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UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE
FACULDADE DE CIÊNCIAS E SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Suzana Coelho Soares Moraes
Achillea millefolium L
– ASTERACEAE
PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA, PERFIL ESPECTROMÉTRICO E ATIVIDADE
ANTIFÚNGICA.
Governador Valadares
2008
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1
SUZANA COELHO SOARES MORAES
Achillea millefolium L.
– ASTERACEAE
PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA, PERFIL ESPECTROMÉTRICO E ATIVIDADE
ANTIFÚNGICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências
Biológicas da Faculdade de Ciências da
Saúde da Univale, para a obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas. Área de
Concentração: Imunopatologia das doenças
infecto-contagiosas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Loreto Peres
Governador Valadares
2008
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2
Moraes, Suzana Coelho Soares
Achillea millefolium L. – Asteraceae:
Prospecção fitoquímica,
perfil espectrométrico e atividade a
ntifúngica / Suzana Coelho
Soares Moraes. -- 2008.
89 f.
Dissertação (mestrado) –
Universidade Vale do Rio Doce,
Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências
Biológicas, Governador Valadares, MG, 2008.
Orientador: Rodrigo Loreto Peres
1. Plantas medicinais. 2. Achillea millefolium L-
asteraceae. 3.
Análise espectral. 4. Análise antifúngica. I. Peres, Rodrigo Loreto.
II. Universidade Vale do Rio Doce. III. Título.
CDD 581.634
3
Ao meu querido esposo Cícero – meu eterno
amor.
Aos meus lindos filhos Gabriel e Henrique –
meus maiores presentes.
À minha família: Matozinhos, Izaura, Suzete e
Weber – meu bem maior.
4
AGRADECIMENTOS:
Á DEUS, que me guiou nos caminhos dando força e persistência para alcançar meu objetivo.
Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Loreto Peres pelo apoio, incentivo e conhecimentos os
quais foram muito importantes para a realização desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcelo Barcelos da Rosa, que necessitou se afastar, mas mesmo à distância,
continuou apoiando e ajudando-me a concluir o presente trabalho.
À Professora Drª. Alda Maria Soares Oliveira pela implantação do Mestrado na UNIVALE,
pela confiança, incentivo, amizade e “boa conversa” sempre que nos encontramos.
Aos alunos de iniciação científica do laboratório de química da UNIVALE, principalmente à
Paula Alves Ferreira cuja ajuda foi imprescindível na realização da primeira parte
experimental do trabalho.
À Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais, FAPEMIG, pelo suporte financeiro.
Aos alunos do curso de mestrado pela amizade e boa convivência durante o período de aulas
do curso.
MUITO OBRIGADA!!!
5
“(...) Uma descoberta não consiste em ver o que
todo mundo não viu, mas em pensar o que
ninguém pensou”.
Goethe
“(...) Aquilo que você mais sabe ensinar, é o que
mais precisa aprender...”
Richard Bach (Ilusões)
“(...) Mestre não é quem sempre ensina, mas
quem de repente aprende.”
João Guimarães Rosa
6
RESUMO
A Achillea millefolium é uma planta da família Asteraceae, conhecida popularmente como
milfolhas, erva-do-carpinteiro, tem sido usada na medicina popular desde a antiguidade com
várias finalidades: antiinflamatória, antifúngica, antibacteriana, entre outras. Os objetivos do
presente estudo foram realizar a prospecção fitoquímica e traçar o perfil espectrométrico da
planta em solventes polares e apolares, avaliando a influência do pH sobre o extrato aquoso, a
influência de diversos tempos e concentrações de carvão ativo na extração da clorofila e dos
compostos da planta, comparar a extração utilizando ultra-som e sem ultrasom e avaliar a
atividade antifúngica da planta em fitopatógeno (Colletotrichum musae) utilizando o método
de infusão do extrato no meio de cultura. Os bioensaios foram realizados com o extrato
etanólico seco. Esse extrato foi submetido à cromatografia preparativa em camada delgada
(CCD) sendo realizado o fracionamento dos componentes da amostra. Observou-se a
separação de seis frações as quais foram biomonitoradas. Os resultados obtidos na prospecção
fitoquímica revelaram a presença de flavonóides, taninos e cumarinas. Os perfis espectrais
apresentaram o metanol como melhor solvente na extração dos compostos polares e apolares
da Achillea millefolium. Referente às análises de pH, verificou-se que em pH alcalino os
componentes químicos do extrato tornam-se deprotonados. O uso do carvão ativo 1g/10
minutos, mostrou ser o tempo e concentração ideais para extração de 90% da clorofila e 80%
dos constituintes da planta.Constatou-se uma maior eficiência de extração com ultra-som em
cerca de 20%. A atividade antifúngica foi evidenciada contra Colletotrichum musae sendo
que o extrato seco etanólico inibiu em cerca de 56% o crescimento do patógeno e a fração A6
produziu 100% de inibição do crescimento micelial.
Palavras-chave: Achillea millefolium, Compostos fenólicos, Atividade antifúngica,
Espectrofotometria
7
ABSTRACT
Achillea millefolium (Asteraceae), known as milefolio, yarrow, has been used in folk
medicine since antiquity with several activites: anti-inflamatory, antifungal, antibacterial,
analgesic and others. The aim of the present study was to take the fitoquimic assay and to
obtain the spectrophotometer profile using polar and apolar solvents, evaluating the influency
of the pH in the aqueous extract and the influence of the different times and concentrations
of active coal in the chlorophyll and compounds of plant extraction and to compare the
extraction using ultrasound and without ultrasound. The antifungal activity in phytopatogenic
(Colletotrichum musae) was investigated using extract infusion method in the fungus
culture.The bioassays were evaluated using dry ethanol extract and after the preparative
chromatography was used to separate the fractions of the components of the sample. 6(six)
fractions were detected and bio-monitoring. The results from phytochemical assays presented
flavonoids, coumarins and tanning barks. The spectrometric profiles showed the methanol as
the best solvent to extract the polar and apolar compounds. About the pH, it was verified that
in alkaline it made deprotonations of the quimic compounds of the extract.The use of active
coal 1g for 10min, as the concentration and the ideal time for the 90% of chlorophyll
extraction and 80% of plant compounds extraction Using ultrasound it was 20% more
efficient to extract the compounds of the extract.Antifungal activity in Colletotrichum musae
using dry ethanol extract produced 56% of inhibition of the phytopatogenic and the A6
fraction showed 100% of inhibition of the microorganism.
Key words: Achillea millefolium, Fenolic composts, Antifungal activity, Spectrophotometer.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Molécula de etoposídeo............................................................................................17
Figura 2 - Molécula de artemisinina.........................................................................................17
Figura 3 - Molécula de taxol.....................................................................................................17
Figura 4 - Principais vias do metabolismo secundário.............................................................21
Figura 5 - Rota de biossíntese de compostos fenólicos derivados da fenilalanina...................22
Figura 6 - Rota de síntese de flavonóides.................................................................................23
Figura 7 - Exemplos de cumarinas............................................................................................23
Figura 8 - Procedimentos gerais para obtenção de compostos biologicamente ativos.............24
Figura 9 - Gráfico de crescimento da bolha com o tempo........................................................28
Figura 10 - Foto do momento da implosão da bolha de cavitação...........................................28
Figura 11 - Espectrofotômetro de varredura UV-visível Femto modelo 800 XI......................30
Figura 12 - Detalhes de A. millefolium L e folha da planta.......................................................39
Figura 13 - Flores de A. millefolium.........................................................................................40
Figura 14 - Exemplo de componentes do óleo essencial de A. millefolium..............................42
Figura 15 - Exemplos de flavonóides de A.millefolium............................................................43
Figura 16 - Exemplos de outros compostos presentes em A.millefolium..................................43
Figura 17 - Fluxograma das análises experimentais realizadas com A.millefolium..................48
Figura 18 - Esquema de distribuição do extrato em cavidade central na placa de Petri com
conídios suspensos no meio de cultura BDA................................................... 54
Figura 19 - Perfil espectrofotométrico da Achillea millefolium para diferentes solventes.......60
Figura 20 - Influência de valores extremos de pH sobre o extrato aquoso da Achillea
millefolium..............................................................................................................61
Figura 21 - Adsorção da clorofila usando 0,1g de carvão ativo para o extrato metanólico de
Achillea millefolium................................................................................................62
Figura 22 - Adsorção da clorofila utilizando-se 0,5 g de carvão ativo para o extrato
metanólico da Achillea millefolium.........................................................................63
Figura 23 - Adsorção da clorofila utilizando-se 1,0 g de carvão ativo para o extrato
metanólico da Achillea millefolium.........................................................................63
Figura 24 - Decaimentos adsortivos da clorofila no carvão ativo, de acordo com as massas de
carvão usadas..........................................................................................................65
9
Figura 25 - Decaimentos dos compostos de A.millefolium utilizando 0,5 e 1,0 g de carvão
ativo.........................................................................................................................65
Figura 26 - Perfil espectrofotométrico da extração dos compostos utilizando maceração.......66
Figura 27 - Perfil espectrofotométrico da extração dos compostos utilizando ultra-som.........67
Figura 28 - Resultado de teste de inibição do patógeno Colletotrichum musae por ação do
extrato seco etanólico de A.millefolium.................................................................68
Figura 29 - Medidas dos coeficientes de retenção das frações.................................................69
Figura 30 - Resultado de teste de inibição do patógeno Colletotrichum musae por ação das
frações A3, A5 e A6 da A. millefolium...................................................................70
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Solvente e os seus respectivos metabólitos secundários extraído............................26
Tabela 2 - Enquadramento taxonômico da A. millefolium........................................................38
Tabela 3 - Descrição da composição dos tratamentos veiculados em placa com dupla camada
de gel.......................................................................................................................54
Tabela 4 - Peso das frações obtidas por CCD da Achillea millefolium.....................................57
Tabela 5 - Resultados da prospecção fitoquímica para Achillea millefolium...........................58
Tabela 6 - Dados de absorção para cromóforos isolados..........................................................60
Tabela 7 - Relação entre o decaimento da clorofila e dos compostos da A.millefolium L........66
Tabela 8 - Frações do extrato seco da Achillea millefolium e seus respectivos índices de
retenção...................................................................................................................69
Tabela 9 - Efeito de diferentes frações do extrato etanólico de A.millefolium sobre o
crescimento radial do fungo Colletotrichum musae em meio BDA, a 28ºC..........70
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A – absorbância
aC- antes de Cristo
B - caminho óptico
BDA - Batata dextrose agar
C - concentração da espécie absorvente
CCD - cromatografia em camada delgada
CL - cromatografia líquida
dC- antes de Cristo
DMSO - dimetilsulfóxido
ε - absortividade molar
EM - espectrometria de massas
g - grama
HCl - ácido clorídrico
I - intensidade da radiação que emerge da amostra
Io - intensidade da radiação monocromática que incide na amostra
IV - infravermelho
K - constante característica do soluto
KHz - quilohertz
MHz - megahertz
Kg - quilograma
Log - logarítmo
M - molaridade
m - massa
mg - miligramas
min. - minutos
ml - mililitros
NaOH - hidróxido de sódio
nm - nanômetros
µl - microlitro
12
pH - potencial hidrogeniônico
R
f
- Fator de retenção
RMN - ressonância magnética nuclear
T- transmitância
US - ultra-som
UV - ultravioleta;
V - volume
var. - variedade
VIS - visível
λ - comprimento de onda
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO…………….…....……………..........……..........................……..............16
1.1 OBJETIVOS.....………………………………………………..........................................19
1.1.1 Gerais…………………….……………………....…..................................……...........19
1.1.2 Específicos…..………………..……………………...…....………................................19
2 REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................20
2.1 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS PLANTAS.......................................................20
2.2 CRITÉRIOS EXPERIMENTAIS PARA A OBTENÇÃO DE PRINÍCPIOS ATIVOS DE
PLANTAS MEDICINAIS..................................................................................................24
2.2.1 Ultra-som........................................................................................................................26
2.2.2 Método Cromatográfico................................................................................................28
2.2.2.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD).................................................................29
2.2.3 Técnica Espectrométrica...............................................................................................30
2.2.3.1 Espectrometria de absorção na região Ultravioleta Visível..........................................30
2.3 FUNGOS FITOPATOGÊNICOS.......................................................................................33
2.4 UTILIZAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS NO CONTROLE DE FUNGOS
FITOPATOGÊNICOS.....................................................................................................34
2.4.1 Colletotrichum musae.....................................................................................................36
2.5 FAMÍLIA ASTERACEAE...................................................................................................37
2.5.1 Achillea millefolium L....................................................................................................38
2.5.1.1 Composição química....................................................................................................40
2.5.1.2 Ação Farmacológica.....................................................................................................43
2.5.1.3 Aspectos toxicológicos.................................................................................................46
3 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................48
3.1 MATERIAL VEGETAL....................................................................................................49
3.2 SECAGEM E MOAGEM..................................................................................................49
3.3 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA............................................................ 49
3.3.1 Preparação dos extratos brutos....................................................................................49
3.3.2 Ensaios com os extratos aquosos, etanóico e diclorometano..................................... 50
3.3.2.1 Análise de açúcares redutores.......................................................................................50
14
3.3.2.2 Análise de compostos fenólicos....................................................................................50
3.3.2.3 Análise de taninos.........................................................................................................50
3.3.2.4 Análise de flavonóides..................................................................................................51
3.3.2.5 Análise de cumarinas....................................................................................................51
3.4 ANÁLISES ESPECTROMÉTRICAS................................................................................51
3.4.1 Preparo dos extratos brutos..........................................................................................51
3.4.1.1 Para estudo utilizando diversos solventes.....................................................................51
3.4.1.2 Para estudo utilizando carvão ativo como extrator de clorofila e dos compostos da
planta..........................................................................................................................52
3.4.1.3 Para estudo da hidrólise do estrato aquoso...................................................................52
3.4.1.4 Para comparação entre ultra-som e maceração.............................................................52
3.5 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA.................................................................53
3.5.1 Microorganismo utilizado.............................................................................................53
3.5.2 Metodologia para biomonitoramento...........................................................................53
3.5.2.1 Placa com dupla camada de gel....................................................................................53
3.5.2.2 Infusão do extrato no meio de cultura...........................................................................54
3.6 SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA..............................................................................55
3.6.1 Preparo do extrato seco.................................................................................................55
3.6.2 Diluição do extrato seco.................................................................................................55
3.6.3 Cromatografia Planar Preparativa..............................................................................55
3.6.3.1 Preparo das placas.........................................................................................................55
3.6.3.2 Escolha do solvente de eluição.....................................................................................56
3.6.3.3 Aplicação da amostra....................................................................................................56
3.6.3.4 Ensaios com frações do extrato seco etanólico.............................................................56
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................58
4.1 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA DA Achillea millefolium...............................................58
4.2 ANÁLISE EXPECTROMÉTRICA....................................................................................59
4.2.1 Perfil espectrométrico para diferentes solventes.........................................................59
4.2.2 Hidrólise do extrato aquoso da Achillea millefolium..................................................61
4.2.3 Influência do tempo e massa de carvão ativo na extração de clorofila e dos
compostos da planta.......................................................................................................62
4.2.4 Estudo comparativo entre ultra-som e maceração.....................................................66
4.3 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA.................................................................67
5 CONCLUSÃO......................................................................................................................72
15
5.1 PERFIL FITOQUÍMICO PRELIMINAR..........................................................................72
5.2 ANÁLISES ESPECTROMÉTRICAS................................................................................72
5.3 ANÁLISE ANTIFÚNGICA...............................................................................................72
6 PERSPECTIVAS.................................................................................................................74
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................75
16
1 INTRODUÇÃO
A fitoterapia data de antes do início do cristianismo perfazendo pergaminhos, escritas
e conhecimentos transmitidos de pai para filho que sobreviveu até os dias atuais. Na
Mesopotâmia, em 3000 a.C. foram encontrados registros em placas de barro, os quais foram
considerados os primeiros documentos escritos, relatos sobre a utilização de ervas com fins
medicinais. Hipócrates também descreve novos conhecimentos sobre o uso terapêutico dos
vegetais em 460-377 aC. Também Galeno (131-201 d.C.) preparou formulações à base de
plantas(FERRO, 2006). Entretanto, foi apenas em 1492 que Paracelsus atentou pela
necessidade de se descobrir o que as plantas medicinais possuíam, pois eram capazes de curar.
“Archidoxa” do “Arcanum” foi o primeiro relato a respeito da procura pelos princípios ativos,
escrito por Paracelsus (CORDELL, 2000). Em 1500, Pero Vaz de Caminha faz a primeira
referência no Brasil sobre o uso de plantas medicinais (FERRO, 2006).
A necessidade de se descobrir compostos responsáveis pela cura começou por volta de
1780 com o trabalho de Scheele, onde foram estudados ácidos orgânicos de várias plantas. No
final do século XIX com os trabalhos de Lavoisier, Berzelius e Leibniz a química se
constituiu como disciplina científica moderna, sendo esta a época em que a química e a
medicina começaram a andar juntas. Neste período, importantes alcalóides da medicina
convencional tais como morfina, atropina, papaverina, codeína e efedrina foram descobertas.
Foi também nesta época que o exemplo mais clássico de medicamento concebido através de
produtos naturais, a aspirina (ácido acetilsalicílico) foi desenvolvida (CORDELL, 2000).
Até a década de 1950, os medicamentos utilizados eram quase exclusivamente de
origem vegetal. A partir daí foram sendo substituídos por medicamentos contendo substâncias
ativas deles extraídos ou seus derivados sintéticos. Em conseqüência dessa prática, poucas
plantas medicinais foram estudadas, sendo que a maioria das informações atualmente
disponíveis não atende ao mínimo exigido para garantir a eficácia e segurança deste tipo de
terapia (SIMÕES et al., 2004).
Após a revolução industrial, mais especificamente entre 1901 e 1970, foram
procuradas substâncias químicas de origem sintéticas que pudessem ser usadas como
medicamento. Um exemplo clássico foi o trabalho de Ehrlich entre 1909 e 1935 e a
descoberta das sulfas por Foumeau (CORDELL, 2000).
Durante os últimos anos a atenção da indústria farmacêutica tem se voltado novamente
para os produtos naturais, em especial devido a três novas drogas de origem vegetal, o taxol
17
(Figura 3), o etoposídeo e a artemisinina (Figuras 1 e 2). O taxol e o etoposídeo têm se
mostrado eficazes no combate ao câncer e a artemisinina como antimalárica (PHILLIPSON,
2001).
O
O
O
OH
O
CH
3
O
O
O
O
OH
OH
O
R
O
CH
3
O
O
CH
3
O
H
CH
3
H
CH
3
O
O
Figura 1 - Molécula de etoposídeo Figura 2 - Molécula de artemisinina
O
H
O
O
AcO
CH
3
OH
O
AcO
OH
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
N
H
O
OH
Figura 3 - Molécula de taxol. Adaptado de Viegas Jr. et al.; 2006.
A quantidade de plantas existente no planeta, reconhecidas sob o ponto de vista
científico, situa-se entre 250 a 500 mil espécies, sendo que somente 5% têm sido estudadas
fitoquimicamente e uma porcentagem menor avaliadas sob os aspectos biológicos
(CECHINEL FILHO & YUNES, 1998; YUNES et al., 2001).
18
A grande importância dos produtos naturais é relatada por Gragg e colaboradores. Em
seu trabalho eles verificaram que 157 que correspondem a 30%, das 520 novas drogas
aprovadas pela Food and Drug Administration nos Estados Unidos num período de 12 anos
(1983-1994), eram produtos naturais ou seus derivados. Isso evidencia a importância e o
crescimento da fitoterapia, seja em países pobres, onde não existem alternativas, ou em países
ricos, onde programas bem direcionados buscam novas alternativas para a saúde da população
(CORDELL, 2000; YUNES et al., 2001).
A maior parte da biodiversidade mundial está presente nos países da América Latina.
O Brasil possui cerca de 20% de todas as plantas e microorganismos existentes no planeta.
(CALIXTO, 2005).
Muitas plantas são usadas no Brasil na forma de extratos brutos, infusões ou emplastos
para tratar infecções comuns sem nenhuma evidência científica de sua eficácia (CARDOSO
& FONTELES, 1999).
Para a obtenção de novos fármacos dois aspectos distinguem os produtos de origem
natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função biológica. A diversidade molecular
dos produtos naturais é muito superior àquela derivada dos produtos sintéticos, que apesar dos
avanços tecnológicos atuais ainda são restritos. Este fato possibilita que os compostos
químicos presentes nas plantas possam vir a se tornar fármacos em potencial para as mais
diferentes moléstias (NODARI et al., 2000; MACIEL et al., 2002).
Estudos bioquímicos, farmacológicos e etnobotânicos têm sido feitos com o objetivo
de identificar os compostos químicos presentes em várias espécies de plantas usadas na
medicina popular. O controle de doenças de animais e vegetais, no Brasil e no mundo, com o
uso de extratos de plantas medicinais tem sido um desafio. Os extratos de plantas apresentam
em sua composição substâncias efetivas contra patógenos de plantas e animais e são
praticamente inofensivos ao meio ambiente quando comparados com derivados sintéticos,
podendo até superar sua ação antimicrobiana (MIGUEL & MIGUEL, 1999; STANGARLIN
et al., 1999).
A Achillea millefolium é uma planta popularmente conhecida por suas propriedades
medicinais desde a antiguidade (BALBACH, 1995). Entretanto, suas atividades biológicas
necessitam de maiores comprovações científicas e para isso suas características químicas, e
evidências farmacológicas que correlacionam o conhecimento popular com testes
cientificamente aceitáveis necessitam de um aprofundamento.
19
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Geral:
• Realizar a prospecção fitoquímica por via clássica e avaliar biologicamente os extratos
de A. millefolium.
1.1.2 Específicos:
Em relação à A. millefolium e seus extratos, pretende-se:
• Realizar um levantamento bibliográfico acerca de informações científicas como a
classificação farmacológica, toxicológica, constituição química e relatos terapêuticos;
• Realizar uma prospecção fitoquímica com a finalidade de se determinar as classes de
compostos predominantes em diferentes extratos;
• Traçar um perfil espectrofotométrico utilizando-se solventes com diferentes
polaridades;
• Avaliar espectrofotometricamente a influência do pH (hidrólise) sobre o extrato
aquoso;
• Avaliar espectrofotometricamente o poder adsortivo do carvão ativo para clorofila e
para os demais constituintes da planta em extratos metanólicos;
• Comparar a eficiência da ultrasonicação com a extração simples para a extração dos
constituintes da planta no extrato metanólico;
• Realizar o fracionamento do extrato seco por Cromatografia em Camada Preparativa;
• Realizar biomonitoramento avaliando a atividade antifungica contra o fungo
Colletrotrichum musae.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE ORIGEM VEGETAL
A natureza produz uma grande variedade de produtos na química combinatória de sua
evolução. O número total de produtos naturais produzidos por plantas está estimado em torno
de 500.000 (DEMAIN et al, 2000).
O metabolismo da planta é dividido em duas fases: metabólitos primários e
metabólitos secundários. Os metabólitos primários são encontrados em todos os sistemas
vivos, essenciais ao crescimento e a vida como aminoácidos, proteínas, monossacarídeos,
ácidos carboxílicos do ciclo de Krebs, lipídeos, glicerídeos, etc. Os metabólitos secundários
são produtos do metabolismo específico, relacionado a processos adaptativos. Estes são
biossintetizados a partir de metabólitos primários, com uma distribuição restrita a certas
plantas e microorganismos (às vezes característico de um dado gênero ou espécie), e
caracterizados por uma enorme diversidade química, como os alcalóides, esteróides,
terpenóides, flavonóides, etc (SANTOS, 1999).
Durante muito tempo, os metabólitos secundários foram considerados como produtos
de excreção do vegetal, com estruturas químicas e, algumas vezes, propriedades biológicas
interessantes. Atualmente é reconhecido que muitos deles desempenham papéis vitais como
mediadores em interações ecológicas; na defesa contra herbívoros e microrganismos, proteção
contra os raios UV, atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em
interações alelopáticas (SANTOS, 1999).
Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos, compostos
fenólicos e alcalóides (Figura 4, p.22). Estes podem ser classificados de diferentes maneiras,
segundo suas características químicas, origem da planta ou origem biossintética. Do ponto de
vista químico, os compostos podem ser divididos em várias classes, que são baseadas em
certas características. Os alcalóides são caracterizados pela presença de um nitrogênio básico.
Os compostos fenólicos são caracterizados por ser um sistema aromático que apresenta um
grupo hidroxila fenólico. Outros grupos ou subgrupos são baseados na presença de certos
tipos de esqueletos comuns a toda classe como: antracenos, cumarinas, quinonas, etc.
Exemplos de classificação baseadas na origem da planta são os alcalóides e glicosídeos
21
digitálicos. Estes são freqüentemente relacionados com aplicações farmacológicas. A
classificação baseada na origem biossintética tem como principal exemplo os terpenóides,
fenilpropanóides e policetídeos (DI STASI et al., 1996; VERPOORTE et al., 2000).
Figura 4 - Principais vias do metabolismo secundário. Adaptado de TAIZ e ZEIGER, 2004.
Compostos fenólicos, ou fenilpropanóides são considerados metabólicos secundários
que são sintetizados pelas plantas durante o desenvolvimento normal e em resposta a
condições de stress como infecções, lesões e radiação UV, entre outros. Estes compostos
estão onipresentes nas plantas e são um grupo muito diversificado de fitoquímicos derivados
da fenilalanina e tirosina. Compostos fenólicos das plantas incluem fenóis simples, ácidos
fenólicos (ambos derivados de ácido benzóico e ácidocinâmico), cumarinas, flavonóides,
taninos hidrolisáveis e condensados, lignanas e ligninas. Nas plantas, os fenólicos podem
atuar como fitoalexinas, atratores de polinizadores, contribuintes da pigmentação da planta,
antioxidantes e agentes protetores antioxidantes. Nos alimentos, os compostos fenólicos
podem contribuir para o amargor, adstringência, cor, sabor, odor estabilidade oxidativa dos
produtos. Além disso, a capacidade da proteção da saúde de alguns e propriedades
antinutricionais de outros fenólicos das plantas são de grande importância para os produtores,
processadores e consumidores (NACZK et al., 2004).
Compostos fenólicos são formados através de duas rotas metabólicas principais
(Figura 5, p.23), pelo ácido chiquímico, a partir de carboidratos, ou pela via do mevalonato a
qual é menos significativa por estar restrita a certos vírus e bactérias (TAIZ & ZEIGER,
2004).
22
Figura 5 - Rota de biossíntese de compostos fenólicos derivados da fenilalanina. Adaptado de TAIZ e
ZEIGER, 2004.
Os flavonóides (Figura 6, p.24) estão amplamente distribuídos no reino vegetal. Mais
de 4.200 tipos são conhecidos. São encontrados em frações mais polares como acetato de
etila (agliconas) e butanólica (flavonóides glicosados). Estão presentes em frutas, verduras,
vinho, cereais e chá verde. Possuem ações anti-carcinogênica, antiinflamatória, antialérgica,
anti-ulcerogênica, anti-oxidantes, anti-viral e contra fungos e bactérias e atuam contra
problemas cardiovasculares (SIMÕES et al. 1996; COWAN, 1999). São conhecidos por
serem sintetizados por plantas em resposta a infecções microbianas, justificando assim sua
ação frente a vários microrganismos. Esta atividade se dá provavelmente à habilidade de
complexação com a parede bacteriana. Os flavonóides mais lipofílicos podem lisar a parede
microbiana (COWAN, 1999). Dois flavonóides, diosmina e rutina, são usados pela indústria
farmacêutica na preparação de agentes vasodilatadores, outros como a quercetina e luteolina
são abundantes na natureza e produzem significativa resposta antiinflamatória (CALIXTO et
al., 2005).
23
Figura 6 - Rota de síntese de flavonóides. Adaptado de TAIZ e ZEIGER, 2004.
Taninos são polifenóis de alto peso molecular de origem vegetal, solúveis em água, que
possuem a capacidade de combinar-se com proteínas, precipitando-as. Diversas propriedades
farmacológicas são atribuídas a eles tais como: anti-hipertensiva, anti-reumática, anti-
hemorrágica, antiinflamatória, cicatrizante, anti-diarréica (HASLAM, 1996), bactericida e
fungicida (WAAGE et al.,1984; MARWAN & NAGEL, 1986).
As cumarinas (Figura 7), são derivadas do ácido cinâmico, do metabolismo da
fenilalanina. São amplamente distribuídas no reino vegetal, podendo ser encontradas em
fungos e bactérias. Mais de 1300 cumarinas foram isoladas e identificadas estruturalmente.
São atribuídas a elas diversas ações biológicas tais como: anti-coagulante (HARDMAN &
LIMBIRD, 1996), anti-espasmódica, hipotensora, relaxante vascular, hipolidêmica (HOULT
e PAYÁ, 1996), anti-oxidante (MARTÍN-ARAGÓN et al., 1996), antibacteriana (LINUNA et
al., 1996), antiinflamatória (LIN et al., 1996).
O O
R
1
R
2
R
3
Cumarinas
Figura 7 - Exemplos de cumarinas.
R
1
= R
3
= H, R
2
= OH; Umbeliferona
R
1
= R
3
= H, R
2
= OCH
3
; Herniarina
R
1
= R
2
= OH, R
3
= H; Esculetina
R
1
= OCH
3
, R
2
= OH, R
3
= H, Escopoletina
R
1
= OGlc, R
2
= OH, R
3
= H; Esculina
24
2.2 CRITÉRIOS EXPERIMENTAIS GERAIS PARA A BUSCA DE PRINCÍPIOS ATIVOS
DE PLANTAS MEDICINAIS
Embora uma planta possa conter centenas de matabólitos secundários, apenas os
compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados e estudados pela
fitoquímica clássica (CECHINEL FILHO & YUNES, 1997).
A investigação de substâncias de plantas inclui várias etapas e podem ser classificadas
da seguinte forma: 1- escolha da planta a ser estudada; 2- identificação botânica; 3- avaliação
prévia da composição química; 4- isolamento e purificação dos constituintes principais e 5-
elucidação da estrutura molecular dos compostos puros e isolados, ou seja, a determinação
estrutural (MATOS, 1988). A Figura 8 ilustra algumas etapas básicas que podem ser
seguidas quando se procura obter princípios ativos de plantas.
Figura 8 - Procedimentos gerais para obtenção de compostos biologicamente ativos -
Adaptado de CECHINEL FILHO
&
&&
&
YUNES, 1997.
Planta
Testes biológicos
Extrato bruto
Extratos semipuros
Testes biológicos
Procedimentos cromatográficos
Elucidação estrutural
Frações compostos puros
Testes biológicos
Modificação
estrutural
Síntese de
análogos
Testes biológicos
Relação estrutura -
atividade
Testes biológicos
25
A escolha da espécie de planta a ser estudada é uma das etapas primordiais para o
êxito da pesquisa. O conhecimento da flora da região a ser pesquisada e informações
populares a respeito do uso de plantas deve ser considerado.
Vários processos de seleção têm sido desenvolvidos ao longo da história da
fitoquímica, todos eles condicionados a objetivos específicos e técnicas postas à disposição do
pesquisador. Exsicatas devem ser depositadas em herbário para evitar possíveis dúvidas
acerca da origem correta das substâncias isoladas e identificadas (MATOS, 1998;
CECHINEL FILHO & YUNES, 1997).
Fatores como a longevidade da planta e a sazonalidade durante a coleta são condições
que também podem implicar em variações das concentrações de diferentes princípios ativos
de interesse (MATOS, 1988).
A coleta da planta pode ser preliminar e definitiva. A preliminar visa à identificação
etnobotânica da planta, como pequenos ramos com folhas, flores, frutos e sementes em
diferentes estágios de desenvolvimento.
A definitiva, a sazonalidade, a delimitação das partes da planta (raiz, cascas, caule,
galhos, folhas, flores, frutos), assim como a quantidade de material a serem analisados são
fundamentais (DI STASI, 1996; MATOS, 1998).
O procedimento clássico para obtenção de extratos orgânicos de material vegetal seco
e triturado é a extração por solventes de polaridade crescente, sendo os principais hexano,
clorofórmio e etanol ou metanol (para compostos mais polares) e hexano, clorofórmio ou éter
(para compostos apolares).
Tais solventes devem ser preferidos ao invés da água, pois são mais facilmente
evaporados e previnem o crescimento de microrganismos.
Com uma extração inicial que utiliza solventes de baixa polaridade obtêm-se
compostos mais lipofílicos, por outro lado com solventes alcoólicos obtêm-se um amplo
espectro de material polar e apolar (MATOS, 1998; HOSTETTMANN et al., 2003).
Em relação à escolha do solvente, deve-se levar em consideração a toxicidade do
solvente e a estabilidade das substâncias extraídas.
Na Tabela 1 (p.27), são listadas algumas substâncias e o tipo de solvente adequado à
sua extração (MATOS, 1998).
26
Tabela 1 - Solvente e os seus respectivos metabólitos secundários extraídos
.
Solvente Substâncias extraídas
Éter de petróleo, hexano lipídeos; ceras, pigmentos; furanocumarinas
Éter etílico, diclorometano,
clorofórmio
bases alcaloídicas livres; antraquinonas livres; terpenos;
heterosídeos cardiotônicos; esteróides.
Acetato de etila; butanol. geninas de flavonóides, cumarinas simples; terpenos e
esteróides
Etanol, metanol. heterosídeos de forma geral
Misturas hidroalcoólicas;
água.
saponinas; taninos; flavonóides; açúcares
Água acidificada Alcalóides
Água alcalinizada Saponinas
Os métodos de extração utilizados podem ser a frio e a quente. A maceração,
percolação e o ultra-som são exemplos de extração a frio. A infusão, a decocção, a extração
sob refluxo, em aparelho soxhlet e a destilação por arraste com vapor são métodos de extração
a quente (SIMÕES et al., 2004; MATOS, 1998).
A separação e elucidação estrutural dos constituintes químicos de interesse das plantas
são feitas através de diversas técnicas cromatográficas. Normalmente os melhores resultados
decorrem da utilização combinada de uma ou mais dessas técnicas. Dentre elas está a
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), Cromatografia Gasosa (GC),
Espectrometria de Massas (MS), Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Eletroforese
Capilar (CE) e outras (LANÇAS, 1993; COLLINS et al., 1997; CHAVES, 1997).
2.2.1 Ultra-som
O ultra-som é uma forma de energia caracterizada pela vibração de moléculas de um
meio. Propaga-se no ar, água, tecido, entre outros, através da transferência de energia
vibracional de uma molécula para outra. Isto requer um meio deformável que pode ser gasoso,
líquido ou sólido. Ainda que a molécula tenha deslocamento muito pequeno em relação à sua
27
posição de repouso, o som é capaz de percorrer longas distâncias. O ouvido humano é capaz
de perceber sons com freqüências de até 20 khz. O ultra-som é a energia sonora com
freqüência acima do limite de audição humana. A maioria das aplicações médicas utiliza
freqüências entre 1 e 10 MHz (HAAR, 1978).
O ultra-som desenvolve o processo biofísico da cavitação que vem sendo considerado
como um dos principais mecanismos que afetam a atividade germicida em meio líquido. A
cavitação é a formação de cavidades ou bolhas no meio líquido contendo quantidades
variáveis de gás, vapor ou ambos. A cavitação é devido à atividade oscilatória e à alta
compressão de corpos semelhantes a bolhas. Essas bolhas são transformadas através de
energia transferida pelo campo acústico incidente. As bolhas podem ser formadas (Figura 9,
p.29) porque a pressão negativa no tecido durante a rarefação pode fazer com que os gases
dissolvidos ou capturados se juntem e formem as bolhas (DOMNGOS, 1998).
No caso de células biológicas ou macromoléculas em suspensão aquosa, o ultrasom
pode alterá-las estrutural ou funcionalmente através da cavitação. Outro fenômeno citado
pelo autor é que no colapso das bolhas (Figura 10, p.29) há liberação de energia que pode
romper as ligações moleculares provocando a produção de radicais livres H e OH altamente
reativos e, como conseqüência, causar mudanças químicas (DOMNGOS, 1998).
São várias as aplicações de ondas de ultra-som, que vão desde homogeneização de
substâncias, rompimento de células, extração de produtos fitoquímicos, esterilização de
equipamentos, localização de mineral, emulsificação, até degradação de massa molar e
fonoforese (ação do ultra-som para facilitar a penetração de agentes farmacologicamente
ativos através da pele) (WILLIANS,1990).
Fundamentos para aplicação do ultra-som em análises químicas como preparo de
amostras, estão relacionados com as ondas de choque resultantes da aplicação do campo
acústico sobre um meio material. Essas ondas acentuam a interação entre o solvente e a
superfície dos sólidos, aumentando, na solução, a concentração das espécies presentes no
material sob investigação. A vibração causada pelos ultra-sons minimiza o gradiente de
concentração na vizinhança da superfície do sólido presente no meio exposto e possibilita o
arraste para a solução de sais e óxidos da superfície do sólido. Assim, o emprego de ultra-
sons, analogamente à radiação microondas ou infravermelho, se dá visando melhorar as
condições de reação/interação entre solventes e amostra, pelo aumento da energia cinética,
além de favorecer a decomposição pelo aumento localizado
da temperatura e/ou pressão
(KORN et al., 2003).
28
Figura 9. Gráfico de crescimento da bolha pelo tempo. Figura 10. Foto do momento de implosão da bolha de
cavitação.
2.2.2 Método Cromatográfico
No início do século XX, o botânico russo M.S.Tsvet, encontrou uma maneira de
separar os muitos pigmentos de flores e folhas. Ele moeu as plantas e dissolveu os pigmentos,
então despejou a solução no topo de um tubo vertical cheio de giz moído. Os diferentes
pigmentos percorreram a coluna em diferentes velocidades, produzindo bandas coloridas no
tubo, inspirando o nome cromatografia (“escrevendo em cores”). A separação ocorreu porque
os diferentes pigmentos foram absorvidos em diferentes extensões pelo giz (ATKINS &
JONES, 2001).
A cromatografia é um método de separação, no qual os componentes de uma amostra
dividem-se em duas fases: uma permanece imóvel, fase estacionária e outra percorre através
dela, fase móvel. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes
da amostra são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é
seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais de cada um
destes componentes (COLLINS et al., 1997).
29
A classificação dos diferentes tipos de cromatografia se dá de acordo com: o estado
físico da fase móvel (líquida, gasosa, ou fluído super crítico); a disposição da fase estacionária
(coluna ou planar); e o mecanismo de separação (adsorção, partição, troca iônica, exclusão
por tamanho, etc.) (COLLINS et al., 1997).
A separação e a purificação dos constituintes químicos das plantas são freqüentemente
efetuadas utilizando-se uma ou mais técnicas cromatográficas. Entre os métodos modernos de
análise, a cromatografia ocupa lugar de destaque devido à sua facilidade de efetuar a
separação, a identificação e a quantificação das espécies químicas, por si só ou em conjunto
com outras técnicas instrumentais de análise (COLLINS et al., 1997).
2.2.2.1. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Esta é uma técnica amplamente utilizada para fins de análise, tanto em extratos
vegetais brutos, quanto para monitrar um processo de separação (HARBONE, 1984).
A cromatografia em camada delgada consiste na separação dos componentes de uma
mistura através da migração diferencial sobre uma camada de adsorvente retido sobre uma
superfície plana (WASICKY et al., 1987; CHAVES, 1997).
O processo de separação pode estar fundamentado no fenômeno de adsorção. Assim a
sílica é seguramente um dos adsorventes mais utilizados. Em geral a sílica é utilizada na
separação de compostos lipofílicos (WASICKY et al., 1987).
Na escolha da fase móvel deve-se levar em conta a natureza química das substâncias a
serem separadas e a polaridade da fase móvel já que existe uma competição entre as
moléculas da fase móvel e da amostra pela superfície do adsorvente (WASICKY et al., 1987;
CHAVES, 1997).
Após o desenvolvimento dos cromatogramas, as placas são secas e reveladas. A etapa
de revelação consiste em tornar visíveis as substâncias incolores presentes na amostra. A
visualização das manchas pode ser feita através de métodos físicos (luz ultravioleta),
químicos (regentes) e biológicos (enzimas) (WASICKY et al., 1987; CHAVES, 1997).
30
2.2.3 Técnica espectrométrica
A espectrometria é um método de análise óptico utilizado para quantificar e qualificar
solutos em soluções, através da observação da quantidade de luz que é absorvida, denominada
absorbância, quando esta é atingida por um feixe de energia radiante monocromática, luz
(SKOOG et al., 2002). O aparelho utilizado é o espectrofotômetro como demonstrado na
Figura 11 .
Esta colabora na identificação de compostos que apresentam insaturações em
conjugação. A espectrofotometria permite uma análise multivariada de compostos, desde que
estes não absorvam nas mesmas faixas espectrais. Esta ferramenta é amplamente aplicada
tanto para análises qualitativas, como quantitativas de compostos isolados e puros (HARRIS,
2001; SKOOG & LEARY, 1992; SKOOG et al., 2002).
Figura 11 - Espectrofotômetro de varredura UV-visível Femto modelo 800 XI.
2.2.3.1 Espectrometria de Absorção na Região do Ultravioleta-Visível
31
A espectrofotometria na região ultravioleta-visível (UV-VIS) do espectro
eletromagnético, é uma das técnicas analíticas mais empregadas, em função da praticidade,
custo relativamente baixo e grande número de aplicações desenvolvidas (ROCHA &
TEIXEIRA, 2004).
Muitas moléculas orgânicas e grupos funcionais não absorvem luz em partes da faixa
espectral ultravioleta (UV), a qual compreende comprimentos de onda entre 190-400 nm e
visível (VIS), a região compreendida entre 400 nm a 800 nm, sendo responsável pela cor das
substâncias e objetos. Quando uma radiação contínua passa através de um material
transparente, que esteja em uma cela de amostra de quartzo, uma parte da radiação pode ser
absorvida. Se isto ocorre, a radiação residual, quando é passada através de um prisma, produz
um espectro com fendas chamado de espectro de absorção. Como resultado da absorção de
energia, átomos ou moléculas passam de um estado de baixa energia (estado fundamental)
para um estado de maior energia (estado excitado). A radiação eletromagnética que é
absorvida tem energia exatamente igual à diferença entre os estados excitado e fundamental.
Como a energia absorvida é quantizada, o espectro que se origina de uma única transição
eletrônica deveria corresponder a uma linha única e discreta. Isto não se confirma, já que à
absorção eletrônica superpõem-se os sub-níveis rotacionais, vibracionais e translacionais,
originando bandas de absorção que possuem posição correspondente ao comprimento de onda
cuja energia é igual à energia necessária para transição eletrônica (SKOOG et al., 2002).
A absorção de uma dada substância é muito afetada se ela contém grupos cromóforos.
Um cromóforo é um grupo funcional que tem absorção característica na região do ultravioleta
ou do visível. Estes grupos têm invariavelmente ligações duplas ou triplas. Se o cromóforo
estiver conjugado com outro grupo do mesmo tipo ou diferente, a absorção é mais intensa e
ocorre em comprimentos de onda maiores (EWING, 1972; SKOOG et al., 2002; MENDHAM
et al., 2002; HARRIS, 2005).
A lei de Lambert-Beer é a base matemática para medidas analíticas de absorção da
radiação por amostras no estado sólido, líquido ou gasoso, nas regiões ultravioleta, visível e
infravermelho do espectro eletromagnético. Para medidas de absorção de radiação em
determinado comprimento de onda, tem-se uma proporcionalidade entre a absorção da luz, o
caminho ótico a qual ela percorre a concentração e a absortividade molar dos constituintes
dessa substância. A absortividade molar (ε) é uma grandeza característica da espécie
absorvente, cuja magnitude depende do comprimento de onda da radiação incidente (EWING,
1972; ROCHA & TEIXEIRA, 2004; HARRIS, 2005).
32
A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorvância seja proporcionalmente linear à
concentração da espécie absorvente. Ela se aplica à maioria das substâncias quando a radiação
é monocromática e as soluções estão suficientemente diluídas. O não obedecimento dessa lei
ocorre quando a solução está muito concentrada (> 0,01M), onde espécies não absorventes
interagem com as absorventes, por exemplo, na dissociação de um ácido HA gera A
-
, cuja
absortividade não é a mesma do ácido. Dessa forma a solução parece não obedecer à lei de
Beer (HARRIS, 2005).
A intensidade de uma absorção pode ser expressa também em transmitância (T). A
expressão mais convincente é obtida da Lei de Lambert-Beer que relaciona a transmitância
com a espessura da cela de amostra e a concentração das espécies que absorvem:
A = log
(I/I
0
) = k c b
Onde k é igual à constante característica do soluto, c é a concentração do soluto, b, é o
comprimento do caminho óptico através da amostra e A é a absorvância. Quando c é expresso
em moles L
-1
e o comprimento do caminho óptico em centímetros, a expressão acima se torna:
A= ε b c
A intensidade de uma banda de absorção em um espectro no UV-VIS é usualmente
expressa como absortividade molar no máximo de absorção, ε
máximo
ou log
10
(ε
máximo
).
Durante o curso de uma reação química, muitas vezes uma espécie absorvente (x) é
convertida em outra espécie absorvente (y). Se o espectro de x puro e de y puro cruza um com
o outro em algum comprimento de onda então todos os espectros obtidos durante essa reação
química cruzaram num mesmo ponto, denominado ponto isosbéstico (HARRIS, 2005).
O ponto isoabsortivo ou isosbéstico evidencia que há um equilíbrio químico entre duas
espécies principais. Se uma banda de absorção desaparece, enquanto aparece outra (condições
para um ponto isoabsortivo), o comprimento de onda de um máximo se desloca gradualmente
por variação do pH, concentração ou outra variável, então se pode admitir com segurança que
a variação é devida a interação física e/ou química entre a substância absorvente e seus
arredores (EWING, 1972; HARRIS, 2005).
Segundo Ewing (1972), examinando em diferentes valores pH um espectro de
absorção, torna-se possível acompanhar mudanças de conformação nas moléculas que estejam
ocorrendo por força de mudanças nas condições de protonação ou deprotonação do meio. Os
33
comprimentos de onda de absorção máxima dos compostos fornecem um meio de identificar
o cromóforo que ele contém.
Em geral, os espectros são modificados pela presença de vários grupos atômicos,
quando se retiram os átomos de hidrogênio do sistema cromóforo, deslocam-se as bandas de
absorção para comprimentos de onda maiores e mudam seus valores de absorvância (SKOOG
et al., 2002).
2.3 FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
Fungos são organismos eucariontes, aclorofilados, heterotróficos, que se reproduzem
sexuada e assexuadamente e cujas estruturas somáticas são geralmente filamentosas e
ramificadas, com parede celular contendo celulose ou quitina, ou ambos (ALEXOPOULOS et
al., 1979).
Os fungos obtêm o alimento de diversas maneiras, seja como saprófitas, como
organismos que vivem sobre a matéria orgânica morta ou como parasitas, que se nutrem da
matéria viva. Em ambos os casos, as substâncias nutritivas são ingeridas por absorção após
terem sido parcialmente digeridas por meio
de enzimas (ALEXOPOULOS et al., 1979).
A maioria dos fungos é constituída de espécies saprófitas que desempenham a
importante função de decomposição na biosfera, degradando produtos orgânicos e
devolvendo carbono, nitrogênio e outros componentes ao solo, tornando assim disponíveis às
plantas. Cerca de 100 espécies de fungos produzem doenças no homem e quase o mesmo
número em animais, a maioria das quais são enfermidades superficiais da pele ou de seus
apêndices. No entanto, mais de 8.000 espécies de fungos causam doenças em plantas, sendo
que todas as plantas são atacadas por algum tipo de fungo, e cada um dos fungos parasitas
atacam um ou mais tipos de plantas (MENEZES et al., 1993).
Os fungos, em sua maioria, são constituídos de filamentos microscópicos com parede
celular bem definida, chamados hifas. A célula fúngica é constituída pelos principais
componentes encontrados nos organismos eucariotos. A parede celular é composta
principalmente por polissacarídios, pequena quantidade de lipídios e íons orgânicos. A
membrana plasmática é composta por fosfolipídios e esfingolipídios, proteínas, além de estão
imersas organelas membranosas, como mitocôndrias, complexo de Golgi e microcorpos,
assim como estruturas não membranosas, como ribossomos, microtubos e microfilamentos. A
34
célula fúngica apresenta núcleos dotados de uma membrana nuclear ou carioteca
(ALEXOPOULOS et al., 1979).
Os fungos por serem aclorofilados, não podem utilizar energia solar para sintetizar seu
próprio alimento. A substância de onde os fungos retiram os nutrientes chama-se substrato.
As hifas ramificam-se em todas as direções no substrato formando o micélio. Os esporos são
as estruturas reprodutivas dos fungos os quais podem ser sexuais ou assexuais.
A maioria dos fungos fitopatogênicos passa parte de seu ciclo de vida nas plantas que
lhe servem de hospedeiro, e outra parte no solo ou em restos vegetais depositados sobre este
substrato. Alguns fungos passam todo o seu ciclo de vida sobre o hospedeiro e somente seus
esporos se depositam no solo, onde permanecem em dormência até que sejam levados a um
hospedeiro no qual germinam e se reproduzem. Outros fungos devem passar parte de seu
ciclo de vida como parasitas de seu hospedeiro e parte como saprófitas sobre os tecidos
mortos depositados no solo. No entanto, este último grupo de fungos se mantém em estreita
associação com os tecidos do hospedeiro, não se desenvolvendo em qualquer outro tipo de
matéria orgânica (MENEZES et al., 1993).
Os fungos fitopatogênicos podem penetrar no hospedeiro diretamente (em nível
subcuticular, bem como em nível celular com haustório, micélio intercelular, micélio
intercelular com haustório, ou apressório e micélio intracelular), por aberturas naturais
(estômatos, lenticelas e hidatódios) ou por ferimentos (artificiais, naturais pela rachadura de
raízes), bem como através da ação do fungo, pela morte e maceração das células a frente do
seu avanço (MENEZES et al., 1993).
Os agentes antifúngicos podem ser classificados em duas categorias: os que afetam a
membrana celular e os que atuam intracelularmente, interrompendo processos celulares vitais
com síntese de DNA, RNA ou proteínas (SCHAECHTER et al., 2002).
2.4. UTILIZAÇÃO DE EXTRATOS DE VEGETAIS NO CONTROLE DE FUNGOS
FITOPATOGÊNICOS
Atualmente nos locais onde se pratica uma agricultura econômica, a intervenção para
o controle das doenças de plantas é amplamente praticada pelo uso de pesticidas (KIMATI et
al., 1997). Atualmente na agricultura orgânica a planta mais usada na forma de extrato é o
35
Nim (Azadirachta indica A. Juss), que dentre suas aplicações, a ação inseticida é a mais
visada.
Em curto prazo, o uso de tais produtos pode ter um efeito produtivo para o produtor,
mas em longo prazo, além do surgimento de fitopatógenos resistentes às substâncias químicas
utilizadas, os resultados para a população e para o meio ambiente podem ser negativos devido
à poluição causada pelos resíduos. Desta forma, termos como “agricultura alternativa” e
“agricultura sustentável”, se tornam importantes e estimulam a busca de novos produtos para
o controle de doenças de plantas (ZADOKS, 1992).
As infecções fúngicas em plantas das espécies de Rhizoctonia, Phytophtora,
Sclerotinia, Fusarium, Cercospora, colletotrichum e outras, representam perdas incalculáveis
para a produção agrícola (ZACCHINO, 2001). A exploração da atividade biológica de
compostos secundários originários de extrato bruto ou óleo essencial de plantas medicinais,
podem se constituir, ao lado da indução de resistência, em mais uma forma de controle
alternativo de doenças em plantas cultivadas. Algumas espécies estudadas sob esse aspecto
são: Baccharis trimera, Eucalyptus citriodora, C.martinii, Ocimum gratissimum. Uma grande
quantidade de metabólitos secundários das plantas já foi isolada e suas estruturas químicas
elucidadas, mas muitos ainda não foram estudados quanto às suas atividades biológicas (DI
STASI, 1996).
Estudos realizados com extrato bruto ou óleo essencial, obtidos a partir de plantas
medicinais têm evidenciado o potencial das mesmas no controle de fitopatógenos, tanto por
sua ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e germinação de esporos, quanto
pela indução de fitoalexinas (DI STASI, 1996). As fitoalexinas são metabólitos secundários,
antimicrobianos, de baixo peso molecular e produzidos pelas plantas em resposta a estresses
físicos, químicos ou biológicos, sendo capazes de impedir ou reduzir a atividade de agentes
patogênicos. Atuam sobre fungos produzindo granulação citoplasmática, desorganização dos
conteúdos celulares, ruptura de membrana plasmática e inibição de enzimas fúngicas. Mais de
300 fitoalexinas já foram caracterizadas em diferentes classes de compostos químicos como
cumarinas, diterpenos e flavonóides (PURKAYASTHA, 1995; SMITH, 1996).
A busca de novos fitoterápicos com aplicação na agricultura orgânica se faz necessária
e indícios da ação fungicida da A. millefolium sugerem que a mesma possa exercer tal função
sem causar danos à saúde do consumidor.
36
2.4.1 Colletotrichum musae.
Colletotrichum musae é um patógeno comum de frutos de banana (Musa spp.),
causando antracnose, com ampla distribuição geográfica, onde a bananeira é cultivada
(WARDLAW, 1972). Economicamente, o patógeno é muito importante por causar prejuízos
em pós-colheita e, também perdas ao nível de campo, sendo fator limitante da qualidade
prejudicando a comercialização do produto (JEFFRIES et al., 1990).
Para o controle da doença vêm sendo utilizados tratamento químico e práticas
culturais, visando reduzir a quantidade de inóculo no campo. Em pós-colheita, as medidas de
controle são constituídas principalmente de fungicidas. A restrição ao uso de fungicidas,
devido à fitotoxicidade, efeitos residuais, espectro de ação e resistência pelo patógeno, tem
levado a procura de métodos alternativos de controle tais como, uso de biofungicidas, extratos
vegetais e óleos essenciais.
Os resultados alcançados nessa linha de pesquisa têm-se mostrado promissores para
uma utilização prática no controle de fitopatógenos em diversas culturas (BENATO et al.,
2002; MOREIRA et al., 2002).
Em condições favoráveis, os conídeos de C. musae germinam na superfície em frutos
imaturos, dentro de 6 a 8 horas, produzindo um tubo germinativo, na extremidade do qual se
forma o apressório, considerado um órgão de adesão. Esse órgão capacita o patógeno a
sobreviver em condições adversas do ambiente, antes da penetração no tecido do hospedeiro.
Quando C. musae penetra em frutos imaturos, geralmente permanece quiescente até o início
do processo de amadurecimento, ocorrendo a colonização e a expressão dos sintomas (GOOS
& TSCHIRSCH, 1962). Com relação à temperatura ideal para crescimento micelial,
esporulação e germinação de conídeos, Goos e Tschirsch (1962) citaram a faixa de 27-30°C,
enquanto Cox e Irwin (1988), de 26-28 °C.
Couto et al., (2004), estudaram isolados de C. musae obtidos de quatro cultivares de
banana (Musa spp.), “Comprida”, “Maçã”, “Pacovan” e “Prata”, quanto ao aspecto
morfológico dos conídeos, apressórios, características culturais, diâmetro das colônias em
meio BDA, germinação dos conídeos em água destilada e meio líquido BD, como também o
efeito da combinação de C/N no crescimento micelial, esporulação e peso da matéria seca,
sob alternância luminosa, a aproximadamente 25° C.
Os resultados mostraram conídeos hialinos, com forma e tamanhos característicos da
espécie. A relação comprimento/largura foi menor para os isolados de banana “Comprida”. A
37
germinação de conídeos ocorreu a partir de 8 horas de incubação. Foram observados
apressórios em todos os isolados, variando apenas a quantidade.
Houve diversidade nas características culturais e diâmetro das colônias isoladas em
BDA. Com relação às combinações C/N, a análise estatística revelou diferença significativa
entre os isolados, quanto ao percentual de conídeos isolados, sob efeito da interação C/N, bem
como dos fatores independentes, sobre o crescimento micelial, produção de esporos e peso
seco do micélio. De modo geral, as combinações de carbono com peptona favoreceram esses
três processos fisiológicos, porém com diferença significativa entre os isolados de C. musae
dentro de cada processo considerado.
2.5 FAMÍLIA ASTERACEAE
A família Asteraceae ou Compositae é uma das maiores nas angiospermas, possuindo
cerca de 1.500 gêneros, dos quais aproximadamente 180 encontram-se no Brasil e
aproximadamente 23.000 espécies, arranjadas em 4 subfamílias e 17 tribos (BREMER, 1994).
Como representantes importantes da família destacam-se o girassol (Helianthus annus), de
grande importância agrícola e econômica; a camomila (Matricaria chamomilla), empregada
como anti-espasmódica; a arnica (Arnica Montana), como antiinflamatória (ZARDINI, 1991),
a milfolhas (Achillea millefolium), usada com várias propriedades medicinais (SWEETMAN
et al., 2002), entre outras, todas com diversas atividades biológicas.
O elevado número de espécies se distribui por todos os continentes, sendo mais
facilmente encontradas em regiões de clima temperado, subtropical não densamente
florestado e tropical montanhoso, dentre estes, especialmente regiões áridas e de campo
aberto (CRONQUIST, 1981).
São plantas de hábitos muito variados, sendo cerca de 98% de pequeno porte.
Destacam-se ervas, subarbustos, trepadeiras e árvores de pequeno e médio porte
(CRONQUIST, 1981).
A química das Asteraceaes tem sido empregada na investigação de aspectos
taxonômicos (SPRING & BUSHMANN, 1994).
Até 1990, aproximadamente 7.000 constituintes haviam sido isolados de apenas 5.000
espécies da família (BOHLMANN, 1990; BOHLMANN & ZDERO, 1990).
Na família Asteraceae há a ocorrência de diferentes tipos de terpenóides,
poliacetilenos, flavonóides, cumarinas, benzofuranos, derivados de p-hidroxiacetofenonas e
38
de fenilpropanóides (ALVARENGA et al., 2001; BOHLMANN & ZDERO, 1990;
HEYWOOD et al., 1977).
2.5.1 Achillea millefolium L.
A Achillea millefolium (Figuras 12 e 13, p.40), é uma planta pertencente à família
Asteraceae, originária da Europa, Ásia, América do norte, sul da Austrália, adaptada ao clima
brasileiro. É considerada a espécie mais conhecida do gênero Achillea. A A. millefolium L.
representa a maior parte das 85 espécies conhecidas do gênero. Apenas na Turquia foram
encontradas 40 espécies do gênero (CANDAN et al., 2003).
O nome do gênero Achillea, deriva provavelmente do herói grego Achilles, que
utilizava a planta para tratar as feridas de seus soldados. O nome da espécie, millefolium,
refere-se ao tipo das folhas, as quais são muito recortadas, o que faz a planta aparentar ter mil
folhas (CHANDLER, 1989).
A classificação taxonômica da espécie pode ser vista na Tabela 2 .
Tabela 2 - Enquadramento taxonômico da Achillea millefolium L.
Táxon Classificação
DIVISÃO Magnoliophyta
CLASSE Magnoliopsida
SUBCLASSE Asteridae
ORDEM Asterales
FAMÍLIA Asteraceae
SUBFAMÍLIA Asteroideae
TRIBO Anthemideae
GÊNERO Achillea
ESPÉCIE Achillea millefolium Linnaeus
FONTE: CRONQUIST et al, 1981.
É uma erva, perene, rizomatosa, com inúmeras raízes fibrosas e finas, caules eretos,
com ramos na parte superior, aromática, entouceirada que pode alcançar de 30 a 50 cm de
39
altura. As folhas são verde-acinzentadas escuras, aromáticas, compostas, divididas em muitos
segmentos. A planta cresce selvagem ao longo de rodovias e em campos e pastagens
(LORENZI & MATOS, 2002; MARTINS et al., 2000; PANIZZA, 1997).
As flores são pequenas e reunidas em capítulos dimorfos cujas flores do raio são
linguladas, brancas ou levemente rosadas, unissexuadas-femininas (pistiladas) e as do centro
tubulosas, hermafroditas, brancas, com estigma bifurcado e papiloso na sua extremidade (PIO
CORREIA, 1979; BALBACH, 1995). Os frutos pequenos, secos e duros (aquênio) tem sabor
amargo e apenas uma semente (CASTRO & CHEMALE, 1995).
Muitas espécies do gênero Achillea diferem no crescimento, cor das flores e formato
das folhas. São cultivadas como plantas ornamentais, e em jardins de pedras (SIMON et al.,
1984).
Figura 12. Detalhes de A. millefolium L e folha da planta. ( Ilustração: KOHLER, 1887; foto:
YATSKIEVYCH, MBG, on line, 2000).
40
Figura 13- Flores de A. millefolium (foto: A. VOGEL, on line, 2007).
Tais plantas crescem em climas temperados a subtropicais, suportando condições
climáticas adversas como frio de até –15°. Quando cultivada, floresce na primavera e quando
nativa floresce duas vezes por ano nos meses de maio a setembro (CHANDLER, 1989).
Esta espécie é conhecida popularmente como: milfolhas, erva de cortaduras, mil-em-
rama, erva-do-carpinteiro, milefólio, pronto alívio e outros. Em outros idiomas, schafgarbe
(alemão), milenrama (espanhol), yarrow (inglês), millefeuille (francês), millefoglie (italiano)
(PIO CORREIA, 1979; BALBACH, 1995).
A prática medicinal da planta é relatada no manual de medicina encontrada na
Mesopotâmia (∼ 2200 a.C.). Relata-se também o uso da planta com fins medicinais durante a
guerra civil americana, onde o emprego de folhas e flores secas era considerado oficialmente
como tônico, estimulante e emenagogo segundo a farmacopéia dos Estados Unidos (1836-
1882) (CHANDLER, 1989; THORWALD, 1990).
Índios norte-americanos indicavam o uso da planta na forma de chás, ungüentos ou
loções para tratar feridas, contusões e em raches cutâneos assim como antitérmico e para
resfriados comuns (CHANDLER et al., 1982).
A A. millefolium também é empregada para acentuar o sabor de bebidas como vinho e
cerveja. As folhas e flores são utilizadas como tempero. Com as folhas são preparadas saladas
(TORRES & CHÁVEZ, 2001).
2.5.1.1 Composição química
41
As pesquisas sobre o conteúdo químico da planta são numerosas. Foi com a destilação
de um óleo volátil azul em 1719 por Hoffman, que as análises químicas da planta se iniciaram
(FALK et al., 1975; CHANDLER, 1989).
O óleo volátil da A. millefolium é composto majoritariamente pelo óleo essencial
(monoterpenos) (30-80%), sesquiterpenos (8-62%) e em menor quantidade por outros
compostos (1-3%), como álcoois, ésteres, aldeídos e norcarotenóides (HOFMANN et al.,
1992). Quantitativamente os constituintes mais importantes do óleo essencial foram:
sabineno,
β
-pineno, 1,8- cineol, artemísia, quecetona, linalol,
α
-tujona,
β
-tujona, cânfora,
borneol, acetato de fenchila, acetato de bornila, (E)–
β
- cariofileno, germacreno D, oxido
cariofilenico,
β
-bisabolol, γ-cadinol e camazuleno (Figura 14, p.43) (HAGGAG, 1975;
ORAV et al., 2006; HOFMANN et al., 1992; CANDAN et al., 2003). Os sesquiterpenos do
tipo hidrocarbonetos são os mais abundantes (até 64%) (HOFMANN et al., 1992). Três novos
sesquiterpenos foram isolados de A. millefolium, como metil ésteres, são eles ácidos
aquimílicos A, B e C (TOZYO et al. 1994).
O primeiro e principal proazuleno natural do gênero Achillea a ser isolado e elucidado
foi a aquilicina e foi identificada como 8-acetoxiartabsina (CUONG et al., 1979). Alguns
exemplos de proazulenos isolados da planta são: 8α-angeloxiartabsina, 8α-tigloxiartabsina,
7,8-guaianolides, 8-desacetil-4-epi-matricina, 8-desacetil-8-tiogloil-4-epi-matricina, 8-
desacetil-8-tigloil-matricina, entre outros; e de sesquiterpenos não azulenogênico são:
arglanina, matricarina, tauremisina, santamarina, 8α angeloxiartabsina-1,4-endoperóxido, 8α-
tigloxiartabsina-1,4-endoperóxido, derivado de germacrane, entre outros (GLASL et al.,
1999; KUBELKA et al., 1999; GLASL et al., 2002).
Os primeiros flavonóides da A. millefolium foram isolados em 1961 por Horhamer e
foram eles: apigenina 7-O-glucosídeo (cosmosiina) e a luteolina 7-O-glucosídeo (cinarosídeo)
(FALK et al. 1975; GUÉDON et al., 1993). Outros flavonóides identificados são
isorhamnetina, rutina, quercetina, centaureidina, pectolinarigenina, 3-metilbetuleto (Figura
15, p.43) (VALANT-VETSCHERA & WOLLENWEBER, 1988; GUÉDON et al., 1993).
Falk et al. (1975), identificaram mais três flavonóides da classe das flavonas: 5-hidroxi-3, 6,
7,4’-tetrametoxiflavona, a artemetina e a casticina.
O primeiro alcalóide nessa espécie foi isolado por Zanon em 1846 e foi chamado
aquileína. Tujona, também encontrada em outras plantas, foi detectada (CHANDLER et al.,
1989).
42
A presença de esteróis, triterpenos e saponinas foram determinadas na A. millefolium.
Entre os esteróis estão o β-sitosterol (o principal), estigmasterol, campesterol e colesterol; e
entre os triterpenos, o principal é a α-amirina, mas β-amirina, taraxasterol e
pseudotaraxasterol também são encontrados (CHANDLER et al., 1982).
Algumas outras substâncias foram identificadas como alcamidas: prolina, estaquidrina,
betonicina, betaina, colina (MEHLFÜHRER et al., 1997).
Cumarinas foram encontrados e alguns aminoácidos como alanina, histidina, leucina,
lisina. Ácidos graxos: ácidos linoléico, palmítico, oléico. Ácidos fenólicos: ácidos caféico,
salicílico, ascórbico e açúcares: dextrose, glucose, manitol, sucrose (Figura 16, p.44)
(BLUMENTHAL et al., 2000).
CH
3
CH
3
CH
3
CH
2
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
2
CH
3
CH
3
CH
3
CH
2
CH
3
CH
3
Camazuleno
β−
pineno 1,8-cineol
cânfora
sabineno
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
H
CH
2
CH
3
CH
3
CH
3
CH
2
Borneol
β
-cariofileno
Germaceno
Figura 14. Exemplos de componentes do óleo essencial de A. millefolium
43
O
OH OH
O
OH
O
O
O
H
O
H
O
OOH
OH
OH
OH
OH
Rutina
O
O
R
1
OOH
OR
2
R
3
CH
3
Figura 15. Exemplos de flavonóides de A.millefolium
N
O
CH
3
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
Amida piperideídica
Ácido ascórbico
Ácido caféico
Figura 16. Exemplos de outros compostos presentes em A.milllefolium
2.5.1.2 Ação Farmacológica
A A. millefolium tem sido empregada popularmente no tratamento de hemorragias,
úlceras, diarréia, câncer, tumores, condilomas, verrugas, leucorréia, gripe, pneumonia, etc. É
também considerada abortiva, contraceptiva, anti-hemética, cicatrizante, analgésica,
antiinflamatória, anti-térmica e anti-helmíntica (CHANDLER et al., 1982). Tem sido usada
Nome R
1
R
2
R
3
Pectolinarigenina H H H
3-Metilbetuletol OMe H H
Centaureidina OMe H OH
44
homeopaticamente como antibacteriana, antifúngica, antitumoral, antioxidante, antiedematoso
(ISAAC et al., 2002; SWEETMAN, 2002). Entretanto, os estudos dessas propriedades ainda
não são conclusivos (JORGE et al., 1999).
Na Alemanha, a A. millefolium compõe vários medicamentos para o tratamento de
dispepsias e sintomas gastrointestinais, sendo indicada como colerética, antiespasmódica,
adstringente e bactericida pela Comissão E alemã (BLUMENTHAL et al., 2000). O British
Herbal Compendium também ressalta ações espasmolíticas, emenagoga e colerética da planta
(BRADLEY, 1992).
A eficácia antiulcerogênica do extrato aquoso de A. millefolium foi avaliada após
exposição aguda da mucosa gástrica de ratos Wistar por etanol e indometacina, bem como
lesões gástricas crônicas provocadas por ácido acético. Os resultados mostraram um potencial
antiulcerogênico das partes aéreas da planta sem sinais relevantemente tóxicos, mesmo
submetendo-se a exposições crônicas por longo tempo (CAVALCANTI et al., 2006).
A capacidade hepatoprotetora e efeitos antiespasmódicos do extrato alcoólico da A.
millefolium foram também estudados, onde o emprego do extrato bruto reduziu a mortalidade
dos camundongos em 40%. Os efeitos hepatoprotetores do extrato bruto da Achillea foram
mais fortemente verificados com base na histopatologia do fígado, a qual evidenciou aumento
da arquitetura, ausência de congestão parenquimal, diminuição de células edematosas e
apoptóticas (YAEESH et al., 2006).
Diferentes espécies do gênero Achillea têm sido usadas no tratamento de desordens
gastrointestinais e hepatobiliares na medicina européia tradicional, onde em fígados de rato, o
efeito colerético de frações da planta comparado com a cinarina, principal componente
colerético da Cynara scolymus tem sido estudado. O extrato da planta estimulou um fluxo
biliar mais eficientemente que o simples composto cinarina (BENEDEK et al., 2005).
Com relação à atividade antiinflamatória, foram feitos estudos comparativos usando
um gel contendo extrato da planta e Ruscus e diclofenaco sódico (diclosal emugel) em edemas
induzidos por carragenina em patas de ratos albinos. Os resultados mostraram que a redução
do edema pelo extrato de Achillea e Ruscus foi de aproximadamente 48% enquanto que o uso
do diclosal reduziu o edema em 47% (MASWADEEH et al., 2006).
Della Loggia et al. (1992), demonstraram a atividade antiinflamatória da fração
clorofórmica (rica em proazuleno), inibindo o edema induzido por óleo de Cróton. A
atividade antiinflamatória dos flavonóides quercetina e rutina foi demonstrada num modelo
experimental de artrite (GUARDIA et al, 2001).
45
Os flavonóides encontrados nas folhas e flores, a apigenina 7-O glucosídeo e a
luteolina 7-O-glucosídeo, foram relacionados à atividade espasmolítica (FALK et al., 1975).
A analgesia resulta de derivados do ácido salicílico, eugenol, mentol e outros
componentes presentes no óleo volátil. Taninos, esteróis, triterpenos e substâncias do óleo
volátil, como cânfora, azuleno, sesquiterpenos e mentol possuem atividade antiinflamatória e
flavonóides com atividade anti-espasmódica (CHANDLER et al., 1989).
A ação antitumoral desta planta tem sido estudada e três novos sesquiterpenóides,
ácido aquimílico A, B e C foram isolados do extrato metanólico das flores de A. millefolium.
Os componentes se mostraram ativos contra células leucêmicas de ratos P-388 in vivo
(TOZYO et al., 1994).
O flavonóide casticina, derivado da A.millefolium, foi investigado pelo seu mecanismo
de ação antitumoral, sugerindo a sua utilização na terapia do câncer (HAIDARA et al., 2005).
A atividade fotoprotetora tem sido também investigada. Extratos etanólicos de flores e
folhas secas não apresentaram significativa absorção para a faixa de radiação UV entre 290-
400 nm, sendo encontrada uma absorvância muito baixa (SOUZA et al., 2005).
Segundo Candan et al.(2003), o óleo essencial de A. millefolium possui uma atividade
antimicrobiana maior que o extrato metanólico sendo a sua atividade moderada frente aos
microrganismos Streptococcus pneumonie, Clostridium perfringens e Cândida Albicans,
Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter iwofii e Candida Krusei. O extrato metanólico
apresentou fraca ou nenhuma atividade antimicrobiana.
Pesquisas demonstraram que o óleo essencial da espécie apresenta também ação
fungistática contra Cândida albicans e Saccharomyces cerevisae e ação antibacteriana contra
Staphylococcus aureus (KEDZIA et al., 1990; POPOVICI et al., 1990).
Outros relatos de atividade antimicrobiana demonstraram que o extrato hidroalcoólico
90% era ineficaz contra os microrganismos S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa,
C.krusei, C. parapsilosis, C. albicans e C. tropicalis (HOLETZ et al., 2002).
O extrato de flores de A. millefolium inibiu o crescimento de Streptococcus
β
hemolíticos, Staphylococcus aureus e Candida albicans (DETTER, 1981).
Pouquíssimos estudos são encontrados para a atividade antifúngica de A. millefolium
contra fitopatógenos. Fenner et al. (2006), realizaram um levantamento bibliográfico
etnobotânico sobre plantas utilizadas pela população brasileira no tratamento de sinais e
sintomas relacionados às infecções fúngicas. Foram citadas 409 espécies, distribuídas em 98
famílias, com maior concentração em Febaceae e Asteraceae. Foi realizada uma busca na
base de dados MEDLINE-PubMed para as 10 espécies mais citadas, sendo que o maior
46
número de citações, não pertence a essas famílias. Foram encontradas 108 publicações para a
família Asteraceae.
Segundo Fiori et al. (2000), a atividade fungicida de extratos brutos e do óleo
essencial de A. millefolium e outras plantas em fungos Didymella bryoniae foi verificada in
vitro por meio da observação de germinação de esporos e crescimento micelial. Os resultados
evidenciaram uma inibição de 52% do crescimento micelial utilizando extratos brutos e
análises envolvendo microscopia eletrônica revelaram alterações no padrão de crescimento
das hifas na presença do óleo essencial, entretanto no trabalho citado não há esclarecimento
do solvente utilizado na produção do extrato. Em trabalho mais recente utilizando a Achillea
ligustica all foi verificada uma pequena atividade contra o fitopatógeno Fusarium oxysporum
e outros microrganismos estudados (TUBEROSO et al., 2005).
Em trabalho desenvolvido por Stangarlin et al, (1997), também não foi verificada a
presença de frações fungitóxicas de A. millefolium na inibição do fungo fitopatógeno
Colletotrichum. Graminicola.. Schwan-Estrada et al. (2000), não verificaram atividade
fungicida em fitopatógenos da Alternaria spp ao utilizar extratos brutos aquosos de A.
millefolium e Artemísia absinthium. Souza et al. (2006), também não verificaram inibição
para o extrato etanólico contra cepas de S. aureus, S. epidermidis e E. coli.
Pesquisas na literatura mostram que outras espécies do gênero Achillea sp., como A.
atrata, A..falcata, A..clavennae, A..aleppica, A..biebersteinii, A..multifida, apresentam
propriedades antimicrobianas contra fungos e bactérias de humanos (ALJANCIC et al., 1999;
ABURJAI & HUDAIB, 2006; BEZIC et al., 2002; ISCAN et al., 2006; BARIS et al., 2006;
BASER et al., 2002).
2.5.1.3 Aspectos toxicológicos.
A A. millefolium é considerada uma planta pouco tóxica, mas existem relatos de
respostas alérgicas por uso da planta. Casos de dermatite alérgica quando em contato com A.
millefolium têm sido descritos desde 1899. O principal sesquiterpeno sensibilizante
identificado em experimentos com porcos guinea foi chamado α-peroxyachifolide. De 1985 –
1990, mais de 50% dos pacientes sensíveis reagiram a testes com extrato etanólico da planta
(HAUSEN et al., 1991; RUCKER et al., 1991; CHANDLER et al., 1989; BLUMENTHAL et
al., 2000).
47
A planta tem sido também considerada tradicionalmente como abortiva, contraceptiva
e estimulante de contrações uterinas, estudos com fêmeas de ratos grávidos foram realizados
administrando oralmente o extrato etanólico da planta em diferentes fases da gestação. Os
resultados mostram uma redução no peso fetal e aumento no peso placentário, sugerindo que
o consumo da mesma seja contra-indicado na gestação, até que maiores investigações sejam
realizadas (BOSWELL-RUYS et al., 2003; DALSENTER et al., 2004). Em outro
experimento, o extrato de folhas não alterou o tempo do primeiro acasalamento, fertilidade e o
tamanho das crias (BARNES et al., 1979).
Ainda com relação à atividade contraceptiva da A. millefolium, a fração água/metanol
exibiu atividade estrogênica e nove componentes foram isolados entre eles um composto que
foi isolado pela primeira vez do gênero Achillea: 9-O- β-d-glucopiranosídeo (MONTANARI
et al., 1998; INNOCENTI et al, 2007).
As alcamidas, betonicina e estaquidrina, produziram uma ação uterotônica em ratas
prenhas, indicando que o uso da planta não é recomendável durante a gestação (ALONSO,
1998; BLUMENTHAL et al., 2000).
Alonso (1998) e Cáceres (1999) relataram que tanto o uso prolongado quanto
doses elevadas da planta foram relacionadas a queixas de tontura e cefaléia.
48
3 MATERIAIS E MÉTODOS
As diversas análises da planta foram realizadas conforme fluxograma abaixo.
Figura 17 - Fluxograma das análises experimentais realizadas com A. millefolium.
A. millefolium
Extratos brutos
Extrato
etanólico seco
Prospecção fitoquímica Ensaios biológicos
Cromatografia
Preparativa
Fracionamento
Fração
A2
Fração
A3
Fração
A4
Fração
A5
Fração
A1
Fração
A6
Testes Biológicos
49
3.1 MATERIAL VEGETAL
Partes aéreas, folha e caule, da Achillea millefolium L. foram coletadas após 100 dias
de plantio no Horto Botânico do Campus Antônio Rodrigues Coelho da Universidade Vale do
Rio Doce – UNIVALE – Governador Valadares, Minas Gerais.
3.2 SECAGEM E MOAGEM
Logo após a coleta, procedeu-se o processo de secagem utilizando uma estufa com
temperatura aproximada de 40°C durante dois dias. A planta seca foi triturada com o auxílio
de um moinho de facas (Marconi
®
- Modelo 340). O pulverizado foi armazenado em um saco
opaco ao abrigo da luz.
3.3 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
A prospecção fitoquímica dos extratos aquoso, etanólico e em diclorometano das
folhas e caule da Achillea foi realizada conforme Simões et al. (2004).
3.3.1 Preparação dos Extratos brutos
Para a prospecção fitoquímica, extratos aquosos, etanólicos e em diclorometano foram
produzidos separadamente, utilizando-se 5,0 g da planta pulverizada e 50 ml de cada solvente
sob ultra-sonicação (Unique
®
- MaxiClean 1400) por 30 minutos com a adição de 1,0 g de
carvão ativo para eliminação da clorofila, uma vez que ela mascara a resposta colorimétrica
da prospecção fitoquímica. Após adsorção da clorofila pelo carvão, procedeu-se a filtragem
do extrato em papel de filtro.
50
3.3.2 Ensaios com os extratos aquosos, etanólico e em diclorometano
Todos os testes foram realizados em tubos de ensaio, promovendo reações de
coloração e precipitação.
3.3.2.1 Análise de açúcares redutores
Primeiramente foi feito o ajuste do pH do extrato bruto, para 7,0. Utilizaram-se os
testes com os reagentes Fehling A e Fehling B. Em Fehling A, num balão volumétrico de 500
ml foram dissolvidos 34,7 g de CuSO4 em água Completou-se o volume com H
2
SO
4
a 0,5%.
Para Fehling B, em balão volumétrico de 500 ml foram solubilizados 175,0 g de tartarato de
sódio e 150,0 g de NaOH, completando-se o volume com água. Estes reagentes foram
dispostos em tubos de ensaio contendo os extratos. Aqueceu-se até a ebulição e o
aparecimento de um precipitado vermelho-tijolo indica a presença de açúcares redutores.
3.3.2.2 Análise de compostos fenólicos
Para compostos fenólicos utilizamos o teste com cloreto de Ferro (FeCl
3
5%).
Adicionaram-se cinco gotas de FeCl
3
a 5% em alíquotas dos extratos. A formação de
precipitado ou mudança de coloração indica a presença de compostos fenólicos.
3.3.2.3 Análise de taninos
Dois testes foram realizados com ácido clorídrico diluído 0,1M e gelatina salgada e
com ácido acético 10% e acetato de chumbo a 10 %. No primeiro teste adicionaram-se cinco
gotas de HCl diluído 0,1 M e gotas de solução de gelatina salgada. A formação de precipitado
indica a presença de taninos. No segundo teste, adicionou-se 2,0 ml de ácido acético 10% e
51
cinco gotas de acetato de chumbo a 10%. A formação de precipitado indica a presença de
taninos .
3.3.2.4 Análise de flavonóides
Foi utilizado o teste com ácido clorídrico e magnésio. No primeiro teste, adicionou-se
1,0 ml de HCl concentrado e fragmentos de magnésio em fita. Observou-se a cor formada,
indicando a presença de diversos compostos flavônicos. Para o segundo teste, o extrato foi
transferido para uma cápsula de porcelana e acrescentaram-se gotas de solução metanólica de
cloreto de alumínio (AlCl
3
) a 2,0%. Aqueceu-se em banho-maria até redução do volume e
submeteu-se a radiação UV e observou-se a fluorescência emitida sob a luz UV.
3.3.2.5 Análise de cumarinas
Separaram-se duas amostras do extrato e aplicou-se sobre uma das amostras uma gota
de solução alcoólica de 1,0 M KOH. Levaram-se as amostras à luz UV.
3.4 ANÁLISES ESPECTROMÉTRICAS
3.4.1 Preparo dos extratos brutos
Os extratos para as diversas análises espectrométricas foram preparados conforme
especificação abaixo.
3.4.1.1 Para estudo utilizando diversos solventes
52
Para a obtenção dos vários extratos brutos, foram testados, separadamente, água,
metanol, hexano, éter e diclorometano. Utilizou-se 1,0 g do pulverizado e 100 ml de cada
solvente. Os extratos foram sonicados, ultra-som modelo (Unique
®
- MaxiClean 1400), por 30
minutos. Posteriormente fez-se a filtragem a vácuo (Bomba de vácuo Prismatec modelo 131
A).
3.4.1.2 Para estudo do carvão ativo como extrator de clorofila e dos compostos da planta
Utilizou-se 1,0 g do pulverizado em 100 ml de solvente em três béckers e levou-se ao
ultra-som por 60 minutos, sem a adição de carvão. Após, adicionou-se 0,1 g de carvão ativo
no primeiro bécker, 0,5 g de carvão no segundo bécker e 1,0 g no terceiro bécker.
Foram feitas amostragens de 10 em 10 minutos até o tempo máximo de 60 minutos.
Procedeu-se a filtragem a vácuo dos extratos. Estes foram diluídos em 1:200 (m/v) de
solvente e avaliados espectrometricamente.
3.4.1.3 Para estudo da hidrólise do extrato aquoso
Utilizou-se 1,0 g do pulverizado em 100 ml de água. Levou-se ao ultra-som por 30
minutos. Foi feita a filtragem a vácuo e a diluição de 1: 3000 ml (mv) do solvente. Mediu-se o
pH inicial da amostra no (pHmetro Quimis
®
- Q 400
A
) sendo este 6,0. Acrescentou-se 2 gotas
de NaOH 1,0 M em 3 ml do extrato aquoso elevando-se o pH para ≅ 14 e 2 gotas de HCl 1,0
M em 3ml do extrato ajustando-se o pH para ≅ 1.
3.4.1.4 Para comparação entre ultra-som e maceração
Utilizou-se 1,0 g da A.millefolium pulverizada em 100 ml de metanol. Levou-se ao
ultra-som por 30 minutos. Após esse tempo, coletou-se a primeira alíquota de 1,0 ml e assim
sucessivamente as alíquotas foram sendo coletadas de 30 em 30 minutos até o tempo máximo
53
de 240 minutos. Foram feitas as filtragens a vácuo das mesmas e feita a diluição de 1:200 ml
do solvente e os extratos foram analisados no espectrofotômetro.
O mesmo procedimento foi utilizado para a extração simples, onde no final de cada
tempo, espectros de cada alíquota sonicada, foram medidos e comparadas às absorbâncias, ou
seja, quanto maior a absorbância, maior é o poder extrator do procedimento.
3.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
3.5.1 Microrganismo utilizado
Utilizou-se isolado do fungo Colletotrichum musae obtido diretamente de frutos de
banana doentes da região. O isolamento do patógeno foi realizado no laboratório de
Fitopatologia da Faculdade de Ciências Agrárias da UNIVALE. O fungo foi isolado
inicialmente em tubos de ensaios, caracterizado e repicado para placas de Petri contendo meio
de cultivo BDA (batata dextrose ágar).
3.5.2 Metodologia para biomonitoramento
3.5.2.1 Placa com dupla camada de gel
Colocou-se na placa de Petri uma primeira camada de ágar-água esterilizado, de
aproximadamente 0,5 cm de espessura. Esperou-se uma hora para resfriamento do meio.
Posteriormente colocou-se uma camada de BDA misturado com conídios do fungo teste. Em
seguida adicionou-se 100 µL de água estéril em um tubo de ensaio contendo isolado do fungo
esporulando. Agitou-se e verteu no Erlenmeyer contendo 40 ml de BDA, o qual foi
previamente levado ao forno de microondas, resfriado até temperatura aproximada de 50°C.
Após foi imediatamente vertido na placa de Petri. Posteriormente foi feito um orifício no
centro da placa com diâmetro médio de 0,7 cm até alcançar o ágar-água (Figura 18, p.55).
54
Neste orifício foi depositado o tratamento. Os experimentos foram realizados em triplicata. Os
tratamentos estão descritos na Tabela 3 .
Figura 18 - Esquema de distribuição do extrato em cavidade central na placa de Petri com conídios suspensos no
meio de cultura BDA.
Tabela 3 – Descrição da composição dos tratamentos veiculados em Placa com Dupla Camada de Gel.
Tratamento
Volume do
Soluto (µl)
Volume do solvente
DMSO (µl)
Concentração final
Extrato 100% 50 0 100%
Extrato 50% 25 25 50%
Extrato 5% 2,5 47,5 5%
Extrato 0,5% 0,25 49,75 0,5%
DMSO 0 50 100% de DMSO
Fungicida (Procloraz) 1 49 2% de fungicida
3.5.2.2 Infusão do extrato no meio de cultura
Pesou-se 0,09 gramas de extrato etanólico seco de A. millefolium a qual foi diluída em
150 µl de DMSO. O extrato diluído em DMSO foi vertido em Erlemeyer contendo 40 ml de
BDA fundente, homogeneizado e vertido nas placas de Petri estéril. Após resfriamento e
solidificação do meio, um disco de 8 mm de micélio com sete dias de repicado, foi colocado
no centro de cada placa de Petri. Após cinco dias, o crescimento radial do fungo foi avaliado
com o uso de régua transparente, medindo-se o diâmetro da colônia formada em dois sentidos
ortogonais.
Após a obtenção de resultado positivo com este protocolo, o mesmo foi adotado para
os ensaios subseqüentes onde se realizou a separação em placa preparativa cromatográfica
Camada de BDA + conídio
Camada de ágar
-
água
Tratamento
55
para separação das frações do extrato seco etanólico da A. millefolium para o posterior
biomonitoramento das frações.
3.6. SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
3.6.1 Preparo do extrato seco
Pesou-se 50 gramas do pulverizado, adicionou-se 100 ml de etanol, levou-se ao ultra-
som até a exaustão, monitorando a saturação do solvente no comprimento de onda 664 nm
que é o comprimento de onda de absorção da clorofila para se certificar da máxima extração
dos constituintes da planta. Posteriormente o extrato bruto da planta foi concentrado
eliminando-se o solvente com o uso de um evaporador rotativo, em temperatura inferior a
40
o
C. O extrato seco obtido deste processo foi fracionado com o método da cromatografia
preparativa planar e suas frações utilizadas para os testes biológicos.
3.6.2 Diluição do extrato seco
O extrato seco da planta de peso 0,393 gramas, foi redissolvido em 5,0 ml de etanol
para aplicação em placa cromatográfica.
3.6.3 Cromatografia Planar Preparativa
3.6.3.1 Preparo das placas
As placas de vidro foram limpas com água e detergente e após com éter etílico para
retirada de resíduos orgânicos e secas em estufa a 50°C por 2 horas.
56
Utilizaram-se placas de vidro de 20 por 20 cm recobertas com uma camada de 0,5 mm
de espessura de sílica 60 Merck
®
e água na proporção de 1:1,9 (sílica/água), após foram
deixadas em estufa a 105°C por 2 horas.
3.6.3.2 Escolha do solvente de eluição
A escolha do solvente de eluição foi realizada por cromatografia em camada delgada.
Uma amostra de 3,0 mg do extrato da Achillea millefolium foi diluída em diclorometano. Com
um capilar de vidro realizou-se o spot test.
Os solventes de eluição foram adicionados em cubas de vidro até a altura de 1,0 cm.
Os solventes testados foram hexano, hexano/acetato de etila (90:10) e hexano/acetato de etila
(50:50).
3.6.3.3 Aplicação da amostra
A aplicação da amostra sobre a cromatoplaca foi feita utilizando-se uma pipeta de 5,0
ml a uma distancia de 1,0 cm do extremo inferior da cromatoplaca. Efetuou-se a aplicação da
amostra em 5 frações consecutivas de 1,0 ml, em seguida deixou-se aproximadamente 1 hora
até evaporação completa do solvente e adsorção da amostra na placa. Logo após, a placa foi
colocada em uma cuba contendo o solvente de eluição hexano. Utilizou-se 200 ml de
solvente. A altura da fase móvel na cuba foi de aproximadamente 1,0 cm abaixo do ponto de
aplicação da amostra. Para a saturação da cuba utilizou-se uma tira de papel de filtro,
previamente embebida em hexano, que foi aderida à parede da cuba.
3.6.3.4 Ensaios com frações do extrato seco etanólico
Após a separação, as seis frações juntamente com a sílica, foram removidas da placa
com auxílio de uma espátula e re-solubilizadas com hexano e separadas da sílica por filtração
57
a vácuo. Em seguida as frações filtradas tiveram o solvente retirado por destilação à pressão
reduzida e o sólido resultante rotulado e mantido sob temperatura de -18°C até o uso posterior
para o biomonitoramento das frações. As frações foram pesadas (Tabela 4) e cada fração foi
dissolvida em 150 µL de DMSO e foi seguido o protocolo da infusão do extrato no meio de
cultura. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Tabela 4 - Peso das frações obtidas por CCD da A. millefolium.
Fração A1
Fração A2
Fração A3
Fração A4
Fração A5
Fração A6
0,007g 0,013g 0,010g 0,155g 0,144g 0,190g
58
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
Por mais de 3000 anos, a A. millefolium é utilizada em vários continentes e diversas
culturas como planta medicinal para o tratamento de numerosas afecções (CHANDLER,
1989; BLUMENTHAL et al., 2000).
Os resultados da prospecção fitoquímica para os extratos aquosos, etanólico e
diclorometano dos caules e folhas da Achillea millefoium podem ser observados na Tabela 5 .
Tabela 5 - Resultados da prospecção fitoquímica para A. millefolium.
Teste Extrato aquoso
Extrato etanólico
Extrato em diclorometano
Açúcares redutores
- - -
Compostos fenólicos
+ + -
Taninos (a)
+ - -
Taninos (b)
+ + -
Flavonóides (a)
+ + -
Flavonóides(b)
+ + -
Cumarinas
+ + +
• (+) resultado positivo e (-) resultado negativo.
Em relação aos resultados da prospecção fitoquímica, estes mostraram a presença de
metabólitos secundários os quais apresentam potencialmente propriedades antimicrobianas
como compostos fenólicos, taninos e flavonóides (COWAN, 1999). Verificou-se também a
presença de cumarinas e ausência de açúcares redutores. Souza et al., (2006), relataram a
presença de taninos, flavonóides e saponinas e a ausência de glicosídeos cardiotônicos,
alcalóides e antraquinonas. Os resultados estão de acordo com o previsto na literatura
especializada (MATTOS, 1998), onde, misturas hidroalcoólicas extraem taninos, flavonóides
e açúcares e solventes com menor polaridade como diclorometano, acetato de etila e butanol
59
extraem geninas de flavonoides, cumarinas simples e terpenos. A ausência de açúcares no
extrato aquoso de A. millefolium contradiz Blumenthal et al. (2000), que relatou a presença de
dextrose, glucose, manitol e sucrose. A diferença nos resultados reforça a hipótese de que a
época do ano influência de maneira determinante na concentração dos compostos. Segundo
Cruz et al. (1998), os meses de setembro, outubro e novembro quando a espécie está florida,
os teores de óleo essencial são maiores.
4.2 ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA
4.2.1 Perfil espectrométrico de diferentes solventes
Na região do ultravioleta as absorções ocorrem por meio de transições eletrônicas
características para cada grupo funcional.
Para obtenção do melhor solvente de extração dos constituintes da planta, observou-se
o espectro de varredura no UV-VIS de extratos com constantes dielétricas diferentes, de
acordo com a Figura 19 (p. 61). Para evidenciar as diferenças entre os solventes foi utilizada
a escala logarítmica. Os perfis apresentados pelos diferentes solventes demonstram que tanto
solventes polares (água) quanto solventes apolares (hexano) apresentam absorção nas regiões
do ultravioleta e do espectro visível. Isto é, diferentes compostos são extraídos nos dois
solventes com polaridades extremas, pois apresentam grupos cromóforos semelhantes
descritos na Tabela 6 (p. 61). Dentre esses grupos, nos interessam especialmente os que
fazem parte da classe de compostos fenólicos como flavonoides, cumarinas e taninos.
O metanol apresentou-se como o solvente mais adequado para a extração dos
constituintes polares e apolares da A. millefolium ao longo da faixa espectral analisada, onde
segundo Simões et al. (2004), se enquadram os compostos fenólicos das classes
isoflavonóides e biflavonóides aos quais são atribuídas atividades antifúngicas e absorvem em
240-285 nm e 300-400 nm. Entretanto, a toxicidade do metanol é elevada e optou-se por usar
o etanol, uma vez que este apresentou perfil semelhante ao do metanol, porém com menores
absorbâncias. A escolha pelo etanol visou também à minimização de erros no
biomonitoramento decorrentes de traços do solvente de extração.
60
200 250 300 350 400 450 500
0,01
0,1
1
ÁGUA
ETANOL
METANOL
ÉTER
HEXANO
DICLOROMETANO
Absorbância
λ
/ nm
Figura 19 - Perfil espectrofotométrico da A. millefolium para diferentes solventes.
Tabela 6 - Dados de absorção para cromóforos isolados.
Grupo cromóforo Sistema
λ
max (nm)
ε
max
Carbonila
O
R
1
R
2
279 15
Carbonila
O
H
R
1
290 16
Carboxila
O
OH
R
1
204 60
Fenol
OH
210
270
6.200
1.450
Benzeno
200
255
8.000
215
Fonte: Silverstein et al., 1991.
61
4.2.2 Hidrólise do extrato aquoso da Achillea millefolium
Com relação à influência do pH sobre o extrato aquoso, obtiveram-se espectros para
valores extremos de pH ≈ 1,0 (adição de 2 gotas de 1,0 M HCl em 3 mL de extrato aquoso),
pH ≈ 6,0 (pH original do extrato aquoso) e 14,0 (adição de 2 gotas de 1,0 M NaOH em 3 mL
de extrato aquoso) conforme a Figura 20 . Os espectros medidos para valores de pH entre 1 e
6 não apresentaram modificações significativas no seu perfil, o que indica pouca ou nenhuma
hidrólise do meio sobre os constituintes da planta no que se refere à protonação das
moléculas. Observa-se uma mudança significativa no espectro para valores de pH alcalino, o
que indica uma possível hidrólise com a deprotonação de grupamentos como os descritos na
Tabela 6 (p. 61).
250 300 350 400 450 500 550 600
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
Espectro de Mil folhas / AQUILEA
EXTRATO AQUOSO
pH~14
pH~6
pH~1
Absorbância
λ
/ nm
Ponto isosbéstico: equilíbrio de uma parte
protonada e deprotonada da molécula
250 300 350 400 450 500 550 600
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
Espectro de Mil folhas / AQUILEA
EXTRATO AQUOSO
pH~14
pH~6
pH~1
Absorbância
λ
/ nm
Figura 20 - Influência de valores extremos de pH sobre o extrato aquoso da Achillea millefolium.
62
4.2.3 Influência do tempo e massa de carvão ativo na extração de clorofila e dos
compostos da planta
Sabe-se que a clorofila é um pigmento que dificulta a interpretação dos resultados da
prospecção fitoquímica dos extratos, visto que são resultados colorimétricos, portanto a
mesma deve ser retirada dos extratos. Para tal extração utilizou-se carvão ativo em diversos
tempos e massas.
Utilizou-se 0,1g; 0,5g e 1,0g de carvão ativo medindo-se de 10 em 10 min. até o tempo
máximo de 60 min, a fim de se avaliar o poder adsorvente deste para a clorofila, tratando-se
do extrato metanólico da A. millefolium.
Perfis espectrais foram medidos e são apresentados nas Figuras 21, 22 e 23 (p. 64).
400 500 600 700
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
ABSORBÂNCIA
λ
/nm
TEMPO: 0'
TEMPO: 10'
TEMPO: 20'
TEMPO: 30'
TEMPO: 40'
TEMPO: 50'
TEMPO: 60 '
Extração da clorofila (0,1 g carvão)
m
extrato
: 1g/100mL de CH
3
OH
∆
∆∆
∆t= 10 min
Pico da clorofila 660 nm
Figura 21 - Adsorção da clorofila utilizando-se 0,1 g. de carvão ativo para o extrato metanólico de A
millefolium.
63
400 500 600 700
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Absorbância
λ
/nm
TEMPO: 0
TEMPO: 20 min
TEMPO: 30 min
TEMPO: 40 min
TEMPO: 50 min
TEMPO: 60 min
Pico da clorofila 660 nm
Extração da clorofila (0,5 g
carvão)
m
extrato:
1g/100mL de CH
3
OH
∆
∆∆
∆t= 10 min
350 400 450 500 550 600 650 700
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
t = 0 minutos
Absorvância
λ / nm
tempo zero
10 minutos
20 minutos
30 minutos
40 minutos
50 minutos
60 minutos
Figura 22 - Adsorção da clorofila utilizando-se 0.5 g.de carvão ativo para o extrato metanólico da A. millefolium.
Figura 23 - Adsorção da clorofila utilizando-se 1,0 g de carvão ativo para o extrato metanólico da A.
millefolium.
64
Os perfis espectrais revelaram que, com utilização de 0,1g de carvão na Figura 21 (p.
63), não houve decaimento significativo nos valores de absorvância em 660 nm ao longo dos
60 min.
Utilizando-se 0,5 g de carvão ativo, em 660 nm, observou-se que no tempo zero a
absorvância foi de 1,25 e com apenas 10 min de extração a mesma diminuiu para 0, 75,
indicando uma redução considerável da clorofila. Em 20 min a absorvância diminuiu para
aproximadamente 0, 5, em 30 min 0, 25, reduzindo progressivamente até 60 min. (Figura 22 -
p. 64), (Tabela 7, p. 67).
Para 1,0 g. de carvão ativo no tempo zero a absorbância foi de 1,25 e nos primeiros 10
min a absorvância cai substancialmente para 0,20 mantendo-se praticamente a mesma ao
longo dos 60 min (Figura 23, p.64 / Tabela 7, p.67).
Considerando o comprimento de onda de 660nm, que é o de absorção máxima da
clorofila, as absorvâncias para este comprimento de onda foram tomadas e um gráfico foi
traçado comparando a adsorção do carvão para as três massas em 60 min., como pode ser
constatado na Figura 24 (p. 66).
Entretanto, sabe-se que a clorofila não é seletiva para carvão ativo, retirando também
outros constituintes da planta. Considerando o comprimento de onda de 438 nm, que é o de
absorção de compostos fenólicos principalmente (SIMÕES et al., 2004), as absorvâncias para
este comprimento utilizando 0,5g e 1,0g de carvão ativo foram tomadas em detrimento do
teste com 0,1g que não foi satisfatório, e um gráfico comparativo do decaimento dos
constituintes do extrato foi traçado conforme a Figura 25 (p.66).
Observou-se ainda na Tabela 7 (p. 67), na análise do experimento de extração de
constituintes e clorofila, utilizando 1,0g de carvão ativo, nos tempos de 10 min. e de 30 a 60
min. não houve variação na extração da clorofila mantendo-se em 90%, no tempo de 20 min.
houve uma maior extração de 95%, entretanto os constituintes tiveram sua extração
aumentada no decorrer do tempo, sendo de 20-50 min 85% e em 60 min 90%.
Nos experimentos envolvendo extração com 0,5g de carvão ativo, para avaliação de
desempenho observou-se que nos tempos de 10, 20 e 30 minutos houve uma variação de 40,
50 e 75% respectivamente na extração de clorofila. Nos tempos de 40 á 60 min. estabilizou-se
em 65%. Para os constituintes da planta, observou-se que nos tempos de 10, 20 e 30 minutos
as extrações foram de 30, 40 e 65% respectivamente. Nos tempos de 40, 50 e 60 min. foi de
60, 50 e 55% respectivamente.
65
0 10 20 30 40 50 60
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
m
extrato
= 1,0g / 100ml CH
3
OH
1,0g carvão
0,5g carvão
0,1g carvão
[extrato]/[extrato]
0
tempo / min
Figura 24 - Decaimentos adsortivos da clorofila no carvão ativo, de acordo com as massas de carvão usadas.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 10 20 30 40 50 60
Tempo (min)
Absorbância [ABS]/[ABSº]
1,0g de C. A.
0,5g de C. A
Figura 25 - Decaimentos dos compostos da A, millefolium utilizando-se 0.5 e 1.0 gr de Carvão Ativo.
66
Tabela 7 - Relação entre o decaimento da clorofila e dos compostos da A.millefolium L.
Tempo
(min)
Decaimento da
clorofila (%)
0,5g C.A
Decaimento dos
compostos da planta
(%)
0,5g.C.A.
Decaimento
da clorofila da
(%) 1,0 g.C.A.
Decaimento dos
compostos da
planta (%)1,0
g.C.A.
10 40 30 90 80
20 50 40 95 85
30 75 65 90 85
40 65 60 90 85
50 65 50 90 85
60 65 55 90 90
4.2.4 Estudo comparativo entre ultra-som e sem ultra-som
Ensaios visando uma comparação entre dois procedimentos distintos para extração,
ultra-som e extração simples, foram realizados a fim de se avaliar a efetividade de ambos. Nas
Figuras 26 e 27 (p.68), são mostrados os aumentos da absorvância quando submetidos à
mesma condição experimental, ou seja, variando apenas a aplicação, ou não do banho de
ultra-som.
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
extração - S/ ULTRASOM
1g extrato / 100ml CH
3
OH
∆
T = 30' T
f
= 240 min
Absorbância
λ
/ nm
Figura 26 - Perfil espectrofotométrico da extração dos compostos utilizando maceração.
67
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
extração - ULTRASO M
(m
extrato
= 1g/100m l CH
3
O H)
∆
T = 30' T
f
= 240m in
Absorbância
λ
/ nm
Figura 27 - Perfil espectrofotométrico da extração dos compostos utilizando ultra-som.
Comparando-se as Figuras 26 (p.67) e 27 (p.68), do espectro medido em 240 minutos
verificou-se, que a extração utilizando-se ultra-som é 20% mais efetiva observado pelo
aumento da absorbância obtida em 325 nm para ambos os experimentos. Segundo Korn et a.l.
(2003), a utilização do ultra-som colabora na extração de compostos orgânicos, pois as ondas
de choque resultantes da aplicação do campo acústico sobre um meio material, acentuam a
interação entre o solvente e a superfície dos sólidos, pois a vibração causada pelos ultra-sons
minimiza o gradiente de concentração na vizinhança da superfície do sólido presente no meio
exposto e possibilita o arraste para a solução de sais e óxidos da superfície do sólido. A
pulverização facilita a ação das bolhas de cavitação que ao implodirem provocam um jato de
solvente sob a superfície da planta (DOMNGOS, 1998). Este efeito juntamente com a grande
quantidade de energia liberada pelas bolhas de cavitação no aquecimento/resfriamento
localizado (variações de 10
10
K·s
-1
), justifica a maior efetividade na extração com banho de
ultra-som.
4.3 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
Dois protocolos foram avaliados, placa com dupla camada de gel e infusão do extrato
no meio de cultura. O que permitiu a observação da atividade do extrato sobre a germinação
do esporo foi o conduzido por meio da infusão do extrato no meio de cultura. No protocolo
com dupla camada de gel, o extrato foi colocado diretamente em contato com o meio de
68
cultura, e o efeito do mesmo seria decorrente da difusão do mesmo no meio de cultura. Com
este procedimento, não foi observada a atividade do extrato sobre a germinação do esporo.
Foi então realizado o método da infusão do extrato no meio de cultura. Com a adoção deste
protocolo, foi possível discriminar o efeito do extrato na inibição do crescimento do patógeno,
medindo-se o diâmetro médio do crescimento radial do fungo em meio BDA, a 28°C, o qual
foi de 4,03 cm, apresentando 56,19% de redução do crescimento micelial (Figura 28 ).
Figura 28 - Resultado do teste de inibição do patógeno Colletotrichum musae por ação do extrato seco etanólico
de A.millefolium.
Após a realização da cromatografia preparativa, verificou-se a separação de seis
frações, nomeadas A1, A2, A3, A4, A5 e A6 e seus respectivos Índices de Retenção (R
f
),
foram medidos com régua milimetrada (Figura 29, p.70).
69
Figura 29 - Medidas dos coeficientes de retenção das frações.
Os valores dos índices de retenção podem ser verificados na Tabela 8 .
Tabela 8 - Frações do extrato seco da A. millefolium e seus respectivos índices de retenção
Fração Fator de Retenção - R
f
1ª Fração –A1 0,9
2ª Fração-A2 0,7
3ª Fração –A3 0,5
4ª Fração –A4 0,4
5ª Fração –A5 0,2
6ª Fração –A6 0
Resultante do fracionamento do extrato de A.millefolium, observou-se três frações com
maior potencial fungicida com inibição variando de 25% para a fração A5, 30% para a fração
A3 e 100% para a fração A6 (Figura 30,p.71). As demais frações não apresentaram
resultados significativos estatisticamente (Tabela 9, p.71).
70
Tabela 9 - Efeito de diferentes frações do extrato seco etanólico de A.millefolium sobre o crescimento radial do
fungo Colletotrichum musae em meio BDA, a 28ºC.
Tratamento
Diâmetro Médio do
Crescimento Radial do
Fungo (cm)
Redução do
Crescimento
(%)
BDA 8,20 A 0
BDA + DMSO 8,20 A 0
Aquiléia fração 2 8,17 A 0
Aquiléia fração 1 7,87 A 4
Aquiléia fração 4 7,40 A B 10
Aquiléia fração 5 6,13 B C 25
Aquiléia fração 3 5,73 C 30
Aquiléia fração 6 0,00 D 100
CV (%) 7,04
DMS 1,44
Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (0,05).
A fração de número seis foi a que apresentou 100% de inibição o que é extremamente
desejável para um produto natural. Tal fração possivelmente apresentaria constituintes polares
já que o solvente de eluição utilizado foi o hexano, o qual é altamente apolar e a mesma
apresentou índice de retenção igual à zero, ou seja, o solvente não conseguiu eluir os
constituintes polares da fração.
Figura 30 - Resultado do teste de inibição do patógeno Colletotrichum musae por ação das frações A3, A5 e A6
da A.millefolium.
A5
A6
A3
71
Estudos anteriores sinalizam para flavonóides (SIMÕES et al., 2004; COWAN, 1999)
e taninos (WAAGE et al., 1984; MARWAN & NAGEL, 1986) como agentes antifúngicos os
quais foram caracterizados na marcha fitoquímica. Os flavonóides possuem uma variedade de
efeitos biológicos em várias partes celulares. São conhecidos por serem sintetizados por
plantas em resposta a infecções microbianas, justificando assim sua ação frente a vários
microrganismos. Esta atividade se dá provavelmente por complexação com a parede
bacteriana. Os flavonóides mais lipofílicos podem lisar a parede microbiana (COWAN,
1999).
Os efeitos inibitórios dos taninos sobre bactérias e fungos derivam de 3 hipóteses:
inibição das enzimas de bactérias e fungos e/ou complexação com os substratos dessas
enzimas; ação sobre as membranas celulares dos microrganismos, modificando seu
metabolismo; complexação com íons metálicos diminuindo a disponibilidade desses para o
metabolismo dos microrganismos (SIMÕES et al., 2004).
72
5 CONCLUSÃO
5.1 PERFIL FITOQUÍMICO PRELIMINAR
Extratos aquosos de folhas e caules de Achillea millefolium avaliados à 01:20 ml de
solvente são mais eficientes na extração dos compostos químicos polares tais como
flavonóides, taninos e cumarinas.
5.2 ANÁLISES ESPECTROMÉTRICAS
Dentre os extratos em água, metanol, etanol, éter, diclorometano e hexano de caules e
folhas de Achillea millefolium, 1/100ml de solvente, o extrato metanólico se apresenta como o
mais eficiente na extração de compostos polares e apolares da planta, entretanto, optou-se
pelo uso do etanol, o qual apresentou perfil espectral semelhante ao metanol, por ser menos
tóxico e não interferir nos testes microbiológicos em quantidades/traço. Em meio aquoso,
1/100ml, o pH alcalino ocasiona formação de dois pontos isosbésticos determinando mudança
na estrutura das moléculas às quais se tornam deprotonadas. Com relação ao uso do carvão
ativo na extração da clorofila e compostos da planta, concluiu-se que 1,0g de carvão ativo por
10 min retirando 90% da clorofila e 80%dos constituintes da planta, revelaram-se a melhor
condição para realização dos experimentos da prospecção fitoquímica. Comparando-se a
extração dos constituintes da planta em extrato metanólico, 1/100ml, por maceração e por
sonicação, verificou-se que o processo físico do ultra-som mostrou-se mais eficiente na
extração dos constituintes da planta em cerca de 20% justificando assim seu uso.
5.3 ANÁLISE ANTIFÚNGICA
O extrato seco etanólico na concentração de 2000 ppm, apresentou inibição de 56%
sobre o patógeno estudado, Colletotrichum musae.
73
Com o fracionamento realizado por CCD foi possível detectar duas frações do extrato
(A3 e A5) com razoável ação fungicida, 30 e 25% respectivamente. A fração A6 apresentou
100% de inibição do crescimento micelial, tornando-se uma fração com potencial muito
grande para estudos avançados na identificação dos compostos presentes na fração isolada.
74
6 PERSPECTIVAS
Monitoramento dos efeitos edafoclimáticos na obtenção de extratos em solventes de
diferentes polaridades;
Utilizar a fração de maior atividade (A6) para caracterização estrutural (RMN, Massas, IV,
ultravioleta) dos compostos presentes na fração;
Após a padronização do extrato será possível desenvolver um concentrado emulsionável com
a referida fração e realizar testes in vivo.
75
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