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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALTERAÇÕES LIPOGÊNICAS NO TECIDO ADIPOSO BRANCO
RETROPERITONEAL DE RATOS MACHOS EM CRESCIMENTO
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTÉICA MODERADA
José Tiago Funabashi dos Santos
Cuiabá – Mato Grosso
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALTERAÇÕES LIPOGÊNICAS DO TECIDO ADIPOSO BRANCO
RETROPERITONEAL DE RATOS MACHOS EM CRESCIMENTO
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTÉICA MODERADA
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Área de concentração
Cirurgia, Nutrição e
Metabolismo, da Universidade
Federal de Mato Grosso, como
pré-requisito para a obtenção do
título de Mestre.
Orientando: José Tiago Funabashi dos Santos
Orientadora: Profª Dra Nair Honda Kawashita
Cuiabá – Mato Grosso
2008
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Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada pelo Bibliotecário Carlos Henrique T. de Freitas. CRB-1: 2.234
Permitida a reprodução parcial ou total desde que citada a fonte.
S237a Santos, José Tiago Funabashi dos.
Alterações lipogênicas no tecido adiposo branco retroperitoneal
de ratos machos em crescimento submetidos à restrição protéica
moderada / José Tiago Funabashi dos Santos. -- 2008.
xii, 49 f. : il. (algumas color.) ; 30 cm.
Orientadora: Nair Honda Kawashita.
Dissertação (mestrado). Universidade Federal de Mato
Grosso. Faculdade de Ciências Médicas. Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde, 2008.
Inclui bibliografia.
“Querer não é poder. Quem pôde, quis antes de poder só depois de poder. Quem quer
nunca há de poder, porque se perde em querer”
“No fundo, só se sabe que sabemos pouco; com o saber cresce a dúvida”
Johann Goethe
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Tânia e Luis pelos ensinamentos, carinho e apoio proporcionados.
A Vanessa pelos momentos de alegria vividos juntos, pelo incentivo e respeito a um sonho
e todo amor dedicado a mim.
Aos meus irmãos Fabrício, Fabiano e Tatiana pelo carinho e admiração.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha orientadora Profa. Dra. Nair Honda Kawashita, por dispor do
seu tempo e seu conhecimento, caminhando ao meu lado ao longo desenvolvimento
deste trabalho;
À Deus por conceder-me serenidade necessária para aceitar as coisas que não
posso modificar, coragem para modificar as coisas que posso e sabedoria para
distinguir uma da outra, aceitando que as dificuldades constituem o caminho da
paz;
As minhas amigas lipogênicas Maísa Pavani e Suélem Aparecida de França pela
sincera amizade, agradável convívio e indispensável ajuda para o desenvolvimento
deste trabalho;
Ao Air Francisco, pelo apoio amizade e conversas agradáveis e pelos momentos de
descontração;
Ao Prof. Dr. Fabrício Stoppiglia pelos auxílios prestados e pela boa vontade em
ajudar;
Ao meu sócio e amigo Jaime de Figueiredo Neto pela amizade, cooperação e pelo
desenvolvimento de nossos projetos na minha ausência, obrigado pelo incrível
trabalho realizado;
A profa. Msc. Ângela Nolasco pelo carinho, adimiração e incentivo para a
realização deste trabalho;
Aos meus amigos do laboratório de bioquímica Gustavo, Andressa, Samira, Paula,
Diego, Ana Carolina, Gínia e Monique pelos agradáveis anos de convivência;
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, meu
muito obrigado!
A Universidade Federal de Mato Grosso.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3
H - Trítio
3
H
2
O – Água triciada
ACTH – Hormônio adrenocorticotrópico
ACX – Acetil CoA Carboxilase
AG – Ácido Graxo
AGL – Àcido Graxo Livre
AgRP – Peptídeo relacionado ao agouti
AGs – Ácidos Graxos
AG-TAG – Ácido Graxo de triacilglicerol
AIN – American Institute Nutrition
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico
ARQ – Núcleo arqueado
ATP – Adenosina trifosfato
ATP-CL – ATP-Citrato Liase
CART – Transcrito regulado por cocaína e anfetamina
CoA – Coenzima A
CRF – corticotropin releasing factor
DM – Dorsomedial
EM – Enzima málica
EMP – Erro médio padrão
G3P – Glicerol-3-fosfato
G3PD – Glicerol-3-fosfato desidrogenase
G6PD – Glicose 6-fosfato desidrogenase
GABA – Ácido gama aminobutírico
GK – Gliceroquinase
GLI – Glicerol
GLI-TAG – Glicerol de triacilglicerol
H - Hipoprotéica
H
+
- Prótons
HL – Hipotálamo Lateral
HVM – Hipotálamo ventromedial
k – Velocidade de renovação fracional
LHS – Lipase hormônio sensível
LPL – Lipase lipoprotéica
N – Normoprotéica
NAD - Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH + H
+
- Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido
NADPH + H
+
- Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido
NOR – Noradrenalina
NPY – Neuropeptídeo Y
PKA – Proteína quinase dependente de AMPc
PPAR – Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma
PV – Paraventricular
SNS – Sistema nervoso simpático
t
1/2
– Meia vida
TAB – Tecido Adiposo Branco
TAG – Triacilglicerol
TAM – Tecido Adiposo Marrom
VLDL – Lipoproteína de densidade muito baixa
VR – Velocidade de renovação
α-MSH – Peptídeo de melanocortina
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Vias para transferência do grupo acetil da mitocôndria para o citosol.................. 5
Figura 2: Vias de geração de glicerol-3-fosfato no tecido adiposo branco........................... 7
Figura 3: Velocidade de síntese de ácidos graxos (µmol/g.h) de ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias...................................... 27
Figura 4: Velocidade de síntese de glicerol (µmol/g.h) de ratos machos tratados com dieta
normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias.............................................. 28
Figura 5: Atividade das enzimas Málica, Glicose 6-fosfato desidrogenase e ATP citrato
liase (nmol/ mg de prot. min) no Tecido Adiposo Branco Retroperitoneal (TABR) de ratos
machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias.......... 30
Figura 6 = Atividade in vitro da enzima Lípase Lipoprotéica (LPL) no tecido adiposo
branco retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou
hipoprotéica (H) durante 15 dias......................................................................................... 30
Figura 7: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) de ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias...................................... 31
LISTA DE TABELA
Tabela 1: Alterações do peso dos animais e peso dos tecidos , dos parâmetros bioquímicos
e hormonais de ratos machos em crescimento submetidos à dieta hipoproteíca (6%) em
comparação aos ratos que receberam dieta normoprotéica (11% de proteína)..................... 9
Tabela 2 – Composição da dieta normoprotéica e hipoprotéica (g/Kg).............................. 15
Taela 3 : Velocidade de síntese de ácidos graxos e glicerol de novo (µmol/g.h) e
velocidade do ciclo de reesterificação de ácidos graxos (AGs) no tecido adiposo branco
retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica (N) ou
hipoprotéica (H) durante 15 dias......................................................................................... 29
Tabela 4 : Atividade da enzima Málica, Gicose-6-fosfato desidrogenase e ATP citrato liase
(µmol/ mg de prot. min) e lipase Lipoprotéica (nmol AG. Mg ptn
-1
.min
-1)
no tecido
adiposo branco retroperitoneal (TABR) de ratos machos tratados com dieta normoprotéica
(N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias............................................................................. 31
Tabela 5: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) de ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao final de 15 dias....................................... 32
Tabela 6: Concentração de noradrenalina, velocidade de renovação fracional (k) e
velocidade de renovação (VR) de noradrenalina no TABR de ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) e hipoprotéica (H) durante de 15 dias.......................................... 33
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estudar o metabolismo de lipídeos no Tecido
Adiposo Branco Retroperitoneal de ratos machos submetidos à dieta
hipoprotéica (H - 6% de proteína) na fase de crescimento. Estudos anteriores em
nosso Laboratório mostram que 15 dias neste nível de restrição protéica, nesta
fase de desenvolvimento do animal é suficiente para que sejam observadas
profundas alterações na composição química corporal com acúmulo de lipídeos
e redução de proteínas e água, quando comparado aos animais submetidos à
dieta normoprotéica (N – 17% de proteína). Em nosso estudo sobre o
metabolismo lipídico neste modelo experimental, foram avaliadas as sínteses de
ácidos graxos e glicerol de novo em triacilglicerol, as enzimas que participam da
síntese de AG (ATP-Citrato liase, Glicose-6-P desidrogenase e Enzima málica), a
lipase lipoprotéica (LPL), o turnover de noradrenalina e a concentração sérica de
corticosterona. Pudemos constatar que as vias de síntese de novo de AG e GLI,
avaliadas in vivo pela incorporação de
3
H
2
O, foi alterada apenas na síntese de
ácidos graxos. Da mesma forma, não constatamos nenhuma diferença na
atividade das enzimas da síntese de AG. No entanto, a atividade da Lípase
lipoprotéica foi aumentada em 107% nos animais que receberam a dieta H. O
alto nível de corticosterona encontrado nestes animais, parece contribuir para a
redução da síntese de AG no TABR. Estes achados nos levam a concluir que mais
do que a síntese de ácidos graxos, um melhor aproveitamento dos AG
circulantes e uma maior reesterificação do glicerol resultante da lipólise
intracelular e fosforilado pela gliceroquinase pode ser responsável pelo acúmulo
de TAG neste tecido, nestas condições.
Palavras chave: dieta hipoprotéica, TAB, lipogênese.
ABSTRACT
The purpose of this work was to study the lipid metabolism in the Retroperitoneal
White Adipose Tissue of growing male rats fed a hypoproteic diet (H- 6% protein).
Previous studies by our group showed that 15 days of protein restriction in this
particular age is sufficient to induce profound alterations at the level of body
chemical composition, with lipid accumulation and decrease of protein and
water contents, when compared to animals fed a normoproteic diet (N- 17%
protein). In this experimental design, there were evaluated the fatty acids and
glycerol synthesis and its sterification into triacylglycerol, the enzymes that
participate in fatty acid synthesis (ATP-citrate lyase, Glucose-6-phosphate
dehydrogenase and Malic enzyme), the lipoprotein lipase (LPL) activity, the
norepinephrin turnover and the serum concentration of corticosterone. We
observed that the de novo synthesis of fatty acids and glycerol - evaluated in vivo
by
3
H
2
O incorporation - was modified in fatty acid synthesis. We also found no
differences in the activity of enzymes from the fatty acid synthesis pathway. These
results led us to conclude that much more than the fatty acid synthesis can cause
the triacylglycerol accumulation in the WAT, such as a better uptake of circulating
fatty acids and an increased reesterification of the glycerol produced by
intracellular lipolysis and phosphorylated by glycerokinase.
Key words: hypoproteic diet, WAT, lipogenesis.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS................................................................................................................... 11
2.1. Objetivos Gerais.............................................................................................. 12
2.2. Objetivos Específicos...................................................................................... 12
3. MÉTODOS.................................................................................................................... 13
3.1. Animais e Dieta.............................................................................................. 14
3.2. Determinação in vivo da síntese de ácidos graxos de novo e glicerol............ 16
3.3. Medida da atividade das enzimas da síntese de ácidos graxos de novo......... 18
3.3.1. Glicose 6-P desidrogenase................................................................ 19
3.3.2. Enzima málica.................................................................................. 19
3.3.3. ATP-citrato liase............................................................................... 19
3.4. Atividade da Lipase lipoprotéica..................................................................... 20
3.5. Velocidade de renovação de noradrenalina..................................................... 21
3.6. Determinação de corticosterona plasmática.................................................... 23
3.7. Análise Estatística........................................................................................... 25
4. RESULTADOS............................................................................................................. 26
4.1. Síntese de ácidos graxos e glicerol................................................................. 27
4.1.1. Síntese de ácidos graxos.................................................................. 27
4.1.2. Síntese de glicerol............................................................................ 28
4.2. Atividade enzimática no TABR...................................................................... 29
4.3. Concentração sérica de corticosterona............................................................ 31
4.4. Turnover de noradrenalina.............................................................................. 32
5. DISCUSSÃO.................................................................................................................. 34
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 40
1. INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
A principal função do tecido adiposo branco (TAB) é contribuir para o controle do
metabolismo energético mobilizando ou estocando energia na forma de triacilglicerol
(TAG), estruturalmente formado pela união de três moléculas de ácidos graxos (AGs) a
uma molécula de glicerol por meio de ligações ésteres. Uma reserva adequada de TAG é
necessária para o tecido adiposo exercer sua função de mobilizar AGs de acordo com a
demanda energética dos outros tecidos, no caso do TAB, ou de suas próprias necessidades
no caso do Tecido Adiposo Marrom (TAM), em que os AGs são os principais
combustíveis para a termogênese no próprio tecido.
Para o TAB atender as necessidades energéticas dos tecidos periféricos nas diversas
situações fisiológicas, os TAGs são continuamente hidrolisados. Essa hidrólise ocorre em
grau variável, de acordo com a demanda, liberando os AGs na forma livre (AGL), que são
transportados na circulação ligados à albumina, que podem ser captados e oxidados pelos
tecidos.
Os ácidos graxos livres (AGL) e a glicose constituem os principais substratos
utilizados pelos tecidos periféricos para a produção de energia. Tanto a produção hepática
de glicose como sua utilização pelos tecidos são controladas. Os AGL, no entanto, parecem
ser controlados apenas a nível de produção, não sendo conhecido nenhum fator que regule
sua utilização. Portanto, um aumento nos níveis de AGL, ocorre por um aumento da sua
mobilização decorrente da hidrólise de TAG
1
.
O conteúdo de TAG armazenado no TAB é decorrente do balanço entre sua
velocidade de síntese (lipogênese) e sua velocidade de degradação (lipólise). Em período
de balanço energético negativo, como durante o jejum, a lipólise é estimulada com o
objetivo de liberar AGs e glicerol que serão utilizados como fonte de energia em diversos
tecidos corporais como o fígado, músculo esquelético e cardíaco. Em contraste, em
períodos de balanço energético positivo, como por exemplo, após a ingestão alimentar, a
lipogênese e o armazenamento de TAG no TAB estão estimulados.
O controle na lipólise no TAB é bastante complexo e envolve a interação de
diversos fatores. As catecolaminas são as ativadoras primárias da mobilização de AGs do
TAB induzida pelo jejum. A noradrenalina atua nos tecidos alvos, em uma classe de
receptores de membrana denominados receptores adrenérgicos. Dependendo da afinidade e
do mecanismo de transdução de sinal que estes receptores estão acoplados, estes ainda
podem ser classificados em duas categorias, com diversos subtipos: os receptores α-
adrenérgicos (α1 e α2) e os receptores β-adrenérgicos (β1, β2, β3). A noradrenalina ao se
ligar aos receptores β-adrenérgico, que são acoplados as proteínas Gs localizados na
membrana plasmática dos adipócitos, transmitem o sinal estimulatório à enzima adenilato
ciclase, que catalisa a conversão de ATP em AMPc (adenosina monofosfato cíclico). O
AMPc gerado se liga a proteína quinase dependente de AMPc (PKA) que é ativada pela
dissociação das subunidades regulatórias e catalíticas. Uma vez estimulada, a PKA
fosforila a lípase hormônio sensível (LHS), induzindo a ativação desta enzima e,
subseqüentemente, sua translocação do citosol para o glóbulo de gordura, desencadeando a
hidrólise dos TAGs estocados
2
. Além da LHS, as perilipinas, proteínas que recobrem a
superfície do glóbulo de lipídeos protegendo-os da hidrólise, também são fosforiladas pela
PKA durante o estímulo lipolítico. Estas proteínas, quando fosforiladas, sofrem
modificação conformacional permitindo o acesso da LHS ao glóbulo de gordura
3,4
.
Estudos em camundongos Knockout para perilipinas mostraram que estes animais,
embora consumam a mesma quantidade de alimentos, apresentam uma redução de 30% do
tecido adiposo, quando comparado aos controles
5
. Além disso apresentam uma lipólise
basal (não estimulada) elevada e são resistentes à obesidade induzida pela dieta
6
.
O controle da lipogênese é bastante complexo e está relacionada a fatores neurais,
hormonais e nutricionais. Embora seja a causa primária das alterações da atividade
lipogênica, os fatores nutricionais controlam a síntese de AGs não apenas diretamente,
pelas alterações de fluxo de metabólitos, como também através de hormônios que
estimulam ou inibem a síntese de AGs
7
.
A insulina é, provavelmente, o mais importante fator hormonal envolvido na
regulação da lipogênese. Os efeitos da insulina são iniciados pela ligação da insulina ao
seu receptor na superfície celular, ativando a atividade tirosinaquinase do receptor e
iniciando a cascata de transdução do sinal, que culminará com a estimulação da lipogênese
por mais de um mecanismo: a) aumento da captação de glicose pelos adipócitos via
recrutamento dos transportadores de glicose (GLUT-4) para a membrana plasmática; b)
ativação das enzimas glicolíticas e lipogênicas por modificação covalente e/ou estimulação
da expressão gênica
8,9,10
.
Durante o processo de lipogênese, o AG esterificado pode ser proveniente
de duas possíveis fontes: os sintetizados de novo a partir da glicose ou de outros compostos
produtores de acetil-CoA; e os pré-formados, reciclados da hidrólise dos triacilgliceróis
endógenos ou captados da circulação através da hidrólise da lípase lipoprotéica (LPL) dos
triacilgliceróis presentes nos quilomicrons e nas lipoproteínas de muito baixa intensidade
(VLDL) secretadas pelo fígado.
A síntese de novo de ácidos graxos ocorre no citosol de células adiposas e hepáticas
(principalmente) e necessita de unidades de dois carbonos na forma de acetil CoA e de
equivalentes redutores provenientes do NADPH + H
+
. A principal fonte de geração de
acetil CoA, no citosol, é através da enzima ATP-Citrato liase (ATP-CL) que atua sobre o
citrato (figura 1) proveniente da mitocôndria (forma de transporte destas unidades da
mitocôndria para o citosol). Parte deste acetil CoA no citosol entra na formação de AG na
forma de malonil CoA numa reação catalisada pela acetil CoA carboxilase (ACX). As
principais reações geradoras de NADPH + H
+
na célula são as catalisadas pela enzima
Málica (EM) e pela Glicose-6-P desidrogenase (G6PD) da via das pentoses.
Figura 1: Vias para transferência do grupo acetil da mitocôndria para o citosol.
Fonte: Lehninger Principles of Biochemistry 4ª edição
69
.
Uma série de evidências indica que a atividade da LPL no TAB pode ser controlada
pela insulina e pela noradrenalina. Ratos jejuados, diabéticos e expostos ao frio apresentam
diminuição na atividade da LPL no TAB quando comparados ao controle
11,12,13
. A
administração de uma dieta rica em carboidratos ou a adição de sacarose (32%) na água
ingerida pelos ratos induz uma elevação nos níveis plasmáticos de insulina e um aumento
significativo na atividade da LPL do TAB
14,15
. A administração de insulina à animais
expostos ao frio e ao jejum, bem como a adição de insulina e glicose ao meio de incubação
de fragmentos de TAB de ratos jejuados elevam a atividade da LPL
11,12,16,17
. Os efeitos
estimulatórios da glicose e da insulina na atividade da LPL no TAB de ratos jejuados são
completamente bloqueados in vivo ou in vitro pela adição de inibidores da síntese protéica,
indicando que a manutenção da atividade da LPL elevada requer uma síntese protéica
contínua
18,19,20,21
. Apesar dos baixos níveis plasmáticos de insulina em ratos expostos ao
frio, alguns trabalhos indicam que o efeito da exposição ao frio é mediado em parte pelo
SNS, resultando em diminuição na atividade da LPL no TAB
12
. De fato a administração de
noradrenalina ou isoprotenerol mimetiza o efeito in vivo da exposição ao frio e pode ser
bloqueado por antagonista β-adrenérgicos
22,23
.
Estudos realizados com a técnica de dupla marcação (administração simultânea de
3
H
2
O e de glicose-U-
14
C) desenvolvidos por Botion e cols.
24
indicam que os AGs
provenientes da síntese de novo constituem uma fração menor dos AGs totais utilizados
pelo TAB para a síntese de TAG. Em animais adaptados à dieta balanceada, cerca de 37%
do glicerol é utilizado para a esterificação de AGs sintetizados de novo. O restante do
glicerol (63%) é utilizado para a esterificação de AGs pré-formados (captados na
circulação ou reciclados da hidrólise de TAG endógenos.
Independentemente da origem dos AGs, a geração de glicerol-3-fosfato (G3P) é
essencial para o funcionamento adequado do TAB e formação de TAG. Existem três vias
de geração de G3P: a via clássica de obtenção de G3P pelo TAB é a sua síntese a partir de
carbonos de glicose, pela conversão de diidroxiacetona, um intermediário da Via
Glicolítica, a G3P catalisada pela enzima glicose-3-fosfato desidrogenase (G3PD). Além
da formação através da glicose, a geração de G3P no TAB pode ocorre através da
fosforilação direta do glicerol pela gliceroquinase (GK)
e pela via da gliceroneogênese que
envolve a carboxilação do piruvato a oxaloacetato, descarboxilação do oxaloacetato a
fosfoenolpiruvato e a formação da G3P por reversão parcial da via glicolítica.
Figura 2: Vias de geração de glicerol-3-fosfato no tecido adiposo branco.
A geração de G3P pelas três vias, em diversas situações fisiológicas sofre
influência de fatores metabólicos - nutricionais, hormonais e da atividade do sistema
nervoso simpático (SNS). Assim como a quantidade de AG, a disponibilidade de G3P é
determinante no tamanho dos estoques de TAG armazenados.
A influência da dieta sobre o metabolismo lipídico é uma linha de investigação que
vem sendo conduzida, em vários modelos experimentais, por nosso grupo de trabalho.
Dando continuidade a estes estudos, o modelo utilizado em trabalhos mais recentes deste
Laboratório, são ratos com desnutrição protéica na fase de crescimento; que apresentam
aumento na ingestão de alimento e calorias, com proporcional aumento do gasto energético
e ganho energético, além de acúmulo de lipídeos na carcaça, fígado e Tecidos Adiposos
35
.
Os dados da literatura são bastante contraditórios quanto ao efeito da desnutrição
protéica sobre os componentes do balanço energético. Estudos avaliando o efeito da
restrição protéica sobre a ingestão de alimentos em particular, reforçam a hipótese de que
mais que o teor absoluto de proteínas na dieta, a ingestão de alimento está relacionada com
a relação entre a quantidade de proteínas da dieta e o requerimento protéico do animal (12-
15%)
25,26
. Níveis extremos de proteína na dieta, muito acima ou abaixo do requerimento,
parecem diminuir a ingestão
25
.
Uma das hipóteses mais aceitas para justificar a hiperfagia observada em algumas
condições de desnutrição protéica, é a tentativa do organismo em obter aminoácidos para a
síntese de proteínas e outras finalidades
26
. No entanto, o que se constata é que mesmo com
a hiperfagia, o aumento na ingestão de alimentos, nunca atende o requerimento protéico
27
Segundo Meyer, o limite da ingestão é estabelecido pela capacidade do organismo em
estocar/dissipar uma maior quantidade de energia
28
. Isto explicaria o maior consumo de
alimentos em situações de exercício ou exposição ao frio (onde temos um aumento no
gasto de energia)
29
e a hiperfagia dos ratos submetidos à restrição protéica moderada (6%)
em fase de crescimento (que trata o nosso trabalho), uma vez que este período se
caracteriza por aumento no gasto energético.
Estudos posteriores no TAM destes animais, conduzidos por FRANÇA e cols,
mostram aumento da atividade simpática e o aumento da síntese de AG de novo neste
tecido, e a possibilidade da contribuição desta via para o aumento dos estoques de TAG;
uma vez que a atividade da LPL não foi alterada pela restrição protéica. Paralelamente a
estes achados, a constatação do aumento da sensibilidade à insulina e da resistência à
leptina, reafirmam a relação direta da insulina e da atividade simpática com a síntese de
AG no TAM, já evidenciado em animais submetidos à dieta normoprotéica e hiperprotéica
livre de carboidratos
62
.
Sob o ponto de vista metabólico, o acúmulo de lipídeos decorrente da hiperfagia,
com maior ingestão de calorias e com resistência à leptina, em muito se assemelha às
causas da obesidade humana, se apresentando como um interessante modelo para estudos
sobre a regulação do metabolismo energético. Após ter iniciado a investigação sobre o
metabolismo lipídico neste modelo experimental no TAM, o nosso objetivo é estender
estes estudos a outros tecidos, particularmente no TABR e fígado, uma vez que a
manutenção da homeostase no organismo é obtida pelas diferenças metabólicas entre os
tecidos e as diferentes formas de regulação tecido-específica. Com isto, além de contribuir
para a melhor compreensão dos mecanismos de acúmulo de TAG, possibilitará ampliar as
informações sobre a resposta do organismo frente à restrição protéica na fase de
crescimento.
2. OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
2.1.1. Avaliar a contribuição dos ácidos graxos circulantes e dos ácidos graxos e glicerol
sintetizados de novo na formação de triacilgliceróis, no tecido adiposo branco
retroperitoneal de ratos machos em crescimento, submetidos à restrição protéica moderada.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1. Avaliar a síntese de novo de ácidos graxos e glicerol de triacilglicerol (AG-TAG e
GLI-TAG), pela incorporação de
3
H
2
O, do tecido adiposo branco retroperitoneal.
2.2.1 Determinar a atividade das enzimas Lípase lipoprotéica, Málica, ATP-citrato liase e
Glicose-6-fosfato desidrogenase no TABR.
2.2.3. Determinar o turnover de noradrenalina no TABR
2.2.4. Determinar a concentração sérica de corticosterona
3. MÉTODOS
3. MÉTODOS
A parte experimental deste trabalho foi desenvolvida no Laboratório de
Bioquímica do Departamento de Química, vinculado ao Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde da Universidade Federal de Mato grosso (UFMT). Os experimentos
foram dirigidos por princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos,
de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA), adotadas pela UFMT.
3.1. Animais e Dieta
Foram utilizados ratos machos, albinos (Rattus norvegicus), variedade Wistar,
pesando entre 90-100g no início dos experimentos, provenientes do Biotério Central da
Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá – Brasil. Os animais foram mantidos em
gaiola metabólica, à temperatura controlada (24˚±1˚C), umidade relativa de 55% e ciclo
claro/escuro de 12 horas recebendo água ad libitum durante todo o período experimental. O
peso corporal, o consumo alimentar e a água ingerida foram monitorados diariamente.
Após o desmame, os animais receberam dieta comercial Labina®, até atingirem o
peso aproximado de 100g, quando então eram distribuídos em dois grupos experimentais,
passando a receber dieta normoprotéica (grupo N) com 17% de proteína, ou dieta
hipoprotéica (grupo H) com 6% de proteína (TABELA 1). A diferença em calorias
resultante da redução de proteínas na dieta H foi compensada com o equivalente em
carboidratos, mantendo-a isocalórica. A dieta normoprotéica segue as recomendações do
Instituto Americano de Nutrição
27
(AIN – 93G) para roedores na fase de crescimento,
gravidez e lactação
Tabela 1 – Composição da dieta normoprotéica e hipoprotéica (g/Kg)
Ingredientes
Normoprotéica
(17% de proteína) g/Kg
Hipoprotéica
(6% de proteína) g/Kg
Caseína (84% de proteína)* 202 71,5
Amido 397 480
Dextrina 130,5 159
Sacarose 100 121
Óleo de Soja 70 70
Fibra (microcelulose) 50 50
Mistura se Sais AIN 93G** 35 35
Mistura de Vitaminas AIN 93G** 10 10
L-cistina 3 1
Bitartarato de Colina 2,5 2,5
*Valores corrigidos em função do conteúdo de proteína desejada
** Composição detalhada dada por REEVES, NIELSEN & FAHEY, 1993
As dietas N e H foram ministradas na forma de pó, sendo os ingredientes secos,
pesados em balança analítica da marca Marte (modelo A 500, com precisão de 0,01 g),
peneirados (malha 200) e homogeneizados. As dietas foram preparadas em quantidade
suficiente para todo o estudo, acondicionadas em recipiente de polipropileno
hermeticamente fechados e armazenadas a 5˚C.
Todos os procedimentos experimentais tiveram início as 7:00 horas e se estenderam
por toda a manhã. As coletas de sangue para as determinações bioquímicas e hormonais,
bem como a coleta de tecidos para as análises foram realizadas com os animais no estado
alimentado ao final de 15 dias de dieta N ou H. Os animais foram eutanasiados por
decapitação e amostras de sangue foram coletadas em heparina sódica para a obtenção de
plasma e sem anticoagulantes para a obtenção de soro. Após a coleta, o sangue com
heparina foi centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos para obtenção do plasma. O soro
foi separado por centrifugação a 700 rpm durante 15 minutos. Os tecidos adiposos brancos
retroperitoneal (TABR) foram coletados por laparotomia mediana, pesados e congelados
imediatamente em Nitrogênio e armazenados a -80°C para análises posteriores.
3.2. Determinação in vivo da síntese de ácidos graxos de novo e glicerol
A determinação da síntese de ácidos de novo e de glicerol foi avaliada pela
incorporação de trício da
3
H
2
O em ácidos graxos e glicerol de triacilgliceróis (AG-TAG e
GLI-TAG). A distribuição da água tritiada pela água corporal e a manutenção da atividade
específica constante, tanto no plasma como nos tecidos por longo período, faz com que ela
seja a substância radioisotopicamente marcada, de preferência para estudos da lipogênese
in vivo. A incorporação do trítio durante a síntese de ácidos graxos em ligações estáveis C-
H, ocorre por meio da troca de
3
H com os H dos nucleotídeos de pirimidinas reduzidos
(NADPH). A fórmula utilizada para o cálculo da velocidade de síntese de ácidos graxos é a
seguinte:
ppm de
3
H incorporados em AG 10
9
1
nmol de AG/h= _________________________________ X _____ X ____
ppm
3
H/átomo - g de H na água corporal 13,3 t
2
-t
1
A fórmula acima é baseada nas premissas
de WINDMUELLER E SPAETH
33
. A
atividade específica da água tritiada (ppm de
3
H/ml de H
2
O) é obtida a partir da
radioatividade plasmática, considerando que cada ml de plasma contém 0,94 ml de água. O
fator 10
9
/13,3 corrige a discriminação isotópica e converte átomo-grama de hidrogênio em
nmol de ácido graxos com 16 átomos de carbono. O cálculo pressupõe que metade de
todos os átomos de hidrogênio são provenientes da água. Esta técnica estima a síntese de
ácidos graxos a partir de todas as unidades de dois carbonos, independentemente do tipo de
substrato utilizado.
Para avaliar a síntese de GLI-TAG, considera-se que a incorporação de 3H da
3
H
2
O
e hidrogênios da glicose e de nucleotídeos de piridina reduzidos
53
. Dessa forma o 3H-
glicerol-TAG reflete a síntese a partir de glicose e de intermediários de três carbonos
(gliceroneogênese), mas não da gliceroquinase. JUNCAS (1968)
54
demonstrou que o
tecido adiposo incubado com
3
H
2
O, U
14
C-glicose (5mm) na presença de insulina, apresenta
uma relação 3H/14C no GLI-TAG de 1,1. Como o glicerol tem três carbonos, 3,3 átomos
de
3
H são incorporados para cada molécula de glicerol-TAG formada. Desta forma, o fator
que converte átomos-grama de H em nmoles de glicerol é 10
9
/3,3.
Para determinação da lipogênese foi administrada água tritiada (3mCi/rato, i.p) nos
animais normoprotéicos e hipoprotéicos. Uma hora após, os animais foram eutanasiados
por decapitação e o sangue coletado em tubos heparinizados para obtenção do plasma para
determinação da atividade específica. O TABR foi retirado e pesado. A extração de
lipídeos foi realizada empregando-se clorofórmio:metanol 2:1 completando-se o volume
para 10 ml.
31
Após a extração, o material foi filtrado e para cada 8 ml de filtrado foram
adicionados 1,6 mL de salina. Em seguida, os tubos foram centrifugados à baixa rotação
por alguns minutos. A fase superior foi aspirada e a fase inferior (clorofórmica) lavada 3
vezes com mistura da fase superior preparada com clorofórmio, metanol e mistura salina
na proporção de 21,1:337:330 (ml), respectivamente. A mistura salina foi preparada com
0,528g de CaCl
2
.2H
2
O + 0,732g de MgCl
2
.6H
2
O + 5,8g de NaCl + 940 ml de H
2
O. Uma
fração da fase clorofórmica (2mL) foi retirada para evaporação e contagem da
radioatividade dos lipídeos totais. Após evaporada, o resíduo era ressuspenso com coquetel
de cintilação para determinação da radioatividade Para determinação dos ácidos graxos
4mL da fase clorofórmica foi evaporada e os lipídeos saponificados com 2 ml de KOH
etanólico (1ml de KOH saturado para 20 ml de etanol). Os tubos eram fechados com tampa
de vidro e submetidos a aquecimento em banho Maria a temperatura de 70-80˚C por duas
horas. Após a saponificação foram adicionados 3 ml de água milli-Q, e o tubo mantido a
temperatura de 40-50˚C até a evaporação total do álcool. O material saponificado foi então
lavado 3 vezes com 8 ml de éter de petróleo para a remoção dos lipídeos não
saponificáveis. Posteriormente o material foi acidificado com ácido perclórico 6% e os
ácidos graxos extraídos com éter de petróleo. Após a evaporação do conteúdo etéreo, o
resíduo foi dissolvido em 10 ml de coquetel de cintilação para contagem de ácidos graxos-
TAG. A diferença entre a radioatividade dos lipídeos totais e a incorporada em ácidos
graxos foi utilizada para o cálculo da velocidade de síntese de GLI-TAG. Para a medida da
radioatividade foi utilizado o aparelho de cintilação líquida Tri Carb 2100 TR (Packard).
3.3. Medida da atividade das enzimas da síntese de ácidos graxos de novo
Para ensaio das enzimas, Glicose 6-P Desidrogenase, ATP-Citrato Liase e Enzima
Málica, foi utilizado o mesmo homogenado. A homogeneização do TABR foi realizado em
tampão TRIS 10mM, pH 7,4, sacarose 0,32M, EDTA 2mM e 2-β-mercaptoetanol 5mM
seguido de centrifugação a 5.000 rpm por 10 minutos a 4°C. A camada gordurosa superior
foi descartada e a fração sobrenadante transferida para outro tubo sendo centrifugada a
13.000 rpm por 2 horas a 4˚C para obtenção da fração citossólica. O conteúdo protéico do
homogenado foi determinado pelo método de Lowry
34
.
3.3.1. Glicose 6-P desidrogenase
A atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase foi seguida
espectrofotometricamente a 340nm, de acordo com o método de LEE (1982)
35
A mistura
da reação continha TRIS 0,1M pH 8,0, NADP
+
1mM e D-glicose-6-fosfato 1mM. A reação
foi iniciada pela adição de glicose-6-fosfato que foi omitida do branco.
3.3.2. Enzima málica
A atividade da enzima málica foi avaliada medindo-se a formação de NADPH a
partir de L-malato e NADP
+
. O método utilizado é essencialmente o descrito por OCHOA,
36
modificado por HSU e LARDY.
37
.Estas modificações fornecem melhor estabilidade e
linearidade em ampla faixa de concentrações de proteína e tempo. A formação de NADPH
foi monitorada em espectrofotômetro (340nm) e o ritmo de sua formação, proporcional à
concentração de enzimas. O sistema de ensaio continha tampão Trietanolamina 67mM (pH
7,4), L-malato 5mM, MnCl
2
.4H
2
O 4mM, NADP
+
0,2mM. A reação era iniciada com L-
malato, que era omitida do branco.
3.3.3. ATP-citrato liase
O ensaio da ATP-citrato liase foi realizado de acordo com o método descrito por
SRERE, acompanhando a oxidação do NADH espectrofotometricamente a 340 nm. A
mistura de reação continha, tampão Trietanolamina 50mM (pH 7,7) contendo ATP-Mg
7mM, citrato de potássio 10mM, NADH 0,1mM, Coenzima A 0,24mM, 2-mercaptoetanol
10mM, NAD-malato desidrogenase (1U/ml). A reação era iniciada pela adição de citrato
de potássio. O NADH foi omitido no branco.
3.4. Atividade da Lipase lipoprotéica
O ensaio da atividade enzimática da LPL foi baseado no método de Nilsson-Ehle &
Schotz,
38
e se fundamenta na reação, onde os ácidos graxos liberados (
14
C-oleato) foram
separados usando um sistema de partição líquido-líquido. Tomando uma alíquota dos AGL
situados na fase polar, e medindo-se a radioatividade correspondente foi calculado o grau
de hidrólise dos triacilgliceróis e a atividade da enzima.
LPL
TAG (glicerol tri-
14
C-oleato) glicerol + (
14
C-oleato)
O TABR foi homogeneizado em tampão contendo 250mM de sacarose, 1mM de
EDTA e 20U/ml de heparina, pH 7,4, mantendo a relação de 0,1:1 (m/v). O homogenado
foi centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante, abaixo da camada
gordurosa foi utilizado na avaliação.
O substrato foi preparado no dia anterior ao ensaio e continha 78 µmoles de
trioleína fria, 4mg de lisolecitina em clorofórmio e 12,5 µCi de trioleína-
14
C em tolueno.
Após a evaporação todo os solvente orgânico foi evaporado sob corrente de nitrogênio.
Posteriormente foram adicionados 5 ml de glicerol e agitados vigorosamente. Ao final do
procedimento, a mistura apresentava-se turva, mas voltava à transparência após 10 a 20
horas. Esse substrato é estável a temperatura ambiente e no escuro por 3 meses. Entre as
propriedades da lípase lipoprotéica (LPL) importantes para a determinação da sua
atividade, estão: inibição por NaCl 5M e requerimento de cofator específico
(apolipoproteína C-II).
No dia do ensaio foi preparado a mistura de reação, contendo 2 partes de tampão
para LPL (pH 8,8) contendo TRIS 0,2M, albumina bovina livre de ácidos graxos (6%) e
cloreto de sódio 0,15 M; 2 partes do substrato e uma parte de soro de rato jejuado (36
horas). A mistura de reação foi agitada em vórtex e 100
µl adicionados em todos os tubos,
inclusive nos tubos “inibidos” que continham 50 µl de NaCl 5M, (reação inibida pelo
NaCl). A reação foi iniciada pela adição de 100 µl do homogenado e incubados por 60
minutos a 37˚C, sob agitação (80 ciclos/min). Ao final do período de incubação foram
adicionados 3,25 ml de mistura de extração de VAUGHAN (clorofórmio: heptana: etanol
na proporção de 1,25 : 1 : 1,41) sob agitação;
40
e em seguida 1 ml de tampão carbonato-
borato 0,1M pH 10,5 também sob agitação em vórtex. Os tubos de ensaio foram então
centrifugados à temperatura ambiente a 1.000g por 15 minutos. Uma alíquota de 0,8 ml da
fase superior aquosa foi colocada em líquido de cintilação SX20 Fischer, para contagem da
radioatividade. Para o cálculo da atividade da enzima, foi descontada da radioatividade da
amostra, a radioatividade do inibido.
3.5. Velocidade de renovação de noradrenalina
A velocidade de renovação de noradrenalina no TABR de ratos controles e
submetidos à dieta hipoprotéica foi avaliada medindo-se o ritmo de queda na concentração
de noradrenalina após 6 e 12 horas de administração intraperitoneal de α-metil-tirosina
(300mg/Kg de peso corporal), um inibidor da síntese de noradrenalina, que bloqueia a
atividade da tirosina hidroxilase. O grupo 12h recebeu uma segunda dose (250mg/kg de
peso corporal) da droga, 6 horas após iniciado os experimentos
Após o sacrifício dos animais por deslocamento cervical, o TABR foi rapidamente
removido e congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80˚C até o momento da
avaliação.
Para determinar o conteúdo de noradrenalina, o tecido foi homogenado em 5,5 ml
de ácido perclórico 0,2N (deaerado) contendo metabissulfito de sódio 1% e EDTA 1 mM.
O homogenado foi centrifugado a 3000g por 10 minutos a 4˚C e 4 ml do sobrenadante foi
transferido para um tubo contendo 1 ml de tampão TRIS 2M (pH 8,9) com 0,5% de
metabissulfito de sódio e 2,5% de EDTA, previamente deaerado, contendo 50 mg de
alumina ativada (30 minutos a 100˚C) e 20 µl de padrão interno (3,4-diidroxibenzilamina,
DHBA). Após 20 minutos de agitação em banho Dubnoff, as amostras foram centrifugadas
a 7500g por 3 minutos a 4˚C e o sobrenadante foi aspirado. Ao precipitado foram
adicionados 3 ml de água milli-Q deaerada contendo 0,5 ml de EDTA 20mM, 100 µl de
metabissulfito de sódio 1M e 0,25 ml de TRIS 2M seguido de aspiração do sobrenadante.
Esta etapa foi realizada duas vezes. Após a última aspiração foi adicionado ao precipitado,
0,5 ml de ácido perclórico 0,1M contendo metabissulfito de sódio 1mM e EDTA 0,02%.
Após 10 minutos de agitação em banho Maria Dubnoff, o sobrenadante foi separado para
determinação do conteúdo de noradrenalina por cromatografia líquida de alta performance
(HPLC LC-7ª) em coluna de fase reversa.
41
A noradrenalina e o padrão interno foram quantificados com o auxílio de um
detector eletroquímico (LC-ECD-6ª, Shimadzu).
A velocidade de renovação (VR) da noradrenalina é o produto da concentração de
noradrenalina no tempo zero (NOR
0
) e a velocidade de renovação fracional (k).
VR = k . [NOR]
0
Após o bloqueio da síntese pela α-metil-tirosina, o declínio na concentração de
noradrenalina é dado pela seguinte equação:
[NE] = [NEo] e
kt
O valor de k pode ser determinado pelo cálculo da regressão linear dos logarítmos
naturais da concentração noradrenalina versus o tempo.
42
O intervalo de confiança de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da
noradrenalina foi determinado da seguinte maneira:
a) O intervalo de confiança do erro padrão médio da velocidade de renovação
fracional (k) e da concentração de noradrenalina (NOR
0
) foi estabelecido.
b) Os limites inferiores da velocidade de renovação fracional (k) e da concentração
de noradrenalina (NOR
0
) foram multiplicados para determinação do limite
inferior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação (VR) da
noradrenalina.
c) Os limites superiores da velocidade de renovação fracional (k) e da
concentração de noradrenalina (NOR
0
) foram multiplicados para determinação
do limite superior do intervalo de 95% de confiança da velocidade de renovação
(VR) da noradrenalina.
43
O tempo médio de desaparecimento de noradrenalina (t
1/2
) foi calculado dividindo-
se 69,3 pelo valor da velocidade de renovação fracional (k).
3.6. Determinação de corticosterona plasmática
Foi adicionado 1 mL de acetato de etila para cada 1 mL de amostra que foi agitado
vigorosamente. Após a separação das fases, a fase orgânica superior foi transferida para
um tubo de ensaio. Foi repetida a adição de acetato de etila e separação das fases mais duas
ou três vezes, para remover toda a corticosterona da amostra.
O acetato de etila foi evaporado na capela, sob jato de N
2
. A corticosterona extraída
foi dissolvida em 250 µL de tampão de ensaio (10 mL de concentrado do Kit mais 90 mL
de água deionizada), agitado e deixado descansar por 5 minutos a temperatura ambiente.
Esse procedimento foi repetido mais 2 vezes e as amostras foram usadas imediatamente.
Todas as amostras foram feitas em duplicata.
Foram adicionados 100 µL do tampão ensaio numa dupla de poços denominados
B
0
, 100 µL dos padrões 1 a 5 nos respectivos poços (em duplicata), 100 µl das amostras
(em duplicata) nos respectivos poços, 50 µL de tampão de ensaio em poços denominados
NSB (ligação não-específica) e 50 µL de conjugado azul em todos os poços, exceto no
atividade total (TA) e o branco. Depois foi adicionado 50 µl de anticorpo amarelo em cada
poço, exceto no TA, branco e NSB. Todos os poços apresentaram a cor verde, exceto os
NSBs, que se apresentaram azuis.
A placa foi incubada em temperatura ambiente, por 2:00 horas sob agitação de 500
rpm. A placa foi selada, por precaução, com o material fornecido. Os poços foram
esvaziados e adicionou-se 400 µL de tampão de lavagem (5 mL de concentrado do kit mais
95 mL de água deionizada) em cada poço. Esvaziou-se os poços e a placa foi agitada
vigorosamente para remover todo o tampão, depois disso, adicionou-se 5 µL de conjugado
azul aos poços TA e 200 µL do substrato de paranitrofenilfosfato (pNpp), onde foi
Incubado por 1:00 hora em temperatura ambiente, em repouso.
Após o repouso, foi adicionado 50 µL de solução de parada em cada poço para
interromper a reação. A absorbância foi lida em 405 nm, com correção em 570-590 nm.
Após a leitura foi subtraído à leitura do branco de todas as amostras.
Cálculo
Absorbância líquida = Absorbância da amostra – Absorbância do NSB
Absorbância líquida
Ligação ao Anticorpo = __________________ × 100
Absorbância B
0
Foi montado um gráfico das concentrações dos padrões 1 a 5 versus a ligação ao
anticorpo e calculado a corticosterona das amostras por interpolação.
3.7. Análise Estatística
Os resultados foram analisados utilizando-se o Teste t de Student para a
comparação das médias dos diferentes tratamentos experimentais. O nível de significância
adotado foi de 5%. Para análise dos resultados utilizou-se o programa Statistic for
Windows, versão 4.3 (StatSoft, Tulsa, OK, USA).
4. RESULTADOS
4. RESULTADOS
4.1. Síntese de ácidos graxos
A síntese de AGs a partir de todas as fontes, avaliada pela incorporação in vivo de
3
H
2
O foi 50% menor nos animais submetidos à restrição protéica (6% de proteína), quando
comparados com o grupo controle que recebeu dieta normoprotéica (17% de proteína).
N H
0
1
2
3
4
5
Vel sintese AG (µmol/g.h)
*
Figura 3: Velocidade de síntese de ácidos graxos (µmol/g.h) “in vivo” de ratos machos
tratados com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias. Valores
representam a média ± EPM de 14 animais por grupo. Diferença estatística em relação aos
animais controle (*p˂0,05)
4.1.2. Síntese de glicerol
A velocidade de síntese de glicerol avaliada pela incorporação de
3
H
2
O in vivo em
animais H, não apresentou alteração significativa quando comparada ao grupo controle.
N H
0
2
4
6
8
10
Vel sintese Gli (µmol/g.h)
Figura 4: Velocidade de síntese de glicerol em ratos machos t ao final de 15 dias de
tratamento com dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H). Valores representam a média
± EPM de 14 animais por grupo.
Tabela 2 : Velocidade de síntese de ácidos graxos e glicerol de novo (µmol/g.h) e
velocidade do ciclo de reesterificação de AGs, no TABR de ratos machos tratados com
dieta N ou H ao final de 15 dias de tratamento.
Grupos
Parâmetros
N (14) H (14)
Ácido Graxo 3,6 ± 0,76 1,8± 0,23*
Glicerol 8.3 ± 1,5 6,3 ± 1,1
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças
estatísticas em relação aos controles (*p<0,05).
4.2. Atividade enzimática
As enzimas lipogênicas ATP Citrato Liase, Málica e Glicose-6-fosfato
Desidrogenase não apresentaram alteração na sua atividade quando comparadas com os
grupos controles (Figura 5).
No entanto, a atividade da enzima Lipase Lipoprotéica nos animais submetidos à
dieta hipoprotéica (H), apresentaram um aumento de mais de 100%, sugerindo uma maior
captação de AGs da circulação.
N LP N LP N LP
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
µmol/mg de prot/min
ATP Citrato
Málica
G-6-P
N
H
Figura 5: Atividade das enzimas Málica, Glicose 6-fosfato desidrogenase e ATP citrato
liase (nmol/ mg de prot. min) no TABR, de ratos machos, ao final de 15 dias de tratamento
com a dieta N ou H. Os valores representam a média ± EPM de 7 animais por grupo.
N
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
nmol AG. mg ptn
-1
.min
-1
*
H
Figura 6 - Atividade da enzima Lípase Lipoprotéica no TABR, de ratos machos, ao final de
15 dias de tratamento com dieta N ou H. Os valores representam a Média ± EPM de 7
animais por grupo. Diferença estatística em relação aos animais controle (*p˂0,05).
Tabela 3 : Atividade da enzima Lipase Lipoprotéica (nmol AG/ mg de prot. min), Málica,
Gicose-6-fosfato desidrogenase e ATP Citrato liase (µmol/ mg de prot. min) no TABR, de
ratos machos, ao final de 15 dias de tratamento com dieta N ou H.
Grupos
Parâmetros
N (7) H (7)
ATP Citrato Liase 0,65 ± 0,13 0,36 ± 0,06
Enzima Málica 1,15 ± 0,19 1,39 ± 0,11
Glicose-6-
fosfato Desidrogenase
1,31 ± 0,24 1,88 ± 0,19
LPL – TAB (nmol AG. mg ptn
-
1
.min
-
1
) 1,3 ± 0,24 2,7 ± 0,48*
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças
estatísticas em relação aos controles (*p<0,05).
4.3. Concentração sérica de corticosterona
A concentração sérica de corticosterona nos animais H teve aumento superior a 100%
quando comparada com ao grupo controle (N).
N H
0
100
200
300
400
Corticosterona (
µ
µ
µ
µ
g/ml)
**
Figura 7: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) em ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao longo de 15 dias. Valores representam a
média ± EPM de 11 a 12 animais. Diferença estatística em relação aos animais controle
(**p˂0,01).
Tabela 4: Concentração sérica de corticosterona (µg/ml) de ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) ou hipoprotéica (H) ao final de 15 dias.
Grupos
Parâmetros
N (11) H (12)
Corticosterona (µg/ml)
145,47 ± 1,52 304,12 ± 1,94**
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças
estatísticas em relação aos controles (**p<0,01).
4.4. Turnover de noradrenalina
Nenhuma diferença significativa foi encontrada na concentração de noradrenalina
no TABR entre os grupos avaliados. No entanto o grupo H apresentou velocidade de
renovação de noradrenalina de 5,84 ng. Tecido
-1
. Hora
-1
e o grupo N de 3,98 ng. Tecido
-1
.
Hora
-1
. A diferença na velocidade de renovação de 1,86 ng. Tecido
-1
. Hora
-1
foi
estatisticamente significativa (p˂0,01). O tempo de decaimento (meia vida) da
noradrenalina foi de 9,5 horas para o grupo H e 14,9 horas para o grupo N.
0 6 12
20
55
Dieta N
t
1/2
=14,9 h
Dieta H
t
1/2
=9,5 h
[NE] ng. tecido
-1
TABR
Tempo (h)
Figura 8: Velocidade de renovação de noradrenalina no TABR após a aplicação
intraperitoneal de α-metil-ester-tirosina em ratos machos tratados com dieta normoprotéica
(N) ou hipoprotéica (H) durante 15 dias. Cada ponto representa a média de 4 a 5 animais
em cada tempo.
Tabela 5: Concentração de noradrenalina, velocidade de renovação fracional (k) e
velocidade de renovação (VR) de noradrenalina no TABR de ratos machos tratados com
dieta normoprotéica (N) e hipoprotéica (H) durante de 15 dias.
Grupos
Parâmetros N (4) H (5)
Noradrenalina (ng. tecido
-1
) 86,0 ± 4,9 80,5 ± 5,7
k (%h
-1
)
4,6 ± 3,43 7,3 ± 3,78
VR (ng. tecido
-1
. hora
-1
) 4,0 (3,27-4,70) 5,8 (4,69-6,99)**
Valores representam a média ± EMP do número de animais entre parênteses. Diferenças
estatísticas em relação aos controles (**p<0,01).
5.
DISCUSSÃO
5. DISCUSSÃO
Além dos parâmetros relacionados à geração de ácidos graxos e glicerol, foram
determinados neste trabalho, os níveis de corticosterona sérica e o turnover de
noradrenalina no TABR. A coleta destes dados, juntamente com outros obtidos em
experimentos anteriores, teve por finalidade caracterizar o modelo experimental (ratos em
crescimento submetidos à restrição protéica) e conhecer o contexto neural e hormonal em
que se processam as alterações metabólicas nestes animais.
O aumento no turnover de noradrenalina no TABR dos animais do grupo H e
apresentado na Tabela 5, é a primeira constatação do aumento da atividade simpática neste
tecido em animais com restrição protéica. Estes dados se opõem aos encontrados no TAB
Epididimal de ratos adultos submetidos à dieta com 5% de caseína (muito próximo ao
conteúdo de 6% de proteína administrado a nossos animais) por Kevonian et al
71
. Além de
uma possível diferença tecido-específica, não podemos descartar que este resultado
aparentemente contraditório entre os dois tipos de tecido adiposo branco, poderia ser
resultado da diferente etapa de desenvolvimento em que os mesmos foram submetidos à
restrição protéica (fase de crescimento e adultos, respectivamente), já que este fato leva à
diferença na ingestão de alimento (calorias), e balanço nitrogenado tendo como
conseqüência, diferente respostas simpática nos tecidos. Segundo White et al.
26
o aumento
da ingestão em situações de restrição protéica é uma tentativa do organismo em repor a
deficiência de aminoácidos, sendo, no entanto limitada, pelo próprio gasto energético; de
tal forma que o aumento do gasto energético levaria a um aumento na ingestão de
alimento. O fato do grupo H (nosso grupo experimental) se encontrar em fase de
crescimento, onde ocorre aumento no gasto energético, pode ter sido o fator fundamental
para o diferente comportamento alimentar entre os dois grupos acima mencionados,
mesmo submetidos a um grau de restrição protéica muito próximos. A associação entre a
maior ingestão de calorias e maior atividade simpática no TABR encontrado em nossos
experimentos foi observada também por outros autores: Chaves et al.
1
observou aumento
na atividade simpática no TABR após administração de dieta hipercalórica por 3 semanas
e Young et al.
61
,em animais submetidos à dieta padrão suplementado com solução de
glicose ou frutose por 6 dias, entre outros. Estudos em ratos adaptados à dieta hiperprotéica
(HP) livre de carboidratos, mostram uma diminuição na atividade simpática no TABR
62
.
Esta diminuição é provavelmente induzida pela ausência de carboidratos na dieta
38
ou pelo
aumento da concentração de proteínas
39,40,41,42
. Com isso, concluímos que a atividade
simpática aumentada no TABR no grupo H é coerente com a maior ingestão de calorias e
carboidratos e menor concentração de proteínas na dieta.
Classicamente o SNS desempenha um papel importante na regulação da lipólise no
TAB. Dados de Migliorini et al.
63
e Garófalo et al.
64
mostraram que o jejum e a exposição
ao frio são situações onde constatamos simultaneamente aumento da atividade simpática e
da lipólise. No entanto, é difícil justificar a necessidade da ativação da lipólise em animais
com maior ingestão calórica. Mais recentemente, Carey et al.
65
e Lafontan et al.
66
constataram que as catecolaminas através dos receptores α2 adrenérgicos e inibição da
produção de AMPc, podem também prevenir a mobilização lipídica. Diante disto, para
uma melhor interpretação do objetivo finalístico do aumento da atividade simpática nestes
animais, outros experimentos, confirmando ou não o aumento da lipólise neste tecido,
serão necessários.
Se considerarmos, no entanto, uma ação lipolítica do SNS no TABR nestes
animais, somente o aumento na reesterificação, poderia justificar o aumento do conteúdo
de TAG neste tecido, processo este dependente da disponibilidade de G3P, fundamental no
ciclo lipólise/reesterificação, regulando a taxa de liberação de AG pelo tecido e
conseqüentemente o seu armazenamento na forma de triacilgliceróis (TAG).
Quanto à geração de AG, pudemos constatar que a síntese de AG de novo no TABR
do grupo N, utiliza apenas cerca de 15% do G3P sintetizado pelas vias da
gliceroneogênese e a partir da glicose (incorporação de
3
H
2
O em GLI-TAG). Para esta
determinação a velocidade de síntese de AG de novo dividido por 3, nos dá o quanto de
G3P foi utilizado para esterificar estes AG, uma vez que cada molécula de G3P esterifica 3
moléculas de AG. Isto significa que a maior parte dos G3P (85%) foram utilizados para
esterificar AG pré formados, sejam eles provenientes da hidrólise dos TAG no próprio
tecido ou captado das lipoproteínas circulantes pela ação da LPL. Estes resultados
reforçam a importância da reesterificação dos AGs observado em animais adultos por
Botion et al.
24
em que cerca de 63% do GLI-TAG sintetizado pela gliceroneogênese e a
partir da glicose, é utilizado para reesterificar AG pré-formados, aumentando para 80% em
animais submetidos à dieta hiperprotéica
24
. Nos animais com restrição protéica dos nossos
experimentos, observamos um aumento na contribuição dos AG pré-formados (circulantes
e endógenos) para 90%. Este resultado explica o aumento dos estoques de TAG nestes
animais, mesmo com redução significante da síntese de AG de novo (50% da síntese do
grupo N). O aumento de 100% na atividade da LPL observado neste grupo sugere que o
aumento dos estoques de TAG, tem relação direta com a maior contribuição dos AG
circulantes captados da circulação do que os AG provenientes dos TAG endógenos. O
aumento da sensibilidade à insulina constatada no grupo H em relação ao grupo N poderia
justificar o aumento da atividade da LPL no TABR
35
, suprimindo os possíveis efeitos
inibitórios da noradrenalina sobre a enzima (uma vez que o tecido nesta condição tem,
como já relatado anteriormente, um aumento na atividade simpática).
Outra fonte de geração de G3P, que não é contabilizada pela técnica da
3
H
2
O é o
glicerol reciclado por fosforilação pela GK. Embora a atividade desta enzima tenha sido
considerada nula no TAB durante muito tempo, mais recentemente foi constatado que a
sua atividade é perfeitamente detectável, sendo em torno de 1/10 da atividade da GK no
TAM sendo ativada pelo SNS
70
. Como nos animais H a atividade simpática está
aumentada (não se conhece outro fator que regule a atividade desta enzima), podemos
supor que a síntese de G3P a partir da gliceroquinase estará possivelmente mais elevada
nos animais H em relação à N, contribuindo para maior formação de G3P por esta via e
como conseqüência maior esterificação de AG, o que elevaria a percentagem do glicerol
utilizado para reesterificar ácidos graxos pré-formados.
O alto nível de corticosterona sérica encontrada nos animais H em nossas
experimentações (Tabela 4) são corroborados por Herbert & Carilloo
43
que constataram
aumento no peso da glândula adrenal e maiores níveis de corticosterona em animais com
restrição protéica. Adicionalmente, houve aumento de 63,8% no número de células
secretoras de ACTH em relação aos animais submetidos à dieta normoprotéica. Estes
resultados sugerem que a secreção de ACTH e a fisiologia adrenocortical estão estimuladas
sob condições de restrição protéica, condição esta, semelhante às situações de stress
crônico. Achados semelhantes (inclusive em outras espécies animais) foram encontrados
em ratos machos com restrição protéica na dieta (8% de proteína) por trinta dias
consecutivos a partir do 20° dia de vida
50
.
A regulação por feedback pelos níveis de glicocorticóides plasmáticos inibindo a
secreção de ACTH pelo hipotálamo, tem sido revisto ao longo das últimas décadas. Este
modelo clássico de retroalimentação é observado agudamente, nas primeiras 18h após o
stress, onde os níveis de glicocorticóides exercem uma ação inibitória sobre este sistema.
Entretanto em situações de stress crônico ou um simples stress de alta intensidade, a ação
direta dos glicocorticóides (em altos níveis) é estimulatória
51,52
. Dados recentes relacionam
também o stress crônico com desarranjos da homeostase metabólica que contribui em
manifestações clínicas como a obesidade visceral, diabetes tipo 2, aterosclerose e síndrome
metabólica; ressaltando a importância fisiológica desta relação.
Tudo indica que o mecanismo primário que estabelece estas alterações é o eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal e o componente central e periférico do Sistema Nervoso
Central. A hiperleptinemia dos animais H, mencionada anteriormente, poderia também
contribuir nestas alterações, uma vez que esta condição aumenta a expressão de
corticotropin releasing factor (CRF) (secretado pelo hipotálamo, estimulando a secreção
de ACTH que estimula o córtex adrenal na hipófise), resultando em maior secreção de
ACTH pela hipófise, maior estimulação das adrenais e aumento na secreção de
corticosterona
37
.
O papel deste hormônio na lipogênese está ainda por ser estabelecido. Até a década
de 80, os glicocorticóides eram vistos como hormônios catabólicos
68
, entretanto a
compreensão de seu mecanismo de ação e de seus efeitos estimuladores na síntese de
muitas enzimas das vias de síntese faz com que atualmente, se atribua a ele, também
funções anabólicas.
As ações metabólicas dos glicocorticóides são bastante amplas e o seu papel no
metabolismo de lipídeos ganha interesse cada vez maior, frente a sua associação com a
obesidade em humanos e roedores, sugerindo que os glicocorticóides podem ter papel
importante na gênese da obesidade. Além de estimular o acúmulo de lipídeos, este
hormônio participa também da distribuição corporal entre os vários depósitos.
Os efeitos finais dos GC sobre o metabolismo parecem ter duas características: a
especificidade tecidual e a interação com outros sistemas hormonais, que pode ser ilustrado
por sua ação permissiva sobre a ação estimulatória da insulina sobre a LPL e pela ação
inibitória sobre a ação anti-lipolítica da insulina. Esta interação pode também explicar a
maior ingestão de alimento no grupo H apesar dos elevados níveis de leptina sérica
(anorexígeno), já que a redução na ingestão é tamponada por altos níveis de corticosterona
(orexígeno) como constatado nos animais do grupo H
60
.
As interações dos GC se estende também a fatores de transcrição, como o receptor
ativado por proliferador de peroxissomos (PPARγ) que é expresso predominantemente no
Tecido Adiposo e modula a expressão gênica de proteínas envolvidas no metabolismo de
glicose e lipídeos. Entre estas interações podemos ressaltar a ativação do PPARγ pelos GC
e a sua associação com o fenótipo adiposo, que é definido pelo acúmulo de lipídeos e
genes marcadores específicos de lipídeos, como proteína ligadora de ácidos graxos nos
adipócitos (aP2), lipase lipoprotéica e adipsina
67
.
Dados da literatura sustentam ainda, a possibilidade da participação dos
glicocorticóides no controle das vias de geração de G3P, como a redução de 80% da
expressão gênica da fosfoenolpiruvato carboxiquinase citoplasmática (PEPCK-C)
observada após a incubação de adipócitos brancos com dexametasona por 4h
55
. Estes
resultados mostram uma ação diferente do hormônio no tecido adiposo e fígado, já que os
glicocorticóides estimulam a expressão da PEPCK-C hepática
56
. Esta enzima regulada a
nível transcricional, apresenta diferentes funções tecido-específicas, sendo a enzima chave
da gliconeogênese no fígado, enquanto no Tecido Adiposo sua função esteja associada
unicamente à geração de G3P através da gliceroneogênese. Esta participação da enzima em
vias com diferentes finalidades justificam as diferentes respostas da enzima ao hormônio
57
.
Estudos semelhantes mostram aumento da atividade da Gliceroquinase (GK) depois de
prolongada incubação de adipócitos brancos de ratos com dexametasona
58
. Por fim, estas
associações podem ser estabelecidas em outros vertebrados, onde o aumento da atividade
da glicerol 3-P desidrogenase (conversão da diidroxiacetona-P da Via glicolítica em
glicerol-P) e GK foram observadas após implantes de glicocorticóides em peixes
59
.
Estes achados isolados podem ser indicativos, ou não, de um possível controle dos
glicocorticoides sobre as vias relacionadas a estas enzimas. Experimentos posteriores serão
necessários para estabelece a real contribuição dos altos níveis de Corticosterona no
acúmulo de TAG no tecido adiposo branco retroperitoneal de animais submetidos à
restrição protéica na fase de crescimento.
Conclusão
Tendo em vista os resultados e as considerações anteriormente expostas, podemos
concluir que:
• As adaptações metabólicas determinadas pela restrição protéica ocorreu dentro de
um quadro de resistência à leptina, sensibilidade à insulina, hipercorticosterolemia
e aumento na atividade simpática no TABR;
• O aumento no conteúdo de TAG no TABR se deve mais, ao aumento na captação
de AG circulantes, decorrente em parte pelo aumento da sensibilidade à insulina e
independente da possível ação inibitória da LPL pelo Sistema Nervos Simpático;
• O alto nível de corticosterona parece contribuir para a redução da síntese de AG no
TABR e aumento do G3P, aumentando a velocidade de reesterificação;
• A atividade simpática pode também contribuir para o aumento do ciclo de
reesterificação aumentando a formação de G3P pela gliceroquinase.
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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