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Constituintes Químicos de Borreria verticillata
(RUBIACEAE)
VINICIUS FERNANDES MOREIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA AGROPECUÁRIAS
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
Setembro de 2009
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CONSTITUINTES QUÍMICOS DE Borreria verticillata
(RUBIACEAE)
VINICIUS FERNANDES MOREIRA
“Dissertação de Mestrado apresentada ao
Centro de Ciências e Tecnologia
Agropecuárias da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Produção Vegetal”.
Orientador: Prof. Dr. Ivo José Curcino Vieira
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA AGROPECUÁRIAS
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
SETEMBRO DE 2009
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CONSTITUINTES QUÍMICOS DE Borreria verticillata
(RUBIACEAE)
VINICIUS FERNANDES MOREIRA
“Dissertação de Mestrado apresentada ao
Centro de Ciências e Tecnologia
Agropecuárias da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Produção Vegetal”.
Aprovado em 30 de setembro de 2009.
Comissão Examinadora:
____________________________________________________________
Prof
a
Maria Raquel G. Vega (Pós.D. Sc.Química de Produtos Naturais) – UFRRJ
____________________________________________________________
Prof
o
Edmilson José Maria
(D. Sc., Química Orgânica) – UENF
____________________________________________________________
Prof
o
Rodrigo Rodrigues de Oliveira (D. Sc., Química Orgânica) – UENF
____________________________________________________________
Prof
o
Ivo José Curcino Vieira (D. Sc., Química Orgânica) – UENF
(Orientador)
ii
Dedico este trabalho aos meus pais, à minha irmã, à minha namora-esposa
e aos meus amigos.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo que tem me dado até aqui;
A meus pais: Julio e Elisete;
À minha namorada-esposa Fernanda;
Aos amigos e companheiros de laboratório;
Ao professor Ivo José Curcino Vieira pela orientação e ensinamento;
Aos professores Carlos Matos e Raimundo Braz-Filho;
Ao Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas - (UNICAMP);
Ao DEQUIM/ UFRRJ;
A FIOCRUZ;
A QEFPN/UF;
A todos,
obrigado por tudo.
iv
SUMÁRIO
Lista de figuras vi
Lista de tabelas xii
Lista de fluxogramas xiii
Lista de esquemas xiii
Lista de Abreviaturas e Símbolos xiv
Abstract xvi
Resumo xvii
1- INTRODUÇÃO 1
2- OBJETIVO 4
3- REVISÃO DE LITERATURA 5
3.1- Família Rubiaceae 5
3.2- O Gênero Borreria 9
3.3- Borreria verticillata 12
3.4- Iridóides 15
3.5- Alcalóides 18
3.5.1- Alcalóides Indólicos 19
4- METODOLOGIA 22
4.1-Coleta do material vegetal e classificação botânica 20
4.2- A secagem, moagem e pesagem do material 22
4.3- A extração dos constituintes químicos do material botânico 22
4.4- Identificação das substâncias isoladas 22
4.5- Análises cromatográficas 23
4.6- Análises espectroscópicas 23
4.7- Ensaio de toxicidade frente a Artemia salina (TAS) 23
5- PARTE EXPERIMENTAL 25
5.1- A extração dos constituintes químicos do material botânico
(1ª coleta).
25
5.1.2- A extração dos constituintes químicos do material
botânico (2ª coleta).
25
5.2- Descrição experimental do isolamento dos constituintes
químicos isolados
26
v
5.2.1- Análise das frações obtidas do extrato do caule de
Borreria verticillata
26
5.2.1.1- Análise do Extrato metanólico (BCM) 26
5.2.2- Análise das frações obtidas do extrato das raízes de
Borreria verticillata
29
5.2.2.1- Análise do Extrato metanólico (BVR) 29
6- RESULTADOS E DISCUSSÃO 34
6.1- Substâncias identificadas de Borreria verticillata 34
6.2- Determinação Estrutural
35
6.2.1- Identificação da substância BR-13
35
6.2.2- Identificação da substância BR-22 55
6.2.3- Identificação da substância BC-4 69
6.2.4- Identificação do derivado (BC-8Ac) da substância BC-8 80
6.2.5- Identificação da substância BR-25 92
6.2.6- Identificação da mistura de esteróides BR-31 117
6.2.7- Identificação do derivado acetilado (BR-29Ac) da
substância BR-29
126
6.2.8- Identificação do derivado acetilado (BR-28Ac) da
substância BR-28
151
6.3- Resultado do ensaio de toxicidade frente a Artemia salina
(TAS)
164
7- CONCLUSÃO
165
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 166
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Exemplos de produtos naturais isolados de plantas. 1
Figura 2: Diversidade química e distribuição dos principais
constituintes nas quatro subfamílias: Ixoroideae (IXO),
Cinchonoideae (CIN), Rubioideae (RUB) e Antirheoideae
(ANT) pertencentes à família Rubiaceae.
6
Figura 3: Alcalóides indólicos de Borreria capitata 9
Figura 4: Iridóide asperulosídeo 10
Figura 5: Iridoides de Borreria latifólia 10
Figura 6: Terpenóides do Gênero Borreria 11
Figura 7: Flavonóides de Borreria stricta 11
Figura 8: Borreria verticillata 12
Figura 9: Alcalóides de Borreria verticillta 13
Figura 10: Iridóides de Borreria verticillata: 14
Figura 11: Esqueleto iridano 15
Figura 12: Alguns exemplos de iridóides 16
Figura 13: Biossíntese simplificada dos iridóides 17
Figura 14: Alcalóides com atividade biológica 19
Figura 15: Formação de estrictosidina a partir da triptamina e
secologanina pela estrictosidina sintase
20
Figura 16: Espectro de IV (KBr) de BR-13 38
Figura 17: Espectro de RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BR-13 39
Figura 18: Ampliação da região de δ
H
3,8 a 0,8 do espectro de
RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BR-13
40
Figura 19: Ampliação da região de δ
H
8,0 a 5,3 do espectro de
RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BR-13
41
Figura 20: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-13 42
Figura 21: Ampliações do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em
CDCl
3
de BR-13
43
Figura 22: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) em CDCl
3
de BR-13 44
Figura 23: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º, 100 MHz) em CDCl
3
de
BR-13
45
Figura 24: Mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de 46
vii
BR-13
Figura 25: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC
em CDCl
3
de BR-13
47
Figura 26: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC
em CDCl
3
de BR-13
48
Figura 27: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC
em CDCl
3
de BR-13
49
Figura 28: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de
BR-13
50
Figura 29: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BR-13
51
Figura 30: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BR-13
52
Figura 31: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BR-13
53
Figura 32: Cromatograma de BR-13 54
Figura 33: Espectro de Massas da substância BR-13 54
Figura 34: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
de BR-22 58
Figura 35: Ampliação da região δ
H
8,6 a 7,2 do espectro de RMN
1
H
(500 MHz) em CDCl
3
de BR-22
59
Figura 36: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-22 60
Figura 37: Mapa de correlação
1
H-
1
H-NOESY em CDCl
3
de BR-22 61
Figura 38: Espectro de RMN
13
C (125 MHz) em CDCl
3
de BR-22 62
Figura 39: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º, 125 MHz) em CDCl
3
de
BR-22
63
Figura 40: Mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de
BR-22
64
Figura 41: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de
BR-22
65
Figura 42: Ampliações do mapa de correlação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BR-22
66
Figura 43: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BR-22
67
Figura 44: Espectro de massas de BR-22 68
viii
Figura 45: Espectro de IV (KBr) de BC-4 72
Figura 46: Espectro de RMN1H (400 MHz) em MeOH de BC-4 73
Figura 47: Ampliação da região δ
H
5,1 a 4,1 do espectro de RMN1H
(400 MHz) em MeOH de BC-4
74
Figura 48: Ampliação da região δ
H
4,3 a 2,9 do espectro de RMN1H
(400 MHz) em MeOH de BC-4
75
Figura 49: Espectro de RMN
13
C (APT, 100 MHz) em MeOH de BC-4 76
Figura 50: Mapa de correlação do espectro de HMQC em MeOH de
BC-4
77
Figura 51: Mapa de correlação do espectro de HMBC em MeOH de
BC-4
78
Figura 52: Espectros de HR-ESI-MS/MS de BC-4 79
Figura 53: Espectro de IV (KBr) de BC-8 82
Figura 54: Espectro de RMN1H (400 MHz) em CDCl3 de BC-8 antes
da acetilação
84
Figura 55: Espectro de RMN1H (400 MHz) em CDCl
3
de BC-8Ac 85
Figura 56: Ampliação da região δ
H
6,0 a 3,1 do espectro de RMN1H
(400 MHz) em CDCl
3
de BC-8Ac
86
Figura 57: Ampliação da região δ
H
2,1a 0,0 do espectro de RMN1H
(400 MHz) em CDCl
3
de BC-8Ac
87
Figura 58: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) em CDCl
3
de BR-8Ac 88
Figura 59: Mapa de correlação do espectro de HMQC em CDCl
3
de
BC-8Ac
89
Figura 60: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de
BC-8Ac
90
Figura 61: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BC-8Ac
91
Figura 62: Espectro de IV (KBr) de BR - 25 96
Figura 63: Espectro de RMN1H (400 MHz) em
C
5
D
5
N
de BR-25 97
Figura 64: Ampliação da região de δ
H
7,8 a 5,2 do espectro de
RMN1H (400 MHz) em
C
5
D
5
N
de BR-25
98
Figura 65: Ampliação da região de δ
H
4,9 a 4,2 do espectro de
RMN1H (400 MHz) em
C
5
D
5
N
de BR-25
99
Figura 66: Ampliação da região de δ
H
4,1 a 3,4 do espectro de
100
ix
RMN1H (400 MHz) em
C
5
D
5
N
de BR-25
Figura 67: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em
C
5
D
5
N
de BR-25 101
Figura 68: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em
C
5
D
5
N
de BR-25
102
Figura 69: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em
C
5
D
5
N
de BR-25
103
Figura 70: Espectro de RMN13C (DEPT135º, 100 MHz) em
C
5
D
5
N
de
BR-25
104
Figura 71: Ampliação do espectro de RMN13C (DEPT135º, 100
MHz) em
C
5
D
5
N
de BR-25
105
Figura 72: Mapa de correlação do espectro de HSQC em
C
5
D
5
N
de
BR-25
106
Figura 73: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC
em
C
5
D
5
N
de BR-25
107
Figura 74: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC
em
C
5
D
5
N
de BR-25
108
Figura 75: Mapa de correlação do espectro de HMBC em
C
5
D
5
N
de
BR-25
109
Figura 76: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em
C
5
D
5
N
de BR-25
110
Figura 77: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em
C
5
D
5
N
de BR-25
111
Figura 78: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC
em
C
5
D
5
N
de BR-25
112
Figura 79: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
do derivado
acetilado BR-25Ac
113
Figura 80: Espectro de RMN
13
C (125 MHz) em CDCl
3
do derivado
acetilado BR-25Ac
114
Figura 81: Espectros de HR-ESI-MS/MS de BR-25 115
Figura 82: Espectro de RMN
1
H (400MHz) de BR-31 120
Figura 83: Ampliação da região δ
H
5,7 a 4,5 do espectro de RMN
1
H
(400MHz) de BR-31
121
Figura 84: Ampliação da região δ
H
4,2 a 2,9 do espectro de RMN
1
H
(400MHz) de BR-31
122
x
Figura 85: Espectro de RMN
13
C (APT, 400MHz) de BR-31 123
Figura 86: Cromatograma da mistura de esteróides BR-31 124
Figura 87: Espectro de massas de β-sitosterol de BR-31
124
Figura 88: Espectro de massas de estigmasterol de BR-31 125
Figura 89: Espectro de massas de campesterol de BR-31 125
Figura 90: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac 130
Figura 91: Ampliação da região δ
H
5,7 a 4,8 do espectro de RMN
1
H
(500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
131
Figura 92: Ampliação da região δ
H
4,3 a 4,0 do espectro de RMN
1
H
(500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
132
Figura 93: Ampliação da região δ
H
2,3 a 2,0 do espectro de RMN
1
H
(500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
133
Figura 94: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-29Ac 134
Figura 95: Mapa de correlação
1
H-
1
H-NOESY em CDCl
3
de BR-
29Ac
135
Figura 96: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-NOESY em
CDCl
3
de BR-29Ac
136
Figura 97: Espectro de RMN
13
C (500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac 137
Figura 98: Ampliação da região δ
C
80,0 a 60,0 do espectro de
RMN
13
C (500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
138
Figura 99: Ampliação da região δ
C
171,0 a 168,0 do espectro de
RMN
13
C (500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
139
Figura 100: Mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de
BR-29Ac
140
Figura 101: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HSQC em CDCl
3
de BR-29Ac
141
Figura 102: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HSQC em CDCl
3
de BR-29Ac
142
Figura 103: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de
BR-29Ac
143
Figura 104: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
144
Figura 105: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
145
xi
Figura 106: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
146
Figura 107: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
147
Figura 108: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
148
Figura 109: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
149
Figura 110: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
150
Figura 111: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
da
substâncias BR-28Ac α e β
153
Figura 112: Ampliação da região de δ
H
5,8 a 3,8 do espectro de
RMN
1
H (500 MHz) de BR-28Ac em CDCl
3
.
154
Figura 113: Ampliação da região de δ
H
5,8 a 3,8 do espectro de
RMN
1
H (500 MHz) de BR-28Ac em CDCl
3
155
Figura 114: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-28Ac 156
Figura 115: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em
CDCl
3
de BR-28Ac
157
Figura 116: Espectro de RMN
13
C (125 MHz) em CDCl
3
de BR-28Ac 158
Figura 117: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º 125 MHz) em CDCl
3
de BR-28Ac
159
Figura 118: Ampliação do espectro de RMN
13
C (DEPT135º, 125
MHz) em CDCl
3
de BR-28Ac
160
Figura 119: Mapas de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-28Ac
161
Figura 120: Mapas de correlação e ampliação do espectro de HMBC
em CDCl
3
de BR-28Ac
162
Figura 121: Ampliação do mapa de correlação do espectro de
HMBC de BR-28Ac
163
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Quantidade dos extratos obtidos
25
Tabela 1.2: Quantidade dos extratos obtidos
25
Tabela 2: Estudo cromatográfico das frações coletadas
26
Tabela 3: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em CDCl
3
e as correlações observadas no espectro de HMQC e
HMBC da substância BR-13, e os dados de
13
C do Mo-1
38
Tabela 4: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em CDCl
3
e as correlações observadas no espectro de HSQC e
HMBC da substância BR-22.
57
Tabela 5: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em
metanol-d
4
,
e as correlações observadas no espectro de
HMQC e HMBC do iridóide BC-4, e comparação com
valores de literatura para os modelos Mo-1 e Mo-2.
71
Tabela 6: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em CDCl
3
,
e as correlações observadas no espectro de HMQC e
HMBC do iridóide BC-8Ac e comparação com valores de
literatura para os modelos Mo-1 e Mo-2
83
Tabela 7: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em
piridina-d
5
,
e as correlações observadas no espectro de
HMQC e HMBC do iridóide BR-25, BR-25Ac (CDCl
3
) e
comparação com valores de literatura para os modelos
Mo-1 e Mo-2
95
Tabela 8. Dados de RMN
13
C (100 MHz) em CDCl
3
para a mistura
de esteróides e comparação com valores de literatura
para os modelos Mo-1 (sitosterol), Mo-2 (estigmasterol) e
Mo-3 (campesterol).
119
Tabela 9: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em CDCl
3
,
e as correlações observadas no espectro de HMQC de
BR-29Ac e comparação com valores de literatura para o
modelo Mo-1
129
Tabela 10: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em
CDCl
3
,
e as correlações observadas no espectro de
HMQC de BR-28Ac e comparação com valores de
152
xiii
literatura para os modelos Mo-1 e Mo-2
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1: Análise Cromatográfica da fração BCM-12 27
Fluxograma 2: Análise da fração BCM-13 28
Fluxograma 3: Fracionamento do extrato BCM 29
Fluxograma 4: Análise do extrato BVR e das frações BVR-2 e BVR-
10
30
Fluxograma 5: Análise da fração BVR-5. 31
Fluxograma 6: Análise da fração BVR-12. 32
Fluxograma 7: Fracionamento do extrato BVR 33
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Interpretação mecanística dos principais fragmentos
no espectro de massas da substância BR-13.
37
Esquema 2: Interpretação mecanística dos principais fragmentos
no espectro de massas da substância BR-22.
57
Esquema 3: Proposta mecanística para MS/MS do pico em m/z
501,15803 ([M+Na]
+
) para o iridóide BR-25.
116
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AcO Acetato
AcOet Acetato de etila
APT Attached Proton Test
CC Cromatografia em Coluna
CCDP Cromatografia em Camada Delgada em escala Preparativa
CGMS Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrômetro de Massas
CH
2
Cl
2
Diclorometano
COSY Correlation Spectroscopy
δ
Deslocamento químico em parte por milhão
d Dupleto
dd Duplo dupleto
DEPT 135 Distortionless Enhancement Polarization Transfer
EM Espectro de Massa
Hex Hexano
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
HR-ESI-MS/MS
High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Hz Hertz
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento medida em Hertz
m Multipleto
MeOH Metanol
MHz Megahertz
MS Mass Spectrometry
m/z Relação massa/carga
NOESY Nuclear Overhauser Effect Correlation Spectroscopy
RMN
1
H Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio
RMN
13
C Ressonância Magnética Nuclear de carbono
RP-18 Reversed phase C18 (octadecilsílica)
s Sinal simples
sl Sinal simples largo
xv
t Tripleto
tl Tripleto largo
t
r
Tempo de retenção
xvi
ABSTRAT
The Rubiaceae family has many important pharmaceutically plants. Borreria
verticillata is a species which occurs throughout the Brazilian territory and is
commonly used in traditional medicine as an antipyretic and analgesic. Previous
phytochemical studies of this species showed the presence of terpenoid indole
alkaloids. In the present study we investigated the iridoids present in a specimen
collected in Campos dos Goytacazes, in the area of the Campus of the
Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro, Brazil. One new
iridoid and two new alkaloids were isolated from an MeOH extract of the roots in
addition to the already known iridoids asperuloside and 6-β
ββ
β-hydroxygeniposíde,
the steroids stigmasterol, β
ββ
β-sitosterol and campesterol, and the units of free
sugar peracetylsucrose e α
α α
α and β
β β
β glucopyranose pentaacetate.
xvii
RESUMO
A familia Rubiaceae tem muitas plantas farmaceuticamente importantes. A
espécie Borreria verticillata pertence a esta família e ocorre em todo território
Brasileiro e é geralmente usada na medicina tradicional como um antipirético e
analgésico. Estudos fitoquimicos anteriores desta espécie mostraram o presença
de alcalóides de indólicos e iridóides. No presente estudo, investigamos os
constituintes químicos presentes em espécimes coletados em Campos dos
Goytacazes, dentro da área do Campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense, Rio de Janeiro, Brasil. Um novo iridóide e dois novos alcalóides
foram isolados do extrato MeOH das raízes e caules em adição aos iridóides já
conhecidos asperulosideo e 6-β
ββ
β-hidroxigeniposídeo, os esteróides
estigmasterol, β
ββ
β-sitosterol e campesterol; e as unidades de açúcar livre
peracetilsucrose e α
α α
α e β
β β
β.glicopiranose peracetilada
1
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento sobre as plantas sempre tem acompanhado a evolução do
homem através dos tempos (CUNHA, 2005). Durante séculos, a população vem
utilizando espécies vegetais para vários fins, tais como, alucinógenos, venenos,
droga, estimulantes, especiarias, perfumes e pigmentos (DI STASI, 1996).
Atualmente a utilização das plantas medicinais vem atingindo um público
cada vez maior, recebendo incentivo da própria Organização Mundial da Saúde,
que recomendou aos países membros o desenvolvimento de pesquisas visando o
uso da flora com propósito terapêutico. O principal fator a contribuir para o
crescimento dessa prática terapêutica consiste no desenvolvimento dos estudos
químicos e farmacológicos, que comprovam a eficácia das plantas medicinais
(CASTRO, 2001).
A Química de Produtos Naturais surgiu no final do século XVIII com a
finalidade de isolar e determinar a estrutura de substâncias ativas isoladas de
plantas, conhecidos como metabólitos especiais (YUNES, 2001). Dessa forma,
alguns potentes fármacos foram descobertos, e muitos deles ainda são usados na
terapêutica atual. Como exemplo, pode-se citar a morfina (1), isolada em 1803 de
Papaver somniferum, planta usada para acalmar a dor viceral, e da Ephedra
sinica foi isolada a efedrina (2) em 1887, que ainda é usada clinicamente como
um potente agente broncodilatador (Figura 1) (YUNES, 2001).
Figura 1: Exemplos de produtos naturais isolados de plantas
.
A Química de Produtos Naturais representa, dentro da área de pesquisa
com plantas medicinais, um ponto de grande importância e valor, na medida em
que somente por meio dos métodos utilizados nessa área pode-se obter tanto o
isolamento e a purificação de novos compostos como a correta determinação
estrutural e posterior síntese total ou parcial. Os avanços nessa área são
(1)
O
H
H
HO
NMe
HO
Me
OH
H
H
NHMe
(2)
2
enormes, especialmente nas ultimas décadas (DI STASI, 1996), com uma
crescente busca por novos constituintes químicos, metabólitos especiais
principalmente, que possam ter alguma atividade biológica de interesse para a
humanidade. Nessa linha, os Químicos de Produtos Naturais, vêm isolando e
identificando várias substâncias naturais, com as mais diversificadas atividades
biológicas (KINGHORN, 1993).
O crescente desenvolvimento de novas técnicas analíticas, como a
cromatografia, e o constante aperfeiçoamento dos instrumentos de análise
espectrométrica têm na química de produtos naturais, ao lado da bioquímica, sua
principal força motora (MATOS, 1997). Além deste aspecto, o estudo químico de
espécies vegetais vem se tornando uma arma importante em um complexo ramo
da botânica, que é a classificação taxonômica (Quimiossistemática) (KINGHORN,
1993).
O isolamento e a identificação de novas moléculas bioproduzidas pelo
metabolismo especial e a avaliação biológica das substâncias têm proporcionado
a descoberta de produtos naturais bioativos, tais como: antibióticos, reguladores
de crescimento vegetal, herbicidas, antivirais, antitumorais, imunoestimulantes,
antimaláricos, amebicidas, inseticidas, moluscicidas, citotóxicos, etc. (DEWICK,
2001).
Calcula-se que o número de espécies vegetais presentes no planeta esteja
compreendido entre 250.000 a 500.000, sendo que menos de 5% foram
explorados quanto ao aspecto fitoquímico e, menor é a percentagem das que
foram avaliadas quanto à atividade biológica. A grande maioria das espécies
vegetais utilizadas na medicina popular, não tem sua eficácia e toxidade
esclarecidas (FERREIRA, 1998). A composição química das espécies vegetais,
especialmente das plantas encontradas nas florestas tropicais, ainda está longe
de ser descrita em sua totalidade. Um enorme arsenal de constituintes naturais
ainda não foi isolado e estudado do ponto de vista químico (VIEIRA, 1999a).
O Brasil é o país com maior número de espécies no mundo. Estima-se
possuir em torno de 120.000 espécies de plantas superiores (FERREIRA, 1998).
Quanto maior o número de espécies, maior o potencial de novos medicamentos
(DI STASI, 1996). Embora a flora brasileira constitua uma das principais fontes de
recursos naturais, os estudos sobre a química de metabólitos especiais das
espécies que a compõem, ainda são insuficientes (VIEIRA, 1999a).
3
Nos últimos anos, a preocupação com a manutenção da biodiversidade no
planeta levou as autoridades governamentais a voltar sua atenção para a
manutenção dos refúgios naturais que se encontram ameaçados. Atenção
especial tem sido destinada às áreas naturais em perigo de extinção em
decorrência da ação antrópica. Entre elas a Mata Atlântica, merece destaque,
reconhecida no cenário mundial como uma das principais fontes de diversidade
genética a ser protegida e cujos recursos devem ser investigados, procurando-se
como meta o equilíbrio entre a proteção à natureza e o desenvolvimento. A flora
brasileira deve ser considerada não apenas como matéria-prima, fonte para a
descoberta de novas substâncias, mas também como um recurso natural a ser
preservado (VIEIRA, 1999a).
A família Rubiaceae é uma das maiores famílias dentre as Angiospermas e
compreende cerca de 600 gêneros e mais de 10000 espécies de hábitos
essencialmente tropicais. No Brasil, as espécies de Rubiaceae são amplamente
distribuídas nos mais variados ecossistemas, sendo encontrada na Floresta
Amazônica, Floresta Atlântica e Cerrado. Isso confere as espécies grande
variedade de formas e estruturas (BOLZANI et al., 2001).
Com relação aos constituintes químicos, a família Rubiaceae apresenta
grande diversidade de metabólitos especiais, tais como: iridóides, alcalóides
indólicos, antraquinonas, flavonóides e outros derivados fenólicos e terpenóides
(BOLZANI et al., 2001). Contribuindo com a bioprodução de metabólitos especiais
com um grande potencial farmacológico (HEITZMAN, 2005).
Considerando a importância biológica dos metabólitos especiais isolados
de espécies da família Rubiaceae, propôs-se neste trabalho, realizar um estudo
dos constituintes químicos da espécie vegetal Borreria verticillata.
4
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo:
• Isolar e identificar estruturalmente os constituintes químicos do
caule, folhas, flores e raízes da espécie Borreria verticillata;
• Realizar testes biológicos com as substâncias isoladas e/ou extratos
brutos em colaboração com outros grupos de pesquisa, devido ao
grande potencial biológico que a família Rubiaceae apresenta.
5
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Família Rubiaceae
A família Rubiaceae inclui aproximadamente 637 gêneros e cerca de
10.700 espécies, classificadas em quatro subfamílias (Cinchonoideae, Ixoroideae,
Antirheoideae e Rubioideae) e 44 tribos (ROBBRECHT, 1988 apud
PEREIRA,
2004).
Ocupa o quarto lugar em diversidade entre as Angiospermas, perdendo
apenas para as Asteraceae, Orchidaceae e Fabaceae. Diversos gêneros são
endêmicos da região neotropical, que apresenta cerca de 4.555 espécies
(ANDERSSON, 1992 apud
PEREIRA, 2004). Psychotria L. é o maior gênero da
família, representado mundialmente por cerca de 1.650 espécies (HAMILTON,
1989 apud
PEREIRA, 2004).
No Brasil ainda são poucos os tratamentos taxonômicos para a família
Rubiaceae, sendo os mais completos aqueles elaborados para a Flora
Brasiliensis
(PEREIRA, 2004), idealizado e coordenado pelo botânico alemão Karl
Friederich Philipp von Martius, sendo o maior projeto florístico realizado no seu
tempo, entre os anos de 1840 e 1906.
O estudo das Rubiaceae nesta obra foi elaborado por Karl Moritz
Schumann e Johann Mueller Argovensis, ficando cada um deles responsável por
uma parte da abordagem taxonômica desta família. No estudo das Rubiaceae,
são tratados 99 gêneros e 1043 espécies (CHIQUIERI, 2004). Estudos mais
recentes estimam cerca de 96 gêneros (BARROSO et al. 1986 apud
PEREIRA,
2004); para região Nordeste, Barbosa et.al. (1996) compilaram 66 gêneros e 277
espécies (apud
PEREIRA, 2004).
A Figura 2 mostra a grande diversidade de classes de metabólitos
secundários como iridóides, alcalóides indólicos, antraquinonas, flavonóides e
outros derivados fenólicos e terpenóides (triterpenos, diterpenos) presentes na
família Rubiaceae.
.
6
Figura 2: Diversidade química e distribuição dos principais constituintes nas quatro
subfamílias: Ixoroideae (IXO), Cinchonoideae (CIN), Rubioideae (RUB) e Antirheoideae
(ANT) pertencentes à família Rubiaceae (BOLZANI et al., 2001).
Considerando-se o perfil químico desta família, existem muitas espécies
sem qualquer estudo, o que não permite os taxonomistas de realizar as divisões
na família e subfamília, através da quimiotaxonomia, destas espécies (BOLZANI
et al., 2001).
Na subfamília Ixoroideae, os iridóides são encontrados como marcadores
quimiotaxonômicos exclusivos, enquanto em Cinchonoideae os alcalóides
indólicos predominam e, em Rubioideae, as antraquinomas estão presentes como
a principal classe de metabólitos secundários. Já na subfamília Antirrheoideae
não há a ocorrência de nenhum destes marcadores químicos. (BOLZANI et al.,
2001).
As plantas dessa família podem ser de porte arbóreo, arbusto, subarbusto
ou ervas perenes ou anuais, menos freqüentemente lianas. Apresentam folhas
simples, opostas ou verticiladas, com estípulas interpecioladas (WATSON, 1992).
Entre suas espécies, encontra-se o café (Coffea arabica), uma das bebidas
mais usadas no mundo (WATSON, 1992). Esta espécie de Rubiaceae tem grande
importância pela manufatura de uma bebida estimulante e alimentícia e para a
extração de cafeína. A cafeína entra na composição de diversos analgésicos,
antipiréticos e antigripais, associada com ácido acetilsalicílico, paracetamol e a
codeína no alívio ou abortamento de crises de enxaqueca. Além disso, a cafeína
isoladamente tem sido utilizada como sonolítico, tônica e revigorante (SIMÕES,
1999);
O uso de espécies de Rubiaceae para o tratamento do reumatismo é muito
comum. Um exemplo é a Paederia foetida L. (“prasarini”) que é utilizada no
7
tratamento desta doença por possuir propriedades analgésicas e antiinflamatórias
contra a artrite (SUBRATA, RAVISHANKAR & BHAVSAR, 1994).
A Cephaelis ipecacuanha (Rich.) conhecida como “ipeca” e “ipecacuanha”,
dentre outras denominações populares, é endêmica na floresta tropical (MORS,
2000; apud LORENZI, 2002). Esta espécie é produtora de alcalóides como a
emetina, muito utilizados como emético, expectorante e também no tratamento da
amebíase (TOKARNIA et al., 2000). A emetina e seus análogos ocorrem somente
em três famílias vegetais, incluindo Rubiaceae (WOLFGANG, 1984).
Uma Rubiaceae muito conhecida é o “genipapo”, Genipa americana, que
além do seu uso alimentício possui muitas atividades biológicas. As raízes
possuem ação purgativa e o decocto das folhas e cascas é utilizado como
catártico. Seu uso também é conhecido junto a tribos indígenas para a
pigmentação da pele nos rituais religiosos e bélicos. Este uso provém da
propriedade do suco dos frutos, escurecer quando exposto à luz ultravioleta. A
genipicina, um iridóide extraído dos frutos de “genipapo” foi isolado por Djerassi,
Gray & Kincl em 1960. A atividade destas substâncias foi avaliada contra cepas
bacterianas onde foi observado efeito inibitório do crescimento de
microorganismos Gram positivos e negativos in vitro (TALLENT, 1964).
Outra espécie de Rubiaceae que tem sido testada no tratamento de
enfermidades tropicais, como a malária, é a Gardenia saxatilis Geddes. O uso dos
seus brotos como analgésico é bastante difundido na medicina popular. Os
triterpenos isolados destes brotos mostraram ter atividade contra o Plasmodium
falciparium, responsável pela etiologia da malária (SUKSAMRARN et al., 2003).
Apesar de Rubiaceae não ser uma família notadamente tóxica, algumas
espécies apresentam toxidez cientificamente reconhecida como, por exemplo,
espécies dos gêneros Palicourea, Pachystigma, Pavetta e Fadogia. Algumas
espécies desses gêneros causam lesões cardíacas graves em bovinos após a
ingestão das folhas. (OLIVEIRA, 1996). No Brasil, a Palicourea marcgravii St. Hil.,
conhecida como “erva-de-rato”, é uma das plantas tóxicas mais importantes do
Brasil, devido à sua extensa distribuição, boa palatabilidade, alta toxidez e efeito
cumulativo. Ela é responsável por 80% de todas as mortes em bovinos causadas
por plantas tóxicas (TOKARNIA et al., 2000).
Outra espécie da família Rubiaceae envolvida em casos de intoxicação é a
Cephaelis ipecacuanha Rich. Apesar de ser muito usada pelas propriedades
8
eméticas e anti-helmínticas que possui, é também capaz de produzir irritação
cutânea e nas mucosas. O contato da planta com a pele determina lesões
irritativas com eritema, bolhas e vesículas; contato com os olhos ou exposição em
ambientes contaminados pode ocasionar conjuntivites intensas ou um quadro
asmatiforme com dispnéia, sibilos e cianose. A ingestão de doses excessivas de
emetina provoca, inicialmente, irritação da mucosa digestiva, náuseas, vômitos,
cólicas abdominais, diarréia e, posteriormente, depressão do sistema nervoso
central, hipotensão, choque e óbito (TOKARNIA et al., 2000).
Uma Rubiaceae que tem despertado interesse por suas propriedades
alucinógenas é a Psychotria viridis, planta muito utilizada em associação com
partes de Banisteriopsis caapi (Malpighiaceae) para o preparo de uma bebida
psicoativa potente, utilizada em rituais espirituais e medicinais. No Brasil, estas
duas plantas fazem parte do ritual realizado pela comunidade do Santo Daime no
norte do país (CALLAWAY et al.,1996). O efeito alucinógeno da bebida é devido à
presença do alcalóide N,N-dimetiltriptamina (DMT), encontrado nas folhas da
Psychotria viridis (DEULOFEU, 1967).
Além disso, a familia apresenta espécies ornamentais (Ixora, Gardenia,
Pentas, Mussaendas); e espécies invasoras (Poaia, mata-pasto) (WATSON,
1992);
A família é caracterizada pela produção de metabólitos especiais com um
grande potencial farmacológico, dentre os quais se pode citar: antiinflamatório,
tóxico, antiviral, propriedades antioxidantes, efeitos em doenças vasculares e do
sistema nervoso central, mutagenicidade, atividade antibacterial (HEITZMAN,
2005) e atividade analgésica (TAKAYAMA, 2004).
9
3.2 O Gênero Borreria
O gênero Borreria (Rubiaceae - Rubioideae - Spermacoceae) possui cerca
de 100 espécies (CABRAL, 1991 apud DE TONI, 2004), distribuídas em regiões
tropicais e subtropicais da América, África, Ásia e Austrália. No Brasil apresenta
maior diversidade no planalto brasileiro (STEYERMARK, 1972 apud DE TONI,
2004).
Entre os membros deste gênero, a espécie B. articularis é usada para tratar
dor de cabeça, e como emplastro no abdômen para curar dor de estômago de
crianças pequenas na China. A espécie B. osimoides é usada na cura de feridas
na Indonésia (KAMIYA, 2002).
Estudos químicos de plantas deste gênero Borreria revelaram a presença
de alcalóides indólicos. Como os alcalóides: borrelina (3), borrecapina (4),
dehidroborrecapina (5) e borrecoxina (6) encontrados na espécie Borreria capitata
(Figura 3) (JOSSANG, 1981).
N
N
O
H
N
N
O
O
H
N
N
O
H
N
HN
O
H
(3)
(4)
(5)
(6)
Figura 3: Alcalóides indólicos de Borreria capitata
A presença de iridóides é também muito comum na família, onde se pode
citar o asperulosideo (7)
(Figura 4), um iridóide bastante comum dentro da
família, e que tem utilidade taxonômica considerável para a classificação das
subfamílias.
10
(7)
O
O
CH
2
H
H
O
C
Glc(H)
4
Ac
O
Figura 4: Iridóide asperulosídeo
O gênero Borreria pertence à tribo Spermacoceae, subfamília Rubioideae.
Nesta subfamília o asperulosideo (7) foi encontrado em quase todas as espécies
investigadas, em contraste com as outras subfamílias nas quais este iridóide não
foi encontrado (INOUYE, 1988).
Da espécie Borreria latifolia foram isolados das partes aéreas, os iridóides:
dafilosídeo (8), metildesacetilasperulosidato (9), ácido asperulosídico (10), ácido
desacetilasperulosídico (11), scandosídeo (12), 6-O-acetilscandosídeo (13) e 10-
hidrologanina (14) (Figura 5) (KAMIYA, 2002).
O
OH
CH
2
H
H
O
CO
2
CH
3
Glc
OAc
O
OH
CH
2
H
H
O
CO
2
CH
3
Glc
OH
O
OH
CH
2
H
H
O
CO
2
H
Glc
OAc
(8)
(9)
(10)
O
OH
CH
2
H
H
O
CO
2
H
Glc
OH
O
OH
CH
2
H
H
O
CO
2
H
Glc
OH
O
OAc
CH
2
H
H
O
CO
2
H
Glc
OH
O
CH
2
H
H
O
CO
2
CH
3
Glc
OH
HO
(11)
(12)
(13) (14)
Figura 5: Iridoides de Borreria latifólia.
Alguns terpenóides também são relatados das partes aéreas de B. latifolia:
o diterpeno fitol (15) (KAMIYA, 2002); da espécie B. articularis: eritrodiol (16),
11
ácido olean-12-en-3β-ol-29-óico (17), ácido 3-ceto-olean-12-en-29-óico (18),
olean-12-en-3β-ol-29-metil carboxilato(19) (MUKHERJEE, 1993); da espécie B.
difusa: ácido oleanólico (20), ácido ursólico (21) (LIMA, 2008) que também foi
relatado na espécie B. stricta, que junto com a espécie B. articularis apresentou o
esteróide β-sitosterol (22) (Figura 6) (BHADORIA, 1981;
MUKHERJEE, 1993).
(18)
(21)
CH
2
OH
HO
OH
CO
2
H
HO
(15)
(16)
O
CO
2
H
(17)
(19)
CO
2
CH
3
HO
(20)
HO
CO OH
HO
COOH
(22)
HO
H
H
H
Figura 6: Terpenóides do Gênero Borreria
Da espécie B. stricta, ainda são relatados os flavonóides: astragalin (23),
quercetina (24) e rutina (25) (Figura 7) (BHADORIA, 1981).
O
OH O
O
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH OH
O
O
OH
OH
OH
(25)
O
OH O
OH
HO
OH
OH
(24)
O
O
OOH
HO
OH
HO
OH
OH
OH
(23)
Figura 7: Flavonóides de Borreria stricta.
12
3.3 Borreria verticillata
A espécie Borreria verticillata é conhecida vulgarmente como: vassourinha,
vassourinha de botão, cordão de frade, poaia, poaia-rosário, erva-botão (Figura
8). É uma herbácea perene, ereta, ramificada de base lenhosa, de hastes
subangulosas, esparsamente pubescentes, de 30 a 60 cm de altura, nativa do
continente Americano (MAYNART, 1980).
Figura 8: Borreria verticillata
Essa espécie ocorre em todo território do Brasil, e é geralmente usada na
medicina tradicional como um antipirético e analgésico.
O chá das raízes é usado
no tratamento de leucorreas e blenorreas (PEIXOTO NETO, 2002).
A literatura etnofarmacológica cita o uso de suas raízes como vomitivo e
diurético na forma de infusão que é empregada, também, como medicação
caseira contra diarréia infantil (MORS, 2000; VIEIRA, 1992 apud LORENZI, 2002).
O extrato metanólico das raízes de B. verticillata mostrou grande atividade
13
antibacterial contra seis diferentes cepas de Pseudomonas aeruginosa,
mostrando atividade até mesmo contra tipos resistentes a quinolonas e
cefalosporinas de última geração (PEIXOTO NETO, 2002). Na medicina
tradicional do oeste da África, extratos de partes aéreas são aplicados
externamente para tratar doenças de pele (BALDÉ, 1991).
Estudos fitoquímicos anteriores desta espécie mostraram a presença de
alcalóides indólicos (VIEIRA, 1999b). Na sua composição química destaca-se a
presença dos alcalóides borrerina (26) e borreverina
(27), spermacoceina (28) e
isoborreverina (29) (Figura 9) (FERREIRA, 1978;
BALDÉ, 1991).
(28)
N
H
OH
NH
H
H
N Me
H
(29)
N
H
NH
N
H
H
N
H
Me
Me
H
Figura 9: Alcalóides de Borreria verticillta
Foram isolados também isolados desta espécie, os iridóides dafilosideo (8),
asperulosideo (7), borreriagenina (30), feretosideo (31),
metildesacetilasperulosidato (9), desacetilasperulosideo (32), ácido asperulosidico
(10), ácido desacetilasperulosidico (11), pentaacetildafilosideo (33),
tetraacetilasperulosideo (34) e hexaacetilferetosideo (35) (Figura 10) (POUSSET,
1973; POUSSET, 1977; SAINTY, 1981 apud LORENZI, 2002, MAYNART, 1980).
N
N
CH
3
CH
3
CH
3
H
N
CH
3
CH
3
N
CH
3
H
H
CH
3
H
N
N
CH
3
H
H
(27)
(26)
14
Figura 10: Iridóides de Borreria verticillata: asperulosideo (7), dafilosideo (8),
borreriagenina (30), feretosideo (31), metildesacetilasperulosidato (9),
desacetilasperulosideo (32), ácido asperulosidico (10), ácido desacetilasperulosidico (11),
pentaacetildafilosideo (33), tetraacetilasperulosideo (34) e hexaacetilferetosideo (35).
O
O
HO
OH
H
OH
H
1
3
4
5
6
7
8
9
10
(30)
7
O
OR'
CH
2
H
H
O
CO
2
CH
3
Glc(R)
4
OR''
1
3
4
5
6
8
9
10
11
O
O
CH
2
H
H
O
C
Glc(R)
4
OR'
O
(8) H H Ac
(9) H H H
(33) Ac Ac Ac
R R' R''
(7) H Ac
(32) H H
(34) Ac Ac
R R'
O
OR
CH
2
H
H
O
CO
2
CH
3
Glc(R)
4
OR
O
OH
CH
2
H
H
O
CO
2
H
Glc
OR
(31) H
(35) Ac
R
(10) Ac
(11) H
R
15
3.4 Iridóides
Iridóides são produtos do metabolismo secundário de alguns grupos
vegetais e suas agliconas monoterpênicas são invariavelmente oxigenadas, com
uma característica fusão do anel ciclopentapirano (COSSY,1989;HARBORNE,
1998 apud SENA FILHO, 2007) também conhecido como esqueleto iridano
(Figura 11) onde uma clivagem oxidativa da ligação 7,8 do anel ciclopentano
fornece os chamados secoiridóides (SAMPAIO-SANTOS, 2001).
Eles derivam formalmente do iridoidial, substância que ao lado da
iridomirmecina (Figura 11) foram descritos pela primeira vez no final do século
XIX na secreção de defesa da formiga australiana Iridomirmex detectus (EL –
NAGGAR, 1980 apud SENA FILHO, 2007).
iridomirmecina
O
H
H
O
O
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
iridano
Figura 11: Esqueleto iridano
Originalmente este grupo de substâncias era chamado de pseudoindican,
uma alusão ao glicosideo precursor do índigo e existente em alguns
representantes de Indigofera (Fabaceae) (EL – NAGGAR, 1980; HEGNAUER,
1973 apud SENA FILHO, 2007). De fato, alguns compostos não glicosilados
adquirem cor azul depois de hidrólise e oxidação ao ar, como o índigo (CUNHA,
2005).
O grupo é biossinteticamente homogêneo, e é representado, exceto por
umas poucas estruturas específicas de insetos, em famílias de Angiospermas
Dicotiledôneas (BRUNETON, 1993). Em quimiossistemática, os iridóides
representam um marcador importante em classificação vegetal, filogenia e
evolução. Têm sido usados como marcadores quimiotaxonômicos para as
superordens Corniflorae, Gentianiflorae, Loasiflorae e Lamiiflorae (SAMPAIO-
SANTOS, 2001).
16
Os iridóides geralmente possuem dez átomos de carbono. Quando possui
um décimo primeiro carbono, este é geralmente parte de um grupo éster
(loganina, geniposideo Figura 12), ou parte de um grupo ácido carboxílico
(monotropeina Figura 12); Em certo número de casos, o C-11 está ausente
(aucubina, catalpol Figura12). Excepcionalmente o anel pirano é aberto
(nepetariasideo Figura 12) (BRUNETON, 1993). Existem também vários tipos de
aglicona tipo secoiridoide (7-metil éster secologanisideo Figura 12) (DINDA,
2007).
O
OGlic
CO
2
HMeO
2
C
H
H
7-metil ester secologanosideo
catalpol
verbenalina
monotropeina
neptariasídeo
aucubina
lamiosideo
geniposideo
loganina
O
CO
2
CH
3
H
H
HO
O Glc
O
HO
O
OH
H
H
O Glc
O
CO
2
H
H
O
OH
HO
Glc
CO
2
H
H
H
O Glc
O
H
H
HO
HO
O Glc
O
CO
2
CH
3
O
H
H
O Glc
O
H
O
OH
HO
AcO
Glc
O
CO
2
CH
3
H
H
HO
O Glc
Figura 12: Alguns exemplos de iridóides
O número e a natureza dos iridóides encontrados no Reino Vegetal são
indicativos da complexidade das vias envolvidas na sua biossíntese (SAMPAIO-
SANTOS, 2001). A incorporação do ácido mevalônico, bem como derivados
geraniol, em estruturas tipo iridóide, e em alcalóides indólicos, demonstram o
caráter terpenóico desses metabólitos. Vários mecanismos têm sido propostos,
tais como o demonstrado na Figura 13, envolvendo a ciclização do 10-oxo-
17
geranial a iridodial. A glicosilação e oxidação do iridodial levam a loganina, o
precursor imediato da maioria dos iridóides. Alguns processos aplicam o 8-epi-
iridoidial levando ao antirrinosideo, bem como a aucubina e o gardenosideo. A
loganina é o intermediário que sofre abertura do anel, reação que leva ao
secoiridoide (BRUNETON,1993).
O
H
MeO
2
C
H
OGlc
HO
O
H
MeO
2
C
H
OGlc
HO
OH
H
2
O
O
CHO
H
MeO
2
C
H
OGlc
secologanina
hidroxilação
oxidação
H
O
CHO
H
NADPH
H
artirrinosideo
OPP
GPP
OH
geraniol
O
OGlc
HO
H
HO
O
DMAPP
IPP
OPP
OPP
OPP
H
H
10-oxogeranial
H
HN
CHO
Enz
H
H
HN
CHO
Enz
CHO
CHO
H
8-epi-iridodial
O
OGlc
H
H
MeO
2
C
OH
HO
gardenosideo
CHO
CHO
H
iridodial
CHO
CHO
H
OHC
O
iridotrial
O
H
HOC
H
OH
formação de
hemiacetal
O
H
MeO
2
C
H
OGlc
deoxiloganina
oxidação do aldeído à ácido
glicosilção
esterificação
O
O
H
MeO
2
C
H
OGlc
HO
loganina
O
2
NADPH
O
H
MeO
2
C
H
OGlc
HO
H
EnzFe
O
O
H
MeO
2
C
H
OGlc
HO
H
H
EnzFe
OH
alcalóides
indólicos
monoterpênicos
Figura 13: Biossíntese simplificada dos iridóides
18
De um modo geral os iridóides são substâncias de sabor extremamente
amargo, sendo os de natureza glicosídica solúveis em água e em solventes
polares, enquanto que os não glicosídicos são solúveis nos solventes apolares.
Contudo, os glicosídicos são muito instáveis, o que explica o rápido
escurecimento que muitos vegetais com iridóides apresentam, após a colheita.
Isto, porque a hidrólise se faz com muita facilidade, oxidando-se as geninas
rapidamente, e provocando o enegrecimento (CUNHA, 2005).
Por serem amargos ou venenosos, desempenham no vegetal um papel de
proteção contra predadores, principalmente herbívoros. Algumas aplicabilidades
foram descobertas com iridóides como, por exemplo: a nepetalactona (Figura 11)
nos Estados Unidos encontrou aplicações, no desenvolvimento de brinquedos
para gatos domésticos (Felix catus); e incorporada à isca para a caça ao puma
(Felix concolor) (HEGNAUER,KOOIMAN,1978 apud SENA FILHO, 2007).
3.5 Alcalóides
Alcalóides são substâncias nitrogenadas (SIMÕES, 1999), de caráter
básico que ocorrem, sobretudo no reino vegetal (DI STASI, 1996). O caráter
básico originou a designação de alcalóides dada no início do século XIX por W.
Meissner, termo que derivou da palavra árabe al kaly (álcalis, básico) e da palavra
grega eidos, aspecto (CUNHA, 2005).
São encontrados em cerca de 4.000 espécies de plantas, sendo mais
freqüentes em dicotiledôneas. Atualmente, a função natural de muitos metabólitos
especiais tem sido reavaliada, reconhecendo-se que estes são, de fato,
essenciais para a existência dos vegetais. Tem sido observado que, muitas
plantas que produzem alcalóides são evitadas por animais ou insetos em sua
dieta, isto certamente devido à sua toxicidade ou ao fato de a maioria dos
alcalóides terem gosto amargo (SIMÕES, 1999).
A maioria dos alcalóides tem atividade biológica de algum tipo, e muitos
têm sido empregados por suas propriedades farmacológicas. Para citar alguns
exemplos: os alcalóides vincristina (37) e vinblastina (38) (Figura 14) produzidos
pela vinca (Catharanthus roseus) possuem acentuada ação antitumoral. A quinina
(39) encontrada em espécies de plantas do gênero Cinchona, é muito empregada
no tratamento da malária (CASTRO, 2001).
19
Figura 14: Alcalóides com atividade biológica
A família Rubiaceae é conhecida produtora deste tipo de metabólito
especial e suas propriedades analgésicas e antiinflamatórias já foram estudadas
em algumas espécies. Diversas plantas, pertencentes ao gênero Psychotria, são
usadas na medicina popular pelas suas ações analgésicas baseadas nas
propriedades que os alcalóides presentes possuem (ELISABETSKY,1995).
Na espécie Borreria verticillata, o alcalóide Borreverina (27) (Figura 9)
apresentou ação antimicrobial in vitro. A concentração inibitória mínima é menor
que 50 µg/mL para coccus Gram positivo, (especialmente Staphylococcus aureus)
e que 6 µg/mL para Vibrio cholerae, e superior que 200 µg/mL para vários bacilos
e bactérias Gram negativas (Enterobacteria e Pseudomonas) (MAYNART, 1980).
Os alcalóides originam-se de aminoácidos. Entretanto, para a formação do
esqueleto final de um alcalóide, contribuem outros precursores, tais como
terpenos ou esteróides. Costumam ser classificados de acordo com os sistemas
de anéis que constituem a principal parte de suas estruturas, os quais, por sua
vez, podem ser classificados de acordo com aminoácido precursor (SIMÕES,
1999).
3.5.1 Alcalóides Indólicos
Os Alcalóides indólicos têm origem no aminoácido L-triptofano (Figura15)
(SIMÕES, 1999). Os alcalóides indólicos, em especial os monoterpênicos, são
encontrados em três famílias Rubiaceae, Loganiaceae e Apocynaceae
(SCHRIPSEMA, 2000).
H
N
MeO
2
C
N
OH
H
MeO
N
H
R
N
H
OAc
OH
CO
2
Me
R= Me, vimblastina (37)
R= CHO, vincristina (
38
)
N
N
MeO
H
HO
H
H
(39)
20
Os alcalóides indólicos, que junto com as antraquinonas e iridóides são
considerados marcadores quimiotaxonômicos da família, pertencem ao grupo de
metabólitos especiais mais estudados, na tentativa de comprovar a correlação
filogenética entre a química e a taxonomia de Rubiaceae. Evidências baseadas
no esqueleto dos alcalóides indólicos servem como base para tendências
químicas e morfológicas da ligação evolucionária entre Rubiaceae, Apocynaceae
e Loganiaceae (BOLZANI, 2001).
Os alcalóides com estrutura indólica estão muito representados na
natureza, de tal modo que se conhecem cerca de 2000. Contudo, uma vez que ao
núcleo indólico (Figura 15), na maioria dos alcalóides, estão associados outros
tipos de ciclos, para ser feito um estudo exaustivo destes alcalóides têm sido
propostas inúmeras classificações que se baseiam não só na sua origem
biossintética como no seu tipo estrutural (CUNHA, 2005).
Em uma classificação simplificada podem-se dividir os alcalóides indólicos
em dois grandes grupos: o grupo dos indólicos monoterpênicos, e o grupo dos
indólicos não monoterpênicos, ambos derivados do triptofano. (CUNHA, 2005).
Os alcalóides indólicos monoterpênicos têm como precursor o triptofano. O
L-triptofano é descarboxilado pela enzima triptofano-descarboxilase (TDC) para
formar a triptamina, que dá origem ao sistema indólico Esses alcalóides são
formados pela condensação da triptamina com a secologanina, essa
condensação é catalisada pela enzima estrictosidina sintase formando a
estrictosidina, que é o esqueleto básico dos alcalóides indólicos monoterpênicos
(Figura 15).
N
NH
2
H
CO
2
H
H
N
H
NH
2
TDC
L-Triptofano Triptamina
Triptamina
+
CHO
O
OGlu
MeO
2
C
H
H
Secologanina
O
OGlu
H
H
MeCO
O
N
H
NH
2
N
H
NH
H
Estrictosidina
Figura 15: Formação da estrictosidina a partir da triptamina e secologanina pela
estrictosidina sintase.
21
Quanto aos alcalóides indólicos não monoterpênicos, poderão ser
agrupados do seguinte modo:
- Alcalóides indólicos tipo β-carbolínicos;
- Alcalóides indólicos simples, obtidos por desaminação,
descarboxilação, metilação e/ou hidroxilação do triptofano;
- Alcalóides indólicos derivados de um núcleo tetracíclico
octa-hidroindolquinoleico (CUNHA, 2005).
22
4. METODOLOGIA
O estudo químico da espécie vegetal consistiu das seguintes etapas
descritas a seguir:
4.1 Coleta do material vegetal e classificação botânica
Os critérios adotados para a escolha da planta Borreria verticillata foram
baseados na posição taxonômica, onde espécies do gênero Borreria como
descrito na literatura, são ricas em alcalóides e iridóides, substâncias estas, com
uma grande gama de atividades biológicas já comprovadas experimentalmente.
O material vegetal (folhas, flores, caules e raízes) coletado no campus da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro no período de agosto
de 2006. Posteriormente, uma nova coleta foi realizada em novembro de 2007.
4.2 A secagem e moagem do material.
A secagem do material botânico feita ao ar livre, e o material após seco foi
triturado usando-se moinho de martelos.
4.3 A extração dos constituintes químicos do material botânico.
A extração dos componentes fixos feita a frio (maceração) usando-se em
ordem crescente de polaridade os solventes orgânicos hexano e metanol. As
soluções obtidas foram destiladas a pressão reduzida em evaporador rotativo,
fornecendo os extratos brutos.
4.4 Identificação das substâncias isoladas
Foram utilizados métodos espectrométricos, tais como, espectrometria no
infravermelho (IV), de ressonância magnética nuclear (RMN
1
H e
13
C), e de
massas (EM); e métodos cromatográficos clássicos como, cromatografia em
coluna e em camada delgada (BREITMAIER, 1987; FRIEBOLIN, 1993;
GOTTLIEB, 1967; LAMBERT, 1987; NAKANISHI, 1990; PIHLAJA, 1994;
SANDERS, 1993; SIZDAK, 1996).
23
4.5 Análises cromatográficas
As análises de cromatografia em coluna foram realizadas utilizando-se gel
de sílica, da marca Merck, Darmstadt 60 (0,063–0,200 mm), Sephadex LH 20
e
RP18.
As análises de cromatografia em camada delgada analítica foram
realizadas em cromatofolhas de alumínio com gel de sílica 60 F
254
Merck. As
substâncias foram visualizadas por irradiação com lâmpada ultravioleta (Aldrich) a
254 nm e 365 nm e/ou pulverizadas com o seguinte reagente cromogênicos
H
2
SO
4
conc./ Vanilina, seguido de aquecimento, e Dragendorff (solução de nitrato
de bismuto básico II em ácido acético diluído com iodeto de potássio).
As análises em cromatografia em camada delgada, em escala preparativa
foram realizadas utilizando-se placas de vidro 20 x 20 cm, com gel de sílica 60
GF254. Para obtenção dessas placas, diluiu-se 20 g de gel de sílica em 70 ml de
água destilada, em seguida, distribuiu-se manualmente essa solução sobre as
placas de vidro.
4.6 Análises espectroscópicas
As análises espectrométricas foram realizadas em aparelhos dos
Laboratórios de Ciências Químicas da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, FIOCRUZ , QEFPN - Universidade Federal do Ceará,
DEQUIM – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e Laboratório Thomson
de Espectrometria de Massas – UNICAMP.
Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H) e
carbono-13 (RMN
13
C) foram obtidos em espectrômetros Jeol (400 MHz para
1
H e
100 MHz para
13
C), e Bruker (DPX 300 e DRX 500).
Os espectros de massas (EM) foram obtidos em aparelhos - CG/MS–QP–
5050 A SHIMADZU, utilizando impacto de elétrons; e Waters Micromass Q-TOF.
Os espectros infravermelhos (IV) foram obtidos em um aparelho FTIR -
8300 SHIMADZU, utilizando pastilha de KBr.
4.7 Ensaio de toxicidade frente à Artemia salina (TAS)
O ensaio de toxicidade frente à Artemia salina (TAS) foi executado de
acordo com a metodologia proposta por McLaughlin. Diluições das amostras e do
24
controle positivo foram feitas pelo método de diluições aritméticas em solução
aquosa de sal marinho artificial com 1% DMSO (v/v) (McLaughlin, 1991).
Para a realização dos bioensaios, os ovos de A. salina (20 mg) foram
incubados sob iluminação artificial por 48 horas para que houvesse a eclosão das
larvas (metanáuplios), foram separadas as larvas recém-eclodidas e distribuídas
15 larvas por tubo de ensaio, sendo cada tubo com 5mL de solução nas seguintes
concentrações: 500, 200, 100, 50 µg/mL a partir de 50 mg dos extratos
metanólicos da raiz e caule da espécie Borreria verticillata, sendo realizado para
cada tratamento quatro repetições. Um grupo controle também foi preparado nas
mesmas condições sem a presença dos extratos.
O conjunto permaneceu em incubação sob luz artificial por 24 h e então foi
realizada a contagem do número de larvas vivas e mortas para determinação da
CL
50
. Utilizou-se o método Probits de análise através do software BIOSTAT®
2007, com 95% de confiança para obtenção das CL
50
e respectivos intervalos de
confiança. Os extratos são considerados ativos quando TAS <1000ppm
(McLaughlin, 1991).
25
5. PARTE EXPERIMENTAL
5.1 A extração dos constituintes químicos do material botânico (1ª coleta).
A extração dos componentes fixos foi feita a frio (maceração) usando-se
em ordem crescente de polaridade os solventes orgânicos hexano e metanol. As
soluções obtidas foram destiladas a pressão reduzida em evaporador rotativo,
fornecendo os extratos brutos (Tabela 1).
Tabela 1: Quantidade dos extratos obtidos
Espécie
Botânica
Parte Botânica Peso do
material (g)
Solventes Peso dos
extratos (g)
Borreria
verticillata
Folhas 355,7 Hexano
Metanol
5,7351
35,2634
Flores 170,8 Hexano
Metanol
1,7681
12,0871
Caules 609,6 Hexano
Metanol
2,7463
45,6500
Raízes 552,1 Hexano
Metanol
1,8456
6,4079
5.1.2 A extração dos constituintes químicos do material botânico (2ª coleta).
A extração dos componentes fixos foi feita a frio (maceração) usando-se o
solvente orgânico metanol. As soluções obtidas foram destiladas a pressão
reduzida em evaporador rotativo, fornecendo os extratos brutos (Tabela 1.2).
Tabela 1.2: Quantidade dos extratos obtidos
Espécie
Botânica
Parte Botânica Peso do
material (g)
Solventes Peso dos
extratos (g)
Borreria
verticillata
Parte Aérea 1008,5 Metanol 90,9374
Raízes 505,5 Metanol 29,1735
26
5.2 Descrição experimental do isolamento dos constituintes químicos
5.2.1 Análise das frações obtidas do extrato do caule de Borreria verticillata
5.2.1.1 ANÁLISE DO EXTRATO METANÓLICO (BCM)
Após um screening para a presença de iridóides o extrato, com 45,6500g
(1ª coleta) foi submetido a uma cromatografia em coluna, usando como eluente
inicialmente diclorometano puro, com gradiente de eluição até metanol puro,
sendo coletadas 27 frações, que posteriormente foram reunidas em 15 frações,
através de comparação por cromatografia em camada delgada analítica. O estudo
cromatográfico das frações está na Tabela 02.
Tabela 02: Estudo cromatográfico das frações coletadas
Frações Reunidas Códigos Quantidade (mg)
0 BCM-0 215
1 BCM-1 10,9
2-4 BCM-2 21,5
5-6 BCM-3 8,8
7-8 BCM-4 48,2
9-11 BCM-5 33,2
12 BCM-6 1880
13-16 BCM-7 1525
17-19 BCM-8 2433,4
20 BCM-9 428
21-22 BCM-10 370,6
23 BCM-11 172,9
24-25 BCM-12 947,5
26 BCM-13 2318,2
27 BCM-14 7726,1
ANÁLISE DA FRAÇÃO BCM-12 (947,5 mg)
Após um screening para a presença de iridóides a fração BCM-12 foi
submetida a sucessivas colunas cromatográficas até o isolamento da substância
BC-4. A análise da fração BCM-12 encontra-se sumarizada no Fluxograma 1.
27
Fluxograma 1: Análise Cromatográfica da fração BCM-12
As frações trabalhadas foram selecionadas após obtenção de
cromatogramas com manchas de coloração característica para iridóides, quando
reveladas com vanilina sulfúrica, e valores de Rf indicando substâncias polares.
ANÁLISE DA FRAÇÃO BCM-13 ( 2318,2 mg)
Após um screening para a presença de iridóides a fração BCM-13 foi
submetida à análise cromatográfica até o isolamento da substância BC-8. A
análise da fração BCM-13 encontra-se sumarizada no Fluxograma 2.
28
Fluxograma 2: Análise da fração BCM-13
As frações trabalhadas foram selecionadas após obtenção de
cromatogramas com manchas de coloração característica para iridóides, quando
reveladas com vanilina sulfúrica, e valores de Rf indicando substâncias polares.
29
Um resumo do estudo cromatográfico do extrato BCM e substâncias
isoladas é apresentado no Fluxograma 3
.
Fluxograma 3:
F
racionamento do extrato BCM
5.2.2 Análise das frações obtidas do extrato das raízes de Borreria
verticillata
5.2.2.1 ANÁLISE DO EXTRATO METANÓLICO (BVR)
Após um screening para a presença de iridóides o extrato, com 29,1735g
(2ª coleta) foi submetido a uma cromatografia em coluna, usando como eluente
inicialmente diclorometano puro, com gradiente de eluição até metanol puro,
sendo coletadas 84 frações, que posteriormente foram reunidas em 12 frações,
através de comparação por cromatografia em camada delgada analítica. A
30
análise do extrato BVR e das frações BVR-2 e BVR-10 e os respectivos
isolamentos das substâncias BR-13 e BR-25, encontram-se sumarizados no
Fluxograma 4.
Fluxograma 4:
Análise do extrato BVR e das frações BVR-2 e BVR-10
As frações trabalhadas foram selecionadas após obtenção de
cromatogramas com manchas de coloração característica, quando reveladas com
vanilina sulfúrica para iridóides, e Dragendorff para alcalóides.
ANÁLISE DA FRAÇÃO BVR-5 (1168,0 mg)
A fração BVR-5 foi submetida à análise cromatográfica até o isolamento
das substâncias BR-22 e BR-31. O estudo cromatográfico das frações encontra-
se sumarizado no Fluxograma 5.
31
Fluxograma 5: Análise da fração BVR-5.
As frações trabalhadas foram selecionadas após obtenção de
cromatogramas com manchas de coloração característica, quando reveladas com
vanilina sulfúrica para esteróides, e Dragendorff para alcalóides.
32
ANÁLISE DA FRAÇÃO BVR12 (12439,7mg)
A fração BVR-12 foi submetida à análise cromatográfica até o isolamento
das substâncias BR-28 e BR-29. O estudo cromatográfico das frações encontra-
se sumarizado no Fluxograma 6.
Fluxograma 6: Análise da fração BVR-12.
As frações trabalhadas foram selecionadas após obtenção de
cromatogramas com manchas de coloração característica, quando reveladas com
vanilina sulfúrica para glicosídeos.
33
Um resumo do estudo cromatográfico do extrato BCM e substâncias
isoladas é apresentado no Fluxograma 7.
Figura 7:
F
racionamento do extrato BVR
34
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1
Substâncias identificadas de Borreria verticillata
O estudo fitoquímico de Borreria verticillata permitiu o isolamento e a
identificação de 11 substâncias, sendo 2 alcalóides e 3 iridóides, 3 esteróides e 3
unidades de açúcar livres.
N
O
H
BR-22
N
MeO
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
BR-13
O
COOMe
O
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
BC- 4
O
AcO
O
O
O
O
AcO
OAc
OAc
OAc
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
7
8
9
10
BC- 8
O
COOMe
O
HO
HO
O
HO
OH
OH
O
OHHO
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
BR-25
1"
2"
3"
HO
H
H
H
HO
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
HO
H
H
H
BR-31a
BR-31b
BR-31c
BR-29Ac
O
AcO
AcO
AcO
OAc
O
O
OAc
AcO
OAc
AcO
O
AcO
AcO
AcO
OAc
OAc
BR-28Ac (α
αα
α e β
ββ
β)
35
6.2 Determinação Estrutural
6.2.1 Identificação da substância BR-13
1
4
5´
4´
6
5
3
3´
2´
1´
9
8
7
2
N
MeO
H
N
H
2
7
8
9
3
5
6
4
1
BR-13
Mo-1
A substância BR-13 foi isolada do extrato em MeOH das raízes como um
óleo amarelo-claro, apresentando teste positivo para alcalóides com o reagente
de Dragendorff.
Analisando o espectro na região do infravermelho (IV) (Figura 16, p. 38)
pode-se observar a presença de absorções em 3409 (N-H), característica de
grupamento amina, 1270 e 1238 característica de grupamento C-O-C (grupo
metoxila), 2978 e 725 característica de grupamento =CH e 1498 cm
-1
(C=C de
anel benzênico substituído) (SILVERTEIN,2007; BARBOSA, 2007).
A análise do espectro de RMN
13
C e DEPT 135° (Figuras 22 e 23, p. 44-
45, Tabela 3, p. 38) da substância BR-13 permitiu reconhecer a presença de
quatorze (14) átomos de carbono, sendo três carbonos metílicos (sendo um ligado
a átomo de oxigênio e dois ligados a um átomo de carbono sp
2
), um carbono
metilênico (sp
3
), cinco carbonos metínicos (sendo quatro sp
2
aromáticos) e cinco
carbonos quaternários (todos sp
2
) (SILVERSTEIN, 2007; FRIEBOLIM, 1993).
Esses dados, em conjunto com os dados do espectro de massas (Figura
33 p. 54, esquema 1, p. 37), o qual apresentou o pico do íon molecular em m/z
215 Daltons, permitiram propor a fórmula molecular C
14
H
17
NO para a substância
BR-13, caracterizando um Índice de Deficiência de Hidrogênio (IDH) igual a 7.
O espectro de RMN
1
H da substância BR-13 (Figuras 17 a 19, p. 39 a 41
Tabela 3) apresentou sinais de deslocamentos químicos (δ
H
) característicos de
grupos metila, metoxila, hidrogênios aromáticos, grupos metínicos, grupo
metilênico,
e ainda a presença de um hidrogênio referente a grupamento amina
(SILVERSTEIN, 2007; FRIEBOLIM, 1993).
36
O espectro de RMN
1
H da substância BR-13 (Figura 17, Tabela 3)
apresenta dois sinais relativos a hidrogênios de um núcleo benzênico a δ
H
6,92
(1H, d, J= 8,7 Hz; H-7) e 7,19 (1H, d, J= 8,7 Hz; H-8), característicos de um
núcleo benzênico tetra substituido (LOUNASMAA, 1986), confirmado através das
correlações heteronucleares dos átomos de carbono metínicos (HSQC, Figura
24, p. 46) através das correlações a
1
J
CH
entre CH-7 (δ
C
110,14)/H-7 (δ
H
6,92) e
CH-8 (δ
C
108,73)/H-8 (δ
H
7,19). A presença de dois sinais duplos acoplando entre
si (
1
H-
1
H-COSY, Figura 20, p. 42) a δ
H
7,18 (1H, d, J= 2,9 Hz; H-2) e 6,51 (1H, d,
J= 2,9 Hz; H-3), juntamente com a presença de um sinal simples largo a δ
H
8,02
referente a um hidrogênio de um grupo H-N, confirmam a presença de um núcleo
indólico com substituintes (AZOUG, et al. 1995).
A presença do núcleo indólico substituído no anel benzênico foi também
corroborada pelas correlações heteronucleares a longa distância (HMBC, Figura
28, p. 50) através das correlações entre os átomos de carbono C-9 (δ
C
131,57) e
C-6 (δ
C
151,00) com os hidrogênios H-8 (δ
H
7,19) e H-7 (δ
H
6,92); C-4 (δ
C
128,32)
com os hidrogênios H-3 (δ
H
6,51) e H-2 (δ
H
7,18), as demais correlações estão
descritas na Tabela 3.
A presença de um grupo metoxila ligado ao carbono C-6 foi confirmada
pela presença de um sinal simples integrando para três hidrogênios em δ
H
3,85,
juntamente com um sinal referente a um carbono metoxílico em δ
c
58,14. A
localização deste grupo foi apoiada pela correlação heteronuclear
3
J
CH
a longa
distância (HMBC, Figura 28) entre o átomo de carbono quaternário C-6 (δ
C
151,00) com os hidrogênios do grupo OCH
3
-6 (δ
H
3,85).
A presença do grupo prenila localizada no átomo de carbono C-5, pôde ser
notada pelos deslocamentos químicos dos hidrogênios metilênicos, 2H-1’,
apresentando-se como um sinal duplo em δ
H
3,62 (d, J = 7,0 Hz), acoplando com
os hidrogênios olefínicos em δ
H
5,24 (t, J = 7,0 Hz, H-2’), observados claramente
no espectro de RMN
1
H (Figura 17).
A presença deste grupo localizado no átomo de carbono C-5, foi
confirmada pelas correlações heteronucleares a longa distância entre 2H-1’ em δ
H
43,62 com o átomo de carbono C-5 em δ
C
121,40 (
2
J
CH
) e com os átomos de
carbono C-6 (δ
C
151,00,
3
J
CH
) e C-4 (δ
C
128,32,
3
J
CH
); e do átomo de carbono
olefínico C-3´em δ
C
130,98 com os hidrogênios dos grupos metila CH
3
-4´ (δ
H
1,84,
37
2
J
CH
) e CH
3
-5´ (δ
H
1,67
2
J
CH
) observadas no mapa de correlação HMBC
(Figuras
28-31, p. 50-53). As demais correlações estão apresentadas na Tabela 3, p. 35.
Os dois sinais simples integrando para três hidrogênios cada apresentados
no espectro de RMN
1
H (Figura 17), em δ
H
1,84 (3H-4’) e 1,67 (3H-5’) também
corroboram com a presença de dois grupos metila, ambos ligados a carbonos sp
2
(SILVERSTEIN et al., 1994).
A presença do grupo metoxila ligado ao átomo de carbono C-6 foi ainda
corroborada pelo fragmento m/z= 200 no espectro de massas, indicando a perda
de 15 u.m.a., confirmando assim a presença deste grupo (Figura 33, p. 54,
Esquema 1, p.37).
O conjunto destes dados permitiu definir um esqueleto do tipo indol para
substância BR-13, metoxilado na posição C-6, e com uma unidade prenila ligada
ao átomo de carbono C-5. Pelo melhor do conhecimento do presente autor o
alcalóide BR-13 encontra-se inédito na literatura.
N
H
MeO
C
14
H
17
NO
m/z 215
N
H
O
N
H
OMe
Me
m/z 200
m/z184
Esquema 1: Interpretação mecanística dos principais fragmentos no espectro de massas
da substância BR-13.
38
Tabela 3: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em CDCl
3
e as correlações
observadas no espectro de HSQC e HMBC da substância BR-13, e os dados de
13
C do
Mo-1 (LOUNASMAA, 1986). Os valores das constantes de acoplamento (J) em Hz, estão
entre parêntesis.
BR-13 Mo-1
HSQC HMBC C
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
C
4 128,32 - H-3 H-2; 2H-1` 127,6
5 121,40 - 2H-1` H-7 120,5
6 151,00 - H-7 H-8; MeO-6; 2H-1` 119,6
9 131,57 - H-8 H-3; H-7 135,5
3’ 130,98 - 3H-4`; 3H-5` 2H-1`
CH
2 124,77 7,18 (d, 2,9) 124,1
3 101,20 6,51 (m) 102,1
7 110,14 6,92 (d, 8,7) 121,9
8 108,73 7,19 (d, 8,7) 111,0
2` 123,39 5,24 (t, 7,0) 2H-1` 3H-4`; 3H-5`
CH
2
1` 26,07 3,62 (d, 7,0)
CH
3
4` 17,92 1,84 (sl) 3H-5`
5` 25,76 1,67 (sl) 3H-4`
MeO-6 58,14 3,85 (s)
HN-1 - 8,02 (sl)
Figura 16: Espectro de IV (KBr) de BR-13
39
Figura 17: Espectro de RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BR-13
40
Figura 18: Ampliação da região de δ
H
3,8 a 0,8 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em
CDCl
3
de BR-13
41
Figura 19: Ampliação da região de δ
H
8,0 a 5,3 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em
CDCl
3
de BR-13
42
Figura 20: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-13
43
Figura 21: Ampliações do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-13
44
Figura 22: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) em CDCl
3
de BR-13
45
Figura 23: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º, 100 MHz) em CDCl
3
de BR-13
46
Figura 24: Mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-13
47
Figura 25: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-13
48
Figura 26: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-13
49
Figura 27: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-13
50
Figura 28: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-13
51
Figura 29: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-13
52
Figura 30: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-13
53
Figura 31: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-13
54
Figura 32: Cromatograma de BR-13
Figura 33: Espectro de Massas da substância BR-13
55
6.2.2 Identificação da substância BR-22
BR-22
N
H
O
2
7
8
9
3
5
6
4
1
1`
2`
3`
5`
4`
A substância BR-22 foi isolada do extrato em MeOH das raízes como um
óleo amarelo-claro, apresentando teste positivo para alcalóides com o reagente
de Dragendorff.
A análise do espectro de RMN
13
C e DEPT 135° (Figuras 38 e 39, p. 62-
63, Tabela 4, p. 57) da substância BR-22 permitiu reconhecer a presença de
treze (13) átomos de carbono, sendo dois carbonos metílicos, um carbono
metilênico (sp
3
), seis carbonos metínicos (sendo cinco sp
2
aromáticos) e quatro
carbonos não hidrogenados (todos sp
2
, sendo um carbonílico em δ
C
200,68)
(SILVERSTEIN, 2007; FRIEBOLIM, 1993).
Esses dados, em conjunto com os dados do espectro de massas
(Figura 44 p. 68, esquema 2, p. 57), o qual apresentou o pico do íon molecular
em
m/z 201 Daltons, permitiram propor a fórmula molecular C
13
H
15
NO para a
substância BR-22, caracterizando um Índice de Deficiência de Hidrogênio (IDH)
igual a 7.
O espectro de RMN
1
H da substância BR-22 (Figuras 34 e 35, p.58 e 59
Tabela 4) apresentou sinais de deslocamentos químicos (
δ
H
) característicos de
grupos metila, hidrogênios aromáticos, grupos metínicos, grupo metilênico,
e
ainda a presença de um hidrogênio referente a grupamento amina
(SILVERSTEIN, 2007; FRIEBOLIM, 1993).
O espectro de RMN
1
H da substância BR-22 (Figura 34, Tabela 4)
apresenta três sinais relativos a hidrogênios de um núcleo benzênico a
δ
H
8,33
(1H, sl, H-5), 7,89 (1H, dd, J= 8,6 e 1,3 Hz; H-7) e 7,43 (1H, d, J= 8,6 Hz; H-8)
característicos de um núcleo benzênico tri substituído (LOUNASMAA, 1986),
confirmado através das correlações heteronucleares dos átomos de carbono
metínicos (HSQC, Figura 40, p. 64) através das correlações a
1
J
CH
entre CH-5 (δ
C
122,94)/H-7 (δ
H
8,33), CH-7 (δ
C
122,53)/H-7 (δ
H
7,89) e CH-8 (δ
C
111,16)/H-8 (δ
H
56
7,43). A presença de dois sinais múltiplos acoplando entre si (
1
H-
1
H-COSY,
Figura 36, p. 60) a
δ
H
7,29 (1H, m, H-2) e 6,68 (1H, m, H-3), juntamente com a
presença de um sinal simples largo a
δ
H
8,33 referente a um hidrogênio de um
grupo H-N, confirmam a presença de um núcleo indólico com substituintes
(AZOUG,
et al. 1995).
A presença do núcleo indólico substituído no anel benzênico foi também
corroborada pelas correlações heteronucleares a longa distância (HMBC, Figura
41, p. 65) através das correlações a
3
J
CH
entre os átomos de carbono C-9 (δ
C
138,58) com os hidrogênios H-5 (
δ
H
8,33), H-7 (δ
H
7,89), H-2 (δ
H
7,29) e H-3 (δ
H
6,68); C-4 (
δ
C
127,66) com os hidrogênios H-2 (δ
H
7,29) e H-8 (δ
H
7,43); as
demais correlações estão descritas na Tabela 4.
A presença do grupo isopentenila localizada no átomo de carbono C-6,
pôde ser notada pelos deslocamentos químicos dos hidrogênios metilênicos, 2H-
2’, apresentando-se como um sinal duplo em
δ
H
2,92 (d, J = 6,9 Hz), acoplando
com um hidrogênio metínico em
δ
H
2,58 (m, H-3’), observadas claramente no
espectro de
1
H-
1
H-COSY (Figura 36).
Pode-se observar ainda a presença de um grupo carbonila,
característico de grupamento cetona ligado a anel aromático (SILVERSTEIN,
2007; FRIEBOLIM, 1993) em
δ
C
200,68 (C-1`). A presença deste grupo foi
confirmada através das correlações a
2
J
CH
entre o átomo de carbono C-1` (δ
C
200,68) com os hidrogênios 2H-2` (δ
H
2,92) e a
3
J
CH
com os hidrogênios H-5 (δ
H
8,33), H-7 (
δ
H
7,89) e H-3` (δ
H
2,58).
A presença do grupo isopentenila foi confirmada ainda pelas correlações
heteronucleares a longa distância entre os hidrogênios dos dois grupos metila 3H-
4` (
δ
H
1,02) e 3H-5` (δ
H
1,03) com os átomos de carbono metilênico CH
2
-2` (δ
C
47,73,
3
J
CH
) e com o átomo de carbono metínico CH-3` (δ
C
25,87,
2
J
CH
)
observadas no mapa de correlação HMBC
(Figuras 41 a 43, p. 65 a 67). As
demais correlações estão apresentadas na Tabela 4.
Os dois sinais simples integrando para três hidrogênios cada apresentados
no espectro de RMN
1
H (Figura 34, p. 58), em δ
H
1,03 (3H-5’) e 1,02 (3H-4’)
também corroboram com a presença de dois grupos metila (SILVERSTEIN
et al.,
1994).
57
O conjunto destes dados permitiu definir um esqueleto do tipo indol para
substância BR-22, e com uma unidade isopentenila com um grupo ligado ao
átomo de carbono C-6. Pelo melhor do conhecimento do presente autor o
alcalóide BR-22 [6-(3metilbut-1-ona) indol] encontra-se inédito na literatura.
N
O
H
C
13
H
15
NO
m/z 201.26
N
O
H
O
m/z 116
m/z 159
m/z 144
N
H
N
HO
H
Esquema 2: Interpretação mecanística dos principais fragmentos no espectro de massas
da substância BR-22.
Tabela 4: Dados de RMN
1
H (500 MHz) e
13
C (125 MHz) em CDCl
3
e as correlações
observadas no espectro de HSQC e HMBC da substância BR-22. Os valores das
constantes de acoplamento (J) em Hz, estão entre parêntesis.
HSQC HMBC
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
C
6 130,53 - H-8
3` 127,66 - H-2; H-8
9 138,58 - H-5; H-7; H-2; H-3
1` 200.68 - 2H-2` H-5; H-7; H-3`
CH
5 122,94 8,33 (sl) H-7
8 111,16 7,43 (d, 8,6)
7 122,53 7,89 (dd, 8,6, 1,3) H-5
3` 25,87 2,58 (m) 3H-5`; 3H-4`
2 125,77 7,29 (m)
3 104,59 6,68 (sl) H-2 H-5
CH
2
2` 47,73 2,92 (d, 6,9) H-3` 3H-5`; 3H-4`
CH
3
5` 23,10 1,03 (s) H-3` 2H-2`; 3H-4`
4` 23,10 1,02 (s) H-3` 2H-2`; 3H-5`
HN-1 - 8,33 (sl)
58
Figura 34: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
de BR-22
59
Figura 35: Ampliação da região δ
H
8,6 a 7,2 do espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
de BR-22
60
Figura 36: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-22
61
Figura 37: Mapa de correlação
1
H-
1
H-NOESY em CDCl
3
de BR-22
62
Figura 38: Espectro de RMN
13
C (125 MHz) em CDCl
3
de BR-22
63
Figura 39: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º, 125 MHz) em CDCl
3
de BR-22
64
Figura 40: Mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-22
65
Figura 41: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-22
66
Figura 42: Ampliações do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
22
67
Figura 43: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-22
68
Figura 44: Espectro de massas de BR-22
69
6.2.3 Identificação da substância BC-4
O
COOMe
O
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
O
COOMe
O
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Mo-1: 6β-OH
M
o
-
2
:
6
α
-
O
H
O espectro obtido na região do IV para a substância BC-4 apresentou
bandas de absorção em 3409 (correspondente a grupos OH), 2923 (característico
de grupos CH
2
e CH), 1693 (característico de C=O de éster), 1635 a 1438
(característicos de carbonos olefínicos), 1226 a 1157 (característico de
estiramento C-O de alcoóis) e 1080 cm
-1
(correspondente a álcool secundário β-
insaturado) (Figura 45, p. 72).
No espectro de RMN
13
C APT (Figura 49, p. 76) foram observados dois
sinais referentes a carbonos metilênicos em
δ
C
60,93 e 62,61; três sinais para
carbonos quaternários em
δ
C
110,74, 147,47 e 170,17, sendo este último atribuído
a um grupo carbonila de éster. Além de um sinal em
δ
C
52,07 característico de
grupo metoxila de uma função éster, e dos sinais correspondentes a carbonos
metinicos (CH) em
δ
C
153,85, 130,06, 98,26, 83,20, 47,44 e 45,50. Pôde-se
observar também, sinais característicos de uma unidade glicopiranosídica,
através dos sinais em
δ
C
100,24 (carbono anomérico), 78,32, 77,78, 74,71 e 71,45
(BREITMAIER, 1987), totalizando 17 átomos de carbono.
Os dados de RMN
13
C APT (Figura 49) em conjunto com o espectro de
massas (Figura 52, p. 79) de alta resolução (HR-ES/MS/MS) da substância BC-4,
a qual apresentou o pico do íon molecular em
m/z 427.12085, permitiu propor a
forma molecular C
17
H
24
O
11
Na
+
, confirmando assim os 17 átomos de carbono para
a substância BC-4.
A unidade glicopiranosídica pode ser comprovada através das correlações
a uma ligação entre os hidrogênios em δ
H
4,57 (d, 8,2 Hz), relativo a um
hidrogênio anomérico, com o átomo de carbono CH-1` (δ
C
100,24) e do átomo de
70
carbono metilênico CH-6` (δ
C
62,61) com um dupleto largo em δ
H
3,76, ambas
observadas no espectro de HMQC (Figura 50, p. 77). As demais correlações
encontram-se sumarizadas na (Tabela 5, p. 71).
A presença da unidade glicopiranosídica foi corroborada através das
correlações a longa distância entre o átomo de carbono CH-1 (
δ
C
98,26) com o
sinal duplo em
δ
H
4,57 (H-1`), relativo ao hidrogênio anomérico, e as correlações
entre ambos, o átomo de carbono anomérico em CH-1` (
δ
C
100,24), o átomo de
carbono CH-3` (
δ
C
77,78) com o hidrogênio H-2` (δ
H
3,12); o átomo de carbono
CH-4` (
δ
C
71,45) com o hidrogênio H-3` (δ
H
3,28), e do átomo de carbono CH-5`
(
δ
C
78,32) com o hidrogênio H-4` (δ
H
3,21), ambas apresentadas no espectro e
HMBC (Figura 51, p. 78).
A unidade aglicona da molécula caracterizada através das
correlações a uma ligação observadas no espectro de HMQC (Figura 50, p. 77) e
apresentadas na Tabela 5, e corroboradas pelas correlações longa distância
apresentadas no espectro de HMBC (Figura 51, p. 78) entre o átomo de carbono,
entre o carbono carbonílico do éster em
δ
C
170,17 com um sinal simples, relativo
ao hidrogênio olefínico em
δ
H
7,41 (H-3), e com outro sinal simples integrando
para três hidrogênios em
δ
H
3,65 (OMe-11), relativo ao grupo metoxila do grupo
éster. Pôde-se observar ainda a correlações entre os átomos de carbonos
olefínicos CH-7 (
δ
C
130,06) e C-8 (δ
C
147,47) com dois sinais duplos em δ
H
4,24 e
4,08, característicos de hidrogênios de grupo metilênico de álcool primário. As
demais correlações encontram-se sumarizadas na Tabela 5.
Estes dados em conjunto com os dados de RMN
13
C-APT (Figura 49, p.
76) confirmam a presença de um esqueleto iridoidal com duas insaturações
atribuídas através dos sinais em
δ
C
153,85 (CH-3), 110,74(C-4), 130,06 (CH-7) e
147,47 (C-8), e ainda com a presença de dois grupos hidroxila atribuídos através
dos sinais em
δ
C
83,20 (CH-6), 60,93 (CH
2
-10), característicos de carbonos
carbinólicos (BREITMAIER, 1987).
O conjunto desses dados em adição a comparação com os dados de
literatura, consistentes para um esqueleto iridoidal glicosilado permitiram propor a
estrutura para a substância BC-4 como sendo o 6
β-hidroxigeniposídeo
(scandosideo metil éster) já isolada anteriormente
Borreria verticillata
(SAINTY,1981, BOROS, 1990).
71
Os dados espectroscópicos obtidos para a substância BC-4, e os valores
de
δ comparados com os valores da literatura encontram-se sumarizados na
Tabela 5.
Tabela 5: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em metanol-d
4
,
e as correlações
observadas no espectro de HMQC e HMBC do iridóide BC-4, e comparação com valores
de literatura para os modelos Mo-1 e Mo-2 (BOROS, 1990).* Os valores das constantes
de acoplamento (J) em Hz, estão entre parêntesis.
BC-4
HMQC HMBC
Mo-1 Mo-2
C
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
C
δ
C
4 110,74 - - - 110,0 108,3
8 147,47 - H-9; 2H-10 - 147,9 151,8
11 170,17 - - - 171,0 169,5
CH
1 98,26 5,09 (d, 5,9) H-9 H-5; H-1’ 98,4 101,6
3 153,85 7,41 (s) - - 153,9 155,4
5 45,50 2,94 (m) - H-1; H-3; H-7 47,1 42,7
6 83,20 4,45 (sl) - - 82,9 75,4
7 130,06 5,79 (sl) - H-9; 2H-10 130,0 130,0
9 47,44 2,91 (m) - - 47,6 45,9
CH
2
10 60,93 4,24 (d, 15,2)
4,08 (d, 15,2)
C-8 C-7 61,4 61,7
CH
3
MeO-11 52,07 3,65 (s) - - 52,1 -
CH-1’ 100,24 4,57 (d, 8,2) H-2’ H-1 100,3 100,5
CH-2’ 74,71 3,12 (t, 8,2) - - 74,8 75,0
CH-3’ 77,78 3,28 (m) H-2’ - 77,9 77,8
CH-4’ 71,45 3,21 (m) H-3’ - 71,5 71,6
CH-5’ 78,32 - H-4’ - 78,4 78,5
CH
2
-6’ 62,61 3,76(dl, 11,7)
3,55 (m)
- - 61,0 62,8
*
Os valores de δ
C
para os modelos Mo-1 (D
2
O) e Mo-2 (metanol-d
4
) foram obtidos a 200
MHz.
72
Figura 45: Espectro de IV (KBr) de BC-4
73
Figura 46: Espectro de RMN1H (400 MHz) em MeOH de BC-4
74
Figura 47: Ampliação da região δ
H
5,1 a 4,1 do espectro de RMN1H (400 MHz) em
MeOH de BC-4
75
Figura 48: Ampliação da região δ
H
4,3 a 2,9 do espectro de RMN1H (400 MHz) em
MeOH de BC-4
76
Figura 49: Espectro de RMN
13
C (APT, 100 MHz) em MeOH de BC-4
77
Figura 50: Mapa de correlação do espectro de HMQC em MeOH de BC-4
78
Figura 51: Mapa de correlação do espectro de HMBC em MeOH de BC-4
79
Figura 52: Espectros de HR-ESI-MS/MS de BC-4
80
6.2.4 Identificação do derivado (BC-8Ac) da substância BC-8
O
AcO
O
O
O
O
AcO
OAc
OAc
OAc
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
7
8
9
10
BC- 8Ac
11
6
O
AcO
O
O
O
O
HO
OH
OH
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
7
8
9
10
BC- 8
A substância BC-8 foi obtida como derivado acetilado (BC-8Ac) em
piridina: anidrido acético (1:2; v/v) a partir de uma alíquota do extrato metanólico
do caule de
Borreria verticillata.
O espectro obtido na região do IV para a substância BC-8Ac apresentou
bandas de absorção em 2958 cm
-1
(característico de grupo CH
2
e CH), 1658 cm
-1
e 1249 cm
-1
(característicos de γ-lactona), 1735-1762 cm
-1
(característicos de
grupos acetato), 1211-1234 cm
-1
(característicos de grupos acetato), 1168 cm
-1
(éster conjugado)
(Figura 53, p. 82) (BARBOSA, 2007).
A análise do espectro de RMN
13
C (Figura 58, p. 88) da substância BC-
8Ac mostrou-se muito semelhante ao iridóide BR-25Ac (pág. 92), com exceção
de três sinais adicionais da unidade de glicerol presente no iridóide BR-25Ac. Os
restantes dos sinais apresentaram semelhança ao iridóide BR-25Ac, tais como,
três sinais para carbonos quaternários em
δ
C
105,53 (C-4), 141,43 (C-8) e 169,01
(C-11) sendo este último atribuído a carbono do grupo carbonila de uma lactona.
Notou-se agora no iridóide BC-8Ac a ausência do sinal relativo ao grupo metoxila
presente no iridóide BR-25Ac, e os sinais característicos de uma unidade
glicopiranosídica acetilada em
δ
C
96,03 (C-1`; carbono anomérico), 70,53, 72,26,
68,14 e 72,25 e 61,70.
Observou-se também
no espectro de RMN
13
C (Figura 58, p. 88) da
substância BC-8Ac, a presença dos quatro grupos carbonila referentes aos
grupos acetoxila em
δ
C
169,52 (AcO-2`), 170,65 (AcO-3`), 170,15 (AcO-4`),
169,43 (AcO-6`), juntamente com um sinal em
δ
C
170,30 (AcO-10) referente ao
81
grupo acetoxila ligado ao átomo de carbono CH
2
-10 presente no esqueleto
iridoidal.
A presença dos cinco sinais simples no espectro de RMN
1
H (Figura 55, p.
85), integrando para três hidrogênios cada, em
δ
H
1,99; 2,00; 2,03; 2,08 e 2,10
característicos de hidrogênios metílicos dos grupos acetoxilas, corroboram a
presença dos cinco grupos acetoxila.
A unidade glicopiranosídica acetilada pode ser comprovada através das
correlações a uma ligação entre os hidrogênios em
δ
H
4,89 (d, 8,2 Hz), relativo a
um hidrogênio anomérico, com o átomo de carbono CH-1` (
δ
C
96,03), e do átomo
de carbono metilênico CH-6` (
δ
C
61,70) com os dois sinais em δ
H
4,31 (dd, 12,9 e
4,7 Hz) e 4,15 (dl, 12,9 Hz), ambas observadas no espectro de HMQC (Figura 59,
p. 89). As demais correlações encontram-se sumarizadas na Tabela 6, p. 83.
A presença da unidade glicopiranosídica acetilada foi corroborada através
das correlações a longa distância entre o átomo de carbono CH-1 (
δ
C
91,61) com
o sinal duplo em
δ
H
4,89 (H-1`), relativo ao hidrogênio anomérico, e as correlações
entre ambos, o átomo de carbono anomérico em CH-1` (
δ
C
96,03), o átomo de
carbono CH-3` (
δ
C
72,26) com o hidrogênio H-2` (δ
H
4,99); o átomo de carbono
CH-4` (
δ
C
68,14) com o hidrogênio H-3` (δ
H
5,23), e do átomo de carbono CH-5`
(
δ
C
72,45) com o hidrogênio H-4` (δ
H
5,03), ambas apresentadas no espectro e
HMBC (Figuras 60 e 61, p. 90 e 91).
A unidade aglicona da molécula foi caracterizada através das correlações a
uma ligação observadas no espectro de HMQC (Figura 59, p. 89) e apresentadas
na Tabela 6, e corroboradas pelas correlações longa distância apresentadas no
espectro de HMBC (Figura 59) entre o átomo de carbono entre o carbono
carbonílico da lactona em δ
C
169,01 com um sinal simples largo, relativo ao
hidrogênio carbinólico em
δ
H
5,49 (H-6). Pôde-se observar ainda as correlações
entre os átomos de carbonos olefínicos CH-7 (
δ
C
129,01) e C-8 (δ
C
141,43) com
dois sinais duplos em
δ
H
4,67 e 4,60, característicos de hidrogênios de grupo
metilênico ligado ao grupo acetato. As demais correlações encontram-se
sumarizadas na Tabela 6.
Estes dados em conjunto com os dados de RMN
13
C (Figura 58, p. 88)
confirmam a presença de um esqueleto iridoidal com duas insaturações atribuídas
através dos sinais em
δ
C
147,79 (CH-3), 105,53 (C-4), 129,01 (CH-7) e 141,43 (C-
82
8), e ainda com a presença de um grupo acetoxila atribuído através do sinal em δ
C
60,49 (CH
2
-10), característicos de carbono ligado ao grupo acetoxila
(BREITMAIER, 1987).
A unidade de glicose presente na molécula BC-8Ac, foi acetilada pela
reação de acetilação com piridina e anidrido acético (1:2, v/v, 24 horas).
O conjunto desses dados em adição a comparação com os dados do
iridóide BC-4, BR-25 e BR-25Ac são consistentes para um esqueleto iridoidal
glicosilado no átomo de carbono CH-1 e com a presença de uma
γ-lactona nas
posições C-4 e CH-6, permitiram propor a estrutura do derivado acetilado BC-8Ac
da substância BC-8 (asperulosideo).
Os dados espectroscópicos obtidos para o derivado BC-8Ac, e os valores
de
δ
C
comparados com os valores da literatura, Mo-1 (6`-
acetildesacetilasperulosideo) e Mo-2 (dímero do asperulosideo e ácido
asperulosídico)
(
DINDA, 2007
) encontram-se sumarizados na Tabela 6.
Figura 53: Espectro de IV (KBr) de BC-8
83
Tabela 6: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em CDCl
3
,
e as
correlações observadas no espectro de HMQC e HMBC do iridóide BC-8Ac em
comparação com valores de literatura para os modelos Mo-1 e Mo-2 (
DINDA,
2007
).* Os valores das constantes de acoplamento (J) em Hz, estão entre
parêntesis.
BC-8Ac
HMQC HMBC Mo-1*
Mo-2*
C
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
C
δ
C
4 105,53
- H-3; H-5 H-9 107,4 106,4
8 141,43
- H-7; H-9; 2H-10
H-5; H-6 149,9 144,2
11 169,01
- H-6 176,5 172,1
AcO-10
170,30
- 2H-10 172,5
AcO-2’ 169,52
- H-2’
AcO-3’ 170,65
- H-3’
AcO-4’ 170,15
- H-4’
AcO-6’ 169,43
-
CH
1 91,61 5,67(s) H-1; H-3; H-5; H-1’
95,7 93,4
3 147,79
7,21(s) H-1; H-5 152,6 150,2
5 36,13 3,47(t, 6,4) H-1; H-3; H-7 38,6 37,5
6 84,07 5,49(dl) H-7 89,4 86,3
7 129,01
5,74(sl) H-6 H-5; H-9; 2H-10 127,6 129,3
9 43,47 3,24(d, 6,4) H-7; 2H-10 45,9 45,4
CH
2
10 60,49
4,67(d, 14,1)
4,60(d, 14,1)
H-7 61,3 61,9
CH
3
Ac-10 20,79 2,10(s) 20,8
Ac-2’ 20,65 2,08(s) 22,9
Ac-3’ 20,65 2,03(s) 22,9
Ac-4’ 20,65 2,00(s) 22,9
Ac-6’ 20,65 1,99(s) 22,9
Gli
CH-1’ 96,03 4,89(d, 8,2) H-2’ H-1 101,3
CH-2’ 70,53 4,99(dd, 8,2; 9,4) 75,2
CH-3’ 72,26 5,23(t, 9,4) H-2’; H-4’ 78,0
CH-4’ 68,14 5,03(t, 9,4) H-3’ H-6’ 72,1
CH-5’ 72,45 3,76(dm) H-4’ 76,5
CH
2
-6’ 61,70
4,31(dd, 12,9; 4,7)
4,15(dl, 12,9)
H-4’ 65,8
*
Os valores de δ
C
para os modelos Mo-1 (125 MHz; D
2
O) e Mo-2 (125 MHz; metanol-d
4
).
84
Figura 54: Espectro de RMN
1
H (400 MHz) em MeOH de BC-8 antes da acetilação
85
Figura 55: Espectro de RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BC-8Ac
86
Figura 56: Ampliação da região δ
H
6,0 a 3,1 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BC-8Ac
87
Figura 57: Ampliação da região δ
H
2,1a 0,0 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em CDCl
3
de BC-8Ac
88
Figura 58: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) em CDCl
3
de BR-8Ac
89
Figura 59: Mapa de correlação do espectro de HMQC em CDCl
3
de BC-8Ac
90
Figura 60: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BC-8Ac
91
Figura 61: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BC-
8Ac
92
6.2.5 Identificação da substância BR-25
1'' 3''
2''
BR-25: R= H
BR-25-Ac: R= Ac
O
COOMe
O
RO
RO
O
RO
OR
OR
O
OR
RO
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
O
COOMe
O
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Mo-1: 6β-OH
Mo-2: 6α-OH
O espectro obtido na região do IV para a substância BR-25 apresentou
bandas de absorção em 3386 cm
-1
(correspondente a OH), 2923 cm
-1
(característico de grupos CH
2
e CH
3
), 1693 cm
-1
(correspondente a C=O de éster),
1635 cm
-1
a 1438 cm
-1
(característicos de carbonos olefínicos), 1195 cm
-1
a 1157
cm
-1
(correspondentes a estiramentos C-O de álcoois) e 1080 cm
-1
(correspondente a álcool secundário αβ-insaturado) (Figura 62, p. 96).
A análise do espectro de RMN
13
C e DEPT 135º (Figura 70 e 71, p. 104 e
105) da substância BR-25 mostrou-se muito semelhante ao iridóide BC-4, com
exceção de três sinais adicionais, sendo dois sinais de carbonos metilênicos
(CH
2
) em δ
C
62,46 e um sinal relativo a um carbono metínico (CH) em δ
C
74,04.
Os restantes dos sinais apresentaram semelhança ao iridóide BC-4, tais como,
três sinais para carbonos quaternários em
δ
C
110,31, 147,21 e 168,69 este último
atribuído a carbono do grupo carbonila de éster. Um sinal em
δ
C
51,26
correspondente a grupo metoxila, e os sinais característicos de uma unidade
glicopiranosídica em
δ
C
101,01 (carbono anomérico), 78,81, 78,39, 74,78 e 71,36,
totalizando 20 átomos carbonos.
Os dados de RMN
13
C e DEPT 135º (Figura 70 e 71) em conjunto com o
espectro de massas (Figura 81, p. 115) de alta resolução (HR-ESI-MS/MS) da
substância BR-25, a qual apresentou o pico do íon molecular em
m/z 501.15803,
postulou a propor a forma molecular C
20
H
30
O
13
Na
+
, confirmando assim os 20
átomos de carbono para a substância BR-25, com uma unidade de C
3
H
6
O
2
a
mais do que o iridóide BC-4. Os principais fragmentos encontram-se descritos no
Esquema 3, p. 116.
93
A unidade glicopiranosídica pode ser comprovada através das
correlações a uma ligação entre os hidrogênios em
δ
H
5,38 (d, 7,8 Hz), relativo a
um hidrogênio anomérico, com o átomo de carbono CH-1` (
δ
C
101,01), e do
átomo de carbono metilênico CH-6` (
δ
C
64,79) com um multipleto na faixa de δ
H
4,26-4,20, ambas observadas no espectro de HSQC (Figuras 72 a 74, p. 106 a
108). As demais correlações encontram-se sumarizadas na Tabela 7, p. 95.
A presença da unidade glicopiranosídica foi corroborada através das
correlações a longa distância entre o átomo de carbono CH-1 (δ
C
97,67) com o
sinal duplo em
δ
H
5,38 (H-1`), relativo ao hidrogênio anomérico, e as correlações
entre ambos, o átomo de carbono anomérico em CH-1` (
δ
C
101,01), o átomo de
carbono CH-3` (
δ
C
78,39) com o hidrogênio H-2` (δ
H
4,06); o átomo de carbono
CH-4` (
δ
C
71,36) com o hidrogênio H-3` (δ
H
4,28), e do átomo de carbono CH-5`
(
δ
C
78,81) com o hidrogênio H-4` (δ
H
4,20) e com o hidrogênio H-3` (δ
H
4,28),
ambas apresentadas no espectro e HMBC (Figuras 75 a 78, p. 109 a 112).
A presença de uma unidade de glicerol ligada ao grupo hidroxila do átomo
de carbono CH
2
OH-6` foi confirmada pela presença dos sinais, quintupleto em δ
H
4,41 (J= 5,4 Hz) correlacionando com um sinal em δ
C
74,04, e um sinal em δ
C
62,46, referente a dois carbonos metilênicos correlacionando com dois sinais
múltiplos em
δ
H
4,48 e 4,26, apresentadas no espectro de HSQC (Figuras 72 a
74).
A presença de uma unidade de glicerol ligada ao grupo hidroxila do átomo
de carbono CH
2
OH-6` foi corroborada pela correlação a longa distância
apresentada no espectro de HMBC (Figuras 75 a 78), através da correlação entre
o átomo de carbono CH
2
-6` (δ
C
64,79) com o quintupleto, relativo ao hidrogênio H-
2`` (
δ
H
4,41). Outras correlações apresentadas no espectro de HMBC (Figuras 75
a 78), tais como, CH
2
-1``/CH2-3`` (δ
C
62,46) com o hidrogênio H-2`` (δ
H
4,41), e
do átomo de carbono CH-2`` (
δ
C
74,04) com os dois multipletos, relativos aos
hidrogênios 2H-1`` e 2H-3`` em
δ
H
4,48 e 4,26.
A unidade aglicona da molécula foi caracterizada através das correlações a
uma ligação observadas no espectro de HSQC (Figuras 72 a 74) e apresentadas
na Tabela 7, e corroboradas pelas correlações longa distância apresentadas no
espectro de HMBC (Figuras 75 a 78) entre o átomo de carbono, entre o carbono
carbonílico do éster em
δ
C
168,69 com um sinal simples, relativo ao hidrogênio
94
olefínico em δ
H
7,70 (H-3), e com outro sinal simples integrando para três
hidrogênios em
δ
H
3,59 (OMe-11), relativo ao grupo metoxila do grupo éster.
Pôde-se observar ainda as correlações entre os átomos de carbonos olefínicos
CH-7 (
δ
C
130,21) e C-8 (δ
C
147,21) com dois sinais duplos largos em δ
H
4,80 e
4,51, característicos de hidrogênios de grupo metilênico de álcool primário. As
demais correlações encontram-se sumarizadas na Tabela 7.
Estes dados em conjunto com os dados de RMN
13
C e DEPT 135º
(Figuras 70 e 71) confirmam a presença de um esqueleto iridoidal com duas
insaturações atribuídas através dos sinais em
δ
C
152,96 (CH-3), 110,31(C-4),
130,21 (CH-7) e 147,21 (C-8), e ainda com a presença de dois grupos hidroxila
atribuídos através dos sinais em
δ
C
81,21 (CH-6), 60,38 (CH
2
-10), característicos
de carbonos carbinólicos (BREITMAIER, 1987).
A unidade de glicose, glicerol e ainda os dois grupos hidroxila presentes na
molécula BR-25, foi confirmada ainda pela reação de acetilação com piridina e
anidrido acético (1:2, v/v, 24 horas), através dos valores dos deslocamentos
químicos apresentados pelos átomos de carbono da unidade de glicose presentes
na substância BR-25Ac, mostrando a proteção devido ao efeito
γ protetor
(BREITMAIER, 1987).
O conjunto desses dados em adição a comparação com os dados do
iridóide BC-4, são consistentes para um esqueleto iridoidal glicosilado com
unidade de glicerol ligada ao átomo de carbono CH
2
-6` da unidade glicopiranosila,
permitiram propor a estrutura para a substância BR-25.
Pelo melhor do conhecimento do presente autor o iridóide BR-25 encontra-
se inédito na literatura.
Os dados espectroscópicos obtidos para a substância BR-25, o derivado
BR-25Ac e os valores de
δ comparados com os valores da literatura (BOROS,
1990) encontram-se sumarizados na Tabela 7.
95
Tabela 7: Dados de RMN
1
H (400 MHz) e
13
C (100 MHz) em piridina-d
5
,
e as correlações
observadas no espectro de HSQC e HMBC do iridóide BR-25 (C
5
D
5
N), BR-25Ac (CDCl
3
)
e comparação com valores de literatura para os modelos Mo-1 e Mo-2 (BOROS, 1990).*
Os valores das constantes de acoplamento (
J) em Hz, estão entre parêntesis.
BR-25
HSQC HMBC BR-25Ac Mo-1 Mo-2
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
C
δ
H
δ
C
δ
C
C
4 110,31
- H-3; H-5 109,16
- 110,0
108,3
8 147,21
- H-7; H-9;
2H-10
142,81
- 147,9
151,8
11 168,69
- H-3;MeO-
11
166,83
- 171,0
169,5
AcO - - - - - - -
AcO - - - - - - -
AcO - - - - - - -
AcO - - - - - - -
AcO - - - - - - -
AcO - - - - - - -
CH
1 97,67 5,82 (d, 5,6) H-9 H-3; H-1’ 94,74 5,21 98,4 101,6
3 152,96
7,70 (s) H-1; H-5 151,73
7,38 (s) 153,9
155,4
5 44,99 3,46 (ddl,
6,7, 3,0)
H-9 H-1; H-7 39,13 3,24 (sl) 47,1 42,7
6 81,21 4,95 (m) H-5; H-7 81,36 5,52 (sl) 82,9 75,4
7 130,21
6,33 (sl) H-9; 2H-
10
128,73
5,89 (sl) 130,0
130,0
9 47,00 3,51 (tl, 5,8) H-5 H-7 46,34 3,24 (sl) 47,6 45,9
CH
2
10 60,38 4,80 (dl,
15,2)
4,51 (dl,
15,2)
H-7 61,14 4,71 (sl) 61,4 61,7
CH
3
MeO-
11
51,26 3,59 (s) 51,51 3,71 (s) 52,1
AcO - - - - 2,43 (s),
2Ac
- -
AcO - - - - 2,28 (s) - -
AcO - - - - 2,22 (s) - -
AcO - - - - 2,11 (s) - -
AcO - - - - 2,03 (s) - -
AcO - - - - 1,97 (s) - -
Gli
CH-1’ 101,01
5,38 (d, 7,8) H-2’ H-1 96,46 4,83 (d,
6,9)
100,3
100,5
CH-2’ 74,78 406 (dd) H-3’ 70,71 5,00 (dd) 74,8 75,0
CH-3’ 78,39 4,28 H-2’ 72,40 5,21 77,9 77,8
CH-4’ 71,36 4,20 H-3’ 70,71 5,10 71,5 71,6
CH-5’ 78,81 3,98 (m) H-3’; H-4’ 72,43 3,72 78,4 78,5
CH
2
-6’ 64,79 4,26 – 4,20 H-2’’; H-4’ 61,51 4,29, 4,19
61,0 62,8
Glice
1’’/3’’ 62,46 4,48 (dd),
4,26
H-2’’ 62,47 4,29, 4,19
-
2’’ 74,04 4,41 (qu, 5,4) 2H-1’’/2H-3’’ 2H-6’ 68,11 5,21 -
*Os valores de δ
C
para os modelos Mo-1 (D
2
O) e Mo-2 (metanol-d
4
) foram obtidos a 200
MHz.
96
Figura 62: Espectro de IV (KBr) de BR-25
97
Figura 63: Espectro de RMN
1
H (400 MHz) em C
5
D
5
N de BR-25
98
Figura 64: Ampliação da região de δ
H
7,8 a 5,2 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em
C
5
D
5
N de BR-25
99
Figura 65: Ampliação da região de δ
H
4,9 a 4,2 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em
C
5
D
5
N de BR-25
100
Figura 66: Ampliação da região de δ
H
4,1 a 3,4 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) em
C
5
D
5
N de BR-25
101
Figura 67: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em C
5
D
5
N de BR-25
102
Figura 68: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em C
5
D
5
N de BR-25
103
Figura 69: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em C
5
D
5
N de BR-25
104
Figura 70: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º, 100 MHz) em C
5
D
5
N de BR-25
105
Figura 71: Espectro de RMN
13
C (100 MHz) em C
5
D
5
N de BR-25
106
Figura 72: Mapa de correlação do espectro de HSQC em C
5
D
5
N de BR-25
107
Figura 73: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em C
5
D
5
N de BR-25
108
Figura 74: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em C
5
D
5
N de BR-25
109
Figura 75: Mapa de correlação do espectro de HMBC em C
5
D
5
N de BR-25
110
Figura 76: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em C
5
D
5
N de BR-25
111
Figura 77: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em C
5
D
5
N de BR-25
112
Figura 78: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em C
5
D
5
N de BR-25
113
Figura 79: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
do derivado acetilado BR-25Ac
114
Figura 80: Espectro de RMN
13
C (125 MHz) em CDCl
3
do derivado acetilado BR-25Ac
115
Figura 81: Espectros de HR-ESI-MS/MS de BR-25
116
O
C
HO
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
O
OMe
Na
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
10
C
17
H
24
NaO
11
m/z 427.12163
m/z 427.12106
1''
2''
3''
HO
OH
o
O
C
HO
O
HO
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
O
OMe
Na
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
10
C
20
H
30
NaO
13
m/z 501.15841
m/z 501.15803
ESI-MS/MS m/z 501:
O
C
HO
O
HO
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
O
OMe
Na
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
10
m/z 501
H
.
m/z 500
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
10
O
C
HO
O
HO
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
O
O
Na
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
10
m/z 486
O
C
HO
H
O
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
O
OMe
Na
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
m/z 471
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
10
m/z 411
O
C
HO
O
HO
O
HO
OH
OH
O
O
O
Na
O
C
O
O
HO
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
O
OMe
Na
Esquema 3: Proposta mecanística para MS/MS do pico em
m/z 501,15803 ([M+Na]
+
)
para o iridóide BR-25.
117
6.2.6 Identificação da mistura de esteróides BR-31
HO
H
H
H
HO
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
HO
H
H
H
Os fitoesteróides são frequentemente encontrados dentro do reino vegetal,
sendo que os mais comuns são o estigmasterol (BR-31b) e o β-sitosterol (BR-
31a). No entanto quase sempre estas substâncias ocorrem em misturas devido às
suas semelhanças estruturais, dificultando suas separações através de técnicas
cromatográficas usuais. Por isso na maioria das vezes, suas identificações são
feitas em mistura, através da análise de dados obtidos utilizando-se as técnicas
de cromatografia de gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG/EM) e RMN
13
C.
A análise dos espectros de RMN
1
H (Figura 82, p. 120) da amostra BR-31
apresentou um grande acúmulo de sinais intensos na região de
δ
H
0,68 a 2,28,
relativos aos vários grupos de hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos de
um esqueleto estereoidal. Observa-se um multipleto em
δ
H
3,52 característico de
um átomo de hidrogênio (H-3) oxigenado e um dupleto em
δ
H
5,36, característico
de um átomo de hidrogênio olefínico (H-6) do esqueleto esteroidal.
A presença do esteróide estigmasterol foi notada no espectro de RMN
1
H
da mistura (Figura 82) pelas absorções dos hidrogênios olefínicos da cadeia
lateral em
δ
H
5,04 (dd, J = 8,8 e 15,2 Hz, H-22) e δ
H
5,14 (dd, J = 8,8 e 15,2 Hz, H-
23).
A distinção entre os esteróides β-sitosterol (BR-31a) e o estigmasterol (BR-
31b), foi confirmada pelos sinais observados no espectro de RMN
13
C APT
(Figura 85, p. 123) em
δ
C
121,8 e 140,8 (C-6 e C-5) comuns para ambas as
estruturas e
δ
C
129,4 e 138,4 (C-23 e C-22), presentes somente no esteróide
estigmasterol. Observa-se ainda no espectro de RMN
13
C APT o sinal
característico do carbono oxigenado em
δ
C
71,9 que indica a presença de um
grupamento hidroxila no átomo de carbono CH-3 das substâncias presentes na
mistura.
(BR-31 a) (BR-31 b) (BR-31 c)
118
A análise por CG/EM da fração BR-31 apresentou três sinais com tempos
de retenção t
R1 =
17,4 min. (27,6%), t
R2 =
17,8 min. (43,7%) e t
R3 =
18,8 min.
(26,8%), sendo que o espectro de massas obtido a partir de cada sinal permitiu
identificar t
R1
como sendo o esteróide campesterol (BR-31c) com m/z= 400, t
R2
como sendo o esteróide estigmasterol (BR-31b) m/z= 412 e t
R3
como sendo o
esteróide β-sitosterol (BR-31a)
m/z= 414 (Figuras 87 a 89, p. 121 a 122).
O conjunto desses dados em comparação com dados da literatura (
VIEIRA,
1999a
) permitiu identificar a mistura de esteróides em BR-31 como sendo β-
sitosterol, estigmasterol e campesterol. Os dados de RMN obtidos para a mistura
de esteróides em BR-31 e dos dados da literatura para mistura dos esteróides
encontram-se sumarizados na Tabela 8, p. 119.
119
Tabela 8. Dados de RMN
13
C (100 MHz) em CDCl
3
para a mistura de esteróides e
comparação com valores de literatura para os modelos Mo-1 (sitosterol), Mo-2
(estigmasterol) e Mo-3 (campesterol).
C BR-31a BR-31b BR-31c Mo-1 Mo-2 Mo-3
1 37,3 37,3 37,3 37,3 37,3 37,3
2 31,9 31,9 31,9 31,9 31,9 31,9
3 71,8 71,8 71,8 71,8 71,8 71,8
4 42,3 42,3 42,3 42,2 42,2 42,2
5 140,7 140,7 140,7 140,7 140,7 140,7
6 121,7 121,7 121,7 121,7 121,7 121,7
7 33,9 33,9 33,9 33,9 33,9 33,9
8 31,6 31,6 31,6 31,9 31,9 31,9
9 50,1 50,1 50,1 50,1 50,1 50,1
10 36,1 36,1 36,1 36,1 36,1 36,1
11 21,2 21,2 21,2 21,1 21,1 21,1
12 39,7 39,7 39,7 39,8 39,8 39,8
13 42,3 42,3 42,3 42,3 42,3 42,3
14 56,8 56,8 56,8 56,8 56,8 56,8
15 24,3 24,3 24,3 24,3 24,3 24,3
16 28,9 28,9 28,9 28,9 28,9 28,9
17 56,0 56,0 56,0 56,0 56,0 56,0
18 12,2 12,2 12,2 12,3 12,3 12,3
19 19,4 19,4 19,4 19,4 19,4 19,4
20 39,7 39,7 37,3 39,8 39,8 37,3
21 18,9 21,0 14,0 18,8 20,5 14,1
22 31,9 138,3 31,9 32,0 138,3 32,0
23 26,0 129,2 31,6 26,0 129,3 31,6
24 45,8 51,2 45,8 45,8 51,2 45,8
25 29,0 31,9 31,9 29,0 31,9 31,9
26 19,8 21,2 21,2 19,8 21,2 21,2
27 19,8 19,8 21,0 19,8 19,8 20,2
28 23,0 25,4 18,7 23,0 25,4 18,2
29 11,8 12,0 - 11,8 11,9 -
120
Figura 82: Espectro de RMN
1
H (400 MHz) de BR-31
121
Figura 83: Ampliação da região δ
H
5,7 a 4,5 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) de BR-31
122
Figura 84: Ampliação da região δ
H
4,2 a 2,9 do espectro de RMN
1
H (400 MHz) de BR-31
123
Figura 85: Espectro de RMN
13
C (APT, 400 MHz) de BR-31
124
Figura 86: Cromatograma da mistura de esteróides BR-31
Figura 87: Espectro de massas de β-sitosterol de BR-31
125
Figura 88: Espectro de massas de estigmasterol de BR-31
Figura 89: Espectro de massas de campesterol de BR-31
126
6.2.7 Identificação do derivado acetilado (BR-29Ac) da substância BR-29
1
2
3 4
5
6
1'
2'
3'4'
5'
6'
BR-29Ac
O
AcO
AcO
AcO
OAc
O
O
OAc
AcO
OAc
AcO
1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
BR-29
O
HO
HO
HO
OH
O
O
OH
AcO
OH
HO
O derivado acetilado (BR-29Ac) da substância BR-29 foi obtida como
derivado acetilado em piridina: anidrido acético (1:2; v/v) a partir de uma fração do
extrato metanólico da raiz de
Borreria verticillata, apresentando-se sob a forma de
um sólido amorfo.
Na interpretação do espectro de RMN
13
C (Figura 97, p. 137, Tabela 9, p.
129) foram observados três sinais referentes a carbonos metilênicos em
δ
C
61,96;
63,09 e 63,85; nove sinais para carbonos quaternários, sendo oito relativos a
carbonos quaternários característicos de C=O de grupo acetoxila em
δ
C
169,72;
169,89; 170,25; 170,32; 170,70; 170,77; 170,95 e 179,10; e um em
δ
C
104,21.
Foram observados ainda, oito sinais para carbonos metínicos em
δ
C
68,42; 68,71;
69,83; 70,51; 75,22; 75,93; 79,32 e 90,15; oito sinais para grupos metila de
grupos acetoxila em
δ
C
20,52; 20,76; 20,78; 20,81; 20,85; 20,89; 20,91 e 21,68
totalizando 28 átomos de carbono.
No espectro de RMN
1
H (Figura 90, p. 130, Tabela 9) pode-se observar
um sinal característico de hidrogênio de uma unidade glicosídica em
δ
C
5,68 (d,
3,6 Hz) que no espectro HSQC (Figura 100, p. 140) apresenta correlação a uma
ligação com o sinal em
δ
C
90,15,
e no espectro de
1
H-
1
H-COSY (Figura 94, p.
134) correlaciona-se com o hidrogênio em
δ
H
4,87 (dd, 3,6; 10,4 Hz) atribuído ao
H-2’. Este por sua vez apresenta no espectro de HSQC (Figura 100) uma
correlação com o sinal em
δ
C
70,51, e no espectro de HMBC apresenta
correlações a duas ligações com o sinal em
δ
H
5,44(t, 9,9 Hz) atribuído ao
hidrogênio H-3’; e a três ligações com os hidrogênios do grupo metila referentes
ao grupo acetoxila em
δ
CH
3
20,89 [2,10 (s)] (AcO-2’).
127
O hidrogênio de H-3’ apresenta uma correlação no espectro de HSQC
(Figura 100) com o sinal em
δ
C
69,83, o qual apresenta no espectro de HMBC
(Figura 103, p. 143) correlações a duas ligações com os sinais em
δ
H
4,87 (dd,
3,6; 10,4 Hz, H-2’), e
δ
H
5,08 (t, 9,9 Hz, H-4’), e a três ligações com os sinais em
δ
H
5,68 (d, 3,6 Hz, H-1’) e com os hidrogênios da metila do grupo acetoxila em δ
C
20,81 (s, 2,02; AcO-3’).
O hidrogênio H-4’ apresenta uma correlação no espectro de HSQC (Figura
100) com o sinal em
δ
C
68,42, que por sua vez apresenta correlação no espectro
de HMBC (Figura 103) a duas ligações com o sinal em
δ
H
5,08 (t, 9,9 Hz, H-3’), e
a três ligações com os hidrogênios do grupo acetoxila em
δ
C
20,52 (s, 2,04; AcO-
4’). Além disso, o hidrogênio H-4’
apresenta correlação no espectro de HMBC
(Figura 103) a duas ligações com o sinal em
δ
C
68,71; que por sua vez
correlaciona-se no espetro de HSQC (Figura 100) com o sinal em
δ
H
4,27 (H-5’),
e no espectro de HMBC (Figura 103) a duas ligações com os sinais em
δ
H
4,26 e
4,15 atribuídos aos dois hidrogênios H-6’, e a três ligações com os hidrogênios
em
δ
H
5,68 (d, 3,6 Hz, H-1’) e δ
H
5,44 (t, 9,9 Hz, H-3’).
Os hidrogênios 2H-6’ apresentam correlação no espectro de HSQC (Figura
100) com o sinal em
δ
C
61,96, que por sua vez apresenta correlação no espectro
de HMBC (Figura 103) a três ligações com o sinal em
δ
H
5,08 (t, 9,9 Hz, H-4’). Os
hidrogênios 2H-6’ ainda correlacionam-se a três ligações no espectro de HMBC
(Figura 103) com o sinal em
δ
C
21,68, referente ao átomo de carbono do grupo
metila, referente ao grupo acetoxila (AcO-6’). Esses dados confirmam a presença
de uma unidade glicopiranosila acetilada na molécula.
O hidrogênio H-1’ apresenta uma correlação no espectro de HMBC (Figura
103) a três ligações com o sinal em
δ
C
104,21, o qual por sua vez apresenta
correlações, a duas ligações com o sinal em
δ
H
4,17(s) atribuído aos dois
hidrogênios 2H-1, e a três ligações com o sinal
δ
H
5,37(t, 5,9 Hz) atribuído ao
hidrogênioH-4. Os hidrogênios 2H-1 apresentam correlação no espectro HSQC
(Figura 100) com o sinal em
δ
C
63,09, o qual apresenta uma correlação no
espectro de HMBC (Figura 103) a três ligações com o sinal em
δ
H
5,45 (d, 5,9 Hz,
H-3).
O hidrogênio H-3 correlaciona-se no espectro de HSQC (Figura 100) com
o sinal em
δ
C
75,93, o qual se correlaciona no espectro de HMBC (Figura 103) a
128
três ligações com o hidrogênio H-1, e com os hidrogênios do grupo metila de um
grupo carboxila em
δ
C
20,76 (s, 2,18; AcO-3).
O hidrogênio H-4 correlaciona-se no HSQC (Figura 100) com o sinal em
δ
C
75,22, o qual se correlaciona no HMBC a duas ligações com o multipleto em
δ
H
4,21, e a três ligações com os sinais em
δ
H
4,35 (dd, 11,7; 4,3 Hz) e 4,30 (dd,
11,9; 6,3 Hz) atribuídos aos hidrogênios 2H-6, e com os sinais referentes aos
hidrogênios do grupo metila do grupo acetoxila em
δ
C
20,78 (s, 2,11; AcO-4).
Os hidrogênios 2H-6 apresentam correlação HSQC (Figura 100) com o
sinal em
δ
C
63,85, o qual por sua vez apresenta correlação no espectro de HMBC
(Figura 103) a duas ligações com o multipleto em
δ
H
4,21 (H-5), e a três ligações
com o sinal triplo em
δ
H
5,37 (H-4).
Os dados descritos acima possibilitam definir a substância BR-29Ac como
um derivado acetilado (peracetilsucrose) da substância natural sucrose (α-D-
glicopiranosila-β-D-frutofuranosideo; BR-29).
129
Tabela 9: Dados de RMN
1
H (500 MHz) e
13
C (125 MHz) em CDCl
3
,
e as correlações
observadas nos espectros de HSQC e HMBC de BR-29Ac e comparação com valores de
literatura para o modelo Mo-1 (BREITMEIR, 1987).* Os valores das constantes de
acoplamento (
J) em Hz, estão entre parêntesis.
BR-29Ac
HSQC HMBC Mo-1
C
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
C
δ
H
2 104,21 - 2H-1 H-1’; H-4 104,4 -
AcO-1 170,95 - - -
AcO-3 169,89 - - -
AcO-4 179,10 - - -
AcO-6 170,70 - - -
AcO-2’ 170,32 - - -
AcO-3’ 170,25 - - -
AcO-4’ 169,72 - - -
AcO-6’ 170,77 - - -
CH
3 75,93 5,45(d,5,9) 2H-1; AcO-3 77,4 4,23
4 75,22 5,37(t,5,9) H-5 2H-6; AcO-4 75,0 4,26
5 79,32 4,21(m) 2H-6 82,2 3,70
1’ 90,15 5,68(d, 3,6) 92,9 5,41
2’ 70,51 4,87(dd, 3,6; 10,4) H-3’ AcO-2’ 72,0 3,51
3’ 69,83 5,44(t, 9,9) H-2’;H-4’ H-1’; AcO-3’ 73,6 3,76
4’ 68,42 5,08(t, 9,9) H-3’ AcO-4’ 70,2 3,48
5’ 68,71 4,27 H-4’;2H-6’ H-1’;H-3’ 73,3 3,84
CH
2
1 69,09 4,17(s) H-3 63,3 3,82
6 63,85 4,35(dd, 11,7; 4,3)
4,30(dd, 11,9;6,3)
H-5 H-4 63,4 3,82
6’ 61,96 4,26; 4,15 H-4’ 61,1 3,52
CH
3
AcO-1 20,85 2,12(s) 2H-1 - -
AcO-3 20,76 2,18(s) H-3 - -
AcO-4 20,78 2,11(s) H-4 - -
AcO-6 20,91 2,12(s) H-6 - -
AcO-2’ 20,89 2,10(s) H-2’ - -
AcO-3’ 20,81 2,02(s) H-3’ - -
AcO-4’ 20,52 2,04(s) H-4’ - -
AcO-6’ 21,68 2,10(s) 2H-6’ - -
130
Figura 90: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
131
Figura 91: Ampliação da região δ
H
5,7 a 4,8 do espectro de RMN
1
H (500 MHz) em
CDCl
3
de BR-29Ac
132
Figura 92: Ampliação da região δ
H
4,3 a 4,0 do espectro de RMN
1
H (500 MHz) em
CDCl
3
de BR-29Ac
133
Figura 93: Ampliação da região δ
H
2,3 a 2,0 do espectro de RMN
1
H (500 MHz) em
CDCl
3
de BR-29Ac
134
Figura 94: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-29Ac
135
Figura 95: Mapa de correlação
1
H-
1
H-NOESY em CDCl
3
de BR-29Ac
136
Figura 96: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-NOESY em CDCl
3
de BR-29Ac
137
Figura 97: Espectro de RMN
13
C (500 MHz) em CDCl
3
de BR-29Ac
138
Figura 98: Ampliação da região δ
C
80,0 a 60,0 do espectro de RMN
13
C (500 MHz) em
CDCl
3
de BR-29Ac
139
Figura 99: Ampliação da região δ
C
171,0 a 168,0 do espectro de RMN
13
C (500 MHz) em
CDCl
3
de BR-29Ac
140
Figura 100: Mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-29Ac
141
Figura 101: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-
29Ac
142
Figura 102: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-
29Ac
143
Figura 103: Mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-29Ac
144
Figura 104: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
145
Figura 105: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
146
Figura 106: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
147
Figura 107: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
148
Figura 108: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
149
Figura 109: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
150
Figura 110: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
29Ac
151
6.2.8 Identificação do derivado acetilado (BR-28Ac) da substância BR-28
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
AcO
AcO
AcO
OAc
OAc
BR-28Ac-a α
αα
α
BR-28Ac-b β
ββ
β
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
HO
HO
HO
OH
OH
BR-28 α
αα
α
BR-28 β
ββ
β
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
AcO
AcO
AcO
OAc
OAc
Mo-2 α
αα
α-glic
Mo-1 β
ββ
β-glic
A mistura de derivados acetilados (BR-28Ac) das substâncias BR-28 foi
obtida como derivados acetilados em piridina: anidrido acético (1:2; v/v) a partir de
uma fração do extrato metanólico da raiz de
Borreria verticillata, apresentando-se
sob a forma de sólidos amorfos.
A análise dos espectros de RMN
13
C e
1
H, HMBC e HSQC (Figuras 111 a
121, p. 153 a 163) das substâncias BR-28Ac mostrou-se muito semelhante à
unidade glicopiranosila acetilada da substância BR-29. Os espectros de RMN
1
H
apresentam sinais intensos na região de δ
H
2,18 a 2,00 relativos aos hidrogênios
metílicos dos grupos acetoxila de unidade glicopiranosidica peracetilada.
A presença dos cinco grupos acetoxila pode ser comprovada através dos
espectros de RMN
13
C que apresentaram um acúmulo de sinais referentes a
carbonos quaternários (C=O) de grupo acetoxila na região de
δ
C
170,82 a 168,97.
A mistura de unidades glicopiranosídicas acetiladas foi corroborada através
das correlações a uma ligação entre os hidrogênios em
δ
H
5,72 (d, 8,3 Hz),
relativo a um hidrogênio anomérico, com o átomo de carbono CH-1` (
δ
C
91,95)
(para BR-28Ac-b) e em
δ
H
6,33 (d, 3,6 Hz), relativo a um hidrogênio anomérico,
com o átomo de carbono CH-1` (
δ
C
89,31) (para BR-28Ac-a); e do átomo de
carbono metilênico CH-6` (
δ
C
61,70) com os dois sinais em δ
H
4,27 e 4,14 (para
BR-28Ac-b) e do átomo de carbono metilênico CH-6` (
δ
C
63,13) com os dois
sinais em
δ
H
4,40 e 4,25 (para BR-28Ac-a), todas observadas no espectro de
HSQC (Figura 119, p. 161). As demais correlações encontram-se sumarizadas
na Tabela 10, p. 152.
Os dados descritos acima em conjunto com os dados de literatura
(BREITMEIR,1987) e comparação com a substância BR-29Ac possibilitam definir
as substâncias BR-28Ac-b e BR-28Ac-a como derivados acetilados
152
(glicopiranose peracetilada) das substâncias naturais β-glicopiranose (BR-28 β
ββ
β) e
α-glicopiranose (BR-28 α
αα
α), respectivamente.
Tabela 10: Dados de RMN
1
H (500 MHz) e
13
C (125 MHz) em CDCl
3
,
e as correlações
observadas no espectro de HMQC de BR-28Ac e comparação com valores de literatura
para os modelos Mo-1 e Mo-2 (BREITMEIR, 1987).* Os valores das constantes de
acoplamento (
J) em Hz, estão entre parêntesis.
BR-28Ac-b BR-28Ac Mo-1 Mo-2
C
δ
C
δ
H
2
J
CH
3
J
CH
δ
C
δ
H
AcO-1’ 169,4 169,4 169,30 169,40
AcO-2’ 169,87
169,17
168,80 169,20
AcO-3’ 169,6 169,6 168,70 168,80
AcO-4’ 168,97
168,97
168,40 168,30
AcO-6’ 170,4 170,4 169,80 169,80
CH
1’ 91,95 5,72 (d, 8,3) 89,31 6,33 (d, 3,6) 91,30 88,60
2’ 70,48 5,15 65,15 5,12 70,00 68,90
3’ 72,97 5,26 (t, 9,4) 70,07 5,46 (t, 8,6) 72,30 69,50
4’ 68,01 5,14 67,76 5,14 67,60 67,70
5’ 73,03 3,84 (m) 70,07 4,17 72,30 69,50
CH
2
6’ 61,70 4,27; 4,14 63,13 4,40; 4,25 61,30 61,10
CH
3
AcO-1’ 20,93 2,18 (s) 20,93 2,18 (s) 19,90 20,30
AcO-2’ 20,93 2,12 (s) 20,93 2,12 (s) 19,90 19,80
AcO-3’ 20,93 2,04 (s) 20,93 2,04 (s) 19,90 19,80
AcO-4’ 20,93 2,05 (s) 20,93 2,05 (s) 19,90 19,80
AcO-6’ 20,67 2,10 (s) 20,67 2,10 (s) 19,80 19,30
153
Figura 111: Espectro de RMN
1
H (500 MHz) em CDCl
3
da substancias BR-28Ac α e β
154
Figura 112: Ampliação da região de δ
H
5,8 a 3,8 do espectro de RMN
1
H (500 MHz) de
BR-28Ac em CDCl
3
.
155
Figura 113: Ampliação da região de δ
H
5,8 a 3,8 do espectro de RMN
1
H (500 MHz) de
BR-28Ac em CDCl
3
156
Figura 114: Mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-28Ac
157
Figura 115: Ampliação do mapa de correlação
1
H-
1
H-COSY em CDCl
3
de BR-28Ac
158
Figura 116: Espectro de RMN
13
C (125 MHz) em CDCl
3
de BR-28Ac
159
Figura 117: Espectro de RMN
13
C (DEPT 135º 125 MHz) em CDCl
3
de BR-28Ac
160
Figura 118: Ampliação do espectro de RMN
13
C (DEPT 135º, 125 MHz) em CDCl
3
de
BR-28Ac
161
Figura 119: Mapas de correlação do espectro de HSQC em CDCl
3
de BR-28Ac
162
Figura 120: Mapas de correlação e ampliação do espectro de HMBC em CDCl
3
de BR-
28Ac
163
Figura 121: Ampliação do mapa de correlação do espectro de HMBC de BR-28Ac
164
6.3 Resultado do ensaio de toxicidade frente à Artemia salina (TAS)
Uma forma de complementar os estudos fitoquímicos é associá-los a
bioensaios, por esta razão muitos laboratórios de Produtos Naturais têm inserido
dentro de suas rotinas ensaios biológicos simples, no intuito de selecionar e
monitorar a pesquisa de extratos de plantas na procura de substâncias bioativas.
Dentre esses bioensaios, encontra-se a toxicidade sobre
Artemia salina
Leach, que é um microcrustáceo de água salgada comumente usado como
alimento para peixes. A simplicidade com que pode ser manuseado, a rapidez dos
ensaios e o baixo custo favorece a sua utilização rotineira em diversos estudos,
além do que, tais ensaios de letalidade são muito utilizados em análises
preliminares de toxicidade geral (LUNA, 2005).
Segundo Meyer et al. (1982), é possível estabelecer uma relação
entre o grau de toxicidade e a dose letal média, CL
50
, apresentada por extratos de
plantas sobre larvas de
A. salina. Considera-se então, que quando são verificados
valores acima 1000 µg/mL, estes, são considerados atóxicos, de outra maneira,
quanto menor a CL mais tóxico é o produto.
Os resultados obtidos para os ensaios de toxicidade com os extratos
metanólicos da raiz e do caule de
B. verticillata apresentaram valores de CL
50
superiores a 1000 µg/mL e, portanto, considerados atóxicos.
165
7. CONCLUSÃO
O reestudo da espécie
Borreria verticillata permitiu o isolamento e a
identificação de três novas substâncias juntamente com oito substâncias já
conhecidas. Foram isolados um novo iridóide e dois novos alcalóides dos extratos
metanólicos das raízes e caules, juntamente com os já conhecidos iridóides
asperulosideo e 6-
β
ββ
β-hidroxigeniposídeo, os esteróides estigmasterol, β
ββ
β-
sitosterol e campesterol; e as unidades de açúcar livre peracetilsucrose e
α
α α
α e β
β β
β.glicopiranose peracetilada.
O isolamento de iridóides correspondeu às expectativas para os
constituintes químicos da espécie. Sendo o iridóide asperulosideo o marcador
taxonômico da subfamília Rubioideae a qual pertence a espécie
B. verticillata.
A identificação de dois novos alcalóides corrobora para a presença desta
classe de metabólitos secundários na espécie.
Os extratos metanólicos da raiz e do caule de
B. verticillata testados quanto
a toxicidade frente a
Artemia salina mostraram baixa toxicidade com valores de
CL
50
acima de 1000 µg/mL.
166
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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