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COMISSÃO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR
INSTITUTO DE RADIOPROTEÇÃO E DOSIMETRIA
LABORATÓRIO DE MEDIDAS IN VIVO
ESTUDO IN VIVO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO MOLIBDÊNIO-99
Raphael Sancho Sisley de Souza
Orientador: Bernardo Maranhão Dantas
Co-orientador: Mario Bernardo Filho
RIO DE JANEIRO
Raphael Sancho Sisley de Souza
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ESTUDO IN VIVO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO MOLIBDÊNIO-99
Rio de Janeiro – Brasil
Instituto de Radioproteção e Dosimetria – Comissão Nacional de Energia Nuclear
Coordenação de Pós-Graduação
2009
ii
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Souza, Raphael Sancho Sisley de Souza
ESTUDO IN VIVO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO MOLIBDÊNIO-99
Dissertação (mestrado) – Instituto de Radioproteção e Dosimetria
Rio de Janeiro, 2009.
Raphael Sancho Sisley de Souza
iii
O presente trabalho foi desenvolvido no Instituto de Radioproteção e Dosimetria da
Comissão Nacional de Energia Nuclear, sob orientação do Professor Dr. Bernardo
Maranhão Dantas e co-orientação da Professor Dr. Mario Bernardo Filho, com auxílios
financeiros concedidos pela CNEN e CAPES.
v
O que sabemos é uma gota;
o que nós ignoramos é um oceano.
(Isaac Newton)
vi
Esta dissertação é dedicada aos meus
pais, Marcel Sisley de Souza e Kátia
Sancho Sisley de Souza, por sempre
incentivarem meus estudos e por
serem exemplos de humildade e
perseverança frente a todas as
adversidades.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço integralmente a Deus por me permitir alcançar o conhecimento necessário
para realizar esse trabalho!
A meus pais, Marcel Sisley de Souza e Kátia Sancho Sisley de Souza, pelo apoio
financeiro, confiança, incentivo e, principalmente, pelo carinho que recebo em minha
vida. A minha irmã, Juliana Sancho Sisley de Souza, ao meu cunhado Alex Sandro
Torres de Queiroz e ao novo membro da família, meu sobrinho Eduardo Sisley de
Souza Queiroz. A toda minha família que comemorou minha vitória e acreditou no meu
sucesso.
À Adriana Moraes, minha namorada, que me ajudou com amor, carinho e compreensão.
Agradeço pela companhia e pelas palavras de incentivo.
A todos meus amigos que me incentivaram e torceram pelo êxito deste projeto,
especialmente meu grande amigo Gabriel Marinho Webler.
Aos meus orientadores Bernardo Dantas e Mario Bernardo filho, pelos ensinamentos e
por acreditarem neste projeto.
A todos meus colegas da turma de mestrado 2007: Artur, Aneli, Bárbara, Cristiny,
Delano, Juliana, Rafael, Ronaldo, Samuel e Valmiro.
Aos amigos do LABMIV do IRD, Ana Letícia Dantas, Francisco Araújo, Éder Lucena,
Bianca Ribeiro e do LRE da UERJ, Claudia, Fernanda, Cristiano, Deise, Marcela e
Scheila.
Aos amigos do IRD Mônica, Isabele, Samira, Vanessa, Paulo entre outros que, de
inúmeras maneiras, me ajudaram.
Aos Professores que me ajudaram em diversos aspectos a me moldar: Pedro, Conte,
Silvia, Tahuata, Denison, Eliane, Carlos entre outros
viii
Ao LNMRI pelo fornecimento de padrões necessários à realização deste trabalho.
Ao IPEN (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares) que cedeu gentilmente
material radioativo e kits de medicina nuclear para este estudo.
ix
RESUMO
A modificação do metabolismo padrão do
99
Mo em presença de MDP poderia levar a
alterações na biocinética e dosimetria deste radionuclídeo em pacientes de medicina
nuclear. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar a influência do MDP na
biodistribuição de
99
Mo. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos de seis animais
cada, sendo inoculados respectivamente com
99
molibdato e
99
molibdato+MDP via plexo
ocular. O estudo de biodistribuição foi realizado após 10 e 120 minutos
respectivamente. Os órgãos foram contados com detector NaI(Tl). Os valores de uptake
não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Foi realizado também um
estudo in vitro através de cromatografia planar para determinar a afinidade entre o
molibdênio e o MDP. Os resultados mostraram que o molibdênio tem baixa afinidade
tanto pela propanona quanto pela solução 0,9% de NaCl. Entretanto, o molibdênio em
presença de MDP apresentou afinidade pela solução 0,9% de NaCl e baixa afinidade
pela propanona, sugerindo ter ocorrido ligação entre o
99
Mo e o MDP nas condições do
experimento.
x
ABSTRACT
The modification of
99
Mo standard metabolism in the presence of MDP would alter the
biokinetics and dosimetry of this radionuclide in nuclear medicine patients. Therefore,
the objective of this work is to evaluate the influence of MDP in the biodistribution of
99
Mo. Wistar rats were divided in two groups of six animals each, being inoculated
respectively
99
molibdate and
99
Mo+MDP via ocular plex. The biodistribution study was
carried out after 10 and 120 minutes respectively. The organs were counted with a
NaI(Tl) detector. The uptake values did not present significant differences among the
groups. An in vitro study through planar chromatography was also carried out to
determine the affinity between molybdenum and MDP. The results show that
99
Mo has
low affinity to both propanone and NaCl- 0.9% solution. However,
99
Mo in the presence
of MDP presented affinity to NaCl-0.9% solution and low affinity to propanone
suggesting that
99
Mo was bound to MDP under the conditions of the experiment.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Estatística de utilização de radiofármacos no decorrer do ano de 2008,
no Hospital Universitário Pedro Ernesto e Hospital da Força Aérea do
Galeão.
3
Figura 2.1 Esquema simplificado do decaimento do molibdênio-99 (Marques et al
2001). 9
Figura 2.2 Gerador de
99
Mo/
99m
Tc produzido pelo IPEN 10
Figura 2.3
Estrutura molecular do ácido metilenodifosfônico MDP usado em
medicina nuclear. 15
Figura 2.4 Imagem de tórax anterior realizada por cintilografia planar utilizando
99m
Tc-MDP onde verificamos a ligação do radiofármaco com estruturas
ósseas assim como o tecido renal (Timothy et al 1991).
16
Figura 3.1 a) Tubo de vidro utilizado para medida dos órgãos nos experimentos de
biodistribuição e espectometria gama (altura: 4,3 cm; diâmetro: 1,0 cm)
e b) Esquema da cromatografia planar. 20
Figura 3.2 Imagem rato com os respectivos órgãos retirados 22
Figura 3.3 Fluxograma do experimento de biodistribuição. 23
Figura 3.4 Geometria de medição das amostras com sistema de detecção de
NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV 24
Figura 4.1 Curvas de calibração do detector NaI(Tl) 8”x 4”obtidas nas geometrias
de 2, 4, 6, 8 e 10 mL , nas distâncias de 10, 15 e 20 cm. 27
Figura 4.2 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de NaCl
0,9% 30
Figura 4.3 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de
propanona 30
Figura 4.4 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de
NaCl 0,9%. 31
Figura 4.5 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de
propanona. 31
Figura 4.6 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de
NaCl 0,9%.
32
xii
Figura 4.7 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de
propanona.
32
Figura 4.8 Atividades dos compartimentos analisados nos grupos administrados
com Molibdato (coluna cinza) e Molibdato + MDP (coluna preta). 35
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Substâncias empregadas na biodistribuição e funções. 19
Tabela 3.2 Volumes e distâncias na analise dos órgãos biodistribuidos 25
Tabela 4.1 Radionuclídeos utilizados para calibração do sistema de detecção
NaI(Tl) 8”X4” do LABMIV 26
Tabela 4.2 Valores de R
2
obtidos para cada geometria de calibração do detector
NaI(Tl) 8”X4” 28
Tabela 4.3 Equações das curvas de calibração obtidas no detector NaI(Tl) 8”X4” 29
Tabela 4.4 Massa dos órgãos dos animais utilizados nos experimentos de
biodistribuição in vivo do
99
Mo
34
Tabela 4.5 Atividades específicas médias presentes nos órgãos analisados nos
grupos de animais 1 e 2
35
xiv
SUMÁRIO
RESUMO x
ABSTRACT xi
LISTADE FIGURAS xii
LISTA DE TABELAS xiv
1 – INTRODUÇÃO 1
1.1 – Definição do problema 1
1.2 - Objetivo geral 3
1.3 - Objetivos específicos 3
2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS 5
2.1 - Histórico do uso de radionuclídeos em medicina 5
2.2 - Medicina nuclear 5
2.2.1 - Radionuclídeos em medicina nuclear 7
2.2.2 - Radionuclídeo tecnécio-99m (
99m
Tc) 7
2.2.3 - Radionuclídeo Molibdênio-99 (
99
Mo) 8
2.2.4 - Geradores
99
Mo/
99m
Tc 10
2.2.5 - Impurezas 10
2.2.5.1 - Impurezas Radionuclídicas 10
2.2.5.2 - Impurezas Químicas 11
2.2.5.3 - Impurezas radioquímicas 11
2.2.6 – Utilização de Radiofármacos 12
2.2.7 – Biodisponibilidade dos radiofármacos 12
2.2.8.1 – Biocinética do Molibdênio 13
2.2.8.2 - Ácido metilenodifosfônico (MDP) marcado com
99m
Tc 14
2.2.8.3 – Interferências na biodisponibilidade de radiofármacos 16
2.2.8.4 - Biodistribuição 16
2.3 - Cromatografia planar 17
2.4 - Detectores de Cintilação 17
2.5 - Espectrometria gama 18
3 - MATERIAIS E MÉTODOS 19
3.1 - Animal experimental 19
3.2 - Drogas e reagentes utilizados 19
3.3 - Radionuclídeo 20
xv
3.4 - Cromatografia Planar 20
3.5 - Biodistribuição do radiofármaco 21
3.6 – Sistema de detecção da Unidade de Contagem 24
3.7 – Calibração do sistema de detecção da UCCI 22
3.8 – Distâncias e Volumes dos órgãos para avaliação 24
3.9 – Análise estatística 25
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 26
4.1 - Calibração do sistema de detecção para determinação de
99m
Tc e
99
Mo em
amostras de biodistribuição e cromatografia planar
26
4.2 - Cromatografia planar associada à espectrometria gama 29
4.3 – Biodistribuição do
99
Mo in vivo 33
4.3.1 – Massas dos órgãos 33
4.3.2 - Atividades captadas pelos órgãos 34
5 – CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES 37
5.1 – Conclusões 37
5.2 – Recomendações 37
ANEXO1 - Certificado de aprovação pelo Comitê de ética da UERJ 39
ANEXO 2 – Certificado de Calibração da Fonte de
99
Mo – 1 41
ANEXO 3 – Certificado de Calibração da Fonte de
99
Mo – 2 44
ANEXO 4 – Bula do Fármaco MDP 46
ANEXO 5 – Certificado de Calibração do Coquetel de Radionuclídeos 49
ANEXO 6 – Artigo publicado na revista Brazilian Archives of Biology and
Tecnology
51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56
xvi
1- INTRODUÇÃO
1.1 – Definição do problema
Nas últimas décadas houve um elevado crescimento do número de serviços de
medicina nuclear no Brasil, aproximando-se atualmente de 300. Nestes, o radionuclídeo
mais frequente é o tecnécio meta-estável (
99m
Tc), utilizado em cerca de 90% dos
diagnósticos como o componente radioativo dos radiofármacos.
Entre os fatores que justificam a utilização do
99m
Tc pode-se citar a facilidade
de obtenção, aliado às suas propriedades físicas como meia-vida física de 6 horas,
emissão de radiação gama de baixa energia e vários números de oxidação (Nox)
possíveis, o que permite ligação com diversos compostos que alteram a sua afinidade
química, ampliando sua aplicação em diversas técnicas de diagnóstico por imagem
(Saha, 2004).
A Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN) e a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) estabeleceram uma série de Regulamentos associados à
segurança radiológica de trabalhadores e pacientes de serviços de medicina nuclear
(CNEN, 1996; ANVISA, 2007).
Nos eluatos de
99m
Tc usados em medicina nuclear ocorre a presença de
99
Mo
sendo este classificado como impureza radionuclídica, e tendo o limite sugerido para
este é de 0,15 kBq de
99
Mo por MBq de
99m
Tc no eluato administrado ao paciente. Para
garantir que os radiofármacos atendam a esse critério é necessário que cada eluato seja
testado individualmente (IAEA, 2006). Um levantamento realizado por Khoury et al
(2003) mostrou que 7,4% das amostras de eluatos coletadas em serviços de medicina
nuclear de Recife/PE, Brasil apresentavam níveis de impureza radionuclídica de
99
Mo
acima dos valores recomendados.
A presença de
99
Mo nos eluatos resulta em uma exposição desnecessária do
paciente que realiza o exame, além de prejudicar a qualidade das imagens formadas,
podendo conduzir à necessidade de repetição do exame.
Sistemas de garantia da qualidade estão sendo discutidos com a finalidade de
melhorar a qualificação e treinamento dos envolvidos na produção e manipulação dos
radiofármacos e estabelecer uma série de rotinas básicas de segurança na verificação da
qualidade dos radiofármacos que serão administrados ao paciente, entre essas temos os
controles sobre as impurezas radionuclídicas (ANVISA, 2007).
1
Estudos realizados por Dantas et al (2005) e Silva (2007) indicaram a presença
de
99
Mo em pacientes de medicina nuclear através de medidas in vivo e in vitro. Nesses
estudos, as doses associadas à incorporação do
99
Mo foram calculadas supondo-se a
biocinética padrão do
99
Mo descrita na publicação 30 de ICRP (1979). Ressalta-se o
fato de que até o início desse trabalho não foi disponibilizado na literatura nenhum
estudo visando verificar a influência de fármacos na biodistribuição de
99
Mo. Assim, o
cálculo da dose no paciente devido à incorporação de
99
Mo baseia-se em um modelo
biocinético que leva em consideração sua biodistribuição padrão no organismo (ICRP,
1993). Porém ainda não existem estudos conclusivos sobre a interferência que os
fármacos utilizados em conjunto com o
99m
Tc, possam causar na biodistribuição do
99
Mo, assim como a avaliação da possibilidade de ligação química entre o
99
Mo e estes
fármacos. Tais informações têm impacto direto no cálculo de dose interna dos pacientes
devido a incorporação de
99
Mo.
Em estudo preliminar foi realizado um levantamento em dois serviços de
medicina nuclear da rede pública do município do Rio de Janeiro, referente ao número
de pacientes que realizaram exames com uso do radionuclídeo
99m
Tc, evidenciando
quais radiofármacos são os mais utilizados. Este levantamento compreendeu os exames
realizados no período de janeiro a dezembro de 2008 no Hospital da Força Aérea do
Galeão (HFAG) e Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE). Os dados obtidos
foram gentilmente cedidos pelos responsáveis pelos SMN sem identificação do nome do
paciente.
A Figura 1.1 apresenta o resultado do levantamento do uso de radiofármacos em
dois serviços de medicina nuclear localizados em Hospitais públicos da cidade do Rio
de Janeiro.
2
Estatistica de uso de radofármacos de 2008
0
100
200
300
400
500
600
700
MDP DTPA DMSA Pertecnetato MAA Sestamibi ECD Outras
Radiofármacos
Número de Exames
Figura 1.1 Estatística de utilização de radiofármacos no decorrer do ano de 2008, no
Hospital Universitário Pedro Ernesto e Hospital da Força Aérea do Galeão.
Foram computados 1451 exames realizados no ano de 2008. A distribuição
observada apresenta menor frequência de exames cardíacos do que os dados obtidos por
Velásques et al (2006). Esta diferença pode ser atribuída ao custo do fármaco usado
neste tipo de exame tornando-o menos frequentes em SMN da rede pública. A principal
conclusão deste levantamento é que a cintilografia óssea utilizando MDP foi o exame
mais freqüente realizado nestes serviços de medicina nuclear da rede pública na cidade
do Rio de Janeiro em 2008.
1.2 - Objetivo geral
O presente estudo visa avaliar a influência do fármaco MDP, utilizado em
medicina nuclear, na biodistribuição in vivo do molibdênio 99.
1.3 - Objetivos específicos
i) Implementar metodologia para identificação e quantificação de
99
Mo em
amostras de órgãos e tecidos de ratos Wistar.
ii) Estabelecer e aplicar metodologia baseada em cromatografia planar associada
à espectrometria gama para avaliar a capacidade de ligação in vitro entre o Mo e o
MDP.
3
iii) Realizar estudos in vivo da Biodistribuição do
99
Mo na forma de molibdato
em ratos Wistar
iv) Realizar estudo in vivo da Biodistribuição de
99
Mo em solução de Kit de
MDP em ratos Wistar.
4
2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS
2.1 - Histórico do uso de radionuclídeos em medicina
Em 1913, a aplicação de radioisótopos em medicina teve sua origem com os
estudos realizados pelo físico George Von Hevesy. Nestes, observou-se que a
radioatividade dos elementos não alterava as suas propriedades químicas. Assim, um
elemento radioativo poderia substituir um elemento estável sem alteração das suas
reações químicas características (Levi, 1976; Harbert et al., 1996).
O físico Emilio Segré descobriu, em 1937, o tecnécio-99m que, atualmente é um
dos radionuclídeos mais utilizados em medicina nuclear (Segré, 1987).
No final dos anos 50, Hal Anger desenvolveu a primeira câmara de cintilação,
também chamada gama-câmara ou câmara Anger, que constitui um sistema de detecção
de radiação que permite registrar a distribuição espacial de um radioisótopo no interior
do corpo humano. Este método de detecção se tornou a base da medicina nuclear e do
desenvolvimento da tomografia axial computadorizada (Okuno et al., 1986; Saha,
2004).
Em 1969, os médicos David Kuhl e Roy Edwards desenvolveram outras formas
de obtenção de imagens fisiológicas: a Tomografia Computadorizada por Emissão de
Fóton Único ou SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) e a
Tomografia por Emissão de Pósitrons ou PET (Positron Emission Tomography) (Cherry
et al., 2003).
No Brasil, em 1951 foi criada, no Rio de Janeiro, a Comissão Nacional de
Energia Nuclear (CNEN) e os radionuclídeos começaram a ser empregados em 1955
(Marques et al., 2001).
2.2 - Medicina nuclear
A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza radionuclídeos in
vivo com finalidade diagnóstica (emissores de radiação gama, ou beta positiva ou que
realizem captura eletrônica) e terapêutica (emissores de radiação beta negativa). As
atividades das amostras administradas são medidas em câmara de ionização na função
do número de decaimentos radioativos por segundo, sendo expressas em Becquerel (Bq)
ou Curie (Ci) (Chandra, 1998).
5
Para minimizar a dose de radiação administrada ao paciente, o radionuclídeo
empregado em diagnóstico deve ter uma meia-vida compatível com o estudo clínico a
ser executado, emitindo radiação que seja capaz de penetração nos tecidos e energia
compatível com o sistema de detecção (Owunwanne et al., 1995).
Os radiofármacos são compostos químicos ou estruturas biológicas que
aumentam as possibilidades de utilização dos radionuclídeos. Apresentam capacidade
de causar alterações na biodistribuição dos mesmos, decorrente das alterações nas
afinidades químicas dos radionuclídeos originais (Bernardo-Filho et al, 2005).
A radiofarmácia é uma especialidade multidisciplinar exercida no serviço de
medicina nuclear e está relacionada com o armazenamento, fracionamento, diluição,
preparação, desenvolvimento, controle de qualidade e distribuição de radionuclídeos ou
moléculas marcadas para administração in vivo (Chandra, 1998).
Os exames realizados em medicina nuclear permitem avaliar tanto a morfologia
quanto a fisiologia de órgãos. As doenças são avaliadas de acordo com as variações da
biodistribuição da radioatividade nos órgãos em relação aos padrões normais
previamente estabelecidos (Saha, 2004). O rápido crescimento da medicina nuclear
contribuiu para o diagnóstico de diversas alterações orgânicas objetivando a avaliação
da eficácia da estratégia terapêutica (Ching et al., 2004; Imam, 2005).
O avanço da tecnologia de imagem tem gerado grande interesse em relação ao
avanço de equipamentos e softwares, protocolos de aquisição de imagem, interpretação
e qualificação profissional (Coleman et al., 2005).
Os produtos administrados aos pacientes devem passar por uma garantia de
qualidade regidos por documentos nacionais (ANVISA) e farmacopéias
internacionais.(ANVISA, 2007)
A obtenção de imagens na medicina nuclear incluem o SPECT que utiliza a
radiação gama (γ) emitida pelo radionuclídeo ou os raios-X emitidos no processo de
captura eletrônica (Sampson, 1999; Imam, 2005).
Essas técnicas são exploradas para estudar alterações bioquímicas como sinais
precoces de doenças, seus mecanismos, associações com estados patológicos (incluindo
câncer, doenças cerebrais, cardiovasculares, desordens mentais, dentre outros) e para
uma correlação molecular de alterações bioquímicas conduzindo ao tratamento da
doença (Imam, 2005).
6
2.2.1 - Radionuclídeos em medicina nuclear
Os nuclídeos são utilizados em medicina nuclear como fontes de radiação não
seladas marcando estruturas celulares ou moleculares denominadas radiofármacos ou
radiobiocomplexos (Harbert et al., 1996; Perkins e Frier, 1999; Bernardo-Filho et al.,
2005). A primeira etapa na preparação de radiofármacos envolve a produção dos
radionuclídeos. Existem três métodos de produção de radionuclídeos: aceleradores
nucleares, reatores nucleares e geradores (Saha, 2004).
Nos aceleradores nucleares (Ciclotrons) partículas são aceleradas e colidem com
um núcleo alvo, dando origem a reações nucleares. Através desse método de produção
são obtidos os radionuclídeos flúor-18, iodo-123, tálio-201, índio-111, gálio-67, dentre
outros, sendo esses empregados nos procedimentos de diagnóstico. Nos reatores
nucleares os radionuclídeos são obtidos por reações nucleares como resultado da
interação entre um núcleo alvo com nêutrons, como o xenônio-133 e cromo-51,
utilizados para diagnóstico e fósforo-32, estrôncio-89 e cobalto-60, utilizados em
terapia (Harbert et al., 1996; Sampson, 1999; Saha, 2004).
Nos geradores de radionuclídeo ocorre a transmutação do radionuclídeo pai
(meia-vida longa) em radionuclídeo filho (meia-vida curta). As propriedades químicas
dos radionuclídeos pai e filho devem ser distintas, de forma que possam ser facilmente
separados. São obtidos através desse método de produção os radionuclídeos tecnécio-
99m, gálio-68, cobre-62 e rubídio-82, utilizados para diagnóstico, e rênio-188, utilizado
em terapia (Harbert et al., 1996; Sampson, 1999; Saha, 2004).
A importância dos geradores de radionuclídeos reside no fato de serem facilmente
transportados e servirem como fontes de radionuclídeos em instituições distantes do
local da instalação do ciclotron ou do reator nuclear (Owunwanne et al., 1995; Perkins
& Frier, 1999; Saha, 2004).
2.2.2 - Radionuclídeo tecnécio-99m (
99m
Tc)
O tecnécio possui número atômico 43 e pertence ao grupo VIIB ou coluna 7 da
Tabela Periódica dos Elementos. É classificado como um metal de transição que forma
complexo ligante-metal com um grande número de estruturas de interesse biomédico.
Estes são componentes formados pela ligação entre o metal (eletrófilo) e átomos ou
grupos funcionais que são capazes de doar pares de elétrons (nucleófilo). Exemplos de
7
nucleófilos formadores de complexo com tecnécio são: amina, amida, tiol, fosfina,
oxima, e isonitrila (Sampson, 1999, Imam, 2005).
Os metais de transição possuem múltiplos estados de oxidação. O
99m
Tc, em
particular, apresenta números de oxidação (Nox) variando de -1 a +7. Esta característica
permite que este radionuclídeo forme complexos com diferentes estruturas
(Owunwanne et al., 1995).
O
99m
Tc se encontra em um estado meta-estável e, por transição isomérica, passa
a tecnécio-99 (
99
Tc), com meia-vida de 2,1x10
5
anos, com emissão de um fóton com
energia de 140 keV, abundância de 87%, meia-vida de 6 horas (Owunwanne et al.,
1995).
Essas características tornam possível a aquisição de imagens de excelente
qualidade com baixas doses administradas, acarretando uma baixa exposição do
paciente e rejeitos radioativos de fácil gerenciamento e baixo impacto ambiental.
(Owunwanne et al., 1995). Todas essas características, em conjunto, são responsáveis
pela grande aceitação do
99m
Tc em procedimentos da medicina nuclear (Perkins & Frier,
1999; Bernardo-Filho, 1999; Schneider et al., 2002) e também em atividades de
pesquisa (Bernardo-Filho, 1999; Samnick et al., 2004).
Os radiofármacos marcados com
99m
Tc tornaram-se, nos últimos trinta anos,
importantes ferramentas para diagnóstico de doenças, sendo usados em exames de
rotina em busca de metástases dentre outras. Atualmente, existem diversos compostos
gerando um significante volume de exames na rotina do serviço de medicina nuclear
(Imam, 2005).
2.2.3 - Radionuclídeo Molibdênio-99 (
99
Mo)
O molibdênio é um elemento químico do grupo VIB ou coluna 6 da Tabela
Periódica dos Elementos, sendo classificado com um metal de transição. O isótopo
99
Mo
pode ser gerado pelas reações Mo(d,p)
2
, Mo(n, γ)
2,3
, Mo(n,2n)
2,3
, Zr(α,n)
4,5
e por
produtos de fissão do urânio e tório (Edwards e Pool, 1947).
O Mo é um oligo-elemento essencial na dieta dos seres humanos, exigido para a
função de três enzimas encontradas em humanos: sulfito oxidase, xantina oxidase, e
aldeído oxidase (Bell et al 1964). Estas enzimas estão envolvidas na oxidação de sulfito
a sulfato, na produção de ácido úrico e na oxidação de aldeídos em seres humanos, mas
8
apenas a enzima sulfito oxidase é conhecida por ser indispensável ao ser humano. Estas
enzimas têm um cofator essencial comum, molibdoptenina (Turnlund et al 1995).
Indivíduos com ausência da enzima sulfito oxidase sofrem com desordens
neurológicas graves que geralmente levam à morte precoce. O molibdênio, entretanto, é
um metal tóxico em grandes quantidades. Este fato tem sido observado em muitas
espécies animais e é comum em bovinos que se alimentam em pastagens em áreas com
alta concentração de molibdênio(Rosoff and Spencer,1973). Uma alta incidência de
artropatias inflamatórias foi observada em regiões com elevadas taxas de molibdênio no
solo e alta ingestão na dieta (Turnlund et al 1995).
O primeiro estudo em seres humanos sobre o metabolismo do molibdênio como
marcador foi realizado em 1964 utilizando-se uma única injeção intravenosa do
radioisótopo
99
Mo em quatro pacientes com câncer terminal. Este trabalho revelou que a
principal via de excreção do molibdênio em humanos é através do rim (Rosoff and
Spencer,1964, Turnlund et al, 1995).
Atualmente o
99
Mo é utilizado em medicina nuclear como isótopo precursor do
tecnécio-99m. O
99
Mo apresenta meia-vida física de 67 horas, emitindo partículas beta
negativas e fótons gama associados de 740 e 778 keV, decaindo a tecnécio de duas
formas: metaestável (
99m
Tc) ou
99
Tc com respectivas probabilidades de 86 e 14%.(figura
2.1) (Marques et al 2001).
Figura 2.1 Esquema simplificado do decaimento do molibdênio-99 (Marques et al 2001)
9
2.2.4 - Geradores
99
Mo/
99m
Tc
O
99m
Tc é o radionuclídeo mais utilizado em medicina nuclear diagnóstica,
sendo obtido a partir do gerador de
99
Mo/
99m
Tc (Figura 2.2). Estes radionuclídeos se
encontram na forma de íons molibdato (
99
MoO
4
-2
) e pertecnetato (
99m
TcO
4
-
). No gerador
existe uma coluna de plástico ou vidro que possui alumina (Al
2
O
3
) em seu interior.
Esta coluna contém molibdato de sódio (Na
2
99
MoO
4
) e pertecnetato adsorvidos.
Devido à maior afinidade do íon molibdato (
99
MoO
4
-2
) pela alumina, observa-se que,
com a passagem de uma solução de cloreto de sódio 0,9%, um eluente, o
99m
TcO
4
-,
é
seletivamente eluído, permanecendo o
99
MoO
4
-2
retido na alumina (Chattopadhyay et al,
2008). O molibdênio utilizado para a fabricação das colunas dos geradores é obtido dos
produtos de fissão do Urânio (Hou et al 2007).
Figura 2.2 Gerador de
99
Mo/
99m
Tc produzido pelo IPEN
2.2.5 - Impurezas
2.2.5.1 - Impurezas Radionuclídicas
Consistem na presença de qualquer outro radionuclídeo no eluato que não seja o
de interesse. A presença de impurezas radionuclídicas em eluatos de tecnécio pode
ocorrer devido a algum tipo de falha no gerador, promovendo o desprendimento do
10
molibdênio da coluna de alumina. Isto acarreta exposição desnecessária ao paciente sem
que ocorra um benefício clínico (Owunwanne et al., 1995; Saha, 2004;).
O limite de
99
Mo em eluatos de
99m
Tc recomendado pela Agência Internacional
de Energia Atômica (IAEA) é de 0,55 MBq de
99
Mo para cada 3,7x10
7
MBq de
99m
Tc
administrado ao paciente (IAEA, 2006).
O tempo decorrido entre a eluição do gerador e o momento da administração da
dose é relevante devido às características físico-químicas do
99
Mo e do
99m
Tc, pois o
99
Mo possui meia-vida de 66 horas, ao passo que o
99m
Tc de 6 horas. Assim, a
proporção de
9
Mo no eluato aumenta em função do tempo (Owunwanne et al., 1995;
Saha, 2004).
Para determinar a quantidade de impurezas radionuclídicas devem ser realizados
testes de espectrometria gama para determinar a presença de energias diferentes das
previstas na literatura (Saha, 2004).
2.2.5.2 - Impurezas Químicas
São caracterizadas quando em um eluato existem outras substâncias químicas
que podem interferir no rendimento químico da reação (Saha, 2004;).
Em eluatos oriundos de colunas de
99
Mo/
99m
Tc pode ocorrer a presença de
alumina, que se desprende no momento da eluição. Este evento pode causar intoxicação
ao paciente, assim como causar alterações significativas na biodistribuição de certos
radiofármacos, tais como:
99m
Tc-enxofre-coloidal e
99m
Tc-metildifosfonato (Saha,2004).
Isto pode acarretar resultados que não refletem a realidade, prejudicando o diagnóstico e
levando à necessidade de repetição do exame (Saha, 2004;).
Este tipo de impureza pode ser verificado por meio da determinação de
coloração combinada com teste de cromatografia de camada fina, determinando-se a
presença de outros compostos químicos no eluato (Owunwanne et al., 1995).
2.2.5.3 - Impurezas radioquímicas
São definidas como quando há presença de uma ou mais formas químicas não
desejadas em um eluato. Em eluatos de
99m
Tc pode ocorrer a presença de tecnécio em
outras formas químicas com diferentes valores de Nox. Tais formas, quando não
apresentam valores de Nox ideais, não possuem a reatividade necessária para realização
11
de ligações químicas com os fármacos de interesse para determinados exames,
promovendo uma biodistribuição de duas fases:
99m
Tc-livre e
99m
Tc-fármaco.
Com o auxílio da cromatografia de camada fina aliada à espectrometria gama, é
possível determinar as frações de retenção dos radiofármacos conforme os rendimentos
químicos ideais para cada tipo de ligação e quantidade das mesmas para os complexos
radionuclídeo - fármaco (Saha, 2004;).
2.2.6 – Utilização de Radiofármacos
Sua utilidade depende essencialmente do comportamento químico, biológico e
farmacocinético da estrutura marcada e das características do radionuclídeo incorporado
(Okuno et al., 1986; Saha, 2004).
Um radiofármaco ou radiobiocomplexo ideal deve apresentar uma meia-vida
efetiva curta. Para a realização do exame deve possuir uma emissão eletromagnética
(raios γ ou raios-X) e localizar-se preferencialmente no tecido ou órgão desejados
(Owunwanne et al., 1995; Saha, 2004).
Os mesmos devem ser estéreis, livres de pirógenos e precisam ser submetidos a
todos os testes requeridos pelo controle de qualidade químico, físico-químico e
biológico de uma droga convencional a ser administrada em humanos (Saha, 2004).
2.2.7 – Biodisponibilidade dos radiofármacos
O comportamento biológico dos radiofármacos após serem administrados no
organismo é determinado pelas características físico-químicas do composto e pelo
estado funcional dos tecidos ou tipos celulares envolvidos (Owunwanne et al., 1995). A
distribuição biológica dos radiofármacos envolve os processos de absorção,
distribuição, metabolismo e excreção da substância (Owunwanne et al., 1995).
Outros fatores, como a ligação às proteínas plasmáticas, ligação aos constituintes
intracelulares das células sangüíneas, solubilidade relativa do radiotraçador, tamanho e
polaridade da estrutura do radiotraçador, mecanismo de transporte (ativo ou passivo),
metabolismo celular e ligação a receptores, possivelmente desempenham um papel na
fixação do radiotraçador ao órgão-alvo e em conseqüência, na sua biodistribuição
(Owunwanne et al., 1995).
12
Quando a alteração na biodisponibilidade do radiofármaco é desejada, esta
modificação pode auxiliar no diagnóstico de doenças. Entretanto, quando ela é
indesejada, este fenômeno pode estar associado à interação de drogas ou à sua
toxicidade, podendo comprometer o exame (Owunwanne et al., 1995; Gomes et al.,
2002a; Jankovic e Djokic, 2005). Além disso, um outro fator relevante é a alteração
desconhecida da biodistribuição do radiofármaco com conseqüente imprecisão no
diagnóstico ou necessidade de repetição do exame cintilográfico, expondo o paciente a
uma dose adicional e desnecessária de radiação (Gomes et al., 2002b).
2.2.8.1 – Biocinética do Molibdênio
Segundo a publicação 67 da Comissão Internacional de Proteção Radiológica
(ICRP, 1993) as informações sobre a distribuição do molibdênio estável em tecidos
humanos mostram uma concentração elevada no osso, no fígado e nos rins. A ligação
do molibdênio ao osso apresenta uma meia-vida biológica elevada (Coughtrey e
Thorne, 1983). Teste em camundongos para administração via intravenosa de
99
Mo na
forma de molibdato de amônio mostrou as maiores absorções e retenções no fígado
onde apresentou retenção de 26% da atividade administrada em 1 hora e 21% após 24
horas. Outro órgão que apresentou alta retenção de
99
Mo foi o rim, apresentando cerca
de 3,8 % da atividade administrada em 1 hora e 24 horas depois (Rosoff e Spencer,
1973).
A administração de molibdato de amônio em ratos revelou excreção de 74 % do
material em um período de 3 horas (Ando et al., 1989). A biodistribuição nos tecidos de
camundongos e ratos foi semelhante.
Rosoff e Spencer (1964) publicaram experimentos em seres humanos
envolvendo quatro pacientes com idades compreendidas entre os 53 a 78 anos. Foi
observado que a principal via de excreção é a urina, com urina acumulada em 24 horas e
10 dias depois de 12 e 25 % respectivamente. Cerca de 3 % da atividade administrada
foi excretada nas fezes durante este tempo.
Com base nos dados experimentais disponíveis, considera-se que a retenção de
molibdênio em seres humanos é composta de duas componentes com tempos de meia-
vida de um dia (10%) e 50 dias (90%). Isto sugere que o molibdênio é retido no
esqueleto com uma longa meia-vida (ICRP, 1979).
13
A ICRP 1979 sugere que a partir do compartimento transferência (sangue) 10%
do molibdênio seja depositado no esqueleto onde será retido com uma meia-vida
biológica de 10.000 dias. O restante da atividade é distribuído para o fígado (25%), rins
(5%) e outros tecidos (60%).
Estudos com ratos jovens mostram que o tempo de retenção é menor quando
comparado com os animais adultos. Esses dados, no entanto, não fornecem uma base
para afirmar dependência com a idade. Para efeito de cálculos são assumidos os dados
de adultos como parâmetros para todas as idades (ICRP, 1979).
Estudos sobre a biocinética do molibdênio foram realizados também através de
medidas in vivo e in vitro em cinco pacientes de serviços de medicina nuclear
submetidos a cintilografia óssea para detecção de metástases e que apresentaram
diagnóstico negativo. Foram determinados valores de doses efetivas médias de 0,82 μSv
e meia-vida efetiva de 2,3 ± 0,4 dias (Silva, 2007). Os resultados obtidos estão em
concordância com dados publicados por Giussani et al (1998) e sugerem que os valores
gerados pelo modelo teórico da ICRP 1979 superestimam a retenção do radionuclídeo
no organismo.
2.2.8.2 - Ácido metilenodifosfônico (MDP) marcado com
99m
Tc
O ácido metilenodifosfônico marcado com
99m
Tc (
99m
Tc-MDP) tem sido usado
para obtenção de imagens ósseas, baseado na elevada afinidade do componente
fosfonatado com os cristais de hidroxiapatita e colágeno imaturo, e são dependentes da
circulação sangüínea óssea e da atividade osteoblástica (McCracken et al., 2001; Saha,
2004).
O ácido metilenodifosfônico (MDP), (Figura 2.3), é um fármaco utilizado em
medicina nuclear que apresenta afinidade pelo tecido ósseo, sendo aplicável em
cintilografia óssea quando o mesmo é ligado com o radionuclídeo
99m
Tc.
A marcação do MDP ao
99m
Tc, ocorre quando o Nox do
99m
Tc é reduzido de +7
para +4 ou +3 por reação de óxido-redução com o Sn
+2
presente na solução na forma do
agente redutor cloreto estanoso (SnCl
2
). Na presença de MDP o
99m
Tc realiza ligações
químicas do tipo covalente simples ao mesmo.
14
Figura 2.3 Estrutura molecular do ácido metilenodifosfônico MDP usado em medicina
nuclear.
Algumas doenças podem ser diagnosticadas pelo aumento na captação do
componente fosfatado marcado com
99m
Tc, incluindo lesões metastáticas, doença de
Paget, fraturas, osteomielite, tumores ósseos, artrite reumatóide, lombalgia,
espondilólise e demais doenças que correspondam a modificações demonstradas na
cintilografia óssea, resultantes de condições capazes de provocar respostas inflamatórias
e conduzir à mineralização anormal (Datz 1995; Moore et al. 2003; Saha 2004).
O uso da localização e distribuição de agentes para imagens ósseas, como os
radiofármacos difosfonados marcados com
99m
Tc ou citrato de gálio-67 (
67
Ga),
oferecem um modo sensível e pontual de detectar doenças ocultas e investigar o fluxo
sangüíneo ósseo, o metabolismo e a patologia relacionada (Owunwanne et al., 1995).
A imagem “single photon emission computed tomography” tem,
progressivamente, alcançado uma importante função nos estudos de imagens de doenças
articulares, infecções, necrose avascular, crescimento ósseo, desenvolvimento de
anormalidades e efeitos causados por descarga de peso, exercícios e em outras formas
de tratamento em processos de reparos ósseos, (Figura 2.4) (McCracken et al. 2001;
Saha 2004).
15
Figura 2.4 Imagem de tórax anterior realizada por cintilografia planar utilizando
99m
Tc-
MDP onde verificamos a ligação do radiofármaco com estruturas ósseas assim como o
tecido renal (Timothy et al 1991).
2.2.8.3 – Interferências na biodisponibilidade de radiofármacos
A biodisponiblidade ou farmacocinética de radiofármacos pode ser alterada por
doenças (Owunwanne et al., 1995), pelo estado nutricional (Passos et al., 2002), por
uma variedade de produtos naturais ou sintéticos administrados aos pacientes
(Hesslewood & Leung, 1994) ou em animais de experimentação (Diré et al., 2003), por
procedimentos médicos invasivos e não invasivos, como radioterapia, processos
cirúrgicos, próteses, intubação, hemodiálise, dentre outros (Suga et al., 2001; Okudan et
al., 2004; Bernardo-Filho et al., 2005).
2.2.8.4 - Biodistribuição
Os estudos de biodistribuição são utilizados para controle de qualidade do lote
de preparação de radiofármacos para assegurar aos usuários sua adequação in vivo, e
determinação de retenção e eliminação. Nestes testes uma amostra do radiofármaco é
injetada em um modelo animal, sendo posteriormente sacrificados em intervalos de
tempos fixos, os órgãos dissecados e a atividade retida em cada órgão medida e
16
calculada, fornecendo, assim, uma aproximação para humanos (Owunwanne et al.,
1995).
Diversos estudos de biodistribuição são realizados com ratos da linhagem
Wistar, devido à sua aproximação com a biodistribuição humana comprovada em
experimentos anteriores para o radionuclídeo tecnécio 99m (Diré et al. 2003; Valença et
al. 2005; Souza et al., 2007).
2.3 - Cromatografia planar
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de
uma mistura realizada através de distribuição destes componentes entre duas fases em
contato direto (Collins et al.,1995)
.
A cromatografia de camada fina é uma técnica que destrói uma pequena porção
da amostra, tendo a capacidade de separação de componentes de misturas liquido-
liquido, relacionando-se com as características de polaridade dos materiais que
compõem a mistura, possibilitando, assim, a realização de análise qualitativa da amostra
(Collins et al.,1995).
2.4 - Detectores de Cintilação
Alguns materiais são capazes de transformar a energia cinética da radiação
incidente, ou produtos gerados durante essa interação, em luz que pode ser detectável de
uma maneira que exista uma proporcionalidade entre a energia depositada e a produção
de luz. A estes materiais chamamos detectores de cintilação (Tauhata et al. 2003).
Existem materiais que podem ser usados como detectores de cintilação na forma
de cristais (cintiladores sólidos), em que a construção da rede cristalina é fundamental
para que esse fenômeno seja possível, os materiais que possuem moléculas que
envolvem a amostra e são capazes de transformar a radiação em luz (cintiladores
líquidos) (Tauhata et al., 2003).
O cristal de iodeto de sódio ativado com tálio apresenta a capacidade de emitir
luz quando seus elétrons da banda valência são excitados pela energia cinética da
radiação, migrando para a banda de condução, por meio de um salto quântico. Porém,
ao voltar para seu estado fundamental (não excitado) na rede cristalina os elétrons têm a
17
probabilidade de entrar nas bandas criadas pelo ativador, no caso o tálio (Tauhata et al.,
2003).
Regiões de bandas criadas pelo processo de ativação do cristal com tálio, até a
sua posição original, permitem a geração de energia luminosa detectável, podendo ser
contada por meio da associação deste cristal a uma válvula fotomultiplicadora. A
mesma transforma a energia luminosa em sinais elétricos com intensidade conveniente
para serem processados, permitindo que o mesmo seja captado e classificado pela
instrumentação através do módulo eletrônico (Tauhata et al., 2003; Saha, 2004).
2.5 - Espectrometria gama
A espectrometria gama é uma técnica que permite análise quantitativa e
qualitativa de um radionuclídeo emissor gama em diversos tipos de amostras. É
realizada em detectores que possuem a capacidade de diferenciar as energias de emissão
gama, como: detectores de cintilação como o NaI(Tl) e semi-condutores Germânio
Hiper Puro (HPGe), por meio do recurso do módulo eletrônico, sendo então possível
discriminar os radionuclídeos presentes na amostra (Tauhata et al., 2003).
18
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Animal experimental
Os animais utilizados neste estudo foram ratos machos (Rattus norvegicus) da
linhagem Wistar, 12 ratos, com aproximadamente quatro meses de idade e peso médio
311 ± 21 g. Os animais foram cedidos pelo biotério da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), e mantidos sob os
mesmos cuidados relativos à alimentação (ração e água ad libitum), temperatura
(22 ± 5 ºC), umidade (45-65 %) e ciclos de 12 horas claro/escuro.
O experimento e o uso dos animais foi baseado em estudo aprovado pelo comitê
de ética da Universidade do Estado do Rio de Janeiro /COBEA (Souza et al, 2007).
(ANEXO1).
3.2 - Drogas e reagentes utilizados
As substâncias empregadas no experimento de biodistribuição estão
apresentadas na Tabela 3.1:
Tabela 3.1: Substâncias empregadas na biodistribuição e funções.
Reagente / droga Função Fabricante lote validade
Heparina sóidica Anticoagulante Roche / Brasil B1042 05 / 2010
Metilenodifosfonato
de sódio
Fármaco de
medicina nuclear
IPEN / Brasil 00479 10 / 2008
Tiopentax sódico Anestésico
intraperitonial
Cristália / Brasil 07096458 09 / 2009
O anestésico Tiopentax sódico foi injetado intraperitonealmente com
concetração 6,7 %. A quantidade de material injetada em cada animal foi de 60mg/kg de
massa do animal (Souza et al., 2007).
19
3.3 - Radionuclídeo
O radionuclídeo utilizado, molibdênio-99 (
99
Mo) em solução estéril de
NaCl 0,9%, sob a forma de Na
2
99
MoO
4
, foi gentilmente cedido pelo Centro de
Radiofarmácia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares da Comissão Nacional
de Energia Nuclear e calibrado no LNMRI do IRD (ANEXOS 2 e 3).
3.4 - Cromatografia Planar
Adicionou-se 3 mL de solução de
99
Mo na forma de Na
2
99
MoO
4
a um Kit de
Metilenodifosfonato de sódio. A solução foi agitada ao abrigo da luz por 15 minutos em
Vortex. aliquotas da solução de Na
2
99
MoO
4
e do complexo Metilenodifosfonato de
sódio + Na
2
99
MoO
4
foram colocadas em papel WHATMAN 1MM servindo de fase
sólida. Cada um dos conjuntos foi posto em contato com eluentes diferentes: Propanona
e NaCl 0,9% (Anexo 4). Após atingido 10 cm a fase sólida foi cortada em pedaços de
1 cm cada e estas foram contadas no sistema de detecção de NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV
em tubos utilizados em medicina nuclear (medindo 4,3 cm de altura por 1,0 cm de
diâmetro), mostrado na Figura 3.1
a) b)
Figura 3.1 a) Tubo de vidro utilizado para medida dos órgãos nos experimentos de
biodistribuição e espectrometria gama (altura: 4,3 cm; diâmetro: 1,0 cm) e b) Esquema
da cromatografia planar.
20
3.5 - Biodistribuição do radiofármaco
Para avaliar a biodistribuição do radiofármaco Na
2
99
MoO
4
e
99
Mo-MDP, os
animais foram anestesiados e, posteriormente foi injetado, por via endovenosa através
do plexo venoso ocular (Diré et al., 2003) 0,3 mL de solução de Na
2
99
MoO
4
(grupo 1) e
0,3 mL do radiofármaco
99
Mo-MDP
(grupo 2). Após respectivamente 10 e 120 minutos
da administração dos radiofármacos os animais foram sacrificados em câmara de CO
2
.
Os órgãos dos animais (Figura 3.2) foram isolados, identificados e pesados. Os
órgãos foram selecionados seguindo a distribuição conhecida pela ICRP 1979. Na
figura 3.3 está descrito o fluxograma experimental.
21
Figura 3.2 Imagem do rato com os respectivos órgãos retirados
As massas dos órgãos e dos animais foram determinadas em balança analítica
de precisão. A seguir os órgãos, além de uma amostra de sangue de 2mL de cada
animal, foram transferidos para tubos utilizados em medicina nuclear, conforme
mostrado na Figura 3.1a.
A Figura 3.3 apresenta o fluxograma do experimento de biodistribuição.
Figura 3.2 Imagem do Rato com os respectivos órgãos retirados
22
Ratos Wistar
inoculados com
Na
2
99
MoO
4
(n=6)
Ratos Wistar
inoculados com
99
Mo+MDP
(n=6)
Pesagem dos animais
Anestesia dos animais com
Tiopentax sódico 6,7%por injeção
intraperitoneal
Biodistribuição do
radiofármaco
Na
2
99
MoO
4
por
10 minutos
Biodistribuição do
radiofármaco
99
Mo+MDP por
120 minutos
Sacrifício e remoção dos órgãos listados na figura 3.2
Pesagem dos órgãos e embalagem dos órgãos em frascos
utilizados em medicina nuclear mostrado na figura 3.1 a)
Contagem das emissões na Unidade de Contador de Corpo Inteiro
em contador de cintilação sólida de NaI(Tl) 8”x4”, conforme a
figura 3.4, para cada órgão por 300 segundos de tempo vivo
corrigido pelo programa gennie2000
Cálculo das atividades pelas curvas de calibração e determinação da
atividade / massa do respectivo órgão
Análise estatística
Figura 3.3 Fluxograma experimental.
23
3.6 – Sistema de detecção da Unidade de Contagem
As medidas dos órgãos e das fitas de cromatografia foram realizadas na Unidade
de Contador de Corpo Inteiro (UCCI) do Laboratório de Medidas In Vivo (LABMIV)
do Instituto de Radioproteção e Dosimetria (IRD). A UCCI é composta de blindagem de
aço com dimensões de 2,5m x 2,5m x 2,65m revestida internamente com camadas
adicionais de chumbo, cádmio e cobre. Este sistema foi originalmente projetado para a
identificação e quantificação in vivo de traços de radionuclídeos emissores de fótons
depositados em órgãos e tecidos do corpo humano (Oliveira et al, 1989).
O sistema de detecção utilizado neste experimento é composto de detector
NaI(Tl) 8”x4” conectado ao sistema de aquisição de espectro Genie2000.
3.7 – Calibração do sistema de detecção da UCCI
As curvas de calibração do detector de NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV, para as
distâncias de 10, 15 e 20 cm em volumes de 2, 4, 6, 8 e 10 mL, foram obtidas
utilizando-se um suporte de acrílico e um coquetel de fontes radioativas (
57
Co,
137
Cs,
54
Mn e
65
Zn) fornecido e certificado pelo Laboratório Nacional de Metrologia das
Radiações Ionizantes (LNMRI) (ANEXO 5 e Figura 3.4). Desta forma é possível
determinar a atividade para cada órgão, utilizando-se as curvas de calibração, qual
melhor se adequa a medida, considerando-se o volume do órgão e a distância do frasco
em relação ao detector.
Figura 3.4 Geometria de medição das amostras com sistema de detecção de
NaI(Tl) 8”x4” do LABMIV
24
3.8 – Distâncias e Volumes dos órgãos para avaliação
As medidas das atividades para cada órgão foram realizadas em distâncias fixas e com
os órgãos ocupando os volumes descritos na Tabela 3.2.
Tabela 3.2 Volumes e distâncias na analise dos órgãos biodistribuidos
Órgão Volume (mL) Distância (cm)
Cérebro 2 10
Tireóide 2 15
Pulmão 4 20
Coração 4 20
Fígado 10 20
Baço 4 15
Pâncreas 2 15
Testículo 4 15
Osso 10 20
Músculo 2 20
Sangue 2 20
Rim 4 20
Para distintos órgãos foram utilizadas geometrias de contagens que melhor se
adequassem a simulação do volume ocupado no frasco e a atividade do radiofármaco
presente após a biodistribuição.
3.9 – Análise estatística
As médias aritméticas e desvios padrão dos experimentos isolados foram
calculados e processados pelo programa GraphPad Instat. Os resultados foram
comparados, e os testes estatísticos escolhidos conforme as características da
distribuição dos valores da população, com nível de significância de p<0,05 (Souza et al
2007).
25
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 - Calibração do sistema de detecção para determinação de
99m
Tc e
99
Mo em
amostras de biodistribuição e cromatografia planar
Para calibração do detector NaI(Tl) 8”x4” (Figura 4.1) foi utilizado um coquetel
de radionuclídeos contendo atividades certificadas pelo LNMRI/IRD (ANEXO 5). A
Tabela 4.1 apresenta os radionuclídeos utilizados, energias dos fótons considerados na
calibração e as respectivas intensidades.
Tabela 4.1 Características físicas dos radionuclídeos utilizados para calibração do
sistema de detecção NaI(Tl) 8”X4” do LABMIV
Radionuclídeo Energia (keV) Abundância (Attix et al. 1986)
cobalto-57 105,5 0,1360
césio-137 661,6 0,0722
manganês-54 831,0 0,0697
zinco-65 1115,4 0,0572
26
Energia x Eficiência
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0,1200
0,1400
0,1600
0 200 400 600 800 1000 1200
Energia (keV)
Eficiência (cpm/dpm)
Volume 2 distância 10
Volume 4 distância 10
Volume 6 distância 10
Volume 8 distância 10
Volume 10 distância 10
volume 2 distância 15
volume 4 distância 15
volume 6 distância 15
volume 8 distância 15
volume 10 distância 15
volume 2 distância 20
volume 4 distância 20
volume 6 distância 20
volume 8 distância 20
volume 10 distância 20
Expon. (Volume 2 distância 10)
Expon. (Volume 4 distância 10)
Expon. (Volume 6 distância 10)
Expon. (Volume 8 distância 10)
Expon. (Volume 10 distância 10)
Expon. (volume 2 distância 15)
Expon. (volume 4 distância 15)
Expon. (volume 6 distância 15)
Expon. (volume 8 distância 15)
Expon. (volume 10 distância 15)
Expon. (volume 2 distância 20)
Expon. (volume 4 distância 20)
Expon. (volume 6 distância 20)
Expon. (volume 8 distância 20)
Expon. (volume 10 distância 20)
Figura 4.1 Curvas de calibração do detector NaI(Tl) 8”x 4”obtidas nas geometrias de 2,
4, 6, 8 e 10 mL , nas distâncias de 10, 15 e 20 cm.
27
Tabela 4.2 Valores de R
2
obtidos para cada geometria de calibração do detector
NaI(Tl) 8”X4”
Geometria e distância Coeficiente de aderência (R
2
)
Volume 2 mL distância 10 cm 0,967
Volume 2 mL distância 15 cm 0,891
Volume 2 mL distância 20 cm 0,988
Volume 4 mL distância 10 cm 0,962
Volume 4 mL distância 15 cm 0,973
Volume 4 mL distância 20 cm 0,980
Volume 6 mL distância 10 cm 0,964
Volume 6 mL distância 15 cm 0,967
Volume 6 mL distância 20 cm 0,978
Volume 8 mL distância 10 cm 0,958
Volume 8 mL distância 15 cm 0,970
Volume 8 mL distância 20 cm 0,983
Volume 10 mL distância 10 cm 0,961
Volume 10 mL distância 15 cm 0,970
Volume 10 mL distância 20 cm 0,974
Foi observado, (Tabela 4.2), que as curvas apresentaram desvio estatístico do
coeficiente de determinação (R
2
) próximo a 1 em todas as geometria e distâncias
calibradas. Em todos os casos a variação do volume nas distâncias não resultou em
alteração significativa na tendência das curvas, revelando terem pouca contribuição para
a variação da eficiência de detecção do cristal de NaI(Tl). Por outro lado, observou-se
que a distâncias entre a fonte e o detector representa o parâmetro de maior impacto na
eficiência de detecção.
As equações das curvas de calibração obtidas no UCCI/IRD estão mostradas na
tabela 4.3
28
Tabela 4.3 Equações das curvas de calibração obtidas no detector NaI(Tl) 8”X4”
Geometria distância Equação da curva
Volume 2 mL distância 10 cm y= 0,1403e
-0,0009x
Volume 2 mL distância 15 cm y= 0,0886e
-0,0015x
Volume 2 mL distância 20 cm y= 0,0469e
-0,0008x
Volume 4 mL distância 10 cm y= 0,138e
-0,0009x
Volume 4 mL distância 15 cm y= 0,0783e
-0,0008x
Volume 4 mL distância 20 cm y= 0,0464e
-0,0008x
Volume 6 mL distância 10 cm y= 0,1395e
-0,0009x
Volume 6 mL distância 15 cm y= 0,0778e
-0,0008x
Volume 6 mL distância 20 cm y= 0,0448e
-0,0008x
Volume 8 mL distância 10 cm y= 0,1395e
-0,0009x
Volume 8 mL distância 15 cm y= 0,0787e
-0,0009x
Volume 8 mL distância 20 cm y= 0,0464e
-0,0008x
Volume 10 mL distância 10 cm y= 0,1423e
-0,0009x
Volume 10 mL distância 15 cm y= 0,0793e
-0,0008x
Volume 10 mL distância 20 cm y= 0,0464e
-0,0008x
A disponibilidade de calibrações em diferentes distâncias permite a seleção da
geometria mais adequada em função da atividade da amostra, evitando assim a
ocorrência de tempo morto do detector no caso de amostras que apresentem maiores
atividades.
4.2 - Cromatografia planar associada à espectrometria gama
Foram realizadas corridas cromatográficas planares do molibdato puro e
associado ao MDP para verificar sua interação com soluções de NaCl 0,9% e
Propanona+MDP (ANEXO 4). Os experimentos foram executados em meio sólido
utilizando fitas de papel cromatográfico Whatman 1MM. O experimento foi repetido
com 4 vezes. Posteriormente os meios sólidos foram cortados em distâncias de 1 cm. Os
resultados são apresentados a seguir.
29
Cromatografia Planar do Mo-99 em NaCl 0,9%
0
5
10
15
20
25
12345678910
Partes
Atividade Percentual
Figura 4.2 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de NaCl 0,9%
Cromatografia Planar do Mo-99 em propanona
0
10
20
30
40
50
60
70
12345678910
Partes
Atividade Percentual
Figura 4.3 Resultado da cromatografia planar do molibdato em solução de propanona
As distribuições das contagens nas diferentes porções da fita cromatográfica nos
eluatos representados nas Figuras 4.3 e 4.4 revelam baixa afinidade do molibdato pelo
eluato de maior polaridade (solução de NaCl 0,9%) e maior afinidade pelo eluato de
característica menos polar (solução de propanona).
30
Cromatografia Planar do Mo-99+MDP em NaCl 0,9%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
12345678910
Partes
Atividade percentual
Figura 4.4 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de
NaCl 0,9%.
Cromatografia Planar do Mo-99+MDP em propanona
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
12345678910
Partes
Atividade Percentual
Figura 4.5 Resultado da cromatografia planar do Molibdato + MDP em solução de
propanona.
As distribuições das contagens nas diferentes porções da fita cromatográfica nos
eluatos mostrados nas Figuras 4.5 e 4.6 revelam o comportamento de alta afinidade do
Molibdato com MDP pelo eluato de maior polaridade (solução de NaCl 0,9%), e menor
afinidade pelo eluato de característica menos polar (solução de propanona).
As figuras a seguir apresentam a comparação entre os resultados obtidos nos
experimentos cromatográficos.
31
Figura 4.6 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de
NaCl 0,9%.
Cromatografia Planar comparativa em propanona
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
12345678910
Partes
Atividade percentual
Mo-99
Mo-99+MDP
Figura 4.7 Comparação das cromatografias planares do molibdato em solução de
propanona.
Os resultados mostrados nas Figuras 4.7 e 4.8 estão de acordo com o
comportamento previsto para o radiofármaco
99m
Tc-MDP para cromatografia de camada
fina para o eluente NaCl 0,9%, assim como para a propanona (ANEXO 4).
Os resultados da cromatografia planar para o MDP são conhecidos e já foram
descritos por Owunwanne (1995). O MDP apresenta alta afinidade por solução de
32
NaCl 0,9%. O molibdênio apresenta maior afinidade pela fase sólida (papel
cromatográfico Whatman 1MM), quando comparado à solução de NaCl 0,9%. Isto
sugere que houve uma combinação química in vitro do molibdênio com MDP pela
interação do complexo com a solução de NaCl 0,9%.
4.3 – Biodistribuição do
99
Mo in vivo
A biodistribuição foi realizada utilizando dois grupos de estudo. O Grupo 1
(Controle) sofreu injeção de molibdato. Ao Grupo 2 foi administrada solução de
molibdato+MDP.
4.3.1 – Massas dos órgãos
A Tabela 4.3 apresenta as massas médias dos órgãos dos animais, para cada
grupo.
33
Tabela 4.4 - Massa dos órgãos dos animais utilizados nos experimentos de
biodistribuição in vivo do
99
Mo
Massa dos órgãos (g)
Órgão
Grupo 1 Grupo 2
Cérebro
1,4 ± 0,2
1,4 ± 0,2
Tireóide
0,14 ± 0,05 0,12 ± 0,02
Pulmão
2,2 ± 0,4 2,2 ± 0,2
Coração
0,98 ± 0,18 0,94 ± 0,07
Fígado
12 ± 2 10 ± 2
Baço
0,67 ± 0,08 0,62 ± 0,06
Pâncreas
0,7 ± 0,2 0,63 ± 0,06
Rim
1,04 ± 0,08 1,0 ± 0,1
Testículo
1,4 ± 0,2 1,3 ± 0,2
Osso
3,7 ± 0,6 3,1 ± 0,6
Músculo
1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,2
Aplicando-se o teste ANOVA p<0,05 realizado pelo programa GraphPad
Instat., conclui-se que os resultados mostrados na Tabela 4.4 indicam que não houve
diferença significativa entre as massas dos órgãos entre os dois grupos de animais
utilizados nos experimentos de biodistribuição (ANEXO 7).
4.3.2 - Atividades captadas pelos órgãos
Foram determinadas as atividades de cada órgão coletado no experimento de
biodistribuição para cada grupo de estudo. Os resultados foram avaliados em teste de
significância ANOVA p<0,05. As atividades específicas das médias de cada
compartimento estão apresentadas na Tabela 4.5 e na Figura 4.9 (ANEXO 8).
34
Tabela 4.5 Atividades específicas médias presentes nos órgãos analisados nos grupos de
animais 1 e 2
Atividade específicas médias dos órgãos (kBq/g)
Órgãos
Grupo 1 Grupo 2
Cérebro
22 ± 6 20 ± 7
Tireóide
263 ± 96 194 ± 71
Pulmão
351 ± 57 371 ± 21
Coração
150 ± 21 161 ± 15
Fígado
2266 ± 129 2293 ± 138
Baço
680 ± 80 718 ± 86
Pâncreas
659 ± 100 750 ± 86
Rim
1129 ± 200 1052 ± 74
Testículo
78 ± 25 103 ± 39
Osso
120 ± 41 147 ± 40
Músculo
59 ± 23 46 ± 13
Gráfico comparativo entre a biodistribuição do 99-Mo e o 99-Mo+MDP
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
FÍGA
D
O
RIM
SANGU
E
PANCÊA
S
BAÇO
P
ULMÃ
O
C
ORAÇÃ
O
TIREÓ
ID
E
OSSO
S
TES
TÍCUL
O
MÚS
C
ULO
S
C
ÉREBR
O
Órgãos
atividade (Bq/g)
99-Mo
99-Mo + MDP
Figura 4.8 Atividades dos compartimentos analisados nos grupos administrados com
Molibdato (coluna cinza) e Molibdato + MDP (coluna preta).
35
As atividades dos órgãos, medidos no detector NaI(Tl), e calculadas de acordo
com as respectivas curvas de calibração, foram corrigidas pelo tempo de decaimento.
Segundo teste ANOVA p<0,05 realizado pelo programa GraphPad Instat, não houve
diferença significativa entre as atividades dos órgãos dos animais dos dois grupos. Este
resultado sugere que o
99
Mo associado ao MDP não mantém a ligação in vivo, que havia
sido observada no experimento in vitro ou que o molibdênio ligado ao MDP teve o
mesmo padrão de interação que o molibdênio livre.
Os resultados deste experimento estão de acordo com o modelo biocinético do
molibdênio publicado pela ICRP (1993), sugerindo que a maior fração da atividade de
molibdênio administrado por injeção é captada pelo fígado e rins.
O presente trabalho fornece suporte adicional às estimativas de dose realizadas
em recente estudo sobre a exposição interna ao
99
Mo em pacientes de medicina nuclear
(Silva, 2007; Silva et al, 2008), nesse estudo, foi assumido, para o cálculo de dose
interna, que metabolismo do molibdênio é independente da presença do fármaco e segue
o modelo de biocinética disponível na literatura.
No presente trabalho observou-se que a presença de MDP na solução não
interferiu na biodistribuição do molibdênio nos órgãos estudados, não promovendo
maior dose no tecido ósseo, alvo do radiofármaco MDP-
99m
Tc. A comparação dos
grupos tratados apenas com molibdato e o grupo molibdato+MDP não alterou
significativamente, com p<0,05, a biodistribuição do radionuclídeo em ratos Wistar em
nenhum dos compartimentos estudados. Os resultados referentes à biodisitribuição e à
cromatografia planar foram publicados na revista Brazilian Archives of Biology and
Tecnology. (ANEXO 6).
36
5 – CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
5.1 - Conclusões
• A metodologia de medição de amostras de pequeno volume, implementada através
da calibração do sistema de detecção do LABMIV/IRD, utilizando suporte com
distância variável, desenvolvido especificamente para esta aplicação, mostrou-se
adequado para este tipo de estudo, podendo ser utilizado para outros radionuclídeos
na faixa de energia de 100 a 1200 keV.
• A cromatografia planar revelou que ocorre interação in vitro do molibdênio na
forma de molibdato com o fármaco MDP, reiterando a importância de realização do
controle das impurezas radionuclídicas oriundas dos geradores
99
Mo/
99m
Tc.
• A biodistribuição do molibdato observada em ratos Wistar machos, revelou-se
coincidente com o esperado, supondo-se o comportamento metabólico sugerido pelo
modelo para humanos.
• A biodistribuição do molibdênio em solução de MDP, não apresentou modificação
na distribuição das atividades nos órgãos estudados.
5.2 - Recomendações
• Sugerimos o prosseguimento de estudos de biodistribuição para avaliar as
possibilidades de alterações na biodistribuição do
99
Mo com os demais fármacos
utilizados em medicina nuclear.
• Sugerimos o prosseguimento de estudos de cromatografia utilizando outras técnicas
cromatográficas, além da usada no presente trabalho, para avaliar as possibilidades
de afinidades do
99
Mo com os demais fármacos utilizados em medicina nuclear.
37
• Visando avaliar a permanência in vivo da ligação entre o
99
Mo e o MDP observada
in vitro neste trabalho, recomendamos analise complementar da biodistribuição do
MDP marcado com
99
Mo, utilizando o
99
Mo e
32
P na forma de fármaco MD
32
P
ligado a
99
Mo.
38
ANEXO 1 – Certificado de aprovação pelo Comitê de Ética da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
39
40
ANEXO 2 – Certificado de Calibração da Fonte de
99
Mo – 1
42
43
ANEXO 3 – Certificado de Calibração da Fonte de
99
Mo – 2
44
45
ANEXO 4 – Bula do Fármaco MDP
46
47
48
ANEXO 5 – Certificado de Calibração do Coquetel de Radionuclídeos
49
50
ANEXO 6 – Artigo publicado na revista Brazilian Archives of Biology and
Tecnology
51
52
53
54
55
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