( PDF ) Análise da ação do laser em baixa intensidade sobre o processo de reparo após reimplante dentário: estudo histomorfométrico e imunoistoquímico

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Célia Tomiko Matida Hamata Saito

Célia Tomiko Matida Hamata SaitoCélia Tomiko Matida Hamata Saito

Célia Tomiko Matida Hamata Saito

Análise da ação do laser em baixa

intensidade sobre o processo de reparo

após reimplante dentário: estudo

histomorfométrico e imunoistoquímico

Araçatuba – SP

2008

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Célia Tomiko Matida Hamata Saito

Célia Tomiko Matida Hamata SaitoCélia Tomiko Matida Hamata Saito

Célia Tomiko Matida Hamata Saito

Análise da ação do laser em baixa

intensidade sobre o processo de reparo

após reimplante dentário: estudo

histomorfométrico e imunoistoquímico

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de

Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual

Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, para obtenção

do Grau de “Doutor em Odontologia” – Área de

concentração em Clínica Integrada.

Orientadora: Profa. Adjunto Sônia Regina Panzarini Barioni

Araçatuba – SP

2008

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Catalogação-na-Publicação

Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP

Saito, Célia Tomiko Matida Hamata

S158a Análise da ação do laser em baixa intensidade sobre o processo

de reparo após reimplante dentário: estudo histomorfométrico

e imunoistoquímico / Célia Tomiko Matida Hamata

Saito. - Araçatuba : [s.n.], 2008

100 f. : il. ; tab.

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de

Odontologia, Araçatuba, 2008

Orientador: Profa. Dra. Sônia Regina Panzarini Barioni

1. Avulsão dentária 2. Reimplante dentário 3. Cicatrização de

feridas 4. Terapia a laser de baixa intensidade 5. Terapia a laser

6. Imunoistoquímica

Black D2

CDD 617.6

óó

Ao meu marido Ricardo e aos meus queridos

Ao meu marido Ricardo e aos meus queridos Ao meu marido Ricardo e aos meus queridos

Ao meu marido Ricardo e aos meus queridos

filhos, Cristhiana e Fernando,

filhos, Cristhiana e Fernando,filhos, Cristhiana e Fernando,

filhos, Cristhiana e Fernando,

Que com amor, carinho e compreensão me deram

todo suporte para realização deste trabalho.

Aos meus pais Satar

Aos meus pais SatarAos meus pais Satar

Aos meus pais Sataro e Nobuko

o e Nobukoo e Nobuko

o e Nobuko,

Aos meus irmãos, Pedro, Roberto e Marcelo;

Aos meus irmãos, Pedro, Roberto e Marcelo;Aos meus irmãos, Pedro, Roberto e Marcelo;

Aos meus irmãos, Pedro, Roberto e Marcelo;

Aos meus sogros Hélio e Alice;

Aos meus sogros Hélio e Alice; Aos meus sogros Hélio e Alice;

Aos meus sogros Hélio e Alice;

Aos meus cunhados Cláudia, Gláucia, Miriam,

Aos meus cunhados Cláudia, Gláucia, Miriam, Aos meus cunhados Cláudia, Gláucia, Miriam,

Aos meus cunhados Cláudia, Gláucia, Miriam,

Nobuaki, Oscar e Zilda;

Nobuaki, Oscar e Zilda;Nobuaki, Oscar e Zilda;

Nobuaki, Oscar e Zilda;

A os meus sobrinhos Amanda, Gabriela, Guilherme,

A os meus sobrinhos Amanda, Gabriela, Guilherme, A os meus sobrinhos Amanda, Gabriela, Guilherme,

A os meus sobrinhos Amanda, Gabriela, Guilherme,

João Pedro, João Vitor, Leandro, Matheus e Rodrigo,

João Pedro, João Vitor, Leandro, Matheus e Rodrigo,João Pedro, João Vitor, Leandro, Matheus e Rodrigo,

João Pedro, João Vitor, Leandro, Matheus e Rodrigo,

Pelo apoio e carinho.

Agradecimentos Especiais

À Profa. Sônia Regina Panzarini Barioni,

À Profa. Sônia Regina Panzarini Barioni,À Profa. Sônia Regina Panzarini Barioni,

À Profa. Sônia Regina Panzarini Barioni,

Agradeço o privilégio de tê-la como orientadora.

Obrigada pela orientação deste, de muitos outros

trabalhos, pela amizade, pelo carinho e

oportunidade de trabalhar numa área que tanto

me identifiquei: a Clínica Integrada.

Minha profunda admiração pelo seu

profissionalismo, serenidade e organização.

Agradecimentos Especiais

Ao Prof. Valdir Gouveia Garcia,

Ao Prof. Valdir Gouveia Garcia,Ao Prof. Valdir Gouveia Garcia,

Ao Prof. Valdir Gouveia Garcia,

Pela participação na concepção e realização deste

trabalho, pelos ensinamentos, respeito e carinho.

Ao Prof. Tetuo Okamoto,

Ao Prof. Tetuo Okamoto,Ao Prof. Tetuo Okamoto,

Ao Prof. Tetuo Okamoto,

Pela participação e inestimável contribuição em várias

fases deste trabalho, pelo incentivo e amizade.

À Profa

À ProfaÀ Profa

À Profa.

. .

. Roberta Okamoto

Roberta OkamotoRoberta Okamoto

Roberta Okamoto

Pela contribuição em várias etapas deste trabalho.

Minha eterna gratidão, admiração e respeito.

Aos professores da disciplina de Cínica Integrada:

Aos professores da disciplina de Cínica Integrada: Aos professores da disciplina de Cínica Integrada:

Aos professores da disciplina de Cínica Integrada:

Prof.

Prof.Prof.

Prof.

Celso Koogi Sonoda,

Celso Koogi Sonoda, Celso Koogi Sonoda,

Celso Koogi Sonoda,

Profa. Daniela Atili Brandini,

Profa. Daniela Atili Brandini, Profa. Daniela Atili Brandini,

Profa. Daniela Atili Brandini,

Profa. Denise Pedrini,

Profa. Denise Pedrini, Profa. Denise Pedrini,

Profa. Denise Pedrini,

Prof. José Carlos Monteiro de Castro,

Prof. José Carlos Monteiro de Castro, Prof. José Carlos Monteiro de Castro,

Prof. José Carlos Monteiro de Castro,

Prof. Wilson Roberto Poi

Prof. Wilson Roberto PoiProf. Wilson Roberto Poi

Prof. Wilson Roberto Poi

Pela acolhida carinhosa.

Minha admiração por estarem sempre dispostos a

participar e ajudar, fazendo algo mais para tornar o

mundo um lugar melhor para todos.

À Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP, nas

pessoas do Diretor Prof. Dr. Pedro Felício Estrada Bernabé e Vice-

Diretora Profa. Dra. Ana Maria Pires Soubhia, pelas condições

oferecidas para a realização deste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, em especial ao seu

coordenador, Prof. Dr. Idelmo Rangel Garcia Júnior e todo corpo

docente, pela dedicação e empenho com que conduzem todas as suas

atividades.

Às companheiras de trabalho Cláudia Misue Kanno e Margarete Romão

Gobetti, pela amizade e por tornarem possível o desenvolvimento deste

trabalho.

À amiga Jéssica Lemos Gulinelli, pelo apoio, amizade, companheirismo

e colaboração nos diversos projetos que participamos juntas.

À minha parceira Cláudia Letícia, pelo apoio, amizade,

companheirismo, pelos conselhos e auxílio sempre.

Ao Prof. Dr. João Eduardo Gomes Filho, pela colaboração em momentos

importantes deste trabalho.

À amiga Simone Watanabe, pela amizade e auxílio essenciais neste

trabalho.

À amiga Sueli Satomi Murata, pela amizade e colaboração sempre.

Agradecimentos

À Profa. Maria Lúcia Marçal Mazza Sundfeld, pela orientação na

análise estatística deste trabalho.

Aos estagiários do Laboratório de Imunoistoquímica coordenado pela

Profa. Roberta Okamoto, pelo auxílio na realização das reações

imunoistoquímicas deste trabalho.

Às colegas da Pós-Graduação em Clínica Integrada: Carolina, Daniele,

Daniela, Elizane, Eloá, Lithiene, Luciene, Márcia, Milena e Thaís; pelo

companheirismo e amizade compartilhados.

Aos colegas de Pós-Graduação em Cirurgia, Implantodontia,

Estomatologia, Ortodontia e Prótese, pelos momentos agradáveis e troca

de experiências.

A todos os funcionários da Seção Técnica de Triagem, Emergência e

Documentação, pela amizade e apoio.

Aos funcionários do Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada, em

especial: Antonia, Bernadete, Claudiomiro, Cleide, Dirce, Gilmar, Odair

e Paulo; pela amizade e colaboração na realização deste trabalho.

A todos os funcionários do Biotério Central da Faculdade de

Odontologia do Câmpus de Araçatuba – UNESP, pelo auxílio no

manuseio dos animais deste trabalho.

Ao Departamento de Patologia e Propedêutica Clínica e ao

Departamento de Morfologia da Faculdade de Odontologia do Campus

de Araçatuba – UNESP; por estarem sempre de portas abertas e pelo

carinho com que todos os seus integrantes me receberam e me

auxiliaram em todos os momentos.

Agradecimentos

Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia do

Câmpus de Araçatuba – UNESP, pela gentileza e presteza com que sempre

me auxiliaram.

Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, pelas orientações e pela

simpatia.

Aos animais, por contribuírem para o desenvolvimento da ciência.

A todos os que colaboraram direta e indiretamente na execução deste

trabalho.

íí

“EU APRENDI

Que a melhor sala de aula do mundo está aos pés de uma pessoa mais

velha;

Que ser gentil é mais importante do que estar certo;

Que não importa quanta seriedade a vida exija de você,

cada um de nós precisa de um amigo brincalhão para se divertir

junto;

Que algumas vezes tudo o que precisamos é de

uma mão para segurar e um coração para nos entender;

Que deveríamos ser gratos a Deus por não nos dar tudo que lhe

pedimos;

Que quando você planeja se nivelar com alguém,

apenas está permitindo que essa pessoa continue a magoar você;

Que o AMOR, e não o TEMPO, é que cura todas as feridas;

Que a vida é dura, mas eu sou mais ainda;

Que um sorriso é a maneira mais barata de melhorar sua aparência;

Que todos querem viver no topo da montanha, mas toda felicidade e

crescimento ocorre quando você está escalando-a;

Que só se deve dar conselho em duas ocasiões:

quando é pedido ou quando é caso de vida ou morte;

Que quanto menos tempo tenho, mais coisas consigo fazer...

Ao refletir sobre isto, aprendi que tenho muito a aprender, e que se

alguém pensa saber tudo, é porque não aprendeu como convém saber!!”

Saito CTMH. Análise da ação do laser em baixa intensidade sobre o processo de

reparo após reimplante dentário: estudo histomorfométrico e imunoistoquímico

[tese]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual

Paulista; 2008.

O sucesso do reimplante dentário, mesmo nos dias atuais, é limitado, pois grande

parte dos dentes é perdida devido à reabsorção radicular progressiva, justificando a

busca de novas estratégias que possam controlar esse problema. Assim, foi objetivo

deste estudo, avaliar por meio de análise histomorfométrica e imunoistoquímica, a

ação do laser em baixa intensidade (LLLT) sobre o processo de reparo após

reimplante dentário em ratos. Sessenta ratos (Rattus norvegicus albinus, Wistar)

tiveram seus incisivos superiores direitos extraídos e foram aleatoriamente divididos

em seis grupos: C0, C30 e C45 considerados controles, onde o reimplante dentário

foi realizado imediatamente, trinta e quarenta e cinco minutos após a exodontia

respectivamente, sem nenhum tratamento do ligamento periodontal remanescente e

L0, L30 e L45, onde o reimplante foi realizado nos mesmos tempos extra-alveolares

dos controles, porém a superfície radicular e alvéolo, com remanescentes do

ligamento periodontal, foram tratados com LLLT (Arseneto de Gálio e Alumínio)

antes do reimplante. Os animais foram eutanasiados após 60 dias. Os resultados

evidenciaram reabsorções radiculares externas por substituição e inflamatória em

todos os grupos, não apresentando diferença significativa entre o grupo controle e

tratado em cada período de tempo extra-alveolar (P>0,05). A anquilose, porém, foi

maior no grupo L30 em comparação com o C30 (P<0,05). Na análise

imunoistoquímica houve predominância da proteína RANKL sobre a RANK e OPG

no reimplante imediato (p<0,05). No período extra-alveolar de 45 minutos houve

predominância da RANK sobre a RANKL (p<0,05). A proteína TRAP foi

predominante nos grupos tratados com LLLT no reimplante imediato e com 30

minutos de tempo extra-alveolar (p<0,05). Esses resultados levaram a concluir que o

tratamento da superfície radicular e alvéolo com LLLT, nas especificações

Resumo

deste estudo, não favoreceu o processo de reparo após reimplante dentário em

ratos e que outros estudos, utilizando diferentes parâmetros, são necessários para

melhor avaliar a efetividade do LLLT no reimplante dentário.

Palavras Chave: Avulsão dentária. Reimplante dentário. Cicatrização de feridas.

Terapia a Laser de Baixa Intensidade. Terapia a Laser. Imunoistoquímica

Saito CTMH. Effect of low-level laser therapy on healing of replanted teeth:

histomorphometric and immunohistochemical analysis [thesis]. Araçatuba: Dentistry

School of SP State University; 2008.

The success of the replanted tooth, nowadays, still tends to be limited because great

amount of teeth are lost because of progressive root resorption, justifying the search

of new strategies that can control this problem. This study investigates by

histomorphometric and immunohistochemical analysis the of low-level laser terapy

(LLLT) influence on in the control of root resorption on the healing process after tooth

replantation. Sixty Wistar rats were submitted to extraction of their upper right incisor

and randomly were allocated to one of six experimental groups. The groups: C0, C30

and C45 had been considered controls, where the teeth were replanted immediately,

thirty and forty five minutes after the tooth extraction respectively, without any

treatment of the remaining periodontal ligament. In the groups L0, L30 and L45, the

teeth were replanted immediately, thirty and forty five minutes after tooth extraction

respectively; however the root surface and dental sockets with remainders of the

periodontal ligament had been treated with LLLT (gallium-aluminium-arsinide). The

animals were euthanasied after 60 days. The comparative analysis did not reveal

statistically significant differences in external root resorption (P>0.05) between the

treatment modalities when used for tooth replantation in each extra-alveolar period,

but anchylosis was bigger in L30 (P<0.05) comparing to C30. Immunohistochemical

analysis showed predominant expression of RANKL on RANK and OPG in the

immediate replant (p<0.05). At 45 minutes extra-alveolar time, there was

predominant expression of RANKL on RANK (p<0.05). TRAP protein showed

predominant expression in the LLLT groups in immediate replant and 30 minutes

extra-alveolar time (P<0.05). These results suggest that the treatment of root surface

and dental sockets with LLLT, in this study specification, were not able to prevent

root resorption in tooth replantation in rats and that more studies, using other

Abstract

specifications, must be done for better investigate LLLT effect in tooth replant.

Keywords: Tooth avulsion. Tooth replantation. Wound healing. Laser therapy, low-

level. Laser therapy. Immunohistochemistry.

Figura 1 -

Grupo C0 – Parede óssea alveolar (O) apresentando discreta

neoformação óssea (setas) não comprometendo o espaço do

ligamento periodontal (LP) preenchido por tecido conjuntivo

com disposição oblíqua das fibras com relação à superfície

radicular. Dentina (D). H.E., original 160x.

Figura 2 -

Grupo C0 – Áreas com reabsorção do cemento e da dentina

(D) reparados por cemento neoformado (setas). H.E., original

160x.

Figura 3 -

Grupo C0 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK

(b), RANKL (c) e TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas).

Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

Figura 4 -

Grupo L0 – Ligamento periodontal (LP) apresentando

numerosas células inflamatórias (setas). H.E., original 160x.

Figura 5 -

Grupo L0 – Áreas de reabsorção radicular por substituição.

Dentina (D); tecido ósseo (O). H.E., original 160x.

Figura 6 -

Grupo L0 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK

(b), RANKL (c) e TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas).

Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

Figura 7 -

Grupo C30 – Áreas de reabsorção radicular por substituição.

Pontos de anquilose (seta). Tecido ósseo (O) neoformado

preenchendo totalmente o espaço do ligamento periodontal

Dentina (D); tecido ósseo (O). H.E., original 160x.

Figura 8 -

Grupo C30 – Áreas de reabsorção radicular inflamatória com

presença de numerosas células inflamatórias (setas). Dentina

(D). H.E., original 160x.

Figura 9 -

Grupo C30 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK

(b), RANKL (c) e TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas).

Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

Lista de Figuras

Figura 10 - Grupo L30 - Área onde o espaço do ligamento periodontal,

encontra-se preenchido por tecido ósseo (O) neoformado. O

cemento (setas) em alguns pontos encontra-se justaposto ao

tecido ósseo (O), em outras sofreu reabsorção por

substituição juntamente com a dentina (D). H.E., original

160x.

Figura 11 - Grupo L30 - Áreas de dentina (D) exibindo reabsorção

inflamatória. Células multinucleadas (setas). H.E., original

160x.

Figura 12 - Grupo L30 - Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK

(b), RANKL (c) e TRAP (d). Imunomarcações positivas

(setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

Figura 13 - Grupo C45 - Extensas áreas de cemento e dentina (D)

reabsorvidos sendo substituídos por tecido ósseo (O). H.E.,

original 63x.

Figura 14 - Grupo C45 - Área onde o espaço do ligamento periodontal

encontra-se preenchido por tecido ósseo (O). Dentina (D);

cemento (setas). H.E., original 63x.

Figura 15 - Grupo C45 - Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK

(b), RANKL (c) e TRAP (d). Imunomarcações positivas

(setas). Dentina (D); tecido ósseo. Original 100x.

Figura 16 - Grupo L45 - Áreas onde o espaço do ligamento periodontal

encontra-se preenchido por tecido ósseo. Tecido ósseo (O).

Dentina (D). H.E., original 63x.

Figura 17 - Grupo L45 - Áreas da superfície radicular exibindo

reabsorção de cemento e dentina (D), com neoformação de

tecido ósseo (O). H.E., original 63x.

Figura 18 - Grupo L45 - Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK

(b), RANKL (c) e TRAP (d). Imunomarcações positivas

(setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

Figura 19 - Animais acondicionados em gaiolas no Biotério e Centro

Cirúrgico “Ilídio Teodoro”.

Figura 20 - Anestésicos utilizados: Dopalen (Cloridrato de Ketamina) e

Dopaser (Cloridrato de Xilazina).

Figura 21 - Luxação do incisivo superior direito. 92

Lista de Figuras

Figura 22 - Exodontia do incisivo superior direito. 92

Figura 23 - Dente mantido em recipiente com soro fisiológico. 92

Figura 24 - Remoção da papila dental e órgão do esmalte com lâmina de

bisturi nº15.

Figura 25 - Pulpectomia por via retrógrada 92

Figura 26 - Irrigação com soro fisiológico. 92

Figura 27 - Secagem do canal radicular com cone de papel absorvente. 93

Figura 28 - Preenchimento do canal radicular com pasta de hidróxido de

cálcio e propilenoglicol.

Figura 29 - Irrigação do alvéolo com soro fisiológico. 93

Figura 30 - Reimplante dentário. 93

Figura 31- Aparelho de laser em baixa intensidade utilizado. 93

Figura 32 - Aplicação do laser, luz visível com movimento de varredura

na superfície lingual do dente.

Figura 33 - Aplicação do laser em baixa intensidade, luz infravermelha no

alvéolo.

Figura 34 - Antibiótico utilizado: Pentabiótico pequeno porte. 93

Figura 35 - Câmera digital (JVC TK-1270 Color Vídeo Câmera) acoplada

ao microscópio Carl Zeiss (Axiolab).

Figura 36 - Visualização das imagens no Programa Image Lab.

Demarcação da área total.

Figura 37- Planilha de resultado - Image Lab. Área total. 95

Figura 38 - Visualização da demarcação do perímetro total - Image Lab. 95

Figura 39 - Visualização da demarcação da anquilose (seta) - Image Lab. 96

Figura 40 - Visualização da demarcação da área de reabsorção

inflamatória - Image Lab.

Tabela 1 - Grupos Experimentais 31

Tabela 2 - Valores dos escores atribuídos aos eventos histológicos de

acordo com cada grupo experimental.

Tabela 3 - Valores de significâncias (p) e de Mann-Whitney U nos

eventos de reparo tecidual frente ao reimplante dentário

comparando os grupos controle e tratado em cada tempo

extra-alveolar.

Tabela 4 - Valores dos escores atribuídos às marcações

imunoistoquímicas para cada proteína de acordo com cada

grupo experimental.

Tabela 5 - Valores de significâncias (p) e de Mann-Whitney U para cada

proteína confrontando os grupos controles e tratados e cada

período de tempo extra-alveolar.

Tabela 6 - Valores de significâncias (p) e de Kruskal-Wallis (KW) para

cada período extra-alveolar avaliando as proteínas OPG,

RANK e RANKL.

Tabela 7 - Valores obtidos após a quantificação das áreas de

reabsorções e anquilose utilizando o programa ImageLab

2001 (Diracom 3).

Tabela 8 - Escores atribuídos para distribuição das imunomarcações

presentes para as proteínas OPG, RANK, RANKL e TRAP.

Gráfico 1 - Resultados das imunomarcações para cada proteína nos

grupos controles (C0, C30, C45).

Gráfico 2 - Resultados das imunomarcações para cada proteína nos

grupos tratados com Laser (L0, L30, L45).

Gráfico 3- Valores médios de anquilose de cada grupo. 98

Gráfico 4 - Valores médios de reabsorção por substituição de cada grupo. 98

Gráfico 5 - Valores médios de reabsorção inflamatória de cada grupo.

Gráfico 6 - Valores médios do grupo C0 e L0 avaliando as proteínas OPG,

RANK, RANKL e TRAP.

100

Gráfico 7 - Valores médios do grupo C30 e L30 avaliando as proteínas

OPG, RANK, RANKL e TRAP.

100

Gráfico 8 - Valores médios do grupo C45 e L45 avaliando as proteínas

OPG, RANK, RANKL e TRAP.

100

áá

LASER =

do inglês light amplification by stimulated emission of radiation

HILT =

do inglês high-intensity laser therapy

LLLT =

do inglês low-level laser therapy

dióxido de carbono

Nd: YAG =

neodímio ítrio-alumínio em forma de granada

He-Ne =

hélio-neônio

AsGa =

arseneto de gálio

AsGaAl =

arseneto de gálio e alumínio

TNF =

fator de necrose tumoral

RANK =

receptor ativado do fator nuclear kappa b

RANKL =

ligante do receptor ativado do fator nuclear kappa b

ODF =

fator de diferenciação dos osteoclastos

OPGL =

ligante da osteoprotegerina

TRANCE =

fator de necrose tumoral relacionado à ativação induzida das

citocinas

OPG =

osteoprotegerina

OCIF =

fator inibitório da osteoclastogênese

TRAP =

fosfatase ácida resistente ao tartarato

EDTA =

ácido etilenodiaminotetracético

H. E. =

técnica da hematoxilina e eosina

InGaAlP =

fosfato de índio gálio e alumínio

ATP = adenosina trifosfato

Anexo A -

Certificado da Comissão de Ética na Experimentação Animal

Anexo B -

Normas para publicação – Dental Traumatology 80

Anexo C -

Imagens material e método

Anexo D -

Dados complementares da análise histomorfométrica

Anexo E -

Dados complementares da análise imunoistoquímica

1 Introdução 22

2 Proposição 26

3 Material e Método 28

4 Resultados 37

5 Discussão 46

6 Conclusão 51

Referências 53

Figuras 65

Anexos 78

áá

Introdução

perda precoce de elementos dentários em decorrência de trauma

compromete a manutenção da integridade da dentição natural. Desta forma, quando

um dente sofre avulsão, os esforços devem ser direcionados no sentido de

reimplantá-lo imediatamente para favorecer ao máximo o processo de reparo na

tentativa de retardar ou evitar a sua perda (1-3).

Caso o reimplante imediato não seja possível, o prognóstico do tratamento

dependerá da observância de diversos fatores, como o tempo extrabucal, o meio de

armazenamento, a viabilidade do ligamento periodontal e grau de contaminação da

superfície dentária (1, 4-6).

Várias estratégias buscaram melhorar o prognóstico dos dentes

reimplantados procurando formas de favorecer o reparo do ligamento periodontal

visando a manutenção do dente por um período mais longo (7-9). Mesmo assim, o

prognóstico da maioria dos dentes reimplantados é duvidoso devido à reabsorção

radicular externa (3,10). Por este motivo, novas estratégias merecem ser

investigadas com o objetivo de favorecer ou minimizar os danos decorrentes do

reimplante dentário.

O laser (light amplification by stimulated emission of radiation) em baixa

intensidade é uma das estratégias que merece ser considerada, pois tem potencial

de bioestimulação (11) que poderia ter efeitos reparadores favoráveis no reimplante

dentário. O laser foi desenvolvido por Theodore Maiman em 1960 (11, 12) e ainda

na década de 60, iniciaram-se os estudos de sua aplicação na odontologia (13). Os

primeiros resultados, entretanto, não despertaram muito interesse e o estudo sobre a

utilização do laser foi inexpressivo até a década de 80, quando um grande número

de pesquisas passou a ser realizada, vindo a culminar com os tempos atuais, onde o

uso do laser deixou de ser uma teoria e se tornou uma realidade. A principal

Normalização segundo a Revista Dental Traumatology (Anexo B)

çç

ãã

Introdução

classificação do laser utilizado em odontologia divide-os em laser em alta

intensidade ou HILT (high-intensity laser therapy) cujos principais representantes são

o laser de argônio, CO

(dióxido de carbono) e Nd: YAG (neodímio-ítrio-alumínio em

forma de granada) e o laser em baixa intensidade ou LLLT (low-level laser therapy)

cujos principais representantes são o laser de He-Ne (hélio-neônio) e AsGa

(arseneto de gálio) e AsGaAl (arseneto de gálio e alumínio) (14).

Atualmente, a eficácia e aceitação do laser em alta intensidade (HILT) têm

sido demonstradas por proporcionar dentre as qualidades uma excelente

hemostasia e visualização do campo operatório com redução microbiana, redução

do edema e dor pós-operatórios, redução da possibilidade de difusão de células

anormais, e pouca formação de cicatrizes (15). Por outro lado a literatura mostra

uma ampla variação na utilização do laser em baixa intensidade (LLLT).

Em odontologia o uso do laser (LLLT) tem sido estudado em várias situações

como: no tratamento de herpes simples recorrente (16), como adjunto na terapia de

periodontite (17, 18), no tratamento de hipersensibilidade dentinária (19, 20) e na

recuperação das estruturas dentárias envolvidas na preparação da cavidade (21), na

prevenção e tratamento de mucosite (22-25), no alívio de dor de disfunção

temporomandicular (26-29), na aceleração do movimento ortodôntico (30, 31), no

processo de reparo pós-exodontia (32-34), no tratamento de alveolite (35) e na

aceleração do reparo ósseo após instalação de implante ósseo-integrado (36, 37).

Apesar do grande número de trabalhos mostrando efetividade do laser

(LLLT), seu efeito ainda é motivo de controvérsias. Por este motivo, a literatura

defende a necessidade de mais estudos sobre esta terapia, pois ainda existem

vários questionamentos sobre sua ação e seus reais benefícios (38, 39-41).

Desta forma, o efeito fotobioestimulador do laser (LLLT) favorecendo a

cicatrização, agindo como antiinflamatório e analgésico (42) poderia ter efeitos

benéficos no processo de reparo após reimplante dentário, merecendo ser

investigado.

Para estudar os mecanismos envolvidos no reparo celular em reimplante

dentário, como a atuação do laser (LLLT), a imunoistoquímica é uma ferramenta

metodológica que pode auxiliar na compreensão e justificativa de fatos que até

então foram evidenciados com maior frequência por meio da análise

histomorfométrica (8, 43-49).

Introdução

As proteínas pertencentes à família do Fator de Necrose Tumoral (TNF): OPG

(osteoprotegerina) (50); RANK (receptor ativado do fator nuclear kappa B) (51);

RANKL (ligante do receptor ativado do fator nuclear kappa B) (52) estão intimamente

ligadas à dinâmica dos processos de reabsorção e remodelação do tecido ósseo

(53-55). A ação destas proteínas ocorre da seguinte forma: a ligação das proteínas

RANK-RANKL estimula a diferenciação dos pré-osteoclastos em osteoclastos ativos

estimulando o processo de reabsorção óssea (56,57). A OPG, molécula de

superfície sintetizada por osteoblastos e por células do estroma, modera a

osteoclastogênese, atuando como receptor chamariz, ligando-se a RANKL e

impedindo a sua ligação à RANK (57,58). Assim, o balanço entre a expressão das

proteínas do sistema RANK/RANKL/OPG fornece informações importantes sobre

metabolismo ósseo (59-62), pois tem participação na dinâmica e homeostasia do

tecido ósseo.

A proteína TRAP (fosfatase ácida resistente ao tartarato) também tem um

papel importante no processo de reabsorção, pois atua como um marcador da

enzima que evidencia a atividade osteoclástica (63, 64).

Os experimentos de imunomarcação associando a imunomarcação para as

proteínas RANK, RANKL, OPG e TRAP podem possibilitar a realização de uma

análise da dinâmica dos tecidos periodontais durante o processo de reparo após o

reimplante dentário.

Assim, embora a ação do laser em baixa intensidade (LLLT) sobre os tecidos

biológicos já seja um assunto amplamente investigado, existe escassez de estudos

avaliando a sua ação sobre o reparo em dentes reimplantados, principalmente

associando análise histomorfométrica e imunoistoquímica, tornando esta pesquisa

relevante.

Proposição

proposta deste trabalho foi avaliar por meio de análise histomorfométrica e

imunoistoquímica a ação do laser em baixa intensidade no processo de reparo após

reimplante dentário em ratos.

çç

ãã

Material e Método

reviamente à sua realização, a metodologia empregada no trabalho foi

submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da

Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP (protocolo nº 19/06, Anexo A).

Modelo Experimental

Para realização deste estudo, foram utilizados 60 ratos (Rattus norvegicus

albinus, variedade Wistar), machos, com peso corporal variando entre 250 a 300

gramas, em bom estado de saúde, provenientes do Biotério da Faculdade de

Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP. Os animais foram alimentados com

ração sólida triturada (Guabi Nutrilabor, Mogiana Alimentos SA, Campinas, SP,

Brasil), durante todo o período experimental, exceto no período das 12 horas

antecedentes ao ato cirúrgico e água ad libitum.

Etapa Cirúrgica

Foi administrado, por via intramuscular, cloridrato de xilazina (Dopaser,

Laboratório Calier do Brasil. Ltda, Osasco, SP, Brasil) na dosagem de 0,6 mg para

cada 100g de peso corporal, para promover um relaxamento muscular. Na

seqüência, o cloridrato de ketamina (Dopalen AgriBands Ltda., Paulínea, SP, Brasil)

na dosagem de 7 mg para cada 100g de peso corporal para a obtenção do efeito

anestésico.

Após a anestesia do animal, foi realizada a antissepsia da porção anterior da

maxila com polivinilpirrolidona iodada a 10% (Riodeine – Indústria Farmacêutica

Rioquímica Ltda., São José do Rio Preto, SP, Brasil). Procedeu-se a sindesmotomia,

luxação e exodontia do incisivo superior direito, com instrumental especialmente

adaptado para este fim (65). Em seguida, os animais foram divididos aleatoriamente

em 6 grupos experimentais com 10 animais cada, a saber:

éé

Material e Método

 Grupo C0: Após a exodontia os dentes permaneceram 4 minutos em meio

ambiente, que foi o tempo necessário para a aplicação do laser no grupo tratado.

Logo após foi realizada a antissepsia da porção anterior da maxila com

polivinilpirrolidona iodada a 10% (Riodeine – Indústria Farmacêutica Rioquímica

Ltda., São José do Rio Preto, SP, Brasil) e os dentes foram reimplantados, sem

qualquer tipo de tratamento na superfície radicular e alvéolo, com remanescentes

do ligamento periodontal.

 Grupo C30: Os dentes foram mantidos em soro fisiológico, por um período de 30

minutos. Após este período, a papila dentária e o órgão do esmalte foram

seccionados e removidos com lâmina de bisturi n° 15 (Wuxi Xinda Medical

Device Co Ltd., Zhanging Town, Xishan City, China), e a polpa removida por via

retrógrada, empregando-se lima tipo Kerr n° 35 (Kerr 25 mm - Sybron Kerr,

Guarulhos, SP, Brasil) ligeiramente curvada. Os canais foram irrigados com soro

fisiológico, secos com cones de papel e preenchidos com pasta de hidróxido de

cálcio (Biodinâmica Química e Farmacêutica Ltda., Ibiporã, PR, Brasil) e

propileno glicol (Manipullis, Araçatuba, SP, Brasil) com auxílio de uma agulha

hipodérmica 28X8 mm acoplada a uma seringa de insulina (Injex Indústrias

Cirúrgicas Ltda., Ourinhos, SP, Brasil). Após esses procedimentos, foi realizada a

antissepsia da porção anterior da maxila com polivinilpirrolidona iodada a 10%

(Riodeine – Indústria Farmacêutica Rioquímica Ltda., São José do Rio Preto, SP,

Brasil) e em seguida, os dentes foram reimplantados em seus respectivos

alvéolos sem qualquer tipo de tratamento na superfície radicular e alvéolo.

 Grupo C45: Os dentes receberam os mesmos procedimentos realizados no

Grupo C30, com exceção do tempo extra-alveolar, que neste grupo foi de 45

minutos.

 Grupo L0: Após a exodontia, os dentes, em sua superfície lingual, receberam a

aplicação do laser de diodo semicondutor de Arseneto de Gálio e Alumínio, luz

visível (660 nm), por 2 minutos e 13 segundos e os alvéolos uma aplicação de

laser infravermelho (830 nm) por mais 1 minuto e 40 segundos totalizado um

tempo extra-alveolar de aproximadamente 4 minutos, em seguida foi realizada a

antissepsia da porção anterior da maxila com polivinilpirrolidona iodada a 10%

(Riodeine – Indústria Farmacêutica Rioquímica Ltda., São José do Rio Preto, SP,

Brasil) e os dentes foram reimplantados em seus respectivos alvéolos.

Material e Método

 Grupo L30: Os dentes receberam os mesmos procedimentos realizados no

Grupo C30 até o momento anterior ao reimplante, quando os dentes receberam a

aplicação do laser em baixa intensidade nas mesmas especificações do Grupo

L0, sendo, em seguida foram reimplantados em seus respectivos alvéolos.

 Grupo L45: Os dentes receberam os mesmos procedimentos realizados no

Grupo L30, com exceção do tempo extra-alveolar, que neste grupo foi de 45

minutos.

Após o reimplante, todos os animais receberam uma dose única de 24.000 UI

de Pentabiótico pequeno porte (Benzilpenicilina benzatina-12.000 UI,

Benzilpenicilina procaína- 6.000 UI, Benzilpenicilina potássica- 6.000 UI, Sulfato de

Diidroestreptomicina- 5 mg, Sulfato de Estreptomicina- 5 mg) (Fort Dodge Saúde

Animal Ltda., Campinas, SP, Brasil), por via intramuscular.

Tabela 1. Grupos Experimentais

Grupo Laser Tempo extra-alveolar Amostra Avaliação

C0 Não 4 min. n = 10 60 dias

C30 Não 30 min. n = 10 60 dias

C45 Não 45 min. n = 10 60 dias

L0 Sim 4 min. n = 10 60 dias

L30 Sim 30 min. n = 10 60 dias

L45 Sim 45 min. n = 10 60 dias

Especificações do Laser

O laser utilizado no presente estudo apresentou as seguintes características:

 Equipamento laser: BioWave LLLT (Kondortech Equipamentos Odontológicos

Ltda., São Carlos, SP, Brasil);

 Meio ativo: Diodo de Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl);

 Comprimento de onda: 660 nm (visível) e 830 nm (infravermelho);

 Potência de saída: 30 mW (660 nm) e 40 mW (830 nm);

 Modo de operação: contínuo ou modulado até 1 kHz;

 Polarização do feixe: randômica;

 Diâmetro do feixe na ponteira: 3 mm;

Material e Método

 Área do feixe de laser: 0,07 cm

;

 Divergência dos feixes: 20

graus;

 Comprimento do cabo da ponteira: 1,5 metros.

Protocolo de tratamento com laser em baixa intensidade

 Na superfície dentária: o laser em baixa intensidade foi utilizado diretamente na

superfície lingual dos incisivos superiores extraídos, seguindo o seguinte

protocolo de tratamento:

- Comprimento de onda: 660 nm, laser visível;

- Potência de saída: 30 mW;

- Modo de emissão: laser contínuo;

- Modo de aplicação: laser contato, varredura;

- Número de aplicação: aplicação única;

- Área de aplicação do Laser: A irradiação do laser foi realizada com a ponteira

direcionada em contato direto com a superfície lingual dos incisivos superiores,

realizando movimentos curtos de varredura no sentido longitudinal;

- Energia: 4 J;

- Tempo de exposição pontual: 133 s;

- Fluência (Densidade Energética): 57,14 J/cm

 No alvéolo cirúrgico: após o tratamento da radicular, o alvéolo dentário foi

submetido também ao LLLT, com os seguintes parâmetros:

- Comprimento de onda: 830 nm, laser infravermelho;

- Potência de saída: 40 mW;

- Modo de emissão: laser contínuo;

- Modo de aplicação: laser contato, pontual;

- Número de aplicação: aplicação única;

- Área de aplicação do Laser: a irradiação do laser foi realizada com a ponteira

em contato direto com a superfície lingual dos alvéolos, na altura do terço

médio alveolar;

- Energia: 4 J;

- Tempo de exposição pontual: 100 s;

- Fluência (Densidade Energética): 57,14 J/cm

Material e Método

Processamento Laboratorial

Os animais foram eutanasiados 60 dias após o reimplante por meio de dose

excessiva do anestésico. A maxila direita foi separada da esquerda na linha mediana

com o emprego uma lâmina de bisturi nº 15 (Wuxi Xinda Medical Device Co Ltd.,

Zhanging Town, Xishan City, China). Um corte com tesoura reta, tangenciando a

face distal dos molares, possibilitou a obtenção da hemi-maxila direita contendo o

alvéolo dentário com o dente reimplantado.

As peças obtidas foram fixadas em solução de formalina a 10% e na

seqüência foram descalcificadas em solução de EDTA a 20 %, pH 7,0, desidratadas,

clarificadas e incluídas em parafina, permitindo cortes histológicos do alvéolo no

sentido longitudinal.

Os cortes semi-seriados obtidos, com 6 µm de espessura, foram divididos em

duas metades sendo parte deles corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina

(H. E.) para a análise histológica e histomorfométrica e a outra parte submetida às

reações imunoistoquímicas para análise específica.

Análise histológica

A análise histológica foi realizada com auxílio de microscópio de luz, onde

somente a face lingual da raiz foi considerada, pois o dente do rato apresenta

ligamento periodontal apenas nesta face. Foram analisadas as características do

ligamento periodontal, osso alveolar, cemento, dentina além da ocorrência de

reabsorção inflamatória, por substituição e anquilose.

Análise histomorfométrica

O corte longitudinal da raiz foi capturado por meio de uma câmera Axio Cam

MRc5 (Carl Zeiss do Brasil LTDA, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) acoplada a um

Estereomicroscópio Stemi 2000 – C (Carl Zeiss do Brasil LTDA, Rio de Janeiro, RJ,

Brasil) com um aumento de 1:20 que permitia uma visão panorâmica do dente. Essa

imagem foi salva como figura no programa Axio Vision 4.5 (Carl Zeiss do Brasil

LTDA, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e utilizada para a quantificação no programa

Material e Método

ImageLab 2000 (Laboratório de Informática Dedicado à Odontologia, LIDO, USP,

SP, Brasil).

De posse dessas imagens, a área correspondente à face lingual de cada raiz

foi selecionada, recortada e quantificada, obtendo-se, dessa maneira, a área total de

dentina radicular. Esses dados foram armazenados em planilhas. Posteriormente, as

áreas de reabsorção inflamatória e reabsorção por substituição foram selecionadas e

quantificadas e os dados armazenados nas mesmas planilhas (Anexo C).

Os valores da área de dentina total e da área de dentina reabsorvida foram

submetidos a uma regra de três para verificar que porcentagem da raiz estava

comprometida pela reabsorção inflamatória e pela reabsorção por substituição. A

partir desses valores foram atribuídos escores para a aplicação do teste estatístico

(Anexo D).

A anquilose foi mensurada por meio do perímetro, sendo inicialmente

mensurado o perímetro total da face lingual de cada raiz e depois o perímetro da

anquilose. Esses valores armazenados em planilhas foram também submetidos a

uma regra de três para verificar que porcentagem da raiz estava comprometida pela

anquilose. Entende-se por anquilose as áreas cujo tecido ósseo está justaposto ao

cemento. De maneira semelhante às reabsorções, foram atribuídos escores para

aplicação do teste estatístico.

Para a identificação e seleção de áreas de reabsorção e anquilose, as

imagens digitais foram comparadas com os cortes histológicos no microscópio.

Os valores numéricos absolutos, transformados em porcentagens foram

classificados de acordo com o seguinte escore (43,49):

Reabsorção inflamatória e por substituição:

1 - Ausência de reabsorção.

2 - de 0,1% a 50% da área com reabsorção.

3 - de 51% a 99 % da área com reabsorção.

4 - 100% da área com reabsorção.

Anquilose

1 - Ausência de anquilose.

2 - de 0,1% a 50% da área com anquilose.

3 - de 51% a 99 % da área com anquilose.

4 - 100% da área com anquilose.

Material e Método

Análise imunoistoquímica

Com o objetivo de identificar se a aplicação do laser em baixa intensidade

promove a ativação de fibroblastos do ligamento periodontal, foi utilizada a técnica

imunoistoquímica com método de detecção por imunoperoxidase (66, 67).

A análise a ser realizada através da imunoistoquímica consistiu na avaliação

da expressão das proteínas OPG, RANK, RANKL e TRAP durante o processo de

reparo após reimplante nos tempos extra-alveolares de 4, 30 e 45 minutos.

Com relação aos anticorpos contra as proteínas RANK, OPG, RANKL e

TRAP, os anticorpos primários foram respectivamente o anti RANK (goat anti RANK

polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), o anti OPG (goat

anti OPG polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), anti

RANKL (goat anti RANKL polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz,

CA, USA) e anti TRAP (goat anti TRAP polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, Inc.,

Santa Cruz, CA, USA), todos produzidos em cabras. O secundário foi o anticorpo

biotinilado anticabras produzido em coelhos, (Pierce Biotechnology Inc., Rockford,

IL, USA.), utilizou-se o kit Streptavidina e Biotina (Dako, Carpinteria, CA, EUA) para

amplificar o sinal e a diaminobenzidina (Dako, Carpinteria, CA, EUA) como

cromógeno. Na seqüência, os cortes receberam a contra-coloração por hematoxilina

de Harris.

Um controle negativo foi preparado para cada espécime analisado usando

procedimento similar com exclusão do anticorpo primário.

Cada espécime foi mensurado por um examinador calibrado usando um

método semi-quantitativo para avaliar a distribuição das marcações presentes

classificando todos os casos em categorias (61): (-) ausência ou marcação

desprezível, (+) marcação leve, (++) marcação moderada, (+++) marcação severa.

Para facilitar a comparação entre os grupos, os escores foram convertidos em: 1

para ausência ou marcação desprezível (-), 2 para marcação leve (+), 3 para

marcação moderada (++) e 4 para marcação severa (+++). O avaliador desconhecia

o grupo pertencente a cada imagem, para evitar tendenciosidade durante a análise.

Material e Método

Análise estatística

Na avaliação histomorfométrica, para a comparação entre os resultados

obtidos na forma de escore correspondente à porcentagem de reabsorção

inflamatória, por substituição e anquilose entre o grupo controle e tratado em cada

período de tempo extra-alveolar utilizou-se o teste não paramétrico de Mann-

Whitney, ao nível de significância de 5%.

Para análise imunoistoquímica, os resultados também, na forma de escores,

foram submetidos ao teste não-paramétrico de Mann-Whitney para avaliar duas

amostras e de Kruskal-Wallis para mais de duas amostras de dados independentes,

ao nível de significância de 5%. Foram realizados os cruzamentos de cada uma das

variáveis proteínas RANK, RANKL, OPG e TRAP entre o grupo controle e tratado

em cada período extra-alveolar e das proteínas RANK, RANKL e OPG em cada

grupo.

Resultados

nálise histológica

Os resultados obtidos foram descritos, após análise das seguintes estruturas:

mucosa gengival, ligamento periodontal, cemento, dentina e parede alveolar após 60

dias do reimplante.

Em todos os grupos estudados a reinserção epitelial ocorreu no nível da

junção cemento-esmalte e o tecido conjuntivo subjacente exibiu poucas células

inflamatórias.

Grupo C0 (controle imediato)

O ligamento periodontal, na maioria dos espécimes, exibiu fibras com

disposição oblíqua à superfície radicular, notando-se, além disso, a ausência de

células inflamatórias (Fig. 1).

O cemento e a dentina, em alguns pontos da raiz, encontraram-se

reabsorvidos e reparados por cemento neoformado (Fig. 2).

A parede óssea alveolar apresentou discreta neoformação óssea que não

compromete o espaço do ligamento periodontal (Fig. 1).

Grupo L0 (Laser imediato)

O ligamento periodontal mostrou, em alguns espécimes, a presença de

numerosas células inflamatórias (Fig. 4).

O cemento e a dentina apresentaram áreas de reabsorção por substituição

(Fig. 5) e inflamatória.

Observou-se aposição óssea na parede alveolar ocasionando o estreitamento

do espaço do ligamento periodontal.

Grupo C30 (controle - 30 minutos extra-alveolar)

O espaço do ligamento periodontal em algumas áreas encontrou-se

completamente preenchido por tecido ósseo (Fig. 7) e, em outras, o tecido conjuntivo

presente exibiu fibras cuja direção é paralela à superfície radicular.

O cemento e a dentina apresentaram áreas de reabsorção inflamatória (Fig.

8) e por substituição.

Foram poucos os pontos de anquilose alvéolo-dentária (Fig. 7).

A parede óssea alveolar exibiu em alguns pontos, neoformação óssea

ocasionando o estreitamento do espaço do ligamento periodontal. Em outros, o

tecido neoformado preencheu totalmente o espaço do ligamento periodontal (Fig. 7).

Grupo L30 (Laser - 30 minutos extra-alveolar)

O espaço do ligamento periodontal, na maioria dos espécimes, encontrou-se

preenchido por tecido ósseo, ao longo dos três terços radiculares, caracterizando a

neoformação óssea da parede alveolar (Fig. 10).

O cemento encontrou-se justaposto ao tecido ósseo em vários pontos ao

longo de toda a superfície radicular (Fig. 10).

A dentina exibiu reabsorção de superfície, inflamatória (Fig. 11) e por

substituição (Fig. 10).

Grupo C45 (controle - 45 minutos extra-alveolar)

O espaço do ligamento periodontal encontrou-se em grande parte da raiz

preenchido por tecido ósseo (Fig. 13).

Extensas áreas de anquilose puderam ser observadas ao longo dos três

terços radiculares (Fig. 14).

O cemento e a dentina encontraram-se reabsorvidos com presença de células

inflamatórias ou substituídos por tecido ósseo (Fig.13).

A parede alveolar exibiu neoformação óssea causando o estreitamento e em

algumas áreas, preencheu o espaço do ligamento periodontal.

Grupo L45 (Laser - 45 minutos extra-alveolar)

O espaço do ligamento periodontal encontrou-se em quase toda a extensão

da raiz preenchido por tecido ósseo (Fig. 16).

As fibras do ligamento periodontal mostraram disposição paralela com relação

à superfície radicular.

Extensas áreas da superfície radicular exibiram reabsorção de cemento e

dentina (Fig. 17).

A parede alveolar apresentou aposição óssea ocasionando o estreitamento

do espaço do ligamento periodontal.

Análise imunoistoquímica

Foram realizadas reações imunoistoquímicas utilizando-se anticorpos

primários contra as proteínas OPG, RANK, RANKL e TRAP analisadas no período

de 60 dias após a realização do reimplante dentário.

Considerando-se cada grupo experimental, os seguintes resultados foram

observados:

Grupo C0 (controle imediato)

Observou-se ausência de marcações positivas para a proteína OPG e RANK

(Fig. 3a e 3b). Uma marcação moderada para a proteína RANKL foi observada em

osteócitos e na matriz extracelular dos fibroblastos (Fig. 3c). A marcação observada

para a proteína TRAP foi leve, evidenciando poucos osteoclastos (Fig. 3d).

Grupo L0 (Laser imediato)

A maioria dos espécimes apresentou marcação leve para a proteína OPG

localizadas na matriz extracelular dos fibroblastos (Fig. 6a) e marcação desprezível

ou ausente para a proteína RANK (Fig. 6b). Observou-se marcação severa para a

proteína RANKL em osteócitos e na matriz extracelular dos fibroblastos (Fig. 6c).

Observou-se marcação moderada para a proteína TRAP (Fig. 6d).

Grupo C30 (controle - 30 minutos extra-alveolar)

Na maioria dos espécimes, marcações severas foram observadas para a

proteína OPG (Fig. 9a) e marcações moderadas para a proteína RANK, ambas

localizadas em osteócitos (Fig. 9b). As marcações para a proteína RANKL foram

moderadas localizadas em osteócitos e na matriz extracelular dos osteócitos (Fig.

9c). Evidenciou-se marcação leve para a proteína TRAP (Fig. 9d).

Grupo L30 (Laser - 30 minutos extra-alveolar)

Observou-se predominância de marcação moderada para a proteína OPG

localizadas em osteócitos (Fig. 12a). As marcações para as proteínas RANK e

RANKL localizadas em osteócitos e pré-osteócitos sofreram variação de leve a

moderada (Fig. 12b e 12c). As marcações para a proteína TRAP demarcando os

osteoclastos variaram de leve a moderada (Fig. 12d).

Grupo C45 (controle - 45 minutos extra-alveolar)

Na maioria dos espécimes observaram-se marcações moderadas para as

proteínas OPG e RANKL localizada em osteócitos (Fig. 15a e 15b). As marcações

para a proteína RANK foram observadas em osteócitos variando de moderada a

severa (Fig. 15c). As marcações para a proteína TRAP variaram de leve a moderada

(Fig. 15d).

Grupo L45 (Laser - 45 minutos extra-alveolar)

Marcações variando de leve a moderada foram observadas para a proteína

OPG, localizadas em osteócitos e na matriz extracelular de fibroblastos (Fig. 18a) e

para a proteína RANKL em osteócitos (Fig. 18c). A proteína RANK apresentou

marcação moderada localizada em osteócitos (Fig. 18b). A proteína TRAP

apresentou uma marcação leve localizada em osteoclastos (Fig. 18d).

Análise estatística

Na análise histomorfométrica, os eventos de reabsorção inflamatória, por

substituição e anquilose foram analisados comparando o grupo controle e tratado

em cada período de tempo extra-alveolar (Tabela 2) utilizando o teste estatístico não

paramétrico de Mann-Whitney, onde não houve diferença estatisticamente

significante (p>0,05) quanto à reabsorção inflamatória e por substituição (Tabela 3),

porém a presença de áreas de anquilose foi maior grupo tratado com laser no

reimplante após 30 minutos de tempo extra-alveolar (p<0,05) (Tabela 3).

Tabela 2. Valores dos escores atribuídos aos eventos histológicos de acordo com cada

grupo experimental.

4 minutos 30 minutos 45 minutos Eventos

Histológicos

Escores

C0 L0 C30 L30 C45 L45

1- Ausente 7/10 3/8 1/10 1/8 1/8 0/9

2- 0,1% a 50% 3/10 5/8 9/10 7/8 7/8 8/9

3- 51% a 99 % 0/10 0/8 0/10 0/8 0/8 1/9

Reabsorção por

Substituição

4- 100% 0/10 0/8 0/10 0/8 0/8 0/9

1- Ausente 6/10 3/8 6/10 4/8 2/8 5/9

2- 0,1% a 50% 4/10 5/8 4/10 4/8 6/8 4/9

3- 51% a 99 % 0/10 0/8 0/10 0/8 0/8 0/9

Reabsorção

Inflamatória

4- 100% 0/10 0/8 0/10 0/8 0/8 0/9

1- Ausente 9/10 5/8 4/10 0/8 1/8 1/9

2- 0,1% a 50% 1/10 3/8 6/10 7/8 6/8 8/9

3- 51% a 99 % 0/10 0/8 0/10 1/8 1/8 0/9

Anquilose

4- 100% 0/10 0/8 0/10 0/8 0/8 0/9

Tabela 3. Valores de significâncias (p) e de Mann-Whitney U nos eventos de reparo tecidual

frente ao reimplante dentário comparando os grupos controle e tratado em cada tempo

extra-alveolar.

Eventos Histológicos Tempo extra-alveolar P valor Mann-Whitney U

4 min. 0,1958 29,00

30 min. 0,0359 * 21,00

Anquilose

45 min. 0,6638 32,50

4 min. 0,1976 27,00

30 min. 0,9654 39,00

Reabsorção por

substituição

45 min. 0,1976 28,00

4 min. 0,3839 31,00

30 min. 0,7618 36,00

Reabsorção Inflamatória

45 min. 0,2367 25,00

* Diferença estatística significativa entre o grupo controle e tratado.

Na análise imunoistoquímica, os valores dos escores atribuídos às

imunomarcações para cada proteína (Tabela 4) foram analisados. Considerando

cada proteína analisada isoladamente em cada período extra-alveolar confrontando

o grupo controle e tratado, a presença de imunomarcações positivas para proteína

OPG foi significativamente maior no grupo tratado com laser no período de 4

minutos (p<0,05, Tabela 5, Gráfico 1 e 2). As imunomarcações para a proteína

RANK estiveram presentes em maior quantidade no grupo controle dos períodos

extra-alveolares de 30 e 45 minutos (p<0,05, Tabela 5, Gráfico 1 e 2). A proteína

RANKL teve uma marcação semelhante nos grupos controles e tratados com laser

nos três períodos de tempo extra-alveolar (p>0,05, Tabela 5, Gráfico 1 e 2). A

proteína TRAP foi observada em maior quantidade no grupo tratado com laser nos

casos de reimplante imediato e tempo extra-alveolar de 30 minutos (p<0,05, Tabela

5, Gráfico 1 e 2).

Tabela 4. Valores dos escores atribuídos às marcações imunoistoquímicas para cada

proteína de acordo com cada grupo experimental.

4 minutos 30 minutos 45 minutos Proteína Escores

C0 L0 C30 L30 C45 L45

1- Ausente 9/10 2/8 0/10 0/8 0/8 0/9

2- Leve 1/10 4/8 5/10 1/8 1/8 4/9

3- Moderada 0/10 2/8 1/10 6/8 7/8 4/9

OPG

4- Severa 0/10 0/8 4/10 1/8 0/8 1/9

1- Ausente 9/10 6/8 0/10 0/8 0/8 0/9

2- Leve 1/10 2/8 0/10 5/8 0/8 1/9

3- Moderada 0/10 0/8 9/10 3/8 4/8 8/9

RANK

4- Severa 0/10 0/8 1/10 0/8 4/8 0/9

1- Ausente 0/10 0/8 0/10 0/8 0/8 0/9

2- Leve 2/10 0/8 1/10 4/8 3/8 7/9

3- Moderada 4/10 2/8 9/10 3/8 4/8 2/9

RANKL

4- Severa 4/10 6/8 0/10 1/8 1/8 0/9

1- Ausente 0/10 0/8 1/10 0/8 0/8 0/9

2- Leve 9/10 0/8 9/10 5/8 5/8 8/9

3- Moderada 1/10 6/8 0/10 2/8 3/8 1/9

TRAP

4- Severa 0/10 2/8 0/10 1/8 0/8 0/9

* Diferença estatística significativa entre o grupo controle e tratado.

Tabela 5. Valores de significâncias (p) e de Mann-Whitney U para cada proteína

confrontando os grupos controles e tratados e cada período de tempo extra-alveolar.

Proteína Tempo extra-alveolar P valor Mann-Whitney U

4 min. 0,0066 * 13,00

30 min. 0,7770 36,50

OPG

45 min. 0,3904 28,00

4 min. 0,4497 34,00

30 min. 0,0059 * 13,50

RANK

45 min. 0,0188 * 16,00

4 min. 0,1219 24,00

30 min. 0,2374 28,50

RANKL

45 min. 0,0967 20,50

4 min. 0,0003 * 3,000

30 min. 0,0381 * 22,50

TRAP

45 min. 0,2393 26,50

* Diferença estatística significativa entre o grupo controle e tratado.

Gráfico 1. Resultados das imunomarcações para cada proteína nos grupos controles (C0,

C30, C45).

0,5

1,5

2,5

3,5

C0 C30 C45

OPG

RANK

RANKL

TRAP

Gráfico 2. Resultados das imunomarcações para cada proteína nos grupos tratados com

Laser (L0, L30, L45).

0,5

1,5

2,5

3,5

L0 L30 L45

OPG

RANK

RANKL

TRAP

Analisando as proteínas OPG, RANK e RANKL em cada período extra-alveolar,

houve predominância da RANKL sobre a RANK e OPG com diferença estatística

significativa no reimplante imediato tanto no grupo controle como no grupo tratado

(p<0,05, Tabela 5). No período extra-alveolar de 30 minutos houve equilíbrio entre

as proteínas em ambos os grupos, controle e tratado com laser (p>0,05, Tabela 5).

No período extra-alveolar de 45 minutos houve predominância da RANK sobre a

RANKL em ambos os grupos (p<0,05, Tabela 5).

Tabela 6. Valores de significâncias (p) e de Kruskal-Wallis (KW) para cada período extra-

alveolar avaliando as proteínas OPG, RANK e RANKL.

Tempo

extra-alveolar

Grupo

OPG

RANK

RANKL

C0 a a b* < 0.0001* 27,67 4 min.

L0 a a b* 0,0002 * 17,47

C30 a a a 0,6820 0,7654 30 min.

L30 a a a 0,1247 4,163

C45 a, b a* b 0,0356 * 6,673 45 min.

L45 a, b a* b 0,0299 * 7,019

* Diferença estatística significativa. Grupos com a mesma letra (a) ou (b), em cada grupo, não

possuem diferença estatisticamente significante entre si.

Discussão

literatura mostra que, mesmo nos dias atuais, o sucesso do reimplante

dentário é limitado, pois grande parte dos dentes é perdida devido à reabsorção

radicular progressiva (68-70), justificando a busca de novas estratégias para

controlar este problema.

O modelo experimental escolhido para esta análise foi o rato, pelo baixo

custo, fácil acesso e existência de uma metodologia definida para reproduzir o

trauma dentário a ser estudado (43-49).

A maioria dos trabalhos utilizou métodos histológicos e histomorfométricos

para avaliar o processo de reparo no reimplante dentário (43-47, 49). Este trabalho

demonstrou que a análise imunoistoquímica pode ser considerada uma importante

ferramenta de estudo,

eficaz para fornecer uma avaliação diferenciada da expressão

e da localização de cada proteína envolvida no processo de reparo do reimplante

dentário, fornecendo informações complementares às obtidas na análise

histomorfométrica. Além disso, confirmou os relatos de Manfrin et al. 2007 (71),

quanto à participação do sistema RANK-RANKL-OPG no processo de reparo após

reimplante dentário.

Os tempos extra-alveolares de 4, 30 e 45 minutos em soro fisiológico foram

estipulados baseando-se nas propriedades de bioestimulação do laser (LLLT), uma

vez que a literatura mostra que nesses períodos, há células do ligamento periodontal

viáveis (72,73). Um tempo extra-alveolar inferior a 30 minutos apresenta um

prognóstico melhor, com possibilidade de reabsorção de em torno de 10%, de 30 a

90 minutos 57% e além de 90 minutos pode ser superior a 90% (72). Com a variação

do tempo extra-alveolar foi possível avaliar a atuação do laser em diferentes

quantidades de células viáveis do ligamento periodontal.

O tratamento endodôntico foi instituído somente nos dentes que

permaneceram por 30 e 45 minutos extra-alveolares. O objetivo deste procedimento

foi evitar a ação de produtos teciduais nocivos resultantes da necrose pulpar que

ãã

Discussão

poderiam favorecer a reabsorção do tipo inflamatória (4, 10, 74).

No reimplante imediato (4 minutos), esse tratamento não foi instituído pela

possibilidade de revascularização pulpar, já que o dente de rato apresenta um amplo

forame apical, o que se confirmou na análise histológica. Apesar da mudança na

metodologia, o objetivo foi alcançado, evitando-se a interferência da necrose pulpar

no processo de reparo em todos os grupos.

O hidróxido de cálcio foi o material utilizado como curativo de demora nos

dentes reimplantados com tempo extra-alveolar de 30 e 45 minutos, devido à sua

boa capacidade de prevenir e/ou controlar a progressão da reabsorção inflamatória

(74,75) porque além da ação antimicrobiana, neutraliza toxinas e promove o reparo

(76-80).

Ainda na tentativa de controlar interferências que pudessem contribuir para a

contaminação nos casos de reimplante dentário e conseqüentemente atuar na

reabsorção radicular foi instituída a antibioticoterapia sistêmica (3, 72, 81) utilizando

antibiótico a base de penicilina em todos os grupos.

A estratégia investigada neste trabalho foi o efeito bioestimulador do laser em

baixa intensidade que pode ser obtido utilizando-se diferentes equipamentos. O

primeiro laser estudado com este efeito foi o laser de rubi (694nm), em seguida

vieram os de He-Ne (632,8 nm), AsGa (904nm), AsGaAl (780 a 890nm) e o InGaAlP

(fosfato de índio gálio e alumínio, 630 a 700nm) (11). O laser utilizado neste trabalho

foi AsGaAl que tem como propriedades: potencial de penetração profunda é portátil,

de fácil utilização e de baixo custo (42).

A despeito da escassez de pesquisas com objetivo semelhante, a determinação

dos parâmetros do laser utilizada nessa pesquisa, baseou-se inicialmente em

características inerentes ao equipamento escolhido no que diz respeito ao meio

ativo, comprimento do cabo da ponteira, polarização, diâmetro, área e divergência

do feixe de laser. O comprimento de onda, por sua vez, baseou-se no tecido alvo,

ou seja, o ligamento periodontal remanescente. Desta forma, para a parte do

ligamento remanescente aderida ao dente, a luz visível (630 nm) foi utilizada por

penetrar menos nos tecidos sendo indicada nas lesões superficiais, enquanto que, o

infravermelho (830 nm) por ser mais penetrante, podendo atingir os tecidos

profundos, foi utilizada no ligamento periodontal remanescente na parede do alvéolo

(82, 83).

Discussão

Apesar da absorção da luz visível e infravermelha ocorrer de maneira

diferente, a primeira sendo absorvida pela cadeia respiratória que acontece nas

mitocôndrias (84) e a outra atuando na membrana celular (85), o resultado dessas

interações é semelhante conduzindo ao aumento da atividade enzimática, transporte

aumentado de elétron e produção aumentada de adenosina trifosfato (ATP)

podendo, desta forma, favorecer várias reações do metabolismo celular durante um

processo de reparo (85-89). Os resultados dessa pesquisa, no entanto, não

demonstraram que os potenciais efeitos do laser em baixa intensidade na

cicatrização (90-92), estimulação da proliferação celular (93-95) e vascular (96, 97),

efeito antiinflamatório (98-101), analgésico (97) e bioestimulador da remodelação

óssea (36, 37, 102, 103) foram benefícios ao processo de reparo após o reimplante

dentário.

A avaliação histomorfométrica não mostrou diferença significativa entre os

grupos controles e tratados nos diferentes períodos de tempo extra-alveolar quanto

à reabsorção inflamatória e por substituição. Este resultado foi confirmado na análise

imunoistoquímica mostrando equivalência no sistema RANK, RANKL e OPG entre

os grupos controles e tratados em cada período de tempo extra-alveolar.

A predominância de anquilose no reimplante com tempo extra-alveolar de 30

minutos no grupo tratado com laser foi decorrente de uma deposição mais precoce

de tecido ósseo neste grupo. Uma possível explicação para este evento foi a

aplicação do laser no alvéolo, concordando com relatos anteriores que afirmaram

que o laser aplicado neste ambiente, favorece a neoformação óssea alveolar (32,

33, 35). O objetivo principal desta manobra foi estimular as células do ligamento

periodontal remanescentes no alvéolo, entretanto, os resultados obtidos indicam que

houve maior estimulação de células ósseas, provavelmente devido à pequena

quantidade de células do ligamento periodontal presentes no momento da

bioestimulação.

É importante ressaltar que a formação irregular do osso primário ou imaturo

nos reimplantes dentários sobre as áreas desprotegidas da superfície radicular que

caracteriza o quadro de anquilose alvéolo-dentária primária poderá ser de caráter

transitório ou evoluir para uma reabsorção por substituição, dependendo

principalmente da viabilidade do ligamento periodontal (47).

Nos traumatismos e reimplantes dentários existem áreas de necrose,

formação de coágulo e exsudato inflamatório no espaço e ligamento periodontal.

Discussão

Nessas áreas, nas primeiras horas, acontece a migração celular e diferenciação de

células osteoblásticas que imediata e aceleradamente depositam matriz óssea

desorganizada típica do osso imaturo, inclusive sobre áreas da superfície radicular

desprotegida pela perda de cementoblastos e pré-cemento em decorrência da lesão

provocada (72, 104). Dessa forma, como a atuação do laser na proliferação celular

dos osteoblastos, fibroblastos, macrófagos, linfócitos, auxiliando ainda na

diferenciação e ativação dos osteoclastos (93-95, 105-108) justifica uma resposta

acelerada. A predominância da proteína TRAP nos tempos extra-alveolares de 4 e

30 minutos no grupo do laser confirmam uma aceleração no processo de reparo

nesses grupos determinada pela sua ação na proliferação celular, pois quanto maior

o número de células viáveis maiores foram as diferenças observadas para esta

proteína.

É necessário ressaltar que cada um dos parâmetros do laser utilizado, ou

seja, o comprimento de onda, a potência de saída, modo de emissão, modo de

aplicação, número de aplicações, área de aplicação, energia, tempo de exposição;

densidade energética de radiação tem um papel importante no resultado obtido com

o uso do LLLT (105-107). Além disso, pesquisas mostram que sua associação com

drogas específicas ou fotossensibilizadores também podem modificar os resultados

(101, 109-112). Assim, a ação do laser (LLLT) para a área de traumatismo dentário

ainda necessita de uma ampla investigação pela grande quantidade de variáveis que

podem alterar a resposta obtida e o presente resultado deve ser interpretado como

um dos parâmetros iniciais.

Quanto ao reimplante dentário, muitos não acreditam no procedimento pelo

grande número de insucessos que observaram. Esses insucessos não advêm de

limitação biológica e sim de limitações técnicas e das condições em que chegam os

dentes a serem reimplantados. Portanto, o processo de reparo do reimplante deve

ser visto de maneira semelhante ao da cárie dentária e doença periodontal onde a

prevenção e a educação à população e aos profissionais são fundamentais para um

controle eficiente (72).

Conclusão

partir da análise dos resultados obtidos foi possível concluir que:

- a ação do laser em baixa intensidade, nas especificações deste estudo, não

favoreceu o processo de reparo após reimplante dentário em ratos;

- outros estudos, utilizando diferentes parâmetros de aplicação, são necessários

para melhor avaliar a efetividade do LLLT no reimplante dentário.

ãã

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Figuras

Fig. 1. Grupo C0 – Parede óssea alveolar (O) apresentando discreta neoformação

óssea (setas) não comprometendo o espaço do ligamento periodontal (LP)

preenchido por tecido conjuntivo com disposição oblíqua das fibras com relação à

superfície radicular. Dentina (D). H.E., original 160x.

Fig. 2. Grupo C0 – Áreas com reabsorção do cemento e da dentina (D) reparados

por cemento neoformado (setas). H.E., original 160x.

Figuras

Fig. 3. Grupo C0 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK (b), RANKL (c) e

TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

D D

Figuras

Fig. 4. Grupo L0 – Ligamento periodontal (LP) apresentando numerosas células

inflamatórias (setas). H.E., original 160x.

Fig. 5. Grupo L0 – Áreas de reabsorção radicular por substituição. Dentina (D); tecido

ósseo (O). H.E., original 160x.

Figuras

Fig. 6. Grupo L0 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK (b), RANKL (c) e

TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

D D

Figuras

Fig. 7. Grupo C30 – Áreas de reabsorção radicular por substituição. Pontos de

anquilose (seta). Tecido ósseo (O) neoformado preenchendo totalmente o espaço do

ligamento periodontal Dentina (D); tecido ósseo (O). H.E., original 160x.

Fig. 8. Grupo C30 – Áreas de reabsorção radicular inflamatória com presença de

numerosas células inflamatórias (setas). Dentina (D). H.E., original 160x.

Figuras

Fig. 9. Grupo C30 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK (b), RANKL (c) e

TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

D D

O O

Figuras

Fig. 10. Grupo L30 – Área onde o espaço do ligamento periodontal, encontra-se

preenchido por tecido ósseo (O) neoformado. O cemento (setas) em alguns pontos

encontra-se justaposto ao tecido ósseo (O), em outras sofreu reabsorção por

substituição juntamente com a dentina (D). H.E., original 160x.

Fig. 11. Grupo L30 Áreas de dentina (D) exibindo reabsorção inflamatória. Células

multinucleadas (setas). H.E., original 160x.

Figuras

Fig. 12. Grupo L30 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK (b), RANKL (c) e

TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

D D

Figuras

Fig. 13. Grupo C45 – Extensas áreas de cemento e dentina (D) reabsorvidos sendo

substituídos por tecido ósseo (O). H.E., original 63x.

Fig. 14. Grupo C45 – Área onde o espaço do ligamento periodontal encontra-se

preenchido por tecido ósseo (O). Dentina (D); cemento (setas). H.E., original 63x.

Figuras

Fig. 15. Grupo C45 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK (b), RANKL (c) e

TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

Figuras

Fig. 16. Grupo L45 – Áreas onde o espaço do ligamento periodontal encontra-se

preenchido por tecido ósseo. Tecido ósseo (O). Dentina (D). H.E., original 63x.

Fig. 17. Grupo L45 – Áreas da superfície radicular exibindo reabsorção de cemento e

dentina (D), com neoformação de tecido ósseo (O). H.E., original 63x.

Figuras

Fig. 18. Grupo L45 – Imunoistoquímica das proteínas OPG (a), RANK (b), RANKL (c) e

TRAP (d). Imunomarcações positivas (setas). Dentina (D); tecido ósseo (O). Original 100x.

D D

Anexos

Anexo A- Certificado da Comissão de Ética

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

Instructions to Authors – Dental Traumatology

Dental Traumatology

Official Publication of the International Association for Dental Traumatology and the

International Academy of Sports Dentistry

Edited by:

Lars Andersson

Print ISSN: 1600-4469

Online ISSN: 1600-9657

Frequency: Bi-monthly

Current Volume: 24 / 2008

ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2007: 37/51 (Dentistry, Oral Surgery & Medicine)

Impact Factor: 1.093

TopAuthor Guidelines

Content of Author Guidelines: 1. General, 2. Ethical Guidelines, 3. Submission of

Manuscripts, 4. Manuscript Types Accepted, 5. Manuscript Format and Structure, 6. After

Acceptance

Relevant Documents: Exclusive Licence Form

Useful Websites: Submission Site, Articles published in Dental Traumatology, Author

Services, Blackwell Publishing's Ethical Guidelines, Guidelines for Figures

1. GENERAL

Dental Traumatology is an international journal which aims to convey scientific and clinical

progress in all areas related to adult and pediatric dental traumatology. It aims to promote

communication among clinicians, educators, researchers, administrators and others interested

in dental traumatology. The journal publishes original scientific articles, review articles in the

form of comprehensive reviews or mini reviews of a smaller area, short communication about

clinical methods and techniques and case reports. The journal focuses on the following areas

related to dental trauma: Epidemiology and Social Aspects Tissue, Periodontal, and

Endodontic Considerations Pediatrics and Orthodontics Oral and Maxillofacial Surgery /

Transplants/Implants Esthetics / Restorations / ProstheticsPrevention and Sports Dentistry.

Please read the instructions below carefully for details on the submission of manuscripts, the

journal's requirements and standards as well as information concerning the procedure after a

manuscript has been accepted for publication in Dental Traumatology. Authors are

encouraged to visit Blackwell Publishing Author Services for further information on the

preparation and submission of articles and figures.

2. ETHICAL GUIDELINES

Dental Traumatology adheres to the below ethical guidelines for publication and research.

2.1. Authorship and Acknowledgements

Authors submitting a paper do so on the understanding that the manuscript have been read and

approved by all authors and that all authors agree to the submission of the manuscript to the

Journal. ALL named authors must have made an active contribution to the conception and

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

design and/or analysis and interpretation of the data and/or the drafting of the paper and ALL

must have critically reviewed its content and have approved the final version submitted for

publication. Participation solely in the acquisition of funding or the collection of data does not

justify authorship.

Dental Traumatology adheres to the definition of authorship set up by The International

Committee of Medical Journal Editors (ICMJE). According to the ICMJE authorship criteria

should be based on 1) substantial contributions to conception and design of, or acquisiation of

data or analysis and interpretation of data, 2) drafting the article or revising it critically for

important intellectual content and 3) final approval of the version to be published. Authors

should meet conditions 1, 2 and 3.

It is a requirement that all authors have been accredited as appropriate upon submission of the

manuscript. Contributors who do not qualify as authors should be mentioned under

Acknowledgements.

Acknowledgements: Under acknowledgements please specify contributors to the article other

than the authors accredited.

2.2. Ethical Approvals

Experimentation involving human subjects will only be published if such research has been

conducted in full accordance with ethical principles, including the World Medical Association

Declaration of Helsinki (version, 2002 www.wma.net/e/policy/b3.htm) and the additional

requirements, if any, of the country where the research has been carried out. Manuscripts must

be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the understanding

and written consent of each subject and according to the above mentioned principles. A

statement regarding the fact that the study has been independently reviewed and approved by

an ethical board should also be included. Editors reserve the right to reject papers if there are

doubts as to whether appropriate procedures have been used.

2.3 Clinical Trials

Clinical trials should be reported using the CONSORT guidelines available at www.consort-

statement.org. A CONSORT checklist should also be included in the submission material.

All manuscripts reporting results from a clinical trial must indicate that the trial was fully

registered at a readily accessible website, e.g., www.clinicaltrials.gov.

2.4 DNA Sequences and Crystallographic Structure Determinations

Papers reporting protein or DNA sequences and crystallographic structure determinations will

not be accepted without a Genbank or Brookhaven accession number, respectively. Other

supporting data sets must be made available on the publication date from the authors directly.

2.5 Conflict of Interest

Dental Traumatology requires that sources of institutional, private and corporate financial

support for the work within the manuscript must be fully acknowledged, and any potential

grant holders should be listed. Acknowledgements should be brief and should not include

thanks to anonymous referees and editors. The Conflict of Interest Statement should be

included as a separate document uploaded under the file designation "Title Page" to allow

blinded review.

2.6 Appeal of Decision

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

The decision on a paper is final and cannot be appealed.

2.7 Permissions

If all or parts of previously published illustrations are used, permission must be obtained from

the copyright holder concerned. It is the author's responsibility to obtain these in writing and

provide copies to the Publishers.

2.8 Copyright Assignment

Authors submitting a paper do so on the understanding that the work and its essential

substance have not been published before and is not being considered for publication

elsewhere. The submission of the manuscript by the authors means that the authors

automatically agree to assign exclusive copyright to Blackwell Publishing if and when the

manuscript is accepted for publication. The work shall not be published elsewhere in any

language without the written consent of the publisher. The articles published in this journal

are protected by copyright, which covers translation rights and the exclusive right to

reproduce and distribute all of the articles printed in the journal. No material published in the

journal may be stored on microfilm or videocassettes or in electronic database and the like or

reproduced photographically without the prior written permission of the publisher.

Upon acceptance of a paper, authors are required to assign the exclusive licence to publish

their paper to Blackwell Publishing. Assignment of the exclusive licence is a condition of

publication and papers will not be passed to the publisher for production unless licence has

been assigned. (Papers subject to government or Crown copyright are exempt from this

requirement; however, the form still has to be signed). A completed Exclusive Licence Form

must be sent to the address specified on the Exclusive Licence Form, before any manuscript

can be published. Authors must send the completed original Exclusive Licence Form by

regular mail upon receiving notice of manuscript acceptance, i.e., do not send the Exclusive

Licence form at submission. Faxing or e-mailing the Exclusive Licence Form does not meet

requirements.

For questions concerning copyright, please visit Blackwell Publishing's Copyright FAQ

3. MANUSCRIPT SUBMISSION PROCEDURE

Manuscripts should be submitted electronically via the online submission site

http://mc.manuscriptcentral.com/dt. The use of an online submission and peer review site

enables immediate distribution of manuscripts and consequentially speeds up the review

process. It also allows authors to track the status of their own manuscripts. Complete

instructions for submitting a paper is available online and below. Further assistance can be

obtained from Editorial Assistant Karin Andersson at dtof[email protected].

3.1. Getting Started

• Launch your web browser (supported browsers include Internet Explorer 6 or higher,

Netscape 7.0, 7.1, or 7.2, Safari 1.2.4, or Firefox 1.0.4) and go to the journal's online

Submission Site: http://mc.manuscriptcentral.com/dt

• Log-in or click the "Create Account" option if you are a first-time user.

• If you are creating a new account.

-After clicking on "Create Account", enter your name and e-mail information and click

"Next". Your e-mail information is very important.

-Enter your institution and address information as appropriate, and then click "Next."

-Enter a user ID and password of your choice (we recommend using your e-mail address as

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

your user ID), and then select your area of expertise. Click "Finish".

• If you have an account, but have forgotten your log in details, go to Password Help on the

journals online submission system http://mc.manuscriptcentral.com/dt and enter your e-mail

address. The system will send you an automatic user ID and a new temporary password.

• Log-in and select "Author Centre (enter correct name, different name might be used by

some online systems)."

3.2. Submitting Your Manuscript

• After you have logged into your "Author Centre", submit your manuscript by clicking the

submission link under "Author Resources".

• Enter data and answer questions as appropriate. You may copy and paste directly from your

manuscript and you may upload your pre-prepared covering letter.

• Click the "Next" button on each screen to save your work and advance to the next screen.

• You are required to upload your files.

-Click on the "Browse" button and locate the file on your computer.

-Select the designation of each file in the drop down next to the Browse button.

-When you have selected all files you wish to upload, click the "Upload Files" button.

• To allow double blinded review, please submit (upload) your main manuscript and title page

as separate files. Please upload:

-Your manuscript without title page under the file designation "main document"

-Figure files under the file designation "figures".

-The title page, Acknowledgements and Conflict of Interest Statement where applicable,

should be uploaded under the file designation "title page"

• Review your submission (in HTML and PDF format) before completing your submission by

sending it to the Journal. Click the "Submit" button when you are finished reviewing. All

documents uploaded under the file designation "title page" will not be viewable in the html

and pdf format you are asked to review in the end of the submission process. The files

viewable in the html and pdf format are the files available to the reviewer in the review

process.

3.3. Manuscript Files Accepted

Manuscripts should be uploaded as Word (.doc) or Rich Text Format (.rft) files (not write-

protected) plus separate figure files. GIF, JPEG, PICT or Bitmap files are acceptable for

submission, but only high-resolution TIF or EPS files are suitable for printing. The files

uploaded as main manuscript documents will be automatically converted to HTML and PDF

on upload and will be used for the review process. The files uploaded as title page will be

blinded from review and not converted into HTML and PDF. The main manuscript document

file must contain the entire manuscript including abstract, text, references, tables, and figure

legends, but no embedded figures. In the text, please reference figures as for instance "Figure

1", "Figure 2" etc to match the tag name you choose for the individual figure files uploaded.

Manuscripts should be formatted as described in the Author Guidelines below. Please note

that any manuscripts uploaded as Word 2007 (.docx) will be automatically rejected. Please

save any .docx file as .doc before uploading.

3.4. Blinded Review

All manuscripts submitted to Dental Traumatology will be reviewed by two experts in the

field. Dental Traumatology uses double blinded review. The names of the reviewers will thus

not be disclosed to the author submitting a paper and the name(s) of the author(s) will not be

disclosed to the reviewers.

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

To allow double blinded review, please submit (upload) your main manuscript and title page

as separate files.

Please upload:

• Your manuscript without title page under the file designation "main document"

• Figure files under the file designation "figures"

• The title page, Acknowledgements and Conflict of Interest Statement where applicable,

should be uploaded under the file designation "title page"

All documents uploaded under the file designation "title page" will not be viewable in the

html and pdf format you are asked to review in the end of the submission process. The files

viewable in the html and pdf format are the files available to the reviewer in the review

process.

3.5. Suggest a Reviewer

Dental Traumatology attempts to keep the review process as short as possible to enable rapid

publication of new scientific data. In order to facilitate this process, please suggest the names

and current email addresses of a potential international reviewer whom you consider capable

of reviewing your manuscript. In addition to your choice the journal editor will choose one or

two reviewers as well. When the review is done you will be notified under "Manuscripts with

decision" and through e-mail.

3.6. Suspension of Submission Mid-way in the Submission Process

You may suspend a submission at any phase before clicking the "Submit" button and save it

to submit later. The manuscript can then be located under "Unsubmitted Manuscripts" and

you can click on "Continue Submission" to continue your submission when you choose to.

3.7. E-mail Confirmation of Submission

After submission you will receive an e-mail to confirm receipt of your manuscript. If you do

not receive the confirmation e-mail after 24 hours, please check your e-mail address carefully

in the system. If the e-mail address is correct please contact your IT department. The error

may be caused by some sort of spam filtering on your e-mail server. Also, the e-mails should

be received if the IT department adds our e-mail server (uranus.scholarone.com) to their

whitelist.

3.8. Manuscript Status

You can access Manuscript Central any time to check your "Author Center" for the status of

your manuscript. The Journal will inform you by e-mail once a decision has been made.

3.9. Submission of Revised Manuscripts

To submit a revised manuscript, locate your manuscript under "Manuscripts with Decisions"

and click on "Submit a Revision". Please remember to delete any old files uploaded when you

upload your revised manuscript. Please also remember to upload your manuscript document

separate from your title page.

4. MANUSCRIPT TYPES ACCEPTED

Original Research Articles in all areas related to adult and pediatric dental traumatology are

of interest to Dental Traumatology. Examples of such areas are Epidemiology and Social

Aspects, Tissue, Periodontal, and Endodontic Considerations, Pediatrics and Orthodontics,

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

Oral and Maxillofacial Surgery/ Transplants / Implants, Esthetics / Restorations / Prosthetics

and Prevention and Sports Dentistry.

Review Papers: Dental Traumatology commissions review papers of comprehensive areas

and mini reviews of small areas. The journal also welcomes uninvited reviews. Reviews

should be submitted via the online submission site and are subject to peer-review.

Comprehensive Reviews should be a complete coverage of a subject discussed with the

Editor in Chief prior to preparation and submission. Comprehensive review articles should

include a description of search strategy of relevant literature, inclusion criteria, evaluation of

papers and level of evidence.

Mini Reviews are covering a smaller area and may be written in a more free format.

Case Reports: Dental Traumatology accepts Case Reports but these will only be published

online and will not be included in the printed version unless specifically requested by the

Editor-in-Chief.

Case Reports illustrating unusual and clinically relevant observations are acceptable, but their

merit needs to provide high priority for publication in the journal. They should be kept within

3-4 printed pages and need not follow the usual division into material and methods etc, but

should have an abstract. The introduction should be kept short. Thereafter the case is

described followed by a discussion.

Short Communications of 1-2 pages are accepted for quick publication. These papers need

not follow the usual division into Material and Methods, etc., but should have an abstract.

They should contain important new information to warrant publication and may reflect

improvements in clinical practice such as introduction of new technology or practical

approaches. They should conform to a high scientific and a high clinical practice standard.

Letters to the Editor, if of broad interest, are encouraged. They may deal with material in

papers published in Dental Traumatology or they may raise new issues, but should have

important implications.

Meetings: advance information about and reports from international meetings are welcome,

but should not be submitted via the online submission site, but send directly to the journal

administrator Karin Andersson at [email protected]

5. MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE

5.1. Format

Language: The language of publication is English. Authors for whom English is a second

language must have their manuscript professionally edited by an English speaking person

before submission to make sure the English is of high quality. It is preferred that manuscript is

professionally edited. A list of independent suppliers of editing services can be found at

www.blackwellpublishing.com/bauthor/english_language.asp. All services are paid for and

arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or

preference for publication.

Abbreviations, Symbols and Nomenclature: Abbreviations should be kept to a minimum,

particularly those that are not standard. Non-standard abbreviations must be used three or

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

more times and written out completely in the text when first used. Consult the following

sources for additional abbreviations: 1) CBE Style Manual Committee. Scientific style and

format: the CBE manual for authors, editors, and publishers. 6th ed. Cambridge: Cambridge

University Press; 1994; and 2) O'Connor M, Woodford FP. Writing scientific papers in

English: an ELSE-Ciba Foundation guide for authors. Amsterdam: Elsevier-Excerpta Medica;

1975.

Font: When preparing your file, please use only standard fonts such as Times, Times New

Roman or Arial for text, and Symbol font for Greek letters, to avoid inadvertent character

substitutions. In particular, please do not use Japanese or other Asian fonts. Do not use

automated or manual hyphenation. Use double spacing when writing.

5.2. Structure

All papers submitted to Dental Traumatology should include: Title Page, Abstract, Main text,

References and Tables, Figures, Figure Legends, Conflict of Interest Statement and

Acknowledgements where appropriate. Title page, Conflict of Interest Statement and any

Acknowledgements must be submitted as separate files and uploaded under the file

designation Title Page to allow blinded review. Manuscripts must conform to the journal

style. Manuscripts not complying with the journal style will be returned to the author(s).

Title Page: should be uploaded as a separate document in the submission process under the

file designation "Title Page" to allow blinded review. It should include: Full title of the

manuscript, author(s)' full names and institutional affiliations including city, country, and the

name and address of the corresponding author. If the author does not want the e-mail address

to be published this must be clearly indicated. The title page should also include a running

title of no more than 60 characters and 3-6 keywords.

Abstract is limited to 300 words in length and should contain no abbreviations. The abstract

should be included in the manuscript document uploaded for review as well as inserted

separately where specified in the submission process. The abstract should convey the essential

purpose and message of the paper in an abbreviated form. For original articles the abstract

should be structured with the following headings: Background/Aim, Material and Methods,

Results and Conclusions. For other article types, please choose headings appropriate for the

article.

Main Text of Original Articles should be divided into Introduction, Material and Methods,

Results and Discussion. During the editorial process reviewers and editors frequently need to

refer to specific portions of the manuscript, which is difficult unless the pages are numbered.

Authors should number all of the pages consecutively.

Introduction should be focused, outlining the historical or logical origins of the study and not

summarize the results; exhaustive literature reviews are inappropriate. Give only strict and

pertinent references and do not include data or conclusions from the work being reported. The

introduction should close with the explicit statement of the specific aims of the investigation

or hypothesis tested.

Materials and Methods must contain sufficient detail such that, in combination with the

references cited, all clinical trials and experiments reported can be fully reproduced. As a

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

condition of publication, authors are required to make materials and methods used freely

available to academic researchers for their own use. Describe your selection of observational

or experimental participants clearly. Identify the method, apparatus and procedures in

sufficient detail. Give references to established methods, including statistical methods,

describe new or modify methods. Identify precisely all drugs used including generic names

and route of administration.

(i) Clinical trials should be reported using the CONSORT guidelines available at

www.consort-statement.org. A CONSORT checklist should also be included in the

submission material. All manuscripts reporting results from a clinical trial must indicate that

the trial was fully registered at a readily accessible website, e.g., www.clinicaltrials.gov.

(ii) Experimental subjects: experimentation involving human subjects will only be published

if such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including the

World Medical Association Declaration of Helsinki (version, 2002

www.wma.net/e/policy/b3.htm) and the additional requirements, if any, of the country where

the research has been carried out. Manuscripts must be accompanied by a statement that the

experiments were undertaken with the understanding and written consent of each subject and

according to the above mentioned principles. A statement regarding the fact that the study has

been independently reviewed and approved by an ethical board should also be included.

Editors reserve the right to reject papers if there are doubts as to whether appropriate

procedures have been used.

(iii) Suppliers of materials should be named and their location (town, state/county, country)

included.

Results should present the observations with minimal reference to earlier literature or to

possible interpretations. Present your results in logical sequence in the text, tables and

illustrations giving the main or most important findings first. Do not duplicate data in graphs

and tables.

Discussion may usually start with a brief summary of the major findings, but repetition of

parts of the Introduction or of the Results sections should be avoided. The section should end

with a brief conclusion and a comment on the potential clinical relevance of the findings. Link

the conclusions to the aim of the study. Statements and interpretation of the data should be

appropriately supported by original references.

Main Text of Review Articles comprises an introduction and a running text structured in a

suitable way according to the subject treated. A final section with conclusions may be added.

Acknowledgements: Under acknowledgements please specify contributors to the article other

than the authors accredited. Acknowledgements should be brief and should not include thanks

to anonymous referees and editors.

Conflict of Interest Statement: All sources of institutional, private and corporate financial

support for the work within the manuscript must be fully acknowledged, and any potential

grant holders should be listed. The Conflict of Interest Statement should be included as a

separate document uploaded under the file designation "Title Page" to allow blinded review.

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

5.3. References

As the Journal follows the Vancouver system for biomedical manuscripts, the author is

referred to the publication of the International Committee of Medical Journal Editors:

Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. Ann Int Med

1997;126:36-47.

Number references consecutively in the order in which they are first mentioned in the text.

Identify references in texts, tables, and legends by Arabic numerals (in parentheses). Use the

style of the examples below, which are based on the format used by the US National Library

of Medicine in Index Medicus. For abbreviations of journals, consult the "List of the Journals

Indexed" printed annually in the January issue of Index Medicus.

We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference

management and formatting. EndNote reference styles can be searched for here:

www.endnote.com/support/enstyles.asp. Reference Manager reference styles can be searched

for here: www.refman.com/support/rmstyles.asp

Try to avoid using abstracts of articles as references. "Unpublished observations", "personal

communications", and "unaccepted papers" may not be used as references, although

references to written, not verbal, communications may be inserted (in parentheses) in the text.

Examples of correct forms of references are given below.

Journals:

Standard journal article - list all authors when six or fewer; when seven or more, list first six

authors and add et al.

Examples:

Andreasen JO, Hjørting-Hansen E. Replantation of teeth. I. Radiographic and clinical study of

100 human teeth. Acta Odontol Scand 1966;24:263-86.

Corporate author:

American Association of Endodontists. Recommended guidelines for treatment of the avulsed

tooth. J Endod 1983;9:571.

Books and other monographs:

Examples:

Personal author(s) Grossman LI. Endodontic practice. 10th ed. Philadelphia: Lea & Febiger;

1981. p. 176-9.

Chapter in book: Sanders B, Brady FA, Johnson R. Injuries. In: Sanders B, editor. Pediatric

oral and maxillofacial surgery. St. Louis: Mosby; 1979. p. 330-400.

5.4. Tables, Figures and Figure Legends

Tables should only be used to clarify important points. Tables must, as far as possible, be

self-explanatory. The tables should be numbered consecutively with Arabic numerals.

Figures: All graphs, drawings and photographs are considered figures and should be

numbered in sequence with Arabic numerals and abbreviated Fig(s). Each figure should have

a legend and all legends should be numbered correspondingly and included at the end of the

manuscript. Text on the figures should be in capitals. Figures should be planned to fit the

proportions of the printed page.

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

All figures and artwork must be provided in electronic format. Please save vector graphics

(e.g. line artwork) in Encapsulated Postscript Format (EPS) and bitmap files (e.g. half-tones)

or clinical or in vitro pictures in Tagged Image Format (TIFF). JPEG files are also acceptable.

Detailed information on our digital illustration standards can be found at

www.blackwellpublishing.com/bauthor/illustration.asp

Unnecessary figures and parts (panels) of figures should be avoided: data presented in small

tables or histograms, for instance, can generally be stated briefly in the text instead. Figures

should not contain more than one panel unless the parts are logically connected.

Figures divided into parts should be labelled with a lower-case, boldface, roman letter, a, b,

and so on, in the same type size as used elsewhere in the figure. Lettering in figures should be

in lower-case type, with the first letter capitalized. Units should have a single space between

the number and unit, and follow SI nomenclature common to a particular field. Unusual units

and abbreviations should be spelled out in full or defined in the legend. Scale bars should be

used rather than magnification factors, with the length of the bar defined in the legend rather

than on the bar itself. In general visual cues (on the figures themselves) are preferred to verbal

explanations in the legend (e.g. broken line, open red triangles etc)

Preparation of Electronic Figures for Publication: Although low quality images are

adequate for review purposes, print publication requires high quality images to prevent the

final product being blurred or fuzzy. Submit EPS (lineart) or TIFF (halftone/photographs)

files only. MS PowerPoint and Word Graphics are unsuitable for printed pictures. Do not use

pixel-oriented programmes. Scans (TIFF only) should have a resolution of 300 dpi (halftone)

or 600 to 1200 dpi (line drawings) in relation to the reproduction size (see below). EPS files

should be saved with fonts embedded (and with a TIFF preview if possible).

For scanned images, the scanning resolution (at final image size) should be as follows to

ensure good reproduction: lineart: >600 dpi; half-tones (including gel photographs): >300

dpi; figures containing both halftone and line images: >600 dpi.

Further information can be obtained at Blackwell Publishing's guidelines for figures:

www.blackwellpublishing.com/bauthor/illustration.asp.

Check your electronic artwork before submitting it:

www.blackwellpublishing.com/bauthor/eachecklist.asp

Permissions: If all or parts of previously published illustrations are used, permission must be

obtained from the copyright holder concerned. It is the author's responsibility to obtain these

in writing and provide copies to the Publishers.

Figure Legends should be a separate section of the manuscript, and should begin with a brief

title for the whole figure and continue with a short description of each panel and the symbols

used: they should not contain any details of methods

5.5. Supplementary Material

Publication in electronic formats has created opportunities for adding details or whole

sections in the electronic version only. Authors need to work closely with the editors in

developing or using such new publication formats.

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

Supplementary Material, such as data sets or additional figures or tables, that will not be

published in the print edition of the journal, but which will be viewable via the online edition,

can be submitted. It should be clearly stated at the time of submission that the Supplementary

Material is intended to be made available through the online edition. If the size or format of

the Supplementary Material is such that it cannot be accommodated on the journal's Web site,

the author agrees to make the Supplementary Material available free of charge on a permanent

Web site, to which links will be set up from the journal's website. The author must advise

Blackwell Publishing if the URL of the website where the Supplementary Material is located

changes. The content of the Supplementary Material must not be altered after the paper has

been accepted for publication.

The availability of Supplementary Material should be indicated in the main manuscript by a

paragraph, to appear after the References, headed "Supplementary Material" and providing

titles of figures, tables, etc. In order to protect reviewer anonymity, material posted on the

authors Web site cannot be reviewed. The Supplementary Material is an integral part of the

article and will be reviewed accordingly.

Extra issues - Larger papers or monographs may be published as additional issues (numbered

as the ordinary issues), the full cost being paid by the author. Further information may be

obtained from the editor.

6. AFTER ACCEPTANCE

Upon acceptance of a paper for publication, the manuscript will be forwarded to the

Production Editor who is responsible for the production of the journal.

6.1 Proof Corrections

The corresponding author will receive an email alert containing a link to a web site. A

working e-mail address must therefore be provided for the corresponding author. The proof

can be downloaded as a PDF (portable document format) file from this site. Acrobat Reader

will be required in order to read this file. This software can be downloaded (free of charge)

from the following web site: www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. This will

enable the file to be opened, read on screen and printed out in order for any corrections to be

added. Further instructions will be sent with the proof.

6.2 OnlineEarly (Publication Prior to Print)

Dental Traumatology is covered by Blackwell Publishing's OnlineEarly service. OnlineEarly

articles are complete full-text articles published online in advance of their publication in a

printed issue. OnlineEarly articles are complete and final. They have been fully reviewed,

revised and edited for publication, and the authors' final corrections have been incorporated.

Because they are in final form, no changes can be made after online publication. The nature of

OnlineEarly articles means that they do not yet have volume, issue or page numbers, so

OnlineEarly articles cannot be cited in the traditional way. They are therefore given a Digital

Object Identifier (DOI), which allows the article to be cited and tracked before it is allocated

to an issue. After print publication, the DOI remains valid and can continue to be used to cite

and access the article.

Anexo B – Normas para publicação – Dental Traumatology

6.3 Author Services

Online production tracking is available for your article through Blackwell's Author Services.

Author Services enables authors to track their article - once it has been accepted - through the

production process to publication online and in print. Authors can check the status of their

articles online and choose to receive automated e-mails at key stages of production. The

author will receive an e-mail with a unique link that enables them to register and have their

article automatically added to the system. Please ensure that a complete e-mail address is

provided when submitting the manuscript. Visit www.blackwellpublishing.com/bauthor for

more details on online production tracking and for a wealth of resources including FAQs and

tips on article preparation, submission and more.

For more substantial information on the services provided for authors, please see Blackwell

Publishing Author Services

6.4 Author Material Archive Policy

Please note that unless specifically requested, Blackwell Publishing will dispose of all

hardcopy or electronic material submitted two months after publication. If you require the

return of any material submitted, please inform the editorial office or production editor as

soon as possible.

6.5 Offprints and Extra Copies

A PDF offprint of the online published article will be provided free of charge to the

corresponding author, and may be distributed subject to the Publisher's terms and conditions.

Additional paper offprints may be ordered online. Please click on the following link, fill in the

necessary details and ensure that you type information in all of the required fields: Offprint

Cosprinters.If you have queries about offprints please email [email protected]

6.6 Note to NIH Grantees

Pursuant to NIH mandate, Wiley-Blackwell will post the accepted version of contributions

authored by NIH grant-holders to PubMed Central upon acceptance. This accepted version

will be made publicly available 12 months after publication. For further information, see

www.wiley.com/go/nihmandate

Anexo C – Imagens Material e Método

Fig. 19. Animais acondicionados em gaiolas

no Biotério e Centro Cirúrgico “Ilídio

Teodoro”.

Fig. 20. Anestésicos utilizados: Dopalen

(Cloridrato de Ketamina) e Dopaser

(Cloridrato de Xilazina).

Fig. 21. Luxação do incisivo superior direito.

Fig. 22. Exodontia do incisivo superior direito.

Fig. 23. Dente mantido em recipiente com soro

fisiológico.

Fig. 24. Remoção da papila dental e órgão do

esmalte com lâmina de bisturi nº15.

Fig. 25. Pulpectomia por via retrógrada Fig. 26. Irrigação com soro fisiológico.

Anexo C – Imagens Material e Método

Fig. 27. Secagem do canal radicular com cone

de papel absorvente.

Fig. 28. Preenchimento do canal radicular com

pasta de hidróxido de cálcio e propilenoglicol.

Fig. 29. Irrigação do alvéolo com soro

fisiológico.

Fig. 30. Reimplante dentário.

Fig. 31. Aparelho de laser em baixa

intensidade utilizado.

Fig. 32. Aplicação do laser, luz visível com

movimento de varredura na superfície lingual

do dente.

Fig. 33. Aplicação do laser em baixa

intensidade, luz infravermelha no alvéolo.

Fig. 34. Antibiótico utilizado: Pentabiótico

pequeno porte.

Anexo C – Imagens Material e Método

Fig. 35. Câmera digital (JVC TK-1270 Color Vídeo Câmera) acoplada ao

microscópio Carl Zeiss (Axiolab).

Fig. 36. Visualização das imagens no Programa Image Lab. Demarcação da área

total.

Anexo C – Imagens Material e Método

Fig. 37. Planilha de resultado - Image Lab. Área total.

Fig. 38. Visualização da demarcação do perímetro total - Image Lab.

Anexo C – Imagens Material e Método

Fig. 39. Visualização da demarcação da anquilose (seta) - Image Lab.

Fig. 40. Visualização da demarcação da área de reabsorção inflamatória - Image Lab.

Anexo D- Dados complementares da análise histomorfométrica

Tabela 7. Valores obtidos após a quantificação das áreas de reabsorções e anquilose

utilizando o programa ImageLab 2001 (Diracom 3).

Dentina Total Reabsorção por substituição Reabsorção inflamatória Anquilose

lâmina Soma Soma % escore Soma % escore Total Soma % escore

C0 -1 344378,5 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2749,6 0,0 0,00 1

C0 -2 382248,5 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2940,5 0,0 0,00 1

C0 -3 484008,0 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2835,5 0,0 0,00 1

C0 -4 460722,0 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2558,8 0,0 0,00 1

C0 -5 458825,0 17716,5 3,86 2 7431,0 1,62 2 3129,1 0,0 0,00 1

C0 -6 419755,5 37473,0 8,93 2 1552,5 0,37 2 2987,3 55,3 1,85 2

C0 -7 462467,0 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 3029,9 0,0 0,00 1

C0 -8 333596,0 46878,0 14,05 2 9967,0 2,99 2 2767,6 0,0 0,00 1

C0 -9 249770,5 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2704,6 0,0 0,00 1

C0 -10 292760,5 0,0 0,00 1 7358,5 2,51 2 2727,2 0,0 0,00 1

C30-1 544894,5 2978,5 0,55 2 0,0 0,00 1 2669,8 347,0 13,00 2

C30-2 247012,5 0,0 0,00 1 94826,0 38,39 2 2751,4 0,0 0,00 1

C30-3 440682,0 4221,5 0,96 2 31300,5 7,10 2 2799,6 120,0 4,29 2

C30-4 224701,5 11193,0 4,98 2 0,0 0,00 1 2441,9 0,0 0,00 1

C30-5 439947,5 71018,0 16,14 2 0,0 0,00 1 3049,0 396,7 13,01 2

C30-6 442400,5 30891,0 6,98 2 0,0 0,00 1 2847,2 0,0 0,00 1

C30-7 350243,0 14884,1 4,25 2 0,0 0,00 1 3177,7 84,5 2,66 2

C30-8 443869,0 27952,5 6,30 2 6772,0 1,53 2 3192,2 292,1 9,15 2

C30-9 290223,0 7936,1 2,73 2 0,0 0,00 1 3013,8 0,0 0,00 1

C30-10 392129,5 38664,0 9,86 2 57330,0 14,62 2 2727,2 277,4 10,17 2

C45-1 354320,5 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 3155,1 23,4 0,74 2

C45-2 426618,5 38421,6 9,00 2 15973,5 3,74 2 3086,9 672,8 21,80 2

C45-3 504186,0 25136,0 4,98 2 7343,0 1,46 2 3317,5 365,6 11,02 2

C45-4 381188,5 11673,0 3,06 2 2769,0 0,73 2 3121,0 401,7 12,87 2

C45-5 511715,0 73853,0 14,43 2 33933,5 6,63 2 3190,6 157,2 4,93 2

C45-6 349527,0 70760,0 20,24 2 38561,0 11,03 2 2587,6 0,0 0,00 1

C45-7 369652,0 60349,0 16,32 2 56053,0 15,16 2 2500,7 231,5 9,26 2

C45-8 452766,0 8898,0 1,96 2 0,0 0,00 1 3290,7 1770,1 53,79 3

L0-1 385099,0 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2832,0 0,0 0,00 1

L0-2 379078,0 8153,5 2,15 2 4971,0 1,31 2 3353,3 0,0 0,00 1

L0-3 338054,5 34159,4 10,10 2 43116,8 12,75 2 3048,5 1400,3 45,94 2

L0-4 328834,0 11264,5 3,42 2 0,0 0,00 1 2902,5 137,3 4,73 2

L0-5 310230,0 0,0 0,00 1 550,5 0,18 2 2717,0 0,0 0,00 1

L0-6 332731,5 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 2352,2 0,0 0,00 1

L0-7 435354,5 12002,0 2,76 2 23987,5 5,64 2 2370,5 0,0 0,00 1

L0-8 454963,5 6506,5 1,43 2 2832,5 0,62 2 3423,6 439,5 12,84 2

L30-1 923043,0 61814,0 6,70 2 0,0 0,00 1 3011,7 82,8 2,75 2

L30-2 326724,0 74288,0 22,74 2 51124,0 15,65 2 2882,0 18,0 0,62 2

L30-3 390315,5 56790,0 14,55 2 2916,0 0,75 2 2728,5 311,2 11,41 2

L30-4 470324,0 21166,5 2,50 2 0,0 0,00 1 3073,8 757,0 24,63 2

L30-5 367961,0 34495,0 9,37 2 5514,0 1,50 2 3161,3 74,3 2,35 2

L30-6 343746,5 46897,0 13,64 2 7051,5 2,05 2 2942,0 645,8 21,95 2

L30-7 557573,0 0,0 0,00 1 0,0 0,00 1 3177,6 1616,0 50,85 3

L30-8 483527,5 25299,0 5,23 2 0,0 0,00 1 3205,1 652,0 20,34 2

L45-1 387574,0 161417,0 41,64 2 0,0 0,00 1 2522,0 0,0 0,00 1

L45-2 362706,0 54394,5 14,99 2 19607,0 5,41 2 2818,0 546,7 19,40 2

L45-3 322612,0 51330,5 15,91 2 33502,0 10,38 2 2493,5 63,0 2,53 2

L45-4 414511,0 11545,6 2,78 2 0,0 0,00 1 3022,7 350,0 11,58 2

L45-5 473480,5 35712,0 7,54 2 0,0 0,00 1 3052,5 83,0 2,72 2

L45-6 382939,5 36729,5 9,59 2 14879,0 3,89 2 2982,9 32,6 1,09 2

L45-7 559906,5 49202,0 8,79 2 55679,0 9,94 2 3220,8 477,8 14,83 2

L45-8 494634,5 253224,0 51,19 3 0,0 0,00 1 2940,7 472,9 16,08 2

L45-9 374761,5 67369,0 17,98 2 0,0 0,00 1 2798,0 206,6 7,39 2

Anexo D- Dados complementares da análise histomorfométrica

Gráfico 3. Valores médios de anquilose de cada grupo.

Anquilose

C0 L0 C30 L30 C45 L45

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

C30

L30

C45

L45

Grupos

Escores

Gráfico 4. Valores médios de reabsorção por substituição de cada grupo.

Substituição

C0 L0 C30 L30 C45 L45

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

C30

L30

C45

L45

Grupos

Escores

Gráfico 5. Valores médios de reabsorção inflamatória de cada grupo.

Inflamatória

C0 L0 C30 L30 C45 L45

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

C30

L30

C45

L45

Grupos

Escores

Anexo E- Dados complementares da análise Imunoistoquímica

Tabela 8. Escores atribuídos para distribuição das imunomarcações presentes para as

proteínas OPG, RANK, RANKL e TRAP.

Espécime Controle RANK RANKL OPG TRAP

C0 -1

1 1 4 1 2

C0 -2

1 1 4 1 2

C0 -3

1 1 2 1 2

C0 -4

1 1 3 1 2

C0 -5

1 1 3 1 2

C0 -6

1 1 4 1 2

C0 -7

1 1 4 1 2

C0 -8

1 1 2 1 2

C0 -9

1 2 3 1 2

C0 -10

1 1 3 2 3

C30-1

1 3 2 4 2

C30-2

1 3 3 2 2

C30-3

1 3 3 4 2

C30-4

1 3 3 2 2

C30-5

1 4 3 3 1

C30-6

1 3 3 2 2

C30-7

1 3 3 4 2

C30-8

1 3 3 2 2

C30-9

1 3 3 4 2

C30-10

1 3 3 2 2

C45-1

1 3 3 3 2

C45-2

1 3 2 3 3

C45-3

1 4 3 3 2

C45-4

1 3 2 3 3

C45-5

1 4 4 3 2

C45-6

1 4 3 3 2

C45-7

1 4 3 3 2

C45-8

2 3 2 2 3

L0-1

1 2 3 2 3

L0-2

1 1 4 3 4

L0-3

1 1 4 1 3

L0-4

1 1 4 2 3

L0-5

1 1 4 2 3

L0-6

1 2 3 2 3

L0-7

1 1 4 3 4

L0-8

1 1 4 1 3

L30-1

1 2 2 3 4

L30-2

1 3 3 3 2

L30-3

1 2 2 4 2

L30-4

1 3 3 3 2

L30-5

1 2 4 2 2

L30-6

1 2 2 3 3

L30-7

1 2 2 3 3

L30-8

1 3 3 3 2

L45-1

1 3 2 2 3

L45-2

1 3 2 3 2

L45-3

1 2 2 2 2

L45-4

2 3 2 3 2

L45-5

2 3 3 3 2

L45-6

1 3 2 2 2

L45-7

1 3 3 4 2

L45-8

1 3 2 2 2

L45-9

1 3 2 3 2

Anexo E- Dados complementares da análise Imunoistoquímica

100

Gráfico 6. Valores médios do grupo C0 e L0 avaliando as proteínas OPG, RANK, RANKL e

TRAP.

RANK

RANKL

OPG

TRAP

C0 L0

Escores

Gráfico 7. Valores médios do grupo C30 e L30 avaliando as proteínas OPG, RANK, RANKL

e TRAP.

RANK

RANKL

OPG

TRAP

L30

C30

Escores

Gráfico 8. Valores médios do grupo C45 e L45 avaliando as proteínas OPG, RANK, RANKL

e TRAP.

RANK

RANKL

OPG

TRAP

L45

C45

Escores

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