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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
EFEITOS DA INJEÇÃO INTRACEREBRAL DE ANTAGONISTAS
DE RECEPTORES MUSCARÍNICOS, SEROTONINÉRGICOS E
OPIÓIDES NO NÚCLEO PRETECTAL ANTERIOR SOBRE A
ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DOS CÓRTICES OCCIPITAL E
RETROESPLÊNIO EM MODELO DE NOCICEPÇÃO
PERSISTENTE
Ana Carolina Rossaneis
RIBEIRÃO PRETO
2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Dissertação apresentada à
Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo,
para a obtenção do título
de Mestre em Ciências.
Área de Concentração:
Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. Wiliam Alves do Prado
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E/OU DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL
DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE
CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de
Ribeirão Preto/USP
Rossaneis, Ana Carolina
Efeitos da injeção intracerebral de antagonistas de receptores
muscarínicos, serotoninérgicos e opióides no núcleo pretectal anterior sobre a
estimulação elétrica dos córtices occipital e retroesplênio em modelo de dor
persistente / Ana Carolina Rossaneis;
Orientador: Wiliam Alves do Prado – Ribeirão Preto, 2009.
86 f.
Dissertação (Mestrado em Ciências – Área de
Concentração: Farmacologia) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo.
1. Nocicepção. 2. Córtex occipital. 3. Córtex retroesplênio. 4. Núcleo
pretectal anterior. 5. Inibição descendente.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Ana Carolina Rossaneis
Efeitos da injeção intracerebral de antagonistas de receptores
muscarínicos, serotoninérgicos e opióides no núcleo pretectal anterior
sobre a estimulação elétrica dos córtices occipital e retroesplênio em
modelo de dor persistente
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia
Banca Examinadora
Prof. Dr. Wiliam Alves do Prado
Instituição: FMRP – USP Assinatura: __________________________
Profa. Dra. Christie Ramos Andrade Leite Panissi
Instituição: FORP – USP Assinatura: __________________________
Prof. Dr. Jyrson Guilherme Klamt
Instituição: FMRP – USP Assinatura: __________________________
Trabalho realizado com auxílio financeiro da CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior)
"O olho é a lâmpada do corpo. Se teu olho é bom, todo o teu corpo se
encherá de luz. Mas se ele é mau, todo teu corpo se encherá de escuridão. Se
a luz que há em ti está apagada, imensa é a escuridão."
Jesus Cristo
Aos meus pais, José Carlos e Jane e
à minha irmã Ana Claudia.
A Deus... sempre.
Ao Prof. Dr. Wiliam Alves do Prado, meu orientador, por todos os
ensinamentos, a atenção, a disponibilidade e principalmente por ter me
acolhido tão gentilmente em seu laboratório.
Aos membros da banca examinadora: Profª. Drª. Christie Ramos Andrade Leite
Panissi e Prof.º Dr. Jyrson Guilherme Klamt, por contribuírem para o
engrandecimento desse trabalho.
A todos os amigos do laboratório: Gláucia, Josie, Marcelo, Karina, Lili, Quintino,
Rafael e João pela solicitude e amizade.
A todos os professores do Departamento de Farmacologia da FMRP pela
contribuição à minha formação científica.
Aos técnicos Paulo Roberto Castania e Marcos Antônio de Carvalho pela
indispensável ajuda nos experimentos.
À Maria Inês e Eliana, pela inestimável ajuda nos cuidados com os animais no
biotério.
Aos secretários Sônia Maria Stefanelli, Fátima Helena Ferreira Petean e José
Waldik Ramón por todos os serviços gentilmente prestados.
Às minhas grandes amigas, Priscila, Catarine e Bárbara sempre presentes nos
momentos mais importantes da minha vida.
A todos os colegas do departamento de Farmacologia.
Aos meus queridos pais, por todo o sacrifício e amor. Obrigada pela confiança
depositada e pela dedicação incondicional.
À minha família, pelo apoio, pelo carinho...
Ao Fábio, o seu incentivo, o seu amor e a sua compreensão foram
fundamentais para que tudo se tornasse mais fácil.
Enfim, a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a
realização desse trabalho.
ÍNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................
Modulação nociceptiva.....................................................................................
Núcleo Pretectal Anterior..................................................................................
Modulação Cortical...........................................................................................
2. OBJETIVOS..................................................................................................
Objetivo Geral...................................................................................................
Objetivos Específicos........................................................................................
3. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................
Animais.............................................................................................................
Cirurgia para implante de eletrodos..................................................................
Cirurgia para implante de cânula-guia..............................................................
Microinjeção......................................................................................................
Estimulação elétrica..........................................................................................
Modelo de dor pós-incisão................................................................................
Drogas...............................................................................................................
Histologia..........................................................................................................
Análise estatística.............................................................................................
Protocolo experimental.....................................................................................
4. RESULTADOS.............................................................................................
Córtex Occipital...............................................................................................
Grupo controle .................................................................................................
Pág
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7
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Efeito do bloqueio neural do NPA sobre a antinocicepção induzida por
estimulação elétrica do córtex occipital...........................................................
Efeito da microinjeção de atropina no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex occipital.....................................................
Efeito da microinjeção de metisergida no NPA sobre a antinocicepção
induzida por estimulação elétrica do córtex occipital........................................
Efeito da microinjeção de naloxona no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex occipital.....................................................
Córtex Retroesplênio......................................................................................
Grupo controle..................................................................................................
Efeito do bloqueio neural
do NPA sobre a antinocicepção induzida por
estimulação elétrica do córtex retroesplênio.....................................................
Efeito da microinjeção de atropina no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex retroesplênio.............................................
Efeito da microinjeção de metisergida no NPA
sobre a antinocicepção
induzida por estimulação elétrica do córtex retroesplênio................................
Efeito da microinjeção de naloxona no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex retroesplênio.............................................
5. DISCUSSÃO.................................................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Fotografia de animal fixado no aparelho estereotáxico,para ser submetido à
cirurgia de implante de eletrodo no córtex occipital ou retroesplênio e cânula-guia
direcionada ao NPA............................................................................................................
Figura 02: Aparato utilizado para estimular eletricamente os córtices occipital ou
retroesplênio.......................................................................................................................
Figura 03: Animal após ser submetido à incisão na pata traseira direita..........................
Figura 04: Aparato utilizado para medir limiar de dor na pata do animal..........................
Figura 05: Curva intensidade-
duração do efeito antinociceptivo causado por
estimulação elétrica no córtex occipital de ratos................................................................
Figura 06: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital e de microinjeção de
salina no NPA.....................................................................................................................
Figura 07:
Efeito da injeção de lidocaína 2% no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata ipsilateral).............
Figura 08: Efeito da injeção de lidocaína 2% no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata contralateral)........
Figura 09: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital e de microinjeção de
lidocaína no NPA................................................................................................................
Figura 10: Efeito da injeção de atropina no NPA sobre o efeito antinociceptivo causado
por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata ipsilateral)...........................
Figura 11: Efeito da injeção de atropina no NPA sobre o efeito antinociceptivo causado
por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata contralateral).......................
Figura 12: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital e de microinjeção de
atropina no NPA..................................................................................................................
Figura 13:
Efeito da injeção de metisergida no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata ipsilateral).............
Figura 14: Efeito da injeção
de metisergida no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata contralateral)........
Figura 15: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de
estimulação elétrica no córtex occipital e de microinjeção de
metisergida no NPA............................................................................................................
Figura 16: Efeito da injeção de naloxona no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata ipsilateral).............
Figura 17:
Efeito da injeção de naloxona no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex occipital (limiares da pata contralateral)........
Figura 18: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital e de microinjeção de
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naloxona no NPA................................................................................................................
Figura 19: Curva intensidade-
duração do efeito antinociceptivo causado por
estimulação elétrica no córtex retroesplênio de ratos.........................................................
Figura 20: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio e de microinjeção
de salina no NPA................................................................................................................
Figura 21:
Efeito da injeção de lidocaína 2% no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata
ipsilateral)............................................................................................................................
Figura 22:
Efeito da injeção de lidocaína 2% no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata
contralateral).......................................................................................................................
Figura 23: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio e de microinjeção
de lidocaína no NPA...........................................................................................................
Figura 24: Efeito da injeção de atropina no NPA sobre o efeito antinociceptivo causado
por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata ipsilateral)...................
Figura 25: Efeito da injeção de atropina no NPA sobre o efeito antinociceptivo causado
por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata contralateral)...............
Figura 26: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio e de microinjeção
de atropina no NPA.............................................................................................................
Figura 27:
Efeito da injeção de metisergida no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata ipsilateral).....
Figura 28: Efeito da
injeção de metisergida no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata
contralateral).......................................................................................................................
Figura 29: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio e de microinjeção
de metisergida no NPA.......................................................................................................
Figura 30:
Efeito da injeção de naloxona no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata ipsilateral).....
Figura 31: Efeito da injeção d
e naloxona no NPA sobre o efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica do córtex retroesplênio (limiares da pata
contralateral).......................................................................................................................
Figura 32: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio e de microinjeção
de naloxona no NPA...........................................................................................................
Figura 33:
Esquema ilustrativo da participação do NPA na modulação nociceptiva
exercida pelo córtex retroesplênio na nocicepção persistente...........................................
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RESUMO
Neste estudo investigamos os neurotransmissores envolvidos na
conexão entre o córtex occipital ou retroesplênio e o núcleo pretectal anterior
(NPA) na modulação da nocicepção persistente em ratos. Avaliamos o efeito
da microinjeção de antagonistas (colinérgico muscarínico, serotoninérgico e
opióide) no NPA sobre o efeito anti-hiperalgésico da estimulação elétrica
cortical. Utilizamos ratos com implante crônico de eletrodo unipolar no córtex
occipital ou retroesplênio e de cânula-guia no NPA. Sete dias mais tarde os
animais foram submetidos à incisão na pata traseira direita e o limiar de
retirada de para foi medido com auxílio de algesímetro mecânico. Atropina,
metisergida ou naloxona no NPA diminuiu significativamente o limiar de retirada
da pata ipsilateral (IL). O efeito antinociceptivo da estimulação elétrica do
córtex occipital não foi alterado por nenhum dos antagonistas. O efeito
antinociceptivo da estimulação elétrica do córtex retroesplênio também não foi
alterado pela administração prévia de atropina no NPA. Entretanto, metisergida
ou naloxona no NPA diminuiu significativamente a intensidade e a duração do
efeito antinociceptivo da estimulação elétrica do córtex retroesplênio. Os
resultados apresentados sugerem o envolvimento de receptores
serotoninérgicos e opióides do NPA na modulação da nocicepção persistente
exercida pelo córtex retroesplênio. Entretanto, esses receptores do NPA
parecem não estarem envolvidos na via antinociceptiva ativada a partir do
córtex occipital.
Palavras-chaves: Antinocicepção, núcleo pretectal anterior, córtex
retroesplênio, córtex occipital.
ABSTRACT
The neurotransmitters of efferents from the occipital or retrosplenial
cortex to the anterior pretectal nucleus (APN) involved in the modulation of
persistent nociception in rats were investigated. Antagonists of muscarinic
cholinergic, serotonergic or opioid receptors were injected into the NPA and
electrical stimulation was applied to the cortical target. Rats were chronically
implanted in the occipital or retrosplenial cortex with a monopolar electrode and
a guide cannula in the NPA. Seven days later a surgical incision was performed
on the plantar aspect of the right hind paw. Two hours later, saline or antagonist
was injected into the NPA and 15 minutes later the cortical target was
stimulated electrically. Atropine, methysergide or naloxone injected into the
NPA significantly reduced the withdrawal thresholds to mechanical stimulation
of the ipsilateral paw. The antinociception caused by electrical stimulation of the
occipital cortex was not altered by atropine, methysergide or naloxone. In
contrast, the antinociception caused by electrical stimulation of the
retroesplenial cortex was significantly shorter and less intense after
methysergide or naloxone, but not atropine in the NPA. The results suggest the
involvement of serotonergic and opioid mechanisms in the NPA for modulation
of persistent noxious stimulation and n the antinociception activated from the
occipital cortex.
Keywords: Antinociception, anterior pretectal nucleus, retrosplenial cortex,
occipital cortex.
INTRODUÇÃO
Introdução
2
Rossaneis, A.C.
A dor é uma experiência sensorial de aspecto particular para cada
indivíduo, podendo ser influenciada por fatores afetivos e emocionais,
sensoriais, interpretativos e comportamentais (Calvino & Grilo, 2006).
A principal função fisiológica da dor é proteger o organismo,
sinalizando aos centros nervosos as alterações dos meios externo e interno do
organismo. A este sinal o organismo responde de modo a preservar sua
integridade física. Alterações nos níveis de integração da resposta a um
estímulo nociceptivo podem aumentar a duração e a intensidade da dor, nesse
caso, a dor deixa de exercer sua função protetora e passa a ser a própria
patologia, representando severa agressão e influenciando o comportamento e
a qualidade de vida do indivíduo.
O controle da dor persistente é ainda sério problema para parcela
importante da população, podendo provocar no indivíduo prejuízo cognitivo,
incapacidade de raciocínio lógico e de tomada de decisões (Neugebauer et al.,
2009). Dor por câncer e dor de origem neuropática são freqüentemente
resistentes a tratamentos de rotina em clínicas de dor.
Modulação Nociceptiva
A informação nociceptiva é inicialmente identificada por
nociceptores, que são terminações nervosas livres do braço periférico de um
neurônio aferente primário. O braço central do neurônio aferente primário
conduz o estímulo nociceptivo até o corno dorsal da medula espinal, onde ativa
sinapticamente o neurônio espinal. Este, por sua vez, conduz o estímulo para
Introdução
3
Rossaneis, A.C.
os centros superiores encefálicos, incluindo a formação reticular, substância
cinzenta periaquedutal, tálamo e córtex cerebral (Julius & Basbaum, 2001;
Schaible & Richter, 2004). Durante esse processo, a informação nociceptiva
pode ser modulada em diversos níveis do sistema nervoso, havendo inúmeras
evidências de que vias descendentes ativadas por estímulos nociceptivos são
capazes de modular a transmissão nociceptiva na medula espinal. Essa
modulação descendente do estímulo nociceptivo pode ser tanto inibitória
quanto facilitatória (ver Urban & Gebhart, 1999; Vanegas & Schaible, 2004).
Até a década de 90 os estudos voltaram-se principalmente para a inibição
descendente do processamento espinal da nocicepção, não sendo observadas
eventuais vantagens de mecanismos descendentes facilitatórios como sendo,
também, uma forma de proteção para o organismo.
A estimulação elétrica de determinadas regiões cerebrais como
forma de se obter efeito antinociceptivo tem sido alvo de diferentes estudos.
Dentre essas regiões destacam-se a substância cinzenta periaquedutal (SCP)
e o núcleo magno da rafe (NMR) (ver revisão de Besson e Chaouch, 1987). Em
1969, Reynolds demonstrou que era possível submeter ratos à cirurgia
abdominal sem a necessidade de anestesia geral, desencadeando
antinocicepção somente pela estimulação elétrica da SCP.
Um dos maiores empecilhos encontrados no uso da estimulação
intracerebral é o fato de que a analgesia resultante é, na maioria dos casos,
acompanhada por reações aversivas em animais e sensações de desprazer
em humanos (Oleson et al., 1980). Reações de pânico e angústia durante a
Introdução
4
Rossaneis, A.C.
estimulação elétrica da SCP em humanos (Richardson & Akil, 1977) limitam o
uso clínico deste tipo de tratamento.
Em 1985, Prado e Roberts demonstraram que a SCP e o NMR são
exemplos de estruturas cuja estimulação elétrica embora desencadeie
antinocicepção, leva também a efeitos aversivos. Nesse estudo, foram
estimulados eletricamente 114 sítios cerebrais no rato e a maioria demonstrou
associação entre efeito antinociceptivo e efeito aversivo. Uma exceção foi o
núcleo pretectal anterior (NPA). A estimulação elétrica deste núcleo aumenta a
latência da resposta reflexa de retirada de cauda a estímulo térmico nocivo
sem comprometer o desempenho motor dos animais e as reações dos mesmos
a estímulos não nocivos (Roberts & Rees, 1986).
Núcleo Pretectal Anterior
O complexo pretectal é uma estrutura bilateral localizada
dorsomedialmente entre o mesencéfalo e o diencéfalo. É composto por núcleos
do trato óptico, pretectal olivar, pretectal médio, pretectal posterior e NPA
(Weber & Harting, 1980), sendo esse último, o maior componente do complexo.
Embora o complexo pretectal esteja relacionado à função visual (Berkley &
Mash, 1978, não foram encontradas no NPA conexões com a retina em ratos
ou camundongos (Scalia, 1972; Itaya, 1980), sugerindo que esse núcleo atue
em uma função independente do complexo.
A participação do núcleo pretectal anterior (NPA) na antinocicepção
vem sendo demonstrada em vários estudos, exercendo papel tanto na
Introdução
5
Rossaneis, A.C.
modulação descendente facilitatória quanto inibitória da nocicepção. A
estimulação elétrica do NPA produz antinocicepção acentuada e de longa
duração em ratos submetidos ao teste de retirada de cauda (Prado & Roberts,
1985; Roberts & Rees, 1986), e nos testes de formalina, pressão da pata
(Wilson et al., 1991), e de abertura mandibular (Chiang et al., 1989).
A estimulação desse núcleo pode levar ainda, a inibição da resposta
de células de camadas profundas do corno dorsal da medula espinal a
estímulos nocivos periféricos (Rees & Roberts, 1987). Essa inibição depende
de conexões intermediárias entre o NPA e a medula espinal, uma vez que
projeções diretas ainda não foram demonstradas. Os autores sugerem como
possível conexão o funículo dorsolateral ipsilateral, uma vez que a lesão do
mesmo abole o efeito inibitório da estimulação elétrica do NPA sobre os
neurônios da lâmina V do corno dorsal.
A participação de mecanismos opióides, colinérgicos e
noradrenérgicos na antinocicepção induzida pela estimulação elétrica do NPA
foi demonstrada por Rees et al. (1987). A administração de l-glutamato,
serotonina ou morfina no NPA induz antinocicepção dose-dependente no teste
de retirada de cauda em ratos. O efeito destas drogas foi menor ou inexistente
quando administradas em sítios vizinhos ao NPA (Prado, 1989), sugerindo que
o efeito observado decorre da ativação de neurônios no NPA. Rosa e Prado
(1997) confirmaram a participação de mecanismos serotoninérgicos e opióides
na antinocicepção evocada pelo NPA através da microinjeção local de
agonistas µ-opióide ou agonistas 5-HT1 ou 5-HT1B. O mesmo não ocorria
Introdução
6
Rossaneis, A.C.
quando eram injetados agonistas opióides do tipo κ, δ, ou σ ou agonistas
serotoninérgicos do tipo 5-HT2 ou 5-HT3.
Villarreal et al. (2004) demonstraram que diferentes partes do NPA
estão envolvidas no controle espinal de “inputs” nocivos. Estímulos nocivos
persistentes ativam a porção ventral do NPA, enquanto estímulos nocivos
breves ativam a porção dorsal do NPA. O mesmo grupo mostrou ainda que a
alodinia mecânica incisional foi significativamente mais intensa em ratos
previamente submetidos ao bloqueio neural do NPA contralateral à pata
incisionada (Villarreal et al., 2003) e que a injeção de naloxona, atropina ou
metisergida na porção ventral do NPA produz aumento dose-dependente da
dor incisional (Villarreal & Prado, 2007).
Eferências do NPA para áreas encefálicas distintas envolvidas no
controle nociceptivo incluem o núcleo tegmental pedunculopontino, núcleo
reticular gigantocelular, núcleo reticular paragigantocelular, hipotálamo,
substância cinzenta periaquedutal e núcleo magno da rafe (Weber & Harting,
1980; Terenzi et al., 1991, 1992).
Foster et al., (1989), utilizando técnica de transporte axonal
retrógrado de Fast Blue, examinou aferências à porção rostral do NPA,
observando que as células marcadas estavam mais densamente distribuídas
no córtex occipital e no córtex retroesplênio (porção granular e agranular). A
participação do NPA na via descendente inibitória ativada a partir desses
córtices já foi demonstrada em experimentos no nosso laboratório utilizando-se
modelo de dor fásica (Reis et al., dados não publicados).
Introdução
7
Rossaneis, A.C.
Modulação Cortical
Sabe-se que a percepção da dor pode ser alterada pelo humor,
cognição e atenção, ou por estimulação direta do córtex, porém muito pouco é
sabido sobre os mecanismos neurais subjacentes à modulação cortical da dor.
Durante muito tempo as atenções voltaram-se apenas para o tálamo, em
virtude da observação de que grandes lesões do córtex somatossensorial
primário (SI) em humanos, raramente prejudicava a sensação dolorosa. Uma
hipótese subsequente dizia que a dor era um fenômeno subcortical (ver revisão
de Treede et al., 1999). Entretanto, evidências mais recentes favorecem a
hipótese do envolvimento cortical em todos os aspectos do processo sensorial.
Dentre as áreas corticais estudadas das quais se obtiveram informações mais
satisfatórias em estudos relacionados à nocicepção, podemos apontar o córtex
cingulato anterior, córtex insular, córtex pré-frontal e as áreas
somatossensoriais primária e secundária (ver Zhuo, 2008).
Kenshalo et al. (1983) relataram que vias nociceptivas do sistema
somatossensorial projetam-se para a área 3b e 1 do córtex somatossensorial
primário, assim como, para o córtex parietal posterior adjacente. A estimulação
elétrica do córtex cingulato anterior induz resposta hipernociceptiva freqüência-
dependente, uma vez que corrente de alta intensidade assim como a
administração local de um agonista de receptor glutamatérgico metabotrópico
(ACPD) produz hipernocicepção no teste de retirada de cauda. Enquanto que
estímulos elétricos de baixa freqüência reduzem ou inibem completamente
essa resposta de facilitação (Calejesan et al., 2000). Esta resposta freqüência-
dependente é consistente com evidências farmacológicas de que os receptores
Introdução
8
Rossaneis, A.C.
glutamatérgicos metabotrópicos seriam ativados, uma vez que a ativação
destes receptores em outras regiões cerebrais geralmente requer altas
freqüências de estimulação (ver Scanziani et al., 1997; Batchelor e Garthwaite,
1997).
A lesão do córtex insular rostral agranular (CIRA) produz analgesia,
indicando que o córtex insular produz hiperalgesia tonicamente (Jasmin et al.,
2003). Aumentando-se os níveis de GABA pelo uso de um inibidor da enzima
GABA-aminotransferase, os autores observaram ainda que a ativação seletiva
de receptores GABA
B
Em contrapartida, Huang et al. (2001) observaram significativo efeito
antinociceptivo induzido pela estimulação elétrica do córtex ventrolateral orbital
(VLO), efeito bloqueado por lesão ou depressão da substância cinzenta
periaquedutal (ver Zhang et al., 1997). Lesão ou depressão do VLO acarreta
completa eliminação da antinocicepção. Adicionalmente o autor demonstrou
que a microinjeção de morfina (5 µl/0,5 µl) no VLO suprime o reflexo de retirada
de cauda.
relacionados aos neurônios do CIRA produz hiperalgesia
via projeções para a amígdala, uma área envolvida em sensações de dor e
medo.
Lesões do córtex somatossensorial estão associadas com estados
dolorosos (Canavero e Bonicalzi, 2002) ou com redução na percepção da dor
em humanos (ver Becerra et al., 2001). A aplicação de morfina no córtex
somatossensorial primário gera analgesia no teste de formalina, efeito que é
parcialmente revertido pela naloxona (Soto-Moyano et al., 1988). Esta região é
Introdução
9
Rossaneis, A.C.
rica em receptores µ- e δ-opióides (Tempel e Zuckin, 1987). Em nenhum dos
estudos citados, o efeito analgésico ultrapassa o período de estimulação.
Hess et al. (2007) em estudo de ressonância magnética funcional
em ratos, demonstraram que a hiperalgesia causada por estímulo térmico das
patas traseiras do animal leva à ativação de áreas cerebrais como os córtices
cingulato, retroesplênio, insular e sensorial motor, além dos núcleos talâmicos
medial e lateral posterior, área pretectal, hipotálamo e substância cinzenta
periaquedutal. Paulson et al. (2002) observaram alterações de longa duração
no fluxo sanguíneo do córtex retroesplênio após constrição do nervo ciático em
ratos.
Tendo em vista que os córtices occipital e retroesplênio enviam
“inputs” para a porção rostral do NPA (Foster et al. 1989), estrutura envolvida
na modulação nociceptiva, torna-se interessante aprofundar os estudos das
conexões entre essas áreas corticais e o NPA e verificar seu envolvimento nas
vias descendentes de controle de nocicepção.
Experimentos realizados em nosso laboratório (Reis et al.
submetido) demonstraram que a estimulação elétrica dos córtices occipital ou
retroesplênio em ratos produz efeito antinociceptivo no teste de retirada de
cauda que ultrapassa o período de estimulação sem alterar a função motora
dos animais. Tais efeitos dependem da integridade do NPA, uma vez que o
bloqueio desse núcleo reduz a duração, mas não a intensidade do efeito obtido
pela estimulação elétrica do córtex occipital e reduz a duração e a intensidade
do efeito obtido pela estimulação elétrica do córtex retroesplênio. Ainda
utilizando modelo de dor fásica, os autores demonstraram, a participação de
Introdução
10
Rossaneis, A.C.
receptores serotoninérgicos do NPA na modulação exercida pelo córtex
occipital e de receptores opióides na modulação exercida pelo córtex
retroesplênio sobre a nocicepção.
Neste estudo investigamos se a via descendente inibitória ativada
pelos córtices occipital ou retroesplênio na modulação da nocicepção
persistente depende da integridade do NPA e dos receptores encontrados
nesse núcleo.
ObjetivOs
Objetivos
12
Rossaneis, A.C.
Objetivo geral
Investigar o papel do NPA e sua neurotransmissão no efeito
antinociceptivo evocado pela estimulação elétrica do córtex occipital ou
retroesplênio em modelo de dor persistente pós-incisão em ratos.
Objetivos específicos
(1) Avaliar o efeito do bloqueio neural do NPA sobre a
antinocicepção induzida por estimulação elétrica dos córtices occipital ou
retroesplênio em modelo de dor persistente.
(2) Investigar o envolvimento da neurotransmissão colinérgica
muscarínica na conexão entre o córtex occipital e/ou córtex retroesplênio e o
NPA na modulação da nocicepção persistente através da microinjeção de
antagonista de receptores muscarínicos (atropina).
(3) Investigar o envolvimento da neurotransmissão serotoninérgica
na conexão entre o córtex occipital e/ou do córtex retroesplênio e o NPA na
modulação da nocicepção persistente através da microinjeção de antagonista
não seletivo de receptores serotoninérgicos (metisergida).
(4) Investigar o envolvimento da neurotransmissão opióide na
conexão entre o córtex occipital e/ou do córtex retroesplênio e o NPA na
modulação da nocicepção persistente através da microinjeção de antagonista
não seletivo de receptores opióides (naloxona).
Material e métodos
14
Rossaneis, A.C.
Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos (6 animais por grupo
experimental), provenientes do Biotério Central do Campus da USP de Ribeirão
Preto, pesando entre 140 a 160 g, no momento da cirurgia. Os animais foram
mantidos no biotério do Departamento de Farmacologia, sob ciclo claro/escuro
de 12/12h, temperatura entre 22-23°C e sem restrição de água ou comida,
durante todo o período experimental. Os experimentos foram realizados e
aprovados segundo as normas que regulamentam aspectos éticos da utilização
de animais de laboratório elaboradas pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal da FMRP-USP (nº 069/2009).
Cirurgia para implante de eletrodos
Os animais foram anestesiados com tribomoetanol (25 mg/kg,
intraperitoneal) e fixados em aparelho estereotáxico (DKI). A calota craniana foi
exposta e os animais receberam implante crônico de eletrodo monopolar
revestido por teflon (0.125 mm de diâmetro) dirigido ao objetivo, segundo as
seguintes coordenadas: Córtex retroesplênio: AP: + 1,7mm a partir da linha
interaural; ventral: -1,9 mm a partir da calota craniana; lateral: +1,8 mm a partir
da sutura sagital; Córtex occipital: AP: + 3,2mm a partir da linha interaural;
ventral: -1,7 mm a partir da calota craniana; lateral: +3,5 mm a partir da sutura
sagital de acordo com as coordenadas estabelecidas por Paxinos & Watson
(1986). Os implantes foram fixados com acrílico polimerizável ancorado por
dois parafusos de aço inoxidável rosqueados na calota craniana do animal.
Material e Métodos
Material e métodos
15
Rossaneis, A.C.
Após a cirurgia os animais foram tratados com injeção intramuscular
de 0,3 ml de antibiótico intramuscular (Pentabiótico Veterinário) e
permaneceram no biotério do Departamento por um período mínimo de
repouso de sete dias.
Cirurgia para implante de cânula-guia
Os animais foram anestesiados com Tribomoetanol (25 mg/kg,
intraperitoneal) e fixados em aparelho estereotáxico (DKI). A calota craniana foi
exposta e os animais receberam implante crônico de cânula-guia de aço
inoxidável (23G) de 12 mm de comprimento. As cânulas foram direcionadas de
modo a manter a extremidade inferior 3 mm acima do alvo (NPA): AP: + 3,0
mm a partir da linha interaural; ventral: -2,5 mm a partir da calota craniana;
lateral: +1,7 mm a partir da sutura sagital, segundo as coordenadas
estabelecidas por Paxinos e Watson (1986). Os implantes foram fixados com
acrílico polimerizável ancorado por dois parafusos de aço inoxidável
rosqueados na calota craniana do animal. Para evitar obstrução da cânula-guia
um mandril foi introduzido no interior da mesma até o momento do
experimento.
Após a cirurgia os animais foram tratados com injeção intramuscular
de 0,3 ml de antibiótico intramuscular (Pentabiótico Veterinário) e
permaneceram no biotério do Departamento por um período mínimo de
repouso de sete dias.
Material e métodos
16
Rossaneis, A.C.
Figura 1: Animal fixado em aparelho estereotáxico para implante de eletrodo no córtex occipital ou retroesplênio e
cânula-guia direcionada ao NPA.
Microinjeção
A microinjeção foi feita através de agulha de vidro (70-90µm)
conectada a um tubo de aço inoxidável (30G). O conjunto é protegido por
sistema telescópico de tubos de aço inoxidável composto por um tubo de 30G
conectado a outro de 23 G. O tubo de aço inoxidável 30G da agulha foi
conectado a um cateter (tubo de polietileno PE 10) sobreposto a uma tira de
papel milimetrado. O deslocamento de volume foi obtido pela pressão exercida
por uma seringa vazia de 50 mL conectada ao cateter, o qual foi preenchido
com solução em um sistema calibrado de modo que o deslocamento de 1 mm
da solução dentro do cateter correspondesse a 0,1 µL de volume injetado.
Estimulação elétrica
Para estimulação elétrica os animais receberam previamente
implante crônico de eletrodo monopolar revestido por teflon (0,125mm de
diâmetro) dirigido para o córtex alvo, como descrito acima. Os animais foram
Material e métodos
17
Rossaneis, A.C.
contidos em caixas que permitiam sua livre movimentação e o estimulador
regulado para fornecer pulsos senoidais contínuos de 60 Hz. A variação de
corrente é continuamente acompanhada na tela de um osciloscópio via resistor
de 1KΩ ligado em série ao eletrodo ativo. Foi utilizada estimulação elétrica de
20 µA, durante 15 s, corrente previamente estabelecida como a mínima
necessária para desencadear o efeito antinociceptivo (Reis, et al., submetido).
Figura 2: Aparato utilizado para estimular eletricamente os córtices occipital e retroesplênio: A) aparelho regulador da
duração e intensidade do estímulo elétrico; B) osciloscópio utilizado para monitorar a corrente elétrica aplicada no
córtex.
Modelo de dor pós-incisão
Os animais foram anestesiados com halotano via cone nasal e
submetidos à incisão longitudinal medial da região plantar da pata traseira
direita com lâmina cirúrgica. A incisão abrangeu a pele e fáscia iniciando-se a
0,5 cm da borda proximal do calcâneo, como descrito anteriormente (Brennan
et al., 1996). O músculo plantar foi elevado com auxílio de pinça curva, mas
suas origem e inserção foram mantidas intactas. Após hemostasia, a pele foi
A
B
Material e métodos
18
Rossaneis, A.C.
suturada com dois pontos de fio mononylon 5.0, e o animal alocado em um dos
grupos experimentais. A pata incisionada foi denominada ipsilateral (IL) e a
pata sem incisão, contralateral (CL).
Antes da incisão plantar, cada animal foi colocado em caixas
plásticas de contenção durante 15 min para acomodação comportamental. A
caixa possuia assoalho de malha de arame com espaços de 0,5 cm, de modo a
permitir acesso à superfície plantar da pata do animal. Medidas do limiar de
resposta a estímulos mecânicos foram feitas com analgesímetro eletrônico
(Von Frey, Stoelting) antes e duas horas após a incisão. O limiar foi medido
pela aplicação de força crescente contra a superfície plantar da pata, em região
vizinha à ferida cirúrgica e próxima ao calcanhar, até que o animal exibisse
nítido reflexo de retirada da pata. Em cada momento, este procedimento foi
repetido 3 vezes a intervalos de 30 s, e a média dos valores obtidos
considerados como estímulo mecânico limiar. Procedimento idêntico foi
efetuado na pata não operada. Novas medidas do limiar foram efetuadas 5, 10
e 15 minutos após a microinjeção de salina, lidocaína ou antagonista no NPA e
imediatamente após a estimulação elétrica de um dos córtices.
Figura 03: pata traseira do animal suturada após incisão cirúrgica.
Material e métodos
19
Rossaneis, A.C.
A
Figura 4: Aparato utilizado para medir limiar de dor na pata do animal: A) anestesiômetro eletrônico; B) sistema de
caixas de contenção com assoalho de arame
Drogas:
Pentabiótico (1.200.000UI, Fort Dodge).
2,2,2- tribromoetanol (Aldrich).
Tiopental sódico (Abbott).
Cloridrato de Lidocaína 2% (Dentsply probem).
Sulfato de atropina (Sigma): antagonista colinérgico muscarínico. Dissolvido
em salina estéril.
Maleato de metisergida (RBI): antagonista serotoninérgico. Dissolvido em
salina estéril.
Hidrocloridrato de naloxona (RBI): antagonista opióide. Dissolvido em salina
estéril.
A
B
Material e métodos
20
Rossaneis, A.C.
Histologia
Terminados os testes, os animais foram anestesiados com tiopental
sódico (50 mg/Kg, i.p.) e receberam microinjeção de 0,1 µl de corante Fast
Green (1%) no local correspondente à microinjeção das drogas. Em seguida
foram perfundidos através do ventrículo esquerdo com solução de NaCl 0,9 %
em volume suficiente para retirar todo o sangue do animal, seguida de solução
tamponada de formaldeído 10 % em volume suficiente para fixar os tecidos. Os
cérebros foram retirados e mantidos em formaldeído por no mínimo dois dias.
Após este período de fixação, os cérebros foram congelados e cortados, no
plano frontal, em fatias de 100 μm de espessura e montados em lâminas de
vidro gelatinizadas, secos ao ar, corados com solução de vermelho neutro 1 %,
e analisados com o auxílio de uma lupa. A posição das pontas dos eletrodos ou
dos sítios de microinjeção foi anotada sobre figuras retiradas do Atlas de
Paxinos e Watson (1986).
Análise estatística
Os limiares de resposta à estimulação mecânica foram considerados
em termos de força (em grama) necessária para evocar o reflexo de retirada da
pata. Em cada subgrupo os limiares foram analisados e apresentados em
gráficos como média ± E.P.M. Os subgrupos foram comparados utilizando
análise de variância multivariada (MANOVA). Os fatores analisados foram
tratamentos, tempo e interação tratamento-tempo. Para cada tempo, foi
Material e métodos
21
Rossaneis, A.C.
realizada análise de variância (one-way) seguida por teste de Bonferroni com
nível de significância estabelecido em P < 0,05 em todos os casos.
Protocolo experimental
Os animais possuíam implante de eletrodo monopolar dirigido ao
córtex occipital (CO) ou ao córtex retroesplênio (CR) e implante de cânula-guia
direcionada ao NPA. Sete dias após a cirurgia, foram realizadas medidas
basais do limiar de retirada de pata e em seguida procedida a incisão cirúrgica
na pata direita traseira direita dos animais. Duas horas mais tarde, foram
realizadas novas medidas basais. Os animais receberam, então, injeção
intracerebral de salina, lidocaína a 2%, metisergida (40 pg), atropina (100 ng),
ou naloxona (10 ng), todas em volume de 0,25 µl. As doses utilizadas foram
baseadas em Villarreal & Prado (2007). Quinze minutos mais tarde, os animais
foram submetidos à estimulação elétrica do córtex occipital ou retroesplênio e o
limiar de retirada de pata foi registrado a intervalos de 5 min por até 25
minutos.
Animais dos grupos falso-estimulados (sham) foram submetidos aos
mesmos procedimentos, com exceção da estimulação elétrica cortical.
O esquema a seguir resume o protocolo descrito.
Material e métodos
22
Rossaneis, A.C.
Implante de
eletrodo (CO
ou CR) e
cânula-guia
(NPA)
Linha de
base I
Perfusão e
análise
histológica
7 dias
Medidas dos limiares a intervalos de 5
minutos.
2 horas
Injeção de
salina,
lidocaína
ou
antagonista
no NPA
Incisão
na pata
Linha de
base II
15 min
Estimulação
elétrica ou falsa-
estimulação (CO
ou CR)
25 min
Resultados
Resultados
24
Rossaneis, A.C.
CÓRTEX OCCIPITAL
Grupo controle
Os resultados deste grupo estão apresentados na figura 5 e são
utilizados durante todos os demais experimentos como controle da pata IL. Os
animais receberam salina (0,25 μl) injetada no NPA e 15 minutos mais tarde
receberam estimulação elétrica real (15 μA) ou falsa (sham) aplicada ao córtex
occipital. A incisão plantar provocou diminuição significativa do limiar de
retirada da pata IL, mas não alterou o limiar da pata CL. A estimulação elétrica
promoveu aumento significativo do limiar da pata IL por um período menor que
10 (dez) minutos, sem alterar o limiar da pata CL. A injeção de salina no NPA
não alterou significativamente o limiar de nenhum dos grupos experimentais.
As curvas da Figura 5 foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
81,31; p < 0,0001) e tempo (F10,200 = 80,36; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 37,88; p < 0,0001). A
localização dos sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está
indicada na Figura 6.
Resultados
25
Rossaneis, A.C.
Salina NPA
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20
30
40
50
pata CL / EE
pata IL / EE
pata CL / Sham
pata IL / Sham
1 2 3
Tempo (minutos)
Força (g)
#
#
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Figura 5: Curva intensidade-duração do efeito antinociceptivo causado por estimulação elétrica
(EE) no córtex occipital de ratos em modelo de dor pós-incisão. Os pontos representam média
± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da incisão (seta 1), da microinjeção de salina
(0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação elétrica do córtex occipital (seta 3) estão indicados
no gráfico. (*) diferente da pata CL dos falso-estimulados; (#) diferente da pata IL do falso
estimulado, P < 0,05.
Resultados
26
Rossaneis, A.C.
4,52mm 4,80mm 5,20mm
Figura 6: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica (15 µA) no córtex occipital (círculos pretos
fechados) e de microinjeção de salina (0,25 µl) no NPA (círculos abertos). Acima estão
indicadas as distâncias ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
27
Rossaneis, A.C.
Efeito do bloqueio neural do NPA sobre a antinocicepção induzida por
estimulação elétrica do córtex occipital.
Os resultados deste experimento estão apresentados nas figuras 7
(pata ipsilateral) e 8 (pata contralateral). Lidocaína 2% (0,25 µl) ou salina (0,25
µl) foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação elétrica real (15 μA) ou
falsa (sham) do córtex occipital. Observou-se diminuição significativa do limiar
da pata IL dos animais que receberam lidocaína no NPA em relação ao limiar
dos que receberam apenas salina. O bloqueio neural do NPA diminuiu
significativamente a intensidade e a duração do efeito antinociceptivo induzido
pela estimulação elétrica do córtex occipital. Os animais falso estimulados não
exibiram alterações significativas do limiar de resposta ao teste em nenhuma
das patas.
As curvas obtidas foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
57,00; p < 0,0001) e tempo (F10,200 = 322,22; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 25,24; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não foi alterado de modo significativo (figura 8). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura 9.
Resultados
28
Rossaneis, A.C.
Lidocaína (Limiares pata IL)
-120 0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10 15 20 30 40 50
Salina/EE
Lidocaína/EE
Salina/Sham
Lidocaína/Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
+
+
+
Figura 7: Efeito da injeção de lidocaína 2% no NPA sobre efeito antinociceptivo causado por
estimulação elétrica (EE) no córtex occipital de ratos em modelo de dor pós-incisão. Os pontos
representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da incisão (seta 1), da
microinjeção de lidocaína (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação elétrica do córtex
occipital (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de salina/sham e de salina/ estímulo
elétrico, (+) diferente dos demais grupos, P < 0,05.
Resultados
29
Rossaneis, A.C.
Lidocaína (Limiares pata CL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
10 20
30 40 50
EE
Sham
21
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 8: Efeito da estimulação elétrica (EE, seta 2) do córtex occipital após injeção de
lidocaína (0,25 μl) no NPA (seta1 ) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os pontos
representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
4,80mm 5,20mm
Figura 9: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital (círculos pretos fechados) e de
microinjeção de lidocaína (0,25 µl) no NPA (círculos abertos). Estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural
.
Resultados
30
Rossaneis, A.C.
Efeito da microinjeção de atropina no NPA sobre a antinocicepção induzida por
estimulação elétrica do córtex occipital.
Os resultados deste experimento estão apresentados nas figuras 10
(pata IL) e 11 (pata CL). Atropina (antagonista de receptores muscarínicos; 100
ng) foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação elétrica real (15 μA)
ou falsa (sham) do córtex occipital. Atropina promoveu diminuição significativa
do limiar da pata em relação aos que receberam salina. A atropina não impediu
o aumento imediato do limiar de retirada da pata IL nem alterou a duração do
efeito antinociceptivo induzido pela estimulação elétrica do córtex occipital. Os
animais falso estimulados não exibiram alterações significativas do limiar de
resposta em nenhuma das patas.
As curvas obtidas foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
31,36; p < 0,0001) e tempo (F10,200 = 320,01; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 34,46; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não foi alterado de modo significativo (figura 11). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura12.
Resultados
31
Rossaneis, A.C.
Atropina (Limiares pata IL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20
30
40
50
Salina/EE
Atropina/EE
Salina/Sham
Atropina/Sham
321
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
#
#
Figura 10: Efeito da injeção de atropina (100 ng / 0,25 μl) no NPA sobre efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica (EE) no córtex occipital de ratos em modelo de dor pós-
incisão. Os pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da
incisão (seta 1), da microinjeção de salina (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação elétrica
do córtex occipital (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de salina/sham e de
salina/estímulo elétrico, (#) diferente de salina/sham e de atropina/sham /, P < 0,05.
Resultados
32
Rossaneis, A.C.
Atropina (Limiares pata CL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
10 20
30 40 50
EE
Sham
1 2
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 11: Efeito da estimulação elétrica (EE, seta 2) do córtex occipital após injeção de
atropina (100 ng / 0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os
pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
4,52 mm 4,80mm 5,20mm 5,30mm
Figura 12: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital (círculos pretos fechados) e de
microinjeção de atropina no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
33
Rossaneis, A.C.
Efeito da microinjeção de metisergida no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex occipital.
Os resultados deste experimento estão apresentados nas figuras 13
(pata IL) e 14 (pata CL). Metisergida (antagonista de receptores
serotoninérgicos; 40 pg) foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação
elétrica real (15 μA) ou falsa (sham) do córtex occipital. Metisergida promoveu
diminuição significativa do limiar da pata IL em relação aos animais que
receberam salina. A metisergida não impediu o aumento imediato do limiar da
pata IL, nem alterou a duração do efeito antinociceptivo induzido pela
estimulação elétrica do córtex occipital. Os animais falso estimulados não
exibiram alterações significativas dos limiares de resposta ao teste em
nenhuma das patas.
As curvas obtidas foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
41,98; p < 0,001) e tempo (F10,200 = 276,19; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 26,75; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não foi alterado de modo significativo (figura 14). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura 15.
Resultados
34
Rossaneis, A.C.
Metisergida (Limiares pata IL)
-120 0
0
10
20
30
40
50
60
70
5 10 15 20 30 40 50
Metisergida/EE
Metisergida/Sham
Salina/EE
Salina/Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
+
*
+
+
+
Figura 13: Efeito da injeção de metisergida (40 pg / 0,25 μl) no NPA sobre efeito
antinociceptivo causado por estimulação elétrica (EE) no córtex occipital de ratos em modelo
de dor pós-incisão. Os pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os
momentos da incisão (seta 1), da microinjeção de metisergida (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da
estimulação elétrica do córtex occipital (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de
salina/sham e de salina/ estímulo elétrico, (+) diferente dos demais grupos, P < 0,05
.
Resultados
35
Rossaneis, A.C.
Metisergida (Limiares pata CL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
10 20
30 40 50
EE
Sham
21
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 14: Efeito da estimulação elétrica (EE, 2) do córtex occipital após injeção de atropina
(40 pg / 0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os pontos
representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
4,52mm 4,80mm 5,20mm 5,30mm
Figura 15: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital (círculos pretos fechados) e de
microinjeção de metisergida no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
36
Rossaneis, A.C.
Efeito da microinjeção de naloxona no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex occipital.
Os resultados deste experimento estão apresentados na figura 16
(pata IL) e 17 (pata CL). Naloxona (antagonista de receptores opióides; 10 ng)
foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação elétrica real (15 μA) ou
falsa (sham) do córtex occipital. Naloxone promoveu diminuição significativa do
limiar da pata IL em relação aos animais que receberam apenas salina. A
naloxona não impediu o aumento imediato do limiar de retirada da pata IL, nem
alterou a duração do efeito antinociceptivo induzido pela estimulação elétrica
do córtex occipital. Os animais falso estimulados não exibiram alterações
significativas do limiar de resposta ao teste em nenhuma das patas.
As curvas obtidas foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
41,92; p < 0,001) e tempo (F10,200 = 389,81; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 46,11; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não sofreu alteração significativa (figura 17). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura 18.
Resultados
37
Rossaneis, A.C.
Naloxona (Limiares pata IL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20
30
40
50
Salina/ EE
Naloxona/ EE
Salina/ Sham
Naloxona/ Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
#
+
+
#
Figura 16: Efeito da injeção de naloxona (10 ng / 0,25 μl) no NPA sobre efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica (EE) no córtex occipital de ratos em modelo de dor pós-
incisão. Os pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da
incisão (seta 1), da microinjeção de naloxona (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação
elétrica do córtex occipital (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de salina/sham e de
salina/estímulo elétrico, (#) diferente de salina/sham e de naloxona/sham e (+) diferente dos
demais grupos, P < 0,05.
Resultados
38
Rossaneis, A.C.
Naloxona (Limiares pata CL)
-120
0
10
20
30
40
50
60
70
10
20
30 40
50
EE
Sham
1 2
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 17: Efeito da estimulação elétrica (EE, seta 2) do córtex occipital após injeção de
naloxona (10 ng / 0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os
pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
4,52mm 4,80mm 5,20mm
Figura 18: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex occipital (círculos pretos fechados) e de
microinjeção de naloxona no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
39
Rossaneis, A.C.
CÓRTEX RETROESPLÊNIO
Grupo controle
Os resultados deste grupo estão apresentados na figura 19 e são
utilizados durante todos os demais experimentos como controle da pata IL. Os
animais receberam salina (0,25 μl) injetada no NPA e 15 minutos mais tarde
receberam estimulação elétrica real (15 μA) ou falsa (sham) aplicada ao córtex
retroesplênio. A incisão plantar provocou diminuição significativa do limiar de
retirada da pata IL, mas não alterou o limiar da pata CL. A estimulação elétrica
promoveu aumento significativo do limiar da pata IL por um período de
aproximadamente 15 (quinze) minutos, sem alterar o limiar da pata CL. A
injeção de salina no NPA não alterou significativamente o limiar de nenhum dos
grupos experimentais.
As curvas da Figura 19 foram significativamente diferentes quanto
ao tratamento (F3,20 = 164,36; p < 0,0001) e tempo (F10,200 = 115,47; p < 0,0001)
e demonstraram significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 63,74; p <
0,0001). A localização dos sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no
NPA está indicada na Figura 20.
Resultados
40
Rossaneis, A.C.
Salina NPA
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20
30
40
50
pata CL / EE
pata IL / EE
pata CL / Sham
pata IL / Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
#
#
#
#
Figura 19: Curva intensidade-duração do efeito antinociceptivo causado por estimulação
elétrica (EE) no córtex retroesplênio de ratos em modelo de dor pós-incisão. Os pontos
representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da incisão (seta 1), da
microinjeção de salina (0,25µL) no NPA (seta 2) e da estimulação elétrica do córtex
retroesplênio (seta 3) estão indicados no gráfico (*) diferente da pata CL dos falso-estimulados;
(#) diferente da pata IL dos falso estimulados,P < 0,05.
Resultados
41
Rossaneis, A.C.
4,52mm 4,80mm 5,20mm
5,30mm 5,60mm 5,80mm
Figura 20: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio (círculos pretos fechados)
e de microinjeção de salina no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
42
Rossaneis, A.C.
Efeito do bloqueio neural do NPA sobre a antinocicepção induzida por
estimulação elétrica do córtex retroesplênio.
Os resultados deste experimento estão apresentados nas figuras 21
(pata ipsilateral) e 22 (pata contralateral). Lidocaína 2% (0,25 µl) ou salina (0,25
µl) foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação elétrica real (15 μA) ou
falsa (sham) do córtex retroesplênio. Observou-se diminuição significativa do
limiar da pata IL dos animais que receberam lidocaína no NPA em relação ao
limiar dos que receberam apenas salina. O bloqueio neural do NPA diminuiu
significativamente a intensidade e a duração do efeito antinociceptivo induzido
pela estimulação elétrica do córtex retroesplênio. Os animais falso estimulados
não exibiram alterações significativas do limiar de resposta ao teste em
nenhuma das patas.
As curvas da Figura 21 foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20
= 92,60; p < 0,0001) e tempo (F10,200 = 332,34; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 46,37; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não foi alterado de modo significativo (figura 22). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura 23.
Resultados
43
Rossaneis, A.C.
Lidocaína (Limiares pata IL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20
30
40
50
Salina/EE
Lidocaína/EE
Salina/Sham
Lidocaína/Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
+
+
+
+
Figura 21: Efeito da injeção de lidocaína 2% no NPA sobre efeito antinociceptivo causado por
estimulação elétrica (EE) no córtex retroesplênio de ratos em modelo de dor pós-incisão. Os
pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da incisão (seta 1),
da microinjeção de lidocaína (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação elétrica do córtex
retoresplênio (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de salina/sham e de
salina/estímulo elétrico, (+) diferente dos demais grupos,P < 0,05.
Resultados
44
Rossaneis, A.C.
Lidocaína (Limiares pata CL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
10 20
30 40 50
EE
Sham
1 2
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 22: Efeito da estimulação elétrica (seta 2) do córtex retroesplênio após injeção de
lidocaína (0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os pontos
representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
4,80mm 5,20mm 5,30mm 5,60mm
Figura 23: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio (círculos pretos fechados)
e de microinjeção de lidocaína (círculos abertos) no NPA. Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
45
Rossaneis, A.C.
Efeito da microinjeção de atropina no NPA sobre a antinocicepção induzida por
estimulação elétrica do córtex retroesplênio.
Os resultados deste experimento estão apresentados nas figuras 24
(pata IL) e 25 (pata CL). Atropina (antagonista de receptores muscarínicos; 100
ng) foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação elétrica real (15 μA)
ou falsa (sham) do córtex retroesplênio. Atropina promoveu diminuição
significativa do limiar da pata em relação aos que receberam salina. A atropina
não impediu o aumento imediato do limiar de retirada da pata IL, mas diminuiu
a duração do efeito antinociceptivo induzido pela estimulação elétrica do córtex
retroesplênio. Os animais falso estimulados não exibiram alterações
significativas do limiar de resposta em nenhuma das patas.
As curvas da Figura 24 foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20
= 49,83; p < 0,0001) e tempo (F10,200 = 411,80; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 62,97; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não foi alterado de modo significativo (figura 25). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura 26.
Resultados
46
Rossaneis, A.C.
Atropina (Limiares pata IL)
-120 0
0
10
20
30
40
50
60
70
5 10 15 20 30 40 50
Salina/EE
Atropina/EE
Salina/Sham
Atropina/Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
#
#
+
+
+
+
Figura 24: Efeito da injeção de atropina (100 ng / 0,25 μl ) no NPA sobre efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica (EE) no córtex retroesplênio de ratos em modelo de dor pós-
incisão. Os pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da
incisão (seta 1), da microinjeção de salina (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação elétrica
do córtex retroesplênio (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de salina/sham e de
salina/estímulo elétrico, (#) diferente de salina/sham e de atropina/sham e (+) diferente dos
demais grupos, P < 0,05.
Resultados
47
Rossaneis, A.C.
Atropina (Limiares pata CL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
10 20
30 40 50
EE
Sham
1 2
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 25: Efeito da estimulação elétrica (EE, seta 2) do córtex retroesplênio após injeção de
atropina (100 ng / 0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os
pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
Resultados
48
Rossaneis, A.C.
4,52mm 4,80mm 5,20mm
5,60mm 5,80mm 6,04mm
Figura 26: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio (círculos pretos fechados)
e de microinjeção de atropina no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
49
Rossaneis, A.C.
Efeito da microinjeção de metisergida no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex retroesplênio.
Os resultados deste experimento estão apresentados nas figuras 27
(pata IL) e 28 (pata CL). Metisergida (antagonista de receptores
serotoninérgicos; 40 pg) foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação
elétrica real (15 μA) ou falsa (sham) do córtex retroesplênio. Metisergida
promoveu diminuição significativa do limiar da pata IL em relação aos animais
que receberam salina. A metisergida não impediu o aumento imediato do limiar
de retirada da pata IL, entretanto, diminuiu a duração do efeito antinociceptivo
induzido pela estimulação elétrica do córtex retroesplênio. Os animais falso
estimulados não exibiram alterações significativas dos limiares de resposta ao
teste em nenhuma das patas.
As curvas obtidas foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
74,89; p < 0,001) e tempo (F10,200 = 376,56; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 52,69; p < 0,0001). O limiar
da pata CL não foi alterado de modo significativo (figura 28). A localização dos
sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no NPA está indicada na
Figura 29.
Resultados
50
Rossaneis, A.C.
Metisergida (Limiares pata IL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20 30
40
50
Metisergida/EE
Metisergida/Sham
Salina/EE
Salina/Sham
1 32
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
+
+
+
+
+
Figura 27: Efeito da injeção de metisergida (40 pg / 0,25 μl) no NPA sobre efeito
antinociceptivo causado por estimulação elétrica (EE) no córtex retroesplênio de ratos em
modelo de dor pós-incisão. Os pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os
momentos da incisão (seta 1), da microinjeção de metisergida (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da
estimulação elétrica do córtex retroesplênio (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de
salina/sham e de salina/estímulo elétrico e de metisergida/sham e (+) diferente dos demais
grupos, P < 0,05.
Resultados
51
Rossaneis, A.C.
Metisergida (Limiares pata CL)
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
10 20
30 40 50
EE
Sham
1 2
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 28: Efeito da estimulação elétrica (EE, seta 2) do córtex retroesplênio após injeção de
metisergida (40 pg / 0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os
pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
Resultados
52
Rossaneis, A.C.
4,80mm 5,20mm 5,30mm
5,60mm 5,80mm 6,04mm
Figura 29: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio (círculos pretos fechados)
e de microinjeção de metisergida no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as
distâncias ântero-posteriores em relação à linha interaural.
Resultados
53
Rossaneis, A.C.
Efeito da microinjeção de naloxona no NPA sobre a antinocicepção induzida
por estimulação elétrica do córtex retroesplênio.
Os resultados deste experimento estão apresentados na figura 30
(pata IL) e 31 (pata CL). Naloxona (antagonista de receptores opióides; 10 ng)
foi injetada no NPA 15 minutos antes da estimulação elétrica real (15 μA) ou
falsa (sham) do córtex occipital. Naloxone promoveu diminuição significativa do
limiar da pata IL em relação aos animais que receberam apenas salina. A
naloxona não impediu o aumento imediato do limiar de retirada da pata IL,
entretanto, alterou a duração do efeito antinociceptivo induzido pela
estimulação elétrica do córtex retroesplênio. Os animais falso estimulados
também não exibiram alterações significativas do limiar de resposta ao teste
em nenhuma das patas.
As curvas obtidas foram diferentes quanto ao tratamento (F3,20 =
66,41; p < 0,001) e tempo (F10,200 = 339,17; p < 0,0001) e demonstraram
significativa interação tratamento x tempo (F30,200 = 42,34; p < 0,0001). ). O
limiar da pata CL dos mesmos animais não sofreu alteração significativa (figura
31). A localização dos sítios de estimulação elétrica cortical e de injeção no
NPA está indicada na Figura 32.
Resultados
54
Rossaneis, A.C.
Naloxona pata IL
-120
0
0
10
20
30
40
50
60
70
5
10
15
20
30
40
50
Salina/ EE
Naloxona/ EE
Salina/ Sham
Naloxona/ Sham
1 3
2
Tempo (minutos)
Força (g)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
+
+
+
+
+
Figura 30: Efeito da injeção de naloxona (10 ng / 0,25 μl) no NPA sobre efeito antinociceptivo
causado por estimulação elétrica (EE) no córtex retroesplênio de ratos em modelo de dor pós-
incisão. Os pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Os momentos da
incisão (seta 1), da microinjeção de naloxona (0,25 µL) no NPA (seta 2) e da estimulação
elétrica do córtex retroesplênio (seta 3) estão indicados no gráfico. (*) diferente de salina/sham
e de salina/estímulo elétrico e de naloxona/sham e (+) diferente dos demais grupos, P < 0,05.
Resultados
55
Rossaneis, A.C.
Naloxona (Limiares pata CL)
-120 0
10
20
30
40
50
60
70
10
20
30
40
50
EE
Sham
1 2
Tempo (minutos)
Força (g)
Figura 31: Efeito da estimulação elétrica (EE, seta 2) do córtex retroesplênio após injeção de
naloxona (10 ng / 0,25 μl) no NPA (seta 1) sobre o limiar de retirada da pata CL à incisão. Os
pontos representam média ± E.P.M. de 6 animais por grupo.
Resultados
56
Rossaneis, A.C.
4,52mm 4,80mm 5,20mm
5,30mm 5,60mm 5,80mm
Figura 32: Secções coronais retiradas do atlas Paxinos e Watson (1986) mostrando a
localização de sítios de estimulação elétrica no córtex retroesplênio (círculos pretos fechados)
e de microinjeção de naloxona no NPA (círculos abertos). Acima estão indicadas as distâncias
ântero-posteriores em relação à linha interaural.
discussão
Discussão
58
Rossaneis, A.C.
Evidências da literatura mostram a participação de distintas áreas
corticais na modulação da nocicepção, dentre elas destacam-se o córtex
cingulato anterior (CCA), córtex insular rostral agranular (CIRA) e o córtex
ventrolateral orbital (VLO) (Brown & Barbaro, 2003; Ohara, 2004). Lesão ou
depressão do VLO acarreta completa eliminação da antinocicepção, enquanto
que a estimulação elétrica desse córtex produz efeito antinociceptivo no teste
de retirada de cauda (ver Zhang et al., 1997). A perfusão crônica de morfina no
VLO produz antinocicepção em ratos (Al-Amin et al., 2004). A lesão do CIRA
produz analgesia, entretanto, a ativação seletiva de receptores GABA
B
No presente trabalho, estudamos a antinocicepção evocada pela
estimulação elétrica do córtex occipital ou retroesplênio em modelo de dor
relacionados aos neurônios do CIRA produz hiperalgesia. (Jasmin et al., 2003).
A estimulação elétrica do CCA com corrente de alta intensidade assim como a
administração local de um agonista de receptor glutamatérgico metabotrópico
(ACPD) induz hipernocicepção no teste de retirada de cauda. Por outro lado,
estímulos elétricos de baixa freqüência, reduzem ou inibem completamente
essa resposta de facilitação (Calejesan et al., 2000). Estes estudos apontam
para a participação, de maneira distinta, destes córtices nas vias nociceptivas
inibitórias ou facilitatórias descendentes. O córtex retroesplênio mantêm
conexões recíprocas com o CCA (Groen et al., 1990- 1992- 2003; Kobayashi et
al., 2000- 2003- 2007) e assim como o córtex occipital, envia eferências ao
NPA (Foster et al., 1989), regiões reconhecidamente envolvidas na modulação
da nocicepção. Desta forma, o córtex occipital e o córtex retroesplênio ainda
não receberam a merecida atenção quanto a sua possível participação nesta
modulação.
Discussão
59
Rossaneis, A.C.
persistente causada por incisão cirúrgica em ratos. Foi avaliada também a
participação do NPA como possível estação intermediária na via descendente
utilizada por esses córtices. A estimulação elétrica do córtex occipital ou
retroesplênio promoveu redução significativa da hiperalgesia pós-incisão, efeito
que se manteve acima do controle por aproximadamente dez minutos após a
estimulação do córtex occipital e por cerca de quinze minutos após a
estimulação do córtex retroesplênio. É importante ressaltar que o efeito
antinociceptivo da estimulação elétrica do córtex occipital ou retroesplênio é
longo quando comparado com o obtido pela estimulação de outras áreas
corticais, que raramente ultrapassa o período de estimulação (Jasmin et al.,
2003 e Zhang et al., 1997). Tais resultados apóiam dados da literatura que
indicam o aumento do fluxo sanguíneo do córtex retroesplênio após constrição
do nervo ciático em ratos (Paulson et al.(2002), assim como, a ativação do
córtex occipital (Kong et al., 2006) ou retroesplênio (Hees et al., 2007) na
presença de estímulos nocivos, em estudos que se utilizam de imagens de
ressonância magnética nuclear funcional (fRMN). Nossos achados também
corroboram estudos conduzidos previamente em nosso laboratório que
demonstram que estimulação elétrica do córtex occipital ou retroesplênio
promove antinocicepção em modelo de dor fásica (Reis et al.,submetido).
A antinocicepção produzida por estimulação elétrica dos córtices
occipital ou retroesplênio foi avaliada em termos de variação do limiar de
retirada de pata de ratos em resposta à aplicação de estímulos mecânicos.
Para isso, utilizamos o modelo de dor persistente pós incisão cirúrgica descrito
por Brennan et al. (1996) e submetemos os animais ao teste de Von Frey.
Estes autores observaram que a incisão longitudinal na superfície plantar da
Discussão
60
Rossaneis, A.C.
pata de ratos reduz o limiar para estímulo mecânico aplicado em área próxima
à borda cirúrgica. De fato, o limiar de retirada da pata ipsilateral medido duas
horas após a incisão foi significativamente mais baixo do que antes da incisão,
caracterizando quadro de hiperalgesia a estímulo mecânico.
Sendo conhecidas as aferências dos córtices occipital e
retroesplênio à porção rostral do NPA (Foster et al.,1989), seria possível que a
antinocicepção induzida pela estimulação elétrica destas áreas dependesse da
integridade do NPA. Villarreal et al., (2004) demonstrou envolvimento distinto
do NPtA no controle espinal de “inputs” nocivos via ativação de vias
descendentes: estímulos nocivos persistentes ativam vias a partir do NPtA
ventral, enquanto estímulos nocivos breves ativam a porção dorsal do NPA.
Resultados anteriores observados em nosso laboratório demonstraram que o
bloqueio do NPA reduz a duração, mas não a intensidade do efeito obtido pela
estimulação elétrica do córtex occipital. Enquanto que o bloqueio do NPA reduz
a duração e a intensidade do efeito obtido pela estimulação elétrica do córtex
retroesplênio, em ratos submetidos ao teste de retirada de cauda (Reis, 2007).
Nossos resultados, entretanto, mostraram que no modelo de dor persistente, o
bloqueio neural do NPA reduziu a duração e a intensidade do efeito
antinociceptivo da estimulação elétrica do córtex occipital e bloqueou efeito
similar induzido pela estimulação do córtex retroesplênio, sugerindo que o NPA
participe como uma estação intermediária na via descendente ativada por
ambas as regiões corticais, de maneira distinta de acordo com o estímulo
nocivo aplicado.
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Rossaneis, A.C.
Tendo em vista que lidocaína inibe tanto corpos celulares quanto
fibras de passagem no NPA, o próximo passo deste estudo foi investigar quais
receptores no NPA estariam envolvidos na mediação do efeito antinociceptivo
da estimulação do córtex occipital ou retroesplênio. Numerosos estudos
comportamentais sugerem a participação de receptores serotoninérgicos
(Prado, 1989; Rosa & Prado, 1997), opioidérgicos (Rees et al., 1987; Prado,
1989; Rosa & Prado, 1997 e colinérgicos muscarínicos (Rees et al., 1992) na
modulação da nocicepção pelo NPA. Desta forma, optamos por administrar
antagonistas não seletivos destes receptores no NPA a fim de investigar os
possíveis neurotransmissores envolvidos na conexão entre o córtex occipital
e/ou córtex retroesplênio e o NPA.
A prévia administração de salina no NPA não alterou o efeito
antinociceptivo da estimulação elétrica, nem alterou a hiperalgesia pós-incisão.
Corroborando resultados anteriores (Villarreal & Prado, 2007), a administração
prévia de atropina, metisergida ou naloxona no NPA diminuiu significativamente
o limiar de retirada da pata incisionada, mas não alterou o limiar de retirada da
pata contralateral.
O efeito antinociceptivo causado pela estimulação elétrica do córtex
occipital não foi alterado de modo significativo pela administração prévia de
atropina, metisergida ou naloxona no NPA. Embora o limiar da pata IL após o
estímulo elétrico tenha sido significativamente menor na presença de
metisergida do que na presença de salina no NPA, não podemos afirmar que
houve alteração do efeito, uma vez que o limiar basal após a administração de
Discussão
62
Rossaneis, A.C.
metisergida também foi menor que o limiar basal após administração de salina
no NPA.
A estimulação elétrica do córtex retroesplênio promoveu aumento
significativo do limiar de retirada da pata IL que ultrapassou o limiar basal
anterior à incisão, caracterizando efeito não apenas antinociceptivo, mas
também analgésico. O efeito antinociceptivo causado pela estimulação elétrica
do córtex retroesplênio não foi alterado pela administração prévia de atropina
no NPA. Entretanto, a administração de metisergida ou naloxona no NPA
diminuiu significativamente a intensidade e a duração do efeito antinociceptivo.
A tabela abaixo resume os resultados obtidos.
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA
ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DO
CÓRTEX OCCIPITAL
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA
ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DO
CÓRTEX RETROESPLÊNIO
INTENSIDADE
DURAÇÃO
INTENSIDADE
DURAÇÃO
LIDOCAÍNA NO
NPA
DIMINUIU DIMINUIU DIMINUIU DIMINUIU
ATROPINA NO
NPA
NÃO ALTEROU NÃO ALTEROU NÃO ALTEROU DIMINUIU
METISERGIDA
NO NPA
NÃO ALTEROU NÃO ALTEROU DIMINUIU DIMINUIU
NALOXONA NO
NPA
NÃO ALTEROU NÃO ALTEROU DIMINUIU DIMINUIU
Nossos resultados diferem, em parte, de resultados obtidos
anteriormente em nosso laboratório utilizando teste de retirada de cauda (tail-
flick), um modelo de dor fásica (Reis et al., dados não publicados). Nesse
modelo, foi observado que a via antinociceptiva ativada pela estimulação
elétrica do córtex occipital inclui a participação de receptores serotoninérgicos
localizados no NPA. A estimulação elétrica do córtex retroesplênio, por sua
Discussão
63
Rossaneis, A.C.
vez, ativa via antinociceptiva dependente de receptores opióides localizados no
NPA. No nosso modelo de dor pós-cirúrgica observamos que além dos
receptores opióides, os receptores serotoninérgicos e colinérgicos
muscarìnicos localizados no NPA também estão envolvidos na modulação da
nocicepção persistente exercida pelo córtex retroesplênio. Entretanto, não
observamos a participação de nenhum dos receptores estudados na
modulação da nocicepção persistente exercida pelo córtex occipital. Sendo
assim, podemos afirmar que os córtices estudados exercem papel fundamental
na modulação tanto da dor fásica quanto da dor pós-cirúrgica, e que embora
utilizem-se do NPA como pelo menos uma estação intermediária, os
neurotransmissores envolvidos na(s) via(s) ativada(s) pela estimulação desses
córtices são diferentes para cada tipo de estímulo nociceptivo.
É interessante ressaltar que no modelo de dor persistente, embora a
via antinociceptiva ativada pela estimulação elétrica do córtex occipital dependa
da integridade do NPA, os neurotransmissores envolvidos nessa via
permanecem desconhecidos, uma vez que nenhum dos antagonistas testados
mostrou-se eficiente na diminuição do efeito antinociceptivo. Esse resultado
poderia ser explicado por três hipóteses: 1. A via antinociceptiva ativada pelo
córtex occipital depende da participação de algum outro neurotransmissor
presente no NPA, como por exemplo, o glutamato, principal neurotransmissor
excitatório do sistema nervoso. 2. A estimulação elétrica do córtex occipital
ativa no NPA diferentes receptores ao mesmo tempo, assim, o bloqueio de
apenas um tipo de receptor no NPA não impede que os outros
neurotransmissores atuem nessa via. 3. A estimulação elétrica do córtex
occipital, além da via dependente do NPA, ativa via independente do NPA, uma
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64
Rossaneis, A.C.
vez que o bloqueio neural do NPA diminuiu significativamente, mas não
bloqueou totalmente o efeito da estimulação elétrica cortical.
Os resultados apresentados confirmam a noção de envolvimento de
receptores colinérgicos muscarínicos, serotoninérgicos e opióides na
modulação da nocicepção persistente exercida pelo NPA. Entretanto, esses
receptores localizados no NPA parecem não estar envolvidos na via
antinociceptiva ativada pelo córtex occipital, uma vez que o bloqueio seletivo
dos mesmos não diminui a antinocicepção causada pelo estímulo elétrico
cortical. Por outro lado, receptores serotoninérgicos, opióides e colinérgicos
muscarínicos do NPA estão envolvidos no efeito antinociceptivo causado pela
estimulação elétrica do córtex retroesplênio.
Os resultados comportamentais acima sugerem que a estimulação
elétrica dos córtices occipital ou retroesplênio ativa via descendente inibitória
que se utiliza do NPA, ao menos como uma estação intermediária. Além disso,
verificamos a importância dos sistemas serotoninérgico, opióide e colinérgico
muscarínico na antinocicepção induzida por estimulação elétrica do córtex
retroesplênio, entretanto tais receptores não estão envolvidos na mediação da
antinocicepção ativada pelo córtex occipital.
Discussão
65
Rossaneis, A.C.
Figura 33: Esquema ilustrativo da participação do NPA na modulação nociceptiva exercida
pelo córtex retroesplênio na nocicepção persistente.
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Rossaneis, A.C.
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