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ESTUDO DAS PROTEÍNAS QUE REGULAM A
APOPTOSE NO RETINOBLASTOMA DE
PACIENTES SUBMETIDOS À ENUCLEAÇÃO
OU EXENTERAÇÃO AO DIAGNÓSTICO
RENATO JOSÉ MENDONÇA NATALINO
Dissertação apresentada à Fundação Antônio
Prudente para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de concentração: Oncologia
Orientadora: Dra. Célia Beatriz Gianotti Antoneli
Co-Orientador: Prof. Dr. Fernando Augusto Soares
São Paulo
2009
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente
Natalino, Renato José Mendonça
Estudo das proteínas que regulam a apoptose no retinoblastoma de
pacientes submetidos à enucleação ou exenteração ao diagnóstico / Renato
José Mendonça Natalino – São Paulo, 2009.
115p.
Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia.
Orientador: Célia Beatriz Gianotti Antoneli
Descritores: 1. RETINOBLASTOMA. 2. APOPTOSE. 3. PROTEINA
SUPRESSORA DE TUMOR p53. 4. PROTEINAS BCL-2 PROTO-
ONCOGENICAS. 5. IMUNOHISTOQUÍMICA. 6. CASPASE 3.
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DEDICATÓRIA
Á minha esposa Sheila,
minha vida, meu amor...
AGRADECIMENTOS
À Dra. Célia Beatriz Gianotti Antoneli pelas orientações, apoio e entusiasmo
durante todo o período do mestrado. Suas palavras foram essenciais na elaboração
desta dissertação. Seu apoio foi fundamental nos momentos mais difíceis. Seu
entusiasmo foi o grande estímulo desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Fernando Augusto Soares pelas orientações norteadoras ao
longo desta dissertação. Agradeço também pelo seu entusiasmo constante e por
disponibilizar toda a estrutura do departamento para a realização do mestrado.
À Dra. Karina de Cássia Ribeiro pela ajuda na estatística e nos ensinamentos
sobre método sempre com preciosismo e inteligência.
Ao Dr. Clóvis Antônio Lopes Pinto por participar da banca de qualificação
desde a elaboração do projeto até a entrega dos resultados. Seus conselhos e críticas
foram muito importantes na elaboração da dissertação.
À Dra. Maristela Amaral Palazzi pela sua participação da banca de
qualificação. Foram essenciais suas orientações e críticas ao projeto. A Dra Maristela
também foi a principal motivadora desta dissertação. Foi minha primeira orientadora
nos estudos sobre o retinoblastoma.
Ao Dr. Antônio Hugo Antônio Hugo José Froes Marques Campos,
responsável pela patologia ocular do Departamento de Patologia, pela ajuda e apoio.
A todos os amigos e colegas do Departamento de Anatomia Patológica do
Hospital A.C. Camargo.
A todos os colegas da pós-graduação, especialmente a Yukie e Luciana pela
importante ajuda no trabalho com o ACIS III®.
Aos técnicos José Ivanildo Neves, Sueli Nonogaki, Carlos F. Nascimento e
Severino da Silva Ferreira pela perfeição e presteza na construção da TMA e na
realização das reações imunoistoquímicas.
Aos funcionários Marcelo e Glauber pela ajuda na separação dos blocos de
parafina contendo as amostras.
A equipe do Serviço de Arquivo Médico (SAME), especialmente aos Sr Luis
e Sr Luciano pela presteza na separação dos prontuários dos pacientes deste estudo.
Aos Departamentos de Oftalmologia e Pediatria do Hospital A.C. Camargo
que fizeram o seguimento destes pacientes.
À secretária da pós-graduação, especialmente à Ana Kurinari e Luciana
Pitombeira pelas orientações e paciência.
À todos os colaboradores da Biblioteca, que disponibilizaram os livros e
periódicos essenciais na realização deste trabalho. E especialmente à Suely Francisco
pela diagramação final deste trabalho
Ao Christopher Mack pela correção dos textos de língua inglesa.
Aos meus amigos Héverton e Andressa pela inestimável amizade.
Aos amigos do setor de Patologia do Laboratório Diagnósticos da América e
especialmente aos meus chefes, Dr Antônio C. Alves e Dr Marcelo A. Gianotti.
Aos meus sogros Dorgival e Adélia e minhas cunhadas Michelle e Kelly.
Aos meus pais Geraldo e Márcia e minhas irmãs Marina e Alaide pelo apoio,
amor e incondicional compreensão. E aos meus cunhados Nilvan e André. Aos meus
afilhados: Jorge, Nicolas e João Francisco. Vocês são a minha maior fortuna.
À minha amada esposa Sheila. A sua beleza, graça, espirituosidade e
inteligência foram a minha inspiração. Sem a sua ajuda, seu carinho, sua
compreensão e seus conselhos não seria possível a realização desta dissertação.
Ao apoio financeiro concedido pela CAPES - Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior através do programa de bolsa no ano
de 2007 para a realização de parte do projeto de Mestrado.
RESUMO
Natalino RJM. Estudo das proteínas que regulam a apoptose no retinoblastoma
de pacientes submetidos à enucleação ou exenteração ao diagnóstico. São Paulo;
2009. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].
O Retinoblastoma é a neoplasia intraocular mais comum na infância e é resultado da
inativação parcial ou total dos dois genes do retinoblastoma (RB1). Com os
tratamentos utilizados atualmente, há um excelente prognóstico; e os desafios atuais
são a preservação da visão e a cura do retinoblastoma que se extende para sistema
nervoso central. O estudo das vias de apoptose é fundamental porque muitos dos
tipos de tratamentos contemporâneos resultam em apoptose. Bloqueios nesta via
podem estar associados à pior prognóstico. CASUÍSTICA E MÉTODOS: as
proteínas relacionadas à apoptose foram avaliadas pela imunoistoquímica em
plataformas de “tissue microarray” contendo tumores de 93 pacientes sem nenhum
tratamento prévio à cirurgia. As reações imunoistoquímicas foram avaliadas tanto
pela microscopia óptica quanto pela plataforma ACIS III®. O índice apoptótico foi
avaliado pela contagem de células marcadas pela caspase-3 clivada em 1000 células.
RESULTADOS: As proteínas pró-apoptóticas foram expressas mais frequentemente
do que as proteínas antiapoptóticas. A diminuição da expressão de p53 foi associada
à extensão tumoral extraocular. A mediana do índice apoptótico (AI) foi de 0,085.
Houve uma tendência a associação entre tumores com AI > 0,17 (p75) e um pior
prognóstico (p=0,057). Extensão extraocular, comprometimento pós lâmina crivosa e
da esclera foram associados a pior sobrevida em análise univariada. CONCLUSÃO:
As células tumorais parecem estar susceptíveis à apoptose, entretanto não houve
correlação entre AI e a intensidade de expressão de proteínas pró-apoptóticas como
p53, Bax, PUMA e Smac/DIABLO. A proteína Bcl-x
L
apresentou correlação
negativa com AI o que pode sugerir que esta proteína tenha um papel central no
bloqueio da apoptose e houve uma tendência de associação entre AI > 0,17 e pior
prognóstico no retinoblastoma.
SUMMARY
Natalino RJM. [Study of the proteins that regulate the apoptosis in the
retinoblastoma of patients who underwent enucleation at diagnosis]. São Paulo;
2009. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].
Retinoblastoma is the most common intraocular malignant neoplasia during
childhood and is a result of the partial or total inactivity of two copies of the
retinoblastoma genes (RB1). Under the treatment currently used, there is a good
prognosis, and the current challenges are the preservation of eyesight and the cure of
retinoblastoma which spreads to the central nervous system. The study of apoptotic
pathways is fundamental because many contemporary forms of treatment result in
apoptosis. Blockages in this pathway can be associated with poor prognosis.
METHODS: Related apoptosis proteins were evaluated using immunohistochemistry
on tissue microarrays which contained samples of tumors taken from ninety-three
patients without any treatment previous to surgery. The immunohistochemistry
reactions were evaluated using an optical microscope as well as the ACIS III®
platform. The apoptotic index was assessed by counting cells marked with cleaved
caspase-3 in 1000 cells. RESULTS: The pro-apoptotic proteins were more frequently
expressed than the anti-apoptotic proteins. The lower p53 expression was associated
with extra ocular tumor extension. The median of the apoptotic index (AI) was
0.085. There was a trend towards the association between tumors presented with AI
> 0.17 and poorer survival (p=0.057). Extra ocular extension, scleral and post
laminar optic nerve involvement were associated with poor survival in a univariate
analysis. CONCLUSIONS: The tumor cells seemed to be susceptible to apoptosis,
but there was no correlation between AI and the intensity of pro-apoptotic protein
expression, such as p53, Bax, PUMA and Smac/DIABLO. The protein Bcl-x
L
had a
negative correlation with AI. Then, Bcl-x
L
could be implicated in the apoptosis block.
Also, there was an association tendency between AI > 0.17 and a poorer prognosis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Tipos de estruturas observadas em retinoblastomas e retinomas..... 4
Figura 2
Foto de microscopia eletrônica demonstrando um “fleurette”........... 5
Figura 3
Fotomicroscopia de rosetas e “fleurettes”.......................................... 6
Figura 4
Características do segundo evento somático em pacientes com
tumores germinativos.........................................................................
14
Figura 5
Vias moleculares onde a ausência de pRb pode levar à apoptose
através da liberação de E
2
F.................................................................
17
Figura 6
Diagrama do modo de ação da proteína Bcl-x
L
.................................. 19
Figura 7
p53 pode induzir tanto parada do ciclo celular quanto apoptose........ 26
Figura 8
M.E. e fotomicroscopia das células do retinoblastoma viáveis,
necróticas e apoptóticas......................................................................
32
Figura 9
Fotografia de lâmina obtida da plataforma de “tissue microarray”
submetidas à reações imunoistoquímicas...........................................
41
Figura 10
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de p53....................... 54
Figura 11
Expressão de p53, PUMA e Bax em áreas com hipóxia.................... 54
Figura 12
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bax....................... 54
Figura 13
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de PUMA.................. 56
Figura 14
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bak.................... 56
Figura 15
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bim
LONG
............... 56
Figura 16
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Smac/DIABLO.... 57
Figura 17
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de APAF-1................ 57
Figura 18
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de pró-caspase-3....... 57
Figura 19
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bcl-x
L
................... 58
Figura 20
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bcl-2.................... 58
Figura 21
Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de MDM2................. 58
Figura 22
Curva ROC demontrando a comparação entre as medidas do ACIS
III® e as medidas da microscopia óptica........................................... 63
Figura 23
Fotomicroscopia de reação imunoistoquímica para caspase-3
clivada.................................................................................................
67
Figura 24
Distribuição dos valores do índice apoptótico medido....................... 68
Figura 25
Correlação entre expressão de Bcl-x
L
e caspase-3 clivada................. 71
Figura 26
Fotomicrocospia demonstrando a expressão das proteínas
relacionadas à apoptose estudadas no retinoma................................. 92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Principais estudos que quantificaram a apoptose no
retinoblastoma..............................................................................
33
Tabela 2
Anticorpos utilizados, clones e origem em relação às proteínas
controladoras da apoptose................................................................ 43
Tabela 3
Gradação da reação imunoistoquímica de acordo com a
intensidade........................................................................................ 43
Tabela 4
Gradação da reação imunoistoquímica de acordo com o número de
células coradas............................................................................. 44
Tabela 5
Características demográficas e clínicas............................................ 48
Tabela 6
Estadiamento clínico e anátomo patológico do retinoblastoma....... 49
Tabela 7
Seguimento dos pacientes................................................................. 50
Tabela 8
Análise univariada de sobrevida segundo variáveis clínicas e
demográficas.................................................................................... 51
Tabela 9
Análise univariada da sobrevida segundo variáveis anátomo
patológicas........................................................................................ 52
Tabela 10
Expressão à imunoistoquímicas das proteínas avaliadas por
microscopia óptica............................................................................ 59
Tabela 11
Expressão imunoistoquímica das proteínas de expressão
citoplasmática avaliadas na plataforma ACIS III®..........................
60
Tabela 12
Expressão imunoistoquímica das proteínas de expressão nuclear
avaliadas na plataforma ACIS III®..................................................
60
Tabela 13
Comparação das áreas sob a curva ROC para cada marcador
citoplasmático e escolha do ponto de corte baseado no ponto da
curva ROC mais próximo do ponto (0,1)......................................... 62
Tabela 14
Comparação das áreas sob a curva ROC dos marcadores
imunoistoquímicos de padrão nuclear..............................................
63
Tabela 15
Índice kappa de concordância entre os valores obtidos na
microscopia óptica e os valores obtidos através da estratificação
dos resultados obtidos no ACIS III® para os marcadores
citoplasmáticos................................................................................... 65
Tabela 16
Índice kappa de concordância entre os valores obtidos na
microscopia óptica e os valores obtidos através da estratificação
dos resultados obtidos no ACIS III® para os marcadores nucleares.
66
Tabela 17
Índice Apoptótico.............................................................................. 67
Tabela 18
Correlação de AI e medidas da caspase 3 clivada feitas no ACIS
III®.................................................................................................... 69
Tabela 19
Correlação entre caspase 3 clivada e proteínas relacionadas à
apoptose.............................................................................................
70
Tabela 20
Correlação entre expressão de p53 com a expressão das demais
proteínas.............................................................................................
72
Tabela 21
Verificação de associação entre índice apoptótico e extensão
tumoral............................................................................................... 72
Tabela 22
Expressão imunoistoquímica e extensão tumoral.............................. 73
Tabela 23
Extensão tumoral e a expressão imunoistoquímica medida no
ACIS III®..........................................................................................
74
Tabela 24
Sobrevida segundo as medidas semi quantitativas feitas através da
microscopia óptica............................................................................. 75
Tabela 25
Sobrevida global segundo as medidas obtidas na plataforma ACIS
III®.................................................................................................... 77
Tabela 26
Análise univariada de sobrevida segundo o índice apoptótico.......... 78
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AI índice apoptótico
APAF-1 “apoptotic activation factor-1”
Bak “Bcl-2 homologous antagonist/ killer”
Bax “Bcl-2–associated X protein”
Bcl-2 “B-Cell Lymphoma/Leukemia-2”
Bcl-x
L
“B-Cell Lymphoma/Leukemia-x large”
BH3 “Bcl-2 homology domain”
Bim “Bcl-2 interacting mediator of cell death”
Bim
EL
“Bcl-2 interacting mediator of cell death extra long”
Bim
L
“Bcl-2 interacting mediator of cell death long”
Bim
S
“Bcl-2 interacting mediator of cell death short”
Caspase “cysteine-aspartic-acid-proteases”
CCSG “Children Cancer Study Group”
DIABLO “Direct IAP Binding Protein with low isoeletric point”
DNA “Deoxyribonucleic acid”
DP desvio padrão
EGFR “Epidermal Growth Factor Receptor”
H&E coloração de hematoxilina & eosina
HIF “Hypoxia inducible transcription factor”
IAP inibidores de apoptose (ou “inibitor of apoptosis protein family”)
IL-3 interleucina-3
ISEL “in situ end-labeling technique”
MDM2 “murine double minute – 2”
M.E. microscopia eletrônica
NO óxido nítrico
p53 proteína 53 ou “tumor protein 53”
pRb proteína Rb
PUMA “p53 upregulated modulator of apoptosis”
Rb1 genes do retinoblastoma
rNTP ribonucleotídeos trifospato
SG sobrevida global
Smac “Second mitochondria-derived activator of caspases”
ROC curva “Receiver operating characteristic”
TMA “tissue microarray”
TNF-1 “tumoral necrosis factor-1”
TNM Classificação de Tumores Malignos TNM (T descreve o tamanho do
tumor; N, linfonodo regional; e M, metástases)
TTT termoterapia transpupilar
TUNEL “terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end
labelling”
VEGF “Vascular endothelial growt factor”
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................1
1.1 Epidemiologia...................................................................................................1
1.2 Apresentação Clínica........................................................................................2
1.3 Aspectos Anátomo-Patológicos........................................................................2
1.4 Terapêutica do Retinoblastoma.........................................................................7
1.5 Estadiamento...................................................................................................10
1.6 Prognóstico do Retinoblastoma......................................................................11
1.7 O Modelo de Knudson....................................................................................12
1.8 Gene do Retinoblastoma.................................................................................14
1.9 A proteína Retinoblastoma (pRb)...................................................................15
1.10 Apoptose.........................................................................................................16
1.10.1 Definição, funções e mecanismos...................................................................16
1.10.2 Moléculas envolvidas na apoptose..................................................................20
1.10.3 Métodos de detecção da apoptose...................................................................30
2 OBJETIVOS E HIPÓTESES......................................................................35
2.1 Objetivos.........................................................................................................35
2.2 Hipóteses.........................................................................................................35
2.3 Objetivos post hoc...........................................................................................36
2.4 Hipóteses post hoc..........................................................................................36
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS.......................................................................37
3.1 Seleção das Amostras......................................................................................37
3.2 Coleta de dados no prontuário........................................................................37
3.3 Avaliação histológica......................................................................................38
3.4 Confecção da “Tissue Array”..........................................................................39
3.5 Imunoistoquímica............................................................................................41
3.6 Análise Estatística...........................................................................................44
3.7 Comissão de ética............................................................................................45
4 RESULTADOS..............................................................................................46
4.1 Características dos pacientes incluídos no estudo...........................................46
4.2 Análise univariada de sobrevida a partir dos dados clínicos e anátomo-
patológicos......................................................................................................51
4.3 Imunoistoquímica............................................................................................52
4.4 Comparação dos resultados da avaliação pela microscopia óptica e das
medidas obtidas pelo ACIS III®.....................................................................61
4.5 Índice Apoptótico e a expressão de Caspase-3 clivada...................................66
4.6 Correlação entre as medidas quantitativas do índice apoptótico e as
medidas da caspase-3 clivada realizadas no ACIS III®.................................68
4.7 Correlação entre as medidas de expressão feitas pelo ACIS III® e o índice
apoptótico........................................................................................................69
4.8 Verificação de associação entre o índice apoptótico e a extensão tumoral.....72
4.9 Verificação de associação entre a expressão imunoistoquímica e a
extensão tumoral.............................................................................................73
5 DISCUSSÃO..................................................................................................79
6 CONCLUSÕES.............................................................................................97
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................98
ANEXOS
Anexo 1 Classificação de REESE-ELLSWORTH
Anexo 2 ABC – CLASSIFICAÇÃO DE MURPHREE
Anexo 3 Classificação do CCSG-962
Anexo 4 Proposta de classificação do Retinoblastoma
Anexo 5 Dados clínicos, epidemiológicos, histopatológicos e
imunistoquímicos
Anexo 6 Protocolo de Imunoistoquímica
1
1 INTRODUÇÃO
Retinoblastoma é a neoplasia maligna que se origina de células embrionárias
da retina. Estudos imunoistoquímicos, ultraestruturais e moleculares, além das
características histopatológicas, corroboram o conceito de que o retinoblastoma surge
de células totipotentes (DYER e BREMNER 2005).
1.1 EPIDEMIOLOGIA
É a neoplasia intraocular maligna mais freqüente na infância. Sua incidência
é de aproximadamente 1:18000 nascidos vivos (DEVESA 1975) e tem havido poucas
alterações nesta taxa nas últimas décadas (TAMBOLI et al. 1990). Acomete
principalmente crianças entre o nascimento e 5 anos de idade embora também possa
ocorrer em crianças mais velhas (DE AGUIRRE NETO et al. 2007) e até mesmo
adultos (ODASHIRO et al. 2005). No Brasil, os dados do Registro de Câncer de
Base Populacional apresentam uma incidência de 0,61/100.000 para o sexo
masculino em São Paulo, e de 0,60/100.000 para o sexo feminino em Fortaleza
(Ministério da Saúde 2003). Também não há evidências de diferenças na incidência
entre raças, embora pareça ocorrer diferenças importantes na incidência entre países,
com países em desenvolvimento na América Latina, África e Ásia apresentando
maior incidência (HURWITZ et al. 2002).
2
1.2 APRESENTAÇÃO CLÍNICA
A apresentação clínica do retinoblastoma depende do tamanho e da
localização do tumor. O principal sinal é a leucocoria. Outras freqüentes
apresentações são: proptose, estrabismo, glaucoma e perda da visão. Endoftalmite,
uveíte, hifema espontâneo, heterocromia de íris, anisocoria, neovasos de íris,
deposição de tumor na íris e no cristalino são apresentações pouco freqüentes do
retinoblastoma (BINDER 1974; BALASUBRAMANYA et al. 2004). Em tumores
metastáticos ao diagnóstico, a sintomatologia depende do órgão ou tecido acometido
(GUNDUZ et al. 2006).
Os Retinoblastomas podem ser classificados como: germinais ou esporádicos.
Os pacientes portadores de tumores germinais geralmente apresentam
retinoblastomas bilaterais ou unilaterais multifocais, enquanto os pacientes
portadores de esporádicos apresentam tumores únicos e unilaterais. Ao diagnóstico, a
média de idade dos pacientes com tumores germinais é de 12 meses, enquanto nos
pacientes com tumores esporádicos é de 24 meses (AUGSBURGER et al. 2004).
1.3 ASPECTOS ANÁTOMO-PATOLÓGICOS
Macroscopicamente, o retinoblastoma pode apresentar diferentes padrões de
crescimento. Retinoblastomas com padrão endofítico são tumores friáveis que
crescem em direção ao corpo vítreo e podem apresentar inúmeras sementes vítreas.
Os de padrão exofítico crescem em direção à coroide, acometendo primeiro o espaço
subrretiniano causando descolamento de retina, e depois ultrapassando a membrana
3
de Bruch e invadindo a coroide. Há ainda um padrão de crescimento mais raro que é
o difuso, que causa espessamento da retina sem calcificações (BHATNAGAR e
VINE 1991). Não parece haver importantes diferenças na evolução entre os
retinoblastomas exofíticos e endofíticos, exceto que os tumores exofíticos
apresentem maior taxa de invasão da coroide (PALAZZI et al. 1990). Contudo, um
retinoblastoma de padrão difuso geralmente apresenta estadiamento mais avançado à
enucleação (BHATNAGAR e VINE 1991).
Microscopicamente, o retinoblastoma é composto de células com um núcleo
grande e basofílico, e citoplasma escasso. Apresenta áreas de necrose, inúmeras
figuras de mitose e de apoptose. Há também calcificações que são vistas em áreas de
necrose tumoral. Se a necrose é extensa, as células necróticas podem liberar seu
DNA que se apresenta como um material basofílico na parede dos vasos sanguíneos.
A vascularização é proeminente, e cada vaso sanguíneo é circundado por um
manguito de células viáveis. As células tumorais localizadas em uma distância maior
que 90-110 micrometros podem sofrer necrose ou apoptose (MCLEAN et al. 1994).
A quantificação da área vascular representa um fator prognóstico independente de
fatores de evolução clássicos como invasão do nervo óptico e invasão da coroide,
provavelmente porque a capacidade de recrutamento de vasos pelo tumor está
relacionada à sua progressão (MARBACK et al. 2003).
A formação de rosetas é uma das características histológicas mais conhecidas
do retinoblastoma (Figura 1). A roseta de Flexner-Wintersteiner é composta por
células cuboidais que circundam um lúmen apical que contém mucopolissacárides
ácidos resistentes à hialuronidase de forma similar aos mucopolissacárides existentes
próximos a bastonetes e cones (MCLEAN 1996). Os “fleurettes” apresentam
4
diferenciação para fotorreceptor que lembram os segmentos internos dos cones. A
Figura 2 apresenta as características ultraestruturais dos “fleurettes” com acúmulo de
mitocôndrias nas suas projeções. As rosetas de Homer-Wright se assemelham às
rosetas de Flexner-Wintersteiner, mas não apresentam lúmen (FONT et al. 2006). A
Figura 3 demonstra o aspecto das rosetas e “fleurettes” nas colorações habituais.
Legenda: A – Roseta de Flexner-Wintersteiner; B - Roseta de Homer-Wright; C - “fleurettes”
Fonte: Adaptado de YANOFF e FINE (2002).
Figura 1 - Tipose de estruturas observadas em retinoblastomas e retinomas.
A quantificação da formação de rosetas está relacionada ao grau de
diferenciação dos retinoblastomas, sendo adotada a classificação de bem,
moderadamente e pouco diferenciado dependendo da porcentagem da área onde é
observada a formação de rosetas de Flexner-Wintersteiner. Tumores com mais que
5
80% da área com formação destas rosetas são classificados como bem diferenciados,
enquanto os que não apresentam formação de rosetas são classificados como pouco
diferenciados; e os intermediários como moderadamente diferenciados. A
diferenciação do retinoblastoma parece não ter importância prognóstica
(KHELFAOUI et al. 1996) embora os estudos iniciais demonstrassem que os
retinoblastomas pouco diferenciados apresentavam pior evolução (ANDERSEN
1971). No entanto, SCHOUTEN-VAN MEETEREN et al. (2001) demonstraram que
os tumores pouco diferenciados têm maior sensibilidade in vitro a quimioterápicos
tais como a carboplatina, doxorrubicina e ifosfamida.
Legenda: fotomicroscopia eletrônica de um “fleurette”. Observar as inúmeras mitocôndrias (m) no
ápice da estrutura.
Fonte: Adaptado de YANOFF e FINE (2002)
Figura 2 - Foto de microscopia eletrônica demonstrando um “fleurette”.
6
A principal forma de progressão do retinoblastoma é através do nervo óptico
onde as células tumorais se espalham entre as fibras nervosas e infiltram o espaço
subaracnoide através da pia-mater. Desta forma, um dos principais fatores
prognósticos do retinoblastoma é o status do nervo óptico à enucleação
(KHELFAOUI et al. 1996).
Legenda: Coloração de H&E: A – Roseta de Flexner-Wintersteiner; B - Roseta de Homer-Wright; C
- “fleurettes”
Figura 3 - Fotomicroscopia de rosetas e “fleurettes”.
Em relação à invasão da coroide, há inúmeras formas de classificar e
interpretar os achados histológicos. Em diferentes serviços, o conceito de invasão
difusa da coroide pode variar desde: a invasão tem que ser maior que 3 mm;
apresentar mais que 3 focos; invadir mais que 50% da espessura da coroide ou ter
que invadir toda a espessura da coroide até tocar a esclera (CHANTADA et al.
2008). Entretanto, a maioria dos autores concorda que a invasão da coroide também é
fator de pior prognóstico. KHELFAOUI et al. (1996), demonstraram que 7% dos
pacientes tiveram recaídas da neoplasia no grupo dos pacientes sem invasão da
coroide, enquanto cerca de 25% dos pacientes com invasão maciça da coroide
recidivaram.
7
A invasão da câmara anterior é mais frequente nos pacientes com recaída,
mas esse fator não foi significante em uma análise multivariada (KHELFAOUI et al.
1996).
1.4 TERAPÊUTICA DO RETINOBLASTOMA
As modalidades de tratamento são variadas, sendo a mais antiga forma de
tratamento a enucleação (ABRAMSON e SCHEFLER 2004), que ainda é utilizada
em alguns casos específicos. Entretanto, a enucleação leva a perda definitiva da
função visual e por isso houve uma busca por formas de tratamento conservadores do
retinoblastoma.
Uma das primeiras opções utilizadas para o tratamento conservador foi a
radioterapia externa. É ainda indicada para tumores maculares pequenos com o
intuito de preservar a visão central. Há restrições ao uso de radioterapia
principalmente pelo aumento do risco de segundas neoplasias nos casos de tumores
germinais. Outras complicações são: catarata, lesões vasculares com possíveis
hemorragias vítreas e hipoplasia de ossos faciais e temporais. Com as altas taxas de
cura observadas nesses pacientes, o refinamento nas novas modalidades terapêuticas
foram se impondo (ABRAMSON e SCHEFLER 2004).
A terapêutica oftalmológica utilizada em tumores intraoculares como a
fototerapia, com a utilização de LASER, é indicada em tumores pequenos distantes
da mácula ou da papila. O LASER é aplicado em torno da base do tumor com o
objetivo de impedir o suprimento sanguíneo do tumor (ABRAMSON e SCHEFLER
2004).
8
A termoterapia transpupilar (TTT) é a utilização de energia em forma de raios
infravermelhos. Ao contrário da fototerapia, a termoterapia é aplicada sobre o tumor,
levando as células tumorais a uma temperatura em torno de 45-60
o
C, que não é capaz
de causar necrose, mas leva à ativação direta da apoptose (ABRAMSON e
SCHEFLER 2004). Por isso, a TTT pode ser utilizada em tumores peripapilares. Em
lesões periféricas, os raios infravermelhos também podem ser aplicados através da
conjuntiva por um “probe” especial.
A crioterapia pode ser usada como terapia primária para retinoblastomas
quando o tumor é pequeno (menor que 3-4 diâmetros de papila) e periférico. Após a
colocação do probe de crioterapia, o tumor é congelado rapidamente o que causa a
formação de cristais de gelo, desnaturação de proteínas e alterações do pH que levam
a ruptura da membrana das células tumorais. Além disso, a crioterapia causa morte
das células tumorais pela destruição da circulação sanguínea através dos danos
causados às celulas endoteliais e pela formação de trombos (ABRAMSON e
SCHEFLER 2004).
A braquiterapia é utilizada principalmente em tumores medindo entre 4 e 10
diâmetros de disco e em tumores que não regrediram após a utilização de fototerapia
ou crioterapia. O Iodo
125
é o isótopo mais comumente utilizado. O material
radioativo pode ser colocado dentro de placas com tamanho correspondente ao tumor
e a grande vantagem do uso destas placas é que há uma exposição mínima de
radiação para os cuidadores. A placa é removida após 3-5 dias (ABRAMSON e
SCHEFLER 2004).
A quimioterapia sistêmica é utilizada para tratamento de pacientes com
retinoblastoma intraocular, com prognóstico visual, que se apresentam com tumores
9
muito grandes para serem controlados com os tratamentos locais (ABRAMSON e
SCHEFLER 2004). É utilizada para a diminuição do volume do tumor, e então, o
tratamento é complementado por tratamentos locais. A quimioterapia sistêmica para
portadores de retinoblastoma intraoculares com o objetivo de preservação do globo
ocular foi proposto nos anos 90 por SHIELDS et al. (1996). Além disso, a utilização
da quimioterapia sistêmica pode ser responsável pela diminuição dos casos de
retinoblastomas trilaterais (SHIELDS et al. 2001). A experiência do Hospital A.C.
Camargo, com um esquema quimioterápico que utilizou carboplatina, etoposide e
vincristina em 84 pacientes, apresentou como resultado a conservação de 49% dos
globos oculares com retinoblastoma e 36% dos olhos com retinoblastoma foram
tratados sem a necessidade de radioterapia externa. Neste grupo, não houve relatos
de sérias complicações ao tratamento quimioterápico (ANTONELI et al. 2006).
Entretanto, a enucleação ainda é utilizada quando as formas de tratamento
conservadoras como quimioterapia, fototerapia ou braquiterapia não apresentam
resposta terapêutica. É ainda preconizada como tratamento primário em casos sem
prognóstico visual e em casos de tumores avançados como: casos com envolvimento
extenso da retina, rubeosis iridis, glaucoma secundário, ou extensa invasão da
coróide e do nervo óptico (BALMER et al. 2006). Após a enucleação, não há um
consenso sobre a necessidade de tratamento quimioterápico adjuvante em casos de
doença envolvendo coróide e nervo óptico (STEINHORST 2006).
O tratamento de retinoblastomas extraoculares é complexo e depende
principalmente do estadiamento (Anexo 2). Nos tumores extraoculares com
envolvimento microscópico dos emissários esclerais, o tratamento preconizado é
apenas quimioterapia sem a utilização de radioterapia. Para os pacientes com
10
margem do nervo óptico ou tecido orbitário comprometidos, o tratamento
preconizado é quimioterapia e radioterapia externa. O esquema quimioterápico
geralmente utilizado são ciclos de cisplatina e tenoposide alternado com
ciclofosfamida, vincristina e doxorrubicina. Protocolo realizado neste hospital com a
adição de ifosfamida e etoposide com a retirada da ciclofosfamida, vincristina e
doxorrubicina apresentou melhora da sobrevida (ANTONELI et al. 2007a). A
radioterapia externa é aplicada na órbita nesses pacientes com estadio II e III da
classificação de CCSG. Nos pacientes com estadio IV, além do esquema de
quimioterapia, é utilizada radioterapia em todo o cérebro e neuroeixo. Nos pacientes
com estadio V, a ratioterapia é aplicada na área da metástase (ANTONELI et al.
2003). Além deste tratamento, ciclos de quimioterapia intratecal com metrotexate,
citarabina e dexametasona são utilizados. Mesmo assim, os pacientes com
comprometimento de sistema nervoso central tem pequena resposta ao tratamento
(ANTONELI et al. 2007b).
1.5 ESTADIAMENTO
Há diferentes formas de estadiamento do retinoblastoma e não foi
estabelecido um sistema de estadiamento padrão. Devido às múltiplas formas
disponíveis de tratamento do retinoblastoma, à complexidade da anatomia ocular e,
principalmente, à diferença prognóstica entre tumores intra e extraoculares, muitos
serviços adotam uma escala de estadiamento para tumores intraoculares e outra para
tumores extraoculares. Somente os esquemas de estadiamento de St. Jude (PRATT et
11
al. 1997) e da Classificação de Tumores Malignos TNM (SOBIN e WITTEKIND
2004) contemplam tumores intraoculares e extraoculares.
Durante muitos anos, a escala de estadiamento mais utilizada nos
retinoblastomas intraoculares foi a escala de Reese-Ellsworth (Anexo 3) publicada
em 1963 (REESE e ELLSWORTH 1963). Esta escala foi criada para predizer a
resposta dos tumores à radioterapia de feixes externos.
Recentemente, com novas formas de tratamento do retinoblastoma
intraocular, outras formas de classificação apareceram e a mais promissora é a
International Classification of Intraocular Retinoblastoma (ABC Classification)
(MURPHREE 2005). Esta classificação leva em conta as novas modalidades de
tratamento passíveis de preservação do globo ocular e divide os tumores em 5
categorias (Letra A até E) dependendo do sucesso ou fracasso terapêutico (Anexo 2).
O estadiamento de tumores extraoculares pode ser estabelecido por diferentes
esquemas como a classificação criada pelo Children Cancer Study Group segundo
Wolff et al. (1978), citado por ANTONELI et al. (2003b, p.403), (Anexo 3) e a
classificação internacional proposta por CHANTADA et al. (2006) envolvendo
centros de tratamento do retinoblastoma em diferentes continentes (Anexo 4).
1.6 PROGNÓSTICO DO RETINOBLASTOMA
O prognóstico do Retinoblastoma depende principalmente do estadio da
neoplasia ao diagnóstico. Enquanto pacientes com tumores que são diagnosticados
quando ainda não apresentaram extensão para estruturas extraoculares apresentam
sobrevida em 5 anos de até 99% (ABRAMSON e SCHEFLER 2004) as taxas de
12
sobrevida de pacientes com extensão extraocular estão em torno de 50-60%
(ANTONELI et al. 2003).
No Brasil, observa-se um declínio das taxas de mortalidade do
Retinoblastoma nos últimos anos (RIBEIRO e ANTONELI 2007). Essa taxa
decresceu no sexo masculino de 0,14:100.000 em 1981 para 0,06:100.000 habitantes
em 1994. Isto é provavelmente decorrente da melhora do tratamento do
retinoblastoma, encaminhamento precoce dos pacientes e a campanhas educacionais
direcionadas aos profissionais de saúde (RIBEIRO e ANTONELI 2007).
1.7 O MODELO DE KNUDSON
O Retinoblastoma sempre foi um modelo de estudo para outras neoplasias.
KNUDSON (1971) propôs o modelo do duplo evento mutacional, para explicar a
origem dos retinoblastomas, tanto os unilaterais quanto os bilaterais. Em 1975,
KNUDSON estendeu este modelo para explicar a origem de outras neoplasias da
infância.
A partir dos estudos no retinoblastoma, foi também feita a descrição de um
gene supressor de tumores. Esse gene está localizado no braço longo do cromossomo
13 e é denominado gene do Retinoblastoma (RB1) (FRIEND et al. 1986). Outras
neoplasias como carcinoma urotelial ou carcinoma de pequenas células do pulmão
também podem apresentar alterações nesse gene (SCAMBIA et al. 2006).
A proposta de Knudson foi de que os tumores unilaterais apresentavam maior
tempo para o aparecimento porque necessitavam de dois eventos numa mesma célula
para o seu aparecimento. Os tumores bilaterais, em alguns casos de pacientes com
13
história familiar positiva, necessitavam da metade do tempo para o desenvolvimento
do tumor pois o primeiro evento teria sido herdado. O fato de todas as células do
corpo terem herdado esse evento explicaria a presença de inúmeros focos do tumor ,
visto que o segundo evento poderia ocorrer em várias células da retina. Esse fato
também justificaria a maior susceptibilidade desses pacientes a segundas neoplasias
(HARBOUR 2006).
Os tumores bilaterais geralmente são conseqüência de mutações germinativas
do gene do retinoblastoma (gene RB1). A possibilidade de um paciente desenvolver
um retinoblastoma bilateral como consequências de mutações somáticas é em torno
de 1:1.000.000.000 (MURPHREE 1998). Entretanto, aproximadamente 82% dos
pacientes com tumores bilaterais não apresentam história familiar. Apresentam
mutações germinativas novas ou mutações herdadas de baixa penetrância que não
comprometeram o genitor afetado. Neste último caso, é comum ao exame de
mapeamento da retina, o encontro de um retinocitoma assintomático neste genitor
afetado (MURPHREE 1998).
Os tumores unilaterais, em sua maioria, são conseqüências de duas alterações
somáticas. Entretanto, um terço dos pacientes com história familiar positiva
apresenta doença unilateral (AUGSBURGER et al. 2004). Isso pode ser explicado
porque alguns tipos de mutação do gene Rb1 (ou em seu promotor) podem produzir
quantidades deficientes de proteína Rb (pRb) ou proteínas mutantes com atividade
parcial (BREMNER et al. 1997; HARBOUR 2001). E a quantidade de atividade da
pRb também depende do tipo de segundo evento que ocorre nas células precursoras
(Figura 4). E mesmo pacientes com tumores unilaterais, unifocais e sem história
familiar podem apresentar estas mutações germinativas (BRICHARD et al. 2006).
14
Legenda: características do segundo evento somático em pacientes com tumores germinativos, e como
as mutações associadas a baixa penetrância se comportam dependendo de qual foi o segundo evento.
Fonte: Adaptado de HARBOUR (2001)
Figura 4 - Características do segundo evento somático em pacientes com tumores
germinativos.
1.8 GENE DO RETINOBLASTOMA
O gene de susceptibilidade do Retinoblastoma Humano (RB1) é um gene
com 27 éxons primeiramente descrito em 1986 (FRIEND et al. 1986). Apresenta
inúmeras alterações catalogadas, desde mutações “nonsense”, “missense”, “splicing”
e pequenas deleções e inserções que se acumulam em áreas denominada “hot spots”
(VALVERDE et al. 2005). Esses “hot spots” coincidem com áreas preservadas da
proteína durante a evolução denominas “box a” e “box b” responsáveis pela ligação
da pRb com o fator de transcrição E
2
F (HARBOUR 2001). Há também perda do
15
gene RB1 consequente a deleções de parte do cromossomo 13, que podem causar
além dos tumores oculares, deformações dos ossos do crânio, retardo mental e no
desenvolvimento neuropsicomotor (BRICHARD et al. 2008).
1.9 A PROTEÍNA RETINOBLASTOMA (pRb)
O gene RB1 codifica uma fosfoproteína nuclear de 110 kDa com uma
seqüência de 928 aminoácidos, que é a proteína do retinoblastoma (pRb). Ela se liga
a membros da família de fatores de transcrição E
2
F inibindo sua ação. Esses fatores
de transcrição regulam genes necessários durante a progressão do ciclo celular. O
RB1 age então como gene supressor de tumor, em parte pela supressão do ciclo
celular na transição G1/S. Isso explica porque a inativação dos dois genes RB1 retira
o fator de inibição da progressão do ciclo celular na transição G1/S o que resulta em
uma proliferação celular desregulada (CLASSON e HARLOW 2002).
A proteína pRb também apresenta importante papel na diferenciação celular.
Havia um modelo teórico que a pRb atuava na diferenciação apenas retirando a
célula do ciclo celular. Atualmente o consenso é que a pRb atua na diferenciação
através de mecanismos diferentes daqueles da ligação com as proteínas E
2
F, que
fazem o controle do ciclo celular. Mesmo proteínas com alterações nos sítios de
ligação com E
2
F mantém propriedades de promover a diferenciação celular
(GOODRICH 2006).
A proteína pRb apresenta importante atuação na apoptose. Os camundongos
sem as duas cópias do gene RB1 apresentam sérias anormalidades em sistema
nervoso central e hematopoiese devido a intensa e aberrante apoptose nestes tecidos
16
causando a morte do embrião antes do nascimento (CLARKE et al. 1992).
Entretanto, foi observado que as placentas destes camundongos apresentavam
alterações na sua arquitetura e função. E que os embriões RB1-/- com placenta
normal (RB1+/+) não apresentaram a apoptose aberrante, ou seja, parece que na
ausência de pRb, as células ficariam mais sensibilizadas à apoptose sob o estímulo
isquêmico causado pelas alterações na placenta (DE BRUIN et al. 2003). Em muitos
tecidos, a perda de pRb induz a expressão de grandes quantidades de p14
ARF
que
inibe a função das proteínas antiapoptóticas MDM2 (“murine double minute – 2”) e
MDM4 e ativa o processo de apoptose dependente de p53 (GUO et al. 2008). Como
observado na Figura 5, na ausência de pRb, os fatores de transcrição E
2
F
1
são
liberados e ativam a transcrição de proteínas como o “apoptotic activation factor-1”
(APAF-1) (MORONI et al. 2001) e procaspases importantes na apoptose
(GINSBERG 2002). E
2
F
1
aumenta a atividade de p53 através de ligações diretas à
proteína e do aumento de p53 quinases aumentando sua atividade de transcrição de
proteínas pró-apoptóticas como Bax (“Bcl-2–associated X protein”), APAF-1,
caspases, e inibindo a transcrição de Bcl-2 (HERSHKO e GINSBERG 2004).
1.10 APOPTOSE
1.10.1 Definição, funções e mecanismos
A apoptose é frequentemente definida como uma forma de morte celular que
envolve uma sequência de ativação de proteínas denominadas caspases
(DEGTEREV e YUAN 2008). É caracterizada por alterações morfológicas nas
células como fragmentação do núcleo, formação de protusões na membrana
17
(“membrane blebbing”) e formação de corpos apoptóticos. Existem outras formas de
morte celular “programada”: a morte celular autofágica (ou tipo II), necroptose, e
morte celular mediada pela PARP-1.
Fonte: Adaptado de GINSBERG (2002)
Figura 5 - Vias moleculares onde a ausência de pRb pode levar à apoptose
através da liberação de E
2
F.
18
A apoptose está presente nos tecidos desde a embriogênese. É importante
para os organismos pluricelulares para a eliminação de células redundantes,
danificadas ou infectadas por patógenos (ADAMS e CORY 1998). Está presente nos
tumores tanto na sua regressão quanto em sua fase de crescimento (COTRAN et al.
2005).
A apoptose é ativada por uma cascata de eventos moleculares que culmina
numa fase executora pela ativação de proteínas de nome “caspases”. Essa cascata de
eventos é dividida em via intrínseca e extrínseca (COTRAN et al. 2005).
A via extrínseca é ativada por mensageiros externos à célula. Os fatores de
apoptose mais estudados nesta via é o receptor do “tumoral necrosis factor-1” (TNF-
1) e o receptor Fas2.
A via intrínseca é controlada principalmente pela família de proteínas Bcl-2
(B-Cell Lymphoma-2), localizada nas mitocôndrias. A proteína Bcl-2 foi
primeiramente isolada em células que perderam a capacidade de apoptose de uma
linhagem obtida a partir de células neoplásicas de um paciente portador de leucemia
mieloide. Esta família de proteínas está subdividida em 3 sub-famílias: sub-família
Bcl-2 (antiapoptótica) constituída por Bcl-2 e Bcl-x
L
; sub-família Bax (pró-
apoptótica) constituída por Bax, Bak e Bok, e sub-família BH3 “only” (pró-
apoptótica) constituída pelas proteínas Bik, Blk, Bim e PUMA. O equilíbrio dessas
proteínas pró-apoptóticas e antiapoptótica funciona como um reostato para o início
do programa de apoptose (ADAMS e CORY 1998).
As proteínas da família Bcl-2 atuam na integridade da membrana
mitocondrial, impedindo ou estimulando a liberação do citocromo-C no citosol. Uma
vez liberado no citosol, o citocromo-C forma com a APAF-1 (apoptosis activation
19
factor-1) um complexo proteico denominado apoptossomo que por sua vez, cliva a
prócaspase-9 formando a proteína efetora caspase-9 (ZOU et al. 1999).
Especificamente a proteína Bcl-X
L
liga-se à proteína APAF-1 impedindo-a de ativar
a procaspase-9. No caso de um sinal pró-apoptótico ser enviado (Figura 6), proteínas
pró-apoptóticas do grupo BH3 “only” tentarão se ligar ao Bcl-X
L
para que a proteína
APAF-1 seja liberada (ADAMS e CORY 1998).
Legenda: Para bloquear a apoptose, Bcl-xL se liga à APAF-1. Um estímulo apoptótico que aumenta
as proteínas do grupo BH3 “only” irá bloquear a função da proteína Bcl-x
L
.
Fonte: Adaptado de ADAMS e CORY (1998).
Figura 6 - Diagrama do modo de ação da proteína Bcl-x
L
.
A caspase-9 clivada atua sobre a pró-caspase-3 formando a caspase-3 clivada.
A caspase-3 clivada, por sua vez, ativa a caspase-9 formando uma alça de
retroalimentação positiva que amplifica o sinal apoptótico.
A partir da ativação das caspases, começa a fase efetora da apoptose. As
caspases atuam sobre várias estruturas celulares. Elas clivam citoesqueleto e
20
proteínas da matriz nuclear, além de proteínas que fazem transcrição, replicação e
reparo do DNA. Também ativam DNAse pela clivagem de um inibidor desta enzima
(COTRAN et al. 2005).
1.10.2 Moléculas envolvidas na apoptose
• Bcl-2
Bcl-2 tem função essencial na sobrevivência da célula através da inibição da
liberação do citocromo C pela mitocôndria. O gene do Bcl-2 foi primeiro localizado
através de estudos de linhagens de células de leucemia linfoblástica aguda de um
paciente adulto que apresentava duas translocações: t(8;14) comum no linfoma de
Burkitt e t(14;18) comum no linfoma folicular (PEGORARO et al. 1984). Para este
gene no cromossomo 18, foi dado o nome de Bcl-2 (PEGORARO et al. 1984;
TSUJIMOTO et al. 1984). Entretanto, somente após alguns anos de estudo, seu papel
biológico foi ligado ao aumento da sobrevivência celular em experimentos em
culturas de células da medula óssea. Estas células, que são dependentes de
interleucina-3 (IL-3), foram infectadas por um retrovírus contendo a sequência de
Bcl-2. Quando a IL-3 foi retirada, as células infectadas pelo vírus que continham
excesso de Bcl-2 sobreviveram sem apresentarem proliferação (VAUX et al. 1988).
Os estudos que utilizaram imunoistoquímica em amostras de retinoblastoma
encontraram resultados divergentes: em alguns, não houve expressão
imunoistoquímica (YUGE et al. 1995; COUPLAND et al. 1998) enquanto em outros
houve expressão fraca de Bcl-2 (TATLIPINAR et al. 2002) e expressão moderada de
padrão membrana (FUJISAWA et al. 1998).
21
• Bak
A proteína Bak (“Bcl-2 homologous antagonist/ killer”) é um dos membros
da família Bcl-2 que é capaz de ativar a apoptose. A descrição da proteína foi feita
por três grupos de pesquisa diferentes que isolaram a proteína através de sua
capacidade de interagir com a proteína do adenovírus E1B 19K. Esta proteína têm
função de inibir a apoptose da célula infectada pelo vírus (FARROW et al. 1995;
CHITTENDEN et al. 1995b; KIEFER et al. 1995).
É uma proteína de 211 aminoácidos que se localiza na mitocôndria e para
induzir a apoptose, interage e acelera a abertura de um canal de amnios da membrana
mitocondrial que leva a liberação de citocromo C no citosol. A proteína Bak possui
um domínio diferente de BH1 e BH2 (o domínio BH3) que apresenta funções pró-
apoptóticas e a capacidade de ligação com Bcl-x
L
(CHITTENDEN et al. 1995a).
Bak parece ter papel importante na gênese tumoral. Em um estudo utilizando
técnica imunoistoquímica, Bak apresentou diminuição de sua expressão em amostras
de adenomas e adenocarcinomas do cólon em relação à expressão em mucosa normal
(KRAJEWSKA et al. 1996).
• Bax
Bax é uma proteína pró-apoptótica que apresenta um papel chave na apoptose
mediada pela via intrínseca ou mitocondrial (OLTVAI et al. 1993). Sob um estímulo
apoptótico, Bax forma oligômeros que se agregam na membrana mitocondrial e
interagem formando canais de íons depentes de pH e de voltagem (ANTONSSON et
al. 1997). Desta forma, Bax aumenta a liberação do citocromo c da mitocondria para
o citosol (JURGENSMEIER et al. 1998). Em linhagens celulares de retinoblastoma,
22
experimentos utilizando bloqueadores do fator de sobrevivência celular NFkB que
induzem a apoptose nestas células, a transcrição do gene Bax aumenta demonstrando
que esta proteína é um importante regulador da via de apoptose nestas linhagens
(POULAKI et al. 2002).
A diminução da expressão do gene Bax está associado à pior resposta à
quimioterapia e pior sobrevida no câncer de mama (KRAJEWSKI et al. 1995).
A diminuição da expressão de Bax observada através da imunoistoquímica
foi associada à pior prognóstico em pacientes portadores de câncer de pulmão não
pequenas células (JEONG et al. 2008), em pacientes com câncer epidermoide da
boca (KATO et al. 2008), carcinoma de esôfago (KANG et al. 2007), tumor de
células germinativas da infância (ADDEO et al. 2007), carcinoma urotelial da bexiga
(GONZALEZ-CAMPORA et al. 2007), adenocarcinoma da ampola de Water
(SANTINI et al. 2005), carcinoma do ovário e carcinoma do colo uterino
(WOOTIPOOM et al. 2004).
• Bim
Bim (“Bcl-2 interacting mediator of cell death”) foi identificado em
experimentos que determinava quais proteínas se ligam a Bcl-2. Desta forma foi
descoberta esta proteína que apresenta três variantes: Bim
EL
(extra long), Bim
L
(long)
e Bim
S
(short) que possuem respectivamente 198, 138 e 110 aminoácidos. A variante
BimS parece ser o mais potente fator pró-apoptótico. Todas as variantes possuem
localização em membranas citoplasmática como a membrana da mitocôndria, e todas
apresentam a sequência BH3 (O'CONNOR et al. 1998).
23
Bim tem a capacidade de se ligar tanto a Bcl-2 quanto a Bcl-xL assim como
as outras proteínas do grupo “BH3 only” (O'CONNOR et al. 1998).
O estudo de Bim em outras neoplasias apresentou interessantes resultados.
Em experimentos com culturas celulares de carcinomas de pulmão, Bim apresentou
papel fundamental na indução de apoptose em culturas submetidas à inibição de
EGFR por erlotinib (GONG et al. 2007). Em estudos utilizando cultura de células de
carcinoma de células renais, a perda de expressão de Bim estava associada com a
resistência à apoptose (ZANTL et al. 2007).
• MDM2
A proteína MDM2 (“murine double minute – 2”) é um importante regulador
negativo da p53. O gene correspondente, de mesmo nome, foi clonado a partir de
RNA isolado de uma linhagem de células transformadas de camundongo
(CAHILLY-SNYDER et al. 1987). MDM2 é considerado um proto-oncogene. A
amplificação deste gene está associada com uma grande variedade de tumores
incluindo até 20% dos sarcomas de partes moles (MOMAND et al. 1998).
MDM2 interage com um grande número de moléculas, mas sua principal
função é a de inibir a atividade de fator de transcrição da p53 (CHEN et al. 1995).
MDM2 é produzida no citoplasma e necessita voltar ao núcleo. Foi demonstrado que
a PI3Kinase/AKT promove a entrada de MDM2 no núcleo (MAYO e DONNER
2001). No núcleo, MDM2 liga-se diretamente no sítio de transcrição da p53 e este
complexo sai novamente do núcleo e é degradado por proteases (ubiquitininas) no
citoplasma. Uma vez que p53 aumenta a expressão de MDM2, essas duas moléculas
formam uma alça de autorregulação (WU et al. 1993).
24
A proteína MDM2, quando interage com a pRb, perde sua função de inibir a
p53. A pRb também possui a capacidade de formar um complexo trimérico pRb-
MDM2-p53 que protege o p53 da degradação por proteases e mantém a sua função
apoptótica (HSIEH et al. 1999).
MDM2 encontra-se expresso na maioria dos retinoblastomas. A ausência de
expressão de p14ARF, um importante modulador da MDM2, constitui uma evidência
de que a MDM2, bloqueando a função da p53, promove o desenvolvimento do
retinoblastoma (GUO et al. 2008). Reforçando esta hipótese, um estudo utilizando
um inibidor da função da MDM2, uma pequena molécula denominada nutilina-3,
demonstrou que esta molécula pode reativar a função da p53 e induzir apoptose nas
células do retinoblastoma (LAURIE et al. 2006).
Utilizando-se a técnica de imunoistoquímica, MDM2 apresenta expressão
nuclear em 37% dos sarcomas de partes moles (CORDON-CARDO et al. 1994), em
30% dos carcinomas uroteliais da bexiga (LIANES et al. 1994), em 85% dos
linfomas de Hodgkin (CHILOSI et al. 1994), e em 40% dos carcinomas de mama
(MARCHETTI et al. 1995). Entretanto, este último estudo demonstrou que a
amplificação do gene foi observada apenas em 7,7% dos casos demonstrando que o
aumento de MDM2 pode ocorrer por outros mecanismos além da amplificação
gênica.
• p53
A p53 é uma proteína supressora de tumores que induz a apoptose em
resposta a um estresse oncogênico (VOUSDEN e LU 2002). Essa proteína foi
identificada por três grupos distintos de pesquisa que observaram a expressão
25
aumentada desta proteína em linhagens infectadas ou transformada pelo vírus SV40
(LINZER e LEVINE 1979; LANE e CRAWFORD 1979) ou em linhagem celulares
de sarcomas de camundongo induzido por hidrocarbonetos policíclicos (DELEO et
al. 1979).
A p53 funciona predominantemente como um fator de transcrição e é
codificada pelo gene Tp53 localizado no braço curto do cromossomo 17
(MATLASHEWSKI et al. 1984; ISOBE et al. 1986). Este gene foi considerado pelo
grupo de estudos coordenado por Prof. Dr. Bert Vogelstein em 1989, como um gene
supressor de tumores (BAKER et al. 1989; NIGRO et al. 1989). Antes, acreditava-se
que o Tp53 era um oncogene. Isto porque, experimentos demonstraram aumento
transitório de seu transcrito quando células de cultura eram estímuladas a crescer
(REICH e LEVINE 1984) e microinjeções de anticorpos anti-p53 inibiam a divisão
celular se a aplicação fosse feita no período do estímulo de crescimento, sugerindo
que a p53 era uma molécula necessária na transição da fase G0/G1 (MERCER et al.
1984). Além disso, os estudos imunoistoquímicos demonstram que em muitas
neoplasias, há intensa positividade nuclear o que foi interpretado como um depósito
desta proteína no núcleo das células malignas (DIPPOLD et al. 1981).
Inúmeros são os estímulos que podem aumentar a p53. Quebras nas cadeias
de DNA são os principais estímulos (KO e PRIVES 1996). Entretanto, outros
estresses como o choque térmico, a hipóxia, privação de nutrientes, depleção de
ribonucleotídeos trifospato (rNTP) e óxido nítrico (NO) também estimulam a p53
(LEVINE et al. 2006). A proteína p53 pode ativar inúmeros fenômenos celulares tais
como diferenciação, senescência, parada do ciclo celular e principalmente a apoptose
(VOUSDEN e LU 2002). Para executar estas funções, a p53 ativa a transcrição de
26
inúmeros genes, incluindo o gene do p21 que inibe a progressão do ciclo celular; e os
genes APAF-1, Bax, NOXA, PTEN e PUMA (Figura 7) que estimulam a apoptose
(KO e PRIVES 1996; VOUSDEN e LU 2002; YU e ZHANG 2003).
Legenda: Esquema demonstrando que p53 pode induzir tanto parada do ciclo celular quanto
apoptose. Dependendo da intensidade do estímulo, do tipo celular de alterações subcelulares, p53
pode induzir tanto parada do ciclo celular quanto apoptose.
Fonte: Adaptado de YU e ZHANG (2003).
Figura 7 - p53 pode induzir tanto parada do ciclo celular quanto apoptose.
A progressão neoplásica depende da inativação da via da p53 que pode ser
devidas tanto a mutações do gene Tp53, quanto a alterações nas vias de sinalização
da proteína (VOUSDEN e LU 2002). As mutações do gene Tp53 ocorrem em mais
que 50% de todos os tumores humanos com alguns tumores se desenvolvendo sem a
27
perda dos dois alelos selvagens do Tp53. Este é um comportamento diferente dos
outros genes supressores de tumor como o RB1. Algumas mutações específicas do
gene Tp53 apresentam uma alta frequência, com 28% das mutações afetando apenas
seis códons de uma sequência de DNA que apresenta 393 códons. Uma explicação
para esta alta incidência de mutações em pontos específicos do Tp53 nas neoplasias é
que as p53 mutantes formadas a partir deste gene mutado funcionariam como
inibidora da função da proteína normal. A proteína mutante forma tetrâmeros com
outras proteínas mutantes ou com as proteínas normais. Desta forma, há um
sequestro da proteína normal que para de executar sua função de parar o ciclo celular
ou induzir a célula a apoptose quando é detectado um dano ao DNA. Isto explicaria
porque muitas células neoplásicas mantêm um alelo selvagem do Tp53 (VOUSDEN
e LU 2002). E como essas proteínas mutantes que formam esses tetrâmeros têm
maior estabilidade que a proteína selvagem, os experimentos com imunoistoquímica,
podem demonstrar positividade para p53 sem que a proteína esteja exercendo sua
função normal (BARTEK et al. 1990; WANG et al. 1994).
Devido a estas inúmeras e importantes funções na célula, de sua importância
na gênense das neoplasias malignas humanas, a p53 é uma das proteínas mais bem
estudadas que existem. E foi eleita pela revista Science como a “molécula do ano”
em 1993 (KOSHLAND 1993).
No retinoblastoma, a análise de perda de heterozigose do cromossomo 17
detectou alteração em apenas um de 23 pacientes, sugerindo que não há alterações do
gene Tp53 no retinoblastoma (KATO et al. 1996). Utilizando-se imunoistoquímica,
diferentes resultados são descritos na literatura. YUGE et al. (1995) relataram
expressão de p53 em 75% das amostras e CHA et al. (2000) relataram positividade
28
em 85% das amostras, enquanto outros autores encontraram apenas positividade
focal em 80% das amostras (SCHWIMER e PRAYSON 2001).
NORK et al. (1997) encontraram que a expressão imunoistoquímica de p53
nos retinoblastomas se correlacionava com a apoptose e DIVAN et al. (2001)
encontraram que em retinoblastomas pouco diferenciados, a expressão de p53 era
maior nas áreas mais distantes do vaso sanguíneo, onde o suprimento de oxigênio e
nutrientes é menor e a a apoptose é mais frequente.
• PUMA
A proteína PUMA (“p53 upregulated modulator of apoptosis) foi descrita por
dois diferentes grupos. O primeiro utilizou linhagens celulares de carcinoma
colorretal e, após induzir a produção de p53, observaram quais transcritos estavam
aumentados nestas células (YU et al. 2001). O segundo grupo comparou a expressão
de RNA em células com e sem p53 no intuito de descobrir quais os genes são alvos
da p53 (NAKANO e VOUSDEN 2001). PUMA é uma proteína do chamado grupo
“BH3-only” que apresenta duas formas decorrentes de “splicing” alternativo:
PUMA-alpha e PUMA-beta (NAKANO e VOUSDEN 2001). Alterações no sítio
BH3 fazem com que estas proteínas percam sua função, pois este é o sítio de ligação
com as proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e Bcl-x
L
(NAKANO e VOUSDEN 2001).
A p53 é o principal fator de transcrição do gene PUMA. E embora a p53
apresente diversas vias para estímular a apoptose nas células, quando os transcritos
do gene PUMA são inibidos por oligonucleotídeos “antissense”, o índice de apoptose
dependente de p53 cai (NAKANO e VOUSDEN 2001). E em camundongos sem o
29
gene PUMA, praticamente toda a apoptose mediada pela p53 desaparece (JEFFERS
et al. 2003).
Estudos relacionando a expressão imunoistoquímica de PUMA com
neoplasias apresentou interessantes resultados. Em carcinoma colorretal, PUMA foi
expresso em todos os casos e em suas respectivas mucosas (KIM et al. 2007). Em
tumores gástricos, PUMA foi positivo em 73% dos casos, mas não havia alteraçòes
no gene PUMA (YOO et al. 2007).
• Smac/DIABLO
Smac/ DIABLO (“Second mitochondria-derived activator of caspases/ direct
IAP Binding Protein with low isoeletric point”) é uma proteína descrita por dois
grupos destintos de pesquisadores. Um desses grupos percebeu que extratos celulares
preparados com detergentes tinham mais capacidade de ativar a caspase-3. Desta
forma, eles compararam as proteínas diluídas nos extratos preparados com e sem
detergentes e identificaram uma proteína de 25 kDA. E, com anticorpos policlonais
contra esta proteína, eles determinaram que a sua localização em células normais era
no interior da mitocôndria e que sob o estímulo apoptótico, tanto citocromo C quanto
esta proteína eram liberadas no citosol (DU et al. 2000).
O outro grupo estudou quais proteínas se ligavam aos inibidores de apoptose
(IAP ou “inibitor of apoptosis protein family) e identificaram esta proteína de 23
kDA com baixo ponto isoelétrico e a denominaram de DIABLO (“Direct IAP
Binding Protein with low isoeletric point”) (VERHAGEN et al. 2000). Estes
inibidores de apoptose são proteínas altamente conservadas na evolução. Tanto que,
30
os inibidores dos IAP das drosófilas são capazes de induzir ativação das caspases em
células de mamíferos (VERHAGEN e VAUX 2002).
Smac/DIABLO é expressa em diversos tecidos normais tais como coração,
fígado, rim e testículos (VERHAGEN et al. 2000). O estudo desta proteína nas
neoplasias malignas já apresenta alguns resultados interessantes. Em uma recente
revisão, MARTINEZ-RUIZ et al. (2008) listaram artigos que demonstraram tanto
aumento quanto diminuição da proteína ou do RNAm em diferentes neoplasias, o
que pode ocorrer dependendo da via da carcinogênese utilizada. E também listaram
artigos que demontraram que a expressão da proteína estava associada à pior ou
melhor prognóstico dependendo do tipo de neoplasia.
1.10.3 Métodos de detecção da apoptose
A apoptose pode ser observada e medida por inúmeros e variados métodos. O
primeiro método descrito e ainda considerado por muitos como padrão ouro para a
diferenciar apoptose de necrose é a avaliação das alterações morfológicas observadas
à microcopia eletrônica. As alterações morfológicas, quando observadas à
microscopia óptica e utilizando-se as colorações histoquímicas habituais tem
pequena capacidade para medir a apoptose.
As alterações morfológicas são as últimas alterações observadas na célula.
Quando uma célula recebe o estímulo apoptótico desencadeando toda a cascata de
eventos, as alterações morfológicas só irão aparecer algum tempo depois que a célula
já está comprometida com a apoptose. Desta forma, os métodos morfológicos têm a
desvantagem de não detectar a apoptose nos seus estágios iniciais. A Figura 8
demonstra as características morfológicas da apoptose e necrose no retinoblastoma.
31
Em material biológico arquivado em blocos de parafina, há três principais
técnicas de detecção da apoptose: TUNEL (“terminal deoxynucleotidyl transferase-
mediated dUTP nick-end labelling”), ISEL (in situ end-labeling technique) e a
detecção da caspase-3 clivada pela imunoistoquímica (GOWN e WILLINGHAM
2002).
As técnicas de TUNEL e ISEL utilizam uma das mais importantes
características da apoptose, a fragmentação do DNA. O método TUNEL utiliza a
enzima Tdt que se liga às extremidades dos fragmentos de DNA e incorpora um
nucleotídeo marcado com um cromógeno ou uma molécula fluorescente (GAVRIELI
et al. 1992). TUNEL tem a desvantagem de detectar também o DNA fragmentado na
necrose. Já o método ISEL utiliza, ao invés de Tdt, DNA polimerase-1 para ligar
nucleotídeos marcados nas falhas do DNA (WIJSMAN et al. 1993). ISEL tem a
desvantagem de ser menos sensível que TUNEL além de ser um experimento mais
demorado (HUERTA et al. 2007).
A detecção da caspase-3 clivada através da imunoistoquímica tem muitas
vantagens. Grande parte dos laboratórios de patologia tem domínio sobre este
método e a caspase-3 clivada parace detectar a apoptose nos seus momentos mais
iniciais. É possível que o fenômeno da apoptose ocorra através de outras vias, sem a
clivagem da caspase-3. Entretanto, essa desvantagem não supera as características de
praticidade deste método que detecta a apoptose desde sua fase inicial.
32
Legenda: A e D retinoblastoma pouco diferenciado; B e E necrose das células malignas; C e F,
apoptose das células malignas. A, B e C fotos de microscopia eletrônica; D, E e F fotos em H& E.
Fonte: Fotos Microscopia eletrônica: adaptado de CHA et al. (2000).
Figura 8 - M.E. e fotomicroscopia das células do retinoblastoma viáveis, necróticas
e apoptóticas.
33
Há poucos trabalhos anteriores que quantificaram a apoptose no
retinoblastoma e a correlacionaram com fatores prognósticos (Tabela 1).
KERIMOGGLU et al. (2003) mediram o índice apoptótico obtido através da técnica
TUNEL em uma pequena amostra (n = 36). Obtiveram uma correlação significante
entre índice apoptótico (AI) e metástases, e o AI e o tamanho do tumor. Também
observaram uma correlação inversa significante entre o AI e índice proliferativo
(KERIMOGGLU et al. 2003). TATLIPINAR et al. (2002) não encontraram nenhuma
associação entre AI com variáveis clínicas como tratamento prévio, grau de
diferenciação do tumor, e tumores unilaterais vs bilaterais.
Tabela 1 – Principais estudos que quantificaram a apoptose no retinoblastoma.
Autores Número
de
pacientes
Incluídos
pacientes
com
tratamento
anterior
Método de
detecção da
apoptose
utilizado
Indice
apoptótico
Objetivo principal
Kerimogglu
et al. (2003)
n = 53
Sim
-TUNEL
2,67±1,18
Associar índice
apoptótico com
parâmetros clínico-
patológicos.
Tatlipinar et
al (2002)
n = 31
Sim
-TUNEL
2,75±1,20
Associar índice
apoptótico com
parâmetros clínico-
patológicos.
Cha et al
(2000)
n = 13
Não
-TUNEL
-Microscopia
eletrônica
-Citometria
de fluxo
Dif.
AI < 1
Indif
AI > 8
Associar índice
apoptótico com grau de
diferenciação
Bellan et al
(2002)
n=42
Não
-ISEL
p130 (+)AI =
3,26±2,23
P130(–) AI =
1,01±0,86
Quantificar a apoptose
segundo a expressão da
proteína p130.
34
Em outro estudo utilizando a técnica de ISEL, comparando-se o índice
apoptótico e a expressão de p130, o índice apoptótico foi menor no grupo dos
retinoblastomas que não expressaram esta proteína e dentre os retinoblastomas que
expressaram esta proteína, houve uma correlação positiva entre o número de células
expressando p130 e o índice apoptótico (BELLAN et al. 2002).
O Retinoblastoma é uma neoplasia que sempre se desenvolve a partir da
mesma alteração: a inativação parcial ou total do gene Rb1 que codifica uma proteína
que tem papel central no controle do ciclo celular. Descrever a expressão
imunoistoquímica de proteínas relacionadas à apoptose pode melhorar nosso
entendimento sobre a progressão do retinoblastoma e de outras neoplasias. Pode
demonstrar, para futuros estudos, possíveis alvos de tratamento naqueles pontos onde
há um bloqueio da cascata apoptótica permitindo ao tumor maior resistência à
apoptose e consequentemente, maior resistência a alguns dos tratamentos utilizados.
E também, demonstrar importantes fatores prognósticos para o retinoblastoma.
35
2 OBJETIVOS E HIPÓTESES
2.1 OBJETIVOS
Descrever a expressão imunoistoquímica de proteínas envolvidas na
apoptose, em sua via intrínseca e comum no Retinoblastoma
Verificar a associação entre o índice apoptótico e extensão tumoral do
Retinoblastoma
Verificar a associação entre a expressão de cada proteína da via apoptótica e a
extensão do tumor.
Comparar as taxas de sobrevida global segundo o índice apoptótico.
Comparar as taxas de sobrevida global segundo a expressão
imunoistoquímica de cada proteína da via apoptótica.
2.2 HIPÓTESES
Haverá um predomínio da expressão de proteínas pró-apoptóticas em relação
a expressão das proteínas antiapoptóticas
O índice apoptótico estará inversamente associado ao estadio do
retinoblastoma
A expressão de proteínas antiapoptóticas se associará diretamente com a
extensão do tumor enquanto a expressão de proteínas pró-apoptóticas se associará
inversamente.
36
O índice apoptótico se associará diretamente com a melhor sobrevida global.
A expressão de proteínas antiapoptóticas se associará inversamente a
sobrevida global enquanto a expressão das proteínas pró-apoptóticas se associarão
diretamente.
2.3 OBJETIVOS POST HOC
Verificar o índice de concordância entre avaliação através da MO e
parâmetros de leitura imunoistoquímica pelo ACIS III®.
Verificar a associação da expressão das proteínas estudadas com AI.
Verificar a associação entre a expressão do fator de transcrição p53 e as
demais proteínas.
2.4 HIPÓTESES POST HOC
Métodos de avaliação da imunoistoquímica através da MO e através da
plataforma do ACIS III® apresentarão boa concordância.
Expressão das proteínas pró-apoptóticas se associará diretamente ao AI.
Expressão das proteínas pró-apoptóticas se associará diretamento à expressão
de p53.
37
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS
Foram incluídas neste estudo amostras de pacientes portadores de
retinoblastoma submetidos à enucleação ou exenteração logo após o diagnóstico no
período 1986 a 2000 no Hospital A. C. Camargo.
Os critérios de exclusão foram:
• blocos de parafina não disponíveis no arquivo do departamento de patologia;
• ausência de tumor viável nos cortes histológicos examinados.
• amostras de tumores de segundo olho enucleado;
• amostras de pacientes submetidos a qualquer tratamento prévio à enucleação
ou exenteração tais como quimioterapia ou radioterapia;
• amostras de pacientes com dados clínicos incompletos.
3.2 COLETA DE DADOS NO PRONTUÁRIO
Dados clínicos como idade, sexo, tempo de encaminhamento, bilateralidade,
história familiar, tratamentos prévios à cirurgia, e estadiamento da neoplasia foram
coletados dos prontuários.
As variáveis clínicas e anátomo-patológicas foram anotadas de acordo com o
Anexo 5 a partir de dados do prontuário e da revisão sistemática das lâminas.
38
As escalas de estadiamento empregadas neste estudo foram REESE e
ELLSWORTH (1963) e CCSG-92 (Wolff et al. 1978, citado por ANTONELI et al.
2003b, p.403), que eram utilizadas no serviço quando os pacientes foram tratados
(Anexos 1 e 3).
Foram excluídos do estudo pacientes cujos prontuários não foram
encontrados. E os pacientes que a data da última informação era superior a dois anos
da data de consulta ao prontuário foram considerados como perda de seguimento.
3.3 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
Todas as lâminas arquivadas dos pacientes incluídos neste estudo foram
revisadas pelo autor. As avaliações de fatores histológicos de alto risco como invasão
das túnicas oculares, invasão do nervo óptico, invasão de câmera anterior e presença
de doença extraocular foram observadas.
A classificação quanto à diferenciação do retinoblastoma foi avaliada pela
presença de formação de rosetas de Flexner-Winterstein. Assim como nos estudos de
SCHOUTEN-VAN MEETEREN et al (2001) os tumores que apresentavam
formação de rosetas em mais que 80% do tumor eram classificados como bem
diferenciados, e os que não apresentavam formação de rosetas foram classificados
como pouco diferenciados. Os demais foram classificados como moderadamente
diferenciados.
A invasão dos folhetos oculares pela neoplasia foi avaliada de forma
semelhante aos estudos de KHELFOUI et al. (1996) A presença de invasão da
coroide foi avaliada pela presença de foco(s) tumorais além da membrana de Brunch.
39
Quando havia até três focos microscópicos além desta membrana, a invasão foi
denominada focal. Em olhos com mais que três focos microscópicos ou invasão
macroscópica, a invasão foi denominada maciça. A invasão da esclera foi
considerado quando havia dissecção do tecido conjuntivo escleral pela neoplasia.
A invasão do nervo óptico foi avaliada nos cortes longitudinais do disco
óptico e foi classificada como invasão pré-laminar, na lâmina crivosa e pós lâmina
crivosa dependendo de onde foi observada a invasão das células tumorais no nervo
óptico (FOLBERG et al. 2003), além do comprometimento ou não da margem de
ressecção do nervo óptico pela neoplasia.
Foi considerado comprometimento da câmara anterior quando havia células
tumorais anteriores ao cristalino e íris.
3.4 CONFECÇÃO DA “TISSUE ARRAY”
A montagem de uma “tissue microarray” (TMA) consiste na composição de
pequenas amostras de tecidos de diferentes origens em uma mesma plataforma. As
lâminas feitas a partir desta plataforma (Figura 9) podem ser submetidas a técnicas
imunoistoquímicas ou de biologia molecular com menor custo e menos tempo de
execução que se as amostras fossem analisadas em lâminas separadas. Desta forma, é
possível analisar um marcador imunoistoquímico de forma rápida e barata em
diferentes tipos de tecidos normais ou tumorais ou em grandes séries de um
determinado tipo de neoplasia. Por isso, as TMA se tornaram uma importante
ferramenta na patologia. Tanto na diminuição dos custos do controle de qualidade
das reações imunoistoquímicas, como na avaliação da expressão imunoistoquímica
40
de novos marcadores nestas grandes séries de tumores (SAUTER e MIRLACHER
2002).
Para confecção da “Tissue Array” foram utilizadas amostras de
retinoblastoma fixadas em formol e arquivadas em blocos de parafina no laboratório
de anatomia patológica do Hospital A.C. Camargo no período de 1986 a 2000.
Na avaliação de lâminas coradas em H&E, foram selecionadas áreas de
aproximadamente 1 mm evitando áreas com necrose ou calcificação e áreas de
invasão da coroide onde o pigmento melânico presente poderia interferir na leitura
semi-automatizada das reações imunoistoquímicas. As áreas correspondentes às
areas selecionadas foram marcadas nos blocos de parafina para a construção da
“Tissue Array” semelhante ao descrito no artigo de HOOS e CORDON-CARDO
(2001). E utilizando um “tissue microarrayer” (Beecher Instruments, Silver Spring,
MD) foi montada a matriz com amostras de tumor medindo 1 mm de diâmetro cada.
As principais vantagens da utilização em pesquisas de lâminas feitas a partir
de TMA em reações imunoistoquímicas são: (1) as amostras são submetidas à
condições idênticas de temperatura e tempo de exposição aos reagentes; (2)
praticidade e menor custo das reações; (3) maior rapidez na avaliação de uma grande
série de amostras. Há a desvantagem de que o tumor não é avaliado em uma maior
extensão que nas lâminas tradicionais. Entretanto essa desvantagem pode ser
minimizada com a amostragem de diversas áreas destes tumores (HOOS e
CORDON-CARDO 2001).
41
Figura 9 – Fotografia de lâmina obtida da plataforma de “tissue microarray”
submetidas à reações imunoistoquímicas.
3.5 IMUNOISTOQUÍMICA
Foram testados anticorpos listados na Tabela 2 pela técnica da
imunoistoquímica (Anexo 1). Esses anticorpos são marcadores da expressão de
proteínas envolvidas na via apoptótica intrínseca e na via apoptótica comum.
A reação imunoistoquímica foi analisada pelo autor via microscopia óptica,
por método semiquantitativo de acordo com as Tabelas 3 e 4. O escore final foi
estabelecido pela somatória dos graus, sendo considerados casos negativos aqueles
cujo escore foi entre 0-2; e positivos, os casos cuja somatória foi maior ou igual a 3.
A intensidade de reação também foi avaliada pelo equipamento semi-
automatizado DAKO ACIS III® Image Analysis System. Para marcadores
imunoistoquímicos de padrão citoplasmático, o aparelho, através do “software”
ACIS versão 3.0.1 “Cytoplasmic Application” fornece informações de intensidade de
42
coloração e da área de coloração. Para marcadores de padrão nuclear, o ACIS
“Nuclear Application” fornece informações de intensidade e porcentagem de núcleos
corados.
Somente a expressão da caspase-3 clivada, que tem relação direta com o
índice apoptótico, foi avaliada por método quantitativo (expressão em 1000 células
tumorais). O índice apoptótico foi avaliado pela expressão da caspase-3 clivada e foi
definido como o número de células tumorais com coloração citoplasmática positiva
dividido pelo número de células tumorais contadas por campo de microscopia em
aumento de 400x. A contagem foi realizada pelo autor com o auxílio do programa de
computador “Axion Vision” 3.1 (Carl Zeiss Vision, Germany) com o processo de
captura de imagens digitais e marcação com cores diferentes das células positivas e
negativas. E os campos de microscopia escolhidos para contagem correspondem às
áreas mais densamente coradas pela caspase-3 clivada.
43
Tabela 2 - Anticorpos utilizados, clones e origem em relação às proteínas
controladoras da apoptose.
Anticorpo Diluição Marca Clone Recuperação Amplificação
APAF-1 1/50 Novocastra Policlonal Eterna/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Bak 1/150 DAKO Policlonal Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Bax 1/400 DAKO Policlonal Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Bcl-2 1/200 DAKO 124 Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Bcl –x
L
1/500 DAKO Policlonal Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Bim-long 1/100 Chemicon 5E5 Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Caspase-3 clivada
(Asp 175)
1/300 Cell
Signaling
Policlonal Eterna/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
MDM2 1/150 DAKO SMP14 Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
p53 1/2000 DAKO D07 Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
procaspase3 1/4000 Epitomics E61 Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
PUMA 1/250 Epitomics EP512Y Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Smac/DIABLO 1/100 Epitomics Y12 Pascal/CT/pH6,0 NovoLink
Polymer(Novocastra)
Tabela 3 - Gradação da reação imunoistoquímica de acordo com a intensidade.
Característica da Coloração Grau
Negativa 0
Intensidade fraca 1
Intensidade Moderada 2
Intensidade Forte 3
Intensidade Muito Forte 4
44
Tabela 4 - Gradação da reação imunoistoquímica de acordo com o número de
células coradas.
Células Positivas Grau
Nenhuma 0
Menos de 10% 1
10-50% 2
51-90% 3
Mais de 90% 4
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A tabulação dos dados foi feita no programa estatístico Statistical Package for
the Social Sciences (SPSS) versão 13 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Primeiro, foi realizada a estatística descritiva, com cálculo de medidas de
posição e dispersão e freqüências absolutas e relativas.
Para a associação de variáveis categóricas, foi utilizado o teste de associação
do qui-quadrado ou o teste exato de Fisher (quando pelo menos uma das freqüências
esperadas era menor que 5).
Para a associação das variáveis não categóricas, foram utilizados os testes de t
de Student ou teste de Mann-Whitney, quando a distribuição não era normal. Para a
avaliação se uma variável apresentava distribuição normal foi utilizado o teste de
Kolmogorov-Smirnov.
Para analisar possíveis associações, foram usados os coeficientes de
correlação de Pearson ou os coeficientes de correlação de Spearman, quando as
variáveis não apresentaram uma distribuição normal.
45
Foi realizada a comparação dos valores obtidos a partir da microscopia óptica
e da plataforma ACIS III®. Para tal, a categorização a partir dos valores obtido pela
microscopia óptica foi utilizado como referência. Foram construídas curvas ROC
(“Receiver Operating Characteristics”) e o ponto mais próximo do vértice (0,1) foi
considerado o ponto de corte (AKOBENG 2007). Após a determinação do ponto de
corte, foi estabelecido um índice kappa de concordância. Dependendo do valor de
kappa, o nível de concordância foi classificado como: mínimo, baixo, moderado,
bom e excelente.
A análise de sobrevida foi realizada pelo método de Kaplan-Meier e a
comparação entre as curvas foram feitas pelo teste de log-rank.
Para todos os testes estatísticos, foi estabelecido um erro α = 5%.
3.7 COMISSÃO DE ÉTICA
Este protocolo de pesquisa foi aprovado no dia 29/05/2007 pela Comissão de
Ética do Hospital A. C. Camargo (Projeto de Pesquisa 931/07).
46
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES INCLUÍDOS NO
ESTUDO
Foram selecionados para o estudo 93 pacientes portadores de retinoblastoma
admitidos nos departamentos de Pediatria e Oftalmologia do Hospital AC Camargo
no período de 1986 a 2000 e que suas amostras estavam incluídas na “tissue
microarray” já disponível no departamento de patologia. Todos foram submetidos à
cirurgia como primeira opção. A média de idade dos pacientes à admissão era de 27
meses (2-80 meses), sendo que 29% apresentavam tumores bilaterais e
aproximadamente 5% apresentavam história familiar positiva. Os dados sócio-
demográficos e clínicos destes pacientes estão descritos na Tabela 5.
No mesmo período, foram admitidos 418 pacientes para o tratamento de
retinoblastoma. A média de idade do grupo completo à admissão era de 24,3 ± 18,4
meses, 222 (53,1% dos pacientes) eram do sexo masculino e 39% dos pacientes
apresentaram tumores bilaterais. A sobrevida do grupo foi de 87,9 %. Destes 418
pacientes, 33 pacientes (7,9%) fizeram tratamento conservador e dois pacientes não
fizeram nenhum tratamento na instituição. Não foram encontrados no arquivo do
Departamento de Anatomia Patológica os blocos de parafina de 92 pacientes
(22,1%). As amostras de 28 pacientes (6,7%) não apresentaram nenhuma área de
tumor viável.
47
Dos 263 blocos de parafina encontrados, foram selecionados aleatoriamente
119 amostras para a construção da TMA já disponível no departamento. Seis
amostras pertenciam a pacientes que foram submetidos a tratamentos antes da
cirurgia (cinco pacientes submetidos à quimioterapia e um submetido à fototerapia).
Destes, dois pacientes foram a óbito durante o seguimento. Não foram encontrados
os prontuários de 14 pacientes que também foram excluídos do estudo. Entretanto,
em banco de dados de trabalhos anteriores, havia a informação que três destes
pacientes foram à óbito. Mais seis pacientes foram excluídos do estudo por não
apresentaram nenhuma amostra positiva para qualquer dos marcadores estudados ou
ausência de tumor viável na lâmina de TMA. Destes, dois pacientes foram à óbito.
Em resumo, dos 119 pacientes cujas amostras foram incluídas na TMA, 26 pacientes
foram excluídos. Destes, havia informação que pelo menos sete (27%) foram à óbito.
E destes 26 pacientes, dez pacientes (38%) eram portadores de tumores bilaterais.
Dos 93 pacientes incluídos no estudo, 13 pacientes (18,3%) apresentavam
tumores extraoculares. Mais que 80% dos pacientes apresentaram tumores
intraoculares Reese Ellsworth V e entre os pacientes com tumores extraoculares, 11
pacientes apresentaram estadio II na CCSG-92 (pacientes apresentando nervo óptico
com margem cirúrgica comprometida). Nesta amostra, há poucos pacientes com
retinoblastoma intraocular em estadio inicial e nenhum paciente com tumor
extraocular com estadio avançado (CCSG 92 III, IV e V). Em relação aos pacientes
excluídos após a confecção da TMA, dois pacientes apresentavam tumor extraocular
grau III e foram excluídos porque fizeram quimioterapia prévia à enucleação e um
paciente apresentava tumor extraocular grau IV e foi excluído da amostra porque não
havia tumor viável na TMA (Tabela 6).
48
Tabela 5 - Características demográficas e clínicas.
Dados demográficos e clínicos Estatística
Idade (meses)
Unilaterais
Bilaterais
26,7 ± 16,5 (n = 93)
30,3 ± 15,5 (n = 66)
18,0 ± 15,9 (n = 27)
Sexo Masculino 54,8% (n = 51)
Feminino 45,2% (n = 42)
Raça Branca 88,2% (n = 82)
Negra 11,8% (n = 11)
Olho incluído no estudo Olho direito (OD) 45,2% (n = 42)
Olho esquerdo (OE) 54,8% (n = 51)
Primeiro procedimento realizado Enucleação OD 45,2% (n = 42)
Enucleaçao OE 53,8% (n = 50)
Enuc. ambos olhos (AO) 1,1% (n = 01)
Exenteração 0% (n = 0)
História Familiar Não 87,1% (n = 81)
Sim 5,4% (n = 5)
Ignorada 7,5% (n = 7)
Lateralidade Unilaterais 71,0% (n = 66)
Bilaterais 29,0% (n = 27)
Dos 93 pacientes incluídos no estudo, 13 pacientes (18,3%) apresentavam
tumores extraoculares. Mais que 80% dos pacientes apresentaram tumores
intraoculares Reese Ellsworth V e entre os pacientes com tumores extraoculares, 11
pacientes apresentaram estadio II na CCSG-92 (pacientes apresentando nervo óptico
com margem cirúrgica comprometida). Nesta amostra, há poucos pacientes com
retinoblastoma intraocular em estadio inicial e nenhum paciente com tumor
extraocular com estadio avançado (CCSG 92 III, IV e V). Dos pacientes excluídos
após a confecção da TMA, dois pacientes apresentavam tumor extraocular grau III e
foram excluídos porque fizeram quimioterapia prévia à enucleação e um paciente
apresentava tumor extraocular grau IV e foi excluído da amostra porque não havia
tumor viável na TMA (Tabela 6).
49
Tabela 6 - Estadiamento clínico e anátomo-patológico do retinoblastoma
Variáveis clínicas e anátomo-
patológicas
Frequência
Extensão do tumor
Intraocular 86,0% (n = 80)
Extraocular 14,0% (n = 13)
Estadiamento intraocular
(Reese-Ellsworth)
Estadio I 0% (n = 0)
Estadio II 1,1% (n = 1)
Estadio III 2,2% (n = 2)
Estadio IV 1,1% (n = 1)
Estadio V 81,7% (n = 76)
Estadiamento extraocular
(CSG-92)
Estadio I 2,2% (n = 2)
Estadio II 11,8% (n = 11)
Estadio III 0
Estadio IV 0
Estadio V 0
Diferenciação
Bem/ moderadamento diferenciado 36,6% (n = 34)
Pouco diferenciado 63,4% (n = 59)
Comprometimento do nervo
óptico
Sim 37,6% (n = 35)
Pré lâmina crivosa 11,8% (n = 11)
Até lâmina crivosa 6,4% (n = 6)
Pós lâmina crivosa 19,4% (n = 18)
Não 49,5% (n = 46)
Ignorado 12,9% (n = 12)
Margem do nervo óptico
Comprometida 11,2 (n = 11)
Livre 77,6 (n = 72)
Ignorado 10,2 (n = 10)
Invasão coróide
Sim 36,6% (n = 34)
Focal 10,8% (n = 10)
Maciça 25,8% (n = 24)
Não 63,4% (n = 59)
Invasão de esclera
Sim 9,7% (n = 9)
Não 90,3% (n = 84)
Comprometimento da câmara
anterior
Sim 9,7% (n = 9)
Não 90,3% (n = 84)
Comprometimento de vasos
episclerais
Sim 2,2% (n = 2)
Não 93,5% (n = 87)
Ignorado 4,3% (n = 4)
50
Os pacientes foram acompanhados no serviço por uma média de 11,5 anos (0
– 22 anos) após a cirurgia. Após 5 anos de seguimento, 93,5% dos pacientes estavam
vivos e apenas dois (2,2%) pacientes haviam sido perdidos de seguimento. As mortes
por retinoblastoma ocorreram nos dois primeiros anos após o início do tratamento. O
aparecimento de segundos tumores ocorreu em quatro pacientes, sendo que dois
pacientes desenvolveram osteossarcomas, um desenvolveu pinealoblastoma (tumor
trilateral) e um desenvolveu tumor de células de Leydig em um teratoma mediastinal
(Tabela 7).
Tabela 7 - Seguimento dos pacientes.
Variável do seguimento Frequência
“Status” na última
informação
Vivo sem doença 77,4% (n = 72)
Morte (pelo retinoblastoma) 4,3% (n = 4)
Morte (outras causas) 1,1% (n = 1)
Perda de seguimento 17,2% (n = 16)
Tempo de seguimento (meses).
Total 168,3 ± 66,5 (0 – 266)
Vivo sem doença 190,0 ± 46,9 (91 – 266)
Morte pelo retinoblastoma: 11,8 ± 4,3 (8 – 18)
Morte por outras causas: 63,0
Perda de seguimento: 116,5 ± 65,9 (0 – 218)
“Status” aos 60 meses de
seguimento
Vivo 93,5% (n = 87)
Morte (pelo retinoblastoma) 4,3% (n = 4)
Perda de seguimento 2,2% (n = 2)
Recidiva
Sim 6,5% (n = 6)
Não 74,2% (n = 69)
Ignorado 19,4% (n = 18)
Segundo tumor
Sim 4,3% (n = 4)
Não 77,4% (n = 69)
Ignorado 18,3% (n = 17)
51
4.2 ANÁLISE UNIVARIADA DE SOBREVIDA A PARTIR DOS
DADOS CLÍNICOS E ANÁTOMO-PATOLÓGICOS
A análise da sobrevida global câncer específica segundo variáveis clínicas e
anátomo-patológicas são apresentadas nas Tabelas 8 e 9. A sobrevida é menor entre
os pacientes da raça negra e entre aqueles pacientes com intervalo entre
aparecimento dos sintomas e início do tratamento maior que 1 ano. A sobrevida
também é menor entre os pacientes com tumores extraoculares, com invasão de
esclera, com invasão pós-laminar do nervo óptico e comprometimento dos vasos
episclerais.
Tabela 8 - Análise univariada de sobrevida segundo variáveis clínicas e
demográficas.
Variável clínica Sobrevida global Significância
Sexo Feminino
Masculino
95,1% (n=42)
96,1% (n=51)
p = 0,82
Raça Branca
Negra
97,5% (n=82)
81,8% (n=11)
p = 0,015
Tempo de
encaminhamento
≤ 1 ano
> 1 ano
97,6% (n=85)
66,7% (n=6)
p < 0,001
História Familiar Sim
Não
100,0% (n=5)
95,0% (n=81)
p = 0,61
Retinoblastoma
bilateral
Sim
Não
100,0% (n=27)
93,8% (n=66)
p = 0,19
52
Tabela 9 - Análise univariada da sobrevida segundo variáveis anátomo-patológicas.
Variáveis anátomo-patológicas Sobrevida Global Significância
Extensão tumoral
Intraocular
Extraocular
97,5%
83,3%
p = 0,023
Diferenciação tumoral
Bem
Pouco
97,1%
94,8%
p = 0,60
Margem do nervo óptico
Comprometida
Livre
90,0%
97,2%
p = 0,27
Comprometimento pré-laminar
nervo óptico
Não
Sim
97,8%
93,9%
p = 0,39
Comprometimento da lâmina
crivosa nervo óptico
Não
Sim
98,2%
90,9%
p = 0,14
Comprometimento pós-laminar
nervo óptico
Não
Sim
98,4%
87,5%
p = 0,049
Comprometimento câmara
anterior
Não
Sim
96,4%
87,5%
p = 0,26
Comprometimento esclera
Não
Sim
97,6%
75,0%
p = 0,002
Comprometimento da Coroide
Não
Focal
Maciço
96,6%
100,0%
91,3%
p = 0,93
Comprometimento de Vasos
episclerais
Não
Sim
96,5%
50,0%
p < 0,001
4.3 IMUNOISTOQUÍMICA
A observação das amostras de retinoblastoma após a realização da
imunoistoquímica demonstraram um predomínio da expressão das proteínas pró-
apoptóticas. APAF-1, Bax, p53, PUMA e Smac/DIABLO foram expressas em
grande parte das amostras. Das proteínas antiapoptóticas, apenas Bcl-x
L
apresentou
expressão em parte das amostras. Bcl-2 e MDM2 apresentaram positividade focal.
53
A proteína p53, como comandante da apoptose apresentou diferentes formas
de expressão (Figura 10). De um modo geral, p53 foi difusamente expressa no
retinoblastoma. Podemos observar que p53 foi positivo nos retinoblastomas tanto em
áreas diferenciadas ou pouco diferenciadas, em áreas com muitas figuras de apoptose
e em áreas sem apoptose, em células tumorais próximas aos vasos sanguíneos e
apresentando um reforço na intensidade de coloração em células que estão no limite
entre tumor viável e necrose. A figura 11 demonstra a positividade para p53 e para
Bax e PUMA, outras duas importantes proteínas pró-apoptóticas, em áreas limítrofes
de tumor viável e necrose.
A proteína Bax apresentou positivadade citoplasmática difusa na maior parte
das amostras (Figura 12). Bax não apresentou padrão de expressão, com as células
apresentando citoplasma difusamente corado (Figuras 11 e 12).
A proteína PUMA apresentou também difusa positividade citoplasmática,
demonstrando uma discreta intensificação da reação nas rosetas (Figura 13). PUMA
apresentou em alguns casos, padrão semelhante à p53 com intensificação da
expressão no limite entre tumor viável e áreas de necrose (Figuras 11 e 13)
54
Legenda: A - p53 com reforço de positividade nas células próximas à necrose (setas); B - positividade
em rosetas; C - positividade próximo aos vasos; D e E - positividade em áreas sem e com apoptose
respectivamente; F - amostra negativa.
Figura 10 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de p53 (clone DO7).
Legenda: A - p53 apresentando reforço de expressão no limite entre tumor viável e necrose; B - este
aumento de positividade é acompanhado por PUMA; C - Bax apresenta expressão difusa.
Figura 11 - Expressão de p53, PUMA e Bax em áreas com hipóxia.
Legenda: A e B - expressão difusa de Bax; C - expressão de Bax nas rosetas.
Figura 12 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bax (anticorpo
policlonal)
55
A proteína Bak foi negativa em quase todas as amostras, apresentando
expressão difusa no citoplasma das célula tumorais em apenas um caso (Figura 14).
A proteína Bim
LONG
apresentou também positividade citoplasmática difusa
nas células tumorais (Figura 15), enquanto Smac/DIABLO apresentou positividade
no citoplasma com intensificação nas rosetas e padrão “dot” nas áreas pouco
diferenciadas (Figura 16).
A proteína APAF-1 também foi difusamente expressa no retinoblastoma
(Figura 17) tanto em áreas próximas aos vasos como em áreas com hipóxia, em áreas
bem e pouco diferenciadas.
A proteína caspase-3 em seu estado inativo (pro-caspase-3) foi expressa
difusamente no retinoblastoma, com fraca intensidade e sem reforços de intensidade
(Figura 18).
Das proteína antiapoptóticas, a proteína Bcl-x
L
foi a mais expressa nas
amostras (Figura 19). Sua expressão apresentou padrão reforço na intensidade nas
rosetas e padrão “dot” paranuclear nas áreas pouco diferenciadas.
A proteína Bcl-2 apresentou fraca e difusa positividade citoplasmática em
apenas uma amostra. Uma das amostras apresentava inúmeros astrócitos reativos que
foram positivos para esta proteína antiapoptótica (Figura 20).
A proteína MDM2 apresentou fraca positividade de padrão nuclear em
algumas amostras (Figura 21) e não apresentou em nenhuma amostra o padrão de
positividade nas áreas tumorais próximas às áreas de necrose observadas em p53.
56
Legenda: A - discreta intensificação da reação nas rosetas; B - reação difusa em áreas de
retinoblastoma pouco diferenciado; C - amostra negativa.
Figura 13 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de PUMA (clone
EP512Y)
Legenda: A - positividade citoplasmática difusa no único caso que foi Bak positivo;
B e C - amostras negativa.
Figura 14 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica para Bak (policlonal)
Legenda: A - positividade difusa de Bim
LONG
; B e C - amostras negativas.
Figura 15 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bim
LONG
(clone 5E5).
57
Legenda: Intensificação da expressão de Smac/DIABLO nas rosetas em A e em padrão “dot”
paranuclear em B. Reação imunoistoquímica negativa em C.
Figura 16- Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Smac/DIABLO (clone
Y12).
Legenda: A - positividade difusa de APAF-1, tanto nas células próximas ao vaso quanto nas
distantes; B - detalhe da positividade difusa de APAF-1 nas rosetas; C - amostra negativa
Figura 17 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de APAF-1 (policlonal).
Legenda: A e B - expressão pouco intensa e difusa de pró-caspase-3; C - amostra negativa.
Figura 18 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de pro-caspase-3 (clone
E61).
58
Legenda: A e B - expressão de Bcl-x
L
com reforço da intensidade nas rosetas em A e padrão “dot” paranuclear
em B. C - amostra negativa.
Figura 19 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bcl-x
L
(policlonal).
Legenda: A - única amostra positiva demonstrando fraca e difusa positividade no citoplasma; B -
amostra negativa; C - amostra negativa demonstrando astrócitos reativos expressando Bcl-2.
Figura 20 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de Bcl-2 (clone 124).
Legenda: A e B - fraca e difusa expressão nuclear de MDM2; C - amostra negativa.
Figura 21 - Fotomicroscopia da reação imunoistoquímica de MDM2 (clone SMP14).
59
As medidas da expressão das reações imunoistoquímicas também
demonstraram um predomínio na expressão de moléculas que promovem a apoptose.
Das proteínas estudadas que são consideradas pró-apoptóticas, as reações
para APAF-1, p53, pró-caspase-3, Bax, PUMA e Smac/DIABLO foram positivas em
mais que 50% dos casos. Somente Bak e Bim-long, proteínas que também
promovem apoptose, apresentaram resultado negativo em mais da metade dos casos.
Por outro lado, as proteínas Bcl-2, Bcl-x
L
e MDM2 que têm função ligada à
inibição da apoptose, foram pouco expressas nessas amostras de retinoblastoma.
Os resultados das avaliações semiquantitativas das reações
imunoistoquímicas realizadas através da microscopia óptica foram sumarizadas na
Tabela 10.
Nas Tabelas 11 e 12 estão as médias e desvio padrão das medidas das reações
feitas na plataforma ACIS III®.
Tabela 10 - Expressão à imunoistoquímicas das proteínas avaliadas por microscopia
óptica.
Proteína
Função na
apoptose
(%) de amostras
negativas
Escore < 3
(%) de amostras
positivas
Escore ≥ 3
APAF-1 Pró-apoptótica 26,4 (n = 23) 73,6 (n = 64)
Bak Pró-apoptótica 98,9 (n = 88) 1,1 (n = 01)
Bax Pró-apoptótica 13,5 (n = 12) 86,5 (n = 77)
Bcl-2 Antiapoptótica 98,9 (n = 88) 1,1 (n = 01)
Bcl-x
L
Antiapoptótica 61,4 (n = 51) 38,6 (n = 32)
Bim
LONG
Pró-apoptótica 73,9 (n = 65) 26,1 (n = 23)
MDM2 Antiapoptótica 97,7 (n = 84) 2,3 (n = 02)
p53 Pró-apoptótica 7,8 (n = 07) 92,2 (n = 83)
Procaspase 3 Pró-apoptótica 33,8 (n = 25) 66,2 (n = 49)
PUMA Pró-apoptótica 34,1 (n = 29) 65,9 (n = 56)
Smac/DIABLO Pró-apoptótica 33,3 (n = 29) 66,7 (n = 58)
60
Tabela 11 - Expressão imunoistoquímica das proteínas de expressão citoplasmática
avaliadas na plataforma ACIS III®.
Marcador Intensidade
Porcentagem de
área corada (%)
Produto:
Intensidade x
porcentagem
APAF-1 152,6 ± 15,8 88,4 ± 13,8 136,7 ± 31,0
Bak 52,8 ± 3,5 3,0 ± 2,2 1,6 ± 1,2
Bax 102,3 ± 12,3 85,9 ± 16,0 89,2 ± 23,3
Bcl-2 55,9 ± 4,4 7,2 ± 5,8 4,2 ± 3,9
Bcl-x
L
77,2 ± 8,4 54,0 ± 21,2 43,0 ±19,9
Bim
LONG
72,6 ± 14,4 47,4 ± 23,2 37,0 ± 24,7
Caspase-3 clivada 106,3 ± 14,5 25,5 ± 18,2 29,2 ± 24,3
Procaspase3 78,0 ± 8,2 50,6 ± 16,3 40,0 ± 15,3
PUMA 94,0 ± 15,9 63,4 ± 17,9 61,7 ± 25,0
Smac/DIABLO 110,0 ± 14,7 77,8 ± 18,0 87,3 ± 28,3
Tabela 12 - Expressão imunoistoquímica das proteínas de expressão nuclear
avaliadas na plataforma ACIS III®.
Marcador Intensidade
Porcentagem de núcleos
positivos
Caspase-3 clivada 109,1 ± 12,1 44,5 ± 19,5
MDM2 77,4 ± 7,7 41,5 ± 16,2
p53 110,4 ± 15,4 81,6 ± 20,9
61
4.4 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS DA AVALIAÇÃO PELA
MICROSCOPIA ÓPTICA E DAS MEDIDAS OBTIDAS PELO ACIS
III®
Para a comparação dos dois resultados, foram utilizados como referência os
valores obtidos pela microscopia óptica. Os parâmetros obtidos pelo ACIS III®
como intensidade da coloração e porcentagem da área corada em marrom, além do
produto destes dois parâmetros foram comparados pelas curvas ROC (“Receiver
operating characteristic”).
Foram considerados como valores de corte os pontos das curvas ROC mais
próximos da extremidade superior esquerda dos gráficos, o ponto (0,1). Com esses
valores de corte, foi calculado o índice kappa de concordância e a porcentagem de
casos com resultados coincidentes pelos dois métodos.
A Tabela 13 demonstra esses cálculos para os marcadores citoplasmáticos. A
porcentagem de área marrom foi o parâmetro que apresentou maior área sob a curva
ROC em três marcadores: APAF-1, Bax e Smac/DIABLO. A Tabela 14 demonstra
esses cálculos para os marcadores nucleares, que apresentaram maior área sob a
curva do parâmetro porcentagem de núcleos corados.
62
Tabela 13 - Comparação das áreas sob a curva ROC para cada marcador
citoplasmático e escolha do ponto de corte baseado no ponto da curva ROC mais
próximo do ponto (0,1).
Marcador Área sob a
curva ROC
Erro
padrão
Valor p Intervalo de
confiança
Ponto de
corte
APAF-1 intensidade
0,86
0,04
p<0,001
(0,78–0,94)
148,5
APAF-1 porcentagem 0,90
0,04 p<0,001 (0,83-0,97) 91,2%
APAF-1 produto 0,89 0,04 p<0,001 (0,82-0,97) 126,42
Bak intensidade 0,85 0,04 p = 0,24 (0,77–0,93) 55,5
Bak porcentagem 1,00
0,00 p = 0,09 (1,00-1,00) 12,5%
Bak produto 1,00
0,00 p = 0,09 (1,00-1,00) 6,92
Bax intensidade 0,75 0,07 p<0,001 (0,62–0,88) 96,5
Bax porcentagem 0,92
0,05 p<0,001 (0,83–1,00) 81,8%
Bax produto 0,90 0,05 p<0,001 (0,81-1,00) 74,78
Bcl-2 intensidade 1,00
0,00 p = 0,09 (1,00-1,00) 68,5
Bcl-2 porcentagem 1,00
0,00 p = 0,09 (1,00-1,00) 34,8%
Bcl-2 produto 1,00
0,00 p = 0,09 (1,00-1,00) 23,5
Bcl-x
L
intensidade 0,87 0,04 p<0,001 (0,79–0,95) 77,5
Bcl-x
L
porcentagem 0,90 0,03 p<0,001 (0,83-0,97) 59,6%
Bcl-x
L
produto 0,92
0,03 p<0,001 (0,86-0,98) 46,09
Bim
LONG
intensidade 0,91
0,03 p<0,001 (0,84–0,98) 73,5
Bim
LONG
porcentagem 0,87 0,04 p<0,001 (0,79-0,95) 52,4%
Bim
LONG
produto 0,90 0,03 p<0,001 (0,83-0,97) 39,56
Procaspase 3 intensidade 0,70 0,07 p = 0,006 (0,56–0,84) 74,5
Procaspase 3 porcentagem 0,86 0,05 p<0,001 (0,77-0,96) 46,4%
Procaspase 3 produto 0,89
0,04 p<0,001 (0,81-0,97) 36,2
PUMA intensidade 0,86
0,04 p<0,001 (0,78–0,95) 88,0
PUMA porcentagem 0,81 0,05 p<0,001 (0,71-0,91) 58,8%
PUMA produto 0,86 0,05 p<0,001 (0,77-0,95) 48,56
Smac intensidade 0,61 0,07 p = 0,098 (0,48–0,75) 110,5
Smac porcentagem 0,74
0,06 p<0,001 (0,62-0,86) 85,0%
Smac produto 0,70 0,07 p = 0,003 (0,57-0,83) 72,35
63
Figura 22 - Curva ROC demontrando a comparação entre as medidas do ACIS III®
e as medidas da microscopia óptica que foram utilizadas como referência. A seta
mostra o ponto da curva mais próximo do vértice superior esquerdo (ponto 0,1) do
gráfico.
Para os marcadores imunoistoquímicos de padrão nuclear, a porcentagem de
núcleos corados foi o parâmetro com maior área sob a curva ROC (Figura 22).
Tabela 14 – Comparação das áreas sob a curva ROC dos marcadores
imunoistoquímicos de padrão nuclear.
Marcador
Área sob a
curva ROC
Erro
padrão
Valor p
Intervalo de
confiança
Ponto de
corte
MDM2 intensidade
0,95
0,04
p = 0,032
(0,87–1,02)
85,5
MDM2 porcentagem 0,96
0,02 p = 0,026 (0,92-1,00) 67,3%
p53 intensidade 0,98 0,02 p<0,001 (0,95-1,01) 96,0
p53 porcentagem 0,98
0,01 p<0,001 (0,95-1,01) 55,7%
64
Após o cálculo do melhor ponto de corte, cada medida do ACIS III® foi
considerada positiva ou negativa dependendo se a medida era maior ou menor que
este valor. Os parâmetros que apresentaram melhor índice de concordância kappa
foram: o produto intensidade x porcentagem para os marcadores citoplasmáticos
(Tabela 15) e a porcentagem de núcleos corados para os marcadores nucleares
(Tabela 16).
65
Tabela 15 - Índice kappa de concordância entre os valores obtidos na microscopia
óptica e os valores obtidos através da estratificação dos resultados obtidos no ACIS
III® para os marcadores citoplasmáticos.
Marcador
Índice
Kappa
Erro
padrão
Significância
Intervalo
de
confiança
Nível de
concord.
%casos
concor-
dantes
APAF-1 intensidade
0,49
0,10
<0,001
0,28-0,69
Moderado
76,8
APAF-1 porcentagem 0,56 0,09 <0,001 0,37-0,75 Moderado 80,5
APAF-1 produto 0,57
0,10 <0,001 0,37-0,75 Moderado
82,9
Bak intensidade 0,09 0,09 0,038 -0,31-0,50 Mínimo 82,0
Bak porcentagem 1,00
0,00 <0,001 1,00-1,00 Excelente 100,0
Bak produto 1,00
0,00 <0,001 1,00-1,00 Excelente
100,0
Bax intensidade 0,29 0,11 0,003 0,03-0,54 Baixo 74,7
Bax porcentagem 0,60
0,11 <0,001 0,36-0,77 Moderado 87,4
Bax produto 0,57 0,11 <0,001 0,34-0,81 Moderado
87,4
Bcl-2 intensidade 1,00
0,00 <0,001 1,00-1,00 Excelente 100,0
Bcl-2 porcentagem 1,00
0,00 <0,001 1,00-1,00 Excelente 100,0
Bcl-2 produto 1,00
0,00 <0,001 1,00-1,00 Excelente
100,0
Bcl-x
L
intensidade 0,63 0,08 <0,001 0,47-0,80 Bom 81,7
Bcl-x
L
porcentagem 0,70 0,08 <0,001 0,55-0,86 Bom 85,4
Bcl-x
L
produto 0,75
0,07 <0,001 0,61-0,90 Bom
87,8
Bim
LONG
intensidade 0,62
0,09 <0,001 0,44-0,80 Bom 83,5
Bim
LONG
porcentagem 0,54 0,09 <0,001 0,35-0,73 Moderado 78,8
Bim
LONG
produto 0,59 0,09 <0,001 0,41-0,78 Moderado
82,4
Procaspase3
intensidade
0,36 0,12 0,002 0,12-0,59 Baixo 71,2
Procaspase3
porcentagem
0,61
0,10 <0,001 0,42-0,80 Moderado 82,2
Procaspase 3 produto 0,59 0,10 <0,001 0,40-0,78 Moderado
80,8
PUMA intensidade 0,61 0,09 <0,001 0,43-0,80 Bom 82,9
PUMA porcentagem 0,49 0,10 <0,001 0,29-0,69 Moderado 76,8
PUMA produto 0,64
0,09 <0,001 0,47-0,82 Bom
84,2
Smac intensidade 0,14 0,08 0,123 -0,06-0,33 Mínimo 51,8
Smac porcentagem 0,31 0,09 0,002 0,12-0,51 Baixo 64,7
Smac produto 0,38
0,11 0,001 0,17-0,60 Baixo 72,4
66
Tabela 16 - Índice kappa de concordância entre os valores obtidos na microscopia
óptica e os valores obtidos através da estratificação dos resultados obtidos no ACIS
III® para os marcadores nucleares.
Marcador
Índice
Kappa
Erro
padrão
Significância
Intervalo
de
confiança
Nível de
concordância
% casos
concor-
dantes
MDM2 intensidade
0,28
0,16
<0,001
-0,17–072
Baixo
89,4
MDM2 porcentagem 0,56
0,23 <0,001 0,06-1,05 Moderado
96,5
p53 intensidade 0,71 0,12 <0,001 0,46-0,96 Bom 94,4
p53 porcentagem 0,86
0,10 <0,001 0,68-1,05 Excelente
97,8
4.5 ÍNDICE APOPTÓTICO E A EXPRESSÃO DE CASPASE-3
CLIVADA
A reação de imunoistoquímica para caspase-3 clivada (Figura 23) apresentou
interessantes resultados. A caspase-3 clivada que marca células já comprometidas
com o processo de apoptose corou algumas amostras de retinoblastoma difusamente
enquanto em outras há raras células coradas. Entretanto, há maior número de células
coradas nas áreas externas dos manguitos tumorais ou em áreas limítrofes entre
tumor viável e necrose. A caspase-3 clivada também corou células em área bem e
pouco diferenciadas do retinoblastoma.
67
Legenda: A amostras de retinoblastoma com inúmeras células coradas pela caspase-3 clivada; B
amostra com raras células coradas; C amostras corando células no limite entre tumor viável e tumor
necrótico; D demonstrando a expressão nas partes externas dos manguitos tumorais; E em tumores
pouco diferenciados e F e em tumores bem diferenciados.
Figura 23 - Fotomicroscopia de reação imunoistoquímica para caspase-3 clivada.
O índice apoptótico foi medido em 92 amostras e apresentou valor médio de
0,12 com desvio padrão de 0,12 (Tabela 17). O Histograma (Figura 24) apresenta a
distribuição destes valores e demonstra que mais de 30% das amostras apresentaram
valores menores que 0,05.
Tabela 17 - Índice Apoptótico.
Índice
Apoptótico
(n = 92)
Mediana
Média
Desvio Padrão (DP)
Mínimo
Máximo
0,09
0,12
0,12
0
0,72
68
Figura 24 - Distribuição dos valores do índice apoptótico medido
4.6 CORRELAÇÃO ENTRE AS MEDIDAS QUANTITATIVAS DO
ÍNDICE APOPTÓTICO E AS MEDIDAS DA CASPASE-3 CLIVADA
REALIZADAS NO ACIS III®
A caspase-3 clivada foi medida pela plataforma ACIS III® através de
programa de avaliação de citoplasma e também pelo programa de avaliação de
marcador nuclear. A correlação entre os valores do índice apoptótico medido pela
contagem de células marcadas pela caspase-3 clivada e as medidas do ACIS III®
apresentaram correlação positiva e significante (Tabela 18).
69
Tabela 18 - Correlação de AI e medidas da caspase-3 clivada feitas no ACIS III®.
Índice Apoptótico
Parâmetro ACIS III®
rho Significância
Caspase 3 clivada citoplasma - produto
0,53
<0,001
Caspase 3 citoplasma - intensidade 0,37
<0,001
Caspase 3 citoplasma - porcentagem 0,55
<0,001
Caspase 3 clivada núcleo - porcentagem 0,44
<0,001
Caspase 3 clivada núcleo - intensidade 0,47
<0,001
Realizado Teste de correlação de Spearman para variáveis sem distribuição normal
4.7 CORRELAÇÃO ENTRE AS MEDIDAS DE EXPRESSÃO
FEITAS PELO ACIS III® E O ÍNDICE APOPTÓTICO
As medidas da expressão das proteínas estudadas foram correlacionada com o
índice apoptótico e a medida obtida pelo ACIS III® de caspase-3 clivada. Para as
variáveis que utilizaram o programa que mede a expressão no citoplasma, foram
correlacionados apenas o produto da intensidade x porcentagem da área. Para as
variáveis que utilizaram o programa de núcleo, foram correlacionas apenas as
medidas de percentagem de núcleos corados (Tabela 19). Só apresentaram
correlação significante de forma sustentada (para as três medidas) Bak, Bax, Bcl-x
L
e
pró-caspase-3. Entretanto, Bax e pro-caspase-3, proteínas pró-apoptóticas se
correlacionaram negativamente com a expressão de casapase-3 clivada.
70
Tabela 19 - Correlação entre caspase-3 clivada e proteínas relacionadas à apoptose.
Índice Apoptótico
Caspase-3 clivada-
(citoplasma)
produto
Caspase-3 clivada (núcleo)
– porcentagem
rho
a
sig rho
a
sig sig
APAF-1
-0,29
0,008
0,12
0,28
r = 0,31
b
0,005
Bak 0,26
0,020
0,28
0,010
rho = 0,32
a
0,003
Bax - 0,34
0,001
- 0,37
0,001
r = -0,29
b
0,007
Bcl-2 -0,15 0,15 0,11 0,31 rho = 0,29
a
0,008
Bcl-x
L
-0,41
<0,001
- 0,43
<0,001
r = -0,38
b
< 0,001
Bim
LONG
- 0,48
<0,001
- 0,43
<0,001
rho = -0,21
a
0,06
MDM2 -0,32
0,002
- 0,11 0,32 r = -0,12
b
0,29
Pró-caspase -0,47
<0,001
- 0,52
<0,001
r = -0,39
b
< 0,001
PUMA -0,23
0,030
- 0,06 0,57 r = 0,08
b
0,94
Smac/DIABLO 0,26
0,020
0,09 0,44 r = -0,09
b
0,41
p53 -0,32
0,002
-0,14 0,19 rho = -0,16
a
0,14
Legenda:
a. Teste de correlação de Spearman para variáveis sem distribuição normal
b. Teste de correlação de Pearson para variáveis com distribuição normal
sig = significância
Bcl-x
L
e Bak apresentaram correlação compatível com sua função na células.
Enquanto Bak apresentou correlação positiva com a expressão de caspase-3 clivada e
índice apoptótico, Bcl-x
L
apresentou correlação negativa, ou seja, quanto maior a
expressão de Bcl-x
L
, menor a apoptose no retinoblastoma (Figura 25).
71
Figura 25 - Correlação entre expressão de Bcl-x
L
e caspase-3 clivada
Como p53 é um importante fator de transcrição das proteínas pró-apoptóticas,
também realizamos o cálculo da correlação entre expressão da p53 e das outras
proteínas (Tabela 20). Exceto por Smac/DIABLO, todas as proteínas apresentaram
correlação entre sua expressão e a expressão de p53. E entre estas, apenas Bak
apresentou correlação negativa, as demais apresentaram correlação positiva, ou seja,
quanto maior a expressão de p53, maior a expressão destas proteínas.
72
Tabela 20 - Correlação entre expressão de p53 com a expressão das demais
proteínas.
Porcentagem de p53
Rho Significância
APAF-1
0,30
0,006
Bak - 0,21
0,040
Bax 0,64
<0,001
Bcl-2 0,30
0,004
Bcl-x
L
0,63
<0,001
Bim
LONG
0,38
<0,001
Mdm2 0,60
<0,001
Pró-caspase-3 0,55
<0,001
PUMA 0,36
0,001
Smac/DIABLO 0,16 0,14
Realizado Teste de correlação de Spearman para variáveis sem distribuição normal
4.8 VERIFICAÇÃO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE O ÍNDICE
APOPTÓTICO E A EXTENSÃO TUMORAL
A Tabela 21 demonstra que não houve associação entre o índice apoptótico e
a extensão do tumor. Os retinoblastomas extraoculares apresentaram média do índice
apoptótico um pouco maior que a média dos retinoblastomas intraoculares.
Tabela 21 - Verificação de associação entre índice apoptótico e extensão tumoral.
Intraocular Extraocular
N Média DP N Média DP
Índice apoptótico
p = 0.28*
79
11,8
12,6
13
13,3
10,4
* Nível de significância estatística segundo o teste de Mann-Whitney (variável não têm distribuição
normal)
73
4.9 VERIFICAÇÃO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO
IMUNOISTOQUÍMICA E A EXTENSÃO TUMORAL
Nenhum dos marcadores imunoistoquímicos avaliados através da microscopia
óptica apresentaram associação com a extensão tumoral. Esses dados estão
relacionados na Tabela 22.
Tabela 22 - Expressão imunoistoquímica e extensão tumoral.
Intraocular Extraocular Significância
APAF-1 negativo
positivo
19 (21,8%)
58 (66,7%)
4 (4,6%)
6 (6,9%)
p = 0,45*
p53 negativo
positivo
7 (7,8%)
72 (80,0%)
0
11 (12,2%)
p = 0,59*
Pro-caspase 3 negativo
positivo
21 (28,4%)
45 (60,8%)
4 (5,4%)
4 (5,4%)
p = 0,43*
Proteína Bak negativo
positivo
77 (86,5%)
1 (1,1%)
11 (12,4%)
0
p = 1,00*
Proteína Bax negativo
positivo
10 (11,2%)
68 (76,4%)
2 (2,4%)
9 (11,6%)
p = 0,64*
Proteína Bcl-2 negativo
positivo
78 (87,6%)
0
10 (11,2%)
1 (1,1%)
p = 0,12*
Proteína Bcl-x
L
negativo
positivo
45 (54,2%)
30 (36,1%)
6 (7,2%)
2 (2,4%)
p = 0,42*
Proteína Bim Long negativo
positivo
55 (62,5%)
22 (25,0%)
10 (11,4%)
1 (1,1%)
p = 0,28*
Proteína MDM2 negativo
positivo
74 (86,0%)
2 (2,3%)
10 (11,6%)
0
p = 1,00*
PUMA negativo
positivo
25 (29,4%)
49 (57,6%)
4 (4,7%)
7 (8,2%)
p = 1,00*
Smac/DIABLO negativo
positivo
24 (27,6%)
53 (60,9%)
5 (5,7%)
5 (5,7%)
p = 0,29*
* Teste exato de Fisher (um dos valores esperados foi menor que 5)
74
Com os dados obtidos através da plataforma ACIS III®, foram realizados
testes estatísticos para comparar as médias obtidas dos valores de intensidade da
coloração e porcentagem de área corada (ou porcentagem de núcleos corados nos
marcadores nucleares). A p53 apresentou uma associação com o estadio do tumor
com valores mais altos nos tumores intraoculares do que nos tumores extraoculares
(Tabela 23).
Tabela 23 - Extensão tumoral e a expressão imunoistoquímica medida no ACIS
III®.
Intraocular Extraocular
N Média DP N Média DP
APAF-1 produto intensidade x
porcentagem área corada
p = 0,39* 74 137,6 30,9 8 128,1 32,7
Bak produto intensidade x
porcentagem área corada
p = 0,11** 79 1,5 1,2 13 2,1 1,3
Bax produto intensidade x
porcentagem área corada
p = 0,08* 77 91,1 22,6 13 77,5 25,2
Bcl-2 produto intensidade x
porcentagem área corada
p = 0,79** 79 4,0 3,3 11 5,6 7,0
Bcl-x
L
produto intensidade x
porcentagem área corada
p = 0,24* 78 44,1 19,6 12 36,0 21,7
Bim-long produto intensidade
x porcentagem área corada
p = 0,27** 78 38,0 25,4 10 28,8 17,2
MDM2
p
orcentagem de núcleos
corados
p = 0,73* 78 41,3 15,7 11 43,1 19,6
p53 porcentagem de núcleos
corados
p = 0,04**
79 83,4 19,7 13 70,6 25,1
Pro-caspase 3 produto
intensidade x porcentagem área
corada
p = 0,17* 71 40,9 15,6 9 33,5 10,8
PUMA produto intensidade x
porcentagem área corada
p = 0,11* 76 63,2 25,6 10 50,0 16,8
Smac/DIABLO produto
intensidade x porcentagem área
corada
p = 0,09* 76 85,5 28,6 10 101,4 22,0
* Nível de significância estatística segundo o teste t de Student (variáveis com distribuição normal)
** Nível de significância estatística segundo o teste de Mann-Whitney (variáveis que não têm
distribuição normal)
75
Na análise univariada segundo as medidas semiquantitativas feitas através da
microscopia óptica, a expressão de Bcl-2 apresentou associação com pior sobrevida.
Entretanto, não é possível uma conclusão pois somente a amostra de um paciente foi
positiva para Bcl-2. Os demais marcadores imunoistoquímicos não apresentaram
resultados significativos (Tabela 24).
Tabela 24 - Sobrevida segundo as medidas semi-quantitativas feitas através da
microscopia óptica.
Marcador imunoistoquímico Sobrevida global Significância
APAF-1 Negativo (n = 23)
Positivo (n = 64)
91,3%
96,8%
p = 0,26
Bcl-2 Negativo (n = 88)
Positivo (n = 01)
97,7%
0%
p < 0,001*
Bak Negativo (n = 88)
Positivo (n = 01)
96,6%
100,0%
p = 0,85
Bax Negativo (n = 12)
Positivo (n = 77)
90,0%
98,7%
p = 0,09
Bcl-x
L
Negativo (n = 51)
Positivo (n = 32)
95,9%
100,0%
p = 0,25
Bim
LONG
Negativo (n = 65)
Positivo (n = 23)
96,8%
100,0%
p = 0,39
MDM2 Negativo (n = 84)
Positivo (n = 02)
97,6%
100,0%
p = 0,83
p53 Negativo (n = 7)
Positivo (n = 83)
100,0%
95,1%
p = 0,55
Pró-caspase 3 Negativo (n = 25)
Positivo (n = 49)
100,0%
100,0%
-
PUMA Negativo (n = 29)
Positivo (n = 56)
93,1%
98,1%
p = 0,24
Smac/DIABLO Negativo (n = 29)
Positivo (n = 58)
96,3%
98,3%
p = 0,57
* Apenas as células tumorais de um paciente foram positivas para bcl-2.
76
Para a avaliação de sobrevida segundo as medidas realizadas através da
plataforma ACIS III®, foi utilizada a estratégia de cálculo da sobrevida utilizando-se
pontos de corte nos pencentis 25, 50 e 75 das variáveis fornecidas pela plataforma
(Tabela 25). Foram observadas que duas medidas apresentaram significância quando
o ponto de corte foi no percentil 75: porcentagem de área corada por Bak e
intensidade de coloração por Smac/DIABLO. Entretanto esses cálculos não são
confiáveis devido ao pequeno numero de eventos (quatro óbitos)
77
Tabela 25 - Sobrevida global segundo as medidas obtidas na plataforma ACIS III®.
P25 P50 P75
Ponto
corte
SG Valor
p
Ponto
corte
SG Valor
p
Ponto
corte
SG Valor
p
Intensidade
APAF-1
% área
≤142
>142
≤83,5
>83,5
100,0
96,7
100,0
96,7
0,40
0,40
≤152
>152
≤93,2
>93,2
97,6
97,5
100,0
95,1
0,98
0,16
≤165
>165
≤97,8
>97,8
98,4
94,4
98,4
95,0
0,33
0,41
Intensidade
Bcl-2
% área
≤52
>52
≤40,2
>40,2
91,3
96,9
95,5
95,5
0,26
0,98
≤55
>55
≤57,5
>57,5
95,9
94,9
95,6
95,4
0,84
0,98
≤58
>58
≤86,6
>86,6
97,1
89,2
97,0
90,9
0,15
0,24
Intensidade
Bak
% área
≤50
>50
≤16,2
>16,2
91,3
96,9
100,0
95,5
0,26
0,31
≤52
>52
≤25,3
>25,3
98,1
94,7
100,0
93,2
0,37
0,07
≤54
>54
≤38,2
>38,2
97,2
95,0
100,0
86,4
0,65
0,002
Intensidade
Bax
% área
≤93
>93
≤78,9
>78,9
95,5
97,0
90,5
98,5
0,72
0,07
≤103
>103
≤92,0
>92,0
95,5
97,7
95,4
97,8
0,55
0,53
≤110
>110
≤96,7
>96,7
95,5
100,0
95,5
100,0
0,32
0,32
Intensidade
Bcl-x
L
% área
≤71
>71
≤42,4
>42,4
95,5
98,5
100,0
97,0
0,40
0,41
≤76
>76
≤56,4
>56,4
97,7
97,8
95,4
100,0
0,96
0,15
≤82
>82
≤67,9
>67,9
96,9
100,0
97,0
100,0
0,39
0,41
Intensidade
Bim
LONG
% área
≤63
>63
≤32,1
>32,1
100,0
96,9
100,0
96,9
0,41
0,41
≤69
>69
≤46,9
>46,9
97,8
97,6
97,7
97,7
0,94
0,99
≤78
>78
≤67,9
>67,9
98,5
95,5
98,5
95,5
0,43
0,43
Intensidade
MDM2
% área
≤29,3
>29,3
≤72
>72
95,2
97,0
96,0
96,8
0,68
0,84
≤38,8
>38,8
≤76
>76
95,5
97,7
95,5
97,7
0,56
0,56
≤53,6
>53,6
≤84
>84
97,0
95,5
97,2
94,1
0,74
0,53
Intensidade
p53
% área
≤75,9
>75,9
≤101
>101
95,5
97,1
95,5
97,1
0,70
0,70
≤90,9
>90,9
≤113
>113
95,6
97,8
95,7
97,7
0,56
0,58
≤95,3
>95,3
≤120
>120
95,5
100,0
95,7
100,0
0,31
0,33
Intensidade
Pró-caspase 3
% área
≤73
>73
≤38,7
>38,7
100,0
96,8
94,7
98,3
0,47
0,39
≤77
>77
≤51,7
>51,7
100,0
95,5
97,5
97,4
0,21
0,98
≤82
>82
≤61,4
>61,4
96,6
100,0
96,6
100,0
0,42
0,40
Intensidade
PUMA
% área
≤82
>82
≤51,1
>51,1
100,0
96,9
95,2
98,4
0,43
0,41
≤91
>91
≤64,7
>64,7
100,0
95,6
97,6
97,7
0,18
0,99
≤107
>107
≤76,0
>76,0
98,4
95,5
96,8
100,0
0,43
0,40
Intensidade
Smac/DIABLO
% área
≤101
>101
≤65,5
>65,5
100,0
96,8
100,0
96,8
0,40
0,41
≤111
>111
≤83,3
>83,3
100,0
94,1
97,7
97,6
0,08
0,98
≤118
>118
≤91,5
>91,5
100,0
88,9
98,4
95,9
0,006
0,39
78
A mesma estratégia para o cálculo da sobrevida foi utilizada para a avaliação
do índice apoptótico. Quando o ponto de corte foi avaliado no percentil 75, houve
uma tendência (p = 0,057) de associação indireta entre índice apoptótico e melhor
sobrevida (Tabela 26). Pacientes com amostras apresentando índice apoptótico
menor tem melhor sobrevida global.
Tabela 26 - Análise univariada de sobrevida segundo o índice apoptótico.
P25 P50 P75
Ponto
corte
SG Valor
p
Ponto
corte
SG Valor
p
Ponto
corte
SG Valor
p
Indice
apoptótico
≤,034
>,034
95,7
95,6
0,97
≤,085
>,085
97,8
93,5
0,31
≤,174
>,174
98,5
87,0
0,057
79
5 DISCUSSÃO
A amostra de pacientes portadores de retinoblastoma tratados no período de
1986 a 2000 no Hospital A.C. Camargo apresentou características tais como idade,
sexo, proporção de pacientes com tumores bilaterais semelhantes a outras amostras já
publicadas. Entretanto, a nossa amostra parece apresentar média de idade ao
diagnóstico e proporção de pacientes com tumores bilaterais maiores que em outros
estudos (MURPHREE 1998). É provável que isto seja consequência de tempo de
encaminhamento prolongado e do encaminhamento de pacientes portadores de
retinoblastoma bilateral para nosso hospital que é referência no tratamento do
retinoblastoma.
No nosso estudo, foram incluídos apenas 22,3% dos pacientes tratados neste
mesmo período. Quando comparamos as características dos pacientes incluídos neste
estudo com as características de todos os pacientes, observaremos algumas
diferenças. A primeira é que a taxa de sobrevida no grupo inteiro de pacientes foi de
87,9% e na amostra deste estudo foi de 95,6%. Isto foi devido aos critérios de
exclusão utilizados. Dos 26 pacientes excluídos após a confecção da TMA, havia
informação que sete pacientes (27%) foram a óbito. Dos excluídos, havia pacientes
com estágios avançados da doença que foram submetidos à quimioterapia prévia,
prontuários não encontrados de pacientes que foram a óbito e também, pacientes que
foram excluídos por não apresentarem tumor viável na TMA. Esses retinoblastomas
com extensa necrose podem realmente apresentar pior prognóstico. CHONG et al.
(2006) descreveram que retinoblastomas extensivamente necróticos, quando
80
comparados com casos apresentando tumor viável, apresentam mais fatores de risco
para doença metastática e morte como: invasão do nervo óptico, invasão pós laminar
do nervo óptico e invasão da coroide.
A segunda diferença entre a amostra deste estudo e de todos os pacientes do
Hospital A.C. Camargo é a porcentagem de pacientes com tumores bilaterais: no
grupo completo havia 37% de pacientes com retinoblastoma bilateral enquanto que
no grupo selecionado para estudo apenas 29% dos pacientes apresentavam tumores
bilaterais. Pacientes com tumores bilaterais geralmente são frequentemente
submetidos a tratamentos conservadores antes da cirurgia. Não houve diferenças
significativas em relação a outros dados demográficos como idade e sexo.
Nos pacientes incluídos no estudo, a média de idade dos portadores de
tumores bilaterais foi um pouco mais que a metade que a média de idade dos
portadores de tumores unilaterais (18,0 vs 30,3 meses). Esta distribuição das idades
corresponde à clássica descrição feita por KNUDSON (1971) que gerou sua teoria a
respeito dos dois eventos mutacionais.
Nenhum paciente do estudo foi submetido à exenteração, um procedimento
reservado para tratamento de retinoblastoma com maciça infiltração do tecido
orbitário. Pacientes apresentando estas características passaram a receber tratamento
quimioterápico antes da cirurgia a partir de 1987 (ANTONELI et al. 2003a).
A diferenciação do retinoblastoma foi estratificada em apenas duas
categorias. Os tumores considerados como pouco diferenciados corresponderam a
63,4% dos casos. Há divergências na literatura a respeito da proporção de
retinoblastomas diferenciados e indiferenciados. KHELFAOUI et al. (1996)
classificaram apenas 16% dos retinoblastomas como pouco diferenciados enquanto
81
STANNARD et al. (1979) classificaram 74% dos retinoblastomas como pouco
diferenciados. Nenhum dos dois grupos conseguiu associar a diferenciação do
retinoblastoma com extensão tumoral ou sobrevida. Na nossa amostra, também não
houve associação entre diferenciação e sobrevida (p = 0,60).
A invasão do nervo óptico foi detectada em 37,6% dos olhos enucleados, com
19,4% apresentando invasão pós-lâmina crivosa. Doze pacientes não apresentavam
no laudo anátomo-patológico o status do nervo óptico e também não foram
encontradas lâminas contendo os cortes histológicos do nervo óptico. KHELFAOUI
et al. (1996), em estudo retrospectivo realizado na França com pacientes procedentes
de diversos países e tratados no período de 1977-1990, demonstraram que 10% dos
olhos enucleados apresentavam margem comprometida, 20% apresentavam invasão
pós-laminar sem margem comprometida e 15% apresentavam invasão até a lâmina
crivosa. CHANTADA et al. (2007), em estudo retrospectivo realizado na Argentina
de pacientes tratados no período de 1989-2004, apresentaram resultados semelhantes,
com 15,7% dos pacientes admitidos apresentando invasão pós-laminar sem
comprometimento da margem do nervo óptico. SHIELDS et al. (1994)
demonstraram resultados bem melhores, com apenas 5,9% dos pacientes
apresentando invasão pós-laminar do nervo óptico, e apenas 0,6% apresentando
margem do nervo óptico comprometida. Estes autores também demonstraram pior
sobrevida nos pacientes com invasão pós-laminar do nervo óptico assim como no
nosso estudo (p = 0,049). Entretanto, estes autores encontraram uma associação com
pior sobrevida mesmo comparando somente os retinoblastomas sem margem
comprometida.
82
A invasão da coroide foi estratificada também como focal ou maciça
seguindo a descrição de KHELFAOUI et al. (1996). Esses autores estratificaram
invasão dos folhetos oculares em cinco categorias (sem invasão, invasão focal da
coroide, invasão maciça, invasão de esclera e invasão de tecidos extraoculares) e
quando agruparam invasão maciça de coroide e invasão de esclera, encontraram
associação deste grupo com maior risco de metástases. Na nossa amostra, não há
associação com invasão de coroide e pior sobrevida. Entretanto, há associação entre
invasão de esclera e pior sobrevida na análise univariada.
A média de tempo de seguimento destes pacientes foi de 11,5 anos, que é
bastante satisfatório para avaliar sobrevida em pacientes com retinoblastoma, pois os
óbitos decorrentes da neoplasia ocorrem geralmente nos cinco primeiros anos após o
diagnóstico (BROADDUS et al. 2009). A presença de segundos tumores foi também
avaliada no seguimento destes pacientes, e para esta avaliação, o tempo de
seguimento precisa ser maior. Apesar de nas duas primeiras décadas de vida, os
sobreviventes de retinoblastoma germintativo já apresentarem maior incidência de
sarcomas (sarcomas de partes moles e osteossarcomas) que a população geral, é na
quarta década de vida que há um aumento de até 15 vezes na incidência de
neoplasias malignas em relação à população geral às custas do aumento na incidência
de carcinomas e melanomas (MAREES et al. 2008). Na nossa amostra, quatro
pacientes apresentaram segundas neoplasias. Dois apresentaram osteossarcoma e um
apresentou pinealoblastoma, que são as segundas neoplasias frequentes em amostras
com seguimento até 20 anos (MAREES et al. 2008).
O estudo imunoistoquímico do retinoblastoma foi realizado em lâminas
contendo uma matriz tecidual (TMA). Este recurso que consiste em colocar amostras
83
de inúmeros pacientes em uma mesma lâmina têm sido frequentemente utilizado em
pesquisas. Apresenta como principal vantagem o fato das amostras serem submetidas
aos mesmos reagentes, anticorpos e condições de temperatura e umidade. A principal
desvantagem é que a reação imunoistoquímica é feita em uma superfície de tecido
tumoral muito menor que a superfície tumoral de uma lâmina tradicional.
O índice apoptótico medido pela imunoistoquímica através da marcação da
caspase-3 clivada apresentou média de 120 células por 1000 células contadas e foi
maior que a encontrada em outros estudos que utilizaram TUNEL ou ISEL.
TATLIPINAR et al. (2002) apresentou uma média de índice apoptótico de 2,78 ±1,2,
ou seja, 28 por 1000 células. BELLAN et al (2002) verificaram a associação da
expressão de p130, uma outra proteína do grupo do retinoblastoma, e demonstraram
um índice apoptótico de 3,26 ±2,23 (n = 28) em tumores que expressavam p130. Ou
seja, o AI encontrado por esses autores é bem menor que os valores obtidos na nossa
amostra. Isto pode ser devido ao método de detecção da apoptose utilizado. A
utilização de caspase-3 clivada apresenta a vantagem de detectar a apoptose em suas
fases mais iniciais (HUERTA et al. 2007). Quando começa a clivagem da caspase-3,
a célula já está comprometida com a apoptose e a expressão deste marcador não
parece corar células que não estejam em apoptose.
Nas comparações do índice apoptótico com a extensão e a sobrevida dos
pacientes, a média do índice apoptótico foi maior no grupo de pacientes com tumores
extraoculares que nos tumores intraoculares, mas esta diferença não foi
estatísticamente significativa (p = 0,284) e pacientes que apresentaram índice
apoptótico maior que 0,17 apresentaram na comparação das curvas de Kaplan-Meier
tendência à pior sobrevida (p = 0,057).
84
Isto foi exatamente o oposto do que esperávamos. A nossa hipótese foi
baseada nos estudos de KERIMOGGLU et al. (2003) que encontraram menor índice
apoptótico em pacientes que desenvolveram metástases e em estudos demonstrando a
associação da hiperexpressão de proteínas antiapoptóticas como a Bcl-2 com pior
prognóstico em linfomas difusos de grandes células B (RANTANEN et al. 2001) e
em carcinomas uroteliais da bexiga (HUSSAIN et al. 2003). A partir destes estudos e
de outros já citados, nós formulamos a hipótese de que quanto maior a apoptose
celular, melhor a evolução do retinoblastoma. Ou que, quanto maior a resistência das
células do retiblastoma à apoptose, pior o prognóstico.
Entretanto, não foi o que observamos na nossa amostra. As amostras com
maior apoptose apresentavam uma tendência a pior sobrevida. Isto pode ser
explicado pela hipóxia no microambiente tumoral. A hipóxia é um dos maiores
estímulos à apoptose (BRAS et al. 2005). Quando os tumores apresentam
crescimento exagerado, os níveis de oxigênio diminuem nas células mais distantes
dos vasos sanguíneos e estas células começam a consumir avidamente glicose e
produzir ácido láctico, um fenômeno denominado efeito Warburg (1956) citado por
KIM e DANG (2006, p.8927) descrito há mais de 80 anos. Os estudos atuais
demonstraram que sob hipóxia, as células podem desencadear apoptose ou, em uma
tentativa de sobreviver com baixos níveis de oxigênio, ativar enzimas do catabolismo
anaeróbio. Para atingir este objetivo, a célula ativa um fator de trascrição
denominado HIF (“Hypoxia inducible transcription factor”) que ativa também fatores
que promovem a angiogênese. Desta forma, a hipóxia pode levar as células à
apoptose ou pode levar a célula maligna a produzir mais fatores angiogênicos como o
VEGF (“Vascular endothelial growt factor”). MARBACK et al (2003) demonstraram
85
que a angiogênese no retinoblastoma é um fator prognóstico para a disseminação do
tumor e este é um fator prognóstico independente dos outros fatores prognósticos
clássicos. Assim, podemos sugerir que a presença da apoptose no retinoblastoma
pode ser consequência da hipóxia tumoral, que também leva o tumor a apresentar um
fenótipo mais maligno.
A proteína p53 apresentou expressão pela imunoistoquímica em 92% das
amostras, semelhante aos resultados encontrados por outros autores (YUGE et al.
1995; CHA et al. 2000). O anticorpo primário utilizado na reação é o clone DO7, que
se liga a p53 normais ou mutantes.
Em outros tumores, a positividade da p53 está ligada a produção de proteínas
mutantes, que tem tempo de meia vida maior no núcleo da célula (SJOGREN et al.
1996). Como o retinoblastoma raramente apresenta alterações no gene Tp53 (KATO
et al. 1996) e a via do p53 está bloqueada pelas proteínas MDM2 e MDM4 (LAURIE
et al. 2006; GUO et al. 2008), por que há positividade imunoistoquímica para p53 no
retinoblastoma? A primeira explicação seria que diferente de MDM2, que induz a
degradação da p53 por proteases, MDM4 estabiliza a p53 dentro do núcleo e ainda
impede o complexo MDM2-p53 de ir para o citoplasma onde a proteína seria
degradada (SHARP et al. 1999). E há diversas evidências que a MDM4 está
aumentada no retinoblastoma. MDM4 tem sido encontrada hiperexpressa no
retinoblastomas por diferentes grupos de pesquisa (LAURIE et al. 2006; GUO et al.
2008). Além disso, o gene de MDM4 está localizado no braço longo do cromossomo
1 (1q) que apresenta inúmeros ganhos no retinoblastoma (CORSON e GALLIE
2007). A segunda explicação é que a positividade de p53 seja decorrente do excesso
de proteína normal e que estas poderiam estar executando sua função habitual.
86
Hipóxia, quebras no DNA e qualquer estímulo que cause dano ao genoma pode
aumentar os níveis da p53 normal na célula do retinoblastoma. E atualmente, os
métodos imunoistoquímicos que utilizam o clone DO7 com recuperação antigênica e
revelação pelo DAB têm a capacidade de demonstrar intensa expressão nuclear e
infrequente expressão citoplasmática em tecidos normais (PILLAI et al. 2003). Outra
evidência que a imunoistoquímica está detectando p53 normal no retinoblastoma é
que a expressão de p53 parece estar associada com a presença de apoptose (NORK et
al. 1997; DIVAN et al. 2001). Entretanto, no nosso estudo, os cálculos de correlação
dos níveis de p53 com a expressão de caspase 3 não foram conclusivos: a p53 se
correlacionou negativamente com o índice apoptótico (medido pela contagem
manual das células), um resultado diferente dos estudos citados acima. E a expressão
de caspase-3 clivada e da p53 medidas pela plataforma ACIS não apresentaram
correlação significante. A expressão da p53 também apresentou diferenças entre os
tumores intra e extraoculares, com os tumores extraoculares apresentando menores
níveis de expressão de p53. Este resultado é diferente do encontrado em outras
neoplasias como ovário, mama e cólon, onde maior expressão imunoistoquímica está
associada a tumores mais agressivos (BOSARI et al. 1993). Mas esses tumores
apresentam mutações no gene Tp53 o que não ocorre no retinoblastoma.
Bax apresentou positividade em 86,5% da nossa amostra o que é discordante
do trabalho de FUJISAWA et al. (1998) que observaram negatividade em todas as
amostras avaliadas pela imunoistoquímica. Entretanto, não há como comparar os
resultados, uma vez que não há a descrição do anticorpo primário utilizado neste
estudo. O anticorpo utilizado no nosso estudo é um anticorpo policlonal produzido a
partir do peptídeo sintético correspondente a sequência de aminoácidos 43-61 da
87
proteína Bax humana. A positividade para Bax sugere que parte das células do
retinoblastoma apresenta a via apoptótica intrínseca ativada uma vez que Bax induz a
liberação de citocromo C no citosol (JURGENSMEIER et al. 1998). Entretanto, para
exercer sua função, Bax deve estar na membrana da mitocôndria. Mas não é possível
determinar onde a molécula de Bax está localizada através da técnica de
imunoistoquímica, se na membrana da mitocôndria ou no citosol. Somente com
técnicas utilizando microscopia confocal ou microscopia eletrônica com anticorpos
marcados com ouro seria possível localizar a Bax na célula. Além disso, Bax
apresentou na nossa amostra, correlação negativa com o índice apoptótico e com
medidas de expressão da caspase-3 clivada demonstrando que apesar de ser uma
importante molécula pró-apoptótica, a diminuição da expressão imunoistoquímica de
Bax está relacionada ao aumento da apoptose no retinoblastoma.
Por outro lado, das proteínas estudadas, Bax é uma das que mais apresenta
estudos associando a sua diminuição da expressão imunoistoquímica com
estadiamento ou prognóstico de diversas neoplasias (WOOTIPOOM et al. 2004;
SANTINI et al. 2005; ADDEO et al. 2007; GONZALEZ-CAMPORA et al. 2007;
KANG et al. 2007; KATO et al. 2008; JEONG et al. 2008). No nosso estudo, os
tumores com estadiamento mais avançado apresentam menor expressão de Bax
assim como nos estudos citados. Mas esta não é uma diferença estatísticamente
significativa (p = 0,08).
Utilizando-se um anticorpo policlonal, Bak apresentou positividade, na
microscopia óptica em apenas 1 caso da amostra. Interessante que apesar da
microscopia óptica ter detectado expressão de Bak em apenas uma amostra, os
resultados da expressão de Bak medidos pela plataforma ACIS, se correlacionaram
88
positivamente com o índice apoptótico e a expressão de caspase-3 clivada medidos
pela plataforma o que é esperado para uma proteína pró-apoptótica. Entretanto, a
sensibilidade de discernimento de cores da plataforma maior que a do olho humano
talvez tenha detectado debris celulares que se coraram fracamente com o cromógeno
o que fez que as medidas de Bak tenham se correlacionado positivamente com a
apoptose. Confirmando esta possibilidade, houve uma correlação negativa
significante (p = 0,04) entre a expressão de Bak e p53 o que não é um resultado
esperado porque p53 regula positivamente a transcrição do gene Bak (KANNAN et
al. 2001). Desta forma, o melhor é considerar Bak praticamente ausente nas células
do retinoblastoma.
Alguns estudos demonstraram que a proteína Bak pode se oligomerizar com
Bax e formar poros na membrana mitocondrial que estimulam a liberação do
citocromo c e de Smac/DIABLO no citosol. Bax e Bak são inibidos tanto por Bcl-2
quanto por Bcl-x
L
. Desta forma, Bax e Bak parecem ter funções semelhantes e a
ausência de uma delas realmente não impediria a apoptose celular pela via intrínseca
ou mitocondrial (CORY e ADAMS 2002).
Bim
LONG
foi positivo em apenas 26,1% da amostra. O anticorpo utilizado foi
um anticorpo monoclonal o clone 5E5 sintetizado para ligar-se a proteína Bim
long
do
camundongo. Como a proteína Bim humana é muito semelhante à proteína do
camundongo, este clone também pode ser utilizado em tecidos humanos (O'REILLY
et al. 2000). Entretanto, este anticorpo não se liga a variante da proteína
Bim
SHORT
.que, em experimentos com linhagens celulares, parece ser a variante mais
eficaz de Bim (O'CONNOR et al. 1998). Desta forma, o experimento usando este
anticorpo deixou de demonstrar esta outra variante da proteína Bim. As três variantes
89
de Bim apresentam a mesma função de todas as proteínas “BH3 only”, a de inibir as
moléculas Bcl-2 e Bcl-x
L
que são antiapoptóticas. Entretanto, houve uma correlação
negativa significativa entre a expressão de Bim
LONG
e o índice apoptótico medido
pela contagem manual de células (rho = -0,48; p<0,001), um resultado que não é
esperado já que Bim é uma proteína pró-apoptótica.
PUMA foi positivo em 65,9% da amostra. Para a detecção de PUMA foi
utilizado o anticorpo monoclonal clone EP512Y que é capaz de detectar as duas
variantes de PUMA: PUMA-alfa e PUMA-beta. PUMA é uma proteína ligada a p53,
pois o principal estímulo a transcrição do gene PUMA é a presença deste fator de
transcrição. Inversamente, há autores que afirmam que toda a apoptose mediada pela
p53 depende da expressão de PUMA (JEFFERS et al. 2003). A expressão de PUMA
realmente se correlacionou positivamente com a expressão de p53 (rho = +0,36; p =
0,001), mas não houve nenhuma correlação entre a expressão de PUMA e caspase 3
clivada, outro resultado não esperado já que PUMA é uma proteína pró-apoptótica.
Isto, além da correlação negativa de p53 e Bax, pode sugerir que a via de apoptose
mediada pela p53 não seja a via que as células de fenótipo maligno do
retinoblastoma utilizam quando entram em apoptose.
Smac/DIABLO foi positiva em 66,7 % das amostras. Sua função é estímular
a apoptose na célula através da inibição dos chamados IAP. Smac/DIABLO é uma
proteína que exerce sua função apenas quando um estímulo apoptótico ativa Bax e
Bak na membrana da mitocôndria, formando poros que liberam tanto citocromo C
quanto Smac/DIABLO (DU et al. 2000; VERHAGEN et al. 2000). O anticorpo
utilizado na imunoistoquímica foi o anticorpo monoclonal Y12 que não parece
diferenciar a Smac ativa no citosol e a Smac inativa dentro da mitocondria.
90
Smac/DIABLO não apresentou correlação com a expressão imunoistoquímica da
caspase-3 clivada medida pela plataforma ACIS III® embora tenha apresentado
correlação positiva com a contagem manual do índice apoptótico (rho = +0,26; p =
0,02).
A proteína Bcl-2 apresentou positividade no retinoblastoma em apenas 1
paciente resultado comparável a outros estudos que utilizaram imunoistoquímica
para observar a expressão do Bcl-2 nos retinoblastomas. COUPLAND et al (1998)
demonstraram positividade para Bcl-2 apensa em astrócitos reativos distribuídos no
meio das células tumorais enquanto TATLIPINAR et al. (2002) observaram fraca
expressão imunoistoquímica. Para esta reação imunoistoquímica, foi utilizado o
anticorpo monoclonal clone 124, que é utilizado constantemente na rotina
diagnóstica para a classificação de linfomas através da presença de hiperexpressão de
Bcl-2. O paciente que apresentou positividade para Bcl-2 teve evolução desfavorável
e foi a óbito. Este paciente apresentou importantes fatores de risco para o óbito como
tempo de encaminhamento longo, margem do nervo óptico comprometida, e invasão
de coroide e esclera. A avaliação de Bcl-2 como fator prognóstico não foi possível,
pois além de apenas um paciente apresentar positividade, este paciente apresentou
inúmeros outros fatores de pior prognóstico. Bcl-2 não apresentou correlação
significante com o índice apoptótico, entretanto apresentou correlação positiva
significativa (rho = +0,30; p = 0,004) com p53, resultado não esperado porque a
transcrição de Bcl-2 é inibida pela p53.
Bcl-x
L
, outra proteína antiapoptótica, apresentou positividade nos
retinoblastomas em 32/83 pacientes (38,6%) sendo bem mais expresso no
retinoblastoma que Bcl-2. E, como esperado para uma proteína pró-apoptótica,
91
apresentou correlação negativa significativa com o índice apoptótico (rho = -0,41;
p<0,001) e com as medidas observadas pela plataforma ACIS III®. Entretanto, a
expressão de Bcl-x
L
também apresentou correlação com a expressão de p53.
MDM2 apresentou positividade na imunoistoquímica em apenas 2/86 (2,3%)
dos retinoblastomas. Neste experimento, foi utilizado o anticorpo monoclonal clone
SMP14 que tem a peculiaridade de interagir com todas as proteínas MDM2, excetos
as fosforiladas no ponto 216. Somente as Ciclina A-CDK1 e Ciclina A-CDK2
parecem ter a capacidade de fosforilar a proteína neste ponto deixando a MDM2 com
menor capacidade de interagir com a p53 (ZHANG e PRIVES 2001). Entretanto,
mesmo utilizando um anticorpo monoclonal que interage com a maior parte das
proteínas MDM2 em qualquer estado de fosforilação e deixa de interagir apenas com
uma forma fosforilada de MDM2 que parece ter menor atividade na interação com
p53, uma minoria das amostras foi positiva para MDM2. Nas demonstrações de
correlação, MDM2 se correlacionou positivamente com p53 (rho = +0,60; p<0,001) e
negativamente com o índice apoptótico (rho = -0,32; p = 0,002) como o esperado
para uma proteína que exerce função antiapoptótica e tem a sua transcrição regulada
pela p53 em seu mecanismo de autorregulação.
Para melhor explicar, resumir e exemplificar a respeito da expressão das
proteínas estudadas, a Figura 26 demontra as fotomicroscopias da expressão destas
mesmas proteínas em um retinoma (dados não publicados). O retinoma é
considerado pela maioria dos autores como a variante benigna do retinoblastoma que
apresenta a mesma alteração do gene Rb1, mas tem uma evolução benigna, se a
neoplasia não se transforma em um retinoblastoma o que ocorre frequentemente.
92
Legenda: A figura do canto superior demontra corte histológico de um retinoma que apresenta
predominantemente “fleurettes”. O retinoma apresenta raras células em apoptose (que expressam
caspase-3 clivada) e raras células expressando a p53. Interessante, as proteínas relacionadas à
mitocôndria como Bcl-x
L
, PUMA, Smac/DIABLO demonstram expressão mais intensa no ápice
destas estruturas que imitam os fotorreceptores. Bax apresentou expressão difusa no citoplasma
compatível com sua característica de estar inativo no citosol e pontos de intensificação da expressão
(setas). Bcl-2, Bak (não mostrado na figura) e MDM2 foram negativas.
Figura 26 - Fotomicroscopia demonstrando a expressão das proteínas relacionadas à
apoptose estudadas no retinoma.
93
O retinoma é uma neoplasia com proliferação muito menor que a observada
no retinoblastoma. Além disso, necrose e angiogênese são mais raramente
observadas. Característicamente o retinoma é composto predominantemente por
estruturas denominadas “fleurettes” mostradas anteriormente nas Figuras 1 e 3. Estas
estruturas apresentam diferenciação para fotorreceptores que lembram os segmentos
internos dos cones que são muito ricas em mitocôndrias nos suas projeções (Figura
2). Nas fotomicroscopia da Figura 3 o retinoma apresenta raras células em apoptose
(que expressam caspase-3 clivada) e raras células expressando p53. Realmente, os
estímulos para a expressão da p53 são muito menores no retinoma. Há menos
estímulo oncogênico e menos hipóxia. Mesmo assim, as proteínas pró-apoptóticas
PUMA, Smac/DIABLO, Bax, Bim
LONG
, APAF-1 e pro-caspase-3 estão espressas no
retinoma sem que isso induza as células à apoptose. Além disso, PUMA, APAF-1 e
Smac/DIABLO apresentam intensificação da reação imunoistoquímica nas projeções
dos “fleurettes” o que sugere que estas proteínas podem estar localizadas na
mitocôndria. E se isso corresponder à realidade do processo na célula, significa que
Smac/DIABLO e APAF-1, apesar de expressas, não apresentam sua função pró-
apoptótica. Assim como a pró-caspase-3 que está expressa difusamente no
citoplasma, Bax também está expressa desta forma, com apenas raros pontos de
intensificação. Isto corresponde a relação que Bax tem com sua função e localização
subcelular. As células apresentam Bax soltas no citosol e apenas sob um estímulo
apoptótico, Bax irá se aderir a membrana mitocondrial onde ela executa sua função.
Assim como no retinoblastoma, as proteínas Bcl-2 e MDM2 não foram
expressas. Bcl-x
L
apresenta o mesmo padrão de intensificação nas projeções dos
“fleuretes”. É possível que Bcl-x
L
esteja localizado na membrana mitocôndrial,
94
anulando a função pró-apoptótica de PUMA, fazendo ligação com APAF-1 e
contendo Smac/DIABLO dentro da mitocôndria (Figura 6).
Os mecanismos moleculares que atuam nas células retinianas até o
desenvolvimento do fenótipo maligno no retinoblastoma estão sendo extensivamente
estudados através de estudos em culturas celulares, modelos animais e através de
amostras de retinoblastoma. A busca pela célula da retina que dá origem ao
retinoblastoma ainda gera discordância no meio científico com alguns afirmando que
a célula de origem já é, somente pela perda da pRb, uma célula resistente à apoptose
(CHEN et al. 2004) enquanto outros afirmam que a resistência à apoptose é devida
ao aumento de MDM2 ou MDM4 e consequente inativação da via da p53 e que este
seria um evento secundário na tumorigênese (LAURIE et al. 2006; GUO et al. 2008).
Apenas a inativação do gene RB1 não parece ser suficiente para dar origem ao
retinoblastoma, embora seja o evento inicial da sua gênese (CORSON e GALLIE
2007). Segundo VOGELSTEIN e KINZLER (2004), a maioria das neoplasias
necessita da inativação tanto da via da pRb como da p53 no seu desenvolvimento.
Grande parte dos outros tumores executa a inativação destas vias através da produção
exagerada de proteínas que inibem a função da pRb e através de mutações do gene
Tp53. Neste aspecto, o retinoblastoma é peculiar, pois a inativação da via do pRb é
causada pela perda da proteína Rb e a inativação da via p53 parece ser feita pela
produção exagerada de MDM2 e MDM4. Na amostra do nosso estudo,
demonstramos que tanto a p53, como os seus importantes transcritos pró-apoptóticos
Bax e PUMA não se correlacionaram com a apoptose. Isto pode sugerir que a
apoptose dependente de p53 está parcialmente bloqueada no retinoblastoma como
nos estudos com modelos animais (LAURIE et al. 2006).
95
Como foi possível observar pela morfologia e pela expressão de caspase-3
clivada, a apoptose é um fenômeno bastante frequente no retinoblastoma, e sugerem
que essas células malignas são particularmente sensíveis à apoptose. É provável que
a hipóxia e a ausência da pRb com consequente desregulação do ciclo celular sejam
os maiores estímulos à apoptose no retinoblastoma. As consequências da hipóxia
podem ser facilmente observadas. É classica a descrição dos manguitos de células
malignas em torno de vasos sanguíneos, porque distante deles, sem oxigênio, as
células malignas necrosam ou entram em apoptose. Importante lembrar que o
suprimento sanguíneo no olho é particularmente limitado com a presença de
irrigação sanguínea colateral escassa. Como já descrito, a hipóxia é um fenômeno
frequente nas neoplasias e parece conferir às mesmas um fenótipo mais maligno,
com aumento da angiogênese e consequente disseminação tumoral. Nos
retinoblastomas é fácil observar clinicamente a presença de angiogênese, com os
exames fundoscópicos demonstrando vasos nutridores anômalos e frequente
neovascularização da íris nos retinoblastomas avançados. E a angiogênese é um fator
importante na disseminação do retinoblastoma como demonstrado por MARBACK
et al. (2003). Desta forma, acreditamos que a presença de mais células em apoptose
nos pacientes com pior evolução seja mais uma consequencia da hipóxia que fator de
pior prognóstico.
A desregulação do ciclo celular como fator de estímulo a apoptose também
parece ser importante no Retinoblastoma uma vez que observamos apoptose em
áreas do tumor não isquêmicas. A ausência ou diminuição da função da pRb levando
à liberação dos fatores de transcrição da família E
2
F aumenta na célula a expressão
dos fatores pró-apoptóticos. Esta dupla função de E
2
F em transcrever as proteínas
96
responsáveis pelo ciclo celular e pela apoptose parece ser uma importante aquisição
dos organismos pluricelulares na eliminação de células com multiplicação
desregulada. Para avaliar o quanto o bloqueio da apoptose consequente a
desregulação do ciclo celular é importante na progressão e prognóstico do
retinoblastoma, analisaremos em áreas tumorais sem hipóxia a relação entre
proliferação e apoptose.
Este estudo utilizando a imunoistoquímica forneceu importantes resultados de
como as células do retinoblastomas parecem estar sensibilizadas à apoptose, com a
expressão exagerada de molélulas pró-apoptóticas. E, apesar da expressão destas
proteínas, nosso estudo sugere que a via apoptótica dependente de p53 está
parcialmente bloqueada nesta neoplasia. É possível que este bloqueio seja
consequente a expressão de Bcl-x
L.
Novos estudos tentando mapear onde outros
bloqueios à apoptose ocorrem e qual a importância do bloqueio à apoptose pela via
do p53 deverão ser realizados para melhorar o entendimento do desenvolvimento,
progressão e prognóstico do Retinoblastoma.
97
6 CONCLUSÕES
1. Houve um predomínio da expressão de proteínas pró-apoptóticas: Bax,
PUMA e Smac/DIABLO em detrimento da expressão de proteínas
antiapoptóticas: Bcl-2 e Bcl-x
L;
2. A presença da expressão das proteínas pró-apoptóticas parece causar maior
susceptibilidade das células do retinoblastoma à apoptose. Mas a expressão
destas proteínas não foi correlacionada com a apoptose;
3. A apoptose é um fenômeno muito frequente no retinoblastoma. Como
observado, índice apoptótico não apresenta associação com a extensão
tumoral e há uma tendência entre aumento do índice apoptótico e pior
prognóstico.
4. Algum bloqueio à apoptose é um elemento essencial no desenvolvimento das
neoplasias. No retinoblastoma, este bloqueio pode ser consequência da
expressão de Bcl-x
L
que se correlacionou negativamente com o índice
apoptótico.
98
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56.
Anexo 1 - Classificação de REESE-ELLSWORTH (1963)
Grupo I
a. Tumor solitário menor do que 4 diâmetros papilares (DP), junto ou atrás do
equador do globo ocular.
b.Tumores múltiplos, nenhum maior do que 4 DP, todos junto ou atrás do
equador.
Grupo II
a. Tumores solitários com 4 a 10 DP, junto ou atrás do equador.
b. Tumores múltiplos, com tamanho de 4 a 10 DP, atrás do equador.
Grupo III
a. Qualquer tumor anterior ao equador.
b. Tumor solitário maior do que 10 DP atrás do equador.
Grupo IV
a. Tumores múltiplos, alguns maiores que 10 DP
b. Qualquer tumor estendendo-se anteriormente à "ora serrata".
Grupo V
a. Tumor maciço envolvendo mais da metade da retina.
b. Sementes vítreas com qualquer tamanho do tumor.
Anexo 2 - ABC – CLASSIFICAÇÃO DE MURPHREE (2005)
Grupo A – Risco muito baixo.
Tumores pequenos confinados à retina
Nenhum tumor > 3 mm
Nenhum tumor na área de 1,5 mm do nervo óptico (1 DD)
Ou 3mm (2DD) da fóvea
Ausência de sementes vítreas ou descolamento de retina
Grupo B – Risco baixo
Tumor(es) confinado(s) à retina (> 3 mm)
Qualquer localização
Sem sementes vítreas
Descolamento de retina de até 5mm (3,5 DD) a partir da base do tumor
Grupo C – Risco moderado.
Sementes vítreas finas difusas ou localizadas
Descolamento de retina .>5mm ou descolamento total de retina
Ausência de flocos tumorais vítreos ou massas subretinianas
Grupo D – Risco alto.
Sementes vítreas maciças ou subretinianas
Massas em “bola de neve” em vítreo ou subretinianas
Grupo E – Risco muito alto.
Nenhuma visão potencial ou
Presença de um ou mais
Tumor em corpo ciliar /segmento anterior
Glaucoma neo-vascular
Hemorragia vítrea
Olho atrófico ou em processo de atrofia
Hifema
Sinais inflamatórios orbitários (aspecto de celulite)
Tumor anterior ou hialóide anterior
Anexo 3 - Classificação do CCSG-962 (Wolff et al. 1978, citado por ANTONELI et
al. 2003b, p.403)
Classe I Evidência ao exame anátomopatológico de células tumorais
nos canais emissários esclerais ou células tumorais espalhadas nos tecidos episclerais
por ocasião da enucleação.
Classe II Evidênica microscópica de tumor na margem de ressecção do
nervo óptico.
Classe III Tumor orbitário comprovado por biópsia.
Classe IV Massa tumoral no SNC ou células tumorais no líquor.
Classe V Metástases hematogênicas para a medula óssea, osso ou outros
locais, ou disseminação linfática para linfonodos cervicais ou de outras regiões.
Anexo 4 - Proposta de classificação do Retinoblastoma (CHANTADA et al. 2006)
Estágio 0. Pacientes com tratamento conservador.
Estágio I. Pacientes tratados com enucleação, com ressecção completa do
tumor.
Estágio II. Pacientes tratados com enucleação, com tumor residual.
Estágio III. Extensão regional:
a. Doença na órbita.
b. Extensão para linfonodos pré-auriculares e cervicais.
Estágio IV Doença Metastática
a. Metástases hematogênicas (sem envolvimento do SNC)
1. Lesão única
2. Lesões múltiplas
b. Extensão para o SNC (com ou sem metástases hematogênicas ou extensão
regional)
1. Lesão pré-quiasmática
2. Massa no SNC
3. Tumor nas leptomeninges e em LCR.
Anexo 5 - Dados clínicos, epidemiológicos, histopatológicos e imunistoquímicos
1- RGH:______________________________
2- Número do AP:_____________________
3- Sexo: 1( ) masc 2( ) fem
4- Cor: 1( ) branco 2( ) não branco 9( ) ignorado
5- Data de nascimento: ____/____/____
6- Data de admissão: ____/____/____
7- Tempo de encaminhamento:_____________________meses
8- Procedência: 1( ) SP 2( ) MS 3( ) MG 4( ) GO 5( ) BA 6( ) CE 7( ) MA 8( )
PA 9( ) MT 10( ) PR 11( ) SC 12( )RS 13( ) AM 14( ) AC 15( ) PI 16( )
PE 17( ) RN 18( ) RO 19( ) RR 20( ) AP 21( )Al 22( ) SE 23( ) RJ 24( )
TO 25 ( ) DF 26( ) ES 27( ) PB
9- História familiar: 0( ) não 1( ) sim 9( ) ignorado
10- Lateralidade: 1( ) unilateral 2( ) bilateral
11- Localização: 1( ) intraocular 2( ) extraocular
12- Estadiamento: 1( ) I 2( ) II 3( ) III 4( ) IV 5( ) V
13- Primeiros sinais OD: 1( ) brilho 2( ) estrabismo 3( ) vermelhidão
4( ) aumento do globo 5( ) diminuição da visão
6( ) FO rotina 7( ) outros 9( ) ignorado
14- Estadiamento OD: 1( ) I 2( ) II 3( ) III 4( ) IV 5( ) V 6( )nenhum
7( ) phthisis bulbi 9( ) ignorado
15- Localização OD: 1( ) IO 2( ) EO 8( ) não aplicável 9( ) ignorado
16- Fatores de risco OD: 0( ) não 1( ) sim
17- Estadiamento OE: 1( ) I 2( ) II 3( ) III 4( ) IV 5( ) V 6( )nenhum
7( ) phthisis bulbi 9( ) ignorado
18- Localização OE: 1( ) IO 2( ) EO 8( ) não aplicável 9( ) ignorado
19- Fatores de risco OE: 0( ) não 1( ) sim
20- Data de início QT: ____/____/____
21- Protocolo extra: 0( ) não 1( ) sim
22- Protocolo medulo: 0( ) não 1( ) sim
23- Número de ciclos: _________
24- Radioterapia externa OD: 0( ) não 1( ) sim
25- Radioterapia externa OE: 0( ) não 1( ) sim
26- Data da radioterapia: ____/____/____
27- Recidiva: 0( ) não 1( ) sim 9( ) ignorado
28- Data de recidiva: ____/____/____
29- Local da recidiva: 1( ) Órbita direita 2( ) Órbita esquerda 3( ) LCR 4( ) MO
5( ) 1+ 3 6( ) 1+ 4 7( ) 2 + 3 8( ) 2 + 4
9( ) outras 99( ) ignorado
30- Segundo tumor: 0( ) não 1( ) sim 9( ) ignorado
31- Data do segundo tumor: ____/____/____
32- Local do segundo tumor: 1( ) primário com RT 2( ) primário sem RT 3( ) não 1º
8( ) não se aplica 9( ) ignorado
33- Histologia do 2º tumor: 1( ) osteossarcoma 2( ) sarcoma partes moles
3( ) LLA 4( ) LMA 5( ) outro 8( ) não aplica 9( ) ignorado
34- Data da última informação: ____/____/____
35- Status: 1( ) vivo sem doença 2( ) vivo com doença 3( ) morte pelo tumor
4( ) morte sem tumor 5 ( ) morte por segundo tumor 9( ) perda de seguimento
Imunoistoquímica:
Contagem de células marcadas pela caspase-3 clivada
36- Índice apoptótico: ____%
Microscopia óptica.
37- p53: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
38- Bcl-2: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
39- Bax: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
40- Bak: : 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
41- Bcl-x
L
: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
42- Bim
LONG
: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
43- MDM2: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
44- PUMA: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
45- Smac/DIABLO: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
46- APAF-1: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
47 – Pró-caspase-3: 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
49- Caspase-3 clivada: : 0 ( ) negativo 1 ( ) positivo 9 ( ) não avaliável
Avaliação pelo ACIS III®
50- APAF-1: _____ intensidade _______% de área corada.
51- Bcl-2: _____ intensidade _______% de área corada.
52- Bax: _____ intensidade _______% de área corada.
53- Bak: _____ intensidade _______% de área corada.
54- Bcl-x
L
: _____ intensidade _______% de área corada.
55- Bim
LONG
: _____ intensidade _______% de área corada.
56- Caspase-3 clivada: _____ intensidade _______% de área corada.
57- Pró-caspase-3 clivada: _____ intensidade _______% de área corada.
57- PUMA: _____ intensidade _______% de área corada.
58- Smac/DIABLO: _____ intensidade _______% de área corada.
56- Caspase-3 clivada: _____ intensidade _______% de núcleos corados.
59- p53: _____ intensidade _______% de núcleos corados
60- MDM2: _____ intensidade _______% de núcleos corados
Anexo 6 - Protocolo de Imunoistoquímica
1. O bloco de TMA é cortado no micrótomo rotativo na espessura de 5 µm.
Coloca-se o tape contra o bloco de TMA e corta-se.
2. O tape com o material é colado na lâmina apropriada e com a pressão manual
de um rolo o tape é fixado na lâmina. A lâmina com o tape sofre a irradiação
com UV por 30 min, sendo em seguida mergulhada em solução solvente
(TPC) e seca a temperatura ambiente
3. Os tapes são retirados após a secagem.
4. As lâminas sofrem banho de parafina, estando prontas para o armazenamento
em freezer.
5. Desparafinização das lâminas deixadas por 24 horas em estufa 60ºC:
6. Xilol a 60ºC por 20 minutos
7. Xilol à temperatura ambiente por 20 minutos
8. Etanol 100% 30segundos
9. Etanol 85% 30 segundos
10. Etanol 70% 30 segundos
11. Lavar as lâminas em água corrente e destilada.
12. Ferver a solução tampão citrato 10 mM pH 6.0 em panela de pressão
(Pascal® ou Eterna®, Nigro) destampada, mergulhar as lâminas e lacrar a
panela com a válvula de segurança aberta.
13. Após a saída do vapor saturado, abaixar a válvula de segurança e aguardar a
pressurização total. Contar 4 minutos após esse sinal.
14. Deixar a panela fechada sob água corrente por 10 minutos. Destampar a
panela com as lâminas e deixar por mais 10 minutos à temperatura ambiente.
Lavar as lâminas em água corrente e destilada
15. Proceder ao bloqueio da peroxidase endógena com H
2
O
2
3%, (água
oxigenada 10 vol) com 4 trocas de 5 minutos cada. Lavar em água corrente e
destilada
16. Lavar com solução salina tamponada com fosfatos (PBS-phosphate buffered
saline) 10mM pH 7.4 por 5 minutos.
17. Incubar as lâminas com o anticorpo primário diluído em título pré-
estabelecido conforme a tabela 2 em tampão PBS contendo albumina bovina
(BSA) 1% (Sigma, A9647, EUA) e azida sódica (NaN3) 0,1%, por 18 horas a
4ºC em câmara úmida.
18. Lavar em tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada.
19. Incubar por 30 min a 37°C com Post Primary Block (NovoLink Max Polymer
RE7260-k, Reino Unido). Lavar com tampão PBS com 3 trocas de 3 min
cada.
20. Incubar com o NovoLink Polymer por 30 min a 37° C
21. Lavar em tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada.
22. Incubar as lâminas em solução substrato: 60 mg% de 3,3’ Diaminobenzidine
Tetrahydrochloride (DAB) (Sigma, D-5637, EUA); 1 mL de
Dimetilsulfóxido (DMSO); 1 mL de H
2
O
2
6% (água oxigenada 20 vol); 100
mL de PBS; por 5 minutos a 37ºC, ao abrigo da luz.
23. Observar ao microscópio, nas lâminas controles, o desenvolvimento de
precipitado acastanhado, como produto final da reação.
24. Lavar em água corrente e água destilada por 3 minutos.
25. Contracorar com Hematoxilina de Harris por 1 minuto.
Lavar bem em água corrente e destilada
26. Imergir 2 vezes em água amoniacal (solução de hidróxido de amônio 0,5%),
lavando em seguida em água corrente e destilada.
27. Desidratar as lâminas em:
Etanol 80%, 30 segundos
Etanol 95%, 30 segundos
Etanol 100% 2 vezes, 30 segundos cada
Xilol 4 vezes, 30 segundos cada
28. Montagem das lâminas em Entellan neu (Merck, 1.07961, Alemanha).
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