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Degradação bacteriana da MOD excretada por Microcystis
aeruginosa (Cyanobacteria) em culturas, fracionada e
submetida à radiação UV
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Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em
Ecologia e Recursos Naturais da
Universidade Federal de São Carlos,
como parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em Ecologia e
Recursos Naturais, área de concentração
em Ecologia e Recursos Naturais.
SÃO CARLOS
2009
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
M838db
Moreira, Ingritt Caroline.
Degradação bacteriana da MOD excretada por
Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) em culturas,
fracionada e submetida à radiação UV / Ingritt Caroline
Moreira. -- São Carlos : UFSCar, 2009.
59 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2009.
1. Ecologia aquática. 2. Matéria orgânica dissolvida. 3.
Radiação ultravioleta. 4. Microcystis aeruginosa. 5.
Bactérias. 6. Degradação. I. Título.
CDD: 574.5263 (20
a
)
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Ingritt Caroline Moreira
Degradaçao bacteriana da
MOD
excretada por
Microcystis aeruginosa
(Cyanobacteria) em culturas, fracionada e submetida
A
radiaçiio
UV
Dissertação apresentada
à
Universidade Federal de São Carlos, como parte dos
requisitos para obtenção do
títi~lo de Mestre em Ecologia e Reciirsos Naturais.
Aprovada
em
3
1
de julho de 2009
BANCA EXAMINADORA
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Presidente
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Prof. Dr. Armando Augusto Henriques Vieira
(Orientador)
1
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Examinador
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Profa. Dra. ~andrahotter Gouvêa
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Agradeço a Deus pela vida de oportunidades, pela sólida família que tenho (apoio
certo e verdadeiro) e pela saúde de que gozo, imprescindível na busca de meus
ideais e sonhos.
Ao Prof. Dr. Armando Augusto Henriques Vieira pela oportunidade, pela amizade,
pelos valiosos ensinamentos, pelo incentivo e paciência que fizeram desses anos do
Mestrado os mais enriquecedores de minha vida acadêmica.
Ao PPGERN e UFSCar pela infra-estrutura oferecida.
À Profa.Dra. Mirna Helena Regali Seleghim por ter me auxiliado solucionando
dúvidas em diversos momentos de minha pesquisa, pelas preciosas correções do
artigo submetido à qualificação e, especialmente, pelos momentos tão agradáveis de
conversa amiga e sincera!...
Ao Prof. Irineu Bianchini Jr. pelo auxílio com as análises de modelagem matemática
dos dados de COD e também pelas correções do artigo submetido para o exame de
qualificação.
À banca examinadora da defesa de mestrado, Profa. Dra. Sandra Protter Gouvêa,
Profa. Dra Mirna Helena Regali Seleghim (mais uma vez!!) Prof. Dr. Armando
A.H. Vieira pelas valiosas contribuições dadas a este trabalho.
À amiga Carolina Andrade pela verdadeira amizade e cumplicidade em todos os
momentos de sucesso e dificuldades nos últimos anos!! E pela ajuda na tradução do
artigo!!!
Ao colega e companheiro de laboratório Antônio Luiz Sartori pela ajuda tão
necessária em sanar as mais diversas dúvidas.
Ao Luizinho, técnico de campo, companheiro nas coletas, dono de uma disposição
contagiante e que se revelou um amigo de boas conversas.
À amiga e colega Inessa, por ter me ensinado várias etapas da análise de bactérias e
muitas outras dicas e comentários tão valiosos que me ajudaram a pensar melhor!!
Aos amigos e colegas do Laboratório de Ficologia Alessandra, Inessa, Letícia,
Fabrício, Vanessa, Zezé, Patrícia, Helena, Guilherme, Rodrigo e Thais, pelas
conversas enriquecedoras e muita troca de experiências, momentos de
descontração, boas risadas, cafezinhos e desabafos...
Às amigas Cristina, Inês e Bernadete pelas boas conversas muito descontraídas!
Aos meus pais queridos, pela confiança, dedicação e amor incondicional. Mas
principalmente por nunca me deixarem desistir, sequer desanimar. Amo vocês!!
Aos meus irmãos Hiltton e Yeda, amigos sinceros e verdadeiros que, apesar da
distância, sempre estiveram presentes nos momentos mais delicados que passei.
Amo vocês também!!!
Ao meu querido namorado e companheiro Fabrizio, por ser meu confessor, pelo seu
abraço amigo e acolhedor e pelas palavras de estímulo que sempre levantavam meu
ânimo. Te amo!
Aos amigos amados Luciana, André, Érika, Ciça e Giordano, pelas conversas
descontraídas e animadoras, churrasquinhos de fim de semana, passeios bucólicos
ou simplesmente por um abraço acolhedor!...
A toda minha família e amigos que contribuíram de alguma forma para que esta fase
de minha vida tomasse forma e, enfim, se concretizasse!!!
I
LISTA DE ABREVIATURAS
MOD – Matéria orgânica dissolvida
COD – Carbono orgânico dissolvido
PP – Produção primária
CFC – Clorofluorcarbonos
UV – Radiação ultravioleta
UV-A – Radiação ultravioleta A
UV-B – Radiação ultravioleta B
CO – Monóxido de carbono
CO
2
– Dióxido de carbono
CID – Carbono inorgânico dissolvido
H
2
O
2
– Peróxido de hidrogênio (água)
WDCM – World Data Centre of Microorganisms
HCl – Ácido Clorídrico
DAPI - 4’-6-diamidino-2-fenilindol
R – Fator de forma
P – Nível de significânica
n – Número de réplicas
DP – Desvio-padrão
II
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reservatório de Barra Bonita; o símbolo representa o ponto de coleta
de coordenadas 22° 32’ 34,5” S, 48° 29’ 26,4” O, situado a cerca de 3 km a
montante da barragem, (Embrapa, 2002).
10
Figura 2. Sistema utilizado para coleta integrada do inóculo bacteriano
(previamente autoclavado). A entrada de água C (com um peso em sua ponta) é
posicionada na profundidade desejada, permaneceu fechada com papel alumínio e
apenas foi aberta depois de submersa no reservatório. O tubo de vidro com algodão
A, autoclavado juntamente com o sistema, é conectado à mangueira ligada à
bomba de vácuo D a fim de evitar contaminação por bactérias aéreas. Um
respirador B foi adicionado para controle do vácuo e manter as trocas gasosas após
a coleta.
15
Figura 3. Diagrama que relata o destino da MOD produzida por M. aeruginosa,
desde a cultura algal produtora da MOD à composição das culturas bacterianas.
16
Figura 4. Concentração de clorofila a (μg.L
-1
) em função do tempo (dias) da
cultura de Microcystis aeruginosa.
20
Figura 5. Densidade de células de Microcystis aeruginosa (10
6
céls.mL
-1
) em
função do tempo (dias) da cultura.
21
Figura 6. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) nos
controles. O valor médio entre as réplicas é representado pela linha.
22
Figura 7. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas controle. O valor médio entre as réplicas é representado pela
linha. O desvio padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
Figura 8. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas controles. O valor médio entre as réplicas é representado pela
linha. O desvio padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
23
24
III
Figura 9. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas enriquecidas com a fração de MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada. O
valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas.
25
Figura 10. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração MOD<3 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
26
Figura 11. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração MOD<3 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
29
Figura 12. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas enriquecidas com a fração 30>MOD>3 kDa, irradiada e não irradiada. O
valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas.
30
Figura 13. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração 30>MOD>3 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
31
Figura 14. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração 30>MOD>3 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
33
Figura 15. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas enriquecidas com a fração MOD>30 kDa, irradiada e não irradiada. O
valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas.
34
IV
Figura 16. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração MOD>30 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
35
Figura 17. Fotomicrografias da comunidade bacteriana nos momentos de maiores
valores de densidade e biomassa bacterianas nas culturas com MOD>30 kDa
irradiada. A corresponde a 48 horas e B corresponde a 15 dias de incubação.
36
Figura 18. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração MOD>30 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
38
Figura 19. Fotomicrografias da comunidade bacteriana nos momentos de máxima
densidade celular. A representa o controle, B e C representam as culturas com
MOD<3 kDa, D e E correspondem à 30>MOD>3 kDa, F e G representam as
culturas com MOD>30 kDa, irradiadas e não irradiadas, respectivamente, para
todas as frações.
39
V
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Medidas das variáveis físico-químicas verificadas para a água do
reservatório de Barra Bonita no ponto de coleta (junho/2008).
Tabela 2. Concentração média de COD inicial (mg C.L
-1
) nos cultivos
enriquecidos com as diferentes frações de MOD, irradiadas e não irradiadas, bem
como o controle. O desvio padrão é indicado entre parênteses, com n = 2. Valores
de P comparam as culturas com mesmas frações de MOD, irradiada e não
irradiada.
14
21
Tabela 3. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas controle ao
longo dos 27 dias de cultivo.
23
Tabela 4. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com a fração de MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada, ao
longo dos 27 dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
27
Tabela 5. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas enriquecidas
com a fração de MOD<3 kDa, irradiada (Ir.) e não irradiada (Ñ Ir.), ao longo dos
27 dias de cultivo.
28
Tabela 6. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com a fração de 30>MOD>3 kDa, irradiada e não irradiada,
ao longo dos 27 dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
31
Tabela 7. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas enriquecidas
com a fração de 30>MOD>3 kDa, irradiada (Ir.) e não irradiada (Ñ Ir.), ao longo
dos 27 dias de cultivo.
32
Tabela 8. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com a fração de MOD>30 kDa, irradiada e não irradiada, ao
longo dos 27 dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
35
VI
Tabela 9. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas enriquecidas
com a fração de MOD>30 kDa, irradiada (Ir.) e não irradiada (Ñ Ir.), ao longo dos
27 dias de cultivo.
37
Tabela 10. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
nas culturas enriquecidas com as frações irradiadas de MOD, ao longo dos 27 dias
de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
40
Tabela 11. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
nas culturas enriquecidas com as frações não irradiadas de MOD, ao longo dos 27
dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
41
VII
RESUMO
A radiação solar pode alterar a MOD em um ambiente aquático tornando os
compostos mais lábeis ou recalcitrantes à biodegradação. Desta forma, a radiação solar,
principalmente a radiação UV, interfere indiretamente na comunidade microbiana de
forma a incrementar ou diminuir seu crescimento. O objetivo deste trabalho foi verificar
a interferência da radiação UV-A+B na biodisponibilidade da MOD separada em
diferentes frações (massa molecular), oriundas da liberação de células na fase
estacionária de Microcystis aeruginosa. A MOD liberada pela cianobactéria foi
separada por ultra-filtração tangencial e a estas foram inoculadas a comunidade
bacteriana do reservatório de Barra Bonita. A dinâmica da comunidade bacteriana foi
acompanhada por medidas de densidade e biomassa bacteriana e o consumo de carbono
das frações de MOD por medidas de COD. Também foram calculadas as frequências
dos morfotipos bacterianos. Todas as três frações de MOD investigadas apresentaram-se
altamente disponíveis à comunidade bacteriana. As culturas com fração de MOD<3 kDa
e MOD>30 kDa revelaram-se mais vulneráveis à radiação UV, fato corroborado pelas
numerosas diferenças estatísticas encontradas para as densidades bacterianas durante os
27 dias de incubação. Aos 15 dias de incubação, as culturas com fração de MOD>30
kDa irradiada apresentaram um segundo pico na densidade e biomassa bacteriana que
pode ser interpretado como um evento de sucessão na comunidade bacteriana. As
mudanças na frequência relativa dos morfotipos bacterianos ao longo do período de
incubação sugerem um episódio de sucessão durante as distintas fases de degradação da
MOD. Sugeriu-se que a maior parte do COD liberado por um bloom desta cianobactéria
é mineralizado rapidamente. Além disso, com os constantes blooms, ou a sempre alta
biomassa de M. aeruginosa ao longo do ano, inferem que tais consórcios bacterianos
estejam sempre disponíveis.
VIII
ABSTRACT
Solar radiation can change DOM in aquatic environments making compounds
more labile or recalcitrant to biodegradation. Thus, solar radiation, especially UV,
indirectly interfere in the microbial community in order to increase or decrease their
growth. The objective was to verify the interference of UV-A + B on the bioavailability
of DOM separated into different fractions (molecular weight), from release of cells in
stationary phase of M. aeruginosa. DOM released from cyanobacteria was separated by
tangential ultra-filtration and these were inoculated bacterial community of Barra Bonita
reservoir. Bacterial community dynamic was monitored by measures of density and
biomass and bacterial consumption of carbon from DOM by measures of DOC.
Frequency of bacterial morphotypes were also calculated. All three fractions of DOM
investigated were highly available to the bacterial community. The fraction of cultures
with DOM<3 kDa and DOM>30 kDa demonstrated to be more vulnerable to UV
radiation, corroborated by many statistical differences found for bacterial density during
27 days of incubation. At 15 days of incubation, the cultures with irradiated DOM>30
kDa showed a second peak in bacterial density and biomass that can be understood as
an event of succession in bacterial community. Changes in relative frequency of
bacterial morphotypes over incubation period suggest an episode of succession during
the different stages of degradation of DOM. It was suggested that the majority of DOC
released from a bloom of cyanobacteria is rapidly mineralized. Furthermore, the
constant blooms, or ever high biomass of M. aeruginosa during the year, mean that such
bacterial consortia are always available.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas...............................................................................................................I
Lista de Figuras.......................................................................................................................II
Lista de Tabelas.......................................................................................................................V
Resumo..................................................................................................................................VII
Abstract................................................................................................................................VIII
1.Introdução..............................................................................................................................1
1.1 Matéria Orgânica Dissolvida e sua biodisponibilidade à comunidade bacteriana..1
1.2 A radiação UV e a MOD em ambientes aquáticos.................................................3
1.3 Caracterização da MOD liberada por Microcystis aeruginosa e disponibilidade às
bactérias livres associadas........................................................................................................5
2. Objetivos...............................................................................................................................8
2.1 Objetivo Geral.........................................................................................................8
2.2 Objetivos Específicos .............................................................................................8
3. Materiais e Métodos.............................................................................................................9
3.1 Local de Estudo.......................................................................................................9
3.2 Cultura da cianobactéria.......................................................................................11
3.3 Experimentação.....................................................................................................12
3.3.1 Obtenção da MOD excretada e/ou liberada passivamente.....................12
3.3.2 Fracionamento da MOD.........................................................................13
3.3.3 Irradiação das frações de MOD..............................................................13
3.3.4 Biodisponibilidade da MOD..................................................................14
3.3.4.1 Obtenção do inóculo bacteriano..............................................14
3.3.4.2 Consumo da MOD pelo bacterioplâncton...............................15
3.3.4.3 Caracterização da comunidade bacteriana: morfologia,
biovolume e biomassa bacteriana....................................................................17
3.5 Análises estatísticas..............................................................................................19
4. Resultados...........................................................................................................................20
4.1 Crescimento de Microcystis aeruginosa...............................................................20
4.2. Experimento da biodisponibilidade de MOD à comunidade bacteriana.............21
4.2.1 Consumo do COD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas controle..................................................................22
4.2.2 Consumo do COD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas com MOD<3 kDa irradiada e não irradiada..........24
4.2.3 Consumo da MOD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas com 30>MOD>3 kDa irradiada e não irradiada....29
4.2.4 Consumo da MOD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas com MOD>30 kDa irradiada e não irradiada........33
4.2.5 Análise de Variância (ANOVA) e Teste de Tukey-Kramer –
Comparação entre culturas com diferentes frações de MOD.....................................40
5. Discussão............................................................................................................................43
5.1. Obtenção da MOD da fase estacionária...............................................................43
5.2 Biodisponibilidade da MOD à comunidade bacteriana........................................43
5.3 Frequência relativa dos morfotipos celulares bacterianos e sucessão bacteriana.48
5.4 Diferenças entre as frações de MOD....................................................................50
6. Conclusão...........................................................................................................................51
7. Referências Bibliográficas..................................................................................................53
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Matéria Orgânica Dissolvida e sua biodisponibilidade à comunidade
bacteriana
Há tempos, acreditava-se que a matéria orgânica dissolvida (MOD) liberada pelo
fitoplâncton era simplesmente perdida no meio aquático ou decomposta por
microrganismos especializados. Excretada ativamente ou liberada passivamente, a
MOD só poderia retornar às cadeias tróficas após ser mineralizada por bactérias
heterotróficas e assim, disponibilizada para o consumo dos produtores primários na
forma de carbono inorgânico (Wetzel, 2001; Tortora et al., 2003).
Porém, nos últimos 30 anos, estudos revelaram que esta MOD constitui uma das
principais fontes de carbono para bactérias heterotróficas em ambientes aquáticos tanto
marinhos (Amon & Benner, 1994) quanto de água doce (Wetzel, 1972; Carlson et
al.,1994; Lampert & Sommer, 1997; Wetzel, 2001; Tortora et al., 2003). Esta
capacidade das bactérias heterotróficas da coluna d’água em utilizarem a MOD de
origem fitoplanctônica como fonte de energia foi descrita por Azam e colaboradores
(1983) sob o modelo do “elo microbiano” - microbial loop - que seria a via paralela de
reintrodução de carbono orgânico dissolvido (COD) na cadeia trófica, passando pelas
bactérias, protozoários e zooplâncton até chegar aos peixes.
Assim, como principais responsáveis pela degradação da produção primária (PP)
fitoplanctônica, a comunidade bacteriana desempenha um importante papel na ciclagem
de carbono orgânico e de nutrientes nos ambientes aquáticos (Azam et al., 1983; Azam
& Cho, 1987; Ducklow & Carlson, 1992), principalmente em ambientes eutrofizados
nos quais é comum a descarga de grande quantidade de MOD em decorrência de
florações algais (blooms). Sabe-se que cerca de 30 a 40% de toda a PP do fitoplâncton é
liberada como MOD (Baines & Pace, 1991). Contudo, o carbono desta fração da MOD
2
da PP aproveitada pelas bactérias é assimilado com uma baixa eficiência: apenas 50%
de todo carbono assimilado é incorporado como biomassa bacteriana (Furham & Azam,
1982).
A MOD liberada pelo fitoplâncton é constituída por diversos tipos de
substâncias as quais se apresentam sob diferentes tamanhos e massas moleculares
(Ogawa & Ogura, 1992). A maior parte desta MOD, 65 a 80% (Ogawa & Ogura, 1992),
é composta por moléculas de baixa massa (Kaplan & Bott, 1983; Lancelot, 1984),
enquanto cerca de 20 a 30% desta MOD configura-se na forma de moléculas de alta
massa (Meyer et al., 1987; Benner et al., 1992). O tamanho das moléculas comumente
mensurado pela sua massa molecular constitui um fator que influencia diretamente a
utilização microbiana desta MOD. Para Saunders (1976), a MOD com baixa massa
molecular, constituída por moléculas mais simples e menores, é prontamente consumida
(em horas) ao contrário da MOD com alta massa molecular, cuja degradação bacteriana
demoraria dias ou semanas. Este modelo conceitual também foi apresentado por
Münster & Chróst (1990), relatando que as moléculas da MOD menores que 1 kDa são
prontamente degradadas pelo bacterioplâncton e que a biodisponibilidade apresenta uma
relação inversamente proporcional com o aumento da massa molecular.
Embora esta idéia da pronta degradação da MOD de baixa massa molecular seja
aceita por muitos pesquisadores, alguns estudos evidenciam que muitos compostos de
alta massa molecular são consumidos tão logo sejam disponibilizados (Arnosti et al.,
1994). Esta constatação pode ser fundamentada no conceito do modelo do contínuo
tamanho-reatividade, descrito por Amon & Benner (1996), o qual sugere que as
moléculas de alta massa molecular (>1kDa) são mais bioreativas que as moléculas de
baixa massa molecular (<1kDa). O modelo do contínuo tamanho-reatividade postula
que as moléculas de alta massa são diageneticamente mais jovens ou recém produzidas
3
pelo fitoplâncton e estas são mais facilmente degradadas originando moléculas menores
e biologicamente menos reativas (recalcitrantes).
1.2 A radiação UV e a MOD em ambientes aquáticos
A questão da destruição da camada de ozônio, principalmente em decorrência de
ações antrópicas, já não constitui novidade nas discussões acadêmicas. Este fenômeno é
conferido principalmente pela atuação dos clorofluorcarbonos (CFCs) e, com as
moléculas de ozônio aniquiladas, há um aumento do buraco desta camada protetora e
mantenedora da vida na superfície da Terra (WMO, 1995). Como uma conseqüência
deste evento, houve um acréscimo nos níveis de radiação solar, em especial da radiação
UV, incidentes na superfície terrestre (Madronich, 1992). Este excesso de radiação UV
proporciona alterações diretas tanto sobre as comunidades biológicas (Wetzel et al.,
1995; Tranvik & Bertilsson, 2001), quanto sobre as características geoquímicas (Suhett
et al., 2006) dos ecossistemas aquáticos continentais.
Recentemente, os efeitos diretos e indiretos da radiação solar sobre o pool de
MOD têm recebido uma atenção considerável. É sabido que a MOD apresenta
propriedades fotorreativas e é especialmente sensível à radiação UV-A, que corresponde
aos comprimentos de onda que variam entre 320 a 400 nm e à radiação UV-B, com
comprimentos de onda entre 280 e 320 nm. Tais alterações fotoquímicas podem
significar a produção de substratos tanto lábeis quanto recalcitrantes à biodegradação
(Harvey et al., 1983; Naganuma et al., 1996; Gobler et al., 1997).
Alguns estudos indicam que a exposição da MOD à radiação solar (UV) resulta
no aumento da biodisponibilidade de seus compostos (Lindell et al., 1995; Tranvik,
1998). Neste caso, a menor disponibilidade inicial da MOD devido à presença de
macromoléculas pouco disponíveis à comunidade bacteriana (Azam & Cho, 1987;
Søndergaard & Middelboe, 1995) é compensada por reações fotoquímicas de clivagem
4
das moléculas diminuindo a massa molecular média da MOD (Strome & Miller, 1978;
Zepp et al., 1995; Moran & Zepp, 1997; Bertilsson & Tranvik, 2000).
No entanto, outros produtos formados via fotodegradação da MOD (ação da
radiação solar) podem comprometer e até inibir a atividade e o crescimento do
bacterioplâncton. Neste caso pode configura-se a mineralização completa de compostos
orgânicos pela fotooxidação. Variando conforme a fonte de MOD, alguns destes
produtos formados são compostos inorgânicos como o monóxido de carbono (CO)
(Mopper et al., 1991; Valentine & Zepp, 1993), o dióxido de carbono (CO
2
) (Granéli et
al., 1996) e outras formas de carbono inorgânico dissolvido (DIC), bem como o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (Cooper et al., 1994; Scully et al., 1996), que
representam a mineralização fotoquímica direta da MOD. Além desta via de inibição da
atividade bacteriana, outras pesquisas revelam que a menor biodisponibilidade da MOD
após sua irradiação pode ser dada pela produção de substratos mais resistentes à
biodegradação (Naganuma et al., 1996; Benner & Biddanda, 1998; Tranvik & Kokalj,
1998; Tranvik & Bertilsson, 2001; Choi et al., 2004), e isso faz com que haja uma
inibição de 15 a 20 % da atividade microbiana (Tranvik & Kokalj, 1998; Pausz &
Herndl, 1999). Estas reações químicas iniciadas pela radiação UV que levam à produção
de moléculas mais recalcitrantes à biodegradação são conhecidas como reações de
condensação e cross link, em que radicais livres autooxidativos de moléculas
insaturadas da MOD reagem produzindo moléculas maiores e mais complexas como os
ácidos húmicos (Kieber et al., 1997). Tais reações desencadeadas pela radiação UV
causam o aumento da massa molecular média da MOD (Vähätalo et al., 1999; Opsahl &
Zepp, 2001).
Sendo assim, Tranvik & Bertilsson (2001) demonstraram que o efeito líquido da
radiação UV sobre a biodisponibilidade da MOD pode ser prevista conforme as
5
características da fonte. Estes autores propõem que, enquanto a MOD de origem algal é
predominantemente convertida em compostos refratários e de menor qualidade para o
uso microbiano após exposições à radiação UV, e substâncias mais antigas como é o
caso da matéria húmica tendem a se tornar lábeis, demonstrando que o papel da
radiação solar, em especial da radiação UV, em controlar a interação entre a MOD e a
comunidade bacteriana em ambientes aquáticos poderia ser mais complexo do que se
concebia.
1.3 Caracterização da MOD liberada por Microcystis aeruginosa e
disponibilidade às bactérias livres associadas
Sabe-se que grande parte da MOD presente em ambientes aquáticos é
proveniente da excreção ativa ou liberação passiva do fitoplâncton (Myklestad, 1995;
Biddanda & Benner, 1997). Sendo assim, é essencial uma avaliação dos resultados da
radiação UV sobre a biodisponibilidade MOD produzida por espécies fitoplanctônicas.
No reservatório de Barra Bonita (rios Tietê e Piracicaba – SP), área de estudo do
presente trabalho, a espécie Microcystis aeruginosa Kützing (Cyanobacteria) representa
uma considerável quantidade de biomassa e freqüentemente forma enormes blooms ao
longo do ano (Matsumura-Tundisi & Tundisi, 2005; Calijuri & Dos Santos, 2001;
Dellamano-Oliveira et al., 2007). Assim, é possível prever que a radiação UV incidente
na superfície do reservatório influencia a MOD disponibilizada às bactérias, como
também influi profundamente a dinâmica da comunidade aquática local, em especial as
bactérias heterotróficas (Choi et al., 2004). Obviamente, a radiação UV não interfere
somente na qualidade da MOD liberada por M. aeruginosa, mas também nas taxas de
liberação dessa MOD por processos de excreção ou por morte celular quando suas
células, geralmente em colônias, que tendo aerótopos, flutuam na superfície e ficam
expostas à irradiação UV, tema que está sendo abordado em trabalho de doutoramento
6
(Bittar, em preparação).
Levando em conta a baixa quantidade de estudos acerca dos efeitos da radiação
solar sobre a biodisponibilidade de MOD no Brasil (Amado et al., 2006), o estudo deste
tema realizado com culturas axênicas de espécies abundantes nos corpos d’água
brasileiros é extremamente importante para uma maior compreensão do processo de
decomposição e do fluxo de carbono em ambientes aquáticos.
Na maioria dos gêneros de cianobactérias, entre eles Microcystis, são
encontradas eubactérias associadas às células e à MOD liberada por esses organismos
(Worm et al., 2001; Eiler & Bertilsson, 2004; Kapustina, 2006; Bagatini, 2008).
Estudos revelam que, em ambientes eutróficos, 7 a 55% de todo carbono orgânico
utilizado pelas bactérias livres associadas à M. aeruginosa é oriundo da MOD excretada
pela cianobactéria (Worm & Sondergaard, 1998). Nesta MOD são encontradas
moléculas de alta massa molecular, como polissacarídeos maiores do que 30 kDa até
moléculas menores do que 3 kDa (Bittar, 2005; Huang et al., 2007). Devido a essa
heterogeneidade da composição da MOD, sua degradação envolve combinadas ações de
diversos grupos de bactérias o que deve determinar diferentes linhagens de bactérias
com grande variedade metabólica. Além disso, a heterogeneidade da MOD leva a que as
condições de crescimento não sejam uniformes para os diferentes grupos de bactérias e
fatores bióticos e abióticos podem promover sucessões de comunidades (Pernthaler et
al., 1998). A ocorrência de blooms, portanto, faz com que novos nichos sejam criados
levando à seleção de especialistas que poderão atuar em consórcio (Worm et al., 2001).
No entanto, devido a estes freqüentes blooms de M. aeruginosa ao longo do ano no
reservatório de Barra Bonita o que hipoteticamente mantém um contínuo suprimento do
mesmo substrato, tal diversidade nas comunidades bacterianas associadas à MOD de M.
7
aeruginosa poderá ser possivelmente considerada como uma característica permanente
ao longo de quase todo o ano.
8
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo geral avaliar o efeito da radiação UV-A+B
sobre a biodisponibilidade dos compostos de alta, média e baixa massa molecular
presentes na MOD excretada por células na fase estacionária do crescimento de
Microcystis aeruginosa, em culturas axênicas.
Tese: A constante permanência de grande biomassa de Microcystis aeruginosa
no reservatório de Barra Bonita permitiria a ocorrência de constantes e especializados
consórcios bacterianos capazes de mineralizar a MOD liberada pela cianobactéria em
tempos inferiores ao menor tempo de residência das águas. A ação desses consórcios
pode ser incrementada pela radiação UV.
2.2 Objetivos Específicos
(1) Separar a MOD excretada por M. aeruginosa em três frações a) MOD<3kDa;
b) 30>MOD>3 kDa; c) MOD>30 kDa. A escolha destas massas moleculares
representou um ponto de partida, considerando-se que a maior parte de MOD
excretada conhecida concentra-se abaixo de 30 kDa (Bittar, 2005).
(2) Quantificar o efeito da radiação UV-A+B
na transferência de carbono
dissolvido de cada fração para as comunidades bacterianas;
(3) Identificar a distribuição morfológica das espécies bacterianas que se associam
a cada uma das frações testadas, e que possam assimilar carbono orgânico oriundo
das diferentes frações da MOD irradiada com UV-A+B
(4) Verificar a ocorrência de fenômenos de sucessão bacteriana estabelecidos em
função da variedade na composição da MOD liberada pela cianobactéria.
9
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Local de Estudo
O reservatório de Barra Bonita é o primeiro de um complexo de seis
reservatórios em cascata ao longo do médio e baixo rio Tietê. É formado pelos rios
Tietê e Piracicaba (SP), ambos hipereutróficos e poluídos por atividades agrícolas e
industriais (Figura 1). Foi construído a fim de gerar energia elétrica; no entanto, este
reservatório possui como adicionais atividades o abastecimento de água, a pesca, a
navegação, a recreação, bem como a irrigação. Encontra-se em uma região de transição
entre os climas tropical e subtropical, com uma estação seca (inverno) e outra chuvosa
(verão). Trata-se de um reservatório polimítico, porém com freqüentes momentos de
estratificações (química e térmica) de curta duração. Durante o verão (estação chuvosa)
a taxa de descarga é cerca de 1500 m
3
/s; já para a estação seca (inverno), a taxa de
descarga é de aproximadamente 200 m
3
/s. A profundidade máxima é cerca de 25 m,
com uma profundidade média de 10 m. O tempo de retenção no verão é de 37 dias, no
inverno é de 137 dias. Vários estudos caracterizam-no como hipereutrófico, sendo que o
aporte de nutrientes ocorre por meio de fontes difusas, já que seu entorno sofre grandes
impactos ambientais ocasionados pela monocultura de cana-de-açúcar e criação de
gado, ao longo dos rios principais e seus tributários (Calijuri & Tundisi, 1990; Tundisi
& Matsumura-Tundisi, 1990). Predominam os solos tipo latossolo vermelho
distroférrico e latossolo vermelho-amarelo distrófico e argissolo vermelho-amarelo
distrófico (EMBRAPA, 1999).
10
Figura 1. Reservatório de Barra Bonita; o símbolo representa o ponto de coleta de
coordenadas 22° 32’ 34,5” S, 48° 29’ 26,4” O, situado a cerca de 3 km a montante da
barragem, (Embrapa, 2002).
Braço
do Tietê
Ponto das Coletas
Ponto das Coletas
Braço do
Piracicaba
Escala 1:50.000
11
3.2 Cultura da cianobactéria
A espécie Microcystis aeruginosa (Kützing) foi isolada do reservatório de Barra
Bonita e é atualmente mantida como linhagem axênica (BB05) na coleção de culturas
de microalgas de água doce do Departamento de Botânica da Universidade Federal de
São Carlos (WDCM: UFSCar CC 835). Quando livre no ambiente, populações desta
espécie de cianobactéria formam colônias com distintas formas e tamanhos. Estudos
com o gênero Microcystis em lagos temperados definiram características estruturais
comuns entre populações desse gênero, agrupando-as em diversas formas coloniais,
encontradas em diferentes fases de seu ciclo anual de crescimento (Reynolds et al.,
1981). Já no cultivo axênico em laboratório, a M. aeruginosa apresenta um
comportamento atípico em seu crescimento, suas células permaneceram livres, isto é,
individualizadas, o que possibilitou o monitoramento do crescimento das culturas por
contagem.
As culturas axênicas foram obtidas por repetidos isolamentos e lavagens por
centrifugação. Culturas experimentais cresceram em erlenmeyers de 4.0 L de
capacidade, em 2.0 L de meio de cultura ASM-1 (Gorham et al., 1964), em pH 7,0,
previamente autoclavado. Culturas foram mantidas sob as seguintes condições
laboratoriais: 100 - 120 μmol.m
-2
.s
-1
de irradiância (Quantameter QSL-100, Biospherical
Instruments); temperatura de 23 ± 1
o
C; fotoperíodo de 12:12 horas e gentilmente
agitadas duas vezes ao dia. A axenidade destas culturas foi checada periodicamente por
inoculação de uma alíquota das culturas em meio ASM-1 mais peptona, glicose e
extrato de levedura (150 mg.L
-1
cada).
Para acompanhar o crescimento da cultura ao longo do tempo, foram feitas
amostragens para contagem de células em câmara Fuchs-Rosenthal, na qual foram
contadas em tréplicas todas as células dos dois campos inteiros da câmara. O
12
crescimento algal também foi acompanhado por obtenção da concentração de clorofila
a, extraída com etanol 90% a quente (Nusch 1980), segundo recomendações de Marker
et al. (1980) e quantificada segundo Lorenzen (1967). O volume coletado variou entre
57 e 90 mL de acordo com o dia de amostragem. Foram utilizados filtros de fibra de
vidro de 1,2 μm de poro, em duplicata. Os filtros foram armazenados a -5ºC no escuro.
Para a extração propriamente dita, os filtros foram postos em tubos plásticos aos quais
foram acrescidos aproximadamente 5 mL de etanol 90% a 80ºC e macerados com um
bastão de vidro. Este macerado foi conservado em geladeira durante 24 horas. Após este
período, as amostras foram centrifugadas para a separação da fibra de vidro e o volume
de sobrenadante utilizado para a leitura em espectrofotômetro (Hewlett Packard, Diode
Array Spectrophotometer 8452A) nos comprimentos de onda de 665 e 750 nm.
Posterior a esta primeira leitura, as amostras foram acidificadas com HCl 1 M (100 μL
para cada 5 mL de amostra), mantidas em descanso por 15 minutos, e lidas novamente
nos mesmos comprimentos de onda para se obter os valores de feofitina (subproduto da
degradação da clorofila a) usados no cálculo da concentração de clorofila a.
A fase na qual as amostras de MOD foram coletadas foi caracterizada pela
estabilidade ou decréscimo da concentração de células, em concomitância com o
decréscimo da concentração de clorofila a.
3.3 Experimentação
3.3.1 Obtenção da MOD excretada e/ou liberada passivamente
A MOD liberada pela M. aeruginosa foi obtida na fase estacionária do
crescimento, portanto há a possibilidade da ocorrência de MOD oriunda de células
mortas. Ao atingirem a fase estacionária de crescimento, células algais foram separadas
dos meios de cultura por filtração tangencial em cartucho de fibra oca (Xampler™, A/G
13
Technology Corporation/GE) com poros de 0,65 μm (UFP-6-E-4A), previamente
autoclavado.
3.3.2 Fracionamento da MOD
Para o fracionamento da MOD produzida pela M. aeruginosa, a separação das
três frações de interesse, MOD<3 kDa, 30>MO>3 kDa e MO>30 kDa foi inicialmente
realizada por ultra-filtração tangencial em cartuchos de fibra oca de 3 kDa (UFP-3-E-
4A) e de 30 kDa (UFP-30-E-4A), também previamente autoclavados. Após o
fracionamento, foi acertado o volume inicial do filtrado com água ultrapura autoclavada
a fim de manter as concentrações iniciais das frações de MOD no meio de cultivo da
cianobactéria. Estas sub-amostras foram novamente filtradas em membranas de
policarbonato com poros de 0,22 μm (Millipore) para retirar possíveis bactérias
contaminantes.
3.3.3 Irradiação das frações de MOD
Após filtração em membranas de poro 0,22 μm, as frações de MOD obtidas a
partir da cultura experimental da cianobactéria foram submetidas à simultânea radiação
UV-A + UV-B, proveniente de lâmpadas TL 40W 05 (ricas em UV-A) e TL 40W/12RS
(ricas em UV-B) (Phillips), por um período de 12 horas, buscando simular o período de
insolação que ocorre no reservatório de Barra Bonita. Para isso, foram utilizados frascos
de quartzo que permitem a passagem total da radiação UV. A irradiação das amostras
foi realizada mantendo os frascos sob as lâmpadas, a uma distância em que a energia
incidente nos frascos foi similar àquela encontrada incidente à superfície do reservatório
de Barra Bonita no mês de junho (inverno), quando foi realizada a coleta do inóculo
bacteriano. O valor total de irradiância utilizado neste experimento foi de 1000 μmol.m
-
2
.s
-1
. As medidas de intensidade de radiação UV foram realizadas por meio de um
espectroradiômetro (EPP 2000, StellarNet).
14
3.3.4 Biodisponibilidade da MOD
Após serem submetidas à radiação ultravioleta, as três frações de MOD,
irradiadas e não irradiadas, foram utilizadas para composição dos experimentos de
degradação bacteriana. Separadamente, cada uma das frações de MOD serviu de
substrato para as bactérias provenientes da comunidade do reservatório de Barra Bonita.
3.3.4.1 Obtenção do inóculo bacteriano
A coleta do inóculo bacteriano foi efetuada em um único ponto de coordenadas
22° 32’ 34,5” S, 48° 29’ 26,4” O, situado a cerca de 3 km a montante da barragem
(Figura 1). A coleta foi feita no mês de junho de 2008, na estação seca (inverno). A
Tabela 1 caracteriza o ambiente no momento da coleta segundo algumas variáveis
físico-químicas.
Tabela 1. Medidas das variáveis físico-químicas verificadas para a água do reservatório
de Barra Bonita no ponto de coleta (junho/2008).
Variáveis Fisico-Químicas Valor
pH 5,60
Temperatura °C 19,6
Oxigênio Dissolvido mg.L
-1
5,31
Condutividade µS.cm
-1
0,20
Disco de Secchi (profundidade) m 2,30
Este inóculo foi obtido a partir de coleta integrada da coluna d’água (superfície,
1, 5, 10 e 18 metros). As amostras das várias profundidades foram integradas em
sistema previamente autoclavado (Figura 2). 2 L do volume coletado foram filtrados sob
condições estéreis, em filtros de fibra de vidro com poros de 1,2 μm (GF/C, Whatman)
previamente calcinados (500°C por 3 horas), para retirar algas, protozoários e detritos
presentes na amostra.
15
Figura 2. Sistema utilizado para coleta integrada do inóculo bacteriano (previamente
autoclavado). A entrada de água C (com um peso em sua ponta) é posicionada na
profundidade desejada, permaneceu fechada com papel alumínio e apenas foi aberta
depois de submersa no reservatório. O tubo de vidro com algodão A, autoclavado
juntamente com o sistema, é conectado à mangueira ligada à bomba de vácuo D a fim
de evitar contaminação por bactérias aéreas. Um respirador B foi adicionado para
controle do vácuo e manter as trocas gasosas após a coleta.
3.3.4.2 Consumo da MOD pelo bacterioplâncton
Foram feitas duas réplicas das culturas de bactérias para cada tipo de substrato
disponibilizado à comunidade bacteriana, isto é, duas culturas de cada uma das frações:
MOD<3 kDa, 30>MOD>3 kDa e MOD>30 kDa; e para ambos os tratamentos: frações
irradiadas e frações não irradiadas. As culturas continham 500 mL das frações de MOD,
500 mL de água do reservatório filtrada em membranas de policarbonato com poros de
0,22 μm coletada no mesmo local do inóculo bacteriano sob condições assépticas, 100
mL de meio ASM-1 autoclavado e 50 mL do inóculo bacteriano (Figura 3). O meio
ASM-1 foi adicionado para proporcionar os nutrientes inorgânicos necessários ao
C
D
A
B
16
metabolismo bacteriano, para fazer do carbono o único nutriente limitante do
crescimento das bactérias. Também foram feitas duas réplicas para o controle, o qual foi
constituído de 1 L de água do reservatório filtrada em membranas de policarbonato com
poros de 0,22 μm, 100 mL de meio ASM-1 autoclavado e 50 mL de inóculo bacteriano.
É importante salientar que as culturas controle não foram submetidas à radiação UV-
A+UV-B. Culturas bacterianas cresceram em frascos de vidro de 2L com tampa tipo
vent-cap os quais foram mantidos no escuro e sob temperatura de 23 ± 1
o
C e foram
gentilmente agitadas uma vez ao dia.
Figura 3. Diagrama que relata o destino da MOD produzida por M. aeruginosa, desde a
cultura algal produtora da MOD à composição das culturas bacterianas.
A temperatura de cultivo aplicada ao experimento em questão correspondeu à
média das temperaturas verificadas no período do ano em que foi coletado o inóculo
bacteriano (inverno). Assim, buscou-se reproduzir as mesmas condições ambientais
locais a fim de se obter dados que melhor reproduzissem os eventos que sucedem um
bloom de M. aeruginosa no que se refere à resposta da comunidade bacteriana do
reservatório de Barra Bonita.
17
A dinâmica da densidade bacteriana foi acompanhada durante 27 dias através da
contagem das células. Alíquotas de 50 mL das culturas foram amostradas nos seguintes
momentos: 0 horas, 12 horas, 1, 2, 5, 8, 12, 15, 19, 23 e 27 dias, sob condições
assépticas. Estas foram fixadas com formol (4 %) e coradas com DAPI (Porter & Feig,
1980), em filtros pretos de policarbonato com 0,22 µm de diâmetro de poro (Millipore),
utilizando a técnica de microscopia de epifluorescência (microscópio Zeiss Axioplan 2,
Jena, Germany).
O consumo da MOD nas culturas bacterianas foi monitorado por quantificação
do carbono orgânico dissolvido (COD), filtrando uma alíquota de 25 mL da cultura em
membranas de policarbonato com poro 0,22 µm e utilizando-se para as leituras de COD
um analisador de carbono TOC-Vcph (Shimadzu). Foram realizadas 11 amostragens ao
longo do período de incubação (mesmos momentos das análises bacterianas descritas
acima).
3.3.4.3 Caracterização da comunidade bacteriana: morfologia, biovolume e
biomassa bacteriana
Além da densidade, a morfologia das células bacterianas foi obtida também por
microscopia de epifluorescência. Das amostras fixadas obtidas para densidade
bacteriana, foram retiradas pequenas alíquotas (de 0,5 a 4,5 mL) e seus volumes foram
ajustados com água ultrapura autoclavada para um volume final de 4,5 mL. Estas foram
sonificadas em banho de ultrassom (Bransonic 1210) por 30 minutos a fim de dissolver
possíveis agregados bacterianos formados durante o consumo da MOD. A sonificação
aplicada neste trabalho não é capaz de alterar a quantidade, o biovolume e nem a
morfologia das bactérias (Bagatini, 2008). Após a sonificação, estas alíquotas foram
coradas com DAPI (concentração final de 1 μg.mL
-1
) e filtradas em membranas de
policarbonato com poros de 0,22 μm, previamente coradas com Sudan Black. Foram
18
montadas lâminas das quais se obteve fotomicrografias (imagens) para posteriores
análises.
Por meio da técnica de microscopia de epifluorescência, estas fotomicrografias
foram capturadas com uma câmera Zeiss AxioCam HRc acoplada a um microscópio
Zeiss Axioplan 2 (Jena, Germany). As imagens foram tratadas com ajuda do software
Axiovision release 4.5 (Zeiss). Os morfotipos foram identificados pela razão
comprimento/largura (fator de forma “R”) (Zaritsky 1975 apud Racy 2004), e assim
classificados em cocos – de 1,0 a 1,25; cocobacilos – de 1,26 a 1,75; bacilos – de 1,76
até 5. As bactérias com R superior a 5 foram classificadas como filamentos, víbrios
foram identificados pela sua forma falciforme e espirilos foram identificados pela sua
forma em “S”.
Para o cálculo do biovolume de cada célula bacteriana, foram aplicadas fórmulas
descritas por Sun & Liu (2003) assumindo-se que:
COCO
BACILO, ESPIRILO E
FILAMENTO
6
3
a
V
×
=
π
ESFERA
6
2
ab
V
××
=
π
ESFERÓIDE
PROLATADO
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
−×=
124
2
ba
bV
π
CILINDRO COM DUAS CAPAS
HEMI-ESFÉRICAS
VÍBRIO COCOBACILO
4
cba
V
××
×
≈
π
PRISMA FALCIFORME
6
cba
V
×
×
×
=
π
ELIPSÓIDE
Em que: a = comprimento ou diâmetro da célula; b = largura e c = espessura.
O software utilizado para medir as células bacterianas opera em um sistema
bidimensional. Uma vez que células bacterianas possuem uma configuração
tridimensional, considerou-se sempre b = c. O comprimento (a) de víbrios e espirilos
19
corresponde à distância entre as duas extremidades da figura e foi determinado
manualmente, com o auxílio de recursos disponíveis no software. As medidas de cocos,
cocobacilos e bacilos foram efetuadas automaticamente pelo sistema, corrigindo
manualmente quando necessário.
A biomassa bacteriana foi calculada multiplicando-se o número de células em
cada amostragem pelo biovolume médio e pelo fator de conversão de 0,12 pg C.μm
3
(Nagata & Watanabe, 1990). Este fator foi escolhido devido à sua aplicabilidade para
avaliação de comunidades de bactérias obtidas a partir de culturas enriquecidas.
3.5 Análises estatísticas
As análises estatísticas dos valores obtidos para densidade bacteriana (testes T
Student, ANOVA e comparações múltiplas de Tukey-Kramer (Zar, 1999)) foram
realizadas utilizando-se o programa GraphPad InStat® 3.0 (1997).
Os limites de significância para o teste de Tukey-Kramer para n=3 foram de q =
5,910 e P < 0,05
Foram adotados os seguintes limites para os níveis de significância:
Valor de P Significado
<0,001 Extremamente significante
0,001 a 0,01 Muito significante
0,01 a 0,05 Significante
> 0,05 Não significante
20
4. RESULTADOS
4.1 Crescimento de Microcystis aeruginosa
A cianobactéria foi monitorada durante todo seu crescimento a fim de se obter
um filtrado de MOD excretada ativamente ou liberada passivamente na fase
estacionária. O 53° dia de cultivo correspondeu ao período de estabilização no início da
fase estacionária.
Figura 4. Concentração de clorofila a (μg.L
-1
) em função do tempo (dias) da cultura de
Microcystis aeruginosa.
Além da concentração de clorofila a (Figura 4), o crescimento algal foi
acompanhado por contagem celular. As medidas de densidade celular também indicam
que a cultura estava, no 53
o.
dia de cultivo, na fase estacionária do crescimento (Figura
5).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 102030405060
Tempo (Dias)
[CL a] (ug.L
-1
)
21
Figura 5. Densidade de células de Microcystis aeruginosa (10
6
céls.mL
-1
) em função do
tempo (dias) da cultura.
4.2. Experimento da biodisponibilidade de MOD à comunidade bacteriana
A Tabela 1 mostra as concentrações iniciais de COD nos diferentes tratamentos.
As culturas enriquecidas com MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada, apresentaram
valores iniciais de carbono orgânico dissolvido bem superiores às demais frações,
seguidas daquelas com MOD>30 kDa e 30>MO>3 kDa. Porém, comparando-se
estatisticamente as concentrações entre as culturas irradiadas e não irradiadas de mesma
fração, não houve diferenças significativas o que permite comparações entre as mesmas.
Tabela 2. Concentração de COD inicial (mg C.L
-1
) nas réplicas dos cultivos
enriquecidos com as diferentes frações de MOD, irradiadas e não irradiadas, bem como
o controle. Valores de P comparam as culturas com mesmas frações de MOD, irradiada
e não irradiada.
Carbono Orgânico Dissolvido Inicial [COD]
i
(mg C.L
-1
)
MOD<3
kDa
30>MOD>3
kDa
MOD>30
kDa
Controle
(Ñ irradiado)
Irradiada
17,61/18,12 7,01/8,81 8,50/8,67
4,81/4,67
Não irradiada
15,58/16,48 7,21/8,05 8,31/9,03
Teste t de Student
(P)
0,0719 0,8039 0,8307
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 102030405060
Tempo (Dias)
Densidade celular (10
6
Céls.mL
-1
)
22
4.2.1 Consumo do COD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas controle
A dinâmica de utilização do COD contido nas culturas controle pelas bactérias é
apresentada na Figura 6. Os controles apresentaram uma baixa concentração inicial de
COD. Estes foram compostos do dobro do volume de água do reservatório utilizado nas
culturas com MOD liberada pela M. aeruginosa, além dos 100 mL de meio ASM-1
adicionados em todos os tratamentos.
Figura 6. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) nos controles. O
valor médio entre as réplicas é representado pela linha.
Na Figura 7 é mostrado o comportamento da densidade das bactérias presentes
nos controles. Observa-se que o crescimento é exponencial nas primeiras 48 horas de
cultivo, declinando acentuadamente após o 2° dia e praticamente se estabiliza do 12°
dia até o final do período de incubação.
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25 30
Carbono Orgânico Dissolvido (mg.L-¹)
Tempo (dias)
C1
C2
Média controles
23
Figura 7. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
bacterianas controle. O valor médio entre as réplicas é representado pela linha. O desvio
padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
Foram analisadas também as freqüências dos morfotipos celulares bacterianos
durante o período de incubação. Houve uma variação muito discreta na freqüência
relativa dos morfotipos bacterianos das culturas controle nas primeiras 24 horas de
incubação (Tabela 3). Após o 5° dia, houve uma estabilização na freqüência dos tipos
bacterianos. Os morfotipos filamento e espirilo não apresentaram muito sucesso em suas
adaptações às condições de cultivos nas culturas controle, sendo que espirilo apresentou
freqüência nula em 8 das 11 amostragens.
Tabela 3. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas controle ao longo
dos 27 dias de cultivo.
% MORFOTIPOS BACTERIANOS
Dias Coco Cocobacilo Bacilo Víbrio Espirilo Filamento
0
15,03 40,48 31,49 12,60 0,40 0
0,5
19,57 38,34 33,11 8,38 0,29 0,31
1
8,05 33,58 42,82 14,55 0 0
2
10,43 29,80 42,56 16,50 0 0,71
5
15,23 30,39 46,75 7,63 0 0
8
15,38 26,84 49,17 6,25 0 2,36
12
15,41 32,01 42,35 8,50 0 1,73
15
14,74 29,90 47,07 7,74 0 0,54
19
12,72 37,10 40,60 8,44 0,33 0,81
23
16,49 31,78 41,40 8,70 0 1,63
27
12,90 35,92 43,57 6,15 0 1,45
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)
Densidade Bacteriana
(10
6
céls.ml-1)
Média Controles
24
A dinâmica da biomassa bacteriana nas culturas controle é mostrada na Figura 8.
Foi constatado um rápido aumento da biomassa bacteriana no início do período de
incubação (primeiras 48 horas), com um valor máximo atingido no segundo dia (438,92
μg C.mL
-1
). Este valor cai após o 2° dia e do 5° ao 27° dia houve uma fase de pequenas
flutuações, com um valor médio de 141,47 μg C.mL
-1
.
Figura 8. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
bacterianas controles. O valor médio entre as réplicas é representado pela linha. O
desvio padrão é representado pelas barras verticais, com n = 2.
4.2.2 Consumo do COD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas com MOD<3 kDa irradiada e não irradiada
A dinâmica de consumo da MOD<3 kDa dos tratamentos irradiado e não
irradiado é semelhante durante praticamente todo o tempo de incubação, mas é possível
observar que a fração não irradiada foi mais prontamente degradada nas primeiras 48
horas de incubação. A partir do 27° dia o carbono da fração irradiada sofre uma redução
de cerca de 30% enquanto na fração não irradiada, os valores de COD permanecem
praticamente constantes nestas amostragens finais (Figura 9).
0
100
200
300
400
500
600
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)
Biomassa (μg C.mL
-1
)
Média Controles
25
Figura 9. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
enriquecidas com a fração de MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada. O valor médio
entre as réplicas é representado pelas linhas.
Os resultados obtidos para as culturas com a fração de MOD<3 kDa
demonstraram um rápido aumento da densidade bacteriana no início do período de
incubação. Porém, as culturas com MOD não irradiada atingiram valores máximos em
24 horas de incubação (média = 32,81.10
6
células.mL
-1
, DP = 2,50.10
6
células.mL
-1
) e
as culturas com MOD irradiada atingiram valores máximos em 48 horas de incubação
(média = 36,73.10
6
células.mL
-1
, DP = 1,08.10
6
células.mL
-1
). Ocorreu um rápido
declínio nos valores de densidade bacteriana após este período inicial, e do 5° ao 27° dia
houve uma fase aparentemente estável, com valores médios de 9,18.10
6
(DP=0,59.10
6
)
células.mL
-1
para as culturas com MOD irradiada e 7,31.10
6
(DP=0,66.10
6
) células.mL
-1
para aquelas com MOD não irradiada (Figura 10)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30
Te mpo (dias )
Carbono Orgânico Dissolvido (mg.L-¹)
R1 irradiada
R2 irradiada
Média irradiadas
R1 não irradiada
R2 não irradiada
Média não irradiadas
26
Figura 10. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada.
O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio padrão é
representado pelas barras verticais, com n = 2.
Optou-se por analisar estatisticamente os valores de densidade bacteriana
buscando avaliar a eficiência da reprodução desta comunidade. Este evento de
multiplicação celular ocorre intensamente em momentos de abundância dos recursos
energéticos e boas condições ambientais, o que simula uma ocasião de bloom.
A Tabela 4 mostra os valores obtidos no teste t de Student comparando os dois
tratamentos (irradiado e não irradiado) da fração de MOD<3 kDa.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15 20 25 30
Densidade Bacteriana
(10
6
céls.ml-1)
Tempo (dias)
Irradiada
Não Irradiada
27
Tabela 4. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com a fração de MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada, ao longo
dos 27 dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
Densidade Bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
Teste t de Student
Tempo Irradiadas Não-Irradiadas
Dia Média DP Média DP P
0 0,705 0,083 0,469 0,036 0,0627
0,5 13,091 1,121 21,080 0,981 0,0169*
1 28,487 2,825 32,812 2,449 0,2467
2 36,725 1,081 25,538 0,735 0,0067 **
5 10,065 0,692 7,434 1,408 0,1410
8 7,266 0,770 7,166 0,605 0,8984
12 7,968 0,513 9,173 0,958 0,2569
15 8,624 0,334 7,152 0,472 0,0687
19 9,598 0,726 5,877 0,406 0,0243*
23 10,022 0,488 6,451 0,337 0,0136*
27 10,740 0,613 7,940 0,447 0,0346*
* significativo
** muito significativo
Os resultados demonstraram que das 11 amostragens, as diferenças foram
significativas em 4 momentos (12 horas, P = 0,0169; 19 dias, P = 0,0243; 23 dias, P =
0,0136; 27 dias, P = 0,0346) e em 1 foi muito significativa (48 horas, P = 0,0067)
(Tabela 4) .
Quanto aos morfotipos celulares, as culturas com a fração irradiada de MOD<3
kDa apresentaram freqüências médias de bacilos um pouco maiores que as com MOD
não irradiada nas primeiras 48 horas de incubação. Já na fase de estabilização (5° ao 27°
dia), as freqüências relativas dos morfotipos mantiveram-se praticamente constantes,
com predominância de bacilos, cocobacilos e cocos, respectivamente, para ambos os
tratamentos. Espirilos e filamentos possuem as menores freqüências relativas, porém é
necessário notar que as freqüências dos filamentos são mais altas nas culturas com a
fração irradiada (Tabela 5).
28
Tabela 5. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas enriquecidas com
a fração de MOD<3 kDa, irradiada (Ir.) e não irradiada (Ñ Ir.), ao longo dos 27 dias de
cultivo.
% MORFOTIPOS BACTERIANOS
Dias
Coco Cocobacilo Bacilo Víbrio Espirilo Filamento
Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir.
0
8,15 16,13 61,55 58,99 23,76 17,78 6,55 7,11 0 0 0 0
0,5
0,50 5,46 11,45 25,74 86,06 66,01 1,64 2,03 0 0 0,34 0,76
1
4,02 2,30 25,44 24,21 60,37 57,55 7,93 14,86 1,34 0 0,89 1,08
2
3,46 5,25 18,36 23,91 61,01 58,61 14,77 11,59 1,14 0 1,26 0,64
5
3,53 17,12 21,19 29,96 63,97 40,57 9,90 12,10 0,18 0,24 1,23 0
8
14,84 9,46 29,04 25,89 42,66 47,55 10,77 15,9 0 0,59 2,68 0,62
12
18,48 13,32 29,91 31,88 43,19 42,52 7,50 11,26 0 0,65 0,92 0,33
15
14,32 15,29 36,33 31,62 41,84 47,12 6,77 5,48 0,16 0 0,58 0,46
19
22,81 18,36 33,56 36,98 35,27 36,72 7,32 6,83 0,48 1,08 0,56 0
23
17,46 18,86 37,40 33,19 37,73 40,08 5,95 7,64 0,21 0 1,25 0,22
27
13,38 19,10 33,19 36,13 48,82 38,10 3,83 6,03 0 0,64 0,77 0
Para a fração de MOD de baixo peso molecular, foi constatado um rápido
aumento da biomassa bacteriana no início do período de incubação, porém as culturas
com MOD irradiada atingiram valores máximos com 48 horas de incubação (média =
1.793,45 μg C.mL
-1
, desvio-padrão (DP) = 141,57 μg C.mL
-1
) enquanto que as culturas
com MOD não irradiada atingiram valores máximos com 24 horas de incubação (média
= 1.674,92 μg C.mL
-1
, DP = 184,13 μg C.mL
-1
). Ocorreu um rápido declínio nos valores
de biomassa após o 2° e 1° dias, respectivamente, e do 5° ao 27° dia houve uma fase
estável, com um valor médio de 185,75 μg C.mL
-1
e DP de 85,91 μg C.mL
-1
para as
culturas com MOD irradiada e média de 143,16 μg C.mL
-1
e DP de 32,69 μg C.mL
-1
para aquelas com MOD não irradiada (Figura 11).
29
Figura 11. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
bacterianas enriquecidas com a fração MOD<3 kDa, irradiada e não irradiada. O valor
médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio padrão é representado
pelas barras verticais, com n = 2.
4.2.3 Consumo da MOD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas com 30>MOD>3 kDa irradiada e não irradiada
A figura 12 apresenta os resultados do consumo de COD para a fração de
30>MOD>3 kDa. A MOD irradiada foi consumida com maior eficiência pelas bactérias
até 12° dia. Após esse período, os valores de COD dos dois tratamentos tornam-se mais
similares.
0
500
1,000
1,500
2,000
2,500
0 5 10 15 20 25 30
Te m po (dias )
Biomassa (μg C.mL
-1
)
Irradiada
Não Irradiada
30
Figura 12. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
enriquecidas com a fração 30>MOD>3 kDa, irradiada e não irradiada. O valor médio
entre as réplicas é representado pelas linhas.
Quanto ao crescimento da comunidade bacteriana, os resultados (Figura 13)
demonstraram que as culturas com 30>MOD>3 kDa irradiada apresentaram valores
máximos de densidade bacteriana maiores que as culturas não irradiadas (40,41.10
6
céls.mL
-1
e 32,44. 10
6
céls.mL
-1
, respectivamente), e ambos no 2° dia de incubação.
Também foi observado um rápido declínio nos valores de densidade bacteriana entre o
2° e 5° dia, e do dia 5 em diante houve uma fase aparentemente estável, com valores
médios de 7,64.10
6
células.mL
-1
e DP 1,34.10
6
células.mL
-1
para as culturas com MOD
irradiada e 6,73.10
6
células.mL
-1
e DP 1,39.10
6
células.mL
-1
para aquelas com MOD
não irradiada.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30
Dias
Carbono Orgânico Dissolvido (mg.L-¹
)
R1 irradiada
R2 irradiada
Média irradiadas
R1 não irradiada
R2 não irradiada
Média não irradiadas
31
Figura 13. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração 30>MOD>3 kDa, irradiada e não
irradiada. O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio padrão é
representado pelas barras verticais, com n = 2.
Nas análises estatísticas envolvendo as culturas com fração de 30>MOD>3 kDa
irradiada e não irradiada (Tabela 6), os resultados demonstraram que apenas em 1
momento do cultivo os valores médios da densidade bacteriana encontrados para estes
tratamentos foram significativamente distintos (48 horas, P = 0,0442).
Tabela 6. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com a fração de 30>MOD>3 kDa, irradiada e não irradiada, ao
longo dos 27 dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
Densidade Bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
Teste t de Student
Tempo Irradiadas Não-Irradiadas
Dias Média DP Média DP P
0
0,327 0,078 0,391 0,062 0,4596
0,5
10,278 2,778 9,144 0,142 0,6225
1
23,985 3,991 24,533 8,012 0,9389
2
40,413 2,145 32,442 1,187 0,0442*
5
6,958 0,565 6,011 0,083 0,1437
8
7,694 0,151 6,188 1,277 0,2395
12
5,969 1,278 5,527 1,704 0,7968
15
6,768 2,020 7,287 1,827 0,8128
19
7,619 0,830 6,351 2,415 0,5553
23
8,640 2,679 8,139 0,936 0,8261
27
9,794 1,888 7,601 1,472 0,3245
* significativo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 5 10 15 20 25 30
Te mpo (dias )
Densidade Bacteriana
(10
6
céls.ml-1)
Irradiada
Não Irradiada
32
Ao que se refere à frequência morfotípica das células bacterianas nas culturas
com fração 30>MOD>3 kDa, a Tabela 7 apresenta valores muito próximos para as
diferentes culturas durante praticamente todo o período de incubação. Em 12 horas,
ocorreram as maiores freqüências relativas de bacilos. Para a fase de estabilização, foi
possível observar que as freqüências relativas dos morfotipos permaneceram constantes,
com predominância de bacilos e cocobacilos, respectivamente. Quanto aos vibrios, esta
fração de MOD favoreceu ligeiramente o crescimento deste morfotipo em relação às
demais frações de MOD, principalmente em 24 e 48 horas, tanto no pool irradiado com
no pool não irradiado.
Tabela 7. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas enriquecidas com
a fração de 30>MOD>3 kDa, irradiada (Ir.) e não irradiada (Ñ Ir.), ao longo dos 27
dias de cultivo.
% MORFOTIPOS BACTERIANOS
Dias
Coco Cocobacilo Bacilo Víbrio Espirilo Filamento
Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir.
0
14,00 13,84 30,60 41,87 35,37 30,2 16,70 14,09 2,50 0 0,83 0
0,5
3,61 4,23 25,87 23,35 66,31 66,05 2,66 5,84 0 0 1,55 0,53
1
4,26 3,43 19,71 22,13 50,51 52,87 24,85 20,93 0,21 0 0,46 0,64
2
7,36 4,76 25,38 24,70 45,04 49,91 21,71 19,20 0 0,54 0,51 0,90
5
7,76 6,63 20,60 20,90 58,17 58,43 11,32 12,06 0 0 2,15 1,99
8
11,96 8,92 21,49 23,29 48,61 53,18 14,04 12,48 0,61 0,44 3,28 1,70
12
14,95 10,55 28,38 23,58 43,69 50,06 11,03 14,62 0,34 0,4 1,62 0,80
15
11,47 12,18 26,56 21,82 49,30 44,72 9,84 10,09 0,32 0 2,50 1,19
19
11,29 16,24 30,87 36,26 50,55 36,90 6,33 10,31 0,34 0,29 0,62 0
23
14,38 13,60 31,26 41,25 44,56 37,34 8,95 6,78 0 0,25 0,85 0,77
27
14,29 15,32 27,86 34,23 48,31 43,39 9,27 4,69 0 0,29 0,27 2,08
Para ambos os tratamentos desta fração, verificou-se um rápido aumento da
biomassa bacteriana no início do período de incubação (Figura 14). Além disso, as
diferentes culturas atingiram valores máximos com 24 horas de incubação (irradiadas
média = 937,80 μg C.mL
-1
, DP = 150,98 μg C.mL
-1
, não irradiadas média = 833,11 μg
C.mL
-1
, DP = 100,86 μg C.mL
-1
). Após o 1° dia de incubação, houve um rápido declínio
nos valores de biomassa e uma fase de aparente estabilidade do 5° em diante pôde ser
observada, com um valor médio de 177,33 μg C.mL
-1
e DP de 18,43 μg C.mL
-1
para as
33
culturas com MOD irradiada e, para aquelas com MOD não irradiada, valor médio de
140,62 μg C.mL
-1
e DP de 18,42 μg C.mL
-1
.
Figura 14. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
bacterianas enriquecidas com a fração 30>MOD>3 kDa, irradiada e não irradiada. O
valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio padrão é
representado pelas barras verticais, com n = 2.
4.2.4 Consumo da MOD, densidade bacteriana, freqüência dos morfotipos e
biomassa bacteriana nas culturas com MOD>30 kDa irradiada e não irradiada
Para a fração de MOD>30 kDa, o consumo de COD foi um pouco mais intenso
nos primeiros 12 dias nas culturas com MOD irradiada. É importante notar que no 15°
dia a fração não irradiada mostra uma súbita redução de aproximadamente 22,40% nas
concentrações de COD e permanece praticamente constante até o final da incubação. Já
a fração irradiada apresentou um pequeno acréscimo em sua concentração de COD, caiu
cerca de 19,60% no 19° dia e, posteriormente, permaneceu constante (Figura 15).
0
200
400
600
800
1,000
1,200
0 5 10 15 20 25 30
Te mpo ( dias )
Biomassa (μg C.mL
-1
)
Irradiada
Não Irradiada
34
Figura 15. Concentração de COD (mg.L
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
enriquecidas com a fração MOD>30 kDa, irradiada e não irradiada. O valor médio entre
as réplicas é representado pelas linhas.
A Figura 16 revela que ocorreu uma considerável diferença no crescimento
bacteriano inicial entre as culturas com MOD>30 kDa irradiada e não irradiada. A
média das densidades máximas observadas nas culturas com MOD irradiada foi 45%
maior que a média das densidades obtidas para as culturas com MOD não irradiada
(38,60.10
6
e 26,58.10
6
células.mL
-1
, respectivamente). Os resultados também apontaram
um rápido declínio nos valores de densidade bacteriana após o 2° dia, em ambos os
tratamentos. Nas culturas com MOD não irradiada, houve uma fase de estabilidade
aparente do 5° ao 27° dia de incubação (média = 7,34.10
6
células.mL
-1
, DP = 0,42.10
6
células.mL
-1
). E nas culturas com MOD irradiada ocorreu uma quebra na estabilidade da
densidade bacteriana aos 15° dias de incubação (17,27. 10
6
células.mL
-1
).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30
Dias
CarbonoOrgânico Dissolvido (mg.L-¹
)
R1 irradiada
R2 irradiada
Média irradiadas
R1 não irradiada
R2 não irradiada
Média não irradiadas
35
Figura 16. Densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as
culturas bacterianas enriquecidas com a fração MOD>30 kDa, irradiada e não irradiada.
O valor médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio padrão é
representado pelas barras verticais, com n = 2.
Foi constatado que as médias das densidades bacterianas de 4 momentos de
amostragem foram significativamente diferentes (48 horas, P = 0,0213; 5 dias, P =
0,0241; 12 dias, P = 0,0415; 27 dias, P = 0,0363) e em 1 foi muito significativo (15 dias,
P = 0,0065) (Tabela 8).
Tabela 8. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com a fração de MOD>30 kDa, irradiada e não irradiada, ao longo
dos 27 dias de cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
Densidade Bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
Teste t de Student
Tempo Irradiadas Não-Irradiadas
Dia Média DP Média DP P
0
0,341 0,036 0,328 0,047 0,7855
0,5
8,660 0,829 9,331 0,433 0,4171
1
24,790 2,791 23,412 1,591 0,6058
2
38,596 2,179 26,581 1,262 0,0213*
5
10,824 0,783 6,791 0,447 0,0241*
8
7,164 0,516 6,783 0,692 0,5962
12
11,084 1,043 7,360 0,372 0,0415*
15
17,267 1,042 8,046 0,174 0,0065**
19
8,868 0,652 8,419 0,536 0,5304
23
7,574 0,610 7,267 0,457 0,6264
27
4,978 0,401 6,727 0,272 0,0363*
* significativo
** muito significativo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 5 10 15 20 25 30
Te mpo (dias )
Densidade Bacteriana
(10
6
céls.ml-1)
Irradiada
Não Irradiada
36
A Figura 17 exibe fotomicrografias da comunidade bacteriana nos dois
momentos em que ocorrem os picos (maiores valores – 48 horas e 15 dias) de densidade
e biomassa bacterianas nas culturas com MOD>30 kDa irradiada. É evidente a diferença
na quantidade dos morfotipos bacterianos.
Figura 17. Fotomicrografias da comunidade bacteriana nos momentos de maiores
valores de densidade e biomassa bacterianas nas culturas com MOD>30 kDa irradiada.
A corresponde a 48 horas e B corresponde a 15 dias de incubação.
A
B
37
A Tabela 9 apresenta as frequências relativas de cada morfotipo para as culturas
com a fração de MOD>30 kDa. Nas primeiras 48 horas, a MOD irradiada favoreceu o
crescimento de bacilos, seguidos de cocobacilos e víbrios. No que se refere à fase de
estabilização, as freqüências relativas dos morfotipos também se mantiveram
praticamente constantes, com predominância de bacilos e cocobacilos, para ambos os
tratamentos. A maior freqüência encontrada para filamentos foi observada nas culturas
com fração de MOD>30 kDa não-irradiada (média de 6,69%).
Tabela 9. Freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas culturas enriquecidas com
a fração de MOD>30 kDa, irradiada (Ir.) e não irradiada (Ñ Ir.), ao longo dos 27 dias
de cultivo.
% MORFOTIPOS BACTERIANOS
Dias
Coco Cocobacilo Bacilo Víbrio Espirilo Filamento
Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir. Ir. Ñ Ir.
0
13,53 20,78 54,02 32,44 24,47 33,74 7,23 11,49 0 0 0,76 1,56
0,5
0,78 4,66 29,29 17,47 58,78 68,28 8,72 9,03 0 0 0,81 0,56
1
4,44 3,07 29,53 19,86 54,55 56,06 10,00 18,61 0 1,03 1,48 1,37
2
2,62 4,59 20,24 27,17 59,37 48,09 17,05 17,59 0,37 1,52 0,35 1,04
5
7,62 5,58 22,44 27,38 58,71 54,10 8,89 11,05 0,69 0 1,64 1,88
8
10,76 7,49 26,88 28,73 53,76 52,40 8,06 10,12 0,54 0 0 1,26
12
13,01 15,83 31,59 34,21 44,83 43,48 10,28 4,91 0 0,52 0,29 1,04
15
8,95 13,04 37,77 34,22 42,65 43,75 9,67 7,01 0,60 0 0,35 1,98
19
11,89 13,93 41,37 26,08 39,36 51,68 6,19 5,72 0,39 0 0,80 2,59
23
12,65 14,01 41,27 36,27 38,56 37,57 4,18 4,98 0,37 0,48 2,98 6,69
27
10,88 9,72 31,89 31,65 48,65 51,71 5,49 3,94 1,19 0 1,91 2,98
A Figura 18 revela que em ambos os tratamentos, as culturas com a fração de
MOD>30 kDa proporcionaram um acelerado aumento da biomassa bacteriana no início
do período de incubação. Ainda, nas culturas com MOD irradiada foram encontrados
valores máximos em 48 horas de incubação (média = 1.138,96 μg C.mL
-1
, DP = 174,61
μg C.mL
-1
) e nas culturas com MOD não irradiada valores máximos foram obtidos em
24 horas de incubação (média = 832,90 μg C.mL
-1
, DP = 83,16 μg C.mL
-1
). Da mesma
maneira como ocorreu nas demais frações, um rápido declínio nos valores de biomassa
foram observados após o 2° e 1° dia, respectivamente. Além disso, do 5° ao 27° dia
verificou-se uma fase de aparente estabilidade, com valores médios de 195,32 μg
38
C.mL
-1
e 204,72 μg C.mL
-1
, e DP 18,34 μg C.mL
-1
e 16,90 μg C.mL
-1
, para as culturas
com MOD irradiada e não irradiada, respectivamente.
Figura 18. Biomassa bacteriana (μg C.mL
-1
) em função do tempo (dias) para as culturas
bacterianas enriquecidas com a fração MOD>30 kDa, irradiada e não irradiada. O valor
médio entre as réplicas é representado pelas linhas. O desvio padrão é representado
pelas barras verticais, com n = 2.
A Figura 19 apresenta fotomicrografias da comunidade bacteriana de cada uma
das culturas bacterianas em seus respectivos momentos de máxima densidade celular. A
composição morfotípica e o tamanho médio das bactérias se mostraram bastante
semelhantes.
0
200
400
600
800
1,000
1,200
1,400
0 5 10 15 20 25 30
Te mpo (dias )
Biomassa (μg C.mL
-1
)
Irradiada
Não Irradiada
39
Figura 19. Fotomicrografias da comunidade bacteriana nos momentos de máxima
densidade celular. A representa o controle, B e C representam as culturas com MOD<3
kDa, D e E correspondem à 30>MOD>3 kDa, F e G representam as culturas com
MOD>30 kDa, irradiadas e não irradiadas, respectivamente, para todas as frações.
A
B C
D E
F
G
40
4.2.5 Análise de Variância (ANOVA) e Teste de Tukey-Kramer – Comparação
entre culturas com diferentes frações de MOD
Foram comparadas as médias das densidades bacterianas entre as culturas com
diferentes frações irradiadas e as médias daquelas com diferentes frações não irradiadas.
Para tanto, foi aplicada a análise de variância (ANOVA). Caso o valor de P confirmasse
significância entre as três frações de MOD (P<0,005), o teste de Tukey-Kramer seria
aplicado para verificar entre quais pares de tratamentos a diferença se confirmava.
As análises de variância envolvendo as culturas com as frações irradiadas
(Tabela 10) revelaram que houve diferenças em 4 dos 11 momentos de amostragem
para os valores médios de densidade bacteriana. Aqui, 3 diferenças entre as frações
irradiadas mostraram–se significativas e em 1 momento as diferenças foram muito
significativas. O valor de P observado para as densidades no tempo 0 é devido a erros
de metodologia, já que os inóculos são iguais quanto à origem e volume, para todas as
culturas.
Tabela 10. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com as frações irradiadas de MOD, ao longo dos 27 dias de
cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
Densidade Bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
ANOVA
Tempo MO<3 kDa 30>MO>3 kDa MO>30 kDa
Dia Média DP Média DP Média DP P
0
0,705 0,083 0,327 0,078 0,341 0,036 0,0193*
0,5
13,091 1,121 10,278 2,778 8,660 0,829 0,1849
1
28,487 2,825 23,985 3,991 24,790 2,791 0,4405
2
36,725 1,081 40,413 2,145 38,596 2,179 0,2879
5
10,065 0,692 6,958 0,565 10,824 0,783 0,0216*
8
7,266 0,770 7,694 0,151 7,164 0,516 0,6314
12
7,968 0,513 5,969 1,278 11,084 1,043 0,0321*
15
8,624 0,334 6,768 2,020 17,267 1,042 0,0081**
19
9,598 0,726 7,619 0,830 8,868 0,652 0,1567
23
10,022 0,488 8,640 2,679 7,574 0,610 0,4233
27
10,740 0,613 9,794 1,888 4,978 0,401 0,0302*
* significativo
** muito significativo
41
O teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer mostrou que em 5 dias, as
densidades bacterianas diferiram significativamente entre as culturas com fração de
MOD<3 kDa e 30>MOD>3 kDa (q = 6,407 e P<0,05) e entre as culturas com fração
30>MOD>3 kDa e MOD>30 kDa (q = 7,972 e P<0,05). Para o tempo 12 dias, as
médias das densidades foram significativamente diferentes apenas entre as culturas com
MOD>30 kDa e 30>MOD>3 kDa. Aos 15 dias, foi verificada diferença significativa
entre as culturas com MOD<3 kDa e MOD>30 kDa (q = 9,215 e P<0,05) e muito
significativa entre as culturas com MOD>30 kDa e 30>MOD>3 kDa (q = 11,194 e
P<0,01). Por fim, aos 27 dias, verificou-se que os valores médios das densidades
diferiram significativamente entre as culturas com MOD<3 kDa e MOD>30 kDa (q =
6,969 e P<0,05).
Por sua vez, as análises de variância envolvendo as culturas com as frações não
irradiadas (Tabela 11) revelaram que em 1 dos 11 momentos de amostragem os valores
médios da densidade bacteriana se mostraram significativamente diferentes e também
em 1 momento as diferenças foram extremamente significativas.
Tabela 11. Média e desvio-padrão (DP) da densidade bacteriana (10
6
céls.mL
-1
) nas
culturas enriquecidas com as frações não irradiadas de MOD, ao longo dos 27 dias de
cultivo e respectivos valores de P, com n = 2.
Densidade Bacteriana (10
6
céls.mL
-1
)
ANOVA
Tempo MO<3 kDa 30>MO>3 kDa MO>30 kDa
Dia Média DP Média DP Média DP P
0
0,469 0,036 0,391 0,062 0,328 0,047 0,1396
0,5
21,080 0,981 9,144 0,142 9,331 0,433 0,0005***
1
32,812 2,449 24,533 8,012 23,412 1,591 0,2608
2
25,538 0,735 32,442 1,187 26,581 1,262 0,0147*
5
7,434 1,408 6,011 0,083 6,791 0,447 0,3736
8
7,166 0,605 6,188 1,277 6,783 0,692 0,6086
12
9,173 0,958 5,527 1,704 7,360 0,372 0,1100
15
7,152 0,472 7,287 1,827 8,046 0,174 0,7081
19
5,877 0,406 6,351 2,415 8,419 0,536 0,3144
23
6,451 0,337 8,139 0,936 7,267 0,457 0,1610
27
7,940 0,447 7,601 1,472 6,727 0,272 0,4753
* significativo
*** extremamente significativo
42
Em 12 horas, as diferenças se confirmaram extremas entre as culturas com
MOD<3 kDa e 30>MOD>3 kDa (q = 27,030 e P<0,001) e MOD<3 kDa e MOD>30
kDa (q = 26,606 e P<0,001). Já em 48 horas, as análises comparativas revelaram
diferenças significativas entre MOD<3 kDa e 30>MOD>3 kDa (q = 7,628 e P<0,05)
bem como entre as culturas com 30>MOD>3 kDa e MOD>30 kDa (q = 8,986 e
P<0,05).
43
5. DISCUSSÃO
5.1. Justificativa para obtenção da MOD da fase estacionária
As frações de MOD foram obtidas quando as culturas atingiram a fase
estacionária, caracterizada pela estabilidade ou decréscimo na concentração do número
de células, em concomitância com o decréscimo da concentração de clorofila a. Nessa
fase, é grande a possibilidade de ocorrência de morte celular de parte das células de M.
aeruginosa as quais, ao se desintegrarem, liberam MOD para o ambiente. Por outro
lado, as células que permanecem vivas, mas sem entrar em citocinese, aumentam a
liberação de MOD para o meio, por excreção. A opção por esta fase do ciclo biológico
justifica-se na maior fidelidade do experimento com o que ocorre naturalmente em
blooms de M. aeruginosa expostos a altas intensidades de luz na superfície dos
reservatórios, onde predomina. Sendo assim, o experimento de biodisponibilidade de
carbono orgânico dissolvido das frações de MOD irradiada e não irradiada buscou
descrever a atividade metabólica dos microrganismos heterotróficos da comunidade do
reservatório de Barra Bonita envolvidos no processo de degradação a partir da MOD
produzida por M. aeruginosa em blooms.
5.2 Biodisponibilidade da MOD à comunidade bacteriana
Todas as três frações de MOD investigadas no presente estudo apresentaram-se
altamente biodisponíveis à comunidade bacteriana, fato revelado na rápida degradação
inicial do COD (48 horas) bem como nos incrementos iniciais da densidade e da
biomassa bacteriana. As culturas com fração de MOD<3 kDa e MOD>30 kDa
revelaram-se mais vulneráveis à radiação UV, confirmando-se nas numerosas diferenças
encontradas para os valores de densidade bacteriana ao longo do período de incubação
(Teste t de Student – Tabela 4 e 7), principalmente no início da degradação da MOD<3
kDa irradiada (12 e 48 horas) e em 48 horas para a MOD>30 kDa.
44
Os valores iniciais de COD mostraram-se diferentes em cada uma das frações,
visto que foram mantidas as concentrações originais de COD que cada uma das
diferentes frações de MOD que representava no momento anterior ao fracionamento. A
maior parte da MOD liberada pela M. aeruginosa concentrou-se abaixo de 3 kDa.
Resultados similares foram encontrados por Aoki et al. (2008), em experimentos
realizados com cepas de M. aeruginosa obtidas em um reservatório eutrofizado no
Japão.
Aliando-se a concentração inicial de COD aos valores máximos de densidade e
biomassa bacterianas, é possível inferir que a energia disponível para o crescimento
bacteriano liberada na degradação dos compostos das frações analisadas aumenta na
seguinte ordem 30>MOD>3 kDa, MOD>30 kDa e MOD<3 kDa. Estes resultados
podem ser legitimados pela teoria proposta por Amon & Benner (1994), o modelo do
contínuo tamanho-reatividade o qual descreve que moléculas de alta massa molecular
são mais intensamente degradadas que as moléculas de baixa massa molecular devido à
maior biorreatividade. Esta situação pode ser justificada pela presença de numerosos
sítios reativos em moléculas maiores, estes reduzidos em moléculas pequenas.
É importante salientar que o volume de água do reservatório utilizado para
preparação dos controles representa o dobro daquele utilizado na composição das
culturas enriquecidas com uma das frações da MOD liberada pela M. aeruginosa. Como
a concentração média de COD inicial nos controles é de 4,74 mgC.L
-1
, às culturas
enriquecidas foi adicionado 2,37 mgC.L
-1
de COD correspondente ao volume de água
do reservatório. Assim, a interferência do COD advindo da água do reservatório de
Barra Bonita corresponde a uma parcela relativamente pequena dos valores iniciais de
COD observados para as culturas bacterianas enriquecidas (13,25 e 14,79% para as
culturas com MOD<3 kDa, 29,96 e 31,06% para as culturas com 30>MOD>3 kDa; 27,6
45
e 27,33% para as culturas com MOD>30 kDa, irradiadas e não irradiadas
respectivamente).
Os resultados obtidos na presente investigação confirmaram a expectativa de que
as densidades bacterianas atingiriam valores máximos nos primeiros momentos (horas
ou dias) de incubação. Chróst et al. (1989) encontrou resultados similares em estudos
envolvendo a produção de matéria orgânica fitoplanctônica e sua simultânea
decomposição bacteriana em um lago naturalmente eutrófico, durante um bloom de
algas no início da primavera. Estes autores também observaram que quando o bloom
começou a declinar, a biomassa bacteriana aumentou rapidamente e, no final da
floração, as bactérias contribuíram de 48 a 70% na biomassa total do plâncton (até
200μm). Um padrão semelhante de degradação foi observado neste trabalho, o qual se
delineia por uma fase inicial de rápida degradação (intenso crescimento bacteriano),
seguida de uma fase de aparente estabilidade (densidades bacterianas constantes).
Apesar de ter sido verificado um mesmo padrão de degradação do COD para as
culturas com fração de MOD<3 kDa irradiada e não irradiada – uma fase rápida de
degradação nos primeiros momentos da incubação (de 24 a 48 horas) e uma fase
posterior lenta e relativamente estável – observa-se uma diferença temporal vista tanto
para densidade como para biomassa bacterianas máximas nas culturas com MOD<3
kDa irradiada (48 horas) e não irradiada (24 horas) a qual reflete a maior eficiência na
assimilação do COD presente na fração não irradiada. Tal acontecimento pode ser
justificado pelo fato de que, ao sofrer influência da radiação UV, a MOD de baixa
massa molecular e diageneticamente jovem, p.e. exudatos algais, pode passar por
reações de condensação e humificação, em que radicais livres de ácidos graxos da MOD
reagem entre si formando polímeros menos propensos à pronta degradação bacteriana,
que podem ser tanto substâncias lábeis como húmicas (Harvey et al., 1983). Além disso,
46
é provável que tenha ocorrido o fenômeno da fotooxidação no qual a radiação UV
degrada os compostos orgânicos a subprodutos inorgânicos como dióxido de carbono,
peróxido de hidrogênio, monóxido de carbono, entre outros. Este evento foi verificado
por Bertilsson & Tranvik (2000) em experimentos com amostras de MOD provenientes
de 32 lagos temperados na Suíça, expostas a radiação UV-A+B durante um período de
12 horas, o mesmo tempo utilizado no presente estudo.
É possível notar também que nas primeiras 48 horas de incubação o consumo
bacteriano da fração de MOD<3 kDa não irradiada foi mais intenso que o consumo da
mesma fração irradiada, o que confere um crescimento inicial máximo mais acelerado
(densidade bacteriana – Tabela 4). Estes resultados condizem com aqueles observados
por Tranvik & Kokalj (1998), Tranvik & Bertilsson (2001) e Obernosterer et al. (2001)
em experimentos de degradação do COD de diferentes fontes, incluindo lagos
temperados e oceanos. Segundo estes autores, após sofrer ação da radiação UV, a MOD
produzida pelo fitoplâncton é menos eficientemente consumida pelo bacterioplâncton.
Este fato é justificado pela ausência de estruturas que absorvam a radiação UV na MOD
produzida pelas algas (p.e. anéis aromáticos). Essas estruturas são amplamente
encontradas em moléculas de ácidos fúlvicos e húmicos característicos da maior parte
da MOD refratária (McKnight & Aiken, 1998). Além disso, sabe-se que estes ácidos
tornam-se mais biodisponíveis às bactérias após serem expostos à luz UV (Bertilsson &
Tranvik, 1998; Anesio et al., 2005).
Por outro lado, valores máximos de densidade e biomassa bacteriana para as
culturas com MOD<3 kDa irradiada mostraram que o pool de MOD fitoplanctônica de
baixa massa molecular tem sua biodisponibilidade aumentada quando submetido à ação
da radiação UV, apesar do consumo ser ligeiramente retardado. Este padrão de
utilização da MOD também foi relatado em pesquisa de Rosenstock et al. (2005) em
47
que substâncias não-húmicas de baixo peso molecular de diferentes regiões oceânicas
sustentaram um maior crescimento bacteriano e, assim, tiveram sua biodisponibilidade
aumentada após serem submetidas à radiação UV.
O consumo bacteriano ao final do período de incubação mostrou-se bastante
distinto entre as culturas com MOD<3 kDa irradiada e não irradiada. Tal fato também
pode ser associado à degradação de compostos refratários presentes nas culturas
bacterianas irradiadas e que não foram consumidos nos primeiros momentos da
incubação. Assim, a ação da radiação UV facilitou a degradação destes compostos
recalcitrantes presentes na MOD<3 kDa irradiada, também confirmado por um aumento
na densidade bacteriana nestas culturas (Moran & Zepp, 1997).
Para as culturas com a fração 30>MOD>3 kDa, as diferenças observadas para as
degradações em ambos os tratamentos permitem concluir que os compostos
constituintes desta fração da MOD sofrem ligeiras alterações quando sob influência da
radiação UV o que confere um aumento da biodisponibilidade à fração irradiada. É
possível inferir que tais compostos sofrem moderada ação da luz ultravioleta (McKnight
& Aiken, 1998) o que revela apenas um único momento de diferença significativa entre
os valores máximos de densidade bacteriana (48 horas - Tabela 5). Em experimentos
envolvendo ambientes de água salgada, Obernosterer et al. (2001) relata que, após
sofrer ação da radiação UV, a MOD<20 kDa proveniente do oceano apresentou um
sensível incremento em sua disponibilidade ao bacterioplâncton, fato que corrobora os
resultados aqui apresentados.
Já o consumo nas culturas bacterianas cujo recurso energético compreendeu a
fração de MOD>30 kDa revelou que a parte irradiada foi mais intensamente degradada
nos primeiros 12 dias. Este comportamento da fração de MOD>30 kDa foi observado
para substâncias orgânicas de alta massa molecular as quais são parcialmente oxidadas,
48
dando origem a uma ampla variedade de compostos de menor peso molecular, dentre os
quais se encontram substratos mais acessíveis ao bacterioplâncton (Kieber et al., 1989;
Moran & Zepp, 1997). Também foram encontradas as maiores diferenças entre as
densidades bacterianas máximas das culturas com MOD irradiada e com MOD não
irradiada para esta fração (38,60.10
6
e 26,58.10
6
células.mL
-1
, respectivamente) o que
confirma mais uma vez o aumento na biodisponibilidade desta fração após tratamento
com radiação UV.
5.3 Frequência relativa dos morfotipos celulares bacterianos e sucessão
bacteriana
A pequena variação inicial na freqüência relativa dos morfotipos bacterianos nas
culturas controle pode ser justificada pela limitação do carbono orgânico. Já o
crescimento bacteriano pode ser creditado à estabilidade das condições de cultivo e pelo
enriquecimento com nutrientes inorgânicos do meio ASM-1 adicionado. Após o
esgotamento das fontes de nutrientes na cultura controle, sucedeu um período de
estabilidade no crescimento bem como na frequência relativa dos morfotipos
bacterianos.
É evidente a predominância do morfotipo cocobacilo seguido de bacilo, ambos
característicos do tempo inicial (0 hora) em todos os tratamentos. Isto indica que no
reservatório de Barra Bonita a comunidade bacteriana típica da estação seca (inverno) é
caracterizada pela preponderância deste tipo celular bacteriano. Em experimentos com
amostras ambientais do mesmo reservatório, Racy (2004) também observou o mesmo
padrão de distribuição da freqüência dos morfotipos bacterianos para o mês de junho de
2003.
Quanto à distribuição morfotípica das bactérias associadas às frações de MOD
produzidas por M. aeruginosa, não houve diferenças significativas entre as frações,
49
tampouco entre os tratamentos, irradiado e não irradiado. Em todas as culturas
observou-se a predominância de bacilos, seguidos de cocobacilos e vibrios na fase
inicial da degradação (24 e 48 horas de incubação – Figura 19) o que indica uma
tendência à seleção preferencial destes morfotipos bacterianos (Pernthaler et al., 1998,
Worm et al., 2001). Tal fato indica que estes tipos bacterianos podem ser especialistas
na degradação das moléculas lábeis da MOD de M. aeruginosa. Em estudo realizado no
mesmo reservatório, Racy (2004) também observou predomínio dos cocobacilos e
bacilos em amostras coletadas durante um bloom de M. aeruginosa.
No que se refere à fase de estabilidade da comunidade bacteriana, a aparente
homogeneidade entre as proporções dos morfotipos bem como a estabilidade da
densidade bacteriana nas culturas com distintas frações (irradiadas e não irradiadas)
condiz com a proposição de uma fase de lenta degradação dos compostos mais difíceis
de serem mineralizados (substâncias refratárias) em todas as culturas.
Aos 15 dias de incubação, as culturas com fração de MOD>30 kDa irradiada
apresentaram um comportamento atípico às demais culturas. Nesse momento a
comunidade bacteriana apresentou um segundo pico na densidade de células bacterianas
(Figura 16), bem como diferenças perante as porcentagens de morfotipos bacterianos na
comunidade (Tabela 9). Esse fato pode ser interpretado como um evento de sucessão na
comunidade bacteriana ocasionado pela degradação inicial dos compostos mais lábeis e
posterior seleção de outras bactérias metabolicamente capazes de degradar alguns
compostos mais recalcitrantes (Riemann et al., 2000).
Estas mudanças na abundancia relativa dos morfotipos bacterianos ao longo do
período de incubação (Figura 17) sugerem um evento de sucessão durante as distintas
fases de degradação da MOD (Pernthaler et al., 1998). Tais bactérias possivelmente
apresentam capacidades metabólicas particulares que as tornam especialistas na
50
degradação de diferentes compostos orgânicos (Martinez et al., 1996; Riemann et al.,
2000) e, assim, promovem significativas transformações biogeoquímicas na MOD
advinda dos blooms algais.
5.4 Diferenças entre as frações de MOD
Considerando a heterogeneidade da MOD quanto à massa molecular, e
consequente degradação bacteriana (Amon & Benner, 1996), bem como os valores
máximos de densidade bacteriana, a assimilação do carbono orgânico foi mais eficiente
após a irradiação das frações devido às alterações ocorridas na MOD pela ação da
radiação UV (Lindell et al., 1995; Rosenstock et al., 2005). É necessário salientar que,
apesar das culturas com fração de MOD<3 kDa (tanto irradiada como não irradiada)
terem apresentado as maiores concentrações iniciais de COD, os maiores valores de
densidade bacteriana alcançados foram bastante parecidos entre as culturas com MOD
irradiada e não irradiada.
Caso sejam consideradas as concentrações iniciais de COD, as maiores
eficiências de conversão de MOD em biomassa bacteriana foram observadas para as
culturas com MOD>30 kDa e para aquelas com 30>MOD>3 kDa, ambas irradiadas.
Estes resultados podem ser corroborados pelo modelo do contínuo tamanho-reatividade
(Amon & Benner, 1994, 1996), o qual sugere que as moléculas de alta massa molecular
são mais biorreativas que as moléculas de baixa massa molecular.
Além disso, as diferenças nos valores de densidade e biomassa bacterianas
podem ser justificadas pelas diferenças estabelecidas nas condições de crescimento
entre as frações de MOD adicionados como substrato às culturas (Pernthaler et al.,
1998, Worm et al., 2001), bem como da influência da radiação UV sobre o pool de
MOD (Harvey et al., 1983; Naganuma et al., 1996; Gobler et al., 1997)
51
6. CONCLUSÃO
De um modo geral, a radiação UV-A+B aumentou a biodisponibilidade dos
compostos de alta, média e baixa massa molecular presentes na MOD excretada por
células na fase estacionária do crescimento de M. aeruginosa, porém o processo de
degradação pode se tornar um pouco retardado (horas ou dias). Este resultado leva a
crer que a radiação incidente na superfície do reservatório de Barra Bonita aumenta a
biodisponibilidade da MOD autóctone liberada por blooms de M. aeruginosa e, com
isso, facilita a ocorrência do microbial loop (Azam et al., 1983) no reservatório em
questão.
A dinâmica global do consumo de MOD relatada no presente estudo indica que a
maior parte da MO produzida pela M. aeruginosa durante um bloom é rapidamente
degradada pela comunidade bacteriana nas primeiras 48 horas de incubação. Esta
constatação constitui um claro indicativo de que a maior parte do carbono orgânico
dissolvido liberado no reservatório de Barra Bonita em conseqüência de um bloom desta
cianobactéria é mineralizado relativamente rápido, em um período de tempo bem
inferior ao menor tempo de residência das águas no reservatório (em média 37 dias no
verão e 137 dias no inverno). Tal fato indica que a MOD de M. aeruginosa é produzida
e consumida pelo bacterioplâcton no local, teoricamente sem exportação. Quando
incorporada na forma de biomassa bacteriana, a MOD estará disponível ao consumo
(predação das bactérias) por organismos de níveis tróficos superiores (nanoflagelados
heterotróficos e zooplâncton).
O fato das frequências relativas dos morfotipos bacterianos presentes nos
controles serem semelhantes àquelas ocorridas nas três frações de MOD estudadas seria
um indicativo de ratificação da tese inicial a qual propôs que haveria ocorrência de
constantes e especializados consórcios bacterianos capazes de mineralizar prontamente
52
a MOD liberada pela cianobactéria. Assim, os constantes blooms, ou a sempre alta
biomassa de M. aeruginosa no reservatório de Barra Bonita ao longo do ano, fazem com
que tais consórcios bacterianos especializados na mineralização da MOD liberada pela
cianobactéria estejam sempre disponíveis.
53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AOKI, S., OHARA, S., KIMURA, K., MIZUGUCHI, H., FUSE, Y. & YAMADA, E. 2008.
Characterization of Dissolved Organic Matter Released from Microcystis
aeruginosa. Analytical Sciences. 24:389-394
AMON, RMW. & BENNER, R. 1994. Rapid cycling of high-molecular-weight dissolved
organic matter in the ocean. Nature. 369:549-552
AMON, RMW. & BENNER, R. 1996. Bacterial utilization of different size classes of
dissolved organic matter. Limnology and Oceanography. 41:41–51
A
MADO, AM., FARJALLA, VF., ESTEVES, FA., BOZELLI, RL., ROLAND, F. & ENRICH-
P
RAST, A. 2006. Complementary pathways of dissolved organic carbon removal
pathways in clear-waterAmazonian ecosystems: photochemical degradationand
bacterial uptake. FEMS Microbiology Ecology. 56:8–17
ANESIO, AM., GRANÉLI, W., AIKEN, GR., KIEBER, DJ. & MOPPEr, K. 2005. Effect of
humic substance photodegradation on bacterial growth and respiration in lake
water. Applied and Environmental Microbiology. 71:6267-6275
ARNOSTI, C., REPETA, DJ. & BLOUGH, NV. 1994. Rapid bacterial degradation of
polysaccharides in anoxic marine systems. Geochimica et Cosmochimica Acta
58:2639–2652
AZAM, F. & CHO, BC. 1987. Bacterial utilization of organic matter in the sea. In:
FLETCHER, M., GRAY TRG. e JONES, JG. (Eds). Ecology of Microbial Communities.
Cambridge University Press. pp. 261-281.
AZAM, F., FENCHEL, T., FIELD, JG., GRAY, JS., MEYER-REIL, LA. & THINGSTAD, F.
1983. The ecological role of water column microbes in the sea. Marine Ecology
Progress Series. 10:257-263
BAGATINI, IL. 2008. Associação de Bactérias à Cápsula de Anabaena spiroides
(Cyanobacteria) em cultura. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de
São Carlos, São Carlos-SP, 70 p.
B
AINES, SB. & PACE, ML. 1991. The production of dissolved organic matter by
phytoplankton and its importance to bacteria: patterns across marine and freshwater
systems. Limnology and Oceanography. 36: 1078–90
B
ENNER, R., PAKULSKI, JD., MCCARTHY, M., HEDGES, JI. & HATCHER, PG. 1992. Bulk
chemical characteristics of dissolved organic matter in the ocean. Science. 255:
1561-1564
BENNER, R. & BIDDANDA, B. 1998. Photochemical transformation of surface and deep
marine dissolved organic matter: Effects on bacterial growth. Limnology and
Oceanography. 43:1373-1378
54
BERTILSSON, S. & TRANVIK, LJ. 1998. Photochemically produced carboxylic acids as
substrates for freshwater bacterioplankton. Limnology and Oceanography. 43(5):
885–895
BERTILSSON, S. & TRANVIK, LJ. 2000. Photochemical transformation of dissolved
organic matter in lakes. Limnology and Oceanography. 45:753-762
BIDDANDA, B. & BENNER, R. 1997. Carbon, nitrogen, and carbohydrate fluxes during
the production of particulate and dissolved organic matter by marine phytoplankton.
Limnology and Oceanography. 42: 306-318
BITTAR, TB. (em preparação). Efeito da radiação solar sobre a biodisponibilidade da
matéria orgânica dissolvida produzida por Microcystis aeruginosa. Tese de
Doutorado. Universidade Federal de São Carlos, São Carlos-SP.
BITTAR, TB. 2005. Produção de TEP (Transparent Exopolymer Particles) em culturas
de três espécies de microalgas isoladas do reservatório de Barra Bonita (Rio
Tietê/SP). Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos - SP, 87 p.
CALIJURI, MC. & DOS SANTOS, ACA. 2001. Temporal variations in phytoplankton
primary production in a tropical reservoir (Barra Bonita, SP – Brasil).
Hidrobiologia, 445:11-26
CALIJURI, MC. & TUNDISI, JG. 1990. Limnologia comparada das represas do Lobo
(Broa) e Barra Bonita- Estado de São Paulo: mecanismos de funcionamento e bases
para o gerenciamento. Ver. Brasileira de Biologia, 50: 893-913
CARLSON, CA., DUCKLOW, HW. & MICHAELS, AF. 1994. Annual flux of dissolved
organic carbon from the euphotic zone in the northwestern Sargasso Sea. Nature.
371:405-408
C
HOI, K., UEKI, M., IMAI, A., KIM, B. & KAWABATA, Z. 2004. Photoalteration of
dissolved organic matter (DOM) released from Microcystis aeruginosa in different
growth phases: DOM-fraction distribution and biodegradability. Archiv für
Hydrobiologie. 159:271-286
COOPER, WJ., SHAO, C., LEAN, DRS., GORDON, AS. & SCULLY, FE. 1994. Factors
affecting the distribution of H
2
O
2
in surface waters,. In Environmental chemistry of
lakes and reservoirs. Advances in Chemistry Series. 237:393-422
CHRÓST, RJ., MÜNSTER, U., RAI, H., ALBRECHT, D., WITZEL, PK. & OVERBECK, J.
1989. Photosynthetic production and exoenzymatic degradation of organic matter in
the euphotic zone of a eutrophic lake. Journal of Plankton Research. 11:223-242
DELLAMANO-OLIVEIRA, MJ., COLOMBO-CORBI, V. & VIEIRA, AAH. 2007.
Carboidratos dissolvidos do reservatório de Barra Bonita (Estado de São Paulo,
Brasil) e sua relação com as algas fitoplanctônicas abundantes. Biota Neotropica
7:59-66
55
DUCKLOW, HW. & CARLSON, CA. 1992. Oceanic bacterial production. Advances in
Microbial Ecology. 12:113-181
EILER, A. & BERTILSSON, S. 2004. Composition of freshwater bacterial communities
associated with cyanobacterial blooms in four Swedish lakes. Environmental
Microbioligy. 6:1228-1243
EMBRAPA. 1999. EMBRAPA Solos: Sistema brasileiro de classificação de solos.
Brasília: EMBRAPA, 412p.
EMBRAPA. 2002. Brasil Visto do Espaço. Disponível em:
http://www.cdbrasil.cnpm.embrapa.br. Acessado em 29/06/2009
FUHRMAN, JA. & AZAM, F. 1982. Thymidine incorporation as a measure of
heterotrophic bacterioplankton production in marine surface waters: evaluation and
field results. Marine Biology, 66:109- 120
GOBLER, CJ., HUTCHINS, DA., FISHER, NS., COSPER, EM. & SAÑUDO-WILHELMY, SA.
1997. Release and bioavailability of C, N, P, Se and Fe following viral lysis of a
marine chrysophyte. Limnology and Oceanography. 42:1492-1504
GORHAM, PR., MCLACHLAN, J., HAMMER, UT. & KIM, WK. 1964. Isolation and culture
of toxic strains of Anabaena flosaquae (Lingb.). Verh. Internat. Verein. Limnol.
15: 769-780
GRANÉLI, W., LINDELL, M. & TRANVIK, L. 1996. Photo-oxidative production of
dissolved inorganic carbon in lakes of different humic content. Limnology and
Oceanography 41:698–706
HARVEY, GA., BORAN, DA., CHESAL, LA. & TOKAR, JM. 1983. The structure of marine
fulvic and humic acids. Marine Chemistry. 12:119-132
H
UANG, WJ., LAI, CH. & CHENG, YL. 2007. Evaluation of extracellular products and
mutagenicity in cyanobacteria cultures separated from a eutrophic reservoir.
Science of the Total Environment. 377:214–223
KAPLAN, LA. & BOTT, TL. 1983. Microbial heterotrophic utilization of dissolved
organic matter in a piedmont stream. Freshwater Biology. 13:363–77
K
APUSTINA, LL. 2006. Experimental Study of Microcystis-Associated and Free-Living
Bacteria. Microbiology. 75(5):696–701
KIEBER, DJ., DANIEL, JM. & MOPPER, K. 1989. Photochemical source of biological
substrates in sea water: implications for carbon cycling. Nature. 341:637–639
KIEBER, RJ., HYDRO, LJ. & SEATON, PJ. 1997. Photooxidation of triglycerides and fatty
acids in seawater: implication toward the formation of marine humic substances.
Limnology and Oceanography. 42:1454-1462
LAMPERT, W. & SOMMER, U. 1997. Limnoecology. Oxford University Press, Inc. pp
56
96-97.
LANCELOT, C. 1984. Extracellular release of small and large molecules by
phytoplankton in the southern Bight of the North sea. Estuarine Coastal Shelf
Science. 18: 65-77
LINDELL, MJ., GRANÉLI, W. & TRANVIK, LJ. 1995. Enhanced bacterial growth in
response to photochemical transformation of dissolved organic matter. Limnology
and Oceanography. 40:195-199
LORENZEN, CJ. 1967. Determination of chlorophyll and phaeopigments:
spectrophotometric equations. Limnology and Oceanography. 12:343-346
MADRONICH, S. 1992. Implications of recent total atmospheric ozone measurements for
biologically active ultraviolet radiation reaching the earth’s surface. Geophysical
Research Letters. 19: 37-40
MARKER, AFH., NUSCH, EA., RAI, H. & RIEMANN, B. 1980. The measurement of
photosynthetic pigments in freshwaters and standardization of methods: conclusions
and recommendations. Arch Hydrobiol Beih. 14:91-106
MARTINEZ, J., SMITH, DC., STEWARD, GF. & AZAM, F., 1996. Variability in
ectoenzyme activities of pelagic marine bacteria and its significance for substrate
processing in the sea. Aquatic Microbial Ecology. 10:223–230
MATSUMURA-TUNDISI, T. & TUNDISI, JG. 2005. Plankton richness in a eutrophic
reservoir (Barra Bonita Reservoir, SP, Brazil). Hydrobiologia. 542:367-378
MCKNIGHT, DM. & AIKEN, GR. 1998. Sources and age of aquatic humus. In:
Ecological Studies: Aquatic humic substances, vol. 133. ed. Hessen, D. O. &
Tranvik, L. J., pp. 9-39. Springer-Verlag, Berlin
M
EYER, JL., EDWARDS, RT. & RISLEY, R. 1987. Bacterial growth on dissolved organic
carbon from a blackwater river. Microbial Ecology. 13:13–29
M
OPPER, K., ZHOU, X., KIEBER, RJ., KIEBER, DJ., SIKORSKI, RJ. & JONES, RD. 1991.
Photochemical degradation of dissolved organic carbon and its impact on the
oceanic carbon cycle. Nature. 353: 60–62
MORAN, MA. & ZEPP, RG. 1997. Role of photoreactions in the formation of
biologically labile compounds from dissolved organic matter. Limnology and
Oceanography. 42:1307-1316
MÜNSTER, U. & CHRÓST, RJ. 1990. Origin, composition and microbial utilization of
dissolved organic matter, p. 8-46. In Overbcck, J. & Chróst, RJ. reds., Aquatic
Microbial Ecology: Biochemical and Molecular Approaches. Springer
MYKLESTAD, S.M. 1995. Release of extracellular products by phytoplankton with
special emphasis on polysaccharides. Science of the Total Environment. 165: 155-
164
57
NAGANUMA, T., KONISHI, S., INOUE, T., NAKANE, T. & SUKIZAKI, S. 1996.
Photodegradation or photoalteration? Microbial assay of the effect of UV-B on
dissolved organic matter. Marine Ecology Progress Series. 135:309-310
NAGATA, T. & WATANABE, Y. 1990. Carbon-to-volume and nitrogen-to-volume ratios
of bacterioplankton grown under different nutritional conditions. Applied and
Environmental Microbiology. 56:1303-1309
NUSCH, EA. 1980. Comparison of different methods for chlorophyll and phaeopigments
determination. Arch Hydrobiol Beih. 14:14-36
OBERNOSTERER, J., SEMPÉRÉ, R. & HERNDL, GJ. 2001. Ultraviolet radiation induces
reversal of the bioavailability of DOM to marine bacterioplankton. Aquatic
Microbial Ecology. 24: 61–68
OGAWA, H. & OGURA, N. 1992. Comparison of two methods for measuring dissolved
organic carbon in sea water. Nature. 356: 696–698
OPSAHL, SP. & ZEPP, RG. 2001. Photochemically-induced alteration of stable carbon
isotope ratios (delta C-13) in terrigenous dissolved organic carbon. Geophysical
Research Letters. 28:2417-2420
PAUSZ, C. & HERNDL, GJ. 1999. Role of ultraviolet radiation on phytoplankton
njextracellular release and its subsequent utilization by marine bacterioplankton.
Aquatic Microbial Ecology. 18:85-93
PERNTHALER, J., GLÖCKNER, FO., UNTERHOLZNER, S., ALFREIDER, A., PSENNER, R. &
AMANN, R. 1998. Seasonal community and population dynamics of pelagic
Bacteria and Archaea in a high mountain lake. Applied and Environmental
Microbiology. 64: 4299-4306
PORTER, KG. & FEIG, TS. 1980. The use of DAPI for identifying and counting aquatic
microflora. Limnology and Oceanography. 25:943-948
R
ACY, F. 2004. Aspectos numéricos, morfológicos e morfométricos das comunidades
bacterianas em diferentes escalas trófica e temporal, em reservatórios. Dissertação
de Mestrado. Universidade Federal de São Carlos. São Carlos-SP 63p.
R
EYNOLDS, CS., JAWORSKI, GHM., CMIECH, HA. & LEEDALE, GF. 1981. On the annual
cycle of the blue-green alga Microcystis aeruginosa Kütz. Emend. Elenkin.
Phisyological Transactions of the Royal Society of London, Series B. 293:419-
477
RIEMANN, L., STEWARD, GF. & AZAM, F. 2000. Dynamics of bacterial community
composition and activity during a mesocosm diatom bloom. Applied and
Environmental Microbiology. 66:578–587
ROSENSTOCK, B., ZWISLER, W. & SIMON, M. 2005. Bacterial consumption of humic
58
and non-humic low and high molecular weight DOM and the effect of solar
irradiation on the turnover of labile DOM in the southern ocean. Microbial
Ecology. 50:90–101
SAUNDERS, GW. 1976. Decomposition in freshwater. In: Anderson, JM. & MacFayden
A. (eds.), The role of terrestrial and aquatic organisms in decomposition processes.
17o Symposium of British Ecological Society, Blackwell Scientific Publications,
New York: 341–373
SCULLY, NM., MCQUEEN, DJ. & LEAN, DRS. 1996. Hydrogen peroxide formation: The
interaction of ultraviolet radiation and dissolved organic carbon in lake waters
along a 43–758N gradient. Limnology and Oceanography. 41(3): 540–548
SØNDERGAARD, M. & MIDDELBOE, MA. 1995. A cross-system analysis of labile
dissolved organic carbon. Marine Ecology Progress Series. 118:283-294
STROME, DJ. & MILLER, MC. 1978. Photolytic changes in dissolved humic substances.
Verh. Internat. Verein. Limnol. 20:1248-1254
SUHETT, AL., AMADO, AM., BOZELLI, RL., ESTEVES, FA. & FARJALLA, VF. 2006. O
papel da fotodegradação do carbono orgânico dissolvido (COD) nos ecossistemas
aquáticos. Oecologia Brasiliensis. 10(2):186-204
SUN, J. & LIU, D. 2003. Geometric models for calculating cell biovolume and surface
area for phytoplankton. Journal of Plankton Research. 25:1331-1346
TORTORA, GJ., FUNKE, BR. & CASE, CL. 2003 Microbiologia. 6ª ed. 827pp. Edit.
Artmed Editora S.A. Porto Alegre – Brasil
TRANVIK, LJ. 1998. Degradation of dissolved organic matter in humic waters by
bacteria, In: Hessen, DO. & Tranvik, LJ. (eds.). Aquatic Humic Substances –
Ecology and Biogeochemistry. Springer, Berlin, pp. 259-283
TRANVIK, LJ. & BERTILSSON, S. 2001. Contrasting effects of solar UV radiation on
dissolved organic sources for bacterial growth. Ecology Letters. 4:458-463
T
RANVIK, LJ. & KOKALJ, S. 1998. Decreased biodegradability of algal DOC due to
interactive effects of UV radiation and humic matter. Aquatic Microbial Ecology.
14:301-307
T
UNDISI, JG. & MATSUMURA-TUNDISI, T. 1990. Limnology and eutrophication of Barra
Bonita Reservoir, São Paulo State, Southern Brazil. Arch. Hydrobiol. Beih.
(Ergebn. Limnol.). 33:661-676
VÄHÄTALO, H., AURIOLA, S. & LAPINJOKI, S. 1999. High performance liquid
chromatography-mass spectrometry of an osteocalcin derivative. Journal of
Chromatography. 846:49-57
VALENTINE, RL. & ZEPP, RG. 1993. Formation of carbon monoxide from the
photodegradation of terrestrial dissolved organic carbon in natural waters.
59
Environmental Science and Technology. 27: 409–412
WETZEL, RG. 1972. The role of carbon in hard-water marl lakes. In: Likens, GE. (Ed.).
Nutrients and eutrophication: the limiting-nutrient controversy. Spec. Symp.,
Amer. Soc. Limnology and Oceanography. 1:84-97
WETZEL, RG. 2001. Limnology: lake and river ecosystem (3
rd
ed.). Academic Press
WETZEL, RG., HATCHER, PG. & BIANCHI, TS. 1995. Natural photolysis by ultraviolet
irradiance of recalcitrant dissolved organic matter to simple substrates for rapid
bacterial metabolism, Limnology and Oceanography. 40:1369–1380
WMO. 1995. Scientific assessment of ozone depletion: 1994. Word Meteorological
Organization, Global Ozozne Research and Monitoring Project, Relatório n° 37,
Geneva
WORM, J. & SØNDERGAARD, M. 1998. Dynamics of heterotrophic bacteria attached to
Microcystis spp. (Cyanobacteria). Aquatic Microbial Ecology. 14:19-28
WORM, J., GUSTAVSON, K., GARDE, K., BORCH, NH. & SØNDERGAARD, M. 2001.
Functional similarity of attached and free-living bacteria during freshwater
phytoplankton blooms. Aquatic Microbial Ecology. 25:103–111
ZAR, JH. 1999 Biostatistical Analysis. 4ª ed. 663pp. Edit. Prentice Hall. New Jersey –
USA
ZARITSKY, A. 1975. On dimensional determination of rod-shaped bacteria. J. Theor.
Biol. 54 :243-248 apud RACY, F. 2004. Aspectos numéricos, morfológicos e
morfométricos das comunidades bacterianas em diferentes escalas trófica e
temporal, em reservatórios. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de São
Carlos. São Carlos – SP. 63p.
Z
EPP, RG., CALLAGHAN, TV. & ERICKSON, DJ. 1995. Effects of increased solar
ultraviolet radiation on biogeochemical cycles. Ambio. 24:181-187
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