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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO HUMANA
Fernanda Ribeiro Rosa
Deficiência de vitamina A altera o status de ferro e de estresse
oxidativo em ratos
BRASÍLIA
Distrito Federal - Brasil
Agosto - 2009
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Fernanda Ribeiro Rosa
Deficiência de vitamina A altera o status de ferro e de estresse
oxidativo em ratos
Dissertação apresentada à Universidade de Brasília
como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Nutrição Humana. Área de Concentração:
Bioquímica Nutricional
.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Sandra Fernandes Arruda.
Co-orientação: Prof
a
. Dr
a
. Egle Machado de Almeida
Siqueira
Brasília, 07 de agosto de 2009.
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Universidade de Brasília
Departamento de Nutrição
Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana
Comunicamos a aprovação da dissertação de mestrado da aluna
Fernanda Ribeiro Rosa, intitulada “Deficiência de vitamina A altera o status
de ferro e de estresse oxidativo em ratos”, submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Nutrição Humana do Departamento de Nutrição da
Universidade de Brasília.
Prof
a
. Dr
a
Sandra Fernandes Arruda
Presidente – Universidade de Brasília (UnB)
Prof
a
. Dr
a
Maria do Carmo Gouveia Peluzio
Membro – Universidade Federal de Viçosa
Prof
a
. Dr
a
Nathalia Marcolini Pelucio Pizato Valério
Membro - Externo
Prof
a
. Dr
a
Egle Machado de Almeida Siqueira
Suplente – Universidade de Brasília (UnB)
Brasília, 07 de agosto de 2009.
4
1. Introdução
A ingestão adequada de micronutrientes é importante para a
manutenção das diversas funções metabólicas do organismo. A vitamina A é
um micronutriente essencial necessário ao crescimento e desenvolvimento.
Embora abundante em vários alimentos, é potencialmente responsável por
uma das carências nutricionais mais prevalentes no mundo, a hipovitaminose
A, sendo conhecidas diversas patologias desencadeadas pela deficiência
desse micronutriente (Majchrzak; Fabian; Elmadfa, 2006; Burria & Cliffordb,
2004; Almeida-Muradian, Penteado, 2003). A deficiência de vitamina A ocorre
de forma endêmica principalmente em países em desenvolvimento, o que a
torna um nutriente de grande interesse em saúde pública (Fujita et al., 2009). A
cegueira noturna compreende o sintoma clínico mais comum. Estima-se que
nestes países 43 milhões de crianças menores de 5 anos de idade apresentam
deficiência de vitamina A, e 140-250 milhões de pessoas apresentam risco de
deficiência de vitamina A (Kabat et al, 2009).
Nos alimentos de origem animal a vitamina A está presente na forma
pré-formada, retinol, enquanto os carotenóides pró-vitamínicos, que
compreendem compostos precursores de retinol, estão presentes nas frutas e
hortaliças, sendo o β-caroteno o principal precursor de vitamina A nestes
alimentos (Maoka, 2009).
A vitamina A desempenha inúmeras funções vitais no organismo
humano, desde a fase neonatal até a fase adulta. Podem-se destacar a
proliferação e diferenciação celular, o desenvolvimento embrionário, o
mecanismo da visão e imunidade (Esteban-Pretel et al., 2009), e a potente
atividade antioxidante, (Oliveira et al, 2009). A recomendação de ingestão
diária (RDA) desse micronutriente varia entre 500 µg/dia a 1000 µg/dia de
acordo com o sexo e faixa etária (Johnson-Davis et al., 2009; Oliveros et al.,
2007). A sua carência está associada com o aumento da morbidade e
mortalidade infantil em crianças, relacionadas principalmente a doenças
infecciosas (Vega et al., 2009; Oliveros et al., 2007).
O potencial antioxidante da vitamina A tem sido associado a sua
capacidade de interagir com as espécies reativas de oxigênio (EROs) através
5
da transferência de elétrons, remoção de íons hidrogênio, ou pela adição de
espécies radicalares (Fraser, Enfissi, Bramley, 2009; Young & Lowe, 2001). No
organismo humano, diversas ERO
S
são produzidas incluindo o oxigênio
singleto(
1
O
2
), radical hidroxil(
•
OH), superóxido(O
2
-•
) e peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
). As EROs reagem facilmente com as biomoléculas causando
principalmente peroxidação lipídica, danos ao DNA e oxidação de proteínas
(Halliwell & Gutteridge, 2007; Valko et al., 2007). Estes danos estão associados
a diversos processos patológicos, como acidentes vascular-cerebrais, infarto
do miocárdio, patologias do sistema nervoso (doença de Alzheimer e
Parkinson), vários tipos de câncer e ao processo de envelhecimento natural. O
mecanismo e a eficiência de eliminação destas espécies dependem do
potencial antioxidante do organismo, integrado pelas defesas antioxidantes
enzimáticas e não-enzimáticas, essa última constituída por compostos
provenientes da dieta, tais como vitamina A, carotenóides, vitamina C,
polifenóis (Englberge et al., 2009).
Embora a literatura mostre que a ação antioxidante da vitamina A ocorre
através de reações de óxido-redução, estudos sugerem a existência de uma
relação sinérgica entre o metabolismo da vitamina A e do ferro, esse último um
potente agente oxidante (Arruda et al. 2009; Ma et al., 2008; Tanumihardjo,
2002; Strube, Beard, Ross,2002). A hipovitaminose A parece ser uma das
causas da perda da homeostase de ferro levando a redução da incorporação
de ferro nos eritrócitos e ao acúmulo deste nos tecidos. Indivíduos adultos
anêmicos suplementados com vitamina A ou β-caroteno têm absorção duas
vezes maior de ferro não hêmico. A vitamina A parece estar diretamente
relacionada com o tratamento da anemia ferropriva. Estudos em animais
evidenciam que a deficiência de vitamina A leva ao acúmulo de ferro nos
tecidos, sugerindo que essa deficiência diminui a mobilização de ferro e/ou
aumenta a absorção intestinal de ferro (Arruda et al. 2009; Maoka, 2009;
Bolem, Wendell, 1990; Meija, Chew, 1988).
O ferro em excesso pode catalisar reações de oxidação e levar a
produção de radicais livres e consequentemente aumentar o estresse oxidativo
nos tecidos (Valko et al., 2007; Papanikolaou & Pantopoulos, 2005). Assim, os
programas de suplementação de micronutrientes nas regiões onde a anemia
6
ferropriva e hipovitaminose A coexistem devem considerar essa interação. O
presente trabalho teve por objetivo avaliar in vivo o efeito da deficiência de
vitamina A na concentração de ferro e no dano oxidativo em tecidos de ratos
com diferentes estágios de depleção.
7
2. Revisão Bibliográfica
2.1 Vitamina A
2.1.1 Retinóides
O termo vitamina A descreve um grupo de compostos lipossolúveis
metabolicamente relatados como retinol e seus ésteres, é mais empregado
para designar a família dos retinóides (retinil, retinol, retinal e ácido retinóico
em suas diversas isoformas) (Glenn, 2009; Arnhold et al., 2002). Contém um
anel β-ionona e uma cadeia de hidrocarboneto (Figura 1(a)), com saturações
alternadas, ligadas a um grupo funcional. A variação de um retinóide para outro
está em suas diferentes formas de oxidação do grupo funcional (Thompsona &
Gal, 2002).
Figura 01. Estrutura química da vitamina A (a); estrutura do all-trans-retinol (b);
estrutura do 11-cis-retinal existente na retina e ligado a rodopsina. (c);
principais isoformas do ácido retinóico (d). Fonte: Senno, 2004.
8
A vitamina A é um micronutriente essencial para os processos biológicos
como visão, reprodução, crescimento e diferenciação celular, e
desenvolvimento embrionário na maioria dos mamíferos (Majchrzak, Fabian,
Elmadfa, 2006). Não é sintetizada pelo organismo humano sendo absorvida
pelo intestino através da dieta, podendo ser fornecida por meio dos alimentos e
suplementos (Mucida, Park, Cheroutre, 2009; Anderson, 2002). Embora a
vitamina A tenha sido uma das primeiras vitaminas a ser identificadas, a
compreensão plena de seus efeitos fisiológicos e mecanismos de ação
permanecem obscuros (Maoka, 2009; Oliveros et al., 2007; Burria & Cliffordb,
2004).
Os retinóides estão presentes nos alimentos de origem animal, tais
como fígado, ovos e produtos lácteos, na forma de ésteres de retinil, molécula
de retinol esterificada a uma molécula de ácido graxo; e nos alimentos de
origem vegetal, principalmente em vegetais amarelos e verde-escuros, na
forma de carotenóides pró-vitamina A que são parcialmente convertidos em
retinol durante ou após a absorção. Na maioria dos produtos, a fortificação é
feita com a utilização de carotenóides pelo fato de apresentarem toxicidade
menor do que a vitamina A (Dias et al., 2009; Luo et al., 2009; Rutkowska &
Stolyhwo, 2009).
Grande parte da população humana depende de carotenóides dietéticos
como a principal fonte da vitamina A (Goswami, Ivanoff. Barua, 2003). Desde
os primeiros relatos estruturais do β-caroteno por Kuhn e Karrer em 1928–
1930, aproximadamente 750 formas de carotenóides já foram descritas (Britton,
Liaaen-Jensen, Pfander, 2004), e cerca de 20 novas estruturas de carotenóides
estão sendo relatadas anualmente através da melhoria nos instrumentos de
análise (Maoka, 2009). Embora sejam abundantes as formas de carotenóides
nos vegetais, apenas cerca de 50 destas são metabolizadas pelos organismos
vivos como precursores de vitamina A, sendo o β-caroteno a forma com maior
atividade pró-vitamínica (Figura 02) (Englberge et al., 2009; Jun et al., 2009). A
atividade pró-vitamínica de um carotenóide depende da presença do anel de β-
ionona em sua estrutura.
9
Figura 02. Estrutura Química dos principais carotenóides dietéticos pró-vitamínicos . Fonte:
Dragsted, 2008.
Embora essencial ao metabolismo, a ingestão elevada de vitamina A
está relacionada com vários efeitos adversos, principalmente no metabolismo
hepático, e parece ser teratogênica (Yehya et al., 2009; Anderson, 2002;
Arnhold et al., 2002). Alguns estudos demonstraram que altas doses de
vitamina A, utilizadas principalmente pelo uso terapêutico em tratamento de
leucemia e dermatológicos, induz a hepatotoxidade, cefaléia, irritabilidade,
confusão mental, depressão e alterações no metabolismo lipídico (De Oliveira
et al., 2009; Myhre et al., 2003; Fenaux, Chomienne, Degos, 2001). Por este
motivo, a dose diária de ingestão deve ser limitada para evitar os agravos da
hipervitaminose. O limite máximo de ingestão segura (UL) para essa vitamina,
estabelecido pelo Comitê Científico de Alimentação Humana (2002) e pela
Comissão da Ingestão Dietética de Referência (2002), é de 3000 µg/dia (in
Majchrzak (2006), a ingestão recomendada varia de 300 a 1300 µg/dia de
acordo com o sexo, faixa etária e estado fisiológico segundo Dietary Reference
Intakes (DRIs).
A deficiência de vitamina A é um dos grandes problemas de saúde
pública em 118 países, atingindo cerca de 20 milhões de mulheres grávidas;
10
aproximadamente 100 a 140 milhões de crianças pré-escolares; entre 250.000
a 500.000 crianças por ano sendo 50% destas menores de um ano (Davey et
al., 2009; Kabat et al., 2009). Segundo o Sistema de Informações de
Deficiência de Micronutrientes (Micronutrient Deficiency Information System-
MDIS) da Organização Mundial de Saúde cerca de três milhões de crianças
com idade de 0 a 5 anos adquirem xeroftalmia, doença caracterizada por
debilidades visuais em decorrência da deficiência de vitamina A. No caso de
gestantes, as estatísticas apontam que cerca de 5% sofrem de cegueira
noturna durante a gravidez (WHO/FAO, 2002). A deficiência de vitamina A
apresenta muitas outras conseqüências além da cegueira noturna ou a perda
de visão, é relatado retardo no desenvolvimento mental, encurtamento e
espessamento dos ossos, atrofia dos testículos, imunodeficiência, levando a
um aumento da morbidade e mortalidade (Wei et al., 2009).
No Brasil, considera-se que as informações existentes são insuficientes
para definir a situação da carência de vitamina A no país, não dispondo de
estudos suficientes e adequados que permita definir o problema da
hipovitaminose A como um todo (Batista-Filho, Rissin, 2003). Atualmente, 23%
das mortes por diarréia em crianças brasileiras são reconhecidamente
associadas a deficiência de vitamina A, sendo o Brasil classificado pela
Organização Mundial da Saúde (OMS) como área de carência sub-clínica
grave. Calcula-se que o número de crianças com carência marginal de vitamina
A seja de cinco a dez vezes maior do que o número de crianças com carência
clínica (Kobori, Amaya, 2008; Ramalho, Flores, Saunders, 2002). Estudos
realizados principalmente na região nordeste têm indicado a deficiência de
vitamina A como um grave problema de saúde pública, registrando 14,7 a
54,7% de inadequação dos níveis séricos de retinol (Prado et al., 1995).
Inquéritos bioquímicos confirmam que há deficiência de vitamina A também nos
estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro (Ramalho, Flores,
Saunders, 2002). Os grupos populacionais mais atingidos são as gestantes,
nutrizes e crianças, sendo a faixa etária 3 a 5 anos a mais vulnerável (Batista-
Filho, Rissin, 2003; Ramalho, Flores, Saunders, 2002).
A forma subclínica assintomática aumenta a morbidade e mortalidade
por infecções, diarréia, doenças do trato respiratório (Kabat et al, 2009), e
anemia (West Jr, 2003). Em mulheres grávidas está associada com alta
11
mortalidade durante a gravidez (West Jr, 2003). A deficiência da vitamina A na
dieta ou defeito do metabolismo dessa vitamina são citados como as prováveis
causas de distrofias e disfunções visuais (Kabat et al., 2009). Em alguns casos
não é claro se a ocorrência de hipovitaminose A esteja ligada ao consumo
insuficiente ou a outros fatores envolvidos na biodisponibilidade e bioconversão
dos carotenóides dietéticos (Goswami, Ivanoff, Barua, 2003). A causa primária
das deficiências vitamínicas é a falta ou aporte deficiente dessas substâncias
na dieta (Ramalho, Flores, Saunders, 2002; WHO, 1996).
As principais enfermidades causadas pela hipovitaminose A estão
associadas à visão, na deficiência de vitamina A ocorre a condição chamada
cegueira noturna (nictalopia), e quando se torna mais severa começa a alterar
a integridade ocular afetando principalmente a conjuntiva e a córnea. Ocorre
uma série de alterações oculares que vão desde o ressecamento (xeroftalmia)
até a degeneração total (queratomalacia), geralmente irreversível, da
conjuntiva e/ou da córnea chegando a conseqüente cegueira (Tanumihardjo,
2002), causada pela cicatrização da córnea em uma região que compromete a
passagem da luz para a retina. Essa cicatrização ocorre em decorrência da
inibição da diferenciação das células epiteliais basais causada pela depleção
de vitamina A, o que faz com que estas células sofram queratinização (Vauclair
et al., 2007). Publicações da Organização Mundial de Saúde de 2002 indicam
que pelo menos 250.000 crianças perdem a visão anualmente em
conseqüência da falta de vitamina A em suas dietas.
A hipovitaminose A também tem sido associada a efeitos negativos na
hematopoiese, parece contribuir para o desenvolvimento da anemia (Davey et
al., 2009), acúmulo de ferro nos tecidos em animais submetidos a deficiência
dessa vitamina (Arruda et al. 2009), sugerindo que a deficiência de vitamina A
diminui a mobilização e/ou aumento da absorção de ferro (Roodenburg et al.,
2000). Este é um aspecto importante a ser considerado em países em
desenvolvimento já que as anemias nutricionais constituem um dos principais
problemas de saúde pública.
A hipovitaminose A pode ser diagnosticada por meio de testes
bioquímicos plasmáticos e pelo teste Relativo de Dose Resposta (RDR). A
dosagem plasmática de vitamina A, embora já tenha sido muito usada, possui
algumas limitações, pois o fígado, principal órgão que atua como estoque de
12
vitamina A, mantém os níveis deste micronutriente constantes no plasma de
forma que seus níveis no sangue só declinam quando as reservas hepáticas já
estão esgotadas (Ross, Pasatiempo, Green, 2004; Davila et al., 1985).
No teste de dose resposta (RDR) são diluídas doses de vitamina A em
óleos e oferecidas ao paciente. Amostras do plasma são coletadas e dosadas
no tempo 0 (zero) e 5 horas após a administração das doses. O RDR é um
bom meio de se avaliar o estado nutricional de vitamina A, embora a
necessidade de duas coletas de amostras sangüíneas possa ser um problema
quando se trata de crianças, ou de lactantes, por causa da necessidade da
permanência deles no local de coleta (WHO, 2002).
2.1.2 Metabolismo da Vitamina A
A biodisponibilidade da vitamina A é afetada, entre outros fatores, pelo
estado nutricional do indivíduo e pela integridade da mucosa intestinal. Alguns
fatores nutricionais importantes para a biodisponibilidade da vitamina A são:
proteínas, gorduras, vitamina E e zinco (Almeida-Muradian, Penteado, 2003;
Ramalho, Flores, Saunders, 2002), além da alta prevalência de infecções, a
falta de saneamento ambiental e de água tratada, as condições sócio-
econômicas desfavoráveis e os tabus alimentares aumentam a demanda ou
interferem na ingestão e metabolização da vitamina A pelo organismo
(Ramalho, Flores, Saunders, 2002).
A absorção da vitamina A e dos carotenóides pró-vitamínicos começa
com sua liberação da matrix dos alimentos pela ação de enzimas presentes no
estômago e intestino, e incorporação em micelas compostas por ácidos
biliares, ácidos graxos livres, monoglicerídeos e fosfolipídeos. A eficiência da
liberação é influenciada pela disposição física dos carotenóides no alimento, o
tamanho das partículas trituradas pela mastigação e ação das enzimas e
ácidos estomacais, e da eficiência das enzimas digestivas (Parker, 1996).
O retinol, após incorporação às micelas, é absorvido pela mucosa
intestinal no duodeno, por um mecanismo envolvendo difusão passiva,
semelhante ao do colesterol e triglicérideos, produtos da lipólise. A eficiência
de absorção, ou biodisponibilidade, é maior para vitamina A pré-formada (80-
90%) comparada aos carotenóides (50-60%), e depende tanto de sua
13
polaridade quanto da composição dos ácidos graxos da micela e da eficiência
do organismo na liberação destes da matriz do alimento. Essencialmente todos
os ésteres de retinil ingeridos (vitamina A) são convertidos no lúmen intestinal a
retinol e então absorvido pelos enterócitos (Parker, 1996).
O β-caroteno é a principal fonte alimentar de vitamina A, por ser uma
molécula pró-vitamínica, cada molécula de β-caroteno é clivada para formar
retinal, essa ação é catalisada pela enzima β-β-caroteno 15,15’ monooxigenase
(βCMOOX) localizada no epitélio intestinal, e produz duas moléculas de retinal
que podem ser reduzidas de maneira reversível a retinol ou irreversivelmente
oxidadas a ácido retinóico pela retinal desidrogenase. (Fields, Soprano,
Soprano, 2007).
Ao ser absorvido pelo enterócito o retinol pode permanecer livre ou pode
ser associado à proteína celular ligante de retinol (CBRPII), e em seguida,
independente da fonte alimentar de vitamina A, o retinol é esterificado
novamente a éster de retinil (RE) pela lecitina-retinol-aciltranferase (LRAT) e
incorporado nos quilomícrons. A LRAT esterifica o retinol livre e o retinol ligado
a CRBPII, enquanto a enzima Acil Coenzima A: Retinol Acil Transferase (Acyl
CoA: Retinol Acyl Transferase- ARAT), esterifica apenas o retinol livre no
citoplasma. Tanto os ésteres de retinil quanto os carotenóides intactos são
incorporados aos quilomícrons, os quais são exocitados no sistema linfático
para então caírem na corrente sanguínea e serem transportados até o fígado,
onde os ésteres de retinil serão absorvidos e armazenados nas células
“estreladas” (Parker, 1996;), e em menor quantidade aos tecidos da medula
óssea, baço, tecido adiposo, e os rins (Fields, Soprano, Soprano, 2007).
Nos tecidos, os quilomícrons sofrem ação das Lipases Lipoproteicas
(Lipoprotein Lipase- LPL), permitindo com isso a liberação de ácidos graxos,
carotenóides e dos retinóides livres. Após sofrerem ação da lipase lipoprotéica
os quilomícrons resultantes são denominados quilomícrons remanescentes, e
ao chegarem ao fígado liberam os ésteres de retinil restantes os quais são
incorporados às células parenquimais hepáticas (Figura 03) (Senno, 2004).
14
Figura 03: Ação nos tecidos extra-hepáticos e armazenamento no fígado da
vitamina A adquirida na dieta. A vitamina A atua principalmente como um
hormônio nuclear, na forma de ácido retinóico. No fígado a vitamina A é
estocada no interior das células estreladas na forma de éster de retinil, até que
seja transportada ao restante do organismo ligada a proteína ligante de retinol
(RBP) como retinol. Fonte: Senoo, 2004 com adaptações.
Quando há demanda de vitamina A pelos tecidos os ésteres de retinil
das células parenquimais do fígado se ligam principalmente a CRBP-III e pela
ação da enzima LRAT, são oxidados a retinol e transportados para os tecidos
alvos através da circulação sanguínea ligados a proteína ligante de retinol
(RBP) (Touma et al., 2009; Fields, Soprano, Soprano, 2007). Após captação
pelos tecidos alvos, o retinol pode ser metabolizado por seqüências de reações
de oxidação e produzir duas classes de retinóides biologicamente ativos: o
retinaldeído, por ação da enzima álcool desidrogenase (ADH1,4,5), e o ácido
trans retinóico, pela ação da enzima retinal desidrogenase (RALDH) (Ghenimi
et al., 2009; Manicassamya, Pulendrana, 2009; Parker, 1996). O retinal está
15
presente em concentrações extremamente baixas por ser convertido facilmente
em ácido retinóico, que é capaz de regular a transcrição de alguns genes no
núcleo celular. Alguns tecidos são capazes de produzir ácido retinóico
diretamente do β-caroteno não precisando passar necessariamente a retinol ou
retinal (Fields, Soprano, Soprano, 2007).
Os ácidos retinóicos (RA) possuem em sua estrutura o grupo COOH
ligado ao carbono 15 e inclui várias isoformas, representados principalmente
pelos all-trans-ácido-retinóico (all-trans-RA), o 13-cis-ácido retinóico e o ácido-
9-cis-retinóico (9-cis-RA) (Figura 1), desempenham funções muito importantes,
atuam como potentes hormônios na expressão de centenas de genes, como
por exemplo, nos genes responsáveis pela síntese de enzimas como a álcool
desidrogenase e a transglutaminase, as proteínas transportadoras de retinol,
além de potentes reguladores de diversos processos metabólicos, atuam nos
genes diretamente envolvidos na diferenciação celular e na inibição da
proliferação celular (Mitro et al., 2007; Vauclair et al., 2007; Ross, 2003).
Uma vez no núcleo, os ácidos retinóicos são responsáveis pela ativação
de duas famílias de receptores nucleares, denominados receptores de ácido
retinóico (RAR) e receptor X de retinóides (RXR). Esses receptores possuem
três formas, α, β e γ, codificados por três diferentes genes. Na presença de
seus ligantes naturais, o all-trans-RA é capaz de se ligar com alta afinidade ao
RAR α, β e γ, enquanto o 9-cis-RA, embora se ligue em ambos os receptores,
apresenta maior afinidade pelo ao RXRα, β e γ. Quando ativadas pelo ácido
retinóico, estas proteínas formam o complexo ligante-receptor, formando
dímeros do tipo RAR/RXR ou RXR/RXR, e atuam como fatores de transcrição,
ligam-se a seqüências específicas do DNA, denominadas elementos
responsivos ao ácido retinóico (RARE ou RXRE), localizados na região 5’
regulatória de genes que sofrem regulação pelos retinóides (Ross, 2003).
O all-trans-RA e o 9-cis-RA, por apresentarem alta afinidade por seus
receptores de membrana, tem a produção e catabolismo extremamente
controlados, porém ainda pouco elucidados (Ross, 2003). Uma hipótese é que
as enzimas LRAT e a citocromo da família P450 (família de enzimas envolvidas
no catabolismo de corpos estranhos) especificamente a CYP26 (que degrada o
all-trans-retinol a metabólitos polares) representam um ponto chave na
regulação da homeostase dos retinóides (Ross, 2003). O nível plasmático da
16
proteína RBP é significativamente reduzido com o aumento da concentração
hepática de RA, sugerindo que o aumento de RA hepático sinaliza que os
tecidos periféricos estão com níveis normais de retinóides (Randolph, Ross,
1991). Um outro estudo sugere que o intestino possa ser o ponto de regulação
dos retinóides através da expressão da enzima βCMOOX (β-βcaroteno 15,15
monoxigenase), sugerindo que a regulação dessa enzima é realizada via RAR.
O tratamento de animais com antagonistas de RAR provocou o aumento da
atividade da βCMOOX intestinal (Bachmann et al., 2002). Estudos prévios
demonstraram que essa enzima é citosólica e que sua atividade parece ser
dependente do íon ferroso (Fidge, Smith, Goodman, 2001), porém outros
estudos sugeriram que um ou mais co-fatores celulares também são essenciais
para a plena atividade enzimática em mamíferos (Paik et al., 2001).
17
2.2 Ferro
Do ponto de vista biológico o ferro, é o mais importante dos metais, sem
o qual, a vida não seria possível, exceto para alguns microrganismos da família
Lactobacillus (Crichton et al., 2002). É capaz de formar um número muito
amplo de estruturas, na sua grande maioria complexados a compostos
orgânicos, destacando-se aqueles envolvidos nos processos biológicos
(Monsen, 1999). O ferro é componente essencial de diversas metaloproteínas e
desempenha papel essencial em diversos processos bioquímicos, tais como:
transporte de oxigênio, metabolismo oxidativo e crescimento celular (Lynch,
1997).
A maior parte do ferro corporal está ligada à hemoglobina no sangue, e
em menor quantidade, à mioglobina nos músculos, às enzimas citocromos e
proteínas com centro ferro-enxofre (FeS) envolvidas nas transferência de
elétrons na cadeia respiratória. (Ponka, 2000).
As diversas propriedades químicas do ferro, tais como a capacidade de
formar complexos com compostos orgânicos, o seu potencial óxido-redutor
sendo capaz de alternar entre as formas ferrosa (Fe
+2
) e férrica (Fe
+3
), são
responsáveis pela função indispensável em diversos organismos vivos
(Papanikolaoua, Pantopoulosb, 2005). O oxigênio é capaz de oxidar Fe
+2
à Fe
+3
espontaneamente, desta forma o estado de oxidação mais estável do ferro, em
qualquer que seja o meio que contenha oxigênio é o férrico (Barros, 1992).
Em torno de 1 a 2 mg do ferro dietético são absorvidos diariamente
pelos enterócitos duodenais para repor o ferro perdido. Entretanto, estima-se
que cerca de 20-30 mg de ferro por dia é suprida endogenamente para a
eritropoiese e demais funções. Na medula óssea o ferro é utilizado para a
inserção no anel de porfirina para formação de hemoglobina. O turnover do
ferro é mediado principalmente pela destruição dos eritrócitos senescentes pelo
sistema reticuloendotelial (Beard, 2009). Os eritrócitos, que contém cerca de
80% do ferro corporal, apresentam uma média de 120 dias de funcionalidade
em seres humanos. Ao final de sua vida funcional esses são reconhecidos
como senescentes devido a mudanças na estrutura de suas membranas e são
catabolizados nas células de Kupffer e macrófagos do baço. Após a fagocitose,
a hemoglobina é desnaturada para liberação do heme, esse no espaço
18
intracelular é degradado pela heme oxigenase que libera o ferro. Cerca de 85%
do ferro proveniente da degradação de hemoglobina é novamente liberado
para a circulação em forma de ferro ligado a transferrina ou ferritina. Os
hepatócitos possuem uma reserva fisiológica, estratégica, de ferro de
aproximadamente 1g, mobilizada quando há um desequilíbrio na homeostase
de ferro (Beard, 2009).
Na dieta, o ferro está presente sob duas formas fundamentais, heme e
não-heme ou inorgânico, em dois estados de oxidação, ferroso e férrico, que
respectivamente, podem doar ou receber elétrons facilmente. O ferro hêmico
está presente principalmente nas carnes, enquanto o ferro não-heme encontra-
se presente nos alimentos de origem vegetal e alimentos fortificados. Embora o
ferro hêmico seja mais biodisponível, a forma inorgânica (Fe
+3
) está presente
em maior concentração na dieta (Vander et al., 2005; Martínez-Navarrete et al.,
2002).
O ferro heme refere-se a todas as formas de ferro de origem animal
(Figura 04). Nessa forma o ferro aparece no centro do anel orgânico chamado
de porfirina (composto orgânico formado por quatro anéis pirrólicos ligados por
ligações metínicas (-CH-), que possui no seu centro um espaço apropriado
para acomodar um íon metálico), essa estrutura é encontrada na mioglobina,
hemoglobina, citocromos, peroxidases e citocromo oxigenase (Beard, 2009). O
grupamento heme é o local de transporte de elétrons nos citocromo e
citocromo oxigenase; das peroxidases que protegem as células das lesões
oxidativas ao reduzirem peróxidos a água; é também o local de captação de
oxigênio pela mioglobina e hemoglobina (Zhenyu, 2009).
19
Figura 04: Estrutura química do grupo heme.
O ferro não-heme compreende todas as outras formas de ferro. Nessa
forma o ferro aparece ligado a diversos compostos presentes nos alimentos
sendo liberado no trato gastrointestinal após digestão. Uma vez liberado da
matriz dos alimentos, o ferro não-heme apresenta-se na forma férrica no
estômago e permanece na forma solúvel enquanto o pH do meio se mantiver
ácido. Diversos compostos alimentares podem se ligar ao ferro não-heme,
aumentando ou diminuindo sua biodisponibilidade. O ácido cítrico, alguns
aminoácidos e o ácido ascórbico são promotores da absorção desse
micronutriente. Enquanto os fitatos, polifenóis, taninos, ácido tânico se ligam
aos íons ferroso ou férrico reduzindo a biodisponibilidade (Beard, 2009).
Embora seja um elemento essencial, a absorção de ferro nos mamíferos é
extremamente controlada por mecanismos moleculares, eficazes na
manutenção do equilíbrio entre demandas e oferta, que estabelecem a
homeostase de ferro no organismo (Jamieson & Kuhnlein, 2008; Testa, 2002).
A metabolização do ferro heme tem início com sua liberação das
moléculas de hemoglobina e mioglobina dos alimentos pela ação de enzimas
proteolíticas presentes no estômago e intestino delgado. A proteína carreadora
do grupo heme-1 (HCT1) tem sido apontada como responsável pela absorção
do ferro heme dietético em função de sua alta expressão nos enterócitos do
duodeno. Após absorção, o grupo heme aparece associado a uma vesícula
ligada a membrana citoplasmática. No interior da vesícula o heme é degradado
20
pela enzima heme oxigenase 1 (HO-1) liberando no citosol o ferro na forma
ferrosa (Fe
+2
) que então parece seguir a mesma via que o ferro não hêmico
(Beard, 2009).
A maior parte do ferro não-heme da dieta apresenta-se no trato
gastrointestinal na forma férrica (Fe
+3
), e precisa ser primeiramente reduzido a
forma ferrosa (Fe
+2
), possivelmente por ação da enzima, citrocomo b redutase
(Dcytb) presente na membrana da borda em escova do intestino ou por
agentes redutores presentes na própria dieta. Os íons ferrosos são então
internalizados pelos enterócitos, através da proteína transportadora de metal
divalente (DMT-1), onde são novamente oxidados a forma férrica e incorporado
a ferritina no enterócito ou exportado através da membrana basolateral (Beard,
2009).
Uma vez dentro da célula, o Fe
+2
é oxidado a Fe
+3
incorporado à molécula
de ferritina e armazenado ou transportado até a membrana basolateral, por
uma proteína semelhante a transferrina. Na membrana basolateral, a difusão
do ferro é facilitada pelo transportador transmembrânico, a ferroportina (IREG-
1). Uma outra proteína de membrana, hefaestina, promove a oxidação do Fe
+2
a Fe
+3
que nesta forma, liga-se à proteína transportadora de ferro, a
apotransferrina, que o transporta através da corrente sanguínea às células
alvo, essas células possuem receptores de transferrina. A associação do ferro
com proteínas constituí uma forma de proteção celular contra possíveis danos
oxidativos, catalisados por ferro livre e, facilita a captação deste pelos demais
tecidos (Beard, 2009; Fairweather-Tait, 1997).
Embora a absorção intestinal de ferro heme e não-heme seja distinta, sua
exportação pela membrana basolateral é comum a ambas as formas, e parece
ser regulada pelas reservas de ferro do organismo através de uma sinalização
mediada pelo peptídeo denominado hepcidina (Wang et al., 2006). O controle
da absorção no lúmen intestinal é um ponto chave na regulação da
homeostase de ferro corporal (Beard, 2009; Fairweather-Tait, 1997). Em
situações de baixas concentrações de ferro corporal, observa-se um aumento
significativo nos níveis de mRNA de DMT1 e da Dcytb duodenal, sugerindo que
os genes DMT1 e Dcytb são regulados em sincronia, diferentemente do gene
IREG-1, envolvido na transferência basolateral do ferro (Zoller et al., 2001;
Dupic et al., 2002).
21
O ferro é transportado, entre os sítios de absorção, armazenamento e
utilização, pela glicoproteína plasmática denominada transferrina (Tf), que se
liga fortemente de forma reversível ao ferro. A transferrina é reconhecida por
receptores de membrana específicos denominados receptores de transferrina
(TfR), necessários para a aquisição de ferro pelas células. Após a liberação
intracelular do complexo Tf-TfR, o ferro penetra em compartimentos funcionais
ou é armazenado nas células associado à molécula de ferritina (4000 átomos
de ferro por molécula) (Beard, 2009; Rivera et al., 2005; Hernandez M, Sousa,
2003).
A taxa de produção de transferrina é controlada pelo status de ferro
corporal. Em indivíduos com depleção dos estoques de ferro e concentrações
plasmáticas de ferro diminuídas a produção e concentração plasmática de
transferrina aumentam na tentativa de manter normais as taxas desse nutriente
no organismo. Porém, quando os estoques estão muito baixos, ou seja, na
deficiência de ferro, saturação de transferrina baixa (<15%), o fornecimento de
ferro para a medula óssea é insuficiente para manter normais as taxas de
eritropoiese. A taxa de captação e a localização de captação do ferro a partir
do pool plasmático são proporcionais ao número de receptores de transferrina
expressos na membrana plasmática da célula (Beard, 2009).
Embora o mecanismo de transporte de ferro intracelular ainda não tenha
sido totalmente elucidado, esse mecanismo que envolve a hepcidina é o mais
provável (Figura05) (Beard, 2009). Animais que não expressam hepcidina
apresentam sobrecarga de ferro (Nemeth et al., 2004), enquanto a alta
expressão de hepcidina em ratos e humanos leva a uma redução na absorção
intestinal de ferro e conseqüente anemia ferropriva (Nicolas et al., 2002;
Weinstein, et al., 2002). Assim, quando os estoques corporais de ferro estão
repletos observa-se um aumento na expressão de hepcidina que se liga a
ferroportina e promove sua internalização e degradação, inibindo a exportação
do ferro dos enterócitos. Com o acúmulo de ferro no meio intracelular do
enterócito, o DMT1 é inibido, promovendo a redução da absorção de ferro do
lúmen intestinal. A hepcidina também inibe a liberação de ferro dos macrófagos
(baço) e hepatócitos, agindo sobre a FPN presente nessas células, e nos
trofoblastos placentários (Beard, 2009).
22
Figura 05 . Esquema de regulação da absorção intestinal de ferro pelo
peptídeo hepcidina. Fonte: adaptado de Zimmermann and Hurrell, 2007.
O estado de ferro corporal está relacionado com o sexo, sendo que a
média de ferro corporal total é de cerca de 3,8 g no homem, e 2,3 g na mulher.
Em ambos os gêneros, as concentrações séricas de ferritina se mantêm
estáveis até a adolescência. A partir da adolescência, essas concentrações
aumentam nos homens, estabilizando por volta dos 30-35 anos de vida
McClung & Karl, 2009). Nas mulheres, as concentrações de ferritina são
estáveis entre a menarca e a menopausa, aumentando após a menopausa
(Swanson, 2003; Milman et al., 2004). Maiores concentrações de hemoglobina,
ferritina sérica e consumo de ferro dietético são encontradas nos homens em
relação às mulheres, provavelmente devido ao maior consumo de energia,
carne vermelha e bebidas alcoólicas (Milman et al., 2004; Fleming et al, 2002).
Polla, Polla, Polla (2003) sugerem inclusive que o menor status de ferro nas
mulheres favorece a sua longevidade em relação aos homens.
A mesma propriedade que torna o ferro um elemento essencial ao
metabolismo de alguns organismos, também é responsável por sua toxicidade.
O ferro participa como catalizador de reações de óxido-redução, e conseqüente
23
geração de radicais livre, sendo que o excesso desse nutriente pode levar ao
estabelecimento de uma condição de estresse oxidativo (Maoka, 2009).
Devido à limitada capacidade do organismo em excretar ferro, a
sobrecarga pode ser desenvolvida como resultado de uma hiper-absorção
prolongada de ferro da dieta, por administração parenteral de ferro (via
transfusão de sangue), ou por combinação dos dois fatores, ou ainda por
alguma alteração na mobilização de ferro dos estoques corporais. Pacientes
com sobrecarga de ferro acumulam excessivas quantidades deste em vários
órgãos, inclusive no fígado, pâncreas, e coração, podendo resultar em cirrose
hepática, diabetes e disfunção cardíaca.
A etiologia das doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) como o
câncer, o diabetes, as doenças cardiovasculares e neurodegenerativas e o
envelhecimento precoce tem sido associada a danos oxidativos produzidos por
radicais livres (Britton, Liaaen-Jensen, Pfander, 2004). O ferro pode agir como
agente carcinogênico ou co-carcinogênico através da indução do estresse
oxidativo, facilitação do crescimento tumoral e modificação do sistema imune
(Jun et al., 2009). Estudos in vivo, in vitro, achados clínicos e estudos
populacionais suportam a evidência de que o ferro, por meio da catálise de
reações de geração de EROs e radicais livres (RL), tem participação na
iniciação (dano ao DNA, como a oxidação de bases nitrogenadas e/ou a
quebra de fitas simples ou dupla, e falha em repará-lo), promoção de alteração
fenotípica, onde a anomalia em uma célula leva a desorganização do tecido ou
progressão (desenvolvimento do câncer) da carcinogênese (Englberge et al.,
2009; Jun et al., 2009; Papanikolaou & Pantopoulos, 2005).
O ferro em excesso participa na reação de Fenton reagindo com EROs
menos reativas para produzir EROs mais reativas. O ferro catalisa a reação do
superóxido (O
2
•−
) e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) resultando na formação de
radicais hidroxil (
•
OH), que apresentam maior reatividade quando comparadas
as anteriores. Os produtos de oxidação decorrentes destas macromoléculas
podem iniciar lesão tecidual, direta ou indiretamente (Jun et al., 2009., Halliwell
& Gutteridge, 2007).
Em um estudo onde foram analisadas as fezes de 80 homens
suplementados com sulfato ferroso (19 mg de ferro/dia) foi observado um
aumento nas concentrações de ferro nas fezes de 60 para 300 µmol/L, e de
24
40% em radicais livres, aumentando o risco de desenvolvimento do câncer de
intestino (Lund et al, 1999). Wu et al (2004) realizaram um estudo de coorte
prospectivo com homens e mulheres com idades entre 35 e 74 anos, não
portadoras de câncer no início do estudo. Após 18 anos de acompanhamento
dos indivíduos foi observado um aumento do risco de morte por câncer entre os
indivíduos com altos níveis séricos de ferro, saturação de transferrina ou cobre,
sendo a associação com a saturação de transferrina mais forte entre as
mulheres e com o cobre entre os homens. Knobel et al. (2006) demonstraram
in vitro, usando células humanas de tumores de cólon (HT28 clone 19A), que o
dano ao DNA, o crescimento celular e a geração EROS são aumentados na
presença de Fe
3+
.
O aumento da prevalência do excesso de ferro corporal entre homens,
mulheres pós-menopausa e em idosos saudáveis tem sido também reportado e
atribuído a mudanças nos hábitos dietéticos, como o alto consumo de carne,
álcool e vitamina C, a fortificação de alimentos com ferro e a suplementação
(Milman et al, 2004; Lahti-Koski et al, 2003; Milman et al, 2003; Yuan et al,
2003; Fleming et al, 2002; Milman et al, 2002).
As recomendações de ingestão de ferro foram revisadas, havendo uma
redução para quase todos os grupos populacionais (National Academy of
Science, 2001). Porém, muitos países ainda adotam a fortificação de alimentos
de forma generalizada a toda população, podendo estar expondo a parcela da
população que apresenta estado nutricional de ferro normal a um maior risco
de acúmulo de ferro e desenvolvimento de DCNT.
25
2.3 Interaçao entre Vitamina A e Ferro
A anemia ferropriva e a deficiência de vitamina A constituem as duas
maiores deficiências nutricionais no mundo, as maiores prevalências estão em
áreas geográficas coincidentes, sendo as crianças e mulheres em idade
reprodutiva os grupos mais vulneráveis. E estas duas deficiências podem
ocorrer simultaneamente (WHO, 2002; Monsen, 1999).
Alguns estudos sugerem a existência de um sinergismo entre o
metabolismo de vitamina A e a homeostase de ferro no organismo (Schroeder,
Reddy, Schalinske, 2007; Roodenburg et al., 2000; Roodenburg et al, 1996). A
hipovitaminose A parece promover o acúmulo do ferro nos tecidos e,
conseqüentemente, aumenta a sua disponibilidade para a catálise de reações
de oxidação, como a geração de radicais livres. O fenótipo apresentado na
deficiência de vitamina A é similar ao de indivíduos portadores de
hemocromatose, ou seja, acúmulo de ferro em tecidos. Estes indivíduos
apresentam freqüentemente complicações como cirrose hepática,
cardiomiopatia, diabetes e outras, associados a danos oxidativos catalisados
por ferro (Viatte et al., 2006).
Embora a associação entre o status de vitamina A e ferro tenha sido
relatada na literatura pela primeira vez em 1978 por Hodges et al, o exato
mecanismo de interação entre esses dois nutrientes ainda não é conhecido.
A vitamina A é necessária para eritropoiese, portanto quando há
deficiência de vitamina A, o ferro não é incorporado às células vermelhas do
sangue como em indivíduos normais. Há relato que evidencia a deficiência de
vitamina A associada com a redução na incorporação de ferro aos enterócitos e
redução na concentração de hemoglobina (Lynch, 1997). Também é descrita a
associação entre a redução da vitamina A com redução do ferro sérico, baixa
capacidade de ligação de ferro (TIBC) e saturação da transferrina, aumento na
ferritina sérica, com uma maior deposição de ferro no fígado e baço (Chaston
et al., 2008). No entanto ainda não há consenso sobre o efeito dessa
deficiência na absorção de ferro (Walczyk et al., 2003).
Alguns mecanismos têm sido relatados para explicar esta interação.
Alguns autores sugeriram que a deficiência de vitamina A pode diminuir a
26
síntese de transferrina e assim reduzir o transporte de ferro (Bolem, Wendell,
1990), ou que a deficiência de vitamina A prejudica a captação de ferro pela
medula óssea (Sijtma, Van den Berg, 1993; Bolem, Wendell, 1990), ou ainda
que esta deficiência é resultado de uma eritropoiese ineficiente (Roodenburg et
al., 1996), ou que a deficiência de vitamina A afeta a mobilização de ferro
armazenado nos tecidos (Meija, Chew, 1988).
A literatura tem descrito um efeito positivo da suplementação de
vitamina A no status de ferro em humanos com anemia (Walczyk et al., 2003;
Tanumihardjo, 2002) e em animais com deficiência de vitamina A (Kelleher,
Lonnerdal, 2005). A suplementação combinada desses dois micronutrientes
tem mostrado ser efetiva na redução da deficiência de ferro e anemia ferropriva
quando comparada com a administração de ferro ou vitamina A separadamente
(Constante et al. 2006; Souza, Vilas Boas, 2002).
O efeito do ferro sobre o metabolismo da vitamina A e estado nutricional
também tem sido bastante estudado. Em ratos foi observado que a deficiência
de ferro está associada com baixa concentração de retinol plasmático e
aumento hepático de vitamina A, e o aumento na deposição de vitamina A no
fígado parece estar associada com baixos níveis de hemoglobina sanguínea.
Estes resultados sugerem que o metabolismo de vitamina A é alterado e a
mobilização desta vitamina pode ser prejudicada na deficiência de ferro
(Strube, Beard, Ross, 2002; Rosales et al., 1999).
Strube et al. (2002) investigaram os efeitos da deficiência de ferro e
vitamina A isoladamente e combinados, e relacionaram com dados
bioquímicos, moleculares e hematológicos desses micronutrientes. A restrição
de ferro reduziu o ganho de peso, a ingestão alimentar, e os níveis de
hemoglobina, hematócrito, ferro sérico e saturação de transferrina. Os autores
observaram ainda que a quantidade de ferro dietético afeta a concentração
plasmática e hepática de retinol. A deficiência de ferro esteve associada com
uma baixa concentração de retinol plasmático e aumento na concentração de
vitamina A hepática, indicando insuficiência na mobilização de estoques de
vitamina A hepática durante a deficiência de ferro. A deficiência marginal de
vitamina A não agravou os parâmetros de ferro durante a deficiência de ferro.
Arruda et al. (2009) observaram que ratos com deficiência de
vitamina A apresentaram maiores níveis de estresse oxidativo, e que o
27
estresse foi reduzido quando os ratos receberam alguma fonte de vitamina A.
Os autores observaram ainda que o aumento de danos oxidativos nos ratos
com deficiência de vitamina A foi acompanhado de um acúmulo de ferro nos
tecidos. Estes resultados consubstanciam outros achados que sugerem que a
vitamina A por algum mecanismo modula o metabolismo de ferro e ainda, que
a vitamina A é um antioxidante, cujo mecanismo de ação pode ser mediado
pela regulação do status de ferro no organismo, e não por interação direta com
EROs (Arruda et al. 2009; Luo et al., 2009).
28
2.4 Radicais livres, Espécies Reativas e Estresse oxidativo
O acúmulo de oxigênio na atmosfera da Terra primitiva teve como
conseqüência a seleção e adaptação de organismos vivos para um
metabolismo aeróbico. Os organismos começaram então a interagir com o
meio ambiente visando manter um equilíbrio interno que favorecesse a
sobrevivência, o crescimento e a reprodução, contudo esta mudança levou ao
aumento de mutações genéticas e à aceleração dos processos evolutivos. A
principal vantagem foi a ocorrência de transformações metabólicas
dependentes de oxigênio que levaram à melhor utilização dos substratos
energéticos, permitindo o desenvolvimento de complexos organismos
multicelulares (Halliwell & Gutteridge, 2007; Valko et al., 2007; Fridovich, 1998).
A evolução dos organismos para um metabolismo aeróbico apresenta
vantagens em relação aqueles com metabolismo anaeróbico, incluindo o
melhor aproveitamento de energia derivada dos alimentos. Nos organismos
aeróbicos a oxidação de uma única molécula de glicose produz 36 moléculas
de ATP, enquanto apenas duas moléculas são produzidas em condições
anaeróbicas. A produção de ATP no metabolismo aeróbico envolve a redução
completa do O
2
molecular em H
2
O, na cadeia respiratória mitocondrial, com a
utilização de 4 elétrons. Entretanto, tais benefícios revelaram o potencial tóxico
do O
2
, a redução incompleta da molécula de O
2
pode levar a formação de
espécies químicas intermediárias, altamente reativas e que ameaçam a
integridade celular por meio da oxidação de biomoléculas, as EROs, como
H
2
O
2
e
1
O
2
,e, à geração de RL, como o superóxido (O
2
-
) e hidroxil (
OH). As
EROs podem ser formadas em qualquer compartimento celular, porém a
mitocôndria é o principal sítio de formação (Halliwell & Gutteridge, 2007). Desta
forma, aqueles organismos que conseguiram desenvolver defesas contra estas
espécies radicalares sobreviveram e fazem parte da enorme variedade de
seres aeróbicos que hoje compõem a biosfera (Valko et al., 2007).
29
2.4.1 Radicais livres e Espécies Reativas
Radical livre é uma terminologia dada a todo átomo ou molécula que
possuí elétrons desemparelhados em seu orbital mais externo. A instabilidade
eletrônica que resulta da presença deste elétron desemparelhado torna essas
espécies mais reativas (Halliwell & Gutteridge, 2007; Valko et al., 2007; Yu,
1994).
Uma espécie radicalar pode ser formada a partir da perda ou ganho de
um elétron por uma espécie não radicalar, ou pela dissociação de moléculas
através da fissão homolítica, processo no qual o compartilhamento de elétrons
é interrompido, gerando duas espécies com elétrons desemparelhados. As
espécies reativas embora não apresentem elétrons desemparelhados podem
participar de reações catalisadas por metais de transição, gerando radicais
livres (Valko et al., 2006; Bauer, 2000).
No organismo humano são produzidos em condições normais as
espécies reativas de carbono, enxofre, nitrogênio e oxigênio. Dentre esses se
destacam as EROs devido à alta reatividade e aos danos que podem causar,
principalmente os radicais superóxido (O
2
-•
) e o radical hidroxil (
•
OH). (Valko et
al., 2007).
2.4.2 Espécies Reativas de Oxigênio
O oxigênio é um paradoxo pelo fato de ser um gás essencial a produção
de energia, mas ao mesmo tempo gerar EROs através do metabolismo celular.
Em alta concentração pode ser extremamente prejudicial aos constituintes
celulares. Várias moléculas exógenas, como os poluentes ambientais
orgânicos e inorgânicos, ou processos endógenos, inflamação, doenças
respiratórias, são conhecidas por aumentar a geração das EROs resultando no
esgotamento de antioxidantes (Amado et al, 2009).
O oxigênio molecular apresenta 2 elétrons desemparelhados com spins
paralelos em dois orbitais atômicos distintos, localizados na última camada
eletrônica. Isto explica sua capacidade de agir como um agente oxidante.
Entretanto, para se estabilizar o O
2
no estado basal precisa receber 2 elétrons
30
com spins de mesma direção entre si e antiparalelos aos spins já presentes em
seus orbitais. Esta restrição ao recebimento de elétrons pelo O
2
no estado
basal faz com que o mesmo reaja de forma lenta com espécies não radicalares
(Figura 6) (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Figura 6. Representação da estabilização do O
2
A maneira de contornar este problema é a inserção dos elétrons um a
um podendo ocorrer a inversão do spin eletrônico e facilitar a redução do O
2
.
Esta capacidade de redução do O
2
, através de etapas, pode levar à produção
de espécies intermediárias de oxigênio como peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e
oxigênio singleto (
1
O
2
) e, à geração de radicais superóxido (O
2
-
) e hidroxil
(
OH). Estima-se que cerca de 1-4% do O
2
consumido pelos mamíferos seja
convertido a O
2
-
e H
2
O
2
. A alta reatividade e os efeitos oxidativos de algumas
destas espécies é que são os principais responsáveis pela toxicidade do O
2
em
organismos vivos (Fridovich, 1998).
A redução do O
2
a H
2
O requer quatro elétrons (Figura 7). Durante este
processo, é possível que ocorra a formação de espécies intermediárias de
oxigênio parcialmente reduzidas, as quais possuem comumente apenas um
elétron desemparelhado e, por isso, são mais reativas que o próprio O
2
(Fridovich, 1998).
O O
2
-
, H
2
O
2
e
OH
são os principais responsáveis pela toxicidade do O
2
.
Dessa maneira, as defesas antioxidantes devem agir de forma a minimizar sua
produção ou maximizar a eliminação destes compostos quando sua produção
não pode ser evitada (Fridovich, 1998; Halliwell & Gutteridge, 2007).
31
Figura 7 – Reação de redução do O
2
a H
2
O com formação de EROs
2.4.2.1 Oxigênio Singleto (
1
O
2
)
É formado de acordo com a quantidade de energia absorvida, um dos
elétrons do O
2
pode ter a direção de seu spin invertida, pareando com o elétron
de spin antiparalelo presente no outro orbital atômico, ou o elétron pode
manter-se no mesmo orbital atômico, porém ocorre a inversão do spin,
tornando a molécula mais reativa e conseqüentemente tendo uma meia-vida
curta. É altamente reativo no sistema biológico, capaz de inativar proteínas,
provocar peroxidação lipídica e danos ao DNA (Halliwell & Gutteridge, 2007).
2.4.2.2 Peróxido de Hidrogênio (H
2
O
2
)
O peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) é um agente oxidante relativamente
fraco, é menos reativo quando comparado as outras EROs. Em organismos
com um balanço adequado entre produção de radicais livres e defesas
antioxidantes a maior parte do radical superóxido produzido é consumido em
uma reação de dismutação espontânea ou catalisada enzimaticamente pela
superóxido dismutase (SOD), cujo produto final é o H
2
O
2
(Halliwell, 1994).
Porém, uma série de enzimas, tais como xantina-oxidase e diversas oxidases,
são capazes de produzir in vivo H
2
O
2
(reação I). Os níveis de xantina oxidase
aumentam em condições de trauma e hipóxia (Valko et al., 2006; Bauer, 2000).
2O
2
-
•
+ 2H
+
→ H
2
O
2
+ O
2
(I)
O que faz com que o H
2
O
2
seja potencialmente danoso é a sua
facilidade de difusão através de membranas biológicas e sua alta estabilidade.
Dessa forma, o H
2
O
2
produzido na mitocôndria alcança facilmente outros
compartimentos intracelulares, podendo causar danos oxidativos inclusive no
núcleo celular. Apesar disso, existem uma série de compostos (metais de
32
transição, enzimas e pequenas moléculas) capazes de decompor o H
2
O
2
,
impedindo seus efeitos (Hermes-Lima, 2004).
2.4.2.3 Superóxido (O
2
- •
••
•
)
O radical superóxido (O
2
- •
) é produzido principalmente em sistemas
biológicos devido a reduções incompletas do O
2
, acontece com cerca de 0,1-
0,2% do O
2
consumido pelos vertebrados. A maior parte do O
2
consumido pela
respiração celular é reduzido pela enzima citocromo c oxidase, a qual, pela
presença de dois grupamentos heme e dois grupos prostéticos de cobre,
favorece a redução do O
2
a H
2
O sem a liberação de intermediários (Valko et al.,
2006; Fridovich, 1998). Quando ocorre o escape de elétrons, a redução do O
2
não é tetravalente, ocorrendo a formação do radical O
2
-•
, principalmente na
mitocôndria (Bauer, 2000; Babior 1990).
O radical O
2
-•
pode agir tanto como um agente redutor como agente
oxidante. A reatividade varia de acordo com o composto que reage, é
relativamente baixa, e conseqüentemente apresenta maior meia vida quando
comparado ao radical
•
OH. Paradoxalmente, é a espécie intermediária que
causa maiores danos, uma vez que, devido à sua reatividade seletiva, pode
difundir-se por maiores distâncias, alcançando diferentes alvos oxidativos
(Valko et al., 2006; Fridovich, 1998).
Este radical pode iniciar uma seqüência de reações que levam a
formação de outras espécies reativas de oxigênio não radicalares como o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), e o radical hidroxil (
•
OH) (reações I, II e III). Em
organismos vivos, a enzima superóxido dismutase (SOD), catalisa a
dismutação do O
2
- •
em O
2
e H
2
O
2
. Na presença de metais de transição ou
quinonas, o O
2
- •
transfere elétrons para os peróxidos, e inversamente podem
também atuar como oxidante, convertendo hidroquinonas em semiquinonas
com concomitante produção de H
2
O
2
(reações II, III e IV) (Hermes-Lima, 2004).
33
O
2
+ e
-
→ O
2
-
•
••
•
(II)
2 O
2
-
•
••
•
+ 2H
+
→ H
2
O
2
+
O
2
(III)
H
2
O
2
+
Fe(II)
→
•
••
•
OH +
-
OH + Fe(III) (IV)
Os organismos vivos estão frequentemente expostos a agentes nocivos,
por isso algumas células fagocitárias como os macrófagos, neutrófilos,
monócitos e eosinófilos produzem o radical O
2
- •
••
•
para inativar vírus e bactérias
(Babior 1990). Este radical também é gerado em reações de autoxidação, onde
catecolaminas, tetrahidrofolatos, e flavinas reduzidas reagem diretamente com
o O
2
formando o radical O
2
- •
••
•
(Halliwell & Gutteridge, 2007; Halliwell, 1994).
2.4.2.4 Hidroxil (
•
••
•
OH)
A característica mais relevante do radical hidroxil (
•
••
•
OH) é a sua alta
reatividade com um tempo de meia-vida estimado em 1ns (Halliwell &
Gutteridge, 2007). Em organismos vivos, devido a sua alta reatividade, pode
reagir com todas as biomoléculas próximas do local que é gerado, provocando
danos em DNA, lipídeos e proteínas, podendo assim inviabilizar uma célula
originando um quadro de apoptose celular (Halliwell & Gutteridge, 2007; Bauer,
2000). O dano ao DNA pode resultar em interrupção ou indução da transcrição,
indução de sinais para a transdução, erros de replicação e instabilidade
genômica. Esse dano é o primeiro passo envolvido na mutagênese,
carcinogênese e no envelhecimento (Halliwell & Gutteridge, 2007).
O radical hidroxil pode ser formado a partir das espécies reativas
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e do radical superóxido (O
2
- •
••
•
) com um metal de
transição na sua forma reduzida, tais como ferro e cobre conforme as reações
de Fenton e Haber-Weiss (reações V, VI e VII) (Yu, 1994). Na reação de
Fenton a formação do
•
OH ocorre através da redução do H
2
O
2
, processo que
resulta na quebra da ligação O-O, onde o doador de elétrons é um metal de
transição na sua forma reduzida. As reações demonstram a formação do
radical hidroxil catalisada por íons cuprosos (Cu(I)) e íons ferrosos (Fe(II)),
respectivamente (Halliwell & Gutteridge, 2007).
34
Cu (I)
+ H
2
O
2 →
Cu (II) +
-
OH +
•
••
•
OH Reação de Fenton (catalisada por Cu
+1
) (V)
Fe (II)
+ H
2
O
2 →
Fe (III) +
-
OH +
•
••
•
OH Reação de Fenton (catalisada por Fe
+2
) (VI)
Fe (III) + O
2
-
•
••
•
→
Fe (II)
+ O
2
________________________________
O
2
-
•
••
•
+ H
2
O
2
→
O
2
+
-
OH +
•
••
•
OH Reação de Haber-Weiss (VII)
Os complexos com íons metálicos podem ainda reagir com agentes
redutores presentes no meio intracelular, como por exemplo, o ácido ascórbico
(vitamina C) e radicais O
2
- •
••
•
. Dessa forma o radical hidroxil pode ser formado a
partir do ciclo redox dos íons Fe (III) e Cu (II) (ver reações VIII a XI) (Halliwell &
Gutteridge, 2007; Babior, 1990). O ácido ascórbico reduz espécies reativas e
participa do mecanismo protetor contra peroxidação, o gene responsável pela
síntese de ácido ascórbico não é transcrito em humanos e em alguns outros
mamíferos, embora esteja presente no genoma. Essa a via endógena de
síntese é fonte de EROs, portanto a perda da capacidade de sintetizar ácido
ascórbico é considerada benéfica, visto que a dieta é capaz de suprir a
deficiência endógena (Cerqueira et al, 2007).
Cu (II) + ascorbato → Cu (II)-ascorbato → Cu (I) + radical ascorbil (VIII)
Cu (I) + O
2
→ Cu (II) + O
2
-
(IX)
2 O
2
-
+ 2H
+
→ H
2
O
2
+ O
2
(X)
Cu (I) + H
2
O
2
→ Cu (II) + OH
-
+ ·OH (XI)
2.4.2.5 Radicais Peroxil e Alcoxil
O radical hidroxil (OH
•
) ao reagir com compostos orgânicos produz um
carbono radicalar (R
•
) que em condições aeróbicas reage com o oxigênio
dando origem aos radicais alcoxil (RO
•
) e peroxil (RO
2
•
) (reação XII). A química
do radical peroxil varia de acordo com a natureza do radical R, o meio e a
concentração de O
2
e outros reagentes. (Goetz, 2008; Babior 1990).
R
•
+ O
2
→
RO
2
•
(XII)
35
A ação das EROs sobre as membranas biológicas promove reações em
cadeia, que resultam na peroxidação de fosfolipídios de membrana contendo
cadeias de ácidos graxos insaturados, resultando na formação de
hidroperóxidos lipídicos. Apesar dos peróxidos orgânicos (ROOH) serem
relativamente estáveis a temperatura ambiente, a exposição destes a metais de
transição, ao aquecimento ou aos raios UV, provoca sua decomposição
levando também a geração de radicais de alcoxil (RO
•
) e peroxil (ROO
•
)
(reações XIII e XIV). A oxidação de lipídios em condições de estresse oxidativo
e a ação das prostaglandinas H sintetases 1 e 2, que participam da síntese de
prostaglandinas, constituem processos significativos na geração destes
radicais (Valko et al., 2006; Fridovich, 1998; Emerit, 1994).
ROOH + Fe (III) →
RO
2
•
+ Fe (II) + H
+
(XIII)
ROOH + Fe (II)
→ RO
•
+ OH
-
+ Fe (III) (XIV)
Os radicais peroxil estão envolvidos na clivagem do DNA e na
modificação do esqueleto carbônico da proteína. (Halliwell & Gutteridge, 2007;
Emerit, 1994).
2.4.3 Espécies Reativas de Nitrogênio
O principal radical livre de nitrogênio é o óxido nítrico (NO
•
), é um radical
alcoxil, é sintetizado nos organismos vivos na presença de oxigênio a partir da
L-arginina durante a conversão da arginina a citrulina, por ação da enzima
óxido nítrico sintase (NOS). Quando exposto ao ar, o radical óxido nítrico reage
com o O
2
formando o gás dióxido de nitrogênio (NO
2
•
), espécie reativa de
nitrogênio de maior reatividade que o NO
•
(Halliwell & Gutteridge, 2007).
O interesse no estudo do NO
•
começou a partir da descoberta da
capacidade deste ativar a enzima guanilato ciclase aumentando os níveis de
GMP cíclico com conseqüente queda nos níveis intracelulares de cálcio,
resultando no relaxamento muscular, dilatação dos vasos e conseqüente queda
da pressão sanguínea (Halliwell & Gutteridge, 2007; Valko et al., 2006).
36
O NO
•
tem uma meia-vida de segundos em ambiente aquoso e maior
estabilidade em meios com baixa concentração de O
2
. Por ser solúvel em meio
aquoso e lipídico, o NO
•
difunde-se pelo citoplasma e atravessa a membrana
plasmática. Atua como importante sinalizador biológico em diversos processos
como neurotransmissão, regulação da pressão sanguínea, mecanismos de
defesa, relaxamento dos músculos lisos e na regulação do sistema imune. No
meio extracelular, o NO
•
reage com H
2
O e O
2
para formar nitrato e nitrito.
Durante os processos inflamatórios as células do sistema imune produzem O
2
- •
e NO
•
, que reagem entre si formando uma espécie reativa com maior potencial
oxidativo, o ânion peroxinitrito (ONOO
-
) que pode causar fragmentação do DNA
e oxidação lipídica (Valko et al., 2007).
2.4.4 Estresse Oxidativo
Estresse oxidativo é definido como a condição na qual ocorre um
desequilíbrio entre a produção fisiológica de EROs e ação das defesas
antioxidantes favorecendo os efeitos oxidativos danosos (Halliwell &
Gutteridge, 2007). As células, apesar de produzirem continuamente RL e EROs
durante o metabolismo aeróbico, produzem simultaneamente antioxidantes
para combatê-los, evitando assim o estresse oxidativo. A produção intracelular
de EROs não implica necessariamente toxicidade celular, isso somente irá
ocorrer quando sua produção ultrapassar a capacidade das defesas
antioxidantes ou afetar a sinalização redox, interferindo na funcionalidade das
células (Jones, 2006), e conseqüentemente, resultando em patologias
decorrentes da ação dos radicais livres sobre as biomoléculas (Halliwell &
Gutteridge, 2007).
Os danos causados pelos radicais livres às biomoléculas, através da
destruição de membranas biológicas, mutações gênica, alteração de
receptores bioquímicos e outros processos podem resultar em condições
patológicas (Valko et al., 2007; Cooke et al., 2003).
O estresse oxidativo parece estar relacionado a etiologia de diversas
doenças crônico não-transmissíveis, tais como, doenças cardiovascular,
câncer, diabetes, doenças neurodegenerativas; também tem sido comumente
associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias e auto-imunes, infecção
37
por HIV, quadros de isquemia e reperfusão devido a transplantes de órgãos
(Asare et al., 2009; WHO/FAO, 2003; ). As doença crônicas não-transmissíveis
compreendem aquelas desenvolvidas ao longo da vida como resultado de uma
interação entre características genéticas e influências ambientais, estas últimas
representadas principalmente por hábitos alimentares inadequados, o
tabagismo, poluição, sedentarismo e o consumo de bebidas alcoólicas (Block
et al., 2002).
Tanto o excesso como a deficiência de micronutrientes podem
potencializar danos oxidativos ao DNA, lipídeos e proteínas. A perda da
homeostase desses nutrientes pode acontecer devido a erros inatos do
metabolismo e/ou consumo excessivo de micronutrientes (Block et al., 2002).
Nos países em desenvolvimento, como o Brasil, as doenças carenciais
coexistem com as DCNT que, em sua maioria, estão associadas ao excesso de
nutrientes (Brasil, 2007). A prevalência das DCNT tem aumentado no mundo e,
este cenário tende a se intensificar com o envelhecimento da população (Brasil,
2006). Mundialmente, a mortalidade por doenças crônicas em 2001 foi de 46%
e estima-se que atinja 57% em 2020 (WHO/FAO, 2002). No Brasil, houve um
aumento de 34% para 48% de 1979 a 2003 (Brasil, 2006).
2.4.4.1 Agentes Oxidantes (Pró-oxidantes)
Agentes oxidantes ou pró-oxidantes são substâncias endógenas ou
exógenas que possuem a capacidade de oxidar moléculas-alvo devido à maior
geração intracelular de EROs e conseqüente deficiência dos mecanismos
antioxidantes (Figura 8). Dentre algumas moléculas exógenas que fazem parte
dos agentes oxidantes podemos citar a radiação ionizante, medicamentos,
cigarro, ozônio, poluentes ambientais e alguns micronutrientes dietéticos. No
grupo das moléculas endógenas estão algumas enzimas da cadeia respiratória,
inflamações, peroxissomos e fagócitos. Alguns metais de transição,
principalmente ferro e cobre, provenientes de fontes dietéticas são utilizados
como doadores de elétrons nas reações que desencadeiam a formação de
alguns radicais livres, potencializando o efeito dessas no organismo (Cerqueira,
Medeiros, Augusto, 2007; Young, Lowe, 2001; Guven et al., 2000)
38
Figura 8. Esquema da regulação fisiológica entre oxidantes e antioxidantes. Os
antioxidantes (ANTIOX) endógenos incluem enzimas: superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPX), peroxirredoxinas (PRX) e
tiorredoxinas (Trx); compostos de baixo peso molecular: ácido úrico (AU); ácido
lipóico (AL); coenzima Q (CoQ) e glutationa (GSH); tiol proteínas, como
albumina, peroxirredoxinas e tiorredoxinas, e proteínas
armazenadoras/transportadoras de íons de metais de transição. As defesas
antioxidantes exógenas referem-se aos antioxidantes obtidos por meio da
alimentação, sendo os mais estudados o ácido ascórbico (Asc), α-tocoferol (α-
TH), carotenóides (CAR) e polifenóis. Fonte: Cerqueira, Medeiros, Augusto,
2007 com adaptações.
39
2.4.4.1.2 Marcadores de Danos Oxidativos a Biomoléculas
2.4.4.1.2.1 Peroxidação Lipídica
Em termos gerais, a peroxidação lipídica é o processo, segundo o qual,
ocorrem oxidações sucessivas em lipídeos insaturados, se inicia com a
oxidação dos ácidos graxos insaturados devido ao excesso de radicais livres,
principalmente radicais
•
OH, com conseqüente formação de radicais de ácidos
graxos e hidroperóxidos de lipídeos (L
•
ou LOOH
•
, respectivamente). Levam a
alteração da fluidez das membranas, alterando, portanto seu funcionamento e
podendo até rompê-las (Montine, Quinn, Montine, 2003). O termo é largamente
conhecido pela indústria alimentícia, uma vez que é o principal responsável
pela rancidez de óleos, carnes e derivados (Girotti, 1998).
Este processo parece ocorrer por sucessivas abstrações de átomos de
hidrogênio do grupamento metil dos ácidos graxos poliinsaturados ou da cadeia
lateral destes por radicais livres. O radical resultante desta reação pode então,
ao interagir com O
2
, formar radicais peróxidos (Montine, Quinn, Montine, 2003;
Guven et al., 2000; Henle, Linn, 1997). Os lipídeos hidroperóxidos alteram a
estrutura, propriedades e função das membranas celulares (Girotti, 1998), além
de constituírem fonte de aldeídos reativos, como o MDA, que são capazes de
causar danos ao DNA e proteínas, resultando em processos mutagênicos
(Toyokuni et al., 1994).
Os níveis de malondialdeído (MDA) são utilizados para avaliar a
peroxidação lipídica em tecidos, sendo quantificado por cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC), ou por espectrofotometria através do teste de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs), que identifica compostos
que apresentam reatividade com o ácido tiobarbitúrico (TBA). O teste
espectrofotométrico tem sido criticado na literatura, pois pode superestimar os
níveis de peroxidação lipídica, pois diversos produtos da oxidação de lipídeos
que não apenas o malondialdeído são capazes de formar complexos com o
TBA.
40
Figura 9. Reação do TBA (1) e MDA (2) resultando no complexo TBA-MDA.
Fonte: Griffiths et al, 2002.
O processo de peroxidação lipídica ocorre em três etapas: iniciação,
propagação e terminação (Figura 10) (Halliwell & Gutteridge, 2007). A iniciação
é caracterizada pela abstração de um átomo de hidrogênio do lipídeo (LH),
devido à presença do agente oxidante, formando um radical lipídico (L
•
), que
posteriormente reage com o O
2
liberando o radical peroxil (LOO
•
). A
propagação da peroxidação lipídica caracteriza-se pela reação do LOO
•
com
outro lipídeo, ocorrendo nova abstração do átomo de hidrogênio e liberando
nova molécula de L
•
e um lipídeo hidroperóxido (LOOH). O LOOH pode reagir
com metais de transição, liberando tanto radical alcoxil (LO
•
) quanto radical
peroxil (LOO
•
). Na terminação os peróxidos se combinam, formando moléculas
mais estáveis (Cerqueira, Medeiros, Augusto, 2007).
Figura 10. Representação esquemática das fases de peroxidação lipídica.
Fonte: Cerqueira, Medeiros, Augusto, 2007.
Os processos de peroxidação lipídica são considerados os principais
responsáveis por causar dano e morte celular, os produtos de peroxidação
lipídica (aldeídos e radicais peroxil e alcoxil) podem interagir com bases
41
nitrogenadas e proteínas transmembrânicas aumentando os danos celulares.
Várias condições patológicas estão relacionadas à peroxidação lipídica. Isto
ocorre porque os produtos formados são potencialmente tóxicos, como é o
caso principalmente dos aldeídos e dos hidroperóxidos (Halliwell & Gutteridge,
2007). O MDA, assim como outros produtos da peroxidação lipídica, também
possui efeito mutagênico e carcinogênico (Valko et al., 2006).
2.4.4.1.2.2 Peroxidação Protéica
A oxidação de proteínas está intimamente relacionada aos processos de
envelhecimento e de desenvolvimento de desordens neurodegenerativas. Uma
vez oxidadas, as proteínas tornam-se alvos de degradação por proteases
endógenas. Este processo proteolítico diminui o acúmulo de proteínas sem
função bioquímica adequada (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Na oxidação protéica pode ocorrer a introdução de um novo grupo
funcional, como o hidroxil e o carbonil, que levam a uma alteração da função e
do turnover protéico (Valko et al., 2007). O radical
•
OH promove a abstração de
um átomo de hidrogênio da cadeia polipeptídica da proteína resultando na
formação de um radical de carbono central, que reage com O
2
formando o
radical peroxil, este reage com a forma protonada do O
2
- •
(HO
2
•
) originando o
alcoxil peróxido. Na ausência de metais de transição, as proteínas são
resistentes à ação do H
2
O
2
, mas os radicais hidroxil e alcoxil podem provocar a
clivagem das ligações peptídicas (Griffiths et al., 2002)..
A maior evidência de que EROs são capazes de interagir com proteínas
é a presença de proteínas carboniladas em condições de estresse oxidativo,
geradas pela quebra e oxidação da cadeia polipeptídica ou pela oxidação das
cadeias laterais dos aminoácidos como arginina, lisina, prolina e treonina. Os
níveis de proteínas carboniladas tem sido utilizado como um dos marcadores
de estresse oxidativo, sendo considerado um biomarcador genérico, pois é
produto da oxidação de diferentes aminoácidos (Figura 11) (Stadtman &
Levine, 2000).
42
Figura 11. Formação do grupamento carbonil. Fonte: Griffiths et al.,
2002.
2.4.4.2 Agentes Antioxidantes
O desenvolvimento dos organismos aeróbicos somente tornou-se
possível graças às adaptações biológicas que levaram ao desenvolvimento de
defesas antioxidantes contra a toxicidade do oxigênio e espécies derivadas
deste (Cerqueira, Medeiros, Augusto, 2007).
Por definição um antioxidante constitui qualquer substância que em
baixa concentração comparada com uma substância oxidante, retarda ou inibe
a velocidade de oxidação do substrato (Englberge et al., 2009). De maneira
geral, o sistema de defesas antioxidantes é composto por defesas enzimáticas
e não enzimáticas.
Os principais mecanismos de ação de compostos antioxidantes incluem:
captadores de radicais e supressores de estados excitados; sistemas
catalíticos que neutralizam ou eliminam EROs/ERNs e a ligação de íons
metálicos a proteínas, o que os torna indisponíveis para a produção de
espécies oxidantes (Cerqueira, Medeiros, Augusto, 2007). Entre os principais
antioxidantes encontrados no plasma humano estão proteínas/peptídeos com
grupamento tiol (SH) (800-1000 µmol/L), sendo a albumina a principal
representante; ácido úrico (150-400 µmol/L); ácido ascórbico (30-150 µmol/L);
tocoferol (20-50 µmol/L) e carotenóides (0,08-3 µmol/L) (Cerqueira, Medeiros,
43
Augusto, 2007). De maneira geral as defesas antioxidantes podem ser
classificadas em: enzimáticas e não-enzimáticas.
2.4.4.2.1 Defesas enzimáticas
Os antioxidantes enzimáticos incluem as enzimas: superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase dependente de selênio (SeGPx
ou GPX), glutationa-S-transferase (GST) e glutationa-redutase (GR), que
protegem as células dos efeitos tóxicos dos radicais livres (Valko et al., 2007).
O sistema de defesa enzimático começou a ser descrito na década de
60, com a descoberta da enzima superóxido dismutase (SOD), essa enzima
converte O
2
•-
em H
2
O
2
através de um reação de dismutação do radical O
2
•-
,
constitui a primeira defesa do organismo contra as EROs. Possui diversas
isoformas, cada uma sendo caracterizada pelo tipo de metal que compõe seu
grupo prostético (Fridovich, 1998). Nas células de mamíferos a enzima SOD
mitocondrial é dependente de Mn (MnSOD), enquanto a citosólica é
dependente de Cu e Zn (CuZnSOD). Devido à atividade da enzima SOD gerar
como produto final H
2
O
2
, a eficiência de sua ação é dependente da atividade
de duas outras enzimas para remoção deste produto, a catalase e a glutationa
peroxidase (GPX) (Valko et al., 2007).
A CAT é responsável pela degradação do H
2
O
2
a H
2
O e O
2
, enquanto a
SeGPx, catalisa reações de degradação de peróxidos orgânicos e inorgânicos,
através da oxidação da glutationa. A redução da glutationa-oxidada (GSSG) a
glutationa reduzida (GSH) é catalisada pela enzima glutationa redutase (GR) e
libera duas moléculas de água, utilizando como co-fator a nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH). A SeGPx e a GR são encontradas no
citoplasma e na mitocôndria. A enzima GPx possui atividade de glutationa-
peroxidase independente de selênio, reduzindo peróxidos orgânicos (Englberge
et al., 2009; Valko et al., 2007). Por ser o maior sítio de geração de radicais
livres, a mitocôndria possui alta atividade de enzimas antioxidantes como GR,
SOD e GPX, em ambos os lados das suas membranas, em relação aos demais
compartimentos celulares, para minimizar o estresse oxidativo (Figura 12)
(Valko et al., 2007).
44
Figura 12. Esquema de ação das defesas antioxidantes enzimáticas. Fonte:
Halliwell & Gutteridge, 2007.
2.4.4.2.2 Defesas não - enzimáticas
O sistema não-enzimático de defesas antioxidantes é composto por
antioxidantes de baixo peso molecular. Estes podem ser substâncias
produzidas pelo próprio organismo ou obtidas da dieta. Os componentes
celulares não são protegidos totalmente por antioxidantes endógenos, dessa
forma os antioxidantes obtidos da dieta parecem auxiliar nas defesas contra
oxidação, tendo importante papel na manutenção da saúde. Os benefícios para
a saúde associados ao consumo de frutas e hortaliças devem-se, em parte, à
presença de antioxidantes nestes alimentos. Os compostos antioxidantes
podem reagir de duas maneiras distintas, diretamente com um radical livre,
neutralizando-o, ou impedindo a sua formação (Cerqueira, Medeiros, Augusto,
2007).
Dentre os agentes antioxidantes não enzimáticos seqüestradores de
elétrons estão os metabólitos como lactato, piruvato e ácido úrico, outras
substâncias endógenas como o hormônio do crescimento (GSH), estrógenos,
ácido lipóico, melatonina e bilirrubina, e por fim, os chamados fitonutrientes,
largamente encontrados nos denominados alimentos funcionais, como os
polifenóis, os flavonóides, o ácido ascórbico, o
α-tocoferol, os carotenóides,
45
como o β-caroteno, as xantofilas e o licopeno. Há também os seqüestradores
de origem não-biológica, utilizados, em estudos in vitro. Os mais comuns são:
benzoato, 2-desoxirribose, butil hidroxi tolueno (BHT), dimetilsulfóxido (DMSO),
tiouréia e compostos furanosídicos. (Asare et al., 2009).
No grupo de antioxidantes que atuam impedindo ou dificultando o início
das reações de formação de EROs os mais estudados são desferroxamina
(DFO), ácido etileno diamino tetracético (EDTA), ácido dietileno triamino
pentacético (DTPA), ácido N,N´-o-hidroxi benzil etileno diamino diacético
(HBED), e piridoxal isocotinoil hidrazona (PIH). Normalmente, essas moléculas
agem como quelantes de metais de transição, principalmente de ferro e cobre
(Block et al., 2002).
As defesas não-enzimáticas compreendem ainda as proteínas que se
ligam aos metais de transição, como a transferrina, a ferritina e a
ceruloplasmina não deixando esses metais disponíveis para catalisarem
reações, como a reação de Fenton (Block et al., 2002).
Os mecanismos de ação antioxidante do ácido ascórbico, α-tocoferol,
carotenóides e polifenóis in vitro são conhecidos. No entanto, estudos tem sido
desenvolvidos na tentativa de estabelecer a eficiência de absorção no trato
gastrointestinal, biodisponibilidade, mecanismo de ação e recomendações
desses compostos para consumo humano. Há perspectivas de que
antioxidantes dietéticos possam ser usados futuramente no tratamento de
doenças cuja gênese envolva processos oxidativos (Jun et al., 2009).
A vitamina E é relatada como um dos antioxidantes mais eficazes, sendo
o mais comum e potente antioxidante distribuído na natureza, principalmente
em óleos vegetais, além de ser parte integrante de um sistema de proteção que
envolve outros componentes, dentre eles o ácido ascórbico e as enzimas como
a glutationa redutase, a glutationa peroxidase, a superóxido dismutase e a
catalase (Bianchini-Pontuschka & Penteado, 2003). Os tocoferóis, quando não
esterificados, protegem as membranas celulares por terem a habilidade para
atuar como antioxidante por quelar radicais livres pela doação de hidrogênio
fenólico e elétron (Gregory, 1996). Parece oferecer proteção contra os efeitos
da superdosagem de vitamina A, além disso, acentua a atividade do retinol no
intestino prevenindo assim sua oxidação (Youngson, 1995).
46
É importante frisar que existem antioxidantes certos para cada tipo de
radical livre. Deve-se conhecer o tipo de radical livre lesivo e qual o mecanismo
que este age para poder definir o antioxidante adequado para combatê-lo
(Youngson, 1995).
Estudos recentes sugerem que os antioxidantes são eficazes na
prevenção de DCNT associadas ao estresse oxidativo quando aplicados em
grupos que apresentam concentrações plasmáticas inadequadas desses
compostos (Hercberg et al., 2004; Knoops et al., 2004). Não existem evidências
de que o consumo de alimentos ricos em antioxidantes ao longo da vida
acarrete efeitos prejudiciais. Ao contrário, há fortes evidências epidemiológicas
de que estejam associados a um envelhecimento saudável e à longevidade
funcional (Hercberg et al., 2004; Knoops et al., 2004). A maioria dos estudos
que apresentam resultados controversos utilizam antioxidantes em doses de
suplementos (Asare et al., 2009, Young, Lowe, 2001).
Asare et al. (2009) estudaram o efeito da combinação das vitaminas A e
E sobre o câncer hepático iniciado por EROs, em ratos tratados com
sobrecarga de ferro na dieta. Os animais foram divididos em quatro grupos, um
grupo controle (dieta AIN-93G), três grupos com sobrecarga de ferro (2,5% de
ferro pentacarbonil), sendo um sem uso de antioxidante e dois outros tratados
com diferentes doses de vitamina A e E (42xRDA e 10xRDA, respectivamente),
e um quarto grupo com dieta deficiente em vitaminas A e E. O estudo teve
duração de 32 meses, sendo sacrificados cinco animais de cada grupo após 2
meses, 4 meses e em seguida a cada 4 meses até os 2 anos e ao final de 32
meses. Os autores observaram que a suplementação de vitamina A e E
reduziu os efeitos do estresse oxidativo por um período limitado (20 meses),
entretanto, um longo período com altas doses dessas vitaminas não foi capaz
de reduzir o efeito tóxico dos produtos de reações de oxidação e
consequentemente os danos hepáticos. Porém estudos com doses fisiológicas
são necessários para avaliar o potencial antioxidantes dessas vitaminas.
2.4.4.2.2.1 Ação Antioxidante dos retinóides e
carotenóides
47
Na literatura tem sido proposto o papel antioxidante do retinol em
sistemas biológicos, vários estudos procuram esclarecer o mecanismo da
vitamina A em alguns processos envolvendo doenças relacionadas a oxidação
de biomoléculas, e a relação entre a ingestão de vitamina A e a proteção contra
DCNT. Bjelke, em 1975, relatou pela primeira vez algumas evidencias
epidemiológicas sugestivas de que a vitamina A poderia ter um efeito protetor
contra o câncer de pulmão. Entretanto no início de 1980 tornou-se mais forte a
associação entre o β-caroteno e a redução de câncer de pulmão, mas não para
o retinol (Moreno, 1999).
Uma revisão de estudos epidemiológicos publicados na literatura
descreveu que em animais a vitamina A apresenta uma ação preventiva no
desenvolvimento de tumores da bexiga, mama, estômago e pele. Estudos
epidemiológicos também mostraram que o consumo regular de alimentos ricos
em vitamina A pode diminuir a incidência de câncer retal e de cólon (Bianch,
Antunes, 1999; WCRF, 1999). A atividade quimiopreventiva dos retinóides
observada tanto em modelos experimentais de carcinogênese quanto em
alguns tipos de cânceres em humanos, tem sido atribuída à ação do ácido
retinóico sobre a expressão de genes envolvidos com a diferenciação e
proliferação celular (Asare et al., 2009; Lotan, 1996).
O processo carcinogênico é caracterizado por um estado oxidativo
crônico, especialmente na etapa de promoção. Além disso, a fase de iniciação
está associada com dano irreversível no material genético da célula, muitas
vezes devido ao ataque de radicais livres. Desse modo, os nutrientes
antioxidantes podem reduzir o risco de câncer inibindo danos oxidativos ao
DNA, sendo, portanto considerados como agentes potencialmente
quimiopreventivos (Pool-Zobel et al.,1997).
A atividade antioxidante da vitamina A ainda não está bem definida,
porém é sugerido que a vitamina A é capaz de interagir com radicais livres,
como o radical peroxil, interrompendo a propagação da peroxidação lipídica e a
geração de hidroperóxidos (Palace et al, 1999). Tesoriere et al (1993)
demonstraram em células lisossomais que o retinol é um eficaz seqüestrador
de radicais peroxil, sendo capaz de inibir a peroxidação em soluções oxidáveis.
Neste experimento quando as espécies radicalares foram colocadas em
ambientes lipídicos o retinol teve melhor efeito antioxidante que o tocoferol,
48
comparados a meios aquosos. Essa propriedade do retinol foi atribuída a sua
estrutura química menor que a do tocoferol, o que permitiria ter uma maior
mobilidade e uma menor habilidade de interagir com os radicais peroxil nas
membranas. Além de estabilizar os radicais peroxil, a vitamina A pode ser
oxidada diretamente por espécies radicalares estabilizando o radical lipídico.
DAS & PEREIRA (1990) estudaram o uso de antioxidantes naturais em óleos
comestíveis, e observaram que a vitamina A e seus análogos, retinal, ácido
retinóico, acetato e palmitato de retinol, mostraram efeitos antioxidantes
expressivos, podendo ser usados como uma alternativa na inibição da
peroxidação lipídica.
A atividade pró-vitamínica dos carotenóides vem sendo estudada desde
a década de 50, mas foi no inicio da década de 90 que surgiu o interesse no
papel antioxidante destes compostos relacionados a proteção das DCNT
(Hercberg et al., 2004). O β-caroteno, o mais importante precursor da vitamina
A, está amplamente distribuído nos alimentos e possui ação antioxidante. Os
carotenóides são considerados quimiopreventivos, porque inibem,
principalmente, a iniciação e propagação da carcinogênese (Peres et al, 2003).
O β-caroteno, apresenta propriedade de interceptar certos radicais livres e
desativar moléculas reativas de oxigênio singleto, que são geradas como
subprodutos de muitos processos metabólicos normais. Logo, é possível que o
β-caroteno livre circulante tenha efeito protetor na carcinogênese,
independente de sua conversão a retinol, desativando estes tipos de moléculas
ou prevenindo dano oxidativo (Peres et al, 2003).
Os mecanismos de ação dos carotenóides capazes de proteger as
células contra danos oxidativos resumem-se na habilidade destas moléculas
funcionarem tanto como agentes fotoprotetor, contra os efeitos nocivos da luz e
oxigênio, quanto como moléculas reativas contra espécies químicas geradas
dentro das células, capazes de induzir danos oxidativos (Cerqueira, Medeiros,
Augusto, 2007; Young, Lowe, 2001). A habilidade dos carotenóides com a
molécula de O
2
fundamenta-se na estrutura desses compostos, principalmente
as duplas ligações conjugadas que possivelmente captam radicais livres.
Enquanto como agentes fotossensíveis os carotenóides possuem a habilidade
de suprimir as formas tripleto e singleto gerados nas células, via transferência
49
de energia destas, transformando-as na molécula de oxigênio em seu estado
fundamental. A energia então absorvida pelo carotenóide é dissipada na forma
de calor, retornando a molécula ao seu estado basal (Cerqueira, Medeiros,
Augusto, 2007; Young, Lowe, 2001). O carotenóide excitado resultante libera
pouca energia e, portanto, é inofensiva ao meio celular (Cerqueira, Medeiros,
Augusto, 2007; Young, Lowe, 2001).
Diversos fatores, tais como, a estrutura da molécula oxidável, tipo de carotenóide; a
localização e sítio de atuação do carotenóide; a capacidade de interagir com outros
carotenóides e antioxidantes; a concentração do carotenóide e a pressão parcial de oxigênio
influenciam a capacidade antioxidante dos carotenóides em sistemas biológicos (Young, Lowe,
2001). Entre as reações in vitro bem estabelecidas dos antioxidantes carotenóides (CAR),
encontram-se as reações com radical peroxil (ROO
•
) que se dão ao menos por três vias
(reações XV a XVII) (Cerqueira, Medeiros, Augusto, 2007, Young, Lowe, 2001):
CAR + ROO• → CAR•+ + ROO- (transferência de elétrons) (XV)
CAR + ROO• → CAR• + ROOH (abstração de hidrogênio) (XVI)
CAR + ROO• → ROOCAR• (adição) (XVII)
As reações de transferência de elétrons resultam em carotenóides
radicalares na forma de cátion (CAR
+•
), anion (CAR
-•
) ou de um radical alkil
(CAR
•
) (Young, Lowe, 2001). A adição de radicais livres, como radicais
peróxidos (ROO·) pode ocorrer em qualquer ponto da molécula de carotenóide
(CAR), resultando na formação de um carotenóide carbono radicalar. O radical
seria estabilizado interferindo, portanto, na fase de propagação da oxidação,
por exemplo, na peroxidação lipídica (Young, Lowe, 2001).
In vivo, o conteúdo e a composição tecidual de carotenóides são
heterogêneos. Em ambientes apolares, como tecido adiposo e interior de
membranas plasmáticas, a separação de carga é termodinamicamente
desfavorável, e a reação (transferência de elétrons) é improvável para licopeno
e β-caroteno (hidrocarbonetos). Contudo, carotenóides, como zeaxantina,
possuem grupamentos polares, e podem, portanto interceptar radicais no meio
aquoso e na superfície de membranas. Uma vez que o cátion radical
carotenóide (CAR
•+
) é formado, pode oxidar diferentes compostos no ambiente
aquoso (Young, Lowe, 2001).
50
Os radicais carotenóides podem decair por meio de reações com outros
radicais, formando produtos estáveis; ou podem ser estabilizados por
ressonância e, portanto, são pouco reativos. Contudo, os diferentes
mecanismos pelos quais os carotenóides podem captar radicais levam a uma
variedade de radicais carotenóides que, por sua vez, levam a múltiplos
produtos finais. O potencial protetor ou deletério destes produtos finais
depende da natureza do radical, de seu meio ambiente (aquoso ou lipídico) e
de características estruturais, como terminal cíclico ou acíclico, grupos finais
polares ou apolares, propriedades redox, entre outras (Young, Lowe, 2001).
A proteção sinérgica dos diversos carotenóides depende da razão molar
entre estes antioxidantes. Um aumento ou decréscimo de um destes
componentes proporciona um desequilíbrio, podendo gerar uma ação pró-
oxidante. O aumento excessivo na concentração de carotenóides resulta na
formação de carotenóides radicalares (CAR
•
••
•
) muito acima da concentração de
ascorbato e tocoferol. O acúmulo de CAR
•
••
•
propicia a reação com os
carotenóides presentes, produzindo o efeito pró-oxidante nas células (reação
XVIII) (Young, Lowe, 2001; Russel, 2000):
CAR
1
•
+
+ CAR
2
→ CAR
1
+ CAR
2
•
+
(XVIII)
Embora estudos com animais demonstrem que a suplementação com β-
caroteno protege contra o câncer em algumas situações, estudos populacionais
mostraram efeitos nulos ou negativos. O estudo populacional CARET (“The
Beta Carotene and Retinol Efficacy Trial”) realizado com 18000 fumantes norte-
americanos no qual foi administrado β-caroteno e vitamina A na forma de
suplementos, previsto para durar 5 anos, encerrou-se na metade do tempo
devido a uma tendência de aumento no desenvolvimento de câncer de pulmão
e da mortalidade nos indivíduos suplementados (Omen et al., 1996). O estudo
anterior, ATBC “Alpha-Tocopherol Beta- Carotene”, também realizado em
fumantes, apresentou igual tendência nos grupos suplementados com β-
caroteno e β-caroteno e α-tocoferol, o que não foi observado na suplementação
apenas com α-tocoferol. Não há consenso entre os pesquisadores em relação
à atividade pró-oxidante dos carotenóides, mas sugere-se que em sistemas
51
biológicos existem muitos fatores que podem reduzir a eficácia antioxidante
destes compostos (Fields, Soprano, Soprano, 2007).
A participação dos carotenóides nos processos de comunicação celular,
regulação da transcrição de alguns genes e conversão em retinóides pode ser
tão ou mais importante que a atividade antioxidante nos efeitos fisiológicos
atribuídos aos radicais livres (Englberger et al., 2009; Young, Lowe, 2001). Um
dos mecanismos propostos para o efeito antineoplásico do RA quando
associado aos seus receptores (RAR e RXR), seria que o complexo RA-RAR-
RXR se ligaria a proteína ativadora 1 (AP-1) inibindo sua atividade. A AP-1
compreende um complexo protéico, codificado pelos genes c-Fos e c-Jun, que
medeia a sinalização de fatores de crescimento, oncogenes e promotores de
tumores, que usualmente resulta em proliferação celular. Desta forma a perda
da homeostase do RA por indução das CYPs levaria consequentemente a uma
diminuição da sinalização celular por ação do RA, e conseqüente aumento da
expressão de AP-1 (Russel, 2000). Assim, estudos adicionais são necessários
para confirmar se os benefícios dos carotenóides relacionam-se às
propriedades antioxidantes ou a outras atividades biológicas.
Apesar de fortes evidências epidemiológicas estabelecerem essas
associações, o mecanismo de inibição da carcinogênese pela vitamina A e
carotenóides não está completamente elucidado. Assim, o uso de vitaminas e
outros antioxidantes na prevenção e modulação das conseqüências
patológicas dos radicais livres precisa da definição de doses e de protocolo de
tratamento, sendo necessários mais estudos sobre o mecanismo de ação
desses agentes antes da sua prescrição em larga escala (Kabat et al., 2009).
52
3 Objetivos
3.4 Objetivo geral
Avaliar in vivo o efeito da deficiência de vitamina A na concentração de
ferro e no dano oxidativo em tecidos de ratos em diferentes estágios de
depleção.
3.5 Objetivos específicos
• Avaliar a concentração de vitamina A no fígado dos ratos submetidos a
dietas com diferentes concentrações de vitamina A e em diferentes estágios
de depleção;
• Avaliar a concentração de ferro no fígado, baço e intestino dos ratos
submetidos a dietas com diferentes concentrações de vitamina A e em
diferentes estágios de depleção;
• Avaliar a peroxidação lipídica e protéica nos tecidos (intestino, baço,
fígado) de ratos submetidos a dietas com diferentes concentrações de
vitamina A e em diferentes estágios de depleção;
• Verificar possíveis associações entre os níveis de peroxidação lipídica e
protéica com a concentração de vitamina A e ferro nos diferentes tecidos
estudados em diferentes estágios de depleção.
53
4 Materiais e Métodos
4.4 Animais
52 ratos Wistar machos, com 21 dias de idade, foram alojados no
biotério, em gaiolas individuais, com ciclos de luz / escuridão 12/12h, e
temperatura de 22
0
± 2°C. A dieta foi oferecida durante o ciclo de escuridão,
com livre acesso a água. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso
Animal (CEUA) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília,
UnB, UNBDOC n
o
18996/2008.
No início do estudo (T
0
), após três dias de aclimatização, foram
sacrificados por deslocamento cervical 10 animais para determinação dos
parâmetros basais (Grupo T
0
). Os demais animais foram aleatoriamente
separados em dois grupos de tratamento (21 ratos/grupo) e alimentados com
uma das seguintes dietas:
h Grupo Controle (CT): dieta AIN-93G com 35 mg de Fe/kg dieta e 4000UI de
vitamina A. Estes teores correspondem à recomendação de ferro e vitamina A
para roedores (Reeves, 1993).
h Grupo Deficiente em Vitamina A (VA): dieta AIN-93G com 35 mg de Fe/kg
dieta e sem fonte de vitamina A (Reeves, 1993).
Após 15 (T
15
), 30 (T
30
) e 45 (T
45
) dias de tratamento com uma das dietas
descritas anteriormente, 7 animais de cada grupo foram sacrificados. O fígado,
baço e intestino delgado foram retirados e lavados com solução salina para
retirada do excesso de sangue, o excesso de salina removido em papel toalha;
pesados e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -
70º C até a realização das análises.
4.5 Variáveis Analisadas
Ganho de peso: Os animais foram pesados semanalmente em balança de
precisão com capacidade mínima de 0,5g e máxima de 500g ± 0,001g.
Consumo de dieta: foi determinado diariamente através da diferença entre a
quantidade de dieta ofertada e a sobra.
54
Determinação da concentração de retinol hepático
A concentração de retinol hepático foi determinada por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (HPLC), segundo método descrito por Tanumihardjo
& Penniston (2002). Todo processo foi realizado a meia luz. Brevemente, uma
amostra de aproximadamente 0,1 g de fígado foi macerada em
homogeneizador de tecidos (Ultra-Turrax T8, IKA
®
- Werke, Alemanha) à
temperatura de 4ºC, posteriormente ressuspendido em etanol (1,5 × volume) e
agitado durante 15 segundos em vortex. Ao homogeneizado foi acrescentado
KOH 50% (0,8 × volume), em seguida agitado durante 15 segundos e depois
incubado em banho maria a 50 ºC, durante 30 minutos. As amostras foram
homogeneizadas a cada 15 minutos por aproximadamente 15 segundos
durante o período de incubação. Após a saponificação, o retinol foi extraído
com hexano pureza HPLC (2 x volume/3 vezes). A extração foi feita da
seguinte forma: após a adição do hexano, a amostra foi homogeneizada em
vortex durante 30 segundos sendo posteriormente centrifugada a 1000xg
durante 3 minutos para a separação das fases. A fase menos densa, que
continha o hexano, foi retirada e transferida para um tubo limpo, onde o
hexano foi evaporado com nitrogênio gasoso e o extrato estocado a -70ºC em
microtubos protegidos da luz, para evitar oxidação, até leitura no HPLC.
A separação e identificação da molécula de retinol foram feitas utilizando
o Sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, Shimadzu, Sinc
do Brasil Instrumentação Científica Ltda), coluna CLC-ODS (M), com fluxo de 1
mL/min, fase móvel metanol/ água (95:5) e detecção em 325 nm. Para
obtenção do perfil cromatográfico, o extrato foi diluído em 2 mL de etanol
pureza HPLC, filtrada em filtro de membrana de nylon 0,45 µm e 13 mm de
diâmetro (Millipore), o filtrado foi colocado no injetor automático e aplicado 20
µL para análise. As análises foram feitas em duplicata.
Para quantificação foi construída uma curva padrão utilizando o all-
trans-retinol sintético (Fluka Biochemika, retinol ≥ 99% - HPLC) diluído em
etanol. A concentração da solução anterior foi calculada a partir da
absorbância obtida a 325 nm em espectrofotômetro (Pharmacia Biotech,
55
Brasil), utilizando o valor de A
1%
325nm
= 5248. A solução concentrada foi então
diluída 0, 2, 5, 4 e 10 vezes e aplicada no HPLC pelo injetor manual (20 µL),
com fluxo de 1 mL/min de metanol/água (95:5). Tendo como base a
concentração de retinol e a área do pico obtida no cromatograma para cada
diluição, obteve-se então a equação da reta, y = 0,031 – 2,3574x + 43,162; =
0,9998.
Peroxidação lipídica
O nível de peroxidação lipídica no fígado, baço e intestino foram
determinados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), segundo
Candan e Tuzmen (2008) com modificações. Brevemente, cerca de 0,1g de
tecido foi homogeneizado em ácido sulfúrico 1%, com diluição final de tecido :
solução de 1:10 (p/v) utilizando homogeneizador elétrico Ultraturrax (Ultra-
Turrax T8, IKA
®
- Werke, Alemanha). Posteriormente, foi retirada uma alíquota
para dosagem de proteína total e a outra parte do homogeneizado foi
centrifugado a 11.000 x g, a temperatura de 4ºC, por 15 minutos. A uma
alíquota de 500µL do sobrenadante do homogeneizado foram adicionados
750µL de ácido fosfórico 440 mmol/L e 250µL de ácido tiobarbitúrico 42
mmol/L, a mistura foi então agitada no vortex, aquecida a 100ºC durante 1 hora
em banho-maria para formação do complexo ácido tiobarbiturico e
malondialdeído (TBA-MDA). Após resfriamento das amostras, retirou-se uma
alíquota de 500
µ
L e acrescentou-se mais 500 µL de solução metanol pureza
HPLC : hidróxido de sódio 1 mol/L (91:9). As amostras foram centrifugadas por
5 minutos a 11.000 x g, o sobrenadante filtrado em filtro de membrana de nylon
0,45 µm e 13 mm de diâmetro (Millipore), e aplicadas em sistema HPLC
(Shimadzu) utilizando coluna Shim-park C
18
CLC-ODS 25 cm, e detector de
fluorescência. O comprimento de onda de excitação utilizado foi 553nm e a
emissão monitorada a 532nm. O volume de amostra injetado foi de 20 a 30 µL
de acordo com o tecido. A eluição do complexo MDA-TBA foi realizada
utilizando fase móvel metanol : tampão fosfato 50 mmol/L, na proporção de
60:40 com fluxo mantido em 0,6 mL/min, temperatura de 30 ºC, e tempo de
corrida de seis minutos por amostra.
56
A curva padrão de MDA foi feita a partir da hidrólise do composto
1,1,3,3-tetraethoxy-propano 97% (Sigma) em H
2
SO
4
1% e diluído em água
para obtenção das seguintes concentrações: 1,62; 4,04; 8,08; 16,16 nmol/mL.
As soluções padrões ficaram a temperatura ambiente por 2 horas, e em
seguida foram submetidos ao mesmo protocolo descrito anteriormente para os
homogeneizados de tecido. A concentração de MDA foi expressa em nmol de
MDA por mg de proteína total. (y = 2,63
-7
x + 0,01851; r
2
: 0,9986).
A concentração de proteínas totais dos homogeneizados de tecidos
utilizados para as dosagens MDA foi determinada pelo método de Lowry
modificado por Hartree (1972). (y = 0,0127x + 0,0022; r
2
: 0,9978).
Proteína carbonilada
Amostras de aproximadamente 0,1g de fígado, baço e intestino foram homogeneizadas
(Ultra-Turrax T8, IKA
®
- Werke, Alemanha) na proporção de 1:20 (p/v) em tampão Tris HCl 25
mmol/L contendo uréia 6 mol/L (pH 9,0). Foram retiradas 4 alíquotas do homogenizado, 2 para
dosagem de proteína carbonilada, uma para o branco do tecido e outra para determinação de
proteína total. Esta última foi imediatamente congelada até o momento da análise. As outras
três alíquotas de 200
µ
L de homogeneizado foram transferidas para microtubos e 200
µ
L de
ácido tricloroacético (TCA) 20 % adicionados para precipitação das proteínas. Os tubos foram
rapidamente agitados e em seguida centrifugados a 11.000 x g / 2 min. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 200
µ
L do tampão de homogeneização. Aos
tubos contendo amostra foram adicionados 0,7 mL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) 0,2%
em HCl 2 mol/L e aos brancos 0,7 mL de HCl 2 mol/L. As amostras foram agitadas por 15 min a
4
o
C, após agitação foram adicionados 0,7 mL de TCA 20% e novamente centrifugadas a
11.000 x g / 2 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de proteínas foi lavado três
vezes com 1 mL de solução de acetato de etila : etanol (1:1) e centrifugado a 11.000 x g / 2
min. O precipitado foi deixado a temperatura ambiente por 10 min, para evaporação do
excesso de acetato de etila:etanol, e posteriormente ressuspendido em 0,5 mL de tampão
fosfato de potássio 500 mmol/L (pH 2,5), contendo 6 mol/L de cloreto de guanidina, e incubado
a 4
o
C por 30 min em um agitador. Após agitação os tubos foram novamente centrifugados a
11.000 x g / 2 min. A absorbância foi então lida a 375nm. Os cálculos foram realizados
retirando o branco de cada tecido e utilizando o coeficiente de extinção molar do complexo
proteína - dinitrofenil-hidrazina de 22 mM
-1
cm
-1
a 375 nm (Richert et al. 2002). A concentração
de proteína carbonilada foi expressa em nmol de proteína carbonilada por mg de proteína total.
A concentração de proteínas totais no sobrenadante dos homogeneizados de tecidos
utilizados para as dosagens de proteína carbonilada foi determinada pelo método de Lowry
modificado por Hartree (1972). (y = 0,0127x + 0,0022; r
2
: 0,9978).
57
Concentração de Ferro nos tecidos
Foram utilizados aproximadamente 0,1 g de fígado e baço, e 0,4 g de
intestino para determinação da concentração de ferro. Na cápsula de digestão
foram adicionados às amostras 5mL de HNO
3
PA e 2,5 mL de H
2
SO
4
PA. As
amostras foram então digeridas em forno microondas (DGT 100 Plus -
Provecta Analítica), de acordo com a metodologia descrita por Baranowska et
al, 1995, utilizando o seguinte programa: 5 min – 330W; 6 min – 700W ; 1 min –
800W; 20 min – 0W (resfriamento).
Após a digestão, o volume das amostras foi completado para 25 mL com
HNO
3
0,1 mol/L, e filtrado em papel de filtro quantitativo faixa preta e
armazenados em tubos sob refrigeração. A concentração de ferro nas
amostras foi determinada por Espectroscopia de Emissão Atômica (ICP-AES-
Shapes-Spectroflame Modulates – Spectro Analytical Instruments - Kleve-
Germany) induzido por plasma, e como fonte de excitação o gás argônio. Foi
utilizada uma curva padrão construída com padrão de ferro (Titrisol; Merk) nas
seguintes concentrações 0,04; 0,4; 2,5; 5,0; 10 ppm e comprimento de onda
238nm. Os resultados foram expressos em µg de ferro por g de tecido úmido. A
exatidão do método para quantificação de ferro foi determinada utilizando uma
amostra referência (Rice Flour (1568a), United States Department of
Commerce, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg,
Maryland), analisada em triplicata. A exatidão obtida foi de 86%. Todas as
vidrarias utilizadas na realização das análises foram deixadas em HCl 10% por
3 h, e posteriormente lavadas com H
2
O deionizada (sistema Milli-Q, Millipore
Corporation). (Baranowska, Czernicki, Aleksandrowicz, 1995).
58
4.3 Análise Estatística
A análise estática da normalidade dos dados foi realizada pelo teste
Kolmogorov-Smirnov, utilizando o software SPSS (versão 12.0, SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA). Para análise das diferenças intra-grupo (mesmo tratamento
ao longo do período de tratamento) foi utilizado o teste ANOVA múltiplas
comparações com correção de Bonferroni, e para comparação entre grupos foi
utilizado o teste ANOVA fator único, no programa Excel Office 2003. As
análises de correlações entre concentração de ferro e malondialdeído ou
proteína carbonilada nos tecidos foram realizadas utilizando os testes de
Pearson e Spearman, de acordo com a distribuição apresentada pelos dados,
normal ou não-normal, respectivamente, no software SPSS (versão 12.0, SPSS
Inc., Chicago, IL, USA). O nível de significância utilizado foi p < 0,05.
59
5 Resultados
Os grupos controle (CT) e deficiente em vitamina A (VA) apresentaram um
aumento significativo no ganho de peso durante os 45 dias de tratamento. A
deficiência de vitamina A não alterou o ganho de peso e o consumo de dieta
dos animais (Tabela 1).
Após 15 dias de depleção, os animais apresentaram uma redução da
concentração de retinol hepático (57%) em relação ao grupo controle (p =
0,0007). E após 30 dias de depleção não foi mais possível quantificar a
concentração de retinol no fígado dos animais pelo método de cromatografia
liquida de alta eficiência (HPLC) (Tabela 1; Figura 13). No tempo basal (T
0
) os
níveis de hemoglobina foram significativamente menores em relação aos
demais períodos de tratamento, em ambos os grupo CT e VA.
Tabela 1: Ganho de peso, ingestão total de dieta e retinol hepático de animais
controle e deficientes em vitamina A nos tempos 0, 15, 30 e 45 dias de
depleção.
Grupos
Ganho de peso
(g)
Consumo de dieta
(g/período)
Retinol hepático
(µg/g de tecido)
Hemoglobina
(g/dL)
T
0
- -
43,0 ± 10,6
ab; (a)
8,6 ± 1,1
b
CT 15
142,9 ± 11,2
c
323,5 ± 24,39
c
34,8 ± 8,0
b
12,3 ± 1,4
a
VA 15
149,1 ± 12,0
(c)
348,81 ± 23,5
(c)
15,1 ± 3,8
(b)*
12,6 ± 0,7
a
CT 30
233,5 ± 20,3
b
584,6 ± 45,1
b
47,3 ± 7,6
ab
13,2 ± 1,7
a
VA 30
239,1 ± 28,6
(b)
635,4 ± 58,
2(b)
< LD
(c) *
12,3 ± 2,1
a
CT 45
289,4 ± 22,0
a
869,6 ± 72,8
a
51,7 ± 5,5
a
14,2 ± 0,8
a
VA 45
289,9 ± 36,0
(a)
886,3 ± 73,6
(a)
< LD
(c) *
13,7 ± 1,1
a
LD (limite de detecção) = 0,0011 µg/g. Letras diferentes indicam comparação
intra-grupo e letras diferentes entre parênteses comparação intra-grupo VA,
durante os 45 dias de tratamento (p < 0,05). * Comparação entre grupos, no
mesmo período de tratamento (p ≤ 0,05). CT: controle; VA: deficiente em
vitamina A. T0: tempo inicial. Os dados correspondem a média e desvio
padrão, n= 6 animais por grupo.
60
Figura 13: Concentração hepática de retinol (µg/g) dos ratos controle e
deficientes em vitamina A, durante os 45 dias de tratamento. Letras diferentes
indicam comparação intra-grupo CT e letras diferentes entre parênteses
comparação intra-grupo VA, entre os quatro períodos de tratamento (p < 0,05).
*Comparação entre grupos, no mesmo período de tratamento (p ≤ 0,001).
Controle: y = 0,014x
2
– 0,3753x + 41,597; r
2
= 0,7306. Deficiente em vitamina A
(y = 0,031 – 2,3574x + 43,162; = 0,9998). Os dados correspondem a média e
desvio padrão, n= 6 animais por grupo.
Na Figura 14 observa-se um aumento significativo na concentração de
ferro hepático entre 15 e 30 dias nos grupos CT e VA (p = 0,0309; p < 0,0001
respectivamente). O grupo VA apresentou uma redução neste teor entre 30 e
45 dias de tratamento. Entretanto, não foi observada diferença significativa no
teor hepático de ferro entre os dois grupos nos três períodos de tratamento
(Figura 14; Figura 17).
No baço, dos ratos do grupo CT pode ser observada uma oscilação
significativa na concentração de ferro, aumentou no início do tratamento (T
0
a
T
15
– p = 0,0029), com redução significativa com 30 dias (T
15
a T
30
– p =
0,01080) e aumentou novamente com 45 dias de tratamento (T
45
). No grupo
VA, é observado claramente um acúmulo gradual de ferro no baço, durante os
45 dias de tratamento (T
0
, T
15
e T
30
). Com 30 dias o grupo VA apresentou um
61
aumento de ferro em relação ao grupo controle (p = 0,0046), entretanto, após
45 dias, não foi observada diferença significativa nos níveis de ferro, entre os
dois grupos (Figura 14, Figura 18).
No intestino dos animais controle também foi observada uma oscilação no
conteúdo de ferro durante todo o período de tratamento. No início do
tratamento, aos 15 dias, os ratos do grupo controle apresentaram um aumento
na concentração de ferro em relação ao tempo basal (p < 0,0001), havendo
uma redução significativa com 30 dias (p = 0,0307) para, novamente, aos 45
dias, retornar ao valor encontrado com 15 dias de tratamento (p= 0,0038). Os
níveis de ferro intestinal nos animais do grupo VA mantiveram-se constantes
durante os 30 dias de tratamento, sofrendo um aumento significativo aos 45
dias. Entre os grupos, foi observada uma redução significativa nos níveis de
ferro no intestino dos ratos VA até o período de 30 dias (p = 0,0021; p = 0,0016
para T
15
e T
30
, respectivamente). Entretanto, após 45 dias de depleção, os
ratos deficientes apresentaram níveis de ferro semelhantes aos dos animais do
grupo controle (Figura 14; Figura 19).
Figura 14: Concentração de ferro (µg/g) no fígado, baço e intestino de ratos
controle e deficientes em vitamina A (VA) durante os 45 dias de tratamento.
Letras diferentes indicam comparação intra-grupo CT e letras diferentes entre
62
parênteses comparação intra-grupo VA, entre os quatro períodos de tratamento
(p < 0,05). *Comparação entre grupos, no mesmo período de tratamento (p ≤
0,01). T
0
: tempo inicial. Os dados correspondem a média e desvio padrão, n =
6 animais por grupo.
A Figura 15 apresenta os níveis de malondialdeído (MDA) nos três tecidos
estudados. Os animais apresentaram maior teor de MDA hepático no tempo
basal, em relação aos demais períodos de tratamento, nos dois grupos. Os
animais deficientes em vitamina A (VA) apresentaram menor concentração de
MDA hepático com 30 e 45 dias de tratamento quando comparados ao grupo
controle nos mesmos períodos (p = 0,0428; p = 0,0109, respectivamente). No
baço, os dois grupos apresentaram maior concentração de MDA no tempo 45
em relação aos demais períodos de tratamento, não havendo diferença
significativa entre os dois grupos. No intestino houve um acúmulo gradativo de
MDA no grupo controle e uma redução gradativa no grupo VA. Com 45 dias de
tratamento, o grupo VA apresentou menor estresse oxidativo que o grupo
controle (p =0,0247) (Figura 15; Figura 18).
Figura 15: Concentração de malondialdeído (MDA) (nmol/mg de proteína total)
no fígado, baço e intestino de ratos controle e deficientes em vitamina A (VA)
63
durante os 45 dias de tratamento. Letras diferentes indicam comparação intra-
grupo CT e letras diferentes entre parênteses comparação intra-grupo VA,
entre os quatro períodos de tratamento (p < 0,05). *Comparação entre grupos,
no mesmo período de tratamento (* p ≤ 0,05). T
0
: tempo inicial. Os dados
correspondem a média e desvio padrão, n = 6 animais por grupo.
A Figura 16 apresenta concentração de proteínas carboniladas nos três
tecidos. No fígado, ambos os grupos apresentaram aumento na concentração
de proteínas carboniladas após 30 dias de tratamento (T
30
), havendo uma
estabilização em T4
45.
A deficiência de vitamina A não influenciou a
concentração de proteínas carboniladas no fígado (Figura 16; Figura 19).
No baço dos ratos do grupo controle foi observado um decréscimo na
concentração de proteínas carboniladas com 30 dias de tratamento, mantendo
este nível no T
45
. No grupo VA foi observada uma redução no teor de proteína
carbonilada após 15 dias de tratamento, mantendo-se este nível até 45 dias de
tratamento. O grupo VA apresentou menor concentração de proteínas
carboniladas em relação ao grupo controle, no período T15, (p =0,0002), não
sendo observada diferença significativa entre os dois outros períodos.
No intestino não foi observada diferenças significativas no teor de
proteínas carboniladas no grupo VA durante o período de depleção, enquanto
no grupo controle, a concentração basal (T
0
) de proteína carbonilada foi maior
em relação aos demais tempos de tratamento. Apenas com 15 dias de
tratamento (T
15
), o grupo VA apresentou maior teor de proteínas carboniladas
no intestino quando comparado ao grupo Controle (p =0,0011) (Figura 16;
Figura 19).
64
Figura 16: Concentração de proteína carbonilada (nmol/mg de proteína total)
no fígado, baço e intestino de ratos controle e deficientes em vitamina A (VA)
durante os 45 dias de tratamento. Letras diferentes indicam comparação intra-
grupo CT e letras diferentes entre parênteses comparação intra-grupo VA,
entre os quatro períodos de tratamento (p < 0,05). Comparação entre grupos,
no mesmo período de tratamento (*p ≤ 0,01; ** P ≤ 0,001). T
0
: tempo inicial. Os
dados correspondem a média e desvio padrão, n = 6 animais por grupo.
Figura 17: Concentração de ferro (µg/g), malondialdeído (MDA) (nmol/mg de
proteína total) e proteína carbonilada (nmol/mg de proteína total) no fígado (A),
de ratos controle (CT) e deficientes em vitamina A (VA) durante os 45 dias de
tratamento. Letras diferentes indicam comparação intra-grupo CT e letras
diferentes entre parênteses comparação intra-grupo VA, entre os quatro
períodos de tratamento (p < 0,05). Comparação entre grupos, no mesmo
período de tratamento (*p
≤ 0,01). Os dados correspondem a média e desvio
padrão, n = 6 animais por grupo.
65
Figura 18: Concentração de ferro (µg/g), malondialdeído (MDA) (nmol/mg de
proteína total) e proteína carbonilada (nmol/mg de proteína total) no baço (B),
de ratos controle (CT) e deficientes em vitamina A (VA) durante os 45 dias de
tratamento. Letras diferentes indicam comparação intra-grupo CT e letras
diferentes entre parênteses comparação intra-grupo VA, entre os quatro
períodos de tratamento (p < 0,05). Comparação entre grupos, no mesmo
período de tratamento (*p ≤ 0,01). Os dados correspondem a média e desvio
padrão, n = 6 animais por grupo.
66
Figura:19: Concentração de ferro (µg/g), malondialdeído (MDA) (nmol/mg de
proteína total) e proteína carbonilada (nmol/mg de proteína total)no intestino
(C), de ratos controle (CT) e deficientes em vitamina A (VA) durante os 45 dias
de tratamento. Letras diferentes indicam comparação intra-grupo CT e letras
diferentes entre parênteses comparação intra-grupo VA, entre os quatro
períodos de tratamento (p < 0,05). Comparação entre grupos, no mesmo
período de tratamento (*p ≤ 0,01). Os dados correspondem a média e desvio
padrão, n = 6 animais por grupo.
67
6 Discussão
Uma relação sinérgica entre o metabolismo de vitamina A e ferro tem sido
descrita na literatura (Arruda et al., 2009; Ma et al., 2008; Zimmermann et
al.,2006; Kelleher & Lonnerdal, 2005; Walczyk et al., 2003; Strube, Beard,
Ross, 2002). Alguns estudos mostram uma alteração nos níveis de
hemoglobina em animais deficientes em vitamina A (Arruda et al., 2009; Lechtig
et al., 2009; Meija Hodges, Rucker, 1979). Arruda et al (2009) observaram um
aumento na concentração de hemoglobina em ratos deficientes em vitamina A
comparados ao controle, após 57 dias de depleção. No entanto outros estudos
mostram uma redução na concentração de hemoglobina em ratos e humanos
(Zimmermann, 2006; Meija et al., 1979). No presente estudo a deficiência de
vitamina A não alterou os níveis de hemoglobina (tabela 1), sugerindo que o
tempo e o grau de deficiência são fatores determinantes para alteração dos
níveis de hemoglobina.
No presente estudo com 30 dias de depleção a concentração de retinol
apresentou-se abaixo do limite de detecção, indicando que a reserva de retinol
hepático foi esgotada entre 15 e 30 dias da ausência de ingestão dietética
(tabela 01; Figura 13). Sendo o fígado o órgão estoque de vitamina A, e
conseqüentemente responsável pela manutenção de sua homeostase
sistêmica (Nobili et al., 2009), as funções dependentes de vitamina A deveriam
somente estar comprometidas quando as reservas hepáticas estivessem
completamente esgotadas. Ghenimi et al. (2009) observaram que após três
semanas de indução da deficiência de vitamina A em ratos, os níveis séricos
de retinol eram significativamente menores em relação ao grupo controle, e
após aproximadamente cinco a seis semanas os níveis séricos estavam
praticamente esgotados (0.36 ± 0.13 e 2.4 ± 0.08 µmol/L deficiente e controle,
respectivamente). Estes resultados sugerem que a concentração de retinol de
outros tecidos é dependente da concentração de retinol hepática.
Embora alguns autores demonstrem uma redução no crescimento de
animais deficientes em vitamina A (Ghenimi, 2009; Husson et al, 2004, Arruda
et al, 2009), no presente estudo, com 45 dias de depleção, não foi observada
diferença no ganho de peso entre os ratos controle e VA (tabela 1). Estes
68
resultados sugerem que os animais foram acompanhados em um estágio inicial
de depleção, 45 dias, não sendo suficiente para alterar o ganho de peso. Nos
estudos citados anteriormente os autores somente obtiveram redução
significativa do ganho de peso dos animais deficientes em vitamina A a partir
de 7 semanas de depleção.
A vitamina A apresenta uma capacidade antioxidante direta in vitro, no
entanto, sua ação antioxidante in vivo, assim como seu efeito sobre os
biomarcadores de estresse oxidativo, ainda não são bem estabelecidos (Lars,
2008). Um mecanismo de ação antioxidante direto, no qual a vitamina A seria
capaz de reduzir moléculas radicares ou formar um aduto (complexo) com
espécies radicalares, estabilizando os elétrons desemparelhados por
ressonância tem sido sugerido pela literatura (Peres et al, 2003; Palace et al,
1999).
Um estudo recente desenvolvido por nosso grupo (Arruda et al, 2009)
demonstrou um aumento na concentração de ferro, MDA e carbonil no baço, e
um aumento da expressão de hepcidina hepática em animais submetidos a
deficiência de vitamina A por 57 dias. Sugerindo que as mudanças no estado
oxidativo provocadas pela deficiência de vitamina A sejam mediadas pela
perda da homeostase de ferro. Em altas concentrações, o ferro é capaz de
catalisar reações de oxidação, como a de Fenton, gerando radicais hidroxil e
consequentemente promovendo danos a biomoléculas (Maoka, 2009; Britton,
Liaaen-Jensen, Pfander, 2004).
Estudos anteriores evidenciaram que a deficiência de vitamina A promove
um aumento da concentração de ferro em alguns órgãos, possivelmente pela
redução da mobilização do ferro armazenado (Maoka, 2009; Bolem, Wendell,
1990; Meija, Chew, 1988). Embora o mecanismo de manutenção da
homeostase do ferro não esteja totalmente elucidado, a concentração de ferro
nos tecidos é controlada pelo peptídeo hepcidina, que é secretado
principalmente pelo fígado (Beard, 2009). Um aumento dos níveis de ferro nos
tecidos promove um aumento da secreção de hepcidina, que por sua vez induz
a internalização e degradação da ferroportina intestinal, promovendo um
acúmulo de ferro nos enterócitos e inibição da absorção de ferro via DMT-1.
Mecanismo contrário acontece quando ocorre redução dos níveis de ferro
tecidual (Beard, 2009; Nemeth et al., 2004; Nicolas et al., 2002; Weinstein, et
69
al., 2002). No presente estudo, os dados do grupo controle mostram um
acúmulo do ferro intestinal nos animais com 15 dias de tratamento, enquanto
no fígado os níveis de ferro se mantiveram estáveis nesse período.
Considerando a brusca mudança na biodisponibilidade de ferro dietético (do
leite para a ração) durante os primeiros dias de tratamento dos ratos, a maior
oferta e absorção repentina de ferro dietético, acarretariam no aumento dos
níveis de ferro séricos, resultando na indução da secreção da hepcidina
hepática e, consequentemente, na internalização da ferroportina. O acúmulo de
ferro intestinal e manutenção dos níveis de ferro hepático sugerem uma
redução na exportação do ferro do enterócito para o sangue, e, portanto, uma
redução na função da ferroportina. O aumento repentino e significativo na
concentração de hemoglobina observado nos primeiros quinze dias de
tratamento corrobora com esta teoria da maior oferta e absorção de ferro
dietético no início do tratamento. Após 30 dias houve uma redução nos níveis
de ferro intestinal e simultâneo aumento no fígado, sugerindo um aumento na
exportação do ferro do enterócito e, conseqüente, armazenamento no fígado
(Figura 14).
O fígado tem sido identificado como o principal órgão responsável pela
secreção de hepcidina (Beard, 2009). No entanto, os níveis de ferro no fígado
parecem não responderem à auto-regulação via hepcidina, conforme
resultados obtidos por Arruda et al (2009). Quando o fígado está com altas
reservas de ferro ocorre a estimulação da expressão de hepcidina, que então
irá impedir a exportação de ferro pelo intestino e baço, o que explica um
aumento simultâneo da concentração de ferro nesses órgãos, suportando os
resultados obtidos no presente estudo (Figura 14, Figura 20).
Portanto os resultados sugerem que a homeostase do ferro no organismo
é mantida através de uma comunicação entre os diferentes órgãos, que
respondem de acordo com suas funções específicas. O conteúdo de ferro no
baço parece responder a variação do ferro intestinal de modo diferenciado ao
proposto para o fígado.
70
Figura 20: Representação do mecanismo de homeostase de ferro em animais
controles durante 45 dias de tratamento. A princípio (T
0
ao T
15
) há uma
mudança na biodisponibilidade do ferro, com maior oferta e maior absorção de
ferro e um aumento na concentração de ferro sérico, confirmado com aumento
na concentração de hemoglobina (Hb), o que leva ao aumento da expressão de
hepcidina (Hpc) hepática e internalização da ferroportina (FPN) intestinal e
esplênica e retém ferro nesses tecidos. Aos 30 dias, com a redução na
concentração de ferro no intestino e baço sugere uma redução na expressão
da hepcidna, e liberação da ferroportina, com aumento na exportação de Fe
pelos tecidos, aumentando o armazenamento hepático. O aumento da
concentração de ferro hepático sugere ao aumento na expressão de hepcidina
e novamente internalização da ferroportina e retenção de ferro nos tecidos
como observado aos 45 dias. Hb: hemoglobina; Fe: ferro; Hpc: hepcidina; FPN:
ferroportina; DMT1: transportador de metal divalente.
A deficiência de vitamina A alterou o perfil da concentração de ferro nos
três órgãos ao longo do período de tratamento. No grupo VA os níveis de ferro
intestinal ao longo dos 30 dias de tratamento se mantiveram estáveis, ao
contrário do grupo controle que apresentou uma oscilação. Embora não
tenham ocorrido variações nos níveis de ferro intestinal até 30 dias foi
observado um aumento de ferro hepático aos 30 dias e no baço aos 15 dias
71
(Figura 14), sugerindo que a deficiência de vitamina A promove uma perda da
homeostase do ferro mediada pelo aumento da expressão da hepcidina pelo
fígado, que promove a internalização da ferroportina e conseqüente retenção
de ferro no baço (Beard, 2009; Nemeth et al., 2004; Arruda et al, 2009).
A redução significativa dos níveis de retinol hepático nos ratos
deficientes, após 15 dias de depleção foi acompanhada de uma redução da
concentração de ferro no intestino quando comparado ao grupo controle, o
mesmo foi observado aos 30 dias quando os estoques de retinol hepático
estavam esgotados (Figura 13). Apesar da literatura sugerir que a redução do
nível de ferro intestinal induziria um aumento de sua absorção (Beard, 2009;
Strube et al., 2002), não foi observado acúmulo de ferro no fígado dos animais
deficientes em vitamina A, enquanto no baço foi observado acúmulo de ferro
apenas aos 30 dias quando comparado ao grupo controle (Figura 14). Aos 45
dias foi observada uma redução da concentração de ferro hepático no grupo
VA em relação ao obtido ao período anterior. Esses dados sugerem que a
deficiência de vitamina A promova a retenção de ferro no baço, e redução da
importação e exportação do ferro do intestino (Figura 21).
Em estudo anterior foi obtido resultado semelhante ao descrito no
presente estudo, aos 57 dias de deficiência de vitamina A houve um acúmulo
significativo de ferro no baço, mas não no fígado de animais deficientes em
vitamina A quando comparados a ratos controle (Arruda et al., 2009; Asare et
al., 2009). Os autores ainda observaram um aumento na expressão de
hepcidina no fígado, sugerindo que a liberação de ferro do baço seja inibida
pela hepcidina, através da internalização e degradação da ferroportina,
resultando no acúmulo desse mineral (Chaston et al., 2008). Outros estudos
consubstanciam a tese de que a hepcidina não regule a ferroportina hepática,
(Constante et al.; 2006; Wang et al., 2006; Rivera et al., 2005), Strube et at
(2002) não observaram acúmulo de ferro hepático em ratos com deficiência
marginal de vitamina A, mesmo quando os estoques de ferro do baço e da
medula óssea estavam aumentados. Os autores sugerem que os efeitos da
deficiência de vitamina A nos níveis de ferro teciduais são dose e/ou tempo
dependentes, e que alguns biomarcadores do estado nutricional de ferro sejam
mais responsivos que outros.
72
Figura 21: Representação do mecanismo de absorção de ferro na deficiência
de vitamina A durante 45 dias de tratamento. Com 15 dias foi observada uma
redução significativa da concentração de retinol hepático e uma possível perda
da homeostase de ferro, sugerida pela manutenção da concentração intestinal
de ferro comparado ao T0, não sendo observado acúmulo hepático. Com 30
dias de deficiência observa-se absorção intestinal de ferro e acúmulo de ferro
hepático, porém houve retenção na concentração de ferro no baço em relação
aos animais controle, o que sugere uma expressão ou atuação deficiente da
hepcidina nesses tecidos e uma perda da homeostase de ferro nesses tecidos.
Aos 45 dias sugere que embora tenha ocorrido internalização da ferroportina e
acúmulo de ferro no baço e intestino, a concentração de ferro hepático não
estava alta, e a deficiência de vitamina A estava alterando a expressão de
hepcidina e controle da homeostase de ferro nesses tecidos. Hb: hemoglobina;
Fe: ferro; Hpc: hepcidina; FPN: ferroportina; DMT1: transportador de metal
divalente.
A concentração de ferro tem sido frequentemente correlacionada
positivamente a danos oxidativos a biomoléculas, e conseqüentes, a danos
teciduais (Englberge et al., 2009; Kabat et al, 2009; Britton, Liaaen-Jensen,
Pfander, 2004). O ferro participa como catalisador da reação de Fenton
promovendo a geração de radicais hidroxil que podem causar danos oxidativos
73
a biomoléculas (Valko et al., 2007). Alguns estudos mostram que em animais
com o aumento da idade ocorre um aumento da concentração de ferro nos
tecidos, que está associado ao aumento da peroxidação lipídica e outros danos
oxidativos (Valko et al., 2007; Mecocci et al., 1999; Cook & Yu, 1998).
Os dados obtidos no presente estudo mostram um aumento significativo
na concentração de ferro e MDA, e uma redução nos níveis de proteína
carbonilada no baço e intestino dos animais controle no tempo 45 em relação
ao tempo basal (T0) (Figura 14- 19). Uma correlação positiva foi encontrada
entre idade do animal e níveis de MDA no baço e intestino dos animais controle
(r = 0,6173, p = 0,0010; r = 0,6060, p = 0,0017; respectivamente), enquanto
uma correlação negativa foi observada entre idade e proteína carbonilada
nestes órgãos (r = - 0,4466, p = 0,0326; r = - 0,4129, p = 0,050;
respectivamente). Esses resultados sugerem que os danos oxidativos a
lipídeos aumentam com a idade do animal e são dependentes da concentração
de ferro nesses tecidos. Xu et al (2008) observaram um aumento gradativo na
concentração de ferro e de danos oxidativos ao DNA com a idade dos animais.
Contrariando a tendência observada no baço e intestino dos animais
controle, no fígado, apesar dos níveis de ferro terem aumentado em função
direta da idade dos animais, foi observada uma correlação inversa entre idade
e MDA (r = - 0,4312; p = 0,0399) e direta entre idade e proteína carbonilada (r =
7263; p= 0,00006). Esse aumento na concentração de proteínas carboniladas
foi também observado em outro estudo no fígado de animais submetidos a
deficiência de vitamina A por 57 dias, embora não tenha sido observado maior
acúmulo de ferro no fígado em relação a animais controle (Arruda et al, 2009).
Esses achados sugerem que o mecanismo de oxidação das proteínas seja
ferro independente. Um estudo que investigou a exatidão da resposta dos
biomarcadores (MDA, TBARs, proteína carbonilada e Free 8-iso-PGF2) ao
estresse oxidativo induzido por administração de tetracloreto de carbono
(CCl
4
), os autores verificaram que os biomarcadores de danos oxidativos a
proteínas não refletiram com exatidão os danos causados por CC l
4
. Não foram
obtidas respostas com carbonil e de outros marcadores de aminoácidos
oxidados, sugerindo que não existe um consenso quanto à resposta dos
diferentes marcadores de estresse oxidativo frente aos diferentes modelos de
indução do estresse (Kadiiska et, 2005).
74
Os danos oxidativos são causados a partir da perda do balanço entre a
quantidade de oxidantes gerado e a capacidade antioxidante do organismo
(Valko et al., 2007). A deficiência de vitamina A induziu a redução dos níveis de
ferro intestinal aos 15 e 30 dias de tratamento, mas não foram observadas
diferenças em relação aos níveis de MDA nesse tecido entre os grupos.
Embora a capacidade antioxidante dos ratos do grupo VA estivesse menor em
função da menor concentração de retinol, a quantidade do elemento oxidante,
ferro, também foi menor, mantendo, portanto, o balanço entre antioxidante e
oxidante, o que poderia explicar a obtenção de níveis de MDA similar entre os
grupos nos tempos de tratamento 15 e 30 dias.
A capacidade antioxidante total dos organismos vivos é mantida por uma
série de diferentes agentes incluindo, enzimas antioxidantes, proteínas
quelantes de metais, e compostos de baixa massa molecular seqüestradores
de EROs provenientes principalmente da dieta (Halliwell & Gutteridge, 2001;
Hercberg et al., 2004; Knoops et al., 2004). A composição das defesas
antioxidantes difere de tecido para tecido e entre tipos celulares em um
determinado tecido.
Apesar dos grupos Controle e deficiente em vitamina A (VA) apresentarem
níveis hepáticos de ferro similares ao longo do tempo de tratamento, as
concentrações hepáticas de MDA foram significativamente menores nos ratos
deficientes em vitamina A a partir de 30 dias de tratamento. Um aumento na
concentração do antioxidante GSH foi descrito em camundongos sem pêlos
(hairless) submetidos a estresse oxidativo por deficiência de vitamina A. Os
autores sugeriram que um aumento da concentração de vitamina E nos tecidos
causado pela deficiência de vitamina A, pode ter poupado o uso de GSH,
promovendo o aumento desse nos tecidos (Pélissier et al, 1997). Portanto o
menor dano oxidativo a lipídeos observado no grupo VA pode ser explicado por
um aumento na concentração de outros antioxidantes induzido pela deficiência
de vitamina A.
Comportamento semelhante foi observado no baço, onde os animais com
30 dias de deficiência de vitamina A apresentaram acúmulo de ferro nesse
órgão, mas tinham igual nível de dano a lipídeos e a proteínas em relação ao
controle. E aos 15 dias de tratamento embora o grupo deficiente em vitamina A
tivesse nível de ferro e níveis de MDA semelhantes, os níveis de proteínas
75
carboniladas foram menores que os obtidos para o grupo controle. Portanto um
aumento nas defesas antioxidantes induzido pela deficiência de vitamina A ou
ainda o fato da quantidade de ferro acumulada no tecido não ter sido suficiente
para ultrapassar a capacidade antioxidante do organismo desses animais
podem explicar esses resultados. Ainda, as variações decorrentes da mudança
abrupta na biodisponibilidade do ferro dietético, no início do estudo (ferro
proveniente do leite e da ração), somado as demandas específicas, durante o
processo de amadurecimento dos órgãos do rato recém desmamado podem ter
exercido efeito nos resultados obtidos no presente estudo. A utilização de ratos
adultos e um aumento no período de tratamento dos animais poderiam
confirmar os resultados obtidos no presente estudo.
76
7. Conclusão
Os resultados obtidos sugerem que a deficiência de vitamina A altera a
homeostase de ferro do baço e intestino, sendo essas alterações dependentes
do período de depleção e tecido específica. A correlação positiva entre os
níveis de ferro e danos oxidativos a lipídeos observada no baço dos animais
dos dois grupos sugerem um efeito do ferro no mecanismo de oxidação dos
lipídeos, não sendo observado este efeito nos danos a proteínas.
Considerando que as reservas de vitamina A foram esgotadas com trinta dias
de tratamento, o reduzido período de deficiência (15 dias) pode ter sido
responsável por uma alteração moderada nos níveis de ferro e,
consequentemente, menor resposta dos danos oxidativos a biomoléculas
obtidas no presente estudo. Parece que a oxidação de proteínas e lipídeos se
comporta de maneira diferenciada em cada tecido, sugerindo uma proteção
específica de cada órgão. Também observamos que a deficiência de vitamina
A, durante 45 dias de depleção, não alterou o consumo de dieta e o ganho de
peso dos animais.
Estudos empregando uma cinética com maior tempo de duração e menor
intervalo de análises, bem como animais adultos são necessários para verificar
melhor a correlação entre deficiência de vitamina A, o acúmulo de ferro e
danos oxidativos nos tecidos desses animais. Entretanto, salvaguardados os
limites inerentes ao modelo de estudo empregado, a deficiência de vitamina A
influencia a homeostase de ferro podendo contribuir para a etiologia de
patologias associadas ao acúmulo de ferro nos tecidos.
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