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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA
DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SEDIMENTO POR
CROMATOGRAFIA GASOSA MONODIMENSIONAL E
BIDIMENSIONAL ABRANGENTE COM MICRO DETECTOR POR
CAPTURA DE ELÉTRONS
JULIANA MACEDO DA SILVA
Porto Alegre, novembro/2009.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
JULIANA MACEDO DA SILVA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA
DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SEDIMENTO POR
CROMATOGRAFIA GASOSA MONODIMENSIONAL E BIDIMENSIONAL
ABRANGENTE COM MICRO DETECTOR POR CAPTURA DE
ELÉTRONS
Dissertação apresentada como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Química.
Profa. Dra. Elina Bastos Caramão
Orientadora
Porto Alegre, novembro/2009.
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Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
ii
DECLARAÇÃO DE AUTORIA
A presente dissertação foi realizada inteiramente pelo autor, exceto as
colaborações as quais serão devidamente citadas nos agradecimentos, no período
entre agosto/2007 e novembro/2009, no Instituto de Química da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul sob Orientação da Professora Doutora Elina Bastos Caramão.
Juliana Macedo da Silva.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
iii
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção de título de Mestre em
Química e aprovada na sua forma final, pela orientadora e pela banca examinadora do
Programa de Pós-Graduação em Química.
Orientadora: Profa. Dra. Elina Bastos Caramão
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Zenilda de Lourdes Cardeal (DQ – UFMG/Belo Horizonte)
Prof. Dr. João Henrique Zimnoch dos Santos (IQ – UFRGS/Porto Alegre)
Profa. Dra. Ana Maria Geller (IQ – UFRGS/Porto Alegre)
Prof. Dr. Osvaldo de Lázaro Casagrande Jr.
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Química
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
iv
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha família.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
v
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos:
Primeiramente a Deus.
À profa Elina Caramão pela orientação e confiança.
À profa Cláudia Zini, pela grande ajuda e participação neste trabalho.
À Laiza Krause e Maria Regina Rodriguez por todo o incentivo.
À Ewelin Canizares e Karen Leal, químicas da FEPAM, por toda colaboração e auxílio
prestado e por proporcionarem os meus primeiros aprendizados na área da
cromatografia.
Ao João Caramão pela ajuda na coleta das amostras.
À Flaviana Damasceno, Janaína Bortoluzzi, Luiza Luz, Maria Elizabete e Silvana
Aranda por toda ajuda na área técnica, incentivo e por todos os momentos de
descontração.
Aos colegas do Laboratório de Química Analítica Ambiental e Oleoquímica – LAAO.
À Júlia Ávila por todo apoio e amizade.
À Joyce Borowski pela colaboração em parte deste trabalho.
Aos meus pais e irmão por todo apoio e compreensão.
Ao Marcos por todo amor, amizade, incentivo e confiança.
À família Jaeger pela grandiosa ajuda.
MUITO OBRIGADA A TODOS.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
vi
SUMÁRIO
Pág.
SUMÁRIO vi
LISTA DE TABELAS viii
LISTA DE FIGURAS ix
SIGLAS, EXPRESSÕES E ABREVIATURAS x
RESUMO xiii
ABSTRACT xiv
1. INTRODUÇÃO 2
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5
2.1. OS AGROTÓXICOS ESTUDADOS 5
2.1.1. Triclorfom 6
2.1.2. Propanil 6
2.1.3. Fipronil 7
2.1.4. Propiconazol 8
2.1.5. Trifloxistrobina 9
2.1.6. Permetrina 9
2.1.7. Difenoconazol 10
2.1.8. Azoxistrobina 10
2.2. A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DOS AGROTÓXICOS EM SEDIMENTOS 11
2.3. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS AGROTÓXICOS E O RISCO DE
CONTAMINAÇÃO DO SOLO E SEDIMENTO
13
2.4.TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SEDIMENTOS 16
2.4.1. Soxhlet 16
2.4.2. Ultra-som 17
2.4.3. Outras Técnicas 18
2.5. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS
EM SEDIMENTOS
19
2.5.1. Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente – GC × GC 20
2.5.1.1. Princípios e Operação 20
2.5.1.2. Interpretação dos Dados Gerados na GC × GC 23
2.5.1.3. Detecção 27
2.5.1.4. Aplicação da GC × GC na Determinação de Agrotóxicos 29
2.6. PARÂMETROS DE MÉRITO 32
Seletividade e Especificidade 32
2.6.2. Linearidade e Curva de Calibração 32
2.6.3. Precisão 33
Exatidão 34
Limite de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e Limite de Detecção do Método (MDL) 35
3. PARTE EXPERIMENTAL 37
3.1. MATERIAIS EMPREGADOS 37
3.2. EQUIPAMENTOS 37
3.3. PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO 38
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
vii
Pág.
3.4. AMOSTRAGEM DOS SEDIMENTOS 38
3.5. EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SEDIMENTOS 39
3.6. OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS 40
3.6.1. Cromatografia Gasosa Monodimensional (1D-GC) 41
3.6.2. Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC × GC) 41
3.7. PARÂMETROS DE MÉRITO 42
3.7.1. Linearidade e Curva de Calibração 42
3.7.2. Precisão 42
3.7.3. Exatidão 42
3.7.4. Limites de Detecção (LOD) e Quantificação (LOQ) 43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 45
4.1. CROMATOGRAFIA GASOSA MONODIMENSIONAL (1D-GC) 45
4.1.1. Fase Estacionária Polidimetilsiloxano com 50% de Grupos Fenila (HP-50+) 45
4.1.2. Fase Estacionária 5% Difenil – dimetilpolisiloxano (DB-5) 47
4.1.3. Fase Estacionária Polietilenoglicol (DB-WAXetr) 49
4.1.4. Comparação Entre as Fases Estacionárias 49
4.1.5. Parâmetros de Mérito 51
4.1.5.1. Linearidade e Curva de Calibração 51
4.1.5.2. Precisão 54
4.1.5.3. Exatidão 55
4.1.5.4. Limites de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e do Método (MDL) 57
4.2. CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE (GC × GC) 58
4.2.1. Conjunto de Colunas nº1 (DB-5/DB-17ms) 58
4.2.2. Conjunto de Colunas nº2 (HP-50+/DB-1ms) 61
4.2.3. Comparação entre os jogos de colunas DB-5/DB-17ms e HP-50+/DB-1ms 63
4.2.4. Parâmetros de Mérito 64
4.2.4.1. Linearidade e Curva de Calibração 64
4.2.4.2. Precisão 65
4.2.4.3. Exatidão 66
4.2.4.4. Limites de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e Limite de Detecção do
Método (MDL)
69
4.3. ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE SEDIMENTOS 70
5. RESUMO DOS RESULTADOS 74
6. CONCLUSÕES 77
7. REFERÊNCIAS 79
8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA GERADA 87
8.1. TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS 87
8.2. TRABALHO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO 87
8.3. TRABALHO ENVIADO PARA PUBLICAÇÃO 87
8.4. OUTRAS PUBLICAÇÕES 88
ANEXO 1. TRABALHO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO 90
ANEXO 2. TRABALHO ENVIADO PARA PUBLICAÇÃO 114
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
viii
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela I. Propriedades físico-químicas dos agrotóxicos estudados. 15
Tabela II. Aplicações da GC × GC para determinação de agrotóxicos em diferentes
matrizes.
31
Tabela III. Localização geográfica dos sedimentos analisados. 38
Tabela IV. Características físico-químicas dos sedimentos analisados por 1D-GC e
GC × GC.
40
Tabela V. Colunas utilizadas nas otimizações dos parâmetros cromatográficos para 1D-
GC e GC × GC.
41
Tabela VI. Condições cromatográficas obtidas para 1D-GC. 45
Tabela VII. Tempo de retenção (t
R
), fator de assimetria (A
s
) e desvio padrão (DP) para os
picos cromatográficos com a utilização das colunas HP-50+ e DB-5.
51
Tabela VIII. Parâmetros da curva de calibração para os compostos estudados por 1D-
GC.
52
Tabela IX. Avaliação da precisão analítica da 1D-GC expressa através do coeficiente de
variação (CV %) para repetitividade e precisão intermediária (n = 8).
54
Tabela X. Níveis de recuperação em base seca e coeficiente de variação (CV %) para os
valores obtidos em sedimento (amostra controle) por 1D-GC.
55
Tabela XI. Limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) instrumentais e limite de
detecção do método (MDL) obtidos para os compostos estudados por 1D-GC.
57
Tabela XII. Condições cromatográficas obtidas para GC × GC. 58
Tabela XIII. Fator de assimetria (
2
A
s
) e desvio padrão para os picos na
2
D com a
utilização de diferentes durações de jato quente.
60
Tabela XIV. Parâmetros da curva de calibração para os compostos estudados por
GC × GC.
64
Tabela XV. Avaliação da precisão analítica da GC × GC expressa através do coeficiente
de variação (CV %) para repetitividade e precisão intermediária (n = 8).
65
Tabela XVI. Níveis de recuperação em base seca e coeficiente de variação (CV %) para
os compostos estudados em sedimento.
66
Tabela XVII. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) instrumentais e o
MDL para os compostos estudados por GC × GC.
70
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
ix
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Fórmula estrutural do triclorfom. 6
Figura 2. Fórmula estrutural do propanil. 7
Figura 3. Fórmula estrutural do fipronil. 8
Figura 4. Fórmula estrutural do propiconazol. 8
Figura 5. Fórmula estrutural da trifloxistrobina. 9
Figura 6. Fórmula estrutural da permetrina. 10
Figura 7. Fórmula estrutural do difenoconazol. 10
Figura 8. Fórmula estrutural da azoxistrobina. 11
Figura 9. Diagrama dos constituintes da GC × GC. 20
Figura 10. Representação do processo de modulação. 21
Figura 11. Geração e visualização do sinal cromatográfico por GC × GC. 24
Figura 12. Representação de um pico cromatográfico genérico, ilustrando os parâmetros
empregados para cálculo do fator de assimetria.
26
Figura 13. Esquema do µECD.
29
Figura 14. Cromatograma obtido para a mistura de padrões em uma coluna HP-50+. 47
Figura 15. Comparação das médias das alturas dos picos cromatográficos (n = 3) para
diferentes temperaturas de injeção.
48
Figura 16. Cromatograma obtido para a mistura de padrões em uma coluna DB-5. 48
Figura 17. Cromatograma obtido para a mistura de padrões em uma coluna DB-WAXetr. 49
Figura 18. Curvas analíticas obtidas para os sete agrotóxicos na primeira faixa de
concentração por 1D-GC.
53
Figura 19. Curvas analíticas obtidas para os sete agrotóxicos na segunda faixa de
concentração por 1D-GC.
53
Figura 20. Diagrama de cores obtido para a mistura de padrões no jogo de colunas n°1
(DB-5/DB-17ms).
61
Figura 21. Diagrama de cores obtido para a mistura de padrões no jogo de colunas n°2
(HP-50+/DB-1ms).
62
Figura 22. Curvas analíticas obtidas para os sete agrotóxicos por GC × GC. 65
Figura 23. Cromatogramas da amostra de sedimento fortificada a 15 µg kg
-1
(A)
monodimensional – não fortificada; (B) diagrama de cores do branco da amostra; (C)
diagrama de cores da amostra fortificada.
68
Figura 24. Diagrama em terceira dimensão (3D) com reconstrução dos cromatogramas
da
1
D e
2
D: (A) dos padrões na concentração de 200 µg L
-1
,
(B) da amostra fortificada a
15 µg kg
-1
.
69
Figura 25. Cromatogramas do extrato da amostra de sedimento (A) monodimensional;
(B) diagrama de cores de uma amostra de sedimento fortificada com 500 µg L
-1
de
mistura dos padrões.
71
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
x
SIGLAS, EXPRESSÕES E ABREVIATURAS
µECD: Micro detector por captura de elétrons (do inglês “Micro Electron-Capture
Detector”)
1D: Monodimensional
1
D: Primeira dimensão
1
t
R
: Tempo de retenção na primeira dimensão
2D: Bidimensional
2
D: Segunda dimensão
2
t
R
: Tempo de retenção na segunda dimensão
ANVISA: Associação Nacional de Vigilância Sanitária
A
s
: Assimetria de pico
ASE: Extração Acelerada com Solvente (do inglês “Accelerated Solvent Extraction”)
C
18
: Fase sólida composta por octadecil silano
Clean up: Refere-se à etapa de tratamento de amostra, onde se objetiva eliminar
interferentes do processo analítico.
CV: Coeficiente de variação
DAD: Detector de Arranjo de Diodos (do inglês “Diode-Array Detector”)
DB-17ms: Fase estacionária polidimetilsiloxano com 50 % de grupos fenila
DB-1ms: Fase estacionária 100% dimetilpolisiloxano
DB-5: Fase estacionária 5% difenil – dimetilpolisiloxano
DB-WAX: Fase estacionária com 100% etilenoglicol
DT
50
: Tempo de meia-vida (do inglês “Disappearance Time”)
ECD: Detector por Captura de Elétrons (do inglês “Electron-Capture Detector”)
EPA: Agência Americana de Proteção Ambiental (do inglês “Environmental Protection
Agency”)
Fast-GC: Cromatografia Gasosa rápida, com a utilização de colunas capilares de
comprimento, diâmetro de filme e espessura menores que as convencionais
FEPAM: Fundação Estadual de Proteção Ambiental Henrique Luiz Roessler
FID: Detector por ionização em chama (do inglês “Flame Ionization Detector”)
Florisil: Fase sólida constituída de silicato de magnésio
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
xi
GARP: Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas
Gás de make up: Gás cuja finalidade é manter um fluxo estável desde a saída da
coluna cromatográfica até o detector.
GC × GC: Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (do inglês “Comprehensive
Two-Dimensional Gas Chromatography”)
GC: Cromatografia gasosa (do inglês “Gas Chromatography”)
GC-GC: Cromatografia Gasosa Bidimensional de Frações Parciais ou de heartcut (do
inglês “Two-dimensional Gas Chromatography”)
GUS: Índice de GUS (do inglês “Groundwater Ubiquity Score”)
HP-50+: Fase estacionária polidimetilsiloxano com 50 % de grupos fenila
HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês “High Performance Liquid
Chromatography”)
HPLC-GC: Cromatografia Líquida acoplada à Cromatografia Gasosa (do inglês “High-
Performance Liquid Chromatography coupled to Gas Chromatography”)
HRMS: Espectrometria de Massas de Alta resolução (do inglês “High Resolution Mass
Spectrometry”)
ICH: Conferência Internacional em Harmonização (do inglês “International Conference
on Harmonization”)
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IUPAC: União Internacional de Química Pura e Aplicada (do inglês “International Union
of Pure and Applied Chemistry”)
K
H
: Constante da lei de Henry
K
oc
: Coeficiente de adsorção da matéria orgânica no solo
K
ow
: Coeficiente de partição octanol-água
LMR: Limites Máximos de Resíduos
LOD: Limite de Detecção
LOQ: Limite de Quantificação
MAE: Extração Assistida por Microondas (do inglês “Microwave Assisted Extraction”)
MDL: Limite de Detecção do Método (do inglês “Method Detection Limit”)
MRC: Material de Referência Certificado
MSD: Detector de Espectrometria de Massas (do inglês “Mass Spectrometer Detector”)
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
xii
NBR: Norma Brasileira
NPD: Detector de Nitrogênio e Fósforo (do inglês “Nitrogen-Phosphorus Detector”)
PBO: Butóxido de Piperonila (do inglês “Piperonyl Butoxide”)
pH: Potencial hidrogeniônico
PI: Padrão Interno
pK
a
:
Constante de dissociação ácida
pK
b
:
Constante de dissociação básica
P
M
: Período de modulação
P
V
: Pressão de vapor
R
s
: Resolução cromatográfica
RSD: Desvio Padrão Relativo (do inglês “Relative Standard Desviation”
SFC-GC: Cromatografia de Fluido Supercrítico acoplada à Cromatografia Gasosa (do
inglês “Supercritical Fluid Chromatography coupled to Gas Chromatography”)
SFE: Extração com Fluido Supercrítico (do inglês “Supercritical Fluid Extraction”)
SIM: Modo de Monitoramento de Íon Selecionado (do inglês “Selective Ion Monitoring”)
TOF: Analisador por Tempo de Vôo (do inglês “Time of Flight”)
UV: Ultravioleta
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
xiii
RESUMO
Neste trabalho foram desenvolvidas metodologias de análise por GC-µECD e GC × GC-
µECD para determinação de agrotóxicos em sedimentos de regiões sob influência da
cultura orizícola do estado do Rio Grande do Sul. Os agrotóxicos estudados foram
triclorfom, propanil, fipronil, propiconazol, trifloxistrobina, permetrina, difenoconazol e
azoxistrobina, sendo o triclorfom posteriormente excluído do estudo por eluir muito
próximo ao solvente. Os dois métodos foram validados levando-se em consideração
parâmetros como linearidade, precisão (repetitividade e precisão intermediária),
exatidão e limites de detecção e quantificação. Para 1D-GC foram testadas três colunas
cromatográficas (DB-5, HP-50+ e DB-WAXetr), sendo que a coluna DB-5 proporcionou
melhores resultados. No processo de validação, a repetitividade e precisão
intermediária das áreas e alturas dos picos cromatográficos, para os sete compostos,
foram inferiores a 5%. Os LOD e LOQ instrumentais situaram-se na faixa de 0,60 a 2,31
µg L
-1
e 1,83 a 5,62 µg L
-1
, respectivamente; enquanto os limites de detecção do
método variaram de 1,43 a 5,78 µg kg
-1
. As taxas de recuperação para permetrina e
azoxistrobina situaram-se entre 60 e 72%, para os níveis de fortificação de 15 e 30 µg
kg
-1
. No desenvolvimento do método por GC × GC foram testados dois conjuntos de
colunas (DB-5/DB-17ms e HP-50+/DB-1ms), sendo que os melhores resultados foram
obtidos com o conjunto de colunas DB-5/DB-17ms. A repetitividade e precisão
intermediária das áreas e alturas dos picos cromatográficos foram inferiores a 4%. Os
percentuais de recuperação para os compostos investigados ficaram entre 52 e 115%,
para os níveis de fortificação de 15, 30 e 150 µg kg
-1
. Os LOD e LOQ instrumentais
situaram-se na faixa de 0,08 a 1,07 µg L
-1
e 0,25 a 3,23 µg L
-1
, respectivamente. Os
limites de detecção do método variaram de 1,92 a 4,43 µg kg
-1
. Durante a verificação da
aplicabilidade do método foram encontrados resíduos de trifloxistrobina em
concentrações de 21,18 µg kg
-1
na 1D-GC e 3,34 µg kg
-1
para GC × GC (base seca) em
um sedimento coletado em local próximo a plantação de arroz.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
xiv
ABSTRACT
A GC-µECD and a GC × GC-µECD method were developed for the analysis of
pesticides in sediments, which are under the influence of nearby rice plantation in the
state of Rio Grande do Sul. The pesticides investigated were trichlorfon, propanil,
fipronil, propiconazole, trifloxystrobin, permethrin, difenoconazole and azoxystrobin,
although trichlorfom had to be excluded afterwards, as it eluted too close to the solvent
peak. Both methods were validated taking into account parameters such as linearity,
precision (repeatability and intermediate precision), accuracy and limits of detection and
quantification. Three chromatographic columns (DB-5, HP-50+ and DB-WAXetr) were
tested for 1D-GC and DB-5 column provided the best results. In the process of method
validation, repeatability and intermediate precision of the areas and heights of
chromatographic peaks for the seven compounds were less than 5%. Recoveries for
permethrin and azoxystrobin were between 60 and 72% for fortification levels of 15 and
30 µg kg
-1
. Instrumental LOD and LOQ were found in the range from 0.60 to 2.31 µg L
-1
and 1.83 to 5.62 µg L
-1
, respectively. The detection limits of the method ranged from
1.43 to 5.78 µg kg
-1
. For GC × GC method development two sets of columns were tested
(DB-5/DB-17ms, and HP-50+/DB-1ms), and the best results were obtained with the set
of columns DB-5/DB-17ms. Repeatability and intermediate precision of the areas and
heights of the chromatographic peaks were less than 4%. Recoveries ranged from 52 to
115% for all compounds studied, for fortification levels of 15, 30 and 150 µg kg
-1
.
Instrumental LOD and LOQ were found in the range from 0.08 to 1.07 µg L
-1
and 0.25 to
3.23 µg L
-1
, respectively. Detection limits of the method varied between 1.92 to 4.43 µg
kg
-1
. Concentrations of 21.18 µg kg
-1
through 1D-GC method and 3.34 µg kg
-1
for GC ×
GC (on dry basis) for trifloxystrobin were found in a sediment sample which was
collected close to an area of rice plantation.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
1
INTRODUÇÃO
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
2
1. INTRODUÇÃO
A utilização de agrotóxicos nas produções agrícolas vem obtendo cada vez mais
destaque no cenário mundial. O Brasil, que até 2007 era o quarto colocado no ranking
mundial em consumo desses compostos, em 2008 passa para segundo lugar,
considerando o consumo de dez países que contribuem com 70% do consumo
mundial.
1
Existem diferentes definições para agrotóxicos, mas de acordo com a Agência
Americana de Proteção Ambiental – EPA (Environmental Protect Agency), são qualquer
substância ou mistura de substâncias que possuem capacidade de atenuar, prevenir,
destruir ou repelir qualquer tipo de praga.
2
Eles podem ser classificados de acordo com
sua estrutura química (grupo funcional) e com o tipo de pragas alvo (algicidas,
fungicidas, herbicidas, inseticidas, acaricidas, moluscidas, nematicidas, ovicidas, entre
outros). Estas diferentes estruturas contrastam segundo a forma de ação, absorção,
biotransformação e eliminação.
3,4
De acordo com o decreto nº 98.816, publicado no Diário Oficial da União em 11
de janeiro de 1990, o termo “pesticida” deixa de ser utilizado e é substituído por
“agrotóxico”. Esse mesmo decreto define resíduo de agrotóxico como sendo uma
substância ou mistura de substâncias remanescentes ou existentes em alimentos ou no
meio ambiente, decorrente do uso ou da presença de agrotóxicos e afins, inclusive
quaisquer derivados específicos, tais como, produtos de conversão e de degradação,
metabólitos, produtos de reação e impurezas consideradas tóxicas e ambientalmente
importantes.
5
O controle de pragas, através do uso de diferentes princípios ativos, reduziu o
índice de doenças para os homens e animais e proporcionou aumento na produção
agrícola. Contudo, resíduos desses compostos podem permanecer no ambiente por
longos períodos e causar impactos nocivos a diferentes ecossistemas. Nesse contexto,
o monitoramento desses compostos em diferentes matrizes como ar, água, solo e
alimentos se torna de extrema importância para que problemas de saúde pública sejam
minimizados e/ou evitados.
6
O estudo da ocorrência de agrotóxicos em sedimentos fornece informação a
respeito da contaminação do corpo hídrico receptor. Dependendo da sua constituição
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
3
físico-química, o sedimento se comporta como fonte de acumulação de poluentes
(compostos orgânicos em geral e metais, por exemplo). Essa característica confere ao
sedimento grande importância no que tange à investigação de processos físicos,
geoquímicos e biológicos no ambiente.
Desta forma, o estudo teve por objetivo a avaliação do potencial da GC-µECD e
GC × GC-µECD para a determinação de oito agrotóxicos de diferentes classes
químicas (triclorfom, propanil, fipronil, propiconazol, trifloxistrobina, permetrina,
difenoconazol e azoxistrobina) em sedimentos de rio proveniente de regiões sob
influência da cultura orizícola no estado do Rio Grande do Sul (Rio Santa Maria e Rio
Gravataí), uma vez que o estado é responsável por 61% da produção de arroz do país.
1
Na região da bacia do Rio Santa Maria predomina a agricultura, mais especificamente a
orizicultura, e é praticamente inexistente a presença de impactos de origem industrial,
descaracterizando a ação de fontes pontuais que afetem a qualidade dos corpos
hídricos, com exceção dos resíduos de esgotos. A região do Rio Gravataí, além da
influência da agricultura também apresenta impactos de origem industrial.
7
A validação
dos métodos foi realizada através da avaliação de parâmetros como curva de
calibração e linearidade, precisão (repetitividade e precisão intermediária), exatidão
(teste de recuperação) e limites de detecção e quantificação instrumentais e do método.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
5
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Os agrotóxicos pertencem à classe dos poluentes ambientais mais estudados
atualmente. A determinação desses compostos em diferentes matrizes torna-se cada
vez mais necessária devido à relação direta entre saúde e qualidade ambiental. Com
isso, a otimização de técnicas de separação, identificação e quantificação desses
compostos ganha grande destaque para que seja possível sua determinação nas mais
variadas matrizes e para que os limites de detecção e quantificação de tais métodos
sejam cada vez menores e contemplem os limites máximos de resíduos (LMR)
estabelecidos pelos órgãos competentes.
2.1. OS AGROTÓXICOS ESTUDADOS
Os compostos estudados foram triclorfom, propanil, fipronil, propiconazol,
trifloxistrobina, permetrina, difenoconazol e azoxistrobina. Estes agrotóxicos são
largamente empregados na agricultura, mais especificamente na cultura do arroz da
região do rio Santa Maria no estado do Rio Grande do Sul.
7,8
A química Ewelin
Canizares, da FEPAM (Fundação Estadual de Proteção Ambiental Henrique Luiz
Roessler), realizou pesquisa com os agricultores e com os trabalhadores que fazem a
aplicação desses compostos na lavoura, bem como com a EMBRAPA (Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária) para embasar a escolha dos agrotóxicos.
De um modo geral, as características estruturais moleculares dos agrotóxicos
determinam o grau de interação dos mesmos com o ambiente. A presença de grupos
funcionais contendo oxigênio, nitrogênio e enxofre pode tornar os compostos orgânicos
mais reativos quimicamente e biologicamente, mais solúveis em água e menos voláteis,
quando comparados aos hidrocarbonetos com o mesmo número de carbonos.
Entretanto, a presença de halogênios na molécula contribui com a diminuição da
solubilidade em água, volatilidade e reatividade, tornando-os mais estáveis
ambientalmente.
9
Algumas características referentes aos analitos investigados neste
estudo estão descritas a seguir.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
6
2.1.1. Triclorfom
O triclorfom é um inseticida pertencente à classe dos organofosforados.
Organofosforado é uma designação genérica que compreende todos os inseticidas que
apresentam na sua estrutura química um átomo central de fósforo pentavalente ao qual
está ligado um átomo de oxigênio ou enxofre, através de uma dupla ligação. São
ésteres do ácido fosfórico ou do ácido fosforotióico, podendo ser subdivididos em
diferentes classes, tais como fosfatos, fosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos e
fosforoamidatos. A Figura 1 apresenta a estrutura química do triclorfom.
10-13
Figura 1. Fórmula estrutural do triclorfom.
Os agrotóxicos desta classe sofrem rápida degradação no ambiente (meia vida
nas plantas de 2 a 10 dias), apresentam baixa ação residual e acumulação limitada em
organismos vivos, uma vez que 80 a 90% dos compostos são eliminados após 48 h de
contato. Possuem um poder de toxicidade agudo relativamente alto na maioria dos
casos. Em geral, são bastante voláteis em comparação com outros grupos de
agrotóxicos.
10,11,14
A ação inseticida dos organofosforados inibe a enzima acetilcolinesterase nos
sistemas nervosos dos vertebrados e invertebrados. Outra característica desses
compostos é a capacidade de serem espontaneamente hidrolisados, principalmente em
pH alto e de sofrerem degradação por hidrolases.
14
2.1.2. Propanil
O propanil é um herbicida seletivo de contato e pós-emergente (aplicado após a
brotação das plantas daninhas) derivado das cloroanilidas. É um dos herbicidas mais
intensivamente utilizados no Brasil, na cultura do arroz, para o controle de plantas
daninhas de folha larga e estreita. Em meio fortemente ácido e alcalino sofre clivagem
hidrolítica originando 3,4- dicloroanilida (3,4-DCA) e ácido propiônico. As cloroanilidas
são absorvidas às substâncias húmicas do solo, podendo permanecer ligadas durante
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
7
anos após sua aplicação. Também estão sujeitas à dimerização e polimerização,
formando compostos azo, altamente estáveis e resistentes à mineralização.
15,16
O
principal efeito tóxico do propanil é a ocorrência da metemoglobinemia (doença que
incapacita o transporte de oxigênio pelo ferro no sangue) e anemia hemolítica
(destruição prematura dos glóbulos vermelhos).
17
As moléculas dos herbicidas apresentam cargas elétricas e, portanto, são
atraídas pela matéria orgânica e argila do solo. O teor de matéria orgânica e argila
influencia diretamente a atividade dos herbicidas e afeta sua eficiência e persistência.
Solos com baixo teor de matéria orgânica e argila favorecem o processo de lixiviação
dos herbicidas.
18
A Figura 2 apresenta a fórmula estrutural do herbicida propanil.
13
Figura 2. Fórmula estrutural do propanil.
2.1.3. Fipronil
O fipronil é um inseticida pertencente à classe dos pirazóis. Foi descoberto em
1987 por Rhone-Poulenc Agro, mas somente foi registrado como agrotóxico em 1996.
19
O inseticida apresenta afinidade pela matéria orgânica do solo e da água. Na superfície
do solo é propenso à fotodegradação, entretanto, abaixo da superfície, ocorre quebra
gradativa das moléculas por ação microbiana, sendo que os produtos de degradação
(desulfinil fipronil, fipronil sulfeto e fipronil sulfona) são mais tóxicos aos organismos
aquáticos do que o próprio agrotóxico.
20
Em relação à característica inseticida do fipronil, o principal modo de ação está
relacionado ao bloqueio do ácido γ-amino-butírico (GABA) regulador dos canais de íons
cloreto na membrana celular, resultando em uma perturbação do funcionamento normal
do sistema nervoso central.
19,21
A Figura 3 apresenta a fórmula estrutural do inseticida
fipronil.
13
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
8
Figura 3. Fórmula estrutural do fipronil.
2.1.4. Propiconazol
O propiconazol é um fungicida pertencente à classe dos triazóis e foi registrado
pela primeira vez em 1981 por Ciba Geigy.
17
Os triazóis são uma das classes mais
importantes de fungicidas devido a sua grande abrangência no combate a diferentes
doenças e culturas.
22
Este agrotóxico atua inibindo uma enzima envolvida na biossíntese do ergosterol,
que é de grande importância para a formação das paredes celulares nos fungos e,
assim, atenua ou faz cessar o crescimento dos fungos. É usado em uma série de
culturas agrícolas, frutos, plantas ornamentais e relva; também atua como agente de
preservação de madeira e como um conservante antimicrobiano em produtos adesivos,
tintas, revestimentos de couro, papel, têxteis e produtos industriais.
17
A Figura 4
apresenta a fórmula estrutural do fungicida propiconazol.
13
Figura 4. Fórmula estrutural do propiconazol.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
9
2.1.5. Trifloxistrobina
Trifloxistrobina é um fungicida pertencente à classe das estrobilurinas (beta-
metoxiacril éster). O sítio de ação das estrobilurinas está localizado na respiração
mitocondrial. Como resultado, trifloxistrobina é um potente inibidor da germinação dos
esporos e crescimento micelial de fungos.
17
Estudos laboratoriais indicam que a mobilidade da trifloxistrobina no solo é baixa
ou mesmo não móvel. Não se espera lixiviação da trifloxistrobina no solo abaixo de 30
cm de altura, portanto, o agrotóxico não tem característica de contaminante de águas
subterrâneas. Contudo, o produto de degradação (CGA-321113) apresenta persistência
no solo, com mobilidade moderada a alta.
23
A Figura 5 apresenta a fórmula estrutural
do fungicida trifloxistrobina.
13
Figura 5. Fórmula estrutural da trifloxistrobina.
2.1.6. Permetrina
A permetrina é um inseticida pertencente à classe dos piretróides. Os piretróides
são derivados sintéticos das piretrinas, ésteres dos ácidos crisantêmico e pirétrico com
os álcoois piretrolona, cinerolona e jasmolona. São isolados das flores das espécies de
Chrysanthemum cinerariaefolium e espécies relacionadas.
24,25
A permetrina é uma mistura racêmica dos isômeros cis e trans que foi sintetizada
em 1973 por Elliott, sendo o primeiro piretróide desenvolvido com estabilidade
adequada para uso na agricultura. É um composto fotoestável, com fotoestabilidade
cerca de 10 a 100 vezes maior do que a dos piretróides não halogenados.
17,24
A Figura
6 apresenta a fórmula estrutural da permetrina.
13
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
10
Figura 6. Fórmula estrutural da permetrina.
Os piretróides, ao atingir águas naturais, são prontamente adsorvidos pelo
sedimento e matéria orgânica em suspensão. Não são susceptíveis à dispersão no
ambiente, pois apresentam baixa pressão de vapor e forte adsorção pela matéria
orgânica do solo.
24
No controle de pragas, agem no sistema nervoso central dos
insetos, tendo como alvo os canais de sódio da membrana celular.
14
2.1.7. Difenoconazol
O difenoconazol é um fungicida pertencente à classe química dos triazóis, assim
como o propiconazol. A estrutura química dos fungicidas triazóicos apresenta o anel
1,2,4 – triazol que é um anel heterociclo aromático contendo três átomos de nitrogênio
dispostos nas posições 1, 2 e 4 de um anel de cinco membros, conectado ao restante
hidrofóbico da molécula pela posição 1.
26
A Figura 7 apresenta a fórmula estrutural do
difenoconazol.
13
Figura 7. Fórmula estrutural do difenoconazol.
2.1.8. Azoxistrobina
A azoxistrobina é um fungicida sistêmico da classe das estrobilurinas, assim
como a trifloxistrobina. O fungicida foi comercializado pela primeira vez em 1998 e foi
descoberto durante estudo com cogumelos (Oudemansiella mucida e Strobilurus
tenacellus) comumente encontrados em florestas da República Checa. Os cogumelos
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
11
atraíram a atenção de cientistas devido à sua capacidade de defesa, que se baseia na
secreção de duas substâncias, a estrobilurina A e oudemansina A. Estas substâncias
permitiam aos cogumelos manter seus agressores à distância e até mesmo destruí-los.
27,28
A Figura 8 apresenta a fórmula estrutural da azoxistrobina.
13
Figura 8. Fórmula estrutural da azoxistrobina.
2.2. A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DOS AGROTÓXICOS EM SEDIMENTOS
De acordo com Golterman e colaboradores,
29
sedimento é um termo geral que
serve para descrever tanto material em suspensão, como depositado, sendo que todas
as águas naturais contêm quantidades variáveis de sedimento em suspensão. O
sedimento contempla todo material particulado que é carreado para dentro de um
sistema aquático, ou que é formado no corpo hídrico.
Os compostos orgânicos tendem a acumular-se nos sedimentos, visto que estes,
de forma geral, apresentam caráter lipofílico. Essa característica confere ao sedimento
grande importância no que tange a investigação de processos físicos, geoquímicos e
biológicos no ambiente.
30
De acordo com Gao e colaboradores,
31
os contaminantes no ambiente aquático
podem ser dispersos em três diferentes fases: na solução aquosa, no carbono orgânico
dissolvido ou na fração coloidal e no sedimento.
Essa distribuição dos agrotóxicos no
ambiente é dependente das propriedades físico-químicas dos mesmos.
32
A persistência dos agrotóxicos no solo e sedimento é dependente da eficiência de
processos físicos de transformação no ambiente, tais como evaporação, lixiviação,
erosão e absorção pelas raízes de diferentes culturas. Outros fatores ambientais
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
12
também contribuem com a taxa de degradação desses compostos. A temperatura,
conteúdo de matéria orgânica, acidez, umidade e tipo de solo influenciam neste
processo. Os solos argilosos, com alto teor de matéria orgânica, providenciam maior
retenção desses resíduos.
6
Mesmo quando esses compostos são aplicados diretamente
sobre as plantas, cerca de 50% da dose total pode vir a contaminar o solo,
independente da forma de aplicação e, lá chegando, essas substâncias podem ser
transportadas por processos de volatilização, lixiviação e escoamento superficial. A
lixiviação tem sido apontada como sendo a principal forma de contaminação dos lençóis
freáticos e corresponde ao transporte vertical dos contaminantes no solo pela água da
chuva ou de irrigação. O escoamento superficial é devido ao transporte dos
contaminantes através da água de enxurrada pela superfície do solo, que pode ter
como destino final os rios e lagos. A volatilização favorece o carreamento desses
compostos pela atmosfera, os quais podem ser depositados nas águas superficiais. As
informações sobre o movimento de agrotóxicos são úteis para se fazer uma previsão da
sua eficácia química, sendo que os processos de decomposição desempenham
importante função para a dissipação de muitos agrotóxicos no solo e o seu
desaparecimento pode se dar por vários processos químicos, inclusive foto
decomposição, entre outras reações químicas.
33,34
Para avaliar o potencial de contaminação de águas superficiais e subterrâneas
são utilizados estudos através de modelos matemáticos e de varredura (screening), que
permitem uma avaliação preliminar do risco de contaminação desses ambientes. Estes
estudos podem ser realizados analisando-se diretamente a água e/ou o solo, uma vez
que o potencial de contaminação da água subterrânea por agrotóxicos depende da
mobilidade dos mesmos no solo ou sedimento. Os parâmetros mais utilizados nesta
avaliação são o de screening da Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
(do inglês, “United States Environmental Protection Agency”, USEPA), a medida do
índice de vulnerabilidade de águas subterrâneas (índice de GUS, do inglês
“Groundwater Ubiquity Score”) e a aplicação do Método de Goss. Esses parâmetros
consideram algumas propriedades físico-químicas para avaliação de risco, tais como
solubilidade em água, K
oc
(coeficiente de adsorção à matéria orgânica no solo),
coeficiente de partição octanol-água (K
ow
), K
H
(constante da lei de Henry), constante de
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
13
ionização ácida ou básica (pK
a
ou pK
b
), meia vida no solo e água (DT
50
, do inglês
“Disappearance Time”), porosidade do solo, potencial de lixiviação (referente ao índice
de GUS), entre outras.
9,35,36
2.3. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS AGROTÓXICOS E O RISCO DE
CONTAMINAÇÃO DO SOLO E SEDIMENTO
O comportamento dos agrotóxicos no solo pode ser influenciado por alguns
fatores como: adsorção, movimento e decomposição. O processo de adsorção tem
influência direta nos efeitos de biodegradabilidade, bioacumulação, entre outros, e
consiste na interação do soluto da fase líquida com a superfície das partículas da fase
sólida do solo, a qual é constituída majoritariamente por argila, minerais, matéria
orgânica, sílica, óxidos e hidróxidos de alumínio e de ferro.
33
Na prática, pode-se avaliar o processo de adsorção através das características
do solo, calculando-se a constante de adsorção (K
oc
), a qual está baseada na
quantidade de carbono orgânico contida no solo. Moléculas altamente solúveis tendem
a apresentar valores de K
oc
relativamente baixos (menores que 150 cm
3
g
-1
), podendo
ser mais rapidamente biodegradados no solo e na água.
33
A adsorção dos agrotóxicos ao sedimento também é influenciada por alguns
fatores como acidez ou alcalinidade, indicada pelo pK
a
ou pK
b
do composto, polaridade
e polarizabilidade (polarização transiente de moléculas ou radicais estruturalmente
apolares). Outros fatores como intensidade de uso, época de aplicação, forma de
aplicação e características do meio físico também influenciam a ocorrência da adsorção
de agrotóxicos em sedimento.
37
A adsorção também pode ser influenciada pelos grupos funcionais que
caracterizam e determinam a carga de uma molécula. Através da constante de
dissociação ácida (pK
a
) e do pH do solo é possível prever a forma ionizável ou
molecular predominante de um agrotóxico ácido, sendo que o mesmo raciocínio pode
ser feito com a constante pK
b
para agrotóxicos alcalinos.
9,37,38
Outra propriedade importante é a solubilidade em água, pois influencia no
comportamento, transporte e destino desses compostos no ambiente. Esse parâmetro
indica a tendência do agrotóxico ao carreamento superficial no solo, fazendo com que o
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
14
mesmo possa atingir águas superficiais. A constante da Lei de Henry (K
H
), também
conhecida como coeficiente de partição ambiental ar-água, juntamente com a pressão
de vapor (P
V
) mostra a tendência do agrotóxico a volatilização ou permanência na fase
aquosa.
9
O coeficiente de partição octanol-água (K
ow
) indica a tendência dos compostos
em se distribuir em regiões ambientalmente hidrofóbicas. É definido como sendo a
razão entre as concentrações de um determinado composto distribuído entre duas
fases imiscíveis em equilíbrio. Essa propriedade demonstra a tendência dos agrotóxicos
à bioconcentração e traz indicativos sobre a capacidade de transporte na cadeia
alimentar. O tempo de meia vida também é um critério usado para determinar os efeitos
ambientais relacionados à volatilização, potencial de lixiviação e características de
degradação de vários compostos químicos.
9,38
A Tabela I apresenta algumas propriedades físico-químicas importantes dos
agrotóxicos estudados.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
15
Tabela I. Propriedades físico-químicas dos agrotóxicos estudados.
39
Os compostos cujo coeficiente de partição octanol/água é alto e cuja solubidade em água é baixa (natureza
hidrofóbica) podem sofrer forte adsorção no solo ou sedimento e, também, bioacumular-se em organismos aquáticos.
Os agrotóxicos que apresentam índice de GUS menor que 1,8 não apresentam tendência à lixiviação. Valores
entre 1,8 e 2,8 estão na faixa de transição. Já os compostos com valores maiores que 2,8 estão sujeitos à lixiviação.
Agrotóxico
Massa
Molecular
(g mol
-1
)
Solubilidade
em água a 25°C
(mg L
-1
)
Log Kow a
pH 7 e
20°C
K
H
a 25°C (Pa m
3
mol
-1
)
DT
50
no solo
(dias)
DT
50
água/sedimento
(dias)
Índice de
GUS
K
oc
(mL g
-1
)
Triclorfom 257,40 120000 - alta 0,43 - baixa 4,50 X 10
-07
– não volátil
18 – não
persistente
-
3,77 – alta
lixiviação
10 –
mobilidade
muito alta
Propanil 218,08 225 - moderada 2,29 - baixa 1,74 X 10
-04
– não volátil
2 – não
persistente
-
0,42 –
baixa
lixiviação
400 –
mobilidade
moderada
Fipronil 437,15 3,78 - baixa 3,75 - alta 2,31 X 10
-04
–
não volátil
142 –
persistente
68 –
moderadamente
rápida
2,67 –
estado de
transição
577 –
ligeiramente
móvel
Propiconazol 342,22 150 - moderada 3,72 - alta 9,20 X 10
-05
–
não volátil
214 –
persistente
636 - estável
2,25 –
estado de
transição
1086 –
ligeiramente
móvel
Trifloxistrobina 408,37 0,61 - baixa 4,5 – alta 2,30 X 10
-03
–
não volátil
7 – não
persistente
2,4 - rápida
0,53 –
baixa
lixiviação
2377 –
ligeiramente
móvel
Permetrina 391,30 0,2 – baixa 6,1 – alta
1,89 X 10
-01
–
moderadamente volátil
13 – não
persistente
40 –
moderadamente
rápido
1,11 –
baixa
lixiviação
100000 –
não móvel
Difenoconazol 406,26 15 – baixa 4,2 – alta 1,50 X 10
-06
– não volátil
120 -
persistente
1053 – estável
0,88 –
baixa
lixiviação
3760 –
ligeiramente
móvel
Azoxistrobina 403,40 6,7 – baixa 2,5 – baixa
7,30 X 10
-09
– não volátil
70 –
moderadamente
persistente
232 – lento
2,53 –
estado de
transição
423 –
mobilidade
moderada
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
16
2.4.TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SEDIMENTOS
As propriedades físico-químicas dos agrotóxicos podem influenciar tanto no
transporte e destino desses compostos no ambiente quanto no comportamento dos
mesmos durante as etapas de extração, clean up e análise instrumental. A interação
existente entre os agrotóxicos e o sedimento pode ser bastante forte, resultando em
resíduos quimicamente ligados. Nesse contexto, esforço significativo vem sendo
realizado para o desenvolvimento de métodos eficientes que possibilitem a análise
multirresíduo de agrotóxicos, minimizando etapas de extração e de clean up das
amostras. Na sequência deste texto serão apresentados alguns dos métodos de
extração empregados para determinação desses compostos em sedimentos.
32,40
2.4.1. Soxhlet
O processo de extração por Soxhlet foi inventado em 1879 por Franz von Soxhlet
e é o mais utilizado para amostras sólidas. Apesar de ser um método moroso (18 a 24
horas) e de utilizar grandes quantidades de solvente, é relativamente simples, eficaz,
barato e apresenta bons resultados de recuperação de analitos em diferentes
amostras.
41
No processo de extração a amostra é colocada em um cartucho poroso e
imersa em solvente. A extração compreende uma série de etapas que envolvem
processos de destilação e condensação do solvente com preenchimento periódico do
mesmo dentro e fora da câmara de extração, fazendo com que ocorra uma mistura
íntima da amostra com o solvente.
42
Woudneh e Oros
43
desenvolveram método analítico para a determinação de
agrotóxicos das classes das piretrinas, piretróides e butóxido de piperonila (PBO, do
inglês “piperonyl butoxide”) por GC/HRMS (Cromatografia Gasosa acoplada a
Espectrometria de Massas de Alta resolução, do inglês “Gas Chromatography coupled
to High Resolution Mass Spectrometry”). A extração foi realizada com diclorometano
por 16 horas, seguida de clean up com Florisil e extração em fase sólida com cartuchos
de fase aminopropil – sílica para remoção de ácidos húmicos e fúlvicos, ácidos graxos e
fenóis. O estudo de recuperação foi realizado através de extração com amostra
fortificada nas concentrações de 10 e 5 ng g
-1
, variando de analito para analito, com
resultados na faixa de 89,7 a 135% de recuperação. A aplicabilidade do método foi
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
17
verificada através da análise de seis amostras de sedimentos, onde foi observada a
presença de piretróides e PBO. Esta técnica também foi utilizada por Darko e
colaboradores
44
na determinação de organoclorados em amostras de peixe, água e
sedimentos. Os solventes extratores utilizados foram acetona e hexano na proporção
20:80 v/v, por 4 horas a 50 °C. O clean up foi realizado com coluna de C
18
e a análise
por GC-ECD (Cromatografia Gasosa com detecção por Captura de Elétrons, do inglês
“Electron- Capture Detection”). Para o estudo de recuperação, as amostras foram
fortificadas com mistura dos padrões na concentração de 1 ng g
-1
, sendo que as
amostras de sedimento apresentaram recuperações de 76 a 95% com desvio padrão
relativo de 4 a 12%.
Covaci e colaboradores
45
utilizaram a extração por Soxhlet na determinação de
agrotóxicos organoclorados, bifenilas policloradas e éteres difenílicos polibromados. O
tempo de extração utilizado foi de duas horas em função da pequena quantidade de
amostra (4 g) e os solventes extratores foram hexano e acetona (3:1, v/v). A etapa de
clean up foi obtida com o auxílio de sílica acidificada e a análise dos compostos
realizada por GC-µECD (µECD, do inglês “micro electron-capture detector”).
Extração em Soxhlet com diclorometano e clean up com duas fases sólidas como
sílica e alumina também é um processo comumente utilizado.
46-48
2.4.2. Ultra-som
A produção de ultra-som é um fenômeno físico associado ao processo de
cavitação. Durante este processo há criação, aumento e implosão de cavidades de
vapor e gases em um líquido, proporcionando um contato mais efetivo entre a matriz e
o solvente. Quando a pressão do sistema é positiva ocorre a compressão das bolhas de
vapor e, quando a pressão é negativa, resultando em “vácuo”, ocorre a expansão. Esse
ciclo de compressão-expansão é responsável pela geração das cavidades.
49
Em um líquido com partículas sólidas dispersas, os gases são adsorvidos nos
poros das partículas. Quando ocorre a compressão, os gases ou vapores, no interior
das cavidades, são comprimidos para o interior da partícula; já na etapa de expansão
são direcionados para fora da mesma. Devido a essas atividades, há aumento no
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
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18
tamanho das cavidades, que se direcionam para o interior do líquido e separam-se da
partícula.
49
Vagi e colaboradores
40
desenvolveram método de extração e análise para 17
agrotóxicos da classe dos organoclorados em sedimento marinho, com auxílio de
banho de ultra-som e análise por GC-ECD. Parâmetros como tipo e quantidade de
solvente e tempo de sonicação foram otimizados. Os solventes utilizados foram
acetona, metanol, hexano, diclorometano e acetato de etila, sendo que os melhores
resultados de recuperação foram obtidos com extração em duas etapas de 20 minutos
com diclorometano.
A otimização do processo de extração para cinco piretróides, um
organofosforado e vinte organoclorados também foi descrita por You e colaboradores.
50
Diferentes solventes foram utilizados para verificação da capacidade extratora (hexano,
diclorometano e mistura de diclorometano e acetona), sendo que os melhores
resultados foram alcançados com a utilização de mistura 50:50 v/v de acetona e
diclorometano, com recuperação dos analitos na faixa de 84 a 111 %. Para a etapa de
clean up, os autores utilizaram Florisil em dois estados: somente ativado por
aquecimento e ativado/desativado com água destilada (6% m/v), sendo que o último
apresentou melhores resultados de recuperação para todos os compostos estudados.
Xue e colaboradores
51
determinaram compostos organoclorados em amostras de
sedimento através da extração por banho de ultra-som com metanol e acetonitrila
(50:50 v/v) por duas vezes a 30 minutos e análise por GC-µECD. Para verificação da
recuperação do método, as amostras foram fortificadas com concentrações de 0,5; 5 e
50 µg Kg
-1
dos padrões dos analitos. A recuperação ficou entre 71 e 103% com desvio
padrão relativo de ± 4 a 8%.
2.4.3. Outras Técnicas
A extração com fluido supercrítico (SFE, do inglês “Supercritical Fluid
Extraction”)
52-54
, extração acelerada com solvente (ASE, do inglês “Accelerated Solvent
Extraction”)
55-57
e extração assistida por microondas (MAE, do inglês “Microwave
Assisted Extraction”)
58-60
são outras técnicas bastante utilizadas na determinação de
agrotóxicos em sedimentos.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
19
2.5. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS
EM SEDIMENTOS
Atualmente, a Cromatografia Gasosa é a técnica mais utilizada para a
determinação de agrotóxicos em diferentes matrizes. Uma limitação dessa técnica é
que ela demanda que a amostra seja volatilizável e termicamente estável. Compostos
não voláteis ou instáveis podem ser derivatizados a fim de se obter resposta por GC. A
técnica possui alto poder de resolução e detecta compostos em escala de nano a
picogramas.
4
A cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas
(GC/MS) no modo monitoramento de íon selecionado (SIM – “Selective Ion Monitoring”)
é uma das técnicas mais empregadas para separação e análise quantitativa de
agrotóxicos em sedimentos. Neste caso, mesmo no modo SIM, é possível que ocorram
coeluições com interferentes que apresentam em sua estrutura os íons escolhidos para
o monitoramento dos analitos. Além disso, apesar do GC/MS ser altamente específico e
eficiente, em alguns casos, pode ocorrer degradação e/ou isomerização dos
agrotóxicos na câmera de ionização, dificultando a identificação desses compostos.
61
Em estudo realizado por Smalling e colaboradores,
62
para determinação de agrotóxicos
em sedimento, foram verificados os limites de detecção instrumentais para oitenta e
cinco agrotóxicos, por GC-µECD e GC/MS. Os resultados obtidos mostraram a grande
sensibilidade da GC-µECD, pois os limites de detecção foram mais baixos para essa
técnica (0,5 a 1 µg kg
-1
para GC-µECD e 1 a 2 µg kg
-1
para GC/MS).
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, do inglês “High Performance
Liquid Chromatography”) é outra opção para este tipo de análise e, neste caso,
compostos não voláteis e termicamente instáveis podem ser alvo desta técnica.
4
Entre
os detectores mais utilizados para determinação de agrotóxicos por cromatografia
líquida encontram-se o detector de ultravioleta (UV), arranjo de diodos (DAD, do inglês
“Diode-Array Detector”) e espectrômetro de massas.
63
A Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC × GC) é uma técnica
relativamente recente, desenvolvida em 1991 por Liu e Phillips
64
e que apresenta
grande poder de separação. Para amostras complexas, contendo de 150 a 250
compostos de interesse, por exemplo, a separação obtida por GC com uma única
coluna não é suficiente para separação de todos os compostos. Outras técnicas
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
20
multidimensionais como GC-GC (Cromatografia Gasosa Bidimensional de Frações
Parciais ou de heartcut), HPLC-GC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada
à Cromatografia Gasosa) e SFC-GC (Cromatografia de Fluido Supercrítico acoplada à
Cromatografia Gasosa) também não providenciam uma separação efetiva de todos os
analitos.
65,66
Neste texto será dado destaque à GC × GC em virtude de ter sido utilizada
no desenvolvimento desse trabalho.
2.5.1. Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente – GC ×
××
× GC
2.5.1.1. Princípios e Operação
Na GC × GC duas colunas cromatográficas de diferentes mecanismos de
retenção são acopladas em série, sendo a coluna da primeira dimensão (
1
D)
comumente de 30 m de comprimento e diâmetro interno de 0,25 a 0,32 mm. A coluna
da segunda dimensão (
2
D) deve ser mais curta, do tipo fast-GC, para que o perfil de
separação obtido na
1
D seja mantido.
67
A Figura 9 apresenta um diagrama
representativo de um sistema cromatográfico da GC × GC.
Figura 9. Diagrama dos constituintes da GC × GC. (1) injetor, (2) primeira
coluna, (3) modulador, (4) segunda coluna e (5) detector.
O modulador é considerado o “coração” da técnica e é acoplado entre as duas
colunas, sendo que sua função é de amostrar e focalizar as estreitas frações eluídas da
MODULADOR
1
2
3
4
5
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
21
primeira coluna e, em seguida, liberar essa porção, rapidamente, para a segunda
coluna.
68
O modulador, ao focalizar o efluente proveniente da primeira coluna e
introduzir o mesmo na segunda dimensão, deve fazê-lo em uma freqüência correta de
amostragem para que a resolução cromatográfica encontrada na primeira separação
seja mantida. Uma amostragem de 3 a 4 fatias por pico proveniente da primeira
dimensão é ideal para manter o perfil de separação obtido na primeira coluna. O
período de amostragem corresponde ao período de modulação (P
M
), que é a duração
de um ciclo completo de modulação, e ao tempo de separação na coluna da segunda
dimensão. Devido ao tempo de separação da segunda dimensão ser muito curto,
geralmente de 2 a 10 segundos, a separação na segunda coluna é essencialmente
isotérmica.
69
A Figura 10 apresenta o processo de modulação gerado pelo modulador
térmico de dois estágios.
Figura 10. Representação do processo de modulação. Adaptado da referência 69.
O primeiro e o segundo estágios são observados quando ocorre a concentração
e a reconcentração da banda cromatográfica, respectivamente, proveniente da primeira
1º estágio
Jato frio ligado
1
2
3
4
2º estágio
Jato frio desligado
Jato quente ligado
Jato frio ligado
Jato frio ligado
Jato frio ligado
Jato frio ligado
Jato quente ligado
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
22
coluna. Um único período de modulação é composto por quatro passos distintos, como
mostra a figura acima: (1) no 1º estágio há o aprisionamento da banda cromatográfica
proveniente da primeira coluna pela ação de um jato frio; (2) liberação do efluente para
o 2º estágio, através de um jato quente; (3) no 1º e 2º estágios ocorre novamente o
aprisionamento da banda e (4) no 2º estágio ocorre a liberação do efluente amostrado,
através do jato quente, com a liberação para a coluna da segunda dimensão. Cada
modulação produz o fatiamento do pico, sendo que o número de fatias amostradas
dependerá do período de modulação e da largura do pico proveniente da primeira
dimensão.
70
O termo “abrangente” é utilizado para designar que todo o efluente da primeira
dimensão, ou uma parte representativa do mesmo seja introduzido na segunda
dimensão, sem perda das características da separação na
1
D. Na separação
abrangente, três fatores devem ser verificados: (1) todos os constituintes da amostra
estão sujeitos a duas separações de mecanismos distintos; (2) os constituintes da
amostra separados na
1
D seguirão separados na
2
D; (3) o perfil de eluição de ambas as
colunas é mantido.
71-74
A ortogonalidade de um sistema multidimensional é verificada quando os
mecanismos de separação das duas colunas são completamente independentes.
Geralmente, a fase estacionária da
1
D é apolar, ou de baixa polaridade, onde o
processo de separação ocorre por diferenças no ponto de ebulição dos analitos; já a
coluna da
2
D possui fase estacionária polar, ou de média polaridade (separação por
polaridade). Esse fator é de grande importância, pois determina a magnitude da
separação no espaço bidimensional, sem obrigatoriamente promover ótima resolução
cromatográfica. A eficiência da separação depende do tipo de amostra e do conjunto de
colunas empregado na primeira e segunda dimensão e não, necessariamente, da
ortogonalidade do sistema. Na prática, existe uma relação direta entre ortogonalidade e
aumento na capacidade de pico, que representa o número máximo de compostos que
podem ser colocados lado a lado em um espaço de separação com uma dada
resolução e em um determinado intervalo de tempo.
71,75,76
Mondello e colaboradores
77
descrevem a GC × GC como sendo uma das
inovações mais revolucionárias na cromatografia gasosa. Os autores também afirmam
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
23
que, provavelmente, a diferença do poder de separação entre a GC × GC e a 1D-GC
seja ainda maior do que a diferença existente entre as colunas capilares e as
empacotadas.
Em geral, a GC × GC apresenta quatro vantagens sobre a 1D-GC: (1) aumento
de resolução, (2) aumento de sensibilidade devido à reconcentração da banda do soluto
na
2
D, favorecendo a detecção de componentes em nível de traços, (3) construção de
cromatograma 2D (bidimensional) com estruturação por compostos quimicamente
similares e (4) aumento da capacidade de pico, pois a retenção nas duas colunas
através de diferentes mecanismos de interação analito – fase estacionária, faz com que
a capacidade teórica de pico na GC × GC se aproxime do produto das capacidades de
pico das duas dimensões.
66,77
2.5.1.2. Interpretação dos Dados Gerados na GC ×
××
× GC
Do mesmo modo como ocorre na 1D-GC, a GC × GC também proporciona
informações qualitativas e quantitativas a respeito de uma amostra cromatografada.
Contudo, a representação gráfica dos resultados é diferenciada. Através de softwares
específicos, são gerados gráficos tridimensionais, onde o eixo x é representado pela
separação na
1
D, o eixo y a separação na
2
D e um terceiro eixo, z, representa a
intensidade do sinal gerado pelo detector. A Figura 11 apresenta a construção da
representação gráfica gerada por um sistema cromatográfico bidimensional abrangente.
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24
Figura 11. Geração e visualização do sinal cromatográfico por GC × GC.
Adaptado da referência 74.
A Figura 11 apresenta uma banda cromatográfica composta por três analitos
que não foram separados na
1
D (A). Essa banda é amostrada e injetada na segunda
coluna na forma de pulsos estreitos e periódicos pelo modulador. Conforme já
mencionado, cada pico eluído da primeira coluna é fatiado de três a quatro vezes num
sistema cromatográfico adequado,
68
o que resulta na formação de, no mínimo, três
cromatogramas consecutivos da separação ocorrida na
2
D (B), gerando o
cromatograma bruto da
2
D. Através do uso de softwares específicos cada
cromatograma individual da
2
D é fatiado e disposto lado a lado (C), mas desta forma, a
interpretação dos dados se torna bastante dificultada. Para facilitar a interpretação, os
cromatogramas são convertidos em diagramas tridimensionais (D), onde a altura dos
picos é representada por linhas de contornos ou por uma escala de cores. O software
Cromatograma
Monodimensional
1. Modulação
Cromatograma Bidimensional
(2ª coluna)
2. Transformação
3. Visualização
Diagrama 3D
Cromatograma da
2
D
colocado lado a lado
Diagrama de contorno
Dia
grama de cores
A
B
C
D
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25
utiliza o período de modulação e o tempo em que ocorrem os pulsos de injeção para a
segunda coluna para fatiar o cromatograma original e gerar o cromatograma da
segunda dimensão.
67
Os picos gerados por um sistema GC × GC apresentam dois tempos de retenção,
na primeira e segunda dimensão (
1
t
R
e
2
t
R
, respectivamente). Essa característica
proporciona grande vantagem analítica, pois se refere a dois mecanismos de
separação, podendo ser utilizada com o propósito de identificação de compostos, uma
vez que a técnica é equiparada a espectrometria de massas.
78
Diferentemente da 1D-GC, na GC × GC mais de dois picos podem ser
considerados como vizinhos de um determinado analito e este novo conceito de
vizinhança foi introduzido por Schure,
79
que foi o primeiro autor a propor a abordagem
relacionada a teoria da razão vale-pico para a avaliação da resolução entre picos
gerados por cromatografia bidimensional. Para tanto, utiliza-se a distância entre os
máximos de dois picos, o ponto de menor intensidade na reta entre estes dois picos e
os valores de intensidade nesses três pontos. Contudo, essa abordagem é válida
apenas para picos gaussianos. Peters e colaboradores
80
propuseram uma abordagem
para cálculo de resolução baseada na teoria da razão vale-pico (monodimensional), a
qual pode ser aplicada tanto para picos gaussianos, quanto não gaussianos. Por outro
lado, Adam e colaboradores
81,82
calcularam a resolução em GC × GC como sendo a
média euclidiana das resoluções em cada uma das duas dimensões. Neste trabalho, as
resoluções foram calculadas de acordo com esta última abordagem. Para a 1D-GC a
resolução entre dois picos genéricos A e B pode ser calculada de acordo com a
Equação 1.
R
S
=
( )
( )
2
2
4
BA
tr
ωω
δ
+
Equação 1
Onde:
δ
tr
: diferença entre os tempos de retenção de dois picos A e B genéricos;
ω
: largura do pico na base.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
26
A Equação 2 apresenta a fórmula utilizada para o cálculo da resolução na GC ×
GC .
81,82
R
S
2D =
2
2
,,
2
,,
2
+
+
+ yByA
y
xBxA
x
ωω
δ
ωω
δ
Equação 2
Onde:
δ
x
e
δ
y
: diferença entre os tempos de retenção de dois picos na
1
D e
2
D,
respectivamente;
ω
x
e
ω
y
: largura do pico na base na
1
D e
2
D, respectivamente. ω
x
corresponde ao
produto entre número de modulações por pico e o período de modulação. ω
y
é referente
ao pico modulado mais intenso.
O fator de assimetria (A
s
) de um pico está diretamente relacionado à eficiência e
resolução cromatográfica. Fatores de assimetria entre 0,8 e 1,2 são considerados
satisfatórios, com pouca ou nenhuma influência de cauda nos picos cromatográficos.
83
Esse fator é calculado utilizando-se a razão entre as larguras B e A a 10% da altura do
pico, conforme Figura 12. Na GC × GC a assimetria de pico é avaliada levando-se em
consideração o pico modulado mais intenso.
Figura 12. Representação de um pico cromatográfico genérico, ilustrando os
parâmetros empregados para cálculo do fator de assimetria.
Quando um composto apresenta
2
t
R
maior do que um período de modulação
ocorre o fenômeno chamado “wraparound” ou pico fora de ciclo. Um pico fora de ciclo
poderá representar um problema na interpretação dos dados, devido a sua eluição
tardia, no próximo ciclo de modulação, juntamente com outros compostos que são
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
27
introduzidos na
2
D. Esse fenômeno pode ocasionar a coeluição com compostos de
interesse, prejudicando o processo de separação e quantificação.
68
A separação espacial por classes químicas é uma outra característica da GC ×
GC. O efeito “telhado” é observado para amostras complexas que contenham séries
homólogas como constituintes. Neste caso, o perfil de agrupamentos de picos dentro de
uma classe química é repetido para cada número de carbonos. Cada “telha”
corresponde a um grupo de compostos pertencentes a uma classe química que
apresenta um determinado número de carbonos. Esta distribuição espacial de “telhas”
em seqüência facilita a identificação dos compostos, principalmente em amostras
complexas.
84
2.5.1.3. Detecção
O detector exerce função de grande importância em um sistema cromatográfico.
Os detectores utilizados na GC × GC devem apresentar rapidez na velocidade de
aquisição, sendo que esta velocidade está relacionada à rapidez no processo físico-
químico que irá produzir o sinal e também à rapidez no processamento eletrônico deste
sinal. Assim, o volume do detector deve ser pequeno e a taxa de aquisição de sinal
deve ser de pelo menos 50 Hz (50 – 200 Hz), evitando-se alargamento de pico por
volume extra coluna e reconstrução incorreta do pico, respectivamente.
85,86
Alguns
detectores vêm sendo empregados na determinação de agrotóxicos em diferentes
matrizes, e dentre eles estão o detector por ionização em chama (FID), de
espectrometria de massas (MS), de nitrogênio e fósforo (NPD) e de captura de elétrons
(ECD).
O detector por ionização em chama (FID) é muito empregado em GC × GC, pois
trabalha com velocidade de aquisição de sinal de até 200 Hz e com praticamente
nenhum volume extra coluna. Outro detector amplamente utilizado para diferentes
matrizes e analitos é o de espectrometria de massas com analisador por tempo de vôo
(TOFMS), visto que ele possui freqüência de aquisição de dados de 50 a 500 Hz e
possibilita acesso a informações estruturais dos analitos, maior sensibilidade,
deconvolução espectral, tendo como desvantagem seu alto custo. O detector de
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
28
nitrogênio e fósforo (NPD) também é utilizado para determinação de agrotóxicos, uma
vez que trabalha com freqüência de aquisição de sinal de até 200 Hz.
86
O detector por captura de elétrons (ECD) apresenta taxa de aquisição de dados
de até 50 Hz e volume interno de 1,5 mL, o que implica em alargamento do pico
cromatográfico. A miniaturização do ECD, o micro-ECD (µECD), com 150 µL de volume
de célula, possibilitou a diminuição do efeito de cauda nos picos cromatográficos, mas
ainda apresenta picos cerca de duas vezes mais largos que os obtidos no FID.
85-87
O µECD, detector utilizado no desenvolvimento desse trabalho, contém uma fonte
de ionização de partículas β, de baixa energia, que colidem com as moléculas do gás
de arraste gerando elétrons livres de baixa energia. Quando algum constituinte da
amostra apresenta grupos de alta afinidade eletrônica, como por exemplo halogenados,
fosforados e grupos nitro, os elétrons livres gerados são capturados por esses
componentes da amostra, com formação de íons carregados negativamente. O sinal
gerado pelo detector é emitido devido à diminuição na corrente elétrica provocada pela
captura dos elétrons livres. O ECD é um detector seletivo, extremamente sensível para
quantificação de compostos organohalogenados, sendo que a principal fonte radioativa
utilizada é o
63
Ni, que apresenta um tempo de vida média de aproximadamente 100
anos.
88,89
Essas importantes características de detecção quando aliadas ao potencial
de separação da cromatografia gasosa bidimensional abrangente propiciam ótimos
resultados de separação e detecção. O esquema referente ao µECD pode ser
observado na Figura 13.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
29
Figura 13. Esquema do µECD. Adaptado da referência 88.
2.5.1.4. Aplicação da GC ×
××
× GC na Determinação de Agrotóxicos
O número de publicações científicas relacionado à determinação de agrotóxicos
por GC × GC ainda é relativamente pequeno, mas suficiente para demonstrar as
potenciais vantagens da técnica em relação a 1D-GC.
Uma conseqüência importante da utilização dos agrotóxicos na agricultura é a
possível presença de resíduos desses compostos e de seus metabólitos em alimentos.
Investigação sobre o poder de separação da GC × GC/TOFMS para determinação de
58 compostos da classe dos organofosforados e nitrogenados em amostras
alimentícias foi realizado por Dallüge e colaboradores.
90
Os autores observaram que a
determinação de alguns compostos por GC/TOFMS seria prejudicada em função da
coeluição com interferentes da matriz, já que o espectro de massas obtido pela
deconvolução espectral ou pela subtração da linha de base não é claro o suficiente
para proporcionar a identificação dos analitos. Em outro estudo de otimização de
metodologia para determinação de 51 agrotóxicos em uva, Banerjee e colaboradores
91
verificaram que a sensibilidade da análise por GC × GC /TOFMS foi consideravelmente
aumentada quando comparada a GC/TOFMS. A GC × GC ainda proporcionou a
Célula de
63
Ni
Adaptador da
coluna capilar
Purga do gás
de anodo e de
make up
Sensor de
pressão
Restritor do gás
de make up
Restritor do gás
de anodo
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
30
separação cromatográfica de alguns compostos que coeluem quando analisados por
GC/MS, embora estes tenham sido identificados por deconvolução espectral na
cromatografia monodimensional. Além disso, a GC × GC possibilita a obtenção de
espectros de massas mais nítidos, evitando assim a possível confirmação de falsos
positivos. O aumento de sensibilidade analítica da GC × GC-NPD quando comparada a
GC-NPD, para análise de vegetais, foi verificado por Khummueng e colaboradores,
83
visto que a soma das alturas dos picos cromatográficos obtidos pela técnica
bidimensional abrangente foi cerca de 20 vezes maior do que aquela obtida na
monodimensional.
O potencial da GC × GC-µECD foi também verificado por Bordajandi e
colaboradores
93
através de desenvolvimento de método para determinação de
poluentes quirais como toxafeno em óleo de peixe. O método descrito para
determinação de cinco congêneros do toxafeno, com coluna enantiosseletiva na
1
D e
coluna de média polaridade na
2
D, providenciou completa separação dos isômeros,
enquanto que para a 1D-GC, com a mesma coluna enantiosseletiva, ocorreu
sobreposição de dois compostos. Além disso, a GC × GC possibilitou excelente
separação entre os compostos estudados e os interferentes da matriz complexa.
A Tabela II apresenta alguns trabalhos científicos que utilizam a GC × GC como
ferramenta analítica para determinação de agrotóxicos em diferentes matrizes.
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31
Tabela II. Aplicações da GC × GC para determinação de agrotóxicos em diferentes matrizes.
Analitos Tipo de amostra Detecção Ref.
20 agrotóxicos de diferentes classes químicas Maçã e pêssego TOFMS 73
Nove fungicidas Vegetais
µECD
92
Cinco enantiômeros do toxafeno Óleo de peixe
µECD
93
Seis compostos da classe dos piretróides Uva
µECD
94
Agrotóxicos organoclorados (OCPs) e toxafeno Carne de porco, ovos e leite materno
µECD
95
Agrotóxicos organoclorados (OCPs) e toxafeno Sedimento e poeira
µECD
96
Toxafeno Misturas técnicas
µECD
97
Agrotóxicos organoclorados (OCPs) Leite e soro humano TOFMS 98
36 agrotóxicos de diferentes classes químicas Chás de frutas, verde e preto TOFMS 99
Agrotóxicos organoclorados Mistura de padrões FID 100
15 agrotóxicos de diferentes classes químicas Soro humano FID 101
32 compostos pertencentes à classe dos organoclorados e
organofosforados
Fumo TOFMS 102
106 agrotóxicos de diferentes classes químicas Cereal TOFMS 103
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32
2.6. PARÂMETROS DE MÉRITO
O processo de validação possibilita uma avaliação da eficiência de um
processo analítico, quando do seu desenvolvimento, adaptação ou implementação.
A validação garante que um método analítico ofereça informações confiáveis e
interpretáveis sobre uma amostra.
104
O conceito de validação de metodologia é
amplamente diversificado na literatura. Pesquisadores
105
e órgãos reguladores, tanto
nacionais
106,107
quanto internacionais
108-110
discutem como e quais parâmetros
devem ser levados em consideração num processo de validação.
Geralmente, os parâmetros avaliados num processo de validação são:
especificidade e seletividade, linearidade e curva de calibração, precisão
(repetitividade e precisão intermediária), limite de detecção (LOD), limite de
quantificação (LOQ) e exatidão (teste de recuperação).
2.6.1. Seletividade e Especificidade
Tanto a seletividade, quanto a especificidade estão relacionadas com o
processo de detecção do método.
107
A seletividade é a capacidade de distinção
entre um analito e outro, ou interferentes da matriz, quando um método gera
resposta para vários compostos. A especificidade é verificada quando um método
gera resposta para apenas um analito.
107
Com o intuito de evitar confusão em
relação a esses dois conceitos, a União Internacional de Química Pura e Aplicada -
IUPAC (do inglês “International Union of Pure and Applied Chemistry”)
recomenda
que seja utilizado o termo seletividade, já que existem poucos métodos
cromatográficos que respondem a apenas um único analito. Se a seletividade do
método não for constatada, parâmetros como exatidão, linearidade e precisão
estarão seriamente comprometidos.
104
A seletividade é um parâmetro avaliado
qualitativamente.
2.6.2. Linearidade e Curva de Calibração
O conceito de linearidade está relacionado à capacidade de um método
produzir resultados diretamente proporcionais à concentração de um analito em um
determinado intervalo de concentração.
104,107
Com isso, torna-se necessário o uso
de soluções padrão para a verificação da relação entre a concentração e a resposta
analítica, pois na prática a linearidade é verificada através da curva de calibração.
105
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
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33
Por meio da curva de calibração é gerado um gráfico, com no mínimo cinco
pontos, representado por uma reta, que relaciona a resposta do equipamento com
as várias concentrações dos analitos em estudo. Assim, a resposta instrumental é
linearmente relacionada com a concentração das soluções padrão ou da matriz
fortificada. Essa resposta pode ser verificada matematicamente através da
regressão linear, descrita pela equação y = ax + b, onde y corresponde a variável
dependente (sinal analítico obtido para as diferentes concentrações); a é o
coeficiente angular da reta (inclinação da curva); x é a variável independente
(relaciona-se as várias concentrações das soluções padrão) e b representa o
coeficiente linear da reta de calibração.
104,105,111
Outro parâmetro importante é o coeficiente de correlação (r) que é utilizado
com o intuito de verificar a adequação da reta como modelo matemático. Um
coeficiente de correlação igual a 1 indica uma correlação perfeita.
111
De acordo com
a Associação Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA e Instituto Nacional de
Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial - INMETRO, valores de r iguais a
0,99 e 0,90, respectivamente, são considerados satisfatórios. O coeficiente de
determinação (r
2
) é outro parâmetro utilizado para verificar a linearidade de uma
curva analítica, sendo que valores de r
2
acima de 0,98 são considerados
satisfatórios.
112
2.6.3. Precisão
A precisão indica a concordância entre vários resultados obtidos para uma
mesma amostra, ou seja, através da avaliação da precisão analítica consegue-se
perceber a dispersão entre os diversos resultados gerados para ensaios
independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou
soluções padrão.
105,107
Tanto a precisão quanto a exatidão de um processo analítico
são considerados parâmetros de grande importância no processo de validação, pois
permitem estimar os erros e variações associados a um determinado método.
113
Normalmente, a precisão é numericamente estimada através do desvio padrão
relativo (RSD) ou coeficiente de variação (CV) – Equação 3, sendo que, para
análise de agrotóxicos e outros compostos em nível de traços ou impurezas, são
aceitos RSD de até 20%.
104,111
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34
Equação 3
Onde:
S é o desvio padrão de uma amostra;
M é a média das determinações.
A repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade são três diferentes
expressões da precisão analítica. A repetitividade é o estudo da precisão realizado
em um mesmo laboratório, em pequeno intervalo de tempo (mesmo dia, analista e
equipamento). A precisão intermediária é expressa pela variação entre resultados
obtidos em dias diferentes pelo mesmo laboratório. A reprodutibilidade refere-se aos
resultados obtidos através da colaboração entre laboratórios, com mudança de
operador, local, equipamentos, entre outros. A reprodutibilidade é considerada em
situações como a padronização de procedimentos analíticos a serem incluídos em
agências regulamentadoras, como métodos oficiais de análise.
104,113
Em estudos cromatográficos, a precisão é determinada através de injeções de
no mínimo cinco replicatas de solução padrão.
105,113
2.6.4. Exatidão
A exatidão de um processo analítico representa o quanto os resultados
individuais, de um determinado ensaio, concordam com um valor de referência
aceito como verdadeiro. Esse parâmetro mede o desvio do valor obtido em relação
ao valor adotado como real.
104,105
São quatro os métodos utilizados para a
verificação da exatidão analítica: uso de material de referência certificado (MRC),
comparação de método proposto com método de referência, testes de recuperação
com matriz fortificada e estudos colaborativos entre vários laboratórios. Geralmente,
em análise de resíduos de agrotóxicos, são utilizados os testes de recuperação, em
que são adicionadas quantidades conhecidas de padrão de agrotóxicos à amostra
em estudo ou à amostra controle.
104
Para determinação de agrotóxicos são aceitos diferentes intervalos de
recuperação, variando de 70 a 120%, 80 a 110% e 70 a 130%, com precisão de até
20%.
104,113
Para amostras complexas, a literatura considera satisfatória
recuperações entre 50 e 120%, com precisão de 15%.
104
A Equação 4 descreve a
porcentagem de recuperação de uma amostra fortificada.
37
RSD % =
S
M
×
100
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JULIANA MACEDO DA SILVA
35
Equação 4
Onde:
R %: Recuperação percentual dos agrotóxicos;
m: massa determinada na amostra fortificada (µg);
m
AD
: massa de agrotóxico adicionada à amostra (µg).
2.6.5. Limite de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e Limite de Detecção do
Método (MDL)
O limite de detecção pode ser definido como sendo a menor quantidade de
um analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, ou seja,
é a menor concentração de um analito que pode ser diferenciada do ruído gerado
por equipamentos que produzem linhas de base.
105
O limite de quantificação é a
menor concentração do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de
exatidão e precisão.
107
A determinação do LOD e LOQ pode ser realizada de diferentes maneiras.
Não existe um consenso para a efetivação de um único método para a determinação
desses dois parâmetros. As metodologias aceitas para avaliação do LOD e LOQ são
a do método visual, método relação sinal-ruído e métodos baseados em parâmetros
da curva analítica. Tanto o LOD quanto o LOQ são medidos em unidades de
concentração.
104
O limite de detecção do método, MDL (do inglês, “Method Detection Limit”) é
a mínima concentração de uma determinada substância que pode ser medida e
reportada com 99% de confiança de que a concentração seja maior do que zero. O
MDL é determinado através da análise de uma amostra fortificada e é, geralmente,
maior do que o LOD. O MDL de procedimento analítico deve variar em função das
características da matriz. Este descreve a precisão da quantificação, enquanto que o
LOD descreve o quão segura é a detecção instrumental.
32,114
A metodologia utilizada neste trabalho para a determinação do LOD e LOQ
está descrita no item 3.7.4.
R % =
m
m
AD
×
100
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36
PARTE EXPERIMENTAL
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
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37
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. MATERIAIS EMPREGADOS
Os solventes utilizados no processo de extração foram de grau analítico e
bidestilados (acetona, hexano, diclorometano e éter etílico, da Nuclear - Diadema,
São Paulo, Brasil). Para o preparo das soluções padrão foi utilizado acetato de etila
grau HPLC (Mallinckrodt, Phillipsburg, Nova Jersey, EUA). Os padrões dos
agrotóxicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Seelze, Alemanha), com grau de
pureza acima de 97%, sendo que o padrão do agrotóxico permetrina constitui-se de
mistura dos isômeros cis e trans e o padrão do composto propiconazol de mistura
dos estereoisômeros. 3,4,5-tricloroguaiacol (Ultra Scientific, Belo Horizonte, Minas
Gerais, Brasil) com pureza acima de 95% foi utilizado como padrão interno. O sulfato
de sódio anidro (Quimex, São Paulo, Brasil) utilizado para retirar a umidade residual
dos sedimentos foi previamente seco em estufa a 400 °C por 4 horas e armazenado
em dessecador. Os papéis filtro utilizados foram de grau quantitativo (Quanty,
Alemanha). As colunas cromatográficas foram todas adquiridas da Agilent
Technologies - J&W Scientific (Palo Alto, CA, EUA).
3.2. EQUIPAMENTOS
As análises por 1D-GC e GC × GC foram realizadas em cromatógrafo Agilent
6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) com micro detector por captura
de elétrons, equipado com amostrador automático Combi PAL (CTC Analytics AG,
Zwingen, Suíça). O cromatógrafo ainda apresenta um forno secundário (LECO, St.
Joseph, MI, EUA) e um modulador térmico com quatro jatos de N
2
(quad jet), sendo
dois jatos quentes que são aquecidos pelo próprio bloco do modulador e dois jatos
frios, resfriados por N
2
líquido, gerando duas armadilhas criogênicas em série. Para
a extração dos sedimentos foi utilizado um banho de ultra-som Maxiclean (Unique,
Indaiatuba, Brasil) com potência de 120 Watts. Para pesagem dos padrões dos
agrotóxicos, sedimentos e sulfato de sódio foi utilizada balança analítica de precisão
(Shimadzu, AY220, Kioto, Japão).
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38
3.3. PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO
As soluções padrão estoque foram preparadas pesando-se os agrotóxicos em
frascos individuais e dissolvendo-os em acetato de etila grau HPLC em balões
volumétricos de 5 mL, previamente silanizados. As diluições posteriores foram
também feitas em balões volumétricos de 5 mL, utilizando-se micropipeta (Brand,
Wertheim, Alemanha) para coleta das alíquotas. Todas as soluções foram
guardadas no freezer à –18 ºC, em frascos de vidro âmbar silanizados.
3.4. AMOSTRAGEM DOS SEDIMENTOS
As coletas foram realizadas por técnicos da FEPAM na região da Bacia do
Rio Santa Maria e na região do Rio Gravataí. Foi coletado em média 1 kg de
sedimento, com retirada de qualquer vegetação presente, próximo à margem, em
locais de deposição de partículas finas (preferencialmente), e pouca profundidade.
Não foi adicionado nenhum componente para preservação das amostras. Os
sedimentos foram coletados em frascos de vidro e transportadas a 4 °C, até o
laboratório, onde foram congelados a –18 °C em freezer, antes do processo de
extração. A Tabela III apresenta a localização geográfica dos locais de coleta dos
sedimentos estudados.
Tabela III. Localização geográfica dos sedimentos analisados.
Amostra Localização Geográfica
SD
1
31° 8’ 11” – latitude sul / 54° 22’ 42” – longitude oeste
Rio Santa Maria
SD
2
30° 16’ 49” – latitude sul / 54° 54’ 10” – longitude oeste
Rio Santa Maria
Amostra controle
29° 56’ 10” – latitude sul / 50° 36’ 05” – longitude oeste
Rio Gravataí
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39
3.5. EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SEDIMENTOS
O processo de extração empregado para as amostras de sedimentos foi
baseado no método reportado por You e colaboradores,
50
EPA 3550C
115
e NBR
(Norma Brasileira) 13408/95.
116
A água residual presente no sedimento foi retirada e o mesmo foi
homogeneizado. Em seguida, foi parcialmente seco ao ar, à temperatura ambiente,
em vidros de relógio e cobertos com papel alumínio. Para a etapa de extração,
foram pesados 20 g de sedimento e 1 g para determinação do percentual de peso
seco. Para esta determinação, o sedimento foi deixado em estufa a 90 °C por 12 h e
colocado em dessecador antes da pesagem.
116
O cálculo da porcentagem de peso
seco (sólidos secos) é feito de acordo com a Equação 5.
Equação 5
Dez gramas de sulfato de sódio anidro foram adicionados a 20 g de
sedimento, procedendo-se à homogeneização do material. Uma alíquota de 50 mL
de mistura 50:50 v/v de acetona:diclorometano foi adicionada à amostra,
submetendo-se a mesma à extração por 15 min no banho de ultra-som. Essa etapa
foi repetida por mais duas vezes, empregando-se o mesmo período de tempo e
mesma quantidade de solvente em cada extração. Os extratos obtidos foram
decantados e filtrados em papel filtro sobre 2 g de sulfato de sódio. A seguir, os
extratos foram combinados, evaporados até a secura e ressuspensos com 1,5 mL
de acetato de etila.
As características físico-químicas dos sedimentos analisados neste trabalho
foram cedidas pela FEPAM. A Tabela IV apresenta algumas características físico-
químicas desses sedimentos.
Material Seco (g)
Amostra (g)
x 100 = % Sólidos Secos
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40
Tabela IV. Características físico-químicas dos sedimentos analisados por 1D-GC e
GC × GC.
Amostras
Carbono
Orgânico
Cascalho Areia Silte Argila
%
SD
1
2,53 3,20 70,97 19,49 6,33
SD
2
0,99 0 83,11 10,20 6,69
Amostra controle 1,98 24,90 66,20 5,08 3,77
3.6. OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
Para a determinação das melhores condições de programação de
temperatura do forno e verificação dos tempos de retenção dos analitos, foram
realizadas injeções de solução padrão contendo os nove compostos (oito
agrotóxicos e um padrão interno - 3,4,5-tricloroguaiacol), na concentração de 100 µg
L
-1
. As injeções foram realizadas com volume de 1 µL, no modo splitless com pulso
de pressão de 60 psi. Durante todas as análises, a temperatura do detector foi
mantida entre 20-25°C acima da temperatura mais alta do forno, a fim de evitar e/ou
diminuir o efeito de cauda nos picos e manter a célula do detector limpa.
79
A
confirmação da identidade de cada analito foi obtida com injeção individual dos
agrotóxicos e do padrão interno na concentração de 1 mg L
-1
. A Tabela V apresenta
a relação de colunas cromatográficas utilizadas nos experimentos, bem como a
característica das fases estacionárias das mesmas.
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41
Tabela V. Colunas utilizadas nas otimizações dos parâmetros cromatográficos para
1D- GC e GC × GC.
1D-GC* e Primeira Dimensão (
1
D)
Segunda Dimensão (
2
D)
Conjunto
de
Colunas
Nome Fase
Nome Fase Dimensões
(1) DB-5
5% difenil-95%
dimetilpolisiloxano
DB-
17ms
50% fenil-50%
metilpolisiloxano
1,70 m x 0,18
mm x 0,18 µm
(2) HP-50+
50% fenil - 50%
metilpolisiloxano
DB-
1ms
100%
metilpolisiloxano
1,70 m x 0,10
mm x 0,10 µm
*As dimensões das colunas empregadas em 1D-GC ou na
1
D foram sempre 30 m x 0,25 mm
x 0,25
µ
m.
3.6.1. Cromatografia Gasosa Monodimensional (1D-GC)
Os parâmetros experimentais que influenciam na análise dos compostos
estudados, tais como programação de temperatura do forno, temperatura do injetor,
fluxo de gás de make up (N
2,
99,999%, Linde Gás, Canoas, RS, Brasil) e coluna
cromatográfica foram otimizados para a análise por GC–µECD. O fluxo de gás de
arraste (H
2
, 99,999%, Linde Gás Canoas, RS, Brasil) utilizado nos experimentos foi
de 2 mL min
-1
.
Devido à maior resistência térmica da coluna DB-5, foi verificada a influência
de três diferentes temperaturas do injetor (250, 280 e 300 °C) na eficiência processo
cromatográfico.
3.6.2. Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC × GC)
A partir dos melhores resultados obtidos para a 1D-GC, como temperatura de
injeção e programação de temperatura do forno, parâmetros como período de
modulação, diferença de temperatura entre forno primário e secundário e duração do
jato quente foram otimizados para as análises por GC × GC–µECD, utilizando-se
diferentes jogos de colunas.
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42
3.7. PARÂMETROS DE MÉRITO
O processo de validação foi realizado para as duas técnicas de análise (mono
e bidimensional). Os parâmetros validados foram: seletividade, linearidade e curva
de calibração, limites de detecção e quantificação instrumentais, limite de detecção
do método, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (teste de
recuperação).
3.7.1. Linearidade e Curva de Calibração
A linearidade do método foi verificada através de injeções de solução padrão
para obtenção da curva de calibração. A curva foi construída através de injeções de
soluções padrão preparadas em acetato de etila, em quintuplicata, na faixa de 5 a
415 µg L
-1
, contendo o padrão interno na concentração de 100 µg L
-1
. As injeções
foram realizadas em ordem crescente de concentração, sendo que o método da
padronização interna foi escolhido a fim de compensar as flutuações nas respostas
geradas pelo µECD.
3.7.2. Precisão
A repetitividade do método foi avaliada através do coeficiente de variação das
áreas e alturas dos picos cromatográficos. Foram realizadas oito injeções sucessivas
de solução padrão contendo os agrotóxicos estudados e o padrão interno (3,4,5-
tricloroguaiacol), na concentração de 100 µg L
-1
. A precisão intermediária também foi
avaliada através do coeficiente de variação das áreas e alturas dos picos
cromatográficos gerados através de injeções realizadas em dois dias diferentes,
num total de oito injeções (quatro injeções a cada dia).
3.7.3. Exatidão
A exatidão foi verificada através dos testes de recuperação em três níveis de
concentração (15, 30 e 150 µg kg
-1
). Foi realizada uma média aritmética dos LOQ
para 1D-GC e, então, escolhidos os valores de fortificação como sendo 1 x LOQ, 2 x
LOQ e 10 x LOQ.
104
Os testes foram realizados com amostra de sedimento isenta dos agrotóxicos
estudados. À amostra foram adicionadas quantidades de 300, 60 e 30 µL de uma
solução a 10 mg L
-1
contendo os analitos estudados, para obtenção da fortificação a
150, 30 e 15 µg kg
-1
, respectivamente. As amostras foram deixadas em contato com
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JULIANA MACEDO DA SILVA
43
a solução padrão contendo os agrotóxicos durante 24 horas, após homogeneização
e evaporação do solvente.
3.7.4. Limites de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e Limite de Detecção do
Método (MDL)
A determinação dos limites de detecção e quantificação instrumentais foram
realizadas de acordo com o que preconiza a Conferência Internacional em
Harmonização – ICH (do inglês “International Conference on Harmonization”).
108
Os
cálculos foram baseados no desvio padrão, s, da intersecção da curva analítica e no
coeficiente angular, S, da curva conforme Equações 6 e 7.
Para o limite de detecção:
LOD = 3,3(s/S) Equação 6
Para o limite de quantificação:
LOQ = 10(s/S) Equação 7
O limite de detecção do método (MDL) foi avaliado através da extração de
sete replicatas de sedimento fortificado a 10 µg Kg
-1
. O nível de fortificação foi
escolhido de acordo com a descrição do “Analytical Detection Limit Guidance”, que
determina que a fortificação fique entre 1 a 5 vezes o limite de detecção
instrumental.
114
O MDL é expresso conforme Equação 8:
MDL = st (0,99; n-1) Equação 8
Na equação acima, s é o desvio padrão das replicatas e t é o valor da
distribuição t de Student, com 99% de confiança e n-1 graus de liberdade.
32,114
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44
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
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45
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. CROMATOGRAFIA GASOSA MONODIMENSIONAL (1D-GC)
A Tabela VI apresenta os parâmetros experimentais otimizados para cada
coluna cromatográfica.
Tabela VI. Condições cromatográficas obtidas para 1D-GC.
Colunas Cromatográficas
Condições
HP-50+ DB-5 DB-WAXetr
Programação de
Temperatura do
Forno
50°C (1,5 min)-30°C min
-
1
/190°C-5°C min
-1
/220°C-7°C
min
-1
/255°C (44 min)
60°C (2,53 min)-35°C min-
1
/180°C-4°C min
-1
/240°C-
12°C min
-1
/300°C (2 min)
40°C (1,5)-12°C
min-
1
/100°C-30°C
min
-1
/235°C (44
min)
Temp. Injetor (ºC) 280 280 260
Temp. Detector
(ºC)
280 325 260
Pulso de Pressão
(s)
36,6 29,4 36,6
4.1.1. Fase Estacionária Polidimetilsiloxano com 50 % de Grupos Fenila (HP-
50+)
A temperatura máxima de trabalho para a HP-50+, em condições isotérmicas,
é de 280 °C, mas os compostos de elevada K
H
e massa molecular como
difenoconazol e azoxistrobina (406,2 g mol
-1
e 403,4 g mol
-1
, respectivamente)
eluem
em temperaturas mais elevadas. Com isso, um tempo maior de análise ao final da
mesma foi necessário para que todos os compostos fossem eluídos. Ao final da
análise, intervalos de 30 a 60 minutos foram testados a 255 °C, sendo que 44
minutos foram suficientes para a completa eluição dos analitos. Esta programação
de temperatura representa a melhor condição encontrada depois de diversos testes
com várias rampas de temperatura.
O manual do equipamento
88
recomenda o emprego de diferentes fluxos de gás
de make up para operação em 1D-GC e em GC × GC. No caso de 1D-GC, o fluxo
mínimo de gás de make up a ser empregado é de 10 mL min
-1
, enquanto o máximo
é de 150 mL min
-1
. Entretanto, o intervalo típico para fluxos de gás de make up situa-
se entre 30 e 60 mL min
-1
. Desta forma foram testados estes dois fluxos
recomendados pelo fabricante. A condição de 30 mL min
-1
foi considerada a mais
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46
apropriada devido à obtenção das melhores intensidades de sinal para os
agrotóxicos em estudo e, por esta razão, nos experimentos posteriores, essa
condição foi mantida. A diminuição de fluxo de gás de make up faz com que o efeito
de diluição dos compostos no detector seja minimizado, com conseqüente
diminuição na largura da base dos picos, proporcionando melhor desempenho no
processo cromatográfico.
A partir dessa condição foram realizadas injeções sem divisão de fluxo com
pulso de pressão de 60 psi com diferentes períodos de duração, a fim de se obter
uma transferência mais rápida da banda cromatográfica para o interior da coluna,
bem como conseqüente estreitamento e aumento de intensidade da mesma.
117
A
literatura reporta algumas vantagens da utilização da injeção com pulso de pressão,
tais como o aumento da velocidade de transferência de analitos com elevado ponto
de ebulição e de compostos que possam ser adsorvidos no injetor; redução do
tempo de residência da amostra no injetor e aumento da capacidade do mesmo, em
função do volume de vapor ser inversamente proporcional a pressão.
118
Entretanto,
verificou-se que a eluição do triclorfom durante o pulso de pressão faz com que a
intensidade de sinal deste pico aumente desproporcionalmente em relação aos
demais analitos, podendo também ocorrer coeluição do triclorfom com o pico
cromatográfico do solvente. A escolha de um pulso de pressão cuja duração seja
apropriada (36,6 s para HP-50+ e DB-WAXetr; 29,4 s para DB-5) resulta em um
gerenciamento adequado destes fenômenos, proporcionando uma condição
cromatográfica satisfatória. As três colunas utilizadas para os experimentos
apresentam dimensões idênticas, mas fases estacionárias diferenciadas, o que
implica em tempos de retenção distintos para os analitos e solvente em cada fase e,
com isso, durações de pulso de pressão diferenciadas.
A Figura 14 apresenta um cromatograma típico dos nove analitos em coluna
capilar HP-50+.
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47
Figura 14. Cromatograma obtido para a mistura de padrões na concentração de 100
µg L
-1
em uma coluna HP-50+. Condições cromatográficas descritas na Tabela VI.
1) Triclorfom, 2) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 3) Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6)
Trifloxistrobina, 7A) Permetrina cis, 7B) Permetrina trans, 8) Difenoconazol I e II e 9) Azoxistrobina.
4.1.2. Fase Estacionária 5% difenil – dimetilpolisiloxano (DB-5)
Inicialmente foram testadas várias rampas de programação de temperatura,
sendo que a condição ótima escolhida está registrada na Tabela VI.
Sabendo-se que a DB-5 apresenta maior resistência a temperaturas elevadas
do que a HP-50+ (325 e 280 °C em condição isotérmica, respectivamente), foram
realizados testes com três diferentes temperaturas de injeção – 250, 280 e 300 °C, a
fim de verificar a influência deste parâmetro na determinação dos compostos. O
aumento da temperatura do injetor pode minimizar efeitos de discriminação,
aumentando o sinal cromatográfico para analitos mais suscetíveis a estes efeitos.
Neste caso, o aumento da resposta se relaciona a uma melhor performance
cromatográfica, que é conseqüência de maior eficiência na transferência da banda
cromatográfica durante a injeção. De acordo com a Figura 15, de forma geral, não
há diferença significativa nas alturas relativas dos picos nas diferentes temperaturas.
Contudo, a temperatura de 280 °C foi escolhida por ter propiciado maior intensidade
do sinal cromatográfico do componente fipronil. Zhang e colaboradores
119
também
verificaram que ocorre uma melhora do sinal cromatográfico para vários analitos,
quando da utilização de temperaturas mais elevadas no injetor.
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48
Figura 15. Comparação das médias das alturas dos picos cromatográficos (n = 3)
para diferentes temperaturas de injeção.
1) Triclorfom, 2) Propanil, 3) Fipronil, 4) Propiconazol I, 5) Propiconazol II, 6) Trifloxistrobina, 7)
Permetrina cis, 8) Permetrina trans, 9) Difenoconazol I, 10) Difenoconazol II e 11) Azoxistrobina.
Para esta fase estacionária, também foi testada a duração do pulso de pressão
durante a injeção cromatográfica, de forma semelhante ao que foi feito para a HP-
50+, objetivando-se o melhor comportamento cromatográfico para o triclorfom. A
Figura 16 apresenta um cromatograma típico dos nove analitos em coluna capilar
DB-5.
Figura 16. Cromatograma obtido para a mistura de padrões na concentração de 100
µg L
-1
em uma coluna DB-5. Condições cromatográficas descritas na Tabela VI.
1) Triclorfom, 2) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 3) Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6)
Trifloxistrobina, 7A) Permetrina cis, 7B) Permetrina trans, 8) Difenoconazol I e II e 9) Azoxistrobina.
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49
4.1.3. Fase Estacionária Polietilenoglicol (DB-WAXetr)
A temperatura máxima de trabalho em condição isotérmica para a DB-WAXetr
é de 235 °C. Nas análises realizadas, observou-se que, mesmo após 180 min a 235
°C, não se verificou a eluição de dois dos compostos: difenoconazol e azoxistrobina.
Além da dificuldade de eluição destes analitos, constatou-se que a DB-WAXetr
possivelmente provocou sorção parcial dos compostos devido a sua alta polaridade.
Isto pode ser observado através da baixa intensidade dos sinais cromatográficos,
quando comparados àqueles obtidos em análises feitas com as mesmas soluções
em outras fases estacionárias. A Figura 17 apresenta um cromatograma típico da
melhor condição de análise utilizando-se esta fase estacionária.
Figura 17. Cromatograma obtido para a mistura de padrões na concentração de 100
µg L
-1
em uma coluna DB-WAXetr. Condições cromatográficas descritas na Tabela VI.
1) Triclorfom, 2) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 3) Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6)
Trifloxistrobina, 7A) Permetrina cis e 7B) Permetrina trans.
4.1.4. Comparação Entre as Fases Estacionárias
O uso da fase estacionária DB-WAXetr mostrou-se inviável, visto que dois dos
analitos não eluíram após 180 min de análise. A comparação entre os resultados
obtidos com as colunas HP-50+ e DB-5 mostra uma maior vantagem analítica para a
segunda coluna cromatográfica. Além de apresentar menor tempo de análise na
separação dos nove compostos (27, 9 min – DB-5 e 61,1 min – HP-50+), a DB-5
ainda oferece melhor resolução na separação dos picos cromatográficos, com
5
10
15
20
25
30
35
Intensidade do Sinal (10
4
)
Tempo de Retenção (min)
5
1
2
3
4
6
7A
7B
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50
exceção do propiconazol II (5) e do trifloxistrobina (6) que apresentam resolução de
1,26 e 2,04 para DB-5 e HP-50+, respectivamente.
A resolução obtida para os picos dos isômeros da permetrina e propiconazol,
na coluna HP-50+, foi de 1,76 e 0,84, respectivamente. Para a DB-5, a resolução
obtida para esses isômeros foi de 2,23 e 1,64, respectivamente. Utilizando-se a
coluna DB-5, observou-se a separação dos dois isômeros do difenoconazol (8) com
resolução de 0,89, enquanto que na HP-50+ estes dois isômeros coeluem. Isto se
deve às diferenças nas interações entre analito e fase estacionária e também ao fato
de a DB-5 permitir o emprego de uma temperatura máxima maior (300 °C) na
análise cromatográfica do que a temperatura máxima da HP-50+ (255 °C).
Tanto a HP-50+ quanto a DB-5 apresentaram, em geral, valores satisfatórios
de assimetria. A Tabela VII apresenta os tempos de retenção, fatores de assimetria
e o desvio padrão para os picos cromatográficos obtidos com as duas colunas
citadas.
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JULIANA MACEDO DA SILVA
51
Tabela VII. Tempo de retenção (t
R
), fator de assimetria (A
s
) e desvio padrão (DP)
para os picos cromatográficos com a utilização das colunas HP-50+ e DB-5.
Analito HP-50+ DB-5
t
R
(min) A
s
(DP)
t
R
(min) A
s
(DP)
Triclorfom 0,77 1,4 (0,07) 0,59 2,0 (0,87)
3,4,5-Tricloroguaiacol (PI) 7,74 1,5 (0,29) 7,46 1,0 (0,24)
Propanil 10,93 1,0 (0,00) 9,90 1,5 (0,29)
Fipronil 11,77 0,8 (0,14) 12,59 1,0 (0,19)
Propiconazol I 16,54 1,0 (0,19) 16,75 1,0 (0,00)
Propiconazol II 16,63 1,3 (0,34) 16,98 1,3 (0,33)
Trifloxistrobina 16,87 1,0 (0,14) 17,14 1,1 (0,23)
*Permetrina cis
21,79 0,9 (0,08) 22,43 1,0 (0,14)
*Permetrina trans
22,19 1,0 (0,07) 22,65 1,0 (0,19)
**Difenoconazol I 36,80 - 25,24 1,5 (0,00)
**Difenoconazol II - - 25,31 1,0 (0,24)
Azoxistrobina 57,35 1,1 (0,07) 25,89 0,7 (0,19)
*A identificação dos isômeros cis e trans foi baseada no certificado de análise do padrão do
agrotóxico. **O fator de assimetria para o difenoconazol, com a utilização da coluna HP-50+, não foi
calculado em função da coeluição parcial entre os isômeros.
À luz dos resultados obtidos para os vários testes realizados com as três
colunas cromatográficas, a DB-5 foi escolhida por sua melhor performance.
4.1.5. Parâmetros de Mérito
4.1.5.1. Linearidade e Curva de Calibração
Em função da ampla faixa de concentração estudada, não foi possível obter
linearidade com apenas uma única curva analítica para 1D-GC. Com isso, foi
necessária a divisão da curva, com obtenção de dois intervalos de concentração,
como está representado na Tabela VIII. Rhoden
120
apresenta trabalho de validação
de método de determinação de nove agrotóxicos em frutas (dentre eles, a
azoxistrobina), utilizando GC-µECD, onde também foi necessária a divisão da curva
de calibração, tendo em vista o comportamento diferente dos analitos em duas
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52
faixas de concentração distintas. Explicação para a ausência de dados para o
triclorfom será apresentada no item 4.1.5.2.
Tabela VIII. Parâmetros da curva de calibração para os compostos estudados por
1D-GC.
Compostos Equação da Reta r
2
Linearidade (µ
µµ
µg L
-1
)
Propanil
y = 0,0023x + 0,0387
y = 0,0036x - 0,3308
0,9778
0,9765
15 - 150
175 - 415
Fipronil
y = 0,0114x + 0,0526
y = 0,016x - 1,6674
0,9984
0,9934
5 - 150
175 - 415
Propiconazol
a
y = 0,0064x - 0,0248
y = 0,0069x - 0,4449
0,9931
0,9799
5 - 95
150 - 355
Trifloxistrobina
y = 0,0048x + 0,0229
y = 0,0045x - 0,1565
0,9945
0,9961
5 - 115
175 - 415
Permetrina
b
y = 0,0019x + 0,0052
y = 0,0013x + 0,0233
0,9988
0,9904
5 - 95
115 - 415
Difenoconazol
c
y = 0,0018x - 0,0044
y = 0,0028x - 0,2981
0,9960
0,9557
15 - 175
150 - 355
Azoxistrobina
y = 0,0042x + 0,0217
y = 0,0055x - 0,4425
0,9917
0,9931
5 - 150
175 - 415
a, c
Soma dos estereoisômeros.
b
Soma dos
isômeros cis e trans.
Através das equações obtidas para as curvas analíticas pode-se observar que
o método proposto apresentou boa linearidade, com coeficientes de determinação
(r
2
) acima de 0,98, com exceção de alguns analitos, tais como o propanil que
apresentou r
2
de 0,9778 e 0,9765 para ambas as faixas de concentração,
propiconazol com r
2
de 0,9799 na faixa de concentração de 150 a 355 µg L
-1
e
difenoconazol que não apresentou linearidade na faixa de 150 a 355 µg L
-1
,
resultando em um coeficiente de determinação de 0,9557.
As curvas obtidas para cada segmento, primeira e segunda faixa de
concentração, estão apresentadas nas Figuras 18 e 19.
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53
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
0 50 100 150 200
Concentração (ug L
-1
)
Área relativa
Figura 18. Curvas analíticas obtidas para os sete agrotóxicos na primeira faixa de
concentração (faixa descrita na Tabela VII) por 1D-GC.
Legenda:♦ Azoxistrobina, Difenoconazol, ▲ Fipronil, × Permetrina, Propanil, Propiconazol, +
Trifloxistrobina. Área relativa = Apadrão/API
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
100 150 200 250 300 350 400 450
Concentração (ug L
-1
)
Área relativa
Figura 19. Curvas analíticas obtidas para os sete agrotóxicos na segunda faixa de
concentração (faixa descrita na Tabela VII) por 1D-GC.
Legenda:♦ Azoxistrobina, Difenoconazol, ▲ Fipronil, × Permetrina, Propanil, Propiconazol, +
Trifloxistrobina. Área relativa = Apadrão/Api
A Associação Nacional dos Especialistas em Resíduos, Contaminantes e
Poluentes Orgânicos (GARP) recomenda que as injeções das soluções da curva de
calibração apresentem desvio padrão relativo inferior a 5%.
104
Neste trabalho, os
resultados obtidos obedeceram a este critério, à exceção das soluções de 5 e 150
µg L
-1
, onde foram verificados desvios entre 5 e 12% para o propiconazol e
difenoconazol.
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54
4.1.5.2. Precisão
Durante os estudos de precisão, em que foram realizadas injeções
sucessivas de uma mistura dos padrões a 100 µg L
-1
, constatou-se a grande
variabilidade do tempo de retenção do triclorfom, devido a sua eluição muito próxima
ao solvente. Com isso, optou-se pela exclusão deste analito nos procedimentos de
validação, já que a identificação do mesmo ficou bastante dificultada. A Tabela IX
apresenta os valores obtidos para o coeficiente de variação (CV %) para o estudo da
precisão analítica.
Tabela IX. Avaliação da precisão analítica da 1D-GC expressa através do
coeficiente de variação (CV %) para repetitividade e precisão intermediária (n = 8).
Compostos Repetitividade Precisão Intermediária
Área Altura Área Altura
Propanil 1,58 2,57 1,11 1,67
Fipronil 1,85 1,75 1,72 1,18
Propiconazol I 2,71 3,63 1,52 2,95
Propiconazol II 3,85 2,86 2,50 3,46
Trifloxistrobina 2,43 1,96 1,38 2,45
Permetrina cis
2,89 2,75 0,90 1,26
Permetrina trans 3,88 3,00 1,50 1,37
Difenoconazol I 2,58 3,54 3,89 3,56
Difenoconazol II 4,17 3,53 2,87 2,42
Azoxistrobina 3,29 4,38 1,62 1,98
Para a repetitividade, as áreas dos picos cromatográficos, para os sete
compostos, apresentaram valores de coeficiente de variação de 1,58 a 4,17%. Para
as alturas dos picos, os valores situaram-se entre 1,75 e 4,38%. Os coeficientes de
variação relativos aos tempos de retenção variaram de 0,003 a 0,015%.
Para a precisão intermediária, o coeficiente de variação para a área dos
compostos situou-se entre 0,90 e 3,89% e para as alturas 1,18 e 3,56%. Os
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55
coeficientes de variação relativos aos tempos de retenção variaram de 0,009 a
0,047%.
Para análise de constituintes em nível de traços, recomenda-se que o
coeficiente de variação para a precisão analítica deve ser de no máximo 20%,
dependendo da complexidade da amostra.
104
Portanto, o método cromatográfico
proposto para a determinação dos sete compostos pode ser considerado preciso.
4.1.5.3. Exatidão
A Tabela X apresenta os valores encontrados para os testes de recuperação
com três níveis de fortificação.
Tabela X. Níveis de recuperação em base seca e coeficiente de variação (CV %)
para os valores obtidos em sedimento (amostra controle) por 1D-GC.
a, c
Soma dos estereoisômeros.
b
Soma dos
isômeros cis e trans.
O método se mostrou eficiente para os compostos permetrina e azoxistrobina,
pois tanto a exatidão quanto a precisão do método para esses compostos foi
satisfatória para os níveis de 15 e 30 µg kg
-1
. Apesar da baixa recuperação obtida
para os compostos propanil, fipronil, propiconazol e trifloxistrobina o método foi
considerado aplicável a estes analitos, pois o coeficiente de variação foi menor do
que 20%, o que indica que o método foi repetitivo, com excelente precisão analítica.
O difenoconazol apresentou recuperação elevada (> 120%) o que inviabiliza a
utilização do método para determinação desse composto, uma vez que altas
Nível de
Fortificação
15 (µ
µµ
µg kg
-1
) 30 (µ
µµ
µg kg
-1
) 150 (µ
µµ
µg kg
-1
)
Analito
Recuperação
(%)
CV
(%)
Recuperação
(%)
CV
(%)
Recuperação
(%)
CV
(%)
Propanil 43 13 47 3 70 22
Fipronil 46 16 46 9 52 28
Propiconazol
a
34 13 35 13 64 39
Trifloxistrobina 47 15 44 12 41 33
Permetrina
b
68 19 72 13 262 42
Difenoconazol
c
155 13 135 21 100 55
Azoxistrobina 72 16 60 20 122 57
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56
recuperações podem favorecer a confirmação de falsos positivos. Coeluições com
interferentes da matriz, provavelmente, favoreceram esses resultados.
As recuperações obtidas com o nível de fortificação de 150 µg kg
-1
apresentaram baixa precisão analítica para todos os compostos, com coeficientes de
variação maiores que 20%.
A resposta relativa obtida para alguns compostos no ECD, como os
hidrocarbonetos, é de 0,01 (tendo como base o clorobenzeno com resposta igual a
1).
121
Caso ocorra coeluição dos agrotóxicos estudados com esses compostos, por
exemplo, pode ocorrer uma contribuição negativa na resposta analítica, com
diminuição de intensidade de sinal. No banho de ultra-som o transdutor é
diretamente preso no fundo da cuba do aparelho e a energia ultra-sonora é
transmitida através da água.
122
Com isso, há muita dispersão de energia e,
conseqüentemente, maior probabilidade de geração de pontos de maior e menor
intensidade de extração. O sinergismo causado pelo efeito negativo no sinal (sinal
diminuído por coeluições com compostos de baixa resposta relativa no ECD) e pela
alta variabilidade no processo de extração no ultra-som pode ter contribuído para
que os resultados de recuperação obtidos na 1D-GC fossem insatisfatórios.
A análise de sedimentos pode apresentar vários interferentes devido aos altos
teores de matéria orgânica. Os resultados obtidos poderiam ser melhorados através
da utilização de etapa de limpeza do extrato da amostra. No trabalho descrito por
You e colaboradores
50
foi utilizada uma etapa de clean up com 10 g de Florisil
ativado e posteriormente, parcialmente desativado com 6 % m/v de água destilada.
Os autores obtiveram bons resultados de recuperação. Entretanto, testes realizados
com Florisil (fase sólida mais utilizada na preparação de amostras para
determinação de agrotóxicos) durante este trabalho, mostraram que, para os oito
agrotóxicos em estudo, houve adsorção irreversível dos analitos na coluna de
Florisil, o que inviabilizou a utilização desta etapa de limpeza. Além disso, os
compostos estudados apresentam características físico-químicas diferenciadas, o
que implicaria na utilização de diferentes eluentes, fazendo com que o processo se
tornasse trabalhoso e de alto custo. Como o objetivo principal deste trabalho é a
avaliação do potencial da 1D-GC e GC × GC para separação destes analitos em
extrato de sedimento e a otimização de método de extração não faz parte do escopo
desse trabalho, optou-se em utilizar este método empregado por You e
colaboradores,
50
apesar da baixa recuperação obtida para alguns analitos. Esses
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57
pesquisadores utilizaram os níveis de fortificação de 1, 5, 20 e 400 µg kg
-1
. Entre os
analitos investigados por eles, apenas um agrotóxico, a permetrina, é comum aos
dois métodos multirresíduos. A recuperação encontrada por You e colaboradores
variou de 87,1 a 101,3%, com coeficientes de variação menores que 10%. A
excelente recuperação encontrada pode ter sido influenciada pela utilização de
sonda ultra-sônica, que é mais eficiente que o banho de ultra-som (utilizado nesse
trabalho), pois a sonda encontra-se fixada na extremidade do amplificador do
transdutor, em contato direto com o sistema, enquanto que no banho há maior
dispersão de energia, pois o transdutor é preso diretamente no fundo da cuba.
122
4.1.5.4. Limites de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e Limite de Detecção
do Método (MDL)
A Tabela XI apresenta os limites instrumentais de detecção e quantificação e
o limite de detecção do método para os agrotóxicos em estudo.
Tabela XI. Limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) instrumentais e limite
de detecção do método (MDL) obtidos para os compostos estudados por 1D-GC.
Compostos
LOD (µ
µµ
µg L
-1
) LOQ (µ
µµ
µg L
-1
) MDL (µ
µµ
µg kg
-1
)
Propanil 2,31 3,99 2,17
Fipronil 0,66 2,00 1,51
Propiconazol
a
0,64 1,94 2,62
Trifloxistrobina 0,60 1,83 1,59
Permetrina
b
0,86 2,60 1,43
Difenoconazol
c
1,85 5,62 5,78
Azoxistrobina 0,63 1,92 2,82
a, c
Soma dos estereoisômeros.
b
Soma dos
isômeros cis e trans.
Os limites de detecção e quantificação instrumentais variaram de 0,60 a 2,31
µg L
-1
e 1,83 a 5,62 µg L
-1
, respectivamente. Os limites do método variaram de 1,43
a 5,78 µg kg
-1
. Não existe legislação vigente que estipule LMR (limite máximo de
resíduo) para os agrotóxicos estudados. Contudo, para fins de ilustração, os LMR
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58
dos analitos para a matriz arroz variam de 0,01 a 2 mg kg
-1
,
13
evidenciando que os
limites encontrados foram considerados satisfatórios.
4.2. CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE (GC × GC)
De acordo com Kristenson e colaboradores,
89
quanto maior o fluxo do gás de
make up na determinação de compostos por GC × GC-µECD, menor é o efeito de
cauda observado nos picos cromatográficos. Contudo, o efeito de diluição dos
compostos no detector é maior. Tendo por base os resultados destes pesquisadores
e também de outros,
93,95
o fluxo de nitrogênio
utilizado para todos os experimentos
foi de 150 mL min
-1
, que é o fluxo máximo permitido pelo equipamento.
A Tabela XII apresenta as condições otimizadas encontradas para os jogos de
colunas testados.
Tabela XII. Condições cromatográficas obtidas para GC × GC.
Temperaturas (ºC) Tempo (s)
Conj.
Colunas
Programação do Forno Injetor
Detector
∆
∆∆
∆T entre
os
Fornos
Modulação
Jato
Quente
(1)
60°C (2,53 min)-35°C min-
1
/180°C-4°C
min
-1
/240°C-10°C min
-1
/295°C (3 min)
280 320 5 7 2,1
(2)
50°C (1,5 min)-50°C min
-1
/190°C-5°C
min
-1
/220°C-5°C min
-1
/280°C (12 min)
280 335 5 4 0,8
* A temperatura do modulador foi mantida a 20°C acima da temperatura do forno primário.
4.2.1. Conjunto de Colunas nº1 (DB-5/DB-17ms)
Inicialmente, foram testados diferentes períodos de modulação (P
M
): 2, 4, 6, 7
e 8 s. Destes, foi escolhido 7s, pois neste P
M
foi observada a melhor distribuição de
picos no diagrama de cores. O objetivo em empregar diferentes períodos de
modulação reside na verificação da melhor distribuição dos analitos, bem como dos
interferentes, no espaço de separação bidimensional, visto que o método
desenvolvido pretende determinar a concentração dos analitos em uma matriz
complexa utilizando um detector seletivo. Um melhor aproveitamento desse espaço
diminui a probabilidade de coeluição dos analitos com os constituintes da matriz.
A duração do jato quente é um fator importante na análise, pois pode
influenciar no formato e intensidade dos picos.
70
Com isso, foram testadas diferentes
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
59
durações do jato, tais como 0,6 s (valor padrão de operação do equipamento); 1,4;
1,75 e 2,1 segundos, sendo que o valor máximo corresponde a 30% do período de
modulação. Para uma duração de 0,6 segundos do jato quente os formatos dos
picos foram bastante distorcidos. De acordo com o manual do equipamento,
69
a
utilização de um jato quente de 0,6 s é, geralmente, considerada satisfatória. Outra
regra de operação mencionada no mesmo manual é o emprego de 20 a 25% do
período de modulação para o jato quente, sendo que este tempo deve ser
obrigatoriamente menor do que 50% do P
M
. Um maior ou menor tempo de duração
deste jato pode implicar na retenção de analitos e conseqüente aparecimento de
caudas, por isso a otimização para cada tipo de composto em estudo deve ser
realizada. Além disso, o tempo de duração do jato frio é automaticamente
determinado pela escolha do tempo de duração do jato quente. Desta forma, para
analitos mais voláteis, é importante ajustar estes tempos de forma que o jato frio
seja suficientemente longo para amostrar e concentrar a banda cromatográfica deste
tipo de composto. Neste contexto, poucos artigos científicos reportam o uso de
diferentes jatos quentes para otimização da condição cromatográfica.
91
A Tabela XIII apresenta os valores encontrados para os fatores de assimetria
de acordo com a duração de jato quente utilizada, desvio padrão e tempos de
retenção na
1
D e
2
D para o conjunto de colunas n°1 e n°2.
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60
Tabela XIII. Fator de assimetria (
2
A
s
) e desvio padrão para os picos na
2
D com a
utilização de diferentes durações de jato quente.
DB-5/DB-17ms HP-50+/DB-1ms
Duração dos jatos quentes (s)
1,4 1,75 2,1
0,8
1,0 1,2
Analito
(
)
)(min
21
stt
RR
Assimetria /Desvio Padrão
(
)
)
(min
21
stt
RR
Triclorfom 2,80 2,06 1,2/0,08
1,1/0,00
1,8/0,14
1,9/0,46
1,7/0,46
1,4/0,00
2,20 1,58
3,4,5-
Tricloroguaiacol
(PI)
7,93 3,16 1,8/0,11
2,1/0,38
1,4/0,21
2,7/0,87
3,4/0,87
2,9/0,62
7,60 1,80
Propanil 10,61
5,94 1,5/0,03
1,6/0,03
1,1/0,31
3,6/0,29
3,9/0,29
3,6/0,48
10,80 2,12
Fipronil 13,41
4,94 1,3/0,07
1,3/0,07
1,3/0,03
1,5/0,00
1,5/0,00
2,0/0,28
11,66 2,76
Propiconazol I 17,85
1,36 1,3/0,11
1,4/0,07
1,2/0,12
1,9/0,36
1,9/0,36
2,0/0,12
16,60 2,40
Propiconazol II 18,08
1,30 1,3/0,10
1,4/0,03
1,2/0,06
- - -
- -
Trifloxistrobina 18,2 0,90 1,1/0,07
1,1/0,11
1,2/0,10
2,1/0,36
2,0/0,36
1,8/0,21
16,86 2,16
Permetrina cis 23,33
6,00 1,3/0,03
1,3/0,10
1,2/0,09
1,8/0,18
1,9/0,18
1,9/0,16
20,53 2,26
Permetrina trans 23,56
5,84 1,1/0,03
1,2/0,03
1,2/0,08
2,4/0,00
2,4/0,00
1,9/0,13
20,73 2,24
Difenoconazol 26,36
5,94 1,3/0,03
1,5/0,08
1,3/0,04
2,1/0,17
1,9/0,17
2,2/0,26
26,80 3,22
Azoxistrobina 27,18
1,40 1,3/0,12
1,3/0,06
1,2/0,11
2,2/0,23
2,3/0,36
2,2/0,20
34,06 3,44
Utilizando-se um jato quente de 2,1 segundos, a simetria dos picos, em geral,
apresentou melhores resultados em relação aos demais períodos. Cabe acrescentar
que as diferentes durações de jato quente testadas não contribuíram com aumento
de sinal analítico dos compostos.
A diferença de temperatura utilizada entre o forno primário e secundário foi
mantida em 5 °C, visto que, devido aos máximos de temperatura permitidos para
cada coluna, não foi possível variar este parâmetro.
A Figura 20 apresenta o diagrama de cores obtido para os analitos com o
jogo de colunas nº1– DB-5/DB-17ms, onde é possível observar que os picos se
encontram dispersos pelas várias regiões do espaço de separação.
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61
Figura 20. Diagrama de cores obtido para a mistura de padrões na concentração de
100 µg L
-1
no jogo de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms). Condições cromatográficas descritas
na Tabela XII.
1) Triclorfom, 2) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 3) Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6)
Trifloxistrobina, 7A) Permetrina cis, 7B) Permetrina trans, 8) Difenoconazol I e II e 9) Azoxistrobina.
4.2.2. Conjunto de Colunas nº2 (HP-50+/DB-1ms)
Os parâmetros otimizados para esse conjunto de colunas foram período de
modulação, diferença de temperatura entre forno primário e secundário e duração do
jato quente.
Os períodos de modulação testados foram de 2, 4 e 6 s e as diferenças de
temperaturas entre os fornos foram de 5, 20, 30 e 40 °C. Devido à maior resistência
de temperatura da coluna da
2
D, o método anteriormente utilizado para 1D-GC foi
modificado para uma isotérmica final a 280 °C (temperatura limite da HP-50+, no
modo isotérmico) com duração de 30 minutos. Esse aumento de temperatura
possibilitou diminuição no tempo total de análise em relação à 1D-GC, já que os
compostos eluíram em menor tempo de retenção. O P
M
que resultou em melhor
distribuição dos picos cromatográficos no espaço de separação foi o de 4 s.
A variação da diferença de temperatura entre os fornos não contribuiu para
melhor separação dos compostos e também não favoreceu o aumento da
intensidade de sinal dos picos cromatográficos. Entretanto, constatou-se que com
uma diferença de 5 °C entre o forno primário e o secundário, os analitos
2
10
18 27
0
2
4
6
1
2
5
6
8
9
7A
4
3
Tempo de Retenção na
1
D (min)
Tempo de Retenção na
2
D (s)
7B
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
62
distribuíram-se amplamente no espaço de separação, de forma a melhor aproveitá-
lo.
Um terceiro parâmetro otimizado foi a duração do jato quente. Os valores
testados foram de 0,6; 0,8; 1,0; e 1,2 s. De forma geral, não houve melhora na
simetria dos picos, quando se alterou a duração do jato quente. O fator de assimetria
para os picos cromatográficos foi calculado da mesma forma como para o conjunto
de colunas nº1. A Tabela XII apresenta os valores encontrados para os fatores de
assimetria de acordo com a duração de jato quente utilizada, desvio padrão e
tempos de retenção na
1
D e
2
D.
A duração de 0,8 s foi escolhida em função dos valores de assimetria obtidos
ser mais próximos dos valores aceitáveis e por apresentar menor desvio padrão, em
comparação com os outros valores testados. As maiores intensidades dos picos
foram obtidas com a utilização dos jatos quentes com durações de 0,8 e 1,2 s,
sendo que as alturas observadas para os picos cromatográficos foram muito
próximas para esses dois valores. A Figura 21 apresenta o diagrama de cores
obtido com o conjunto de colunas n°2 – HP-50+/DB-1ms para a separação dos nove
compostos.
Figura 21. Diagrama de cores obtido para a mistura de padrões na concentração de
100 µg L
-1
no jogo de colunas n°2 (HP-50+/DB-1ms). Condições cromatográficas descritas
na Tabela XII.
1) Triclorfom, 2) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 3) Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6)
Trifloxistrobina, 7A) Permetrina cis 7B) Permetrina trans, 8) Difenoconazol I e II e 9) Azoxistrobina.
2 10
18
27
35
0
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7A
8
9
Tempo de Retenção na
1
D (min)
Tempo de Retenção na
2
D (s)
7B
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
63
4.2.3. Comparação entre os jogos de colunas DB-5/DB-17ms e HP-50+/DB-1ms
O conjunto de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms) proporcionou melhores resultados
analíticos em relação ao n°2 (HP-50+/DB-1ms) devido ao menor tempo de análise
(29,4 min para o conjunto n°1 e 35,7 min para o conjunto n°2) e melhor resolução
para permetrina (7) (R
s
= 0,72 para o conj. n°1 – Fig. 23 – e R
s
= 0,36 para o conj.
n°2 – Fig. 24). A resolução entre o propiconazol (5) e trifloxistrobina (6) foi de 0,6
para os dois jogos de colunas.
Em relação à assimetria de pico, os valores encontrados para o conjunto n°1
foram significativamente melhores que os obtidos para o conjunto n°2 (Tabela XII).
Idealmente, o fator de assimetria deve situar-se entre 0,8 e 1,2.
83
Para o conjunto
n°1, os valores ficaram entre 1,1 e 1,8 para o jato quente de 2,1 s, sendo que
apenas quatro compostos apresentaram valores de assimetria acima de 1,2
(triclorfom, 3,4,5-tricloroguaiacol, fipronil e difenoconazol). O conjunto n°2 não
apresentou fatores de assimetria satisfatórios, com valores entre 1,5 a 3,6, com a
utilização da melhor duração de jato quente (0,8 s).
Apesar do conjunto n°1 ter proporcionado melhor aproveitamento do espaço
de separação, o conjunto n°2 apresentou picos mais estreitos na
2
D, o que resulta
em um aumento na capacidade de pico e aumento de sensibilidade pelo aumento na
intensidade de sinal analítico. Os picos modulados foram cerca de 8 a 62% mais
estreitos que os obtidos para o conjunto n°1, com exceção do triclorfom e propanil,
que apresentaram picos mais largos, de 31 e 15%, respectivamente.
A maioria dos trabalhos reportados na literatura apresenta o jogo
convencional de colunas (fase estacionária apolar na
1
D e polar na
2
D) como sendo
o que proporciona melhores resultados de análise para agrotóxicos em diversas
matrizes.
91,94
Khummueng e colaboradores
92
avaliaram três conjuntos de colunas
para determinação de fungicidas em vegetais, sendo dois conjuntos de geometria
inversa (fase estacionária polar ou de média polaridade na
1
D e apolar na
2
D) e um
conjunto de geometria convencional. O conjunto de colunas convencional foi
considerado o mais eficiente, pois resultou na separação de todos os compostos
estudados e em bons formatos de pico. Entretanto, Bordajandi e colaboradores
95
verificaram que, para a determinação de organoclorados, os melhores resultados de
separação foram obtidos com conjunto de colunas polar versus não polar, apesar da
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
64
restrição de ortogonalidade caracterizada pela utilização de um conjunto inverso de
colunas.
O conjunto de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms) foi escolhido para o
desenvolvimento do método analítico e sua aplicação, visto que apresentou melhor
aproveitamento do espaço de separação, com ampla distribuição dos analitos na
2
D
(o que é uma característica importante e desejável quando da análise de amostras
complexas), menor tempo de análise e boa simetria para os picos cromatográficos.
4.2.4. Parâmetros de Mérito
4.2.4.1. Linearidade e Curva de Calibração
A Tabela XIV apresenta os parâmetros da curva de calibração obtidos para
os agrotóxicos estudados por GC × GC.
Tabela XIV. Parâmetros da curva de calibração para os compostos estudados por
GC × GC.
a
Soma dos estereoisômeros.
b
Soma dos
isômeros cis e trans.
Através das equações obtidas para as curvas analíticas pode-se observar que
o método proposto apresentou ótima linearidade numa ampla faixa de concentração,
com coeficientes de determinação (r
2
) entre 0,9920 e 0,9993. As curvas obtidas para
cada analito estão apresentadas na Figura 22.
Compostos Equação da Reta r
2
Linearidade (µ
µµ
µg L
-1
)
Propanil y = 0,0023x + 0,0186 0,9992 5 - 295
Fipronil y = 0,0061x + 0,0756 0,9945 5 - 415
Propiconazol
a
y = 0,0044x - 0,0234 0,9920 15 - 295
Trifloxistrobina y = 0,0029x + 0,0061 0,9993 5 - 415
Permetrina
b
y = 0,001x + 0,0013 0,9990 5 - 295
Difenoconazol y = 0,0014x - 0,0058 0,9942 5 - 415
Azoxistrobina y = 0,0027x + 0,0092 0,9963 5 - 415
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
65
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 100 200 300 400 500
Concentração (ug L
-1
)
Área relativa
Figura 22. Curvas analíticas obtidas para os sete agrotóxicos por GC × GC.
Legenda:♦ Azoxistrobina, Difenoconazol, ▲ Fipronil, × Permetrina, Propanil,
Propiconazol, + Trifloxistrobina. Área relativa = Apadrão/Api
4.2.4.2. Precisão
A Tabela XV apresenta os valores obtidos para o coeficiente de variação
(desvio padrão relativo) para o estudo da precisão analítica.
Tabela XV. Avaliação da precisão analítica da GC × GC expressa através do
coeficiente de variação (CV %) para repetitividade e precisão intermediária (n = 8).
Compostos Repetitividade Precisão Intermediária
Área Altura Área Altura
Propanil 1,60 0,78 1,58 1,15
Fipronil 0,85 0,78 1,01 0,82
Propiconazol I 1,22 1,25 0,66 0,83
Propiconazol II 0,64 0,77 0,54 0,81
Trifloxistrobina 1,45 1,08 1,60 1,72
Permetrina cis
2,66 2,38 3,50 3,35
Permetrina trans
2,52 2,74 3,34 3,74
Difenoconazol 1,99 2,96 1,99 2,15
Azoxistrobina 3,78 3,16 2,06 3,62
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66
Para a repetitividade, as áreas dos picos cromatográficos, para os sete
compostos, apresentaram valores de coeficiente de variação de 0,64 a 3,78%. Para
as alturas dos picos, os valores situaram-se entre 0,77 e 3,16%.
Para a precisão intermediária, o coeficiente de variação para a área dos
compostos situou-se entre 0,54 e 3,50% e para as alturas 0,81 e 3,74%. Os tempos
de retenção na
1
D não sofreram variação, enquanto que na
2
D o coeficiente de
variação ficou entre 0,11 e 0,66%.
Tendo em vista que os valores obtidos para repetitividade e precisão
intermediária situaram-se abaixo de 20%, o método cromatográfico proposto para a
determinação dos sete compostos pode ser considerado preciso.
4.2.4.3. Exatidão
A Tabela XVI apresenta os valores encontrados para os testes de
recuperação com três níveis de fortificação.
Tabela XVI. Níveis de recuperação em base seca e coeficiente de variação (CV %)
para os compostos estudados em sedimento.
a
Soma dos estereoisômeros.
b
Soma dos
isômeros cis e trans.
Nível de
fortificação
15 (µ
µµ
µg kg
-1
) 30 (µ
µµ
µg kg
-1
) 150 (µ
µµ
µg kg
-1
)
Analito
Recuperação
(%)
CV
(%)
Recuperação
(%)
CV
(%)
Recuperação
(%)
CV
(%)
Propanil 74 13 67 9 60 20
Fipronil 64 14 67 11 65 18
Propiconazol
a
54 7 61 9 47 18
Trifloxistrobina
40 9 52 9 42 16
Permetrina
b
133 20 52 30 39 23
Difenoconazol 254 15 115 9 92 24
Azoxistrobina 127 14 78 9 62 20
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JULIANA MACEDO DA SILVA
67
O presente método se mostrou eficiente (recuperação entre 50 e 120 % e CV
≤ 20 %) para todos os agrotóxicos, com exceção da permetrina, no nível de
fortificação de 30 µg kg
-1
, pois esse composto apresentou coeficiente de variação de
30%.
Apesar da baixa recuperação obtida para a trifloxistrobina nos níveis de 15 e
150 µg kg
-1
e para o propiconazol em 150 µg kg
-1
, considerou-se o método aplicável
a estes analitos, pois o coeficiente de variação foi menor do que 20%, o que indica
que o método foi repetitivo.
Para os compostos difenoconazol e azoxistrobina houve elevada recuperação
(acima de 120%) que pode ter sido causada por coeluições com interferentes da
matriz, no nível de recuperação de 15 µg kg
-1
. Para o difenoconazol, no nível de
fortificação de 150 µg kg
-1
houve boa recuperação, mas a precisão do método não
foi satisfatória (24%). Para determinação da permetrina o método não foi
considerado satisfatório.
A Figura 23 apresenta os diagramas de cores e o cromatograma
monodimensional para amostra de sedimento fortificada (amostra controle) a 15 µg
kg
-1
.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
68
Figura 23. Cromatogramas da amostra de sedimento fortificada a 15 µg kg
-1
(A)
monodimensional; (B) diagrama de cores do branco da amostra; (C) diagrama de
cores da amostra fortificada. Condições cromatográficas descritas nas Tabelas VI e
XII.
1) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 2) Propanil, 3) Fipronil, 4) Propiconazol I e II, 5) Trifloxistrobina, 6)
Permetrina cis e trans, 7) Difenoconazol I e II e 8) Azoxistrobina.
A Figura 24 apresenta os diagramas tridimensionais e os cromatogramas
reconstruídos da
1
D e
2
D para amostra de sedimento fortificada.
2
4
6
8
10
10
13
16
20
23
26
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
8
7
6
6
(B)
(C)
(A)
4
Intensidade de Sinal (10
5
)
Separação na Segunda Dimensão (s)
Separação na Primeira Dimensão (min)
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
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69
Figura 24. Diagrama tridimensional (3D) com reconstrução dos cromatogramas da
1
D e
2
D: (A) dos padrões na concentração de 200 µg L
-1
,
(B) da amostra fortificada a
15 µg kg
-1
. Condições cromatográficas descritas na Tabela XII.
1) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 2) Propanil, 3) Fipronil, 4) Propiconazol I e II, 5) Trifloxistrobina, 6)
Permetrina cis e trans, 7) Difenoconazol I e II e 8) Azoxistrobina.
As Figuras 28 e 29 propiciam a observação da distribuição dos constituintes
(padrão e amostra) no espaço de separação, confirmando que a utilização da
técnica monodimensional não seria suficiente para obter separação dos analitos com
os constituintes da matriz.
4.2.4.4. Limites de Detecção (LOD), Quantificação (LOQ) e Limite de Detecção
do Método (MDL)
A Tabela XVII apresenta os limites instrumentais de detecção e quantificação
e o limite de detecção do método para os agrotóxicos em estudo.
(A) (B)
7
1
2
3
4
5
6
8
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JULIANA MACEDO DA SILVA
70
Tabela XVII. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) instrumentais
e o MDL para os compostos estudados por GC × GC.
a
Soma dos estereoisômeros.
b
Soma dos
isômeros cis e trans.
Os limites de detecção e quantificação instrumentais variaram de 0,08 a 1,07
µg L
-1
e 0,25 a 3,23 µg L
-1
, respectivamente. Os limites do método variaram de 1,92
a 4,43 µg kg
-1
. Para fins de ilustração, os LMR dos analitos para a matriz arroz
variam de 0,01 a 2 mg kg
-1
,
13
evidenciando que os limites encontrados foram
considerados satisfatórios.
4.3. ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE SEDIMENTOS
Inicialmente, para verificação da aplicabilidade da técnica para determinação
de agrotóxicos em sedimentos, foram realizadas injeções de duas amostras de
pontos localizados na região do rio Santa Maria (RS). Nesta etapa, os extratos das
amostras foram submetidos a um processo de limpeza com Florisil e foram
fortificadas com solução padrão na concentração de 500 µg L
-1
no momento da
injeção. Apesar da obtenção de separação total dos analitos com a técnica
monodimensional, através das injeções de amostra na técnica bidimensional, foi
possível perceber claramente as coeluições dos analitos com os intereferentes da
matriz. A Figura 25 apresenta o cromatograma monodimensional e o diagrama de
cores de uma amostra de sedimento fortificada.
Compostos
LOD (µ
µµ
µg L
-1
) LOQ (µ
µµ
µg L
-1
) MDL (µ
µµ
µg kg
-1
)
Propanil 1,07 3,23 2,95
Fipronil 0,26 0,77 3,06
Propiconazol
a
0,08 0,25 1,92
Trifloxistrobina 0,25 0,74 1,97
Permetrina
b
0,19 0,58 2,44
Difenoconazol 0,64 1,94 4,43
Azoxistrobina 0,35 1,06 2,36
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71
Figura 25. Cromatogramas do extrato da amostra de sedimento (A)
monodimensional – não fortificada; (B) diagrama de cores de uma amostra de
sedimento fortificada com 500 µg L
-1
de mistura dos padrões. Condições
cromatográficas descritas nas Tabelas VI e XII.
1) Triclorfom, 2) 3,4,5-Tricloroguaiacol (PI), 3) Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6)
Trifloxistrobina, 7) Permetrina cis e trans, 8) Difenoconazol I e II e 9) Azoxistrobina. As setas indicam
os interferentes da matriz que coeluem com os analitos na 1D-GC.
Através análise dos cromatogramas da amostra fortificada com compostos
padrão (Figura 25) e dos obtidos por 1D-GC, observa-se que esta última traria
prejuízo à quantificação, caso fossem encontrados os compostos nas amostras,
devido à coeluição dos analitos com constituintes da matriz.
A aplicabilidade do método de extração sem a etapa de limpeza com Florisil
(devido à adsorção irreversível dos compostos na coluna de clean up) foi avaliada
através da análise de duas amostras de sedimentos – SD
1
e SD
2
. Apenas na
amostra SD
2
foram encontrados resíduos dos agrotóxicos trifloxistrobina e
azoxistrobina. Os valores de concentração encontrados divergem nas duas técnicas
de análise. Na 1D-GC, a concentração encontrada da trifloxistrobina foi de 21,18 µg
1
2
3
4
5
6
7
8
9
3
6
10
13
16
20
23
26
2
3
4
1
2
3
4
5
6
Tempo de retenção na
1
D (min)
Tempo de retenção na
2
D (s)
Intensidade de sinal (10
6
)
(A)
(B)
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
72
kg
-1
, enquanto que para GC × GC foi de 3,34 µg kg
-1
, ambas em base seca. Tendo
por base os dados que foram apresentados neste trabalho, supõe-se que a
coeluição da trifloxistrobina com outros componentes da matriz contribuiu para que a
concentração encontrada na 1D-GC fosse maior do que na GC × GC. A
concentração para azoxistrobina ficou abaixo do LOD para as duas técnicas de
análise. A confirmação da presença de um determinado analito em uma amostra
pode ser realizada através do uso do detector de espectrometria de massas ou de
injeções em colunas cromatográficas de mecanismos de separação distintos, caso
não exista a disponibilidade de um detector de espectrometria de massas. Sendo
assim, a confirmação da presença dos resíduos de azoxistrobina e trifloxistrobina foi
realizada através de coinjeções em colunas de fases estacionárias diferentes, com o
conjunto de colunas n°2 (HP-50+/DB-1ms), utilizando-se GC × GC-µECD.
Tanto a azoxistrobina quanto a trifloxistrobina apresentam baixa solubilidade
em água.
39
De acordo com o método de GUS, que leva em consideração os valores
de meia vida no solo e coeficiente de adsorção à matéria orgânica [GUS = (log DT
50
)
x (4 – log K
oc
)],
123
esses compostos não tendem à lixiviação, pois apresentam índice
de GUS < 1,8.
A determinação de agrotóxicos e outros poluentes em sedimentos é de grande
importância, pois são indicadores da qualidade ambiental do corpo hídrico onde se
situa. A investigação desses compostos pode levar a informações relevantes quanto
ao seu destino no ambiente e a má utilização pelos agricultores, já que podem vir a
causar danos a toda uma população que de alguma forma utiliza o recurso hídrico e
ao meio ambiente como um todo.
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JULIANA MACEDO DA SILVA
73
RESUMO DOS
RESULTADOS
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
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74
5. RESUMO DOS RESULTADOS
Na etapa de desenvolvimento de método para 1D-GC, a coluna DB-5
proporcionou melhores resultados dentre as três colunas testadas (DB-5, HP-50+ e
DB-WAXetr). A coluna DB-5 proporcionou menor tempo de análise e melhor
resolução cromatográfica com assimetria de pico satisfatória. A otimização da vazão
do gás de make up indicou um fluxo de 30 mL min
-1
como sendo o ideal, quando
comparado a 60 mL min
-1
, pois as intensidades dos picos cromatográficos foram
maiores, em função da menor diluição dos compostos no detector. Esses dois fluxos
são os recomendados pelo manual do fabricante. A temperatura de injeção pode ser
um parâmetro crítico na determinação de agrotóxicos. Portanto, a verificação da
melhor temperatura de injeção para os compostos estudados foi realizada. Dentre as
três temperaturas testadas (250, 280 e 300 °C), 280 °C foi escolhida por ter
propiciado maior intensidade do sinal cromatográfico do componente fipronil, sendo
que, de forma geral, não ocorreu diferença significativa nas alturas relativas dos
picos dos outros compostos nas temperaturas de 280 e 300 °C.
No desenvolvimento de metodologia por GC × GC foram testados dois
conjuntos de colunas (DB-5/DB-17ms e HP-50+/DB-1ms). Os parâmetros avaliados
na técnica bidimensional foram: período de modulação, diferença de temperatura
entre os fornos e duração do pulso quente. O fluxo de gás de make up utilizado nos
experimentos foi de 150 mL min
-1
(fluxo máximo permitido pelo equipamento), pois
quanto maior o fluxo do gás de make up na determinação de compostos por GC ×
GC-µECD, menor é o efeito de cauda observado nos picos cromatográficos.
89
O
conjunto de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms) proporcionou melhores resultados
analíticos em relação ao n°2 (HP-50+/DB-1ms) devido ao menor tempo de análise
(29,4 min para o conjunto n°1 e 35,7 min para o conjunto n°2) e melhor resolução
para permetrina (R
s
= 0,72 para o conj. n°1 e R
s
= 0,36 para o conj. n°2). A escolha
do período de modulação foi feita de modo que todos os compostos ficassem
distribuídos dentro do espaço de separação. A duração dos jatos quentes utilizada
foi aquela que proporcionou os melhores resultados de assimetria de pico. As
melhores condições de análise obtidas para o conjunto DB-5/DB-17ms foram:
período de modulação de 7 s, duração de pulso quente de 2,1 s e diferença de
temperatura entre forno primário e secundário de 5 °C.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
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75
Em relação ao tempo de análise, as duas metodologias praticamente se
equivalem, com 27,9 min para 1D-GC e 29,4 min para GC × GC. O processo de
validação para as duas técnicas de análise confirmou a maior sensibilidade da GC ×
GC frente à 1D-GC. Os limites de detecção instrumentais para a técnica
bidimensional foram cerca de 36% mais baixos do que os obtidos para a
monodimensional. Os resultados obtidos para o MDL foram bastante próximos, com
valores entre 1,92 e 4,43 µg kg
-1
para a GC × GC, enquanto que para 1D-GC ficaram
entre 1,51 e 5,78 µg kg
-1
. A precisão analítica, expressa em termos de repetitividade
e precisão intermediária foi excelente para as duas técnicas, pois os coeficientes de
variação para área e altura dos picos ficaram abaixo de 20%. A exatidão dos
métodos, verificada através dos testes de recuperação, indicou melhores resultados
para a GC × GC, possivelmente pela maior sensibilidade da técnica e também
devido à menor contribuição das coeluições com componentes da matriz, as quais
puderam ser minimizadas pela maior capacidade de pico da técnica.
Durante a verificação da aplicabilidade do método foram encontrados resíduos
de dois agrotóxicos em uma amostra de sedimento: azoxistrobina e trifloxistrobina. A
azoxistrobina foi encontrada em concentrações abaixo do LOD e a trifloxistrobina em
concentrações de 21,18 µg kg
-1
na 1D-GC e 3,34 µg kg
-1
para GC × GC, ambas em
base seca. Possivelmente, coeluições com interferentes da matriz favoreceram uma
maior concentração da trifloxistrobina na 1D-GC.
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76
CONCLUSÕES
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JULIANA MACEDO DA SILVA
77
6. CONCLUSÕES
Este trabalho possibilita a futura aplicação de dois métodos analíticos
validados para determinação de poluição ambiental em sedimentos influenciados
pela orizicultura no estado. Os resultados obtidos apontam para um número maior
de vantagens analíticas com a utilização da GC × GC-µECD, quando comparada a
GC-µECD para determinação de agrotóxicos em sedimentos localizados em áreas
sob influência da cultura de arroz.
Inicialmente, a proposta do trabalho era desenvolver e validar os métodos de
análises para oito compostos. Contudo, devido a eluição do triclorfom ser muito
próxima ao do solvente, optou-se em retirar esse agrotóxico do processo de
validação. Através desse processo foi possível verificar que o método foi satisfatório
apenas para dois compostos, permetrina e azoxistrobina, por 1D-GC. Para GC ×
GC, o processo de validação indicou que o método apenas não foi satisfatório para a
permetrina.
Verificou-se maior sensibilidade da GC × GC em relação à técnica
monodimensional, tendo aquela apresentado melhores limites de detecção e
exatidão analítica. Os LOD foram, em média, cerca de 36% mais baixos do que os
da 1D-GC e os testes de recuperação indicaram maiores faixas aceitáveis de
recuperação com boa precisão.
O uso da GC × GC para análise das amostras de sedimentos evidenciou
também a maior seletividade e capacidade de pico desta técnica relativamente a 1D-
GC para a separação e quantificação dos analitos com menor probabilidade de
interferência de constituintes da matriz. Uma clara demonstração disto é a
quantificação da trifloxistrobina em amostra de sedimento nas concentrações de
21,18 µg kg
-1
na 1D-GC e 3,34 µg kg
-1
para GC × GC, onde se verificou a
capacidade de separação de interferentes em coeluição com os analitos
providenciada pela técnica bidimensional.
Estas vantagens tornam possível o uso de um detector seletivo, como o
µECD para determinação desses compostos em sedimentos, tornando-o uma
alternativa interessante comparativamente ao emprego de um GC/MS no modo SIM,
visto que os riscos de coeluição são minimizados, os custos de ambos os
equipamentos são semelhantes e o µECD apresenta maior sensibilidade.
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JULIANA MACEDO DA SILVA
78
REFERÊNCIAS
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GERADA
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
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8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA GERADA
8.1. TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS
- Silva, J. M.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.; Desenvolvimento e Validação de Método
Multirresíduo para Determinação de Agrotóxicos em Sedimento por GC-µECD. XVII
Encontro de Química da Região Sul, 2009. Rio Grande, Brasil.
- Silva, J. M.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.; Desenvolvimento e Validação de
Metodologia Analítica para Determinação de Agrotóxicos em Sedimento por GC ×
GC-µECD. 15º Encontro Nacional de Química Analítica e 3º Congreso
Iberoamericano de Química Analítica, 2009. Salvador, Brasil.
- Silva, J. M.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.; Desenvolvimento de Método para
Determinação de Agrotóxicos por Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente
(GC × GC-µECD). 32
a
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2009.
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- Silva, J. M.; Borowski, J.; Machado, M. E.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.; Estudo
Comparativo entre GC-µECD e GC × GC-µECD na Determinação de Oito
Agrotóxicos em Sedimentos de Lavoura de Arroz. XII - Congresso Latino-Americano
de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008. Florianópolis, Brasil.
8.2. TRABALHO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO
- Silva, J. M.; Canizares, E. M. P. N.; Leal, K. A.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.;
Desenvolvimento de Métodos Analíticos para Determinação de Agrotóxicos em
Sedimentos por Cromatografia Gasosa Monodimensional e Bidimensional
Abrangente com Micro Detector de Captura de Elétrons. Química Nova. Aceito em
11/08/2009. Anexo 1.
8.3. TRABALHO ENVIADO PARA PUBLICAÇÃO
- Silva, J. M.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.; Aplicação da Cromatografia Gasosa
Bidimensional Abrangente com Micro Detector de Captura de Elétrons para
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
88
Determinação de Agrotóxicos em Sedimentos. Química Nova. Enviado em
15/10/2009. Anexo 2.
8.4. OUTRAS PUBLICAÇÕES
- Abad, F. C.; Winck P. R.; Silva, J. M.; Caramão, E. B.; Zini, C. A.; Multiresidue
Determination of Pesticides in Carrots using Pressurized Liquid Extraction and Gas
Chromatography with Mass Spectrometry Detector. Journal of Brazilian Chemical
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Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
89
ANEXO 1. TRABALHO ACEITO PARA
PUBLICAÇÃO
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
90
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE
AGROTÓXICOS EM SEDIMENTOS POR CROMATOGRAFIA GASOSA
MONODIMENSIONAL E BIDIMENSIONAL ABRANGENTE COM MICRO
DETECTOR DE CAPTURA DE ELÉTRONS
Juliana Macedo da Silva, Cláudia Alcaraz Zini e Elina Bastos Caramão*.
Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Av. Bento
Gonçalves, 9500; CEP: 91501-970, Porto Alegre – RS, Brasil.
Ewelin Monica Paturi Navarro Canizares, Karen Alam Leal
Fundação Estadual de Proteção Ambiental Henrique Luiz Roessler (FEPAM) – Rua
Aurélio Porto, 37; CEP: 90620-090, Porto Alegre – RS, Brasil.
*e-mail: [email protected]
DEVELOPMENT OF ANALYTICAL METHODS FOR PESTICIDES IN SEDIMENTS
BY MONODIMENSIONAL AND COMPREHENSIVE TWO-DIMENSIONAL GAS
CHROMATOGRAPHY WITH MICRO ELECTRON-CAPTURE DETECTION
Abstract
The development of analytical methods for determination of eight pesticides of
different chemical classes (trichlorfon, propanil, fipronil, propiconazole, trifloxystrobin,
permethrin, difenoconazole and azoxystrobin) in sediments with gas
chromatography-micro-electron capture detector (GC-µECD) and comprehensive
two-dimensional gas chromatography (GC×GC-µECD) is described. These methods
were applied to real sediment samples, and the best results were obtained using a
5% diphenyl-methylpolysiloxane column for 1D-GC. For GC×GC the same column
was employed in the first dimension and a 50%-phenyl-methylpolysiloxane stationary
phase was placed in the second dimension. Due to the superior peak capacity and
selectivity of GC×GC, interfering matrix peaks were separated from analytes,
showing a better performance of GC×GC.
Keywords: pesticides, GC×GC, µECD.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
91
INTRODUÇÃO
O homem vem usufruindo os recursos naturais sem levar em consideração
todo o cuidado necessário com sua reposição ou preservação e, com isso, muitos
recursos hídricos se encontram em situação precária, seja pela atividade agrícola ou
por outras atividades antrópicas. A utilização de agrotóxicos na agricultura vem
obtendo cada vez mais destaque no cenário mundial. O Brasil, que até 2007 era o
quarto colocado no consumo desses compostos, em 2008 passou a ocupar o
segundo lugar, considerando o consumo de dez países que contribuem com 70% do
consumo mundial.
1
Os agrotóxicos pertencem à classe dos poluentes ambientais mais estudados
atualmente e sua determinação em diferentes matrizes se torna cada vez mais
necessária devido à relação direta entre saúde e qualidade ambiental. Nesse
contexto, o desenvolvimento de técnicas de separação, identificação e quantificação
desses compostos ganha grande destaque para que os limites de detecção e
quantificação de tais métodos sejam cada vez menores e contemplem os limites
máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pelos órgãos competentes. Atualmente, a
Cromatografia Gasosa é a técnica mais utilizada para a determinação desses
compostos em diferentes matrizes.
2
A cromatografia líquida de alta eficiência tem sido intensamente aplicada na
pesquisa de resíduos em diferentes matrizes devido à capacidade de detectar
compostos termicamente instáveis e não voláteis, que não são identificados por
cromatografia gasosa.
A literatura científica apresenta alguns artigos de revisão em
que o potencial desta técnica acoplada a espectrometria de massas é discutida.
Devido ao grande poder de separação para análise de matrizes complexas, a
técnica é considerada sensível e seletiva e provê identificação segura em baixas
concentrações para diferentes analitos.
3,4
Porém, para amostras complexas,
contendo de 150 a 250 compostos de interesse, por exemplo, a separação obtida
por cromatografia gasosa ou líquida, com uma única coluna, não é suficiente para
separação de todos os compostos. Outras técnicas multidimensionais como GC-GC
(Cromatografia Gasosa Bidimensional de Frações Parciais ou de heartcut), HPLC-
GC (Cromatografia Líquida acoplada à Cromatografia Gasosa) e SFC-GC
(Cromatografia de Fluido Supercrítico acoplada à Cromatografia Gasosa) não
produzem também a separação efetiva de todos os analitos.
5,6
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
92
A Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×GC) é uma técnica
relativamente recente, idealizada em 1991 por Phillips
7
e apresenta grande poder de
separação. Na GC×GC, geralmente, duas colunas cromatográficas de diferentes
mecanismos de retenção são acopladas em série, sendo a primeira de dimensões
convencionais e a segunda mais curta, do tipo fast-GC. O modulador é considerado
o “coração” da técnica e é acoplado entre as duas colunas, tendo a função de
amostrar e focalizar as estreitas frações eluídas da primeira coluna e, em seguida,
liberar estas porções, rapidamente, para a segunda coluna. O termo “abrangente” é
utilizado para designar que todo o efluente da primeira dimensão, ou uma parte
representativa do mesmo seja introduzido na segunda dimensão (
2
D), sem perda
das características da separação na
1
D (primeira dimensão). Os princípios da
GC×GC, aspectos instrumentais, nomenclatura e aplicações a diversas matrizes
encontram-se abordados na literatura científica.
8-12
Mondello e colaboradores
13
descrevem a GC×GC como sendo uma das
inovações mais revolucionárias na cromatografia gasosa. Os autores também
afirmam que, provavelmente, a diferença do poder de separação entre a GC×GC e a
1D-GC seja ainda maior do que a diferença existente entre as colunas capilares e
empacotadas. Em geral, a GC×GC apresenta quatro vantagens sobre a 1D-GC: (1)
aumento de resolução, (2) aumento de sensibilidade devido à re-concentração da
banda do soluto durante o processo de modulação, favorecendo a detecção de
componentes em nível de traços, (3) construção de cromatograma 2D
(bidimensional) com estruturação por compostos quimicamente similares e (4)
aumento da capacidade de pico, pois a retenção nas duas colunas através de
diferentes mecanismos de interação analito – fase estacionária, faz com que a
capacidade teórica de pico na GC×GC se aproxime do produto das capacidades de
pico das duas dimensões.
6,13,14
Uma conseqüência importante da utilização dos agrotóxicos na agricultura é a
possível presença de resíduos desses compostos e de seus metabólitos em
alimentos. Investigação sobre o poder de separação da GC×GC/TOFMS (TOFMS,
detector de espectrometria de massas com analisador por tempo de vôo - do inglês
“Time-of-Flight Mass Spectrometry”) para determinação de 58 compostos da classe
dos organofosforados e nitrogenados em amostras alimentícias foi realizado por
Dallüge e colaboradores.
15
Os autores observaram que a determinação de alguns
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
93
compostos por 1D-GC/TOFMS seria prejudicada em função da coeluição com
interferentes da matriz, já que o espectro de massas obtido pela deconvolução
espectral ou pela subtração da linha de base não é claro o suficiente para
proporcionar a identificação dos analitos de interesse. Em outro estudo de
otimização de metodologia para determinação de 51 agrotóxicos em uva, Banerjee e
colaboradores
16
verificaram que a sensibilidade da análise por GC×GC /TOFMS foi
consideravelmente aumentada quando comparada a 1D-GC/TOFMS. A GC×GC
ainda proporcionou a separação cromatográfica de alguns compostos que coeluem
quando analisados por GC/MS; embora estes tenham sido identificados por
deconvolução espectral na cromatografia monodimensional. Além disso, a GC×GC
possibilita a obtenção de espectros de massas mais nítidos, evitando assim a
possível confirmação de falsos positivos. O aumento de sensibilidade analítica da
GC×GC-NPD quando comparada a GC-NPD, para análise de vegetais, foi verificado
por Khummueng e colaboradores, visto que a soma das alturas dos picos
cromatográficos obtidos pela técnica bidimensional abrangente foi cerca de 20 vezes
maior do que as obtidas na técnica monodimensional.
18
O potencial da GC×GC-µECD foi verificado por Bordajandi e colaboradores
18
através de desenvolvimento de método para determinação de poluentes quirais
como toxafeno em óleo de peixe. O método descrito para determinação de cinco
congêneros do toxafeno com coluna enantiosseletiva na
1
D providenciou completa
separação dos isômeros, enquanto que para a 1D-GC, com a mesma coluna
enantiosseletiva, ocorreu sobreposição de dois compostos. Além disso, a GC×GC
possibilitou excelente separação entre os compostos estudados e os interferentes da
matriz complexa.
Korytár e colaboradores
19
avaliaram a separação de doze diferentes classes
de poluentes, dentre eles agrotóxicos da classe dos organoclorados e toxafeno, por
GC×GC-µECD. Nesse estudo foram utilizados cinco conjuntos de colunas, sendo
que em todas as combinações a fase estacionária apolar 100% dimetilpolisiloxano
(DB-1) ou semelhante foi empregada para a separação na
1
D. A fase estacionária
constituída de 65% fenil-metilpolisiloxano (007-65HT) proporcionou melhor
separação para os agrotóxicos organoclorados e também possibilitou a ordenação
estrutural dos congêneros do toxafeno, baseada no número de substituintes
clorados. A fase estacionária contendo 70 a 90% de grupos ciano (VF-23ms)
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
94
proporcionou excelente separação na
2
D para os organoclorados e toxafeno, embora
não tenha sido possível visualizar a separação de todas as doze classes estudadas.
Para avaliar o potencial da técnica, os autores determinaram dibenzodioxinas e
dibenzofuranos policlorados (PCDD/F) em amostras de sedimentos e éteres
difenílicos polibromados (PBDEs) e alcanos policlorados (PCAs) em amostras de
poeira.
O número de publicações científicas contemplando a determinação de
agrotóxicos por GC×GC ainda é relativamente pequeno, mas suficiente para
demonstrar as potenciais vantagens da técnica em relação a 1D-GC.
20
Não é do
conhecimento destes autores a existência de artigos publicados envolvendo a
determinação de agrotóxicos por GC×GC-µECD em sedimentos.
Este estudo tem por objetivo o desenvolvimento de métodos analíticos por
1D-GC e GC×GC-µECD para a determinação de oito agrotóxicos de diferentes
classes químicas em sedimentos de rios provenientes de regiões sob influência da
cultura do arroz, utilizados no estado do Rio Grande do Sul, uma vez que o mesmo é
responsável por 61% da produção desse cereal no país.
1
Estes níveis de produção
são alcançados através do intenso uso de agrotóxicos durante o plantio.
PARTE EXPERIMENTAL
Os Sedimentos e Agrotóxicos Estudados
Para os estudos qualitativos, como verificação da complexidade da matriz,
foram analisadas duas amostras de sedimentos de pontos localizados em diferentes
bacias hídricas: Rio Gravataí (latitude sul = 29° 56’ 10” e longitude oeste = 50° 36’
05”) e Rio Santa Maria (latitude sul = 30° 52' 15" e longitude oeste = 55° 20' 57").
Foram coletados em média 1 kg de sedimento com auxílio de pá de aço inoxidável,
próximo à margem e em locais de deposição de partículas finas e de pouca
profundidade. Os sedimentos foram armazenados em frascos de vidro e
transportados a 4 °C até o laboratório, onde foram congelados a –18 °C em freezer
antes do processo de extração.
Os compostos estudados foram triclorfom, propanil, fipronil, propiconazol,
trifloxistrobina, permetrina, difenoconazol e azoxistrobina (pureza > 97%, Sigma-
Aldrich, Seelze, Alemanha). Estes agrotóxicos são largamente empregados na
agricultura, mais especificamente na cultura do arroz da região do Rio Santa Maria
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
95
no estado do Rio Grande do Sul.
21,22
A química Ewelin Canizares, da FEPAM,
realizou pesquisa com os agricultores e com os trabalhadores que fazem a aplicação
desses compostos na lavoura, bem como com a EMBRAPA para embasar a escolha
dos agrotóxicos. A Tabela 1 apresenta algumas características e estruturas
químicas dos compostos estudados.
TABELA 1
Extração das Amostras de Sedimentos
O processo de extração empregado está baseado no método reportado por
You e colaboradores.
23
A água residual presente no sedimento foi retirada e o
mesmo foi homogeneizado. Em seguida, foi parcialmente seco ao ar, à temperatura
ambiente, em vidros de relógio. Para a etapa de extração, foram pesados 20 g de
sedimento e adicionados a este, 40 g de sulfato de sódio anidro (Quimex, SP,
Brasil), procedendo-se à homogeneização do material. Uma alíquota de 50 mL de
uma solução 50:50 v/v de acetona:diclorometano foi adicionada à amostra, e esta foi
submetida à extração em 3 ciclos de 15 min no banho de ultra-som Maxiclean
(Unique, Indaiatuba, SP, Brasil) com potência de 120 Watts. A etapa de purificação
(clean up) foi realizada em colunas de vidro de 30 cm de altura por 14 mm de
diâmetro interno, contendo 10 g de Florisil (60-100 mesh; T.J. Baker, Phillipsburg,
EUA) ativado a 90°C por 12 horas e, posteriormente, parcialmente desativado com
água destilada (6% m/v). No topo da coluna foi colocado aproximadamente 1 cm de
sulfato de sódio anidro para reter qualquer umidade residual. A eluição dos analitos
foi realizada com 50 mL de solução 30% de éter etílico em hexano. O extrato foi
levado à secura e o resíduo final dissolvido com 1,5 mL de hexano. Todos os
solventes utilizados para extração são grau analítico (Vetec, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil) e bidestilados.
Desenvolvimento dos Métodos Cromatográficos
As análises por 1D-GC e GC×GC foram realizadas em um cromatógrafo
Agilent 6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) com µECD, equipado com
amostrador automático Combi PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Suíça). O
cromatógrafo também possui um forno secundário (LECO, St. Joseph, MI, EUA)
utilizado nas análises por GC×GC e um modulador térmico de dois estágios com
quatro jatos (quad jet) de N
2
(dois jatos quentes e dois frios que são resfriados por
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
96
N
2
líquido). Durante o desenvolvimento dos métodos foram utilizadas colunas
cromatográficas de diferentes fases estacionárias que estão apresentadas na
Tabela 2. Outros parâmetros experimentais que influenciam na análise dos
compostos estudados, tais como programação de temperatura do forno, temperatura
do injetor (250, 280 e 300 °C) e fluxo de gás de make up (N
2,
99,999%, Linde Gás)
foram otimizados para a análise por GC–µECD. O fluxo de gás de arraste (H
2
,
99,999%, Linde Gás) utilizado nos experimentos foi de 2 mL min
-1
. A partir dos
melhores resultados obtidos para a 1D-GC, parâmetros como período de
modulação, diferença de temperatura entre forno primário e secundário e duração do
jato quente foram otimizados para as análises por GC×GC-µECD, utilizando-se
diferentes jogos de colunas.
TABELA 2
Para a verificação dos tempos de retenção dos analitos, foi realizada a injeção de
solução padrão contendo os nove compostos (oito agrotóxicos e um padrão interno -
3,4,5-tricloroguaiacol para posterior estudo quantitativo), na concentração de 100 µg
L
-1
. As soluções padrão estoque foram preparadas pesando-se os agrotóxicos em
frascos individuais em balança analítica de precisão (Shimadzu, AY220, Quioto,
Japão) e dissolvendo-os em acetato de etila grau HPLC (Mallincrrodt, Phillipsburg,
EUA) em balões volumétricos de 5 mL, previamente silanizados. As diluições
posteriores foram também feitas em balões volumétricos de 5 mL e em acetato de
etila, utilizando-se micropipeta (Brand, Wertheim, Alemanha) para coleta das
alíquotas. Todas as soluções foram guardadas em freezer à –18 °C m frascos de
vidro âmbar silanizados. As injeções foram realizadas com volume de 1 µL, sem
divisão de fluxo e com pulso de pressão de 60 psi. Durante todas as análises, a
temperatura do detector foi mantida entre 20-25 °C acima da temperatura mais alta
do forno, a fim de evitar e/ou diminuir o efeito de cauda nos picos e manter a célula
do detector limpa.
24
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Cromatografia Gasosa Monodimensional (1D-GC)
Inicialmente foram feitos testes para verificar a influência do gás de make up
(N
2
) na resposta do detector aos diferentes agrotóxicos, empregando-se para isto a
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
97
coluna HP-50+. Os fluxos testados foram de 30 e 60 mL min
-1
, que são os
recomendados pelo manual do fabricante.
24
A condição de 30 mL min
-1
foi
considerada a mais apropriada devido à obtenção das melhores intensidades de
sinal para os agrotóxicos em estudo e, por esta razão, nos experimentos posteriores
essa condição foi mantida. A diminuição de fluxo de gás de make up faz com que o
efeito de diluição dos compostos no detector seja minimizado, com conseqüente
diminuição na largura da base dos picos, proporcionando melhor desempenho no
processo cromatográfico. A partir dessa condição foram realizadas injeções sem
divisão de fluxo com pulso de pressão de 60 psi com diferentes períodos de
duração, a fim de se obter uma transferência mais rápida da banda cromatográfica
para o interior da coluna, bem como conseqüente estreitamento e aumento de
intensidade da mesma.
25
A literatura reporta algumas vantagens da utilização da
injeção com pulso de pressão, tais como o aumento da velocidade de transferência
de analitos com elevado ponto de ebulição e de compostos que possam ser
adsorvidos no injetor, redução do tempo de residência da amostra no injetor,
aumento da capacidade do mesmo, em função do volume de vapor ser
inversamente proporcional a pressão.
26
Verificou-se que a eluição do triclorfom
durante o pulso de pressão faz com que a intensidade de sinal deste pico aumente
desproporcionalmente em relação aos demais analitos, podendo também ocorrer
coeluição do triclorfom com o pico cromatográfico do solvente. A escolha de um
pulso de pressão cuja duração seja apropriada (36,6 s para HP-50+ e DB-WAXetr;
29,4 s para DB-5) resulta em um gerenciamento adequado destes fenômenos,
proporcionando uma condição cromatográfica satisfatória. As três colunas utilizadas
para os experimentos apresentam dimensões idênticas, mas fases estacionárias
diferenciadas, o que implica em tempos de retenção distintos para os analitos e
solvente em cada fase.
Outras duas fases estacionárias foram utilizadas na 1D-GC e diversos testes
de programação de temperatura do forno foram testados. A Tabela 3 apresenta as
condições analíticas que resultaram na melhor performance cromatográfica para
cada coluna capilar empregada. A DB-5 foi a coluna cromatográfica que permitiu a
melhor separação de todos os compostos em um menor tempo de análise.
TABELA 3
Sabendo-se que a DB-5 apresenta maior resistência a temperaturas elevadas
do que a HP-50+ (325 e 280 °C em condição isotérmica, respectivamente), foram
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
98
realizados testes com três diferentes temperaturas de injeção – 250, 280 e 300 °C –
a fim de verificar a influência deste parâmetro no sinal cromatográfico obtido para os
compostos em estudo. De acordo com a Figura 1, os dados indicaram que, de
forma geral, não há diferença significativa nas alturas relativas dos picos nas
temperaturas de 280 e 300 °C. Contudo, a temperatura de 280 °C foi escolhida por
ter propiciado maior intensidade do sinal cromatográfico do componente fipronil.
Zhang e colaboradores
27
também verificaram que ocorre uma melhora do sinal
cromatográfico para vários analitos, quando da utilização de temperaturas mais
elevadas no injetor.
FIGURA 1
Em função da baixa temperatura máxima de trabalho em condição isotérmica
para a coluna DB-WAXetr, de fase estacionária 100% polietilenoglicol, observou-se
que, mesmo após 180 min a 235 °C, não houve a eluição de dois dos compostos -
difenoconazol e azoxistrobina - os quais possuem massas moleculares maiores do
que as dos demais analitos (406,2 g mol
-1
e 403,4 g mol
-1
, respectivamente). Tal fato
inviabiliza o uso da DB-WAXetr. Além da dificuldade de eluição destes compostos,
constatou-se que essa coluna possivelmente provocou sorção parcial dos
compostos, devido à sua alta polaridade. Isto pode ser observado através da baixa
intensidade dos sinais cromatográficos, quando comparados àqueles obtidos em
análises feitas com as mesmas soluções em outras fases estacionárias.
O uso da DB-5 oferece vantagens em relação à HP-50+, pois além de
proporcionar menor tempo de análise na separação dos nove compostos (27,9 min e
61,1 min, respectivamente), ainda oferece melhor resolução na separação dos picos
cromatográficos, com exceção do propiconazol II e do trifloxistrobina que
apresentaram resolução de 1,26 e 2,04 para DB-5 e HP-50+, respectivamente. A
coluna DB-5 também proporcionou a separação dos dois isômeros do difenoconazol
com resolução de 0,89, enquanto que na HP-50+ estes dois isômeros coeluem. Isto
se deve às diferenças nas interações entre analito e fase estacionária e também ao
fato de a DB-5 permitir o emprego de uma temperatura máxima maior (300 °C) na
análise cromatográfica do que a temperatura máxima da HP-50+(255 °C).
O fator de assimetria
(
)
s
A de um pico cromatográfico está diretamente
relacionado à eficiência cromatográfica. Fatores de assimetria entre 0,8 e 1,2 são
considerados satisfatórios, com pouca ou nenhuma influência de cauda nos picos
cromatográficos. Tanto a HP-50+ quanto a DB-5 apresentaram, em geral, valores
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
99
satisfatórios de assimetria. A Tabela 4 apresenta os fatores de assimetria para os
picos cromatográficos e os tempos de retenção obtidos para os compostos
estudados. Esse fator foi calculado utilizando-se a razão entre as larguras B e A a
10% da altura do pico, conforme Figura 2.
28
FIGURA 2
À luz dos resultados obtidos para os vários testes realizados com as três
colunas cromatográficas, a DB-5 foi escolhida por sua melhor performance.
TABELA 4
Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GC×
××
×GC)
De acordo com Kristenson e colaboradores,
29
quanto maior o fluxo do gás de
make up na determinação de compostos por GC×GC-µECD, menor é o efeito de
cauda observado nos picos cromatográficos. Contudo o efeito de diluição dos
compostos no detector é maior. Tendo por base os resultados destes pesquisadores
e também de outros,
18, 30
o fluxo de nitrogênio
utilizado para todos os experimentos
foi de 150 mL min
-1
, que é o fluxo máximo permitido pelo equipamento. A Tabela 5
apresenta as melhores condições de análise obtidas para a GC×GC.
TABELA 5
Parâmetros como período de modulação e duração dos jatos quentes foram
testados para todos os conjuntos de colunas. Os máximos períodos testados para a
duração do jato quente foram de 30% do período de modulação. A Tabela 6
apresenta os tempos de retenção na primeira e segunda dimensões, obtidos para os
analitos com a utilização dos diferentes jogos de colunas, bem como os fatores de
assimetria encontrados para as diferentes durações de jato quente. O texto a seguir
discute os resultados obtidos.
TABELA 6
Conjunto de colunas nº1 (DB-5/DB-17ms)
Inicialmente, foram testados diferentes períodos de modulação (P
M
): 2, 4, 6, 7
e 8 s. Destes, foi escolhido 7 s, pois neste P
M
foi observada a melhor distribuição de
picos no diagrama de cores. A duração do jato quente é um fator importante na
análise, pois pode influenciar no formato e intensidade dos picos.
31
Com isso, foram
testadas diferentes durações do jato, tais como 0,6 s (valor padrão de operação do
equipamento); 1,4; 1,75 e 2,1 s. Os fatores de assimetria para esse conjunto de
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
100
colunas foram calculados levando-se em consideração o pico modulado mais
intenso.
17
Para uma duração de 0,6 s, a simetria dos picos no diagrama de cores é
bastante distorcida, fazendo com que ocorra coeluição parcial entre alguns
compostos e, portanto, o fator de assimetria não foi calculado para esse parâmetro.
Com a utilização de uma duração de jato quente de 2,1 s, houve melhoria da
simetria dos picos relativamente aos demais períodos testados. Cabe acrescentar
que as diferentes durações de jato quente testadas não contribuíram com aumento
de sinal analítico dos compostos.
A diferença de temperatura utilizada entre o forno primário e secundário foi
mantida em 5 °C, visto que, devido aos máximos de temperatura permitidos para
cada coluna, não foi possível variar este parâmetro.
Conjunto de colunas nº2 (HP-50+/DB-1ms)
Os períodos de modulação testados foram de 2, 4 e 6 s e as diferenças de
temperaturas entre os fornos foram de 5, 20, 30 e 40 °C. Devido à maior resistência
de temperatura da coluna da
2
D (DB-1ms), o método anteriormente utilizado para
1D-GC foi modificado ao final para uma isoterma a 280 °C (temperatura limite da
HP-50+, no modo isotérmico) com duração de 30 min. Esse aumento de temperatura
possibilitou diminuição no tempo total de análise em relação à 1D-GC, já que os
compostos eluíram em menor tempo de retenção. O P
M
que resultou em melhor
distribuição dos picos cromatográficos no espaço de separação foi o de 4 s. A
variação da diferença de temperatura entre os fornos não contribuiu para melhor
separação dos compostos e também não favoreceu o aumento da intensidade de
sinal dos picos cromatográficos. Entretanto, constatou-se que com uma diferença de
5 °C entre o forno primário e o secundário, os analitos distribuíram-se amplamente
no espaço de separação, de forma a melhor aproveitá-lo.
Um terceiro parâmetro otimizado foi a duração do jato quente. Os valores
testados foram de 0,6; 0,8; 1; e 1,2 s. De forma geral, não houve melhoria na
simetria dos picos, quando se alterou a duração do jato quente, sendo que esse
fator foi calculado da mesma forma como para o conjunto de colunas nº1. Nenhum
dos valores testados contribuiu para a obtenção de bons resultados para a simetria.
Em relação à altura dos picos, as maiores intensidades foram obtidas com a
utilização dos jatos quentes com durações de 0,8 e 1,2 s, sendo que as alturas
observadas foram muito próximas para esses dois valores. A duração de 0,8 s foi
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
101
escolhida em função dos valores de assimetria obtidos serem mais próximos dos
valores aceitáveis e por apresentar menor desvio padrão, em comparação co os
outros valores testados.
Comparação entre os jogos de colunas DB-5/DB-17ms e HP-50+/DB-1ms
O conjunto de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms) proporcionou melhores resultados
analíticos em relação ao n°2 (HP-50+/DB-1ms) devido ao menor tempo de análise
(29,4 min para o conjunto n°1 e 35,7 min para o conjunto n°2) e melhor resolução
para permetrina (R
s
= 0,72 para o conj. n°1 e R
s
= 0,36 para o conj. n°2). A
resolução entre o propiconazol e trifloxistrobina foi de 0,6 para os dois jogos de
colunas. Diferentemente da 1D-GC, na GC×GC mais de dois picos podem ser
considerados como vizinhos de um determinado analito e este novo conceito de
vizinhança foi introduzido por Schure,
32
que foi o primeiro autor a propor a
abordagem relacionada a teoria da razão vale-pico para cromatografia
bidimensional. Para tanto, utiliza-se a distância entre os máximos de dois picos, o
ponto de menor intensidade na reta entre estes dois picos e os valores de
intensidade nesses três pontos. Contudo, essa abordagem é válida apenas para
picos gaussianos. Peters e colaboradores
33
propuseram uma abordagem para
cálculo de resolução baseada na teoria da razão vale-pico (monodimensional), a
qual pode ser aplicada tanto para picos gaussianos, quanto não gaussianos. Por
outro lado, Adam e colaboradores
34,35
calcularam a resolução em GC×GC como
sendo a média euclidiana das resoluções em cada uma das duas dimensões. Neste
trabalho, as resoluções foram calculadas de acordo com esta última abordagem.
Em relação ao fator de assimetria dos picos, o conjunto n°1 apresentou
melhores resultados, com valores entre 1,1 e 1,8 para o jato quente de 2,1 s, sendo
que apenas quatro compostos apresentaram valores de assimetria acima de 1,2
(triclorfom, tricloroguaiacol, fipronil e difenoconazol). O uso do conjunto n°2 não
resultou em fatores de assimetria satisfatórios, apresentando valores entre 1,5 a 3,6.
Apesar do conjunto n°1 ter proporcionado maior aproveitamento do espaço de
separação, o conjunto n°2 apresentou picos mais estreitos na
2
D, o que resulta em
aumento de sensibilidade pelo aumento na intensidade de sinal analítico e,
eventualmente, aumento na capacidade de pico. Os picos modulados foram cerca
de 8 a 62% mais estreitos que os obtidos para o conjunto n°1, com exceção do
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
102
triclorfom e propanil, que apresentaram picos mais largos, de 31 e 15%,
respectivamente.
A maioria dos trabalhos reportados na literatura apresenta o jogo
convencional de colunas (fase estacionária apolar na
1
D e polar na
2
D) como sendo
o que proporciona melhores resultados de análise para agrotóxicos em diversas
matrizes.
16,36
Khummueng e colaboradores
17
avaliaram três conjuntos de colunas
para determinação de fungicidas em vegetais, sendo dois conjuntos de geometria
inversa (fase estacionária polar ou de média polaridade na
1
D e apolar na
2
D) e um
conjunto de geometria convencional. O conjunto de colunas convencional foi
considerado o mais eficiente, pois resultou na separação de todos os compostos
estudados e em bons formatos de pico. Entretanto, Bordajandi e colaboradores
30
verificaram que, para a determinação de organoclorados, os melhores resultados de
separação foram obtidos com conjunto de colunas polar versus não polar, apesar da
restrição de ortogonalidade caracterizada pela utilização de um conjunto inverso de
colunas. Em concordância com a maior parte dos estudos relatados anteriormente, o
conjunto de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms) apresentou melhor aproveitamento do
espaço de separação, com ampla distribuição dos analitos na
2
D, o que é uma
característica importante e desejável quando da análise de amostras complexas.
Análise de Amostras Reais de Sedimentos
A aplicabilidade dos métodos por 1D-GC com a coluna DB-5 e GC × GC com o
jogo de colunas n°1 (DB-5/DB-17ms) foi investigada através da análise de duas
amostras de sedimentos. Em nenhuma das amostras foi verificada a presença dos
analitos estudados, mas percebe-se claramente, através do cromatograma de uma
amostra fortificada com compostos padrão (Figura 3), que a análise por 1D-GC
traria prejuízo à quantificação, caso fossem encontrados os analitos nas amostras,
devido à coeluição dos mesmos com constituintes da matriz.
FIGURA 3
Uma das técnicas mais empregadas para separação e análise quantitativa de
agrotóxicos em sedimentos é a GC/MS no modo monitoramento de íon selecionado
(SIM). Neste caso, mesmo no modo SIM, é possível que ocorram coeluições com
interferentes que apresentam em sua estrutura os íons escolhidos para o
monitoramento dos analitos. A separação em duas dimensões, proporcionada pela
GC × GC, minimiza a possibilidade de coeluições. Em estudo realizado por Smalling
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
103
e colaboradores
37
para determinação de agrotóxicos em sedimento foram
verificados os limite de detecção instrumentais para oitenta e cinco agrotóxicos, por
GC-µECD e GC/MS. Os resultados obtidos mostraram a grande sensibilidade da
GC-µECD, pois os limites de detecção foram mais baixos para essa técnica (0,5 a 1
µg Kg
-1
para GC-µECD e 1 a 2 µg Kg
-1
para GC/MS).
A maior seletividade e capacidade de pico do sistema GC×GC proporcionou a
possibilidade de separação entre os analitos e os interferentes da matriz, fazendo
com que seja possível o emprego da GC×GC com um detector seletivo, como o
µECD para determinação desses compostos em sedimentos. Outra opção seria o
uso de um detector universal, como o TOFMS, que permite deconvolução espectral
nos casos de coeluição. Entretanto, o seu custo é ainda proibitivo para muitos
laboratórios. Por outro lado, o custo de um GC×GC-µECD se assemelha ao de um
GC/MS O µECD é um detector que apresenta alta sensibilidade e seletividade para
a determinação de compostos halogenados.
38
Essas importantes características de
detecção quando aliadas ao potencial de separação da cromatografia gasosa
bidimensional abrangente propiciam ótimos resultados de separação e detecção.
Assim, os resultados obtidos até agora, apontam para o desenvolvimento de um
método analítico para determinação destes oito agrotóxicos em sedimentos
localizados em áreas próximas à lavouras de arroz.
CONCLUSÕES
A análise das amostras de sedimentos por GC×GC, devido à alta seletividade
e capacidade de pico da técnica, possibilita a separação dos oito agrotóxicos com
menor probabilidade de interferência de constituintes da matriz. Através dos
cromatogramas das amostras fortificadas com padrões dos agrotóxicos ficou
evidente o maior potencial da técnica GC×GC (conjunto de colunas DB-5/DB-17ms)
em relação à 1D-GC para a separação e quantificação dos compostos estudados.
Em relação ao tempo de análise, as duas metodologias praticamente se equivalem,
com 27,9 min para 1D-GC e 29,4 min para GC×GC.
Os resultados obtidos até agora apontam para a possibilidade de
desenvolvimento de um método analítico para determinação destes oito agrotóxicos,
provenientes da orizicultura do Rio Grande do Sul, em sedimentos, através do
emprego de GC×GC-µECD, sem a necessidade de emprego de um detector de mais
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
104
alto custo, como o TOFMS. Tal método poderá, futuramente, contribuir para o
monitoramento de rotina da qualidade ambiental dos sedimentos localizados em
sítios próximos à lavoura de arroz neste estado.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Fundação Estadual de Proteção Ambiental (FEPAM) e a Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro a
este projeto.
REFERÊNCIAS
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2. van der Hoff, R. G.; van Zoonen, P.; J. Chromatogr. A 1999, 843, 301.
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11. von Mühlen, C.; Zini, C. A.; Caramão, E. B.; Marriott, P. J.; Quim. Nova 2007, 30,
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12. Pedroso, M. P.; Godoy, L. A. F.; Fidélis, C. H. V.; Ferreira, E. C.; Poppi, R. J.;
Augusto, F.; Quim. Nova 2009, 32, 421.
13. Mondello, L.; Tranchida, P. Q.; Dugo, P.; Dugo, G.; Mass Spectrom. Rev. 2008,
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14. Dallüge, J.; Beens, J.; Brinkman, U. A. Th.; J. Chromatogr. A 2003, 1000, 69.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
105
15. Dallüge, J.; van Rijn, M.; Beens, J.; Vreuls, R. J. J.; Brinkman, U. A. Th.; J.
Chromatogr. A 2002, 965, 207.
16. Banerjee, K.; Patil, S. H.; Dasgupta, S.; Oulkar, D. P.; Patil, S. B.; Savant, R.;
Adsule, P. G.; J. Chromatogr. A 2008, 1190, 350.
17. Khummueng, W.; Trenerry, C.; Rose, G.; Marriott, P. J.; J. Chromatogr. A 2006,
1131, 203.
18. Bordajandi, L. R.; Ramos, L.; González, M. J.; J. Chromatogr. A 2006, 1125, 220.
19. Koritár, P.; Leonards, P. E. G.; de Boer, J.; Brinkiman, U. A. Th.; J. Chromatogr.
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20. Panić, O.; Górecki, T.; Anal. Bioanal. Chem. 2006, 386, 1013.
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Vreuls, R. J.J.; Blens, J.; Brinkman, U. A. Th.; J. Chromatogr. A 2003, 1019, 65.
30. Bordajandi, L. R.; Ramos, J. J.; Sanz, J.; González, M. J.; Ramos, L.; J.
Chromatogr. A 2008, 1186, 312.
31. Hoh, E.; Mastovska, K.; Lehotay, S. J.; J. Chromatogr. A 2007, 1145, 210.
32. Schure, M. R.; J. Microcol. Sep. 1997, 9, 169.
33. Peters, S.; Truyols, G. V.; Marriott, P. J.; Schoenmakers, P. J.; J. Chromatogr. A
2007, 1146, 232.
34. Adam, F.; Vendeuvie, C.; Bertoncini, F.; Thiébaut, D.; Espinat, D.; Hennion, M.
C.; J. Chromatogr. A 2008, 1178, 171.
35. Adam, F.; Bertoncini, F.; Coupard, V.; Charon, N.; Thiébaut, D.; Espinat, D.;
Hennion, M. C.; J. Chromatogr. A 2008, 1186, 236.
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JULIANA MACEDO DA SILVA
106
36. Pizzutti, I. R.; Vreuls, R. J. J.; Kok, A.; Roehrs, R.; Martel, S.; Friggi, C. A.;
Zanella, R.; J. Chromatogr. A 2009, 1216, 3305.
37. Smalling, K.L.; Kuivila, K. M.; J. Chromatogr. A 2008, 1210, 8.
38. Koritár, P.; Haglund, P.; de Boer, J.; Brinkiman, U. A. Th.; Trends Anal. Chem.
2006, 25, 373.
LEGENDA DAS FIGURAS
Figura 1. Comparação das médias das respostas relativas dos picos
cromatográficos (n=3) para diferentes temperaturas de injeção. 1) Triclorfom, 2)
Propanil, 3) Fipronil, 4) Propiconazol I, 5) Propiconazol II, 6) Trifloxistrobina, 7 e 8)
Permetrina cis e trans, 9) Difenoconazol I, 10) Difenoconazol II e 11) Azoxistrobina.
Figura 2. Representação de um pico cromatográfico genérico, ilustrando os
parâmetros empregados para cálculo do fator de assimetria.
Figura 3. Cromatogramas do extrato da amostra de sedimento (A)
monodimensional; (B) diagrama de cores de uma amostra de sedimento fortificada
com 500 µg L
-1
de mistura dos padrões. 1) Triclorfom, 2) Tricloroguaiacol (PI), 3)
Propanil, 4) Fipronil, 5) Propiconazol I e II, 6) Trifloxistrobina, 7) Permetrina cis e
trans, 8) Difenoconazol I e II e 9) Azoxistrobina. As setas indicam os interferentes da
matriz que coeluem com os analitos na 1D-GC.
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107
Tabela 1. Agrotóxicos estudados, uso, grupo químico e fórmula estrutural.
Nome
Uso
Grupo Químico Fórmula Estrutural
Triclorfom Inseticida Organofosforado
Propanil Herbicida Anilida
Fipronil
Inseticida Pirazol
Propiconazol Fungicida Triazol
Trifloxistrobina Fungicida Estrobilurina
Permetrina Inseticida Piretróide
Difenoconazol Fungicida Triazol
Azoxistrobina Fungicida Estrobilurina
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108
Tabela 2. Colunas utilizadas nas otimizações dos parâmetros cromatográficos para
1D-GC e GC×GC.
Primeira Dimensão (
1
D) e para 1D-GC*
Segunda Dimensão (
2
D)
Conj. de
Colunas
Nome Fase estacionária
Nome Fase estacionária
Dimensões
(1) DB-5
5% difenil-95%
dimetilpolisiloxano
DB-17ms
50% fenil-50%
metilpolisiloxano
1,70 m x 0,18 mm x
0,18 µm
(2) HP-50+
50% fenil - 50%
metilpolisiloxano
DB-1ms
100%
metilpolisiloxano
1,70 m x 0,10 mm x
0,10 µm
* As dimensões das colunas empregadas em 1D-GC ou na
1
D foram sempre 30 m x 0,25 mm x 0,25
µ
m. A coluna DBWAXetr possui fase estacionária constituída por 100% polietilenoglicol.
Tabela 3. Condições cromatográficas obtidas para 1D-GC.
Colunas Cromatográficas
Condições
HP-50+ DB-5 DB-WAXetr
Programação de
Temperatura (T) do
Forno
50°C (1,5 min)-30°C min
-
1
/190°C-5°C min
-1
/220°C-7°C
min
-1
/255°C (44 min)
60°C (2,53 min)-35°C min
-
1
/180°C-4°C min
-1
/240°C-
12°C min
-1
/300°C (2 min)
40°C (1,5)-12°C
min
-1
/100°C-30°C
min
-1
/235°C (44
min)
T do Injetor (ºC) 280 280 260
T do Detector (ºC) 280 325 260
Pulso de Pressão
(s)
36,6 29,4 36,6
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109
Tabela 4. Tempos de retenção (
R
t ), fatores de assimetria (
s
A ) e desvio padrão (DP)
obtidos para os compostos estudados com as diferentes colunas cromatográficas.
Analito HP-50+ DB-5
t
R
(min) A
s
(DP) t
R
(min) A
s
(DP)
Triclorfom 0,77 1,4 (0,07) 0,59 2,0 (0,87)
Tricloroguaiacol
(PI)
7,74 1,5 (0,29) 7,46 1,0 (0,24)
Propanil 10,93 1,0 (0,00) 9,90 1,5 (0,29)
Fipronil 11,77 0,8 (0,14) 12,59 1,0 (0,19)
Propiconazol I 16,54 1,0 (0,19) 16,75 1,0 (0,00)
Propiconazol II 16,63 1,3 (0,34) 16,98 1,3 (0,33)
Trifloxistrobina 16,87 1,0 (0,14) 17,14 1,1 (0,23)
Permetrina I 21,79 0,9 (0,08) 22,43 1,0 (0,14)
Permetrina II 22,19 1,0 (0,07) 22,65 1,0 (0,19)
*Difenoconazol I 36,80 - 25,24 1,5 (0,00)
*Difenoconazol II
- - 25,31 1,0 (0,24)
Azoxistrobina 57,35 1,1 (0,07) 25,89 0,7 (0,19)
*O fator de assimetria para o difenoconazol, com a utilização da coluna HP-50+, não foi calculado em
função da coeluição parcial entre os isômeros.
Tabela 5. Condições cromatográficas obtidas para GC×GC.
Temperatura (ºC) Tempo (s)
Conj.
Colunas
Programação do Forno Injetor
Detector
∆
∆∆
∆T entre
os
Fornos
P
M
Jato
Quente
(1)
60°C (2,53 min)-35°C min-
1
/180°C-4°C min
-
1
/240°C-10°C min
-1
/295°C (3 min)
280 320 5 7 2,1
(2)
50°C (1,5 min)-50°C min
-1
/190°C-5°C min
-
1
/220°C-5°C min
-1
/280°C (12 min)
280 335 5 4 0,8
A temperatura do modulador foi mantida a 20°C acima da temperatura do forno primário. P
M
é o
período de modulação em segundos.
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110
Tabela 6. Tempos de retenção, fatores de assimetria (
s
A
2
) e desvio padrão para os
picos na
2
D com a utilização de diferentes durações de jato quente.
DB-5/DB-17ms HP-50+/DB-1ms
Duração dos jatos quentes (s) / Desvio padrão
Analito
(
)
)(min
21
stt
RR
1,4 1,75 2,1
0,8
1,0 1,2
(
)
)
(min
21
stt
RR
Triclorfom 2,80 2,06 1,2/0,08
1,1/0,00
1,8/0,14
1,9/0,46
1,7/0,46
1,4/0,00
2,20 1,58
Tricloroguaiacol
(PI)
7,93 3,16 1,8/0,11
2,1/0,38
1,4/0,21
2,7/0,87
3,4/0,87
2,9/0,62
7,60 1,80
Propanil 10,61
5,94 1,5/0,03
1,6/0,03
1,1/0,31
3,6/0,29
3,9/0,29
3,6/0,48
10,80 2,12
Fipronil 13,41
4,94 1,3/0,07
1,3/0,07
1,3/0,03
1,5/0,00
1,5/0,00
2,0/0,28
11,66 2,76
Propiconazol I 17,85
1,36 1,3/0,11
1,4/0,07
1,2/0,12
1,9/0,36
1,9/0,36
2,0/0,12
16,60 2,40
Propiconazol II 18,08
1,30 1,3/0,10
1,4/0,03
1,2/0,06
- - -
- -
Trifloxistrobina 18,2 0,90 1,1/0,07
1,1/0,11
1,2/0,10
2,1/0,36
2,0/0,36
1,8/0,21
16,86 2,16
Permetrina I 23,33
6,00 1,3/0,03
1,3/0,10
1,2/0,09
1,8/0,18
1,9/0,18
1,9/0,16
20,53 2,26
Permetrina II 23,56
5,84 1,1/0,03
1,2/0,03
1,2/0,08
2,4/0,00
2,4/0,00
1,9/0,13
20,73 2,24
Difenoconazol 26,36
5,94 1,3/0,03
1,5/0,08
1,3/0,04
2,1/0,17
1,9/0,17
2,2/0,26
26,80 3,22
Azoxistrobina 27,18
1,40 1,3/0,12
1,3/0,06
1,2/0,11
2,2/0,23
2,3/0,36
2,2/0,20
34,06 3,44
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111
Figura 1
Figura 2
B A
10%
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112
Figura 3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
3
6
10 13 16 20 23
26
2
3
4
(A)
(B)
1
2
3
4
5
6
Tempo de retenção na
1
D (min)
Tempo de retenção na
2
D
(s)
Intensidade de sinal (10
6
)
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
113
ANEXO 2. TRABALHO ENVIADO PARA
PUBLICAÇÃO
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
114
APLICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA GASOSA BIDIMENSIONAL ABRANGENTE
COM MICRO DETECTOR DE CAPTURA DE ELÉTRONS PARA DETERMINAÇÃO
DE AGROTÓXICOS EM SEDIMENTOS
Juliana Macedo da Silva, Cláudia Alcaraz Zini e Elina Bastos Caramão*.
Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Av. Bento
Gonçalves, 9500; CEP: 91501-970, Porto Alegre – RS, Brasil.
*e-mail: [email protected]
APPLICATION OF COMPREHENSIVE TWO-DIMENSIONAL GAS
CHROMATOGRAPHY WITH MICRO-ELECTRON CAPTURE DETECTION FOR
DETERMINATION OF PESTICIDES IN SEDIMENTS
Abstract
This study evaluated the applicability of GC × GC-µECD for determination of seven
pesticides of different chemical classes in sediments with the column set DB-5/DB-
17ms. The repeatability and intermediate precision of the areas and heights of the
chromatographic peaks were less than 4%. The percentage of recovery for the
compounds investigated were between 52 and 115%. Instrumental LOD and LOQ
were found in the range from 0.60 to 2.31 µg L
-1
and 1.83 to 5.62 µg L
-1
, respectively.
The detection limits of the method ranged from 1.43 to 5.78 µg kg
-1
. Concentrations
of 3.34 µg kg
-1
(dry basis) for trifloxystrobin and azoxystrobin (below the LOD) were
found in a sediment sample which was collected close to an area of rice plantation.
Keywords: pesticides, GC × GC, µECD.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
115
INTRODUÇÃO
A utilização de agrotóxicos nas produções agrícolas vem obtendo cada vez
mais destaque no cenário mundial. O controle de pragas, através do uso de
diferentes princípios ativos, reduziu o índice de doenças para os homens e animais e
proporcionou aumento na produção agrícola. Contudo, resíduos desses compostos
podem permanecer no ambiente por longos períodos e causar impactos nocivos a
diferentes ecossistemas. Nesse contexto, o monitoramento desses compostos em
diferentes matrizes como ar, água, solo, sedimento e alimentos se torna de extrema
importância para que problemas de saúde pública sejam minimizados e/ou
evitados.
1
O estudo da ocorrência de agrotóxicos em sedimentos fornece informação a
respeito da contaminação do corpo hídrico receptor. O sedimento se comporta como
fonte de acumulação de poluentes (compostos orgânicos em geral e metais, por
exemplo) e este comportamento se relaciona diretamente com sua constituição
físico-química. Este fato confere ao sedimento grande importância no que tange à
investigação de processos físicos, geoquímicos e biológicos no ambiente.
2
As suas
propriedades físico-químicas podem influenciar tanto no transporte e destino desses
compostos no ambiente quanto no comportamento dos mesmos durante as etapas
de extração, limpeza (clean up) e análise instrumental. A interação existente entre os
agrotóxicos e o sedimento pode ser bastante forte, resultando em resíduos
quimicamente ligados à matriz. Tendo em vista este contexto, esforço significativo
vem sendo realizado para o desenvolvimento de métodos eficientes que possibilitem
a análise multirresíduo de agrotóxicos, minimizando etapas de extração e de clean
up das amostras.
3,4
Atualmente, técnicas rápidas e automatizadas para extração de amostras
sólidas, que utilizam altas pressões e temperaturas, vêm sendo reportadas com
destaque na literatura. Dentre estas, podem ser citadas a extração com fluido
supercrítico (SFE, do inglês “Supercritical Fluid Extraction”),
51-53
extração acelerada
com solvente (ASE, do inglês “Accelerated Solvent Extraction”),
54-56
extração
assistida por microondas (MAE, do inglês “Microwave Assisted Extraction”),
5-7
ou
técnica que utiliza forte agitação como a extração por ultra-som (USE, do inglês
“Ultrasonic Extraction”).
4,8,9
Outras técnicas como Soxhlet,
10-12
extração em fase
sólida (SPE, do inglês “Solid-Phase Extraction”)
13
,
14
e micro extração em fase sólida
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
116
(SPME, do inglês “Solid-Phase Micro Extraction”)
15
-17
também são utilizadas para
determinação de agrotóxicos em sedimentos. A extração por ultra-som é uma
técnica bastante versátil que permite a extração de várias amostras
simultaneamente, sem demandar o uso de materiais sofisticados.
18
O processo de
extração por ultra-som proporciona um contato mais efetivo entre a matriz e o
solvente, devido aos processos térmicos, mecânicos e de cavitação acústica. A
exposição à irradiação ultra-sônica faz com que haja formação de micro bolhas,
quando a pressão negativa exercida no sistema é alta o suficiente; sendo que,
durante períodos de pressão positiva, as bolhas são comprimidas. Quando ocorre
um colapso perto da superfície de um sólido, causado pela compressão e expansão
das bolhas, as paredes do sólido podem ser danificadas e ter seu conteúdo
(analitos) liberado para o meio.
19
Atualmente, a Cromatografia Gasosa é a técnica mais utilizada para a
determinação de agrotóxicos em diferentes matrizes.
20
A Cromatografia Gasosa
Bidimensional Abrangente (GC × GC) é uma técnica relativamente recente,
idealizada em 1991 por Liu e Phillips
21
e que apresenta grande poder de separação.
Na GC × GC, duas colunas cromatográficas de diferentes mecanismos de retenção
são acopladas em série, sendo a coluna da primeira dimensão (
1
D) comumente de
30 m de comprimento e diâmetro interno de 0,25 a 0,32 mm. A coluna da segunda
dimensão (
2
D) deve ser mais curta, do tipo fast-GC, para que o perfil de separação
obtido na
1
D seja mantido.
22
O modulador é considerado o “coração” da técnica e é
acoplado entre as duas colunas, sendo que sua função é de amostrar e focalizar as
pequenas frações eluídas da primeira coluna e, em seguida, liberar essas porções,
rapidamente, para a segunda coluna.
23
O período de amostragem corresponde ao
período de modulação (P
M
), que é a duração de um ciclo completo de modulação, e
ao tempo de separação na coluna da segunda dimensão. Devido ao tempo de
separação da segunda dimensão ser muito curto, geralmente de 2 a 10 segundos, a
separação na segunda coluna é essencialmente isotérmica.
24
Os picos gerados por
um sistema GC × GC apresentam dois tempos de retenção, na primeira e segunda
dimensão (
1
t
R
e
2
t
R
, respectivamente). Essa característica proporciona grande
vantagem analítica, pois se refere a dois mecanismos de separação, podendo ser
utilizada com o propósito de identificação de compostos.
25
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
117
O número de publicações científicas relacionado à determinação de
agrotóxicos por GC × GC ainda é relativamente pequeno, mas suficiente para
demonstrar as potenciais vantagens da técnica em relação à cromatografia
monodimensional (1D-GC). As principais vantagens apresentadas pela GC × GC em
relação a 1D-GC são: aumento de resolução; aumento de sensibilidade devido à re-
concentração da banda do soluto na
2
D, favorecendo a detecção de componentes
em nível de traços; estruturação do cromatograma 2D (bidimensional) de acordo
com as características químicas dos compostos em análise e aumento da
capacidade de pico.
26,27
A Tabela 1 apresenta alguns trabalhos científicos que
utilizam a GC × GC-ECD como ferramenta analítica para determinação de
agrotóxicos e organoclorados em diferentes matrizes.
TABELA 1
Desta forma, este estudo teve por objetivo a validação de um método
multirresíduo, por GC × GC-µECD, para a determinação de sete agrotóxicos
(propanil, fipronil, propiconazol, trifloxistrobina, permetrina, difenoconazol e
azoxistrobina) de diferentes classes químicas (anilida, pirazol, triazol, estrobilurina e
piretróide) em sedimentos de rio proveniente de regiões sob influência da cultura
orizícola no estado do Rio Grande do Sul. O processo de validação foi realizado
através da avaliação de parâmetros como curva de calibração e linearidade,
precisão (repetitividade e precisão intermediária), exatidão (teste de recuperação) e
limites de detecção e quantificação instrumentais e do método.
PARTE EXPERIMENTAL
Materiais e Reagentes
Os padrões dos agrotóxicos foram obtidos da Sigma-Aldrich (Seelze,
Alemanha) com pureza superior a 97%. Para as análises quantitativas foi utilizado o
3,4,5-tricloroguaiacol como padrão interno. As soluções padrão estoque foram
preparadas pesando-se os agrotóxicos em frascos individuais em balança analítica
de precisão (Shimadzu, AY220, Quioto, Japão) e dissolvendo-os em acetato de etila
grau HPLC (Mallincrrodt, Phillipsburg, EUA) em balões volumétricos de 5 mL,
previamente silanizados. Todas as soluções foram guardadas em freezer à –18 °C
em frascos de vidro âmbar silanizados. O sulfato de sódio anidro (Quimex, São
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
118
Paulo, SP, Brasil), utilizado para retirar a umidade residual dos sedimentos, foi
previamente seco em estufa a 400 °C por 4 horas e armazenado em dessecador. Os
papéis filtro utilizados foram de grau quantitativo (Quanty, Alemanha). O banho de
ultra-som utilizado foi Maxiclean (Unique, Indaiatuba, SP, Brasil) com potência de
120 Watts.
Amostragem e Preparação da Amostra
As coletas foram realizadas por técnicos da FEPAM (Fundação Estadual de
Proteção Ambiental Henrique Luiz Roessler) na região da Bacia do Rio Santa Maria
e na região do Rio Gravataí, no estado do Rio Grande do Sul. Foi coletado em
média 1 kg de sedimento, com retirada de qualquer vegetação presente, próximo à
margem, em locais de deposição de partículas finas (preferencialmente), e pouca
profundidade. Os sedimentos foram coletados em frascos de vidro e transportadas à
4 °C, até o laboratório, onde foram congelados a –18 °C em freezer, antes do
processo de extração. O processo de extração empregado foi baseado no método
reportado por You e colaboradores.
41
A água residual presente no sedimento foi
retirada e o mesmo foi homogeneizado. Em seguida, foi parcialmente seco ao ar, à
temperatura ambiente, em vidros de relógio. Para a etapa de extração, foram
pesados 20 g de sedimento e adicionados a este, 10 g de sulfato de sódio anidro,
procedendo-se à homogeneização do material. Uma alíquota de 50 mL de uma
solução 50:50 v/v de acetona:diclorometano foi adicionada à amostra, a qual foi
submetida à extração em 3 ciclos de 15 min no banho de ultra-som. O extrato foi
levado à secura e o resíduo final dissolvido com 1,5 mL de acetato de etila. Para os
testes de recuperação foram adicionadas quantidades de 300, 60 e 30 µL de uma
solução dos analitos a 10 µg L
-1
, para obtenção da fortificação a 150, 30 e 15 µg kg
-
1
, respectivamente. As amostras foram deixadas em contato com a solução padrão
contendo os agrotóxicos durante 24 horas, após homogeneização e evaporação do
solvente. Todos os solventes utilizados para extração são grau analítico (Vetec, Rio
de Janeiro, RJ, Brasil) e bidestilados. A Tabela 2 apresenta as características e
localização geográfica desses sedimentos.
TABELA 2
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
119
Condições Cromatográficas
As análises foram realizadas em um cromatógrafo Agilent 6890N (Agilent
Technologies, Palo Alto, CA, EUA) com µECD, equipado com amostrador
automático Combi PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Suíça). O cromatógrafo
também possui um forno secundário (LECO, St. Joseph, MI, EUA) e um modulador
térmico de dois estágios com quatro jatos (quad jet) de N
2
(dois jatos quentes e dois
frios que são resfriados por N
2
líquido). A coluna utilizada na primeira dimensão foi
uma DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) e na segunda dimensão, DB-17ms (1,7 m x
0,18 mm x 0,18 µm), ambas adquiridas da Agilent Technologies - J&W Scientific
(Palo Alto, CA, EUA). As temperaturas de injeção e detecção foram de 280 e 320 °C,
respectivamente. O fluxo de gás de arraste (H
2
, 99,999%, Linde Gás, Canoas-RS)
foi de 2 mL min
-1
, enquanto que o fluxo de gás de make up (N
2,
99,999%, Linde Gás,
Canoas-RS) foi de 150 mL min
-1
. O P
M
utilizado foi de 7 s, com duração de pulso
quente de 2,1 s. A programação de temperatura do forno foi de 60 °C (2,53 min)-35
°C min-
1
/180 °C-4 °C min
-1
/240 °C-10 °C min
-1
/295 °C (3 min), com diferença de
temperatura de mais 5 °C no forno secundário. As injeções foram realizadas com
volume de 1 µL, sem divisão de fluxo e com pulso de pressão de 60 psi por 29,4 s. O
desenvolvimento do método de análise está descrito em artigo anteriormente
publicado.
42
Validação do Método
O processo de validação possibilita uma avaliação da eficiência de um
processo analítico, quando do seu desenvolvimento, adaptação ou implementação.
Este processo garante que um método analítico ofereça informações confiáveis e
interpretáveis sobre uma amostra.
43
Os parâmetros avaliados no processo de
validação foram linearidade e curva de calibração, precisão (repetitividade e
precisão intermediária), exatidão (testes de recuperação) e limite de detecção (LOD)
e quantificação (LOQ). A curva de calibração foi avaliada através da injeção de
soluções com concentrações na faixa de 5 a 415 µg L
-1
. Cada solução foi analisada
cinco vezes. O composto 3,4,5-tricloroguaiacol foi utilizado como padrão interno na
concentração de 100 µg L
-1
. A precisão do método foi verificada em termos de
repetitividade e precisão intermediária, expressas como coeficiente de variação
(CV%). A repetitividade foi avaliada através da análise de oito injeções de solução
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
120
padrão a 100 µg L
-1
em um único dia e mantendo-se constante as condições
operacionais. A precisão intermediária foi verificada através da análise de oito
injeções da mesma solução padrão, mas em dois dias diferentes. O CV% foi
calculado utilizando-se a média das áreas e alturas dos picos cromatográficos para
cada agrotóxico. A exatidão de um processo analítico representa o quanto os
resultados individuais, de um determinado ensaio, concordam com um valor de
referência aceito como verdadeiro. Esse parâmetro mede o desvio do valor obtido
em relação ao valor adotado como real
43,44
e foi avaliado através dos testes de
recuperação com amostra fortificada (amostra controle) nos níveis de 15, 30 e 150
µg kg
-1
. O LOD pode ser definido como sendo a menor quantidade de um analito
que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, ou seja, é a menor
concentração de um analito que pode ser diferenciada do ruído gerado por
equipamentos que produzem linhas de base.
44
O LOQ é a menor concentração do
analito que pode ser determinada com um nível aceitável de exatidão e precisão.
45
O
limite de detecção do método, MDL (do inglês, “Method Detection Limit”) é a mínima
concentração de uma determinada substância que pode ser medida e reportada com
99% de confiança de que a concentração seja maior do que zero. O MDL foi
avaliado através da extração de sete replicatas de sedimento fortificado a 10 µg kg
-1
.
A fórmula que expressa o resultado é apresentada abaixo:
MDL = st (0,99; n-1)
Na equação acima, s é o desvio padrão das replicatas e t é o valor da
distribuição t de Student, com 99% de confiança e n-1 graus de liberdade.
3,46
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Condições Cromatográficas
A Figura 1 apresenta o diagrama de cores obtido para os sete agrotóxicos
com o jogo de colunas DB-5/DB-17ms, onde é possível observar que os picos
encontram-se dispersos pelas várias regiões do espaço de separação.
FIGURA 1
A utilização deste jogo de colunas favoreceu o aproveitamento do espaço de
separação, com ampla distribuição dos analitos na
2
D, boa simetria para os picos
cromatográficos, características importantes e desejáveis quando da análise de
amostras complexas.
42
Estes resultados confirmam o que é reportado na literatura,
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
121
visto que a maioria dos trabalhos publicados apresenta a geometria convencional de
colunas (fase estacionária apolar na
1
D e polar na
2
D) como sendo o que
proporciona melhores resultados de análise para agrotóxicos em diversas
matrizes.
28,47
Processo de Extração por Ultra-som
O processo de extração empregado foi baseado no método reportado por You
e colaboradores.
41
No trabalho descrito por esses autores foi utilizada uma etapa de
limpeza com 10 g de Florisil ativado e posteriormente, parcialmente desativado com
6% m/v de água destilada. Os autores obtiveram bons resultados de recuperação.
Entretanto, testes realizados com Florisil durante este trabalho mostraram que para
os sete agrotóxicos em estudo houve adsorção irreversível dos analitos na coluna de
Florisil, o que inviabilizou a utilização desta etapa de limpeza.
Validação do Método
As equações da curva de calibração, coeficiente de determinação (r
2
) e faixa
linear de concentração são apresentados na Tabela 3.
TABELA 3
Através das equações obtidas para as curvas analíticas pode-se observar que
o método proposto apresentou ótima linearidade numa ampla faixa de concentração,
com coeficientes de determinação (r
2
) entre 0,9920 e 0,9993. Valores de r
2
acima de
0,98 são considerados satisfatórios.
48
Para a repetitividade, as áreas dos picos
cromatográficos, para os sete compostos, apresentaram valores de coeficiente de
variação de 0,64 a 3,78%. Para as alturas dos picos, os valores situaram-se entre
0,77 e 3,16%. Para a precisão intermediária, o coeficiente de variação relativo às
áreas dos compostos situou-se entre 0,54 e 3,50% e para as alturas 0,81 e 3,74%.
Os tempos de retenção tiveram variação de 0,00% para a
1
D e de 0,11 a 0,66% para
a
2
D. Tendo em vista que os valores obtidos para repetitividade e precisão
intermediária situaram-se abaixo de 20%,
43,49
o método cromatográfico proposto
para a determinação dos sete compostos pode ser considerado preciso. A Tabela 4
apresenta os níveis de concentração encontrados para os testes de recuperação.
TABELA 4
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
122
O presente método se mostrou eficiente (recuperação entre 50 e 120% e CV
≤ 20%) para todos os agrotóxicos para o nível de concentração de 30 µg kg
-1
.
Apesar da baixa recuperação obtida para a trifloxistrobina nos níveis de 15 e 150 µg
kg
-1
e para o propiconazol em 150 µg kg
-1
, o coeficiente de variação foi menor do
que 20%, o que indica que o método foi repetitivo. Para os compostos difenoconazol
e azoxistrobina houve elevada recuperação (acima de 120%) que pode ter sido
causada por coeluições com interferentes da matriz, no nível de recuperação de 15
µg kg
-1
. Para o difenoconazol no nível de fortificação de 150 µg kg
-1
e para a
permetrina, no nível de 30 µg kg
-1
, houve boa recuperação mas a precisão do
método não foi satisfatória (>20%). A resposta relativa obtida para alguns compostos
no ECD, como os hidrocarbonetos, é de 0,01 (tendo como base o clorobenzeno com
resposta igual a 1).
50
Caso ocorra coeluição dos agrotóxicos estudados com esses
compostos, por exemplo, pode ocorrer uma contribuição negativa na resposta
analítica, com diminuição de intensidade de sinal. No banho de ultra-som o
transdutor é diretamente preso no fundo da cuba do aparelho e a energia ultra-
sonora é transmitida através da água.
51
Com isso, há muita dispersão de energia e,
conseqüentemente, maior probabilidade de geração de pontos de maior e menor
intensidade de extração. O sinergismo causado pelo efeito negativo no sinal (sinal
diminuído por coeluições com compostos de baixa resposta relativa no ECD) e pela
alta variabilidade no processo de extração no ultra-som pode ter contribuído para
que alguns resultados de recuperação não fossem tão satisfatórios. O emprego de
uma sonda de ultra-som poderia melhorar a repetibilidade do processo de extração,
como já constatado por You e colaboradores.
41
A Figura 2 apresenta os diagramas
tridimensionais e os cromatogramas reconstruídos da
1
D e
2
D para amostra de
sedimento fortificada.
FIGURA 2
A Figura 2 propicia a observação da distribuição dos constituintes (padrão e
amostra) no espaço de separação, confirmando que a utilização da técnica
monodimensional (GC-µECD) não seria suficiente para obter separação entre os
analitos e os constituintes da matriz. A Tabela 5 apresenta os limites instrumentais
de detecção e quantificação e o limite de detecção do método para os agrotóxicos
em estudo. Os limites de detecção e quantificação instrumentais variaram de 0,08 a
1,07 µg L
-1
e de 0,25 a 3,23 µg L
-1
, respectivamente. Os limites do método variaram
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
123
de 1,92 a 4,43 µg kg
-1
. Para fins de ilustração, já que não existe legislação vigente
que contemple esses agrotóxicos em sedimentos, os LMR dos analitos para a matriz
arroz variam de 0,01 a 2 mg kg
-1
,
52
evidenciando que os limites encontrados foram
considerados satisfatórios.
TABELA 5
Aplicabilidade do Método a Amostras Reais
A aplicabilidade do método de extração foi avaliada através da análise de
duas amostras de sedimentos – SD
1
e SD
2
. Foram encontrados resíduos dos
agrotóxicos trifloxistrobina e azoxistrobina somente na amostra SD
2
. O valor de
concentração encontrado para trifloxistrobina foi de 3,34 µg kg
-1
, em base seca e
para azoxistrobina a concentração ficou abaixo do LOD. A confirmação da presença
de um determinado analito em uma amostra pode ser realizada através do uso do
detector de espectrometria de massas ou de injeções em colunas cromatográficas
cujas fases estacionárias propiciem a separação através de distintos mecanismos de
separação, caso não exista a disponibilidade de um detector de espectrometria de
massas.
41
Sendo assim, a confirmação da presença dos resíduos de azoxistrobina e
trifloxistrobina foi realizada através de coinjeções em colunas de fases estacionárias
diferentes, com o jogo de colunas HP-50+/DB-1ms, utilizando-se o µECD.
CONCLUSÃO
O método de análise de agrotóxicos proposto neste trabalho apresentou
ótimos resultados, evidenciando o potencial da técnica de GC × GC para a análise
de poluentes em nível de traços em matrizes complexas. A alta capacidade de pico
da técnica contribuiu para que o processo de quantificação tivesse pouca influência
de coeluições de interferentes da matriz com os analitos em estudo, apesar de as
amostras não terem sido submetidas a uma etapa de limpeza. Além disso, os
valores encontrados para os limites de detecção e quantificação comprovam a
grande sensibilidade da técnica. Este trabalho amplia o uso da GC × GC para mais
uma situação específica de relevante importância ambiental, visto que o número de
aplicações desta técnica ainda é pequeno na literatura científica. O método em
questão pode ser empregado por laboratórios de instituições governamentais de
fiscalização ou por outros laboratórios prestadores de serviço, contribuindo assim
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
124
para obtenção de informações relevantes sobre estes compostos no meio ambiente
ou sobre um possível mau gerenciamento de sua aplicação nas lavouras.
Informações obtidas por métodos analíticos como este podem minimizar riscos de
poluição do meio ambiente e também riscos à saúde da população.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Fundação Estadual de Proteção Ambiental (FEPAM) e a Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro a
este projeto.
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38. Liu, Z.; Sirimanne, S. R.; Patterson, D.G.; Needham, L.; Phillips, J. B.; Anal.
Chem. 1994, 66, 3086.
39. Cochran, J.; J. Chromatogr. A 2008, 1186, 202.
40. van der Lee, M. K.; van der Weg, G.; Traag, W. A.; Mol, H. G. J.; J. Chromatogr.
A 2008, 1186, 325.
41. You, J.; Weston, D. P.; Lydy, M. J.; Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2004, 47,
141.
42. Silva, J. M.; Zini, C. A.; Canizares, E. M. P. N.; Leal, K, A.; Caramão, E. B.; Quim.
Nova, no prelo.
43. Ribani, M.; Bottoli, C. B. G.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F.; Melo, L. F. C.;
Quim. Nova 2004, 27, 771.
44. Lanças, F. M.; Validação de Métodos Cromatográficos, 1ª ed., Rima, 2006.
45. INMETRO; Orientação Sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos, 2007.
46. Wisconsin Department of Natural Resources; Analytical Detection Limit Guidance
& Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits, 1996.
47. Banerjee, K.; Patil, S. H.; Dasgupta, S.; Oulkar, D. P.; Patil, S. B.; Savant, R.;
Adsule, P. G.; J. Chromatogr. A 2008, 1190, 350.
48. Chasin, A. A. M.; Nascimento, E. S.; Ribeiro Neto, L. M.; Siqueira, M. E. P. B.;
Andraus, M. H.; Salvatori, M. C.; Fernícola, N. A. G.; Gorni, R.; Salcedo, S.; Rev.
Bras. Toxicol. 1998, 11, 1.
49. Brito, N. M.; Junior, O. P. A.; Polese, L.; Ribeiro, M. L.; Pesticidas: R. Ecotox. e
Meio Ambiente 2003, 13, 129.
50. Grob, R. L.; Barry, E. F.; Modern Practice of Gas Chromatography, 4th ed.,
Wiley, 2004.
51. Barboza, J. C. S.; Serra, A. A.; Quim. Nova 1992, 15, 301.
52. http://www.anvisa.gov.br/toxicologia/monografias/index.htm, acessada em:
novembro, 2007.
Dissertação de Mestrado – PPGQ/UFRGS
JULIANA MACEDO DA SILVA
127
LEGENDA DAS FIGURAS
Figura 1. Diagrama de cores obtido para a mistura de padrões a 100 µg L
-1
.
1) Tricloroguaiacol (PI), 2) Propanil, 3) Fipronil, 4) Propiconazol I e II, 5) Trifloxistrobina, 6) Permetrina
cis e trans, 7) Difenoconazol I e II e 8) Azoxistrobina.
Figura 2. Diagrama tridimensional (3D) com reconstrução dos cromatogramas da
1
D
e
2
D: (A) dos padrões na concentração de 200 µg L
-1
,
(B) da amostra fortificada a 15
µg kg
-1
.
1) Tricloroguaiacol (PI), 2) Propanil, 3) Fipronil, 4) Propiconazol I e II, 5) Trifloxistrobina, 6) Permetrina
cis e trans, 7) Difenoconazol I e II e 8) Azoxistrobina.
FIGURA 1
FIGURA 2
(A)
(B)
1
2
3
4
5
6
7
8
4 12,3 20,6 29
4
2
6
Tempo de retenção na
2
D (s)
Tempo de retenção na
1
D (min)
1
2
3
4
5
6
7
8
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128
TABELAS
Tabela 1. Aplicações da GC × GC a agrotóxicos e outros poluentes em diferentes matrizes.
Analitos Tipo de amostra Detecção Ref.
Seis compostos da classe dos piretróides Uva
µECD
28
Agrotóxicos organoclorados (OCPs), bifenilas policloradas (PCBs), éteres
difenílicos policlorados (PBDEs), dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDDs),
dibenzofuranos policlorados (PCDFs), naftalenos policlorados (PCNs), terfenilas
policloradas (PCTs) e toxafeno (CTT)
Carne de porco,
ovos e leite materno
µECD
29
Cinco enantiômeros do toxafeno Óleo de peixe
µECD
30
Agrotóxicos organoclorados (OCPs), bifenilas policloradas (PCBs) e polibromadas
(PBBs), éteres difenílicos policlorados (PBDEs), dibenzo-p-dioxinas policloradas
(PCDDs), dibenzofuranos policlorados (PCDFs), naftalenos policlorados (PCNs),
terfenils policlorados (PCTs), toxafeno (CTT), naftalenos (PCNs) e dibenzotiofenos
(PCDTs)
Sedimento e poeira
µECD
31
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129
Analitos Tipo de amostra Detecção Ref.
Nove fungicidas Vegetais
µECD
32
Toxafeno Misturas técnicas
µECD
33
Éteres difenílicos policlorados, bifenilas policloradas (PCBs) e polibromadas (PBBs)
e agrotóxicos organoclorados (OCPs)
Leite e soro humano
TOFMS 34
20 agrotóxicos de diferentes classes químicas Maçã e pêssego
TOFMS
35
36 agrotóxicos de diferentes classes químicas
Chás de frutas,
verde e preto
TOFMS
36
Compostos organoclorados, tridecano, benzenos, fenóis, naftalenos aminas e
ftalatos
Mistura de padrões
FID
37
15 agrotóxicos de diferentes classes químicas Soro humano FID 38
32 compostos pertencentes à classe dos organoclorados e organofosforados Fumo
TOFMS
39
106 agrotóxicos e outros poluentes, como PCBs e HPAs Cereal
TOFMS
40
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130
Tabela 2. Localização geográfica e características físico-químicas dos sedimentos
analisados.
Amostra
Localização
Geográfica
Carbono
Orgânico
Cascalho Areia Silte Argila
(%)
SD
1
31° 8’ 11” – latitude sul
54° 22’ 42” – longitude
oeste
2,53 3,20 70,97 19,49 6,33
SD
2
30° 16’ 49” – latitude
sul
54° 54’ 10” – longitude
oeste
0,99 0 83,11 10,20 6,69
Amostra
controle
29° 56’ 10” – latitude
sul
50° 36’ 05” – longitude
oeste
1,98 24,90 66,20 5,08 3,77
Tabela 3. Parâmetros da curva de calibração para os compostos estudados.
a,b
Soma dos isômeros.
Compostos Equação da Reta r
2
Linearidade (µ
µµ
µg L
-1
)
Propanil y = 0,0023x + 0,0186 0,9992 5 - 295
Fipronil y = 0,0061x + 0,0756 0,9945 5 - 415
Propiconazol
a
y = 0,0044x - 0,0234 0,9920 15 - 295
Trifloxistrobina y = 0,0029x + 0,0061 0,9993 5 - 415
Permetrina
b
y = 0,001x + 0,0013 0,9990 5 - 295
Difenoconazol y = 0,0014x - 0,0058 0,9942 5 - 415
Azoxistrobina y = 0,0027x + 0,0092 0,9963 5 - 415
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131
Tabela 4. Níveis de recuperação em base seca e coeficiente de variação (CV %) para
os compostos estudados em sedimento.
a,b
Soma dos isômeros.
Nível de
fortificação
15 (µ
µµ
µg kg
-1
) 30 (µ
µµ
µg kg
-1
) 150 (µ
µµ
µg kg
-1
)
Analito
Recuperação
(%)
CV
(%)
Recuperação
(%)
CV
(%)
Recuperação
(%)
CV
(%)
Propanil 74 13 67 9 60 20
Fipronil 64 14 67 11 65 18
Propiconazol
a
54 7 61 9 47 18
Trifloxistrobina 40 9 52 9 42 16
Permetrina
b
133 20 52 30 39 23
Difenoconazol 254 15 115 9 92 24
Azoxistrobina 127 14 78 9 62 20
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132
Tabela 5. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) instrumentais e o
MDL para os compostos estudados por GC × GC.
a,b
Soma dos isômeros.
Compostos
LOD (µ
µµ
µg L
-1
) LOQ (µ
µµ
µg L
-1
) MDL (µ
µµ
µg kg
-1
)
Propanil 1,07 3,23
2,95
Fipronil 0,26 0,77
3,06
Propiconazol
a
0,08 0,25
1,92
Trifloxistrobina 0,25 0,74
1,97
Permetrina
b
0,19 0,58
2,44
Difenoconazol 0,64 1,94
4,43
Azoxistrobina 0,35 1,06
2,36
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