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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA
KATHLEEN SILVA GONÇALVES
SECREÇÃO DE METALOPROTEINASE-9 (MMP-9) DE MATRIZ EM
MACRÓFAGOS MURINOS INDUZIDA POR HEME:
Envolvimento do estresse oxidativo e
possíveis implicações no processo inflamatório
RIO DE JANEIRO
2009
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II
KATHLEEN SILVA GONÇALVES
SECREÇÃO DE METALOPROTEINASE-9 (MMP-9) DE MATRIZ EM
MACRÓFAGOS MURINOS INDUZIDA POR HEME:
Envolvimento do estresse oxidativo e
possíveis implicações no processo inflamatório
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Química Biológica, do Instituto de Bioquímica Médica,
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em
Química Biológica.
Orientador: Prof. Dr. AURÉLIO VICENTE GRAÇA-SOUZA
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica
IBqM – UFRJ
Rio de Janeiro
2009
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III
Gonçalves, Kathleen Silva
Secreção de metaloproteinase-9 (mmp-9) de matriz em macrófagos
murinos induzida por heme: Envolvimento do estresse oxidativo e
possíveis implicações no processo inflamatório
Gonçalves. Rio de Janeiro, 2009.
Número de páginas fls. 110
Dissertação (Mestrado em Química Biológica)/UFRJ/Instituto de
Bioquímica Médica/Programa de Pós-Graduação em Química
biológica, 2009.
Orientador: Aurélio Vicente Graça-Souza.
Referências bibliográficas: f. 100
1. Heme. 2. Metaloproteinase-9 de matriz. 3. Estresse oxidativo. 4.
Inflamação
I. Graça-Souza, Aurélio V. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Gradução em
Química Biológica. III. Título
IV
FICHA DE APROVAÇÃO
Secreção de metaloproteinase-9 (mmp-9) de matriz em macrófagos murinos
induzida por heme: Envolvimento do estresse oxidativo e possíveis
implicações no processo inflamatório
Kathleen Silva Gonçalves
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Química Biológica, do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal
do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção
do título de Mestre em Química Biológica.
Aprovada por:
___________________________________________________________
Robson de Queiroz Monteiro
Doutor em Química Biológica (2001) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro e
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ.
Membro Interno
___________________________________________________________
Tatiana Lobo Coelho Sampaio
Doutora em Ciências (1992) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro e
Professora Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas.
Membro Externo
___________________________________________________________
Hugo Caire de Castro Faria Neto
Doutor em Biologia Celular e Molecular (1992) pela Fundação Oswaldo Cruz e
Pesquisador Titular da Fundação Oswaldo Cruz, Departamento de Fisiologia e
Farmacodinâmica.
Membro Externo
V
___________________________________________________________
Geórgia Correia Atella
Doutora em Química Biológica (1996) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro e
Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ.
Revisora e Suplente Interno
___________________________________________________________
Fernando Augusto Bozza
Doutor em Biologia Celular e Molecular (2004) pela Fundação Oswaldo Cruz e
Pesquisador do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas – IPEC, Laboratório
de Imunofarmacologia.
Suplente Externo
___________________________________________________________
Aurélio Vicente Graça-Souza
Doutor em Química Biológica (1996) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro e
Professor adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ.
Orientador
Rio de Janeiro, 08 de abril de 2009.
VI
Agradecimentos
Como dizem os matemáticos: A ordem dos fatores não altera o produto.
Ao meu orientador, por sua amizade e confiança. Trabalhar com você, por todos os
motivos muito bons e, confesso, às vezes ruins, só me fizeram crescer. Hoje não
tenho dúvida de que faria tudo de novo.
A minha musa inspiradora: minha adorada irmã. Como se não bastasse amar você,
agora existe o melhor pedacinho de você sorrindo e andando por aí (João Paulo),
obrigado por colocar no mundo mais uma pessoa para eu amar tanto assim.
A minha amiga Clarinha, meu exemplo. Pela amizade dentro e fora do laboratório.
Nossos almoços, conversas, saídas, caronas, e tudo mais que nos cerca fizeram de
mim uma pessoa melhor, mais viva, mais feliz.
A minha Fabizinha, meu braço direito. Sem sua ajuda e disposição nada disto teria
sido possível. Obrigada por sua amizade, interesse e disponibilidade. Você é muito
especial.
Ao meu amigo Rafael. Por sua alegria de sempre e sua preocupação comigo. Estou
sentido muito sua falta.
Ao professor Marcos Sorgine. Por seu interesse em me ajudar sempre, seja lá qual
for o problema, você é meu faz tudo preferido. Gostaria de deixar registrado a sua
importância para manutenção do laboratório
Ao professor Pedro Oliveira. Por nos ceder o espaço para realização deste trabalho.
Mas, mais que isso, por sua disponibilidade, preocupação e despreendimento
(preciso aprender mais com você).
VII
À galera do laboratório. Pela companhia sempre agradável e por me fazerem ter
vontade de estar lá. Queria agradecer em particular ao Tiago, a Ana Caroline, a
Clarinha e a Renatinha que, atualmente, têm tomado as rédeas da administração do
laboratório. E ao Zé e a Renata que também faziam isto antes de viajarem.
À Natália, minha terapeuta. Porque sem terapia eu estaria, neste momento, tentando
escrever uma carta pedindo que me tirassem da camisa de força. Sem sua ajuda e
intervenção, tenho dúvidas de que estaria terminando este trabalho.
Gostaria de agradecer aos membros da banca pela honra de acrescentarem um
pouco de suas impressões e experiências a este trabalho.
Ao pessoal da secretaria da Pós-graduação da Química Biológica, que sempre me
atenderam com simpatia e consideração.
Agradeço a minha querida família. Pelo amor que me deram e ensinaram. Ao meu
querido pai que as circunstâncias impedem de estar mais presente, e a minha
amadíssima mãe que partiu em corpo, mas deixou sua marca impressa em toda a
minha vida.
Obrigada ao Daniel, meu amor. Por seu amor incondicional, seu companheirismo,
sua paciência com meus horários loucos. Te agradeço, ainda mais, por admirar e
respeitar o que faço.
Por fim, agradeço a todos aqueles que fizeram parte da minha vida em algum
momento, mesmo que pequeno. Inclusive aqueles que deixaram uma má impressão.
Afinal, somos resultado de todas as experiências que vivemos, então de alguma
forma sou um pouquinho de todos vocês.
À Deus...
VIII
Dedico este trabalho
Aos loucos e sonhadores
Que insistem na idéia de que
É sempre possível recomeçar.
IX
Resumo
As metaloproteinases de matriz (MMPs) são proteases dependentes de cálcio
e zinco com capacidade para degradar componentes da matriz extracelular (ECM).
Além da degradação da matriz, que facilita o remodelamento tecidual e a migração
celular, sua atividade pode resultar na geração de epítopos que atuam como
ativadores celulares, assim como na liberação de fatores de crescimento e citocinas
aprisionados na ECM.
A literatura mostra que MMPs podem ter sua atividade regulada por espécies
reativas de oxigênio (ROS). Os radicais livres e o estresse oxidativo provocado por
eles, poderiam afetar a atividade das MMPs tanto diretamente, por meio da oxidação
de domínios específicos, como indiretamente, ao modular sua expressão via
elementos sensíveis a redução/oxidação tais como NFkB e AP-1, que possuem sítio
de ligação na região promotora do gene das MMPs.
Nosso grupo e outros têm mostrado que o heme é uma potente molécula pró-
inflamatória, capaz de induzir a ativação de macrófagos e neutrófilos humanos.
Como o heme está envolvido na geração de estresse oxidativo, por induzir a
geração de ROS, decidimos investigar se esta molécula estaria envolvida na
secreção da MMP-9. Para isto, realizamos experimentos in vitro, utilizando como
modelo cultura de macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 . Para análise do
fenômeno in vivo optamos por um modelo de inflamação pulmonar em camundongos
da linhagem C57BL/6.
Primeiramente, incubamos as células RAW com diferentes concentrações de
hemoglobina e heme e medimos a atividade da pró-MMP-9 por zimografia. Em
seguida, confirmamos a habilidade do heme em induzir a produção de superóxido
neste tipo celular utilizando a técnica de redução do citocromo c SOD-inibida.
Nossos resultados indicam uma clara indução do superóxido, de forma dose-
dependente, pelo heme. A indução da secreção da pró-MMP9 pelo heme foi inibida
pelo pré-tratamento com o antioxidante N-acetil-cisteína e pelo inibidor da atividade
da NADPH oxidase DPI, sugerindo um provável papel de ROS neste evento.
Posteriormente, injetamos diferentes concentrações de heme na traquéia de
camundongos com o objetivo de simular um processo inflamatório pulmonar. Após
24 e 48 horas do estímulo, realizamos lavados broncoalveolares (BAL) que foram
utilizados para contagem diferencial de células e análise da atividade de MMP-9 por
zimografia. Também foram feitos extratos de pulmões para análise da expressão de
MMP-9 por Western Blot. Os resultados encontrados mostraram um aumento de
células inflamatórias nos tempos analisados. O BAL indicou um aumento significativo
na secreção da MMP em 48 horas, assim como o Western Blot aponta para um
aumento na quantidade desta MMP-9 em todo o órgão. Mostramos ainda, in vitro,
que macrófagos alveolares aumentam a secreção de MMP-9 ao serem estimulados
com o heme.
Juntos, nossos resultados sugerem que a liberação de heme após eventos
hemolíticos ou hemorrágicos podem aumentar a secreção da MMP-9 em
macrófagos, o que por sua vez, desempenharia um papel importante na promoção
da remodelagem tecidual/vascular associada a processos inflamatórios .
X
Abstract
Matrix metalloproteinases (MMPs) are calcium- and zinc-dependent proteases
that have the combined capacity to degrade several components of the extracellular
matrix. Besides the degradation of extracellular matrix (ECM), which facilitates tissue
remodeling and cell migration, their activity can result in the generation of epitopes
that act as cell effectors as well as in the release of ECM sequestered growth factors
and cytokines.
Several works demonstrated that MMPs can be their expression regulated by
reactive oxygen species (ROS). Free radicals, and the resulting oxidative stress,
could affect the activity of MMPs both directly, through the oxidation of critical
domains, and indirectly by modulating its expression through redox-sensitive
elements such as NFκB and AP-1 that are known to be an integral part of the binding
sites for MMP transcription.
We and others have shown that heme is a potent pro-inflammatory molecule,
able to induce the activation of human neutrophils and macrophages. Since heme is
involved in the generation of oxidative stress by promoting ROS production we
sought to investigate whether this molecule would be involved in the secretion of
MMP-9. We thus performed in vitro experiments with culture murine macrophage
RAW 264.7 cells. To verify the same in vivo phenomenon, we chose a mouse
pulmonary inflammation model.
We first incubated the RAW cells with different concentrations of both,
hemoglobin and heme. After that we measured the activity of pro-MMP-9 by
zimography. Next we confirmed the ability of heme to induce superoxide production
in this cells by using SOD-inhibitable cytochrome c reduction. Our results indicated a
clear dose-dependent induction of superoxide by heme. The induction of pro-MMp-9
secrection by heme was blocked by pre-treatening the cells with N-acetyl-cystein
(antioxidant) and DPI (NADPH oxidase inhibitor) suggesting the potential involvement
of ROS in this event.
Later we injected different concentrations of heme intratracheally in mouse
aimed to simulate a pulmonary inflammatory process. After 24 and 48 hours from
stimulus we collected a bronchoalveolar lavage (BAL) to verified the airway cellular
accumulation and zimography analysis. Pulmonary extracts were prepared to
Western Blot analysis of MMP-9 expression. The found results demonstrated an
increased in number of inflammatory cells in both times. The challenge with heme
caused a significant increased in BAL MMP-9 secretion in 48 hours, as well as the
Western Blot analysis indicated to increase in MMP-9 expression in all lung. We
found that MMP-9 secretion in alveolar macrophage is incresead by heme too.
Taken together, our results suggest that release of heme after hemolytic or
hemorrhagic events can increase the macrophage secretion of MMP-9, which could
in turn, play an important role by promoting tissue/vascular remodeling associated to
inflammatory process.
XI
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO 17
1.1-A molécula de heme 17
1.1.1-O efeito pró-oxidante do heme 21
1.1.2-O heme como um sinalizador 23
1.1.3-O papel do heme na inflamação 25
1.2-As metaloproteinases de matriz 27
1.2.1-A regulação das metaloproteinases de matriz 30
1.2.2-A participação das metaloproteinases de matriz nos processos
inflamatórios 33
1.2.3-As metaloproteinases de matriz e os processos inflamatórios
pulmonares 37
1.2.4-A metaloproteinase-9 de matriz 40
2-OBJETIVOS 44
3-MATERIAL E MÉTODOS 45
3.1-Animais 45
3.1.1-Procedimentos cirúrgicos 45
3.1.2-Homogenatos de pulmão 46
3.1.3-Lavado Broncoalveolar 46
3.1.4-Contagem diferencial de células 47
3.1.5-Indução de MMP-9 em macrófagos alveolares 47
3.2-Cultura de células 49
3.3-Tratamentos dos macrófagos murinos da linhagem RAW 50
3.3.1-incubações com hemoglobina 50
3.3.2-Incubações com heme 50
3.4-Ensaio de viabilidade celular (MTT) 51
3.5-Ensaio de redução do citocromo c 52
3.6-Preparo das amostras de cultura de células para zimografia 52
3.7-Zimografia 53
3.8-Western Blot 53
3.9-Análise estatística dos dados 55
4-RESULTADOS 56
4.1-O efeito da hemoglobina sobre a secreção de MMP-9 56
4.2-O efeito da molécula de heme sobre a secreção de MMP-9 59
4.3-O efeito da molécula de heme sobre a produção de ROS 63
4.4-A participação de ROS na secreção de MMP-9 induzida por heme 66
4.5-Análise da participação de NADPH oxidase na secreção de MMP-9 induzida por
heme 68
4.6-Análise do heme sobre a secreção de MMP-9 em um modelo de inflamação
pulmonar 71
4.6.1-Perfil das células encontradas no BAL de camundongos tratados com
heme 72
4.6.2-Análise da secreção de MMP-9 em BAL de camundongos tratados com
heme 75
4.6.3-Análise da presença de MMP-9 no tecido pulmonar de camundongos
tratados com heme 77
XII
4.7-A secreção de MMP-9 em macrófagos alveolares estimulados com heme 80
4.8-O efeito do heme sobre a secreção de MMP-9 em células tumorais 82
5-DISCUSSÃO 85
5.1- A hemoglobina e o heme induzem a secreção de MMP-9 em macrófagos
murinos 85
5.2-O efeito do heme sobre a secreção de MMP-9 em macrófagos murinos envolve a
participação de ROS 87
5.3-O heme aumenta a secreção de MMP-9 em um modelo inflamação pulmonar 89
5.4-O heme induz a secreção de MMP-9 em células tumorais da linhagem DI145 92
6-CONCLUSÃO 95
7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 100
XIII
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADAM: Desintegrina e tipo-metaloproteinase, ou adamalisina
AP-1: Proteína-1 ativadora
ARE: Elemento de resposta antioxidante
Bach-1: Fator de transcrição zipper básico de leucina-1
BAL: Lavado broncoalveolar
BBB: Barreira hemato-encefálica
DNA: Ácido desoxirribonucléico
DPOC: Doença pulmonar obstrutiva crônica
DMEM: Meio de Eagle modificado por Dulbecco
ECM: Matriz extracelular
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
DPI: Diphenylene iodonium
Fas-L: Ligante de Fas
GPI: Glicosilfosfatidilinositol
HELLP: Nível elevado de hemólise no fígado e baixo número de plaquetas
HO: Heme oxigenase
HRM: Motivos regulados por heme
ICAM-1: Molécula de adesão intracelular 1
IFN-γ: Interferon gama
IL: Interleucina
LDL: Lipoproteína de baixa densidade
LPS: Lipopolissacarídeo
LRP: Receptor de LDL
MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno
MARE: Elementos de reconhecimento de proteínas Maf
MMP: Metaloproteinase de matriz
MT-MMP: Metaloproteinase de matriz associada a membrana
NAC: N´acetil-cisteína
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NFκB: Fator nuclear de transcrição κB
Nrf2: Fator relacionado a NF-E2
PBS: Tampão fosfato
PECAM-1: Molécula de adesão de plaquetas/células endoteliais-1
PEX: Domínio do tipo hemopexina
PKC: Proteína kinase C
PMA: Acetato de forbol miristate
RNS: Espécies reativas de nitrogênio
ROS: Espécies reativas de oxigênio
RPM: Rotações por minuto
SAPK: Proteína quinase ativada por estresse
SDS: Dodecil sulfato de sódio
SEM: Média do erro padrão
SFB: Soro fetal bovino
sMAF: Pequenas proteínas Maf
XIV
SOD: Superóxido dismutase
TACE: Enzima conversora de TNF-α
TGF: Fator de crescimento transformante
TIMP: Inibidor tecidual de metaloproteinases
TNF: Fator de necrose tumoral
TS2: Trombospondina 2
TSP1: Trombospondina 1
uPA: Ativador de plasminogênio uroquinase
uPAR: Receptor do ativado de plasminogênio uroquinase
VCAM-1: Molécula de adesão de célula vascular
VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular
XV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fórmula estrutural da molécula de Heme e da Hemina.
Figura 2 - Destino da Hemoglobina e do Heme liberados durante hemólise
intravascular.
Figura 3 - Estrutura das metaloproteinases de matriz extracelular.
Figura 4 – Cascata proteolítica de ativação das MMPs.
Figura 5 – “Shedding” do pró-TNF-α.
Figura 6 – Expressão de MMPs durante o desenvolvimento do pulmão em
camundongos.
Figura 7 – Aparato para realização do BAL com 10 ml de PBS.
Figura 8 – A hemoglobina induz secreção de MMP-9 em macrófagos murinos.
Figura 9 – As células RAW são resistentes às concentrações de heme.
Figura 10 - Heme induz a secreção de MMP-9 em células RAW.
Figura 11 - Heme induz a produção de superóxido em células RAW.
Figura 12 – Produção de superóxido induzido por heme é equivalente outros
indutores pró-inflamtórios.
Figura 13 - As ROS estão envolvidas na secreção de MMP-9 induzida por heme.
Figura 14 – A secreção de MMP-9 induzida por heme e mediada por ROS envolve a
participação de NADPH oxidase.
Figura 15 – Análise do perfil de células encontradas após 24 e 48 horas do
tratamento com heme.
Figura 16 – Indução da secreção de MMP-9 por heme em BAL de camundongos.
Figura 17 – Indução de MMP-9 por heme em extrato de pulmão de camundongo.
Figura 18 - Heme induz a secreção de MMP-9 em macrófagos alveolares.
Figura 19 - Heme induz a secreção de MMP-9 em células DU145.
Figura 20 – As células DU145 não são resistentes a concentrações elevadas de
Heme.
XVI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Tabela com os substratos das MMP-1 a MMP-10.
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 A molécula de heme
O heme é um complexo formado por um átomo de ferro e uma protoporfirina
que consiste em quatro anéis pirrólicos ligados por grupos –CH. Quando o átomo de
ferro está em seu estado ferroso, o complexo é chamado de ferroprotoporfirina ou
heme; quando ele está em seu estado férrico, o complexo é chamado de
ferriprotoporfirina ou hemina (Kumar e Bandyopadhyay, 2005), como mostra a figura
1.
Figura 1. Fórmula estrutural da molécula de Heme e da Hemina. No heme o ferro está
em seu estado ferroso (Fe
2+
), enquanto que na hemina o ferro se encontra em seu estado
férrico (Fe
3+
).
(Kumar e Bandyopadhyay, 2005).
18
O heme é uma molécula essencial aos organismos aeróbicos e desempenha
um papel importante em diversas reações biológicas, sendo que sua função, em
última análise, depende da proteína à qual ele está ligado (Dawson, 1988). Por
exemplo, na hemoglobina e mioglobina, sua função é o transporte e estocagem de
oxigênio respectivamente, enquanto que nos citocromos, ele está envolvido com o
transporte de elétrons, geração de energia e transformação química. Nas catalases,
o heme participa da degradação do peróxido de hidrogênio, enquanto que nas
peroxidases, atua em diferentes funções biológicas na presença de peróxido de
hidrogênio (Bandyopadhyay et al., 1992).
Apesar de sua indiscutível relevância fisiológica, tanto para os organismos
aeróbicos quanto para alguns anaeróbicos, o heme, em sua forma livre, é
potencialmente perigoso para os sistemas biológicos. Entre outros efeitos, o heme é
capaz de gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que, por sua vez, causam
danos a diversas biomoléculas como carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos
nucléicos (Gutteridge e Smith, 1988; Ponka, 1999; Vincent, 1989; Ryter e Tyrrell,
2000).
Reiter et al. (2002) encontraram no sangue de pacientes com anemia
falciforme (sickle-cell disease), doença que apresenta um quadro de hemólise
severa, concentrações de heme em torno de 20 µM. Levando em consideração o
grau de compartimentalização da hemoglobina dentro dos eritrócitos, podemos
inferir que mesmo pequenos eventos hemolíticos são capazes de liberar uma grande
quantidade de hemoglobina e, conseqüentemente, uma grande quantidade de
heme. Este fato nos faz acreditar que estados patológicos caracterizados por
19
grandes eventos hemolíticos, como isquemia por reperfusão e malária, resultam em
grandes quantidades de heme livre.
A detoxificação do heme, em casos como os citados anteriormente, é um
importante mecanismo de proteção ao ambiente redox produzido por ele. O principal
mecanismo de detoxificação existente envolve uma família de enzimas conhecidas
como heme oxigenases (HO), que se apresentam em três isoformas – HO-1 (forma
indutível) e as constitutivas HO-2 e HO-3.
Quando os eritrócitos são destruídos dentro do compartimento vascular, a
hemoglobina é liberada no plasma, se dimeriza, e rapidamente se liga a uma
proteína sérica chamada haptoglobina. O complexo hemoglobina-haptoglobina
passa a apresentar um novo epítopo que é reconhecido pelo receptor scavenger
CD163, encontrado em monócitos/macrófagos (figura 2). O CD163 é capaz de se
ligar com alta afinidade ao complexo e medeia sua endocitose e degradação
(Kristiansen et al, 2001).
O heme é liberado da hemoglobina ao ser oxidado. Ele, então, se liga com
alta afinidade a uma glicoproteína plasmática chamada hemopexina, a formação
deste complexo, por si só, reduz o efeito tóxico do heme livre. O complexo heme-
hemopexina se liga ao seu receptor específico na membrana plasmática dos
hepatócitos e, assim, é translocado para dentro das células e degradado
enzimaticamente (Rother et al., 2005). A albumina é outra proteína sérica capaz de
se ligar ao heme, no entanto, com menor avidez que a hemopexina.
20
Figura 2. Destino da Hemoglobina e do Heme liberados durante hemólise
intravascular. Quando o eritrócito sofre lise libera a hemoglobina (oxihemoglobina)
seqüestrada em seu interior para o lúmen do vaso. A hemoglobina, que é um tetrâmero, se
dimeriza. Os dímeros sofrem oxidação e se transformam em metahemoglobina, que liberta o
heme, agora em seu estado férrico. Os dímeros se complexam com a proteína sérica
haptoglobina que, juntos, se ligarão ao receptor CD163 dos monócitos/macrófagos para
serem endocitados. O heme livre se liga à hemopexina e é transportado para ser degrado
no fígado. (Rother et al., 2005).
A HO é a enzima que degrada o heme e desempenha um papel significativo
na proteção das células do estresse oxidativo induzido pelo heme. Ela quebra a
molécula de heme em quantidades equimolares de monóxido de carbono (CO),
biliverdina e ferro. As moléculas resultantes da degradação do heme possuem
funções próprias e distintas da molécula que os originou. O CO, por exemplo, possui
propriedades vasodilatadoras, anti-proliferativas, anti-inflamatórias e anti-oxidantes
(Ryter et al., 2002), enquanto a biliverdina apresenta propriedades anti-oxidantes e é
convertida à bilirubina pela biliverdina redutase (Baranano et al., 2002). O átomo de
ferro derivado do heme é seqüestrado pela ferritina para ser reaproveitado, desta
forma seus efeitos pró-óxidantes são suprimidos.
A HO pode ser induzida por diversos estímulos. O TNF-α e a IL-1β induzem
HO-1 em células endoteliais via PKC, cálcio e fosfolipase A2. O ferro induz HO-1 no
endotélio pulmonar. A lipoproteína de baixa densidade (LDL) oxidada induz HO-1 em
células musculares lisas vasculares. Grupamentos -SH interagem com NO para
induzir HO-1. A depleção de glutationa e a isquemia induzem HO-1 no cérebro
21
(Wagner et al., 2003). Por fim, o heme e outros mediadores de estresse oxidativo
estimulam a expressão de HO-1.
Estudos recentes demonstraram que a HO-1 está envolvida na produção e na
atividade de VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular) em células
endoteliais (Jozkowicz et al., 2002), células musculares lisas vasculares (Dulak et al.,
2002) e keratinócitos (Jazwa et al., 2006). Esses dados corroboram um efeito pró-
angiogênico para a HO-1 que, nos casos de injúria a pele, pode ser induzida pela
presença do heme liberado por eritrócitos danificados.
1.1.1 O efeito pró-oxidante do heme
A molécula de oxigênio (O
2
) é essencial à vida, mas sua eletronegatividade
implica em sua redução univalente, produzindo o que chamamos de radicais de
oxigênio. Em suma, radicais livres são espécies químicas que apresentam um ou
mais elétrons desemparelhados (Halliwell e Gutteridge, 1990; Jansen, 2003). Estes
radicais livres podem causar sérios danos às células.
Esta transferência passo a passo de elétrons para o O
2
, que ocorre durante o
metabolismo oxidativo,
leva à formação de intermediários reativos como o ânion
superóxido (O
2
-
), o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical hidroxila (OH
•
).
Estas espécies reativas de oxigênio (ROS) também são produzidas pelas
células fagocitas no combate às infecções por microorganismos (Cheson et al.,
1977; Babior, 2000). Os radicais tóxicos, neste caso, são liberados para eliminar o
invasor em um evento conhecido como explosão respiratória ou “burst oxidativo”.
22
Em pequenas concentrações as ROS não chegam a ser tóxicas e atuam, na
verdade, como sinalizadores intracelulares. No entanto, ao serem geradas em
grandes quantidades interferem na homeostase celular, bem como, provocam danos
importantes a célula por oxidar carboidratos, proteínas, lipídios e DNA (Sies, 1985).
Para lidar com estes efeitos indesejáveis das ROS, os organismos vêm
aparelhados com mecanismos de defesa que podem prevenir a geração destas
espécies, ou eliminar as já formadas, ou ainda, reparar as moléculas danificadas por
elas (Sies, 1985). Estes mecanismos antioxidantes podem ou não envolver atividade
enzimática.
O desequilíbrio entre as condições pró-oxidantes e os mecanismos de defesa
antioxidantes, gera a condição fisiológica que chamamos de estresse oxidativo. Esta
condição tem como conseqüência as disfunções biológicas anteriormente citadas
(Sies, 1993).
As proteínas podem ser oxidadas por reações catalisados por metais. O ferro
é freqüentemente associado a estas reações, pois gera ROS através de sua reação
com o oxigênio molecular ou o peróxido de hidrogênio. Em ambas as situações, os
aminoácidos são oxidados alterando assim, as funções das proteínas (Levine et al.,
1990).
As ROS induzidas pela presença do ferro estão implicadas na patogênese de
numerosas desordens vasculares como a aterosclerose, anemia hemolítica
microangiopática, vasculites, injúrias causadas por reperfusão, entre outras (Kumar
e Bandyopadhyay, 2005). Uma abundante fonte de ferro redox-ativo é o heme
proveniente de heme-proteínas intracelulares. O heme livre é capaz de danificar
lipídios, proteínas e DNAs através da geração de ROS, e a oxidação de
23
componentes da membrana pode, inclusive, levar à lise e morte celular (Schmitt et
al., 1993).
1.1.2 O heme como um sinalizador
É possível encontrar na literatura, diversos trabalhos que mostram que tanto o
heme, quanto as moléculas resultantes de sua degradação, estão envolvidos em
diversos processos de sinalização intracelular. O efeito do heme como sinalizador
tem um caráter pleiotrópico, pois ele atua em vários níveis de regulação (Mense e
Zhang, 2006).
Como visto anteriormente, o heme é capaz de induzir a geração de ROS, que
por sua vez modulam ativamente inúmeras vias de sinalização. A regulação da
expressão gênica via processos de oxidação-redução é um mecanismo importante
para o funcionamento celular via modulação dos fatores de transcrição (Haddad,
2002a).
As espécies reativas de oxigênio, em concentrações moderadas, participam
como segundos mensageiros na regulação de vias bioquímicas intracelulares
importantes como, por exemplo, as das MAPK e da kinase Akt. Além disso, são
capazes de influenciar a expressão gênica de diversas proteínas relacionadas a
processos inflamatórios (Griendling et al., 2000). Já é bem estabelecido pela
literatura que os fatores de transcrição NFκB e AP-1 são regulados por estado redox
intracelular (Sen e Packer, 1996).
24
A indução da expressão gênica pelo fator de transcrição NFκB, envolvendo
sinalização redox, é uma das mais estudadas. O NFκB pode ser ativado por
moléculas oxidantes e sua atividade é inibida por um série de antioxidantes
(Haddad, 2002a). Após translocar-se para o núcleo, o NFκB, guiado por uma
seqüência sinal, se liga a sítios na região promotora do gene, ativando sua
transcrição, cujos produtos da resposta inflamatória, entre outras funções, atuam
como mediadores (Haddad, 2002b).
Outros fatores de transcrição, pertencentes a família AP-1 (activator protein-
1), que regulam ongenes como c-fos e c-jun, também podem ser modulados por
alterações do estado redox (Abate et al., 1990). Os genes c-fos e c-jun são induzidos
por estímulos extracelulares e regulam a transcrição de proteínas envolvidas em
processos de proliferação e transformação celular (Sun e Oberley, 1996).
Quando associado à proteína sérica hemopexina, o heme é capaz de ativar,
após ser endocitado via receptores de hemopexina, uma cascata de sinalização que
levaria à ativação da proteína quinase c-Jun N-terminal (Eskew et al., 1999). Esta
quinase é também conhecida como proteína quinase ativada por estresse (SAPK),
um membro da família das MAP quinases ativadas por exposição a luz ultravioleta,
choque térmico ou citocinas inflamatórias (Woodggett et al., 1996). Essa quinase
desempenha um importante papel no desencadeamento de respostas celulares a
diferentes tipos de estímulos e leva à fosforilação do fator de transcrição c-jun.
Uma outra maneira do heme atuar como sinalizador é agindo diretamente
como regulador de vias metabólicas. O heme é capaz de regular a atividade de
alguns fatores de transcrição. Um bom exemplo são os genes que possuem em sua
região promotora a seqüência MARE (Maf recognition Elements). As proteínas sMAF
25
(small Maf Proteins) podem se associar a certos fatores de transcrição e assim, se
ligarem ao MARE (Motohashi et al., 2002).
Um dos fatores de transcrição que podem se ligar às sMAF é o Bach-1. O
Bach-1 possui em sua seqüência regiões denominadas HRM (Heme Regulatory
Motifs) que são caracterizadas pela presença de um resíduo de cisteína responsável
pela ligação com o heme. A ligação do heme com o Bach-1 impede sua ligação ao
MARE, o que permite que outros fatores de transcrição associados a sMAF, tais
como Nrf2, se liguem a região promotora (Igarash e Sun, 2006).
O hmox1, é o gene que codifica a enzima HO-1. Este gene possui um
domínio chamado elemento de resposta antioxidante (ARE – Antioxidant Response
Element) que se relaciona estruturalmente e funcionalmente ao MARE. Por este
motivo, fatores de transcrição que se ligam ao MARE, caso do Bach-1 e do Nrf2,
podem controlar sua expressão. É através deste mecanismo que o heme induz a
expressão da HO-1 (Sun et al., 2002).
1.1.3 O papel do heme na inflamação
A molécula de heme é encontrada, em sua maior parte, associada a proteínas
que acabam por definir sua função nos sistemas biológicos. Este fato não impede
que haja uma pequena quantidade de heme livre exercendo certas funções de
cunho regulatório, como, por exemplo, influenciar a expressão de genes envolvidos
com diferenciação e proliferação celular (Ishii e Maniatis, 1971; Abraham, 1991).
26
No entanto, grandes quantidades de heme possuem efeitos potencialmente
perigosos para o organismo, pois leva à formação de ROS que, por sua vez,
induzem o estresse oxidativo, evento capaz de causar danos às células e injúria
tecidual. (Schmitt et al., 1993).
Patologias que envolvem eventos hemolíticos, como a malária (Eiam-Ong e
Sitprija, 1998), anemias hemolíticas (Hebbel et al., 1988), síndrome HELLP
(hemolysis, elevated liver levels, and low platelet count) (Baca e Gibbons, 1988),
regiões de grande turbulência do fluxo sanguíneo (Balla et al., 1991), entre outras,
podem causar níveis elevados de heme livre.
A presença de grandes quantidades de heme no leito vascular leva à
formação de infiltrados inflamatórios em diversos órgãos e à indução da ativação e
migração, in vitro e in vivo, de neutrófilos e de monócitos/macrófagos (Graça-Souza
et al., 2002).
O heme é capaz ainda de estimular a expressão de moléculas de adesão
ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina em células endoteliais (Rother et al., 2005). A
indução de moléculas de adesão neste tipo celular ocorre, provavelmente, pela
geração intracelular de ROS mediada por heme e sua subseqüente ativação de
fatores de transcrição como NFkB, AP-1 e SP-1 (Kumar e Bandyopadhyay, 2005).
As células endoteliais ativadas recrutam os leucócitos provenientes da corrente
sanguínea, estabelecendo uma das principais características da inflamação. Por fim,
esse heme liberado no leito vascular causa injúria às células endoteliais o que
determina lesões e desordens inflamatórias vasculares.
Recentemente, Arruda e colaboradores (2004) demonstraram que o heme
livre é capaz de retardar a apoptose de neutrófilos humanos in vitro, em
27
concentrações encontradas durante eventos hemolíticos in vivo. Este efeito foi
dependente da atividade da HO-1, da geração de ROS e da modulação do potencial
de membrana mitocondrial nessas células (Arruda et al., 2006). Esses dados
sugerem um papel pró-inflamatório para o heme, já que ele contribuiria para o
desenvolvimento da inflamação crônica associada a eventos hemolíticos, retardando
a apoptose e promovendo a sobrevivência de neutrófilos (Arruda et al., 2004).
Estes dados em conjuntos apontam para o heme como sendo uma importante
molécula de sinalização pró-inflamatória em eventos hemolíticos.
1.2 As metaloproteinases de matriz
As metaloproteinases de matriz (MMP) constituem uma família de mais de
vinte endopeptidases zinco- e cálcio-dependentes que estão associadas a uma
grande variedade de condições fisiológicas e patológicas envolvidas com a
degradação da matriz extracelular (ECM) e remodelagem tecidual.
Essas enzimas são subdivididas em pelo menos cinco grupos, baseados em
suas estruturas e/ou especificidade por substratos. Como podemos identificar na
figura 3, as MMPs apresentam diversos domínios em sua estrutura primária. A
estrutura mais simples é apresentada pelas MMP-7 e MMP-26, que consiste de um
peptídeo sinal, um domínio pró-peptídeo e um domínio catalítico altamente
conservado que contém um sítio de ligação para o íon zinco (McCawley e Matrisian,
2001). Todas as outras apresentam um domínio PEX (domínio de hemopexina), que
possui uma estrutura em forma de hélice, conectado ao domínio catalítico por uma
28
região de dobradiça rica em prolina. Este domínio é necessário para que as MMPs
possam se ligar a diversas outras proteínas (Stamenkovic, 2003). As MMP-2 e 9,
também chamadas de gelatinases A e B, respectivamente, contêm uma região
dentro do seu domínio catalítico com três inserções para fibronectina do tipo II, o que
permite sua ligação ao seu principal substrato, a gelatina (Lauer-Fields et al., 2002).
Algumas MMPs apresentam um sítio de clivagem para a convertase chamada furina,
isto permite que estas MMPs possam ser ativadas intracelularmente. As
metaloproteinases de membrana (MT-MMPs), diferente das outras MMPs que são
secretadas, ficam ligadas à superfície celular. Esta ligação se dá via um domínio
transmembrana C-terminal ou via uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI)
(Rundhoug, 2005).
Figura 3. Estrutura das metaloproteinases de matriz extracelular. A figura mostra uma
metaloproteinase de matriz com todos os domínios possíveis de serem encontrados nas
enzimas da família. Adaptado de Rundhaug, 2005
Todas as MMPs são sintetizadas como pró-enzimas. A maioria é secretada
como zimógenos, exceto as que são ativadas pela furina, e podem ser ativados in
vitro por proteinases e por agentes não-proteolíticos como agentes SH-reativos,
29
compostos de mercúrio e desnaturantes (Nagase e Woessner, 1999). Em todos os
casos, é necessária a dissociação do resíduo de cisteína do íon zinco, num
mecanismo chamado de switch da cisteína.
As MMPs são tradicionalmente conhecidas por seu papel na degradação dos
componentes da ECM. Como a ECM foi vista por muito tempo como uma estrutura
passiva, que servia apenas para a adesão celular e para dar suporte mecânico,
acreditou-se que o papel das MMPs restringia-se à homeostase dessa matriz ou à
facilitação da migração celular. Mas essa visão sobre a ECM está ultrapassada, pois
sabemos que nela estão contidos fatores de crescimento, proteínas de ligação e
outras moléculas bioativas, bem como, sítios de ligação para moléculas de superfície
celular. Algumas destas moléculas só se tornam biologicamente ativas após
sofrerem proteólise (Somerville et al., 2003). Isto significa que as MMPs além de
degradarem todos os componentes da matriz, modulando a estrutura tecidual para
facilitar o reparo tecidual, a migração celular e o desenvolvimento embrionário,
também atuam na liberação de moléculas que interagem com receptores celulares,
caso de fatores de crescimento que estão seqüestrados na ECM (Lee e Murphy,
2004). Já é bem documentado o envolvimento de MMPs na proteólise de moléculas
de adesão, fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e diversos receptores que
têm efeitos multifatoriais sobre o comportamento celular (Sternilicht e Werb, 2001).
Atualmente, dá-se muita importância à participação dessas enzimas no
crescimento tumoral e metástase devido ao seu papel no processo de angiogênese
(criação de novos vasos sangüíneos) e migração de células tumorais que ocorre na
metástase. O estudo do processo de angiogênese é alvo de inúmeros grupos
científicos e tem especial relevância neste contexto uma vez que a criação de novos
30
vasos ocorre para suprir tecidos em crescimento e expansão, como por exemplo,
tecidos tumorais.
1.2.1 A regulação das metaloproteinases de matriz
Como as MMPs possuem uma grande quantidade de substratos (tabela 1), é
razoável supor que elas estejam envolvidas em numerosas situações fisiológicas.
Por este motivo, a regulação de sua atividade e síntese deve ser muito fina, e
realizada de diversas formas.
Tabela 1 – Tabela com os substratos das MMP-1 a MMP-10. As MMPs possuem uma
grande quantidade de substratos, entre eles estão moléculas que não são componentes da
matriz extracelular. Esta tabela mostra os substratos de algumas MMPs. Adaptado de
Somerville et al, 2003.
31
Uma forma óbvia de regulação é a ativação ou inativação proteolítica dos
zimógenos. A plasmina, gerada a partir do plasminogênio, é capaz de iniciar uma
cascata de ativação onde pró-MMPs vão sendo ativadas por MMPs que já sofreram
uma ativação inicial pela plasmina (figura 4). A MMP-2, uma gelatinase de síntese
constitutiva, apresenta um mecanismo particular de ativação. Ela é ativada na
superfície celular pelo complexo formado pela metaloproteinase de membrana MT1-
MMP e o inibidor tecidual de metaloproteinase TIMP-2 (Chakraborti et al., 2003).
Figura 4 – Cascata proteolítica de ativação das MMPs. O ativador de plasminogênio
uroquinase (uPA) ao se ligar a seu receptor (uPAR) na superfície celular permite a
conversão do plasminogênio em plasmina. A plasmina é o principal ativador de várias
MMPs, inciando uma cascata de ativações. Nessa cascata, as MMPs ativadas pela
plasmina ativam outras pró-MMPs. As MT-MMPs também são ativadores de pró-MMPs,
sozinhas (caso da pró-MMP-13) ou associadas a inibidores teciduais (TIMPs), caso em que
a MT-MMP1 está associada ao TIMP-2 para ativar a pró-MMP-2. Adaptado de Beaudeux et
al., 2004.
O clearence (inativação e retirada do meio extracelular) das MMPs, é outra
forma importante de regulação. A trombospondina (TS2) é um bom exemplo de
molécula capaz de regular a atividade dessas enzimas. A TS2, que normalmente se
32
liga ao receptor LRP (low density lipoprotein receptor-related protein), é capaz de se
complexar com as formas pró e ativa da MMP-2. Sendo assim, ao ser endocitada
leva consigo a MMP-2 para dentro da célula (Yang et al., 2001).
A atividade dessas endopeptidases pode ser também regulada pela ação de
inibidores, notavelmente os inibidores teciduais de MMPs conhecidos como TIMPs e
pela α2-macroglobulina, um inibidor sérico de proteases. O nível de expressão das
MMPs pode ainda ser modulado por diferentes citocinas, fatores de crescimento,
hormônios, agentes químicos, estresse físico, oncogenes e interações com a própria
matriz (Nagase e Woessner, 1999).
As MMPs podem ser reguladas também a nível transcricional. Werb et al.
(1989) mostraram que adição de anticorpo anti-integrina α
5
β
1
em cultura de
fibroblastos de coelho, leva à ruptura do citoesqueleto de actina e aumenta a
expressão de MMP-1. Posteriormente, descobriu-se que isto se deve a ativação da
proteina ligante de GTP Rac1, que leva à geração de ROS e conseqüente ativação
do fator de transcrição NFκB (Kheradmand et al., 1998). Esta ativação leva à
indução da citocina IL-1α, que é um indutor autócrino da expressão de MMP-1
(Tremble et al., 1995).
Os radicais livres, e o resultante estresse oxidativo, podem afetar diretamente
e indiretamente a atividade das MMPs. O processo direto pode envolver a oxidação
ou nitrosilação de MMPs, resultando em sua ativação (Liu e Rosenberg, 2005). De
forma indireta, as ROS atuam sobre elementos redox-sensíveis existentes em
fatores de transcrição, como NFκB ou AP-1, conhecidos por terem sítios de ligação
em diversos genes de MMPs (Liu e Rosenberg, 2005). Rajagopalan et al. (1996)
demostraram que pequenas doses de H
2
O
2
são capazes de ativar a MMP-2 em
33
macrófagos espumosos isolados de ateroma aórtico. Por outro lado, altas doses são
capazes de provocar o efeito contrário, mobilizando o átomo de zinco existente no
sítio catalítico. Este resultado mostra que o estresse oxidativo pode apresentar uma
modulação bifásica. Outro estudo apresenta evidências de que a citocina IL-1β
aumenta a expressão de MMP-9 em macrófagos, via produção de ROS com
envolvimento do fator de transcrição NFκB (Yoo et al., 2002). É importante lembrar
que as ROS são conhecidas por reagirem com grupamentos –SH (ou grupo tiol),
exatamente como aqueles envolvidos na preservação da latência dessas enzimas,
portanto, poderiam modular sua atividade diretamente (Rajagopalan et al., 1996).
1.2.2 A participação das metaloproteinases de matriz nos processos
inflamatórios
A literatura vem mostrando, de forma sistemática, o envolvimento das MMPs
em diversas doenças nas quais o processo inflamatório está presente. Modelos in
vitro e in vivo têm demonstrado que estas enzimas têm um papel importante na
defesa imunológica, no processo inflamatório e na injúria e reparo teciduais (Parks et
al., 2004).
Como possuem um número razoável de substratos, além daqueles que fazem
parte da ECM, as MMPs estão envolvidas em numerosos processos biológicos. Por
este motivo, sua regulação é feita em diversos níveis e de várias formas. Um
desequilíbrio entre sua expressão e sua regulação pode contribuir para o surgimento
ou agravamento de importantes processos patológicos.
34
O desequilíbrio entre MMP e TIMP é um evento bastante comum nos estudos
sobre a aterosclerose. As placas de ateroma apresentam uma quantidade
aumentada de MMPs, principalmente, nas regiões de instabilidade, que são ricas em
células esponjosas (Li et al., 1996). O aumento da secreção de MMPs na parede
aterosclerótica é mediado por moléculas pró-inflamatórias – tais como IL-1β e TGF-β
–, ROS e LDL oxidado (Rajagopalan et al., 1996: Huang et al., 1999; Uzui et al.,
1999). Em experimentos com camundongos, foi demonstrado que um aumento na
expressão de TIMP-1, retarda o desenvolvimento da aterosclerose (Rouis et al.,
1999), enquanto que camundongos com o gene da MMP-9 nocauteado tiveram uma
diminuição no espessamento da camada íntima do vaso, bem como, na migração de
células musculares lisas (Galis et al. 2002), responsáveis em grande parte pela
estabilização da placa de ateroma.
Outra associação entre MMPs e inflamação se faz por sua ação proteolítica
sobre diversas moléculas que estão, de alguma forma, envolvidas no processo
inflamatório. Um bom exemplo é a regulação da migração de leucócitos do leito
vascular para o interior do tecido, um evento dependente da ação de MMPs que
podem proteolisar moléculas de adesão. A MMP-7 é capaz de degradar a VE-
caderina, o principal componente nas junções aderentes das células endoteliais
(Ishikawa et al., 2006). As MMP-2 e MMP-9 também são capazes de regular a
permeabilidade do endotélio através da clivagem da ocludina, uma molécula que
compõe as “tight junctions” (junções apertadas), ação esta que rompe a barreira
hemato-encefálica (BBB) (Reijerkerk et al., 2006). O rompimento da BBB pode levar
ao agravamento de quadros inflamatórios que envolvem o sistema nervoso central.
Da mesma forma, as células dendríticas infectadas com o vírus da dengue, têm uma
35
produção aumentada de MMP-9 que, por sua vez, é responsável pela diminuição de
PECAM-1 e VE-caderina, ambas moléculas expressas nas junções das células
endoteliais. Esta diminuição aumenta a permeabilidade vascular e está envolvida
nos quadros de dengue hemorrágica (Luplertlop et al., 2006).
Diversos trabalhos mostram que as MMPs podem tanto promover como
reprimir a inflamação atuando sobre citocinas ou quimiocinas, ativando-as,
inativando-as ou antagonizando suas funções (McQuibban et al., 2000; McQuibban
et al., 2001; McQuibban et al., 2002). Um bom exemplo deste mecanismo é a ação
destas enzimas sobre a citocina pró-inflamatória TNF-α (fator-α de necrose tumoral).
Quantidades aumentadas desta citocina estão relacionadas a quadros como choque
séptico e diversas doenças autoimunes (Kollias et al., 1999). O TNF-α é expresso
em linfócitos T, macrófagos e outras células como uma proteína de membrana que
para ser ativada precisa sofrer ação proteolítica da enzima conversora de TNF-α
(TACE), também conhecida como ADAM-17 (figura 5). Esta enzima pertence à
família das proteínas ADAM de desintegrinas e metaloproteinases (Black et al.,
1997). No entanto, diversas MMPs (MMP-1, 2, 3, 9, 12, 14, 15 e 17) são, também,
capazes de converter o pró-TNF-α em sua forma ativa (Mohan et al., 2002). A
diferença está no fato de que a TACE está, aparentemente, envolvida na conversão
da citocina em eventos como a sepsi e processos inflamatórios crônicos; enquanto
as MMPs estão envolvidas na conversão de TNF-α em situações fisiológicas como o
reparo tecidual (Manicone e McGuire, 2008).
36
Figura 5 – “Shedding” do pró-TNF-α. A citocina TNF-α é uma proteína de membrana em
seu estado inativo (proTNF). Ela sofre clivagem da também proteína de membrana
TACE/ADAM-17 (shedding), liberando uma parte solúvel (sTNF) que é ativa, e irá se ligar ao
receptor de TNF (TNFR) para induzir uma determinada resposta. Adaptado de Moss et al.,
2008.
Muitos são os exemplos de processamento bioquímico de citocinas,
quimiocinas, moléculas de adesão e até moléculas envolvidas com a apoptose, caso
do Fas-L, que envolvem a ação de MMPs. As conseqüências da participação destas
enzimas podem ser fisiológicas ou patológicas, isto dependerá do tipo celular e
substratos envolvidos, do funcionamento adequado dos mecanismos de regulação
e, se for o caso, das características de desenvolvimento de cada doença.
37
1.2.3 As metaloproteinases de matriz e os processos inflamatórios pulmonares
Assim como em todos os outros tecidos do organismo, as MMPs são
fortemente reguladas no pulmão. Muitas delas são expressas por células deste
tecido e têm sua expressão alterada em doenças inflamatórias associadas a ele.
O pulmão é um órgão altamente vascularizado que está em contato direto
com o meio ambiente externo através da troca de gases. Por este motivo, uma de
suas principais funções é proporcionar a defesa do organismo, protegendo-o contra
diversos microorganismos invasores e outras agressões externas.
Embora pequenas quantidades de MMP-2 e MMP-14 estejam presentes nos
fluidos pulmonares em condições normais, outras MMPs como MMP-7, MMP-8,
MMP-9 e MMP-12 sofrem regulação durante muitos estados patológicos deste órgão
(Greenlee et al., 2007).
No pulmão as MMPs são reguladas de diversas formas. A nível transcricional,
em uma regulação resultante da ação de fatores de transcrição, e a nível
transducional. Os fatores de transcrição respondem à sinalização feita por fatores de
crescimento; citocinas e quimiocinas; ROS - que também podem atuar diretamente
sobre a transcrição gênica - e RNS; fatores ambientais como o fumo e a poluição;
moléculas presentes em microorganismos patogênicos; e estresse mecânico
resultante de obstruções na ventilação ou aumento de pressão do órgão, que
podem, em último caso, resultar no aumento de produção de ROS ou outras
moléculas envolvidas na regulação das MMPs (Greenlee et al., 2007).
38
A regulação após a transcrição e transdução gênica está relacionada às
formas de ativação dos zimógenos de MMP. A localização das enzimas, como já foi
dito anteriormente, também é uma forma de controle da ação desta enzimas.
As MMPs estão presentes e atuantes desde as etapas iniciais do
desenvolvimento dos pulmões. Algumas MMPs (MMP-14 e MMP-12) têm papel
prepoderante nos primórdios da morfogênese do órgão e seu papel vai sendo
reduzido ao longo do desenvolvimento. Outras, surgem e começam a atuar a partir
de determinado estágio do desenvolvimento (figura 6) (Ryu et al., 2005).
Figura 6 – Expressão de MMPs durante o desenvolvimento do pulmão em
camundongos. As MMP-2 e MMP-14 são constitutivamente expressas em todos os cinco
estágios do desenvolvimento pulmonar (formação primária, pseudoglandular, canalicular,
sacular e alveolar). A expressão destas MMPs diminui gradativamente com a conclusão do
desenvolvimento. A expressão de outras MMPs se segue ao período pós-natal e em
pulmões adultos. Adaptado de Greenlee et al., 2007.
39
Durante as doenças inflamatórias que acometem o pulmão, células do
sistema imune como macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos, se dirigem ao
órgão e expressam outras MMPs, caso das MMP-8, MMP-9 e MMP-12. Outros tipos
celulares também respondem secretando estas enzimas quando expostos, por
exemplo, a patógenos ou toxinas. É o caso das células epiteliais alveolares que
podem expressar MMP-9 (Buckley et al., 2001).
As MMPs estão envolvidas em diversas doenças pulmonares de perfil
inflamatório. Entre elas podemos citar a Displasia Broncopulmar; a Fibrose Pulmonar
Idiopática; a Asma; a Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), caso do
Enfisema; a Fibrose Cística; a Bronquiolite Obliterante; entre outras.
A literatura é rica em mostrar casos e modelos que relacionam estas enzimas
tanto para a resolução dos processos inflamatórios como na manutenção ou
agravamento do quadro clínico.
Por exemplo, em modelo de doença pulmonar induzida por hiperóxia em
camundongos, o excesso de O
2
parece estar envolvido com a síntese e liberação de
MMP-9 e MMP-12 por neutrófilos e macrófagos alveolares, causando danos severos
ao tecido (Lian et al., 2005).
A exposição crônica à fumaça de cigarro está relacionada com a secreção de
MMP-12 por macrófagos no pulmão. Um estudo utilizando camundongos Knockout
para o gene desta MMP demonstrou que estes animais, quando expostos à fumaça
por um longo período de tempo, não recrutavam macrófagos em quantidade
suficiente e, portanto, não desenvolviam enfisema (Hautamaki et al., 1997).
40
Já algumas MMPs apresentam um papel muito íntimo com a resposta
imunológica. A MMP-7, por exemplo, é expressa de forma constitutiva pelas células
do epitélio alveolar. Contudo, sua expressão é aumentada quando estas células são
expostas à bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este aumento na expressão da
enzima parece essencial para a eliminação do patógeno, já que em camundongos
knockout para MMP-7 este combate é ineficiente (Wilson et al., 1995).
Rivera-Marrero et al. (2000) mostraram que a MMP-9 tem sua expressão
aumentada em resposta à infecção pelo Mycobacterium tuberculosis. Este aumento
da presença da enzima está intimamente relacionado com a capacidade do
organismo para lidar com a infecção, ou seja, para eliminar o bacilo.
O papel das MMPs em doenças de caráter agudo tem sido bem estabelecido
em diversos trabalhos encontrados na literatura, no entanto, o estudo dos quadros
crônicos precisa ainda de maiores investigações.
1.2.4 A metaloproteinase-9 de matriz
A MMP-9, ou gelatinase B, é expressa, de forma mais intensa, por
queratinócitos, monócitos/macrófagos e macrófagos alveolares (Beaudeux et al.,
2004), sendo a principal MMP secretada por monócitos/macrófagos. Esta enzima,
junto com as MMP-2 e MMP-3, são as principais metaloproteinases solúveis
produzidas no tecido nervoso central (Liu e Rosenberg, 2005).
Nos leucócitos, a MMP-9 é estocada, na sua forma inativa, em vesículas no
citoplasma da célula (Lee e Murphy, 2004) que são secretadas após receberem o
41
estímulo adequado. Sua ativação é feita pelas MMP-2, MMP-3 e MMP-13 ativadas
(Rundhaug, 2005), e o TIMP-1 é o seu principal inibidor fisiológico, realizando esta
função ao se complexar com o domínio PEX em sua estrutura (Brew et al., 2000).
A MMP-9, assim como as MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-10, MMP-12 e
MMP-13, são indutíveis e apresentam em sua região promotora sítios de ligação
para AP-1, PEA3, Sp1 e NFκB (Westermarck e Kahari, 1999).
Alguns trabalhos mostram que o ácido hipocloroso, que é uma ROS, é capaz
de ativar a MMP-9 através da explosão respiratória em fagócitos (Weiss et al., 1985;
Peppin e Weiss, 1986). Uemura e colaboradores (2001), num estudo sobre o
participação de ROS no quadro clínico do diabetes, mostraram que células
endoteliais de aorta bovina incubadas durante um longo período em meio com altas
doses de glicose, apresentam um aumento de ROS e conseqüente aumento de
secreção e expressão de MMP-9, bem como de sua atividade gelatinolítica. A
atividade das gelatinases A e B (MMP-2 e MMP-9) também é aumentada por ROS
produzidas por células espumosas da placa de ateroma (Ohara et al., 1993),
mostrando que estas enzimas podem desempenhar um papel importante no
processo aterosclerótico.
Na literatura encontramos ainda, trabalhos que relacionam MMPs e
angiogênese, tanto fisiológica como tumoral. A MMP-9, particularmente, atua
clivando a citocina pró-inflamatória e pró-angiogênica IL-8, o que a torna cerca de 10
vezes mais ativa. Esta metaloproteinase age, ainda, degradando e inativando o
fator-4 de plaquetas, que atua como um inibidor de angiogênese (Opdenakker et al.,
2001). Outra associação entre esta metaloproteinase e o processo angiogênico é
42
através do TSP-1, também um inibidor de angiogênese. O TSP-1 é capaz de inibir a
ativação das pró-gelatinases A e B (Egeblad e Werb, 2002).
A MMP-9 é encontrada em baixas concentrações em pulmões de adultos
saudáveis, mas se torna abundante em diversos quadros clínicos que afetam este
órgão, principalmente em doenças como a Asma, a Fibrose Pulmonar Idiopática e
em DPOC. Não se sabe dizer com certeza se esta metaloproteinase tem função na
resolução dos quadros e no remodelamento tecidual, ou se faz parte, mantendo e
amplificando, do processo inflamatório. Diversas células presentes no tecido
pulmonar secretam MMP-9, no entanto, a maior parte dos trabalhos apontam para
as células do sistema imunológico como suas maiores fontes, principalmente
neutrófilos e macrófagos alveolares (Atikinson e Sênior, 2003).
Como descrito aqui, a MMP-9 está associada a diversas situações fisiológicas
e condições patológicas que envolvem migração celular, como angiogênese,
processos metastáticos e inflamações agudas e crônicas, principalmente por sua
habilidade em degradar a membrana basal dos vasos, além de vários componentes
da matriz extracelular. O fato de ser secretada por células que podem ser
encontradas na maioria dos tecidos e órgãos, faz dela uma metaloproteinase de
extrema importância quanto ao estudo de seus mecanismos de regulação e justifica
a grande quantidade de trabalhos a seu respeito.
Algumas das características descritas anteriormente, como o fato de ser a
principal MMP secretada por fagócitos e, em muitas situações, ser regulada por
ROS, nos levaram a acreditar que esta enzima poderia ter sua secreção, e quem
sabe sua síntese, regulada pelo heme em macrófagos.
43
Sendo assim, buscamos, neste trabalho, demonstrar esta possível ligação
entre a molécula de heme, que pode ser liberada em eventos hemolíticos, e a MMP-
9, que é uma metaloproteinase intimamente ligada a imunobiologia vascular.
44
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo avaliar a capacidade da molécula de
heme como um indutor da secreção da MMP-9 (gelatinase B), in vitro e in vivo,
utilizando, para isso, cultura de célula de macrófagos murinos transformados e um
modelo de injeção intratraqueal em camundongos, respectivamente.
2.2 Objetivos específicos
¾ Demonstrar que a exposição ao heme tem efeito sobre a secreção de
MMP-9 em cultura de macrófagos murinos da linhagem RAW;
¾ Avaliar a participação de ROS no mecanismo de indução da secreção
de MMP-9 pelo heme;
¾ Analisar o efeito da exposição ao heme sobre a secreção de MMP-9,
in vivo, usando um modelo pulmonar;
¾ Testar o efeito do heme sobre a secreção de MMP-9 em outro tipo
celular.
45
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Para a realização dos experimentos in vivo foram utilizados camundongos do
sexo feminino, com, aproximadamente, 3 meses de idade e 20 gramas de peso,
pertencentes à linhagem C57BL/6, gentilmente fornecidos pelo biotério do professor
Dr. Moisés C. Marinho do Instituto de Bioquímica Média da Universidade Federal do
Rio de Janeiro.
3.1.1 Procedimentos cirúrgicos
Foram realizados dois experimentos em separado. Em cada experimento
foram utilizados vinte e quatro animais, quatro para cada condição. Foram
analisados o efeito de duas doses diferentes de heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg), em
dois diferentes períodos de tempo (24 e 48 horas), e comparados com animais
controle.
Todos os animais foram anestesiados com 40 mg/Kg de Ketamina (Syntec) e
4 mg/Kg de Xilazina (Syntec) aplicadas intraperitonealmente. As traquéias foram
expostas cirurgicamente para aplicação de injeções com heme ou PBS entre os
anéis cartilaginosos. Nos animais controles foram injetados 30 µl de PBS (ph 7.4),
enquanto que nos dois grupos de animais experimentais foram injetadas
46
concentrações diferentes de heme (75 µg/Kg e 7.5 mg/Kg) uma única vez. Após
receberem o tratamento, os animais foram suturados.
Os procedimentos feitos com animais foram aprovados, através do protocolo
IBQM 027, pela Comissão de Ética com Animais de Experimentação do CCS
(CEUA).
3.1.2 Homogenatos de pulmão
Após cada tempo experimental (24 e 48 horas), os animais de cada grupo
foram eutanasiados com uma dose excessiva de anestésico (dez vezes o valor
administrado para o efeito anestésico). O pulmão direito de cada animal foi retirado e
mixado em tampão 1 mmol/L de EDTA, 1% de Triton X-100 , 1% de coquetel de
inibidores (Sigma) e PBS. O extrato foi, então, centrifugado por 10 minutos a 10.000
rpm. O sobrenadante foi retirado e guardado à temperatura de -70˚C.
3.1.3 Lavado Broncoalveolar (BAL)
Após cada tempo experimental (24 e 48 horas), os animais de cada grupo
foram eutanasiados com uma dose excessiva de anestésico (dez vezes o valor
administrado para o efeito anestésico). Foi, então, injetado e retirado 1 ml de PBS,
por via intratraqueal, de cada animal e guardado à temperatura de - 70˚C. Estes
47
lavados foram utilizados para análise por zimografia e para contagem diferencial de
células.
3.1.4 Contagem diferencial de células
Foram colocadas em um citospin (Cientec CT-200), quantidades iguais (200
µl) de cada amostra de BAL, e centrifugadas por 6 minutos a 1.500 rpm, em
temperatura ambiente. Após secarem, as lâminas foram fixadas com metanol
durante 10 minutos e, posteriormente, coradas com eosina e hematoxilina. Em
seguida, foram lavadas com água e deixadas para secagem à temperatura
ambiente. Foram contadas 100 células por lâmina em microscópico óptico (Hund
Wetzlar) e diferenciadas segundo os critérios de padrão morfológico. Foi calculado o
percentual entre mononucleares e polimorfonucleares.
3.1.5 Indução de MMP-9 em macrófagos alveolares
Para os experimentos in vitro com macrófagos alveolares foi necessário obter
uma quantidade maior de células. Por isso foi realizada uma técnica diferente de
BAL. Neste método o pulmão foi lavado com 10 ml de PBS num ambiente extra
corpóreo conforme mostra a Figura 7. Neste procedimento, a cavidade torácica do
animal foi exposta e o conjunto traquéia, pulmão e coração foi retirado e amarrado
na ponta de uma agulha. Os pulmões foram perfundidos por via intratraqueal com 10
48
ml de PBS. O exsudato obtido foi centrifugado a 1500 RPM por 5 minutos. As células
presentes no precipitado são utilizadas para o isolamento de mononucleares
alveolares por adesão em placa.
Figura 7 – Aparato para realização do BAL com 10 ml de PBS – Duas seringas de 10 ml
são conectadas e uma agulha é amarrada ao conjunto traquéia, pulmão e coração.
As células precipitadas dos BALs de 10 camundongos foram ressuspendidas
em DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) (Gibco) com 10% SBF (soro fetal
bovino) (Gibco). Foram então distribuídas em placas de 24 poços de forma que
houvesse 3 x 10
6
células/ml em cada poço. A placa permaneceu overnight em uma
estufa a 37˚C com 5% de CO
2
, para que as mononucleares aderissem a placa
.
O
meio com as células não aderidas foi descartado e as células lavadas 3 vezes com
PBS. Um novo meio com SBF foi colocado e as células foram estimuladas por 6
horas. Os estímulos realizados foram:
a) duas concentrações de heme (Frontier Scientific Inc) de10 µM e 50 µM;
49
b) 10 µg/ml de hemoglobina (Sigma), com pré-tratamento de 15 minutos com 1
mg/ml de polimixina B (Calbiochem);
c) 10 µM de heme, com pré-tratamento de 1 hora com 10 mM de NAC (N-acetil-L-
cisteín) (Sigma);
d) 10 µM de heme, com pré-tratamento de 1 hora com 10 µM de DPI (diphenylene
iodonium) (Sigma).
Após as 6 horas de estímulo, o meio foi descartado, as células foram lavadas
3 vezes com PBS, e DMEM sem SBF foi colocado e deixado por 18 horas. Por fim, o
sobrenadante foi coletado, concentrado e guardado a - 70˚C para posterior análise
por zimografia.
3.2 Cultura de células
As células utilizadas no presente trabalho foram macrófagos murinos da
linhagem RAW 264.7, compradas do banco de células do HUCFF, e células de
câncer de próstata da linhagem DU145, gentilmente cedidas pelo professor Dr. Júlio
Scharfstein do Instituto de Biofísica da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Ambos os tipos celulares foram cultivados em meio DMEM acrescido de 3 mg/L de
bicarbonato de sódio e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco), suplementado com
10% de soro fetal bovino, e mantidos em estufa a 37ºC com 5% de CO
2.
50
3.3 Tratamentos dos macrófagos murinos da linhagem RAW
3.3.1 Incubações com hemoglobina
Nos experimentos foi utilizada hemoglobina bovina (Sigma) diluída em água.
A hemoglobina foi dialisada, dosada e estocada como uma solução de 90 mg/ml a
temperatura de -20˚C.
As células tratadas com hemoglobina ficaram 6 horas com o estímulo. Depois
disso, o sobrenadante era descartado e colocado o mesmo meio DMEM, sem SBF,
por 18 horas.
As células pré-tratadas com polimixina B sulfato (Calbiochem), receberam o
estímulo 15 minutos antes da solução de hemoglobina.
3.3.2 Incubações com heme
As soluções de heme utilizadas em todos os experimentos foram feitas com
hemina da Frontier Scientific Inc.
Os estímulos in vitro com heme foram feitos a partir de uma solução de heme
5 mM feita com NaOH 0,1 N e tampão fosfato 10x (100 mM Na
2
HPO
4
+ 20 mM
KH
2
PO
4
). As células tratadas com heme e PMA ficaram 6 horas com o estímulo.
Depois disso, o sobrenadante era descartado e colocado o mesmo meio DMEM,
sem SBF, por 18 horas. As células que foram pré-tratadas com NAC, DPI e IFN-γ
51
(interferon gama) (Sigma), receberam estes estímulos uma hora antes da solução de
heme.
Nos estímulos in vivo, foram injetados 30 µl de uma solução 0,075 mM de
heme nos animais com indução de 75 µg/kg. No outro grupo, com indução de 7,5
mg/Kg, foram injetados 30 µl de uma solução 7,6 mM de heme. Nestas soluções, o
heme também foi diluído em NaOH 0,1N e tampão fosfato 10x.
3.4 Ensaio de viabilidade celular (MTT)
As células RAW e DU145 foram distribuídas em uma placa de 24 poços,
sendo que cada poço recebeu quantidades iguais de cada tipo celular. As células
foram plaqueadas com DMEM suplementado com 10% de SBF. Cada estímulo foi
feito em triplicata. As células foram estimuladas com o veículo da solução de heme
(NaOH 0,1 N + tampão fosfato 10 x), diferentes concentrações de heme (5 µM, 10
µM, 25 µM e 50 µM) e 5% DMSO. As células controles não foram estimuladas. Após
seis horas de estímulo, o meio foi trocado por DMEM sem SBF e deixado por 18
horas. Após este tempo, o meio condicionado foi descartado e os poços lavados
com PBS. Foi colocado em cada poço 300 µl da solução de MTT (solução estoque
de MTT 5 mg/ml diluída 10 x em PBS), esta solução permaneceu por 15 minutos em
uma estufa a 37 °C. A solução foi descartada e foi adicionado 200 µl de DMSO puro,
deixando agitar por 15 minutos em um orbital. Após este tempo a placa foi levada a
um espectofotômetro, onde foi lida à 540 nm.
52
3.5 Ensaio de redução do citocromo C
Células RAW em cultura foram estimuladas com diferentes concentrações de
heme e concentrações específicas de TNF-α (Sigma), LPS (Sigma) e IL-1 (Sigma)
durante 15 minutos. Em seguida foram adicionados 1 mg/ml de citocromo c (Sigma)
em meio com e sem a enzima superóxido dismutase (SOD) (Sigma) e incubados por
30 minutos à temperatura ambiente, durante os quais a liberação de superóxido foi
medida fazendo-se a conversão em densidade óptica entre as amostras com e sem
SOD e usando-se o coeficiente de extinção molar para o citocromo c reduzido de
550 nm. A SOD, quando utilizada, estava na concentração de 200 U/ml. Os
resultados são expressos como percentagens relativas às células controle não
estimuladas.
3.6 Preparo das amostras de cultura de células para zimografia
Após as 18 horas de incubação em meio DMEM sem SBF, o sobrenadante foi
recolhido e concentrado. Para isso foram utilizados centricons (Millipore) com cut-off
de 50.000 NMWL (nominal molecular weight limit), que foram centrifugados à 3.200
rpm (centrifuga FANEM mod. 206 BL), em temperatura ambiente, até que todos os
filtros ficassem com a mesma quantidade de amostra (200 µl). As amostras foram
estocadas à temperatura de -70˚C.
53
3.7 Zimografia
Este protocolo foi adaptado de Leber e Balkwill (1997). Quantidades iguais de
amostras dos sobrenadantes e do BAL foram misturadas a um tampão de amostra
(50 mM Tris-HCl (ph 6,8), 10% glicerol, 1% SDS, 0,01% azul de bromofenol) e
submetidas a eletrofose em gel de poliacrilamida a 7,5% com SDS contendo 1mg/ml
de gelatina. Para identificação foi utilizado um padrão de gelatinases para zimografia
(Chemicon). Os géis foram submetidos a uma corrente de 85 volts até que as
amostras tivessem saído completamente de cada um. Os géis então, foram
incubados em uma solução de 2,5% de Triton X-100 em água, e postos em um
orbital por 2 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, os géis foram
colocados em um tampão contendo 10 mM de CaCl
2
, 150 mM NaCl e 50 mM de Tris
(pH 7,5) a 37ºC por 18 horas. Por fim, eles foram corados com Comassie blue (100
ml = 0,3 g comassie, 9 ml ácido acético, 46 ml metanol) e depois descorados em
metanol 40%. A proteólise é detectada pelas bandas brancas que aparecem nos
géis, elas indicam o local onde ocorreu a degradação da gelatina. Os géis são
fotografados e analisados pelo programa de densitometria ImageJ 1.38x (Wayne
Rasband – National Institutes of Healthy, USA).
3.8 Western Blotting
Para análise por Western Blotting foram dosadas a quantidade de proteína
das amostras de extrato de pulmão pelo método modificado de Lowry (1951). Foi
54
feita uma curva padrão com crescentes diluições (5, 10, 20, 30, 40 e 50 vezes) de
albumina (1 mg/ml) em água. As amostras de pulmão foram diluídas 200 vezes
também em água. Todos os tubos receberam 1 ml de uma mistura com 98% de
solução alcalina (20 g Na
2
CO
3,
100 ml NaOH 1 N em 1 L água), 1% de tartarato de
sódio e potássio (0,02 g/ml tartarato K
+
/Na
+
) e 1% de sulfato de cobre (0,01 g/ml
CuSO
4
). Em seguida foi misturado 100 µl de Folin (Merk) diluído 3 vezes em água.
Todos os tubos foram levados ao vórtex e guardados no escuro por 30 minutos. As
amostras foram lidas no espectrofotômetro (Pharmacia Biotec) em um comprimento
de onde de 660 ηm. A curva padrão foi montada com a absorbância versus a
quantidade de proteínas em microgramas. As quantidades foram determinadas a
partir da curva.
Quantidades iguais de proteínas foram misturadas em tampão de amostra
(62,5 mM tris, 10% glicerol, 1g/ml β-mercaptoetanol, 2% SDS, ph 6.8) e submetidas
à eletroforese em gel de poliacrilamida 10% com SDS, conforme descrito por
Laemmli (1970). Foi utilizado um padrão de peso molecular pré-corado (Fermentas)
para ajudar na avaliação e identificação das proteínas. Os géis foram submetidos a
uma corrente de 30 volts, até que as amostras entrassem no gel de corrida, quando
então, a corrente passou para 92 volts. As amostras contidas nos géis foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare) ativada em
metanol 100%, através de um sistema semi-seco (Trans-Blot Semi Dry, Bio Rad).
Para a transferência, os géis, a membrana e os papéis de filtro foram embebidos em
um tampão de transferência (25 mM tris, 0,2 M glicina, ph 8,3, 20% metanol), e
submetidos a uma corrente fixa de 190 mA por 30 minutos. Após a transferência as
membranas foram bloqueadas com uma solução de leite em pó desnatado a 5% em
55
TBS (10 mM tris, 0,15 M NaCl, ph 7,0) por 1 hora. As membranas então foram
lavadas com água destilada e incubadas com anticorpo primário monoclonal anti-
MMP-9 (Calbiochem), diluído 1:1.000, por 3 horas. Após esta incubação as
membranas foram lavadas com TBS-Tween (0,01% de Tween 20 em TBS) e TBS.
Em seguida, foram incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo
conjugado com peroxidase (GE Healthcare), diluído 1:15.000, por 1 hora, após o que
foram novamente lavadas com TBS-Tween e TBS. Para revelação das membranas
foi utilizado um kit-ECL (GE Healthcare), soluções reveladora e fixadora (Kodak) e
filme fotográfico (GE Healthcare).
Para revelação do controle interno, as membranas foram lavadas com
solução 1 N NaOH para retirada dos anticorpos de MMP-9 ligados a elas. Foram,
então, novamente bloqueadas e incubadas com anticorpo primário anti-actina
(Calbiochem), diluído 1:5.000. O processo de revelação que se segue é idêntico ao
descrito anteriormente.
Os filmes foram escaneados e analisados pelo programa de densitometria
ImageJ 1.38x (Wayne Rasband – National Institutes of Healthy, USA).
3.9 Análise estatística dos dados
As análises estastísticas dos dados foram feitas utilizando análises de
variância (ANOVA) com teste de camparação múltipla de Dunnett, calculadas pelo
programa GraphPrism 4.0. Os valores calculados pelo programa de densitometria
56
foram transformados em porcentagem para que diferentes resultados pudessem ser
comparados entre si.
57
4 RESULTADOS
4.1 O efeito da hemoglobina sobre a secreção de MMP-9
Sempre que eventos hemolíticos ocorrem, sejam eles fisiológicos ou
patológicos, a hemoglobina retida dentro dos eritrócitos é liberada, seja no leito
vascular ou no tecido afetado por hemorragia. Em pequenas concentrações ela pode
ser retirada do meio circulante ao se ligar à proteína sérica haptoglobina. No
entanto, em grandes concentrações esta proteína, responsável pelo clearence da
hemoglobina, será rapidamente depletada, permitindo os efeitos deletérios da
hemoglobina livre, como: scavening de NO (e sua conseqüente vasoconstrição), pró-
inflamatórios e pró-oxidantes (Rother et al., 2005).
Em 2007, Tejima et al. mostraram, que culturas primárias de astrócitos
tratadas com hemoglobina aumentam sua secreção de MMP-9, numa indução que
envolve a participação de ROS, em um estudo sobre a participação de MMPs na
morte celular que acomete o tecido cerebral após eventos hemorrágicos.
Com base nestas premissas, fomos testar o efeito que a hemoglobina teria
sobre células fagocíticas do sistema imune capazes de lidar com a produção de
ROS, já que as utilizam como mecanismo para destruição de microorganismos
invasores. Outro detalhe que nos atrai para este tipo celular é o fato de estarem
presentes em todos os processos inflamatórios que acometem o organismo.
Para isso, fizemos experimentos in vitro com macrófagos murinos da
linhagem RAW. Estas células, embora transformadas, são bastante utilizadas em
58
estudos que envolvem ativação de macrófagos. As células em cultura foram
estimuladas com diferentes concentrações de hemoglobina (0,6 µg/ml, 10 µg/ml e
150 µg/ml) por 6 horas. Após esta incubação as células foram lavadas com PBS e
receberam um novo meio sem SBF. Isto é necessário já que o SBF contém MMPs e
seus inibidores em sua composição. Com o novo meio as células ficaram por 18
horas, após o que o sobrenadante foi retirado, concentrado e analisado por
zimografia. Para evitar os efeitos de uma possível contaminação da hemoglobina
com LPS, tratamos as células, 15 minutos antes do estímulo, com um inativador de
LPS, a polimixina B (10 µg/ml).
Como é possível verificar nas figuras 8a e 8b, a hemoglobina induz um
aumento na secreção de MMP-9 em todas as concentrações utilizadas, quando
comparadas ao controle que não recebeu nenhum estímulo. Os aumentos são
estatisticamente significativos nas concentrações de 10 µg/ml e 150 µg/ml. A
polimixina B pura não teve nenhum efeito sobre a secreção da enzima. Na
concentração de 10 µg/ml é possível verificar que não houve diferença na secreção
de MMP-9 induzida por hemoglobina entre as células que foram pré-tratadas e as
que não receberam o pré-tratamento com polimixina B.
59
(a)
(b)
Figura 8 – A hemoglobina induz secreção de MMP-9 em macrófagos murinos. (a) As
células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de SBF. As células foram
tratadas com diferentes concentrações de hemoglobina (0,6 µg/ml, 10 µg/ml e 150 µg/ml).
Seis horas depois foram lavadas com PBS e o meio foi trocado por DMEM sem soro, que
permaneceu por 18 horas. As células que foram pré-tratadas com 10 µg/ml de polimixina B,
receberam o estímulo 15 minutos antes da hemoglobina. O sobrenadante condicionado foi
analisado por zimografia. (b) ) Análise por densitometria das bandas relativas à MMP-9. As
colunas representam a média de três experimentos independentes que foram calculados
como porcentagens para fins de comparação. As células tratadas com polimixina,
hemoglobina e ambos foram comparadas com o controle, que foi considerado 100%. As
colunas marcadas com asterisco indicam resultados estatisticamente significativos em
relação ao controle (p<0,01). Os valores são expressos como média e ± S.E.M. Legenda:
CTL: controle; POL: 10 µg/ml de polimixina B; HB 10: 10 µg/ml de hemoglobina; HB
0,6+POL: 0,6 µg/ml de hemoglobina + 10 µg/ml de polimixina B; HB 10+POL: 0,6 µg/ml de
hemoglobina + 10 µg/ml de polimixina B; HB 0,15+POL: 0,15 mg/ml de hemoglobina + 10
µg/ml de polimixina B.
Polimixina (µg/ml) 0 10 0 10 10 10
Hemoglobina (µg/ml) 0 0 10 0,6 10 150
MMP-9
92 KDa
C
TL
P
O
L
HB 10
HB 0,
6
+POL
HB 10+POL
HB
150+
POL
0
200
400
600
*
*
*
*
*
*
Unidades Arbitrárias
60
4.2 O efeito da molécula de heme sobre a secreção de MMP-9
A hemoglobina liberada em eventos hemolíticos e hemorrágicos é degradada,
e um dos metabólitos resultantes é o heme livre, que por sua vez é uma molécula
reconhecidamente pró-oxidante. Como já citado neste trabalho, muitas MMPs
podem ser reguladas por ROS (Rajagopalan et al., 1996; Yoo et al., 2002; Yoon et
al., 2002). Outro fato que nos intriga e nos levou a acreditar que haveria uma
possível relação entre MMPs e o heme, é o fato de que a maioria destas enzimas,
apresentam em sua estrutura um domínio do tipo hemopexina (Somerville et al.,
2003; Beaudeux et al., 2004; Tam et al., 2004; Rundhaug et al., 2005). A proteína
sérica hemopexina é o grande mecanismo de proteção do organismo contra o
estresse oxidativo causado pelo heme livre, por se ligar a ele com alta afinidade.
Para testar a hipótese de que o heme poderia, assim como a hemoglobina,
induzir um aumento da secreção de MMP-9 em macrófagos RAW, nós incubamos as
células com diferentes concentrações de heme por 6 horas, depois das quais as
células foram lavadas com PBS. As células foram então deixadas por 18 horas em
meio sem SBF, sendo ao final concentrado o sobrenadante para análise por
zimografia.
Devido a toxicidade do heme, foram realizados testes de viabilidade celular
(MTT) com células RAW. As células foram tratadas com o veículo (0,1 N NaOH +
tampão P 10X), diferentes concentrações de heme (5 a 50 µM) e como controle
positivo foi do teste foi utilizado 5% de DMSO. Cada ponto foi feito em triplicata. A
viabilidade das células estimuladas foi comparada com as células controle (NS) que
não receberam nenhum estímulo. Este experimento demonstrou serem os
61
macrófagos células bastante resistentes à curva de concentrações utilizada neste
experimento (figura 9).
Por fim, lançamos mão do PMA, conhecido por induzir ativação/diferenciação
em alguns tipos celulares, como controle positivo, já que os macrófagos RAW são de
linhagem tumoral e apresentam uma secreção basal de MMP-9 que nos dificulta
identificar sua ativação.
Como mostrado na figura 10a, o tratamento com heme, em diferentes
concentrações, induz um aumento na secreção de MMP-9. A estatística feita com os
resultados da análise densitométrica de diferentes experimentos indica que as
concentrações de 10 µM e 25 µM apresentam uma indução significativa em
comparação ao controle que não recebeu nenhum tipo de indução (figura 10b).
62
Figura 9 – As células RAW são resistentes às concentrações de heme. Os macrófagos
murinos da linhagem RAW foram plaqueados e estimulados com diferentes concentrações
de heme (5 – 50 µM). As células controle não receberam nenhum estímulo ou receberam só
o veículo. Os estímulos ficaram por 6 horas, quando então o sobrenadante foi trocado por
DMEM sem SBF. Após 18 horas, foi feito ensaio com MTT. Como controle positivo do MTT
foi utilizado 5% de DMSO. Legenda: NS: controle; Veículo: 1N NaOH + tampão fostato 10X;
He 5: 5 µM heme; He 10: 10 µM heme; He 25: 25 µM heme; He 50: 50 µM heme; DMSO
5%: 5% de DMSO.
N
S
Veículo
He 5
He 10
He 25
He 50
DMSO 5%
0
25
50
75
100
125
Redução do MTT
63
(a)
(b)
Figura 10 - Heme induz a secreção de pró-MMP-9 em células RAW. (a) Os macrófagos
murinos da linhagem RAW foram cultivados em DMEM suplementado com 10% de SBF. As
células foram tratadas com diferentes concentrações de heme (5, 10, 25 e 50 µM). Seis
horas depois foram lavadas com PBS e o meio foi trocado por DMEM sem soro, que
permaneceu por 18 horas. O PMA (100 ηg/ml) foi usado como controle positivo. O
sobrenadante condicionado foi analisado por zimografia. (b) ) Análise por densitometria das
bandas relativas à MMP-9. As colunas representam a média de três experimentos
independentes que foram calculados como porcentagens para fins de comparação. As
células tratadas com PMA e com as diferentes concentrações de heme foram comparadas
com o controle, que foi considerado como 100%. As colunas marcadas com asterisco
indicam resultados estatisticamente significativos em relação ao controle (p<0,05). Os
valores são expressos como média e ± S.E.M. Legenda: CTL: controle; PMA: 100 ηg/ml
PMA; He 5: 5 µM Heme; He 10: 10 µM Heme; He 25: 25 µM Heme; He 50: 50 µM Heme.
PMA (ng/ml) 0 0 0 0 0 0
Heme (µM) 0 0 0 0 0 0
MMP-9
(92kDa)
CTL PMA He 5 He 10 He 25 He 50
0
50
100
150
200
250
300
350
*
*
Unidades Arbitrarias
64
4.3 O efeito da molécula de heme sobre a produção de ROS
Estudos recentes têm demonstrado o envolvimento de ROS como o ânion
superóxido e o peróxido de hidrogênio na secreção e/ou expressão de várias MMPs
(Galis et al., 1998; Buhimschi et al., 2000; Gurjar et al., 2001; Liu e Rosenberg,
2005).
Antes de testarmos a hipótese de que ROS estariam envolvidas na indução
da secreção de MMP-9 por heme, utilizamos a técnica de redução do citocromo c
para investigarmos se esta molécula era capaz de induzir a produção de superóxido
em nosso modelo celular; os macrófagos da linhagem RAW.
Como o superóxido é extremamente instável, sua medida é feita pela
redução sofrida pelo citocromo c na presença desta molécula, cuja absorbância
pode ser lida, utilizando um espectrofotômetro, em um comprimento de onda de 550
nm. Foram feitas diversas leituras, cobrindo uma curva de concentrações crescentes
de heme (2 - 50 µM).
Como pode ser visto na figura 11, o heme é capaz de induzir a produção de
superóxido em células RAW até um limite em torno de 25 µM, sendo o pico de
indução por volta de 10 µM. Este resultado confirma as observações encontradas
na literatura e sinaliza a possibilidade de que o heme possa, através dessa via,
regular a MMP-9 em nosso modelo.
Outro importante resultado alcançado, também, com o uso da técnica de
redução do citocromo c, foi a demonstração de que os níveis de indução de
superóxido alcançados pelo heme nas células RAW é equivalente aos níveis
65
induzidos por importantes citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α e a IL-1, bem
como a molécula de LPS, outro forte indutor de inflamação (figura 12).
66
Figura 11 - Heme induz a produção de superóxido em células RAW. Os níveis de
produção de superóxido induzido pelo heme foram medidos pela técnica de redução do
citocromo c SOD-inibido. As células foram estimuladas com concentrações crescentes de
heme (2, 5, 10, 25 e 50 µM) por 15 minutos e a produção de superóxido medida por
espectrometria (550 nm) nos 30 minutos subseqüentes na presença e na ausência de SOD.
Cada ponto é a média de três experimentos independentes
.
Figura 12 – Produção de superóxido induzido por heme é equivalente outros
indutores pró-inflamatórios. As colunas representam a média de três experimentos
independentes. Os níveis de produção de superóxido induzido por TNF-α, LPS, IL-1 e heme
foram medidos pela técnica de redução do citocromo c SOD-inibido. As células foram
estimuladas com 10 ηg/ml de TNF-α, 100 ηg/ml de LPS, 100 ηg/ml de IL-1, 10 µM de heme
por 15 minutos e a produção de superóxido medida por espectrometria (550 nm) nos 30
minutos subseqüentes.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
CTL TNF LPS IL-1 HEME
Absorbância em 550 nM
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Heme (µM)
SOD-inhibitable
superoxide (
∆
550 nm)
67
4.4 A participação de ROS na secreção de MMP-9 induzida por heme
Baseados na literatura, acreditamos que um dos possíveis mecanismos
envolvidos na indução de MMP-9 por heme, seria a produção de ROS promovida por
esta molécula. Por este motivo, após confirmar que o heme era capaz de induzir a
produção de superóxido em macrófagos murinos, realizamos experimentos para
testar esta hipótese.
As células RAW em cultura, foram estimuladas, por seis horas, com uma
concentração de 10 µM de heme. Optamos por este valor por dois motivos; primeiro
porque esta concentração induziu a secreção de MMP-9 de forma estatisticamente
significativa (ver figura 10); segundo por ser um dos valores associados ao pico de
indução da produção de superóxido (ver figura 11).
Para anular os possíveis efeitos de ROS, escolhemos utilizar o antioxidante
NAC. As células incubadas com heme foram pré-tratadas por 1 hora com o NAC em
diferentes concentrações (2 mM, 5 mM e 10 mM). Neste experimento, as células
também foram lavadas com PBS, para retirada dos contaminantes do soro, antes de
receberem o meio sem SBF no qual ficaram por 18 horas. Após este tempo, o meio
condicionado foi concentrado e utilizado para análise por zimografia.
Na figura 13a é possível ver claramente a inibição do efeito indutor do heme
sobre a secreção da MMP-9. O NAC reverte o efeito do heme de forma dose
dependente. A diminuição da secreção se mostra estatisticamente significativa a
partir da concentração de 2 mM do antioxidante (figura 13b), sendo que na
concentração de 10 mM o efeito do heme é quase totalmente anulado.
68
(a)
Heme (µM) 0 10 10 10 10
NAC (mM) 0 0 2 5 10
(b)
Figura 13 - As ROS estão envolvidas na secreção de pró-MMP-9 induzida por heme. (a)
As células RAW foram pré-tratadas com diferentes concentrações de NAC ( 2, 5 e 10 mM)
por uma hora e depois estimuladas com 10 mM de heme durante 6 horas. Após serem
lavadas com PBS o meio foi trocado por DMEM sem SFB e permaneceu por 18 horas. O
efeito do NAC sobre a secreção de MMP-9 mediada por heme foi avaliado por zimografia do
meio condicionado. (b) ) Análise por densitometria das bandas relativas à MMP-9. As
colunas representam a média de três experimentos independentes que foram calculados
como porcentagens para fins de comparação. As células estimuladas com heme e pré-
tratadas com NAC foram comparadas com o as células tratadas apenas com heme, que foi
considerado como 100%. As colunas marcadas com asterisco indicam diferenças
estatisticamente significativas em relação às células que receberam apenas heme (p<0,01).
Os valores são expressos como média e ± S.E.M. Legenda: CTL: controle; Heme: 10 µM
heme; He+NAC2: 10 µM heme e 2 mM NAC; He+NAC5: 10 µM heme e 5 mM NAC;
He+NAC10: 10 µM heme e 10 mM NAC.
Pró-MMP-9
(
92 kDa
)
HEME
CTL
He+NAC
2
He+NAC
5
H
e
+
NAC10
0
20
40
60
80
100
*
*
*
*
Unidades Arbitrárias
69
4.5 Análise da participação da NADPH oxidase na secreção de MMP-9 induzida
por heme
As ROS podem ser induzidas por diversos estímulos e geradas por diversas
organelas. Os maiores produtores destas espécies são as mitocôndrias, o retículo
endoplasmático, a membrana plasmática e o citosol, sendo que diversos sistemas
enzimáticos podem estar envolvidos, como: ciclooxigenase, óxido nítrico sintase,
redutase ribonucleotídeo, cadeia transportadora de elétrons e NADPH oxidase
(Curtin et al., 2002).
Em células fagocíticas, caso dos macrófagos, a principal fonte de ROS é a
NADPH oxidase que atua reduzindo o oxigênio molecular à superóxido (Kassim et
al., 2005) e outras espécies reativas, com a função de combater microorganismos
invasores dentro dos fagossomos.
Com o intuito de determinar se a NADPH oxidase pode ser uma fonte de ROS
envolvida na indução de MMP-9 por heme, utilizamos o DPI. O DPI é um inibidor de
flavoproteínas e não possui função scavenger de ROS (O’Donnell et al., 1993), por
esta razão vem sendo bastante utilizado como ferramenta de inibição da NADPH
oxidase, embora sua especificidade possa ser alvo de discussão.
As células RAW foram pré-tratadas por 1 hora com 10 ng/ml de DPI, antes de
receberem o tratamento com de 10 mM de heme. Após 6 horas de estímulo com
heme, as células foram lavadas com PBS e receberam um novo meio sem SBF, com
o qual ficaram por 18 horas. Após o tempo previsto, o meio condicionado foi
concentrado para ser analisado por zimografia.
70
A figura 14a mostra que o pré-tratamento com DPI reverteu o efeito indutor do
heme sobre a secreção de MMP-9 pelos macrófagos. A reversão tem significância
estatística, como mostra a figura 14b, a um nível de secreção muito próximo ao das
células que não receberam nenhum estímulo.
71
(a)
(b)
Figura 14 – A secreção de MMP-9 induzida por heme e mediada por ROS envolve a
participação de NADPH oxidase. (a) As células RAW foram pré-tratadas com 10 ηg/ ml de
DPI por uma hora e depois estimuladas com 10 mM de heme durante 6 horas. Após serem
lavadas com PBS o meio foi trocado por DMEM sem SFB e permaneceu por 18 horas. O
efeito do tratamento com DPI sobre a secreção de MMP-9 induzida por heme foi avaliado
por zimografia do meio condicionado. (b) ) Análise por densitometria das bandas relativas à
MMP-9. As colunas representam a média de três experimentos independentes que foram
calculados como porcentagens para fins de comparação. As células tratadas apenas com
heme, bem como, as pré-tratadas com DPI foram comparadas com o controle, que foi
considerado como 100%. A coluna marcada com asterisco indica um resultado
estatisticamente significativo em relação às células controle (p<0,01). Os valores são
expressos como média e ± S.E.M. Legenda: CTL: controle; HEME: 10 µM heme; He+DPI:
10 µM heme e 10 ηg/ml DPI.
Heme (µM) 0 10 10
DPI (ηg/ml) 0 0 10
Pró-
MMP-9
(92 kDa
)
CTL HEME He+DPI
0
100
200
*
*
*
Unidades Arbitrárias
72
4.6 Análise do efeito do heme sobre a secreção de MMP-9 em um modelo de
inflamação pulmonar
Existem diversos relatos na literatura apontando para a relação entre
moléculas pró-oxidantes, o sistema imune, metaloproteinases e patogenias
pulmonares (Johnson e Ward, 1981; Johnson et al., 1981; Henson e Johnston,
1987). Esta constatação nos levou a escolher como modelo in vivo, para testar
nossa hipótese, uma simulação de inflamação pulmonar.
Assim, seria possível que a molécula pró-oxidante de heme fosse capaz de
induzir a secreção de MMP-9 em células do sistema imune, como os macrófagos
alveolares?
Para responder a esta pergunta realizamos experimentos com camundongos
da linhagem C57BL/6. O heme foi injetado na traquéia dos animais em duas
diferentes concentrações, 75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg. Os animais controle receberam
PBS estéril.
Os efeitos foram analisados 24 e 48 horas após o estímulo, quando, então,
foram realizados lavados broncoalveolares. Estes BAL foram utilizados para
contagem diferencial de células e zimografia. Também foram preparados extratos
com os pulmões para análise por Western Blot.
73
4.6.1 Perfil das células encontradas no BAL de camundongos tratados com
heme
Graça-Souza et al. (2002) já demonstraram que o heme é capaz de promover
a migração de neutrófilos in vivo, sugerindo um papel pró-inflamatório para esta
molécula. Acreditamos que o heme possa apresentar este mesmo efeito sobre as
células de linhagem monocítica.
Ao injetarmos o heme intratraquealmente, para que alcançasse diretamente
os pulmões, esperávamos encontrar no lavado e no extrato pulmonar, não só os
macrófagos alveolares residentes, mas também células que tivessem sido atraídas,
como neutrófilos e mais macrófagos.
Com o intuito de conferir esta hipótese, usamos parte do BAL para fazer uma
contagem diferencial de células e identificarmos os tipos celulares predominantes
em cada tempo experimental.
As figuras 15a e 15b apresentam o perfil das células encontradas no lavado
nos diferentes tempos experimentais. Em 24 horas (figura 15a) é possível observar
um intenso infiltrado de células polimorfonucleares (neutrófilos) atraídos para os
pulmões, com um aumento notável, em relação ao controle, na maior concentração
injetada de heme (7,5 mg/Kg). O aumento das células mononucleares foi mais
modesto em comparação ao controle neste mesmo tempo, mas foram também
sensíveis à concentração mais baixa de heme.
Em 48 horas (figura 15b), observamos que o infiltrado de células diminui de
forma considerável, principalmente as polimorfonucleares. Este quadro é consistente
com a característica dos neutrófilos que são as primeiras células a chegarem no sítio
74
inflamatório, mas possuem vida curta, em torno de 24 horas. Em 48 horas o perfil
celular se altera e as mononucleares passam a ser preponderantes, em quantidades
próximas ao quadro de 24 horas.
75
(a)
(b)
Figura 19 – Análise do perfil de células encontradas após 24 e 48 horas do tratamento
com heme. (a) Perfil das células após 24 horas de tratamento. Cada coluna é resultante da
média entre os grupos de animais que receberam diferentes concentrações de heme (75
µg/Kg e 7,5 mg/Kg) e os controles. A contagem diferencial foi realizada a partir do BAL, e as
células identificadas através de parâmetros morfológicos. Legenda: 1 – controle; 2 – 75
µg/Kg heme; 7,5 mg/Kg heme; PMN – polimorfonucleares; MONO – mononucleares. (b)
Perfil das células após 48 horas de tratamento. Cada coluna é resultante da média entre os
animais que receberam diferentes concentrações de heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg) e os
controles. A contagem diferencial foi realizada a partir do BAL, e as células identificadas
através de parâmetros morfológicos. Legenda: 1 – controle; 2 – 75 µg/Kg heme; 7,5 mg/Kg
heme; PMN – polimorfonucleares; MONO – mononucleares.
24 HORAS
0
100
200
300
400
500
600
700
800
MONO
PMN
1 2 3 1 2 3
N. células (10
3
/ml)
48 HORAS
0
100
200
300
400
MONO
PMN
1 2 3 1 2 3
N. células (10
3
/ml)
76
4.6.2 – Análise da secreção de MMP-9 em BAL de camundongos tratados com
heme
Além da contagem diferencial, o BAL foi utilizado para uma análise, por
zimografia, da secreção de MMP. Esta análise nos permitiu verificar a mudança no
perfil de secreção da MMP-9 entre os diferentes tempos (24 e 48 horas) e as
diferentes concentrações de heme utilizadas (75
µg/Kg e 7,5 mg/Kg), comparados
aos animais controles que foram injetados com PBS estéril.
Pudemos avaliar através do BAL, que a concentração de 7,5 mg/Kg de heme
induziu um nível de secreção da MMP-9 que a concentração mais baixa não foi
capaz de promover (figura 16a). Na verdade, a concentração menor parece não ter
nenhum efeito sobre a secreção de MMP-9 que pode ser encontrada no lavado. No
entanto, em relação ao controle de cada tempo experimental, a maior concentração
de heme aumentou a secreção de maneira estatisticamente significativa em ambos
os tempos (figura 16b).
77
(a)
(b)
Figura 16a – Indução da secreção de MMP-9 por heme em BAL de camundongos. (a)
Foram realizados lavados em camundongos tratados com diferentes concentrações de
heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg), em diferentes tempos (24 e 48 horas). Os lavados foram
analisados por zimografia para análise do perfil de secreção da pró-MMP-9. (b) ) Análise por
densitometria das bandas relativas à MMP-9. As colunas representam a média de dois
grupos de experimentos indenpendentes com quatro animais cada. Os valores foram
calculados como porcentagens para fins de comparação e expressos como média e ±
S.E.M. Os animais foram tratados com diferentes concentrações de heme (75 µg/Kg e 7,5
mg/Kg) e o lavado foi realizado em tempos diferentes (24 e 48 horas). Os animais controle
receberam injeção de PBS estéril. Os tratamentos com heme, de cada grupo de tempo,
foram comparados com o seu referente controle, que foi considerado como 100%. As
colunas marcadas com asterisco indicam resultados estatisticamente significativos em
relação ao referente controle (p<0,05).
Pró-MMP-9
(92 kDa)
Heme 7,5 mg/Kg X X
Heme 75 µg/Kg X X
Controle X X
24 HORAS 48 HORAS
C
TL
He
7
5
u
g
/Kg
He
7
,5
m
g
/Kg
C
TL
He
7
5
u
g
/Kg
He
7
,5
m
g
/Kg
0
1000
2000
3000
24 Horas
48 Horas
*
*
Unidades Arbitrarias
78
4.6.3 Análise da presença de MMP-9 no tecido pulmonar de camundongos
tratados com heme
O efeito do heme sobre o pulmão também foi analisado a partir de extratos
feitos com o órgão. Após 24 e 48 horas do estímulo com as diferentes
concentrações de heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg), os animais foram sacrificados e o
pulmão direito retirado. Dos órgãos inteiros foram feitos extratos que passaram por
um gel de policrilamida para separação de proteínas e posterior revelação pela
técnica de Western Blot.
Os resultados indicam uma tendência no aumento da presença de MMP-9 no
pulmão após serem desafiados com heme (figuras 17a e 17b), em comparação com
os controles. No tempo de 24 horas e 48 horas, as duas concentrações de heme
produzem efeitos sobre a expressão de MMP-9 em comparação ao controle (figuras
17a e 17b).
79
(a)
(b)
Figura 17 – Indução de MMP-9 por heme em extrato de pulmão de camundongo. (a)
Diferentes concentrações de heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg) foram injetadas
intratraquealmente. O controle recebeu PBS estéril. Após 24 e 48 horas, os pulmões foram
retirados. Foram preparados extratos com o pulmão direito de cada animal, que foram
analisados por Western Blot. As membranas foram incubadas com anticorpo para MMP-9 e
a expressão de actina foi utilizada como controle d quantidade de proteína aplicada em cada
amostra. (b) ) Análise por densitometria das bandas relativas à MMP-9. As colunas
representam a média de dois grupos de experimentos indenpendentes com quatro animais
cada. Os valores foram calculados como porcentagens para fins de comparação e
expressos como média e ± S.E.M. Os animais foram tratados com diferentes concentrações
de heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg) e os pulmões extraídos em 24 e 48 horas. Os animais
controle receberam injeção de PBS estéril. Os tratamentos com heme, de cada grupo de
tempo, foram comparados com o seu referente controle, que foi considerado como 100%.
Pró-MMP-9
(92kDa)
24 HORAS
48 HORAS
Heme 7,5 mg/Kg X X
Heme 75 ug/Kg X X
Controle X X
α-actina
(50 kDa)
C
TL
He
7
5
u
g
/Kg
He
7
,5
m
g
/Kg
C
TL
He
7
5
u
g
/Kg
He
7
,5
m
g
/Kg
0
50
100
150
200
250
24 Horas
48 Horas
Unidades Arbitrarias
80
4.7 A secreção de MMP-9 em macrófagos alveolares estimulados com heme
Os resultados sobre a secreção de MMP-9 no pulmão de camundongos,
foram encontrados a partir do extrato do órgão inteiro. Isto significa que a indução do
heme está sendo considerada sobre outras células pertencentes ao tecido pulmonar
que também secretam esta metaloproteinase.
Para nos assegurarmos de que os macrófagos alveolares estão entre as
células que responderam de forma positiva ao estímulo do heme no pulmão,
preparamos uma cultura primária destas células com o intuito de estimulá-las in vitro.
Após realizarmos um BAL em camundongos da linhagem C57BL/6 que não
receberam nenhum tipo de estímulo. O BAL foi centrifugado para que pudéssemos
plaquear as células. Somente as células mononucleares aderem à placa e destas
90% são macrófagos. Utilizamos estas células para os experimentos.
Foram feitos estímulos com duas concentrações diferentes de heme (10 µM e
50 µM). Aproveitamos também para verificar a possível participação de ROS nesta
indução. Para isto, pré-tratamos um grupo de células com NAC (10 mM) e outro com
DPI (10µM) antes do estímulo com 10 µM de heme. O sobrenadante foi concentrado
e analisado por zimografia.
Como pode ser observado nas figuras 18a e 18b, as duas concentrações de
heme aumentaram a secreção de MMP-9 em macrófagos alveolares de forma
significativa. O pré-tratamento com um antioxidante (NAC) e um inibidor da atividade
da NADPH oxidase (DPI) foi capaz de diminuir o efeito indutor do heme (figura 18a).
81
(a)
(b)
Figura 18 - Heme induz a secreção de MMP-9 em macrófagos alveolares. (a) Os
macrófagos alveolares murinos foram extraídos por BAL e plaqueados com DMEM
suplementado com 10% de SBF. Após 24 horas as células foram lavadas com PBS e
receberam novo meio com SBF. Algumas células foram tratadas por seis horas apenas com
duas concentrações de heme (10 µM e 50 µM). Outras foram pré-tratadas com 10 mM de
NAC e 10 µM de DPI por uma hora e depois receberam o estímulo de heme. As células
foram, então, lavadas com PBS e o meio foi trocado por DMEM sem soro, que permaneceu
por 18 horas. O sobrenadante condicionado foi analisado por zimografia. (b) Análise por
densitometria das bandas relativas à MMP-9. As colunas representam a média de três
experimentos independentes que foram calculados como porcentagens para fins de
comparação. As células estimuladas com heme e as pré-tratadas com NAC e DPI foram
comparadas com o controle, que foi considerado como 100%. As colunas marcadas com
asterisco indicam resultados estatisticamente significativos em relação às células controle
(p<0,01). Os valores são expressos como média e ± S.E.M. Legenda: CTL: controle; Heme
10: 10 µM heme; Heme 50: 50 µM heme; He + NAC: 10 µM heme e 10 mM NAC; He + DPI:
10 µM heme e 10 µM de DPI.
DPI (µM) 0 0 0 0 10
NAC (mM) 0 0 0 10 0
Heme (µM) 0 10 50 10 10
Pró-MMP-9
(92 kDa)
CTL
H
e
10
He
5
0
H
e + NAC
He
+
D
P
I
0
100
200
300
400
500
600
700
*
*
Unidades Arbitrárias
82
4.8 O efeito do heme sobre a secreção de MMP-9 em células tumorais
Por acreditarmos ser importante verificar se o heme era capaz de induzir a
secreção da MMP-9 em outros tipos celulares, realizamos um experimento utilizando
células DU145. Este é uma linhagem que foi originada a partir de células de câncer
de próstata humano.
Neste tipo celular, o heme também induziu de forma significativa a secreção
de MMP-9 (figura 19a). Neste experimento, além das bandas referentes a pró-MMP-
9, encontrada nos outros experimentos
in vitro, também encontramos a presença da
forma ativa da MMP-9 (figura 19b). Utilizamos como controle positivo a citocina pró-
inflamatória IFN-γ, já estabelecida como indutor de MMP-9 (Kidachi
et al., 2007).
É importante ressaltar que, embora a indução da secreção de MMP-9 tenha
sido significativa na concentração de 50 µM de heme, a viabilidade das células foi
baixa conforme podemos observar no ensaio de redução do MTT (figura 20),
mostrando que o heme nesta concentração foi tóxico para este tipo celular.
83
(a)
(b)
Figura 19 - Heme induz a secreção de MMP-9 em células DU145. (a) As células de
câncer de próstata da linhagem DU145 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10%
de SBF. As células foram tratadas com duas concentrações diferentes de heme (10 e 50
µM). Seis horas depois foram lavadas com PBS e o meio foi trocado por DMEM sem soro,
que permaneceu por 18 horas. O INF-γ (1 ηg/ml) foi usado como controle positivo. O
sobrenadante condicionado foi analisado por zimografia. (b) Análise por densitometria das
bandas relativas à pró-MMP-9. As colunas representam a média de três experimentos
independentes que foram calculados como porcentagens para fins de comparação. As
células tratadas com diferentes concentrações de heme foram comparadas com o controle,
que foi considerado como 100%. As colunas marcadas com asterisco indicam resultados
estatisticamente significativos em relação às células não tratadas (He 10, p<0,01 e He 50,
p<0,05). Os valores são expressos como média e ± S.E.M. Legenda: CTL: controle; He 10:
10 µM heme; He 50: 50 µM heme.
IFN-γ (ηg/ml) 0 0 0 1
Heme (µM) 0 10 50 0
Pro-MMP-9 (92 kDa)
MMP-9 ativa (72 kDa)
CTL He 10 He 50
0
100
200
300
400
500
600
*
*
*
*
Unidades Arbitrárias
84
Figura 20 – As células DU145 não são resistentes a concentrações elevadas de Heme.
As colunas representam a média de três experimentos. As células de tumor de próstata
humano da linhagem DU145 foram plaqueadas e estimuladas com duas concentrações de
heme (10 e 50 µM). As células controle não receberam nenhum estímulo ou receberam só o
veículo. Os estímulos ficaram por 6 horas, quando então o sobrenadante foi trocado por
DMEM sem SBF. Após 18 horas, foi feito ensaio com MTT. Como controle positivo do MTT
foi utilizado 5% de DMSO.
NS
Ve
í
cu
l
o
He 10
He
5
0
DMSO 5%
0
50
100
150
Redução do MTT
85
5 DISCUSSÃO
5.1 A hemoglobina e o heme induzem a secreção de MMP-9 em macrófagos
murinos
Encontramos diversos trabalhos na literatura que associam estresse
oxidativo, macrófagos e MMPs (Rajagopalan,
et al., 1996; Power et al., 2003;
Kassim,
et al., 2005). Assim, é natural que se busque relacionar moléculas de efeito
pró-oxidante e estas enzimas.
Como já foi dito anteriormente, Tejima
et al. mostraram que, em cultura
primária de astrócitos de camundongos, a hemoglobina aumenta, de forma rápida e
vigorosa, a secreção de MMP-9. Nossos resultados são compatíveis com este
achado, mostrando que, também, em macrófagos ocorre este efeito (figuras 8a). No
entanto, em nossos experimentos, uma concentração maior de hemoglobina foi
necessária para encontrar um efeito indutor significativo (figura 8b), o que não
invalida o resultado já que o tipo celular e a forma de cultura são distintos.
Tendo em vista que, fisiologicamente, diante de um evento hemolítico a
hemoglobina será oxidada e liberará, em última instância, o heme seqüestrado,
acreditamos que um efeito
in vivo, poderia ser resultante desta segunda molécula.
Nossa idéia de que o heme poderia ser o responsável pelo efeito sobre a
secreção de MMP-9, tem como esteio o fato de o heme ser uma molécula
reconhecidamente pró-oxidante. Além disto, alguns trabalhos na literatura vêm
apontando para o fato de que a hemozoína (polímero de heme) é capaz de
86
aumentar a atividade de MMP-9 em monócitos humanos (Prato et al., 2005; Prato et
al., 2008).
Em nossos experimentos o estímulo com o heme resultou em um aumento do
nível de secreção da MMP-9 de forma significativa em relação às células que não
receberam nenhum estímulo (figura 11a e 11b). Este efeito indutor pode ser
verificado em todas as concentrações utilizadas, tanto em pequenas concentrações
(5 µM) características de eventos fisiológicos como a destruição de hemoglobinas
senescentes; como em grandes concentrações (25 µM e 50 µM), características de
eventos hemolíticos patológicos como na malária ou em alguns tipos de anemias.
Esta relação entre heme e MMPs pode agravar, em alguns casos, as
conseqüências destas patologias, bem como, em situações de hemorragias. Mais
ainda se lembrarmos que macrófagos são células do sistema imunológico
intimamente relacionadas com processos inflamatórios crônicos e por isto,
associadas a lesões resultantes da destruição de tecidos.
Por outro lado, a relação heme-macrófagos pode ter um papel benéfico em
processos fisiológicos, como a angiogênese ou em cicatrizações. Em ambos
processos podemos encontrar, respectivamente, pequenos eventos hemolíticos e
hemorrágicos que colocariam frente a frente a molécula de heme e células de
origem monocítica como os macrófagos.
Nosso resultados indicam que a ligação entre a molécula de heme e o
sistema imunológico aponta para um novo papel do heme e das MMPs nos
processos inflamatórios.
87
5.2 O efeito do heme sobre a secreção de MMP-9 em macrófagos murinos
envolve a participação de ROS
Encontramos na literatura muitos trabalhos que indicam a regulação de MMPs
por ROS. Este fato, associado à idéia de que o heme é um forte indutor do estresse
oxidativo, e macrófagos grandes produtores de ROS, nos levou a acreditar que esta
poderia ser uma possível via da indução da secreção da MMP-9 pelo heme.
No entanto, antes de testarmos esta hipótese, precisávamos mostrar que o
heme era capaz de induzir a produção de ROS em nosso modelo celular, as células
RAW. Por este motivo, estimulamos as células com diferentes concentrações de
heme e medimos, através da técnica de redução do citocromo c SOD-inibido, a
produção de superóxido.
Nossos experimentos mostraram que o heme induz a produção de superóxido
de forma dose dependente (figura 11). O estímulo para a produção de ROS induzido
pelo heme está no mesmo nível de outras conhecidas moléculas pró-inflamatórias,
caso das citocinas TNF-α e IL-1, e do LPS (figura 12).
A teoria aceita para explicar a ativação das MMPs
in vivo, postula que regiões
suscetíveis no domínio do pró-peptídeo sofrem a ação de proteases solúveis como a
plasmina ou outras MMPs.
In vitro, a hipótese é de que a ruptura da ligação do
átomo de zinco, existente no sítio ativo, com o grupo tiol que possui uma cisteína
desemparelhada, representa o evento crítico para a iniciar um processo de
autoativação das MMPs (Rajagopalan
et al., 1996). ROS são capazes de reagir com
grupos tiol como estes, responsáveis pela manutenção da latência em MMPs.
Juntando-se a isso o fato de vários trabalhos mostrarem a regulação de diferentes
88
tipos de MMPs por diferentes espécies reativas, nosso grupo intencionou analisar se
a indução da secreção de MMP-9 por heme, tinha a participação de ROS.
Nossos resultados apontam claramente nesta direção, mostrando que o pré-
tratamento das células com o antioxidante NAC, um precursor da glutationa, diminui
de forma importante, a secreção de MMP-9 estimulada pelo heme (figura 13a). Nas
concentrações de 5 mM e 10 mM, a reversão do efeito do heme é bastante
significativa (figura 13b).
Nos macrófagos, grande parte da produção de intermediários reativos, é
gerada pelo complexo enzimático NADPH oxidase. O produto inicial da NADPH
oxidase é o superóxido, que é convertido posteriormente em ácido hipocloroso e
espécies reativas de nitrogênio pela mieloperoxidase.
A produção excessiva de ROS está associada a diversas patologias,
incluisive àquelas caracterizadas por apresentarem intenso processo inflamatório,
com conseqüente dano tecidual. Encontramos na literatura trabalhos mostrando em
diversos tipos celulares, as ROS geradas pela NADPH oxidase podem afetar de
forma positiva ou negativa a secreção de MMPs (Inoue
et al., 2001; Kassim, et al.
2005). Por estes motivos acreditamos que a NADPH oxidase poderia ser a fonte de
ROS envolvida na indução da secreção de MMP-9 pelo heme.
Para testar esta hipótese usamos um inibidor de flavoproteínas, caso da
NADPH oxidase, chamado DPI. Nossos resultados indicam que o pré-tratamento
das células com DPI diminuiu o efeito indutor do heme sobre a secreção da MMP-9
(figura 14a e 14b). Estes achados apontam para uma possível participação da
NADPH oxidase como fonte das ROS envolvidas nesta via de indução.
89
Embora o DPI possa inibir outras fontes de ROS, pelo fato de nosso modelo
ser uma célula que reconhecidamente tem grande parte de seu superóxido
produzido por este complexo enzimático, acreditamos ser esta a sua maior fonte. No
entanto, não descartamos a necessidade do uso de outros inibidores que permitam
uma conclusão ainda mais precisa.
Em resumo, nossos experimentos apontam que o efeito indutor do heme
sobre a secreção de MMP-9 em macrófagos murinos, envolve a produção de
espécies reativas de oxigênio que participam, possivelmente, como sinalizadores
intracelulares. Estas ROS, por sua vez, são geradas, em grande parte, pelo
complexo enzimático NADPH oxidase.
5.3 O heme aumenta a secreção de MMP-9 em um modelo de inflamação
pulmonar
Em um pulmão normal, as células residentes não produzem MMP-9. No
entanto, sob diversos possíveis estímulos, células como: células epiteliais dos
brônquios; células de Clara; células alveolares do tipo II; fibroblastos; células
musculares lisas; e células endoteliais, podem produzir e secretar MMP-9 (Atkinson
e Senior, 2003). Além destas, células do sistema imunológico como, macrófagos
(Welgus
et al., 1990), eosinófilos (Ohno et al., 1997), mastócitos (Kanbe et al., 1999),
linfócitos (Weeks
et al., 1993), células NK (Albertsson et al., 2000) e células
dendríticas (Bartholome
et al., 2001), também podem ser fonte de MMP-9 no
pulmão.
90
Frente a esta riqueza de possíveis fontes e o número de doenças que
acometem o pulmão e que estão intimamente relacionadas às MMPs, nos pareceu
que o processo inflamatório neste órgão seria um bom modelo para nosso estudo.
Como foi demonstrado por Graça-Souza
et al. (2002), o heme pode ser
considerada uma molécula pró-inflamatória. O grupo demonstrou que o heme é
capaz induzir o recrutamento de neutrófilos, uma característica marcante da
inflamação. Sendo assim, resolvemos analisar o perfil das células presentes no BAL
dos animais que foram desafiados com as diferentes concentrações de heme e
comparar com os animais controle, que só receberam PBS.
Observamos nos lavados de 24 horas dos camundongos que receberam a
maior concentração de heme (7,5 mg/Kg) a presença de um infiltrado de células com
morfologia de polimorfonucleares, que acreditamos ser em sua grande maioria
formada por neutrófilos (figura 19). Este resultado corrobora o encontrado por Graça-
Souza
et al. (2002).
O aumento de polimorfonucleares em 24 horas é bastante evidente, mas
também podemos perceber um aumento significativo no número de células
mononucleares (figura 15a). Este aumento se mostrou constante em 48 horas, pelo
menos nos animais que receberam a maior concentração de heme (figura 15b),
diferente do que ocorreu com os polimorfonucleares que apresentaram uma grande
queda em seu número.
Estes resultados são bastante importantes para chegarmos a determinadas
conclusões sobre os experimentos que se seguem. As zimografias realizadas a
partir dos BAL, mostraram que o nível de secreção de MMP-9 no pulmão aumentou
nos camundongos que receberam a maior concentração de heme (figura 16a e 16b).
91
Este aumento pode ser verificado nos dois tempos analisados, 24 e 48 horas,
sendo que em 24 horas o aumento foi mais proeminente (figura 16a e 16b),
provavelmente porque, associado ao aumento de mononucleares, houve um pico de
polimorfonucleares.
O experimento com os extratos dos pulmões mostra um efeito global do heme
sobre o órgão. Os resultados apontam para um aumento da expressão de MMP-9
com ambas concentrações heme (75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg) injetadas.
A presença de MMP-9 é aumentada nos dois tempos analisados,
apresentando inclusive o mesmo padrão de aumento em relação ao estímulo com as
diferentes concentrações (figura 17a e 17b). É importante ressaltar que no tempo de
48 horas, quando o influxo de polimorfunucleares diminui consideravelmente, a
expressão de MMP-9 se mantém maior que controle. Neste tempo, havia uma
predominância de células mononucleares, o que nos leva a crer que esta resposta
pode estar associada, predominantemente, a este tipo celular.
Observamos sistematicamente uma maior secreção de MMP-9 nos animais
tratados com heme quando comparados ao grupo controle. Entretanto, em função
da grande variação individual apresentada pelos animais, não obtivemos uma
diferença estatística no teste utilizado. Acreditamos que uma possível explicação
para este resultado reside na possibilidade real de infecções e/ou alergias nos
animais em função das condições de alojamento encontradas nos biotérios. De fato,
o BAL de diferentes animais controle apresentaram uma grande variação no número
de células residentes, indicando uma heterogeneidade dentro da população não-
tratada.
92
Para reforçar a idéia de que as células mononucleares podem ter sido a fonte
do aumento de MMP-9 induzido por heme, buscamos demonstrar, com um
experimento
in vitro, que os macrófagos alveolares são células capazes de secretar
a enzima quando estimuladas com heme.
Para isto, fizemos um BAL reunindo vários animais e plaqueamos as células.
Somente as mononucleares aderem à placa, e assim pudemos separá-las dos
outros tipos celulares do lavado. As duas concentrações de heme utilizadas nas
células, 10 µM e 50 µM, induziram de forma expressiva o mesmo efeito encontrado
com os extratos, ou seja, o aumento da MMP-9 (figuras 18a e 18b). O que nos
aponta que o aumento sustentado em 48 horas pode estar sendo resultado do efeito
do heme sobre este tipo celular.
Aproveitamos este experimento com os macrófagos alveolares
in vitro, para
verificar se nestas células, o efeito poderia também envolver ROS resultantes do
estresse oxidativo provocado pelo heme. O uso do antioxidante NAC e do inibidor da
NADPH oxidase, DPI, diminuíram de forma significativa o efeito indutor do heme
(figuras 18a e 18b), indicando a possível participação de radicais livre neste evento.
5.4 O heme induz a secreção de MMP-9 em células tumorais da linhagem
DU145
Diversas MMPs estão envolvidas em vários estágios da progressão tumoral.
A expressão das MMPs pelas células tumorais e pelas células do estroma que as
cercam, ajudam no remodelamento tecidual necessário ao estabelecimento do
93
tumor, bem como, na liberação de fatores de crescimento associados a ECM, que
são importantes para o crescimento da massa tumoral (Rundhaug, 2003).
Um importante passo para o crescimento do tumor é o desenvolvimento de
um processo angiogênico, com formação de vasos capazes de nutrir o tumor em
formação. As MMP-2 e MMP-9 estão implicadas na indução do processo
angiogênico em diferentes modelos (Egeblad e Werb, 2002). Além disto, o aumento
da expressão destas gelatinases leva à degradação dos componentes da membrana
basal dos vasos, permitindo que as células tumorais alcancem a circulação.
As MMPs estão associadas ao processo de migração celular, por exporem
sítios de adesão, romperam as ligações entre as células e liberarem quimiotáxicos
da ECM (McCawley, 2001). Sendo assim, não é difícil entender o papel destas
enzimas nos processos metastáticos do câncer.
Por acreditar que o aumento da secreção de MMP-9 por heme não é um
fenômeno restrito a células do sistema imune, nem tampouco a células murinas,
testamos este efeito sobre outro tipo celular. Utilizamos para isto células de câncer
de próstata humano, chamadas DU145.
Os resultados encontrados mostram que o heme, em diferentes
concentrações, também neste tipo celular, aumenta a secreção de MMP-9 (figura
19a e 19b), tanto na forma de zimogênio como na forma ativa. É interessante
ressaltar, que a concentração de 50 µM, apesar de, aparentemente, levar a um
aumento significativo da secreção de MMP-9, deve ser vista com ressalva. Esta
concentração de heme se mostrou tóxica para as células, e pudemos verificar,
através de MTT, uma morte celular em torno de 50% (figura 20). Portanto, o
resultado encontrado se deve provavelmente à liberação do conteúdo no meio
94
condicionado, não por uma resposta de secreção, mas pelo extravasamento do
conteúdo intracelular em consequência do rompimento das células.
95
6 CONCLUSÃO
Os monócitos do sangue migram para diversos tecidos onde se diferenciam
em macrófagos cujas propriedades morfológicas e funcionais são características do
tecido no qual sofreu a maturação. Os macrófagos são parte integral da resposta
imune em lesões inflamatórias crônicas associadas à destruição tecidual. Eles são
também responsáveis por grande parte da regulação do crescimento de novos vasos
durante o reparo tecidual como, por exemplo, liberando as MMPs que são essenciais
à angiogênese (Frantz
et al., 2005).
As MMP-2 e MMP-9 são especialmente importantes em processos
inflamatórios, pois são capazes de degradar as proteínas da membrana basal,
permitindo a migração das células inflamatórias. A produção de MMPs por
macrófagos está associada a diversas patologias (Mandal
et al., 2003), bem como a
eventos fisiológicos como a reparo tecidual.
Nosso principal alvo nesse trabalho foi a MMP-9 (gelatinase B), que é uma
enzima indutível de grande importância em processos angiogênicos, metastáticos e
de reparo tecidual.
Um dos motivos que nos levaram a concentrar nossos estudos nessa
gelatinase, é uma característica bioquímica, pois ela apresenta um pró-domínio rico
em resíduos de cisteína, o que presumivelmente aumenta sua susceptibilidade à
ação de espécies reativas de oxigênio (Graça-Souza
et al., 2002).
Outra razão é a presença, em sua estrutura, de um segmento homólogo a
molécula de hemopexina, um conhecido carreador de heme, levantando a hipótese
de uma possível interação entre este e a enzima. Já foi demonstrado que o domínio
96
recombinante da hemopexina, quando acrescentado em modelos tumorais, é capaz
de diminuir, por exemplo, a atividade da MMP-2, que interage através deste domínio
com uma integrina de membrana, necessária para sua ativação, diminuindo assim a
angiogênese (Coussens e Werb, 2002). Este viés ainda não foi explorado, mas
utilizando a bioinformática como ferramenta, bem como técnicas de modelagem
molecular em sílica, nosso grupo intenciona, ainda, investigar esse possível
mecanismo de regulação da MMP-9 induzida por heme.
A conformação de zimógenos das MMPs é mantida devido a interações entre
os resíduos de cisteína, existentes no pró-domínio, e o zinco presente no sítio
catalítico (Chakraborti et al., 2003). Sabe-se que esses grupos tiol reagem com ROS
e, portanto, permitiriam a regulação das enzimas.
A geração de espécies radicalares durante o estresse oxidativo vem sendo
cada vez mais associada ao desenvolvimento de certas patologias, como doenças
neurodegenerativas, câncer e arterioesclerose. Várias evidências apontam que uma
das principais moléculas envolvidas na geração de espécies reativas de oxigênio
in
vivo é a Ferri-protoporfirina IX, ou heme (Aft e Mueller, 1983) que ganha especial
importância no contexto das doenças que envolvem um quadro hemolítico, uma vez
que maciças quantidades desta molécula ganham o leito vascular. De fato, já foi
observado ativação de células do sistema imune inato (primordialmente neutrófilos e
macrófagos) quando estas células são expostas ao heme livre em concentrações
habitualmente encontradas nas anemias hemolíticas (Rajagopalan
et al., 1983).
No presente estudo, nós demonstramos que diferentes concentrações de
heme, inclusive em níveis encontrados em processos hemolíticos (25 a 50
µM),
aumentam a secreção de MMP-9 por macrófagos murinos da linhagem RAW. A
97
possibilidade de que o heme possa induzir também a síntese de MMP-9 ainda está
sendo estuda pelo grupo. Em um experimento preliminar com uso de ciclohexamida,
um inibidor da síntese protéica, verificamos que a secreção de MMP-9 no meio
condicionado foi similar, talvez menor, que nas células controles. Intencionamos
ainda, realizar PCRs em tempo real para confirmar estes resultados.
O heme livre tem efeitos tóxicos capazes de causar danos a tecidos e órgãos
por induzir estresse oxidativo via geração de ROS e liberação de ferro redox-ativo
(Jeney
et al., 2002). Por meio da técnica de redução do citocromo c SOD-inibida,
confirmamos que crescentes concentrações de heme induzem a produção de
superóxido em macrófagos RAW.
Como encontramos vasta literatura relatando que vários tipos de ROS podem
modular a atividade de MMPs em diferentes níveis incluindo a ativação direta e o
aumento da secreção (Rajagopalan
et al., 1996; Yoo et al., 2002; Liu e Rosenberg,
2005), realizamos experimentos nos quais pré-tratamos a cultura de macrófagos
RAW com N-acetilcisteína, um potente antioxidante que pode atuar aumentando os
níveis intracelulares de glutationa ou funcionando como
scavenger de oxidantes
como o peróxido de hidrogênio, o radical hidroxila e o ácido hipocloroso (Bowie e
O’Neill, 2000). O NAC interferiu de forma significativa na indução da expressão de
MMP-9 por heme, indicando o envolvimento de ROS neste evento. Acreditamos que
este resultado possa ser melhor explorado, e para isto estamos preparando
experimentos usando como estímulo outras porfirinas como, por exemplo, uma
porfirina sem o átomo de ferro.
Existe uma grande variedade de fontes de origem enzimáticas para a
produção de superóxido, no entanto, a NADH/NADPH oxidase parece ser a maior
98
fonte em polimorfonucleares, sendo originalmente descritas em células fagocíticas
(Dale
et al., 2008). Sendo assim, utilizamos um inibidor (DPI) desse sistema
enzimático, que apontou para um possível envolvimento da NADPH oxidase na
regulação da secreção de MMP-9 induzida pelo heme em macrófagos RAW.
Também buscamos neste trabalho reproduzir estes achados em um sistema
in vivo. Para isto optamos por simular uma inflamação pulmonar. O pulmão é um
órgão de grande vascularização e com uma vasta literatura que associa as MMPs
com doenças que o acometem. Ao instilarmos o heme, por via intratraqueal, no
pulmão, pudemos verificar que o efeito verificado
in vitro se repetia in vivo.
Através de uma contagem diferencial de células, verificamos que havia um
infiltrado inflamatório formado tanto por células polimorfonucleares - mais
proeminente em 24 horas – como por mononucleares - que se mantiveram por 48
horas. Os BALs mostraram que a secreção de MMP-9 aumenta quando os pulmões
são desafiados com 7,5 mg/Kg de heme. Além deste resultado, pudemos constatar
que o órgão como um todo responde com aumento de MMP-9 após 48 horas do
estímulo com heme nas concentrações de 75 µg/Kg e 7,5 mg/Kg.
Por acreditarmos que grande parte deste aumento da MMP-9 é de
responsabilidade de células mononucleares, realizamos experimentos
in vitro com
macrófagos alveolares. Baseamos esta hipótese no fato de que em 48 horas, tempo
em que foi detectado maior aumento de MMP-9 nas duas condições, BAL e extratos
de pulmão, as células inflamatórias em maior quantidade eram as mononucleares.
Além do que, os neutrófilos (polimorfonucleares), apesar de secretarem MMP-9 em
grande quantidade, não necessitam desta enzima para processos de migração
(Betsuyaku et al., 1999). Os macrófagos alveolares responderam de forma idêntica
99
às células RAW, aumentando a secreção de MMP-9 frente ao estímulo com heme,
bem como, tiveram esta indução revertida com o uso de antioxidante e um inibidor
da NADPH oxidase.
A partir dos resultados apresentados no presente estudo, passamos a
acreditar em um novo papel para o heme, como molécula capaz de aumentar a
secreção de MMP-9, via indução de estresse oxidativo resultante da produção de
ROS, em macrófagos murinos da linhagem RAW, bem como em macrófagos
murinos alveolares. A possível indução de outras MMPs, e por outros tipos celulares,
pelo heme, é passível de maiores investigações, bem como um melhor delineamento
das vias bioquímicas envolvidas neste processo.
100
7 BIBLIOGRAFIA
Abate, C; Patel, L; Rauscher, F; Curran, T: Redox regulation of fos and jun DNA
binding activity in vitro. Science 1990, 249:1157-1161.
Abraham, NG: Molecular regulation – Biological role of heme in hematopoiesis.
Blood Rev. 1991: 5:19-28.
Aft, RL e Mueller, GC: Hemin-mediated DNA strand scission. J. Biol. Chem. 1983,
258:12069-12072.
Albertsson, P; Kim, MH; Jonges, LE; Kitson, RP; Kuppen, PJ; Johansson, BR;
Nannmark, U; Goldfarb, RH: Matrix metalloproteinases of human NK cells. In Vivo
2000, 14:269-276.
Arruda, MA; Rossi, AG; De Freitas MS; Barja-Fidalgo, C; Graça-Souza, AV:
Heme inhibits human neutrophil apoptosis: involvement of phosphoinositide 3-
kinase, MAPK, and NF-kB. J. Immunol 2004, 173:2023-2030.
Arruda, MA; Souza, PB; Sampaio, ALF; Rossi, AG; Graça-Souza, AV; Barja-
Fidalgo, C: NADPH oxidase-derived ROS: Key modulators of heme-induced
mitochondrial stability in human neutrophils. Exp. Cell Research 2006,
312(19):3939-3948.
Atkinson, JJ; Senior, RM: Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling. Am. J.
Respir. Cell Mol. Bio. 2003, 38:12-24.
Babior, BM: Phagocytes and oxidative stress. Am. J. Med. 2000, 109:33-44.
Baca, L, Gibbons, RB: The HELLP syndrome: a sereious complication of
pregnancy with hemolysis, elevated levels of liver enzymes, and low platelet
count. Am. J. Med. 1998, 85:590-591.
Balla, G.: Jacob, HS: Eaton, J; Belcher, J; Vercellotti, G: Hemin: a possible
physiological mediator of low density lipropotein oxidation and endothelial injury.
Arterioscler. Thromb. 1991, 11:1700-1711.
Balla, J; Balla, G; Jeney, V; Kakuk, G; Jacob, HS; Vercellotti, GM: Ferriporphyrins
and endothelium: A 2-edged sword-promotion of oxidation and induction of
cytoprotectants. Blood 2000, 95:3442-3450.
Bandyopadhyay, U; Bhattacharyya, DK; Chatterjee, R; Banerjee, RK: Localization
of gastric peroxidase and its inhibition by mercaptomethylimidazole, an inducer of
gastric acid secretion. Biochem. J. 1992, 284:305-312.
101
Baranano, DE; Rao, M; Ferris, CD; Snyder, SH: Biliverdin reductase: a major
physiologic cytoprotectant. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2002, 99:16093-16098.
Bartholome, EJ; Van Aelst, I; Koyen, E; Kiss, R; Willems, F; Goldman, M;
Opdenakker, G: Human monocyte-derived dendritic cells produced bioactive
gelatinase B: inhibition by IFN-beta. J. Interferon Cytokine Res. 2001, 21:495-501.
Beaudeux, JL; Giral, P; Bruckert, E; Foglietti, MJ; Chapman, MJ: Matrix
metalloproteinases, inflammation and atherosclerosis: therapeutic perspectives.
Clin. Chem. Lab. Med. 2004, 42(2):121-131.
Betsuyaku, T; Shipley, JM; Liu, Z; Senior, RM: Neutrophil emigration in the lungs,
peritoneum, and skin does not require gelatinase B. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.
1999, 20:1303-1309.
Bian, J e Sun, Y: Transcriptional activation by p53 of the human type IV
collagenase (gelatinase A ou Matrix metalloproteinase 2) promoter. Mol. Cell.
Biol. 1997, 17:6330-6336.
Black, RA; Rauch, CT; Kozlosky, CJ; Peschon, JJ; Slack, JL; Wolfson, MF;
et al.:
A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from
cells. Nature 1997, 385:729-33.
Bowie, A e O´Neill LAJ: Oxidative Stress and Nuclear Factor-kB activation: A
reassessment of the evidence in the light of recent discoveries. Biochem. Pharm.
2000, 59:13-23.
Brew, K; Dinakarpandian, D; Nagase, H: Tissue inhibitors of metalloproteinases:
Evolution, structure and function. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1477:267-283.
Buckley, S; Driscoll, B; Shi, W; Anderson, K; Warburton, D: Migration and
gelatinases in cultured fetal, adult, and hyperoxic alveolar epithelial cells. Am. J.
Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2001, 281:427-434.
Buhimschi, IA; Kramer, WB; Buhimschi, CS; Thompson, LP: Reduction-oxidation
(redox) state regulation of matrix metalloproteinase activity in human fetal
membranes. Am. J. Obstet. Gynecol. 2000, 182:458-464.
Chakraborti, S; Mandal, M; Das, S; Mandal, A; Chakraborti, T: Regulation of
matrix metalloproteinases: An overview. Mol. Cell. Biochem. 2003, 253:269-285.
Cheson, BD; Curnette, JT e Babior, BM: The oxidative killing mechanisms of the
neutrophil. Prog. Clin. Immunol. 1977, 3:1-65.
Coussens,LM e Werb Z: Inflammation and cancer. Nature 2002, 420:860-867.
Curtin, JF; Donovan, M; Cotter, TG: Regulation and measurement of oxidative
stress in apoptosis. J. Immunol. Methods 2002, 265:49-72.
102
Dale, DC; Boxer, L; Liles, WC: The phagocytes: neutrophils and monocytes.
Blood 2008, 112: 935-945.
Dawson, JH: Probing structure-function relations in heme containing oxygenases
and peroxidases. Science 1988, 240:433-439.
Dulak, J; Jozkowicz, A; Foresti, R; Kasza, A; Frick, M; Huk, I; Green, CJ;
Pachinger, O; Weidinger, F; Motterlini, R: Heme oxygenase activity modulates
vascular endothelial growth factor synthesis in vascular smooth muscle cells.
Antiox. Redox Signal 2002, 4:229-240.
Eiam-Ong, S; Sitprija, V: Falciparum malaria and the kidney: a model of
inflammation. Am. J. Kidney Dis. 1998, 32:361-375.
Egeblad, M; Werb, Z: New functions for the matrix metalloproteinase expression
in cancer progression. Nature Reviews Cancer 2002, 2:161-174.
Eskew, JD; Vanacore, RM: Sung, L; Morales, PJ; Smith, A: Cellular protection
mechanisms against extracellular heme. Heme-hemopexin, but not free heme,
actives the N-terminal c-jun kinase. J. Biol. Chem. 1999, 274:638-648.
Fleiner, M; Kummer, M; Mirlacher, M; Sauter, G; Cathomas, G; Krapf, R;
Biedermann, BC: Arterial neovascularization and inflammation in vunerable
patients: early and late signs of symptomatic atherosclerosis. Circulation 2004,
110:2843-2850.
Frantz, S; Vincent, KA; Feron, O; Kelly, RA: Innate immunity and angiogenesis.
Circ. Res. 2005, 96:15-26.
Galis, ZS; Asanuma, K; Godin, D; Meng, X: N-acetyl-cysteine decreases the
matrix-degrading capacity of macrophage-derived foam cells: new target for
antioxidant therapy? Cirulation 1998, 97:2445-2453.
Galis, ZS; Johnson, C; Godin, D; Magid, R; Shipley, JM; Senior, RM; Ivan, E:
Targeted disruption of the matrix metalloproteinase-9 gene impairs smooth
muscle cell migration and geometrical arterial remodelling. Circ. Res. 2002,
91:852-859.
Graça-Souza, AV; Arruda, MA; de Freitas, MS; Barja-Fidalgo, C; Oliveira, PL:
Neutrophil activation by heme: implications for inflammatory processes. Blood
2002, 99:4160-4165.
Greenlee, KJ; Werb, Z; Kheradmand, F: Matrix metalloproteinases in lung:
Multiple, multifarious, and multifaceted. Physiol. Rev. 2007, 87:69-98.
Griendling, KK; Sorescu, D; Ushio-Fukai, M: NAD(P)H oxidase: role in
cardiovascular biology and disease. Circ. Res. 2000, 86:494-501.
103
Gurjar, MV; Deleon, J; Sharma, RV; Bhalla, RC: Role of reactive oxygen species
in IL-1β-stimulated sustained ERK activation and MMP-9 induction. Am. J.
Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001, 281:2568:2574.
Gutteridge, JM e Smith, A: Antioxidant protection by haemopexin of haem-
stimulated lipid peroxidation. Biochem. J. 1988, 256:861-865.
Haddad, JJ: Antioxidant and prooxidant mechanisms in the regulation of redox
(y)-sensitive transcription factors. Cell. Signalling 2002a, 14:879-897.
Haddad, JJ: Oxygen homeostasis, thiol equilibrium and redox regulation of
signaling transcription factors in the alveolar epithelium. Cell. Signalling 2002b,
14:799-810.
Halliwell, B; Gutteridge, JM: Role of free radicals and catalytic metal ions in
human disease: an overwiew. Methods in Enzymology 1990, 189(B):1-85.
Hautamaki, RD; Kobayashi, DK; Senior, RM; Shapiro, SD: Requirement for
macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphusema in mice. Science
1997, 277:2002-2004.
Hebbel, RP; Morgan, WT; Eaton, JW; Helund, BE: Accelerated autoxidation and
heme loss due to instability of sickle hemoglobin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1988, 85:237:241.
Henson, PM; Johnston Jr, RB: Tissue injury in inflammation: oxidants,
proteinases, and cationic proteins. J. Clin. Invest. 1987:79:674-699.
Huang, Y; Mironova, M; Lopes-Virella, MF. Oxidized LDL stimulates matrix
metalloproteinase-1 expression in human vascular endothelial cells. Arterioscler.
Thromb. Vasc. Biol. 1999, 19:2640-2647.
Ichikawa, Y; Ishikawa, T; Momiyama, N; Kamiyama, M; Sakurada, H; Matsuyama,
R; Hasegawa, S; Chishina, T; Hamaguchi, Y; Fuji, S;
et al: Matrilysin (MMP-7)
degrades VE-cadherin and accelerates accumulation of beta-catenin in the
nucleus of human umbilical vein endothelial cells. Oncol. Rep. 2006, 15:311-315.
Igarashi, K e Sun, J: The heme-Bach1 pathway in the regulation of oxidative
stress response and erythroid differentiation. Antioxid. Redox Signal. 2006, 8:107-
118.
Ishii, DN e Maniatis, GM: Haemin promotes rapid neurit outgrowth in cultured
mouse neuroblastoma cells. Nature 1978, 271:371-374.
Jansen, SJK: Oxidative stress and free radicals. J. Mol. Structure (Theochem.)
2003, 666:387-392.
104
Jazwa, A; Loboda, A; Golda, S; Cisowski, J; Szelag, M; Zagorska, A; Sroczynska,
P; Drukala, J; Jozkowicz, A; Dulak, J: Effect of heme and heme oxygenase-1 on
vascular endothelial growth factor synthesis and angiogenic potency of human
keratinocytes. Free Rad. Biol. & Med. 2006, 40:1250-1263.
Jeney,V; Balla, J; Yachie, A; Varga, Z; Vercellotti, GM; Eaton, JW; Balla, G: Pro-
oxidant and cytotoxic effects of circulating heme. Blood 2002, 100:879-887.
Johnson, KJ; Fantone, JC; Kaplan, J; Ward, PA:
In vivo damage of rat lungs by
oxygen metabolites. J. Clin. Invest. 1981, 67:983-993.
Johnson, KJ e Ward, PA: Role of oxygen metabolites in immune complex injury of
lung. J. Immunol. 1981, 126:2355-2359.
Jozkowicz, A; Huk, I; Nigisch, A; Weigel, G; Dietrich, W; Motterlini, R; Dulak, J:
Heme oxygenase and angiogenic activity of endothelial cells: Stimulation by
carbon monoxide and inhibition by tin protoporphyrin-IX. Antiox. Redox Signal
2002, 4:577-585.
Kanbe, N; Tanaka, A; Kanbe, M; Itakura, A; Kurosawa, M; Matsuda, H: Human
mast cells produce matrix metalloproteinase 9. J. Immunol. 1999, 29:2645-2649.
Kassim, SY; Fu, X; Liles WC; Shapiro, SD; Parks, WC; Heinecke, JW: NADPH
oxidase restrains the matrix metalloproteinase activity of macrophages. J. Biol.
Chem. 2005, 280:30201-30205.
Kheradmand F; Werner, E; Tremble, P; Symons, M; Werb, Z: Role of Rac1 and
oxygen radicals in collagenase-1 expression induced by cell shape change.
Science 1998, 280:898-902.
Kidachi, Y; Yamaguchi, H; Umetsu, H; Ryoyama, K: Interferon-gamma and
lipopolysaccharide stimulation increases matrix metalloproteinase-9 expression
and enhances invasion activity in ras/myc-transformed serum-free mouse embryo
cells. Cell. Biol. Int. 2007, 31:1511-1517.
Kollias, G; Douni, E; Kassiotis, G; Kontoyiannis, D: The function of tumour
necrosis factor and receptors in models of multi-organ inflammation, rheumatoid
arthritis, multiple sclerosis and inflammatory bowel disease. Ann. Rheum. Dis.
1999, 58:132-139.
Kristiansen, M; Graversen, JH; Jacobsen, C: Identification of the hemoglobin
scavenger receptor. Nature 2001, 409:198-201.
Kumar, S e Bandyopadhyay, U: Free heme toxicity and its detoxification systems
in human. Toxicology Letters 2005, 157:175-188.
Laemmli, UK: cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 1970, 227:680-685.
105
Lauer-Fields, JL; Juska, D; Fields, GB: Matrix metalloproteinases and collagen
catabolism. Biopolymers 2002, 66:19-32.
Leber, TM; Balkwill, FR: Zymography: A single-step staining method for
quantitation of proteolytic activity on substrate gels. Anal. Biochem. 1997, 249:24-
28.
Lee, MH e Murphy, G: Matrix metalloproteinases at a glance. J. Cell Science
2004, 117:4015-4016.
Levine, RL; Garland, D; Oliver, CN; Amici, A; Climent, I; Lenz, AG; Ahn, BW;
Shaltiel, S; Stadtman, ER. Determination of carbonyl content in oxidatively
modified proteins. Methods in Enzymology 1990, 186(B):464-485.
Li, Z; Li, L; Zielke, HR; Cheng, L; Xiao, R; Crow, MT; Stetler-Stevenson, WG;
Froehlich, J; Lakatta, EG: Increased expression of 72-Kd type IV collagenase
(MMP-2) in human aortic atherosclerotic lesions. Am. J. Pathol. 1996, 148:121-
128.
Lian, X; Qin, Y; Hossain, SA; Yang, L; White, A; Xu, H; Shipley, JM; Li, T; Senior,
RM; Du, H; Yan, C: Overexpression of Stat3C in pulmonary epithelium protects
against hyperoxic lung injury. J. Immunol. 2005, 174:7250-7256.
Liu, KJ e Rosenber, GA: Matrix metalloproteinases and free radicals in cerebral
ischemia. Free Rad. Biol. & Med. 2005, 39:71-80.
Loftus, IM e Thompson, MM: The role of matrix metalloproteinases in vascular
disease. Vascular Med. 2002, 7:117-133.
Lowry, OH; Rosebrough, NJ; Farr, AL; Randall, RJ: Protein measurement with the
folin phenol reagent.
J. Biol. Chem. 1951, 193:265-275.
Luplertlop, N; Misse, D; Bray, D; Deleuze, V; Gonzales, JP; Leardkamolkarn, V;
Yssel, H; Veas, F: Dengue-virus-infected dendritic cells trigger vascular leakage
through metalloproteinase overproduction. EMBO Rep. 2006, 7:1176-1181.
Manicone, AM; McGuire, JK: Matrix metalloproteinases as modulators of
inflammation. Sem. Cell Develop. Biol. 2008, 19:34-41.
McCawley, LJ e Matrisian, LM: Matrix metalloproteinases: they’re not just for
matrix anymore!. Cur. Opinion cell Biol. 2001, 13:534-540.
MacQuibban, GA; Gong, JH; Tam, EM; McCulloch, CA; Clark-Lewis, I; Overall,
CM: Inflammation dampened by gelatinase A cleavage of monocyte
chemoattranctant protein-3. Science 2000, 289:1202-6.
106
Mc Quibban, GZ; Butler, GS; Gong, JH; Bendall, L; Power, C; Clark-Lewis, I;
Overall, CM: Matrix metalloproteinase activity inactivates the CXC chemokine
stromal cell-derived factor-1. J. Biol. Chem. 2001, 276:43503-43508.
McQuibban, GA; Gong, JH; Wong, JP; Wallace, JL; Clark-Lewis, I; Overall, CM.
Matrix metalloproteinase processing of monocyte chemoatractant proteins
generates CC chemokine receptor antagonists with anti-inflammatory properties
in vivo. Blood 2002, 100:1160-1167.
Mense, SM e Zhang, L: Heme: a versatile signaling molecule controlling the
activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases.
Cell Res. 2006, 16:681-692.
Mohan, MJ; Seaton, T; Mitchell, J; Howe, A; Blackburn, K; Burkhart, W; Moyer, M;
Patel, I; Waitt, GH, Becherer, JD;
et al: The tumor necrosis factor-alpha
converting enzyme (TACE): a unique metalloproteinase with highly defined
substrate selectivity. Bichemistry 2002, 41:9462-9469.
Moss, ML; Sklair-Tavron, L; Nudelman, R: Drug Insight: tumor necrosis factor-
converting enzyme as a pharmaceutical target for rheumatoid arthritis. Nature
Clin. Pract. Rheumat. 2008, 4:300-309.
Motohashi, H; O’Connor, T; Katsouka, F; Engel, JD; Yamamoto, M: Integration
and diversity of the regulatory network composed of Maf and CNC families of
transcription factors. Gene 2002, 294:1-12.
Nagase, H e Woessner, JF Jr: Matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem. 1999,
274:21491-21494.
O’Donnell, BV; Tew, DG; Jones, OT; England, PJ: Studies on the inhibitory
mechanism of iodonium compounds with special reference to neutrophil NADPH
oxidase. Biochem. J. 1993, 290:41-49.
Ohara, Y; Peternson, TE; Harrison, DG: Hypercholesterolemia increases
endothelial superoxide anion production. J. Clin. Invest. 1993, 91:2546-2551.
Ohno, L; Ohtani, H; Nitta, Y; Suzuki, J; Hoshi, H; Honma, M; Isoyama, S; Tanno,
Y; Tamura, G; Yamauchi, K; Nagura, H; Shirato, K: Eosinophils as a source of
matrix metalloproteinase-9 in asthmatic airway inflammation. Am. J. Respir. Cell
Mol. Bol. 1997, 16: 212-219.
Opdenakker, G; Van den Steen, PE; Van Damme, J: Gelatinase B: A tuner and
amplifier of immune functions. Trends Immunol. 2001, 22:571-579.
Parks, WC; Wilson, CL; Lopez-Boado, YS: Matrix metalloproteinases as
modulators of inflammation and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 2004, 4:617-
629.
107
Peppin, GJ e Weiss, SJ: Activation of the endogenous metalloproteinase,
gelatinase, by triggered human neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sck. USA 1986,
83:4322-4326.
Philip, S; Bulbule, A; Kundu, GC: Matrix metalloproteinase-2: Mechanism and
regulation of NF-kB-mediated activation and its role in cell motility and ECM-
invasion. Glycoconjugate J. 2004, 21:429-441.
Ponka, P: Cell biology o heme. Am. J. Med. Sci. 1999, 318:241-256.
Power, C; Henry, S; Del Bigio, MR; Larsen, PH; Corbett, D; Imai, Yumi; Yong,
VW; Peeling, J: Intracerebral Hemorrhage Induces Macrophage Activation and
Matrix Metalloproteinases. Ann. Neurol. 2003, 53:731-742.
Prato, M; Giribaldi, G; Polimeni, M; Gallo, V; Arese, P: Phagocytosis of hemozoin
enhances matrix metalloproteinase-9 activity and TNF-α production in human
monocytes: Role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of falciparum
malaria. J. Immunol. 2005, 175:6436-6442.
Prato, M; Gallo, V; Giribaldi, G; Arese, P: Phagocytosis of haemozoin (malarial
pigment) enhances metalloproteinase-9 activity in human adherent monocytes:
Role of IL-1beta and 15-HETE.
Rajagopalan, S; Meng, XP; Ramasamy, S; Harrison, DG; Galis, ZS: Reactive
Oxigen Species Produced by Macrophage-derived Foam Cells Regulate the
activity of Vascular Matrix Metalloproteinases in Vitro. J. Clin. Invest. 1996,
98:2572-2579.
Reijerkerk, A; Kooij, G; Van der Pol, SM; Khazen, S; Dijkstra, CD; de Vries, HE:
Diapedesis of monocytes is associated with MMP-mediated occludin
disappearance in brain endothelial cells. FASEB J. 2006, 20:2550-2552.
Reiter, CD; Wang, X; Tanus-Santos, JE; Hogg, N; Cannon III, RO; Schechter, AN;
Gladwin, MT: Cell-free hemoglobin limits nitric oxide bioavailability in sickle-cell
disease. Nat. Medicine 2002, 8:1383-1389.
Rivera-Marrero, CA; Schuyler, W; Roser, S; Roman, J: Induction of MMP-9
mediated gelatinolytic activity in human monocytic cells by cell wall components
of Mycobacterium tuberculosis. Microbial Pathogenesis 2000, 29:231:244.
Rother, RP; Bell, L; Hillmen, P; Gladwin, MT: The clinical sequelae of
intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin. A novel mechanism
of human disease. JAMA 2005, 293:1653-1662.
Rouis, M; Adamy, C; Duverger, N; Lesnik, P; Horellou, P; Moreau, M; Emmanuel,
F; Caillaud, JM; Laplaud, PM; Dachet, C; Chapman, MJ: Adenovirus-mediated
overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 reduces atherosclerotic
lesions in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 1999, 100:533-540.
108
Rundhaug, JE: Matrix metalloproteinases, angiogenesis, and cancer. Clin. Cancer
Res. 2003, 9:551-554.
Rundhaug, JE: Matrix metalloproteinases and angiogenesis. J. Cell Mol. Med.
2005, 9:267-285.
Ryter, SW; Otterbein, LE; Morse, D; Choi, AM: Heme oxygenase/carbon
monoxide signaling pathways: regulation and functional significance. Mol. Cell
Biochem. 2002, 235:249-263.
Ryter, SW e Tyrrell, RM: The heme synthesis and degradation pathways: role in
oxidant sensitivity. Heme oxygenase has both pro- and antioxidant properties.
Free Radic. Biol. Med. 2000, 28:289-309.
Ryu, J; Vicencio, AG; Yeager, ME; Kashgarian, M; Haddad, GG; Eickelber, O:
Differential expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human
and mouse lung development. Thrombosis Haemostasis 2005, 94:175-183.
Schmitt, TH; Wilson, A; Frezzatti Jr., G; Schreier, S: Hemin-induced lipid
membrane disorder and increased permeability: a molecular model for the
mechanism of cell lysis. Arch. Biochem. Biophys. 1993, 207:96-103.
Schreck, R; Meier, B; Mannel, DN; Droge, W; Baeuerle, PA: Dithiocarbamates as
potent inhibitors of nuclear factor kappa B activation in intact cells. J. Exp. Med.
1992, 175:1181-1194.
Sen, CK; Packer, L: Antioxidant and redox regulation of gene transcription.
FASEB 1996, 10:709-720.
Sies, H: Oxidative stress. London: Academic 1985, 507.
Sies, H: Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem. 1993, 215:213-219.
Somerville, RPT; Oblander, AS; Apte, SS: Matrix metalloproteinases: old dogs
with new tricks. Genome Biology 2003, 4:216.
Stamenkovic, I: Extracellular matrix remodeling: The role of matrix
metalloproteinases. J. Pathol. 2003, 200:448-468.
Sternilicht, MD e Werb, Z: How matrix metalloproteinases regulate cell behavior.
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001, 17:463-516.
Sun, J; Hoshino, H; Takaku, K; Nakajima, O; Muto, A; Susuki, H;Tashiro, S;
Takahashi, S; Shibahara, S; Alam, J; Taketo, MM; Yamamoto, M; Igarashi, K:
Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene.
EMBO J. 2002, 21:5216-5224.
109
Sun, Y e Oberley LW: Redox regulation of transcriptional activators. Free Rad.
Biol. Med. 1996, 21:335-348.
Tam, EM; Moore, TR; Butler, GS; Overall, CM: Characterization of the distinct
collagen binding, helicase and cleavage mechanisms of matrix metalloproteinase
2 and 14 (gelatinase A and MT1-MMP). J. Biol. Chem. 2004, 279:43336-43344.
Tejima, E; Zhao, BQ; Tsuji, K; Rosell, A; Leyen, KV; Gonzalez, RG; Montaner, J;
Wang, X; Lo, EG: Astrocytic induction of matrix metalloproteinase-9 and edema in
brain hemorrhage. J. Cer. Blood & Floow Met. 2007, 27:460-468.
Tremble, P; Damsky, CH; Werb, Z: Components of the nuclear signaling cascade
that regulate collagenase gene expression in response to integrin-derived signals.
J. Cell. Biol. 1995, 129:1707-1720.
Uemura, S; Matsushita, H; Li, W; Glassford, AJ; Asagami, T; Lee, KH; Harisson,
DG; Tsao, PS: Diabetes mellitus enhances vascular matrix metalloproteinase
activity: role of oxidative stress. Cir. Res. 2001, 88:1291-1298.
Uzui, H; Harpf, A; Liu, M; Doherty, TM; Shukla, A; Chai, NN; Tripathi, PV;
Jovinge, S; Wilkin, DJ; Asotra, K; Shah, PK; RAjavashisth, TB: Increased
expression of membrane type 3-matrix metalloproteinase in human
atherosclerotic plaque: role of activated macrophages and inflammatory
cytokines. Circulation 2002, 106:3024-3030.
Vincent, SH: Oxidative effects of heme and porphyrins on proteins and lipids.
Simin. Hematol. 1989, 26:105-113.
Virmani, R; Kolodgie, FD; Burke, AP; Finn, AV; Gold, HK; Tulenko, TN; Wrenn,
SP; Narula, J: Atherosclerotic plaque progression and vulnerability to rupture:
Angiogenesis as a source of intraplaque hemorrhage. Arterio. Thromb. Vasc. Biol.
2005, 125:2054-2061.
Wagner, KR; Sharp, FR; Ardizzone, TD; Lu, A; Clark, JF: Heme and iron
metabolism: Role in cerebral hemorrhage. J. Cereb. Blood Flow & Metab. 2003,
23:629-652.
Weeks, Bs; Schnaper, HW; Handy, M; Holloway, E; Kleinman, HK: Human T
lymphocytes synthesize the 92 kDa type IV collagenase (gelatinase B). J. Cell.
Physiol. 1993, 157:644-649.
Weiss, SJ; Peppin, G; Ortiz, X; Ragsdale, C; Test, ST: Oxidative autoactivation of
latent collagenase by human neutrophils. Science 1985, 227:747-749.
Welgus, HG; Campbell, EJ; Cury, JD; Eisen, AZ; Senior, RM; Wilhelm, SM;
Goldberg, GI: Neutral metalloproteinases produced by human mononuclear
phagocytes. Enzyme profile, regulation, and expression during cellular
development. J. Clin. Invest. 1990, 86:1496-1502.
110
Werb, Z; Tremble, PM; Behrendtsen, O; Crowley, E; Damsky, CH: Signal
transduction through the fibronectin receptor induces collagenase and stromelysin
gene expression. J. Cell. Biol. 1989, 109:877-889.
Westermarck, J; Kahari, V-M: Regulation of matrix metalloproteinase expression
in tumor invasion. FASEB J. 1999, 13:781-792.
Wilson, Cl; Ouellette, AJ; Satchell, DP; Ayabe, T; Lopez-Boado, YS; Stratman, JL;
Hultgren, SJ; Matrisian, LM; Parks, WC: Regulation of intestinal alpha-defensin
activation by the metalloproteinase matrilysin in innate host defense. Science
1999, 286:113-117.
Woodgett, JR; Avruch, J; Kyriakis, J: The stress activated protein kinase pathway.
Cancer Surv. 1996, 27:127-138.
Yang, Z; Strickland, DK; Bornstein, P: Extracellular MMP-2 levels are regulated by
the low-density lipoprotein-related scavenger receptor and thrombospodin-2. J.
Biol. Chem. 2001, 276:8403-8408.
Yoo, HG; Shin, BA; Park, JS; Lee, KH; Chay, KO; yang, SY; Ahn, BW; Jung, YD:
IL-1β induces MMP-9 via reactive oxygen species and NFkB in murine
macrophage RAW 264.7 cells. Biochem. Biophys. Res. Com. 2002, 298:251-256.
Yoon, SO; Park, SJ; Yoon, SY; Yun, CH; Chung, AS:Sustained production of
H
2
O
2
activates pro-matrix metalloproteinase-2 through receptor tyrosine
kinases/phosphatidylinositol 3-kinase/NF-κB pathway. J. Biol. Chem. 2002,
277:30271-30282.
Yoshida, M; Korfhagen, TR; Whitsett, JA: Surfactant protein D regulates NF-kB
and matrix metalloproteinase production in alveolar macrophages via oxidant-
sensitive pathways. J. Immunol. 2001, 166:7514-7519.
Zanke, BW; Boudreau, K; Rubie, E; Winnett, E; Tibbles, LA; Zon, L; Kyriakis, J,
Liu, FF; Woodgett, JR: The stress-activated protein kinase pathway mediates cell
death following injury induced by cis-platinum, UV irradiation or heat. J. Biol.
Chem. 1996, 271:648-655.
CURRICULUM VITAE
Nome: Kathleen da Silva Gonçalves
Nascimento: 08/01/1969
Naturalidade: Rio de Janeiro
¾ Formação Acadêmica
• Faculdade de Economia pelo Faculdades Integradas Bennett, de
agosto/1994 a dezembro/1998
• Faculdade de Biomedicina pela Universidade Federal Fluminense, de
janeiro/2003 a dezembro/2006
• Mestrado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica –
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
¾ Orientação de Estudante
1. Fabiana Vieira de Mello – iniciação científica desde julho de 2008.
2. Camila de Oliveira Goulart – iniciação científica de abril/2008 a
fevereiro/2009
¾ Participação em Congresso
• 4 participações com apresentação de pôster em congressos nacionais.
• 2 participações com apresentação de pôster em congressos internacionais.
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