
CAPÍTULO II
34
As soluções padrão foram preparadas por simples diluição do princípio ativo em água de
injeção esterilizada (fornecidas pelo mesmo fabricante) nas concentrações de 0,0 (contendo somente
água para injetáveis), 10,0; 20,0; 24,0; 28,0; 32,0; 36,0; 40,0; 44,0; 44,5; 45,0; 46,0; 48,0; 50,0;
52,0; 54,0; 54,5; 55,0; 55,5; 56,0 e 60,0% (m/v), totalizando 21 padrões. Após o preparo, as
soluções foram acondicionadas em frascos de vidro de coloração âmbar.
Água para injetáveis é uma água estéril, obtida por destilação, em equipamentos cujas partes
em contato com a água são de vidro neutro, quartzo ou metal apropriado, podendo ainda, ser obtida
por processo equivalente ou superior à destilação na remoção de contaminantes químicos ou
microorganismos
[44]
.
As concentrações de 45,0 a 55,0 % (m/v) englobam a faixa de variação das concentrações de
dipirona sódica em medicamentos injetáveis aceita pelos órgãos fiscalizadores, que neste caso é de
±10,0% do valor nominal do princípio ativo do medicamento injetável, que é 50,0% (m/v).
Não foi possível preparar padrões em concentrações superiores a 60,0% (m/v) devido à
limitação da solubilidade do princípio ativo.
2.1.2 Instrumentação
Para o registro dos espectros das amostras do medicamento injetável dipirona sódica foi
utilizado o espectrômetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) da marca Perkin
Elmer, modelo Spectrum, série GX, mostrado na Figura 7.
Figura 7 – Espectrômetro Perkin Elmer FT-IR modelo GX.
2.1.3 Confecção dos suportes para os medicamentos
Para o procedimento das análises NIR, era necessário o correto encaixe das ampolas no
caminho óptico (fixo) do feixe de radiação eletromagnética para minimizar os problemas de
espalhamento e para garantir uma boa reprodutibilidade das medidas. Para isso, tornou-se
necessário a construção de suportes (um para cada classe de ampolas, por exemplo, ampolas de: 1, 3
CAPÍTULO II
35
ou 5 mL), confeccionados em teflon afixados em bases de alumínio. Esses suportes se adaptaram
perfeitamente ao compartimento de análises do espectrômetro NIR (Figura 8).
Figura 8 – Suporte das ampolas de medicamentos adaptado ao compartimento de medidas do espectrômetro NIR.
Vale ressaltar que, os suportes foram construídos de tal forma que as rotulações das ampolas
não alcançavam o feixe da radiação do instrumento.
2.1.4 Estudos físicos das ampolas de vidro
Foram realizados testes para avaliar a interação das paredes de vidro da ampola com a
radiação eletromagnética na região do NIR.
Para os testes, utilizou-se uma ampola vazia, a qual foi previamente marcada em uma
extremidade e rotacionada em 360°, para registro dos espectros NIR a cada 20°. Conforme se pode
verificar na Figura 9, nenhuma absorção foi detectada, indicando a não necessidade de se fixar a
ampola em uma determinada direção para efetuar as análises.
Figura 9 – Estudo de absorção da radiação NIR pelas ampolas de vidro.
CAPÍTULO II
36
2.1.5 Aquisição dos espectros
Quatro ampolas foram previamente abertas, esvaziadas e limpas, para serem usadas como
cubetas nas devidas análises. O tamanho do caminho óptico percorrido pelo feixe luminoso foi de
aproximadamente 1 cm.
Para o registro do branco, utilizou-se as ampolas vazias reservadas, preenchidas com 2 mL
de água para injetáveis.
Para o registro das soluções padrão, utilizou-se as quatro ampolas vazias reservadas,
preenchidas com 2mL de solução, para cada amostra padrão. Como se preparou 21 soluções padrão,
ao se registrar 4 amostragens de cada padrão, formou-se um conjunto de 84 amostras. Todos os
registros dos espectros foram efetuados com três réplicas para cada amostra, totalizando 312
espectros de soluções padrão.
Os espectros NIR das amostras comerciais foram registrados incidindo a radiação
infravermelha diretamente sobre a ampola de vidro do medicamento injetável devidamente fechada.
Os registros dos espectros das amostras comerciais também foram efetuados em triplicata para cada
amostra, totalizando 192 espectros.
A totalidade de espectros registrados para serem usados na construção dos modelos, entre
amostras comerciais e soluções padrão, foi de 504 espectros. O registro de todas as amostras foi
arquivado em um microcomputador para posterior tratamento quimiométrico.
A Figura 10 mostra os detalhes para o registro dos espectros NIR dos medicamentos
injetáveis sem a violação da ampola.
Figura 10 – Sistema para registro dos espectros NIR dos medicamentos injetáveis sem violação da ampola.
A: espectrômetro NIR; B: suporte das ampolas acoplado ao suporte do espectrofotômetro; C: amostra de dipirona sódica
injetável afixada em seu suporte.
A
B
C
CAPÍTULO II
37
Todos os espectros foram registrados na faixa espectral compreendida entre 666 a 2500 nm.
Estes espectros foram utilizados para a análise Screening e para a construção, validação e predição
dos modelos de calibração multivariada.
Todas as análises foram efetuadas em ambiente controlado, onde a temperatura média foi de
26
o
C e umidade relativa média de 54%. Cada espectro NIR registrado foi sempre um espectro
médio resultante de 16 varreduras, empregando uma resolução de 4 cm
-1
.
2.1.6 Programas estatísticos
Para realizar o pré-processamento dos dados e aplicar as técnicas quimiométricas de
análise de dados adequadas (as técnicas de reconhecimento de padrões PCA e SIMCA, e de
regressão PLS), foi utilizado o programa quimiométrico The Unscrambler® 9.7 da CAMO SA. Os
algoritmos de seleção de amostras (SPXY), e de variáveis (SW, GA, SPA e ASA) associadas a
regressão MLR, foram elaborados e executados em ambiente Matlab® 6.5. Para a determinação do
número ótimo de fatores foi utilizando o programa The Unscrambler® 9.7.
CAPÍTULO III
RESULTADOS E DISCUSSÃO
CAPÍTULO III
39
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Seleção da região espectral de trabalho
Para o registro do sinal do branco utilizou-se uma ampola de 2 mL com água para injetáveis.
O sinal espectral obtido encontra-se ilustrado na Figura 11.
Figura 11 – Registro do sinal do branco (ampola com água para injetáveis).
Os espectros NIR das amostras do medicamento dipirona sódica injetável comercial e das
soluções padrão, na faixa espectral de 600 a 2500 nm, são apresentados na Figura 12.
Figura 12 - Espectros brutos das amostras e dos padrões na região NIR entre 666 a 2500 nm.
Faixa selecionada
CAPÍTULO III
40
Na Figura 12, observa-se que os valores de absorbância na região compreendida entre 1300
e 2500 nm apresentam grandes saturações, e a região abaixo de 884 nm (666 a 884 nm) encontra-se
ruidosa e sem a presença de picos aparentes. Estas regiões foram descartadas a priori na definição
da região espectral de trabalho.
A região escolhida para análise foi a faixa espectral compreendida entre 884 e 1220 nm, a
qual se encontra ilustrada na Figura 13. A maior parte desta faixa encotra-se na região do
infravermelho próximo de ondas curtas (Shortwave-NIR - SW-NIR)
[163,164]
. O SW-NIR compreende a
região que vai de 800 a 1100 nm (12500 a 9091 cm
-1
). A partir desta região encontra-se o
infravermelho próximo de ondas longas (Longwave-NIR - LW-NIR) onde se insere a faixa de 1100 a
2500 nm (9091 a 4000 cm
-1
). Essa região escolhida caracteriza-se pela ocorrência principalmente de
sobretons e combinações de transições fundamentais.
Figura 13 - Espectros brutos das amostras e padrões na região NIR entre 884 a 1220 nm.
Como se pode observar na Figura 13, uma parte do espectro apresenta-se ruidoso, e estes
possuem uma grande variação de linha de base entre as amostras. Porém o ruído instrumental é
muito comum nessa região espectral, podendo ser facilmente tratado pelo uso de uma técnica de
suavização adequada, por exemplo, a suavização Savitzky-Golay
[101]
, que ajusta, pelos mínimos
quadrados, um polinômio de baixa ordem aos pontos de uma janela. Neste método de suavização, a
escolha do número de pontos utilizado na janela é muito importante, pois um número elevado de
pontos pode acarretar perda de informações relevantes, e um número pequeno de pontos acarreta a
permanência de ruído nos dados espectrais.
CAPÍTULO III
41
Já o deslocamento de linha de base observado, provavelmente é devido à variação do índice
de refração, que neste caso ocorre devido às pequenas variações como: pequenas diferenças na
espessura das paredes das ampolas; pequenas variações na transparência da coloração das paredes
das ampolas de vidro; além das pequenas diferenças que o feixe luminoso enfrenta em seu percurso,
proporcionadas pela mudança do meio (ar/vidro/água). A variação da linha de base também não se
torna um problema crítico, uma vez que também existem técnicas que possibilitam sua correção,
como por exemplo, os métodos derivativos.
É possível se observar ainda, a presença de algumas absorbâncias negativas na região entre
1195 e 1220 nm. Isso ocorre devido ao fato de a absorbância do sinal do branco ser muito alta em
relação à absorbância da amostra. A banda do O-H da água presente no branco ocorre numa região
próxima a essa faixa (em aproximadamente 1350 nm), e é tão larga e tão intensa que chega a afetar
essa região.
3.2 Atribuição das bandas dos espectros NIR
A região espectral compreendida entre, aproximadamente 700 e 1200 nm corresponde à
região de segundo sobreton do O-H, terceiro sobreton do N-H e quarto sobreton do C-H. Pode-se
verificar na Figura 14, que o intervalo espectral que se encontra aproximadamente entre 884 e
1000 nm apresenta uma absorção relativa à combinação de transições fundamentais dos grupos C-
H
3
, C-H
2
, C-H e R-OH pertencentes às moléculas de dipirona presentes na amostra
[163]
.
Figura 14 – Atribuição das bandas dos espectros NIR para uma amostra de dipirona sódica injetável.
CH
2°
sobreton
NH
2°
sobreton
CH
3°
sobreton
CH
CH
2
CH
3
ArCH RNHR’
RNH
2
ROH
CH
CH
2
CH
3
H
2
O
CAPÍTULO III
42
A faixa de absorção que se encontra aproximadamente entre 1000 e 1100 nm corresponde à
região de combinação de bandas de estiramento de ligações R-NH-R’ e Ar-CH. As bandas de
absorção que aparecem entre 1100 e 1200 nm estão associadas à região de combinação de
transições fundamentais de C-H, C-H
2
e C-H
3
, que estão associadas às freqüências de estiramento
destas ligações
[110]
.
3.3 Pré-Processamento dos dados espectrais
O padrão do ruído presente nas amostras não é uniforme e não se distribui da mesma
maneira em todos os espectros, caracterizando-se como um ruído aleatório. O pré-processamento
utilizado deveria ser capaz de remover a maior porção possível desta informação espúria.
O pré-processamento adotado para ser aplicado no conjunto de dados foi a primeira derivada
(dA/dλ) com suavização pelo método Savitzky-Golay utilizando uma janela de 21 pontos e
polinômio de segunda ordem. Este pré-processamento corrige as variações de linha de base, e
minimiza os ruídos espectrais presentes nos dados. A Figura 15 apresenta o sinal resultante deste
procedimento de pré-processamento.
Figura 15 - Perfis das curvas resultante do pré-processamento em relação aos espectros originais.
3.4 Aplicação de uma análise de componentes principais (PCA)
Com efeito, uma vez que se utiliza outro método para a preparação dos padrões, que não seja
exatamente àquele com as mesmas condições nas quais as amostras comerciais foram preparadas,
pode acontecer de haver fatores que diferenciem significativamente essas amostras. Para se verificar
se isso havia ocorrido com o banco de dados gerado, realizou-se uma análise exploratória das
CAPÍTULO III
43
amostras através da construção de um modelo PCA com os dados pré-processados, usando três PC,
com a finalidade de se visualizar a disposição espacial das amostras e avaliar a provável formação
de grupos. Se caso houvesse uma diferença realmente significativa entre as amostras comerciais e
os padrões preparados no laboratório, observar-se-ia a formação de duas classes distintas de
amostras e, portanto, verificar-se-ia a distribuição espacial em dois grupos. Caso isso ocorresse,
implicaria na inviabilidade do método, sendo necessária uma reprodução exata das condições
utilizadas na indústria farmacêutica, pois indicaria diferenças físico-químicas consideráveis entre as
amostras comerciais e os padrões preparados no laboratório.
Para a construção do modelo PCA foram usadas todas as amostras comerciais (os 192
espectros das amostras) e as concentrações dos padrões que mais se aproximavam dos valores das
concentrações das amostras comerciais adquiridas (os 12 espectros dos padrões na concentração de
48,0% (m/v), os 12 espectros dos padrões na concentração de 50,0% (m/v) e os 12 espectros dos
padrões na concentração de 52,0% (m/v)). Como se pode verificar no gráfico tridimensional dos
escores obtido pela PCA, apresentado na Figura 16, essa distribuição em dois grupos não é
evidente, e o que se observa é que as amostras comerciais se intercalam entre amostras dos padrões
de dipirona, chegando algumas até mesmo a se misturar com os mesmos, indicando uma
similaridade entre estas amostras.
Figura 16 – Gráfico dos escores da PCA dos espectros pré-processados das amostras comerciais e de padrões de
dipirona sódica. Onde P48 (em vermelho), P50 (em verde), P52 (em rosa), indica os padrões nas respectivas
concentrações de 48, 50 e 52% (m/v), e A (em azul) indica as amostras comerciais.
A Figura 17 apresenta o gráfico de influência (para a primeira PC), que revela uma
variância residual muito baixa entre as amostras (da ordem de 0,1 x 10
-7
) e uma distância da
amostra ao centro do modelo também muito pequena (menor que 0.8). Além disso, o
CAPÍTULO III
44
comportamento dessas amostras indica a ausência de amostras anômalas, dado que nenhuma
amostra apresenta simultaneamente alto resíduo e alta influência
[72]
.
Figura 17 – Gráfico de influência das amostras comerciais (A) e dos padrões de dipirona sódica (P).
A priori parece não haver diferenças significativas entre as amostras comerciais e os padrões
de dipirona sódica preparados no laboratório. Entretanto, para reforçar ainda mais essa hipótese, foi
realizada uma análise Screening dos dados utilizando modelos SIMCA.
3.5 Análise Screening
Os espectros NIR das amostras de dipirona sódica injetável, como já mencionado, foram pré-
processados, e a partir desses espectros pré-processados foram construídos os modelos SIMCA com
uma parte das amostras dos padrões de dipirona sódica. Estes modelos SIMCA foram, então,
utilizados para a realização da análise Screening de amostras “desconhecidas” (amostras de padrões
que não entraram na modelagem e as amostras comerciais de dipirona sódica injetável), para
predizer se uma determinada amostra pertence ou não à classe de amostras previamente modeladas.
Para este propósito, um conjunto de treinamento foi composto por padrões de dipirona
sódica preparados nas concentrações de 0,0 (contendo somente água para injetáveis), 10,0; 20,0;
24,0; 28,0; 32,0; 36,0; 40,0; 44,0; 48,0; 52,0; 56,0 e 60,0% (m/v). A partir deste conjunto foram
construídos os modelos SIMCA, empregando o processo de validação cruzada para 1, 2 e 3 PC. O
gráfico da variância explicada em função do número de PC (Figura18) foi, então, utilizado como
ferramenta de diagnóstico para determinar o número ideal de componentes principais a ser usado na
construção deste modelo.
CAPÍTULO III
45
O conjunto reservado para predição contempla os padrões de dipirona sódica nas
concentrações de 44,5; 45,0; 46,0; 50,0; 54,0; 54,5; 55,0 e 55,5% (m/v) e também todo o conjunto
de amostras comerciais analisadas.
Figura 18 – Gráfico da variância explicada de X versus o número de componentes do modelo SIMCA.
Pela análise do gráfico da variância explicada em função do número de componentes
principais, optou-se por utilizar apenas uma PC para a construção do modelo SIMCA, visto que esta
já explica 98,6% da variância de X (matriz das variáveis espectrais), e como a PC2 explica apenas
cerca de 1% a mais do que esta, e a PC3 explica somente cerca de 0,2% a mais que a PC2, a
inclusão dessas PC poderiam prejudicar o modelo. O modelo SIMCA gerado foi então utilizado para
a análise Screening de todas as amostras comerciais e padrões de dipirona sódica (conjunto de
treinamento e o de predição), empregando um nível de confiança de 95%.
Na Tabela 3 são apresentados os resultados do modelo SIMCA usado para análise Screening
de todas as amostras de dipirona sódica. Essa análise demonstrou que o modelo SIMCA foi capaz de
classificar tanto as amostras de dipirona sódica de sua classe (amostras de padrões preparadas nas
mesmas condições), como as amostras da classe formada pelas amostras comerciais de dipirona
sódica injetável, ou seja, todas as amostras foram classificadas como pertencentes a uma mesma
classe.
Este mesmo resultado também pode ser observado no gráfico de Coomans criado a partir do
mesmo conjunto de dados, que está ilustrado na Figura 19. Neste gráfico, observa-se que nenhuma
amostra ficou fora do espaço dimensional criado pelo modelo SIMCA.
CAPÍTULO III
46
Tabela 3.- Análise Screening de todas as amostras de dipirona do conjunto de validação e predição.
A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C
P0 1 * P20 7 * P36 1 * P44 19 * P46 1 * P52 7 * P55 13 * P56 19 * A50,27 1 * A50,97 19
* A51,67 13 * A52,72 7 *
P0 2 * P20 8 * P36 2 * P44 20 * P46 2 * P52 8 * P55 14 * P56 20 * A50,27 2 * A50,97 20
* A51,67 14 * A52,72 8 *
P0 3 * P20 9 * P36 3 * P44 21 * P46 3 * P52 9 * P55 15 * P56 21 * A50,27 3 * A50,97 21
* A51,67 15 * A52,72 9 *
P0 4 * P20 10 * P36 4 * P44 22 * P46 4 * P52 10 * P55 16 * P56 22 * A50,27 4 * A50,97 22
* A51,67 16 * A52,72 10 *
P0 5 * P20 11 * P36 5 * P44 23 * P46 5 * P52 11 * P55 17 * P56 23 * A50,27 5 * A50,97 23
* A51,67 17 * A52,72 11 *
P0 6 * P20 12 * P36 6 * P44 24 * P46 6 * P52 12 * P55 18 * P56 24 * A50,27 6 * A50,97 24
* A51,67 18 * A52,72 12 *
P0 7 * P24 1 * P36 7 * P44,5 1 * P46 7 * P54 1 * P55 19 * P60 1 * A50,27 7 * A50,98 1 * A51,67 19 * A52,72 13 *
P0 8 * P24 2 * P36 8 * P44,5 2 * P46 8 * P54 2 * P55 20 * P60 2 * A50,27 8 * A50,98 2 * A51,67 20 * A52,72 14 *
P0 9 * P24 3 * P36 9 * P44,5 3 * P46 9 * P54 3 * P55 21 * P60 3 * A50,27 9 * A50,98 3 * A51,67 21 * A52,72 15 *
P0 10 * P24 4 * P36 10 * P44,5 4 * P46 10 * P54 4 * P55 22 * P60 4 * A50,27 10 * A50,98 4 * A51,67 22 * A52,72 16 *
P0 11 * P24 5 * P36 11 * P44,5 5 * P46 11 * P54 5 * P55 23 * P60 5 * A50,27 11 * A50,98 5 * A51,67 23 * A52,72 17 *
P0 12 * P24 6 * P36 12 * P44,5 6 * P46 12 * P54 6 * P55 24 * P60 6 * A50,27 12 * A50,98 6 * A51,67 24 * A52,72 18 *
P0 13 * P24 7 * P40 1 * P44,5 7 * P48 1 * P54 7 * P55,5 1 * P60 7 * A50,27 13 * A50,98 7 * A52,02 1 * A52,72 19 *
P0 14 * P24 8 * P40 2 * P44,5 8 * P48 2 * P54 8 * P55,5 2 * P60 8 * A50,27 14 * A50,98 8 * A52,02 2 * A52,72 20 *
P0 15 * P24 9 * P40 3 * P44,5 9 * P48 3 * P54 9 * P55,5 3 * P60 9 * A50,27 15 * A50,98 9 * A52,02 3 * A52,72 21 *
P0 16 * P24 10 * P40 4 * P44,5 10
* P48 4 * P54 10 * P55,5 4 * P60 10 * A50,27 16 * A50,98 10
* A52,02 4 * A52,72 22 *
P0 17 * P24 11 * P40 5 * P44,5 11
* P48 5 * P54 11 * P55,5 5 * P60 11 * A50,27 17 * A50,98 11
* A52,02 5 * A52,72 23 *
P0 18 * P24 12 * P40 6 * P44,5 12
* P48 6 * P54 12 * P55,5 6 * P60 12 * A50,27 18 * A50,98 12
* A52,02 6 * A52,72 24 *
P0 19 * P28 1 * P40 7 * P45 1 * P48 7 * P54,5 1 * P55,5 7 * A49,92 1 * A50,27 19 * A50,98 13
* A52,02 7 * A52,90 1 *
P0 20 * P28 2 * P40 8 * P45 2 * P48 8 * P54,5 2 * P55,5 8 * A49,92 2 * A50,27 20 * A50,98 14
* A52,02 8 * A52,90 2 *
P0 21 * P28 3 * P40 9 * P45 3 * P48 9 * P54,5 3 * P55,5 9 * A49,92 3 * A50,27 21 * A50,98 15
* A52,02 9 * A52,90 3 *
P0 22 * P28 4 * P40 10 * P45 4 * P48 10 * P54,5 4 * P55,5 10 * A49,92 4 * A50,27 22 * A50,98 16
* A52,02 10 * A52,90 4 *
P0 23 * P28 5 * P40 11 * P45 5 * P48 11 * P54,5 5 * P55,5 11 * A49,92 5 * A50,27 23 * A50,98 17
* A52,02 11 * A52,90 5 *
P0 24 * P28 6 * P40 12 * P45 6 * P48 12 * P54,5 6 * P55,5 12 * A49,92 6 * A50,27 24 * A50,98 18
* A52,02 12 * A52,90 6 *
P10 1 * P28 7 * P44 1 * P45 7 * P50 1 * P54,5 7 * P56 1 * A49,92 7 * A50,97 1 * A50,98 19
* A52,02 13 * A52,90 7 *
P10 2 * P28 8 * P44 2 * P45 8 * P50 2 * P54,5 8 * P56 2 * A49,92 8 * A50,97 2 * A50,98 20
* A52,02 14 * A52,90 8 *
P10 3 * P28 9 * P44 3 * P45 9 * P50 3 * P54,5 9 * P56 3 * A49,92 9 * A50,97 3 * A50,98 21
* A52,02 15 * A52,90 9 *
P10 4 * P28 10 * P44 4 * P45 10 * P50 4 * P54,5 10 * P56 4 * A49,92 10
* A50,97 4 * A50,98 22
* A52,02 16 * A52,90 10 *
P10 5 * P28 11 * P44 5 * P45 11 * P50 5 * P54,5 11 * P56 5 * A49,92 11
* A50,97 5 * A50,98 23
* A52,02 17 * A52,90 11 *
P10 6 * P28 12 * P44 6 * P45 12 * P50 6 * P54,5 12 * P56 6 * A49,92 12
* A50,97 6 * A50,98 24
* A52,02 18 * A52,90 12 *
P10 7 * P32 1 * P44 7 * P45 13 * P50 7 * P55 1 * P56 7 * A49,92 13
* A50,97 7 * A51,67 1 * A52,02 19 * A52,90 13 *
P10 8 * P32 2 * P44 8 * P45 14 * P50 8 * P55 2 * P56 8 * A49,92 14
* A50,97 8 * A51,67 2 * A52,02 20 * A52,90 14 *
P10 9 * P32 3 * P44 9 * P45 15 * P50 9 * P55 3 * P56 9 * A49,92 15
* A50,97 9 * A51,67 3 * A52,02 21 * A52,90 15 *
P10 10
* P32 4 * P44 10 * P45 16 * P50 10 * P55 4 * P56 10 * A49,92 16
* A50,97 10 * A51,67 4 * A52,02 22 * A52,90 16 *
P10 11
* P32 5 * P44 11 * P45 17 * P50 11 * P55 5 * P56 11 * A49,92 17
* A50,97 11 * A51,67 5 * A52,02 23 * A52,90 17 *
P10 12
* P32 6 * P44 12 * P45 18 * P50 12 * P55 6 * P56 12 * A49,92 18
* A50,97 12 * A51,67 6 * A52,02 24 * A52,90 18 *
P20 1 * P32 7 * P44 13 * P45 19 * P52 1 * P55 7 * P56 13 * A49,92 19
* A50,97 13 * A51,67 7 * A52,72 1 * A52,90 19 *
P20 2 * P32 8 * P44 14 * P45 20 * P52 2 * P55 8 * P56 14 * A49,92 20
* A50,97 14 * A51,67 8 * A52,72 2 * A52,90 20 *
P20 3 * P32 9 * P44 15 * P45 21 * P52 3 * P55 9 * P56 15 * A49,92 21
* A50,97 15 * A51,67 9 * A52,72 3 * A52,90 21 *
P20 4 * P32 10 * P44 16 * P45 22 * P52 4 * P55 10 * P56 16 * A49,92 22
* A50,97 16 * A51,67 10
* A52,72 4 * A52,90 22 *
P20 5 * P32 11 * P44 17 * P45 23 * P52 5 * P55 11 * P56 17 * A49,92 23
* A50,97 17 * A51,67 11
* A52,72 5 * A52,90 23 *
P20 6 * P32 12 * P44 18 * P45 24 * P52 6 * P55 12 * P56 18 * A49,92 24
* A50,97 18 * A51,67 12
* A52,72 6 * A52,90 24 *
O asterisco (“*”) na tabela indica que a amostra foi classificada como pertencente à classe.
Figura 19 – Gráfico de Coomans do modelo SIMCA. Onde, em vermelho estão as amostras do conjunto de treinamento
e, em verde estão as amostras do conjunto de predição.
•
Treinamento
• Predição
CAPÍTULO III
47
Após testar o modelo com toda a faixa de concentração preparadas, optou-se por testar
também a faixa de concentração aceita pelos órgãos fiscalizadores que é de ±10% (m/v). Para isso,
usou-se um conjunto de treinamento composto por padrões de dipirona sódica preparados nas
concentrações de 45,0; 46,0; 50,0; 54,0; 54,5 e 55,0 % (m/v). Empregou-se o processo de validação
cruzada e utilizou-se uma PC para a construção do modelo SIMCA. O conjunto de predição ficou
reservado apenas para as amostras comerciais de dipirona sódica injetável.
A Tabela 4 apresentada os resultados do modelo SIMCA usado para análise Screening na
faixa de concentração de 45 a 55% de dipirona sódica. Nesta análise o modelo SIMCA foi capaz de
classificar todas as amostras de dipirona sódica comerciais, com um nível de confiança de 99%.
Tabela 4.- Análise Screening das amostras de dipirona comerciais do conjunto predição, usando o modelo SIMCA
construído para a faixa de 45 a 55 % (m/v).
A C A C A C A C A C A C A C A C
A49,92 1 * A50,27 1 * A50,97 1 * A50,98 1 * A51,67 1 * A52,02 1 * A52,72 1 * A52,90 1 *
A49,92 2 * A50,27 2 * A50,97 2 * A50,98 2 * A51,67 2 * A52,02 2 * A52,72 2 * A52,90 2 *
A49,92 3 * A50,27 3 * A50,97 3 * A50,98 3 * A51,67 3 * A52,02 3 * A52,72 3 * A52,90 3 *
A49,92 4 * A50,27 4 * A50,97 4 * A50,98 4 * A51,67 4 * A52,02 4 * A52,72 4 * A52,90 4 *
A49,92 5 * A50,27 5 * A50,97 5 * A50,98 5 * A51,67 5 * A52,02 5 * A52,72 5 * A52,90 5 *
A49,92 6 * A50,27 6 * A50,97 6 * A50,98 6 * A51,67 6 * A52,02 6 * A52,72 6 * A52,90 6 *
A49,92 7 * A50,27 7 * A50,97 7 * A50,98 7 * A51,67 7 * A52,02 7 * A52,72 7 * A52,90 7 *
A49,92 8 * A50,27 8 * A50,97 8 * A50,98 8 * A51,67 8 * A52,02 8 * A52,72 8 * A52,90 8 *
A49,92 9 * A50,27 9 * A50,97 9 * A50,98 9 * A51,67 9 * A52,02 9 * A52,72 9 * A52,90 9 *
A49,92 10 * A50,27 10 * A50,97 10 * A50,98 10 * A51,67 10 * A52,02 10 * A52,72 10 * A52,90 10 *
A49,92 11 * A50,27 11 * A50,97 11 * A50,98 11 * A51,67 11 * A52,02 11 * A52,72 11 * A52,90 11 *
A49,92 12 * A50,27 12 * A50,97 12 * A50,98 12 * A51,67 12 * A52,02 12 * A52,72 12 * A52,90 12 *
A49,92 13 * A50,27 13 * A50,97 13 * A50,98 13 * A51,67 13 * A52,02 13 * A52,72 13 * A52,90 13 *
A49,92 14 * A50,27 14 * A50,97 14 * A50,98 14 * A51,67 14 * A52,02 14 * A52,72 14 * A52,90 14 *
A49,92 15 * A50,27 15 * A50,97 15 * A50,98 15 * A51,67 15 * A52,02 15 * A52,72 15 * A52,90 15 *
A49,92 16 * A50,27 16 * A50,97 16 * A50,98 16 * A51,67 16 * A52,02 16 * A52,72 16 * A52,90 16 *
A49,92 17 * A50,27 17 * A50,97 17 * A50,98 17 * A51,67 17 * A52,02 17 * A52,72 17 * A52,90 17 *
A49,92 18 * A50,27 18 * A50,97 18 * A50,98 18 * A51,67 18 * A52,02 18 * A52,72 18 * A52,90 18 *
A49,92 19 * A50,27 19 * A50,97 19 * A50,98 19 * A51,67 19 * A52,02 19 * A52,72 19 * A52,90 19 *
A49,92 20 * A50,27 20 * A50,97 20 * A50,98 20 * A51,67 20 * A52,02 20 * A52,72 20 * A52,90 20 *
A49,92 21 * A50,27 21 * A50,97 21 * A50,98 21 * A51,67 21 * A52,02 21 * A52,72 21 * A52,90 21 *
A49,92 22 * A50,27 22 * A50,97 22 * A50,98 22 * A51,67 22 * A52,02 22 * A52,72 22 * A52,90 22 *
A49,92 23 * A50,27 23 * A50,97 23 * A50,98 23 * A51,67 23 * A52,02 23 * A52,72 23 * A52,90 23 *
A49,92 24 * A50,27 24 * A50,97 24 * A50,98 24 * A51,67 24 * A52,02 24 * A52,72 24 * A52,90 24 *
O asterisco (“*”) na tabela indica que a amostra foi classificada como pertencente à classe.
O mesmo resultado também foi observado no gráfico de Coomans, ilustrado na Figura 20,
onde se observa que nenhuma amostra ficou fora do espaço dimensional criado pelo modelo
SIMCA.
A vantagem de se realizar uma análise Screening é que essa poderosa técnica permite uma
análise prévia dos dados. Com ela torna-se possível identificar anomalias no conjunto de dados,
bem como identificar amostras adulteradas. Quando se tem um grande conjunto de amostras, como
o utilizado neste trabalho, e se verifica a presença de amostras anômalas nesse conjunto, essas
amostras é que seriam primeiramente investigadas, e não todo o banco de dados, o que na prática
gera a redução de análises químicas, redução de custos operacionais e de gastos com reagentes.
CAPÍTULO III
48
Figura 20 – Gráfico de Coomans para o modelo SIMCA construído para a faixa de 45 a 55% (m/v). Onde, em vermelho
estão as amostras do conjunto de calibração/validação e, em verde estão as amostras do conjunto de predição
Os resultados obtidos com a análise Screening foram muito satisfatórios, e demonstram que
não há diferença significativa entre os conjuntos de amostras preparadas no laboratório e as
amostras comerciais, sendo todas amostras apropriadas para a construção e validação dos modelos
de calibração para a predição do teor de dipirona sódica em medicamentos injetáveis.
3.6 Resultados da aplicação dos modelos
Após pré-processados os dados relativos às amostras e aos padrões de dipirona, foram
separados em três grupos: calibração, validação e predição, sendo 252 amostras sintéticas e
comerciais separadas para o conjunto de calibração, 126 amostras sintéticas e comerciais separadas
para o conjunto de validação e 126 amostras sintéticas e comerciais separadas para o conjunto de
predição. As amostras com concentrações extremas (10,0 e 60,0%), bem como as que não contém o
princípio ativo (0,0%) só entraram no conjunto de calibração para evitar extrapolação. Para a
seleção das amostras de cada conjunto utilizou-se o algoritmo SPXY.
Esses conjuntos foram utilizados para a elaboração de modelos de calibração (PLS1, MLR-
SPA, MLR-ASA, MLR-GA e MLR-SW) com o objetivo de utilizá-los para a determinação da
concentração de dipirona (predição) nas amostras reais e em alguns padrões que simulavam a
presença de amostras fora das especificações no conjunto.
•
Padrões
• Amostras
CAPÍTULO III
49
3.6.1 Modelo PLS1
Para a construção do modelo PLS1, utilizou-se apenas uma variável latente, uma vez que
esta explica 99,2% da variância. Além disso, acreditava-se que o parâmetro que representasse a
maior variância, e portanto estivesse variando na primeira PC, fosse a concentração do princípio
ativo. Essa afirmativa foi reforçada com os resultados obtidos pelo modelo de regressão.
Para a validação do modelo PLS1 adotou-se o método série de teste. A Figura 21 ilustra o
gráfico do valor predito versus o valor de referência das concentrações de dipirona sódica para o
conjunto de validação obtido pelo modelo de calibração PLS1. Neste gráfico observa-se uma boa
correlação linear (no valor de 0,9938), e um RMSEV de 0,98 % (m/v).
Figura 21 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação do modelo PLS1.
O modelo elaborado (calibrado e validado) foi, então, aplicado as amostras comerciais de
medicamentos injetáveis e nos padrões de concentrações de 20,0 a 56,0% (m/v), para a predição das
concentrações de dipirona sódica. Os resultados da predição dos valores das concentrações estão
resumidos no gráfico da Figura 22. O valor do coeficiente de correlação linear obtido e o RMSEP
foram respectivamente, 0,9904 e 1,07 % (m/v).
Tanto as amostras do conjunto de validação como as amostras do conjunto de predição
apresentaram-se distribuídas de forma aleatória em torno da bissetriz (Figura 21 e Figura 22),
indicando ausência de erro sistemático no modelo PLS1. O erro encontrado para predição da
concentração de dipirona nas amostras é muito baixo, com relação ao método de referência.
Amostras
comerciais
CAPÍTULO III
50
Portanto, pode-se afirmar que o modelo PLS1 é bastante promissor para a determinação de dipirona
sódica neste medicamento injetável comercial.
Figura 22 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição do modelo PLS1.
3.6.2 Modelo MLR-SPA
A partir dos conjuntos de amostras selecionados pelo SPXY, o algoritmo das projeções
sucessivas (SPA) selecionou 9 variáveis espectrais mais informativas e não redundantes. A
escolha do número ótimo de variáveis determinadas pelo SPA foi realizada a partir dos valores
dos RMSEV obtidos. A Figura 23 mostra a variação do RMSEV versus o número de variáveis
selecionadas.
0 5 10 15 20 25 30 35
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Número de variáveis inclusas no modelo
RMSEV
Figura 23 – Variação do RMSEV (% m/v) em função do número de variáveis inclusas no modelo MLR-SPA.
Amostras
comerciais
•
CAPÍTULO III
51
A Figura 24 apresenta o gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica,
indicando aproximadamente a localização das variáveis selecionadas pelo algoritmo SPA. Nesta
figura, pode-se observar que as variáveis selecionadas estão localizadas em regiões espectrais
informativas.
850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0.22
0.24
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 24 - Gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica, indicando aproximadamente a localização das
variáveis selecionadas pelo algoritmo SPA.
As variáveis selecionadas pelo algoritmo SPA foram escolhidas no procedimento de
validação do modelo de regressão MLR. A Figura 25 apresenta o gráfico do valor predito versus o
valor de referência para o conjunto de validação do modelo MLR-SPA, onde se verifica um
coeficiente de correlação linear de 0,9974 e um RMSEV de 0,62% ( m/v). Neste gráfico, pode-se
observar que as amostras do conjunto de validação apresentaram-se distribuídas de forma aleatória
em torno da bissetriz, sendo um indicativo da ausência de erro sistemático no modelo SPA-MLR.
Da mesma forma como utilizado no PLS1, o modelo MLR-SPA elaborado (calibrado e
validado) foi, então, aplicado nas amostras comerciais de medicamentos injetáveis e nos padrões de
concentrações de 20,0 a 56,0% (m/v), para a predição das concentrações de dipirona sódica.
O gráfico da Figura 26 apresenta o gráfico do valor predito versus o valor de referência das
concentrações de dipirona sódica para o conjunto de predição do modelo MLR-SPA. O valor da
correlação obtido e o RMSEP foram respectivamente iguais a 0,9938 e 0,81% ( m/v). As amostras
do conjunto do conjunto de predição localizadas na Figura 26 apresentaram-se distribuídas de
forma aleatória em torno da bissetriz, indicando ausência de erro sistemático no modelo SPA-MLR.
•
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•
CAPÍTULO III
52
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 25 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação do modelo MLR-SPA.
20 25 30 35 40 45 50 55 60
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 26 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição do modelo MLR-SPA.
3.6.3 Modelo MLR-ASA
Na a construção do modelo MLR-ASA o valor adotado para o VIF foi 5. O algoritmo ASA
selecionou, a partir do RMSEV, apenas 4 variáveis espectrais mais informativas e não redundantes,
para serem
usadas
para
a
construção
do
modelo
de
regressão MLR,
conforme mostrado na Figura 27.
CAPÍTULO III
53
1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
Número de variáveis selecionadas
RMSEV
Figura 27 - Variação do RMSEV (% m/v) em função do número de variáveis espectrais selecionadas pelo ASA.
A Figura 28 apresenta o gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica,
indicando aproximadamente a localização das variáveis selecionadas pelo algoritmo ASA. Nesta
figura, pode-se observar que as variáveis selecionadas estão localizadas em regiões espectrais
bastante informativas.
850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0.22
0.24
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 28 - Gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica, indicando aproximadamente a localização das
variáveis selecionadas pelo algoritmo ASA.
As variáveis selecionadas pelo ASA foram utilizadas para a construção e validação do
modelo de regressão MLR. O gráfico da Figura 29 apresenta o valor predito versus o valor de
•
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•
•
•
CAPÍTULO III
54
referência das concentrações de dipirona para o conjunto de validação do modelo MLR-ASA. O
valor do coeficiente de correlação linear e do RMSEV são respectivamente 0,9964 e 0,73% (m/v).
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 29 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação do modelo MLR-ASA.
O gráfico da Figura 30 apresenta o valor predito versus o valor de referência das
concentrações de dipirona para o conjunto de predição do modelo MLR-ASA. O valor da correlação
obtido e o RMSEP foram respectivamente iguais a 0,9930 e 0,89% (m/v).
20 25 30 35 40 45 50 55 60
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 30 – Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição do modelo MLR-ASA.
CAPÍTULO III
55
As amostras do conjunto de validação localizadas na Figura 29, e as amostras do conjunto
de predição localizadas na Figura 30, apresentaram-se distribuídas de forma aleatória em torno da
bissetriz, indicando, em ambos os casos, ausência de erro sistemático no modelo MLR-ASA .
3.6.4 Modelo MLR-SW
Na a construção do modelo MLR-SW o valor adotado para o alfa foi 0.05. O algoritmo
Stepwise (SW) selecionou 11 variáveis espectrais, às quais foram usadas para a construção do
modelo de regressão MLR. A Figura 31 apresenta o gráfico do espectro NIR de uma amostra de
dipirona sódica, indicando aproximadamente a localização das variáveis selecionadas pelo
algoritmo SW. Além de ter selecionado poucas variáveis, estas também estão localizadas em regiões
espectrais informativas (Figura 31).
850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0.22
0.24
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 31 - Gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica, indicando aproximadamente a localização
variáveis selecionadas pelo algoritmo SW.
A partir das variáveis selecionadas, construiu-se e validou-se o modelo MLR-SW. A Figura
32 ilustra o gráfico do valor predito versus o valor de referência das concentrações de dipirona para
o conjunto de validação do modelo MLR-SW. O valor do coeficiente de correlação linear e do
RMSEV obtido foram respectivamente 0.9978 e 0,56% (m/v).
As amostras do conjunto de validação (Figura 32) encontram-se distribuídas de forma
aleatória em torno da bissetriz, sendo um indicativo da ausência de erro sistemático no modelo
MLR-SW.
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•
CAPÍTULO III
56
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
15
20
25
30
35
40
45
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55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 32 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação do modelo MLR-SW.
O gráfico da Figura 33 apresenta o valor predito versus o valor de referência das
concentrações de dipirona para o conjunto de predição do modelo MLR-SW. O valor do coeficiente
de correlação obtido e o RMSEP foram respectivamente iguais a 0,9940 e 0,80% (m/v).
20 25 30 35 40 45 50 55 60
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 33 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição do modelo MLR-SW.
As amostras do conjunto de predição localizadas no gráfico da Figura 33 apresentaram-se
distribuídas de forma aleatória em torno da bissetriz, sendo um indicativo ou tendência de que não
ocorre erro sistemático no modelo MLR-SW.
CAPÍTULO III
57
3.6.5 Modelo MLR-GA
Na a construção do modelo MLR-SW o valor adotado para a população foi 100, para o
número máximo de gerações foi 200, para a probabilidade de crossover foi 0.6 e para a
probabilidade de mutação foi 0.05. O algoritmo genético (GA), foi executado (10) dez vezes e a
partir de então, escolheu-se o melhor resultado para a construção do modelo MLR. Esta escolha se
deu pelo menor RMSEP obtido pela regressão MLR efetuada sobre as variáveis selecionadas pelo
algoritmo GA. No melhor resultado, 52 variáveis espectrais foram selecionadas pelo GA, sendo
estas utilizadas para a elaboração do modelo de regressão MLR.
A Figura 34 apresenta o gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica,
indicando aproximadamente a localização das variáveis selecionadas pelo algoritmo GA. Neste
gráfico, pode-se observar que o GA selecionou variáveis em regiões informativas e em regiões,
aparentemente, pouco ou nada informativas. As variáveis selecionadas foram usadas na construção
do modelo MLR.
850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0.22
0.24
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 34 - Gráfico do espectro NIR de uma amostra de dipirona sódica, indicando aproximadamente a localização
variáveis selecionadas pelo algoritmo GA.
O gráfico do valor predito versus o valor de referência das concentrações de dipirona para o
conjunto de validação do modelo MLR-GA, ilustrado na Figura 35, apresenta um RMSEV de 0,49%
(m/v) e um coeficiente de correlação linear de 0.9983.
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•
CAPÍTULO III
58
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 35 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de validação do modelo MLR-GA.
O gráfico do valor predito versus o valor de referência das concentrações de dipirona para o
conjunto de predição do modelo MLR-GA encontra-se na Figura 36. O valor da correlação obtido e
o RMSEP foram respectivamente iguais a 0,9944 e 0,77% (m/v).
20 25 30 35 40 45 50 55 60
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Valor de referência (% m/v)
Valor predito (% m/v)
Figura 36 - Gráfico do valor predito versus o valor de referência para o conjunto de predição do modelo MLR-GA.
Tanto as amostras do conjunto de validação localizadas na Figura 35, como as amostras do
conjunto de predição localizadas na Figura 36, apresentaram-se distribuídas de forma aleatória em
torno da bissetriz, sendo um indicativo, em ambos os casos, de ausência de erro sistemático no
modelo MLR-GA.
CAPÍTULO III
59
Para facilitar a comparação dos resultados das previsões dos valores das concentrações de
dipirona para os modelos desenvolvidos foram dispostos resumidamente na Tabela 5.
Tabela 5. Valores de RMSEV, RMSEP e correlação linear de validação e de previsão dos modelos.
Modelo PLS1 MLR-SPA MLR-ASA MLR-SW MLR-GA
RMSEV
(% m/v)
0,98 (1) 0,62 (9) 0,73 (4) 0,56 (11) 0,49 (52)
Correlação validação
0,9938 0,9974 0,9964 0,9978 0,9983
RMSEP
(% m/v)
1,07 (1) 0,81 (9) 0,89 (4) 0,80 (11) 0,77 (52)
Correlação predição
0,9904 0,9934 0,9930 0,9940 0,9944
Os parênteses (“( )”) representam o n° de variáveis selecionadas ou de variáveis latentes de cada modelo.
Todos os modelos gerados apresentaram valores de RMSEV e RMSEP muito baixos, com
relação ao método de referência (50% m/v ±10%), além de apresentarem bons coeficientes de
correlação linear na validação e na predição de seus modelos. Neste sentido, todos os modelos de
calibração multivariada construídos mostraram-se adequados para a predição das concentrações de
amostras de dipirona sódica injetável.
Dentre os modelos com seleção de variáveis, o MLR-ASA apresentou o maior erro de
predição (maior RMSEP), entretanto, esse erro é menor que o RMSEP do modelo PLS1 que utiliza
todas as variáveis da faixa espectral. O modelo MLR-ASA necessita apenas de 4 variáveis para sua
construção, enquanto que o MLR-SW, o MLR-SPA e o MLR-GA necessitam de muito mais
variáveis, ou seja, o modelo MLR-ASA é mais parcimonioso.
O modelo MLR-SW apresentou um erro menor que o MLR-APS, o MLR-ASA e o PLS1,
entretanto, precisou de 11 variáveis para sua construção, enquanto que o MLR-APS precisou de 9 e
o MLR-ASA precisou de apenas 4 variáveis.
O modelo MLR-GA foi o que apresentou o menor erro de predição, entretanto foram
necessárias 52 variáveis para a elaboração deste modelo. Outro fator importante a se levar em
consideração, é que o GA é um algoritmo estocástico, ou seja, seus resultados não são reprodutíveis.
Os modelos MLR-SPA e MLR-SW apresentaram valores equiparáveis de RMSEV, RMSEP e
correlação, mas vale salientar que o algoritmo APS é determinístico, ou seja, sempre apresenta os
mesmos resultados para o mesmo conjunto de dados, enquanto que as variáveis selecionadas e o
valor do RMSEP do método SW dependem do valor do alfa adotado.
Embora o modelo ASA-MLR tenha sido mais parcimonioso em relação aos demais modelos,
o algoritmo ASA ainda está em fase de teste.
CAPÍTULO IV
CONCLUSÕES
CAPÍTULO IV
61
4. CONCLUSÕES
Uma nova metodologia, não destrutiva, para a análise de medicamentos injetáveis
diretamente na ampola foi desenvolvida. Ela se fundamenta no uso da espectroscopia NIR aliada a
técnicas quimiométricas de análises para a determinação do teor de dipirona sódica injetável, com
vistas a ser aplicada em métodos de controle de qualidade deste medicamento. A metodologia
proposta permite determinar a concentração do princípio ativo do medicamento injetável,
diretamente em sua embalagem, sem a violação da mesma. Esta metodologia apresentou as
seguintes características: análise não-destrutiva e não-invasiva, ou seja, mantém a integridade das
amostras comerciais. Essas características dispensam o tratamento prévio das amostras e uso de
reagentes caros, tóxicos e danosos ao meio ambiente. Além disso, essa metodologia apresentou
algumas vantagens, tais como: maior simplicidade e rapidez das análises.
Os modelos SIMCA gerados, empregando um nível de confiança de 95%, demonstraram
através da análise Screening, que não há diferença entre os espectros NIR das amostras preparadas
no laboratório e as amostras comerciais, sendo todas amostras apropriadas para a construção e
validação dos modelos de calibração para a predição do teor de dipirona sódica em medicamentos
injetáveis.
Os resultados obtidos com a construção/validação e predição dos modelos de calibração
multivariada mostraram que todos os modelos gerados apresentaram erros de predição muito
baixos, sendo bastante promissores para a predição das concentrações de amostras de dipirona
sódica injetável.
Os modelos MLR-SPA e MLR-SW apresentaram valores equiparáveis de RMSEV, RMSEP e
correlação, entretanto, sabe-se que as variáveis selecionadas e o valor do RMSEP obtidos pelo
método SW podem mudar dependendo do valor do alfa adotado.
O modelo MLR-GA apresentou o menor erro de predição em relação aos outros modelos,
porém ele não foi parcimonioso. O algoritmo GA selecionou 52 variáveis para a construção do
modelo MLR, enquanto que os outros algoritmos de seleção de variáveis selecionaram uma quantia
muito inferior a esta para a construção de seus modelos de calibração (o SPA selecionou 9 variáveis,
o SW selecionou 11 variáveis e o ASA selecionou apenas 4 variáveis).
Dentre os modelos com seleção de variáveis, o MLR-ASA apresentou o maior erro de
predição (maior RMSEP), porém, o valor de RMSEP obtido ainda foi menor que o do modelo PLS1
(que utiliza todas as variáveis da faixa espectral).
Como o algoritmo ASA selecionou apenas de 4 variáveis para a construção do modelo MLR,
e os demais modelos utilizaram muito mais variáveis, o modelo MLR-ASA foi o mais parcimonioso.
CAPÍTULO IV
62
4.1 Propostas futuras
Pretende-se, como continuação desse trabalho:
• Melhorar a capacidade de predição dos modelos elaborados utilizando-se outros pré-
tratamentos que não chegaram a ser testados e/ou outras ferramentas de seleção de
amostras, como por exemplo, o SPA para seleção de amostras;
• Verificar a capacidade preditiva de outros modelos quimiométricos, como o uso da
regressão iPLS, por exemplo;
• Ampliar o número lotes e de amostras, a fim de se construir e validar o método de acordo
com a norma ASTM E 1655 00, e deste modo poder sugerir esta metodologia como método
oficial para controle de qualidade do teor de dipirona sódica em medicamentos injetáveis
fabricados pelas Indústrias Farmacêuticas, desde que este método seja acreditado pelos
órgãos responsáveis;
• Construir novos modelos para a determinação de outros parâmetros de qualidade, tais
como: densidade, pH, viscosidade, índice de refração, etc.;
• Desenvolver novas metodologias para o controle de qualidade de outros medicamentos
injetáveis, sem a violação da ampola, usando as mesmas estratégias;
• Desenvolvimento de fotômetros a base de LED’s-NIR microcontrolados para análise
dedicada desses medicamentos, de forma rápida, não dispendiosa e acessível às indústrias
farmacêuticas, aos hospitais, clínicas médicas e farmácias e aos órgãos responsáveis pelo o
controle de qualidade desses medicamentos.
CAPÍTULO V
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÍTULO V
64
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Trissel, L. A. Handbook on injectable drugs. 10ed. Houston, TX-USA: 1998.
2. Brasil. Portaria n.º 802, de 08 de outubro de 1998. Institui o sistema de controle e
fiscalização em toda a cadeia dos produtos farmacêuticos. Diário Oficial da República
Federativa do Brasil. Brasília, v.1, n.24-E, p. 036, 4 de fevereiro de 1999. Seção 1, pt 1.
3. Conselho Federal de Farmácia, A Organização Jurídica da Profissão Farmacêutica, 2º
edição, Editora Cidade Gráfica LTDA, 2000, 1396p.
4. Organização Mundial de Saúde. The importance of Pharmacovigilance. Safety monitoring of
medicinal products. 2002.
5. Jornal Diário de São Paulo, publicado em 7 de abril de 2009. São Paulo.
6. Jornal O Dia, publicado em 15 de março de 2009. Rio de Janeiro.
7. Jornal O Estado de São Paulo, publicado em 8 de setembro de 2009. São Paulo.
8. ANVISA, Informes Técnicos Institucionais, Rev. Saúde Pública 2004, 38(5):748-9.
9. Site: http://www.redenoticia.com.br/noticia/?p=17928, publicado em 19 novembro de 2009,
acessado em 05 de dezembro de 2009.
10. http://www.anvisa.gov.br/DIVULGA/noticias/2009/160409.htm, publicado em 14 de abril
de 2009, acessado em 05 de dezembro de 2009.
11. United States Pharmacopoeia 25, NF20, Rock Ville, 2002.
12. Gilman A. G; Hardman J. G.; Limbird
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E.,
As Bases Farmacológicas da Terapêutica, Rio
de Janeiro, McGraw-Hill, 2003.
13. Ciurczak, E. W., Appl. Spectrosc. Rev. 23 (1987) 147.
14. Burns, D. A.; Ciurczak, E.W., Hand-Book of Near-infrared analysis - Second Edition,
Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc, N. York, 2001.
15. Pasquini, C. , J. of Braz. Chem. Soc., 14 (2003) 198.
16. Workman, J. J.; Mobvley, P. R.; Kowalski, B. R. , Appl. Spectrosc. Reviews, 31 (1996) 73.
17. Roggo,Y.; Chalus,P.; Maurer,L.; Martinez,C. L.; Edmond,A.; Jent, N., J. Pharm. Biomed.
Analysis 44 (2007) 683.
18. Beebe, K.R.; Pell, R.J.; Seasholtz, B., Chemometrics - A Pratical Guide, Wiley, Nova
Iorque, 1998.
19. Forina, M.; Lanteri, S.; Casale, M., Multivariate calibration- Review. J. Chromatography A,
1158 (2007) 61.
CAPÍTULO V
65
20. Prista, L. N.; Alves, A. C.; Morgado, R. M. R., Técnica Farmacêutica e Farmácia Galênica,
volume III, 3ª edição, Fundação Calouste Gulbenkian/Lisboa, 1990.
21. Prista, L. N.; Alves, A. C;Morgado, R. M. R., Tecnologia Farmacêutica, volume III, 4ª
edição, Fundação Calouste Gulbenkian/Lisboa, 1995.
22. Schwidetzky O. History of needles and syringes. Anesth Analg 1944; 23:34-38.
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farmacêutica.Volume II, Fundação Calouste Gulbenkian/Lisboa, 2001.
30. Prista, L. N.; Alves, A. C.; Morgado, R. M. R., Tecnologia Farmacêutica, volume II, 4ª
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