( PDF ) Análise da diversidade genética entre genótipos do gênero Plectranthus

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA VEGETAL

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE GENÓTIPOS DO GÊNERO

Plectranthus

JULIANA DE MAGALHÃES BANDEIRA

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pelotas, sob a orientação da

Profª. Drª. Eugenia Jacira Bolacel Braga,

como parte das exigências do Programa

de Pós-graduação em Fisiologia Vegetal,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências (M.Sc.).

PELOTAS

Rio Grande do Sul – Brasil

Março de 2007

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Dados de catalogação na fonte:

Ubirajara Buddin Cruz – CRB 10/901

Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

B214a Bandeira, Juliana de Magalhães

Análise da diversidade genética entre genótipos do gênero

Plectranthus / Juliana de Magalhães Bandeira ; orientador

Eugenia Jacira Bolacel Braga ; co-orientador José Antonio

Peters, Valmor João Bianchi. – Pelotas, 2007. – 60f. – Disser-

tação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Fisiologia

Vegetal. Instituto de Biologia. Universidade Federal de Pelo-

tas. Pelotas, 2007.

1.Fisiologia vegetal. 2. Plectranthus. 3.RAPD. 4.Cultura

in vitro. 5.Extração de óleos essenciais. 6.Diversidade genéti-

ca. I.Peters, José Antonio. II.Bianchi, Valor João. III.Título

CDD: 581.15

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JULIANA DE MAGALHÃES BANDEIRA

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE GENÓTIPOS DO GÊNERO

Plectranthus

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pelotas, sob a orientação da

Profª. Drª. Eugenia Jacira Bolacel Braga,

como parte das exigências do Programa

de Pós-graduação em Fisiologia Vegetal,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências (M.Sc.).

Aprovada : 26 de março de 2007

_____________________________ ___________________________

Dr. Ariano Martins de Magalhães Jr. Dr

. Rosa Lia Barbieri

______________________________ ___________________________

. Beatriz Helena Gomes Rocha Drª. Eugenia Jacira Bolacel Braga

(Orientadora)

iii

Aos meus pais, Celso e Ieda,

Aos meus irmãos, Rafael, Carolina, Letícia e Felipe

Dedico.

Ao meu namorado, Sérgio e amigos

Ofereço.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Pelotas (UFPel), através do Departamento de

Botânica, pela oportunidade e estrutura para realização deste trabalho.

À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.

À Drª. Eugenia Jacira Bolacel Braga pela orientação, colaboração,

incentivo, auxílio e amizade, assim como aos professores co-orientadores Dr.

José Antonio Peters e Dr. Valmor João Bianchi.

Ao Dr. Marcos Antonio Bacarin pelo empréstimo das dependências do

Laboratório de Metabolismo Vegetal e materiais necessários para o

desenvolvimento de parte da pesquisa.

Aos professores, colegas e funcionários do Curso de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal pelo aprendizado, amizade e incentivo.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas

pelo auxílio e incentivo, os quais se fizeram presentes em todos os momentos

desta caminhada. Em especial ao Alexandre de Carvalho, Antelmo Ralph

Falqueto, Cláudia Simone Madruga Lima, Fabrizio da Fonseca Barbosa,

Guilherme Cardoso, Isabel Corrêa da Silva Rodrigues, Letícia Mascarenhas

Pereira Barbosa, Márcia Vaz Ribeiro e Silvia Rubin.

E, é claro, a todos que de alguma forma contribuíram para realização

deste trabalho.

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS vii

SUMÁRIO viii

SUMMARY x

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 6

3 MATERIAL E MÉTODOS 11

3.1 Análise da similaridade genética de quatro espécies do gênero

Plectranthus 11

3.1.1 Material vegetal 11

3.1.2 Extração de DNA 12

3.1.3 Amplificação do DNA pela técnica de RAPD (Randomly Amplified

Polymorphic DNA) 13

3.2 Avaliação do teor do óleo essencial de quatro espécies do gênero

Plectranthus 15

3.2.1 Material vegetal 16

3.2.2 Determinação do teor de água 16

3.2.3 Extração, separação e quantificação do óleo essencial 16

3.3 Estabelecimento in vitro de três espécies do gênero Plectranthus

3.3.1 Material Vegetal

3.3.2 Desinfestação do material vegetal para inoculação in vitro 19

3.3.3 Meio de cultivo para estabelecimento de gemas e meristemas 19

3.3.4 Meios alternativos para estabelecimento do P. grandis e P.

barbatus 20

3.3.5 Avaliações dos experimentos de estabelecimento in vitro 21

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 22

4.1 Análise da similaridade genética de quatro espécies do gênero

Plectranthus 22

4.1.1 Caracterização molecular 22

4.2 Avaliação do teor do óleo essencial de quatro espécies do gênero

Plectranthus 30

4.2.1 Determinação do teor de água 30

4.2.2 Extração, separação e quantificação do óleo essencial 31

4.3 Estabelecimento in vitro de três espécies do gênero Plectranthus

4.3.1 Estabelecimento de gemas e meristemas in vitro 32

4.3.2 Estabelecimento do P. grandis e P. barbatus em meios

alternativos 34

5 CONCLUSÕES 39

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

MS meio de cultura de Murashige & Skoog

WPM meio de cultura de Lloyd & McCown

ANA ácido α-naftalenoacético

BAP 6-benzilaminopurina

ácido giberélico

g L

-1

grama(s) por litro

mg L

-1

miligrama(s) por litro

µg µL

-1

micrograma(s) por microlitro

ng µL

-1

nanograma(s) por microlitro

µg mL micrograma(s) por mililitro

µL microlitro(s)

mM milimolar

mL mililitro(s)

mg miligrama(s)

µmol m

-2

-1

micromol por metro ao quadrado por segundos

°C graus Celsius

V volts

cm centímetros

mm milímetro(s)

rpm rotações por minutos

b.s. base seca

b.u. base úmida

viii

SUMÁRIO

BANDEIRA, Juliana de Magalhães, M.Sc. Universidade Federal de Pelotas,

março de 2007. Análise da diversidade genética entre genótipos do gênero

Plectranthus. Orientadora: Profª. Drª. Eugenia Jacira Bolacel Braga.

Conselheiros: Dr. José Antonio Peters e Dr. Valmor João Bianchi.

Plantas medicinais são amplamente utilizadas pela população, pois são

importantes fontes de produtos químicos naturais. Entretanto, podem

apresentar problemas na sua utilização com relação à qualidade e à identidade

genética do material vegetal. Técnicas moleculares auxiliam na identificação de

espécies através da construção das impressões digitais, enquanto que a

cultura de tecidos tem importante papel por proporcionar produção massiva de

plantas, livres de agentes patogênicos e geneticamente uniformes. O gênero

Plectranthus abrange espécies que são referidas como boldo por possuírem

propriedades anti-dispépticas, analgésicas e estimulantes da digestão. O

objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética entre quatro espécies

do gênero Plectranthus, através da técnica de RAPD, analisar

quantitativamente seus óleos essenciais e a micropropagação in vitro. A

extração de DNA e amplificação foi realizada pela técnica de RAPD, de quatro

espécies de Plectranthus (P. grandis, P. barbatus, P. neochilus e P.

amboinicus). O óleo essencial destas espécies foi extraído através da

hidrodestilação. Para o estabelecimento de gemas e meristemas de P.

grandis, P. barbatus e P. neochilus foram utilizados os meios MS e MS

suplementado com 0,1 mg L

-1

de BAP, 0,01 mg L

-1

de ANA e 0,1 mg L

-1

, respectivamente. Como meios alternativos para o estabelecimento de

gemas do P. grandis e P. barbatus, foram utilizados os meios MS e WPM

íntegros e com ¾ da força de seus sais, combinados com 30 e 50 g L

-1

sacarose. Maior similaridade genética foi observada entre as espécies P.

neochilus e P. amboinicus (80%), seguido de P. grandis e P. barbatus (77%).

Quanto à concentração de óleo essencial, P. neochilus foi o que apresentou

maior valor (0,43% b.s.), comparado a P. grandis com valores bem menores

(0,09% b.s.). Após 40 dias de cultivo, P. neochilus foi a espécie com melhor

multiplicação no meio MS, enquanto para P. grandis e P. barbatus o meio

alternativo, WPM ¾ com 30 g L

-1

de sacarose apresentou melhor condição

para o desenvolvimento de ambas as espécies. A variabilidade detectada

através da análise de RAPD e a diversidade de respostas obtidas durante a

multiplicação in vitro permitiram uma clara separação entre as quatro espécies

analisadas.

SUMMARY

BANDEIRA, Juliana de Magalhães, M.Sc. Universidade Federal de Pelotas,

march, 2007. Analysis of genetic diversity among genotypes of

Plectranthus. Advisor: Drª. Eugenia Jacira Bolacel Braga. Co-advisors: Dr.

José Antonio Peters e Dr. Valmor João Bianchi.

Medicinal plants are widely used, therefore they are important sources of

natural chemical products. However, they can present problems in their use

with regard to quality and to genetic identity of the vegetal material. Molecular

techniques contribute in the identification of species through the construction of

fingerprints, whereas the tissue culture has important hole for providing massive

production of plants, free of pathogenic agents and genetically uniforms.

Plectranthus includes species that are commonly know as “boldo” for having

anti-dyspeptics and analgesic properties, and stimulant of digestion. The aim of

this work was to evaluate the genetic diversity among four species of

Plectranthus genus, through RAPD technique and quantitative analysis of their

essential oils and to verify the in vitro micropropagation. The DNA extraction

and amplification of four Plectranthus species (P. grandis, P. barbatus, P.

neochilus e P. amboinicus) was carried out by RAPD. The essential oil of these

species was extracted by hidrodestilation. For the establishment of axillaries

buds and meristems of P. grandis, P. barbatus and P. neochilus, MS and MS

medium supplemented with 0.1 mg L

-1

of BAP, 0.01 mg L

-1

of ANA and 0.1 mg

-1

of GA

, were used respectively. As alternative medium for the establishment

of axillaries buds of P. grandis and P. barbatus, the MS and WPM medium were

used complete and with ¾ of the concentration of their salts, combined with 30

and 50 g L

-1

of sucrose. Higher genetic similarity was observed between

species P. neochilus and P. amboinicus (80%), followed by P. grandis and P.

barbatus (77%). Regarding the essential oil concentration, the P. neochilus

presented higher value (0.43% b.s.), compared with the P. grandis with lower

values (0.09% b.s.). After 40 days of culture, the P. neochilus was the species

with better multiplication in MS medium, while for P. grandis and P. barbatus the

alternative medium WPM¾ with 30 g L

-1

of sucrose presented better condition

for the development of both species. The variability detected by RAPD and the

diversity of answers obtained during in vitro multiplication, allowed a clear

separation among the four analyzed species.

1 INTRODUÇÃO

A adoção da fitoterapia com orientação científica, para o uso imediato de

vegetais, garante a utilização correta das plantas medicinais com eficácia e

qualidade, contribuindo para a melhoria do nível da saúde. De acordo com

Lorenzi & Matos (2002) um dos maiores problemas da utilização de plantas

medicinais é relativo à identidade destes vegetais. A fitoterapia é baseada em

nomes populares os quais podem variar de acordo com a região. Tais

interpretações taxonômicas errôneas podem induzir a utilização de uma planta

sem o princípio ativo desejado ou, ainda, a utilização de uma planta perigosa.

Por isso, a identificação correta dos vegetais é de suma importância.

Através do desenvolvimento da biotecnologia, diversas técnicas de

marcadores moleculares têm permitido indicar com precisão as variações

genéticas presentes no DNA de qualquer organismo. Quando marcadores

moleculares são utilizados, a possibilidade de identificação de genótipos

aumenta consideravelmente para todas as espécies (Mulcahy et al., 1993).

Marcadores moleculares são pontos de referência nos cromossomos, ou seja,

são seqüências de DNA que podem ser utilizadas para detectar diferenças

entre dois ou mais indivíduos (Castro & Ferreira, 2001).

Técnicas moleculares são largamente utilizadas a fim de caracterizar

plantas, assim como para estudar sua filogenia. A análise de RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA) oferece vantagens por ser tecnicamente simples e

de rápida execução, além de não requerer nenhuma informação prévia acerca

da seqüência alvo, por utilizar primers curtos de seqüências arbitrárias (Welsh

& McClelland, 1990; Williams et al., 1990; Nakajima et al., 1998). Esta técnica é

baseada na reação de polimerase em cadeia (PCR), a qual promove a

amplificação do DNA, permitindo a comparação direta dos alelos, através da

composição dos nucleotídeos da seqüência. Desta forma, podem-se comparar

os organismos em nível molecular sem a influência do meio ambiente ou da

idade do tecido (Ferreira & Grattapaglia, 1995).

No início da década de 90, técnicas usadas para distinguir cultivares ao

nível de DNA permitiram acessar a variabilidade genética dentro do pool gênico

de espécies cultivadas, assim como identificar a diversidade disponível em

bancos de germoplasma e populações naturais de plantas (Salla et al., 2002).

A demanda de plantas medicinais para utilização na cura ou prevenção

de doenças, torna o cultivo e o extrativismo destes vegetais uma prática cada

vez mais executada na agricultura nacional. No entanto, a exploração de

plantas medicinais da flora brasileira, através da extração direta, nos

ecossistemas tropicais, tem levado à redução drástica das populações naturais

dessas espécies, seja pelo processo predatório de exploração, ou pelo

desconhecimento dos mecanismos de perpetuação das mesmas. Dessa forma,

se faz necessário a domesticação e o cultivo para a obtenção da matéria-prima

de interesse farmacêutico, incorporando a conservação de genótipos em

bancos de germoplasma, juntamente com a implantação de reservas genéticas

(Reis & Mariot, 2002; Castro et al., 2004).

Diante da crescente demanda econômica mundial, esforços de

pesquisadores e estudiosos são requeridos, no intuito de fornecer informações

relativas às plantas de uso medicinal, sendo que a inexistência de material para

propagação com controle fitossanitário é um dos maiores problemas enfrentado

pelos seus produtores (Montanari Jr., 2003).

A multiplicação in vitro tem a finalidade de produzir plantas em larga

escala, com qualidades morfológicas e fisiológicas, garantindo o mínimo de

variação somaclonal, evitando a extração predatória. Estes objetivos são

alcançados através do controle da composição do meio, das condições da

planta matriz, considerando a qualidade e origem dos explantes (Torres et al.,

1998; Kerbauy, 1999).

A utilização de plantas medicinais que já tiveram o valor dos fármacos

confirmados esbarra na dificuldade de obtenção de matéria prima de qualidade

e na quantidade necessária para suprir a demanda requerida pelo mercado

nacional e internacional. Para se ter uma produção confiável de drogas

terapêuticas, é recomendado o cultivo em larga escala de plantas medicinais

(Mantel et al., 1985; Lindsey & Jones, 1985; Corrêa, 1994; Amaral & Silva,

2003).

A micropropagação tem sido direcionada a atividades comerciais,

objetivando a limpeza clonal e multiplicação de espécies ornamentais,

florestais, agronômicas e medicinais. A micropropagação de espécies

aromáticas e medicinais justifica-se pela crescente demanda da indústria

farmacêutica por plantas indexadas, livres de vírus, com alta qualidade

fitossanitária, fisiológica e morfológica, podendo ter a capacidade de síntese de

metabólitos secundários potencializada, através do melhoramento genético

(Martins, 1995; Rout, et al., 2000; Torres et al., 2001; Oliveira & Martins, 1998),

além de possibilitar a obtenção de plantas altamente homogêneas,

possibilitando o aproveitamento da heterose, sem as limitações da produção de

sementes, e ainda há possibilidade de conservação de germoplasma,

garantindo a manutenção da biodiversidade (Echeverrigary et al., 2001).

A composição química dos metabólitos está relacionada com seus

diferentes sítios de produção. Os tricomas glandulares, por exemplo, podem

secretar diversas substâncias (Fahn, 1975), entre estas, óleos essenciais, que

são bastante comuns e ocorrem em gêneros de Verbenaceae, Lamiaceae,

Solanaceae, Asteraceae e Geraniaceae (Metcalfe & Chalk, 1950).

A produção de óleo essencial pode atuar na proteção da parte aérea da

planta contra o ataque de herbívoros e patógenos (Werker, 1993), sendo que a

atividade biológica dos metabólitos secundários é de interesse para diversas

indústrias (Duke, 1994). Portanto, conhecer a estrutura, e estabelecer uma

relação com a produção de princípios ativos, pode contribuir significativamente

no auxílio e na manutenção de caracteres de interesse comercial, através de

programas de melhoramento genético (Franco et al., 1999). Estes compostos

são de grande interesse comercial às indústrias químicas, uma vez que não

apresentam efeitos colaterais, e, portanto não acumulam resíduos tóxicos no

organismo como os medicamentos sintéticos, demonstrando maior eficiência

(Mantel et al., 1985; Montanari Jr., 2003).

Além da extração e composição dos óleos, a toxicologia do chá de

diversas plantas tem sido levada em consideração. O controle de qualidade da

droga vegetal é imprescindível, pois muitas espécies de vegetais são vendidas

sem nenhuma garantia de qualidade, favorecendo a venda de espécies

falsificadas além do armazenamento inadequado do vegetal durante sua

comercialização (Mouco et al., 2003).

A família Lamiaceae é extensa, amplamente difundida e é adaptada a

quase todos os habitats. Caracteriza-se pela existência de inúmeras espécies

utilizadas como aromáticas e medicinais, devido à presença de óleos

essenciais, produzidos nos pêlos glandulares ou escamas, densamente

situados nos caules e folhas (Weberling & Schwantes, 1986).

De acordo com Abdel-Mogib et al. (2002), o gênero Plectranthus L’Her

pertence à subfamília Nepetoideae da tribo Ocimaeae, família Lamiaceae, e é

considerado um dos mais ricos em óleos essenciais, tendo como principais

constituintes os monos e sesquiterpenos. Este gênero compreende muitas

plantas de interesse medicinal e econômico, entretanto sua composição

química é pouco conhecida.

Das 300 espécies do gênero Plectranthus, 62 são mencionadas por

possuírem propriedades medicinais, alimentícias, flavorizantes, antissépticas,

repelentes e por serem utilizados como pastagens e plantas ornamentais

(Lukhoba et al., 2006).

De acordo com Marques et al. (2006) várias espécies deste gênero,

muitas referidas como boldo, são utilizadas como plantas medicinais devido às

suas propriedades anti-dispépticas, analgésicas e estimulantes da digestão.

Desta forma, foram estudadas quatro espécies do gênero Plectranthus,

com propriedades medicinais semelhantes, as quais são conhecidas

popularmente como boldo (P. grandis, P. barbatus, P. neochilus e P.

amboinicus). Plectranthus barbatus Andrews e Plectranthus grandis (Cramer)

R.H. Willemse, conhecidos como falso-boldo e boldo-grande, respectivamente,

são muito semelhantes e, por isso, são bastante confundidos, sendo ambos

utilizados para os mesmos fins na medicina popular (Lorenzi & Matos, 2002).

Estudos moleculares realizados por Passinho et al. (2000), através da técnica

de AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) demonstraram a

existência de diversidade genética entre ambas as espécies. Plectranthus

neochilus (Schlechtre) (boldo-gambá), segundo Lorenzi & Matos (2002), é uma

planta herbácea muito aromática, com uso semelhante ao de P. barbatus. De

acordo com Lukhoba et al. (2006), P. amboinicus (Lour.) Spreng. também

possui propriedades medicinais semelhantes às das espécies anteriormente

mencionadas.

Além das propriedades medicinais, P. barbatus tem sido utilizado como

indicador da fertilidade do solo, para fazer adubo, e, também, tem sido plantado

às margens de rios para impedir a erosão do solo (Drummond, 1953;

Mwangangi, 1982; Riley & Brokensha, 1988).

Por causa das semelhanças taxonômicas, diversas nomenclaturas têm

sido utilizadas para a mesma espécie de Plectranthus, tornando difícil a coleta

de informações sobre a utilização etnobotânica deste gênero. Além do mais, as

espécies de Plectranthus comumente utilizadas para fins medicinais possuem

um grande número de sinonímias (Lukhoba et al., 2006).

Devido à semelhança das propriedades farmacológicas, o objetivo do

presente trabalho foi avaliar a diversidade genética de quatro espécies do

gênero Plectranthus (P. grandis, P. barbatus, P. neochilus e P. amboinicus),

através da técnica de RAPD e da análise quantitativa dos seus óleos

essenciais, além de averiguar o comportamento in vitro.

2 REVISÃO DE LITERATURA

Atualmente, o custo para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos

ou semissintéticos é muito elevado e tem se mostrado pouco frutífero. Furlam

(1998) destaca que 30% dos U$S 300 bilhões referentes ao mercado de

medicamentos estão relacionados aos produtos obtidos através de vegetais,

exigindo uma maior atenção na área de cultivo.

Segundo dados da Associação Brasileira da Indústria de Fitoterápicos, o

setor movimenta R$ 1 bilhão por ano e emprega mais de 100 mil pessoas.

Como o país não investe em pesquisas de plantas medicinais, cerca de 80%

dos fitoterápicos registrados no Brasil são de plantas estrangeiras (Castro et

al., 2004). Estima-se que 250.000 a 500.000 espécies vegetais superiores já

foram descritas, que cerca de 5% têm sido estudadas fitoquimicamente e uma

menor porcentagem já foi avaliada quanto aos aspectos biológicos. O Brasil

possui 30% das florestas tropicais, com 40 a 200 mil espécies vegetais, das

quais 10 mil são medicinais (Cechinel Filho & Yunes, 1998; Castro et al., 2004).

No Brasil, 63% dos medicamentos disponíveis são consumidos por

apenas 20% da população, o restante possui como única fonte terapêutica o

uso dos recursos naturais. Até o momento, ainda não se conhece quase nada

sobre a composição química de 99,6% das plantas da flora nacional, estimadas

entre 40 mil a 55 mil espécies. Além disso, uma grande quantidade de

compostos secundários isolados de plantas medicinais, com estrutura química

já determinada, ainda não foram estudados quanto às suas atividades

biológicas (Stangarlin et al., 2005). Dados da Organização Mundial de Saúde

(OMS) demonstram que cerca de 80% da população mundial faz o uso de

algum tipo de erva na busca de alívio de alguma sintomatologia dolorosa ou

desagradável. Desse total, pelo menos 30% ocorreu por indicação médica. A

ABIFITO (2006) estima que 82% da população brasileira utiliza, no tratamento

de suas doenças, produtos à base de plantas medicinais. Diversos fatores,

principalmente econômicos e sociais, têm contribuído para o desenvolvimento

de práticas de saúde que incluam a utilização de plantas medicinais (Silva &

Casali, 2000).

Os fitoterápicos representam hoje 10% do capital da indústria

farmacêutica mundial, responsável pela movimentação de US$ 30 bilhões no

ano de 2002. Só nos Estados Unidos, entre 1994 e 2000, as vendas cresceram

de US$ 500 milhões para US$ 5 bilhões. No Brasil, chega a US$ 550 milhões,

com previsão de dobrar este valor até 2010 (Mendonça, 2003). Segundo uma

estimativa feita pela PhytoPharm Consulting, em Berlim, até 2007, a fitoterapia

deve movimentar cerca de US$ 47 bilhões anualmente, sendo que os EUA

podem vir a se tornar o maior mercado de medicamentos fitoterápicos do

mundo, responsáveis por uma participação de US$ 20 bilhões, seguido pela

Europa (US$14 bilhões) e Ásia (US$ 10 bilhões). Os demais países, incluindo o

Brasil, seriam responsáveis por um total de US$ 3 bilhões anuais (Herbarium,

2006).

O interesse crescente pelos fitoterápicos tem suas razões, afinal, está

ligada a um mercado potencial da ordem de bilhões de dólares, seja em países

industrializados ou em países em desenvolvimento. Além de apresentar

menores efeitos colaterais, fornecendo uma maior segurança ainda quando

tilizados de forma adequada, a final, em excesso podem causar toxidez. O

tempo de desenvolvimento e o custeio para a produção de um novo fitoterápico

de qualidade são reduzidos, sendo despendidos no máximo cinco anos,

demandando investimentos da ordem de 2 a 3 milhões de dólares, o que

contrasta com a dificuldade de desenvolvimento de novas drogas sintéticas, já

que este processo é extremamente caro e demorado, como por exemplo, nos

últimos 20 anos o lançamento no mercado de um novo fármaco sintético,

requer investimentos da ordem de 500 a 600 milhões de dólares e, um espaço

de tempo nunca inferior a 10 ou 15 anos (Revista Brasileira de Medicina, 2002).

A comercialização de plantas pode se tornar um produto de exportação,

gerando lucros ao produtor rural e ao país. Atualmente, o Brasil exporta ipê-

roxo, espinheira-santa, erva-de-bicho, fáfia, catuaba, chapéu-de-couro, capim-

limão e erva-príncipe, principalmente para os Estados Unidos e Itália. Em

contrapartida, o Brasil importa mais de 1,5 mil toneladas por ano de folhas

secas de sálvia, arnica, ginkgo, babosa, arruda, erva-doce, alcaçuz, alfazema e

até cabelo de milho, os quais são utilizados como diuréticos, além de extratos e

essências para atender as necessidades da indústria nacional (Wilke, 2003).

As rotas que sintetizam os metabólitos primários fornecem moléculas

que são utilizadas como precursoras da síntese dos metabólitos secundários.

Desta forma, as rotas metabólicas estão sob controle da constituição genética

do organismo, sendo que durante estádios particulares do desenvolvimento, ou

durante períodos de estresse, entre outros fatores ambientais, as rotas dos

metabólitos secundários são estimuladas. Conclui-se que as mesmas são

resultantes da especialização celular e que sua manifestação durante certas

fases do desenvolvimento do organismo deve-se à expressão diferencial dos

genes (Mantel et al., 1985; Castro et al., 2004).

Considerando que os fitoquímicos mais valorizados são produtos

originados a partir do metabolismo secundário, os quais possuem substâncias

suficientes com elevada complexidade estrutural, tornando difícil ou mesmo

impossível de serem sintetizados artificialmente. Desta forma, as plantas são

importantes fontes tradicionais de diversos fármacos (Rout et al., 2000).

Os óleos voláteis podem ocorrer em estruturas secretoras

especializadas, dependendo da família, como pêlos glandulares (Lamiaceae),

células parenquimáticas diferenciadas (Laureaceae, Piperaceae, Poaceae),

canais oleíferos (Apiaceae) e em bolsas lisígenas ou esquizolisígenas

(Pinaceae, Rutaceae). Estes óleos podem estar presentes em determinados

partes como nas flores, folhas, cascas, madeira, raízes, rizomas, frutos ou

sementes. Embora todos os órgãos de uma planta possam acumular óleos

voláteis, sua composição pode variar de acordo com sua localização. Óleos

voláteis obtidos de diferentes órgãos de uma mesma planta podem apresentar

composição química, caracteres físico-químicos e odores bem distintos. Cabe

salientar que a composição química de um óleo volátil, extraído do mesmo

órgão de uma mesma espécie vegetal, pode variar significativamente, de

acordo com a época de coleta, estádio de desenvolvimento, condições

climáticas e de solo (Simões & Spitzer, 2003).

Muitos estudos têm sido realizados em relação à produção de óleos

essenciais. Santos-Gomes & Fernandes-Ferreira (2003) avaliaram esta

característica em brotos cultivados in vitro de Salvia officinales L., onde

segmentos nodais foram estabelecidos em meios de cultivo com diferentes

suplementações hormonais. Os óleos essenciais foram extraídos dos brotos

através da técnica de hidrodestilação, seus compostos foram identificados,

sendo que a concentração dos reguladores de crescimento aparentemente

influenciou no acúmulo dos óleos, provavelmente conseqüente do acúmulo de

biomassa.

Estes compostos possuem funções biológicas importantes para a planta,

pois apesar de não serem essenciais para o crescimento e desenvolvimento do

indivíduo, são essenciais para a sobrevivência e continuidade da espécie

dentro do ecossistema, sendo responsáveis pela defesa da planta contra

agentes externos como doenças, pragas, radiação solar, dentre outros. A

qualidade destas substâncias é fortemente influenciada pelas técnicas de

cultivo e pelas características genéticas da população sob cultivo (Montanari

Jr., 2003).

A espécie P. barbatus é comumente utilizada e conhecida como falso

boldo, boldo do reino ou boldo brasileiro, é originária da África tropical e Índia.

Provavelmente foi trazida pelos portugueses da Índia, ainda no período

colonial, por isso o nome boldo do reino, pois foi introduzida pelo Reino de

Portugal. Durante este período era muito comum os colonizadores distribuírem

em suas colônias, nas Américas e nas ilhas do Atlântico, mudas e sementes de

plantas medicinais e espécies coletadas no oriente. Por isso, há muito tempo,

certas plantas foram incorporadas à nossa flora, de tal forma que já são

consagradas como sendo plantas brasileiras (daí o nome boldo brasileiro). Esta

espécie é bastante confundida com o boldo verdadeiro ou boldo do chile,

Peumus boldus Mol., da família Monimiaceae (Lorenzi & Matos, 2002).

O boldo brasileiro apresenta ação terapêutica no estomago e no fígado,

em estudos com as folhas empregadas em maceração aquosa apresentaram

ação hipossecretora gástrica, ou seja, diminuíram a produção de suco gástrico

além de diminuir também sua acidez. Podendo ser empregar como auxiliar nos

tratamentos de gastrite, dispepsia, azia e mal estar gástrico de uma forma

geral. Como é rico em substâncias amargas, que até o momento ainda não

estão bem elucidadas quimicamente, o boldo também é empregado para

problemas hepáticos como má digestão, ressaca, entre outros (Simões et al.,

1998).

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Análise da similaridade genética de quatro espécies do gênero

Plectranthus

O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos e

Plantas, do Departamento de Botânica, no Instituto de Biologia, da

Universidade Federal de Pelotas (LCTP/DB/IB/UFPel).

3.1.1 Material vegetal

Foram utilizadas plantas de P. grandis, P. barbatus, P. neochilus e P.

amboinicus provenientes de diferentes localidades, conforme a Tabela 1. As

plantas oriundas de Porto Alegre (RS) foram cedidas pelo Instituto

Zoobotânico; as de Passo Fundo (RS) pelo Prof. Delvino Nolla da Universidade

de Passo Fundo (UPF) e as de Florianópolis (SC) pela Farmácia Natureza.

Todas as plantas foram devidamente identificadas utilizando chaves

taxonômicas de Lamiaceae no Laboratório de Anatomia Vegetal.

Duas plantas matrizes de cada espécie foram cultivadas em vasos com

30 cm de diâmetro, contendo terra como substrato, mantidos em casa-de-

Vegetação, de março de 2005 a março de 2007, com umidade relativa de

aproximadamente 70% e temperatura controlada de 25 - 30 ºC.

Coletou-se em tubos de polipropileno (2 mL) aproximadamente 150 mg

de folhas jovens (último par de folhas expandidas) das quatro espécies de

Plectranthus e das diferentes localidades (Tabela 1), as quais foram

armazenadas em ultrafreezer a -80 °C, até o processamento das amostras,

para extração de DNA.

Tabela 1- Espécies de Plectranthus utilizadas nas análises de similaridade

genética e seus respectivos locais de coleta

Espécie Fonte do material Código

P. grandis

Pelotas/RS PgPel

P. grandis

Florianópolis/SC PgFlo

P. neochilus

Pelotas/RS PnPel

P. neochilus

Porto Alegre/RS PnPOA

P. amboinicus

Pelotas/RS PaPel

P. barbatus

Pelotas/RS PbPel

P. barbatus

Porto Alegre/RS PbPOA

P. barbatus

Passo Fundo/RS PbPF

P. barbatus

Reserva Indígena de Passo Fundo/RS PbRIPF

P. barbatus

Florianópolis/SC PbFlo

3.1.2 Extração de DNA

O DNA genômico foi extraído de folhas previamente isoladas, utilizando

o método CTAB 2%, conforme descrito por Doyle & Doyle (1987). Cerca de

150 mg de cada amostra foi macerada em cadinho contendo nitrogênio líquido

e, logo após, transferidas para tubos de microcentrífuga de 2 mL, onde foi

adicionado 900 µL de tampão de extração (CTAB 2% e 1% de β-mercaptanol),

agitando até homogeneizar a amostra, seguida da incubação em banho-maria

a 65 ºC por 45 min. Após as amostras terem atingido a temperatura ambiente,

foi adicionado igual volume (900 µL) de clorofórmio:álcool isoamílico (C:IA,

24:1), agitando por 5 min. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a

uma velocidade de 12.000 rpm por 10 min; aproximadamente 700 µL do

sobrenadante foram transferidos para um novo tubo de 1,5 mL. Em seguida, foi

adicionado igual volume (700 µL) de etanol gelado (-20 ºC) e as amostras

foram suavemente agitadas até a visualização do pellet. As amostras foram

novamente centrifugadas a 12.000 rpm para precipitação do DNA e o

sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado com 500 µL de tampão

de lavagem por 20 min, seguido de uma rápida lavagem com 200 µL de etanol

absoluto. O material ficou em câmara de fluxo laminar exposto à temperatura

ambiente até a completa evaporação do etanol. O pellet foi ressuspenso com

100 µL de TE pH 8,0 contendo RNAse (10 µL mL

-1

) e incubado a 37 ºC, por

1 h. Foi realizada uma segunda etapa de extração, onde foi adicionado 400 µL

de CTAB 2% e após homogeneizar a reação foi acrescentado 700 µL de C:IA,

repetindo todo o processo de centrifugação e purificação do DNA, conforme

descrito acima, sendo que o pellet final foi diluído em água MilliQ autoclavada.

A quantificação do DNA foi realizada após a eletroforese em gel de

agarose 0,8%, comparando a intensidade das bandas com marcador λ

DNA/Hind III, na concentração de 0,5 µg µL

-1

e, posteriormente, diluído em

água MilliQ autoclavada para a concentração de trabalho de aproximadamente

10 ng µL

-1

, para ser utilizado na reação de PCR.

3.1.3 Amplificação do DNA pela técnica de RAPD (Randomly

Amplified Polymorphic DNA)

Inicialmente foram realizada reações de PCR para o screening com

primers de RAPD utilizando DNA de P. grandis (Figura 1). Os primers foram

selecionados em função da nitidez e número das bandas e estes tiveram a

reação de amplificação por RAPD repetidas para as demais espécies. Foi

utilizado um total de 36 primers, sendo eles: decâmeros dos kits da Operon –

OPX (01 ao 20), OPA (01 e 07), OPAC (07, 16 e 19), OPB (01, 05, 18, 19 e

20), OPF (07 e 19), OPI07 e da British Columbia University – UBC (50, 53,

410).

Figura 1- Reação de RAPD realizada para o

screening dos primers, utilizando DNA do P.

grandis (20 ng µL

-1

). M - marcador 100pb, 1–20

- primers OPX01 à OPX20, B - prova em

branco.

As reações de amplificação foram conduzidas em um aparelho

termociclador de marca MJ Research, Inc, modelo PTC-1000 (Programmable

Thermal Controller) com o seguinte perfil térmico: o primeiro ciclo de 94 ºC por

2 min e 30 s, 36 ºC por 30 s e 72 ºC por 2 min; segundo ciclo repetido por 19

vezes, a 94 ºC por 20 s, 36 ºC por 15 s, 45 ºC por 15 e 72 ºC por 2 min; o

terceiro ciclo a 94 ºC por 30 s, 36 ºC por 15 s, 45 ºC por 45 s e 72 ºC por 2 min

(repetido 18 vezes), e para finalizar um único ciclo de 72 ºC por 10 min.

As reações foram realizadas em tubos de polipropileno de 0,5 mL e o

mix para as reações de PCR tiveram um volume final de 25 µL contendo:

14,5 µL de água MilliQ estéril, 2,5 µL de Tampão 10X (10mM Tris-HCl pH 9,5,

50 mM KCl), 1 µL de Magnésio (MgCl

50 mM), 1,8 µL de dNTPs (2,5 mM),

3 µL de cada primer (10 µM), 0,2 µL de Taq DNA polimerase –Invitrogen

(5 U µL

-1

) e 2 µL de DNA genômico (10 ng µL

-1

). Para evitar a evaporação

durante os ciclos do PCR, foi adicionada uma gota de óleo mineral em cada

tubo de reação.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 B

A reprodutibilidade dos produtos de amplificação foi testada utilizando

DNA proveniente de duas extrações distintas para cada uma das espécies.

Os fragmentos de DNA amplificados com os primers do RAPD foram

separados por eletroforese horizontal em gel agarose 1,5%, a 65 V por cerca

de 90 min. Após a corrida eletroforética o gel foi submetido a um banho de

brometo de etídio (5 µg mL

-1

), durante 40 min. Posteriormente, o gel foi

visualizado na luz UV e fotodocumentado com auxílio de um sistema de

fotodocumentação, modelo E-BOX-100 – marca Vilber Lourmat.

Os fragmentos das reações de PCR foram classificados como presentes

(1) e ausentes (0), formando uma matriz de dados binários. Para o cálculo da

similaridade genética, foi utilizado o coeficiente de Dice (Nei & Li, 1979). Com

base na matriz de similaridade, a análise de agrupamento foi realizada pelo

método das distâncias genéticas médias (UPGMA – Unweighted Pair-Group

Method with Arithmetic Means) para posterior elaboração do dendrograma com

auxílio do software NTSYSpc versão 2.1 (Rohlf, 2000). Os dados de

agrupamento foram utilizados para o cálculo de uma matriz cofenética, a fim de

verificar a representatividade do dendrograma em relação aos dados de

similaridade, medido pelo coeficiente de correlação (r). Além disso, com a

utilização do programa computacional Winboot, a matriz com os dados binários

foi utilizada para a análise de Bootstrapping (com 1000 replicações), buscando

inferir a confiança de cada agrupamento representado graficamente no

dendrograma.

3.2 Avaliação do teor de óleo essencial de quatro espécies do gênero

Plectranthus

As análises foram conduzidas segundo metodologia utilizada por

Barbosa (2005), no Laboratório de Metabolismo Vegetal, do Departamento de

Botânica, no Instituto de Biologia, da Universidade Federal de Pelotas

(DB/IB/UFPel).

3.2.1 Material vegetal

As mudas das quatro espécies de Plectranthus foram propagadas por

estaquia e cultivadas em casa-de-vegetação com umidade relativa de

aproximadamente 70% e temperatura controlada de 25 - 30 ºC, por três meses,

aproximadamente, até fornecerem quantidade de material suficiente para o

estabelecimento do experimento.

As plantas foram coletadas entre 8 e 9 horas da manhã, selecionando-

se os ramos mais jovens e sadios. Imediatamente, foram eliminadas as folhas

doentes ou atacadas por insetos. Em seguida foi realizado o desfolhamento

dos ramos, segundo metodologia utilizada por (Barbosa, 2005).

3.2.2 Determinação do teor de água

Para cada uma das quatro espécies, amostras de 10 g de folhas recém

colhidas foram secas em estufa a 65 – 70 ºC, por um período de 72 h ou até

estabilizar a massa seca, sendo realizadas três repetições de determinação da

matéria seca para cada uma das repetições da extração de óleo. A quantidade

de água das folhas frescas das plantas analisadas foi determinada calculando

a diferença entre a matéria fresca e seca em 100 g de massa fresca expressas

em porcentagem em base úmida (% b.u.), as médias foram submetidas a

análise de variância com nível de 0,05 de probabilidade de erro.

3.2.3 Extração, separação e quantificação do óleo essencial

A extração do óleo essencial das quatro espécies de Plectranthus foi

realizada por hidrodestilação, utilizando o aparelho Clevenger adaptado a um

balão de fundo redondo de 1 L (Figura 2A), onde foi colocado 100 g de folhas

frescas submersas em 500 mL de água destilada, com aquecimento mantido

na temperatura mínima necessária à ebulição. Com o objetivo de facilitar a

extração, as folhas foram cortadas transversalmente a cada 1 cm. O tempo de

extração foi de cinco horas, contados a partir do momento da ebulição, o qual

foi determinado através de testes preliminares. Durante a extração foram

coletadas alíquotas de 10 mL a cada hora, para não ocorrer o refluxo do óleo.

Na última coleta, após as cinco horas, a coluna de extração do Clevenger foi

lavada com solvente (pentano) para aproveitar os resíduos da amostra.

O material coletado durante a extração foi colocado em um funil de

separação de 500 mL (Figura 2B), onde o óleo essencial foi separado da fase

aquosa utilizando pentano (10 mL) como solvente extrator. Este processo foi

repetido por três vezes a fim de evitar perda de material.

A fração orgânica (óleo + solvente) coletada em um erlenmeyer 100 mL

foi tratada com sulfato de magnésio anidro (MgSO

) em excesso até que não

se formassem mais colóides e a solução ficasse turva, para a retirada da água

remanescente. A seguir, a solução foi filtrada para um frasco âmbar e deixada

à temperatura ambiente para evaporação do solvente. Após, com auxílio de

uma pipeta Pasteur, o material foi transferido para um frasco de 10 mL

previamente pesado. Este foi exposto às mesmas condições para total

evaporação do pentano, verificado ao atingir massa constante, atestando a

evaporação total do solvente.

A quantificação do óleo essencial foi realizada através de pesagem em

balança analítica, com precisão de 0,0001 g. O conteúdo do óleo essencial foi

quantificado por material vegetal seco (100 g mL

-1

) e expresso em

porcentagem de base seca (% b.s.). Foram realizadas três extrações de cada

uma das espécies de interesse.

Após a quantificação, os recipientes contendo os óleos essenciais foram

vedados com parafilme, envoltos com papel alumínio e armazenados em ultra-

freezer a -80 ºC, para posteriormente serem analisados qualitativamente por

cromatografia gasosa.

Figura 2– Aparelho Clevenger acoplado a um balão de fundo

redondo de 1 L utilizado para extração de óleo essencial por

hidrodestilação (A) e funil de separação de 100 mL utilizado para

purificar o óleo essencial através e lavagens com solvente (B).

3.3 Estabelecimento in vitro de três espécies do gênero Plectranthus

Foram realizados dois experimentos, em épocas diferentes, para

estabelecimento das plantas in vitro, tendo em vista as baixas respostas

obtidas.

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura Tecidos

de Plantas, do Departamento de Botânica, no Instituto de Biologia, da

Universidade Federal de Pelotas (LCTP/DB/IB/UFPel).

3.3.1 Material Vegetal

O material vegetal foi solicitado em hortos botânicos, devidamente

identificado, procurando selecionar plantas jovens e sadias, sem indícios de

doenças ou contaminantes. Mudas de P. barbatus e P. neochilus foram

adquiridas no Instituto Zoobotânico de Porto Alegre, enquanto que as de P.

grandis foram gentilmente cedidas pelo Sr. Alésio dos Passos Santos da

Farmácia Natureza (Florianópolis/SC). Foram preparadas exsicatas do material

de estudo e as identificações foram confirmadas com o auxílio de uma lupa

através de chaves específicas da família Lamiaceae.

As mudas das plantas foram cultivadas em casa-de-vegetação com

umidade relativa de aproximadamente 70% e temperatura controlada de 25 -

30 ºC, até fornecerem quantidade de material suficiente para o estabelecimento

do experimento, cerca de dois a três meses.

3.3.2 Desinfestação do material vegetal para inoculação in vitro

Brotações das plantas foram coletadas em casa-de-vegetação, levadas

para o laboratório e lavadas em água corrente. Posteriormente os ramos foram

selecionados tendo suas folhas removidas e seccionados de forma a isolar

cada segmento nodal com duas gemas axilares. Este material foi imerso e

mantido em água destilada sob agitação mecânica por 15 minutos. A seguir,

em câmara de fluxo laminar, o material vegetal foi imerso em álcool 70% por 20

segundos e lavado três vezes com água esterilizada. Em seguida, submetido a

um banho de hipoclorito de sódio 1% com três gotas de tween por 20 minutos,

sob agitação mecânica. Na câmara de fluxo laminar, foi novamente enxaguado

com água esterilizada, para posterior isolamento dos explantes e inoculação no

meio de cultivo.

Foram utilizados, como fonte de explantes, na etapa de estabelecimento,

gemas axilares, no primeiro experimento e meristemas no segundo.

3.3.3 Meio de cultivo para estabelecimento de gemas e meristemas

O meio básico utilizado para o estabelecimento de gemas axilares

(primeiro experimento) foi o meio formulado por Murashige & Skoog (1962),

conhecido como MS, com adição de 30 g L

-1

de sacarose e 7 g L

-1

de ágar.

Foram inoculadas, sob condições assépticas em fluxo laminar, 50 gemas de

cada uma das brotações de P. barbatus, P. neochilus e P. grandis.

Para o estabelecimento dos meristemas (segundo experimento) foi

utilizado o meio especial para meristema que é constituído dos sais básicos do

meio MS acrescido de 0,1 mg L

-1

de BAP (6-Benzilaminopurina), 0,01 mg L

-1

ANA (Ácido α-naftalenoacético) e 0,1 mg L

-1

de AG

(Ácido giberélico).

Neste experimento foram utilizados 50 meristemas de cada uma das

brotações de P. grandis e P. barbatus, com a finalidade de estabelecer in vitro

um maior número de plantas, tendo em vista a falta de resposta obtida a partir

de gemas (primeiro experimento).

Para ambos os meios, o pH foi ajustado para 5,8 antes da adição do

ágar, sendo em seguida vertidos (10 mL) em tubos de ensaio e esterilizados

em autoclave sob pressão de 1,5 atm, a 121 °C, por 20 minutos.

Os tubos de ensaio contendo os explantes foram mantidos em sala de

crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2 °C, submetidos a uma

condição de escuro por sete dias, a fim de evitar a oxidação. Após este

período, foram expostos a uma densidade de fluxo de fótons de 40 µmol m

-2

-1

provida por lâmpadas fluorescentes branca-frias, com fotoperíodo de 16 horas

de luz, por 30 dias. Cada experimento de estabelecimento foi repetido por duas

vezes.

As plantas sobreviventes foram multiplicadas em meio MS através de

segmentos nodais de aproximadamente 1 cm, contendo duas gemas axilares,

como fonte de explante, permanecendo por 40 dias de subcultivo.

3.3.4 Meios alternativos para estabelecimento do P. grandis e P.

barbatus

A fim de estabelecer uma condição de cultivo in vitro de P. grandis e P.

barbatus, por sofrerem oxidações e não terem fornecido material suficiente

para micropropagação em nenhum dos tratamentos anteriores, tais espécies

foram submetidas a um novo experimento de estabelecimento (terceiro

experimento).

Como fontes de explante foram utilizadas 80 gemas de ambas as

espécies, devidamente desinfestadas, isoladas de plantas mantidas em casa-

de-vegetação com temperatura (25 - 30ºC) e umidade (70%) controladas.

Foram utilizados como meios básicos para multiplicação das gemas os

meios MS e o WPM - Wood Plant Media (Lloyd & McCown, 1980) íntegros e

com ¾ da força de seus sais, combinados com duas concentrações de

sacarose (30 e 50 g L

-1

). Cada um dos oito tratamentos foi suplementado com

50 mg L

-1

de ácido cítrico e 40 mg L

-1

de cisteína, como antioxidante. O pH foi

ajustado para 5,8 antes da adição do ágar. Cerca de 10 mL de cada meio de

cultura foi vertido em tubos de ensaio, os quais foram em seguida esterilizados

em autoclave sob pressão de 1,5 atm, a 121 °C, por 20 minutos.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, constituído

de um esquema fatorial 4x2, com dez repetições, sendo cada uma,

representada por um tubo de ensaio contendo uma gema, totalizando 80

gemas, para cada uma das duas espécies.

A inoculação foi conduzida em condições assépticas em fluxo laminar e

os tubos de ensaio foram mantidos em sala de crescimento com temperatura

controlada de 25 ± 2 °C, submetidos a uma condição de escuro por sete dias a

fim de evitar a oxidação. Após este período, foram expostos a uma densidade

de fluxo de fótons de 40 µmol m

-2

-1

, provida por lâmpadas fluorescentes

branca-fria com fotoperíodo de 16 horas de luz, por 40 dias.

3.3.5 Avaliações dos experimentos de estabelecimento in vitro

Para P. neochilus foram realizadas, após 40 dias de subcultivo em meio

MS (primeiro experimento), avaliações da média da altura (cm), do número de

gemas e do comprimento das raízes (cm) de quatro repetições, sendo cada

uma representada por um frasco contendo quatro explantes.

Tendo em vista as baixas respostas obtidas in vitro para as espécies P.

grandis e P. barbatus somente foram possíveis ser analisadas, ao final do

primeiro e segundo experimento, a porcentagem de contaminação e de

oxidação dos explantes.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análise da similaridade genética de quatro espécies do gênero

Plectranthus

4.1.1 Caracterização molecular

A extração do DNA genômico foi realizada com sucesso pelo método

utilizado. Os primers foram selecionados em função da nitidez e número das

bandas fornecidas pelo screening.

Dos 36 primers testados, em quatro não se obteve amplificação (OPX04,

OPX10, OPX11 e OPAC16), e outros cinco por apresentarem bandas fracas

(OPX02, OPX03, OPX15, OPX19 e UBC50) também não foram utilizados para

a realização das análises. Dos 27 primers restantes, todos apresentaram

polimorfismo conforme pode ser observado na Tabela 2, os quais produziram

um total de 284 perfis. Destes apenas 29 (10,21%) foram monomórficos e 255

(89,79%) foram polimórficos. O número médio de polimorfismo apresentado

para cada primer foi de 9,44. Alguns produtos polimórficos estão apresentados

na Figura 3, onde pode ser observada ainda uma banda característica do

primer OPX20, de aproximadamente 1350pb, a qual permite diferenciar

P. amboinicus dos demais genótipos, além de duas bandas características do

primer OPX19, que diferenciam P. grandis de P. barbatus (±1350 e 700pb).

Tabela 2- Polimorfismo detectado com os primers selecionados para as

reações de RAPD das quatro espécies do gênero Plectranthus

Número de fragmentos amplificados

Primer

Monomórficos Polimórficos Total

OPX01 2 15 17

OPX05 0 6 6

OPX06 0 13 13

OPX07 0 17 17

OPX08 0 10 10

OPX09 1 12 13

OPX12 3 18 21

OPX13 1 2 3

OPX14 1 7 8

OPX16 0 6 6

OPX17 0 8 8

OPX18 2 10 12

OPX20 0 11 11

OPA01 3 8 11

OPA07 2 7 9

OPAC07 2 7 9

OPAC19 2 6 8

OPB01 0 13 13

OPB05 1 8 9

OPB18 2 11 13

OPB19 1 10 11

OPB20 1 7 8

OPF07 0 11 11

OPF19 1 5 6

OPI07 3 12 15

UBC53 1 8 9

UBC410 0 7 7

Total 29 255 284

Figura 3- Produtos da amplificação com marcadores do tipo

RAPD em quatro espécies de Plectranthus, gerados pelos

primers OPB20 e OPX19, respectivamente. B – amostra em

branco, sem adição de DNA; M – marcador molecular λ 100pb,

Pg – P. grandis, Pn – P. neochilus, Pa – P. amboinicus, Pb – P.

barbatus. Demais abreviações são correspondentes a

localização de cada genótipo (Tabela 1).

Considerando somente o perfil eletroforético das plantas de P. barbatus

de diferentes localidades, pode ser observado polimorfismo em oito dos 27

primers testados, fornecendo um total de 92 bandas, destas, 11 (11,96%)

foram polimórficas e 81 (88,04%) monomórficas (Tabela 3). Alguns produtos

polimórficos estão apresentados na Figura 4.

M Pg Pg Pn Pn Pa Pb Pb Pb Pb Pb B B Pg Pg Pn Pn Pa Pb Pb Pb Pb Pb M

Pel Flo Pel POA Pel Pel POA PF RIPF Flo Pel Flo Pel POA Pel Pel POA PF RIPF Flo

±1350pb

±700pb

Tabela 3- Polimorfismo detectado com primers RAPD somente entre genótipos

do P. barbatus provenientes de cinco diferentes locais

Número de fragmentos amplificados

Primer

Monomórficos Polimórficos Total

OPX08 9 1 10

OPX09 12 1 13

OPX12 20 1 21

OPX20 7 4 11

OPAC07 8 1 9

OPB05 8 1 9

OPB20 7 1 8

OPF07 10 1 11

Total 81 11 92

Figura 4- Produtos da amplificação de

RAPD para a espécie P. barbatus

gerados pelo primer OPX09. B - prova em

branco, M - marcador molecular λ 100pb,

Pg – P. grandis, Pn – P. neochilus, Pa –

P. amboinicus, Pb – P. barbatus. Demais

abreviações são correspondentes ao

local de coleta do material (Tabela 1).

B Pg Pg Pn Pn Pa Pb Pb Pb Pb Pb M

Pel Flo Pel POA Pel Pel POA PF RIPF Flo

Conforme pode ser observado no dendrograma (Figura 5) verificou-se

uma elevada similaridade, principalmente entre os genótipos do P. barbatus.

Segundo Paton et al. (2004), por causa da grande similaridade dos caracteres

morfológicos, algumas espécies de Plectranthus são difíceis de serem

diferenciadas das espécies do mesmo gênero e também entre os gêneros

estreitamente correlacionados.

O uso de marcadores do tipo RAPD permitiu uma clara separação entre

as quatro espécies de Plectranthus analisadas (Figura 5). Com a utilização de

27 marcadores RAPD, obteve-se uma similaridade genética média de 53% e,

na análise entre os dados da matriz de similaridade e da matriz cofenética,

obteve-se um valor de correlação (r) de 0,99, demonstrando elevada

representatividade dos dados de similaridade genética no dendrograma.

De maneira geral, também se obteve altos valores de bootstrapping em

quase todos os nós do dendrograma, sendo um indicativo de que o

dendrograma é consistente e realmente existe uma clara separação entre as

diferentes espécies do gênero Plectranthus analisadas. Os menores valores de

bootstrapping foram verificados entre P. barbatus de Pelotas e P. barbatus de

Florianópolis (49,1) e entre P. barbatus de Passo Fundo e P. barbatus da

Reserva Indígena de Passo Fundo (51,7) (Figura 5).

Figura 5- Dendrograma de similaridade genética obtido pelo método UPGMA

com 27 primers RAPD, a partir de genótipos de Plectranthus spp. provenientes

de várias localidades da Região Sul do Brasil (SMG - similaridade genética

média de 53%).

Bootstrapping.

Muito embora Plectranthus spp. seja alógama, era de se esperar

elevada variabilidade genética intra e interespecífica. Pela inferência no

dendrograma (Figura 5), embora seja possível observar uma clara separação

entre as espécies estudadas, verifica-se que P. grandis e P. barbatus são mais

próximos geneticamente, com similaridade em torno de 77%, indicando assim

uma possível origem comum. Por outro lado, o mesmo se verifica para P.

amboinicus e P. neochilus, que apresentaram similaridade genética em torno

de 80% entre si, porém apresentam baixa similaridade em relação às demais

espécies analisadas (aproximadamente 12%) (Quadro 1 - Anexo).

Segundo Lorenzi & Matos (2002), P. barbatus e P. grandis são muito

semelhantes, por isso são bastante confundidos. Lukhoba et al. (2006)

realizaram uma revisão etnobotânica com 62 espécies de Plectranthus,

constatando que cerca de 30% das citações literárias consideram P. grandis

uma sinonímia de P. barbatus, considerando ambas as espécies como se

fossem apenas uma. No presente trabalho obteve-se uma clara separação das

duas espécies, o que corrobora com a classificação realizada por Passinho et

al. (2000), que através da técnica de AFLP (Amplified Fragment Lenth

Polymorphism) demonstrou a existência de variabilidade genética entre ambas

as espécies, atestando sua autenticidade.

Os marcadores de DNA apresentam vantagens e superam muitos dos

limites dos marcadores morfológicos, confirmando que a técnica de RAPD gera

polimorfismo em grande número, além de não sofrerem influência de fatores

ambientais e estádio de desenvolvimento, permitindo que a planta seja

identificada em qualquer estádio do ciclo vegetativo (Borém, 1998; Sansavini,

1998).

Vinte e quatro primers permitiram diferenciar as espécies de P. grandis e

P. barbatus, apresentando um total de 164 bandas, onde 37,20% são

polimórficas e 62,80% monomórficas, sendo que, destes, o que apresentou

maior polimorfismo foi o primer OPX01, com oito bandas polimórficas,

enquanto que 32,84% das 134 bandas geradas a partir de 21 primers RAPD

possibilitaram a diferenciação entre P. neochilus e P. amboinicus.

Paton et al. (2004), através da análise filogenética de regiões trnL - trnF

e rps16, elaboraram um dendrograma que une as espécies de P. barbatus e P.

amboinicus com bootstrap de 67%. Diferentemente, no presente trabalho

obteve-se uma similaridade genética média de 53%, onde as quatro espécies

ficaram claramente separadas num primeiro subgrupo representado por P.

grandis e P. barbatus, enquanto que P. neochilus e P. amboinicus se localizam

no segundo subgrupo (Figura 5). Essa diferença de agrupamento está

diretamente relacionada ao tipo de abordagem genômica, uma vez que a

análise de RAPD detecta locos aleatórios dispersos por todo o genoma, no

trabalho de Panton et al. (2004) foram analisadas seqüências específicas, as

quais, em se tratando de espécies relacionadas, podem conduzir a esse tipo de

classificação.

De acordo com Casas et al. (1999), os marcadores moleculares são

muito utilizados tanto para estudar a variabilidade genética entre espécies

quanto para identificar a similaridade entre diferentes acessos.

No presente trabalho, foi observado uma alta similaridade entre os

genótipos da espécie P. barbatus em relação aos diferentes locais de coleta

(próximo a 100%). A maior similaridade genética foi registrada entre as plantas

coletadas em Passo Fundo (PF) e na Reserva Indígena de Passo Fundo

(RIPF) com 99,61%, provavelmente devido à proximidade das regiões,

enquanto que a maior distância genética foi observada para os espécimes

coletados em Pelotas e Reserva Indígena de Passo Fundo (96,10%) (Figura 5).

Embora seja estimado que o número mínimo de primers polimórficos,

necessários para análise de variabilidade genética usando o coeficiente de

Dice seja 12, possivelmente com um maior número de primers, além dos 27

utilizados, poderá ser detectado maior variabilidade genética, principalmente

entre os genótipos de P. barbatus (Valmor Bianchi, comunicação pessoal).

Apesar da técnica RAPD ser considerada por muitos pesquisadores

como sendo de baixa repetibilidade dos resultados, quando utilizada

corretamente e comparada a outras técnicas moleculares, conforme observado

em diversos trabalhos com outros grupos de plantas, ela mostra-se eficiente no

estudo da variabilidade genética. No presente trabalho demonstrou-se que a

técnica RAPD é de grande aplicabilidade para estudo de variabilidade genética

das espécies de Plectranthus. Além do mais, essa técnica é mais rápida, mais

simples, requer menor quantidade de DNA e é mais barata, quando comparada

às outras técnicas moleculares, conforme já mencionada por Upadhyay et al.

(2004).

Embora no presente trabalho tenha sido detectado baixa variabilidade

entre genótipos da mesma espécie, a técnica de RAPD foi eficiente para a

diferenciação das mesmas, podendo ser útil também para mapear

características de interesse ao melhoramento. De acordo com Shimada et al.

(1999), análises de RAPD são capazes de revelar polimorfismo do DNA até

mesmo de espécies altamente relacionadas.

Por se tratar de espécies com grande potencial de aproveitamento na

produção de fármacos, a variabilidade existente entre as diferentes espécies de

Plectranthus pode ser utilizada para seleção de genótipos com características

melhoradas. Entretanto, para que isso seja possível, um estudo mais apurado

sobre a variabilidade com maior número de marcadores se faz necessário, bem

como deverão ser conduzidos trabalhos sobre a biologia reprodutiva destas

espécies para verificar se há possibilidade de transferência de genes entre

estas espécies pelo processo de melhoramento assistido.

4.2 Avaliação do teor de óleo essencial de quatro espécies do gênero

Plectranthus

4.2.1 Determinação do teor de água

Houve diferença estatística em relação ao teor de água nas folhas das

espécies analisadas, sendo que a maior média foi apresentada para o P.

neochilus, com 93,12% b.u., não diferindo estatisticamente do P. amboinicus e

a menor média, de 87,16% b.u. para P. barbatus (Figura 6). Estes resultados

foram de acordo com o esperado, já que as espécies P. neochilus e P.

amboinicus se assemelham morfologicamente, ambas possuem folhas

pequenas e suculentas, com aproximadamente 6 cm de comprimento.

Enquanto que o as outras duas espécies, são bastante confundidas entre si,

possuindo folhas maiores (chegando a 12 cm de comprimento) e mais largas

(com aproximadamente 10 cm de largura), além de serem menos espessas

que as primeiras.

Teor de água (% b.u)

P. neochilus P. amboinicus P. grandis P. barbatus

Figura 6- Determinação do teor de água por massa

fresca de plantas de Plectranthus.

As médias foram

comparadas estatisticamente pelo teste de Tukey em nível

de 5% de probabilidade.

4.2.2 Extração, separação e quantificação do óleo essencial

A partir dos resultados analisados, foi observada diferença significativa,

ao nível de 5% de erro, em relação à quantificação do óleo essencial para as

espécies de interesse (Figura 7). P. amboinicus possui maior teor de óleo

essencial (0,43% b.s.), não diferindo apenas do P. neochilus, enquanto que P.

grandis apresentou os menores valores (0,09% b.s.).

Como esperado, as espécies que apresentaram maior teor de água,

possuem menor matéria seca e, consequentemente menor concentração de

óleo essencial por grama de massa seca. O comportamento diferenciado entre

as espécies é intrínseco das características morfológicas. Os dois principais

grupos formados pela da análise de marcadores moleculares são confirmados

através deste experimento, onde foi possível observar que a concentração de

óleos essenciais por grama de massa seca é menor para o primeiro grupo,

composto por P. grandis e P. barbatus, e maior para o segundo, P. neochilus e

P. amboinicus, demonstrando a existência de maior proximidade e similaridade

entre as espécies de cada grupo.

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Teor de óleo essencial

(% b.s.)

P. amboinicus P.neichilus P. barbatus P. grandis

Figura 7- Teor de óleo essencial extraído de folhas

frescas de quatro espécies de Plectranthus.

As médias

foram comparadas estatisticamente pelo teste de Tukey em

nível de 5% de probabilidade.

De acordo com Abdel-Mogib (2002), a constituição química das espécies

do gênero Plectranthus é pouco conhecida, sendo que estas são ricas em

P. neochilus

óleos essenciais, possuindo em sua constituição teores abaixo de 0,5% de óleo

volátil por base seca, concordando com os baixos valores encontrados no

presente trabalho.

Os maiores constituintes dos óleos essenciais deste gênero são os

mono e sesquiterpenos. Cerca de 140 diterpenóides já foram identificados, de

glândulas foliares, para espécies de Plectranthus (Abdel-Mogib, 2002).

Pode ser observado um comportamento similar quanto ao teor de água

e quantidade de óleo essencial (Figuras 6 e 7). Considerando que os

constituintes dos óleos essenciais das quatro espécies em estudo sejam

semelhantes, tanto na composição quanto na sua concentração, sugere-se que

P. amboinicus é a espécie mais indicada para o cultivo, por apresentar menor

massa seca e maior concentração de óleo essencial.

4.3 Estabelecimento in vitro de três espécies do gênero Plectranthus

4.3.1 Estabelecimento de gemas e meristemas in vitro

A desinfestação com hipoclorito de sódio foi efetiva, pois reduziu

consideravelmente a contaminação por fungos e bactérias na primeira semana

de incubação das gemas de P. grandis, P. barbatus e P. neochilus (primeiro

experimento). Após 30 dias de cultivo no meio MS houve oxidação de quase a

totalidade das gemas para as espécies de P. grandis (95%) e P. barbatus

(92%), enquanto que 70% das gemas do P. neochilus foram bem sucedidas no

estabelecimento in vitro em meio MS.

Esta diferença de comportamento das espécies em relação à oxidação

pode ser decorrente de uma maior lignificação dos tecidos de P. grandis e P.

barbatus em relação ao P. neochilus. De acordo com Andrade et al. (2002), a

oxidação ocorre em função da liberação de compostos fenólicos que se

concentram no interior dos frascos quando a planta é cultivada in vitro, os quais

são precursores da síntese de lignina e liberados dos tecidos perante injúria ou

senescência. O acúmulo de polifenóis e produtos de oxidação, como melanina,

suberina, lignina, cutina e calose, em torno da superfície excisada, modifica a

composição do meio de cultivo, assim como a absorção de metabólitos. Os

polifenóis são derivados do metabolismo secundário, os quais exercem

importante papel no metabolismo das espécies e, ainda atuam na defesa

contra predadores e microrganismos (Teixeira, 2001).

As gemas sobreviventes do primeiro experimento, após 30 dias de

cultivo, foram transferidas para frascos de vidro contendo cerca de 40 mL de

meio MS semi-sólido a fim de tentar a multiplicação. Após 40 dias de

subcultivo, apenas o P. neochilus foi multiplicado com sucesso no meio MS

sem necessidade de tratamento adicional (Figura 8A). Já as outras duas

espécies, tiveram o desenvolvimento prejudicado (Figura 8B e 8C) e não

apresentaram material suficiente para experimento de micropropagação.

Figura 8- Aspecto das plantas de P. neochilus (A), P. barbatus

(B) e P. grandis (C) após o estabelecimento in vitro de gemas

axilares em meio MS por 30 dias e subcultivados em meio MS

por 40 dias.

As plantas de P. neochilus foram multiplicadas com sucesso, através de

segmentos nodais, em meio MS sem adição de nenhum tipo de regulador de

crescimento. Após 40 dias de subcultivo foi observada uma altura média de 10

cm, comprimento médio das raízes de 14 cm e 13 gemas em média por planta.

Após 30 dias de cultivo dos meristemas de P. grandis e P. barbatus em

meio MS suplementado com 0,1 mg L

-1

de BAP, 0,01 mg L

-1

de ANA e 0,1 mg

-1

de AG

(segundo experimento)

houve 100% de oxidação para ambas as

espécies. Segundo Flores et al. (1998), a oxidação fenólica tem sido um dos

principais problemas na fase de estabelecimento de cultivos in vitro. Estes

compostos fenólicos são oxidados pelas enzimas polifenases produzindo

substâncias tóxicas, as quais atuam inibindo o crescimento dos explantes,

podendo causar a morte, além de escurecer o meio de cultura (Sato et al.,

2001).

4.3.2 Estabelecimento do P. grandis e P. barbatus em meios

alternativos

Após a primeira semana de cultivo no escuro, para evitar a oxidação dos

explantes, nos meios MS e WPM íntegros e com três quartos da concentração

de seus sais, combinados com 30 e 50 g L

-1

de sacarose, para o

estabelecimento in vitro de P. grandis e P. barbatus, houve uma reduzida taxa

de contaminação por fungos e bactérias com uma média de 12,5% para P.

grandis e 15% para o P. barbatus (Tabela 4) demonstrando que o sistema de

desinfestação com hipoclorito de sódio 1% foi suficiente (terceiro experimento).

Tabela 4- Porcentagem de contaminação das gemas de P. grandis e P.

barbatus após sete dias de cultivo nos diferentes meios de cultura

Contaminação por fungos e

bactérias (%)

Tipo de meio de

cultura

Concentração de

sacarose (g L

-1

)

P. grandis P. barbatus

MS 30 10 0

MS 50 10 30

MS ¾ 30 0 10

MS ¾ 50 10 10

WPM 30 0 30

WPM 50 30 20

WPM ¾ 30 10 10

WPM ¾ 50 30 10

Total 12,5% 15%

Segundo Teixeira (2001), o cultivo dos explantes no escuro ou em baixa

densidade de fluxo de fótons durante as primeiras semanas da fase de

estabelecimento, pode resultar na diminuição da oxidação fenólica. O cultivo

em condições de luminosidade intermediária, mesmo após o período das

primeiras semanas da etapa de estabelecimento das culturas, contribui para

prevenir a oxidação e melhorar o crescimento dos explantes.

Ao término do experimento, após 40 dias de cultivo em câmara de

crescimento com condição de luz e temperatura controladas, houve um

elevado índice de oxidação dos explantes (Tabela 5), onde em média 52,94%

das gemas de P. grandis oxidaram e 73,53% de P. barbatus.

Tabela 5- Porcentagem de oxidação das gemas de P. grandis e P. barbatus

após 40 dias de incubação nos diferentes meios de cultura

Oxidação das gemas (%)

Tipo de meio de

cultura

Concentração de

sacarose (g L

-1

)

P. grandis P. barbatus

MS 30 55,56 50,00

MS 50 33,33 85,71

MS ¾ 30 40,00 77,78

MS ¾ 50 66,67 55,56

WPM 30 87,50 85,71

WPM 50 57,14 87,50

WPM ¾ 30 55,56 77,78

WPM ¾ 50 28,57 77,78

Total 52,94% 73,53%

Campos (2005) observou para Prunus spp. que percentuais mais

elevados de oxidação ocorrem em meios que apresentam concentrações

maiores de sais, concordando com Teixeira (2001), o qual afirma que meios de

cultivos com sais reduzidos possibilitam a redução das oxidações em explantes

de espécies lenhosas. No presente trabalho, nenhum tipo de correlação entre

os percentuais de oxidação e as concentrações de sais nos meios de cultivo foi

observado, confirmando a possibilidade da oxidação estar relacionada com a

produção de metabólitos secundários, como os compostos fenólicos

sintetizados pelas espécies em estudo.

O crescimento dos explantes foi muito baixo, a maioria desenvolveu

apenas o primeiro par de folhas com aspecto de hiperidricidade. Somente P.

grandis nos meios MS com 50 g L

-1

de sacarose e WPM ¾ com 30 g L

-1

sacarose apresentaram um bom desenvolvimento com enraizamento (Figura

9B e 9C). Para P. barbatus no meio WPM ¾ com 30 g L

-1

de sacarose, as

gemas se desenvolveram, apresentando o primeiro par de folhas verdes com

pouca oxidação na porção basal do explante (Figura 9O).

Figura 9- Aspecto das plantas de P. grandis (A-H) e P.

barbatus (I-P) após 40 dias de cultivo em meio MS e WPM

com ¾ da força de seus sais e na sua composição total,

combinados com 30 e 50 g L

-1

de sacarose, suplementados

com 50 mg L

-1

de ácido cítrico e 40 mg L

-1

de cisteína.

Para ambas as espécies de Plectranthus, a concentração de 30 g L

-1

sacarose apresentou melhores resultados, contrastando com estudos

realizados por Romano (1995) com Quercus suber L. e Nicoloso et al. (2003)

com Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, onde o aumento da concentração

de sacarose favoreceu o alongamento das plantas com maior número de

gemas, demonstrando a necessidade particular de cada espécie.

A sacarose é um carboidrato encontrado com abundância nos tecidos

vegetais, sendo sintetizado indiretamente através da fotossíntese. Quando

cultivadas in vitro, as plantas não produzem todo o açúcar necessário ao seu

crescimento, portanto, a sacarose é adicionada ao meio de cultivo (Kyte &

MS 30 g L

MS 50 g L

MS ¾ 30 g L

MS ¾ 50 g L

WPM 30 g L

WPM 50 g L

WPM ¾ 30 g L

WPM ¾ 50 g L

MS 30 g L

MS 50 g L

MS ¾ 30 g L

MS ¾ 50 g L

WPM 30 g L

WPM 50 g L

WPM ¾ 30 g L

WPM ¾ 50 g L

Kleyn, 1999). Segundo Caldas et al. (1998), a sacarose é o carboidrato mais

utilizado nos meios nutritivos por suportar elevadas taxas de crescimento para

a maioria das espécies vegetais. A concentração de sacarose comumente

utilizada no cultivo in vitro é de 30 g L

-1

, no entanto, esta condição pode variar

para cada espécie (Lakso et al., 1986).

Segundo Hartmann et al. (1997), para muitas espécies de plantas pode

ser utilizado o meio de cultura diluído, para o processo de multiplicação, sem a

necessidade de utilizar sua composição integral, reduzindo custos laboratoriais.

A utilização de meio de cultura diluído tem demonstrado bons resultados

tanto para espécies medicinais, como para outras plantas, como relatado por

Oliveira & Pasqual (1995), que testaram diferentes concentrações de meio MS

para estabelecer as condições ideais de propagação de crisântemo

(Dendranthema grandiflora Tzvelev) e recomendaram a utilização de MS ¾

com 60 g L

-1

de sacarose. De acordo com Barros & Castro (1995), o meio MS

com ¾ de seus sais e vitaminas foi o mais adequado para regeneração da

macela (Achyrocline satureoides (Lam.) D.C.), uma planta medicinal.

No presente trabalho observou-se um melhor desenvolvimento das

plantas no meio WPM diluído para ambas as espécies, concordando em parte,

com estudos feitos por Bosenbecker (2001), onde a micropropagação de

meristemas caulinares de camomila romana foi mais satisfatória em MS com

75% da concentração de seus sais e vitaminas.

O meio de cultura WPM tem sido descrito e utilizado como alternativa

para o meio MS, sua formulação foi especialmente desenvolvida para espécies

lenhosas, tendo como característica, baixas concentrações de sais (Harttmann

& Kester, 1989; Grattapaglia & Machado, 1998). Segundo Harada & Murai

(1996), o meio WPM tem concentrações de sais menores do que o MS e, desta

forma, apresentou melhores condições para a micropropagação de Prunus

mume Sciebold & Zucc.

Um dos mais importantes componentes do meio de cultura é o

nitrogênio, sendo que o MS possui em sua constituição maiores índices de

nitrogênio inorgânico enquanto que outras formulações possuem níveis mais

baixos. Algumas espécies requerem ou toleram índices mais elevados deste

elemento no meio de cultivo do que outras. O balanço entre NH

e NO

bastante crítico para a cultura de células e regeneração de plantas. No geral,

existe uma tendência de usar níveis mais baixos de NH

do que NO

nos

meios de cultura de tecido de plantas (Dixon & Gonzales, 1996).

O meio WPM possui menor concentração de sais básicos do que o MS,

sendo que a relação de amônio:nitrato é de 0,52 mM para o MS e 0,51 mM

para o WPM, e a força iônica total é de 94,25 mM e 42,39 mM,

respectivamente (McCown & Sellmer, 1987).

4 CONCLUSÕES

Através da técnica de RAPD observa-se maior similaridade genética

entre as espécies P. neochilus e P. amboinicus, seguido de P. grandis e P.

barbatus. Verifica-se também uma separação da espécie P. barbatus em

relação aos diferentes locais de coleta, sendo que a maior similaridade é

encontrada nas amostras coletadas em regiões mais próximas

geograficamente.

Em relação à quantificação de óleos essenciais há maior concentração

em P. amboinicus seguido de P. neochilus, P. barbatus e P. grandis.

Pôde ser observado que o meio MS é apropriado para o

estabelecimento e multiplicação in vitro de P. neochilus, enquanto que o meio

WPM ¾ com 30 g L

-1

de sacarose é o mais adequado para o estabelecimento

in vitro de P. grandis e P. barbatus.

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APÊNDICE

P.grandis/Pel 1.000

P.grandis/Flor 0.968 1.000

P.neochilus/Pel 0.129 0.130 1.000

P.neochilus/POA 0.113 0.113 0.979 1.000

P.amboinicus/Pel 0.110 0.111 0.800 0.812 1.000

P.barbatus/Pel 0.786 0.789 0.138 0.114 0.086 1.000

P.barbatus/POA 0.773 0.785 0.152 0.128 0.102 0.968 1.000

P.barbatus/PF 0.770 0.781 0.159 0.136 0.101 0.964 0.996 1.000

P.barbatus/RIPF 0.775 0.778 0.167 0.143 0.109 0.961 0.992 0.996 1.000

P.barbatus/Flor 0.781 0.785 0.160 0.136 0.110 0.976 0.976 0.973 0.977 1.000

Pg/Pel Pg/Flor Pn/Pel Pn/POA Pa/Pel Pb/Pel Pb/POA Pb/PF Pb/RIPF Pb/Flor

Quadro 1– Valores de similaridade genética calculados com o coeficiente de

Dice, utilizando dados gerados com 27 primers RAPD.

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