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THAÍSA TESSUTTI PINHEIRO
Análise da expressão de genes associados à via de biossíntese de ácidos graxos em
Theobroma cacao e ao acúmulo de ácido esteárico
PIRACICABA
2009
Dissertação apresentada ao Centro de
Energia Nuclear na Agricultura,
Universidade de São Paulo, para obtenção do
título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Biologia na
Agricultura e no Ambiente
Orientador: Prof. Dr. Antonio Vargas de
Oliveira Figueira
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER
MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE
QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Pinheiro, Thaísa Tessutti
Análise da expressão de genes associados à via de biossíntese de ácidos graxos em
Theobroma cacao e o acúmulo de ácido esteárico / Thaísa Tessutti Pinheiro; orientador
Antonio Vargas de Oliveira Figueira. - - Piracicaba, 2009.
121 f.: il.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de
Concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia Nuclear na
Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Cacau 2. Expressão gênica 3. Lipídeos
4. Metabolismo de gordura
5. RT-qPCR I. Título
CDU 577.125:575.117
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Aos meus pais Dorival e Marilda e a minha irmã Renata, pelo amor, apoio e pela confiança
sempre depositada em mim
DEDICO
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida, saúde e por toda a luz,
Ao prof. Dr. Antonio Figueira pela orientação e crescimento científico proporcionado;
A Dra. Maria Lorena Sereno por toda ajuda, acessibilidade e atenção;
A aluna Déborah Sanae Nishimura pelo auxílio em muitos momentos da minha
pesquisa e principalmente pela amizade;
Ao Dr. Gildemberg Leal Júnior pelas orientações recebidas;
Ao Dr. Paulo Albuquerque pela atenção e contribuição com os frutos de cacau junto a
CEPLAC;
Aos técnicos Wlamir Godoy, Eduardo Fonseca e Raquel Orsi pela amizade e
cooperação;
Às técnicas Maria Antonia Ladalardo Etchegaray e Carolina Galafasi Pereira, do
Laboratório de Nutrição e Crescimento Animal - ESALQ/USP, pelo auxílio na obtenção e
análise do perfil de ácidos graxos;
Aos secretários da Pós–Graduação do CENA/USP: Cláudia Corrêa, Neuda Oliveira,
Sônia de Campos e Fábio Oliveira; e a bibliotecária Marília Henyei;
A Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) por disponibilizar
os frutos de Theobroma cacao;
A Prof
a
Dr. Sui Mui Tsai, do Laboratório de Biologia celular e Molecular do
CENA/USP pelo auxílio no sequenciamento das amostras;
5
A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela
concessão da bolsa de estudo;
Aos meus pais Dorival e Marilda pelo carinho, amor e apoio em todos os momentos e
a minha irmã Renata pela grande amizade;
Ao meu namorado Tiago Carletti, por tanto amor, conforto e alegrias sempre;
Aos integrantes e ex-integrantes do Laboratório de Melhoramento de Plantas: Aline
Possignolo, Celso Gaspar, Danielle Scotton, Déborah Sanae Nishimura, Eduardo Bressan,
Felippe Campana, João Felipe Oliveira, João Fernando Bortoleto, Joice Banim, Layanne
Souza, Lígia Santos, Matheus Mariotti, Raul Santin, Paula Yamamoto, Renato Ferreira,
Onildo Nunes, Tais Tomazin; pela troca de experiências, convívio, amizade e principalmente
por tornarem minha pós-graduação muito mais feliz!
6
RESUMO
PINHEIRO, T. T. Análise da expressão de genes associados à via de biossíntese de ácidos
graxos em Theobroma cacao e ao acúmulo de ácido esteárico. 2009. 121 f. Dissertação
(mestrado). Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba,
2009.
As sementes do cacaueiro (Theobroma cacao L.) constituem a única fonte de manteiga
de cacau, matéria prima fundamental para as indústrias de chocolates e confeitos,
farmacêutica e cosmética. Cerca de 50 % do peso seco das sementes é composto por gordura,
caracterizada pelo alto nível de estearato (30-37%), em combinação com palmitato (24-31%)
e de oleato (33-39%), conferindo-lhe uma composição triglicerídica única, responsável pelas
suas propriedades de fusão, com aplicações específicas e especiais. Apesar dos genes que
codificam as enzimas da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos e triglicerídeos em
plantas serem conhecidos, os mecanismos moleculares pelos quais as plantas controlam a
produção de estearato e que diferenciam as plantas acumuladoras de estearato de todas as
demais não estão claramente definidos. O objetivo deste trabalho foi analisar a composição de
ácidos graxos nos frutos de Theobroma cacao e a expressão temporal de genes relacionados à
via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de sementes de T.
cacao, com ênfase na acumulação de estearato. Em paralelo, foram eleitos os genes
referências mais estáveis para os estudos em embriões e diversos tecidos de Theobroma
cacao. Empregando-se a técnica de reação quantitativa da amplificação em cadeia de
transcritos reversos de RNA (RT-qPCR), foram analisadas a expressão dos genes
codificadores da proteína carregadora de acil A, B e C, β-cetoacil-ACP sintase II,
Δ9
estearoil-
ACP desaturase A e B, Acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B, acil-CoA sintetase A
e B e da proteína oleosina. Quando se estudou de expressão gênica apenas nos embriões de T.
cacao, os três genes mais estáveis foram proteína ribossomal L35, proteína carregadora de
acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Quando se considerou diversos tecidos de
plantas de Theobroma cacao, os melhores genes para a normalização dos valores de
expressão foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B
e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. A acumulação de transcritos da
Δ9
estearoil-ACP
desaturase foi relacionada ao aumento do ácido oleico. O aumento na quantidade deste ácido
acontece pela ação conjunta da
Δ9
estearoil-ACP desaturase, e acil-ACP tioesterase A, a qual
7
mostra maiores níveis de transcritos entre 90 e 140 DAP com pico aos 100 DAP. O aumento
de ácidos esteárico estaria relacionado com a ação conjunta e com transcrição temporalmente
coordenada dos genes das enzimas β-cetoacil-ACP sintase II, Acil-ACP tioesterase A e Acil-
ACP tioesterase B. Transcritos da enzima β-cetoacil-ACP sintase II apresenta pico aos 100
DAP, possivelmente com acúmulo máximo de substratos 18:0-ACP, que poderiam ser
hidrolizado preferencialmente pela enzima acil-ACP tioesterase A, ou acil-ACP tioesterase B,
O intervalo entre o pico de acúmulo de trasncritos entre β-cetoacil-ACP sintase II (100 DAP)
e Acil-ACP tioesterase A e
Δ9
estearoil-ACP desaturase (110 DAP) sugere que poderia ocorrer
um acúmulo de estearato resultante da ação dessas enzimas. Esses resultados corroboram o
modelo de acumulação de estearato proposto por Silva (2005).
Palavras-chave: cacau, expressão gênica, RT-qPCR, biossíntese ácidos graxos
8
ABSTRACT
PINHEIRO, T. T. Expression analysis of genes associated with the fatty acid biosynthetic
pathway in Theobroma cacao and with the accumulation of stearic acid. 2009. 121 f.
Dissertação (mestrado). Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São
Paulo, Piracicaba, 2009.
Cacao seeds (Theobroma cacao L.) are unique sources of cocoa butter, fundamental
raw material for the chocolate, confectionary, cosmetic and pharmaceutical industries. Around
50% of the seed dry weight represents fat, characterized by the high levels of stearate (30-
37%), in combination of palmitate (24-31%) and oleate (33-39%), giving a unique
triacylglycerol compostion, responsible for the melting profile for special and specific
applications. Despite the fact that genes encoding enzymes of the fatty acid and triglyceride
biosynthetic pathway of plants are known, the mechanisms to control the accumulation of
high levels of stearate, that differ from other species, are not clearly defined. The objective of
this work was to analyse the composition of fatty acids and the expression of genes associated
with fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway during the development of cacao pods,
with emphasis with stearate accumulation. In parallel, the establishment of stable reference
genes to investigate gene expression in developing embryos and other cacao tissues were
investigated. Using the quantitative amplification of reversed transcripts (RT-qPCR), the
expresion of genes coding for the acyl-carrier protein A, B and C; β-ketoacyl-ACP sinthase II;
Δ9
stearoyl-ACP desaturase A and B; Acyl-ACP thioesterase A; Acyl-ACP thioesterase B;
Acyl-CoA sintethase A and B; and oleosin. When gene expression was conductd only in
developing cacao embryos, the three most stable genes were the ribosomal protein L35, acyl-
carrier protein A and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. When various tissues were
considered, the best reference genes for gene expression normalization were those encoding
for the ribosomal protein L35, acyl carrier protein B and glyceraldehide 3-phosphate
dehydrogenase. The accumulation of
Δ9
stearoyl-ACP desaturase transcripts could be
associated with the accumulation of oleate, together with the increase of acyl-ACP
thioesterase A, with increased relative levels of transcripts between 90 and 140 DAP, peaking
at 100 DAP. The increase in stearate might result from the joint activity of the
Δ9
stearoyl-
ACP desaturase and acyl-ACP thioesterase A, which presented higher accumulation of
transcripts between 90 and 140 DAP, with peak at 110 DAP. The increase in stearate would
9
associated with the joint and temporal coordinated expression of genes encoding β-ketoacyl-
ACP synthase II, and Acyl-ACP thioesterase A and B. Transcripts of the enzyme β-ketoacyl-
ACP synthase II peaked at 100 DAP, possibly with the maximum accumulation of substrates
18:0-ACP, that would be preferentially hydrolzyed by the enzyme acyl-ACP thioesterase A,
or acyl-ACP thioesterase B, The gap between the peak in transcript accumulation between β-
ketoacyl-ACP synthase II (100 DAP) and acyl-ACP thioesterase A and
Δ9
stearoyl-ACP
desaturase (110 DAP) could lead to the accumulation of stearate. These results corroborated
the model proposed by Silva (2005).
Key-words: cocoa, gene expression, RT-qPCR, fatty acids biosynthesis
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
16:0
ácido palmítico
16:0-ACP
palmitoil-ACP
18:0
ácido esteárico
18:0-ACP
estearoil-ACP
18:1
acido oleico
18:1-ACP
oleil-ACP
18:2
ácido linoleico
20:1
ácido gadoleico
ACP A
Proteína carregadora de acil A
ACP B
Proteína carregadora de acil B
ACP C
Proteína carregadora de acil C
ACS A
acil-CoA sintetase A
ACS B
acil-CoA sintetase B
BLAST
alinhamento local de sequências (Basic Local Alignament Sequence
Tool)
cDNA
DNA complementar ao mRNA
CTAB
brometo de hexadiltrimetilamônio
DAP
dias após a polinização
DNA
ácido desoxirribonucléico
dNTP
N-desoxinucleótideo trifosfato
EDTA
ácido etilenodiaminotetracético
EST
Etiqueta de sequência expressa (Expressed Sequence tag)
Fat A
Acil-ACP tioesterase A
Fat B
Acil-ACP tioesterase B
KAS II
β-cetoacil-ACP sintase II
OLEO
Oleosina
PCR
reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction)
RNA
ácido ribonucléico
RT-PCR
transcrição reversa seguida de PCR
RT-qPCR
transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo-real
SAD A
D9
estearoil-ACP desaturase A
11
SAD B
D9
estearoil-ACP desaturase B
SB
tampão ácido bórico – sódio (Sodium Boric Acid)
SDS
dodecil sulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate)
T. cacao Theobroma cacao
12
LISTA DE SÍMBOLOS
ton tonelada
pb pares de bases
ºC graus Celsius
mg
micrograma
mL
microlitro
L litro
g grama
mg miligrama
min minuto
mL mililitro
seg segundo
g constante gravitacional
h hora
nm nanômetro
mM milimolar
mM
micromolar
ng nanograma
U unidade de enzima (Weiss)
M molar
cm centímetro
% por cento
V volts
13
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................16
2. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................19
2.1 Importância econômica do gênero Theobroma..................................................................19
2.2 Ácidos graxos e triglicerídeos em sementes de cacaueiro..................................................20
2.3 Alterações na composição de ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de
sementes de cacaueiro ..........................................................................................................21
2.4 Biossíntese de ácidos graxos em plantas............................................................................22
2.5 Biossíntese e empacotamento de triglicerídeos em plantas................................................23
2.6 Desenvolvimento e produção de triglicerídeos nas sementes de cacau .............................25
2.7 Plantas acumuladoras de estearato .....................................................................................25
2.8 Recursos genômicos para o cacaueiro................................................................................28
2.9 Amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR) e genes referência............29
3. OBJETIVOS.......................................................................................................................31
4. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................32
4.1 Material vegetal..................................................................................................................32
4.1.1 Sementes de T. cacao .....................................................................................................32
4.1.2 Tecidos de T. cacao........................................................................................................32
4.2 Identificação de genes associados à via metabólica de biossíntese de ácidos graxos..33
4.2.1 Busca das sequências.....................................................................................................33
4.2.2 Construção dos iniciadores...........................................................................................33
4.3 Extração de RNA................................................................................................................34
4.3.1 Extração de RNA de sementes de T. cacao..................................................................34
14
4.3.2 Extração de RNA de diversos tecidos de T. cacao ......................................................35
4.4 Quantificação e análise da integridade do RNA total ........................................................36
4.5 Tratamento com DNAse.....................................................................................................37
4.6 Síntese de cDNA ................................................................................................................38
4.7 Confirmação da eficiência da síntese.................................................................................37
4.8 Clonagem e sequenciamento..............................................................................................38
4.9 Minipreparação do DNA plasmidial ..................................................................................39
4.10 Sequenciamento dos fragmentos......................................................................................39
4.11 Extração de DNA genômico.............................................................................................40
4.12 Amplificação dos cDNAs e DNA genômico....................................................................41
4.13 Amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR)........................................41
4.14 Seleção dos genes referência............................................................................................43
4.15 Extração e metilação de ácidos graxos.............................................................................43
4.16 Análise por Cromatografia Gasosa...................................................................................44
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................45
5.1 Identificação de genes associados à via metabólica de biossíntese de ácidos graxos do
cacaueiro...............................................................................................................................46
5.2 Construção dos iniciadores.................................................................................................51
5.3 Extração, quantificação e análise de RNA.........................................................................52
5.4 Seleção de genes referência................................................................................................56
5.5 Caracterização do perfil de ácidos graxos dos frutos de Theobroma cacao ......................64
5.6 Determinação da eficiência dos iniciadores específicos dos genes da via metabólica de
ácidos graxos de Theobroma cacao .....................................................................................65
5.7 Análise da expressão gênica nos embriões de Theobroma cacao nos diversos estágios de
desenvolvimento...................................................................................................................66
5.7.1 Expressão gênica das proteínas carregadoras de acil em embriões de Theobroma
cacao.....................................................................................................................................68
5.7.2 Expressão da β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II) em embriões de Theobroma cacao
..............................................................................................................................................71
5.7.3 Expressão das
Δ9
estearoil-ACP desaturases em embriões de Theobroma cacao ......72
5.7.4 Expressão das acil-ACP tioesterases A e B (Fat A e Fat B) em embriões de
Theobroma cacao.................................................................................................................74
15
5.7.5 Expressão acil-CoA sintetase (ACS) em embriões de Theobroma cacao ..................76
5.7.6 Expressão Oleosina (OLEO) em embriões de Theobroma cacao...............................78
5.8 Análise da expressão gênica nos tecidos de Theobroma cacao......................................80
5.8.1 Expressão das proteínas carregadoras de acil A, B e C (ACP A, ACP B e ACP C)
nos diversos tecidos de Theobroma cacao..........................................................................81
5.8.2 Expressão da β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II) nos diversos tecidos de Theobroma
cacao.....................................................................................................................................82
5.8.3 Expressão das estearoil-ACP desaturase nos diversos tecidos de Theobroma cacao83
5.8.4 Expressão das acil-ACP tioesterase A e B (Fat A e Fat B) nos diversos tecidos......85
5.8.5 Expressão das acil-CoA sintetase A e B (ACS A e ACS B) nos diversos tecidos de
Theobroma cacao.................................................................................................................87
5.8.6 Expressão da oleosina nos embriões de Theobroma cacao.........................................89
5.9 Correlação entre acúmulo de transcritos e composição de ácido graxos das sementes em
desenvolvimento...................................................................................................................90
5.10 Biossíntese de ácidos graxos............................................................................................94
5.11 Acumulação de ácido esteárico em Theobroma cacao ....................................................95
6. CONCLUSÕES...................................................................................................................97
7. REFERÊNCIAS .................................................................................................................99
APÊNCICES.........................................................................................................................108
APÊNCICE A.................................................................................................................109
APÊNCICE B.................................................................................................................111
16
1. INTRODUÇÃO
O gênero Theobroma é o de maior importância da antiga família Sterculiaceae (agora
parte da Malvaceae sensu lato; BAYER et al., 1999), devido à relevância econômica do
cacaueiro, Theobroma cacao L. (PURSEGLOVE, 1968). As sementes do cacaueiro
constituem a única fonte de manteiga de cacau e de sólidos (líquor), matérias-primas
fundamentais da indústria de chocolates e confeitos, farmacêutica e cosmética (PIRES et al.,
1998). A composição química singular, devido à saturação dos ácidos graxos, é responsável
por suas propriedades de fusão num comportamento físico único da manteiga, com aplicações
específicas e especiais. A manteiga de cacau é composta basicamente por triglicerídeos
(97%), sendo o restante constituído por diglicerídeos, monoglicerídeos, e ácidos graxos livres.
É caracterizada pelo alto nível de estearato (18:0 = 30-37%), em combinação com 24-31% de
palmitato (16:0) e 33-39% de oleato (18:1), possuindo composição triglicerídica única. Esses
ácidos graxos compõem os três principais triglicerídeos: oleodipalmitina (POP),
oleodiestearina (SOS), e oleopalmitoestearina (POS), que somados representam mais de 75%
da composição em triglicerídeos da manteiga de cacau.
Além do cacaueiro, apenas poucas outras plantas acumulam quantidades importantes
de estearato em suas sementes. O perfil de ácidos graxos dos embriões de T. cacao revelam o
potencial de uso desta espécie na indústria.
Os genes que codificam as enzimas da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos
e triglicerídeos em plantas são conhecidos. As enzimas de síntese estão principalmente
localizadas no estroma de plastídios e no retículo endoplasmático, e o perfil de ácidos graxos
pode ser determinado por atividade diferencial desses genes, sob grande influência ambiental,
principalmente da temperatura. Entretanto, os mecanismos moleculares e bioquímicos pelos
quais as plantas controlam a produção de estearato, e que diferenciam as plantas
acumuladoras de estearato de todas as demais não estão claramente definidos. A seletividade
da enzima acil-ACP tioesterase em sementes oleaginosas acumuladoras de estearato
sugeriram a existência de acil-ACP tioesterases com uma maior atividade sobre estearoil-ACP
quando comparada a acil-ACP tioesterase de plantas não acumuladoras de estearato. Além
disso, a menor atividade da estearoil-ACP desaturase pode também resultar na produção de
maiores níveis de estearato.
Silva (2005) realizou um estudo onde identificou e caracterizou sequências gênicas
expressas (EST) e a expressão de genes durante o desenvolvimento de sementes de T. cacao,
17
com ênfase na via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos. Foi construída uma biblioteca
de cDNA de sementes de cacaueiro em desenvolvimento, seqüenciando-se 1.305 clones, que
resultaram em 892 seqüências únicas e 164 contigs, totalizando 1056 sequências únicas.
Entre esses, foram identificados 71 clones contendo sequências de genes envolvidos na via
metabólicas de ácidos graxos e triglicerídeos. A expressão dos genes codificadores da
proteína carregadora de acil (ACP), b-cetoacil-ACP sintase II (KAS II), acil-ACP tioesterase
A (Fat A), acil-ACP tioesterase B (Fat B), acil-CoA sintetase (ACS) e oleosina, foram
analisados por northern blot em sementes em desenvolvimento de Theobroma cacao. As
conclusões corroboraram a hipótese que a ação conjunta de b-cetoacil sintases (KAS),
estearoil-ACP desaturase, acil-ACP tioesterase A, e acil-ACP tioesterase B determinaria perfil
de ácidos graxos disponíveis para a montagem dos triglicerídeos. Entretanto, a baixa
qualidade do mRNA obtido de sementes de cacau limitaram a precisão dos resultados obtidos
por Silva (2005). A análise quantitativa e temporal da expressão de genes codificadores de
enzimas envolvidos na produção da manteiga de cacau durante o desenvolvimento das
sementes de cacau, possui importância por se tratar de características bioquímicas de interesse
comercial, por suas múltiplas potencialidades na obtenção de novos produtos geneticamente
modificados e auxiliaria na elucidação dos mecanismos de controle da biossíntese de ácidos
graxos e triglicerídeos em Theobroma cacao.
O presente trabalho tem como objetivo principal realizar o estudo da expressão
temporal de genes relacionados à via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o
desenvolvimento de sementes de T. cacao, dando continuidade ao trabalho realizado por Silva
(2005). O emprego da técnica de reação de amplificação em cadeia quantitativa de transcritos
reversos de RNA (RT-qPCR) em embriões em desenvolvimento permitiu a concretização de
um objetivo secundário: estabelecer genes referências adequados para o estudo de expressão
gênica em embriões e diversos tecidos de Theobroma cacao. A quantificação da expressão
necessita de uma série de padronizações, ou seja normalização de vários parâmetros como
quantidade inicial da amostra, integridade e quantidade de RNA, eficiência enzimática da
síntese de cDNA e da amplificação da PCR, atividade transcricional de tecidos e células
analisadas e principalmente o uso de genes referência (housekeepings) adequados (BUSTIN,
2002; GINZINGER, 2002). A escolha do gene referência mais estável para o estudo em
embriões e diversos tecidos de Theobroma cacao, é de grande importância para as futuras
pesquisas nesta cultura.
Portanto, a hipótese deste trabalho é que a ação conjunta de sintases, estearoil-ACP
desaturase, acil-ACP tioesterases A, e acil-ACP tioesterases B determina a acumulação de
18
ácido esteárico, sendo consequentemente relacionada ao perfil único e insubstituível da
manteiga de cacau.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Importância econômica do gênero Theobroma
O gênero Theobroma é o de maior importância da antiga família Sterculiaceae, (agora
parte da Malvaceae sensu lato BAYER et al., 1999), devido à relevância econômica do
cacaueiro, Theobroma. cacao L. (PURSEGLOVE, 1968). O gênero possui 22 espécies
(CUATRECASAS, 1964), sendo que T. grandiflorum (cupuaçu), T. obovatum, T. subincanun,
T. speciosum, T. sylvestre, T. microcarpum, T. bicolor, T. cacao, T. glaucum e T.
canumanense, são representadas no Brasil (CUATRECASAS, 1964; SILVA; FIGUEIRA,
2005). As espécies T. grandiflorum e T. cacao são as únicas cultivadas comercialmente
(SILVA; FIGUEIRA; SOUZA, 2001; SOUZA; DIAS, 2001).
As sementes do cacaueiro constituem a única fonte de manteiga de cacau e de sólidos
(líquor), matérias primas fundamentais da indústria de chocolates e confeitos, farmacêutica e
cosmética (PIRES et al., 1998). Apresentando alto valor comercial, a manteiga de cacau é
considerada uma importante matéria-prima nas indústrias alimentícia e cosmética, alcançando
altos valores no mercado. Sua amêndoa é insubstituível na fabricação de produtos como
chocolates, confeitos, na indústria farmacêutica e cosmética (SILVA; FIGUEIRA, 2005). Seu
ponto de fusão fica um pouco abaixo da temperatura corpórea, o que a torna ideal nos
produtos que necessitam desta característica (POSORSKE, 1988).
A produção anual de cacau no mundo chega a 3 milhões de toneladas e o número de
pessoas que dependem dessa cultura chega a 50 milhões. Nos últimos 100 anos, o aumento
anual da demanda por cacau foi de 3% ao ano (WORLD COCOA FUNDATION, 2009).
Considerando-se a produção brasileira até o mês de agosto de 2008, estimou-se 211.435
toneladas métricas e em 2006 a produção mundial chegou a 4.058.584 toneladas métricas,
sendo os principais produtores Costa do marfim, Gana, Indonésia, Nigéria e Brasil
(AGRIANUAL, 2009; 2008).
20
2.2 Ácidos graxos e triglicerídeos em sementes de cacaueiro
As sementes do cacaueiro apresentam em média de 53 % de gordura em peso seco não
fermentado (PIRES et al., 1998). De forma similar a outros lipídeos de reserva, a manteiga de
cacau é composta por cerca de 97% de triglicerídeos, mas seu perfil de ácidos graxos difere de
outros óleos comerciais, consistindo principalmente de palmitato (16:0; P), estearato (18:0; S)
e oleato (18:1
D9
; O) em proporções similares, e linolenato (18:2
D9,12
; L) em menor
percentual. Os três principais triglicerídeos que compõem a manteiga de cacau são 1,3-
dipalmitoil-2-oleoil-glicerol (POP), 1(3)-palmitoil-3(1)estearoil-2-oleoil-glicerol (POS); 1,3-
distearoil-2-oleoil-glicerol (SOS); com ácido oleico na posição 2-sn da ligação glicerol (LIU;
CHANG; LIU, 2007). Os triglicerídeos POS, SOS e POP representam mais de 75% da
composição da manteiga (GUNSTONE; HARWOOD; PADLEY, 1994; GILABERT-
ESCRIVA, 2002).
As propriedades físicas da manteiga de cacau derivam de sua composição de ácidos
graxos e triglicerídeos (PIRES et al., 1998). Essa característica singular, devido a saturação
dos ácidos graxos, é responsável pelas suas propriedades únicas de fusão num comportamento
única da manteiga, com aplicações específicas e especiais. O perfil de dureza da manteiga de
cacau é determinado pelo comprimento da cadeia de ácidos graxos, grau de insaturação e
posicionamento no triglicerídeo (DIMICK, 1991). O alto conteúdo de estearato está
diretamente relacionado a estas características (HARWOOD, 1996).
Estearato (18:0) representa apenas 1-5% da composição triglicerídica da maioria das
sementes oleaginosas (GUNSTONE; HARWOOD; PADLEY, 1994). Poucas espécies de
plantas acumulam quantidades significantes de estearato em suas sementes como cacaueiro
(Theobroma cacao), Carité (Butyrospermum parkii), ‘Sal’ (Shorea robusta), ‘Kokum’
(Garcinia indica), e Mangostão (Garcinia mangostana) (HAWKINS; KRIDL, 1998).
21
2.3 Alterações na composição de ácidos graxos e triglicerídeos durante o
desenvolvimento de sementes de cacaueiro
A composição de ácidos graxos da manteiga de cacau é influenciada por fatores
ambientais, entre os quais se destaca a temperatura. Desta forma, temperaturas elevadas
durante a fase de desenvolvimento dos frutos conduzem a formação de ácidos graxos com
menor grau de insaturação. Este aumento da saturação dos ácidos graxos determina o
incremento da dureza da manteiga de cacau (BERBERT; ALVIM, 1972; BERBERT, 1976;
LEHRIAN; KEENEY, 1980). Theobroma cacao é cultivado principalmente entre as latitudes
5ºN e 5ºS, entretanto o cacau produzido no sul da Bahia se desenvolve na latitude 15ºS, onde
enfrenta temperaturas mais baixas durante o inverno. A temperatura baixa aumenta o
conteúdo de ácidos oleico e linoleico na manteiga de cacau, ocasionando um amolecimento na
manteiga de cacau de frutos colhidos no sul da Bahia entre os meses de agosto a outubro, o
que diminui o seu preço no mercado internacional (FIGUEIRA et al., 2000).
O tempo necessário para a maturação dos frutos de Theobroma cacao varia de cinco a
seis meses (SOUZA; DIAS, 2001). Estudos comprovaram que existem diferenças na
insaturação da manteiga de cacau quando relacionam- se frutos verdes e maduros, concluindo-
se que a insaturação diminui durante a maturação dos frutos (DITTMAR; DUARTE, 1960).
Alterações na composição lipídica da manteiga de cacau de sementes colhidas em intervalos
de 110 dias após a polinização (DAP), até a maturação dos frutos permitiu concluir-se que em
todos os estágios do desenvolvimento os triglicerídeos estão presentes, o que corresponde a
69-96% dos lipídeos totais (LEHRIAN; KEENEY, 1980). Entre 120 e 150 DAP, a síntese de
triglicerídeos ocorre a uma taxa praticamente linear, estabilizando-se no período final do
desenvolvimento. O teor de lipídeos encontrados na matéria seca triplica entre 110 e 130
DAP, passando de 16,2% para 50,1%. A composição de ácidos graxos altera-se entre 110 e
140 DAP juntamente com o aumento no teor de ácido esteárico e diminuição de ácido
linoleico, estabilizando-se aos 150 DAP (LEHRIAN; KEENEY, 1980).
22
2.4 Biossíntese de ácidos graxos em plantas
A síntese de ácidos graxos nas plantas ocorre no interior dos plastídios. Dois
complexos de enzimas são responsáveis pela síntese de ácidos graxos: acetil- CoA carboxilase
(ACCase) e Sintase de Ácidos Graxos (FAS) (Figura 2.1). O sistema ACCase é responsável
pela carboxilação do acetil- CoA, substrato inicial da síntese de ácidos graxos, formando
malonil- CoA. As enzimas do complexo FAS catalisam o crescimento da cadeia carbônica
adicionando carbonos provenientes da acetil- CoA até atingir 18 carbonos. O alongamento da
cadeia de ácidos graxos é dependente de um co-fator, denominado proteína carregadora de
acil (ACP) (SOMERVILLE, 1991; SOMERVILLE et al., 2000).
A elongação das ligações carbono-carbono é realizada pelas enzimas 3-Ketoacil-ACP
sintase (KAS), as quais são representadas por três isoenzimas (I, II e III). KAS III tem forte
preferência por Acetil-CoA, na qual adicionando carbonos irá se formar malonil-CoA. KAS I
tem preferência a substratos Acil-ACP alongando a cadeia até palmitoil-ACP (16:0-ACP), e
KAS II alonga palmitoil-ACP (16:0-ACP) até estearoil-ACP (18:0-ACP).
Ácidos graxos monoinsaturados são formados por duplas ligações que são
introduzidas nas cadeias carbônicas por enzimas desaturases. Existem isoformas destas
enzimas, as quais agem em diferentes substratos. Palmitoil-ACP e estearoil-ACP podem
sofrer insaturações pelas enzimas
Δ6
estearoil-ACP desaturase (
Δ6
SAD) e
Δ9
estearoil-ACP
desaturase (
D9
SAD), respectivamente (SOMERVILLE, 1991; SOMERVILLE et al., 2000).
Nas plantas, normalmente a cadeia carbônica é alongada em 16:0 ou 18:0 carbonos e
ao atingirem esses comprimentos, algumas enzimas agem hidrolisando as cadeias carbônicas,
transformando-as em ácidos graxos livres. A reação mais comum é a realizada por enzimas
tioesterases, as quais quebram as ligações ésteres da parte acil da ACP. Existem dois tipos
principais de Acil-ACP tioesterases; Fat A e Fat B. Fat A é a mais abundante e tem
preferência pelo substrato 18:1-ACP, e Fat B agem em 16:0-ACP. Essa clivagem permite que
a cadeia pare de ser alongada, e a parte acil seja exportada para fora do plastídio
(SOMERVILLE, 1991; SOMERVILLE et al., 2000).
23
Os ácidos graxos livres são re-esterificados a CoA pela enzima acil-CoA sintetase
(ACS), para assim serem transportados até o retículo endoplasmático, onde irão participar da
biossíntese dos lipídeos de membrana e de reserva (MILLAR; SMITH; KUNST, 2000).
Figura 2.1 - Biossíntese de ácidos graxos em plantas. As principais enzimas da via apresentam-se
circuladas
2.5 Biossíntese e empacotamento de triglicerídeos em plantas
Triglicerídeos, também chamados de triacilgliceróis (TAGs), são os maiores
componentes das sementes oleaginosas (YEN et al., 2008). Essas moléculas constituem-se de
um glicerol esterificado a três ácidos graxos (GARRETT; GRISHAM, 1999). A via de síntese
de triglicerídeo nas plantas é conhecida como via de Kennedy ou glicerol fosfato
(KENNEDY, 1957), a qual é presente em quase todas as células (YEN et al., 2008). A síntese
dos glicerolipídeos é o primeiro passo para a formação dos triglicerídeos, iniciando-se com a
acilação do glicerol 3-fosfato, pela ação da enzima glicerol 3-fosfato aciltransferase (GPAT)
(GIMENO; CAO, 2008 e GONZALEZ-BARÓ; LEWIN; COLEMAN, 2007). A família de
enzimas 1-acilglicerol 3-fosfato aciltransferase (AGPAT), a qual produz o fosfatidato,
convertem ácidos graxo em ácido lisofosfatídico (LPA) (AGARWAL; GARG, 2003). O
fosfatidato é o precursor do diacilglicerol (DAG) e a transferência do grupo acil da acil-CoA
24
para a posição sn-3 do diacilglicerol (DAG) pela enzima diacilglicerol aciltransferase
(DAGAT), finaliza a biossíntese de triglicerídeos (MILLAR; SMITH; KUNST, 2000) (Figura
2.2).
Os lipídeos estocados como TAGs são compartimentalizados em estruturas esféricas,
denominadas de corpos gordurosos. Estes corpos gordurosos medem cerca de 0,5-2,0 µm de
diâmetro e são envoltos por uma monocamada lipídica coberta por uma membrana protéica
(HUANG, 1996; JOLIVET et al., 2004; LIN et al., 2002; NAESTED et al., 2000; TZEN et
al., 1997; TZEN et al., 1993). Cerca de 1-4% do peso dos corpos oleosos das sementes são
compostos por proteínas (HUANG, 1992; TZEN; HUANG, 1992) e as oleosinas são as
maiores representantes destas (TZEN et al., 1990).
Figura 2.2 - Biossíntese e empacotamento de triglicerídeos. A proteína oleosina está circulada
25
2.6 Desenvolvimento e produção de triglicerídeos nas sementes de cacau
No início do desenvolvimento, as sementes do cacaueiro apresentam-se delicadas,
cheia de endosperma líquido e envolvida por uma fina testa. Nos dois primeiros meses, os
óvulos de cor esbranquiçada continuam a se desenvolver, aumentando de tamanho e
enchendo-se de material gelatinoso, o endosperma (LEHRIAN; KEENEY, 1980). Até 85
DAP, os frutos aumentam significativamente seu volume, e aos 90 dias, o embrião torna-se
visível a olho nu. Do início do desenvolvimento até os 120 DAP, ocorre uma discreta
acumulação de lipídeos de membrana, ricos em ácidos graxos insaturados. A partir dos 120
DAP, o embrião de cacaueiro inicia o acúmulo de ácidos graxos e triglicerídeos, os quais são
sintetizados rapidamente. Esse estágio de síntese de triglicerídeos acontece até os 150 DAP.
Nesse espaço de tempo, os embriões trocam sua cor braça-rosada pela cor púrpura. A partir
dos 150 DAP os embriões atingem a maturidade e encerram a síntese de triglicerídeos
(LEHRIAN; KEENEY, 1980 e APPELQVIST, 1975). As sementes nos seus respectivos
estágios de amadurecimento são mostradas na Figura 5.1.
2.7 Plantas acumuladoras de estearato
O perfil de ácidos graxos das sementes das várias espécies revelam o seu potencial
de uso na indústria e no estudo da síntese de lipídios de reserva, além de mecanismos que
regulam a composição de ácidos graxos (CARPENTER et al., 1994). Silva (2000) baseando-
se na composição de ácidos graxos constatou que as espécies de Theobroma e Herrania
podem ser descritas de acordo com a expressão diferenciada de tioesterases, desaturases e
elongases, com potencial de uso em estudos de filogenia e também com uso potencial na
indústria e/ou estudo da síntese de lipídios de reserva, bem como mecanismos que regulam a
composição de ácidos graxos. Gilabert-Escriva (2002), analisaram o perfil lipídico de oito
espécies brasileiras de Theobroma e o gênero Herrania, com o objetivo de avaliar outras
fontes para a obtenção de manteiga de cacau ou um substituto similar. Foi concluído que
apesar de algumas espécies serem potenciais substitutos, nenhuma possui o ponto de fusão
semelhante ao de Theobroma cacao.
26
Os mecanismos moleculares e bioquímicos pelos quais as plantas controlam a
produção de estearato, e que diferenciam as plantas acumuladoras de estearato de todas as
demais não estão claramente definidos. A seletividade da acil-ACP tioesterase em sementes
oleaginosas acumuladoras de estearato sugere a existência de acil-ACP tioesterases com uma
maior atividade sobre estearoil-ACP quando comparada a acil-ACP tioesterase de plantas não
acumuladoras de estearato. A atividade de acil-ACP tioesterase medida em extrato bruto de
sementes de mangostão (Garcinia mangostana) mostrou preferência pelo substrato oleoil-
ACP (18:1-ACP), porém apresentou significante atividade pelo substrato estearoil-ACP
(18:0-ACP) (15% de atividade relativa ao oleoil-ACP), quando comparado com palmitoil-
ACP (16:0-ACP) (6%) ou 14:0-ACP (2%) (HAWKINS; KRIDL, 1998; VOELKER;
KINNEY, 2001). A atividade de acil-ACP tioesterases plastidial isoladas de sementes de
cacau mostrou preferência pelo substrato oleoil-ACP e menor afinidade, porém significante,
pelos substratos estearoil-ACP (34 a 40% de atividade relativa ao oleoil-ACP) e palmitoil-
ACP (7 a 12%) (GRIFFITHS; WALSH; HARWOOD, 1993). Estes resultados diferem da
atividade de tioesterases medidas em extratos brutos de sementes de cártamo (Carthamus
tinctorius) e Brassica, onde 18:1-ACP é o substrato preferido, porém os substratos 16:0-ACP
e 18:0-ACP são usados em taxas iguais (KNUTZON et al., 1992). A atividade desigual de
tioesterases sobre os substratos saturados 16:0-ACP e 18:0-ACP em mangostão e cacau
sugere que sementes que acumulam grandes quantidades de estearato podem conter
tioesterases com atividades distintas daquelas encontradas em plantas não acumuladoras de
estearato, mas não tioesterases específicas (HAWKINS; KRIDL, 1998; VOELKER;
KINNEY, 2001).
Diversas acil-ACP tioesterases têm sido isoladas de várias plantas e uma comparação
de mais de 30 tioesterases vegetais, baseada em diferenças em suas seqüências primárias de
aminoácidos deduzidas e deleções características de aminoácidos nas proximidades de seu
provável sítio ativo, permitem classificá-las em dois tipos: (1) acil-ACP tioesterases Fat A,
tioesterases relativamente específicas para oleoil-ACP (18:1-ACP), porém apresentam uma
menor atividade sobre estearoil-ACP (18:0-ACP) e palmitoil-ACP (16:0-ACP), e (2) acil-
ACP tioesterases Fat B, tioesterases preferencialmente acil-ACP saturado (JONES et al.,
1995; OHLROGGE; JAWORSKI, 1997).
Embora a existência de acil-ACP tioesterases Fat A com elevada atividade, porém
não específica, sobre o substrato estearoil-ACP possa esclarecer a maneira pela qual algumas
plantas acumulam quantidades significativas de estearato em suas sementes, ela não é
suficiente para explicar o acúmulo de estearato em sementes de T. cacao. Griffiths, Walsh e
27
Harwood (1993) avaliando a atividade de acil-ACP tioesterases em dois estágios do
desenvolvimento de sementes de cacau correspondentes à baixa (105 dias após a antese) e alta
produção de estearato (130 dias após a antese), concluíram que não existe a indução de
expressão de uma nova acil-ACP tioesterases com maior seletividade para estearoil-ACP no
acúmulo de estearato na manteiga de cacau, pois não há mudança na seletividade enzimática
com a idade do tecido. Na maioria das plantas, a maior parte do 18:0-ACP produzido sofre
uma insaturação no carbono 9 catalisada pela
Δ 9
-estearoil-ACP desaturase, para formar oleoil-
ACP (VOELKER; KINNEY, 2001). A supressão da atividade de
Δ9
estearoil-ACP desaturase
pode resultar na produção de maiores níveis de estearato (18:0), porém uma atividade normal
ou aumentada dessa enzima deve favorecer a produção de oleato (18:1).
Os níveis de estearoil-ACP desaturase de embriões em desenvolvimento de cacau
entre 95 e 145 dias após a polinização (DAP) foram determinados por Western Blot utilizando
anticorpo de coelho para estearoil- ACP desaturase de abacate (PATEL, 1993). Estearoil-
ACP desaturase de cacau foi detectada em extratos de proteína total solúvel entre 95 e 105
DAP, e apresentou uma concentração 2,3 vezes maior aos 95 DAP quando comparado à
abundância da proteína aos 105 DAP. Não foi detectada a presença de estearoil-ACP
desaturase nos extratos obtidos a partir dos 115 DAP. Entretanto a presença desta enzima nos
extratos brutos após os 115 DAP pode ser inferida a partir da síntese de ácido oleico (18:1) ao
longo de todo período de desenvolvimento do embrião (PATEL, 1993). Durante o período de
maior abundância de estearoil-ACP desaturase, entre 95 e 115 DAP, há um significativo
aumento nos teores de ácido esteárico (18:0) e oleico (18:1), e decréscimo na quantidade de
ácido linoleico (18:2) e palmítico (16:0), portanto a avaliação isolada da atividade estearoil-
ACP desaturase não explica o acúmulo de estearato nas sementes de cacau.
28
2.8 Recursos genômicos para o cacaueiro
Bibliotecas de genes expressos são importantes para o fornecimento de informações
sobre determinado organismo, facilitando o entendimento de funções de genes, permitindo a
execução dos mais diversos experimentos.
Com o objetivo de descobrir e entender possíveis mecanismos naturais de defesa em
Theobroma cacao, Jones et al. (2002) sequenciaram e reuniram cDNAs provenientes de
folhas e sementes, produzindo um único contig com 1380 membros. Verica et al. (2004)
baseando-se na hipótese de que a ativação da defesa das plantas é associada a mudanças na
expressão de um grande número de genes, construíram uma biblioteca subtrativa de cDNA,
através dos estudos em microarranjo, sequenciamento e ferramentas de bioinformática, para
identificar os genes induzidos por moléculas sinalizadoras.
Silva (2005) construiu uma biblioteca de cDNA de sementes em desenvolvimento de
Theobroma cacao. Com o seqüenciamento de 1305 clones, 892 sequências únicas, 164
contigs, totalizando 1056 unigenes, apresentou um índice de novidade de 80,92%. Neste
estudo, foram identificados 71 clones contendo sequências de genes envolvidos na via
metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos, representados por 39 singletons e 29 contigs.
Essas sequências foram depositadas no banco de genes da UNICAMP, disponível em
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/cacau).
Outra biblioteca bastante completa e útil nos estudos de biossíntese de ácidos graxos
em T. cacao, foi a coleção de EST descrita por Argout et al. (2008). Em uma colaboração
internacional, reuniram cinquenta e seis bibliotecas de cDNA de Theobroma cacao,
provenientes de diferentes órgãos, genótipos e condições ambientais. Possuindo um total de
149650 ESTs, correspondentes a 48594 unigenes, 12692 contigs e 35902 singletons, esta
biblioteca mostrou-se adequada para estudos de vias metabólicas bioquímicas. Esta coleção
de ESTs é considerada única, sendo de fundamental importância para estudos em Theobroma
cacao.
29
2.9 Amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR) e genes referência
Métodos eficientes de estudos de expressão gênica têm permitido a análise de grande
número de genes envolvidos nos diversos processos biológicos, desde o desenvolvimento dos
organismos até suas interações com fatores ambientais (DONSON et al., 2002).
Recentemente o método mais utilizado para a avaliação da expressão gênica é amplificação
quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR) devido à rapidez, especificidade e
sensibilidade que essa técnica detecta e quantifica ácidos nucléicos (GACHON; MINGAM;
CHARRIER, 2004). RT-qPCR permite coletar dados da PCR com amplificação e detecção
em tempo real, através da captação da fluorescência proporcionalmente a quantidade de
produtos amplificados (HIGUCHI et al., 1993).
A quantificação por RT-qPCR necessita de uma série de padronizações, ou seja,
normalização de vários parâmetros como quantidade inicial da amostra, integridade e
quantidade de RNA, eficiência enzimática da síntese de cDNA e da amplificação da PCR,
atividade transcricional de tecidos e células analisadas e principalmente o uso de genes
referência (housekeepings) adequados (BUSTIN, 2002; GINZINGER, 2002).
Dois métodos de quantificação da expressão gênica são geralmente usados: absoluta e
relativa. Na quantificação absoluta, o número absoluto de cópias de RNA mensageiro é
determinado por comparação a uma curva padrão determinada (PFAFFL; HAGELEIT, 2001).
A expressão relativa é baseada na taxa de expressão de um gene alvo comparada com um
gene referência. Esse tipo de quantificação pode ser muito eficaz, mas os resultados são
fortemente dependentes do gene referência e dos métodos de normalização usados (PFAFFL,
2001). Segundo Vandersompele et al. (2001), para medir a expressão gênica com acurácia,
devem-se usar múltiplos genes referência, sendo que o mínimo ideal são os três genes
referência mais estáveis. Alguns modelos matemáticos foram desenvolvidos para o cálculo da
expressão relativa, os quais podem ou não usar a correção da eficiência (PFAFFL, 2001;
SOONG et al., 2000 e KENNETH, THOMAS, 2001).
Os genes referência comumente utilizados são principalmente os codificadores de
proteínas responsáveis pela manutenção das estruturas e metabolismo básicos da célula, como
por exemplo, tubulinas (CHOI et al., 1991; SERELS et al., 1998), actinas (CHOI et al., 1991;
WEI et al., 1997) e 18S, 28S rRNA (FINNEGAN et al., 1993; BHATIA et al., 1994). Genes
com essas funções não devem variar sua expressão nos tecidos, células, mudanças no meio
ambiente e sob os diferentes tratamentos em um experimento. Porém, a estabilidade desses
30
genes pode variar consideravelmente e diversos estudos estão sendo desenvolvidos com o
objetivo de escolher o gene mais adequado para cada experimento (VANDESOMPELE et al.,
2002; THELLIN et al., 1999; LØVDAL; LILLO, 2009; PAOLACCI et al., 2008; HONG et
al., 2008; CZECHOWSKI et al., 2005; REMANS et al., 2008; SCHMITTGEN;
ZAKRAJSEK, 2000 e CRUZ et al., 2008).
Alguns métodos estatísticos foram propostos com o objetivo de avaliar candidatos a
gene referência e softwares como GeNorm (VANDESOMPELE et al., 2002) e NormFinder
(ANDERSEN; JENSEN; ORNTOFT, 2004) têm sido usados para esse fim (HONG et al.,
2008; PAOLACCI et al., 2008; VANDESOMPELE et al., 2002).
GeNorm é uma ferramenta aplicada pelo Microsoft Excel que está disponível na
internet. Este programa determina o gene housekeeping mais estável de um conjunto de genes
testados e calcula um fator de normalização que pode ser incorporado na expressão do gene
em cada amostra de tecido. Para todos os genes, é calculada a variação aos pares, analisando a
variação da expressão dois a dois de todas as possíveis combinações gênicas. A estabilidade
do gene é dada por um valor M, o qual é inversamente proporcional a variação de expressão
do gene avaliado (VANDESOMPELE et al., 2002). NormFinder calcula a variação da
expressão intra e intergrupos, onde os grupos são definidos como as diferentes condições do
experimento. O programa também calcula os valores de estabilidade para os genes candidatos
organizando em escala decrescente os mais estáveis (ANDERSEN; JENSEN; ORNTOFT,
2004).
31
3. OBJETIVOS
· Analisar a composição dos ácidos graxos e triglicerídeos em sementes de
cacaueiro em desenvolvimento.
· Investigar a expressão temporal de genes envolvidos na via metabólica de
ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de sementes de T.
cacao, sendo enfatizados os genes já identificados da acil (ACP), β-cetoacil-
ACP sintase II (KAS II), acil-ACP tioesterase tipo A (Fat A), acil-ACP
tioesterase tipo B (Fat B), acil-CoA sintetase (ACS), e oleosinas, além da
Δ 9
-
estearoil-ACP desaturase.
· Investigar e comparar o padrão temporal de expressão dos genes envolvidos
na via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o
desenvolvimento de sementes de Theobroma cacao.
· Identificar dos genes referência mais estáveis para estudos em sementes e
diversos tecidos de Theobroma cacao.
32
4. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Melhoramento de Plantas do Centro de
Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), Piracicaba, SP. Foram estudadas as expressões
dos genes da via metabólica de ácidos graxos em sementes de T. cacao e em outros tecidos
(folhas em expansão, folhas expandidas, flor, caule, raiz, ápice vegetativo e epicarpo).
4.1 Material vegetal
4.1.1 Sementes de T. cacao
Foram realizadas polinizações manuais na estação Experimental de Recursos
Genéticos “José Haroldo” (Marituba, PA) do genótipo PA016. Dois a três frutos de T. cacao
foram coletados aos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 dias após a polinização
(DAP). Após a coleta dos frutos, as sementes foram armazenadas em ultrafreezer a –80
o
C, e
foram transportadas em gelo seco até o Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA)
onde foram processadas para extração de RNA total e caracterização do perfil de ácidos
graxos.
4.1.2 Tecidos de T. cacao
Foram utilizadas plantas de cacau (T. cacao) cultivadas em casa de vegetação, em
substrato de terra vegetal por cerca de cinco meses. Foram coletadas amostras de folhas em
expansão, folhas expandidas, caule, raiz e ápice vegetativo. Amostras de flores e frutos (para
a retirada da casca) foram coletadas na plantação de cacau da Escola Superior de Agricultura
“Luiz de Queiroz”, Piracicaba, SP. As amostras dos tecidos vegetais foram imediatamente
congeladas em nitrogênio líquido e estocadas em ultrafreezer a -80°C para posterior extração
de RNA total.
33
4.2 Identificação de genes associados à via metabólica de biossíntese de ácidos graxos
4.2.1 Busca das sequências
Com base no estudo de Silva (2005), foram realizadas buscas das seqüências dos
principais genes envolvidos na biossíntese de ácidos graxos. Foram buscadas as sequências de
três isoformas da proteína carregadora de acil (ACP A, ACP B e ACP C), β-cetoacil-ACP
sintase II (KAS II), duas isoformas da
Δ9
estearoil-ACP desaturase (SAD A e SAD B), acil-
ACP tioesterase A (Fat A), acil-ACP tioesterase B (Fat B), duas isoformas da isoformas da
acil-CoA sintetase (ACS A e ACS B), e oleosina.
A partir do nome do gene-alvo, as sequências foram obtidas nos bancos de dados do
GeneIndex de T. cacao do TIGR (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-
bin/tgi/gimain.pl?gudb=cocoa), banco de genes da UNICAMP
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/cacau), banco de genes de Arabidopsis (www.arabidopsis.org)
e na coleção de ESTs de cacau descrita por Argout et al. (2008) (Tabela 5.1). Utilizando-se a
ferramenta BlastX da base de dados NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), as
sequências foram confirmadas para os genes de interesse.
4.2.2 Construção dos iniciadores
Com o uso do programa Bioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html) e
ClustalW (http://align.genome.jp/), as sequências referentes a cada gene foram alinhadas e a
região mais conservada foi selecionada para o desenho dos iniciadores. Os primers foram
construídos empregando o programa on-line Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer3/primer3_www.cgi), ajustado com os parâmetros padrões, exceto: o tamanho do
fragmento a ser amplificado, variando de 100 a 300 pb; tamanho do primer entre 19 e 21 pb
(ótimo a 20 pb); temperatura de anelamento entre 59 e 61ºC (ótimo a 60ºC); conteúdo GC%
entre 40 e 60% (ótimo a 50%); fator de auto-complementariedade máxima na região 3´ de
zero. Dentre os pares de iniciadores obtidos para cada gene de interesse, selecionou-se aquele
com melhores características segundo o programa on-line NetPrimer
34
(http://www.premierbiosoft.com/netprimer), em relação à estabilidade e eventual ocorrência
de pareamento indesejável; como a formação de alças (hairpins), dímeros do mesmo iniciador
(primer dimers) e entre o par de iniciadores (cross dimers).
4.3 Extração de RNA
Todo procedimento de extração de RNA foi realizado na bancada livre de
ribonucleases, usando-se luvas de látex descartáveis, com utensílios exclusivos de
manipulação de RNA. Pistilos, cadinhos e espátulas foram lavados com solução 0,01% SDS
(p/v), e enxaguados com água, água destilada e água ultrapura (milli-Q). O material foi
incubado com água tratada com 0,01% dietilpirocarbonato (DEPC) ativo por duas horas na
capela e secos, antes de serem embalados com papel alumínio, autoclavados a 120°C por 20
min e secos na estufa (80°C). Todas as soluções utilizadas na extração de RNA foram
preparadas com água 0,01% DEPC inativa (autoclavada) e autoclavadas novamente.
4.3.1 Extração de RNA de sementes de T. cacao
Extração de RNA
O RNA total de sementes de T. cacao foram extraídos de acordo com o protocolo
proposto por Verica et al. (2004) com algumas modificações, conforme descrito acima.
Lavagem e purificação do RNA
Usando-se o kit RNAeasy (Quiagen; Hilden; Alemanha), foi adicionado 500 mL de
tampão RLT com 250 mL de etanol (95-100%) gelado e agitou-se imediatamente com a pipeta
35
para a lavagem do RNA. A solução foi transferida para um tubo de coluna e centrifugada a
8000 g a 4°C por 15 s descartando-se o líquido. Cerca de 700 mL de tampão RW1 foram
adicionados e centrifugados a 8000 g, 4°C por 15 s. A coluna foi colocada em um novo tubo,
adicionou-se 500 mL de tampão RPE e centrifugou-se a 8000 g a 4°C por 15 s. Adicionou-se
500 mL de tampão RPE e centrifugou-se a 8000 g a 4°C por 2 min. A coluna foi transferida
para outro tubo de 1,5 mL e 30 mL de água ultrapura (milli-Q) DEPC autoclavada foram
adicionados. Centrifugou-se a 8000 g a 4°C por 1 min e o RNA recuperado foi armazenado
ultrafreezer a -80°C.
4.3.2 Extração de RNA de diversos tecidos de T. cacao
Extração de RNA
O RNA total dos tecidos de folhas em expansão, folhas expandidas, caule, raiz, ápice
vegetativo, flor e casca do fruto de T. cacao foi extraído baseando-se no protocolo proposto
por Verica et al. (2004). Foram estabelecidas algumas modificações do processo de extração
após alguns testes usando-se o Mini Kit RNeasy (Quiagen). A extração de RNA iniciou-se a
partir de 100 mg de tecido de embrião de sementes de T. cacao, macerado em nitrogênio
líquido e transferido para um tubo de centrífuga, onde adicionou-se 1 mL de tampão de
extração [2 % CTAB (m/v); 2% PVP (m/v); 100 mM Tris pH 8,0; 25 mM EDTA; 2 M NaCl;
2% β-mercaptoetanol (v/v) e 0,5 g L
-1
Espermidina (m/v)]. Após a homogeneização, as
amostras foram colocadas em banho seco a 65°C por 30 min. Adicionou-se 1 mL de
clorofórmio, seguindo-se de homogeneização e centrifugação a 8000 g por 20 min a 4
o
C.
Aproximadamente 650 mL de sobrenadante foram coletados e transferidos para um novo tubo
de 1,5 mL e o RNA total foi precipitado com 540 mL de solução de Cloreto de Lítio (8 M) por
12 h a 4
o
C. Após a centrifugação a 8000 g por 30 min a 4
o
C, o RNA total decantado foi
purificado seguindo as especificações do kit RNAeasy (Quiagen; Hilden; Germany).
36
Lavagem e purificação do RNA
Após a centrifugação a 8000 g por 30 min a 4
o
C, o RNA total decantado foi
ressuspendido seguindo as especificações do Mini Kit Invisorb Spin Plant RNA (Invitek). O
sobrenadante foi descartado e adicionou-se 900 mL de tampão DCT adicionado de 9 mL de
DTT 1/100 (v/v). A solução foi mantida por cerca de 30 min a temperatura ambiente,
mexendo sempre e centrifugando no final com velocidade máxima por 1 min. O sobrenadante
foi transferido para o pré-filtro e centrifugado a 9300 g por 1 min a temperatura ambiente. O
pré-filtro foi descartado e adicionou-se 500 mL de etanol absoluto misturado por pipetagem. A
solução foi transferida para o tubo de coluna RTA Spin filter, incubada por 1 min,
centrifugada a 9300 g por 1 min a temperatura ambiente e o líquido da parte de baixo foi
descartado. Adicionou-se 500 mL de Wash Buffer R1, centrifugou-se a 9300 g a temperatura
ambiente, por 30 s e descartando-se o sobrenadante. Foram adicionados 700 mL de Wash
Buffer R2 e centrifugou-se a 9300 g a temperatura ambiente, por 30 s. Novamente 700 mL de
Wash Buffer R2 foram adicionados e centrifugou-se a 13400 g a temperatura ambiente, por 3
min. O filtro foi transferido para outro tubo de 1,5 mL e adicionou-se 30 mL de Tampão de
Eluição R. Após a centrifugação de 9300 g por 2 min a temperatura ambiente, o RNA total foi
armazenado em ultrafreezer a -80°C.
4.4 Quantificação e análise da integridade do RNA total
Para conferir a integridade e a concentração do RNA, as amostras foram submetidas à
eletroforese em gel 1,2% agarose com tampão SB (10 mM NaOH pH 8,5; ajustado com ácido
bórico) (BRODY; KERN, 2004) a 3 V cm
-1
. Utilizando-se uma alíquota de 3 mL do RNA
total coloridos com 7 mL de tampão da amostra [50% de formamida; 1X MOPS (20 mM
MOPS, pH 7,0; 50 mM acetato de sódio; 1 mM EDTA); 17,5% formaldeído; 0,4 mg mL-1
brometo de etídeo, e 10X loading buffer (0,25% azul bromofenol; 0,25 % xileno cianol; 0,1
mM EDTA, pH 8; 50% glicerol)] as amostras foram aquecidas a 65°C por 10 min e colocadas
no gelo imediatamente para a eliminação do efeito da estrutura secundária.
Para determinação da concentração e pureza do RNA total extraído, uma alíquota de 3
37
mL de RNA foi diluída em 600 mL de água ultrapura (milli-Q), a qual foi submetida à leitura
óptica no espectofotômetro Ultrospec 1100 pro (Amersham Biosciences) em 260 nm.
4.5 Tratamento com DNAse
Para digerir ácido desoxirribonucléico contaminante (DNA), 1 µg do RNA total foi
tratado com a enzima DNAse I (Fermentas Life Sciences). A enzima foi utilizada na
concentração de 1 Unidade/microlitro (U/mL) com 1 U de RNAse out, tampão apropriado e
água ultrapura (milli-Q) DEPC autoclavada para volume final de 10 mL. A reação foi
incubada no termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) a 37°C por 30
min. Para que ocorresse a inativação da enzima, adicionou-se 1 mL de 25 mM EDTA,
incubando a 65°C por 10 min, sendo colocado no gelo imediatamente.
4.6 Síntese de cDNA
O RNA tratado com DNAse foi preparado para a síntese acrescentando-se 1mL de 50
mM primer poli-T (oligo-dT 18 pb), incubado por 5 min à 70ºC resfriado a 4°C por 5 min.
Para a transcrição reversa, adicionou-se 3 mM de MgCl
2
; 5 mM de dNTPs ; 2 U de RNAse out
(Invitrogen); 1 U da enzima Improm-II Reverse Transcriptase (Invitrogen) e tampão
apropriado. A reação de transcrição reversa foi realizada no termociclador GeneAmp PCR
System 9700 e o programa utilizado foi de 25ºC por 5 min, 42ºC por 60 min e 70ºC por 15
min. Após sintetizados, os cDNAs foram armazenados a -20ºC.
4.7 Confirmação da eficiência da síntese de cDNA
Realizou-se uma reação de RT-PCR para a confirmação da eficiência da síntese do
cDNA recém sintetizado, utilizando-se o iniciador do gene da Actina, com eficiência e
38
especificidade previamente testadas. A reação seguiu os seguintes parâmetros: 1 mL de cDNA
na diluição 1:10 (v/v), 0,2 mM de DNTPs, 5 mM de cada iniciador da Actina (Forward e
Reverse), 2 mM de MgCl
2
, 1 U da enzima Taq polimerase, 10x Taq buffer com (NH
4
)
2
SO
4
(750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200mM (NH
4
)
2
SO
4
) – (Fermentas) e água ultrapura (Mili-Q)
estéril, totalizando 25 mL de reação. Os produto amplificados foram visualizados em gel 1,5%
agarose, tampão SB e eletroforese a 3 V cm
-1
. Para certificação do tamanho do fragmento
utilizou-se marcador de peso molecular GeneRule 100 pb DNA Ladder (Fermentas).
4.8 Clonagem e seqüenciamento
A identidade dos fragmentos gerados pelos iniciadores construídos foi assegurada
por clonagem e sequenciamento. Uma reação de amplificação foi conduzida (nos padrões da
descrita para a confirmação da eficiência da síntese de cDNA), e a ligação dos fragmentos
amplificados foi realizada em vetores de clonagem pGEM-T Easy PCR Product Cloning Kit
(Promega) seguindo as especificações do fabricante. A ligação foi mantida a 8°C por 17 h e
após esse período, 2 mL da ligação foram transferidos para um tubo contendo 40 mL de células
eletrocompetentes de E. coli, linhagem DH10B. Para a eletroporação, utilizou-se um
eletroporador modelo micropulser – (BioRad) e em cubetas de 0,2 mm aplicou-se um pulso
de corrente elétrica de 1,8 KV por 3,4 s. Rapidamente as células foram transferidas para um
tubo contendo 1 mL de meio líquido SOC (20 g L
-1
bacto triptona, 5 g L
-1
extrato de levedura
e 0,5 g L
-1
NaCl, 250 mM de KCl pH 7,0 e 2 M MgCl
2
) e mantidas a 37°C por 1 h em
agitação. O material foi centrifugado por 5 min a 2000 g sedimentando as bactérias. O
sobrenadante foi então descartado e cerca de 100 mL restantes foram ressuspendidos e
plaqueados em meio LB sólido (Luria-Bertani, composto de 10 g L
-1
triptona, 10 g L
-1
NaCl e
5 g L
-1
extrato de levedura e 15 g L
-1
de Bactoagar) contendo 100 mg mL
-1
de ampicilina;
adicionado de 100 mM IPTG (Isopropil ß-D-galactopirqanosideo). As placas foram mantidas
a 37°C por 17 h para o crescimento das colônias com o fragmento de interesse. As colônias
brancas foram selecionadas e crescidas em 5 mL de meio líquido LB com 100 mg mL
-1
de
ampicilina, sendo mantidas em agitação constante a 37°C por 17 h. Após esse período de
incubação, 500 mL do volume foram estocados em 50% glicerol a -80°C e o restante foi
utilizado na minipreparação.
39
4.9 Minipreparação do DNA plasmidial
O protocolo utilizado para o isolamento e purificação de DNA do plasmídeo, usou
como base a lise alcalina, proposto originalmente por Birboim e Doly (1979). Cerca de 1,5
mL foi centrifugado por 1 min a 12000 g a 20°C. O sobrenadante foi descartado e esse
procedimento foi realizado mais uma vez para aumentar o rendimento da minipreparação.
Ressuspendeu-se o pellet em 200 mL da Solução I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0,
10 mM Na
2
.
EDTA, autoclavada por 20 min a 120°C), permanecendo por 10 min à
temperatura ambiente. Adicionou-se 200 mL da Solução II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS),
misturou-se por inversão e incubou-se no gelo por 5 min. Foram adicionados 150 mL da
Solução III (3 M KOAc, pH 5,5), misturados por inversão e incubados no gelo por 5 min.
Centrifugou-se por 10 min e o sobrenadante que continha o DNA plasmidial foi transferido
para outro tubo. Adicionou-se 500 mL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), e
centrifugou-se por 5 min. A fase superior foi coletada e transferida para um tubo de
microcentrífuga novo. Adicionou-se 500 mL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), agitou-
se com o vórtex e centrifugou-se por 1 min. A fase aquosa superior foi coletada e transferida
para outro tubo. Foram adicionados 1 mL de etanol absoluto (100%), misturados por inversão,
e incubados a -20
◦
C por meia hora. O DNA foi centrifugado por 5 min e o etanol foi
descartado, sendo adicionados 500 mL de 70% etanol. Agitou-se no vórtex seguindo de
centrifugação a 12000 g por 5 min, sendo o etanol descartado e o pellet seco. O DNA foi
ressuspendido em 50 mL de 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM Na
2
.
EDTA (TE), contendo 50 mg/mL
RNAse A.
4.10 Sequenciamento dos fragmentos
As reações de seqüenciamento foram realizadas no termociclador GeneAmp PCR
System 9700 em reações de 10 mL contendo 100 ng de DNA plasmidial; 3 mL de 2,5X tampão
Save Money (200 mM Tris-HCl, pH 9.0; 5 mM MgCl
2
.6H
2
O); 1 mL do kit DYEnamic
TM
ET
Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences); 0,25 mM do iniciador universal T7; e
40
água ultrapura (Milli-Q) estéril. A reação de seqüenciamento foi realizada com 30 ciclos de
20 s a 95ºC; 15 s a 50ºC; 1 min a 60ºC, finalizados com 10 min a 4ºC. Os produtos
amplificados foram precipitados com 60 mL de 100% etanol e 2 mL de 3 M acetato de sódio,
centrifugados por 45 min em 8000 g a 4
o
C, seguido por lavagem com 150 mL de 70% etanol,
centrifugado novamente por 15 min e a secagem do pellet foi realizada a 37ºC por 1 h. O
precipitado foi então ressuspenso em tampão de seqüenciamento (80% (v/v) formamida
deionizada; 20% loading buffer), para carregamento em gel de poliacrilamida para análise em
seqüenciador automático ABI-3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA.
EUA).
Os cromatogramas gerados foram examinados para a presença de vetor com a
ferramenta Vecscreen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html), e as
sequências resultantes foram submetidas à busca por similaridade no GenBank através de
BlastN e BlastX (MCGINNIS; MADDEN, 2004) para confirmação da sequência obtida.
4.11 Extração de DNA genômico
A extração do DNA genômico teve como base o protocolo descrito por Doyle e Doyle
et al. (1990), adaptado por Sereno et al. (2005). Utilizou-se cerca de 150 mg de tecido foliar
macerados em nitrogênio líquido e cerca de 1 mL de tampão de extração [2% CTAB (m/v);
1,4 M NaCl; 20 mM EDTA pH 8,0; 1% PVP (m/v); 100 mM Tris–HCl pH 8,0; 0.2% β-
mercaptoetanol (v/v) e 0.1 mg mL
-1
de proteinase K] incubados a 55
o
C por 60 min.
Adicionou-se 1 mL de clorofómio:álcool isoamílico (24:1 v/v) e centrifugou-se por 30 min a
8000 g. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado (repetindo esta etapa mais uma vez),
e para que ocorresse a precipitação do DNA, adicionou-se o mesmo volume de isopropanol
gelado; centrifugando-se por 5 min a 8000 g. O DNA foi lavado com 1 mL de 70% etanol e
depois de seco, o pellet foi resuspenso em 30 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1
mM EDTA) contendo 10 mg/mL de ribonuclease a 37
o
C por 30 min. O DNA foi quantificado
no fluorômetro DyNA Quant 2000 fluorometer (Amersham Biosciences, Buckinghamshire,
Reino Unido).
41
4.12 Amplificação dos cDNAs e DNA genômico
Para observar a presença de íntron nas seqüências genômicas de T. cacao, procedeu-
se duas reações de amplificação, uma com cDNA e outra com DNA genômico no
termociclador GeneAmp PCR System 9700. A primeira reação foi montada dentro dos
seguintes parâmentros: 1 mL de cDNA diluído em 1:10 (v/v), 0,2 mM de dNTPs, 5 mM de
cada iniciador (Forward e Reverse), 2 mM de MgCl
2
, 1 U da enzima Taq polimerase, 10x Taq
buffer com (NH
4
)
2
SO
4
(750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200mM (NH
4
)
2
SO
4
) – (Fermentas) e água
ultrapura (Mili-Q) estéril, totalizando 25 mL de reação. A segunda reação foi realizada nos
mesmos padrões, mas com 5 ng/mL de DNA genômico ao invés do cDNA. O programa
iniciou com uma desnaturação a 95°C por 2 min, seguidos por 40 ciclos de 95°C a 30 s, 60°C
a 30 s, 72°C a 20 s terminando com extensão de 72°C a 5 min. A reação foi colorida com 2
mL SYBR-gold visualizados em gel 1,5% agarose, tampão SB e eletroforese a 3 V cm
-1
. Para
certificação do tamanho do fragmento utilizou-se marcador de peso molecular GeneRule 100
pb DNA Ladder (Fermentas).
4.13 Amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR)
As análises de amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR) foram
realizadas em termociclador centrífugo RotorGene 3000 (Corbett Research, Austrália), a
partir de diluições do cDNA total derivado da transcrição reversa (RT) das amostras de RNA.
As reações de amplificação foram realizadas no volume final de 10 mL utilizando-se 1mL de
cDNA na diluição 1:10 (v/v); 5 µM dos iniciadores gene-específicos; 5mL de Platinum SYBR-
green qPCR SuperMix-UDG 2X (Invitrogen). As amplificações foram conduzidas em
incubações iniciais de 50ºC por 2 min, 95ºC por 2 min e seguidas de 40 ciclos de 95ºC por 15
s, 60ºC por 15 s e 72 ºC por 20 s, com detecção do sinal da fluorescência ao final de cada
etapa de extensão. Após o término dos ciclos de reações, foram determinadas as curvas de
dissociação de cada produto amplificado entre 72ºC e 95ºC (curva de melting). Foram
realizadas três repetições de cada amplificação, todos os experimentos incluíram controle
negativo (água, sem DNA molde), e a eficiência de amplificação de cada par de iniciadores
42
foi determinada pela curva de eficiência com três diluições seriais do pool de cDNA das
amostras de embrião de sementes, utilizados nas diluições 1:10; 1:100 e 1:100 ou 1:10; 1:20 e
1:40 (v/v).
A análise da curva de eficiência da diluição serial do pool de cDNA das amostras,
além de determinar a eficiência dos primers, também serviu como referencial para se
estabelecer o threshold. O coeficiente R
2
resultante foi considerado ideal com valores acima
de 0,98; o valor de M (inclinação da reta) entre -3 e -4 foi considerado aceitável, sendo seu
ótimo em torno de 3,6. A eficiência ideal deve ter valor igual a 1, o que corresponde a uma
eficiência de amplificação = 2 (dobrando a cada ciclo), ou seja, 100%, no entanto, foi
considerado satisfatório valores entre 82 e 100%. A aquisição dos dados em tempo real foi
efetuada com o programa RotorGene Real-Time Analysis 6.0 (Corbett Research, Austrália).
Delineamento do experimento
Foram realizados dois ensaios para o estudo da expressão gênica. No primeiro ensaio,
a expressão gênica foi avaliada em triplicatas das 11 amostras de sementes de cacau nos
diferentes estágios de maturação para cada um dos 12 pares de genes alvo e sete pares de
possíveis genes referência. Essas sementes foram designadas como: 60 DAP (60), 70 DAP
(70), 80 DAP (80), 90 DAP (90), 100 DAP (100), 110 DAP (110), 120 DAP (120), 130 DAP
(130), 140 DAP (140), 150 DAP (150) e 160 DAP (160). No segundo ensaio, a expressão
gênica foi avaliada em triplicatas de cada amostra dos tecidos estudados, apresentados da
seguinte maneira: folhas em expansão (FE), folhas expandidas (FX), flor (F), caule (C), raiz
(R), ápice vegetativo (A) e epicarpo (E). O experimento também foi repetido para os 12 pares
de genes alvo e sete pares de possíveis genes referência. Ambos os ensaios contaram com
uma repetição biológica.
43
4.14 Seleção dos genes referência
Com base na literatura, foram selecionados sete genes referência potencialmente ideais
para a normalização da expressão gênica. Os genes estudados foram os codificadores das
proteínas gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteína ribossomal L35 (RPL35),
actina (ACT), beta tubulina 5 (TUB5), malato desidrogenase (MDH), fator de elongação 1-
alfa (EF1α) e poliubiquitina (PUB). Os genes codificadores das proteínas carregadoras de acil
A (ACP A), proteínas carregadoras de acil B (ACP B) e proteínas carregadoras de acil C
(ACP C), também foram analisados como possíveis genes referência. A estabilidade da
expressão de cada gene foi calculada pelos softwares GeNorm (versão 3.5)
(http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) e NormFinder (versão 0.953)
(http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm). O Programa GeNorm calculou a média da
estabilidade da expressão fornecendo um valor (M) e a variação na estabilidade dos melhores
pares de genes (V), permitindo a exclusão gradual dos genes menos adequados, ou seja, com
menor valor (M). O software NormFinder identificou o melhor gene referência e fez um
ranking com o valor da estabilidade. Utilizando-se o programa Relative Expression Software
Tool -REST 2005, (versão 1.9.12), (PFAFFL et al., 2006), os genes alvo foram normalizados
a partir dos 3 melhores genes referência e a expressão e regulação gênica up e down foi
calculada.
4.15 Extração e metilação de ácidos graxos
A quantidade de material utilizada no processo de extração foi determinada por testes
prévios, estipulando-se cerca de 100-600 mg de sementes de cacau, que foram liofilizadas e
maceradas em nitrogênio líquido. O material macerado foi transferido para um tubo de
extração de 10 x 1,4 cm e foram adicionados 2 mL de uma solução de Metanol e Cloreto de
Acetila (20:1 v/v). Adicionou-se 1 mL de hexano absoluto e os frascos foram fechados e
incubados em banho-maria a 90ºC por 10 min. Após voltarem a temperatura ambiente,
adicionou-se 2 mL de água destilada e centrifugou-se a 3300 g. Com o uso de uma pipeta
Pasteur, transferiu-se cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de cromatografia e este
foi armazenado a 20ºC até a análise.
44
4.16 Análise por Cromatografia Gasosa
As amostras metiladas foram analisadas em cromatógrafo a gás modelo Focus CG-
Finnigan, com detector de ionização de chama, coluna capilar CP-Sil 88 (Varian), com 100 m
de comprimento por 0,25 mm de diâmetro interno e 0,20 mm de espessura do filme. Foi
utilizado hidrogênio como gás de arraste, numa vazão de 1,8 mL/min O programa de
temperatura do forno inicial foi de 70ºC, com tempo de espera de 4 min, seguido de rampa a
175ºC (13ºC/min) com tempo de espera de 27 min, 215ºC (4ºC/min) tempo de espera 9 min e
em seguida aumentando 7ºC/min até 230ºC, permanecendo por 5 min, num total de 65 min. A
temperatura do vaporizador foi de 250ºC e a do detector foi de 300ºC. Uma alíquota de 1 µL
do extrato esterificado foi injetada no cromatógrafo e a identificação dos ácidos graxos foi
feita pela comparação dos tempos de retenção e as percentagens dos ácidos graxos foram
obtidas através do software – Chromquest 4.1 (Thermo Electron, Itália).
Os ácidos graxos foram identificados por comparação dos tempos de retenção dos
ésteres metílicos das amostras com padrões de ácidos graxos de manteiga. Os padrões
utilizados foram BCR-CRM 164, Anhydrous Milk-Fat Producer: BCR Institute for Reference
Materials and Measurements e Supelco TM Component FAME Mix, cat 18919 Supelco,
Bellefonte, PA, EUA. Os ácidos graxos foram quantificados por normalização das áreas dos
ésteres metílicos e os resultados foram expressos em percentual de área (%).
45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Identificação de genes associados à via metabólica de biossíntese de ácidos graxos do
cacaueiro
As sequências utilizadas para o estudo dos genes associados à biossíntese de ácidos graxos em
Theobroma cacao foram obtidas nos bancos de dados Gene Index de T. cacao DFCI
(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/), num banco de genes da UNICAMP
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/cacau), no qual estão depositadas as sequências descritas por
Silva (2005); no banco de genes de Arabidopsis (www.arabidopsis.org) e na coleção de ESTs
de cacau descrita por Argout et al. (2008). A escolha dos genes estudados foi realizada com
base em funções fundamentais exercidas na biossíntese de ácidos graxos, e principalmente de
ácidos esteárico. Os genes buscados foram: três isoformas da proteína carregadora de acil
(ACP A, ACP B e ACP C), β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II), duas isoformas da
Δ9
estearoil-
ACP desaturase (SAD A e SAD B), Acil-ACP tioesterase A (Fat A), Acil-ACP tioesterase B
(Fat B), duas isoformas da acil-CoA sintetase (ACS A e ACS B) e a proteína oleosina
(OLEO). Para todos os genes foram identificadas as seqüências correspondentes. A Tabela 5.1
descreve os genes com suas respectivas siglas, os Reads ou Contigs, possíveis genes e o e-
value estudados. O prefixo BIEM se refere às sequências gênicas buscadas no banco de genes
da UNICAMP, e o prefixo KZO corresponde as sequências de ESTs da coleção de Argout et
al. (2008).
Primeiramente, foram obtidas as sequências da proteína carregadora de acil A (ACP
A), β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II), Acil-ACP tioesterase B (Fat B) e oleosina (OLEO)
por meio de busca com palavras-chaves no banco de genes da UNICAMP. Utilizando-se a
ferramenta Blastx foram confirmadas a identidade destas sequências. Com o uso das palavras-
chave, as demais sequências (proteína carregadora de acil B e C,
Δ 9
estearoil-ACP desaturase
A e B, Acil-ACP tioesterase A, Acil-ACP tioesterase B e acil-CoA sintetase A e B) foram
buscadas no banco de genes de Arabidopsis, e utilizando-se a ferramenta Blast buscou-se as
seqüências com e-value mais próximos aos os genes da coleção de ESTs de cacau obtidas por
Argout et al. (2008).
A proteína carregadora de acil é um co-fator indispensável em diversas vias
metabólicas primárias e secundárias, incluindo aquelas que sintetizam ácidos graxos,
46
fosfolipídeos, co-fatores metabólicos e moléculas sinalizadoras (BYERS; GONG, 2007).
Todas as plantas possuem isoformas de proteínas carregadoras de acil (BATTEY;
OHLROGGE, 1990), e apesar de estarem bem caracterizadas, pouco se sabe sobre a
necessidade e função das diversas isoformas no metabolismo de lipídeos. Interações tecido-
específicas (OHLROGGE; KUO, 1985 e HLOUSEK-RADOJCIC; POST-
BEITTENMILLER; OHLROGGE, 1992), ou organela-específica (SHINTANI;
OHLROGGE, 1994) são algumas explicações para estas isoformas.
As enzimas β-cetoacil-ACP sintases são responsáveis pela ligação dois a dois dos
átomos de carbono nos grupos acil derivados da acil-Coa ou da acil-ACP. Estas enzimas
diferenciam-se, entre outras coisas, pela especificidade de ação no comprimento da cadeia de
carbono. No presente estudo, o gene codificador da β-cetoacil-ACP sintase II foi selecionado,
pois esta enzima age alongando o substrato ACP-16:0 até ACP-18:0. 16:0-ACP representa o
primeiro maior ponto de ramificação na biossíntese de ácidos graxos, o qual também é
substrato da acil-ACP tioesterase B, podendo ser também da
Δ9
estearoil-ACP desaturase
(CAHOON, 2000).
As enzimas estearoil-ACP desaturases são responsáveis pela incorporação de duplas
ligações entre os átomos de carbonos (SHANKLIN; SOMERVILLE, 1991), sendo
codificadas por uma família de genes. Em Thumbergia alata, no mínimo três genes codificam
esta enzima (CAHOON, et al., 1994); em Arabidopsis e arroz, no mínimo quatro genes foram
identificados (MEKHEDOV; ILÁRDUYA; OHLROGGE, 2000); enquanto que em soja, dois
genes da
Δ9
estearoil-ACP desaturase foram relatados (BYFIELD; XUE; UPCHURCH, 2006;
BYFIELD; UPCHURCH, 2007). As tioesterases são enzimas classificadas em duas famílias
gerais, chamadas de acil-ACP tioesterase A e acil-ACP tioesterase B, que diferem pelo
substrato em que atuam (JONES et al., 1995). Acil-ACP tioesterase A tem preferência por
ACP-18:1, e as acil-ACP tioesterase B hidrolisam primeiramente substratos saturados, que
possuem de 16 a 18 carbonos (VOELKER,1996; GINALSKI; RYCHLEWSKI, 2003 e
JONES et al., 1995).
Os organismos eucarióticos apresentam inúmeras isoformas da enzima acil-CoA
sintetase, que participam no transporte de ácidos graxos livres.
A oleosina foi selecionada para este estudo, pois os triglicerídeos recém sintetizados
são armazenados em corpos gordurosos envoltos por proteínas, e as maiores representantes
destas são as oleosinas (HUANG, 1992, TZEN; HUANG, 1992 e TZEN et al., 1990).
Guilloteau et al. (2003) identificou duas isoformas da oleosina em cacaueiro (T. cacao),
47
denominadas TCOleo 15.8 e TCOleo 16.9; mas apenas a expressão de uma da isoforma
TCOleo 15.8 foi incluída neste trabalho.
48
Tabela 5.1 – Lista das sequências de genes associados à biossíntese de ácidos graxos obtidas nos bancos de dados, descrevendo os genes presumíveis,
identificação dos reads ou Contigs, anotação presumível, e o seu respectivo e-value
Gene Read /Contig Anotação presumível do melhor hit e-value
ACP A
BIEM-NT-001-018-D02-CE.F gb|AAB96840.1| acyl carrier protein precursor [Arabidopsis
thaliana]
1x10
-44
KZ0AAP9YN21FM1| gb|AAC27464.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 8x10
-46
KZ0ABA1YN08| gb|AAC27464.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 9x10
-46
ACP B
KZ0AAQ4YG22FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 1x10
-32
KZ0AAV7YM01FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 6x10
-14
KZ0ACAA10YN10FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 2x10
-20
KZ0ACAA9YN13FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 2x10
-15
KZ0AAP10YF21FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 6x10
-33
KZ0ABB16YJ11FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 5x10
-30
KZ0AAP6YA04FM1 emb|CAB63798.1| acyl carrier protein [Arabidopsis thaliana] 7x10
-09
ACP C
KZ0AAV7YJ06FM1 gb|AAM62469.1| acyl carrier protein, putative [Arabidopsis
thaliana]
4x10
-46
KZ0AAT4YN04FM1 gb|AAM62469.1| acyl carrier protein, putative [Arabidopsis
thaliana]
5x10
-46
KZ0AAV10YP23FM1 gb|AAM62469.1| acyl carrier protein, putative [Arabidopsis
thaliana]
2x10
-41
KZ0AAT5YN04FM1 gb|AAM62469.1| acyl carrier protein, putative [Arabidopsis
thaliana]
1x10
-45
Continua
48
49
Gene Read /Contig
Anotação presumível do melhor hit
e-value
KZ0ACAK2YA09FM1 gb|AAM62469.1| acyl carrier protein, putative [Arabidopsis thaliana] 1x10
-44
KAS II
BIEM-NT-001-014-C06-CE.F gb|AAA33873.1| chloroplast beta-ketoacyl-ACP synthase precursor
[Ricinus communis]
3x10
-67
SAD A
KZ0AAS8YE23FM1 gb|AAY86086.1| stearoyl-ACP desaturase [Jatropha curcas] 3x10
-111
KZ0ABE2YI15FM2 gb|AAY86086.1| stearoyl-ACP desaturase [Jatropha curcas] 2x10
-80
SAD B
KZ0AAV9YN21FM1 gb|AAY86086.1| stearoyl-ACP desaturase [Jatropha curcas] 1x10
-119
KZ0ABE2YI15FM2 gb|AAY86086.1| stearoyl-ACP desaturase [Jatropha curcas] 2x10
-80
Fat B
BIEM-NT-001-001-C01-CE.F gb|AAF02215.1|AF076535_1 palmitoyl-acyl carrier protein thioesterase
[Gossypium hirsutum]
4x10
-15
Fat A
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F
gb|AAC49002.1| Br FatA1
2x10
-93
KZ0AAQ8YO09FM1| gb|ABX82799.1| acyl-ACP thioesterase [Jatropha curcas] 1x10
-52
KZ0AAS7YC06FM1| gb|ABX82799.1| acyl-ACP thioesterase [Jatropha curcas] 4x10
-72
KZ0ABA10YN04FM1| gb|ABX82799.1|acyl-ACP thioesterase [Jatropha curcas] 6x10
-54
KZ0ABA10YG11FM1| gb|ABX82799.1| acyl-ACP thioesterase [Jatropha curcas] 6x10
-25
ACS A
KZ0AAT10YC21FM1| gb|AAO22689.1| putative acyl-CoA synthetase [Arabidopsis thaliana] 5x10
-100
KZ0ACAA9YA14FM1 gb|AAO22689.1| putative acyl-CoA synthetase [Arabidopsis thaliana] 3x10
-93
KZ0AAT4YP17FM1 gb|AAO22689.1| putative acyl-CoA synthetase [Arabidopsis thaliana] 8x10
-79
Continuação
49
50
Gene Read /Contig Anotação presumível do melhor hit e-value
ACS B
KZ0AAQ6YG15FM1 dbj|BAB40450.1| long-chain acyl-CoA synthetase [Arabidopsis
thaliana]
2x10
-27
KZ0AAS1YJ07RM1 dbj|BAB40450.1| long-chain acyl-CoA synthetase [Arabidopsis
thaliana]
5x10
-28
KZ0AAP8YI16FM1 dbj|BAB40450.1| long-chain acyl-CoA synthetase [Arabidopsis
thaliana]
1x10
-12
OLEO
BIEM-NT-001-008-E03-CE.F gb|AAO65960.1| oleosin [Corylus avellana] 2x10
-29
Conclusão
50
51
5.2 Construção dos iniciadores
As sequências obtidas no banco de genes de cacaueiro da UNICAMP, correspondentes
aos genes codificadores da proteína carregadora de acil A, β-cetoacil-ACP sintase II, acil-
ACP tioesterase tipo B e oleosina foram usadas como molde para o desenho dos iniciadores
específicos (Apêndice A). Para a construção dos iniciadores da acil-ACP tioesterase tipo A,
foram alinhadas a sequência obtida no banco de genes da UNICAMP e quatro sequências
buscadas no banco de genes de cacau de Argout et al. (2008) (Apêndice B). Para os genes da
proteína carregadora de acil B, proteína carregadora de acil C,
Δ9
estearoil-ACP desaturase A,
Δ9
estearoil-ACP desaturase B, acil-CoA sintetase A e acil-CoA sintetase B (ACS B), realizou-
se o alinhamento das sequências obtidas na coleção de ESTs descrita por Argout et al. (2008).
As regiões entre os reads onde apresentavam maior identidade foram usadas para o desenho
dos iniciadores. Os iniciadores estão apresentados na Tabela 5.2, juntamente a sigla do gene
correspondente, identificação da sequência molde empregada, tamanho do amplicon, e
detecção da presença de íntron identificada por amplificação em DNA genômico.
52
Tabela 5.2 - Iniciadores desenhados para os genes da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos
de Theobroma cacao, apontados junto suas respectivas siglas, identificação da sequência de origem,
tamanho do amplicon e presença ou ausência de íntrons. As sequencias consensuais encontram-se
descritas no Apêndice B
Gene Seqüências Acesso
Amplicon
(PB)
Íntron
ACP A AAAGCTTCCCCAAAGTCGAT
ATTCAACGAGACACCCTTGC
BIEM-NT-001-018-D02-CE.F 236 sim
ACP B GCAGACAAGATCAGCACAA
AAATCAAAGGGCACGACT
consensual
195
ACP C TCTTCCCCACACTCTTTTCG
AGGCTGCATGGAGATTGAT
consensual
118
KAS II GCTTGAAAGCAGAAAATGC
TTGCCAATGTAAAGCAGCAG
BIEM-NT-001-014-C06-CE.F
100 sim
SAD A AAAGCCTTTCATGCCTCCT
TCAGCCCAGTTCTCCAAAG
consensual
100
SAD B GTGCTAGCCTCACCTCTTGG
GTTGCCCTTTCTTGGAATGA
consensual
220
Fat A ACCATTGCCAATCTCTTGC
CTCATGGTGCGAGTGGTAG
consensual
93
Fat B TCTTTCCGGTCACTTCATCC
TGAGCATTTGCCTTGACTTG
BIEM-NT-001-001-C01-CE.F 136
ACS A TTCAGCACGGGGAATATGT
TGAAGCCCAATCTTCCACT
consensual
157
ACS B GCAAAAGCTGTGACTTTGG
TTGCGAAATAATCCCTTGC
consensual
105
OLEO ATCCTCTCCGGTTTGATCCT
AGCCATGAAACCTGTCACC
BIEM-NT-001-008-E03-CE.F
133
5.3 Extração, quantificação e análise de RNA
Foram realizadas polinizações manuais de árvores do acesso PA016 na Estação
Experimental de Recursos Genéticos “José Haroldo” (Marituba-PA). Dois a três frutos de
T.cacao foram coletados aos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 dias após a
polinização (DAP).
53
Também foram utilizadas plantas de cacau (T. cacao) cultivadas em casa de
vegetação, das quais foram coletadas amostras de folhas em expansão (FE), folhas expandidas
(FX), caule (C), raiz (R) e ápice vegetativo (A) (Figura 5.1). Amostras de flores (F) e frutos
(para a retirada do epicarpo (E)) foram coletadas na plantação de cacau da Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba, SP.
O RNA total foi extraído dos embriões das sementes e dos demais tecidos de T. cacao
pelo protocolo proposto por Verica et al. (2004) com algumas modificações. O RNA foi
quantificado em espectrofotômetro e visualizado em gel de agarose para a confirmação da
integridade (Figura 5.2).
54
Figura 5.1 – Ilustração dos tecidos de Theobroma cacao utilizados neste estudo. Em A: planta de T.
cacao, folha em expansão (FE), folha expandida (FX), flor (F), caule (C), raiz (R), ápice vegetativo
(AP) e epicarpo (E). Em B: embriões nos estágios de desenvolvimento referentes a 60, 70, 80, 90, 100,
110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP)
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
DAP
A
B
55
Figura 5.2 - RNA total de Theobroma cacao. Em A, RNA extraído dos embriões nos diversos
períodos de desenvolvimento: 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 DAP. Em B, RNA
oriundo dos tecidos: folhas em expansão (FE), folhas expandidas (FX), flor (F), caule (C), raiz (R),
ápice vegetativo (A) e epicarpo do fruto (E)
Conferida a qualidade, e sendo mensurada a quantidade de RNA extraída das
amostras, foi realizada a síntese de cDNA. Para testar a eficiência da síntese, as amostras
diluídas a 1:10 (v/v) foram submetidas a uma reação de RT-PCR utilizando-se o primer do
gene da Actina. Outra reação de RT-PCR foi realizada com um pool de cDNAs obtidos a
partir do RNA extraído dos embriões e em DNA genômico extraído de folhas de Theobroma
cacao, com o objetivo de testar a especificidade e a presença ou não de íntrons. Todos os
primers amplificaram os cDNAs e os genômicos, sendo que apenas foi detectada a presença
de íntron no fragmento amplificado da proteína carregadora de acil A e β-cetoacil-ACP
sintase II (Tabela 5.2).
Em seguida, usando-se os iniciadores construídos, foi realizada reação de RT-PCR, na
qual os produtos amplificados foram submetidos à clonagem e sequenciamento para a
certificação da identidade do amplicon. Os cromatogramas foram analisados utilizando-se as
ferramentas Vecscreen, BlastN e BlastX, e todas as sequências foram correspondentes aos
fragmentos dos genes de interesse.
FE FX F C R A E
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
A
B
56
5.4 Seleção de genes referência
Com o objetivo de definir genes de referência ou normalizadores apropriado a análise
da expressão gênica em sementes em desenvolvimento e em tecidos de cacaueiro, foi avaliada
a estabilidade da expressão de sete genes codificantes de proteínas básicas do metabolismo
celular de Theobroma cacao, e três genes alvo que possivelmente possuem expressão
constitutiva em sementes oleaginosas.
Os genes utilizados nesse experimento (Tabela 5.3) foram os codificadores das
enzimas/proteínas gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteína ribossomal L35
(RPL35), actina (ACT), beta tubulina 5 (TUB5), malato desidrogenase (MDH), fator de
elongação 1-alfa (EF1a) e poliubiquitina (PUB), usados frequentemente como referência em
estudos de expressão gênica (HONG et al., 2008; PAOLACCI et al., 2009 e CRUZ et al.,
2009). Os genes codificadores das proteínas carregadoras de acil A, proteínas carregadoras de
acil B e proteínas carregadoras de acil C também foram analisados como possíveis genes
referência para expressão em sementes, pois se apresentam em um grande número de cópias
em inúmeras vias metabólicas (PEREGRÍN-ALVAREZ et al., 2005).
57
Tabela 5.3 – Possíveis genes referência e sequência dos iniciadores utilizados
Gene Sequências
GAPDH GATGCTCCTATGTTTGTTGTGG
TCTTCCTCCTCTCCAGTCCTT
RPL35 GTCACTCCGGCTAACATCGT
GAAAACCCACAAGGCTTCAG
ACT TCCTCTTCCAGCCATCTCTC
TCTCCTTGCTCATTCGGTCT
TUB5 ATTCCCCCGTCTTCACTTCT
TCTGCTCATCAACCTCTTTGG
MDH AAAATGGAGTTGGTGGATGC
AACCATGACTGCGATGTTGA
EF1a
AGGTCCACCAACCTTGACTG
TTGGGCTCGTTAATCTGGTC
PUB TTCAGGACAAGGAGGGGATT
AGGACAAGATGAAGGGTGGA
ACP A AAAGCTTCCCCAAAGTCGAT
ATTCAACGAGACACCCTTGC
ACP B GCAGACAAGATCAGCACAA
AAATCAAAGGGCACGACT
ACP C TCTTCCCCACACTCTTTTCG
AGGCTGCATGGAGATTGAT
Utilizando-se um pool de cDNAs dos embriões das sementes de cacau nas diversas
idades, e diluídos a 1:10, 1:100 e 1:100 (v/v), foi estabelecida uma curva de eficiência para
cada amplicon. Para o gene codificador da proteína carregadora de acil A, a diluição do
cDNA para a construção da curva de eficiência foi realizada em 1:10, 1:20 e 1:40 (v/v). Os
valores de eficiência obtidos variaram de 0,74 (genes da malato desidrogenase e
poliubiquitina) a 0,99 (gene da proteína carregadora de acil B), e os valores de R
2
foram
acima de 0,98 (Tabela 5.4).
58
Tabela 5.4 – Valores de eficiência e R
2
dos candidatos a genes referência obtidos através de curva de
eficiência por amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR)
Gene Eficiência R
2
GAPDH 0,96 0,99
RPL35 0,85 0,98
ACT 0,91 0,99
TUB5 0,95 0,99
MDH 0,74 0,99
EF1α 0,98 0,99
PUB 0,74 0,99
ACP A 0,96 0,99
ACP B 0,99 0,98
ACP C 0,89 0,98
Posteriormente, as amostras de cDNA sintetizadas a partir do RNA extraído de
embriões e dos diversos tecidos de T. cacao, foram diluídas a concentração de 1:10 (v/v); e
submetidas as reações de RT-qPCR. Para o estudo da estabilidade dos possíveis genes
referência foram usados os softwares GeNorm e NormFinder. Esses programas necessitam
que os valores de Cts sejam transformados em quantidades relativas (Q). Pela fórmula Delta
Ct, a amostra com maior nível de expressão, ou seja, menor Ct, recebe valor 1 e os demais
valores são subtraídos desta (VANDESOMPELE et al., 2002).
Q= E
Delta Ct
Q= E
(Ct min-Ct amostra)
Q = quantidade relativa;
E = eficiência da amplificação (2 = 100%);
Ct min = menor valor de Ct = Ct da amostra com maior expressão.
Utilizando–se primeiramente o programa GeNorm, os valores de estabilidade gênica
foram medidos com base nos níveis de expressão não normalizados. Este software calcula a
variação aos pares em todos os genes, definindo como valor M a média da variação de um
59
gene em relação a todos os outros. Para todos os possíveis genes, foram determinados os
valores M, e o gene referência com melhor estabilidade, é o que possui o menor valor M.
Na avaliação do melhor gene referência para a normalização da expressão gênica em
sementes de Theobroma cacao, o gene codificador da proteína ribossomal L35 foi
considerado o mais estável, com valor M igual a 1,45. Já o gene menos estável e menos
adequado para os estudos de expressão em sementes de cacau foi beta tubulina 5, com valor
M igual a 3,23 (Tabela 5.5).
Tabela 5.5 – Candidatos a genes referência analisados em embrião de sementes de Theobroma cacao e
ranqueados de acordo com o valor de estabilidade (valor M) pelo programa GeNorm
Gene Valor de Estabilidade (M)
RPL35 1,45
ACP A 1,48
GAPDH 1,50
PUB 1,51
MDH 1,71
ACT 1,77
EF1a
2,26
ACP B 2,41
ACP C 2,00
TUB5 3,23
Quando se considerou o par de genes com melhor estabilidade, os genes codificadores
da proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase foram sugeridos
pelo programa. A Figura 5.3 permite a visualização da estabilidade dos genes avaliados.
60
Figura 5.3 – Valores decrescentes de estabilidade dos candidatos a gene referência para o estudo em
sementes de Theobroma cacao estimado pelo software GeNorm
Quando se considerou os diversos tecidos de Theobroma cacao (Tabela 5.6), o gene
com melhor estabilidade foi a proteína carregadora de acil B, com valor M igual a 2,01 e o
menos estável foi o fator de elongação 1-alfa com valor M de 7,25.
Tabela 5.6 – Candidatos a genes referência analisados nos diversos tecidos de Theobroma cacao e
ranqueados de acordo com o valor de estabilidade (valor M) pelo programa GeNorm
Gene Valor de Estabilidade (M)
ACP B 3,56
GAPDH 3,59
RPL35 3,61
TUB5 4,02
PUBQ 4,03
ACP C 4,06
ACT 4,06
ACP A 4,12
EF1a
7,96
Genes menos estáveis Genes mais estáveis
Média da estabilidade da expressão (M)
61
O par de genes com melhor estabilidade foi formado pelos codificadores da proteína
carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. A Figura 5.4 mostra em valores
decrescentes, do gene menos estável, ao par de genes com maior estabilidade.
Figura 5.4 – Valores decrescentes de estabilidade dos candidatos a gene referência para o estudo em
diversos tecidos de Theobroma cacao, obtido pelo software GeNorm
Já empregando o software NormFinder, calculou-se o valor de estabilidade dos
possíveis genes referência nas sementes e nos diversos tecidos de Theobroma cacao (Tabela
5.7). Nas sementes, o gene com melhor valor de estabilidade foi da proteína ribossomal L35
com 0,25, seguidos por proteína carregadora de acil A com 0,29; e poliubiquitina com valor
de estabilidade igual a 0,33 (Tabela 5.7). O gene menos estável foi beta tubulina 5 que
apresentou valor de estabilidade de 2,11 (Tabela 5.7).
Média da estabilidade da expressão (M)
Genes menos estáveis Genes mais estáveis
62
Tabela 5.7 – Genes referência analisados em sementes de Theobroma cacao e ordenados de acordo
com o valor de estabilidade obtido pelo programa NormFinder
Quando a estabilidade na expressão dos genes referência foi avaliada nos diversos
tecidos de Theobroma cacao pelo programa NormFinder (Tabela 5.8), o melhor gene
referência apontado foi o codificador da proteína carregadora de acil B, com valor de
estabilidade 0,25; seguidos pelo fator de elongação 1-alfa de valor 0,27 e gliceraldeído 3-
fosfato desidrogenase; com valor de estabilidade de 0,34 (Tabela 5.8). O gene menos indicado
para o estudo da expressão quando se considera os tecidos de Theobroma cacao, de acordo
com software NormFinder foi a proteína carregadora de acil C; a qual mostra valor de
estabilidade de 1,17 (Tabela 5.8).
Sigla Valor de estabilidade
RPL35 0,25
ACP A 0,29
PUB 0,33
GAPDH 0,33
MDH 0,74
ACT 0,75
ACP C 1,03
EF1a
1,28
ACP B 1,43
TUB5 2,12
63
Tabela 5.8 – Candidatos a genes referência analisados em diversos tecidos de Theobroma cacao e
ordenados de acordo com o valor de estabilidade pelo programa NormFinder
Sigla Valor de estabilidade
ACP B 0,25
EF1a
0,27
GAPDH 0,34
MDH 0,42
RPL35 0,57
PUBQ 0,89
ACT 1,07
ACP A 1,09
TUB5 1,12
ACP C 1,17
O resultado obtido nos programas GeNorm e NormFinder foram similares, porém para
a normalização dos dados será levado em consideração os genes propostos pelo software
GeNorm. Esse critério foi estabelecido porque o programa NormFinder apenas fornece o gene
mais estável e o GeNorm além do gene mais adequado, também informa o par de genes com
menores variações.
Para mensurar a expressão gênica com eficácia, os genes alvo devem ser normalizados
não apenas com um gene referência, mas sim com no mínimo, os três melhores eleitos pelo
programa (VANDESOMPELE et al., 2002). Considerou-se então que para a normalização da
expressão gênica avaliada em sementes de Theobroma cacao, os três genes mais adequados
foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Para os diversos tecidos de plantas de cacaueiro, os três
melhores genes para se estabelecer a expressão são os codificadores da proteína ribossomal
L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase.
64
5.5 Caracterização do perfil de ácidos graxos dos frutos de Theobroma cacao
A composição de ácidos graxos dos embriões dos frutos em desenvolvimento
empregadas para a análise de expressão gênica foram determinadas de forma a permitir a
comparação entre transcrição e fenótipo final observado (composição ácidos graxos). Todos
os frutos utilizados para a caracterização do perfil de ácidos graxos foram da variedade
PA016, exceto para a amostra de 70 DAP cujo perfil de ácidos graxos foi obtido para a
variedade PA195
Foi realizada a extração, derivatização por metilação e análise do perfil de ácidos
graxos por cromatografia gasosa. Os resultados foram mostrados em porcentagem de ácidos
graxos presente embriões analisados nas diversas idades do fruto (Tabela 5.9).
Tabela 5.9 - Perfil de ácidos graxos das sementes de Theobroma cacao nos diversos períodos de
desenvolvimento. Os valores obtidos entre a relação idade dos frutos e ácido graxo é mostrada em
porcentagem (%)
Tempo
(DAP)
Palmítico
(16:0)
Esteárico
(18:0)
Oleico
(18:1)
Linoleico
(18:2)
Linolênico
(18:3)
Gadoleico
(20:1)
60
31,6 2,3 7,4 44,5 5,3 -
70
34,4 8,3 19,2 27,4 3,3 0,4
80
28,4 2,8 7,2 38,9 5,1 -
90
32,2 3,8 9,3 39,6 5,4 -
100
34,9 3,2 7,3 41,7 7,1 -
110
37,0 26,3 28,4 4,0 0,9 1,0
120
31,0 37,0 24,7 3,1 0,6 0,8
130
29,7 39,7 24,1 2,7 0,6 0,8
140
30,0 37,6 27,1 2,4 0,5 0,4
150
29,0 38,6 26,9 2,7 0,5 0,7
160
29,4 38,7 26,1 3,0 0,5 0,6
65
O início do desenvolvimento dos embriões das sementes de Theobroma cacao
corresponde a uma discreta acumulação de lipídeos de membrana, ricos em ácidos graxos
insaturados. Nesse período, a quantidade de lipídeos de membrana supera a quantidade de
triglicerídeos de reserva (LEHRIAN; KEENEY, 1980). Desta maneira, o ácido linoleico
(18:2) contribui com a maior parte dos lipídeos totais até 100 DAP. Após os 110 DAP, houve
aumento significativo na quantidade de ácidos esteárico (18:0) e oleico (18:1) e diminuição de
ácido linoleico. Esse padrão manteve-se até o final do desenvolvimento, aos 160 DAP. Esse
resultado foi semelhante ao estudo de Patel, Shanklin e Furtek (1994), onde analisando o
perfil lipídico de sementes de cacau em desenvolvimento, constatou aumento de ácido
esteárico e oleico entre 95 e 115 DAP. O resultado da análise da porcentagem lipídica
realizada por Lehrian e Keeney (1980), também mostraram troca na composição de ácidos
graxos no mesmo período, com aumento de ácido esteárico e oleico, que após os 115 DAP,
acumularam-se na mesma proporção. Griffiths e Harwood (1991) analisando a regulação da
biossíntese de triglicerídeos em cacau perceberam a mesma tendência na acumulação de
triglicerídeos.
A análise do perfil de ácidos graxos dos frutos de 70 DAP mostrou dados discrepantes
como alta porcentagem de esteárico (18:0) e oleico (18:1) e baixa quantidade de ácido
linoleico (18:2). Isso pode ter sido ocorrência do fato da amostra de 70 DAP ter sido derivada
de outro genótipo (PA195), com desenvolvimento de fruto distinto, ou com problemas de
imprecisão de determinação do estágio de desenvolvimento.
5.6 Determinação da eficiência dos iniciadores específicos dos genes da via metabólica de
ácidos graxos de Theobroma cacao
Utilizando-se um pool do cDNA dos embriões em desenvolvimento de Theobroma
cacao, diluições seriais a 1:10, 1:100 e 1:1000 (v/v) foram realizadas com o objetivo de
estabelecer uma curva de eficiência para cada amplificador específico dos diversos genes.
Para os genes codificadores da
Δ9
estearoil-ACP desaturase B e proteína carregadora de acil B
foram realizadas diluições nas concentrações 1:10, 1:20 e 1:40 (v/v).
Os valores de eficiência obtidos variaram de 0,82 (gene codificador da
Δ9
estearoil-
ACP desaturase B) a 1,0 (
Δ9
estearoil-ACP desaturase A), e os valores de correlação R
2
foram
acima de 0,98 (Tabela 5.10).
66
Tabela 5.10 – Valores de eficiência e R
2
dos genes da via metabólica de lipídeos de Theobroma cacao,
obtidos através de curva de eficiência por RT-qPCR
Gene Eficiência R
2
ACP A 0,96 0,99
ACP B 0,99 0,98
ACP C 0,89 0,98
KAS II 0,98 0,98
SAD A 1,0 0,99
SAD B 0,82 0,98
Fat B 0,91 0,98
Fat A 0,93 0,98
ACS A 0,99 0,99
ACS B 0,99 0,99
OLEO 0,98 0,99
5.7 Análise da expressão gênica nos embriões de Theobroma cacao nos diversos estágios
de desenvolvimento
Segundo Vandersompele et al. (2001), para medir a expressão gênica com acurácia,
devem-se usar múltiplos genes referência, sendo que o mínimo ideal são os três genes
referência mais estáveis. Alguns modelos matemáticos foram desenvolvidos para o cálculo da
expressão relativa, os quais podem ou não usar a correção da eficiência (PFAFFL, 2001;
SOONG et al., 2000 e KENNETH, THOMAS, 2001). Como se optou previamente pelo uso
dos três genes mais estáveis (proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase) para a normalização da expressão dos genes de
interesse, o programa REST 2005 (versão 1.9.12) foi adotado. Os valores de Ct foram então
transformados em valores de concentração.
Concentração = eficiência
média (controle)-média (amostras)
67
Após serem transformados em valores de concentração, é necessário calcular a média
geométrica da concentração dos três genes referência, como forma de minimizar os possíveis
valores discrepantes e as diferenças entre eles. Os valores de concentração do gene alvo são
então divididos pela média geométrica (GEOMEAN) dos genes referência, obtendo-se assim
o valor de expressão:
Expressão=Concentração do gene de interesse ÷ GEOMEAN (Conc.ref1, Concref2, Concref3)
Os dados de expressão gênica foram então calculados por quantificação relativa, a
qual necessita além do gene referência, uma amostra como referência, ou seja, como
tratamento controle ou calibrador para a determinação da expressão (PFAFFL, 2001). Para
isso, como controle interno da expressão foi estabelecido o Ct obtido das sementes de T.
cacao no menor tempo de desenvolvimento, 60 DAP, que recebeu valor de expressão igual a
1. O período referente a 60 DAP foi escolhido como controle pois assume-se que nesse
estágio de desenvolvimento os embriões de cacaueiro estariam ainda sem acúmulo de reserva
de gordura (LEHRIAN; KEENEY, 1980). Os dados da Tabela 5.9 corroboram esta
justificativa, mostrando os níveis mais baixos de lipídeos de reserva. As sementes nos seus
respectivos estágios de amadurecimento são mostradas na Figura 5.1. A expressão relativa
dos embriões nos diversos estágios de desenvolvimento: 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130,
140, 150 e 160 DAP, foram então comparadas à expressão mensurada nos diversos tecidos da
planta de Theobroma cacao.
68
5.7.1 Expressão gênica das proteínas carregadoras de acil em embriões de Theobroma
cacao
A proteína carregadora de acil é um co-fator indispensável em diversas vias
metabólicas primárias e secundárias, incluindo aquelas que sintetizam ácidos graxos,
fosfolipídeos, co-fatores metabólicos e moléculas sinalizadoras (BYERS; GONG, 2007).
Quase todos os ácidos graxos encontrados nas membranas lipídicas ou como reserva nas
sementes, são sintetizados com a participação da proteína carregadora de acil plastidial
(SCHMID; OHLROGGE, 2002). Segundo Mekhedov, Ilárduya e Ohlrogge (2000) existem
diferentes isoformas desta proteína nas plantas, as quais são codificadas diferencialmente por
muitos genes e expressam-se diferencialmente nos diversos tecidos e organelas da planta.
As três isoformas estudadas, classificadas de acordo com a similaridade com genes de
Arabidopsis, apresentaram de modo geral a tendência de expressão constante durante todo o
desenvolvimento dos embriões, com exceções em alguns tempos de amostragem (Figura 5.5;
Figura 5.6). O perfil de expressão nas sementes de Theobroma cacao sugeriram que estas
proteínas poderiam ser consideradas com expressão constitutiva. Hlousek-Radojcic, Post-
Beittenmiller e Ohlrogge (1992) estudou padrões de expressão de isoformas de proteínas
carregadoras de acil em Arabidopsis, identificando proteínas tecido-específicas e outras que
podem ser consideradas constitutivas, por possuirem padrão de expressão constante como os
apresentados neste estudo. Chen et al. (2007) obteve resultados semelhantes quando estudou o
perfil e a expressão dos genes relacionados a síntese de ácidos graxos em mamona (Ricinus
communis). A expressão gênica da proteína carregadora de acil, β-cetoacil-ACP sintase II
(KAS II) e
Δ9
estearoil-ACP desaturase não mostraram mudanças significativas durante o
amadurecimento dos frutos.
69
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
2
4
6
8
Expressão Relativa ACP A
DAP
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
2
4
6
8
Expressão Relativa ACP B
DAP
Figura 5.5 – Expressão relativa das isoformas da proteína carregadora de acil A e B, em relação aos
genes-referência proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase, analisados em embriões de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como
normalizador embriões de 60 DAP. Em A: expressão gênica da isoforma proteína carregadora de acil
A (ACPA). Em B: expressão gênica da isoforma proteína carregadora de acil B (ACP B)
A
B
70
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
5
10
15
20
25
30
Expressão Relativa ACP C
DAP
Figura 5.6 – Expressão relativa da isoforma proteína carregadora de acil C, em relação aos genes-
referência proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase, analisados em embriões de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como
normalizador embriões de 60 DAP.
As proteínas carregadoras de acil A e B mostraram quantidades infeirores de
transcritos quando comparadas a proteína carregadora de acil C (Figura 5.5; Figura 5.6)). Os
transcritos referentes a proteína carregadora de acil C foram os mais abundantes entre todos
codificadores para as proteínas do sistema FAS (Sintase de ácidos graxos). Esse perfil
também foi observado por Mekhedov, Ilárduya e Ohlrogge (2000), que analisando sequências
de EST de arroz e Arabidopsis, detectou a maior abundância de transcritos das proteína
carregadora de acil T14153 e E48B2Y7, quando comparada a outras enzimas do complexo
Sintase de Ácidos Graxos (FAS). Esse fato é justificado por ser indispensável e estar presente
em inúmeras vias metabólicas (BYERS; GONG, 2007).
Alguns estudos consideram que a expressão diferencial das isoformas da proteína
carregadora de acil podem estar relacionadas a especificidade das vias a que pertencem. Em
Arabidopsis, a ACP-4 foi mais ativa na membrana lipídica fotossintética de tecidos em
crescimento (BONAVENTURE; OHLROGGE, 2002), enquanto que em algodão, as proteínas
carregadoras de acil Fiber3A, 7A e 8A foram específicas na elongação de fibras (SONG;
ALLEN, 1997). Já em coentro, a ACP-1 foi específica para síntese de ácido graxo
monoenóico (SUH et al., 1999), e em pimenta, ACP- ACL mostrou-se ativa na biossíntese de
capsaicinoides (ALURU et al., 2003).
71
Devido à sensibilidade da técnica RT-qPCR usada para o estudo da expressão neste
trabalho, o intervalo de confiança mostrou-se grande, impossibilitando muitas vezes de
confirmar significância nos resultados. As amostras referentes às sementes de 80 DAP quando
quantificadas em todos os genes estudados da via metabólica de ácidos graxos, mostraram
desvio padrão acima da média; o que pode ser justificado por problemas na normalização da
expressão para uma das repetições biológicas.
5.7.2 Expressão da β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II) em embriões de Theobroma cacao
A enzima β-cetoacil-ACP sintase II atua na síntese de ácidos graxos elongando a
cadeia carbônica especificamente no último passo de condensação, onde o esqueleto de
carbono passa de 16 para 18 átomos (HARWOOD, 1996). Houve uma tendênciade acúmulo
de trasncritos aos 100 DAP. Entre 70 e 90 DAP, os valores de expressão foram próximos a 1.
Entre 110 e 120 DAP, houve queda em relação ao pico de 100 DAP, seguido de tendência de
queda no acúmulo de transcritos, com repressão na expressão entre 150 e 160 DAP (Figura
5.7).
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
2
4
6
8
10
Expressão Relativa KAS II
DAP
Figura 5.7 – Expressão relativa da β-cetoacil-ACP sintase II em relação aos genes-referência proteína
ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, analisados em
embriões de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130,
140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador embriões de 60 DAP
72
Hakosaki et al. (2008) estudando a expressão da β-cetoacil-ACP sintase II em
Arabidopsis, concluíram que esta enzima pode ter diversas funções nos tecidos e nos
embriões de semente em vários estágios de desenvolvimento, sendo expressa na folha, flor,
caule; mas principalmente nos cotilédones dos embriões das sementes (medidas em diversos
estágios de desenvolvimento). A expressão da β-cetoacil-ACP sintase II pode ser considerada
tecido-específica para embriões. Comparando-se o estudo de Hakosaki et al. (2008) com os
resultados obtidos neste estudo em Theobroma cacao, percebeu-se que a especificidade por
tecidos embrionários também acontece. Isto sugere que a enzima β-cetoacil-ACP sintase II
(KAS II) possui importante papel no desenvolvimento embrionário.
Pidkowich et al. (2007), usando mutantes de Arabidopsis fab1-1 (heterozigoto
parcialmente deficiente para o gene codificador da β-cetoacil-ACP sintase II) e fab1-2
(homozigoto, totalmente deficiente para o gene codificador da β-cetoacil-ACP sintase II),
comprovou que modulando somente a atividade tecido-específica de β-cetoacil-ACP sintase II
(KAS II) pode-se aumentar a concentração de ácidos graxos com 18 carbonos.
5.7.3 Expressão das
Δ9
estearoil-ACP desaturases em embriões de Theobroma cacao
As estearoil-ACP desaturases são enzimas que agem especificamente em cada
substrato, no comprimento das cadeias carbônicas, introduzindo dupla ligação entre esses
átomos (SHANKLIN; SOMERVILLE, 1991). Nas plantas, a formação da insaturação do 18:1
é catalisada pela enzima
Δ9
estearoil-ACP desaturase. Estas enzimas são codificadas por uma
família de genes, e no presente trabalho foi estudada a expressão de duas isoformas
Δ9
estearoil-ACP desaturase A e B. As duas isoformas estudadas, classificadas de acordo com
a similaridade com genes de Arabidopsis, mostraram padrão de expressão semelhante, com
tendência de aumento entre 90 e 120 DAP (Figura 5.8).
A expressão da isoforma
Δ9
estearoil-ACP desaturase A mostrou tendência de
aumento a partir de 100 DAP (2,2 ± 1,0), chegando a 2,8 ± 0,3 em 120 DAP. Analisando-se a
isoforma
D9
estearoil-ACP desaturase B, houve tendência de aumento da expressão a partir de
100 DAP (3,4 ± 0,8), até atingir um pico em 120 DAP seguido de diminuição gradativa até
140 DAP. Os valores de expressão relativa no período de 80 DAP em ambas as enzimas
73
desviou da tendência observada, tendo sido considerado que essa amostra mostrou resultados
discrepantes em todos os genes analisados (Figura 5.8).
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
5
10
15
Expressão Relativa SAD A
DAP
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
0
5
10
15
Expressão Relativa SAD B
DAP
Figura 5.8 – Expressão relativa das isoformas da
Δ9
estearoil-ACP desaturase em relação aos genes-
referência proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase, analisados em embriões de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como
normalizador embriões de 60 DAP. Em A: expressão gênica da isoforma
Δ9
estearoil-ACP desaturase A
(SAD A). Em B: expressão gênica da isoforma
Δ9
estearoil-ACP desaturase B (SAD B)
Patel (1993) determinou os níveis protéicos de
Δ9
estearoil-ACP desaturase por
western blot em embriões de T. cacao de 95 a 145 DAP. Neste estudo, a desaturase mostrou
A
B
74
expressão dos 95 DAP até 105 DAP, quando ocorreu o mairo acúmulo de estearato. Os níveis
da enzima aos 95 dias foi 2,3 vezes maior do que aos 105 dias, e após 145 DAP, não houve
mais detecção de transcritos, devido a falta de sensibilidade da técnica usada. A autora
concluiu que a diminuição nos ácidos graxos insaturados e aumento de 18:0 nesse período de
20 dias (95 a 115 DAP) pode ocorrer mesmo com intensa produção de
Δ 9
estearoil-ACP
desaturase. Duas hipóteses são consideradas: ou a
Δ 9
estearoil-ACP desaturase pode não
conseguir insaturar todos os substratos estearoil-ACP, ou as acil-ACP tioesterases hidrolisam
rapidamente os estearoil-ACP, não fornecendo substrato para a ação das desaturases.
5.7.4 Expressão das acil-ACP tioesterases A e B (Fat A e Fat B) em embriões de
Theobroma cacao
As tioesterases são enzimas que possuem a função de clivar as ligações tioesters do
grupo acil ligado a coenzima A, liberando os ácidos graxos. Estas enzimas são divididas em
duas classes, de acordo com o substrato a que têm especificidade: acil-ACP tioesterase A com
preferência por 18:1-ACP e acil-ACP tioesterase B que hidrolisam primeiramente substratos
saturados, que possuem de 16 a 18 carbonos (VOELKER,1996; GINALSKI;
RYCHLEWSKI, 2003 e JONES et al., 1995).
A expressão de transcritos para ambas as enzimas foram temporalmente semelhantes
atingindo pico de acúmulo de transcritos a 110 DAP, mas com a acil-ACP tioesterase A
apresentando maior quantidade relativa de transcritos. A acil-ACP tioesterase B mostrou
tendência de aumento de expressão a partir de 90 DAP (1,4 ± 0,7), chegando a 4,8 ± 1,7 aos
110 DAP, diminuindo drasticamente aos 150 DAP (0,4 ± 0,0) (Figura 5.9). A expressão da
acil-ACP tioesterase A mostrou aumento de expressão a partir de 90 DAP (3,2±1,9), com
ápice da acumulação de transcritos em 110 DAP (14,6 ± 4,5), e diminuindo gradativamente
até 150 DAP, onde a expressão mostra o valor de 0,8 ± 0,2. (Figura 5.9).
75
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
5
10
15
20
Expressão Relativa Fat B
DAP
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
5
10
15
20
Expressão Relativa Fat A
DAP
Figura 5.9 – Expressão relativa das tioesterases em relação aos genes-referência proteína ribossomal
L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, analisados em embriões
de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150
e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador embriões de 60 DAP. Em A:
expressão gênica da acil-ACP tioesterase B (Fat B). Em B: expressão gênica da acil-ACP tioesterase A
(Fat A)
Os resultados aqui obtidos corroboraram os dados de Silva (2005), pois estudando a
expressão das acil-ACP tioesterase A e acil-ACP tioesterase B por northern blot durante o
desenvolvimento de sementes de cacau, também percebeu padrão de expressão temporal
semelhante entre as duas enzimas. Ambas as enzimas se expressaram precocemente em
A
B
76
embriões no desenvolvimento de frutos de cacau, a partir dos 60 dias. A expressão dos genes
dobrou entre 60 e 120 dias. A acil-ACP tioesterase A apresentou maior expressão entre 100 e
120 dias de desenvolvimento, enquanto que o a acil-ACP tioesterase B, também, apresentou
maior expressão aos 120 dias, porém a partir dos 130 dias houve diminuição no nível de
expressão, que se manteve praticamente constante até os 150 dias.
5.7.5 Expressão acil-CoA sintetase (ACS) em embriões de Theobroma cacao
Após as tioesterases liberarem os ácidos graxos do grupo acil da coenzima A e
deixarm o plastídeo, estes são re-esterificados a CoA pela enzima acil-CoA sintetase, para
assim serem transportados até o retículo endoplasmático, onde irão participar da biossíntese
dos lipídeos de membrana e de reserva (MILLAR; SMITH; KUNST, 2000).
As duas isoformas estudadas, classificadas de acordo com a similaridade com genes
de Arabidopsis, apresentaram padrão temporal de expressão distintos. A expressão da acil-
CoA sintetase A apresentou pico de expressão a partir dos 100 dias (11,3 ± 1,8)
significativamente diferente em relação aos períodos anteriores permanecendo alta em 110
(5,8 ± 1,0) e 120 DAP (7,2 ± 0,4). No período 130 DAP, houve queda na expressão (1,3 ±
0,0), permanecendo reduzida até o final do desenvolvimento (Figura 5.10).
A expressão da acil-CoA sintetase B mostrou-se baixa dos 70 aos 90 DAP (Figura
5.9), Aos 100 DAP a expressão gênica passa a ser significativa em relação aos períodos
anteriores (30,6 ± 3,3), aumentando aos 110 dias (140,4±71,8) e alcançando os maiores
valores de expressão em 130 (158,9 ± 63,2) e 140 DAP (198,3 ± 63,2), após decréscimo aos
120 DAP. Em 150 e 160 dias, houve queda da expressão (Figura 5.10).
77
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
5
10
15
Expressão Relativa ACS A
DAP
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
100
200
300
Expressão Relativa ACS B
DAP
Figura 5.10 – Expressão relativa das isoformas da acil-CoA sintetase em relação aos genes-referência
proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase,
analisados em embriões de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100,
110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador
embriões de 60 DAP. Em A: expressão gênica da isoforma acil-CoA sintetase A (ACS A). Em B:
expressão gênica da isoforma acil-CoA sintetase B (ACS B)
Shockey et al. (2002) estudaram isoformas de acil-CoA sintetase em Arabidopsis
priorizando a expressão desse gene no desenvolvimento de sementes. Com o uso da técnica
de RT-PCR semi-quantitativo, foi confirmado que diversas isoformas de LACS expressaram-
se durante o desenvolvimento das sementes, mas apenas uma mostrou-se tecido-específica. As
acil-CoA sintetase A e B medidas em sementes de Theobroma cacao, mostraram padrão de
A
B
78
expressão diferentes. Enquanto acil-CoA sintetase A mostrou-se mais expressa nos períodos
de 100 a 120 DAP, a isoforma acil- CoA sintetase B foi mais expressa de 110 a 140 DAP. A
semente em desenvolvimento é o lugar de depósito de triglicerídeos de reserva e onde existe
uma demanda de ácidos graxos para suportarem as aciltransferases que produzem esses
lipídeos. Ambas acil-CoA sintetase A e B são expressas nos períodos de maior síntese de
triglicerídeos, sendo que a primeira isoforma está presente no início e a segunda no fim deste
processo.
5.7.6 Expressão Oleosina (OLEO) em embriões de Theobroma cacao
As sementes oleaginosas estocam os triglicerídeos em estruturas esféricas
denominadas corpos gordurosos. Estes corpos medem cerca de 0,5-2,0 µm de diâmetro e são
envoltos por uma monocamada lipídica coberta por uma membrana protéica (HUANG, 1996;
JOLIVET et al., 2004; LIN et al., 2002; NAESTED et al., 2000; TZEN et al., 1997; TZEN et
al., 1993) e as oleosinas são as maiores componentes destas (TZEN et al., 1990).
O gene codificador da proteína oleosina de 15.8 KDa apresentou expressão reprimida
entre 60 e 80 DAP (Figura 5.11). Aos 90 DAP, houve aumento significativo na expressão, e a
partir desse período houve um importante acúmulo de transcritos, com pico a 110 DAP
(17114,6±15926,0). Em 120 DAP, a expressão passa a diminuir, mas mantendo exprssão aos
150 e 160 DAP (Figura 5.11).
79
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
100
1000
10000
Expressão Relativa OLEO
DAP
Figura 5.11 – Expressão relativa da oleosina (OLEO) em relação aos genes-referência proteína
ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, analisados em
embriões de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130,
140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador embriões de 60 DAP
Simkin et al. (2006) analisaram cinco isoformas de oleosinas em duas variedades de
café, detectando que quando se compara a expressão de sementes e outros tecidos, há maior
expresão de oleosina durante o desenvolvimento das sementes.
Guilloteau et al. (2003) estudou por northern a expressão de duas oleosinas com
cadeia polipepitídica de aproximadamente 15 e 16.1 KDa. Essas oleosinas forma
denominadas TCOleo 15.8 e TCOleo 16.9 KDa. A oleosina TCOleo 15.8 foi a mesma
estudada no presente trabalho, e o padrão de expressão obtido por Guilloteau et al. (2003)
com transcritos fortemente expressos entre 125 e 146 DAP, seguido de diminuição na
expressão após 160 DAP, foi semelhante ao aqui obtido.
O período de máxima acumulação de oleosina coincide com o período de intensa
metabolização de triglicerídeos, podendo-se especular que estes são essenciais para que não
ocorra a junção dos corpos oleosos no período de intensa acumulação.
80
5.8 Análise da expressão gênica nos tecidos de Theobroma cacao
Com o objetivo de investigar a especificidade ou preferência de expressão de alguns
dos genes em tecidos de cacaueiro, foi realizada análise de expressão dos genes em oito
tecidos, buscando demonstrar a especificidade de certos genes ao processo de acúmulo de
lipídeos de reserva em embriões de cacaueiro.
5.8.1 Expressão das proteínas carregadoras de acil A, B e C (ACP A, ACP B e ACP C)
nos diversos tecidos de Theobroma cacao
As proteínas carregadoras de acil A, B e C, em geral mostraram padrão de expressão
constante, com pouca variação entre os tecidos (Figura 5.12; Figura 5.13)). Para o transcrito
da proteína carregadora de acil A, houve expressão em folha em expansão, folha expandida,
caule, ápice vegetativo e embrião de 150 DAP, que mostraram-se reprimidas em relação ao
normalizador (embriões aos 60 DAP). A média de transcritos que obteve o maior valor de
expressão foi no epicarpo do fruto (4,2 ± 3,3) (Figura 5.12).
A proteína carregadora de acil B mostrou valores de expressão ainda mais
homogêneos entre tecidos. Em folha em expansão o valor de expressão foi 1,3 ± 0,9; em folha
em expandida, 1,0 ± 0,1; caule, 1,4 ± 0,7; raiz, 1,6 ± 0,8; ápice vegetativo, 0,8 ± 0,2; epicarpo,
1,1 ± 0,2; embrião de 120 DAP, 0,8 ±0,4 e 150 DAP, 1,2 ± 1,0, (Figura 5.12).
Por outro lado, a proteína carregadora de acil C apresentou maior variação e
quantidade de transcritos nos tecidos. Os valores de expressão nos tecidos estudados foram:
folha em expansão 9,6 ± 7,4; folha expandida, 10,9 ± 3,9; flor, 2,9 ± 1,1; caule, 8,8 ± 7,2; raiz,
3,2 ± 1,3; ápice vegetativo, 4,3 ± 3,3, semente com 120 DAP, 5,8 ± 4,9 e semente com 150
DAP, 6,8 ± 6,4. A média da expressão do epicarpo mostrou o maior valor (31,3 ± 30,6)
(Figura 5.13).
Os níveis de expressão da proteína carregadora de acil podem ser proporcionais a
biossíntese de ácidos graxos em tecidos vegetativos e reprodutivos em crescimento, o que
justifica sua expressão nos diversos tecidos (BAERSON; LAMPPA, 1993;
BONAVENTURE; OHLROGGE, 2002; HANNAPEL; OHLROGGE, 2002 e OHLROGGE;
KUO, 1984).
81
6O 12O 15O R C A FX FE F E
0
2
4
6
8
Expressão Relativa ACP A
Tecidos
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
1
2
3
Expressão Relativa ACP B
Tecidos
Figura 5.12 – Expressão relativa das isoformas das proteínas carregadoras de acil A e B, em relação
aos genes-referência proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase, analisados nos tecidos de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como
normalizador, embriões de 60 DAP. Eixo X: Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O),
embrião de 150 DAP (15O), raiz (R), caule (C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em
expansão (FE), flor (F) e epicarpo (E). Eixo Y: valores relativos de expressão correspondentes. Em A:
expressão relativa da isoforma proteína carregadora de acil A (ACP A). Em B: expressão relativa da
isoforma proteína carregadora de acil B (ACP B)
A
B
82
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
20
40
60
80
Expressão Relativa ACP C
Tecidos
Figura 5.13 – Expressão relativa da isoforma da proteína carregadora de acil C, em relação aos genes-
referência proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase, analisados nos tecidos de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como
normalizador, embriões de 60 DAP. Eixo X: Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O),
embrião de 150 DAP (15O), raiz (R), caule (C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em
expansão (FE), flor (F) e epicarpo (E). Eixo Y: valores relativos de expressão correspondentes.
5.8.2 Expressão da β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II) nos diversos tecidos de Theobroma
cacao
A enzima β-cetoacil-ACP sintase II apresentou expressão constante em todos os
tecidos, sendo a única exceção em embriões a 120 DAP (1,8±0,2). (Figura 5.14). Hakozaki et
al. (2008) analisou a expressão da β-cetoacil-ACP sintase II em diferentes tecidos de
Arabidopsis com o uso da técnica de RT-PCR e com a inserção de GUS no promotor desse
gene. Esta enzima foi expressa em folhas, flores abertas, botões florais, caule e fortemente nos
estágios embrionários da semente, mas em raiz não foi houve expressão. De forma similar, a
β-cetoacil-ACP sintase II estudada no presente trabalho, mostrou especificidade para
embriões em desenvolvimento.
83
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
1
2
3
Expressão Relativa KAS II
Tecidos
Figura 5.14 – Expressão relativa β-cetoacil-ACP sintase II em relação aos genes-referência proteína
ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, analisados nos
tecidos de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130,
140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador, embriões de 60 DAP.
Eixo X: Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O), embrião de 150 DAP (15O), raiz (R),
caule (C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em expansão (FE), flor (F) e epicarpo (E).
Eixo Y: valores relativos de expressão correspondentes
5.8.3 Expressão das estearoil-ACP desaturase nos diversos tecidos de Theobroma cacao
Δ9
estearoil-ACP desaturase A demostrou expressão em todos os tecidos com exceção
do ápice vegetativo (0,2±0,1). Nos embriões de 120 e 150 DAP, os valores foram 2,8±0,3 e
0,9±0,3 respectivamente (Figura 5.15).
A enzima
Δ9
estearoil-ACP desaturase B apresentou expressão em quase todos os
tecidos, a não ser no ápice vegetativo (0,2±0,1) e epicarpo (0,1±0,1. (Figura 5.15) sugerindo
tratar-se de uma enzima com expressão preferencial em embriões.
Whitney et al. (2003) isolou e estudou por northern blot desaturases de Bassia
scoparia, onde observou que a
Δ9
estearoil-ACP desaturase foi expressa nos tecidos das
sementes e também em folha e raiz, não sendo considerada tecido-específica. Esse resultado é
contrastante ao padrão de expressão da
Δ9
estearoil-ACP desaturase B, a qual mostra-se
preferencial para embriões, com pico de expressão aos 120 DAP.
84
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
2
4
6
8
10
Expressão Relativa SAD A
Tecidos
6O 12O 15O R C A FX FE F E
0
2
4
6
8
10
12
Expressão Relativa SAD B
Tecidos
Figura 5.15 – Expressão relativa das isoformas da
Δ9
estearoil-ACP desaturase em relação aos genes-
referência proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase, analisados nos tecidos de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60,
70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como
normalizador, embriões de 60 DAP. Eixo X: Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O),
embrião de 150 DAP (15O), raiz (R), caule (C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em
expansão (FE), flor (F) e epicarpo (E). Eixo Y: valores relativos de expressão correspondentes. Em A:
expressão relativa da isoforma
Δ9
estearoil-ACP desaturase A (SAD A). Em B: expressão relativa da
isoforma
Δ9
estearoil-ACP desaturase B (SAD B)
A
B
85
5.8.4 Expressão das acil-ACP tioesterase A e B (Fat A e Fat B) nos diversos tecidos
A acumulação de transcritos de acil-ACP tioesterase A foi significativamente maior
em embriões de 120 DAP (11,7±3,9) em relação a todos os tecidos (Figura 5.16). O mesmo
foi observado para os transcritos de acil-ACP tioesterase B, com pico para embriões 120
DAP. Para os outros tecidos a expressão foi constante (Figura 5.16).
Dormann, Voelker e Ohlrogge (1995) analisaram a expressão da acil-ACP tioesterase
B em diversos tecidos, concluindo que esta enzima apesar de ser tecido-específica em
sementes, também é expressa em folhas, raiz e vagem de Brassica napus, o que corresponde
exatamente ao observado neste estudo em T. cacao. Eccleston e Ohlrogge (1998) analisaram
mais uma vez a expressão da acil-ACP tioesterase B com maior expressão em flores do que
em folhas. Quando o mesmo estudo foi realizado em Arabidopsis, percebeu-se que a maior
expressão era novamente em flores e fraca expressão em sementes. Dormann, Voelker e
Ohlrogge (2005) utilizando-se transgênicos de Arabidopsis o qual possuíam aumento de 16:0,
perceberam uma acil-ACP tioesterase B tecido específica proporcional a quantidade de 16:0,
expressa em sementes e flores, e uma segunda acil-ACP tioesterase B específica para flores e
folhas. Este estudo pode sugerir que a acil-ACP tioesterase B estudada, é específica para
sementes e fracamente expressa em folhas em expansão, flores, caule e raiz o que também
corrobora os dados observados em T. cacao.
Mandal et al. (2002) analisaram a expressão das acil-ACP tioesterase A e B em
Brassica juncea, em sementes em desenvolvimento, raiz, folha e hipocótilo, demonstrando
que o transcrito foi intensamente expresso em embriões em desenvolvimento, mas nos demais
tecidos nada foi detectado. Esse resultado também confirma o presente estudo em Theobroma
cacao, onde esta enzima foi pouco expressa ou reprimida nos tecidos a não ser na semente de
120 DAP.
Silva (2005) mensurou espacialmente em T. cacao os genes de Acil-ACP tioesterase A
e B, os quais se expressaram em tecido foliar e sementes, porém não apresentaram expressão
importante em ápice vegetativo e em raiz. O uso da técnica northern blot, por possuir
sensibilidade menor do que a RT-qPCR, pode não ter acusado expressão em raiz, como foi
apresentada neste trabalho.
86
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
2
4
Expressão Relativa Fat B
Tecidos
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
5
10
15
20
Expressão Relativa Fat A
Tecidos
Figura 5.16 – Expressão relativa das tioesterases em relação aos genes-referência proteína ribossomal
L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, analisados nos tecidos de
Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e
160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador, embriões de 60 DAP. Eixo X:
Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O), embrião de 150 DAP (15O), raiz (R), caule
(C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em expansão (FE), flor (F) e epicarpo (E). Eixo
Y: valores relativos de expressão correspondentes. Em A: expressão relativa da acil-ACP tioesterase B
(Fat B). Em B: expressão relativa da isoforma acil-ACP tioesterase A (Fat A)
A
B
87
5.8.5 Expressão das acil-CoA sintetase A e B (ACS A e ACS B) nos diversos tecidos de
Theobroma cacao
As enzimas acil-CoA sintetase mostraram maior expressão em folhas em expansão e
flor com valores de expressão de 15,1±14,0 e 11,6±10,6, mas o intervalo de confiança não
permitiu considerá-las significativas (Figura 5.17). A expressão do embrião de 120 DAP foi
7,2±0,4, sendo significativamente maior em relação aos demais tecidos (folha expandida
(3,2±3,2), caule (3,3±3,3), raiz (1,6±1,6), ápice vegetativo (1,5±1,5), epicarpo (1,2±1,1) e
embrião de 150 DAP (1,4±0,9)) (Figura 5.17).
O gene da acil-CoA sintetase B mostrou maior expressão nos embriões em 120 e 150
DAP (Figura 5.15). Em folha em expansão, o valor de expressão foi 17,9±16,5; mas intervalo
de confiança não permitiu considerá-la significativa perante os demais tecidos (Figura 5.15).
Houve expressão significativamente superior em raiz (17,2±5,9) em relação à folha expandida
(0,4±0,1), flor (0,7±0,1), ápice vegetativo (0,9±0,5), caule (4,0±1,5) e epicarpo (3,0±0,2),
podendo-se sugerir maior especificidade para embriões.
Chong et al. (2008) investigaram a expressão de duas isoformas de acil-CoA sintetase
(BnLACS e AtLACS4) em raiz, caule, folhas e flores de Brassica napus. O gene BnLACS4 foi
altamente expresso em raiz e flores e fracamente expresso em caule e folhas e AtLACS4 foi
expresso em raiz, folhas e flores, e não no caule.
88
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
5
10
15
20
25
30
Expressão Relativa ACS A
Tecidos
6O 12O15O R C A FX FE F E
0
20
40
60
80
Expressão Relativa ACS B
Tecidos
Figura 5.17 – Expressão relativa das isoformas de acil-CoA sintetase em relação aos genes-referência
proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase,
analisados nos tecidos de Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100,
110, 120, 130, 140, 150 e 160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador,
embriões de 60 DAP. Eixo X: Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O), embrião de 150
DAP (15O), raiz (R), caule (C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em expansão (FE),
flor (F) e epicarpo (E). Eixo Y: valores relativos de expressão correspondentes. Em A: expressão
relativa da acil-CoA sintetase A (ACS A). Em B: expressão relativa da isoforma acil-CoA sintetase B
(ACS B).
A
B
89
5.8.6 Expressão da oleosina nos embriões de Theobroma cacao
A expressão dos transcritos de olosina demosntraram ser embrião-específicos ou
preferencial. O transcrito da oleosina avaliado mostrou expressão significante nas sementes de
120 e 150 DAP (9173,32±8295,87 e 750,05±598,15). Nos demais tecidos a expressão foi
baixa comparada aos embriões (folha expandida (7,83±7,65); flor (9,97±9,51); caule
(1,37±0,82) e raiz, (1,26±0,41)), ou mostrou-se reprimida (folha em expansão (0,6±0,21);
ápice vegetativo (0,67±0,45) e epicarpo (0,79±0,4); (Figura 5.18).
Simkin et al. (2006), analisaram os níveis de expressão de isoformas de oleosinas em
raiz, folha jovem, caule, flor e frutos em diversos estágios de desenvolvimento de café. A
oleosina foi fortemente expressa durante o desenvolvimento das sementes, mas nos tecidos
restantes foi muito baixa ou nula, corroborando os dados obtidos no presente trabalho.
6O 12O 15O R C A FX FE F E
1
10
100
1000
10000
Expressão Relativa OLEO
Tecidos
Figura 5.18 – Expressão relativa da oleosina em relação aos genes-referência proteína ribossomal L35,
proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, analisados nos tecidos de
Theobroma cacao nos estágios de desenvolvimento em 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e
160 dias após a polinização (DAP), empregando como normalizador, embriões de 60 DAP. Eixo X:
Embrião de 60 DAP (6O), embrião de 120 DAP (12O), embrião de 150 DAP (15O), raiz (R), caule
(C), ápice vegetativo (A), folha expandida (FX), folha em expansão (FE), flor (F) e epicarpo (E). Eixo
Y: valores relativos de expressão correspondentes
90
5.9 Correlação entre acúmulo de transcritos e composição de ácido graxos das sementes
em desenvolvimento
Com o objetivo de se estabelecer relações entre variações na expressão dos genes da
via metabólica de ácidos graxos durante o desenvolvimento dos embriões de Theobroma
cacao e a composição molar de ácidos graxos dos embriões no mesmo período, foram
calculados o coeficiente de correlação entre essas variáveis (Tabela 5.11). De modo geral, o
percentual molar de palmitato foi altamente correlacionada ao valor relativo de transcritos da
proteína carregadora de acil C (0,633) e oleosina (0,660). A concentração de estearato foi
altamente correlacionada com acúmulo de transcritos de acil- CoA sintetase B (0,720),
enquanto que o de oleato foi altamente correlacionado com a expressão relativa de acil- CoA
sintetase B (0,708). O ácido linoleico mostrou-se negativamente correlacionado com acil-CoA
sintetase B (-0,743), e o padrão de acumulação do ácido linolênico (C18:3) mostrou-se
altamente correlacionados ao acúmulo de transcritos de β-cetoacil-ACP sintase II (0,700) e
negativamente correlacionado a acil- CoA sintetase B (-0,685). O ácido gadoleico foi
altamente correlacionado ao acúmulo d transcritos de acil-ACP tioesterase A (0,776).
91
Tabela 5.11 - Coeficientes de correlação para os padrões de expressão gênica relativa e os padrões de
acumulação de lipídeos. Os valores em negrito e sublinhados mostram significância estatística (nível
de probabilidade 1%) e os valores apenas sublinhados mostram que o valor da correlação é
significante (nível de probabilidade 5%)
O substrato 16:0-ACP representa o primeiro maior ponto de ramificação da via de
biossíntese de ácidos graxos por ser utilizado por duas das principais enzimas envolvidas: β-
cetoacil-ACP sintase II e acil-ACP tioesterase B. No caso de 16:0-ACP ser elongado a 18:0-
ACP, que então será o substrato da estearoil-ACP desaturase (CAHOON; SHANKLIN, 2000)
após a insaturação, poderá ser substrato da acil-ACP tioesterase A. A razão entre a quantidade
de transcritos primários dessas enzimas sugere o substrato líquido para ação da próxima
enzima. O coeficiente de correlação foi então calculado entre a razão entre a quantidade de
transcritos das enzimas atuantes no primeiro e segundo ponto importantes de bifurcação da
via de biossíntese de ácidos graxos, com o objetivo de calcular a significância entre estas
(Tabela 5.12).
16:0-
Palmitato
18:0-
Estearato
18:1-
Oleato
18:2-
Linolato
18:3-
Linolênato
20:1-
Gadolato
ACP A
-0,490 -0,119 -0,263 0,160 0,156 -0,527
ACP B
-0,413 -0,144 -0,2180 0,138 0,137 -0,345
ACP C 0,633
-0,186 -0,006 0,097 0,240 -0,383
KAS II
0,401 -0,564 -0,596 0,556
0,700
0,341
SAD A
-0,244 -0,151 -0,180 0,101 0,109 -0,06
SAD B
-0,186 0,208 0,140 -0,245 -0,202 0,189
FAT B
0,195 -0,191 -0,188 0,110 0,173 0,646
FAT A
0,580 -0,001 0,089 -0,11 0,002
0,776
ACS A
0,583 -0,140 -0,115 0,102 0,263 0,585
ACS B
-0,044
0,720 0,708
-0,743
-0,685
0,201
Oleosina 0,660
0,169 0,274 -0,271 -0,137 0,749
92
Tabela 5.12: Coeficientes de correlação entre razão dos padrões de expressão gênica e os padrões de
acumulação de lipídeos. Os valores em negrito e sublinhados mostram alta significância (nível de
probabilidade 1%) e os valores apenas sublinhados mostram que o valor da correlação é significante
(nível de probabilidade 5%).
16:0-
Palmítico
18:0-
Esteárico
18:1-
Oleico
18:2-
Linoleico
18:3-
Linolênic
o
20:1-
Gadoleico
KASII/SADA
0,554
-0,633 -0,652 0,656
0,784 0,340
KASII/SADB
0,507 -0,740 -0,759 0,770 0,869 0,126
FATA/SADA
0,705
-0,042 0,050 -0,051 0,073
0,843
FATA/SADB
0,773 -0,192 -0,066 0,087 0,208
0,822
FATB/SADA
0,497 -0,143 -0,128 0,0970 0,169 0,597
FATB/SADB
0,479 -0,435 -0.393 0,383 0,419 0,521
KASII/FATA
0,116 -0,764
-0,710
0,789
0,719
-0,890
KASII/FATB
0,335
-0,652 -0,698 0,715
0,800 -0,668
A concentração de ácido palmítico foi altamente correlacionado com a razão entre transcritos
de acil-ACP tioesterase A/
Δ 9
estearoil-ACP desaturase A (0,705) e acil-ACP tioesterase
A/
D9
estearoil-ACP desaturase B (0,773). Já os valores de ácido esteárico mostraram-se
negativamente correlacionados a razão entre β-cetoacil-ACP sintase II/
D9
estearoil-ACP
desaturase A (-0,633) e β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase B (0,773), β-cetoacil-
ACP sintase II/
Δ9
estearoil-ACP desaturase B (-0,764) e β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP
tioesterase A (-0,652). Analisando as possíveis correlações entre a concentração de ácido
oleico, esta foi altamente negativa entre β-cetoacil-ACP sintase II/
Δ9
estearoil-ACP desaturase
A (-0,652), entre β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase A (-0,710), entre β-cetoacil-
93
ACP sintase II/acil-ACP tioesterase B (-0,698), entre β-cetoacil-ACP sintase II/
Δ9
estearoil-
ACP desaturase B(-0,759). O ácido linoleico foi altamente correlacionado com as razões entre
a expressão relativa dos genes da β-cetoacil-ACP sintase II/
Δ9
estearoil-ACP desaturase A
(0,656), β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase B (0,715), β-cetoacil-ACP sintase II/
Δ9
estearoil-ACP desaturase B (0,770) e β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase A
(0,790). O ácido linolênico mostrou-se altamente correlacionado a razão de expressão relativa
dos transcritos de β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase A (0,719), β-cetoacil-ACP
sintase II/
Δ9
estearoil-ACP desaturase A (0,784), β-cetoacil-ACP sintase II/
Δ9
estearoil-ACP
desaturase B (0,8690) e β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase B (0,800). O ácido
gadoleico mostrou-se altamente correlacionado a acil-ACP tioesterase A/
Δ9
estearoil-ACP
desaturase A (0,843), acil-ACP tioesterase A/
Δ9
estearoil-ACP desaturase B (0,822) e
negativamente altamente correlacionado com β-cetoacil-ACP sintase II/acil-ACP tioesterase
A (-0,890).
A razão entre o número de transcritos das enzimas e a porcentagem de ácidos graxos
mostraram maior nível de correlação, por exemplo, quando se compara a correlação dos genes
e ácido esteárico. Quando analisado individualmante, apenas um gene, o acil- CoA sintetase B
mostrou ser significativo, contra quatro relações de genes: β-cetoacil-ACP sintase
II/
Δ9
estearoil-ACP desaturase A, β-cetoacil-ACP sintase II/ acil-ACP tioesterase A e β-
cetoacil-ACP sintase II/ acil-ACP tioesterase B, β-cetoacil-ACP sintase II/
Δ9
estearoil-ACP
desaturase B.
De acordo com a análise do perfil de ácidos graxos, com o aumento de ácido esteárico
a partir de 110 DAP seria esperado correlações positivas entre as enzimas participantes desta
síntese. Entretanto, as correlações ou não se mostraram significantes, ou mostraram-se
negativas. Esse resultado pode ser justificado pelo método de quantificação usado, ou seja, a
quantidade de transcritos está expressa em quantidade relativa em relação ao calibrador 60
DAP e não em um número absoluto de cópias como seria na quantificação absoluta. Desta
maneira, não posssuindo um valor exato do número de cópias de transcritos das enzimas
envolvidas na biossíntese de ácidos esteárico, não foi possível a visualização do resultado
esperado.
94
5.10 Biossíntese de ácidos graxos
As proteínas carregadoras de acil apresentaram expressão mais constantes, e a maior
quantidade de transcritos (proteína carregadora de acil C) do complexo Sintase de Ácidos
Graxos (FAS) no desenvolvimento das sementes de Theobroma cacao. Isso é justificado, pois
quase todos os ácidos graxos encontrados nas membranas lipídicas ou como estoque nas
sementes, são sintetizados com a participação desta proteína (SCHMID; OHLROGGE, 2002).
Entre os genes investigados, não houve nenhum com característica de ser preferencialmente
nos embriões. Portanto, o padrão de expressão desses genes ACP pareceu estar associado a
síntese contínua de ácidos graxos, conforme esperado.
A enzima β-cetoacil-ACP sintase II, que alonga o substrato 16:0-ACP até 18:0-ACP, é
a principal responsável por sintetizar ácido esteárico. O gene analisado que codifica esta
enzima mostrou pico de expressão aos 100 DAP, com queda gradativa de acumulação de
transcritos até o final do desenvolvimento das sementes. Esse período coincide com o padrão
de acúmulo de transcritos da acil-ACP tioesterase B (desconsiderando a amostra referente a
80 DAP, a qual apresentou problemas na análise da expressão), e com o início do acúmulo de
estearato nos embriões. Esse transcrito também demonstrou ser preferencialmente expresso
em embriões de cacaueiro em relação aos outros tecidos avaliados. O padrão de expressão
desse gene sugere um papel importante no alto acúmulo de estearato nas sementes de
cacaueiro
Por outro lado, os transcritos das enzimas
Δ9
estearoil-ACP desaturase A e B mostraram
maior acumulação entre 90 e 140 DAP com pico aos 110-120 DAP durante o
desenvolvimento das sementes. O período de maior expressão das desaturases (principalmente
Δ9
estearoil-ACP desaturase B) coincidiu com o rápido aumento do ácido esteárico (100 a 110
DAP), e portanto, ocorreu após o pico de trasncrição da β-cetoacil-ACP sintase II.
Os transcritos das acil-ACP tioesterase (A e B) demosntraram ser preferencialmente
expresos em embriões. Os transcritos da enzima acil-ACP tioesterase A mostrou padrão de
expressão crescente desde o início do desenvolvimento do fruto, com pico de expressão aos
110 DAP. Após esse período, os valores de expressão mostraram-se decrescentes até a
maturação. Esse padrão de expressão coincidiu com o período de intenso metabolismo de
lipídeos e de rápido acúmulo de estearato e oleato. Porém, o pico de expressão foi posterior ao
da β-cetoacil-ACP sintase II e coincidente com a
Δ9
estearoil-ACP desaturase B, sugerindo que
95
o balanço de transcrição entre esses genes poderia estar definindo a composição de ácidos
graxos dos embriões de cacaueiro.
As isoformas acil-CoA sintetase A e acil- CoA sintetase B mostraram se expressar de
forma temporal e quantitativa distinta, sendo que os transcritos da acil-CoA sintetase B serem
preferencialmente expressos em embriões. O maior índice de expressão da acil-CoA sintetase
A aconteceu no período de intensa síntese de lipídeos. Já a enzima acil-CoA sintetase B
expressou-se mais no fim do desenvolvimento das sementes. Como a síntese de triglicerídeos
é contínua e com diminuição de seu fluxo no fim do desenvolvimento, sugere-se que ambas
isoformas são essenciais na via metabólica.
Da mesma forma, transcritos de oleosina foram os mais embriões-específicos e
apresentaram acúmulo elevado nos estágios finais de desenvolvimento dos embriões (a partir
de 90 dias), quando ocorre o início do acúmulo de lipídeos de armazenamento.
5.11 Acumulação de ácido esteárico em Theobroma cacao
Durante o desenvolvimento dos embriões de Theobroma cacao, a composição de
ácido palmítico mostrou-se constante, enquanto que o ácido oleico e ácido esteárico
aumentaram significativamente entre 100 e 110 DAP. A porcentagem dos ácidos graxos
poliinsaturados (18:2 e 18:3) foi inversamente proporcional, pois diminuiu a partir dos 110
DAP, indicando uma alateração de biossíntese de óleos com composição mais próxima a
lipídeos de membranas do que lipídeos de armazenamento. Os transcritos do gene
diretametne associado à síntese de palmitato (acil-ACP tioesterase B), demonstrou menor
valor de acúmulo e constância durante todo o período de desenvolvimento dos frutos. As
enzimas diretamente relacionadas à síntese e/ou acúmulo de ácido esteárico são a β-cetoacil-
ACP sintase II, a
Δ9
estearoil-ACP desaturase B e a enzima, a qual possui especificidade pelo
substrato 18:1-ACP, mas uma menor atividade em 18:0-ACP e 16:0-ACP (FACCIOTTI et al.,
1999; OHLROGGE; JAWORSKI, 1997).
O período de aumento na quantidade de transcritos das enzimas β-cetoacil-ACP
sintase II, acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B e da quantidade de ácido esteárico é
também concomitante ao aumento da expressão do gene codificador da
D9
estearoil-ACP
desaturase B, e do aumento da quantidade de ácido oleico e esteárico.
96
Patel (1993) estudando a expressão da
Δ9
estearoil-ACP desaturase durante o
desenvolvimento de embriões de T. cacao, observou maiores níveis de transcritos entre 95 e
105 DAP. A autora concluiu que a diminuição nos ácidos graxos insaturados e aumento de
18:0 pode ocorrer mesmo com intensa produção de
Δ9
estearoil-ACP desaturase. Duas
hipóteses são consideradas, sendo que ou a
Δ9
estearoil-ACP desaturase pode não conseguir
insaturar todos os substratos estearoil-ACP, ou a acil-ACP tioesterase B hidrolisa rapidamente
os estearoil-ACP; não fornecendo substrato para a ação das desaturases.
Com os dados obtidos no presente estudo, sugere-se que a acumulação de transcritos
da
Δ9
estearoil-ACP desaturase foi relacionada ao aumento do ácido oleico que acontece pela
ação conjunta da
Δ9
estearoil-ACP desaturase,
Δ12
oleatoil-ACP desaturase e acil-ACP
tioesterase A.
Os resultados deste trabalho sugerem um mecanismo de acumulação de ácido
esteárico, pela análise temporal da expressão dos genes codificadores das enzimas β-cetoacil-
ACP sintase II, acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B. A expressão da β-cetoacil-
ACP sintase II apresentou pico aos 100 DAP e a acil-ACP tioesterase A teve pico de
expressão aos 110 DAP, mas aos 100 DAP mostrou-se fortemente expressa. A acil-ACP
tioesterase B mostrou menor quantidade de transcritos com tendência de aumento de 100 aos
130DAP. O período de maior acumulação de transcritos destas enzimas coincidem com o
aumento do ácido esteárico, o qual aos 100 DAP apresentava-se em 3,2% e aos 110 DAP
chegou a 26,3 e em 120 DAP 37,0%. Desta maneira, a enzima β-cetoacil-ACP sintase II aos
100 DAP possivelmente fornece o máximo de substratos 18:0-ACP, que é hidrolizado pela
enzima acil-ACP tioesterase A, que mesmo tendo preferência pelo substrato 18:1, agem
hidrolisando estearóil-ACP, sendo compensada por apresentar maior quantidade de
transcritos.
Silva et al. (2005) estudando a expressão gênica das principais enzimas envolvidas na
síntese de ácidos graxos em Theobroma cacao, com a técnica de northern blot estabeleceu um
modelo para a acumulação de ácido esteárico em sementes de cacau. Considerou que a
expressão contínua e crescente de β-cetoacil-ACP sintase II fornece o substrato 18:0-ACP, e
assumindo-se que a expressão da
Δ9
estearoil-ACP desaturase (medida anteriormente por
western blot por Patel, 1993) diminui por volta de 115–120 DAP, juntamente com a acil-ACP
tioesterase A; ocorre um desbalanceamento entre a expressão dos genes codificadores destas
enzimas, garantindo o acúmulo de estearato. Comparando os resultados de Silva (2005) com
os do presente trabalho, assume-se que o modelo de acumulação de ácidos esteárico foi
confirmado, considerando-se que o padrão de expressão entre os dois estudos foi semelhante.
97
6. CONCLUSÕES
De forma a identificar genes de referência para estudos de expressão gênica em
Theobroma cacao, foram investigados os valores de estabilidade dos genes codificadores das
enzimas/proteínas gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteína ribossomal L35
(RPL35), actina (ACT), beta tubulina 5 (TUB5), malato desidrogenase (MDH), fator de
elongação 1-alfa (EF1α) e poliubiquitina (PUB) nos embriões de Theobroma cacao em
desenvolvimento e em sete outros tecidos: raiz, caule, ápice vegetativo, folha expandida, folha
em expansão, flor e epicarpo. Por meio de análise empregando os softwares GeNorm e
NormFinder, os três genes mais estáveis para análises de expressão gênica em embriões de T.
cacao foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Quando se considera diversos tecidos de Theobroma
cacao, os três melhores genes para se normalizar os valores de expressão são os codificadores
da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase.
De acordo com as funções fundamentais exercidas na biossíntese de ácidos graxos e
principalmente de ácidos esteárico, foram estudados os níveis de acumulação de transcritos
dos principais genes desta via metabólica: três isoformas da proteína carregadora de acil (ACP
A, ACP B e ACP C), β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II), duas isoformas da
Δ9
estearoil-ACP
desaturase (SAD A e SAD B), Acil-ACP tioesterase A (Fat A), Acil-ACP tioesterase B (Fat
B), duas isoformas da acil-CoA sintetase (ACS A e ACS B) e a proteína oleosina (OLEO). A
expressão destes genes foi medida em embriões nos estágios de desenvolvimento referentes a
60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 e 160 DAP. Raiz, caule, ápice vegetativo, folhas
expandidas, folhas em expansão, flor e epicarpo foram usados para certificar a ação tecido-
específica dos genes estudados. Desta maneira, concluiu-se que em geral, os genes
pertencentes ao metabolismo de lipídeos, analisados nos embriões de Theobroma cacao
mostraram expressão em todas as amostras. Já os mesmos genes quando medidas as
expressões nos demais tecidos, mostraram menores quantidades de transcritos, com
expressões baixas ou nulas na maioria das amostras. Os genes codificadores da proteína
carregadora de acil A, B e C expressaram-se de forma homogênea em todos os tecidos, pois
trata-se de uma proteína indispensável na biossíntese de ácidos graxos. A expressão dos genes
codificadores das enzimas β-cetoacil-ACP sintase II,
Δ9
estearoil-ACP desaturase B, acil-ACP
tioesterases B, acil-ACP tioesterases A, acil-CoA sintetase B e oleosina mostraram-se
98
preferencial ou específica em embriões de Theobroma cacao. Já os genes
Δ9
estearoil-ACP
desaturase A e acil-CoA sintetase B, mostraram expressão em embriões, mas também em
outros tecidos.
A acumulação de transcritos da
Δ9
estearoil-ACP desaturase foi relacionada ao aumento
de ácido oleico e que acontece pela ação conjunta da
Δ9
estearoil-ACP desaturase, e acil-ACP
tioesterase A, a qual mostra maiores níveis de transcritos entre 90 e 140 DAP com pico aos
100 DAP.
O aumento de ácidos esteárico estaria relacionado com a ação conjunta e com
transcrição temporalmente coordenada dos genes das enzimas β-cetoacil-ACP sintase II, Acil-
ACP tioesterase A e Acil-ACP tioesterase B. Transcritos da enzima β-cetoacil-ACP sintase II
apresentam pico aos 100 DAP, possivelmente com acúmulo máximo de substratos 18:0-ACP,
que podem ser hidrolizados preferencialmente pela enzima acil-ACP tioesterase A, ou acil-
ACP tioesterase B. Esse resultado corrobora o modelo de acumulação de estearato criado por
Silva (2005).
99
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108
APÊNCICES
109
APÊNDICE A – Sequências usadas na construção dos iniciadores referentes aos genes
codificadores da proteína carregadora de acil A (ACP A), β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II),
acil-ACP tioesterase tipo B (Fat B) e oleosina. Os iniciadores estão sublinhados e em negrito.
Sequência referente ao gene codificador da proteína carregadora de acil A
>BIEM-NT-001-018-D02-CE.F
CCACGCGTCCGCCCAGGTTCGACTCGAGTCGGAAACAGAAATGGCACTCATAGCAGCCGTACTTCGCCACATTCGAGTACCTG
TTCGAACCCTAGCTGCAACCGGATCAAAACCTCAGCTGCAATGGAGTCTCTGCAATTCCATCAGGTTATTTTCATCGGACGAC
GATCACCTAACGAAAGAGGAAGTAATCGACAGAGTCCTCGACGTCGTCAAAAGCTTCCCCAAAGTCGATCCGTCCAAGGTGAC
ACCTCATGTCCATTTCCAAAACGATTTGGGCTTGGATAGCTTGGACAATGTGGAGATTGTAATGGCATTAGAAGAGGAGTTCA
AGCTGGAAATTCCAGACAAGGAAGCTGACAAGATTGACTCATGTAATCTCGCTATTGCGTACATATATAACCATCCAATGGCT
GGTTAATCTGTGGAAAGCAAGGGTGTCTCGTTGAATTTCATTCAAAAAGAAGAACGATGTCTTCTACTCTGTTTTGGTGTTCA
ATATTTTAGGTGTTTGTATCAAATTTACTCCTCATAATGAGATTAAGACTGACAATCTGAATCTGTNTTGGTGGGGTACTACC
TGAACTTGTNTCTAGCACCAAACAACAGCAGATTTCAACTCGCAATAAACTTTTTGTATTGCATGGTGACTTTCTTCACCTTT
CAAGTACTTCTTTTCACATTTGCCGTTGTCCTGACATTGTCAATGGTTTC
Sequência referente ao gene codificador da β-cetoacil-ACP sintase II (KAS II)
>BIEM-NT-001-014-C06-CE.F
ATTCAGAACAGAACAGAACAAAATCTCTCATTGCTGATTAGCCTTTTAAATAAAATAAGTTTAAAGAAAAAAAAAATGAAATT
GGTCCAGACTTCTTTGGCTATCTAGAATCCAACTCAAAATTATTACAACACTAACGATTACAAATTGCTCAAGAAAGTTACAA
GAATGAAGCAGCCTGATCACAGATTAATAGCTGACTCATCTTCCATAATAAATGCAAACTAAGTGACCAACCACCGATGAGAT
TTTCATGGCTTGAAAGCAGAAAATGCCACGACCGAGTTGTGTCCACCAAATCCAAAAGAGTTGGAAATTGCAACATTAACCTC
ATGCTGCTGCTTTACATTGGCAACAGTGTCAAACTCAACTGAAGGCTCTGGATTAAATTGATTTATGGAGGGATGCAGCCATC
CTGTCGTAATGGCCTTCACAGTGGCAATGGCTTCTAAACCACCCGCTGCACCCAGGCAGTGCCCTATCATAGACTTTGTTGCA
TTGATTTTGATGTCTGATGTATTCTTGAATACTTTTTTAATAGCATTTATCTCAGNCAGGTCACCAGCAAGGGTAGAAGTNGC
ATGTGCGTTAATATGGTTACCTCCTCAGGGGACACACAGCATCTTCAAGGCTTCTCTCAATGCAGGAAGACACCCCAAGACCA
TCAGCTCTTGGATCAGTCATATGATAAGCATC
Sequência referente ao gene codificador da acil-ACP tioesterase tipo B (Fat B)
>BIEM-NT-001-001-C01-CE.F
GGCACCGGTCGGTCGGAATCCGGGTCGACCACGCGTCNGAATCTCTCTCTCTCTCTCTCCAAAAACTAAAAGAAAAGTTTTTT
TACTTTTTTTTTCGTATTTTTCTTAATTTCGTTACTTTTGAAATTCGAAACAGGATTTCAGAAAAATATAAAACTCTTCAAAA
AGCCAGAAAGAAAGCGAAGACGAGAGAAAGGAAAAAGTAGTGCTAGATCGCAAGCCCTAGAAGTAGCGAGAAGGGTTTGTAGA
TCCTAAATAACGCAATAGCTTCTACTCTTTGCATTGTTCTCGAGAAAATTTCCCTCATTGATTCGTCTGGTTTTTTTTTGGTT
GAGTTGGAGGATGCAGCAGTTGCTTCTTTAAAAAGCTTACACTTTGCAGAAGAGGGAATTTAACGGAACATTGCTGTGTTAGC
GGATAATTGAGGTTTTTAAATTTTCAAAATCATGGTTGCTACTGCTGCTACATCTGCATTCTTTCCGGTCACTTCATCCCCGG
ACTCCTCTGACTCGAAAAACAAGAAGCTTGGAAGTGGATCTACTAACCTTGGAGGTATCAAGTCGAAACCATCTACTTCTTCT
GGAATTTTGCAAGTCAAGGCAAATGCTCAAGCTCCTCCAAAAATAAATGGTACCACGGTCGTGACAACTCCAG
110
Sequência referente ao gene codificador da oleosina
>BIEM-NT-001-008-E03-CE.F
TCGGGTAGAAACAGCGTCCGATTCTTATTCCTTCGATTTAAAGAAGTTTGAACTATTTGCAACCATGGCTGAGCACCTCCAGC
TGCAGCCCCAATACCATCACCCGTACTCTCAACCAAGGTCCCACCAGATGGTGAAGGCGGCTACTGCTGCCACTGCTGGAGGA
TCCCTTCTAATCCTCTCCGGTTTGATCCTTGCTGGTACGGTTATTGCACTCACCATTGCTACTCCACTCTTTGTCATATTCAG
TCCGGTTCTTGTCCTCGCTCTCATTGGCGCAGCTCTCCTGGTGACAGGTTTCATGGCTTCTGGCGGTTTCGGTGTCGCAGCTA
TTACTGTGCTGTCATGGATTTATAGGTATGTTACCGTGGGGCACCCACCAGGAGCGGATCAGTTGGACCAGGCGCGTATGAGG
CTGGCTAGAAAGGCTCGGGAGATGAACGAAAGGCCTGAGCAGCTCACCAGTGCAGCGGCTTCGTAGTTTGTGCTGCTTAATTA
GCAATTGATCGTTACCTAGCTAGGATCAAATGGCTATCATACAAGTCCTTCTCTTAAGTCTTAAGTCATTAGAATGTTCCTGT
TATTTCTATGACAATGTTCTGAATTTGGAAGGCNACCACANAGAAAGTCTGAACTTGGATCTGNGTCTGNTGAAGACTGAAGT
AATTTACTGTCATAAGCAGNTGTTACTTGNTATTGCTGCTATCCGNNGAAGTGGNTNTANTNTAATATTTTCTG
111
APÊNDICE B - Sequências referentes às proteínas carregadoras de acil B e C (ACP B e ACP
C),
Δ9
estearoil-ACP desaturase (SAD A e SAD B), acil-ACP tioesterase tipo A (Fat A) e acil-
CoA sintetase (ACS A e ACS B) ClustalW (http://align.genome.jp/) para a identificação das
regiões mais conservadas e assim, realizar a construção dos iniciadores. Marcados em
cinza,estão os iniciadores correspondentes.
Alinhamento realizado no programa ClustalW das sequências correspondentes a proteína
carregadora de acil B (ACP B)
KZ0AAT4YN04FM1| 1 GAACGTCTACCCATTTTCACCCAAGAGAGAGGGCTACTTATCGAAATGGCGGCAGTGAGA
KZ0AAT5YN04FM1| 1 GAACGTCTACCCATTTTCACCCAAGAGAGAGGGCTACTTATCGAAATGGCGGCAGTGAGA
KZ0AAV7YJ06FM1| 1 GAACGTCTACCCATTTTCACCCAAGAGAGAGGGCTACTTATCGAAATGGCGGCAGTGAGA
KZ0ACAK2YA09FM1| 1 GAACGTCTACCCATTTTCACCCAAGAGAGAGGGCTACTTATCGAAATGGCGGCAGTGAGA
KZ0AAV10YP23FM1| 1 ------------------------------------------------------------
consensus 1 gaacgtctacccattttcacccaagagagagggctacttatcgaaatggcggcagtgaga
KZ0AAT4YN04FM1| 61 GGAGCTTTGCTAAAGCACTTGAGGGTGAACGCAACGCCCCTTGCCCGTAACCCTAACCCT
KZ0AAT5YN04FM1| 61 GGAGCTTTGCTAAAGCACTTGAGGGTGAACGCAACGCCCCTTGCCCGTAACCCTAACCCT
KZ0AAV7YJ06FM1| 61 GGAGCTTTGCTAAAGCACTTGAGGGTGAACGCAACGCCCCTTGCCCGTAACCCTAACCCT
KZ0ACAK2YA09FM1| 61 GGAGCTTTGCTAAAGCACTTGAGGGTGAACGCAACGCCCCTTGCCCGTAACCCTAACCCT
KZ0AAV10YP23FM1| 1 -----------------------GGTGAACGCAACGCCCCTTGCCCGTAACCCTAACCCT
consensus 61 ggagctttgctaaagcacttgagGGTGAACGCAACGCCCCTTGCCCGTAACCCTAACCCT
KZ0AAT4YN04FM1| 121 ACCAGTCACGGGCTCTTTGCTCTTACCTTCAACGCCATACGCCGCCGTTTCTGCGATGAG
KZ0AAT5YN04FM1| 121 ACCAGTCACGGGCTCTTTGCTCTTACCTTCAACGCCATACGCCGCCGTTTCTGCGATGAG
KZ0AAV7YJ06FM1| 121 ACCAGTCACGGGCTCTTTGCTCTTACCTTCAACGCCATACGCCGCCGTTTCTGCGATGAG
KZ0ACAK2YA09FM1| 121 ACCAGTCACGGGCTCTTTGCTCTTACCTTCAACGCCATACGCCGCCGTTTCTGCGATGAG
KZ0AAV10YP23FM1| 38 ACCAGTCACGGGCTCTTTGCTCTTACCTTCAACGCCATACGCCGCCGTTTCTGCGATGAG
consensus 121 ACCAGTCACGGGCTCTTTGCTCTTACCTTCAACGCCATACGCCGCCGTTTCTGCGATGAG
KZ0AAT4YN04FM1| 181 GTCAAGGGCTCCTTCCTCGACAAATCTGAAGTCACCGATCGCGTCATCTCCGTTGTTAAA
KZ0AAT5YN04FM1| 181 GTCAAGGGCTCCTTCCTCGACAAATCTGAAGTCACCGATCGCGTCATCTCCGTTGTTAAA
KZ0AAV7YJ06FM1| 181 GTCAAGGGCTCCTTCCTCGACAAATCTGAAGTCACCGATCGCGTCATCTCCGTTGTTAAA
KZ0ACAK2YA09FM1| 181 GTCAAGGGCTCCTTCCTCGACAAATCTGAAGTCACCGATCGCGTCATCCCCGTTGTTAAA
KZ0AAV10YP23FM1| 98 GTCAAGGGCTCCTTCCTCGACAAATCTGAAGTCACCGATCGCGTCATTTCCGTTGTTAAA
consensus 181 GTCAAGGGCTCCTTCCTCGACAAATCTGAAGTCACCGATCGCGTCATctCCGTTGTTAAA
Continua
112
KZ0AAT4YN04FM1| 241 AACTTCCAGAAAGTTGATCCTTCCAAGGTTAACCCAAATGCGCATTTTCAAAATGATCTT
KZ0AAT5YN04FM1| 241 AACTTCCAGAGAGTTGATCCTTCCAAGGTTAACCCAAATGCGCATTTTCAAAATGATCTT
KZ0AAV7YJ06FM1| 241 AACTTCCAGAAAGTTGATCCTTCCAAGGTTAACCCAAATGCGCATTTTCAAAATGATCTT
KZ0ACAK2YA09FM1| 241 AACTTCCAGAAAGTTGATCCTTCCAAGGTTAACCCAAATGCGCATTTTCAAAATGATCTT
KZ0AAV10YP23FM1| 158 AACTTCCAGAAAGTTGATCCTTCCAAGGTTAACCCAAATGCGCATTTTCAAAATGATCTT
consensus 241 AACTTCCAGAaAGTTGATCCTTCCAAGGTTAACCCAAATGCGCATTTTCAAAATGATCTT
KZ0AAT4YN04FM1| 301 GGATTGGATAGTTTAGACACTGTGGAGGTTGTCATGGCCCTTGAAGAAGAATTTGGGTTC
KZ0AAT5YN04FM1| 301 GGATTGGATAGTTTAGACACTGTGGAGGTTGTCATGGCCCTTGAAGAAGAATTTGGGTTC
KZ0AAV7YJ06FM1| 301 GGATTGGATAGTTTAGACACTGTGGAGGTTGTCATGGCCCTTGAAGAAGAATTTGGGTTC
KZ0ACAK2YA09FM1| 301 GGATTGGATAGTTTAGGCACTGTGGAGGTTGTCATGGCCCTTGAAGAAGAATTTGGGTTC
KZ0AAV10YP23FM1| 218 GGATTGGATAGTTTAGACACTGTGGAGGTTGTCATGGCCCTTGAAGAAGAATTTGGGTTC
consensus 301 GGATTGGATAGTTTAGaCACTGTGGAGGTTGTCATGGCCCTTGAAGAAGAATTTGGGTTC
KZ0AAT4YN04FM1| 361 GAGATTCCTGATAATGAGGCAGACAAGATCAGCACAATCAATCTTGCTGTTGAGTTCATT
KZ0AAT5YN04FM1| 361 GAGATTCCTGATAATGAGGCAGACAAGATCAGCACAATCAATCTTGCTGTTGAGTTCATT
KZ0AAV7YJ06FM1| 361 GAGATTCCTGATAATGAGGCAGACAAGATCAGCACAATCAATCTTGCTGTTGAGTTCATT
KZ0ACAK2YA09FM1| 361 GAGATTCCTGATAATGAGGCAGACAAGATCAGCACAATCAATCTTGCTGTTGAGTTCATT
KZ0AAV10YP23FM1| 278 GAGATTCCTGATAATGAGGCAGACAAGATCAGCACAATCAATCTTGCTGTTGAGTTCATT
consensus 361 GAGATTCCTGATAATGAGGCAGACAAGATCAGCACAATCAATCTTGCTGTTGAGTTCATT
KZ0AAT4YN04FM1| 421 GCTTCTCACCCTCAGGCAAAGTAGGTGGGAAATTACGAAGCTCTACTCTTTATATTTTGT
KZ0AAT5YN04FM1| 421 GCTTCTCACCCTCAGGCAAAGTAGGTGGGAAATTACGAAGCTCTACTCTTTATATTTTGT
KZ0AAV7YJ06FM1| 421 GCTTCTCACCCTCAGGCAAAGTAGGTGGGAAATTACGAAGCTCTACTCTTTATATTTTGT
KZ0ACAK2YA09FM1| 421 GCTTCTCACCCTCAGGCAAAGTAGGTGGGAAATTACGAAGCTCTACTCTTTATATTTTGT
KZ0AAV10YP23FM1| 338 GCTTCTCACCCTCAGGCAAAGTAGGTGGGAAATTACGAAGCTCTACTCTTTATATTTTGT
consensus 421 GCTTCTCACCCTCAGGCAAAGTAGGTGGGAAATTACGAAGCTCTACTCTTTATATTTTGT
KZ0AAT4YN04FM1| 481 TTTCACTTTGTTCCTGTGAGATCAAGAGCTGCATTAGGAGAATTATGGGATCTTCCCATC
KZ0AAT5YN04FM1| 481 TTTCACTTTGTTCCTGTGAGATCAAGAGCTGCATTAGGAGAATTATGGGATCTTCCCATC
KZ0AAV7YJ06FM1| 481 TTTCACTTTGTTCCTGTGAGATCAAGAGCTGCATTAGGAGAATTATGGGATCTTCCCATC
KZ0ACAK2YA09FM1| 481 TTTCACTTTGTTCCTGTGAGATCAAGAGCTGCATTAGGAGAATTATGGGATCTTCCCATC
KZ0AAV10YP23FM1| 398 TTTCACTTTGTTCCTGTGAGATCAAGAGCTGCATTAGGAGAATTATGGGATCTTCCCATC
consensus 481 TTTCACTTTGTTCCTGTGAGATCAAGAGCTGCATTAGGAGAATTATGGGATCTTCCCATC
Concluído
113
Alinhamento realizado no programa ClustalW das sequências correspondentes a proteína
carregadora de acil C (ACP C)
KZ0ACAA10YN10FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP6YA04FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YN13FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP10YF21FM1| 1 ------------------------------------------------------CAAATG
KZ0AAQ4YG22FM1| 1 CATTTTTTCTTCTTCAACACTCT-------------------------------CAAATG
KZ0ABB16YJ11FM1| 1 -----------------CACTCT-------------------------------CATATG
KZ0AAV7YM01FM1| 1 CTGTCTTTCTCTCAGATCTCTCTTCCTCTTTCCTTGAATCTATCGTAATCGATTCTAATG
KZ0ACAA10YN10FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP6YA04FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YN13FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP10YF21FM1| 7 GCATCCATGGCTGGTTCATCAATCTCCATGCAGCCTCGCCCCACCCCGGCTACAACCAGG
KZ0AAQ4YG22FM1| 30 GCATCCATGGCTGGTTCATCAATCTCCATGCAGCCTCGCCACACCCTGGCTACAACCAGG
KZ0ABB16YJ11FM1| 13 GCATCCATGGCTGGTTCATCAATCTCCCTGCAGCCTCGCCACACCCTGGCTACAACCAGG
KZ0AAV7YM01FM1| 61 GCTTCTACAACTGGTGCTTCATTG-AAATTCACTTCCCTTTCTTCTTTCAAGCAGACACA
KZ0ACAA10YN10FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP6YA04FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YN13FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP10YF21FM1| 67 GTTTTTGGCTTGAAGTTGGTTTCATTTATGAACCAGGGAAGAAGCAGCCTCTCATTTAAT
KZ0AAQ4YG22FM1| 90 GTTTCGGGCTTGAAGTTGGTTTCATTTATGAACCAGGGAAGAAGCAGCCTCTCATTTAAT
KZ0ABB16YJ11FM1| 73 GTTTCTGGCTTGAAGTTGGTTTCATTTATGAACCAGGGAAGAAGCAGCCTCTCATTTAAT
KZ0AAV7YM01FM1| 120 GGTTCCTCTTCGTGG--GGTCTCCAATGTCAACTCAG---TCAGCTTCCCATCTCTTAGA
KZ0ACAA10YN10FM1| 1 --------------------------------------TGCCAAACCAGAGAGGGTGGAT
KZ0AAP6YA04FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YN13FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAP10YF21FM1| 127 TTGCGTCCAATGCCTGCTCGCTTGCGGATTTCCTGTGCTGCCAAACCAGAGACTGTGGAT
KZ0AAQ4YG22FM1| 150 TTGCGTCCAATGCCTGCTCGCTTGCGGATTTCCTGTGCTGCCAAACCAGAGACTGTGGAT
KZ0ABB16YJ11FM1| 133 TTGCGTCCAATGCCTGCTCGCTTGCGGATTTCCTGTGCTGCCAAACCAGAGACTGTGGAT
KZ0AAV7YM01FM1| 175 ATGCGACCAGGGTCATTGCGCTTCCGCGTTTCCTGCGCGGCCAAACCAGAGACAGTGAAC
KZ0ACAA10YN10FM1| 23 TAGGTATGTGCAATGGTAAGGAAACAACTGGTTTTACCAAATGGCAAACCAGTCACTGGT
KZ0AAP6YA04FM1| 1 ------------------------------------------------------------
Continua
114
KZ0ACAA9YN13FM1| 1 ------------CGGGTAAGGAAACAACTGGCTCTACCAAATGACAAACCAGTCACTGGT
KZ0AAP10YF21FM1| 187 AAGGTATGTGCAATAGTAAGGAAACAACTAGCTTTACCAAATGACAAACCAGTCACTGGT
KZ0AAQ4YG22FM1| 210 AAGGTATGTGCAATAGTAAGGAAACAACTGGCTCTACCAAATGACAAACCAGTCACTGGT
KZ0ABB16YJ11FM1| 193 AAGGTATGTGCAATAGTAAGGAAACAACTAGCTCTACCAAATGACAAACCAGTCACTGGT
KZ0AAV7YM01FM1| 235 AAAGTTTGTGAAATAGTGAGGAAGCAACTGGCACTACCTGATGATTCTTCCGTCACCGGG
KZ0ACAA10YN10FM1| 83 GATTCAAAATTTGCTGACCTTGGAGCTGATTCCCTTGATACGGTTGAGATTGTGATGGGA
KZ0AAP6YA04FM1| 1 ---------------------------GATTCCCTTGATACGGTTGAGATTGTGATGGGA
KZ0ACAA9YN13FM1| 49 GATTCAAAATTTGCTGACCTTGGAGCTGATTCCCTTGATACGGTTGAGATTGTGATGGGA
KZ0AAP10YF21FM1| 247 GATTCAAAATTTGCTGACCTTGGAGCTGATTCCCTTGATACGGTTGAGATTGTGATGGGA
KZ0AAQ4YG22FM1| 270 GATTCAAAATTTGCTGACCTTGGAGCTGATTCCCTTGATACGGTTGAGATTGTGATGGGA
KZ0ABB16YJ11FM1| 253 GATTCAAAATTTGCTGACCTTGGAGCTGATTCCCTTGATACGGTTGAGATTGTGATGGGA
KZ0AAV7YM01FM1| 295 GAGTCAAAGTTTTCTACACTTGGAGCTGATTCCCTTGACACGGTCGAGATTGTGATGGGA
KZ0ACAA10YN10FM1| 143 ATTGAGGAAGAATTTGGAATTGCTGTGGAAGAGGACAATGCCCAAAGCATCACAACTGTT
KZ0AAP6YA04FM1| 34 ATTGAGGAAGAATTTGGAATTGCTGTGGAAGAGGACAATGCCCAAAGCATCACAACTGTT
KZ0ACAA9YN13FM1| 109 ATTGAGGAAGAATTTGGAATTGCTGTGGAAGAGGACAATGCCCAAAGCATCACAACTGTT
KZ0AAP10YF21FM1| 307 ATTGAGGAAGAATTTGGAATTGCTGTGGAAGAGGGCAATGCCCAAAGCATCACAACTGTT
KZ0AAQ4YG22FM1| 330 ATTGAGGAAGAATTTGGAATTGCTGTGGAAGAGGACAATGCCCAAAGCATCACAACTGTT
KZ0ABB16YJ11FM1| 313 ATTGAGGAAGAATTTGGAATTGCTGTGGAAGAGGACAATGCCCAAAACATCAAAGCTGTT
KZ0AAV7YM01FM1| 355 C-----------------------------------------------------------
KZ0ACAA10YN10FM1| 203 CAGGATGCTGCAGATCTTGTAGAGAAGCTCTGCAGCGAGAAAAGTGCCTAGAGAATAGGA
KZ0AAP6YA04FM1| 94 CAGGATGCTGCAGATCTTGTAGAGAAGCTCTGCAGCGAGAAAAGTGCCTAGAGAATAGGA
KZ0ACAA9YN13FM1| 169 CAGGATGCTGCAGATCTTGTAGAGAAGCTCTGCAGCGAGAAAAGTGCCTAGAGAATAGGA
KZ0AAP10YF21FM1| 367 CAGGATGCTGCAGATTTTGTAGAGAAGCTTTGCAGCGAGAAAAGTGCCTAGAGAATAGGA
KZ0AAQ4YG22FM1| 390 CAGGATGCTGCACATCATGTAGAGAAGCTCTGCAACGAGAAAAGTGCCTAGAGAATAGCA
KZ0ABB16YJ11FM1| 373 CAGGAAGCTG--------------------------------------------------
KZ0AAV7YM01FM1| ------------------------------------------------------------
Concluído
115
Alinhamento realizado no programa ClustalW das sequências correspondentes a enzima
Δ9
estearoil-ACP desaturase A (SAD A)
KZ0AAS8YE23FM1| 1 ATAGCCAGAGGGGTCTTAAGCACCAAATAAGCAGAGAAAAAAACCAGAACCAAGCAAACG
KZ0ABE2YI15FM2| 1 ATAGCCAGAGGGGTCTTAAGGACCAAATAAGCAGAGAAAAAAACCAGAACCAAGCAAACG
KZ0AAS8YE23FM1| 61 CAGAACAAATGGCTCTGAAATTGAATCCCATCACTTCTCAATCTCAGAAACTTCCGTATT
KZ0ABE2YI15FM2| 61 CAGAACAAATGGCTCTGAAATTGAATCCCATCACTTCTCAATCTCAGAAACTTCCGTATT
KZ0AAS8YE23FM1| 121 TTGCTCTTCCACCAATGGCCAGCCTCAGATCTCCCAAGTTTTTCATGGCCTCCACTCTTC
KZ0ABE2YI15FM2| 121 TTGCTCTTCCACCAATGGCCAGCCTCAGATCTCCCAAGTTTTTCATGGCCTCCACTCTTC
KZ0AAS8YE23FM1| 181 GTTCTGGCTCCAAAGAGGTTGAGAATGTCAAAAAGCCTTTCATGCCTCCTCGGGAGGTGC
KZ0ABE2YI15FM2| 181 GTTCTGGCTCCAAAGAGGTTGAGAATGTCAAAAAGCCTTTCATGCCTCCTCGGGAGGTTC
KZ0AAS8YE23FM1| 241 ATGTTCAGGTCACCCACTCCATGCCACCACAAAAGATTGAGATCTTTAAATCTTTGGAGA
KZ0ABE2YI15FM2| 241 ATGTTCAGGTCACCCACTCCATGCCACCACAAAAGATTGAGATCTTTAAATCTTTGGAGA
KZ0AAS8YE23FM1| 301 ACTGGGCTGAGCAGAACATTTTAGTTCACCTCAAACCAGTTGAGAAATGTTGGCAACCCC
KZ0ABE2YI15FM2| 301 ACTGGGCTGAGCAGAACATTTTAGTTCACCTCAAACCAGTTGAGAAATGTTGGCAACCCC
KZ0AAS8YE23FM1| 361 AGGATTTTCTTCCAAATCCTGCTTCTGATGGATTTGATGAGCAAGTAAAAGAACTAAGGG
KZ0ABE2YI15FM2| 361 AGGATTTTCTTCCAGATCCTGCTTCTGATGGATTTGATGAGCAAGTAAAAGAACTAAGGG
KZ0AAS8YE23FM1| 421 AAAGGGCTAAGGAGATTCCAGATGATTACTTTGTTGTTTTGGTTGGTGATATGATCACAG
KZ0ABE2YI15FM2| 421 AAAGGGCTAAGGAGATTCCAGATGATTACTTTGTTGTTTTGGTTGGTGATATGATCACAG
KZ0AAS8YE23FM1| 481 AGGAAGCCCTTCCAACTTACCAAACAATGCTTAATACCTTAGATGGAGTTCTTGATGAAA
KZ0ABE2YI15FM2| 481 AGGAAGCCCTTCCAACTTACCAAACAATGCTTAATACCTTAGATGGAGTTCTTGATGAAA
KZ0AAS8YE23FM1| 541 CGGGTGCTAGCCTCACCTCTTGGGCAATTTGGACGAGGGCATGGACAGCTGAAGAAAATA
KZ0ABE2YI15FM2| 541 CGGGTGCTAG--------------------------------------------------
KZ0AAS8YE23FM1| 601 GGCATGGTGATCTACTTAATAAGTATCTCTACTTGTCTGGAAGAGTGGACATGAGACAAA
KZ0ABE2YI15FM2| ------------------------------------------------------------
Continua
116
KZ0AAS8YE23FM1| 661 TTGAGAAGACAATCCAGTATTTGATTGGATCAGGAATGGATCC
KZ0ABE2YI15FM2| -------------------------------------------
Concluído
Alinhamento realizado no programa ClustalW das sequências correspondentes a enzima
Δ9
estearoil-ACP desaturase B (SAD B)
KZ0AAV9YN21FM1| 1 GTTTTGGTTGGTGATATGATCACAGAGGAAGCCCTTCCAACTTACCAAACAATGCTTAAT
KZ0ABB11YH03FM1| 1 GTTTTGGTTGGTGATATGATCACAGAGGAAGCCCTTCCAACTTACCAAACAATGCTTAAT
KZ0AAV9YN21FM1| 61 ACCTTAGATGGAGTTCTTGATGAAACGGGTGCTAGCCTCACCTCTTGGGCAATTTGGACG
KZ0ABB11YH03FM1| 61 ACCTTAGATGGAGTTCTTGATGAAACGGGTGCTGGCCTCACCTCTTGGGCAATTTGGACG
KZ0AAV9YN21FM1| 121 AGGGCATGGACAGCTGAAGAAAATAGGCATGGTGATCTACTTAATAAGTATCTCTACTTG
KZ0ABB11YH03FM1| 121 AGGGCATGGACAGCTGAAGAAAATAGGCATGGTGATCTACTTAATAAGTATCTCTACTTG
KZ0AAV9YN21FM1| 181 TCTGGAAGAGTGGACATGAGACAAATTGAGAAGACAATCCAGTATTTGATTGGATCAGGA
KZ0ABB11YH03FM1| 181 TCTGGAAGAGTGGACATGAGACAAATTGAGAAGACAATCCAGTATTTGATTGGATCAGGA
KZ0AAV9YN21FM1| 241 ATGGATCCCCGCACAGAAAACAGCCCTTATCTTGGATTCATCTACACATCATTCCAAGAA
KZ0ABB11YH03FM1| 241 ATGGATCCCCGCACAGAAAACAGCCCTTATCTTGGATTCATCTACACATCATTCCAAGAA
KZ0AAV9YN21FM1| 301 AGGGCAACTTTTATCTCCCATGGGAATACAGCCAGACTTGCCAAGGAGCATGGGGACTTT
KZ0ABB11YH03FM1| 301 AGGGCAACTTTTATCTCCCATGGGAATACAGCCAGACTTGCCAAGGAGCATGGGGACTTT
KZ0AAV9YN21FM1| 361 AAGTTGGTTCAAATATGTGGGACGATTGCCTCGGATGAAAGGCGCCATGAGACAGCTTAT
KZ0ABB11YH03FM1| 361 AAGTTGGCTCAAATATGTGGGACGATTGCCTCGGATGAAAGGCGCCATGAGACAGCTTAT
KZ0AAV9YN21FM1| 421 ACTAAAATCGTGGAAAAGCTCTTTGAGATTGATCCTGATGGTACTGTCCTGGCCTTTGCT
KZ0ABB11YH03FM1| 421 ACTAAAATCGTGGAAAAGCTCTTTGAGATTGATCCTGATGGTACTGTCCTGGCCTTTGCT
KZ0AAV9YN21FM1| 481 GACATGATG-AGAAAGAAAATCTCGATGCCTG-CCCACTTGATGTATGATGGCCGAGATG
KZ0ABB11YH03FM1| 481 GACATGATGGAGAAAGAAAATCTCGATGCCTGCCCCACTTGATGTATG------------
Continua
117
KZ0AAV9YN21FM1| 539 ACAACCTTTTCGACCACTTCTCAGCTGTTGCACAAAGACTTGGGGTTTACACTGCCAAGG
KZ0ABB11YH03FM1| ------------------------------------------------------------
KZ0AAV9YN21FM1| 599 ACTACGCTGATATTCTGGAGTTCCTGGTGGAGAGATGGAAGGTGAAGGAGCTGACTGGAC
KZ0ABB11YH03FM1| ------------------------------------------------------------
KZ0AAV9YN21FM1| 659 TTT
KZ0ABB11YH03FM1| ---
Concluído
Alinhamento realizado no programa ClustalW das seqüências correspondentes a enzima acil-
ACP tioesterase tipo A (Fat A)
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 1 AGGCTCCTGTCCTTGTTCCCCCAAGAAAATAAAAGAAGAGAGAGATGTTGAAGCTTTCCT
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 1 AGGCTCCTGTCTTTGTTCCCCAAAGAAAATAAAAGAAGAGAGAGATGTTGAAGCTTTCTT
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 1 AGGCTCCTGTCTTTGTTCCCCAAAGAAAATAAAAGAAGAGAGAGATGTTGAAGCTTTCTT
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 1 AGGCTCCTGTCTTTGTTCCCCAAAGAAAATAAAAGAAGAGAGAGATGTTGAAGCTTTCTT
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 1 -------------------------------------------------GAAGCTTTCTT
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 61 CCCTGCATGTGACCGGACCAAGACAGGCCTTGGCCCCATGCAGATTCCCTCGCTCCGCCG
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 61 CCTGCAATGTGACGGACCAAAGACAGGCCTTGGCCCAATGCAGATTCCTCGCTCCGCCTG
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 61 CCTGCAATGTGACGGACCAAAGACAGGCCTTGGCCCAATGCAGATTCCTCGCTCCGCCTG
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 61 CCTGCAATGTGACGGACCAAAGACAGGCCTTGGCCCAATGCAGATTCCTCGCTCCGCCTG
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 12 CCTGCAATGTGACGGACCAAAGACAGGCCTTGGCCCAATGCAGATTCCTCGCTCCGCCTG
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 121 CTCCCTTCTCCTTTCGCTGGCGTACCCCG-TCGTCGTCTCCTGCTCTCCTTCCAGCAGAC
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 121 CTCCGTTCTCCTTTCGCTGGCGTACCCCAGTCGTCGTCTCCTGCTCTCCTTCCAGCAGAC
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 121 CTCCGTTCTCCTTTCGCTGGCGTACCCCAGTCGTCGTCTCCTGCTCTCCTTCCAGCAGAC
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 121 CTCCGTTCTCCTTTCGCTGGCGTACCCCAGTCGTCGTCTCCTGCTCTCCTTCCAGCAGAC
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 72 CTCCGTTCTCCTTTCGCTGGCGTACCCCAGTCGTCGTCTCCTGCTCTCCTTCCAGCAGAC
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 180 CTAACCTGTCGCCTCTTCAAGTTGTCCTGTCGGGCCAGCAGCAAGCTGGGATGGAGCTGG
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 181 CTAACCTGTCGCCTCTTCAAGTTGTCCTGTCGGGCCAGCAGCAAGCTGGGATGGAGCTGG
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 181 CTAACCTGTCGCCTCTTCAAGTTGTCCTGTCGGGCCAGCAGCAAGCTGGGATTGAGCTGG
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 181 CTAACCTGTCGCCTCTTCAAGTTGTCCTGTCGGGCCAGCAGCAAGCTGGGATGGAGCTGG
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 132 CTAACCTGTCGCCTCTTCAAGTTGTCCTGTCGGGCCAGCAGCAAGCTGGGATGGAGCTGG
Continua
118
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 240 TCGAATCCGGGTCGGGGAGTTTGGCTGACCGGCTCCGGTTGGGTAGCTTGACGGAAGATG
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 241 TCGAATCCGGGTCGGGGAGTTTGGCTGACCGGCTCCGGTTGGGTAGCTTGACGGAAGATG
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 241 TCGAATCCGGGTCGGGGAGTTTGGCTGACCGGCTCCGGTTGGGTAGCTTGACGGAAGATG
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 241 TCGAATCCGGGTCGGGGAGTTTGGCTGACCGGCTCCGGTTGGGTAGCTTGACGGAAGATG
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 192 TCGAATCCGGGTCGGGGAGTTTGGCTGACCGGCTCCGGTTGGGTAGCTTGACGGAAGATG
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 300 GTTTGTCCTATAAGGAGAAGTTTATTGTGAGGTGTTATGAGGTGGGAATTAACAAAACTG
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 301 GTTTGTCCTATAAGGAGAAGTTTATTGTGAGGTGTTATGAGGTGGGAATTAACAAAACTG
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 301 GTTTGTCCTATAAGGAGAAGTTTATTGTGAGGTGTTATGAGGTGGGAATTAACAAAACTG
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 301 GTTTGTCCTATAAGGAGAAGTTTATTGTGAGGTGTTATGAGGTGGGAATTAACAAAACTG
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 252 GTTTGTCCTATAAGGAGAAGTTTATTGTGAGGTGTTATGAGGTGGGAATTAACAAAACTG
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 360 CCACTGTTGAAACCATTGCCAATCTCTTGCAGGAGGTTGGATGTAACCATGCTCAAAGTG
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 361 CCACTGTCGAAACCATTGCCAATCTCTTGCAGGAGGTTGGATGTAACCATGCTCAAAGTG
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 361 CCACTGTTGAAACCATTGCCAATCTCTTGCAGGAGGTTGGATGTAACCATGCTCAAAGTG
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 361 CCACTGTTGAAACCATTGCCAATCTCTTGCAGGAGGTTGGATGTAACCATGTTCAAAATG
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 312 CCACTGTTGAAACCATTGCCAATCTCTTGCAGGAGGTTGGATGTAACCATGCTCAAAGTG
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 420 TTGGATATTCCACAGATGGGTTTGCTACCACTCGCACCATGAGAAAATTGCATCTCATTT
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 421 TTGGATATTCCACAGATGGGTTTGCTACCACTCGCACCATGAGAAAATTGCATCTCATTT
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 421 TTGGATATTCCACAGATGGGTTTGCTACCACTCGCACCATGAGAAAATTGCATCTCATTT
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 421 TT----------------------------------------------------------
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 372 TTGGATATTCCACAGATGGGTTTGCTACCACTCGCACCATGAGAAAATTGCATCTCATTT
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 480 GAGTAACTGCACGCATGCACATTGAAATATACAAATACCCTGCTTGGAGTGATGTGATTG
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 481 GGGTAACTGCACGCATGCACATTGAAATATACAAATACCCTGCTTGGAGTGATGTGATTG
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 481 GGGTAACTGCACGCATGCACATTGAAATATACAAATACCCTGCTTGGAGTGATGTGATTG
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 ------------------------------------------------------------
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 432 GGGTAACTGCACGCATGCACATTGAAATATACAAATACCCTGCTTGGAGTGATGTGATTG
KZ0AAQ8YO09FM1|Br_FatA1 540 AAATAGAGACATGGTGCCAAAGTGAGGGAAGAATTGGAA---------------------
KZ0ABA10YN04FM1|Br_FatA1 541 AAATAGAGACATGGTGCCAA----------------------------------------
KZ0AAS7YC06FM1|Br_FatA1 541 AAATAGAGACATGGTGCCAAAGTGAGGGAAGAATTGGAACCAGAAGGGACTGGATTCTTA
KZ0ABA10YG11FM1|Br_FatA1 ------------------------------------------------------------
BIEM-NT-001-006-D04-CE.F 492 AAATAGAGACATGGTGCCAAAGTGAGGGAAGAATTGGAACCAGAAGGGACTGGATTCTTA
119
Alinhamento realizado no programa ClustalW das seqüências correspondentes a enzima acil-CoA
sintetase A (ACS A)
KZ0ACAA9YA14FM1| 1 AGGTGGGTATACAACATCTGACAAACCGATGCCTCGAGGAGAGGTTGTTGTTGGGGGATT
KZ0AAT4YP17FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAT10YC21FM1| 1 AGGTGGATATTTAACTAGTGATTCACCAATGCCTCGTGGAGAAATAGTGGTCGGTGGTCC
KZ0ACAA9YA14FM1| 61 TAGTGTAACCACTGGCTATTTCGACAATCCTGGAAAAACTAATGAAGTGTACAAGGTTGA
KZ0AAT4YP17FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAT10YC21FM1| 61 AAGTGTAACACTTGGATACTTCAAAATGGAAGAAAAAACAAAAGAAGTGTACAAGGTTGA
KZ0ACAA9YA14FM1| 121 TGAGAGGGGCATGCGCTGGTTTTACACTGGAGACATTGGACAATTTCATCCTGATGGATG
KZ0AAT4YP17FM1| 1 ------------------------------------------------TGCTGATGGTTG
KZ0AAT10YC21FM1| 121 TGAGAGAGGAATGAGGTGGTTCTATACTGGTGATATAGGACAGTTCCATGCTGATGGTTG
KZ0ACAA9YA14FM1| 181 CCTTGAGATTATTGATAGGAAAAAGGATATTGTCAAACTTCAACATGGAGAGTATATATC
KZ0AAT4YP17FM1| 13 CCTTGAGATAATTGACCGTAAAAAGGACATAGTCAAACTTCAGCACGGGGAATATGTCTC
KZ0AAT10YC21FM1| 181 CCTTGAGATAATTGACCGTAAAAAGGACATAGTCAAACTTCAGCACGGGGAATATGTCTC
KZ0ACAA9YA14FM1| 241 TCTTGGAAAGGTTGAGGCAGCACTGATCTTAAGTAACTTTGTTGACAATATGATGGTATA
KZ0AAT4YP17FM1| 73 TTTAGGAAAGGTTGAGGCTGCTCTCATCATCAGTACCTATGTCGACAATATTATGTTGCA
KZ0AAT10YC21FM1| 241 TTTAGGAAAGGTTGAGGCTGCTCTCATCATCAGTACCTATGTCGACAATATTATGTTGCA
KZ0ACAA9YA14FM1| 301 CGCAGATCCGTTTCACAATTATTGTGTAGCTTTAATTGTTCCATCACGCCCGGTTCTTGA
KZ0AAT4YP17FM1| 133 TGCTGATCCATTTCATAGTTATTGCGTGGCTCTTGTGGTGGCTTCTCAGCATGCAGTGGA
KZ0AAT10YC21FM1| 301 TGCTGATCCATTTCATAGTTATTGCGTGGCTCTTGTGGTGGCTTCTCAGCATGCAGTGGA
KZ0ACAA9YA14FM1| 361 GAAGTGGGCTCTAGAAGCTGGCATTAAGTACAAAGATTTTCCGGAGCTGTGTGGTAAACC
KZ0AAT4YP17FM1| 193 AGATTGGGCTTCAAAGCAAGGAGTTGCTTTCACTGATTTTGCAGACTTGTGTGAGAAGGA
KZ0AAT10YC21FM1| 361 AGATTGGGCTTCAAAGCAAGGAGTTGCTTTCACTGATTTTGCAGACTTGTGTGAGAAGGA
KZ0ACAA9YA14FM1| 421 TGAAACTGTTGGCGAGGTGCAACGGTCGCTTTCAAAGGTGGGAAAGGATGCAAAACTGGA
KZ0AAT4YP17FM1| 253 AGAAACTGTCAAGGAAGTACATTCGTCTCTCATTCAGATTGCCAAGAAGTCACGTTTGGA
KZ0AAT10YC21FM1| 421 AGAAACTGTCAAGGAAGTACATTCGTCTCTCGTTCAGATTGCCAAGAAGTCACGTTTGGA
Continua
120
KZ0ACAA9YA14FM1| 481 CAAGTTTGAAATACCTGCAAAGATTAAATTGCTGTCAGATCCATGGACACCTGAGTCTGG
KZ0AAT4YP17FM1| 313 GAAGTTTGAGATTCCTGCAAAAATCAAATTGCTTTCTACTCCTTGGACTCCAGAATCTGG
KZ0AAT10YC21FM1| 481 GAAGTTTGAGATTCCTGCAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------------
KZ0ACAA9YA14FM1| 541 ATTAGTTACTGCTGCTCTCAAAATAAAGAGG--GAACAGTTGAAGGCCAAGTTCAAAG--
KZ0AAT4YP17FM1| 373 CCTTGTCACTGCAGCTCTCAAGATCAAGCGAGAGGCCATTAGAAAAGCTTTCTCTGAAGA
KZ0AAT10YC21FM1| ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YA14FM1| 597 -----------------------------------------------------------A
KZ0AAT4YP17FM1| 433 CCTGGCTAAGTTATATACGTCATAGTTTCAAGAGGACTTAAGCTTCTACTGGTGACTTTG
KZ0AAT10YC21FM1| ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YA14FM1| 598 CGAACTCCAAAAGTTGTACGAGTAAAACATAATGATAAATTATATTTCACCATGATATGC
KZ0AAT4YP17FM1| 493 CCAATCTTGAAGAATGGAAGACTAGTGTGAGATAATATGATCAATCCTACATTTACACAT
KZ0AAT10YC21FM1| ------------------------------------------------------------
KZ0ACAA9YA14FM1| 658 TCTTTTTTTTGTGAA----------------------------
KZ0AAT4YP17FM1| 553 TCCTTGTTTTGTGTTTAACTATATATTCTTTCTTTTAGCTTTA
KZ0AAT10YC21FM1| -------------------------------------------
Concluído
Alinhamento realizado no programa ClustalW das seqüências correspondentes a enzima acil-
CoA sintetase B (ACS B)
KZ0AAQ6YG15FM1| 1 TGAGAGGCTTCGAATTTGCAAAAGCTGTGACTTTGGTGCTTGAACCATTCACAATGGAAA
KZ0AAS1YJ07RM1| 1 --------------------------GTGACTTTGGTGCTTGAACCATTCACAATGGAAA
KZ0AAP8YI16FM1| 1 ------------------------------------------------------------
KZ0AAQ6YG15FM1| 61 ATGGTCTTCTTACTCCGACATTTAAGATTAAGAGACCTCAAGCAAGGGATTATTTCGCAA
KZ0AAS1YJ07RM1| 35 ATGGTCTTCTTATTCCGCCATTTAAGATTAAGAGACCTCAAGCAAGGGAATATTTCGCAA
KZ0AAP8YI16FM1| 1 ------------------------------------------------------------
Continua
121
KZ0AAQ6YG15FM1| 121 AAGCAATTTCAAACATGTATGCAGAGCTTGCTACATCAGATCCCTCTCCTCAGAAGTAGT
KZ0AAS1YJ07RM1| 95 AAGCAATTTCAAACATGTATGCAGAGCTTGCTACATCAGATCCCTCTCCTCAGAAGTAGT
KZ0AAP8YI16FM1| 1 --------------------GCAGAGCTTGCTACATCAGATCCCTCTCCTCAGAAGTAGT
KZ0AAQ6YG15FM1| 181 TGTGAAGGCAATGCAATGAAAAAAATATAGAATCCATGACCAAGCACTCCAATGCAGAGA
KZ0AAS1YJ07RM1| 155 TGTGAAGGCAATGCAATGAAAAAAATATAGAATCCATGCCCAAGCACTCCAATGCAGAGA
KZ0AAP8YI16FM1| 41 TGTGAAGGCAATGCAATGAAAAAAATATAGAATCCATGACCAAGCACTCCAATGCAGAGA
KZ0AAQ6YG15FM1| 241 CGGACTGGCACCACTACATAATAAGACAGTGAGAGCCTAAAGTTGTCCTGATTTACCAAA
KZ0AAS1YJ07RM1| 215 CGGACTGGCCCCACTACATAATAAGCCAGTGAGAGCCTAAAGTTGTCCTGATTTACCAAA
KZ0AAP8YI16FM1| 101 CGGACTGGCACCACTACATAATAAGACAGTGAGAGCCTAAAGTTGTCCTGATTTACCAAA
KZ0AAQ6YG15FM1| 301 GCCTCCAACATAGTCTCATGTATGTTTTTAATCACCTATCTGAAAAATAAAATGGTTGAT
KZ0AAS1YJ07RM1| 275 GCCTCCAACATAGTTTCATGTATGTTTTTAATCCCCTTTCTGAAAAATAAAATGGTTGAT
KZ0AAP8YI16FM1| 161 GCCTCCAACATAGTTTCATGTATGTTTTTAATCACCTATCTGAAAAATAAAATGGTTGAT
KZ0AAQ6YG15FM1| 361 TTTTCCTTCTATTTTTCCCCTTCAAAGTGAGCATCCCTTCATTCAGCTACTTAACTGTAA
KZ0AAS1YJ07RM1| 335 TTTTCCTTTTATTTTTCCCCTTCAAAGTGAGCATCCCTTCATTCAGCTACTTAACTGTAA
KZ0AAP8YI16FM1| 221 TTTTCCTTCTATTTTTCCCCTTCAAAGTGAGCATCCCTTCATTCAGCTACTTAACTGTAA
KZ0AAQ6YG15FM1| 421TTATTCTCTTCATAAACAGTTGTACACTTAATAAGGAATATAATTTTTATCAGGATCAGG
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