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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
SECRETOMA DA BACTÉRIA FITOPATOGÊNICA
Xanthomonas citri subsp. citri
Rafael Marini Ferreira
Biólogo
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
Novembro de 2009
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
SECRETOMA DA BACTÉRIA FITOPATOGÊNICA
Xanthomonas citri subsp. citri
Rafael Marini Ferreira
Orientador: Prof. Dr. Jesus Aparecido Ferro
Co-orientador: Prof. Dr. Julio Cezar Franco de Oliveira
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para a
obtenção do título de mestre em Agronomia (Genética e
Melhoramento de Plantas).
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
Novembro de 2009
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
RAFAEL MARINI FERREIRA – nascido em Monte Alto, SP no dia 04 de
maio de 1984, graduou-se em Ciências Biológicas (Modalidade Licenciatura e
Bacharelado) na Universidade Estadual Paulista ―Julio de Mesquita Filho‖ Campus
de Jaboticabal em 2005. Estagiou desde o primeiro semestre de 2002 até o
presente momento no Departamento de Tecnologia da Unesp de Jaboticabal,
atuando na área de pesquisas proteômicas em Xanthomonas citri subsp. citri.
Desenvolveu ainda o projeto nos anos de 2005 e 2006 intitulado ―Correlação entre
método de captura-recaptura e predação de ninhos artificiais para a estimativa
populacional de Didelphis albiventris‖ no Departamento de Zootecnia da Unesp de
Jaboticabal.
EPÍGRAFE
Não escreverei poemas, pois poemas tendem a cair no esquecimento como
sombras vazias. Nem tampouco me ligarei a versos para descrever seus olhares.
Não lembrarei de minha própria modéstia e da minha falta de palavras. Aqui só
será encontrado verdade e ciência para explicar meus atos e defeitos. Em minha
psique não consigo encontrar explicação plausível para o fascínio que seu olhar
gerou em mim em um primeiro momento, e o motivo de minha hipnose constante
por seu perfume desconheço.
Conheço mistérios profundos de interações entre moléculas, de partículas
longínquas da aurora dos tempos geradas pelo próprio universo. Mistérios
revelados sob a luz das estrelas diante de meus olhos. Aprendi a duvidar de tudo,
a questionar o dogma e a ser motivo de olhares desdenhosos sem me
envergonhar. E ainda assim, não aprendi a questionar sua repreensão e a viver
longe de ti.
Ah, o que eu daria para conhecer os segredos ainda intocados deste
universo... sacrificaria anos de minha vida, bens materiais, o tempo... mas não
perderia um minuto longe de você. Não consigo entender o porquê, e já tentei
experimentos em triplicata, repetições infinitas e testes estatísticos, e nada me deu
indícios de qual o tipo de energia que me liga a você. Contigo cada novo gesto
que observo em detalhes me extasia mais que descobertas de um prêmio Nobel.
Apenas não sei. Será magnetismo, ou outro tipo de interação forte e
desconhecida, que vaga pelas galáxias e ocasionalmente liga duas pessoas?
Como uma força intocável e paradoxal como Schrödinger descreveria.
Talvez a resposta esteja nas profundezas de gigantes adormecidos ou em
luzes aleatórias sem comprimentos de onda mensuráveis, não importa. Você
existe para meus olhos, e a eletricidade que sua imagem causa em meu cérebro é
o suficiente para que eu ignore qualquer sinal de resposta a quaisquer perguntas
fascinantes.
Um sábio postulou que a dor constante e infinita do homem é diretamente
proporcional a seu conhecimento em relação à toda filosofia e aos elementos a
que estamos todos submetidos. Um homem com tal dor pondera o suicídio em
algum lampejo de sua existência. Essa mesma dor me desperta em sonhos, me
atormenta no cotidiano, e encerra meu apetite. E ainda assim, uma despedida fria
de seus lábios é o que mais me faz desejar inconscientemente a morte. Isso não
explico, nem pondero e experimento, apenas sinto.
Em meu caminho derradeiro não há deus no horizonte, nem anjos e
espíritos em meu encalço, tudo que espero é sua presença e calor a meu lado. E
assim me sinto feliz.
Rafael Marini Ferreira – 29/05/09
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação principalmente a meus pais,
que me amaram, educaram e ampararam mesmo quando eu
acreditava não precisar. Dedico a meu irmão, meus grandes
amigos, meus colegas de trabalho e a todos cujos nomes não
preciso citar, pois sabem que são especiais para mim. Dedico
a meus professores, que me deram a oportunidade de mostrar
meu trabalho e a todos que direta ou indiretamente auxiliaram
no desenvolvimento do mesmo. Dedico a todos que acreditam
que o mundo deva ser moldado pela ciência e não pela
religião. Dedico ao amor da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Jesus Aparecido Ferro pela orientação e ao Professor
Doutor Julio Cezar Franco de Oliveira pela co-orientação.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela bolsa de mestrado concedida ao autor.
A FAPESP por parte do auxílio financeiro concedido a este trabalho.
Ao Professor Doutor Leandro Márcio Moreira e à Professora Doutora Maria
Teresa Marques Novo pelas correções e sugestões dedicadas a este trabalho.
A Professora Doutora Márcia Soares da UFRJ que tornou possível a
identificação das proteínas descritas nesta dissertação.
Ao Professor Doutor Jesus Aparecido Ferro e a Professora Doutora Maria
Inês Tiraboschi Ferro pela utilização do laboratório de bioquímica e biologia
molecular do departamento de Tecnologia da FCAV UNESP de Jaboticabal para a
realização dos experimentos e utilização dos reagentes.
Ao Professor Doutor João Martins Pizauro Júnior e ao Doutor João Carlos
Campanharo pelo auxílio na resolução de problemas relacionados à metodologia
de extração de proteínas da dissertação.
A Doutora Agda Paula Facincani pelos conselhos e atenção.
A Professora Doutora Márcia Justino Rossini Mutton pela utilização de
equipamentos necessários à realização de parte dos experimentos aqui descritos.
A todas as pessoas maravilhosas que trabalham no LBM pela amizade e
atenção.
vii
SUMÁRIO
Página
RESUMO............................................................................................................
viii
SUMMARY.........................................................................................................
ix
I. INTRODUÇÃO................................................................................................
10
II. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................
11
III. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................
18
III.1. Condições de cultivo...............................................................................
18
III.2. Centrifugação e filtração das amostras...................................................
19
III.3. Precipitação de proteínas e eletroforese SDS/PAGE.............................
20
III.4. Tripsinização das amostras e espectrometria de massas......................
21
III.5. Processamento dos espectros gerados e predição de peptídeo sinal....
22
IV. RESULTADO E DISCUSSÃO......................................................................
24
IV.1. Proteínas secretadas por Xac e seu mutante 02H02 sob condição
infectante............................................................................................................
30
IV.2. Proteínas secretadas exclusivamente por Xac sob condição
infectante............................................................................................................
34
V. CONCLUSÕES..............................................................................................
41
VI. REFERÊNCIAS…………………………………………………………………..
43
viii
SECRETOMA DA BACTÉRIA FITOPATOGÊNICA Xanthomonas citri subsp. citri
RESUMO - O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a
produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-
negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo
analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e
por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa
de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em
meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade
(genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela
ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de
massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos
os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas
proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são
exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no
02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas
em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio
de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas
pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu
mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do
hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores
de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração
em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando
a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas
diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no
interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em
Xanthomonas campestris.
Palavras-Chave: interação planta-patógeno, meio indutor de patogenicidade,
proteínas secretadas, proteoma cancro-cítrico, sistema de secreção tipo III
ix
Xanthomonas citri subsp. citri SECRETOME
SUMMARY - Citrus canker is among the major diseases which affect citrus
production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic
bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the
differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an
asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein
HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The
proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid
based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis
identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02,
of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14
proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the
TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria,
showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed
that several type II secretion system’s secreted proteins showed an active role in
host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system’s
proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced
by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the
inactivation of the type three secretion system’s pilus, showing the relationship of
this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted
by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer
membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris.
keywords: plant-pathogen interactions, pathogenicity inducing medium, secreted
proteins, citrus canker proteome, type III secretion system (TTSS)
10
I. INTRODUÇÃO
A citricultura é uma das mais importantes culturas especiais do planeta
(―specialty crop‖), com uma produção global de 50,9 milhões de toneladas de laranjas
frescas e 2,25 milhões de toneladas de suco concentrado nos anos de 2008 a 2009
(UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE, 2009). As principais áreas de
cultivo são encontradas nas Américas, no Mediterrâneo, no Sul e no Leste Asiático,
sendo que o Brasil lidera o ―ranking‖ de produção e exportação mundial, tanto de frutas
frescas como de suco concentrado (TALON & GMITTER, 2008).
O cancro cítrico está entre as principais doenças que representam uma grande
ameaça ao cultivo em larga escala de laranja (KOLLER et al., 1994; GOTTWALD et al.,
2002). No estado de São Paulo, que é o maior exportador de suco de laranja
processado do mundo e um dos maiores produtores de frutas frescas, a progressão do
cancro cítrico tem levado a um aumento significativo no número de focos da doença
nos últimos anos. O comércio mundial impõe restrições à importação de cítricos
originários de países ou regiões com cancro cítrico, sendo esta uma doença
quarentenária nos principais países produtores (GOTTWALD et al., 2002). Não existem
métodos de controle eficiente para este patógeno, nem mesmo variedades de citros
resistentes, logo o procedimento padrão para a eliminação da doença em talhões é a
erradicação do material contaminado e o controle através de pulverizações cúpricas
pouco eficientes. Dados do Fundo de Defesa da Citricultura registraram que de janeiro
a outubro de 2008, 165.397 plantas foram erradicadas em talhões e 49.753 em pomares
domésticos (FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA, 2009) apenas no estado de São
Paulo e ao sul do triângulo mineiro, o que indica a forte presença da doença nos pomares
comerciais da região sudeste.
11
II. REVISÃO DE LITERATURA
O agente etiológico do cancro cítrico é a bactéria fitopatogênica gram-negativa
Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). Uma vez depositada sobre a planta cítrica, o
patógeno penetra nos tecidos jovens por meio de aberturas naturais, tais como
estômatos e hidatódios, ou por meio de ferimentos em tecidos maduros (BROWN,
2001). Os sintomas do cancro cítrico são verificados nas folhas (em ambos os lados),
ramos e frutos como lesões circulares, corticosas, eruptivas, de coloração parda e
circundadas por um halo amarelo (KOLLER et al., 1993). A doença em estágio
avançado é capaz de intensa desfolha, depreciação e queda de frutos. Um sintoma
característico e essencial para o diagnóstico do cancro cítrico é a indução da formação
de tecido hiperplásico, causado por divisões mitóticas excessivas que resulta em lesões
do tipo cancro. A hiperplasia é resultado da atividade do gene pthA da bactéria, que
gera uma proteína de sinalização de divisão celular, que é secretada através do
sistema de secreção tipo III (SSTT) do patógeno e causa divisões celulares excessivas
no hospedeiro (BRUNINGS & GABRIEL, 2003). Além desses fatores, um desequilíbrio
hormonal provocado pela produção excessiva de etileno pela planta, ocasiona a queda
prematura do fruto, ainda não suficientemente maduro (CROZIER et al., 2001). Essa
característica torna os frutos impróprios tanto para a produção de suco concentrado
como para o mercado de frutas frescas, gerando grandes prejuízos para os produtores.
A análise do perfil de proteínas sintetizadas num determinado momento celular
pelo patógeno pode possibilitar uma melhor correlação entre as alterações de fenótipo
observadas no hospedeiro em função das ações de Xac em diferentes situações, já que
não se verifica uma boa correlação entre a abundância de RNA mensageiro produzido
e a quantidade de proteínas existentes na célula (GREENBAUM et al., 2003), tornando
as análises proteômicas mais fidedignas que análises transcriptômicas ou genéticas
quanto à identificação de agentes efetivos da ação biológica em questão.
A análise de proteínas diferencialmente expressas tem sido utilizada em E. coli,
Bacillus subtilis, Listeria, Pseudomonas aeruginosa e Sclerotinia sclerotiorum para a
12
identificação de proteínas induzidas por respostas adaptativas devido a variações
ambientais, principalmente à temperatura e estresse (YURA et al., 1993; JONES &
INOUYE, 1994; VOLKER et al., 1994; NOUWENS et al., 2003; YAJIMA & KAV, 2006).
A análise do genoma através das proteínas expressas leva à obtenção de
informações importantes sobre a regulação gênica e à expressão de proteínas e
modificações pós-traducionais (JUNGBLUT & WITTMAN-LIEBOLD, 1995). O interesse
no estudo de proteomas tem aumentado recentemente com o aumento de sequências
disponíveis resultantes de análises de seqüenciamento de genomas, devido à
modernização dos métodos de detecção e quantificação de proteínas e ao fato de que
os pesquisadores podem trabalhar diretamente com os agentes da ação biológica.
Porém a análise das proteínas presentes dentro da bactéria não engloba aquelas
secretadas pelo patógeno quando em contato com o hospedeiro.
As proteínas secretadas por bactérias são conhecidas por várias funções
importantes, tais como provisão de nutrientes, comunicação célula-célula, detoxificação
do meio e a inibição de potenciais competidores. De um modo mais específico, as
proteínas extracelulares de bactérias patogênicas desempenham um papel crítico na
virulência do organismo (JUNGBLUT et al., 1999; LEI et al., 2000; ROSENKRANDS et
al., 2000; GHOSH, 2004; GOTTIG et al., 2009).
A patogenicidade de Xac deve-se principalmente à sua capacidade de
colonização do hospedeiro e subsequente produção e secreção de enzimas e proteínas
que degradam constituintes da parede celular do hospedeiro para penetrar nas células
causando danos à planta. Tais enzimas de degradação, quando em conjunto com os
diversos sistemas de secreção de toxinas e proteínas de virulência/avirulência
presentes no patógeno, estruturas de adesão bacteriana e enzimas com capacidade de
neutralizar espécies ativas de oxigênio geradas pela planta hospedeira, são capazes de
desenvolver a patogênese, apesar dos esforços da planta hospedeira em combater a
infecção (KAZEMI-POUR et al., 2004). É importante frisar que grande parte destas
características são conservadas em bactérias gram-negativas (BUTTNER & BONAS,
2002).
13
O estudo do secretoma de um organismo consiste na análise das proteínas que
este organismo produz e secreta para o exterior da célula em resposta a uma variação
ambiental. Diversos estudos têm sido realizados utilizando-se a técnica do secretoma,
tanto em procariotos como em eucariotos, com o objetivo de se identificar as proteínas
secretadas por patógenos quando na presença de seu hospedeiro. KAZEMI-POUR e
colaboradores (2004) desenvolveram um estudo de modo a criar um mapa de
referência de proteínas secretadas da bactéria Erwinia chrysanthemi, que tal como a
Xac, é capaz de produzir e secretar enzimas que degradam constituintes da parede
celular do hospedeiro. O estudo demonstrou diversas proteínas relacionadas a vários
sistemas de secreção, que só eram secretadas quando em contato com indutores
específicos presentes em extrato de folhas do vegetal. WATT e colaboradores (2004)
estudaram o perfil de proteínas extracelulares secretadas em Xanthomonas campestris
pv. campestris, e obtiveram como resultado 97 proteínas presentes em géis
bidimensionais (2D), e dentre elas, 11 proteínas eram enzimas degradativas
diretamente envolvidas na patogenicidade da bactéria em questão. Pode-se citar ainda
o estudo de YAJIMA & KAV (2006) que detectou 52 proteínas secretadas em géis 2D
pelo fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum, dentre as quais 18 foram
identificadas por espectrometria de massas, sendo que dentre estas os autores
encontraram algumas proteínas que não haviam sido encontradas anteriormente por
estudos de ESTs (Expressed Sequence Tags) e que possivelmente possuem um papel
importante no desenvolvimento do organismo no hospedeiro.
Assim como outras bactérias gram-negativas patogênicas de animais ou plantas,
a Xac possui um sistema secretório especializado na injeção de proteínas essenciais
para os processos de patogenicidade e virulência diretamente no citoplasma de células
vegetais infectadas pelo patógeno. Este aparato, denominado sistema de secreção tipo
III ou SSTT é conservado entre bactérias patogênicas de plantas e de hospedeiros
animais (HUECK, 1998; CORNELIS & VAN GIJSEGEM, 2000; YEN et al, 2007). Em
bactérias fitopatogênicas, o SSTT é codificado por um agrupamento de genes
classificados como hrp (Hypersensitive Response And Pathogenicity), os quais são
essenciais para a patogenicidade e consequente multiplicação bacteriana no
14
hospedeiro, desencadeando sintomas típicos nas respectivas plantas suscetíveis
(ALFANO & COLLMER, 1997). Além das proteínas estruturais que compõe o duto
secretório propriamente dito, este composto por uma estrutura basal e um pilus,
conservados entre as diferentes espécies de patógenos, os genes do SSTT codificam
ainda proteínas efetoras de virulência, muitas vezes espécie específicas, secretadas
através deste sistema.
Estudos com mutantes de Xac empreendidos por nosso grupo, utilizando uma
biblioteca de mutantes produzida por mutagênese aleatória através da inserção de
transposon TN:KAN, permitiram a identificação de vários genes que podem estar
associados com a virulência da Xac. Dentre estes um mutante não patogênico de Xac
cujo gene nocauteado codifica para uma proteína do SSTT (LAIA et al., 2009) foi
selecionado. A ORF (Open Read Frame) XAC0410 nocauteada codifica a proteína
HrpB4, uma provável proteína de membrana interna presente na estrutura do pilus, que
no entanto não possui peptídeo sinal e nem é predita como secretada por vias não
clássicas de secreção. O caráter essencial para a patogenicidade e virulência do SSTT
é comprovado pelo mutante dessa ORF XAC0410 (02H02), o qual não é capaz de
crescer in planta, mas se desenvolve normalmente em meios de cultura ricos. O
nocaute da proteína HrpB4 parece inativar o SSTT, ou seja, a translocação de efetores
de virulência da bactéria diretamente para o citoplasma da célula vegetal hospedeira,
efeito este refletido na ausência de sintomas de cancro em plantas suscetíveis
inoculadas com o mutante 02H02 e na incapacidade do mutante em multiplicar-se no
hospedeiro. WEBER et al. (2005) empreendeu um estudo em Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria, e chegou à conclusão de que não só este patógeno possui um SSTT
funcional, como qualquer alteração nos genes hrp e hrc (Hypersensitive Response
Conserved) (com excessão de hrpF) resultava em um mutante que não utilizava o pilus
do SSTT, e que não era capaz de secretar quaisquer proteínas relacionadas ao SSTT.
O fato de que um mutante para o gene hrpB4 em Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria também não utilizava o pilus reforça a teoria de que o mutante de Xac com o
gene hrpB4 interrompido (02H02) também não foi capaz de utilizar o pilus do SSTT, e
desta maneira não foi capaz de injetar efetores protéicos no citoplasma das células do
15
hospedeiro através da parede celular, explicando deste modo a ausência de sintomas
do mutante 02H02 quando inoculado no hospedeiro cítrico.
A Xac possui ainda outro sistema de secreção de proteínas altamente
conservado em bactérias gram-negativas, denominado sistema de secreção tipo II
(SSTD) (Figura 1). A secreção através desse sistema ocorre em dois passos: a
maquinaria Sec (Sistema Secretório Geral Conservado) exporta as proteínas possuindo
o peptídeo sinal através da membrana interna de bactérias gram-negativas e as
proteínas do SSTD as secretam através da membrana externa. Os sistemas
bacterianos do tipo II secretam diversos tipos de proteínas, tais como celulases, pectato
liases, toxinas, proteases e alcalino fosfatases (BRUNINGS & GABRIEL, 2003), as
quais desempenham um papel importante na patogenicidade de bactérias gram-
negativas. Esse sistema é mais conhecido por sua importância na patogenicidade de
organismos como Erwinia chrysanthemi, que causa a podridão-mole em diversas
plantas através da secreção de uma bateria de enzimas degradadoras da parede
celular (KAZEMI-POUR et al., 2004). Porém, estudos recentes demonstram que a Xac
não só possui genes preditos para a secreção via SSTD, como de fato secreta
celulases ativas que são responsáveis por degradar a parede celular do hospedeiro
cítrico (BAPTISTA, 2006). Essa característica, apesar de não ser imprescindível para o
desenvolvimento da doença, possui um papel importante na patogênese, de modo que
mutantes que tiveram interrompidos genes para celulases do SSTD, apresentaram
sintomas atenuados de cancrose quando comparados à bactéria selvagem (BAPTISTA,
2006). WANG e colaboradores (2008) citam que algumas proteínas do SSTD são
diretamente controladas pelos genes hrpX e hrpG, que são controladores do SSTT,
demonstrando que ocorre interação entre esses dois sistemas.
É importante ressaltar um último sistema que pode ter importância para a
patogenicidade de Xac: o Sistema de Secreção Tipo IV (SSTQ). Esse sistema é similar
ao encontrado em A. tumifaciens codificado pelos genes virB/D, os quais codificam
proteínas que formam uma estrutura que injeta proteínas ligadas a DNA no interior do
hospedeiro. A função dessa estrutura em bactérias gram-negativas não é bem
16
conhecida, mas sabe-se que esse sistema é importante para a conjugação bacteriana e
colonização do hospedeiro no caso de A. tumifaciens (FRONZES et al., 2009).
Figura 1. Representação esquemática dos diversos sistemas de secreção presentes em bactérias gram-
negativas, divididos por linha tracejada, à esquerda como sistemas dependentes de sec e à
direita como sistemas independentes de sec. OM: membrana externa, IM: membrana interna.
Adaptado de FRONZES et al., 2009.
Devido à dificuldade de se recuperar proteínas secretadas pelo patógeno e seu
mutante quando inoculados in vivo, optou-se pela utilização de dois meios de cultura
diferentes para análises in-vitro: o meio de cultura rico em nutrientes denominado Caldo
Nutritivo (CN) e o meio definido XAM1 indutor de genes hrp, que mimetiza o contato
inicial da bactéria com a planta hospedeira, e permite a extração das proteínas
secretadas para posterior identificação.
O meio de cultura XVM2 é sabidamente um meio indutor de patogenicidade em
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, pelo fato de mimetizar as condições
encontradas nos espaços apoplásticos da planta hospedeira, induzindo a síntese de
genes ligados ao SSTT, como hrp (WENGELNIK et al.,1996). O meio indutor XAM1
17
corresponde ao meio XVM2 com modificações que o tornam mais adaptado para
indução de virulência em Xac. Tal fato obteve comprovação experimental para o
fitopatógeno Xac por CARVALHO (2006) e FACINCANI (2007).
A estratégia utilizada para a detecção das proteínas secretadas nas diferentes
condições no presente estudo é denominada MudPIT (Tecnologia multidimensional de
identificação de proteínas), e consiste da separação de extrato protéico complexo
tripsinizado por cromatografia líquida de fase reversa seguida de identificação por
espectrometria de massas, de peptídeos que compõe o extrato. Esta tecnologia é
« livre de gel » pois abole a necessidade de fracionamento do extrato por eletroforese
bidimensional (2D) em gél de poliacrilamida. É também mais sensível que a estratégia
2D mas não possibilita uma quantificação de variações de expressão de maneira tão
precisa quanto esta técnica. A estratégia de MudPIT foi descrita pela primeira vez por
WASHBURN et al. (2001) que identificou 1486 proteínas (24% do genoma) de levedura.
Dois anos depois, PENG et al (2003) usando a mesma estratégia encontraram 1504
proteínas (25%) na análise do proteoma do mesmo organismo. KOLKER et al (2003),
ao analisar o proteoma do microorganismo Haemophilus influenzae identificaram 414
proteínas (25% do genoma). XIA et al. (2008) analisaram o proteoma do patógeno
Toxoplasma gondii, identificando 2.252 proteínas de um total de 8.000 ORFs anotadas
no genoma do organismo (28,1% do genoma).
A análise de proteínas secretadas pelo patógeno constitui-se em uma poderosa
ferramenta para o acúmulo de conhecimentos que possam guiar o estabelecimento de
novas estratégias de combate ao cancro cítrico e para o desenho de drogas de ação
específica sobre o patógeno, capazes de associar o controle racional do cancro cítrico a
ganhos de produtividade e minimização do impacto ambiental.
O estudo do secretoma do fitopatógeno proposto neste trabalho visou repertoriar
a secreção de proteínas no meio de cultura rico não indutor CN (caldo nutriente) e no
meio indutor de virulência XAM1, pela Xac selvagem (patogênica) e pelo mutante
02H02 defectivo para o SSTT de Xac (não-patogênico), com o objetivo de identificar as
proteínas que deixaram de ser secretadas pelo mutante 02H02, quando comparado
com as proteínas secretadas pela Xac selvagem, em meio de cultura indutor.
18
III. MATERIAL E MÉTODOS
III.1. Condições de cultivo.
A bactéria Xac estirpe 306 e seu mutante 02H02 foram mantidas sempre em
estoques de tampão fosfato à temperatura ambiente, sendo utilizadas conforme a
necessidade. As mesmas bactérias foram cultivadas em meio de cultura sólido PSA
anteriormente ao pré-inóculo. Todas as culturas de manutenção foram mantidas a 25ºC,
com a adição de Canamicina 100 µg/mL para meios de cultura sólidos e 50 µg/mL para
meios de cultura líquidos, no caso de culturas do mutante 02H02.
A Xac selvagem e o mutante 02H02 foram cultivados primeiramente em um pré-
inóculo de 15 mL de meio líquido CN (Caldo nutriente - composto por 5 g/L de peptona;
3 g/L de extrato de carne dissolvidos em água destilada), independente do meio de
cultura a ser utilizado para o inóculo. O pré-inóculo foi cultivado (200 rpm, 28ºC) até
que as culturas atingissem a fase de crescimento logarítmico da bactéria (D.O.
600nm
=
1), quando foi então centrifugado a 3100 g por 15 minutos, o sobrenadante foi
descartado, e o precipitado bacteriano foi lavado em água bidestilada autoclavada e
ressuspendido no meio de cultura desejado. Tanto o fitopatógeno selvagem quanto o
mutante foram então cultivados em 500 mL de meio de cultura CN (200 rpm, 28ºC) até
que o cultivo alcançasse uma densidade ótica a 600nm (D.O.
600nm
),
de no máximo 1,4,
de modo que a bactéria encontrava-se ainda em fase logarítmica de crescimento,
evitando desse modo proteínas resultantes de lise celular liberadas no meio de cultura
e gerando assim um perfil acurado de proteínas secretadas (WATT et al., 2004). O meio
indutor de patogenicidade utilizado foi o XAM1, que é um meio sabidamente indutor de
genes hrp. Neste caso foram utilizados 2 L (4x 500 mL) deste meio para cada bactéria.
O XAM1 é composto de 7,5 mM (NH
4
)
2
SO
4
, 33 mM KH
2
PO
4
, 60 mM K
2
HPO
4
, 1,7 mM
citrato de sódio (C
6
H
5
Na
3
O
7
. 2 H
2
O), 0,9 mM MgSO
4
, 9,9 mM frutose, 9,9 mM sacarose
e 0,03% de Casaminoácidos (caseína hidrolisada) em uma solução de água destilada
com pH final igual a 5,4. A este meio XAM1 não foi adicionado BSA (soroalbumina
19
bovina), já que esta proteína impossibilitava a obtenção das proteínas secretadas pelo
patógeno. A temperatura foi mantida constante em 28ºC e sob agitação a 200 RPM até
que o cultivo alcançasse uma densidade ótica D.O.
600
de no máximo 0,57, de modo que
a bactéria encontrava-se ainda em fase log. de crescimento.
A Xac selvagem foi cultivada por 16 horas em meio de cultura líquido CN,
alcançando uma D.O.
600
igual a 1,0. O mutante 02H02, cultivado no mesmo meio de
cultura por 23 horas, alcançou uma D.O.
600
equivalente a 1,4. A Xac selvagem e o
mutante 02H02 foram cultivados ainda em meio indutor líquido XAM1 por 24 horas,
equivalente aos estágios iniciais de infecção in vivo. A bactéria selvagem alcançou uma
D.O.
600
igual a 0,57 e o mutante alcançou uma D.O.
600
igual a 0,24. A diferença de
crescimento bacteriano entre os meios de cultura CN e XAM1 se deve ao fato de que o
primeiro é um meio rico em nutrientes, e o segundo é um meio definido. Não foi
possível chegar a uma D.O. maior que 0,57 e 0,24 quando a Xac e o mutante foram
cultivados em meio XAM1, respectivamente, mesmo que o período de cultivo fosse
maior que 24 horas. Desse modo optou-se por manter um tempo de cultivo (24 horas)
correspondente a um estágio inicial de infecção, onde foi alcançado a maior quantidade
possível de células mantendo-se a integridade estrutural das mesmas.
III.2. Centrifugação e filtração das amostras.
As culturas foram centrifugadas em duas etapas de 60 minutos: na primeira
etapa as amostras foram centrifugadas a 3.100 g, o sedimentado bacteriano foi
descartado e o sobrenadante contendo as proteínas secretadas foi transferido para
tubos limpos; na segunda etapa as mesmas amostras foram centrifugadas a 11.000 g e
novamente o sobrenadante foi recuperado e o precipitado bacteriano descartado.
Ambas as etapas de centrifugação ocorreram a uma temperatura de 4 ºC. No caso das
bactérias (Xac e 02H02) cultivadas em meio líquido CN, o sobrenadante foi recuperado
e então filtrado logo em seguida à segunda centrifugação através de uma membrana de
nitrocelulose (Millipore
TM
) com poros de 0,2 μm, de modo a remover eventuais bactérias
residuais não retiradas durante a centrifugação.
20
Já para as bactérias cultivadas em meio definido XAM1, a filtração do
sobrenadante não foi possível, devido a uma produção em grande quantidade do que
se acredita ser goma xantana, que entupia a membrana de nitrocelulose, impedindo a
filtração. Todas as amostras foram então congeladas sob a ação de nitrogênio líquido e
liofilizadas até a completa secagem. Cada amostra seca correspondente a 500 mL de
sobrenadante foi ressuspendida em 50 mL de água bidestilada autoclavada.
Neste ponto, apenas as amostras cultivadas em meio XAM1 foram submetidas à
ação de álcool etílico absoluto 3:1 (150 mL de álcool para 50 mL de amostra
ressuspendida em água) à 30ºC e centrifugadas a 3.000 g durante 5 minutos. Esse
processo precipitava grande parte da goma xantana que impedia a filtração do
sobrenadante e a temperatura utilizada minimizava perdas de proteínas que pudessem
sofrer precipitação. Só então as amostras Xac e 02H02 cultivadas em XAM1 foram
filtradas através da membrana de 0,22 µm e foram novamente liofilizadas até completa
secagem e ressuspendidas em 50 mL de água bidestilada autoclavada.
III.3. Precipitação de proteínas e eletroforese SDS/PAGE.
As proteínas foram precipitadas com Ácido Tricloroacético (TCA) utilizando o
protocolo descrito por HIROSE et al. (2000) com modificações. Esse método consistiu
em adicionar uma concentração final por amostra ressuspendida de 10% de TCA,
misturando vigorosamente cada amostra e deixando descansar durante 16 horas a uma
temperatura de 4ºC. Em seguida procedia-se à centrifugação a 20.000 g durante 20
minutos a uma temperatura de 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
lavado três vezes com metanol absoluto a -20 ºC para remover resíduos de TCA. O
precipitado protéico foi então liofilizado até completa secagem e armazenado em
alíquotas de 100 mg por tubo do tipo ―eppendorf‖.
Essas alíquotas liofilizadas foram dissolvidas em tampão de amostra e
submetidas à eletroforese SDS/PAGE em gel 12,5% (LAEMMLI, 1970) para verificar a
presença de proteínas e permitir a normatização entre as amostras que seguiriam para
a cromatografia de fase reversa e finalmente para a espectrometria de massas.
21
III.4. Tripsinização das amostras e espectrometria de massas.
Cada uma das alíquotas foram ressuspendidas em tampão 25 mM NH
4
HCO
3
,
500 mM de Uréia, pH 8.0. As proteínas foram reduzidas adicionando-se 1µg de DTT
para cada 50 µg de proteínas e incubadas durante 1 hora a 37°C. As proteínas foram
alquiladas, através da adição de 5 µg de iodoacetamida para cada 50 µg de proteína e
incubadas à temperatura ambiente no escuro por 1 hora, e finalmente foram
tripsinizadas adicionando-se 20 µg da enzima tripsina modificada de grau de
seqüenciamento da Promega (Madison. EUA) (1:50) durante 20 horas a uma
temperatura de 37°C. A reação de hidrólise foi interrompida através da adição de 2 µL
de ácido fórmico.
As amostras foram carregadas no sistema de cromatografia capilar Waters®
nanoACQUITY UPLC® System (Waters, Milford, MA). As proteínas digeridas foram
desalinizadas ―on line‖ usando a coluna Opti-Pak C18 trap Waters. O volume da
amostra injetada foi de 10 µL e a cromatografia líquida foi realizada numa coluna de
fase reversa Ease C18 150 mm × 2,1 mm (Waters, Milford, MA) com eluição em 0,3
µL/min, usando um gradiente linear variando de 5 a 50% de acetonitrila contendo 0,1%
de ácido fórmico.
O sistema de cromatografia líquida capilar (nLC) estava acoplado ao
espectrômetro de massas com fonte de ionização eletrospray ESI com analisadores
quadrupolo/tempo de vôo em série (Q-Tof Micro da Waters, Milford, MA) (UPLC-
MS/MS), o que permitiu a análise direta dos peptídeos eluídos através do gradiente de
acetonitrila no Q-Tof. Para a formação do ―spray‖, foi aplicada no capilar uma voltagem
de 3000 v e a temperatura foi de 80
o
C. O controle do instrumento e a aquisição dos
dados foram realizados pelo sistema de dados MassLynx (Versão 4.1, Waters) e os
experimentos foram executados pela varredura da razão massa/carga (m/z) de 200 a
2000 usando um tempo de varredura de 1 segundo, aplicado durante todo o processo
cromatográfico. Os espectros de massa correspondentes a cada sinal do total de
cromatogramas de íons correntes (TIC) tiveram suas médias calculadas, permitindo
uma determinação acurada da massa molecular
22
Os valores exatos das massas foram obtidos usando-se uma fonte LockSpray
TM
(Waters, Milford, MA). Este sistema consiste de uma segunda fonte de ESI que injeta
uma substância de massa conhecida a cada 5 segundos. Essa massa de referência foi
usada para corrigir a massa do analito (amostra) durante toda a corrida. A referência
usada neste estudo foi o íon m/z 588.8692 do ácido fosfórico.
A aquisição de dados dependentes do MS/MS foram executados em precursores
com estados de carga de 2 ou 3 sobre um levantamento de amplitude m/z de 50-2000 e
um intervalo abaixo de 2 m/z. No máximo 3 íons foram selecionados para MS/MS de
uma única análise MS. As massas apresentadas de Na
+
e K
+
foram automaticamente
excluídas. Os espectros de MS/MS de dissociação excluídos por colisão (CID) foram
obtidos usando argônio como o gás de colisão a uma pressão de 13 PSI e a voltagem
de colisão variando entre 18 e 45 volts, dependendo da massa do precursor. A razão de
escaneamento foi de 1 segundo.
III.5. Processamento dos espectros gerados e predição de peptídeo sinal.
Todos os dados foram processados usando o servidor Global ProteinLynx
(versão 2.0, Waters). O processamento inclui a correção automática dos valores de m/z
dos espectros MS e MS/MS segundo a massa do íon de referência do ―lock spray‖.
A identificação das proteínas foi feita a partir do banco de dados da Xac através
do programa MASCOT (Version: 2.2.1 - Licensed to Brazilian Synchrotron Light
Laboratory). Na pesquisa foram usados os valores de massas monoisotópicos dos
espectros MS/MS (MS/MS Ion Search), considerando carbamidometilação das cisteínas
como modificações fixas e oxidação da metionina como modificação variável. Na
hidrólise, por tripsina, foi considerada a possível perda de um sítio de clivagem e a
tolerância das massas dos peptídeos e dos fragmentos foi de ± 0,05 Da.
As sequências de aminoácidos das proteínas identificadas foram submetidas à
ferramenta de bioinformática PrediSi (PREDIction of SIgnalpeptides), que é capaz de
23
prever através de algoritmos matemáticos a presença e posição de clivagem do
peptídeo sinal e determinar, com exatidão, se a proteína em questão é de fato uma
proteína secretada (HILLER et al., 2004). O peptídeo sinal presente no N-terminal das
proteínas determina se elas serão secretadas através da via sec e uma vez fora da
membrana celular, esses peptídeos são clivados por uma peptidase sinal extracelular.
O fato de uma proteína não possuir o peptídeo sinal para sec, não significa que esta
não seja secretada por outro sistema. As proteínas detectadas neste trabalho que não
possuíam o peptídeo sinal para a via de secreção geral tiveram suas sequências de
aminoácidos submetidas à ferramenta de bioinformática SecretomeP 2.0, disponível no
endereço eletrônico <http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/>. Esta ferramenta é
baseada em vias não clássicas de secreção bacteriana descritas extensivamente na
literatura (BENDTSEN et al., 2005), e atribui um valor de 0 até 1,0 para a sequência
submetida, de modo que sequências que atingem valores acima de 0,5 são
consideradas proteínas secretadas de forma não clássica, ou seja, não possuem um
peptídeo sinal, mas ainda assim estão presentes no periplasma e no meio extracelular.
As comparações entre proteínas de organismos diferentes foram feitas baseadas
na ferramenta de bioinformática BLASTp disponível no site
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
24
IV. RESULTADO E DISCUSSÃO
Foram identificadas no total 55 proteínas diferentes secretadas para as quatro
condições propostas. 37 destas proteínas possuem o peptídeo sinal responsável pelo
transporte através da membrana interna da célula (sec) predito pelo software PrediSi e
18 não o possuem, porém apenas 5 destas proteínas foram consideradas como não
secretadas pela ferramenta de bioinformática SecretomeP 2.0 (Tabela 1).
Todas as proteínas consideradas secretadas neste trabalho, que não possuem
um peptídeo sinal para sec obtiveram valores entre 0,9 e 1,0 na ferramenta
SecretomeP 2.0, já descrita no Material e Métodos.
Tabela 1. Proteínas secretadas por Xac e seu mutante 02H02 cultivadas em meio de cultura CN e em
meio de cultura indutor de patogenicidade XAM1, identificadas por espectrometria de massas.
Em preto encontram-se as proteínas secretadas por Xac e pelo 02H02 em condições individuais
de cultivo ou secretadas de modo comum em todas as condições. Em verde encontram-se as
proteínas comuns secretadas por Xac e seu mutante 02H02 sob condição infectante. Em
vermelho encontram-se as proteínas que deixaram de ser secretadas em condição de indução
de patogenicidade e virulência, pelo mutante do sistema tipo III. As proteínas marcadas em
negrito são aquelas que serão descritas no decorrer deste trabalho.
25
Nº ORF
Categoria
Bactéria e meio de cultura
Peptídeo
02H02
CN
Xac
CN
02H02
XAM1
Xac
XAM1
Sinal sec
XAC0753
VIII
+
+
-
-
+
XAC0868
VIII
+
+
+
+
+
XAC2992
III
+
+
-
+
+
XAC0798
I
+
-
-
-
+
XAC2763
III
+
-
-
+
+
XAC0542
III
+
+
-
-
-
XAC3354
IV
+
-
-
+
+
XAC3545
III
+
-
-
-
+
XAC4199
I
+
-
+
+
-*
XAC3514
III
+
+
-
-
+
XAC1012
IV
+
+
-
-
+
XAC1349
III
+
-
-
-
+
XAC1550
III
+
-
-
-
-*
XAC2665
IV
-
+
-
-
+
XAC0957
III
-
+
-
+
-
XAC1975
V
-
+
-
-
-*
XAC3314
VIII
-
+
-
-
-*
XAC1974
V
-
+
-
-
-*
XACb0007
IV
-
-
+
-
+
XAC0223
VIII
-
-
+
+
+
XAC1466
IV
-
-
+
+
+
XAC2853
III
-
-
+
+
+
XAC2504
VII
-
-
+
+
-*
XAC1113
IV
-
-
+
+
-*
XAC4344
III
-
-
+
-
+
XAC2562
VIII
-
-
+
+
+
XAC3664
IV
-
-
+
-
+
XAC0677
VIII
-
-
+
+
+
XAC3141
IV
-
-
+
+
-*
XAC0552
III
-
-
+
+
+
XAC1761
VIII
-
-
+
-
+
XAC0661
VII
-
-
+
+
+
XAC2781
III
-
-
+
-
-
XAC0541
III
-
-
+
-
-*
XAC3647
II
-
-
+
+
+
XAC1479
IV
-
-
+
-
+
XAC0232
VIII
-
-
+
+
-*
XAC1585
III
-
-
+
+
+
XAC4342
VII
-
-
+
-
+
* Proteínas secretadas por vias não clássicas preditas pelo software SecretomeP 2.0.
26
Tabela 1. Continuação.
Nº ORF
Proteína
Categoria
Bactéria e meio de cultura
Peptídeo
02H02
CN
Xac CN
02H02
XAM1
Xac
XAM1
Sinal sec
XAC2328
Proteína de membrana
de biogênese do
citocromo tipo C CycK
I
-
-
+
-
+
XAC0645
Aminopeptidase PepN
III
-
-
+
-
-*
XAC3472
Porina O seletiva para
polifosfato OprO
IV
-
-
-
+
+
XAC0678
Hipotética
Conservada
VIII
-
-
-
+
+
XAC3605
Proteína de Membrana
Externa UptE
IV
-
-
-
+
+
XAC0435
Proteína VirK
VII
-
-
-
+
+
XAC0974
Proteína Ribossomal
L23 50S RplW
III
-
-
-
+
-*
XAC1497
Hipotética
VIII
-
-
-
+
+
XAC0029
Celulase Egl
VII
-
-
-
+
+
XAC1081
Proteína do tipo
Histona
III
-
-
-
+
-*
XAC0989
Proteína Ribossomal
S5 30S
III
-
-
-
+
-
XAC3380
Hipotética
VIII
-
-
-
+
+
XAC0028
Celulase Egl
VII
-
-
-
+
+
XAC2682
Hipotética Conservada
VIII
-
-
-
+
+
XAC0612
Celulase EngXCA
VII
-
-
-
+
+
XAC0988
Proteína Ribossomal
L18 50S RplR
III
-
-
-
+
-
* Proteínas secretadas por vias não clássicas preditas pelo software SecretomeP 2.0.
27
As 55 proteínas identificadas como secretadas no meio de cultura foram
classificadas de acordo com suas categorias funcionais descritas na anotação do
genoma de Xac (Figura 2).
Figura 2. Categorização funcional (em porcentagem) de todas as proteínas secretadas pela Xac
selvagem e pelo mutante 02H02. As categorias funcionais utilizadas foram as mesmas descritas
no seqüenciamento do genoma da Xac. Descrição das categorias: VIII, proteínas hipotéticas;
IV, proteínas de estrutura celular; III, proteínas relacionadas ao metabolismo de
macromoléculas; VII, proteínas relacionadas à patogenicidade, virulência e adaptação; I,
proteínas relacionadas ao metabolismo intermediário; V, proteínas relacionadas à quimiotaxia e
mobilidade; II, proteínas relacionadas à biossíntese de aminoácidos.
Do total de 55 proteínas encontradas em todas as condições estudadas, 13
proteínas foram secretadas apenas em condição infectante, ou seja, foram detectadas
tanto para a bactéria selvagem Xac, quanto para seu mutante 02H02 cultivadas em
meio de cultura líquido indutor de patogenicidade XAM1. São as proteínas marcadas na
cor verde (Tabela 1).
As 13 proteínas secretadas tanto por Xac como pelo seu mutante em condições
indutoras de patogenicidade foram classificadas de acordo com as categorias
funcionais descritas na anotação do genoma de Xac (Figura 3).
28
Figura 3. Categorização funcional (em porcentagem) das proteínas secretadas tanto por Xac como pelo
seu mutante 02H02, em condições indutoras de patogenicidade. As categorias funcionais
utilizadas foram as mesmas descritas no seqüenciamento do genoma da Xac. Descrição das
categorias: VIII, proteínas hipotéticas; IV, proteínas de estrutura celular; III, proteínas
relacionadas ao metabolismo de macromoléculas; VII, proteínas relacionadas à patogenicidade,
virulência e adaptação; II, proteínas relacionadas à biossíntese de aminoácidos.
Observando-se a Figura 3 pode-se notar que 15% das proteínas secretadas por
ambas as bactérias em meio indutor são proteínas pertencentes à categoria funcional
VII (Patogenicidade, virulência e adaptação) e são as seguintes: XAC2504 (VirK) e
XAC0661 (Peh1). Esta porcentagem é relativamente pequena, já que o mutante 02H02
possui uma baixa quantidade de proteínas secretadas relacionadas diretamente à
patogênese quando comparado à Xac selvagem cultivada em meio indutor.
Do total de proteínas encontradas para todas as condições analisadas, foram
detectadas ainda 14 proteínas que estavam presentes apenas em condição infectante
(meio XAM1) e secretadas exclusivamente por Xac selvagem (Tabela 1 – proteínas
marcadas na cor vermelha).
Essas 14 proteínas secretadas exclusivamente pela Xac selvagem (proteínas
que o mutante deixou de secretar) foram também classificadas de acordo com as
categorias funcionais já descritas (Figura 4).
29
Figura 4. Categorização funcional (em porcentagem) das proteínas secretadas exclusivamente pela Xac
em condição infectante. As categorias funcionais utilizadas foram as mesmas descritas no
sequenciamento do genoma da Xac. Descrição das categorias: VIII, proteínas hipotéticas; IV,
proteínas de estrutura celular; III, proteínas relacionadas ao metabolismo de macromoléculas;
VII, proteínas relacionadas à patogenicidade, virulência e adaptação.
A porcentagem de proteínas da categoria VII (patogenicidade, virulência e
adaptação) aumenta em quase duas vezes (de 15 para 29%) quando considera-se
apenas as proteínas secretadas pela bactéria selvagem em meio indutor de
patogenicidade e virulência, em relação ao mutante que não possui o pilus funcional do
SSTT no mesmo meio de cultura. Essas proteínas que deixaram de ser secretadas pelo
mutante são as seguintes: XAC0435 (VirK), XAC0029 (Egl), XAC0028 (Egl) e XAC0612
(EngXCA).
As proteínas secretadas mais importantes relacionadas à interação Xac-citrus
serão discutidas em detalhe no decorrer deste trabalho para as seguintes condições
infectantes: Xac e 02H02 cultivadas em XAM1 (proteínas comuns entre as duas
condições) e Xac cultivada em XAM1 (proteínas exclusivas de Xac – proteínas que
deixaram de ser secretadas pelo mutante).
30
IV.1. Proteínas secretadas por Xac e seu mutante 02H02 sob condição infectante.
De modo geral, pode-se dizer que as proteínas secretadas tanto pela bactéria
selvagem Xac como pelo seu mutante 02H02 representam o arsenal do qual ambos os
organismos se utilizam para sobreviver em um meio de cultura com características que
induzem a transcrição de genes hrp responsáveis por regular um dos principais
sistemas de secreção deste patógeno: o SSTT. Deste modo, analisando quais as
proteínas que são expressas e secretadas para o meio extracelular pelo patógeno sob
esta condição de estresse, pode-se observar não só eventuais proteínas envolvidas
nesse sistema de secreção específico, como as demais proteínas responsáveis por
manter a integridade celular da Xac, captando nutrientes necessários para manter a
homeostase da célula, ou mesmo enzimas responsáveis por degradar as paredes
celulares do hospedeiro, utilizando os compostos resultantes da hidrólise como fonte de
alimento. A seguir serão descritas as principais proteínas que tanto a Xac selvagem
como seu mutante, com o pilus do SSTT inativo, secretaram quando cultivados em
meio de cultura definido XAM1.
A ORF XAC1466, que codifica para a Lipoproteína de membrana externa
associada ao peptidoglicano Pcp em Xanthomonas citri, corresponde à proteína SlyB
em Xanthomonas campestris. Essa proteína é regulada diretamente pelo sistema de
dois componentes bacteriano conservado PhoPQ presente em diversos patógenos
bacterianos, tanto de animais quanto de vegetais, como Erwinia carotovora, Yersinia
pestis, Salmonella enterica, E. coli, dentre outros (PEREZ et al., 2009). A Xac também
possui esse sistema de dois componentes composto pelos genes XAC4023 e
XAC4022, porém não existe nenhum estudo a respeito da ação desse gene no gênero
Xanthomonas. Em Erwinia a proteína Pcp/SlyB é expressa quando há baixas
concentrações de Mg
2+
, ambientes ácidos e condições de estresse para o patógeno e
reprimida em altas concentrações de Mg
2+
(PEREZ et al., 2009). Estudos a respeito da
implicação desta proteína na patogenicidade bacteriana foram inconclusivos, porém a
mesma denota ter certa implicação em processos patológicos animais e vegetais
(PLESA et al., 2006). A proteína Pcp foi detectada em Xac e em seu mutante 02H02
31
cultivadas em meio indutor XAM1. Este fato condiz com a característica de que o meio
indutor XAM1 é um meio definido, levemente ácido (pH 5,4) e contendo uma baixa
concentração de Mg
2+
, enquanto que o meio de cultura CN é um meio rico em
nutrientes, e essa característica reprimiu a expressão dessa proteína quando o
patógeno Xac e seu mutante foram cultivados em CN.
A ORF XAC0661 codifica uma enzima de degradação da parede celular da
planta, denominada Peh1 (ORF XCC0705 codificando a proteína PghAxc em
Xanthomonas campestris pv. campestris) com ação de endo-poligalacturonase,
responsável por hidrolisar randomicamente o ácido poligalacturônico presente nos
polímeros pécticos, os principais componentes da lamela média de plantas superiores,
liberando cadeias polissacarídicas de tamanho variável e deste modo destruindo a
parede celular da planta e liberando fontes de carbono para nutrir o patógeno. Esta
proteína é secretada pelo SSTD da Xac, e parece ser regulada por HrpX, já que seu
gene carrega um motif conservado denominado ―promotor induzido por planta‖ (PIP
box). De modo geral, genes que possuem este motivo são regulados por HrpX
(XAC1167 em xanthomonas campestris – XAC1266 HrpXct em Xanthomonas citri), que
é um dos genes reguladores do SSTT (WANG et al., 2008). O gene hrpX codifica para
uma proteína ativadora de transcrição do tipo Ara-C, que é responsável por controlar a
transcrição dos operons hrpB até hrpF, controlando dentre estes o gene inativado do
mutante 02H02 (hrpB4) (FURUTANI et al., 2004). O gene hrpXct já foi descrito como
induzido em Xac em meio XAM1 em estudos de transcriptoma por LAIA (2007). Este
gene hrpX continua ativado mesmo no mutante 02H02, e isso pode explicar a presença
da proteína secretada Peh1 tanto na bactéria selvagem quanto em seu mutante.
Segundo WANG (2008), Peh1 é uma proteína importante no estágio inicial da infecção,
por ser responsável por hidrolisar as primeiras barreiras da planta, das quais a parede
celular é a mais importante. Mutantes de Xanthomonas campestris com o gene
codificando para a proteína PghAxc (Peh1 em Xac) inativados demonstraram virulência
atenuada quando o patógeno foi pulverizado no hospedeiro Arabidopsis, demonstrando
a importância dessa proteína para tais estágios da infecção. A presença de Peh1 em
Xac indica a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir a ativação do gene hrpX.
32
Pode-se constatar ainda que apesar de o mutante não possuir o pilus do SSTT ativo,
por lhe faltar a proteína HrpB4, os demais genes upstream controladores deste sistema
aparentemente ainda encontram-se funcionais e possuem um papel ativo no controle
de algumas proteínas de degradação que foram encontradas como secretadas neste
trabalho e que serão descritas abaixo.
A ORF XAC2853 que codifica a proteína Cisteíno-protease correspondente à
proteína CysP2 em Xanthomonas oryzae pv. oryzae, possui um PIP-BOX imperfeito
segundo estudo realizado por FURUTANI et al. (2004). Este estudo comprovou que
esta Cisteíno-protease secretada pelo SSTD é também regulada por HrpX juntamente
com HrpG. As cisteíno-proteases são consideradas importantes fatores de virulência
para os patógenos de um modo geral, e sua ação consiste na hidrólise de peptídeos
das células do hospedeiro, gerando fontes de carbono indispensáveis para o
desenvolvimento da doença. O estudo com um mutante deficiente para a Cisteíno-
protease realizado in-vivo por SANTOS (2007) demonstrou que a inativação do gene
XAC2853 resultou em uma linhagem menos virulenta de Xac, quando inoculada no
hospedeiro cítrico. Este fato indica a importância desta proteína secretada para a
patogenicidade da bactéria em questão.
A ORF XAC2504 codifica para a proteína RpfN (Fator Regulador de
Patogenicidade), que possui um domínio oprB. Esta proteína é correspondente à
proteína OprB (Porina Seletiva para Carboidratos) em Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria (XCV2682). Esta porina constitui um canal específico para glicose, mas
também é responsável por transportar para o interior da membrana outros
monossacarídeos (WYLIE & WOROBEC, 1995). Segundo NIKAIDO (2003), mutantes
defectivos para esta proteína de Pseudomonas aeruginosa demonstraram reduzida
capacidade em utilizar diversos tipos de monossacarídeos, demonstrando sua
importância para a importação de diversos açúcares para o interior da célula. Estudos
realizados pelo mesmo autor demonstraram que valores de pH ácidos produzem um
forte aumento na transcrição de oprB. O fato de que esta proteína foi detectada apenas
em meio de cultura XAM1 remonta às características deste meio: pH ácido (5,4) e
presença do monossacarídeo frutose, que é um açúcar muito semelhante à glicose,
33
apresentando a mesma composição química C
6
H
12
O
6
. Este resultado é condizente com
a revisão de NIKAIDO (2003) para Xanthomonas campestris pv. vesicatoria e também
com o estudo proteômico empreendido pelo autor do presente trabalho (FERREIRA,
2006), que demonstrou a super-expressão da proteína RpfN por Xac quando cultivada
em meio de cultura XAM1 e sua presença em menor escala em meio de cultura CN,
utilizando diferentes estratégias de detecção. Esta proteína não é predita como
secretada via sec, porém é predita como secretada por vias não clássicas pela
ferramenta de bioinformática SecretomeP 2.0. Levando-se em conta a sensibilidade do
método de detecção utilizado neste estudo, somado à grande indução dessa proteína
na membrana externa da bactéria quando cultivada em XAM1, a mesma deve ter se
desprendido para o referido meio de cultura e foi detectada através da espectrometria
de massas. Possivelmente esta proteína também estava presente na membrana da Xac
e seu mutante 02H02 quando cultivada em CN, porém em quantidade muito menor.
Desse modo, tal proteína não deve ter se desprendido em quantidade, e assim não foi
detectada. A implicação desta proteína na patogenicidade da Xac é pouco conhecida,
mas segundo BARBER et al. (1997), mutantes de Xanthomonas campestris que tiveram
esse gene inativado apresentaram aumento da síntese enzimática e patogenicidade. O
gene rpfN não faz parte do grupo de genes rpfA-I (Xac não possui rpfH e rpfL)
responsáveis por regular a síntese e a secreção de enzimas e polissacarídeos
extracelulares importantes para a patogenicidade bacteriana, mas parece ter um papel
na regulação negativa destes fatores. A alta concentração de enzimas extracelulares só
é obtida durante o fim da fase exponencial, na fase estacionária de crescimento
bacteriano e no desenvolvimento da doença e é controlada globalmente pelo grupo
rpfA-I (ANDRADE et al., 2006). O fato de que o gene rpfN é fortemente expresso em 24
horas de cultivo no meio de cultura XAM1 pela Xac e seu mutante 02H02 pode indicar a
função de regulador negativo de enzimas extracelulares nos tempos iniciais de
infecção, já que segundo trabalhos anteriores esse gene tem uma queda acentuada em
sua expressão após 3 dias de cultivo da bactéria na planta hospedeira (FERREIRA,
2006). Esse gene pode ser um indício do motivo de não haver uma maior quantidade
de enzimas extracelulares detectadas no presente trabalho.
34
A ORF XAC1113 codifica para uma lipoproteína de membrana externa Slp
induzida por deficiência de carbono. Em E. coli esta proteína é induzida quando a
disponibilidade de glicose é limitante no meio de cultura e quando o organismo
encontra-se na transição da fase de crescimento logarítmico para a fase estacionária.
Mutantes deficientes na produção da proteína Slp demonstraram uma diminuição da
resistência frente a antibióticos como o cloranfenicol, o que pode demonstrar um papel
para esta proteína na captação de nutrientes quando o patógeno encontra-se sob uma
condição de estresse, devido à baixa disponibilidade de fontes de carbono (PRICE &
JOHN, 2000). Esta lipoproteína é secretada para a membrana externa da Xac através
de uma via não clássica de secreção, já que não possui um peptídeo sinal em seu N-
terminal. O fato de que esta proteína foi detectada apenas quando a Xac e o mutante
02H02 foram cultivados em meio definido indutor XAM1 demonstra que o mutante,
apesar de ser assintomático quando inoculado in planta, ainda é capaz de sobreviver
no hospedeiro sem causar a doença. No entanto, o fato de que o mutante 02H02
apresenta um crescimento menor em meio de cultivo definido e um crescimento
comparável ao selvagem em meio de cultura rico, pode indicar que a inativação do
gene hrpB4 deve ter influenciado outros mecanismos de captação de fontes de
carbono, que podem ser responsáveis pelo crescimento diminuído em meio de cultura
definido.
IV.2. Proteínas secretadas exclusivamente por Xa c sob condição infectante.
As proteínas secretadas identificadas exclusivamente em Xac selvagem quando
cultivada em meio indutor XAM1 são as mais importantes para se determinar o impacto
da mutação do gene que codifica uma proteína de estrutura do pilus do SSTT no
mutante 02H02 e sua repercussão nas funções moleculares na Xac selvagem. Com os
dados apresentados até o momento pode-se observar que o mutante 02H02 ainda
conserva alguns mecanismos relacionados à captação de nutrientes e mesmo à
patogenicidade, como controladores negativos de enzimas degradadoras da parede
celular do hospedeiro e mesmo uma cisteíno protease que desempenha papel
35
importante na patogenicidade de Xac. Porém, diversas proteínas de ataque ao
hospedeiro e de resistência ao estresse nutricional imposto pelo mesmo foram
detectadas de modo exclusivo para a Xac selvagem, proteínas estas que podem estar
sendo reguladas indiretamente pelo gene mutado hrpB4 ausente no mutante 02H02.
Dentre as proteínas exclusivas de Xac em meio XAM1 pode-se citar algumas a seguir.
A proteína OprO (XAC3472) é uma porina O de membrana externa seletiva para
polifosfatos também regulada por PhoPQ e tem por função permitir a passagem de
polifosfatos advindos da degradação das células do hospedeiro e do meio ambiente em
que a bactéria se encontra para o interior da célula do patógeno, permitindo que a Xac
utilize tal fosfato para gerar a energia necessária para sobreviver e produzir efetores
capazes de subjugar as defesas geradas pelas células do hospedeiro e assim
desenvolver a doença. Em Pseudomonas aeruginosa a OprO é uma porina ânion-
específica, com maior afinidade para ligar pirofosfato do que ortofosfato. Estudo
efetuado por SIEHNEL et al. (1992) em Pseudomonas aeruginosa demonstrou que
esta proteína era expressa apenas sob condições de cultivo pobres em fosfato
conjuntamente com a fase estacionária de crescimento da bactéria. No caso de
Pseudomonas isso ocorre porque a disponibilidade de fosfato no solo muitas vezes é
limitada, já que diversos microorganismos lançam mão de mecanismos de sequestro de
fosfato e o armazena na forma de polifosfatos. Desse modo, uma vez que a
Pseudomonas utiliza seu arsenal de compostos microbicidas para inibir estes
competidores, a presença da OprO na membrana externa da célula é responsável por
capturar o polifosfato e enviar ao periplasma. Em Xac, o meio indutor XAM1 é um meio
de cultura pobre em fosfato, assim como o meio intercelular do hospedeiro cítrico.
Assim, é esperado que a proteína OprO seja expressa para capturar o fosfato liberado
pela degradação das paredes celulares do hospedeiro pela Xac selvagem produzindo
suas enzimas degradadoras. O fato de que o mutante 02H02 não possui a OprO
presente para captar o fosfato necessário para auxiliar no desenvolvimento da
patogênese, pode indicar que a falta do gene hrpB4 e a má formação do pilus do SSTT
impediu de alguma forma a expressão de diversas outras proteínas secretadas pela
Xac selvagem, responsáveis por auxiliar nos processos de virulência que acarretam o
36
pleno desenvolvimento da doença e mesmo o desenvolvimento adequado do mutante
no meio definido XAM1. Isto condiz novamente com as características de meio de
cultura definido indutor de patogenicidade do XAM1 e o fato de que o mutante 02H02 é
assintomático quando inoculado in planta e apresenta crescimento reduzido quando
cultivado em meio de cultura definido, haja visto que a bactéria mutada não possui um
arsenal ativo de degradação para levar a cabo os processos relacionados ao
desenvolvimento da doença.
Outra proteína secretada exclusivamente pela Xac selvagem quando cultivada
em meio indutor foi a VirK (XAC0435). Esta proteína possui um peptídeo sinal em seu
N-terminal, logo é secretada para o periplasma do patógeno através da via de secreção
geral – sec, e parece fazer parte do sistema de secreção do tipo quatro (SSTQ),
responsável por exportar T-DNA e outras proteínas para a planta hospedeira no caso
de Agrobacterium tumefaciens (FACINCANI, 2007). Em Xac esse sistema é descrito
como um sistema não completo por alguns autores, pelo fato de que alguns genes
anotados para este sistema não estão presentes, porém a observação cuidadosa feita
por BRUNINGS & GABRIEL (2003) demonstra que existem alguns genes homólogos
para este sistema em Xac que podem desempenhar o papel dos genes ausentes.
ROMMAIS et al. (2008) descreve VirK como uma proteína de função desconhecida em
Agrobacterium tumefaciens, no entanto um homólogo desta proteína foi também
encontrado em Ralstonia solanacearum e neste organismo, a proteína VirK é regulada
pela proteína HrpG. O fato de que HrpX é funcional em Xac e regulou diversas
proteínas comuns entre Xac e seu mutante, indica que hrpG, que é um gene ―upstream‖
a hrpX, também codifica para uma proteína funcional, mesmo no mutante. O gene
hrpB4 que foi interrompido por ação do transposon no 02H02 parece desempenhar um
papel relacionado à presença da proteína secretada VirK exclusivamente na Xac
selvagem. Estudos baseados em macro arranjos empreendidos por ASTUA-MONGE et
al. (2005) em Xac cultivada em meio indutor XVM2 demonstram que esta proteína
apresentou um aumento de expressão de mais de duas vezes em comparação com o
meio de cultura rico não indutor. O fato de que esta proteína é predita como sendo
parte integrante do SSTQ levanta questões a respeito da interação que pode ocorrer
37
entre esse sistema e o SSTT, já que a má formação do pilus do SSTT no mutante
02H02 parece ter relação com a presença dessa proteína exclusivamente na Xac
selvagem cultivada em meio indutor. Talvez no caso de Xac o gene virK não seja
regulado diretamente por hrpG, e sim por alguma das proteínas diretamente reguladas
por este gene. Já que a inativação do gene hrpB4 inativou quase todos os outros
constituintes do pilus, pode ser que não necessariamente virK seja controlada
diretamente por hrpB4, mas por qualquer um dos genes desativados.
A ORF XAC0678 codifica para uma proteína anotada como hipotética putativa
conservada para Xac e foi detectada exclusivamente para este patógeno cultivado em
meio indutor. Uma nova comparação de sua sequência de aminoácidos (BLASTP),
realizada em agosto de 2009, revelou que esta proteína hipotética de Xac apresenta
uma alta homologia com a lipoproteína da família de antígeno de superfície de 17 kDa
de Rickettsia (17 kDa surface antigen family) em Xanthomonas oryzae pv. oryzae, com
uma identidade de 96% e e-value de 4 e
-63
. Segundo ANDERSON & TZIANABOS
(1989) esta proteína é altamente conservada dentro do gênero Rickettsiae. Este gênero
possui algumas espécies patogênicas responsáveis por doenças como o tifo e a febre
das montanhas rochosas que ocorre nos Estados Unidos. Segundo CARVALHO (2006)
esta proteína hipotética possui um PIP-BOX perfeito em sua sequência de
nucleotídeos, revelando sua relação com a proteína de regulação do SSTT, HrpX.
Análises de bioinformática revelam que esta proteína possui um peptídeo sinal para
sec, sendo exportada para o periplasma do patógeno. DAVIS et al. (1998) foi o primeiro
grupo a relatar uma Rickettsia como um possível patógeno de mamão papaia utilizando
PCR e a lipoproteína de membrana de 17 KDa comum a este gênero por metodologia.
FRÁNOVÁ et al. (2008), utilizando microscopia eletrônica de varredura, também
observaram organismos semelhantes a Rickettsia nos tubos do floema de cenouras
apresentando sintomas de doença. A implicação deste antígeno de superfície de 17
KDa para Rickettsia não é conhecida. Em Xac, o fato dessa proteína possuir um PIP-
BOX pode indicar que a mesma tem relação na patogenicidade de Xac, já que está
relacionada com um dos principais mecanismos conhecidos elicitadores de doença em
animais e plantas (SSTT), porém o mecanismo de ação implicado nesta relação ainda
38
não foi descrito. Julgando pela sua expressão exclusiva na bactéria selvagem sob
indução de patogenicidade, pode-se dizer que esta proteína pode ser diretamente
secretada via SSTT, já que a mesma não foi detectada no mutante deficiente para este
sistema.
O meio XVM2 (XAM1 modificado) já foi demonstrado por ASTUA-MONGE et al.
(2005) como responsável pela indução da secreção de diversas enzimas degradadoras
de parede celular, dentre elas as celulases Egl (XAC0028 e XAC0029). Ambas as
celulases descritas foram novamente detectadas como secretadas apenas no meio
indutor XAM1 pela bactéria selvagem Xac e não pelo seu mutante 02H02. Estas
proteínas são preditas como transportadas via sec para o periplasma e em seguida
secretadas pelo SSTD, de modo que a presença destas apenas na bactéria selvagem
indica que a inativação do SSTT no mutante pode ter reprimido algumas enzimas de
degradação da parede celular do hospedeiro, que são secretadas pelo SSTD. Ou seja,
o SSTT pode ter relação direta na regulação também dessas proteínas secretadas pelo
SSTD.
A ORF XAC0612 codifica para uma celulase EngXca com ação Endo-1,4-beta-
glucanase, supostamente responsável por auxiliar na degradação da celulose da
parede celular do hospedeiro cítrico. Esta proteína parece ser controlada indiretamente
por rpfF em Xanthomonas campestris, já que um mutante deficiente nesta proteína
apresentou considerável diminuição em sua ação enzimática (POPLAWSKY et al.,
1998). BAPTISTA (2006) chegou à conclusão de que em Xac esta proteína não
apresenta ação enzimática celulósica considerável, ao contrário do que sua anotação
prevê, portanto não desempenha um papel importante na patogenicidade de Xac frente
a hospedeiros cítricos. Porém a regulação alterada desta proteína no mutante 02H02
pode indicar que as vias indiretas de secreção de enzimas de degradação de parede
celular controladas por fatores difusíveis (DSF – Fator de Sinalização Difusível)
codificados por rpfF descritos por POPLAWSKY (1998) podem ter sido alteradas pela
má formação do pilus do SSTT. As moléculas DSF são encontradas no sobrenadante
das culturas utilizando-se ensaios baseados em acetato etílico, logo, segundo os
resultados obtidos neste trabalho, pode-se supor que as DSFs controladas por rpfF
39
podem ter relação com a má formação do pilus do SSTT, dado o fato de que o mutante
02H02 para este sistema simplesmente deixou de secretar diversas enzimas de
degradação da parede celular do hospedeiro (XAC0028, XAC0029 e XAC0612).
SICILIANO e colaboradores (2006) descrevem ainda que mutantes de Xac para o gene
rpfF e rpfC apresentaram produção fortemente diminuída de enzimas de degradação da
parede celular do hospedeiro e uma menor produção de goma xantana, resultado
observado indiretamente neste trabalho quando o mutante 02H02 foi cultivado em meio
de cultura XAM1. Meios de cultura XAM1 livres de células eram mais facilmente
filtrados em membranas de 0,2 µm quando o 02H02 era cultivado nos mesmos, em
detrimento ao selvagem Xac – a goma xantana obstruía os poros da membrana de
modo mais evidente em Xac, e a quantidade de goma precipitada por álcool etílico
absoluto em meio XAM1 livre de células era visivelmente maior quando a Xac era
cultivada neste meio indutor. Os mutantes para os genes rpfF e rpfC feitos por
SICILIANO et al. (2006) apresentaram sintomas diminuídos quando inoculados em
hospedeiro cítrico (Limão). A presença de mais duas celulases Egl (XAC0028 e
XAC0029) exclusivas para a Xac selvagem corroboram ainda mais a hipótese de que
possivelmente a má formação do pilus do SSTT e a ausência de suas proteínas
secretadas alteraram a secreção de DSF no mutante e seus efeitos para a produção de
enzimas degradadoras e goma xantana no mutante 02H02.
BAPTISTA (2006), em seu estudo em Xac, descreve os genes XAC0028 e
XAC0029 (egl) como celulases responsáveis por hidrolisar compostos celulósicos da
parede do hospedeiro. Ambas as proteínas citadas foram descritas entre as cinco
principais proteínas diretamente ligadas à degradação de compostos celulósicos em
Xac. Mutantes feitos pelo mesmo autor para os referidos genes demonstram alteração
na patogenicidade mesmo que branda, e o autor sugere que um sinalizador difusível
alternativo possa ser responsável pelo controle destas celulases (DSF). ASTUA-
MONGE et al. (2005) sugeriu a existência deste mesmo sinalizador em Xanthomonas
citri. Apesar do fato de que não foi possível detectar diretamente tal sinalizador DSF, a
presença das principais proteínas e alteração na produção de goma xantana
sabidamente reguladas por ele, indicam que a mutação no gene hrpB4 teve ação na
40
secreção dos fatores de sinalização, já que a má formação do pilus no mutante
desativou a expressão das enzimas já descritas e modificou a produção de goma
xantana pela bactéria não patogênica (ensaios para detectar diretamente esta molécula
deverão ser empreendidos no futuro).
Estudos proteômicos e de microscopia eletrônica realizados por SIDHU et al.
(2008) em Xanthomonas campestris chegaram à conclusão de que diversas bactérias
gram-negativas liberam vesículas lipídicas de suas membranas externas, contendo
compostos envolvidos na sinalização célula a célula, assim como proteínas associadas
à virulência. O referido estudo encontrou particularmente proteínas secretadas
relacionadas ao SSTT, como proteínas de avirulência AvrBs1 e AvrBs2, HrpF e mesmo
a proteína correspondente ao mutante do presente artigo, HrpB4. Foram detectadas
ainda algumas proteínas do SSTD como XpsH e celulases. Estas proteínas, em
particular as proteínas relacionadas ao SSTT foram encontradas apenas na fração
secretada das vesículas de membrana externa, e não nas proteínas extraídas
diretamente da membrana externa do patógeno. A metodologia utilizada para extrair as
vesículas do sobrenadante dos meios de cultura utilizados nos estudos de SIDHU et al.
(2008) foi baseada em ultracentrifugação, o que pode explicar o fato de que não foram
encontradas proteínas diretamente relacionadas ao SSTT nos experimentos de
secreção utilizados neste estudo, logo tais vesículas devem ter sido descartadas
juntamente com o sobrenadante da centrifugação responsável por precipitar as
proteínas livres nos diferentes meios de cultura. A ausência de proteínas de avirulência
sabidamente secretadas pelo SSTT de Xac como AvrBs1 e AvrBs2 e proteínas efetoras
diversas do SSTT como Hrc e Hrp em todas as condições analisadas no presente
artigo, pode indicar que Xac também produz vesículas de membrana externa com tais
proteínas em seu lúmen, as quais não foram detectadas simplesmente devido à
metodologia utilizada que excluiu tais vesículas. Porém a real constatação da existência
dessas vesículas para Xac ainda requer estudos diretos mais aprofundados.
41
V. CONCLUSÕES
Foram identificadas no total 55 proteínas secretadas para as quatro condições
analisadas neste artigo: Xac cultivada em meio CN, Xac cultivada em meio XAM1,
02H02 cultivada em meio CN e 02H02 cultivada em meio XAM1. Destas, 13 proteínas
foram secretadas tanto por Xac como pelo seu mutante 02H02 quando cultivados em
meio de indução XAM1, e 14 proteínas foram secretadas exclusivamente quando Xac
selvagem se encontrava em meio de cultura XAM1.
Dentre as 55 proteínas identificadas neste estudo, apenas 18 não possuíam o
peptídeo sinal predito para secreção através do sistema secretório geral (sec).
Entretanto, das 18 proteínas que não possuem o peptídeo sinal, apenas 5 foram
preditas como não secretadas por vias não clássicas. Isto demonstra que a grande
maioria (50) das proteínas aqui detectada não foram proteínas contaminantes e nem
proteínas liberadas através de lise celular.
A porcentagem de proteínas secretadas relacionadas à categoria VII do genoma
de Xac (Patogenicidade, virulência e adaptação) aumenta em quase duas vezes (de 15
para 29%) quando são consideradas apenas as proteínas secretadas pela bactéria
selvagem Xac em relação àquelas secretadas pelo seu mutante 02H02. Este fato já
demonstra a natureza das proteínas que deixaram de ser secretadas pelo mutante que
possui o pilus do SSTT inativo, ou seja, proteínas diretamente relacionadas com o
desenvolvimento da doença no hospedeiro.
O meio de cultura XAM1, mesmo sem a adição de soroabumina bovina, induziu a
secreção de diversos genes regulados por hrpX e hrpG e secretados pelo SSTD, tanto
no selvagem quanto no mutante 02H02, indicando que os genes reguladores do SSTT
não foram inativados pela mutação do gene hrpB4 no mutante.
A presença da proteína RpfN expressa tanto na Xac selvagem quanto em seu
mutante pode explicar o fato de que não foram identificadas maiores quantidades de
enzimas extracelulares, já que esta proteína é conhecida por ser um regulador negativo
destas enzimas nos tempos iniciais de infecção.
42
A presença da lipoproteína Slp induzida por deficiência de carbono tanto na Xac
quanto em seu mutante cultivados em XAM1 indica que este meio definido tornou-se
limitante para o crescimento das culturas, que possivelmente se encontravam no final
da fase exponencial de crescimento, já entrando na fase estacionária, mesmo no caso
do mutante, que apresentou uma D.O
600 nm
menor que a Xac selvagem. Este fato indica
que a falta da proteína HrpB4 no mutante influenciou em seu crescimento em meios de
cultura definidos, mas não em meios ricos. Não foi possível determinar os mecanismos
responsáveis por este comportamento do mutante.
A expressão de diversas proteínas do SSTD parece ser controlada pelo SSTT,
demonstrando que este fato também ocorre em Xac.
O perfil de proteínas secretadas exclusivamente pela bactéria selvagem Xac e a
quantidade aumentada de goma xantana produzida em meio indutor XAM1 indica que
os DSFs (Fator de Sinalização Difusível) responsáveis pelo controle destes fatores
podem ter relação com a ausência de expressão da proteína HrpB4, já que o mutante
02H02 deficiente na produção dessa proteína foi incapaz de secretar diversos desses
fatores.
A não detecção de proteínas diretamente secretadas pelo SSTT, como AvrBs1 e
2, HrpF e outros fatores de virulência nos experimentos aqui descritos, pode indicar que
em Xac essas proteínas estejam sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas
liberadas das membranas externas do patógeno e que provavelmente se ligam às
membranas do hospedeiro, onde o conteúdo dessas vesículas são liberados, como
ocorre em Xanthomonas campestris (SIDHU et al., 2008).
Estudos mais aprofundados devem ser empreendidos para a observação direta
da ausência de DSFs no mutante 02H02 e da presença de proteínas secretadas
diretamente pelo SSTT no interior de vesículas lipídicas de membrana em Xac
selvagem.
43
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