( PDF ) Análise da atividade da trombina sobre substratos fluorogênicos baseados no receptor par 1

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Bioquímica Médica

ANÁLISE DA ATIVIDADE DA TROMBINA SOBRE

SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS BASEADOS NO

RECEPTOR PAR 1

Saulo Martins Vieira

Rio de Janeiro

2009

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i

Saulo Martins Vieira

ANÁLISE DA ATIVIDADE DA TROMBINA SOBRE

SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS BASEADOS NO

RECEPTOR PAR 1

Profª. Drª. Russolina Benedeta Zingali

Orientadora

Professora Associada do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ

Prof. Dr. Julio Alberto Mignaco

Orientador

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ

Dissertação de Mestrado apresentada

ao Programa de Pós-Graduação de

Química Biológica, Instituto de

Bioquímica Médica, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção

do título de Mestre em Ciências

(Química Biológica).

Rio de Janeiro

2009

ii

FICHA CATALOGRÁFICA

VIEIRA, Saulo Martins

ANÁLISE DA ATIVIDADE DA TROMBINA COM SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS

BASEADOS NO RECEPTOR PAR 1.

Rio de Janeiro, UFRJ, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, 2009.

N° de folhas: 104

Dissertação: Mestrado em Química Biológica

1-Trombina 2-Substrato fluorogênico 3-PAR 1 4-Cinética

iii

FOLHA DE APROVAÇÃO

Saulo Martins Vieira

ANÁLISE DA ATIVIDADE DA TROMBINA COM SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS

BASEADOS NO RECEPTOR PAR 1

Rio de Janeiro, 16 de fevereiro de 2009

Banca Examinadora:

_________________________________

Profª. Russolina Benedeta Zingali

Professora Associada do Instituto de Bioquímica-Médica/UFRJ

Orientadora

__________________________________

Prof. Julio Alberto Mignaco

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica-Médica/UFRJ

Orientador

__________________________________

Prof. Robson Queiroz de Monteiro

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica-Médica/UFRJ

___________________________________

Profª. Lucia Moreira Campos Paiva

Professora Adjunta do Instituto de Química/UFRJ

___________________________________

Profª. Andréa Cheble de Oliveira

Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica-Médica/UFRJ

____________________________________

Prof. Hector Barrabin

Professor Associado do Instituto de Bioquímica-Médica/UFRJ

Revisor e suplente interno

______________________________________

Prof. André Lopes Fuly

Professor Adjunto da Universidade Federal Fluminense/UFF

Suplente externo

iv

Dedico a minha dissertação e todos os anos

do curso de mestrado ao meu pai (em memória),

foi exemplo de um grande homem.

v

A Deus, meu melhor Orientador,

sou eternamente grato.

vi

Agradecimento

Em primeiro lugar, meu agradecimento especial à minha família. Apoiaram-me

desde a graduação e, no mestrado, foi o meu “órgão financiador”. Obrigado por tudo

que sou hoje.

Agradeço aos meus professores da graduação por incentivar-me a pesquisar.

Agradeço à Mariane Assafim, na época, aluna de mestrado do Instituto de

Bioquímica Médica, por me encaminhar à iniciação científica.

Agradeço à professora Lina Zingali, por me aceitar no laboratório e pela

orientação.

Agradeço ao professor Julio Mignaco, pela co-orientação e pelas trocas de

idéias.

Agradeço aos professores Maria Juliano e Luiz Juliano Neto, do

Departamento de Biofísica – Unifesp, pela colaboração com a síntese dos substratos

e pela minha passagem no laboratório deles.

Agradeço a Flávia Reis, do Instituto de Biofísica – UFRJ, pelo auxílio com a

cinética enzimática no início da minha iniciação científica.

Agradeço aos meus companheiros de laboratório, aqueles que já saíram e

aqueles que continuam lá, obrigado pela descontração.

Agradeço aos meus companheiros de fora do laboratório, pela descontração

“científica”.

Agradeço à Universidade Federal do Rio de Janeiro, por expandir meus

horizontes. Foi a minha segunda casa.

vii

“Tudo vale a pena se a alma não é pequena.”

Fernando Pessoa

viii

“Só sei que nada sei.”

Sócrates

ix

“Ainda que eu caminhe por um vale tenebroso

nenhum mal temerei, pois estais junto a mim....”

Salmo 22 (23)

x

Lista de Siglas e Abreviaturas

Abz ácido aminobenzóico

ADP adenosina difosfato

BJC botrojaracina

DMSO dimetilsulfóxido

Dnp dinitrofenil

EDDnp etilenodinitrofenil

EGF fator de crescimento epidermal

FRET transferência de energia de ressonância de Föster

GL glicirrizina

GP glicoproteína

HPLC cromatografia líquida de alta performance

PAR 1 receptor ativado por protease 1

PAR 3 receptor ativado por protease 3

PAR 4 receptor ativado por protease 4

PEG polietilenoglicol

PL fosfolipídio

TF fator tecidual

THR trombina

TM trombomodulina

xi

Lista de Figuras e Tabelas

Figura 1: Esquema representativo da cascata de coagulação. pág. 03

Figura 2: Inibição da coagulação pela ativação da proteína C. pág. 04

Figura 3: Esquema representativo da trombina e dos subsítios. pág. 06

Figura 4: Representação esquemática de múltiplos papéis

da trombina no sangue com a influência do Na

+

. pág. 11

Figura 5: Sítio de ligação do sódio. pág. 13

Figura 6: Localização e mecanismo de ativação

do receptor PAR 1. pág. 15

Figura 7: Esquema dos substratos fluorogênicos. pág. 21

Figura 8: Representação esquemática da liberação

da fluorescência. pág. 30

Figura 9: Análise cromatográfica dos substratos

fluorogênicos por HPLC. pág. 35

Figura 10: Análise das massas dos substratos de 26 aa. pág. 37

Figura 11: Análise das massas dos substratos de 11 aa. pág. 39

Figura 12: Velocidade enzimática da trombina frente

aos substratos fluorogênicos. pág. 42

Figura 13: Efeito da concentração de NaCl e ChCl na

eficiência catalítica da trombina. pág. 45

Figura 14: Eficiência catalítica da trombina em presença

da seqüência C – terminal do substrato de

26 resíduos de aminoácidos. pág. 46

Figura 15: Eficiência catalítica da trombina com o

peptídeo 0714 D. pág. 47

xii

Tabela 1: Ponto de clivagem dos substratos da trombina pág. 08

Tabela 2: Relação das moléculas que ligam ao

exosítio 1 da trombina pág. 10

Tabela 3: Seqüência e enzimas agonistas

dos receptores PARs. pág. 16

Tabela 4: Seqüências e massas dos substratos

íntegros e hidrolisados. pág. 27

Tabela 5: Parâmetros cinéticos da trombina

com os substratos fluorogênicos e

seus moduladores. pág. 43

xiii

Sumário

1. Introdução pág. 01

1.1. Papel da trombina no processo hemostático pág. 02

1.2. Estrutura e especificidade da trombina pág. 04

1.3 Receptores plaquetários pág. 13

1.3.1. PAR e sua função pág. 14

1.4. Inibidores da trombina pág. 17

1.4.1. Glicirrizina pág. 18

1.4.2. Botrojaracina pág. 19

1.5. Emprego dos substratos fluorogênicos

baseados na seqüência do PAR 1. pág. 20

2. Objetivo pág. 23

2.1. Objetivo Geral pág. 24

2.2. Objetivos específicos pág. 25

3. Material e métodos pág. 26

3.1. Síntese dos substratos fluorogênicos pág. 27

3.2. Análise dos substratos fluorogênicos por HPLC pág. 28

3.3. Hidrólise dos substratos e análise por espectrometria de massas pág. 28

3.4. Cinética de hidrólise dos substratos fluorogênicos pela trombina pág. 29

3.4.1. Determinação dos parâmetros cinéticos

com os substratos de 26 aa e 11 aa pág. 29

3.4.2. Determinação dos parâmetros cinéticos

com presença de glicirrizina e botrojaracina pág. 31

3.4.3. Efeito da força iônica na atividade da trombina pág. 31

3.5. Determinação da velocidade enzimática pág. 32

xiv

3.6. Análise da interação da seqüência C – terminal

do substrato de 26 aa com o exosítio 1 pág. 32

4. Resultados pág. 34

4.1. Análise da integridade dos substratos fluorogênicos pág. 35

4.2. Análise das massas e determinação

do sítio de hidrólise dos substratos fluorogênicos

por espectrometria de massas pág. 36

4.3. Velocidade enzimática e parâmetros

da trombina frente aos substratos analisados pág. 42

4.4. Efeito da força iônica na atividade da trombina pág. 44

4.5. Interação da seqüência C – terminal

do substrato de 26 aa no exosítio 1 pág. 46

5. Discussão pág. 49

6. Conclusão pág. 55

7. Referência Bibliográfica pág. 60

8. Anexo pág. 67

xv

Resumo

A trombina exibe uma atividade catalítica altamente seletiva para os seus substratos

devido à especificidade do seu sítio catalítico, além de dois exosítios (exosítio 1 e

exosítio 2) carregados positivamente que governam esta especificidade. O exosítio 1

tem demonstrado ser uma região de maior participação na eficiência da trombina,

por interagir com substratos macromoleculares e com outros ligantes. Nós utilizamos

a seqüência do receptor plaquetário PAR 1, ativado pela trombina, na síntese de

substratos fluorogênicos para estudarmos a atividade catalítica da trombina com

relevância na posição P

3

´ destes substratos. Foram sintetizados dois grupos de

substratos de 11 e 26 resíduos de aminoácidos, onde, na posição P

3

´, cada

substrato contém um resíduo de aminoácido diferente (Arg, Pro, Ala e Asp). Os

substratos de 26 aa, além do sítio de hidrólise, contêm uma seqüência C – terminal

que interage com o exosítio 1 da enzima. Primeiramente, nós determinamos o sítio

de clivagem dos substratos pela trombina onde, por meio de análise por

espectrometria de massas, confirmamos a seqüência como sendo LDPR

41

S

42

FXLN. A sua eficiência catalítica foi maior com os substratos de 26 aa do que

com os 11 aa. Na posição P

3

´, o resíduo Arg (K

cat

/K

m

= 16 µM

-1

s

-1

± 2,5 e K

cat

/K

m

=

0,8 µM

-1

s

-1

± 0,1) e o Asp (K

cat

/K

m

= 5 µM

-1

s

-1

± 0,9 e K

cat

/K

m

= 0,2 µM

-1

s

-1

±

0,03), de ambos substratos, apresentaram, respectivamente, as melhores e as

piores eficiências catalíticas. Moléculas moduladoras da trombina que interagem

com o exosítio 1, glicirrizina e botrojaracina, diminuíram os valores de K

cat

/K

m

para

ambos substratos. Por outro lado, a utilização do C-terminal sintetizado do PAR 1,

(DKYEPFWEDEEKNQ), inibiu a atividade catalítica da trombina nos substratos de

11 aa, 26 aa e S-2238. Sabendo que na ligação com o exosítio 1 a interação

eletrostática tem um papel fundamental, avaliamos o efeito da força iônica dos sais

NaCl e ChCl (0 a 700 mM) na interação da enzima com os substratos de 26 aa e 11

aa. Assim, observamos que a reação com o substrato de 26 aa foi completamente

abolida na presença de ChCl e a partir de 300 mM de NaCl. No entanto, o substrato

de 11 aa teve a atividade estimulada até 150 mM de ChCl e com todas as

concentrações de NaCl. Em conclusão, a interação do C – terminal do substrato de

26 aa no exosítio 1 aumenta a eficiência catalítica da trombina, sem alterar a

preferência dos resíduos de aminoácidos em P

3

´, sendo influenciada por forças

eletrostáticas.

xvi

Abstract

Thrombin exhibits a highly selective catalytic activity over substrates through its

catalytic site specifity, besides two exosites (numbered 1 and 2) positively charged

that govern this specifity too. Exosite 1 proved to be a region with larger interference

on thrombin’s efficiency by interacting with macromolecular substrates and other

ligands. We used the sequence of the platelet receptor PAR1 (which is activated by

thrombin) to design fluorogenic peptide substrates to study the enzyme catalytic

activity, giving special attention to the P

3

’ position of the substrates. Two sets of

peptides, with 11 and 26 amino acid residues respectively, were synthesized, and the

P

3

’ position presented different residues (Arg, Ala, Pro, or Asp). Besides the site of

hydrolysis, the long substrates included a C-terminal sequence interacting with

thrombin’s exosite 1. We first determined the peptide’s cleavage site by mass

spectrometry, and confirmed it to be LDPR

41

S

42

FXLN. Thrombin’s catalytic

efficiency was higher over the 26 aa substrates. For both substrate families, Arg

(K

cat

/K

m

= 16 µM

-1

s

-1

± 2,5 e K

cat

/K

m

= 0,8 µM

-1

s

-1

± 0,1) and Asp (K

cat

/K

m

= 5 µM

-

1

s

-1

± 0,9 e K

cat

/K

m

= 0,2 µM

-1

s

-1

± 0,03) residues presented the best and the worse

catalytic efficiencies, respectively. Glicirrhyzin and bothrojaracin, modulators of

thrombin that interact with exosite 1, diminished K

cat

/K

m

for either substrate.

Conversely, addition of the synthetic C-terminal peptide (DKYEPFWEDEEKNQ) of

PAR-1 impaired thrombin efficiency over the 11 aa, 26 aa, and chromogenic S-2238

substrates. As electrostatic interactions have a fundamental role on the interactions

of ligands with exosite 1, we evaluated the effects of ionic force using NaCl anc ChCl

(0-700 mM) on the interactions of thrombin with the 11 aa and 26 aa substrates.

Thrombin’s activity towards the 26 aa substrate was completely abolished by

increasing ChCl and over 300 mM NaCl. However, activity over the 11 aa substrate

was increased up to 150 mM ChCl and over all the NaCl concentrations. In

conclusion, interaction of the C-terminus of the 26 aa substrates with exosite 1

increases the catalytic efficiency of thrombin, without shifting the preference for

amino acid residues at P

3

’, and is influenced by electrostatic forces.

1

1 INTRODUÇÃO

2

1.1. PAPEL DA TROMBINA NO PROCESSO HEMOSTÁTICO

O processo hemostático, descrito didaticamente, se inicia quando ocorre

injúria vascular através da primeira etapa conhecida como hemostase primária. Esta

etapa é conduzida pela ativação das plaquetas que, através de receptores na sua

membrana, inicializará um processo de adesão no subendotélio exposto, no local da

injúria, e de agregação entre elas. Logo, ocorrerá a formação de um trombo

plaquetário instável (Jackson e col., 2003). A hemostase secundária, para a

estabilização do trombo, é caracterizada pela ativação de enzimas do plasma que

culmina com a formação de fibrina (Dahlbäck, 2000). A ativação destas enzimas

ocorre pela exposição do fator tecidual formando o primeiro complexo hemostático

com o fator VIIa. Este complexo, fator tecidual – fator VIIa, ativará dois zimogênios

presentes na corrente sanguínea, fator X e fator IX, em enzimas funcionais, fator Xa

e fator IXa respectivamente. O fator Xa complexado com fosfolipídios, íons cálcio e

fator Va ativa a protrombina em trombina que terá participação em diversos pontos

do processo hemostático. A amplificação da formação desse complexo, através do

aumento de fator X ativado, dá-se através da sua ativação pelo complexo fator IXa,

fosfolipídios, íons cálcio e fator VIIIa (Dahlbäck, 2000).

A trombina é a única enzima que atua na clivagem do fibrinogênio, proteína

solúvel no plasma, formando monômeros de fibrina que interagem entre si, por

ligações eletrostáticas, formando uma rede insolúvel e instável que será consolidada

pela ação do fator XIIIa, sendo este, também, ativado pela trombina. Esta rede de

fibrina estabiliza o agregado de plaquetas formado sobre a injúria vascular

(Dahlbäck, 2000; Gentry, 2004).

3

Além disso, a trombina ativa os fatores V, VIII, XI e plaquetas. Sua ação em

plaquetas e em outras proteínas da coagulação mostra que a trombina é capaz de

amplificar a hemostase primária e sua própria formação respectivamente (Gentry,

2004).

Figura 1. Esquema representativo da cascata de coagulação. Início da formação do

trombo após a injúria vascular e exposição do fator tecidual para a circulação sangüínea.

Trombina mostra um papel central exercendo regulação positiva, ativando outras proteínas

procoagulantes e plaquetas.

Além de possuir atividade pró-coagulante, a trombina, também, possui

atividade anticoagulante. Isto ocorre através da interação da trombina com a

trombomodulina (Esmon, 1989), uma glicoproteína de membrana encontrada na

superfície de células endoteliais (Mathews e col., 1994). Esta interação acontece

com a ligação da trombomodulina que possui seis domínios similares ao fator de

crescimento epidermal (EGF 1 – 6). Estes domínios ligam-se numa região da

CO

Á

GULO

DE FIBRINA

XIII

a

FIBRINOGÊNIO

POL

Í

MERO

DE FIBRINA

FPA,FPB

XI

XIa

VIII

V

VIII

a

IX

a

PL + Ca

+2

IX

FATOR TECIDUAL

+

VIIa

X

PROTROMBINA

TROMBINA

Xa

V

a

PL + Ca

+2

PLAQUETAS

ATIVA

Ç

ÃO/

AGREGA

Ç

ÃO

CO

Á

GULO

DE FIBRINA

XIII

a

FIBRINOGÊNIO

POL

Í

MERO

DE FIBRINA

FPA,FPB

XI

XIa

VIII

V

VIII

a

IX

a

PL + Ca

+2

IX

FATOR TECIDUAL

+

VIIa

X

PROTROMBINA

TROMBINA

Xa

V

a

PL + Ca

+2

PLAQUETAS

ATIVA

Ç

ÃO/

AGREGA

Ç

ÃO

4

trombina carregada positivamente, conhecida como exosítio 1, provocando uma

mudança conformacional no seu sítio catalítico (Mathews e col., 1994). Esta

mudança conformacional altera a preferência catalítica pelo seu substrato,

fibrinogênio, pela proteína C (Ye e col., 1992). A proteína C, quando ativada pelo

complexo trombina-trombomodulina, associa-se com a proteína S, inativando

proteoliticamente os fatores Va e VIIIa (figura 2). Com a inibição dos cofatores, os

fatores Xa e IXa não atuam eficientemente nos complexos, diminuindo, assim, a

presença de trombina na circulação sangüínea (Esmon, 2005).

Figura 2. Inibição da coagulação pela ativação da proteína C. Trombomodulina, presente

no endotélio celular, liga-se com a trombina circulante nas células intactas passando a ativar

a proteína C. A proteína C ativada forma um complexo com a proteína S na membrana das

células endoteliais inativando os fatores Va e VIIIa resultando, assim, a inibição do processo

procoagulante (adaptada de Dahlbäck, 2000).

1.2. ESTRUTURA E ESPECIFICIDADE DA TROMBINA

A trombina é uma serino-protease pertencente à família da tripsina, formada

por duas cadeias polipeptídicas unidas por uma ligação disulfeto. A cadeia A é

constituída por 36 resíduos de aminoácidos de ~4.600 Da e enquanto a cadeia B é

constituída por 259 resíduos de aminoácidos de ~32.000 Da (Fenton e col., 1977;

Bode e col., 1992).

Proteína

Trombomodulina

Proteína

Trombomodulina

5

Os resíduos de aminoácidos responsáveis pela especificidade da trombina

estão localizados na cadeia B da enzima e as suas posições são equivalentes as do

quimiotripsinogênio bovino, uma vez que cadeia B tem sua estrutura tridimensional

similar a do quimiotripsinogênio bovino (Bode e col., 1989).

Apesar de a trombina possuir atividade catalítica sobre vários substratos, ela

apresenta uma alta especificidade na sua hidrólise. Esta especificidade deve-se, em

parte, pelo seu sítio catalítico, onde está localizada a tríade catalítica composta pelos

resíduos de aminoácidos serina na posição 195, histidina na 57 e ácido aspártico na

102 (Stubbs e Bode, 1993; Bode e col., 1992). Adjacentes à tríade catalítica, estão

os subsítios, formados por resíduo de aminoácido ou por grupos de resíduos de

aminoácidos que interagindo com os resíduos de aminoácidos do substrato

proporcionam uma seletividade na atividade catalítica da enzima, ocasionando

assim, um aumento na eficiência catalítica da enzima para determinados substratos

(figura 3A) (Stubbs e Bode, 1993; Page e col., 2005). Na nomenclatura sugerida por

Schechter e Berger, citados por Page e colaboradores (2005), os subsítios da

enzima são representados pela letra “S” e os resíduos do substrato são

representados pela letra “P”. Os resíduos associados ao lado N-terminal do

substrato, a partir do sítio de clivagem, são denominados em P

1

, P

2

, P

3

..... P

n

,

respectivamente, os subsítios que interagem com os resíduos são denominados de

S

1

, S

2

, S

3

..... S

n

. Os resíduos ao lado C-terminal do substrato, a partir do sítio de

clivagem, são denominados em P

1

´, P

2

´, P

3

´..... P

n

´ interagindo com os seus

respectivos subsítios S

1

´, S

2

´, S

3

´..... S

n

´(figura 3B).

O primeiro subsítio S

1

é idêntico ao da tripsina, com o ácido aspártico na

posição 189 responsável pela interação com a arginina na posição P

1

do substrato

(Stubbs e Bode, 1993, Chirgadze e col., 2000). O subsítio S

2

é composto pelos

6

resíduos histidina na posição 57, serina na 214, leucina na 99, tirosina na 60A,

prolina na 60B, prolina na 60C, triptofano na 60D (seqüência da alça 60), ácido

glutâmico na 146, treonina na 147 e triptofano na posição 148 (Stubbs e Bode, 1993;

Le Bonniec e col., 1993; Le Bonniec e col., 1994). Alguns artigos mostram que

quando a seqüência da alça 60 e a seqüência ácido glutâmico 146, treonina 147 e

triptofano 148 são deletados da trombina, sua atividade catalítica diminui devido à

modificação no subsítio S

2

(Le Bonniec e col., 1993; Le Bonniec e col., 1994).

Figura 3. Esquema representativo da trombina e dos subsítios. (A) Esquema estrutural

da trombina. (B) Esquema da interação dos subsítios da trombina aos respectivos

aminoácidos do seu substrato. (C) Resíduos de aminoácidos que formam os subsítios.

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

1

´

S

2

´S

3

´

S

3

P

3

P

2

P

1

P

2

´P

1

´

P

3

´

H

2

N

CO

2

H

3A

3B

Cadeia A

Cadeia B

Tríade Catalítica

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

3

S

1

´

S

2

´S

3

´

+

Exosítio 1Exosítio 2

SS

Fenda

Catalítica

Asp 189

His 57, Ser 214, Leu 99, alça 60 (Tyr 60A, Pro 60B,Pro

60C, Trp 60D), Glu 146, Thr 147 e Trp 148

Glu 39

Lys 60F

Gln 51, Arg 73

Glu 192

S

1

S

1

´

S

2

S

2

´

S

3

S

3

´

3C

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

1

´

S

2

´S

3

´

S

3

P

3

P

2

P

1

P

2

´P

1

´

P

3

´

H

2

N

CO

2

H

3A

3B

Cadeia A

Cadeia B

Tríade Catalítica

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

3

S

1

´

S

2

´S

3

´

+

Exosítio 1Exosítio 2

SS

Fenda

Catalítica

Cadeia A

Cadeia B

Tríade Catalítica

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

3

S

1

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S

2

´S

3

´

+

Exosítio 1Exosítio 2

SS

Cadeia A

Cadeia B

Tríade Catalítica

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

3

S

1

´

S

2

´S

3

´

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

3

S

1

´

S

2

´S

3

´

S

195

H

57

D

102

S

1

S

2

S

3

S

1

´

S

2

´S

3

´

+

Exosítio 1Exosítio 2

SS

Fenda

Catalítica

Asp 189

His 57, Ser 214, Leu 99, alça 60 (Tyr 60A, Pro 60B,Pro

60C, Trp 60D), Glu 146, Thr 147 e Trp 148

Glu 39

Lys 60F

Gln 51, Arg 73

Glu 192

S

1

S

1

´

S

2

S

2

´

S

3

S

3

´

Asp 189

His 57, Ser 214, Leu 99, alça 60 (Tyr 60A, Pro 60B,Pro

60C, Trp 60D), Glu 146, Thr 147 e Trp 148

Glu 39

Lys 60F

Gln 51, Arg 73

Glu 192

S

1

S

1

S

1

´S

1

´

S

2

S

2

S

2

´S

2

´

S

3

S

3

S

3

´S

3

´

3C

7

A formação do S

2

por esses resíduos favorece interações com aminoácidos

apolares, particularmente com prolina. Harris e colaboradores (2000) mostram que a

troca de prolina por outros aminoácidos na posição P

2

provoca uma diminuição

drástica da atividade catalítica da trombina. No subsítio S

1

´ está o resíduo lisina na

posição 60F que favorece interação com resíduos pequenos na posição P

1

´, como

glicina, alanina e serina (Stubbs e Bode, 1993; Bode e col., 1989; Costanzo e col.,

2005). Sendo que, na maioria das vezes, nos substratos da trombina, serina é

encontrada nesta posição (tabela 1). Para o subsítio S

2

´ estão presentes os resíduos

glutamina na posição 51 e arginina na posição 73 (Bode e col., 1989). Estes

resíduos proporcionam pouca discriminação para a maioria dos aminoácidos na

posição P

2

´, apresentando uma preferência menor para os resíduos ácidos (Le

Bonniec e col., 1996; Marque e col., 2000).

Ambos subsítios S

3

e S

3

´ possuem resíduos ácidos, ácido glutâmico na

posição 39 e ácido glutâmico na posição 192 respectivamente (Stubbs e Bode,

1993; Le Bonniec e Esmon, 1991; Le Bonniec e col., 1991). Ambas regiões têm

pouca ação na especificidade da trombina com seus substratos fisiológicos e

sintéticos (Marque e col., 2000; Le Bonniec e col., 1996). Porém, estes subsítios

limitam a catálise da trombina para a proteína C (Le Bonniec e Esmon, 1991; Le

Bonniec e col., 1991).

8

Tabela 1 – Ponto de clivagem dos substratos da trombina.

Substrato Seqüência P

3

P

2

P

1

- P

1

´ P

2

´ P

3

´

Receptor PAR 1 (Arg

41

) DPR-SFL

Fator V (Arg

1018

) SPR-TFH

Fator V (Arg

709

) GIR-SFR

Fator VIII (Arg

1689

) SPR-SFQ

Fator VIII (Arg

740

) EPR-SFS

Protrombina (Arg

155

) TPR-SEG

Protrombina (Arg

284

) NPR-TFG

Fibrinogênio Aα (Arg

16

) GVR-GPR

Fibrinogênio Aα (Arg

19

) GPR-VVE

Fibrinogênio Bβ (Arg

14

) SAR-GHR

Fator XIII (Arg

36

) VPR-GVK

Proteína C (Arg

169

) DPR-LID

Trombina (Arg

15

) DGR-IVE

Adaptada de Stubbs e Bode, 1993 e Le Boniec e col., 1996

A atividade catalítica da trombina é extremamente baixa frente a proteína C,

devido à presença de resíduos de ácido aspártico nas posições P

3

e P

3

´ (Stubbs e

Bode, 1993). No entanto, quando a trombina interage com a trombomodulina sua

atividade frente a proteína C aumenta (Ye e col., 1991; Musci e col., 1988). Este

aumento na atividade é devido à modificação na posição dos resíduos ácidos dos

subsítios no momento da interação. O ácido glutâmico 39 é deslocado da sua

posição e o ácido glutâmico 192 cede sua posição para a aproximação da arginina

35 (Stubbs e Bode, 1993).

9

Após a descoberta da estrutura da trombina, acreditava-se que a cadeia A

não participava na atividade enzimática. Entretanto, trabalhos recentes mostraram

que a cadeia A é importante para a atividade catalítica da trombina. No trabalho de

De Cristofaro e colaboradores (2004), identificou-se que a deleção da lisina na

posição 9 da cadeia A provoca uma desestruturação no sítio catalítico, onde os

resíduos que fazem parte da tríade catalítica e dos subsítios ficam mais afastados

entre si proporcionando, assim, diminuição na atividade amidolítica da enzima. Em

testes com mutações da cadeia A, foram encontrados outros resíduos relevantes

como os resíduos Arg4-Glu8-Asp14-Glu14c que são responsáveis pelas interações

intra e inter-molecualres e pelo reconhecimento de substratos. Estes resíduos são

considerados importantes para estabilização com a cadeia B (Papaconstantinou e Di

Cera, 2008).

A trombina possui duas regiões, além do sítio catalítico, capazes de governar

sua especificidade. Estas regiões, denominadas de exosítio 1 e exosítio 2, formadas

principalmente por resíduos de arginina e lisina, são essencialmente carregadas

positivamente (Guillin e col., 1995; Stubbs e Bode, 1993). Os exosítios ficam

distantes do sítio catalítico e entre si (figura 3A) e são responsáveis pela interação

da trombina com moléculas ligantes a essas regiões e seus substratos

macromoleculares (Guillin e col., 1995; Meh e col., 1996; Esmon e Lollar, 1996).

Cada exosítio liga-se com moléculas distintas, o que se dá principalmente por

interações eletrostáticas (Warkentin, 2004). O exosítio 1 tem maior participação na

especificidade da enzima e na eficiência catalítica. Todas as interações da trombina

com seus substratos macromoleculares se dão através do exosítio 1, além disso

este sítio interage com alguns inibidores e outros ligantes (Warkentin, 2004;

Francischetti e col., 1997; Mathews e col., 1994; Esmon e Lollar, 1996). A interação

10

com o exosítio 1 provoca uma mudança conformacional no sítio catalítico da

trombina, ocasionando uma mudança na sua atividade catalítica, sendo esta

atividade positiva ou negativa dependendo do substrato (Monteiro e col., 1999). Por

outro lado, a ação inibitória das moléculas que interagem neste sítio é de

competição com os substratos macromoleculares, impedindo-os que tenham uma

interação satisfatória ao exosítio 1 e diminuindo a taxa de hidrólise da trombina

(Warkentin, 2004; Francischetti e col., 1997; Zingali e col., 1993).

Tabela 2 – Relação das moléculas que ligam ao exosítio 1 da trombina.

Molécula Papel na atividade da

trombina

Referência

Fibrinogênio (cadeia Aα) Substrato Binnie e Lord, 1993

PAR 1 Substrato Ossovskaya e col., 2004

Fator V Substrato Esmon e Lollar, 1996

Fator VIII Substrato Esmon e Lollar, 1996

Trombomodulina Ligante Mathews e col., 1994

PAR 3 Ligante Ossovskaya e col., 2004

GPIbα Ligante De Marco e col., 1994

Cofator II de heparina Inibidor Tollefsen, 2007

Hirudina Inibidor Warkentin, 2004

Botrojaracina Inibidor Zingali e col., 1993

Glicirrizina Inibidor Francischetti e col., 1997

Para que a trombina exerça uma ótima atividade pró-coagulante, é

indispensável a presença de cátions monovalentes na estrutura da enzima (Wells e

11

col., 1992). A trombina é capaz de fazer ligações com todos os cátions

monovalentes, no entanto suas constantes cinéticas são melhores na presença de

Na

+

ou K

+

, sendo o sódio o principal cátion para a atividade específica e alostérica

da trombina (Wells e col., 1992; Bah e col., 2006; Gianni e col., 2007).

.

Figura 4. Representação esquemática de múltiplos papéis da trombina no sangue com

a influência do Na

+

. Após a sua ativação, a trombina fica entre a forma lenta, livre de Na

+

(40% da população de moléculas in vivo) e a forma rápida, ligada ao Na

+

(60% da população

de moléculas in vivo). A forma rápida é responsável pela clivagem eficiente do fibrinogênio

para a formação do coágulo e ativação dos fatores V, VIII, e XI que promovem a progressão

da coagulação no vaso danificado. É, também, responsável pela ativação do PAR 1, PAR 3,

e PAR 4 para ativação de plaquetas e sinalização celular. A forma lenta, por outro lado, ativa

eficientemente a proteína C com a associação da trombomodulina (adaptada de Di Cera,

2008).

Anticoagulação

Coagulação

Ativação de

plaquetas, sinalização

Fibrinogênio,

Forma rápida

Forma lenta

Anticoagulação

Coagulação

Ativação de

plaquetas, sinalização

Fibrinogênio,

Forma rápida

Forma lenta

12

Quando a trombina está ligada ao Na

+

, chamada forma rápida, aumenta a sua

atividade catalítica em relação ao fibrinogênio, fator V, fator VIII, fator XI e PAR 1. Na

sua forma lenta, livre de Na

+

, sua atividade diminui, no entanto é favorável para a

ação catalítica sobre a proteína C (Di Cera, 2008; Di Cera, 2004). Estas duas

formas, em condições fisiológicas de NaCl (150 mM), estão significativamente

presentes no plasma, devido à constante de dissociação do íon sódio ser 110 mM a

37 ºC (figura 4) (Di Cera, 2008; Bah e col., 2006; Gianni e col., 2007).

A interação do Na

+

com a trombina é dependente da temperatura e auxilia na

ligação e na hidrólise da enzima com o substrato (Bah e col., 2006; Gianni, e col.,

2007). O sítio de interação do íon sódio está localizado próximo ao sítio catalítico

entre a alça 220 e a alça 186. O Na

+

forma ligações com dois átomos de oxigênio

dos resíduos arginina 221a e lisina 224 e com quatro moléculas de água ancoradas

ao redor dos resíduos do ácido aspártico 189, ácido aspártico 221, glicina 223 e

tirosina 184 (figura 5) (Zhang e Tulinsky, 1997). A ausência de Na

+

causa uma

reorientação dos resíduos serina na posição 195 e ácido glutâmico na posição 192

modificando o substrato alvo da atividade da trombina (Di Cera, 2004, Di Cera,

2008).

13

Figura 5. Sítio de ligação do sódio. Íon sódio representado pelo círculo azul, interação do

Na

+

(linha tracejada verde) com moléculas de água (círculo vermelho) e com átomos de

oxigênio dos resíduos R 221a e K 224. Asp 189 acoplando eletrostaticamente com o resíduo

Arg em P

1

do substrato (adaptada de Di Cera, 2004).

1.3. RECEPTORES PLAQUETÁRIOS

Plaquetas são fragmentos celulares de megacariócitos, com forma discóide,

responsáveis pela resposta primária do processo hemostático (Jackson, 2007). Sua

ação de adesão e agregação é dependente da sua ativação através dos agonistas:

trombina, colágeno, adenosina difosfato (ADP) e tromboxano A2 entre outros

(Jackson, 2007; Mackman, 2008). Quando as plaquetas são ativadas, estas mudam

seu formato discóide para esférico, com emissão de pseudópodes, e expõem seus

receptores (Mackman, 2008).

Colágeno e o fator de von Willenbrand (vWF) são os mediadores da adesão

plaquetária e o fibrinogênio é o mediador da agregação (Mackman, 2008; Marguerie

e col., 1979; Cooper e col., 1979; Clemetson e Clemetson, 2008). Estas moléculas

Substrato

Arg

Substrato

Arg

14

para exercerem suas funções precisam interagir com os seus respectivos receptores

plaquetário: glicoproteínas (GP) Ib, VI e IIb/IIIa (Marguerie e col., 1979; Cooper e

col., 1979; Clemetson e Clemetson, 2008). Além destas interações serem

responsáveis pelo aglomerado plaquetário, elas, também, ativam as plaquetas. No

entanto, sua ativação é eficaz quando a trombina interage com os receptores

ativados por protease (PARs) (Ossovskaya e Bunnett, 2004; Jacques e col., 2000).

1.3.1. PAR E SUA FUNÇÃO

Os receptores ativados por protease (PAR) são responsáveis pela resposta

plaquetária por meio da ação da trombina. Existem quatro receptores pertencentes à

família dos receptores atrelados à proteína G. Eles apresentam 425 resíduos de

cadeia única, contendo um amino-terminal extracelular com 75 resíduos de

aminoácidos, sete domínios hidrofóbicos transmembrana e uma porção carboxi-

terminal intercelular (figura 6) (Ossovskaya e Bunnett, 2004). Os receptores do tipo

PAR estão distribuídos em plaquetas de espécies diferentes, além de serem

encontrados em membranas de células endotelial, neurônios, miócitos, astrócitos,

entre outras (Ossovskaya e Bunnett, 2004; Coughlin, 2000).

15

Figura 6. Localização e mecanismo de ativação do receptor PAR 1. A trombina ativa o

PAR 1 em dois processos: primeiro, ela liga à porção C-terminal semelhante à hirudina da

posição extracelular e em seguida, a enzima cliva a porção N-terminal formando um novo N-

terminal que ativará o receptor (adaptada de Ossovskaya e Bunnett, 2004).

Cada receptor é ativado por enzimas específicas, o que provocará uma

resposta celular característica da célula ativada (tabela 3) (Ossovskaya e Bunnett,

2004). No caso das plaquetas humanas, elas são ativadas pelos receptores PAR 1 e

PAR 4 através da trombina. Entretanto, a ativação ocorre efetivamente com o PAR

1, sendo necessárias concentrações mínimas (picomolar) de trombina, enquanto que

para a ativação através do PAR 4 as concentrações de trombina são da ordem de

micromolar (Ossovskaya e Bunnett, 2004; Jacques e col., 2000). Entretanto, mesmo

a trombina apresentando uma atividade de hidrólise diminuída com o PAR 4, o

receptor é um auxiliar na ativação da plaqueta (Jacques e col., 2000; Coughlin,

2000; Vu e col., 1991).

Trombina

Sinal da

Transdução

Novo N-terminal

Seqüência C-terminal

semelhante ao da hirudina

que interage ao exosítio 1

Trombina

Sinal da

Transdução

Novo N-terminal

Seqüência C-terminal

semelhante ao da hirudina

que interage ao exosítio 1

Novo N-terminal

Seqüência C-terminal

semelhante ao da hirudina

que interage ao exosítio 1

16

Tabela 3 – Seqüência e enzimas agonistas dos receptores PARs.

Receptor Seqüência N-terminal Enzimas Agonistas

PAR 1

38

LDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK

61

Trombina, fator Xa, proteína C

ativada, tripsina

PAR 2

31

SKGRSLIGKVDGTSHVTGKGVTVETC

56

Tripsina, triptase, fator VIIa, fator

Xa, proteinase-3, elastase,

catepsina-G

PAR 3

35

LPIKTFRGAPPNSFEEFPFSALEEGW

60

Trombina

PAR 4

44

PAPRGYPGQVCANDSDTLELPDSSRA

69

Trombina, tripsina, catepsina-G

Adaptada de Ossovskaya e Bunnett, 2004.

A afinidade e atividade da trombina frente ao PAR 1 se deve ao sítio de

hidrólise da porção N-terminal extracelular, LDPR

41

S

42

FLL, e pela interação da

porção C-terminal do receptor,

50

DKYEPFWEDEEK

61

, com o exosítio 1 da trombina

(tabela 3) (Ossovskaya e Bunnett, 2004; Vu e col., 1991). Esta seqüência, quando

ligada à trombina, direciona sua especificidade aumentando sua eficiência catalítica

no ponto de hidrólise (Jacques e col., 2000). A porção C-terminal contém uma

seqüência, DKYEPF, que é semelhante à seqüência C-terminal da hirudina. Desta

seqüência, os resíduos tirosina na posição 52, ácido glutâmico na 53 e fenilalanina

na 55 promovem interação específica e importante no complexo trombina – PAR 1,

sendo que a tirosina 52, particularmente, é vital para esta interação (Vu e col., 1991).

Uma seqüência adjacente, apesar de conter três resíduos negativos de ácido

17

glutâmico e ácido aspártico, não demonstra papel importante nessa interação (Vu e

col., 1991).

Após o reconhecimento da enzima com o domínio extracelular do receptor e a

trombina clivar o seguimento N-terminal do receptor, é formado um novo N-terminal

que se associa na alça do receptor causando a sinalização transmembranar (figura

6) (Coughlin, 2000; Ossovskaya e Bunnett, 2004).

1.4 INIBIDORES DA TROMBINA

A terapia anticoagulante e antitrombótica é, até hoje, baseada em três

agentes principais: heparina, heparina de baixo peso molecular e antagonistas da

vitamina K (Becker e col., 1999; Ansell, 2005). Apesar de serem utilizados com

freqüência, estes agentes apresentam limitações no tratamento. Eles não são

seletivos e se não forem monitorados constantemente podem provocar hemorragias

(Becker e col., 1999; Ansell, 2005).

Novos inibidores estão sendo estudados e desenvolvidos, tendo como alvo

específico a trombina, cada um com diferentes mecanismos de interação na enzima

(Kathiresan e col., 2002; Warkentin, 2004), como exemplo, argatroban, inibidor

químico que liga somente no sítio catalítico da trombina (Kathiresan e col., 2002).

Hirudina interage tanto no sítio catalítico quanto no exosítio 1 (Warkentin, 2004) e

outras moléculas em estudo, botrojaracina e glicirrizina, ambas com ações no

exosítio 1 da trombina (Francischetti e col., 1997; Zingali e col., 1993).

18

1.4.1 GLICIRRIZINA

Glicirrizina (GL) é uma substância, com importância toxológica, extraída da

raiz da planta leguminosa, Glycyrrhiza glabra, composta por uma molécula do ácido

glicirrético e duas moléculas do ácido glicurônico com massa molecular de 840 Da

(Dixon e Sumner, 2003).

Inicialmente, a glicirrizina foi caracterizada como antiinflamatório e,

posteriormente, como antialérgico, antiviral e anti-cancerígeno (Vlietinck e col., 1997;

Klass e Offerman, 2005; Koga e col., 2007). Mais tarde, estudos feitos por

Francischetti e colaboradores (1997) mostraram que a glicirrizina, também, possui

efeito anticoagulante com ação inibitória na trombina. Sua interação com a trombina

se dá através do exosítio 1, bloqueando a hidrólise do fibrinogênio e inibindo a

agregação de plaquetas com uma constante de inibição de 240 µM (Francischetti e

col., 1997). No entanto, sua inibição acontece somente com substratos

macromoleculares como o fibrinogênio e o PAR 1, visto que para substratos

pequenos, onde a interação com a enzima ocorre somente no sítio catalítico, a

glicirrizina é um modulador positivo para trombina (Francischetti e col., 1997).

Experimentos in vivo validaram os estudos de Francischetti na atividade anti

trombótica da glicirrizina. In vivo, observou-se diminuição do trombo induzido e

aumento no tempo de sangramento (Mendes-Silva e col., 2003). A substância

apresentou a capacidade de neutralização do veneno de Bothrops jararaca no

sistema hemostático (Assafim e col., 2006). O tempo de hemorragia induzido pelo

veneno foi reduzido com doses de glicirrizina. Isto supõe que a glicirrizina pode inibir

enzimas similares à trombina (Assafim e col., 2006).

19

1.4.2. BOTROJARACINA

Botrojaracina (BJC) é uma proteína isolada do veneno da serpente Bothrops

jararaca, formada por duas cadeias de peptídeos de 13.000 Da e 15.000 Da, ligadas

por uma ligação disulfeto. Seu ponto isoelétrico é de 4,2 e suas duas cadeias são

80% e 60% homólogas à botrocetina, logo a botrojaracina foi classificada na família

das proteínas semelhantes a lectinas tipo C (Zingali e col., 1993).

Essa molécula apresenta propriedade anticoagulante, sendo o primeiro

inibidor específico da trombina isolado do veneno de serpente (Zingali e col., 1993).

A interação da botrojaracina com a trombina é eletrostática em ambos exosítios,

sendo que no exosítio 1 a sua ação é mais significativa. Sua inibição é competitiva,

com constante de inibição de 15 nM, para os substratos que interagem no exosítio 1.

(Zingali e col., 1993; Arocas e col., 1996; Monteiro e col., 1999).

Quando a botrojaracina está complexada com a enzima, ela impede que

outras moléculas possam interagir com o exosítio 1 para que tenham uma atividade

catalítica eficaz. Assim, a atividade fibrinogenolítica e a ativação plaquetária pela

trombina são inibidas por causa do impedimento da ligação da cadeia Aα do

fibrinogênio e do receptor plaquetário PAR 1, respectivamente, com o exosítio 1,

pela botrojaracina (Arocas e col., 1996; Monteiro e col., 1999; Zingali e col., 1993).

Também foi demonstrado que a BJC impede a ativação de trombina pela interação

da protrombina através do proexosítio 1, um precursor do exosítio 1, impedindo,

assim, a interação do complexo fator Xa/Va com a protrombina, além da diminuição

de fator Va ativado pela trombina (Monteiro e Zingali, 2000; Zingali e col., 2005;

Arocas e col., 1998; Anderson e col., 2000).

20

Como a glicirrizina, a ação inibitória da botrojaracina sobre a trombina

acontece quando esta interage com os substratos macromoleculares. Para

substratos curtos, que interagem no sítio catalítico da trombina, o complexo formado

com a trombina e a botrojaracina pode modular a atividade da enzima, tanto positiva

quanto negativamente. Esta característica da atividade dependerá da interação do

sítio catalítico mudado com seqüências dos resíduos de aminoácidos de cada

substrato (Monteiro e col., 1999). Esta mudança é dada pela modulação do sítio

catalítico que é exposto para o meio externo no momento do complexo trombina –

botrojaracina (Monteiro e col., 1999) .

1.5. EMPREGO DOS SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS BASEADOS

NA SEQÜÊNCIA DO PAR 1

Com a finalidade de avaliar a atividade da trombina com substratos que

interagissem com o subsítios e com o exosítio 1 da enzima, substratos fluorogênicos

foram sintetizados pelos professores Maria Juliano e Luiz Juliano do Departamento

de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo – Unifesp. Foram sintetizados

dois grupos de substratos (figura 7), o primeiro grupo com substratos de 26 resíduos

de aminoácidos e o segundo grupo com substratos de 11 resíduos de aminoácidos,

ambos baseados na seqüência do receptor plaquetário PAR 1

(

38

LDPRSFLLRNKNDKYEPFWEDEEKN

62

). Cada grupo contém quatro seqüências

diferenciadas na posição P

3

´, onde o resíduo original do receptor é leucina, foi

trocado por resíduos de aminoácidos com características ácido, básico e apolar.

A seqüência N-terminal do PAR 1 foi escolhida, devido a uma melhor

eficiência de hidrólise da enzima sobre este receptor. Além disso, a seqüência N-

21

terminal do PAR 1, fora o sítio de clivagem, contém, também, a seqüência que liga

ao exosítio 1 da trombina. Diferente do receptor PAR 4, que apresenta, somente, o

sítio de clivagem, sendo assim, este receptor não seria adequado para a interação

simultânea com os subsítios e com o exosítio 1.

Figura 7. Esquema dos substratos fluorogênicos. Representação esquemática dos

substratos com o fluoróforo (doador), ácido orto-aminobenzóico (Abz), ligado no lado N –

terminal e o aceptor (supressor), Etilenodinitrofenil (EDDnp) e dinitrofenil (Dnp), no lado C –

terminal dos substratos de 26aa e 11aa respectivamente. A letra “X” representa os

diferentes resíduos de aminoácidos na posição P

3

´: resíduo ácido (ácido aspártico), resíduo

básico (arginina), resíduos apolares (alanina e prolina). No substrato de 26aa, destacado em

vermelho, é a seqüência C – terminal do receptor PAR 1. O resíduo de glutamina foi usado

no C-terminal como estratégia de síntese para ligar o EDDnp com a seqüência.

O monitoramento em tempo real da atividade enzimática é dada através do

desenvolvimento, pelo grupo dos professores Maria Juliano e Luiz Juliano, de

moléculas ligadas no amino e carboxi-terminal do substrato causando supressão

interna de fluorescência. Assim, esta estratégia aumenta a capacidade de detecção

e identificação dos fragmentos gerados pela ação enzimática.

A transmissão de fluorescência funciona pelo modelo de FRET, onde um

fluoróforo excitado transfere sua energia de excitação para um aceptor (supressor),

sendo que esta transmissão não é mediada por contato direto (Föster, 1948).

NH

2

O

LDPRSFXLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

Abz

EDDnp

NH

2

O

LDPRSFXLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

2

O

NH

2

O

LDPRSFXLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

Abz

EDDnp

NH

2

O

LDPRSFXLRNK NO

2

NO

2

NH

Abz

Dnp

NH

2

O

LDPRSFXLRNK NO

2

NO

2

NH

2

O

NH

2

O

LDPRSFXLRNK NO

2

NO

2

NH NO

2

NO

2

NH

Abz

Dnp

22

Quando ocorre a clivagem da ligação peptídica, o supressor se distancia do doador

que passa a liberar a energia de emissão, aumentando, assim, a intensidade de

fluorescência (figura 8).

Com os substratos fluorogênicos, nós podemos averiguar nossas indagações

sobre a influência mútua entre o subsítio S

3

´ e o exosítio 1 da trombina.

23

2 OBJETIVOS

24

2.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral é estudar a atividade da trombina em relação à estrutura dos

substratos fluorogênicos capazes de se ligaram ao exosítio 1.

25

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Avaliar os parâmetros cinéticos da trombina com diferentes aminoácidos na

posição P

3

´ dos substratos fluorogênicos de 11 aa e de 26 aa.

 Avaliar os parâmetros cinéticos da trombina com moduladores do exosítio 1,

botrojaracina e glicirrizina.

 Avaliar o efeito da força iônica na atividade catalítica da trombina sobre os

substratos.

 Avaliar o efeito da interação da seqüência C – terminal do substrato de 26 aa

na atividade catalítica da trombina com o substrato de 11 aa e com o

substrato cromogênico.

26

3. MATERIAL E MÉTODOS

27

3.1. SÍNTESE DOS SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS

Os substratos foram preparados pela síntese de fase sólida com o Fmoc (N-

(9-fluorenil)metóxicorbonil) usando um sintetizador de peptídeo múltiplo automático.

Glutamina foi o resíduo C-terminal usado para os substratos de 26 aa e lisina foi

para os substratos de 11 aa, porque é um requerimento de estratégia para a síntese

(Korkmaz e col., 2008).

A pureza do substrato foi verificada por espectrometria de massa e por

cromatografia de fase reversa. As concentrações dos substratos foram determinados

pela mensuração de absorbância de 365 nm usando ε

365 nm

= 17,300 M

-1

cm

-1

para

EDDnp e Dnp. A tabela 4 mostra as seqüências dos substratos, as massas deles

íntegros e as massas dos substratos hidrolisados pela trombina.

Tabela 4. Seqüências e massas dos substratos íntegros e hidrolisados.

a

Seqüência dos substratos de 26 aa (PAR 1 38 – 63) e dos substratos de 11 aa (PAR 1 38

– 48). Resíduos sublinhados correspondem à seqüência semelhante a da hirudina. Os

resíduos em negrito correspondem à posição P

3

´.

b c

Massas determinadas por

espectrometria de massa.

Seqüência dos substratos fluorogênicos

a

massa

b

Abz-LDPRSFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3681,28 619,51 3061,77

Abz-LDPRSFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3623,07 619,58 3004,08

Abz-LDPRSFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3579,72 619,55 2978,99

Abz-LDPRSFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3605,58 619,57 3023,01

Abz-LDPRSFRLRNK-Dnp 1638,85 619,58 1019,27

Abz-LDPRSFPLRNK-Dnp 1624,66 619,64 1005,32

Abz-LDPRSFALRNK-Dnp 1566,55 619,63 946,23

Abz-LDPRSFDLRNK-Dnp 1642,65 619,63 1023,25

N-terminal C-terminal

Massas da hidrólize

c

Seqüência dos substratos fluorogênicos

a

massa

b

Abz-LDPRSFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3681,28 619,51 3061,77

Abz-LDPRSFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3623,07 619,58 3004,08

Abz-LDPRSFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3579,72 619,55 2978,99

Abz-LDPRSFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp 3605,58 619,57 3023,01

Abz-LDPRSFRLRNK-Dnp 1638,85 619,58 1019,27

Abz-LDPRSFPLRNK-Dnp 1624,66 619,64 1005,32

Abz-LDPRSFALRNK-Dnp 1566,55 619,63 946,23

Abz-LDPRSFDLRNK-Dnp 1642,65 619,63 1023,25

N-terminal C-terminal

Massas da hidrólize

c

28

3.2. ANÁLISE DOS SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS POR HPLC

Os substratos sintetizados ressuspensos em DMSO (dimetilsulfóxido) foram

purificados por HPLC para separar produtos de degradação e o DMSO, pois este

interfere na cristalização da amostra para a análise por espectrometria de massas.

Injetamos 100 µL na concentração de 1,0 mg/mL dos substratos numa coluna de

fase reversa C

18

(CLC – ODS Shimadzu 4,6 x 150 mm) acoplada a um sistema

HPLC, utilizando-se os solventes: solvente A – 0,1% ácido trifluoroacético em água

ultra pura e solvente B – 0,1% ácido trifluoroacético e 90% de acetonitrila em água

ultra pura. A corrida ocorreu durante 60 minutos com as seguintes condições de

gradiente: 0 a 10 min. 10% de solvente B; 10 a 35 min. gradiente de 10 % até 50 %

de solvente B; 35 a 40 min. 50% de solvente B; 40 a 50 min. 100% de solvente B e

50 a 60 min. 10% de solvente B. O fluxo utilizado foi de 1,0 mL/min e a análise do

eluido foi realizada no comprimento de onda de 360 nm.

3.3. HIDRÓLISE DOS SUBSTRATOS E ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE

MASSAS

Depois de coletados os picos no HPLC, a integridade das massas foi

analisada por espectrometria de massas. Para este experimento, utilizamos 0,5 µL

das amostras misturados com 0,5 µL de solução matriz, ácido α – ciano – 4 –

hidroxicinâmico para os substratos de 11 aa e ácido sinapínico para os substratos de

26 aa. No final, foi aplicada na placa 1,0 µL da solução com concentração final de

5,5 pmoles. Utilizamos calibração externa com angiotensina I, ACTH (1 – 17 clip)

2094,46 Da, ACTH (18 – 39 clip) 2466,72 Da, ACTH (7 – 38 clip) 3660,19 Da e

29

insulina bovina 5734,59 Da. A intensidade do “laser” foi de 1881 volts no MALTI –

TOF Voyager DE-Pro (Applied Biosystems).

Depois de analisar a integridade dos substratos, verificamos o sítio de

hidrólise dos substratos. Foram utilizadas as mesmas amostras do HPLC, contendo

os substratos íntegros, foram congeladas em nitrogênio líquido, liofilizadas e

ressuspendidas num volume final de 100 µL em tampão (Tris 50 mM, NaCl 150 mM,

CaCl

2

10 mM e PEG 6000 0,1%) em pH 7,5. A concentração final, considerando a

massa coletada, foi de aproximadamente 110 µM e todos os substratos foram

hidrolisados com 100 nM de trombina durante 120 minutos. A hidrólise foi

interrompida adicionando 12 µL de HCl. Em seguida, o produto de hidrólise foi

analisado no espectrômetro de massas de acordo com a metodologia descrita

acima.

3.4. CINÉTICA DE HIDRÓLISE DOS SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS PELA

TROMBINA

3.4.1 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS COM OS SUSBTRATOS

DE 26 aa E 11 aa

Os ensaios enzimáticos com os substratos fluorogênicos foram monitorados

no fluorímetro (Hitachi F – 4500). Foi utilizado cubeta de poli-meta-acrílico contendo

1,0 mL de tampão de reação (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl

2

10 mM e PEG 6000

0,1%) em pH 7,5 à temperatura de 37 °C. A mensuração da hidrólise dos substratos,

(figura 8), foi realizada num comprimento de onda de excitação 320 nm e de

emissão 420 nm. Depois de 1 minuto de incubação da trombina no tampão, a reação

foi disparada com a adição dos substratos. A mensuração da velocidade inicial foi

30

em 5% de hidrólise dos substratos, aproximadamente 50 segundos de reação para

os substratos de 26 aa e 3 minutos para os substratos de 11 aa. Depois de

completado o tempo de hidrólise, era adicionado mais substrato, na mesma cubeta

da reação. Utilizamos doze concentrações de substratos entre 0,05 a 2,2 µM, com

concentrações distintas de trombina, com sítio catalítico titulado, de 0,36 nM para os

substratos de 26 aa e 3,0 nM para os substratos de 11 aa. A conversão de unidades

de fluorescência por segundo para micromoles por segundo foi obtida da curva de

calibração adquirida da hidrólise completa dos substratos. Os valores de K

m

e V

máx

foram calculados a partir da curva de Michaelis – Menten pelo programa Graffit 5.0 e

os valores de K

cat

e K

cat

/K

m

foram calculados pelos dois primeiros parâmetros.

Figura 8. Representação esquemática da liberação da fluorescência. A reação de

hidrólise é mensurada quando o fluoróforo (Abz) se afasta do supressor (EDDnp ou Dnp)

aumentando, assim, a intensidade de fluorescência.

aa

aaaa

NH

2

O

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

aa

aaaa

NH

2

O

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

Enzima

Fluoróforo

Supressor

aaaa

aaaaaaaa

NH

2

O

NH

2

O

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

aaaa

aaaaaaaa

NH

2

O

NH

2

O

NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH NO

2

NO

2

NH(CH

2

)

2

NH

Enzima

Fluoróforo

Supressor

31

3.4.2. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS COM PRESENÇA DE

GLICIRRIZINA E BOTROJARACINA

A atividade enzimática da trombina com os substratos fluorogênicos na

presença de glicirrizina e botrojaracina foi monitorada no fluorímetro (Hitachi F –

4500). Foi utilizada uma cubeta de poli-meta-acrílico contendo 1,0 mL de tampão de

reação (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl

2

10 mM e PEG 6000 0,1%) em pH 7,5 à

temperatura de 37 °C. Antes de disparar a reação com o substrato, a enzima foi

incubada com glicirrizina ou botrojaracina durante 5 minutos no tampão de reação a

37 °C. As concentrações, 15 nM de botrojaracina e 240 µM de glicirrizina, foram

utilizadas de acordo com as suas constantes de inibição (K

i

) determinadas pelos

trabalhos de Zingali e colaboradores (1993) e de Francischetti e colaboradores

(1997) respectivamente. As condições para o ensaio enzimático foram as mesmas

utilizadas no item 3.4.1.

3.4.3. EFEITO DA FORÇA IÔNICA NA ATIVIDADE DA TROMBINA

As condições para o ensaio enzimático foram as mesmas utilizadas no item

3.4.1. O ensaio foi realizado em 1,0 mL de tampão de reação (Tris 50 mM, CaCl

2

10

mM e PEG 6000 0,1%) em pH 7,5 à temperatura de 37 °C. A reação enzimática

ocorreu em condições diferenciadas na presença de concentrações de NaCl e ChCl

de 0, 80, 150, 300, 500 e 700 mM. Os substratos que contêm o resíduo de prolina na

posição P

3

´ foram utilizados para o ensaio enzimático, por ser um resíduo neutro.

32

3.5. DETERMINAÇÃO DA VELOCIDADE ENZIMÁTICA

As velocidades enzimáticas da trombina com os substratos fluorogênicos

foram monitoradas no fluorímetro (Hitachi F – 4500). A reação ocorreu em 1,0 mL de

tampão contendo Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl

2

10 mM e PEG 6000 0,1%,

utilizando uma cubeta de poli-meta-acrílico em pH 7,5 a 37 °C. A monitorização da

reação foi em intensidade de fluorescência vs o tempo, foi calculado a partir do λ

Ex

320 nm e λ

Em

420 nm. Uma concentração fixa dos substratos foi utilizada (1,5 µM)

na presença de 0,4 nM e 0,8 nM de trombina para os substratos de 26 aa e de 11

aa respectivamente. O tempo de reação foi de 7 minutos, após a adição dos

substratos. A velocidade inicial foi calculada em 5% de hidrólise dos substratos pela

regressão linear no programa SigmaPlot 8.0. Os valores da velocidade foram

transformados em velocidade relativa, onde a velocidade mais alta foi dotada como

100%.

3.6. ANÁLISE DA INTERAÇÃO DA SEQUÊNCIA C – TERMINAL DO SUBSTRATO

DE 26 aa COM O EXOSÍTIO 1

Para esta análise, foi sintetizada a seqüência

50

DKYEPFWEDEEKNQ

63

,

identificada como 0714 D, referente ao C – terminal do substrato de 26 resíduos de

aminoácidos. A eficiência catalítica foi mensurada pelo ensaio enzimático com

ambos substratos que contêm resíduo de arginina na posição P

3

´. Concentrações do

peptídeo 0714 D no ensaio com substrato de 26 aa foram 0,003, 0,02 e 2 µM e para

o ensaio com o substrato de 11 aa, as concentrações foram 0,03, 0,06, 0,3 e 2 µM.

Os ensaios cinéticos com as concentrações dos substratos e da trombina e a análise

33

dos parâmetros cinéticos foram as mesmas do item 3.4.1. O tampão de reação

utilizado foi Tris 50 mM, CaCl

2

10 mM e PEG 6000 0,1% em pH 7,5 à 37 °C. As

atividades foram mensuradas no fluorímetro (F – 4500, Hitachi) com comprimento de

onda de excitação 320 nm e de emissão 420 nm.

Para o ensaio enzimático com substrato cromogênico, o substrato utilizado foi

H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238) da Chromogenix. A reação foi realizada em placa de

96 poços com concentrações de 0,8 a 100 µM de substrato e 50 pM de trombina. O

tampão utilizado foi Tris 50 mM, CaCl

2

10 mM e PEG 6000 0,1% em pH 7,5 à 37 °C

e a reação foi mensurada no espectrofotômetro de placa (SpectraMax, Molecular

Device) com comprimento de onda de absorção de 405 nm. A mensuração da

velocidade inicial foi em 5% de hidrólise do substrato e a conversão de micromoles

por segundo foi utilizando o coeficiente de extinção molar de 8600 M

-1

cm

-1

conforme

artigo de Hortin e colaboradores (2001). Os valores de K

m

e V

máx

foram calculados a

partir da curva de Michaelis – Menten pelo programa Graffit 5.0 e os valores de K

cat

e

K

cat

/K

m

foram calculados a partir dos dois primeiros parâmetros.

34

4 RESULTADOS

35

4.1. ANÁLISE DA INTEGRIDADE DOS SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS

Os substratos, sintetizados no laboratório dos professores Maria e Luiz

Juliano, foram purificados em coluna de fase reversa em sistema de HPLC (figura 9),

a fim de retirar possíveis produtos de degradação e o DMSO, para posterior análise

por espectrometria de massas.

Figura 9. Análise cromatográfica dos substratos fluorogênicos por HPLC. Uma

coluna C

18

(SuperPac Sephasil 5 µm, 4,0 mm x 250 mm, marca Pharmacia) foi

usada para purificação dos substratos. Foram utilizados os solventes denominados

A (0,1% ácido trifluoroacético) e B (0,1% ácido trifluoroacético e 90% de acetonitrila).

O gradiente utilizado para análise foi descrito a seguir: 0 a 10 minutos: 10% solvente

B; 10 a 35 minutos: gradiente de solvente B 10 a 50%; 35 a 40 minutos: 50%

solvente B; 40 a 50 minutos: 100% solvente B e 50 a 60 minutos: 10% solvente B.

Fluxo de 1 mL/min. (1) Análise dos substratos de 26 aa com P

3

´ (A) -R-; (B) -D-; (C) -

P-; (D) -A-. (2) Análise dos substratos de 11 aa com P

3

´ (E) -R-; (F) -D-;(G) -P-; (H) -

A-.

Os tempos de retenção de cada substrato foram próximos entre eles, com os

tempos aproximados, para os substratos de 26 aa, de 28 minutos para o resíduo de

prolina na posição P

3

´, 28,2 minutos para o resíduo de alanina, 28,4 minutos para o

resíduo de arginina e 28,8 minutos para o resíduo de ácido aspártico. Para os

substratos de 11 aa, os tempos foram de 30,8 minutos para o resíduo de arginina na

posição P

3

´, 32,2 minutos para o resíduo de ácido aspártico, 32,6 minutos para o

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Time (min.)

Absorbance

λ

λ = 360 nm

A

B

C

D

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

E

F

G

H

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Time (min.)

Absorbance

λ

λ = 360 nm

A

B

C

D

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Time (min.)

Absorbance

λ

λ = 360 nm

A

B

C

D

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

E

F

G

H

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

E

F

G

H

Absorbância

λ = 360 nm

Absorbância

λ = 360 nm

Tempo (min.) Tempo (min.)

1

2

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Time (min.)

Absorbance

λ

λ = 360 nm

A

B

C

D

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

E

F

G

H

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Time (min.)

Absorbance

λ

λ = 360 nm

A

B

C

D

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Time (min.)

Absorbance

λ

λ = 360 nm

A

B

C

D

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

E

F

G

H

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Absorbance

λ

λ = 360 nm

Time (min.)

E

F

G

H

Absorbância

λ = 360 nm

Absorbância

λ = 360 nm

Tempo (min.) Tempo (min.)

1

2

36

resíduo de prolina e 32,8 minutos para o resíduo de alanina. A pequena diferença no

tempo de retenção entre os substratos é devido à substituição de somente um

resíduo de aminoácido em P

3

´. Nós verificamos que os picos menores adjacentes

aos picos centrais não resultavam da degradação dos substratos, sendo confirmado,

mais adiante, pela análise no espectrômetro de massas. Assim, esses picos

adjacentes podem ser algum tipo de contaminante.

4.2. ANÁLISE DAS MASSAS E DETERMINAÇÃO DO SÍTIO DE HIDRÓLISE DOS

SUBSTRATOS FLUOROGÊNICOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS.

Depois de coletar os substratos purificados, confirmamos a integridade dos

mesmos por espectrometria de massas, cujos espectros estão mostrados nas

figuras 10 e 11. Os resultados não mostram indícios de degradação dos substratos e

as massas obtidas estão de acordo com as calculadas.

37

500 1200 1900 2600 3300 4000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

2978.9993

619.5505

SFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3595.7554

3579.7267

Abz-LDPRSFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.5091

Abz-LDPR

3061.7774

SFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

3681.2865

Abz-LDPRSFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

100

3697.8887

A

B

C

D

500 1200 1900 2600 3300 4000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

2978.9993

619.5505

SFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

Abz-LDPR

500 1200 1900 2600 3300 4000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

2978.9993

619.5505

SFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3595.7554

3579.7267

Abz-LDPRSFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3595.7554

3579.7267

Abz-LDPRSFALRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.5091

Abz-LDPR

3061.7774

SFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.5091

Abz-LDPR

3061.7774

SFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

3681.2865

Abz-LDPRSFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

100

3697.8887

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

3681.2865

Abz-LDPRSFRLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

100

3697.8887

A

B

C

D

38

Figura 10. Análise das massas dos substratos de 26 aa. Como matriz foi usado

ácido sinapínico. Os espectros das massas dos substratos íntegros, coletados pelo

HPLC, estão representados pelas letras (A); (C); (E) e (G). Os espectros dos

substratos hidrolisados pela trombina estão identificados pelas letras (B); (D); (F) e

(H).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3605.5823

3621.6214

Abz-LDPRSFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

500 1200 1900 2600 3300 4000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3023.0157

SFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

619.5980

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3004.0815

2988.0449

SFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

619.5830

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

Abz-LDPRSFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

3623.0771

3639.0631

E

F

G

H

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3605.5823

3621.6214

Abz-LDPRSFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

500 1200 1900 2600 3300 4000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3023.0157

SFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

619.5980

Abz-LDPR

500 1200 1900 2600 3300 4000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3023.0157

SFDLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

619.5980

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3004.0815

2988.0449

SFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

619.5830

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

3004.0815

2988.0449

SFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

619.5830

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

Abz-LDPRSFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

3623.0771

3639.0631

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

Abz-LDPRSFPLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ-EDDnp

3623.0771

3639.0631

E

F

G

H

39

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1638.8523

1654.8449

1670.8404

Abz-LDPRSFRLRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1035.8296

619.5895

1051.8287

SFRLRNK-Dnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

100

1598.5373

1582.4135

1566.4001

Abz-LDPRSFALRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.6358

979.8886

SFALRNK-Dnp

Abz-LDPR

500 800 1400 1700 2000

Massa (m/z)

1100

A

B

C

D

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1638.8523

1654.8449

1670.8404

Abz-LDPRSFRLRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1035.8296

619.5895

1051.8287

SFRLRNK-Dnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

100

1598.5373

1582.4135

1566.4001

Abz-LDPRSFALRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.6358

979.8886

SFALRNK-Dnp

Abz-LDPR

500 800 1400 1700 2000

Massa (m/z)

1100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1638.8523

1654.8449

1670.8404

Abz-LDPRSFRLRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1638.8523

1654.8449

1670.8404

Abz-LDPRSFRLRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1035.8296

619.5895

1051.8287

SFRLRNK-Dnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1035.8296

619.5895

1051.8287

SFRLRNK-Dnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

100

1598.5373

1582.4135

1566.4001

Abz-LDPRSFALRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Intensidade (%)

100

1598.5373

1582.4135

1566.4001

Abz-LDPRSFALRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.6358

979.8886

SFALRNK-Dnp

Abz-LDPR

500 800 1400 1700 2000

Massa (m/z)

1100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.6358

979.8886

SFALRNK-Dnp

Abz-LDPR

500 800 1400 1700 2000

Massa (m/z)

1100

A

B

C

D

40

Figura 11. Análise das massas dos substratos de 11aa. Como matriz foi usado ácido

α-ciano-4-hidroxi-cinâmico, (ácido p-cumarínico). Os espectros das massas dos

substratos íntegros, coletados pelo HPLC, estão representados pelas letras (A); (C);

(E) e (G). Os espectros dos substratos hidrolisados pela trombina estão identificados

pelas letras (B); (D); (F) e (H).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1624.7198

1608.7372

1640.6794

Abz-LDPRSFPLRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1021.8544

619.6356

989.8553

1005.8708

SFPLRNK-Dnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1642.7013

1610.7097

1626.7052

Abz-LDPRSFDLRNK-Dnp

500 800 1100 1400 1700 2000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.6325

1023.8143

1007.8136

991.8368

SFDLRNK-Dnp

Abz-LDPR

E

F

G

H

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1624.7198

1608.7372

1640.6794

Abz-LDPRSFPLRNK-Dnp

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1021.8544

619.6356

989.8553

1005.8708

SFPLRNK-Dnp

Abz-LDPR

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

1642.7013

1610.7097

1626.7052

Abz-LDPRSFDLRNK-Dnp

500 800 1100 1400 1700 2000

Massa (m/z)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Intensidade (%)

619.6325

1023.8143

1007.8136

991.8368

SFDLRNK-Dnp

Abz-LDPR

E

F

G

H

41

Observando as massas registradas no espectrômetro de massas, não

encontramos sinal de degradação dos substratos tanto no pico central, obtido na

cromatografia apontado pela figura 9, quanto nos picos menores adjacentes. Os

espectros apresentaram mais de uma massa com diferença de 16 Da para os

substratos (figuras 10 e 11). Isto se deve à oxidação do EDDnp e Dnp causada pelo

“laser”. Os picos observados com massas moleculares entre 500 e 700 m/z devem-

se a adutos de matriz, também, observados na análise da matriz sem amostra.

Em seguida, realizamos a hidrólise total dos substratos pela trombina, para a

confirmação do sítio de hidrólise. Analisando os espectros da hidrólise, asseguramos

que a ação hidrolítica da enzima ocorre na seqüência dos substratos, LDPR

41

S

42

FXLN, uma vez que o produto de massa molecular de 619 Da detectado em

todos os espectros se refere à massa da seqüência Abz-LDPR. Não foi detectada

outra massa obtida pela hidrólise da trombina.

42

4.3. VELOCIDADE ENZIMÁTICA E PARÂMETROS CINÉTICOS DA TROMBINA

FRENTE AOS SUBSTRATOS ANALISADOS

Depois de identificar o sítio de hidrólise dos substratos e verificar que não há

fragmentação prévia dos mesmos, nós examinamos a ação da trombina frente a

estes substratos.

Primeiramente, analisamos as velocidades de hidrólise dos substratos,

representadas pela figura 12, e constatamos que a velocidade relativa de hidrólise

da trombina foi 10 vezes maior com os substratos de 26 aa do que com os de 11 aa.

Figura 12. Velocidade enzimática da trombina frente aos substratos fluorogênicos.

Reação iniciada com 1,5 µM de substratos; 0,4 nM e 0,8 nM de trombina para os

substratos de 26 aa e para os substratos de 11 aa, respectivamente, durante 7

minutos à 37 °C. Solução tampão: Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl

2

10 mM e PEG

6000 0,1%, pH 7,5 à 37 ºC. Comprimentos de onda usados: 320 nm para excitação

e 420 nm para emissão (Cada ponto é a média de 3 experimentos independentes).

Apesar disso, no que diz respeito às modificações na porção P

3

´, o

comportamento da velocidade da enzima foi igual para todos os resíduos de

aminoácidos. Sendo que, a arginina apresenta uma velocidade de hidrólise maior e

uma velocidade enzimática menor para o ácido aspártico nesta posição.

0

20

40

60

80

100

120

Asp

Ala

Pro

Arg

26 aa

11 aa

V

e

l

o

c

i

d

a

d

e

R

e

l

a

t

i

v

a

(

%

)

43

Os parâmetros cinéticos foram calculados e estão apresentados na tabela 5.

A trombina é 20 a 30 vezes mais eficiente na hidrólise dos substratos de 26 aa com

relação aos substratos menores. A enzima apresentou a mesma preferência de

resíduos de aminoácidos em P

3

´, sendo a arginina o melhor resíduo, enquanto que o

ácido aspártico foi o pior resíduo. Já os resíduos prolina e alanina resultaram numa

eficiência média. Esta grande diferença na eficiência catalítica entre os substratos

está, principalmente, no tempo de renovação da enzima que é 50 vezes menor para

os substratos de 11 aa, enquanto que os valores de K

m

não apresentam uma

diferença significativa para ambos.

Tabela 5. Parâmetros cinéticos da trombina com os substratos fluorogênicos e seus

moduladores. Experimento realizado com 0,05 a 2,2 µM dos substratos, 0,36 nM de

trombina. Cinética com a presença dos moduladores foi realizada com 250 µM de

glicirrizina e 15 nM de botrojaracina em pH 7,5 à 37 °C (Cada ponto é a média ±SD

de 3 experimentos independentes).

No ensaio enzimático na presença de glicirrizina e botrojaracina, inibidores

que se ligam ao exosítio 1, estes inibiram a atividade catalítica da enzima somente

para os substratos maiores. A eficiência catalítica diminuiu cerca de 2 a 3 vezes para

ambas moléculas. Entretanto, a análise dos parâmetros cinéticos mostra que estes

inibidores atuam por mecanismos diferentes. Enquanto a botrojaracina aumentou o

26aa (P

3

´) K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

Glicirrizina Botrojaracina

-R-

-P-

-A-

-D-

-R-

-P-

-A-

-D-

1,2 ± 0,3 18 ± 2,6 16 ± 2,5

1,3 ± 0,2 14 ± 0,9 11 ± 0,7

0,6 ± 0,05 7,0 ± 0,9 10 ± 1,2

1,2 ± 0,12 6,0 ± 0,9 5,0 ± 0,9

1,8 ± 0,16 7,7 ± 0,9 4,5 ± 0,8

2,3 ± 0,6 4,4 ± 0,8 2,1 ± 0,2

2,2 ± 0,4 5,6 ± 1,1 2,7 ± 0,6

1,6 ± 0,1 2,8 ± 0,2 1,8 ± 0,2

2,5 ± 0,4 16,8 ± 2,7 6,9 ± 0,7

2,3 ± 0,1 11 ± 0,7 5,0 ± 0,1

2,2 ± 0,2 9,2 ± 1,7 4,2 ± 0,8

3,4 ± 0,8 8,3 ± 1 2,4 ± 0,4

11aa (P

3

´)

0,42 ± 1e

-2

0,34 ± 3e

-2

0,8 ± 1e

-1

0,52 ± 1e

-2

0,15 ± 2e

-2

0,35 ± 7e

-2

0,63 ± 9e

-2

0,21 ± 1e

-2

0,33 ± 3e

-2

0,69 ± 1e

-1

0,13 ± 1e

-2

0,2 ± 3e

-2

0,38 ± 3e

-2

0,4 ± 3e

-2

1,0 ± 1e

-1

0,56 ± 6e

-2

0,2 ± 2e

-2

0,36 ± 5e

-2

0,53 ± 5e

-2

0,17 ± 3e

-2

0,33 ± 6e

-2

0,57 ± 5e

-2

0,14 ± 8e

-3

0,24 ± 3e

-2

0,35 ± 3e

-2

0,5 ± 5e

-2

1,4 ± 2e

-1

0,51 ± 2e

-2

0,2 ± 2e

-2

0,46 ± 5e

-2

0,55 ± 1e

-2

0,16 ± 2e

-2

0,3 ± 3e

-2

0,55 ± 3e

-2

0,15 ± 2e

-2

0,3 ± 4e

-2

26aa (P

3

´) K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

Glicirrizina Botrojaracina

-R-

-P-

-A-

-D-

-R-

-P-

-A-

-D-

1,2 ± 0,3 18 ± 2,6 16 ± 2,5

1,3 ± 0,2 14 ± 0,9 11 ± 0,7

0,6 ± 0,05 7,0 ± 0,9 10 ± 1,2

1,2 ± 0,12 6,0 ± 0,9 5,0 ± 0,9

1,8 ± 0,16 7,7 ± 0,9 4,5 ± 0,8

2,3 ± 0,6 4,4 ± 0,8 2,1 ± 0,2

2,2 ± 0,4 5,6 ± 1,1 2,7 ± 0,6

1,6 ± 0,1 2,8 ± 0,2 1,8 ± 0,2

2,5 ± 0,4 16,8 ± 2,7 6,9 ± 0,7

2,3 ± 0,1 11 ± 0,7 5,0 ± 0,1

2,2 ± 0,2 9,2 ± 1,7 4,2 ± 0,8

3,4 ± 0,8 8,3 ± 1 2,4 ± 0,4

11aa (P

3

´)

0,42 ± 1e

-2

0,34 ± 3e

-2

0,8 ± 1e

-1

0,52 ± 1e

-2

0,15 ± 2e

-2

0,35 ± 7e

-2

0,63 ± 9e

-2

0,21 ± 1e

-2

0,33 ± 3e

-2

0,69 ± 1e

-1

0,13 ± 1e

-2

0,2 ± 3e

-2

0,38 ± 3e

-2

0,4 ± 3e

-2

1,0 ± 1e

-1

0,56 ± 6e

-2

0,2 ± 2e

-2

0,36 ± 5e

-2

0,53 ± 5e

-2

0,17 ± 3e

-2

0,33 ± 6e

-2

0,57 ± 5e

-2

0,14 ± 8e

-3

0,24 ± 3e

-2

0,35 ± 3e

-2

0,5 ± 5e

-2

1,4 ± 2e

-1

0,51 ± 2e

-2

0,2 ± 2e

-2

0,46 ± 5e

-2

0,55 ± 1e

-2

0,16 ± 2e

-2

0,3 ± 3e

-2

0,55 ± 3e

-2

0,15 ± 2e

-2

0,3 ± 4e

-2

44

K

m

indicando maior dificuldade na interação da trombina com os substratos, a

glicirrizina provocou maior modificação do K

cat

indicando queda no número de

renovações da trombina. Tanto a botrojaracina quanto a glicirrizina não provocaram

mudança na atividade da trombina nos substratos de 11 aa, com exceção da

botrojaracina com o substrato contendo o resíduo arginina em P

3

´, causou um

aumento, de quase 2 vezes, na eficiência da trombina pela diminuição do K

m

e

aumento do K

cat

.

4.4. EFEITO DA FORÇA IÔNICA NA ATIVIDADE DA TROMBINA

Uma vez que o exosítio 1 é formado por resíduos de arginina e lisina, levando

à formação de superfícies com potencial eletrostático positivo, decidimos analisar o

papel da força iônica na atividade da trombina frente aos substratos sintéticos.

Utilizamos cloreto de sódio e cloreto de colina no tampão de reação em diferentes

concentrações.

Com os resultados representados pela figura 13, observamos que a eficiência

catalítica da trombina para o substrato de 26 aa aumentava até a concentração

fisiológica de NaCl, 150 mM e acima desta concentração, 300 a 700 mM, o K

cat

/K

m

da trombina mostra-se diminuído (figura 13A).

No caso do substrato de 11 aa, a eficiência da trombina, ao contrário,

aumenta gradativamente com o aumento da concentração de NaCl estabilizando-se

a partir de 300 mM (figura 13B).

Usando o sal cloreto de colina, evitamos o efeito observado pelo sódio. Na

presença deste sal, notamos que os valores de K

cat

/K

m

começam a diminuir em

concentrações mínimas de ChCl (a partir de 80 mM), sendo que a atividade é

45

completamente abolida na presença de 700 mM de ChCl para o substrato de 26 aa

(figura 13A). No entanto, com o substrato de 11 aa, o K

cat

/K

m

da trombina apresentou

um discreto aumento da eficiência catalítica (em 80 mM) e diminuição discreta com o

aumento da concentração do sal (figura 13B).

Figura 13. Efeito da concentração de NaCl e ChCl na eficiência catalítica da

trombina. A análise foi realizada com tampão de reação na presença ou ausência

dos sais à 37 °C em pH 7,5. A eficiência catalítica foi testada com resíduo de prolina

na posição P

3

´ para ambos os substratos. (A) Valores de K

cat

/K

m

da trombina com

substrato de 26 aa. (B) Valores de K

cat

/K

m

da trombina com substrato de 11 aa

(Cada ponto é a média ±SD de 3 experimentos independentes).

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NaCl

ChCl

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

NaCl

ChCl

A

B

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NaCl

ChCl

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

NaCl

ChCl

A

B

46

4.5. INTERAÇÃO DA SEQÜÊNCIA C – TERMINAL DO SUBSTRATO DE 26 aa NO

EXOSÍTIO 1.

Sabendo que a seqüência C-terminal contendo os resíduos de tirosina, ácido

glutâmico e fenilalanina é responsável pela interação com o exosítio 1 (Vu e col.

1991, Jacques e col. 2000), procuramos testar se um peptídeo sintético, (0714 D),

formado pela seqüência C – terminal do substrato, seria capaz de modular a

atividade catalítica sobre os substratos de 26 aa.

Figura 14. Eficiência catalítica da trombina em presença da seqüência C – terminal

do substrato de 26 resíduos de aminoácidos. Seqüência

50

DKYEPFWEDEEKNQ

63

em (A) concentrações do peptídeo 0714 D foram de 3,0; 20 e 2000 nM, com

concentração da trombina de 0,36 nM e utilizando 0,05 a 2,2 µM do substrato de 26

aa. (B) concentrações do peptídeo 0714 D foram de 30; 60; 300 e 2000 nM, com

concentração da trombina de 3,0 nM e utilizando 0,05 a 2,2 µM do substrato de 11

aa. A reação ocorreu em tampão Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl

2

10 mM e PEG

6000 0,1% a pH 7,5 à 37 °C. A eficiência catalítica foi testada com resíduo de

arginina na posição P

3

´ para ambos os substratos (Cada ponto é a média ±SD de 3

experimentos independentes).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

8,3 55,5

5555,5Controle

Conc. 0714 D / Conc. THR

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Controle

10 20

100 666,7

Conc. 0714 D / Conc. THR

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

A

B

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

8,3 55,5

5555,5Controle

Conc. 0714 D / Conc. THR

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Controle

10 20

100 666,7

Conc. 0714 D / Conc. THR

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

A

B

47

A figura 14A mostra que a eficiência catalítica da trombina com o substrato

fluorogênico de 26 aa diminui cerca de 43% somente em concentração de peptídeo

5555,5 vezes maior à da trombina. Contrariando nossas expectativas, os resultados

apresentados pela figura 14B mostram que o peptídeo 0714 D provoca uma

diminuição na eficiência catalítica da trombina quando o substrato de 11 aa é

utilizado em concentrações do peptídeo de 10 a 666,7 vezes em relação à enzima.

Para analisar o efeito deste peptídeo na atividade catalítica frente a outros

substratos, testamos o substrato cromogênico S-2238 (Pre-Phi-Arg-pNA). Os

resultados apresentados na figura 15 mostraram que o peptídeo 0714 D, também,

diminui a eficiência catalítica.

Figura 15. Eficiência catalítica da trombina com o peptídeo 0714 D. Concentrações

do peptídeo 0714 D foram de 5,0; 50; 500 e 1000 pM e a concentração da trombina

foi de 50 pM. A reação ocorreu em tampão Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl

2

10 mM

e PEG 6000 0,1% a pH 7,5 à 37 °C. A eficiência catalítica foi testada com

concentração de 0,8 a 100 µM do substrato cromogênico S-2238 (Pre-Phi-Arg-pNA)

(Cada ponto é a média ±SD de 3 experimentos independentes).

0

50

100

150

200

250

300

350

Controle 0,1 1,0 10 20

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

Conc. 0714 D / Conc. THR

0

50

100

150

200

250

300

350

Controle 0,1 1,0 10 20

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

Conc. 0714 D / Conc. THR

48

Os resultados de K

cat

/K

m

com o substrato cromogênico tiveram, também, uma

ligeira diminuição indicando que o efeito inibitório do peptídeo 0714 D não é restrito

ao substrato fluorogênico de 11 aa. Correlacionando os resultados das figuras 14 e

15, há uma indicação, de que a interação desse peptídeo sintetizado esteja

ocorrendo inespecífico com a trombina.

49

5. DISCUSSÃO

50

A trombina hidrolisa diversas moléculas, porém é uma enzima altamente

seletiva. No entanto, se analisarmos as seqüências do sítio de hidrólise destas

moléculas encontraremos seqüências de resíduos de aminoácidos semelhantes

entre si (Stubbs e Bode, 1993; Le Bonniec e col., 1996). A arginina é um resíduo

importante para que a trombina possa ter sua ação catalítica eficiente em uma

região dos seus substratos. Deste modo, regiões do substrato que contenham

resíduo de arginina poderão ser locais promissores para ação de hidrólise da

trombina. Porém, a hidrólise de uma determinada seqüência não depende somente

da arginina, e sim dos resíduos de aminoácidos adjacentes à arginina (Marque e

col., 2000; Harris e col., 2000). Sendo estes resíduos favoráveis à interação com os

subsítios da trombina, a ação enzimática ocorrerá naquele local que está presente a

arginina, permitindo, assim, que a trombina possa clivar uma ou mais regiões do

mesmo substrato (Stubbs e Bode, 1993; Le Bonniec e col., 1996). Logo, a

especificidade singular da trombina é atribuída pela restrição de ação em

seqüências específicas que estão presentes em muitas moléculas do sistema

hemostático e em outros sistemas.

Este reconhecimento específico é atribuído aos subsítios do sítio catalítico, os

quais interagem com os resíduos de aminoácidos dos substratos. O conhecimento

dos resíduos que compõem os subsítios e quais os melhores resíduos do substrato

para garantir a hidrólise é importante para o entendimento do funcionamento da

enzima. Outra região como o exosítio 1, também, é importante na especificidade e

na eficiência da trombina. Logo, a ação da trombina como procoagulante e

anticoagulante é definida a partir da interação do ligante com o exosítio 1 em

conjunto com os subsítios. Devido às interações específicas do ligante, como é o

caso da trombomodulina, a trombina torna-se eficiente na hidrólise da proteína C

51

que é considerado um substrato pobre devido à presença de um resíduo de Asp na

posição P

3

´ (Ye e col., 1991; Musci e col., 1988; Le Bonniec e col., 1996). Quando a

interação com o exosítio 1 ocorre com outros ligantes, como PAR 1, botrojaracina e

glicirrizina, suas distintas influências na ligação com o exosítio não são capazes de

melhorar a eficiência catalítica da enzima na presença do resíduo de ácido aspártico

em P

3

´ (Myles e col., 2001

a

; Le Bonniec e col., 1996; Vieira e col., manuscrito em

preparação).

Para entender o papel funcional da trombina é necessário, além de outros

meios, fazer uso de substratos sintéticos e inibidores que atuam tanto no sítio

catalítico quanto no exosítio. O benefício de utilizar substratos sintéticos em relação

aos substratos naturais, baseia-se no fato de que é possível variar os aminoácidos

de maneira específica, substituindo sistematicamente cada aminoácido e estudando

o efeito dessa substituição no mecanismo de catálise (Marque e col., 2000; Le

Bonniec e col., 1996; Vieira e col., manuscrito em preparação). A substituição do

resíduo de aminoácido na posição P

3

´ foi escolhida, pois, sabe-se que, nesta

posição a interação com o seu respectivo subsítio da trombina pode ocasionar uma

atividade catalítica eficiente ou não (Ye e col., 1991; Le Bonniec e col., 1996). A

utilização de substratos com fluorescência apagada favoreceu o estudo da atividade

enzimática por permitir que estes substratos possam ter tamanhos variados

consentindo, assim, interações com subsítios distantes do sítio catalítico e com

outras regiões da enzima (Pimenta e col., 2002; Le Bonniec e col., 1996; Vieira e

col., manuscrito em preparação). A vantagem de se utilizar substratos com

fluorescência apagada é a medida da atividade enzimática em tempo real, ao

contrário da utilização da cromatografia como método para testar ensaio enzimático

(Myles e col., 2001

a

). Os substratos fluorogênicos, também, levam vantagem em

52

relação aos substratos cromogênicos, pois permitem o estudo de interações com

subsítios e outras regiões distantes de uma enzima, enquanto que os cromogênicos

clássicos com p-nitroanilina permitem somente interações com os resíduos da região

N-terminal do substrato (Le Bonniec e col., 1991; Monteiro e col., 1999; Francischetti

e col., 1997). Logo, os substratos fluorogênicos com a síntese baseada no PAR 1

proporcionaram o estudo da correlação da interação dos aminoácidos do substrato

no subsítio S

3

´ com interação simultânea no exosítio 1 da trombina.

Iniciamos nossos experimentos analisando o sítio de clivagem da trombina e

verificamos que houve somente um produto de hidrólise, com massa de 619 Da,

para todos os substratos fluorogênicos. Logo, a trombina cliva todos os substratos

sintetizados entre os resíduos Arg na posição 41 e Ser na posição 42 liberando,

como produto, a seqüência do N-terminal, Abz-LDPR

41

, que é a mesma seqüência

do N-terminal do PAR 1 liberado quando clivado pela trombina (Ossovskaya e

Bunnett, 2004). Por existir um outro resíduo de arginina na posição 46 da seqüência

dos substratos e, particularmente, para os substratos que têm arginina na posição

P

3

´, imaginamos que a trombina poderia clivar, também, nestes pontos. No entanto,

não observamos massas diferentes de 619 Da que indicariam outros sítios de

hidrólise nos substratos. Levando em consideração o trabalho de Harris e

colaboradores (2000), que mostra que o resíduo de aminoácido que favorece a

eficiência catalítica da trombina em P

2

é o resíduo de prolina na posição 40, a

eficiência catalítica da trombina em outros resíduos de arginina nas posições 44 e 46

seria baixa, não proporcionando, assim, outros produtos de hidrólise ao longo da

reação devido aos resíduos de fenilalanina e leucina, respectivamente, posicionados

em P

2

.

53

Analisando a ação da trombina nos substratos, observamos na figura 12 que

a velocidade de hidrólise foi consideravelmente maior para os substratos de 26 aa.

Tanto para os substratos de 26 aa quanto para os de 11 aa, a melhor velocidade foi

para o resíduo de arginina na posição P

3

´ e a menor velocidade foi para o resíduo de

ácido aspártico na mesma posição. Estes dados da figura 12 não podem oferecer

detalhes, mas indicam uma diferença nos substratos de 26 aa e de 11 aa que

modifica a atividade da trombina.

Esses dados corroboram os resultados dos cálculos dos parâmetros cinéticos

da enzima (tabela 5). A trombina apresenta eficiência catalítica significativamente

maior para os substratos de 26 aa, enquanto que para os substratos de 11 aa foi

extremamente baixa. De fato, esta diferença se deve pela seqüência do substrato

maior que se liga ao exosítio 1 da trombina. A região C-terminal do substrato

aumenta a eficiência da trombina pelo aumento do K

cat

, enquanto que o K

m

não é

significativamente modificado. Certamente o C-terminal ligante ao exosítio 1 modifica

a conformação do sítio catalítico da trombina de modo que melhore o tempo de

renovação da sua atividade, mas sem alterar a interação com os substratos.

Curiosamente, a interação da porção ligante ao exosítio 1 do substrato maior

não alterou a eficiência catalítica da trombina em relação aos resíduos de

aminoácido em P

3

´, principalmente com o ácido aspártico. Isto indica que o C-

terminal do substrato não modula o subsítio S

3

´ como acontece com a ligação do

domínio EGF 1 – 6 da trombomodulina. Isso indica que o fato de acontecer uma

interação com o exosítio 1, não necessariamente, produzirá o mesmo efeito no sítio

catalítico da enzima. Isto se dá por interações específicas com resíduos de

aminoácidos da região ligante ao exosítio 1 com os resíduos do mesmo. Logo, os

resíduos tirosina, ácido glutâmico e fenilalanina nas posições 52, 53 e 55,

54

respectivamente, do PAR 1, através do substrato de 26 aa, não muda o

posicionamento do resíduo Glu 192 do subsítio S

3

´ da trombina (Ye e col., 1991; Vu

e col., 1991; Vieira e col., manuscrito em preparação).

Comparando-se a atividade catalítica da trombina na presença de glicirrizina e

botrojaracina, ambas as moléculas provocaram inibição da trombina frente aos

substratos de 26 aa, sendo que cada molécula apresenta um desempenho diferente

na inibição enzimática. Glicirrizina foi mais efetiva na queda da eficiência catalítica,

interferindo no tempo de renovação, diminuindo o K

cat

. No caso da botrojaracina, sua

interferência foi na interação da enzima com os substratos aumentando o K

m

da

trombina. A atividade da trombina com os substratos de 11 aa não se alterou na

presença da glicirrizina ou da botrojaracina, mostrando que a modulação

conformacional da trombina provocada por estas moléculas não seja favorável para

aumentar sua eficiência catalítica frente aos substratos de 11 aa (Monteiro e col.,

1999; Francischetti e col., 1997). Apesar de o substrato interagir somente no sítio

catalítico, ele contém vários resíduos de aminoácidos que interagem com outros

subsítios além dos subsítios S

3

e S

3

´ do sítio catalítico, logo estes resíduos de

aminoácidos que compõem o substrato, poderão favorecer tanto positiva quanto

negativamente a eficiência da enzima na interação de ligantes com o exosítio 1

(Monteiro e col., 1999; Vieira e col., manuscrito em preparação). Assim como o

peptídeo C-terminal do substrato de 26 aa, botrojaracina e glicirrizina não

modificaram K

cat

/K

m

da enzima com o resíduo Asp em P

3

´. Podemos concluir que

estas moléculas, também, não modulam o resíduo Glu do subsítio S

3

´.

As interações eletrostáticas têm uma participação importante na atividade da

trombina por conduzir a ligação ao exosítio rico em resíduos positivos. Logo, os

resíduos chaves do ligante poderão interagir com estabilidade com o exosítio (Vu e

55

col., 1991; Baerga-Ortiz e col., 2000; Myles e col., 2001

b

). A atividade catalítica é

modulada pela presença do íon Na

+

(Di Cera, 2008; Di Cera, 2004). Podemos

observar em nossos resultados que a presença de Na

+

até 150 mM ativa a trombina,

no entanto concentrações maiores afetam somente a catálise dos substratos de 26

aa, indicando que um aumento da força iônica pode interferir na interação do

substrato com o exosítio 1. Estes resultados são corroborados através da análise da

atividade catalítica na presença de sais de cloreto de colina, onde podemos observar

que este afeta principalmente a atividade dos substratos de 26 aa que possuem

interação com o exosítio 1.

Trabalhos de Vu e colaboradores, 1991 e de Jacques e colaboradores, 2000

mostraram a importância da interação de alguns resíduos de aminoácidos do C-

terminal do receptor PAR 1 com o exosítio 1. Trocando ou deletando resíduos

chaves do C-terminal (Tyr posição 52, Glu posição 53 e Phe posição 55), eles

relataram que certos resíduos de aminoácidos são determinantes para a interação

com o exosítio, prejudicando, assim, a eficiência catalítica da trombina. Porém, estes

estudos foram realizados com seqüências expressas da porção extracelular

completa do PAR 1, contendo cerca de 33 e 77 resíduos de aminoácidos nos

respectivos trabalhos. Nós estudamos como seria a interação de um segmento

pequeno,

50

DKYEPFWEDEEKNQ

63

, presente na porção C-terminal do substrato de

26 aa com o exosítio 1 da trombina.

A diminuição de K

cat

/K

m

da trombina com o substrato de 11 aa e o

cromogênico em presença de altas concentrações do peptídeo, (667 e 20 vezes,

respectivamente), indicam que o peptídeo interfere parcialmente na hidrólise dos

substratos pela enzima. Isto, também, pode ter ocorrido quando usamos o substrato

de 26 aa. Porém, a diminuição de K

cat

/K

m

na hidrólise deste substrato aconteceu a

56

partir das concentrações, aproximadas, dos peptídeos 50 e 5000 vezes maiores em

relação à concentração de enzima. Talvez a inibição do peptídeo C-terminal na

hidrólise do substrato de 26 aa pela trombina seja eficaz em concentrações

extremamente altas dele em relação à da trombina (figura 14A). Este dado, no

entanto, não é tão surpreendente, pois em trabalho publicado por Hortin e Trimpe

(1991), para causar inibição na atividade da trombina, foram necessárias, também,

concentrações elevadas da seqüência C-terminal da hirudina,

54

EIPEEY(SO

4

)LQNESG

65

(2500 vezes) em relação à concentração da enzima.

Correlacionando os dados da ação do C-terminal do substrato fluorogênico com os

do C-terminal da hirudina (Vu e col., 1991; Hortin e Trimpe, 1991), podemos sugerir

que há alguma correlação com os resíduos de aminoácidos que ficam entre o ponto

de clivagem e a região C-terminal,

42

SFXLRNKN

49

. Esta seqüência pode direcionar e

estabilizar, ao longo da fenda catalítica da trombina, a ligação da seqüência

50

DKYEPFWEDEEKNQ

63

no exosítio 1. Para averiguar esta hipótese, podemos

sugerir a síntese da seqüência

42

SFXLRNKNDKYEPFWEDEEKNQ

63

para estudar

sua interação com a trombina. Além disso, poderíamos incluir três resíduos de

alanina entre as seqüências

42

SFXLRNKN

49

e

50

DKYEPFWEDEEKNQ

63

para

verificar se esta última seria deslocada do exosítio, demonstrando, assim, se a

interação do C-terminal com o exosítio 1 seria controlada pelo comprimento da

seqüência

42

SFXLRNKN

49

.

Certamente, o papel do subsítio S

3

´ é primordial na definição da ação pro ou

anticoagulante da trombina. No entanto, a influência do exosítio 1, também, é

importante na atividade anticoagulante da enzima, pois é a partir da interação com o

exosítio que ocorre a modulação conformacional do subsítio S

3

´, possibilitando,

assim, a catálise eficiente da trombina pela proteína C. Por isso, a utilização dos

57

substratos fluorogênicos sintéticos com a seqüência do receptor PAR 1 possibilitou

para nós a compreensão da estrutura – atividade destes com a trombina.

58

6. CONCLUSÃO

59

Portanto, com este trabalho podemos concluir que:

 A trombina cliva os substratos em um único ponto determinado.

 A velocidade de hidrólise da trombina é, aproximadamente, 10 vezes maior

para os substratos de 26 aa em relação aos substratos de 11 aa.

 A eficiência catalítica da enzima foi melhor com os substratos que tiveram

resíduo de arginina na posição P

3

´ e eficiência deficitária com o resíduo de alanina

em P

3

´.

 A interação do C-terminal do substrato de 26 aa com o exosítio 1 aumentou a

eficiência catalítica, porém não alterou a preferência dos resíduos em P

3

´.

 As interações eletrostáticas são fundamentais para a interação dos substratos

de 26 aa e a trombina e sua conseqüente hidrólise.

 O peptídeo do C-terminal do substrato de 26 aa, por si só tem baixa afinidade

pela trombina, inibindo apenas parcialmente a atividade sobre os substratos de 26

aa.

60

7. Referência Bibliográfica

61

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67

8. ANEXO

68

Investigation of Thrombin Activity with PAR 1-based Fluorogenic Peptides

Saulo Martins Vieira

a

, Flávia Garcia dos Reis

b

, Denis Luis S. Dutra

a

, Luiz Juliano

Neto

c

, Maria Aparecida Juliano

c

, Julio Alberto Mignaco

a

and Russolina Benedeta

Zingali

a*

.

a

Instituto de Bioquímica Médica and

b

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,

UFRJ;

c

Departamento de Biofísica, UNIFESP.

*

Corresponding author: Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ, CCS, Sala H2-004,

Avenida Carlos Chagas Filho, 373, Rio de Janeiro – RJ, Brasil. Fax: +55-21-

25626782

mailto: [email protected]rj.br

69

Thrombin, a highly specific protease of blood coagulation, has two exosites that

modulate its specificity. We used two sets of synthetic fluorescent peptides (11-aa

and 26-aa) based on the PAR 1 sequence. The 26-aa set encompassed a sequence

binding to exosite 1. The relevance of the P

3

´position for catalysis was also evaluated

by varying the amino acid therein (Arg/Pro/Ala/Asp). Thrombin showed higher

catalytic efficiencies towards the 26-aa substrates. Arg (K

cat

/K

m

= 16 µM

-1

s

-1

±2.5 and

K

cat

/K

m

= 0.8 µM

-1

s

-1

±0.1) and Asp (K

cat

/K

m

= 5 µM

-1

s

-1

±0.9 and K

cat

/K

m

= 0.2 µM

-1

s

-

1

±0.03) at P

3

´ resulted in better and poorer substrates for each set respectively.

Glycyrrhizin and bothrojaracin decreased K

cat

/K

m

for the 26-aa but not for the 11-aa

peptides. The 26-aa substrates also presented a higher dependence to salt. Thus,

the exosite binding sequence in the substrate increased thrombin´s catalytic

efficiency ~20-fold and emphasized its salt-dependence, while P

3

´ substitutions

altered efficiency ~4-fold only.

Keywords: Thrombin, Fluorogenic substrates, PAR 1 and P

3

´ position.

70

Introduction

Thrombin is a trypsin-like enzyme with a central role in blood coagulation.

Thrombin is generated from prothrombin by the prothrombinase complex, and is

responsible for the activation of factors V/VIII/XI/XIII, for the cleavage of fibrinogen

into fibrin, and is a platelet aggregation agonist [1,2]. Despite having numerous

macromolecular substrates, thrombin exhibits a narrower catalytic specificity than

trypsin. This specificity originates at the catalytic site, where subsites S

3

to S

3

´

accommodate target residues P

3

to P

3

´. While this interaction determines the

catalysis of a substrate specificity is dictated mainly by a proline in P

2

[3,4]. Thrombin

bears two electropositive exosites (1 and 2) that additionally control its catalytic

specificity, by interacting with macromolecules that bind initially by ionic attraction

followed by hydrophobic interactions [5,6]. Molecules bound to exosites promote a

significant modification in the kinetics of hydrolysis of p-nitroanilide peptidic

substrates, and binding of macromolecular substrates decreases pseudosubstrate

hydrolysis by competition. Long-term exosite interactions with the catalytic site induce

conformational changes that increase the affinity and activity towards the substrates,

and also allow poor substrates to be acted on by the enzyme [7-10]. Exosite 1 can

bind fibrinogen [11], hirudin [12], thrombomodulin [13], protease activated receptors

PAR 1 and PAR 3 [14], and heparin cofactor II [15].

PAR 1 is a member of the seven-transmembrane-domain G-protein-coupled

family of receptors (GPCRs) and when activated by thrombin regulates cellular

responses in human platelets. Thrombin activates PAR 1 by cleaving its N-terminal

exodomain, generating a new N-terminus that bends over conserved regions in the

second extracellular loop of the cleaved receptor, triggering signal transduction [14].

The binding of a hirudin-like sequence to exosite 1 significantly enhances activity. Vu

et al. [16] reported that PAR 1 C-terminal amino-acid residues Tyr-52, Glu-53 and

Phe-55 are vital for the interaction with thrombin’s exosite 1, although the acidic

sequence does not appear to directly interact with the exosite. Hirudin-like domains

bind only to exosite 1, and these interactions induce conformational changes in the

catalytic site of thrombin [8,14]. Therefore, α-thrombin achieves high catalytic rates

over chromogenic substrates when hirudin is bound [8].

Bothrojaracin (BJC), a 27kDa protein isolated from Bothrops jararaca snake

venom, is described as a specific inhibitor [9] that interacts with thrombin’s exosite 1,

but not with its catalytic site, and blocks several thrombin functions. Bothrojaracin-

71

induced structural changes on thrombin’s catalytic site either increase or decrease its

catalytic efficiency [8,17]. Glycyrrhizin (GL), extracted from Glycyrrhiza glabra, is

another ligand of thrombin exosite 1 that inhibits thrombin but does not block its

catalytic site. Although both glycyrrhizin and heparin contain glucuronic acid units in

their structures, GL does not show heparin-like anticoagulant activity [18,19].

In this study, two groups of PAR 1-derived fluorogenic peptide substrates

(Table 1) were constructed: one with 11 amino acids, possibly interacting only with

thrombin’s catalytic site, and another with 26 amino acids, containing a hirudin-like C-

terminal domain able to interact with exosite 1. We evaluated the kinetic parameters,

the influence of ionic strength and the modulator effects of either BJC or GL in their

hydrolysis by thrombin.

Materials and Methods

Fluorogenic substrates synthesis

Abz-peptidyl-EDDnp substrates were prepared by solid-phase synthesis with

the Fmoc (N-(9-fluorenyl)methoxycarbonyl)

methodology using a multiple automated

peptide synthesizer. Glutamine was the C-terminal residue

in all peptides due to

requirements of the synthesis

strategy [20].

Substrate purity was checked by MALDI-TOF mass spectrometry and by

reverse-phase chromatography. The concentrations of Abz-peptidyl-EDDnp

substrates were determined by their absorbance at 365 nm (

ε

365nm

~ 17,300

M

1

.cm

1

for EDDnp or DNP).

Hydrolysis of the fluorogenic peptides and analysis by HPLC

Substrates and their products cleaved by thrombin and were analyzed by

mass spectrometry. Before mass spectrometry the peptides were purified by HPLC to

eliminate degradation products and contaminants. Briefly, 1.0 mg.mL

-1

fluorogenic

peptides in 20 µL were analyzed by reverse-phase HPLC using a C

18

column (CLC-

ODS Shimadzu 4.6 x 150 mm) with the eluent system: solvent A (0.1% trifluoroacetic

acid in ultrapure water) and solvent B (0.1% trifluoroacetic acid, 90% acetonitrile).

Peptides (110 µM) were cleaved with 100 nM thrombin for 120 min and the reaction

was stopped with 100

µL HCl 5 N.

Mass spectrometry

72

After purification, 0.5 µL fluorogenic peptides (5.5 pmoles), with or without

thrombin were mixed with 0.5 µL matrix solution (α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid

for 11-aa peptides, sinapinic acid for 26-aa peptides) and 1.0 µL of this mixture was

applied onto plates. A Voyager DE-Pro (Applied Biosystems) MALDI-TOF was used

for analysis. We used CALMIX 2 [angiotensin I; ACTH (1-17 clip, 2094.46 Da); ACTH

(18-39 clip, 2466.72 Da); ACTH (7-38 clip, 3660.19 Da), bovine insulin (5734.59 Da)]

for external calibration, with a laser intensity of 1881 volts.

Determination of kinetic parameters with 26-aa peptides

Assays contained 0.05 to 2.2 µM fluorogenic peptides, 0.35 nM thrombin, 50

mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2

, and 0.1% PEG 6000, at 37°C.

Reactions were initiated with the enzyme and monitored continuously on a Hitachi F-

4500 spectrofluorometer. The slope was converted into micromoles of substrate

hydrolyzed per minute based on a calibration curve obtained from the complete

hydrolysis of the fluorogenic substrates with λ

exc

320

and λ

em

420

.

Determination of kinetic parameters with 11-aa peptides

The small peptides have lower hydrolysis rates (Fig. 1), thus we calculated

K

cat

/K

m

values by monitoring their complete hydrolysis to their lowest concentration,

thus the reactions were first order. Reaction mixtures contained 0.8 µM peptide, 3.0

nM thrombin, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2

, and 0.1% PEG-

6000, at 37°C. The reaction was monitored as described for the 26-aa substrates.

K

cat

/K

m

values were extrapolated as a function of ln[P] vs time, where P= (F

t

-F

0

/F

t

)

(Eqn. I):

(Eqn. I)

K

cat

/K

m

values were obtained by equation II and converted into micromoles per

minute based on a calibration curve obtained from the complete hydrolysis of the

fluorogenic peptides (F

o

, initial fluorescence; F

t

, total fluorescence; K, rate constant

(defined by the slope); [E], enzyme concentration.

(Eqn. II)

We used the softwares Grafit 5.0 and Sigma Plot 8.0.

ln

F

t

- F

ס

F

t

+ kt = 0

ln

F

t

- F

ס

F

t

+ kt = 0

K =

K

cat

K

m

[E]

K =

K

cat

K

m

[E]

73

Determination of the enzymatic velocity

Hydrolysis of fluorogenic peptides was continuously monitored on a Hitachi F-

4500 spectrofluorometer as above. Assays contained 1.5 µM substrate and either 0.4

nM or 0.8 nM thrombin (for 26-aa or 11-aa substrates respectively), 50 mM Tris-Cl,

150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2

and 0.1% PEG-6000 at pH 7.5 and 37°C. The reaction

was initiated with the enzyme and hydrolysis followed for 7 minutes.

Effect of ionic strength

The influence of NaCl and choline-Cl was investigated with the fluorogenic

substrates in 50 mM Tris-Cl, 10 mM CaCl

2

and 0.1% PEG-6000 at pH 7.5 and 37°C,

over a NaCl and ChCl range of 0–700 mM. Assays were as described above.

Effects of glycyrrhizin and bothrojaracin on the hydrolysis of the peptides by

thrombin

The reaction was measured as in earlier sections but 250 µM GL or 15 nM

BJC were present. Thrombin was pre-incubated with the inhibitors at 37°C for 5 min

in 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2

and 0.1% PEG-6000 before

starting the reaction with the peptides.

Results

Initially, we measured the enzymatic activity of thrombin with a fixed

concentration of each fluorogenic substrate (Fig. 1). The rate of hydrolysis was 10-

fold higher for substrates bearing the exosite ligand sequence than for the catalytic

site ligand-only substrates. Substrates with Arg in the P

3

´ position, (Table 1), were

hydrolyzed more rapidly in both cases, while Ala- and Pro-bearing peptides showed

intermediate rates, and with Asp in the P

3

´ position the rate was slowest for both

substrate groups (Fig. 1).

The K

m

and K

cat

values for the 26-aa substrates and K

cat

/K

m

for either group of

substrates are presented in table 2. K

m

values did not show significant differences

among the 26-aa substrates, but K

cat

and K

cat

/K

m

values were 20-fold to 36-fold

higher than for the 11-aa substrates (Table 2). In each group, the catalytic efficiency

was better for substrates with Arg in the P

3

´ position and worse for substrates bearing

Asp.

The assays were repeated in the presence of GL or BJC. For the 26-aa

peptides, GL decreased the K

cat

and K

cat

/K

m

values to 30% and 23%, respectively for

74

the substrate with Arg in the P

3

´position. With BJC, K

cat

and K

cat

/K

m

decreased to

90% and 45%, respectively. Pro and Ala substrates showed similar diminutions for

either inhibitor, and the Asp substrate again exhibited lower K

cat

and K

cat

/K

m

values.

Noteworthy, the activity of thrombin did not change with BJC or GL for the 11-aa

fluorogenic substrates, with the sole exception of the Arg substrate for which the

catalyic efficiency improved 75% in presence of BJC.

Interactions with cations and anions are important for the activity of thrombin

[21]. Interaction with monovalent cations to produce conformational changes that

render the enzyme more active and specific toward fibrinogen [21,22]. Thrombin has

a higher affinity for Na

+

rather than for other monovalent cations. Moreover,

interaction with substrates at exosite 1 are mostly electrostatically driven, hence the

binding is ultimately responsible for modulating catalytic efficiency [23,24].

We therefore investigated the relevance of electrostatic interactions by

increasing the concentration of NaCl or ChCl. For the 11-aa substrates the K

cat

/K

m

values augmented with increasing concentrations of NaCl (Fig. 2), whereas with 26-

aa substrates the effect of NaCl was biphasic, with a maximum at 150 mM salt and

decreasing thereafter (Fig. 2A). With choline chloride, for the small substrates K

cat

/K

m

increased up to 150 mM and then decreased at higher concentrations, whereas the

longer substrates showed a monotonic decline in the K

cat

/K

m

values at all

concentrations tested (Fig. 2A and 2B).

DISCUSSION

In a site of vascular injury thrombin escapes and binds to its receptor

thrombomodulin (TM) on the cell surface. As a result, thrombin loses its procoagulant

properties and instead becomes a potent activator of protein C [25]. Activated protein

C (APC) functions as a major physiological circulating anticoagulant, which

specifically degrades and inactivates the phospholipid-bound factors Va and VIIIa

and therefore down-regulates the coagulation cascade, limiting clot formation to sites

of vascular injury [25]. Some works describe that protein C is a poor substrate for

thrombin when Asp residues are present at P

3

and P

3

´. High enzymatic efficiency

occurs because of the thrombin-thrombomodulin interaction through EGF-like

domains [10,26,27]. This is possible because Glu

192

residue present at S

3

´ thrombin

subsite difficults the interaction with acidic residues in P

3

´ [6]. Thrombomodulin favors

hydrolysis of protein C by shifting the positioning of Glu

192

and Arg

35

on thrombin

75

[6,28,29]. This is evidence that specific interaction of exosite 1 with EGF-like domains

is necessary to enhance interactions of the catalytic site with acidic residues which

are normally impeded by Glu

192

. Our results did not show augmented thrombin

activity over the 26-aa substrate containing Asp at the P

3

´ position. This indicates that

the hirudin-like sequence at PAR1 does not produce the tilting of Glu

192

therefore

conserving the affinity at P

3

’ position. Conversely, the construction of substrates

containing sequence interactions mimicking EGF domains could induce different

shifts.

The longer substrates, that should be able to bind their C-terminal portion at

exosite 1, gave us evidence that binding at this exosite is important to improve the

catalytic efficiency of thrombin over peptide substrates. Thrombin presented a higher

catalytic rate and better kinetic parameters with the 26-aa substrates rather than with

the 11-aa substrates, which in all cases presented a relatively poor performance as

substrates. However, the longer C-terminal substrates did not significantly alter

thrombin selectivity for amino acids in the P

3

´ position of the substrates. For either

the 26-aa or the 11-aa substrates, K

cat

/K

m

was higher when an Arg residue was

presented at the P

3

’ position, and diminished when an Asp residue was there. These

results would be evoked by the presence of Glu

192

in the S

3

´ subsite that could thus

favor interactions with basic residues while discriminating acidic residues simply due

to electrostatic repulsion.

Bothrojaracin and glycyrrhizin, two molecules that bind to exosites 1, were

also unable to increase K

cat

/K

m

values for substrates with Asp at the P

3

´ position. On

the contrary, these ligands negatively affected the catalytic efficiency of thrombin

over all the 26-aa substrates tested. This is indicative that the PAR-1 C-terminal

exodomain, GL and BJC do not interact with thrombin in a mode akin the EGF-like

thrombomodulin domains. Therefore, these ligands do not modify the conformation of

the S

3

´ subsite as to increase the catalytic efficiency toward substrates bearing Asp

residues at the P

3

´ position. GL and BJC as well did not change thrombin activity

over the 11-aa substrates. In this case, other amino acids in adjacent positions of the

subsites may result in this unaffected catalytic efficiency. This result is in marked

contrast with those observed for chromogenic substrates with only three amino acids,

for which thrombin activity patently increases when BJC or GL interact with exosite 1

[8,18]. However, binding of either BJC or GL was competitive with the 26-aa

76

substrates and as well inhibited activity over other thrombin macromolecular

physiological substrates [9,18].

Binding of Na

+

is the major driving force behind the procoagulant,

prothrombotic and signaling functions of thrombin, but is not required for the cleavage

of the anticoagulant protein C. As mentioned earlier, the anticoagulant function of

thrombin is under the allosteric control of the cofactor thrombomodulin. Our

experiments indicated that the addition of NaCl at nearly physiological concentrations

elicited similar responses for either the 26-aa or the 11-aa peptides. Their hydrolysis

by thrombin was increased nearly 3.5-fold, which afterwards is analogous to the

effect of NaCl on the activation of hydrolysis of fibrinogen by thrombin. However,

apparently higher ionic strength or even Cl

-

shielding of electrostatic interactions also

interfere on the substrate-exosite 1 interactions, with no effect in the hydrolysis of

smaller substrates. These results are in consonance with Baerga-Ortiz et al.[24], who

found that the association constant of thrombomodulin and thrombin decreased by

tenfold when the NaCl concentration was shifted from 100 mM to 250 mM.

Using fluorogenic peptide substrates, mainly the 26-aa substrates, we could

correlate exosite 1 ligand modulation with the catalytic efficiency and therefore with

the catalytic site of thrombin. The longer C-terminus was demonstrated to be a

demand for enzyme catalytic efficiency. Nonetheless, when a small peptide

(DKYEPFWEDEEKNQ) with the PAR-1 C-terminal sequence that normally binds to

exosite 1 was added to the experimental medium, it did not increase thrombin

hydrolysis of the 11-aa substrate; in contrast, this C-terminal peptide elicited a slightly

lower thrombin activity (data not shown). For the 26-aa substrates, thrombin activity

was inhibited by roughly 30% with peptide concentrations 10,000-fold higher than

those of thrombin (data not shown), comparable to hirugen molecules.

Opposedly, a hirudin C-terminal peptide sequence inhibits cleavage of

macromolecular substrates by thrombin and increases its activity upon small

substrates (chromogenic substrates). Hirudin high-affinity binding is due to the

presence of acidic sequences and sulfated tyrosines at the exodomain 1. Those

residues produce an electrostatically-induced docking, contributing to stabilize the

thrombin-hirudin complex [30]. Similar to ours, those results were also obtained with

a 2,000-fold molar excess of that peptide over thrombin [31]. Perhaps both PAR 1

and hirudin C-termini also require the amino acids located between the cleavage site

77

and the C-terminal sequence synthesized to enhance the binding at exosite 1 and

improve the stability and affinity of the thrombin-C-terminus complexes.

Certainly S

3

´ subsite plays an essential role in thrombin activity. This subsite

dictates the coagulant or anticoagulant fate of thrombin action under the influence of

exosite 1 and its ligands. To specifically modulate S

3

´ subsite selectivity, the binding

of a specific thrombomodulin amino acid sequence to exosite 1 is needed, while

other ligands are unable to shift the subsite conformation to the anticoagulation role.

Therefore, the specific binding of different protein C-termini to thrombin exosite 1 is

essential to drive the catalytic specificity, as well as to increase thrombin catalytic

rate. However, definite specific amino acids on the C-termini will determine the

subsite conformation for the selective action of thrombin in either coagulant or

anticoagulant substrates.

78

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by CNPq, FAPERJ CAPES and IMBEBB. We thank the

Rede Proteômica do Rio de Janeiro for the Mass Spectrometry facility and A.L

Oliveira-Carvalho and D.M.Silva for their technical assistance.

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82

Figure Legends

Figure 1.

Enzymatic activity of thrombin in presence of 1.5 µM of either the 26-aa or

the 11-aa fluorogenic substrates. Amino acids in the abscissa indicate those in the

P

3

´ position. The medium contained 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM

CaCl

2

and 0.1% PEG-6000, at 37ºC. Rates are normalized to the maximum value

(5.44e

-9

±2.2e

-10

), obtained with the 26-aa substrate having Arg in P

3

´.

Figure 2.

Catalytic efficiency (K

cat

/K

m

) at different salt concentrations.

(A)

K

cat

/K

m

values for the 26-aa substrate in the presence of NaCl (closed circles) or ChCl (open

circles).

(B)

K

cat

/K

m

values for the 11-aa substrate in the presence of NaCl (closed

circles) or ChCl (open circles). Assays were with Pro in P

3

´ position for either

substrate.

83

Figure 1

0

20

40

60

80

100

120

Asp

Ala

Pro

Arg

26 aa

11 aa

R

e

l

a

t

i

v

e

V

e

l

o

c

i

t

y

(

%

)

0

20

40

60

80

100

120

Asp

Ala

Pro

Arg

26 aa

11 aa

R

e

l

a

t

i

v

e

V

e

l

o

c

i

t

y

(

%

)

84

Figure 2

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NaCl

ChCl

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

NaCl

ChCl

A

B

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NaCl

ChCl

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

NaCl

ChCl

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NaCl

ChCl

[ mM ]

0 200 400 600 800

K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

NaCl

ChCl

A

B

85

Table 1. PAR 1-based Fluorogenic Substrates.

Mass of Hydrolysis Products

c

Fluorogenic Substrate Sequence

a

Mass

b

N-terminal C-terminal

Abz-LDPR

↓

SFRLRNKNDKYEPFWEDEEKN-Q-EDDnp

3681.28 619.51 3061.77

Abz-LDPR

↓

SFPLRNKNDKYEPFWEDEEKN-Q-EDDnp

3623.07 619.58 3004.08

Abz-LDPR

↓

SFALRNKNDKYEPFWEDEEKN-Q-EDDnp

3579.72 619.55 2978.99

Abz-LDPR

↓

SFDLRNKNDKYEPFWEDEEKN-Q-EDDnp

3605.58 619.57 3023.01

Abz-LDPR

↓

SFRLRNK-Dnp

1638.85 619.58 1019.27

Abz-LDPR

↓

SFPLRNK-Dnp

1624.66 619.64 1005.32

Abz-LDPR

↓

SFALRNK-Dnp

1566.55 619.63 946.23

Abz-LDPR

↓

SFDLRNK-Dnp

1642.65 619.63 1023.25

a

PAR 1 38 – 63 (26 aa) and PAR 1 38 – 48 (11 aa) sequences. The hirudin-like sequence that binds exosite 1 is underlined.. Bold

residues are in the P

3

´ position.

b,c

As determined by mass spectrometry. All the peptides were hydrolyzed at R-S peptide bond as

indicated by

↓

..

86

Table 2. Kinetic parameters for the hydrolysis of fluorogenic substrates by thrombin in the absence and presence of glycyrrhizin

and bothrojaracin.

Glycyrrhizin Bothrojaracin

26aa (P

3

´) K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

K

m

(µM) K

cat

(s

-1

) K

cat

/K

m

(µM

-1

s

-1

)

-R- 1.2 ± 0.3 18 ± 2.6 16 ± 2.5 1.8 ± 0.1 7.7 ± 0.9 4.5 ± 0.8 2.5 ± 0.4 16.8 ± 2.7 6.9 ± 0.7

-P- 1.3 ± 0.2 14 ± 0.9 11 ± 0.7 2.3 ± 0.6 4.4 ± 0.8 2.1 ± 0.2 2.3 ± 0.1 11 ± 0.7 5.0 ± 0.1

-A- 0.6 ± 5e

-2

7.0 ± 0.9 10 ± 1.2 2.2 ± 0.4 5.6 ± 1.1 2.7 ± 0.6 2.2 ± 0.2 9.2 ± 1.7 4.2 ± 0.8

-D- 1.2 ± 0.1 6.0 ± 0.9 5.0 ± 0.9 1.6 ± 0.1 2.8 ± 0.2 1.8 ± 0.2 3.4 ± 0.8 8.3 ± 1.0 2.4 ± 0.4

11aa (P

3

´)

-R- ND

*

ND

*

0.80 ± 1e

-1

ND

*

ND

*

1.0 ± 1e

-1

ND

*

ND

*

1.4 ± 2e

-1

-P- ND

*

ND

*

0.35 ± 7e

-2

ND

*

ND

*

0.36 ± 5e

-2

ND

*

ND

*

0.46 ± 5e

-2

-A- ND

*

ND

*

0.33 ± 3e

-2

ND

*

ND

*

0.33 ± 6e

-2

ND

*

ND

*

0.30 ± 3e

-2

-D- ND

*

ND

*

0.20 ± 3e

-2

ND

*

ND

*

0.24 ± 3e

-2

ND

*

ND

*

0.30 ± 4e

-2

Assays were initiated with 0.36 nM or 3.0 nM thrombin for the 26-aa or 11-aa substrates respectively. Inhibitors (250 µM GL and 15

nM BJC) were pre-incubated with thrombin for 5 min at 37 °C. *Not determined.

87

CURRICULUM VITAE

Nome: Saulo Martins Vieira

Nascimento: 22/07/1982

Naturalidade: Rio de Janeiro

Formação Acadêmica

•

Faculdade de Enfermagem pela Universidade Federal do Rio de Janeiro,

agosto de 2006.

•

Mestrado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica pela

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Comunicação em Congresso

10 comunicações em congressos nacionais.

Publicações

Vieira, S. M., Reis, F. G., Dutra, D. S., Juliano, L., Juliano, M. A., Mignaco, J. A. &

Zingali, R. B. (2009). Investigation of Thrombin Activity with PAR 1-based

Fluorogenic Peptides. Artigo submetido a revista Biochimica et Biophysica Acta.

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