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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Faculdade de Farmácia
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Desenvolvimento e avaliação de uma formulação tópica
contendo zinco ftalocianina para uso na terapia fotodinâmica
do câncer de pele
Eduardo Rodrigues da Silva
Rio de Janeiro
2009
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DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO TÓPICA
CONTENDO ZINCO FTALOCIANINA PARA USO NA TERAPIA FOTODINÂMICA
DO CÂNCER DE PELE.
Eduardo Rodrigues da Silva
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade
de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Ricci Júnior
Co-Orientadora: Drª. Zaida Maria F. de Freitas
Rio de Janeiro
2009
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DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO TÓPICA
CONTENDO ZINCO FTALOCIANINA PARA USO NA TERAPIA FOTODINÂMICA
DO CÂNCER DE PELE.
Eduardo Rodrigues da Silva
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade
de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador
Prof. Dr. Eduardo Ricci Júnior
Faculdade de Farmácia - UFRJ
Co-Orientadora
Drª. Zaida Maria Farias de Freitas
Faculdade de Farmácia – UFRJ
Banca Examinadora
Profª. Drª. Elizabete Pereira dos Santos
Faculdade de Farmácia – UFRJ
Profª. Drª. Lycia de Brito Gitirana
Instituto de Ciências Biomédicas – UFRJ
Prof. Dr. Davi Pereira de Santana
Departamento de Farmácia – UFPE
Prfoª. Drª Carla Holandino Quaresma
Faculdade de Farmácia UFRJ
Profª. Drª. Priscilla Vanessa Finotelli
Faculdade de Farmácia - UFRJ
AGRADECIMENTOS
A Deus pela oportunidade de estar cada vez mais evoluindo em todos os aspectos de
minha vida;
A minha mãe Adelaide por todo apoio e incentivo, por ser exemplo de profissional e
de pessoa, por todo amor possível, dedicação e carinho;
Ao meu pai Arildo por todo incentivo, exemplo, amor, conversas e descontrações
durante nossas inúmeras conversas e viagens de ida e volta para o Fundão e também durante
nossos encontros de família ou amigos;
A minha irmã Carolina, amiga e exemplo de dedicação aos estudos e aos objetivos de
vida;
A minha namorada Anna Carolina, por ser tão incrível, tão companheira e amiga,
suportando todos os momentos de tensão ao meu lado e sempre me passando cada vez mais
força e exemplo de dedicação;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Eduardo Ricci, por ter me aceito como aluno e
possibilitado meu ingresso nesta jornada. Obrigado pela paciência, pelos ensinamentos
científicos e sabedoria transmitida, pelos momentos de descontração e pelo apoio;
A minha co-orientadora, Zaida, por ter participado de forma intensa e dedicada nesse
trabalho. Por sua competência, boa vontade, entusiasmo e pelas cobranças, além também dos
momentos de descontração proporcionados;
Ao LADEG e à Farmácia Universitária por todo apoio financeiro e moral;
À coordenadora do curso de Pós Graduação professora Gisela Dellamora Ortiz pelo
empenho e boa vontade e aos funcionários da coordenação de pós-graduação;
Aos meus companheiros de Farmácia Universitária e de momentos que ficarão para
sempre guardados comigo. Em momentos difíceis e complicados eles sempre estavam lá para
me fazer sorrir, fosse através de conversas, piadas e outros. Sempre poderei contar com
Ricardo, Oacir, Vicente, Enoch, Paulo, Carlinhos Cabeça, Carlinhos e Sr. Orcalino. A parte
feminina com Maria Amélia, grande incentivadora e profissional; Cléo, sempre feliz e
soltando piadas e sonhos mirabolantes; Profª Elisabete, toda sua sabedoria e humor
intelectual; Gláucia, com seu incentivo e dicas de quem também já passou por esse momento;
Naira, por toda diversão, dicas, carinho e ajuda; Renata e Fabiane por todos os momentos
“malhação” e divertidos; farmacêuticas Camila, Iolanda e Michela. Muito obrigado a todos
vocês que fazem parte, e muito, disso;
À professora Rita de Cássia, um agradecimento especial, por ter me acolhido há cinco
anos atrás e dessa forma me passado toda sua sabedoria, ética e confiança. Uma pessoa que
sempre me apoiou de forma incondicional e me incentivou, a qual sou muito grato por ser
esse profissional de hoje;
A todos os companheiros de trabalho, Thaís, Hanne, Lucas, Jaque, Priscila, Márcia,
Fernanda, Fernanda Cruz, Natália, enfim, todos os monitores que convivi. A companheira de
trabalho e estudo Camila, obrigado por todas as resoluções de problemas;
A todos os companheiros do LADEG, Débora, Aline, Bárbara, Ana Karla e tantos
outros;
À minha sempre companheira Marianinha, amiga de conversas, idéias, reclamações,
obrigado por tudo;
À Professora Lycia Gitirana e a todos do Laboratório de Histologia Animal e
Comparada, por toda boa vontade nos ensinamentos de microscopia e na obtenção dos cortes,
além dos inúmeros momentos de diversão passados ao seu lado;
À professora Carla Holandino por todo companheirismo e sabedoria demonstrados ao
longo desses anos na farmacotécnica, além de ser muito grato por toda sua contribuição na
banca de acompanhamento;
Ao professor Luis Maurício Trambaioli pelos ensinamentos de fluorimetria;
Ao LabCQ pelo apoio com instrumentos de pesquisa;
À professora Priscilla Vanessa Finotelli pelo seu empenho e ajuda na banca de
acompanhamento;
Aos pesquisadores da Fiocruz Luzia e Pedro pela boa vontade e auxílio na análise e
produção do material histológico;
À técnica Cesônia pela boa vontade na obtenção de cortes histológicos em criostato;
À professora Bartira Rossi Bergmann por toda a atenção e por ter cedido os
camundongos hairless;
Ao Instituto de Zootecnia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e a todos
envolvidos nos cuidados da Fazenda pela gentileza e cooperação no fornecimento das orelhas
suínas;
À professora Morgana do Laboratório de Histologia Animal e Comparada pela boa
vontade em momentos de dúvidas;
Ao professor Alexandre Pirrho pela disponibilização de espaço em seu biotério;
A todos os meus queridos companheiros da Faculdade de Farmácia da UFRJ. Dentre
esses podemos citar alguns especiais: Paulinha, Maura, Tailane, Marianinha, Paola, Bianca,
além de alguns respectivos como Rafael Agostinho, Flavinho e Rafael, amigos de hoje e
sempre que estão ao meu lado apoiando, brincando e transmitindo bons fluidos. Tantos outros
como Flavius, Rodrigo Pedrinha, Rafael PC, Felipe Miojo, Rafael Catatau, Daniel, Patrícia,
Nandol, Flavinha, Fernanda, Pablo, Sting, Duda, enfim todos os queridos companheiros de
faculdade que me deram o prazer de serem meus amigos;
Aos amigos de UFRJ Guilherme, Carlinhos, Leozinho e Lula. Obrigado por todo
divertimento, por nossas sextas no Gil, por todo incentivo, por todo carinho e por serem
amigos meus;
Aos meus primos Matheus, Bárbara, Daniele, Alexandre, Isabela, Elaine, Vitória,
Isabela, Daniel, Ana Paula, Felipe, Felipe Davi, Fabiano, Paulo, Júnior, Cid, pelas risadas e
alegrias;
Aos meus avós Álvaro (in memorium) e Amélia por todo incentivo, amor e exemplo.
A minha avó Noêmia (in memorium) por todo carinho;
Aos meus padrinhos Fátima e Orlando, pelo amor que sempre me dedicaram e por de
alguma forma, estar sempre ao meu lado;
Aos meus tios Davi, Solair, Alair, Idalina, Aroldo, Jonilce, Maria e todos os outros,
pelas orações e pelo carinho;
Ao Nazareno por todo exemplo, sabedoria e momentos de diversão passados juntos;
Ao Bruno pela amizade, exemplo e momentos divertidos vividos;
À minha nova família, Marcus, Márcia, Bernardo, Manu, Ernesto, Aurora, André,
Bárbara, Fernando, Serginho, Carla, Marina, Natália, Zé, Blanche, Diogo, Daniel, Raquel e
João, obrigado por tudo que venho aprendendo e passando com vocês. Obrigado por todo
carinho, incentivo. Agradeço a cada dia por ter encontrado pessoas de tão bom coração em
minha vida;
Finalmente devo agradecer a pessoas muito especiais que constituem uma família. Aos
meus amigos de São Gonçalo fica aqui todo meu agradecimento por existirem em meu
caminho, por tudo que vivem e que passaram ao meu lado, por todo carinho e
companheirismo demonstrado ao longo de todos esses anos. Obrigado Thiago, Marquinho,
Marcelo, Paulinho, Paulo, Vinícius, Caio, Roberto, Rafael, Stanley, Gelson, Bismark,
Quintão, Guilherme, Hugo, André, Reinaldo, Higor, Topini, Marcinho, Dani, Peninha, Taíssa,
Ana, Gláucia, Márcia, Monique, Margareth, Clarinha, Marcele, Suellen, Pamela.
RESUMO
DA SILVA, Eduardo Rodrigues. Desenvolvimento e avaliação de uma formulação tópica
contendo zinco ftalocianina para uso na terapia fotodinâmica do câncer de pele. Rio de
Janeiro, 2009. (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal do Rio de janeiro, 2009.
O câncer é uma das doenças mais disseminadas entre a população mundial e a combinação do
aumento intencional da exposição ao sol com a diminuição da proteção exercida pela camada
de ozônio, têm levado a um aumento epidêmico de câncer de pele, especificamente. Tendo em
vista todas as desvantagens relacionadas aos tratamentos clássicos, alguns atuais, como a
terapia fotodinâmica (TFD), têm surgido visando melhorar a resposta e a qualidade de vida do
paciente. Dessa forma, o desenvolvimento de uma formulação que proporcione um aumento
da penetração e da retenção do fotossensibilizante no tecido cutâneo poderá otimizar o efeito
fototerápico do tratamento do câncer de pele do tipo não melanoma através da TFD tópica.
Dentre os fotossensibilizantes, as ftalocianinas, como as de zinco (ZnPc) se destacam por
apresentar elevada atividade fotofísica, fotodinâmica e fototerápica. O objetivo deste trabalho
visa caracterizar e avaliar o comportamento biofarmacotécnico de cinco formulações
desenvolvidas, contendo o fotossensibilizante ZnPc na concentração de 200µg/mL associado
a diferentes concentrações (5, 10, 20, 30%) de ácido oléico (AO) ou na ausência desse,
sempre veiculado em propilenoglicol. A formulação de melhor desempenho nos ensaios in
vitro, foi empregada nos estudos de localização por microscopia confocal e de atividade
fotodinâmica in vivo. As formulações propostas se apresentaram na forma de solução, sendo
aquelas contendo 10, 20 e 30% de AO as mais estáveis. Um sistema bicompartimental de
difusão vertical com membrana sintética (acetato de celulose) foi empregado para avaliar in
vitro a taxa de liberação. O mesmo, com membrana natural (pele suína), foi empregado na
avaliação da penetração, e eventual permeação e retenção do fármaco. Todas as amostras
foram analisadas pelo método espectrofluorimétrico previamente padronizado. Os ensaios de
liberação in vitro mostraram que formulações contendo menor concentração de AO liberaram,
de forma significativa, mais facilmente a ZnPc. A quantidade de ZnPc nas camadas da pele
suína diminuiu com a profundidade, evidenciando uma atividade tópica. Em todas as
formulações foi detectada maior quantidade de ZnPc na epiderme em relação à derme. A
formulação contendo 10% de AO apresentou um melhor perfil de penetração e retenção
cutânea da ZnPc, sendo escolhida para estudos posteriores. Nos estudos in vivo, a formulação
contendo ZnPc e 10% de AO não apresentou toxicidade na ausência de luz. Com a irradiação
foi verificado um aumento do infiltrado inflamatório e uma descamação intensa na região da
epiderme. Face aos resultados obtidos, a formulação contendo 10% de AO apresentou
potencial promissor para o tratamento tópico do câncer de pele do tipo não-melanoma através
da TFD.
Palavras-chave: terapia fotodinâmica, zinco ftalocianina, ácido oléico.
ABSTRACT
DA SILVA, Eduardo Rodrigues. Development and evaluation of a topical formulation
containing zinc phthalocyanine for use in photodynamic therapy of skin cancer. Rio de
Janeiro, 2009. (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal do Rio de janeiro, 2009.
Cancer is one of the most widespread diseases among the population and the combination of
the increase of intentional exposure to the sun with the decrease of the protection exerted by
the ozone layer has led to growing epidemic of skin cancer specifically. Bearing in mind all
the disadvantages related to conventional treatments some current cancer treatments such as
photodynamic therapy (PDT) have emerged to improve the responsiveness and quality of life.
Thus, developing a formulation that provides increased penetration and retention of
photosensitizes the skin tissue can optimize the effect of phototherapy treatment of skin
cancer in non-melanoma type through topic PDT. Among photosensitizes the phthalocyanine,
such as zinc (ZnPc) are distinguished by having high photophysical, photodynamic and
phototherapy activity. This work aims to characterize and evaluate the biopharmacotechnical
behavior of five developed formulations containing the photosensitizes ZnPc in the
concentration of 200µg/mL associated with different concentrations (5, 10, 20, 30%) of oleic
acid (OA) or failing that, when run in propylene glycol. The formulation of better
performance in in vitro tests would be used in studies of localization by confocal microscopy
and photodynamic activity in vivo. The proposed formulations are presented in the solution
form, and those containing 10, 20 and 30% of OA were the most stables. A bicompartmental
vertical diffusion system using a synthetic membrane (cellulose acetate) was used to assess
drug release in vitro. The same with natural membrane (porcine skin) was used in the
evaluation of penetration, and possible permeation and retention of the drug. All samples were
analyzed by previously standard spectrofluorimetric method. The in vitro release tests showed
that formulations containing lower concentration of AO easier released the ZnPc. The amount
of ZnPc layers of skin in pigs decreased with depth, showing a topical activity. In all
formulations was found higher amount of ZnPc in the epidermis compared to dermis. The
10% OA containing formulation showed a better profile of skin penetration and retention of
ZnPc, and chosen for further studies. In in vivo studies, the formulation containing ZnPc and
10% of OA showed no toxicity in the absence of light. With irradiation has been an increase
in inflammatory infiltrate and an intense desquamation in the epidermis. Given the results, the
formulation containing 10% of OA is shown promising for the topical treatment of skin
cancer type of non-melanoma by PDT.
Keywords: photodynamic therapy, zinc phthalocyanine, oleic acid.
LISTA DE EQUAÇÕES
Pág.
EQUAÇÃO 1: Primeira Lei de Fick. 49
EQUAÇÃO 2: Segunda Lei de Fick. 50
EQUAÇÃO 3: Quantidade de fármaco permeada por área em determinado 50
período de tempo.
EQUAÇÃO 4: Teoria do Lag time. 50
EQUAÇÃO 5: Desvio padrão relativo. 67
EQUAÇÃO 6: Exatidão. 67
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Pág.
FIGURA 1: Evolução do dano celular e proliferação das células cancerosas. 26
FIGURA 2: Tipos de lesões cutâneas: Queratose actínica, Carcinoma de 29
CélulasBasais, Carcinoma de Células Escamosas e Melanoma.
FIGURA 3: Tratamento utilizando a terapia fotodinâmica. 33
FIGURA 4: Teorema de Jablonski. 34
FIGURA 5: Reações desencadeadas pelo fotossensibilizante em seu estado 35
triplete.
FIGURA 6: Mecanismo de ação da TFD na eliminação das células cancerosas. 38
FIGURA 7: Zinco ftalocianina. 43
FIGURA 8: Camadas da pele e estrutura da epiderme. 44
FIGURA 9: Representação diagramática da penetração de fármacos na 48
pele por meio das vias
intercelular, transcelular e trananexal,
com detalhe do espaço intercelular
.
FIGURA 10: Gráfico representativo de uma regressão linear confrontando 51
quantidade de fármaco permeado por área e tempo.
FIGURA 11: Estrutura molecular do ácido oléico nos modelos de linha de 57
ligação e de bola com vareta.
FIGURA 12: Estrutura molecular do propilenoglicol nos modelos de linha 58
de ligação e de bola com vareta.
FIGURA 13: Obtenção da amostra de pele suína para realização de estudos 74
de penetração e permeação cutânea.
FIGURA 14: Modelo de fixação (A) e retirada (B) de fitas para realização do 76
tape-stripping.
FIGURA 15: Esquema da técnica histológica de inclusão. 78
FIGURA 16: Bateria de coloração com hematoxilina de Harris e eosina, 79
utilizando borréis.
FIGURA 17: Preparo de cortes para realização da microscopia confocal. 80
FIGURA 18: Modelo utilizado no estudo in vivo e camundongo hairless 82
com a formulação teste administrada em área delimitada.
FIGURA 19: Aplicação de laser na região delimitada de aplicação da 83
formulação.
FIGURA 20: Aparelho Photon Lase I utilizado na irradiação. 84
FIGURA 21: Espectro de absorção da ZnPc em pirrolidona e em tampão 86
fosfato pH 7,4 contendo 2% de SDS.
FIGURA 22: Espectro de emissão de fluorescência da Zinco ftalocianina em 89
1-meti-2-pirrolidona e em tampão fosfato com 2% de SDS.
FIGURA 23: Espectros de emissão de fluorescência da ZnPc em SDS nas 91
concentração utilizadas para elaboração da curva padrão.
FIGURA 24: Curva analítica da ZnPc em tampão fosfato contendo 2% de 93
SDS obtida no 1º dia da padronização da metodologia analítica.
FIGURA 25: Curva analítica da ZnPc em tampão fosfato contendo 2% de 94
SDS obtida no 2º dia da padronização da metodologia analítica.
FIGURA 26: Espectros de emissão de fluorescência da ZnPc em 96
1-metil-2-pirrolidona nas concentrações utilizadas para
elaboração da curva padrão.
FIGURA 27: Curvas analíticas da zinco ftalocianina em 2-metilpirrolidona 98
obtidas no 1º dia da padronização da metodologia analítica.
FIGURA 28: Curvas analíticas da zinco ftalocianina em 2-metilpirrolidona 98
obtidas no 2º dia da padronização da metodologia analítica.
FIGURA 29: Microscopia de campo claro e de luz polarizada para cada 101
formulação proposta.
FIGURA 30: Espectros de absorção da ZnPc (10µg/mL) obtidos de diluições 103
preparadas a partir das formulações propostas e de uma solução
de 1-metil-2-pirrolidona.
FIGURA 31: Imagens macroscópicas das formulações durante os dias de 105
avaliação.
FIGURA 32: Espectro de emissão de fluorescência da ZnPc e da pele em 107
1-metil-2-pirrolidona e em tampão fosfato contendo 2% de SDS.
FIGURA 33: Perfil de liberação in vitro da ZnPc a partir das formulações 108
desenvolvidas.
FIGURA 34: Regressão linear obtida após aplicação do modelo matemático 109
de Ordem zero nos dados do perfil de liberação in vitro.
FIGURA 35: Regressão linear obtida após aplicação do modelo matemático 110
de Higuchi nos dados do perfil de liberação in vitro.
FIGURA 36: Quantidade acumulativa de ZnPc no meio receptor dos estudos 114
de permeação in vitro utilizando pele suína após 24 horas.
FIGURA 37: Quantidade de ZnPc extraída do estrato córneo (EC) e epiderme 115
sem EC mais derme após a aplicação das formulações contendo
ZnPc em propilenoglicol adicionadas de diferentes concentrações
de AO.
FIGURA 38: Microscopia óptica de campo claro dos fragmentos de 118
pele suína submetidos a técnica de tape-stripping.
FIGURA 39: Imagens por microscopia confocal de secções com espessura 120
de 7µm derivadas de fragmentos de pele suína tratada com
a formulação B.
FIGURA 40: Imagens da pele suína por MVLC em determinados 122
comprimentos de onda.
FIGURA 41: Camundongos fotografados 48hs após a aplicação da 123
formulação e a irradiação.
FIGURA 42: Microscopia de campo claro da pele de ratos sem aplicação 124
da formulação e sem irradiação luminosa.
FIGURA 43: Microscopia de campo claro da pele de ratos com aplicação 125
de 200µL da formulação e sem irradiação luminosa.
FIGURA 44: Microscopia de campo claro da pele de ratos com aplicação 127
de 200µL da formulação e com irradiação luminosa.
LISTA DE TABELAS
Pág.
TABELA 1: Composição das formulações. 68
TABELA 2: Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da 92
ZnPc em tampão fosfato contendo 2% de SDS durante a
padronização da metodologia (1º Dia).
TABELA 3: Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da 92
ZnPc em tampão fosfato contendo 2% de SDS durante a
padronização da metodologia (2º Dia).
TABELA 4: Precisão e Exatidão intra-dia e inter-dias do método 95
analítico de quantificação da ZnPc em meio aquoso.
TABELA 5: Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da 97
ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona durante a validação da
metodologia (1º Dia).
TABELA 6: Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da 97
ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona durante a validação da
metodologia (2º Dia).
TABELA 7: Precisão e Exatidão intra-dia e inter-dias do método 99
analítico de quantificação da ZnPc em meio orgânico.
TABELA 8: Coeficiente de correlação de Pearson (r) obtido após regressão 110
linear dos dados de liberação in vitro ajustados de acordo com
modelos matemáticos de Ordem zero e Higuchi.
TABELA 9: Fluxo de equilíbrio da ZnPc da formulação controle e das 111
formulações contendo diferentes concentrações de ácido
oléico e correspondentes Lag time.
TABELA 10: Quantidade de ZnPc (ng/cm
2
) extraída do EC e epiderme 116
remanescente + derme após os estudos de penetração
e retenção cutânea.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-ALA – ácido 5-aminolevulínico.
DNA – ácido desoxirribonucléico.
RNA – ácido ribonucléico.
AO – ácido oléico.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
ANOVA – Análise de variância.
CCB – carcinoma de células basais.
CCE – carcinoma de células escamosas.
Cito C – citocromo C.
PVC – Cloreto de Polivinila.
CEUA – Comissão de Ética com Uso de Animais.
CI – conversões internas.
CSI – cruzamento inter-sistema.
D.P. – Desvio padrão.
DPR – Desvio padrão relativo.
DMF – dimetilformamida.
DMSO - dimetilsulfóxido.
SDS – dodecil sulfato de sódio.
DB – doença de Bowen.
EROS – espécies reativas de oxigênio.
EC – estrato córneo.
FDA – Food and Drug Administration.
F – fotossensibilizante.
HOMO - highest occupied molecular orbital.
IBCCF - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
INCA – Instituto Nacional do Câncer.
LADEG – Laboratório de Desenvolvimento Galênico.
LUMO - lowest unoccupied molecular orbital.
M.D. – Média.
MVLC - Microscopia de varredura a laser confocal.
Sub – molécula de substrato.
q.s.p – quantidade suficiente para.
QA – queratose aquitínica.
RDC – Resolução da diretoria colegiada.
RPM – Rotações por minuto.
TFD – Terapia Fotodinâmica.
UV – Ultravioleta.
UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro.
UFRRJ – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
VIS – visível.
ZnPc - Zinco ftalocianina.
LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES
% - Percentual.
H
2
O
2
– peróxido de hidrogênio.
HO
·
- radical hidroxila.
O
2
-·
- ânion superóxido.
1
O
2
– oxigênio singleto.
S
0
– estado singleto.
S
n
– estados singleto superiores.
S
1
primeiro estado singleto.
s – segundo (s).
T
1
– estado tripleto excitado.
3
O
2
– oxigênio molecular.
µm – micrômetro (s).
Apaf – 1 – agregado protease-fator de ativação apopitótico.
Ca
+2
– íon cálcio.
Ca-ATPase – proteínas transmembrânicas transportadoras de cálcio.
NO – óxido nítrico.
λ– Comprimento de onda.
nm – nanômetro.
m
2
– metro (s) quadrado (s).
SS – steady-state.
J
ss
– fluxo no estado estacionério por área.
Kp – coeficiente de partição do fármaco entre a formulação e a pele.
D – coeficiente de difusão do fármaco.
h – comprimento difusional.
Α – área.
C
r
– compartimento receptor.
C
d
– compartimento doador.
C
h
– membrana.
P – coeficiente de permeabilidade.
∆C – variação de concentração.
Q/A – quantidade de fármaco permeada por determinada área.
t
Lag
– lag-time.
cm
2
- centímetro(s) quadrado(s).
g/mL – grama (s) por mililitro.
°C – Graus Celsius.
C
18
– dezoito átomos de carbono.
g/mol – grama (s) por molécula.
C
10
– dez átomos de carbono.
C
12
– doze átomos de carbono.
mg – miligrama (s).
mL – mililitro (s).
µL – microlitro (s).
µg/mL – micrograma (s) por mililitro.
ng/mL – nanograma (s) por mililitro.
pH – Potencial de hidrogênio iônico.
g – grama (s).
N – normal (equivalentes por litro).
min – minuto (s).
mg/mL – miligrama (s)/ mililitro.
λ
ex
– Comprimento de onda de excitação.
λ
em
– Comprimento de onda de emissão.
n – número de réplicas.
DPR% - precisão.
E% - exatidão.
R
2
– Coeficiente de determinação.
r – coeficiente de correlação de Pearson.
g – gravidade (s).
µg/cm
2
– micrograma (s) por centímetro quadrado.
hs – horas.
h
1/2
– raiz quadrada do tempo.
µg.cm
-2
.h
-1
– micrograma (s) por centímetro quadrado por hora.
mW – miliwatts.
J/cm
2
– joule (s) por centímetro quadrado.
µg – micrograma(s).
p – Nível de probabilidade.
SUMÁRIO
Pág.
1 INTRODUÇÃO 22
2 REVISÃO DA LITERATURA 25
2.1 Câncer 25
2.2 Câncer de pele 27
2.3 Tratamentos do câncer 30
2.4 Terapia Fotodinâmica 30
2.5 Fotossensibilizantes 40
2.6 Pele 44
2.7 Pele como via de administração de fármacos 46
2.8 Estudos in vitro 51
2.9 Formas Farmacêuticas 54
2.10 Promotores químicos de penetração e/ou permeação cutânea 56
3 OBJETIVOS 60
3.1 Objetivo geral 60
3.2 Objetivos específicos 60
4 MATERIAL E MÉTODOS 61
4.1 Matérias-primas 61
4.2 Reagentes e solventes 61
4.3 Equipamentos 62
4.4 Métodos 63
4.4.1 Avaliação da solubilidade da ZnPc em solventes orgânicos 63
4.4.2 Estudos espectroscópicos de absorção e emissão de fluorescência 63
4.4.3 Padronização da metodologia analítica para a quantificação da ZnPc por 65
espectrofluorimetria em meio aquoso
4.4.4 Padronização da metodologia analítica para a quantificação da 67
ZnPc por espectrofluorimetria em meio orgânico
4.4.5 Preparação das formulações 68
4.4.6 Avaliação microscópica das formulações propostas 69
4.4.7 Avaliação da estabilidade das formulações propostas 69
4.4.8 Análise de interferentes 70
4.4.9 Estudos in vitro 71
4.4.9.1 Estudos in vitro de liberação da ZnPc em membrana sintética 71
4.4.9.2 Estudos in vitro de retenção, penetração e permeação cutânea 73
4.4.9.2.1 Preparo da pele suína 73
4.4.9.2.2 Protocolo da permeação in vitro das formulações contendo ZnPc 74
4.4.9.2.3 Protocolo da penetração e retenção in vitro das formulações 75
contendo ZnPc
4.4.9.2.4 Avaliação microscópica da remoção de camadas do estrato 77
córneo por fitas adesivas
4.4.10 Avaliação da distribuição da ZnPc nas camadas da pele por 79
microscopia de varredura a laser confocal (MVLC)
4.4.11 Estudos de fototoxicidade e toxicidade cutânea in vivo em 81
modelo animal
4.4.12 Análise estatística 84
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 85
5.1 Avaliação da solubilidade da ZnPc em soventes orgânicos 85
5.2 Estudos espectroscópicos de absorção e emissão de fluorescência 85
5.3 Padronização da metodologia analítica para a quantificação de 90
ZnPc por espectrofluorimetria em meio aquoso
5.4 Padronização da metodologia analítica para a quantificação da 95
ZnPc por espectrofluorimetria em meio orgânico
5.5 Preparo das formulações 100
5.6 Avaliação da estabilidade das formulações 102
5.7 Análise de interferentes 106
5.8 Estudos de liberação in vitro em membrana sintética 108
5.9 Estudos de permeação in vitro em pele suína 113
5.10 Estudos de penetração e retenção cutânea 115
5.11 Avaliação microscópica da retirada de camadas do estrato córneo 118
por fitas adesivas
5.12 Avaliação da distribuição da ZnPc nas camadas da pele por 119
microscopia de varredura a laser confocal (MVLC)
5.13 Estudos de fototoxicidade e toxicidade cutânea in vivo em 122
modelo animal
6 CONCLUSÕES 129
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 131
8 ANEXO 146
22
1 INTRODUÇÃO
Desde o início da década de sessenta a liberação de fármacos tem sido foco de muita
atenção, uma vez que as formulações e os sistemas de liberação constituem formas de grande
potencial terapêutico e econômico. Assim, o desenvolvimento dessas formas farmacêuticas de
liberação constitui uma área em ascensão dentro da tecnologia farmacêutica, já que torna
possível a modulação da liberação de fármacos a partir destas.
Recentemente, vem sendo descrito na literatura científica, o desenvolvimento de
formulações para uso na terapia fotodinâmica (TFD) de doenças cutâneas que envolvem a
administração tópica de fotossensibilizante. Essa administração local é vantajosa porque: (1)
possibilita uma liberação sítio específica do fotossensibilizante no seu local de ação, que
nesse caso é a pele; (2) promove um maior acúmulo do fotossensibilizante no sítio alvo,
possibilitando redução da dose a ser administrada ao paciente; (3) limita a fotossensibilização
cutânea ao local de administração da formulação, evitando a fotossensibilização generalizada,
como pode ocorrer na administração intravenosa de fotossensibilizantes (WOOTEN et al.,
1988).
A baixa solubilidade e estabilidade de muitos fotossensibilizantes em veículos aquosos
e a reduzida concentração dos mesmos nos tecidos tumorais limitam o uso da TFD. Essas
limitações têm estimulado a tecnologia farmacêutica a pesquisar veículos de liberação
adequados para a incorporação dos fotossensibilizantes. Esses veículos atuam na resolução de
problemas referentes à solubilidade e a estabilidade dos fotossensibilizantes, além de
facilitarem a penetração e a liberação sítio específica do fotossensibilizante na pele
(HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; DOUGHERTY & POTTER, 1991; BRASSEUR,
1985).
A protoporfirina IX é um fotossensibilizante de primeira geração muito utilizado na
TFD de diversos tipos de câncer. Ela apresenta algumas desvantagens como a baixa absorção
23
de energia na região do vermelho. Além disso, não é conveniente a administração tópica da
protoporfirina IX pelo fato dela ser degradada por enzimas da pele, sendo necessária a
administração intravenosa, que implica ao paciente permanecer protegido da luz solar por um
período de quatro a seis semanas para evitar reações generalizadas de fotossensibilização
cutânea (KENNEDY, 1990). As formulações contendo o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA),
pró-fármaco da protoporfirina IX, apresentam bons resultados quando aplicadas topicamente
(KENNEDY, 1990). Porém, após a bioconversão deste em protoporfirina IX, o antigo
problema da baixa absorção de luz na região do vermelho ainda persiste (OCHSNER, 1997),
sendo necessária uma maior quantidade de 5-ALA na formulação para um efeito desejado na
TFD. A desvantagem do uso do 5-ALA é o custo da formulação, já que o 5-ALA é um
princípio ativo caro. Uma alternativa economicamente viável a protoporfirina IX e ao 5-ALA
é a Zinco ftalocianina (ZnPc), que por apresentar grande atividade fototerapêutica aparece
como fotossensibilizante de escolha em vários estudos recentes (MACHADO et al., 2009;
PRIMO et al., 2008).
Atualmente a ZnPc é utilizada na pesquisa básica e clínica em TFD sistêmica que
envolve a administração sistêmica do fotossensibilizante incorporado em sistemas de
liberação nanoestruturados como lipossomos e nanopartículas (RICCI-JÚNIOR &
MARCHETTI, 2006a e 2006b). Uma desvantagem da administração sistêmica da ZnPc é a
fotossensibilização generalizada que pode ser evitada pela não exposição do paciente a luz
solar. Uma alternativa inteligente e viável é a administração tópica da ZnPc nas áreas de lesão
cutânea evitando a fotossensibilização generalizada.
O desenvolvimento de uma formulação que proporcione um aumento da penetração e
da retenção da ZnPc no tecido cutâneo poderá otimizar o efeito fototerápico do tratamento do
câncer de pele do tipo não melanoma empregando a TFD tópica. O sucesso desta terapia
depende da concentração e do grau de profundidade do fotossensibilizante na pele. O veículo
24
escolhido para incorporação da ZnPc é uma mistura de propilenoglicol e ácido oléico em
várias proporções, sendo este economicamente viável, seguro e biocompatível. Enquanto o
ácido oléico é o componente da formulação responsável por melhorar a penetração e retenção
do fotossensibilizante na pele, o propilenoglicol fornece viscosidade ideal e bioadesão
facilitando a aplicação da formulação na pele.
A formulação foi desenvolvida e caracterizada quanto a liberação in vitro utilizando
um modelo de difusão bicompartimental com membrana sintética, permeação in vitro
utilizando menbrana natural e penetração/retenção cutânea do fotossensibilizante. Ensaios in
vivo de toxicidade e fototoxicidade cutânea em modelo animal foram realizados para avaliar a
biocompatibilidade e a eficácia da formulação, respectivamente.
25
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Câncer
O câncer é uma das doenças mais disseminadas entre a população mundial e a sua
incidência vem crescendo todos os anos devido a vários fatores relacionados a estresse,
alimentação, tabagismo, alcoolismo, doenças e exposição excessiva ao sol, isto é, fatores
químicos, físicos ou biológicos (BRASILEIRO FILHO, 1994).
Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) (BRASIL, 2007), num total de 58
milhões de mortes ocorridas no mundo em 2005, o câncer foi responsável por 7.6 milhões,
cerca de 13% do total, sendo 70% dessas mortes localizadas em países de média ou baixa
renda. No Brasil, as estimativas para o ano de 2008, também pertinentes para 2009, apontam
que ocorreram 466.730 novos casos de câncer. Entre as neoplasias, o câncer de pele do tipo
não-melanoma é o que apresentará maior incidência tanto em homens como em mulheres,
seguido pelos tumores de próstata, mama, pulmão, cólon e reto, estômago e colo do útero
(BRASIL, 2007).
A patogenia do câncer engloba um grupo de mais de cem doenças nas quais células
maduras e diferenciadas em uma determinada parte do corpo iniciam um crescimento
desordenado. Normalmente, as células se dividem rapidamente apenas nos primeiros anos de
vida de uma pessoa voltando a acontecer caso exista alguma necessidade de reposição em
decorrência de lesão tecidual (ESTADOS UNIDOS,
2009).
No câncer, essa proliferação acelerada se origina com uma mudança na estrutura do
DNA, que pode transformar a célula normal em uma célula tumoral (iniciada) dependendo da
mutação do gene que controla o ciclo celular (PÓNTEN et al., 1990). A célula com alteração
do DNA, na maioria das vezes, morre ou sobrevive após reparo feito por mecanismos
celulares. Entretanto, quando há modificação não letal do DNA e os mecanismos de reparo
falham pode surgir uma célula tumoral (ESTADOS UNIDOS,
2009). O processo de
26
transformação de uma célula normal em cancerosa envolve usualmente a ativação de
oncogenes e/ou a inibição da atividade de genes supressores tumorais, como é o caso do P53
antes de uma mutação (PÓNTEN et al., 1990; NIGRO et al., 1989). Após essa etapa de
promoção a célula tumoral pode gerar clones que proliferam descontroladamente, apresentam
um crescimento autônomo e perda da diferenciação celular onde se verifica a produção de
fatores de crescimento e citocinas (DE VITA, 1997; PÓNTEN et al., 1990). Pelo fato das
células cancerosas continuarem a se dividir, ao invés de morrerem continuam se
multiplicando até a formação de uma massa tumoral (Figura 1).
Figura 1. Evolução do dano celular e proliferação das células cancerosas. Adaptado de ESTADOS
UNIDOS,
2006.
No caso da leucemia esse tumor não se forma, porém as células tumorais podem
circular pelo organismo até se fixarem em um determinado órgão e iniciar ali sua
multiplicação, originando uma metástase, comum também a vários outros tipos de câncer
(ESTADOS UNIDOS,
2009).
27
2.2 Câncer de pele
A combinação do aumento intencional da exposição ao sol com a diminuição da
proteção exercida pela camada de ozônio tem levado a um aumento epidêmico de câncer de
pele (WELCH, WOLOSHIN & SCHWARTZ, 2005; GELLER, 2003). Os efeitos nocivos da
radiação ultravioleta (UV) proveniente da luz solar sobre a pele são bem conhecidos: eritema,
edema, produção de pigmentos e conseqüente bronzeamento, espessamento da epiderme e
derme, fotoenvelhecimento e lesões cutâneas pré-cancerosas e cancerosas (SCALIA, 2006;
KULLAVANIJAYA & LIM, 2005; MERUALD et al., 2005; SCALIA, 2002).
No Brasil, o Ministério da Saúde estimou para o biênio 2008/2009 que o número de
pessoas com câncer de pele não-melanoma corresponderá a, aproximadamente, 115.010, em
um total 500.000 casos de câncer no país (BRASIL, 2007). Pela estimativa geral, 55.890
casos de câncer de pele não-melanoma se manifestarão em homens e 59.120 em mulheres,
sendo, portanto, do número total de tipos de câncer, o mais incidente na maioria das regiões
do Brasil. As exceções se localizam na região Centro-Oeste, onde está em segundo lugar
(entre os homens) e na região Sudeste também com o segundo lugar ocupado (entre as
mulheres) (BRASIL, 2007).
A lesão pré-cancerosa mais disseminada é a queratose aquitínica (QA), enquanto que o
carcinoma células basais (CCB), o carcinoma de células escamosas (CCE), a doença de
Bowen (DB) e o melanoma são os cânceres de pele mais comuns, além desses, podemos
encontrar em menor freqüência o dermatofibrosarcoma protuberante e o carcinoma celular de
Merkel (ZEITOUNI, OSEROFF & SHIEH, 2003). Os cânceres do tipo não melanoma (CCB,
CCS e BC) são menos graves porque são superficiais e menos invasivos. Os melanomas são
considerados cânceres de maior gravidade por serem profundos e capazes de originar
metástases (BAGNATO et al., 2005; DAUDA & SHEHU, 2005; RODRIGUEZ, NONAKA
& KUHN, 2005).
28
A QA (Figura 2A) é uma lesão cutânea provocada por excesso de exposição à luz
solar, principalmente radiação UV. Essa dever ser tratada rapidamente para evitar o
surgimento de um câncer de células escamosas que pode sofrer metástase e ser fatal para o
paciente As lesões cutâneas são superficiais e aparecem na face, pescoço, braço e mãos,
regiões que normalmente ficam expostas a luz solar.
O CCB (Figura 2B) é o mais comum dos cânceres de pele originando-se a partir das
células basais da epiderme. As lesões causadas por essa patogenia apresentam clinicamente
inúmeras variações histológicas como infiltrativa, micronodular, basoescamosa, nodular e
superficial, além de uma longa lista de variantes incomuns como écrina, apócrina e trabecular
(HUTCHESON, FISHER & LANG JR,
2005). Apesar de rara, as quatro primeiras variações
têm maior capacidade de provocarem metástase e de serem mais agressivas ao local,
diminuindo as chances de cura do paciente (SCRIVENER, GROSSHANS & CRIBIER,
2002).
Suas lesões têm bordas bem definidas e aspecto de cera ou perolado, sendo planas ou
levemente elevadas, com coloração branca, rosa ou marrom. Essas contêm vasos sanguíneos
evidentes, até mesmo ao seu redor, e também ulcerações centrais (MCGUIRE, GE &
DYSON,
2009).
O CCE (Figura 2C) é uma forma de câncer do tipo não-melanoma originária dos
queratinócitos epiteliais e seus apêndices. Este pode surgir a partir de excesso de exposição à
radiação ultravioleta, ou de lesões pré-existentes, tais como a QA (CZARNECKI et al., 2002).
Enquanto a QA ocupa apenas parte da epiderme, o CCE in situ ocupa toda ela. Além disso,
uma variante mais grave desse tipo de câncer de pele, denominada CCE invasivo, invade a
membrana basal da epiderme. As lesões apresentam perda na ordem de maturação conforme
as células migram da base para o topo, variação no tamanho do núcleo, na forma e na
pigmentação. Da mesma forma, podem apresentar formas mitóticas, multinucleadas e são
frequentemente acompanhadas de hiperqueratose e paraqueratose (MCGUIRE, GE &
29
DYSON,
2009). O CCE é agressivo podendo originar metástases diminuindo as chances de
cura do paciente.
A DB é um CCE intraepidermal e pode ocorrer em qualquer região cutânea do corpo,
ganhando a denominação de eritroplasia de Queurat quando ocorre no aparelho genital
(BAGHERI & SAFAI, 2001). Esse carcinoma se desenvolve in situ, de forma análoga ao
CCE, com as células apresentando alterações citológicas características de malignidade
(hipercromatismo, pleomorfismo, mitoses) e perda da arquitetura, mas sem evidência de
invasão local ou de metástases à distância. Quando a DB não é tratada pode evoluir
vagarosamente para um CCE invasivo, originando metástase e diminuindo as chances de cura
do paciente. Suas lesões se apresentam, freqüentemente, como uma placa rosa bem definida
com superfície áspera e ressecada (BAGHERI & SAFAI, 2001).
O melanoma cutâneo (Figura 2D) é um tipo de câncer com predominância em adultos
brancos que tem origem nos melanócitos, células produtoras de melanina, substância que
determina a cor da pele. Embora só represente 4% dos tipos de câncer de pele, o melanoma é
o mais grave devido à sua alta possibilidade de metástase. Devido a sua alta agressividade e
letalidade recomenda-se o tratamento dos melanomas por meio de cirurgia.
Figura 2. Queratose actínica (A), Carcinoma de Células Basais (B), Carcinoma de Células Escamosas
(C), Melanoma (D). Disponível em: www.golfdigest.com/magazine/2008/07/skincare
30
2.3 Tratamentos do câncer
Os métodos convencionais utilizados no tratamento de tumores superficiais incluem
quimioterapia, radioterapia e cirurgia (MARTIM et al., 1995). A quimioterapia é um
tratamento a base de fármacos citotóxicos que impedem as proliferações celulares, atingindo
principalmente as células neoplásicas, que apresentam metabolismo e crescimento acelerado.
Entretanto, os antineoplásicos também atingem células normais desencadeando efeitos
colaterais que trazem sofrimento ao paciente. A radioterapia induz morte celular por ação de
radiações ionizantes, que também podem atingir tecidos normais desencadeando uma série de
efeitos colaterais. A cirurgia é utilizada para a retirada de tecidos neoplásicos localizados,
podendo deixar traumas nos pacientes. Tendo em vista todas as desvantagens relacionadas a
esses tratamentos clássicos, alguns tratamentos atuais, como a TFD, têm surgido visando
melhorar o tratamento do câncer e a qualidade de vida do paciente (CASTANO, DEMIDOVA
& HAMBLIM, 2005; SIBATA et al., 2000; OCHSNER, 1997).
2.4 Terapia fotodinâmica (TFD)
As primeiras experiências visando à aplicação da TFD no tratamento de tumores em
humanos foram feitas em 1900 quando o estudante de doutorado Oscar Raab, orientado por
Tappeiner, observou que a combinação de luz solar com o corante acridina era capaz de
destruir o microorganismo paramécio (RAAB, 1900). Em 1903, o próprio Tappeiner junto de
Jesioneck, empregando o corante eosina como fotossensibilizante, obteve resultados
relativamente positivos (TAPPEINER & JESIONECK, 1903). Em 1907, a TFD foi definida
como sendo a interação entre luz, fotossensibilizante e molécula de oxigênio (TAPPEINER &
JODLBAUER, 1907). Em 1924, foi verificada por Policard uma grande concentração de
porfirinas em tumores malignos, o que poderia ser utilizado como fotossensibilizante
empregando-se luz (POLICARD, 1924). Da mesma forma, no final dos anos sessenta Lipson
31
obteve sucesso tratando um câncer de mama com hematoporfirina e luz visível (LIPSON,
GRAY & BALDES, 1966). Já em 1976, Weishaupt e colaboladores anunciaram que o
responsável pela morte das células tumorais era o oxigênio singleto derivado da transferência
de energia do fotossensibilizante no estado tripleto para o oxigênio molecular (WEISHAUPT,
GOMER & DOUGHERTY, 1976). Finalmente, no final dos anos setenta, os trabalhos de
Dougherty e colaboradores tornaram a TFD uma alternativa reconhecida para o tratamento do
câncer e de outras condições clínicas, sendo este pesquisador um dos principais fundadores do
mais avançado centro de TFD, vinculado ao Roswell Parck Cancer Institute em Búfalo,
Estados Unidos (MACDONALD & DOUGHERTY, 2001).
Atualmente, o interesse pelo uso da TFD tem aumentado como resultado do seu
reconhecimento por parte do Foods and Drugs Administration (FDA) como uma terapia atual
e eficaz no tratamento do câncer (OLEINICK & EVANS, 1998) e da psoríase (KURWA &
BARLOW, 1999), e na inativação de bactérias (WAINWRIGHT, 1998), fungos e vírus
(CARRE, 1999; HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; DOUGHERTY & POTTER, 1991).
O emprego da TFD no tratamento do câncer de pele se restringe apenas às neoplasias do tipo
não melanoma, tais como, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa e doença
de Bowen, além de lesões pré-cancerosas como a queratose aquitínica. Os melanomas não
devem ser tratados com TFD porque apresentam pigmentos escuros que absorvem a luz
utilizada para ativar o fotossensibilizante (BAGNATO et al., 2005; WOLF & KERL, 1995;
CAIRNDUFF, 1994).
No Brasil a TFD vem ganhando espaço desde 1987 com publicações de estudos na
área, que cresce constantemente em vários centros de pesquisa espalhados pelas
Universidades brasileiras. A experiência clínica da TFD iniciou-se em São Paulo e envolveu a
colaboração do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo, do Hospital
Amaral Carvalho em Jaú, e da Escola de Medicina da Universidade de São Paulo, em
32
Ribeirão Preto (BAGNATO et al., 2005). O grupo estabeleceu contatos com grupos de
pesquisa nos Estados Unidos e Rússia para iniciar as atividades de TFD no Brasil. Os
fotossensibilizantes usados são o Photogem
®
(derivado da hematoporfirina produzido na
Rússia) para os casos de injeção sistêmica e o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) para as
aplicações tópicas (BAGNATO et al., 2005). Diversos tipos de câncer foram tratados, entre
eles, câncer bucal, carcinoma de nasofaringe e pele. Atualmente existem várias clínicas
médicas e hospitais nos grandes centros urbanos com infra-estrutura, equipamentos e
profissionais qualificados para realizar TFD para o tratamento e cura do câncer de pele.
A TFD (Figura 3) envolve aplicações intencionais, tópicas ou sistêmicas, de um agente
fotossensibilizante, que é ativado localmente por uma luz com intensidade e comprimento de
onda apropriado (ALLISON, DOWNIE & CUENCA, 2004). Na presença de oxigênio
tecidual, esse fotossensibilizante ativado induz a destruição de células tumorais por efeitos
tóxicos sobre as organelas e membranas. Essa morte celular ocorre devido à transferência de
energia do fotossensibilizante para o oxigênio molecular, com conseqüente formação de
espécies reativas de oxigênio (EROS) como peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), radical hidroxila
(HO
·
) e ânion superóxido (O
2
-·
), além de oxigênio singleto (
1
O
2
), considerado o principal
agente citotóxico (WEISHAUPT, GOMER & DOUGHERTY,
1976). Todos eles são capazes
de oxidar e lesar componentes vitais da célula (DERYCKE & DE WITTE, 2004;
SHARMAN, VAN LIER & ALLEN, 2004; KONAN, GURNY & ALLEMANN, 2002; DE
ROSA & BENTLEY, 2000; SIBATA et al., 2000; PENG et al., 1997a e 1997b;
HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; JORI & SPIKES, 1990). Os alvos celulares do
oxigênio singleto são as biomoléculas como os fosfolipídios de membrana, o colesterol, as
bases nitrogenadas do DNA e RNA, além de aminoácidos, proteínas e enzimas (CASTANO,
DEMIDOVA & HAMBLIM, 2005a;
DAVIES, 2003; STIEF, 2003; YAMAMOTO, 2001;
KURK et al., 1998; HADJUR
et al., 1997).
33
Figura 3. Tratamento utilizando a TFD (Adaptado de www.clicprovida.com.br).
A fototoxicidade e a extensão do dano celular originado pela TFD, por ser um
processo complexo, está influenciado por múltiplos fatores como classe, dose, via de
administração, absorção, seletividade e biodistribuição do fotossensibilizante, tipo de fonte de
luz, irradiância, dose e comprimento de onda dessa luz, concentração de oxigênio no tecido-
alvo e intervalo entre a administração do fotossensibilizante e a exposição à fonte de luz
(WIEDEMANN & CACA, 2004).
A TFD vai atuar originando danos na célula tumoral e na microvasculatura que
circunda o tumor, além de ativar o sistema inflamatório e imunológico, com efeitos originados
sobre esses sistemas influenciando um sobre outro (DOUGHERTY et al., 1998).
A figura 4 representa o Diagrama de Jablonski e a atividade fototerápica que se inicia
com a absorção de energia por parte do fotossensibilizante no estado fundamental com dois
elétrons em spins opostos, o chamado estado singleto (S
0
), de menor energia.
34
Figura 4. Teorema de Jablonski (Adaptado de RODER, 2000).
Com a absorção do fóton de luz, um desses elétrons é levado a um orbital de alta
energia, mas permanece nesse spin, o que caracteriza estados singletos superiores (S
n
). Esses
podem decair ao primeiro estado singleto (S
1
) por conversões internas (CI), isto é, transições
sem emissão de radiações. Esse estado excitado apresenta vida curta e pode voltar ao estado
fundamental perdendo energia por emissão de fluorescência, um processo rápido que leva de
10
-7
a 10
-9
segundos (s), por desativação térmica, por reações químicas a partir de S
1
e por
cruzamento inter-sistema (CIS). Durante esse último processo de cruzamento intersistema o
spin do elétron excitado sofre uma inversão para formar o estado tripleto excitado (T
1
), de
vida relativamente longa. Esse longo tempo de vida desse estado excitado pode ser explicado
pelo fato de seu decaimento energético acontecer por emissão de fosforecência, o que leva
cerca de 10
-4
s (CASTANO, DEMIDOVA & HAMBLIN,
2005a).
Quando esse estado tripleto excitado apresenta um alto rendimento quântico de
formação e também um longo tempo de vida, o efeito fototóxico do fotossensibilizante é
maior (TAKEMURA et al., 1989).
O estado tripleto excitado (T
1
) pode desencadear duas possíveis reações distintas.
Conforme evidenciado na figura 5, as reações do tipo I envolvem a transferência de elétrons
35
do átomo de hidrogênio do fotossensibilizante (F) para a molécula de substrato (Sub), que por
sua vez, na forma reduzida, reage com o oxigênio molecular (
3
O
2
) gerando EROS. Nas
reações do tipo II o fotossensibilizante no estado tripleto interage diretamente com o oxigênio
molecular (
3
O
2
) por transferência de energia, resultando na formação do oxigênio singleto
(
1
O
2
) (CASTANO, DEMIDOVA & HAMBLIN,
2005a).
Figura 5. Reações desencadeadas pelo fotossensibilizante em seu estado triplete. Transferência de
elétrons (Tipo I) e transferência de energia (Tipo II) (Adaptado de RICCI-JÚNIOR, 2005).
O oxigênio singleto é uma espécie citotóxica com reduzido tempo de vida, e por esse
motivo sua migração está reduzida a apenas 0,02µm (MOAN & BERG, 1991). Dessa forma,
somente as estruturas celulares próximas às regiões com alta concentração do
fotossensibilizante serão destruídas com a TFD (JUZENIENE, NIELSEN & MOAN, 2006).
Os fotossensibilizantes têm a capacidade de se acumular em estruturas celulares como a
membrana plasmática, lisossomos, citoplasma e mitocôndrias (OLEINICK, MORRIS &
BELICHENKO, 2002), sendo os danos sobre estas estruturas responsáveis por desencadear
caminhos distintos que podem levar a morte celular, seja por necrose ou por apoptose. Os
fotossensibilizantes localizados ou formados nas mitocôndrias induzem a apoptose celular,
enquanto a necrose é observada com fotossensibilizantes localizados em lisossomos e na
membrana plasmática (DOUGHERTY et al., 1998). Dessa forma, o tipo de morte celular
36
originado pela TFD irá depender do tipo de fotossensibilizante utilizado, condições de
iluminação, grau de oxigenação dos tecidos e tipo de célula envolvida.
A necrose é conhecida por ser um processo de degeneração drástico e rápido que afeta
uma grande população celular. Nela, ocorrem alterações no equilíbrio fisiológico celular,
onde se verifica um influxo de água para a célula com conseqüente dilatação do citoplasma,
destruição de organelas, ruptura e desintegração da membrana plasmática, levando à liberação
de constituintes intracelulares e à inflamação. Esse processo vem sendo considerado como
morte celular acidental não-programada, causada por dano químico ou físico, sendo sua
evolução mediada principalmente pela atividade proteolítica (CASTANO, DEMIDOVA &
HAMBLIN, 2005b).
Na apoptose, o dano pode ser restrito a uma única célula circundada por células
aparentemente saudáveis, sendo caracterizada por encolhimento celular e aparecimento de
bolhas na membrana plasmática. In vivo, esses corpos apoptóticos são fagocitados,
prevenindo a inflamação, com a morte celular por controle imunológico acontecendo no
interior ou no exterior dessas células fagocitárias, o que é muito vantajoso para os pacientes
quando comparado com uma necrose extensa (CASTANO, DEMIDOVA & HAMBLIN,
2005b; PLAETZER et al., 2005).
O processo de apoptose necessita da transcrição e ativação de genes específicos,
ativação de endonucleases e ativação de caspases. Quando se trabalha com
fotossensibilizantes lipofílicos, como a ZnPc, é elevada a probabilidade destes se depositarem
nas membranas de organelas como o retículo endoplasmático (RE) e a mitocôndria (HSIEH et
al., 2003). Conforme evidenciado por Ding et al. (2004), a TFD promove tanto a liberação de
citocromo C (Cito C) no citoplasma a partir da mitocôndria, como a ativação da Caspase-3. O
Cito C promove a formação do agregado protease-fator de ativação apoptótico (Apaf-1) com a
procaspase-9 para formar o apoptossomo. A procaspase-9 sofre autoclivação para ativar a
37
Caspase-9, que por sua vez transforma a procaspase-3 em Caspase-3, mediadora da apoptose
(OLEINICK, MORRIS & BELICHENKO, 2002).
Contudo, pelo fato desse processo levar algum tempo para se iniciar e sabendo que o
oxigênio singleto tem um tempo de vida muito curto, acredita-se que um segundo mensageiro,
como o íon cálcio (Ca
+2
), pode estar envolvido em processos de apoptose, conforme
evidenciado nos estudos de Ding et al. (2004). Nesses, foi demonstrado que a TFD pode
degradar proteínas transmembrânicas transportadoras de Ca
+2
(Ca-ATPase) do citoplasma
para o RE. Como conseqüência, o Ca
+2
se concentra no citoplasma e por se tratar de um
mensageiro de apoptose ou necrose, promove a liberação de Cito C por parte das
mitocôndrias, dando início a toda aquela cascata descrita anteriormente.
Os fotossensibilizantes localizados em lisossomos podem não produzir fototoxicidade
celular após a irradiação, mas a produção de oxigênio singleto pode provocar a ruptura dos
lisossomos e, conseqüentemente, a liberação de enzimas lisossomais que podem degradar
outros componentes celulares (GEZE et al., 1993). Além disso, moléculas do
fotossensibilizante liberadas na ruptura dos lisossomos podem se relocalizar em outras
organelas como as membranas mitocondriais, possibilitando a ocorrência de fotodanos em
outros sítios celulares.
Além de atuar sobre a célula tumoral, a TFD origina um colapso microvascular
(Figura 6) que pode explicar uma hipóxia severa e persistente sobre o tumor (CASTANO,
MROZ & HAMBLIN 2006; CHEN, O., CHEN, H. & HETZEL, 1996;
ROBERTS et al.,
1994). O tipo de ação sobre a vascularização será dependente do tipo de fotossensibilizante
utilizado, dessa forma as porfirinas ocasionam vasoconstricção, extravasamento vascular de
macromoléculas, adesão leucocitária e formação de trombo (FINGAR, WIEMAN &
HAYDON, 1997). As ftalocianinas e seus derivados promovem principalmente um
extravasamento vascular (FINGAR et al., 1993), enquanto as clorinas interrompem o fluxo
38
sanguíneo por agregação plaquetária (MCMAHON et al., 1994). Outro fator importante na
ação da TFD sobre os vasos sanguíneos é o óxido nítrico (NO), que apesar de elevar o aporte
de oxigênio pela vasodilatação, aumentando a produção de espécies tóxicas de oxigênio, ele
pode diminuir a vasoconstricção, a isquemia, a hipóxia, a adesão leucocitária e
consequentemente a resposta inflamatória à TFD (KORBELIK et al., 2002; KORBELIK,
SHIBUYA & CECIC, 1998).
Figura 6. Mecanismo de ação da TFD na eliminação das células cancerosas (Adaptado de
CASTANO, MROZ & HAMBLIN, 2006).
Esse processo inflamatório, que é considerado uma atividade indireta assim como a
reação imune, se inicia com a expressão de proteínas de stress, com a exposição de
fragmentos lipídicos de membrana e metabólitos do ácido aracdônico, resultantes da ação de
fosfolipases (OCHSNER, 1997; KORBELIK, 1996) e com a contração das células endoteliais
dos vasos tumorais (FINGAR, 1996). Esses fatos culminam na liberação de vários mediadores
de inflamação, como substâncias vasoativas, componentes do complemento, proteínas de fase
aguda, proteinases, peroxidases, radicais, leucócitos, atratores químicos, citocinas e fatores de
crescimento (OCHSNER, 1997; FINGAR, 1996). Conseqüentemente se inicia o recrutamento
e a amplificação da atividade de leucócitos do sangue, além de neutrófilos, monócitos e
39
macrófagos. Dentre essas células, o neutrófilo apresenta grande importância pelo fato de
permanecer em vasos sanguíneos de tumores onde liberam por degranulação espécies
radicalares de oxigênio, mieloperoxidases e enzimas lisossomiais que causam danos ao tumor.
Além disso, os leucócitos promovem a liberação de substâncias químicas atrativas que
desencadeiam uma resposta inflamatória. Korbelik (1996) verificou que a retirada de
neutrólfilos de tumores em ratos resultou na queda de rendimento da TFD.
Conforme evidenciado na figura 6, a TFD também pode destruir o tumor via
modulação da resposta imunológica, que é mediada por macrófagos e/ou células dendríticas
próximas ao tumor, que atuam como células fagocitárias de células tumorais mortas ou
danificadas pelo tratamento por TFD (KOBERLIK, 1996). Ao serem sinalizadas pela resposta
inflamatória provocada pela TFD, as células fagocitárias processam peptídeos tumor-
específicos (antígenos tumorais) e os expõem em suas membranas. Esses peptídeos expostos,
criam uma condição favorável ao reconhecimento dos antígenos tumorais por parte dos
linfócitos T helper, que se ativam e posteriormente sensibilizam as células T citotóxicas para
os epítopos específicos do tumor (antígenos tumorais). A ativação das células T clones CD4 e
CD8 para reconhecimento do tumor como alvo é seguida de sua rápida multiplicação, levando
à ativação da resposta imunológica. Essas células imunológicas não ficam restritas ao sítio
tumoral, podendo atuar sobre lesões disseminadas e metastásicas (KORBELIK, 1996).
As vantagens da aplicação da TFD incluem o tratamento simultâneo de múltiplos
tumores, a boa tolerância do paciente ao fotossensibilizante, o tempo de recuperação
relativamente curto e a excelente recuperação estética da lesão cutânea já que após a
fotossensibilização ocorre a formação de um tecido que descama sem deixar marcas
profundas ou cicatrizes. A TFD também apresenta boa relação custo e benefício, além de
poder ser útil para pacientes que se recusam, ou não podem ser submetidos aos processos
cirúrgicos (ZEITOUNI, OSEROFF & SHIEH, 2003).
40
2.5 Fotossensibilizantes
Os fotossensibilizantes utilizados na TFD devem apresentar as seguintes
características: (1) apresentar baixa toxicidade na ausência de luz, (2) ter um bom rendimento
na produção de espécies citotóxicas, principalmente oxigênio singleto, após iluminação, (3)
ser ativado por luz visível em comprimentos de onda (λ) na faixa de 400 a 800nm (faixa
terapêutica), que penetram profundamente na pele sem absorção ou retenção por parte desta e
(4) ter um perfil farmacocinético que resulte numa retenção seletiva em tecidos tumorais e
rápida depuração de tecidos normais (ALLISON, MANG & WILSON, 1998; WILSON &
MANG, 1995), o que constitui um perfil encontrado nas ftalocianinas. Esses
fotossensibilizantes apresentam elevada absortividade molar na região do espectro
eletromagnético correspondente à cor vermelha (600-800nm), sendo esta a região que
apresenta a máxima transmitância de luz através dos tecidos e, portanto, a mais utilizada na
TFD (BALL, 1999; OCHSNER, 1997). Essa característica resulta em elevada resposta
fototerápica, sendo esse fotossensibilizante capaz de eliminar células neoplásicas in vitro e in
vivo após irradiação com luz (DARWENT et al., 1982).
Em fins da década de 80 foi desenvolvido pela QLT Photo-Therapeutics o primeiro
fotossensibilizante a ter seu emprego na TFD aprovado pelos órgãos regulatórios, o
Photofrin
®
(LEVY, 1995). Esse composto se caracteriza por ser uma mistura oligomérica de
monômeros de hematoporfirina unidos por ligações éter ou éster. Esse, após administração
endovenosa, apresenta algumas desvantagens tais como fotossensibilidade generalizada
prolongada e baixa absortividade molar na região da faixa terapêutica da TFD (LEVY, 1995).
Essas desvantagens foram um estímulo para o desenvolvimento de novas classes de
fotossensibilizantes como as ftalocianinas e as clorinas.
As ftalocianinas e seus derivados metálicos, como a ZnPc, apresentam algumas
vantagens: boa estabilidade física e química, baixo custo de produção e característica apolar
41
que melhora a capacidade de acúmulo nos tecidos cancerosos. Uma substituição no anel por
grupamentos polares pode alterar sua solubilidade (FABRIS et al., 2006; VALDUGA et al.,
1996), porém o aumento da polaridade desses fotossensibilizantes é seguido de uma
diminuição da atividade fototerápica e capacidade de acúmulo nas células neoplásicas
(FABRIS et al., 2006; OWENS et al., 1998; VALDUGA et al., 1996; GANTCHEV & VAN
LIER, 1995; BOYLE, 1992). Esses fotossensibilizantes absorvem energia na região da
radiação ultravioleta (UV) na faixa de 300 a 350nm e, no visível (Vis) na forma de duas
bandas, em 600 e 650nm. Ainda apresentam a propriedade de emissão de fluorescência na
faixa de 600 a 700nm, sendo o máximo de emissão próximo ao comprimento de onda (λ) de
685nm na forma de uma forte banda de emissão (OWENS et al., 1998; RUCK et al., 1996;
ROSENTHAL et al., 1987).
Essas propriedades fotofísicas das ftalocianinas são importantes para a escolha do
método analítico empregado nos estudo desses compostos e seus derivados. Dessa forma, é
muito comum o emprego da espectrofotometria de absorção e de emissão de fluorescência
para tal (DURMUS et al., 2009; ERDOGMUS, OGUNSIPE & NYOKONG, 2009). A
espectrofotometria de fluorescência é mais empregada para caracterização de amostras por ser
mais sensível e específico que a absorção, já que poucas substâncias são capazes de absorver
energia e emitir fluorescência (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002).
Nesses métodos, as radiações ao atravessarem uma determinada amostra têm
freqüências, ou comprimentos de onda, seletivamente removidas por absorção, onde a energia
eletromagnética é transferida para as moléculas. Essa energia absorvida faz com que
moléculas no estado fundamental atinjam um ou mais estados excitados de maior energia. A
diferença de energia entre o estado excitado e o estado fundamental é única para cada espécie,
sendo assim, a análise do comprimento de onda absorvido é um meio interessante para
caracterização de uma amostra (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002).
42
A molécula excitada tem um tempo de vida curto e por meio de processos de relaxação
retornam ao estado fundamental. Algumas moléculas possuem além da relaxação não-radiante
uma forma de relaxação radiante, com emissão de fluorescência ou fosforescência. Enquanto
a fosforescência caracteriza um processo longo derivado de um estado eletrônico metaestável,
ou seja, o estado tripleto, a fluorescência é um processo rápido, completando-se após 10
-8
s,
aproximadamente (CASTANO, DEMIDOVA & HAMBLIN,
2005a).
A localização desse fotossensibilizante geralmente se restringe às regiões externas ao
núcleo, o que é muito interessante, pois dessa forma é praticamente eliminada a possibilidade
de mutações e conseqüentes efeitos carcinogênicos por lesão extensa do DNA (JUZENIENE,
NIELSEN & MOAN, 2006). Porém, quando se trabalha com fotossensibilizantes solúveis em
água como as clorinas, meso-tetrafenilporfirinas sulfonadas e ftalocianinas de alumínio di e
tretrasulfonadas, verifica-se a destruição do DNA após períodos de irradiações de baixa
fluência ou períodos fracionados de irradiação, o que está relacionado à redistribuição dos
fotossensibilizantes liberados de lisossomos para o núcleo celular (JUZENIENE, NIELSEN &
MOAN, 2006).
Entre as ftalocianinas, a ZnPc (Figura 7) é a mais empregadas na TFD por apresentar
forte atividade fotofísica, fotodinâmica e fototerapêutica (GANTCHEV & VAN LIER, 1995),
visto que seus estados triplete e singlete apresentam um longo tempo de meia-vida (NUNES,
SGUILLA & TEDESCO, 2004)
43
Figura 7. Zinco ftalocianina.
A ZnPc e seus derivados vem sendo utilizados com sucesso em pesquisas básicas e
clínicas em animais para tratamento de câncer utilizando TFD. Esse fotossensibilizante é
lipofílico e necessita de um veículo fisiologicamente aceitável para ser administrada na
corrente sanguínea. Dessa forma, ele tem sido encapsulado em lipossomos e nanopartículas
para intravenosa (RICCI-JÚNIOR & MARCHETI, 2006a e 2006b). Entretanto, a
administração cutânea desse fotossensibilizante para uso na TFD do câncer de pele vem sendo
muito pesquisada visando à diminuição dos efeitos de fotossensibilização sistêmica.
O desenvolvimento de formulações que proporcionem a penetração e a retenção da
ZnPc na pele constitui uma maneira de otimizar a TFD, uma vez que a atividade fototerápica
do fotossensibilizante é dependente de sua concentração no tecido alvo. Sendo assim, a
formulação deve facilitar a passagem da ZnPc pelo estrato córneo (EC), possibilitando sua
retenção ao nível de epiderme.
44
2.6 Pele
A pele (Figura 8) é o maior órgão do corpo humano e forma uma interface única entre
o nosso organismo e o ambiente externo, oferecendo uma barreira protetora. Sua extensão
corresponde a 2 m
2
e seu peso representa 16% do peso total do corpo. (KANITAKIS,
2002;
HADGRAFT,
2001).
Figura 8. Camadas da pele e estrutura da epiderme. Disponível em:
www.bioderma.fr/conceils/informations.asp
Este órgão é constituído pela hipoderme (tecido adiposo subcutâneo), derme, epiderme
viável e estrato córneo (EC). Anexos a pele, encontra-se as unhas, os pêlos e as glândulas, os
quais variam conforme a região do corpo. A espessura das camadas da pele sofre muitas
variações em função da idade, do sítio anatômico e do estado de hidratação. Geralmente, a
espessura da epiderme apresenta-se entre 40 e 48µm, da derme entre 800 e 1.500µm, e por
fim, a espessura da hipoderme é muito dependente do sítio anatômico e do estado nutricional
do indivíduo (KIERSZENBAUM, 2004; AGACHE, 2000).
A epiderme apresenta uma estrutura multilamelar que representa os diferentes estágios
da diferenciação celular (BARRY, 2005). Da camada inferior para a superior temos a camada
basal proliferativa, uma estrutura vascularizada que apresenta intensa atividade mitótica,
45
responsável pela renovação e nutrição da epiderme e demais camadas, sendo formada
basicamente por colágeno tipo IV e proteoglicanos. A seguir, se encontra a camada mucosa de
Malpighi, constituída por células poliédricas onde a cisteína se transforma em cistina para a
formação da queratina. Em seguida, encontra-se a camada granulosa, constituída por células
losangulares com citoplasma contendo granulações. Essas granulações se mostram ricas em
glicoproteínas precursoras da eleidina, que por sua vez originará a queratina na camada lúcida
superior (PRISTA et al., 2008). Após se dividirem e sofrerem alterações ordenadas de
atividade metabólica, essas células morrem e se apresentam queratinizadas, sendo
denominadas corneócitos, que constituem o EC juntamente com uma bicamada lipídica
multilamelar que as envolve (KIERSZENBAUM, 2004; BARRY, 2005).
A derme é formada por tecido conjuntivo, contendo capilares e nervos, além de alojar
as porções secretoras das glândulas sebáceas e sudoríparas, os folículos pilosos. Na derme, o
tecido conjuntivo revela uma macha de fibras colagenosas de colágeno entremeado por fibras
elásticas. Esses elementos fibrosos do tecido conjuntivo, principalmente as fibras colagenosas,
fornecem uma imagem histológica que subdivide a derme em derme papilar (de tecido
conjuntivo frouxo) e em derme reticular, formada por tecido conjuntivo denso não modelado,
devido ao arranjo desorganizado desses elementos fibrosos.
A função de barreira da pele é principalmente atribuída ao EC (BARRY, 2005;
HADGRAFT, 2004 e 2001). Essa barreira pode ser exercida também pela pele integra e
dentre os tipos de barreiras exercidas podemos encontrar: (1) química, onde a entrada de
moléculas indesejada é impedida enquanto a perda de água, eletrólitos e outros constituintes
endógenos são controlados; (2) térmica, onde os vasos sanguíneos presentes na derme atuam
no controle da temperatura corporal; (3) elétrica, onde a resistência e impedância são maiores
na pele seca do que em outros tecidos biológicos; (4) mecânica, onde a epiderme pode sofrer
espessamento frente a agressões e (5) contra radiações, onde os pigmentos presentes na pele
46
atuam na minimização dos danos causados pela radiação, principalmente a solar (WICKETT
& VISSCHER, 2006; BARRY, 2005).
Os componentes do EC são água, queratina e lipídeos. Essa camada da pele é
semelhante a uma parede, onde os corneócitos e as microfibras de queratina são considerados
os “tijolos” e as camadas lipídicas encontradas entre as células são consideradas o “cimento
ou cola” (ELIAS et al., 1983). Segundo Wertz & Downing
(1989), a composição lamelar
lipídica do EC apresenta 41% de fosfolipídeos, 27% de colesterol, 10% de ésteres de
colesterol, 9% de ácidos graxos e 2% de sulfatos de colesterol, além de água (11%). Uma das
atribuições mais importante dessa camada da pele é a capacidade de funcionar como barreira
para a difusão molecular (KALIA et.al., 2001, HADGRAFT, 2001). No entanto, é importante
lembrar, que embora o EC apresente baixa permeabilidade, ele não é totalmente impermeável,
a exemplo da pele saudável íntegra (MARKS, 2004). O EC está exposto a uma grande
variabilidade de agentes químicos do ambiente, que podem afetar suas estruturas e suas
funções (SILVA et al., 2007).
2.7 Pele como via de administração de fármacos
O EC se comporta como uma membrana natural semipermeável onde as moléculas das
substâncias ativas penetram por difusão pelos lipídeos intercelulares (KNUTSON et al.,
1985). A natureza exata sobre a função de barreira tem sido investigada nos últimos anos e
recentes avanços em técnicas biofísicas têm promovido interessante compreensão do
mecanismo de absorção a níveis moleculares (HADGRAFT, 2001).
Uma série de fatores biológicos pode alterar a permeabilidade, tais como o estado da
pele (presença de alguma patologia), a idade, o fluxo sangüíneo e o metabolismo. Fatores
físico-químicos também apresentam grande influência no processo de passagem de uma
substância pela pele, sendo a hidratação do EC um dos mais importantes (PRISTA et al.,
47
2008). Além disso, a velocidade de movimentação de um fármaco por essa camada da pele
depende de seu tamanho e forma molecular, da concentração do mesmo no veículo, de sua
solubilidade, de seu coeficiente de difusão e de seu coeficiente de partição entre o EC e o
veículo (MIGRATORI, 2000; SUBER et al.,1990). As substâncias que têm características de
solubilidade tanto em água quanto em lipídios, são boas candidatas à difusão pelo EC, bem
como nas camadas epidérmica subjacente e dérmica (SUBER et al.,1990). Dessa maneira a
camada córnea é a mais indicada para uma medida adequada e mensurável da
biodisponibilidade tópica do ativo, objetivando avaliar o perfil de tempo versus concentração
de ativo na pele.
Os fármacos podem penetrar na pele por meio de apêndices cutâneos (rota
transanexal) (Figura 9), isto é, pelos folículos pilosos e glândulas sudoríparas, que ocupam
apenas 0,1% do total da superfície da pele, sendo a contribuição por esta via considerada
pequena (MOSER et al., 2001). Além dessa possibilidade existem as vias transcelular e
intercelular (Figura 9) (POTTS & GUY, 1992; BARRY, 2001; HADGRAFT, 2001), porém
estudos nas últimas décadas vêm evidenciando que em circunstâncias normais, a rota
predominante é a efetuada pelos espaços intercelulares (rota intercelular) (HEISIG et al.,
1996; BODDE et al., 1991; POTTS & FRANCOEUR, 1991; NEMANIC & ELIAS, 1980;
ALBERY & HADGRAFT, 1979).
48
Figura 9. Representação diagramática da penetração de fármacos na pele por meio das vias
intercelular, transcelular e transanexal, com detalhe do espaço intercelular. (Adaptado de FREITAS,
2005).
De acordo com Wiechers et al. (2004), o processo de penetração cutânea se inicia com
a difusão do fármaco do interior do veículo para a superfície da pele. Este, por partição
penetra na pele e se difunde pelo EC, penetrando na epiderme viável também por partição e se
difundindo nela. Em seguida sofrerá partição para penetrar na derme e se difundir por ela,
para que então possa se depositar no tecido adiposo por partição ou cair na circulação
sangüínea e ser distribuída.
Todo esse processo de difusão de fármacos na pele pode ser analisado com o emprego
das leis de difusão de Fick. A difusão passiva pode ser definida como um processo pelo qual a
diferença de concentração é reduzida por um fluxo espontâneo de matéria. Nesse processo
físico-químico o soluto passa espontaneamente de uma região de alta concentração para outra
de baixa concentração, enquanto as moléculas de solvente movem-se na direção contrária,
assim, admite-se que o fluxo do soluto é estabelecido como conseqüência (FLORENCE e
ATTWOOD, 2003)
49
A primeira lei de difusão de Fick é empregada para descrever o fluxo (J
ss
) que se
estabelece no estado estacionário (SS - steady-state) por área, empregando para tal o
coeficiente de partição do permeante entre a formulação aplicada e a pele (Kp), o seu
coeficiente de difusão (D) no espaço intercelular do EC, e o comprimento difusional (h) desse
último, quando o gradiente de concentração permanece constante ao longo do tempo
(MOSER, 2001). Essa lei assume o EC como uma membrana homogênea de espessura fixa
numa dada área (A) e considera sempre a presença de uma condição sink, isto é, a
concentração de fármaco presente na membrana (C
h
) e no compartimento receptor (C
r
) será
sempre infinitamente menor que no compartimento doador (C
d
), podemos escrevê-la por
meio da Equação 1:
J
ss
= A DK
p
(C
d
-C
r
)/h ou J
ss
= A DK
p
C
d
/h (Equação 1)
Baseadas nessa lei, três diferentes estratégias podem ser utilizadas para aumentar a
penetração de fármacos na pele de acordo com Moser et al. (2001), sendo estas: (1) aumento
do coeficiente de difusão do fármaco, (2) aumento da solubilidade do fármaco na membrana e
(3) aumento da proporção entre a concentração do fármaco dissolvido na formulação e a
solubilidade deste no veículo, elevando o grau de saturação do mesmo na formulação. As
duas primeiras estratégias baseiam-se em um efeito do veículo sobre o EC, geralmente com
auxilio de promotores de penetração cutânea, resultando na alteração de função de barreira
desta camada ou aumento da partilha do composto para a pele.
A última estratégia é a alternativa mais simples, e consiste na supersaturação do
veículo com o fármaco, de modo a aumentar sua atividade termodinâmica. Isso pode ser
conseguido por aumento da concentração do fármaco na formulação, ou por diminuição da
solubilidade deste na formulação (MOSER et al., 2001).
Essas formulações supersaturadas
50
apresentam o inconveniente da baixa estabilidade durante o armazenamento, por esse motivo
essas preparações são alcançadas por três diferentes métodos, ou seja, pela reposição de água
proveniente da pele, pela evaporação de um componente volátil da formulação ou pelo
sistema de mistura de co-solventes.
Entretanto, pelo fato do EC ser uma barreira eficiente, existe um período ou intervalo
de tempo para se alcançar o estado de fluxo constante do fármaco na pele. Além disso, para
uma membrana heterogênea como a pele, onde D, K
p
e h possuem inter-relação complexa, os
termos são agrupados em um único parâmetro denominado coeficiente de permeabilidade (P),
sendo este essencialmente experimental. A partir desse raciocínio podemos descrever a
segunda lei de difusão de Fick por meio da Equação 2:
J
ss
= A.P.∆
∆∆
∆C (Equação 2)
Pela necessidade de um equilíbrio prévio antes de um fluxo constante a segunda lei
de Fick passa a levar em consideração o tempo de equilíbrio (SHAH,
1993). Dessa forma o
que iremos obter é a quantidade de fármaco permeada por uma determinada área em um
período de tempo, descrita pela Equação 3:
Q/A = K
p
D C
d
/h (t – h
2
/6D) (Equação 3)
A expressão matemática que representa a teorida do lag-time (t
Lag
) está descrita na
Equação 4 (SHAH,
1993).
t
lag
= h
2
/6D (Equação 4)
51
Para essa determinação utilizamos o método do t
Lag
onde entram os dados atingidos
apenas durante o estado estacionário. Os pontos na região do estado estacionário são lineares,
oferecendo uma reta do tipo y = ax + b, o que possibilita a determinação do fluxo no estado
estacionário por meio da inclinação da reta (a) e do t
Lag
pela extrapolação da reta e
conseqüente interceptação no eixo x (Figura 10) (SHAH,
1993).
Figura 10. Gráfico representativo de uma regressão linear confrontando quantidade de fármaco
permeado por área (Q/A) e tempo. (SS = estado estacionário; t
lag
= lag-time)
Contudo, para maior sucesso na penetração dos fármacos utilizando essa via, as
propriedades de barreira do estrato córneo devem ser reduzidas, e a perturbação temporária e
reversível dessa propriedade pode ser conseguida utilizando-se formulações contendo
promotores de penetração e/ou permeação cutânea de fármacos.
2.8 Estudos in vitro
A liberação in vitro do fármaco é uma propriedade da formulação que o contém. Essa
pode ser manipulada pela mudança da concentração do fármaco, variação do coeficiente de
partição e aumento de sua solubilidade do fármaco na formulação, ou seja, alterando a
viscosidade ou a termodinâmica do sistema (WELIN-BERGER; NEELISSEN;
BERGENSTAHL, 2001).
52
A velocidade de liberação dos produtos tópicos dermatológicos pode ser medida
empregando um sistema de difusão bicompartimental com membrana sintética e meio
receptor adequado. A membrana sintética serve como um suporte para separar a formulação
do meio receptor, devendo ser quimicamente inerte para não reagir com a formulação ou com
o meio, e não deve ser um ponto limitante nos processos e na velocidade de liberação do
fármaco da formulação, sendo empregados acetato de celulose, nitrato de celulose ou
polisulfona (HAIGH & SMITH, 1994). A solução receptora deve ser compatível com a
metodologia analítica empregada para quantificação do fármaco e apresentar-se sempre na
condição sink, ou seja, o volume empregado é cinco vezes maior que o ponto de saturação do
fármaco (ZATZ, 1995). Sendo assim, encontram-se descritos na literatura vários modelos de
células de difusão, tipos de membranas artificiais, que são empregados na avaliação da
velocidade de liberação in vitro de fármacos em diferentes formas farmacêuticas (CSÓKA et
al., 2005; GALLAGHER, TROTTED & HEARD, 2003; WISSING & MÜLLER, 2002;
WELIN-BERGER, NEELISSEN & BERGENSTAHL, 2001; KIERSTAN et al., 2001;
REGE, VILIVALAM & COLLINS, 1998; KNORST, NEUBERT & WOHLRAB, 1997).
O gráfico de quantidade de fármaco acumulado no meio receptor em função do tempo
fornece o perfil de liberação, enquanto o fluxo de passagem do fármaco a partir da formulação
para a solução receptora é representado pela inclinação da equação da reta obtida (SHAH,
ELKINS & WILLIAMS., 1999).
Esta metodologia também vem sendo largamente empregada para estimar a
permeação/retenção de fármacos na pele, de modo a explicar e predizer a penetração e
absorção in vivo de ativos de diversos tipos a partir de formulações de uso tópicos
(FRELICHOWSKA et al., 2009; HOELLER, SPERGER & VALENTA, 2009; GODIN &
TOUITOU, 2007). Os estudos in vitro de penetração e permeação cutânea têm sido utilizados
53
para caracterizar formulações e sistemas de liberação contendo fotossensibilizantes para uso
TFD do câncer de pele (DRAGICEVI-CURIC et al., 2009; PRIMO et al., 2008).
Nesses estudos utiliza-se membrana natural (pele humana ou animal) acoplada a um
sistema de células de difusão bicompartimental. O sistema é utilizado para conhecimento das
características de permeação cutânea do fármaco a partir da formulação (GODIN &
TOUITOU, 2007). Por motivos éticos, freqüentemente a pele animal é preferida em relação à
pele humana para pesquisa, proporcionando resultados satisfatórios. A pele humana é de
difícil obtenção sendo geralmente proveniente de cadáveres ou cirurgia plástica. O uso da pele
humana necessita de submissão a um comitê de ética antes da sua utilização. Dentre os vários
tipos de pele animal utilizadas como alternativa podemos citar as peles de porco, porco de
guiné, rato, cobaia, camundongo, macaco rhesus e cobra (GODIN & TOUITOU, 2007). Um
destaque maior fica por conta da pele suína, que vem sendo bastante empregada pelo fato de
apresentar grande similaridade com a pele humana no que diz respeito a propriedades
histológicas e bioquímicas. (JACOBI et al., 2007; SEKKAT, KALIA & GUY, 2002; HAIGH
& SMITH, 1994; DICK & SCOTT, 1992).
Particularmente, a região da pele suína mais empregada em experimentos de
permeação é a parte posterior da orelha. Estudos revelam que a espessura do EC situa-se entre
21 e 26µm, enquanto a epiderme viável apresenta espessura entre 66-72µm, com ambas as
estruturas comparáveis com a pele humana (JACOBI et al., 2007; DICK & SCOTT, 1992). A
estrutura folicular também se assemelha à pele humana por apresentar pêlos e infundíbulos
foliculares profundos, na região da derme, e também pela existência de 20 pêlos por cm
2
de
pele, em média (JACOBI et al., 2007). Além disso, a pele suína possui a anatomia vascular, o
arranjo das fibras colágenas e a constituição de lipídeos e ceramidas do EC semelhantes aos
da pele humana (SIMON & MAIBACH, 2000).
54
Os estudos de penetração e retenção in vitro são realizados para determinar a
quantidade de fotossensibilizante retido na pele. O método consiste na remoção do EC por
aplicações sucessivas de fitas adesivas pela técnica determinada “tape stripping” e
subseqüente extração do ativo do EC contido nas fitas adesivas. O fotossensibilizante contido
na pele remanescente, epiderme remanescente e derme, também pode ser quantificado
(PERSHING, 2000; SHAH et al., 1999). Esse procedimento pouco invasivo pode ser utilizado
em estudos tanto in vivo (FREITAS, 2005) quanto in vitro (HERAI et al., 2007), bem como
tanto para animais (SIMONETTI et al., 2009) como para pele humana (MELERO et al.,
2009)
A quantidade de EC removida por uma única fita adesiva irá variar de acordo com
fatores intrínsecos e extrínsecos. Dessa forma, irá depender do tamanho dos corneócitos, de
seu sítio de localização (LOFFLER, DREHER & MAIBACH, 2004; GOSHI, IGUCHI &
TAGAMI, 2000), da idade e da época do ano (BOMMANNAN, POTTS & GUY, 1990), do
tipo de fita adesiva utilizada (TSAI et al., 1991), da força de remoção dessa a partir da pele,
da quantidade de tempo que se aplica a pressão sobre a pele (LOFFLER, DREHER &
MAIBACH, 2004), além da formulação aplicada (LADEMANN et al., 2009).
2.9 Formas farmacêuticas
Segundo Prista et al. (2008), podemos considerar como forma farmacêutica
medicamentosa qualquer fármaco, com ou sem excipientes, que tenha passado por uma ou
mais operações farmacêuticas, atingindo dessa forma, a capacidade de facilitar a
administração no paciente e também o seu efeito terapêutico, seja ele curativo, profilático ou
diagnóstico.
Dentre as formas farmacêuticas conhecidas podemos citar as soluções verdadeiras,
caracterizadas por uma mistura homogênea e límpida de duas ou mais substâncias distintas,
55
onde pelo menos uma delas é considerada como solvente da preparação. Nesse tipo de forma
farmacêutica o soluto, presente em uma quantidade abaixo de seu coeficiente de solubilidade
para aquele solvente, se apresenta em forma de partículas dispersas com dimensões inferiores
a 0,001 µm. Esse fato representa uma das condições ideais para a penetração de fármacos no
organismo, sendo esse o motivo pelo qual a forma galênica solução é tão empregada (PRISTA
et al., 2006).
A principal operação farmacêutica envolvida no preparo das soluções é a dissolução,
onde alguns fatores importantes podem influenciar no seu sucesso ou fracasso. O primeiro
passo é a escolha de um solvente que será eficaz tanto para a estabilidade de seu fármaco,
como também para a viabilidade da preparação atuando como medicamento.
Nesse ponto, um dos solventes mais empregados em farmácia galênica é o
propilenoglicol (WILLIAMS & BARRY, 2004). Essa substância apresenta dois isômeros,
sendo utilizado na farmácia o propilenoglicol ordinário ou 1,2-propanodiol, de densidade
1,036g/mL e ponto de ebulição entre 188 e 189°C. É um líquido considerado fisiologicamente
inativo, incolor, de sabor adocicado e miscível em todas as proporções com água, álcool,
acetona e clorofórmio (PRISTA et al., 2006).
Além do solvente, outros parâmetros irão influenciar o preparo de uma solução e
dentre eles podemos citar o estado físico e o grau de solvatação do sólido, o estado de divisão
desse sólido, a agitação empregada no processo, o pH e a constante dielétrica do solvente
(PRISTA et al., 2006). Essa constante dielétrica se torna extremamente importante ao passo
que a solubilidade de uma determinada substância é condicionada pela polaridade que ela e
solvente possuem (PRISTA et al., 2006). Esse parâmetro pode ser alterado pela inclusão de
substâncias menos polares, que irão diminuí-lo, ou de substâncias mais polares que irão
aumentá-lo.
56
Essas substâncias podem então, ser consideradas co-solventes, pois tornarão o meio
mais favorável à presença do sólido formando uma solução. Da mesma forma, muitos desses
co-solventes podem promover algum tipo de interação com os constituintes do EC
melhorando a penetração do fármaco nessa camada, auxiliando na obtenção do principal
objetivo de uma forma medicamentosa que é a resposta terapêutica eficaz. Por esse motivo,
alguns desses co-solventes podem ser denominados promotores de penetração e/ou permeação
cutânea, podendo ser químicos, físicos e farmacotécnicos (BARRY, 2005).
2.10 Promotores químicos de penetração e/ou permeação cutânea
Os promotores químicos de permeação cutânea são substâncias que reduzem
temporariamente a função de barreira do EC promovendo a penetração e retenção do fármaco
na pele. Eles devem apresentar as seguintes características: (1) não ser tóxico, irritante ou
alergênico; (2) devem agir de forma rápida, reversível e unidirecional; (3) não devem
apresentar atividade farmacológica e (4) devem ser compatíveis com todos os componentes da
formulação (TANOJO, 1996; BARRY, 1983). Esses promotores podem agir diretamente
sobre a pele modificando ou desnaturando a queratina, elevando a hidratação, afetando os
desmossomos, modificando os domínios lipídicos intercelulares e alterando a natureza
solvente do EC. Todos os fatores citados anteriormente modificam o coeficiente de partição
do fármaco na pele, melhorando a penetração e/ou permeação do ativo nesta. Além disso, eles
também podem agir de forma indireta modificando a atividade termodinâmica do veículo
favorecendo a liberação do fármaco da formulação para o estrato córneo, ou arrastando o
ativo com ele pela membrana (WILLIAMS & BARRY, 2004).
O ácido oléico (AO) (Figura 11) é um lipídeo que tem sido utilizado como promotor
de permeação cutânea. Ele é um ácido graxo com 18 átomos de carbono (C
18
), também
conhecido pela nomenclatura ácido (9Z)-9-octadecenóico, com coloração amarelada e odor
57
característico, tendo massa molecular de 282,46 g/mol, fórmula molecular C
18
H
34
O
2
e
densidade 0,895 g/mL.
Figura 11. Estrutura molecular do ácido oléico. (A) Modelo de linha de ligação. (B) modelo de bola e
vareta. Disponível em: www.quimicaorganica.net.
A característica estrutural do composto utilizado como promotor de penetração irá
influenciar no resultado obtido após a administração da formulação. Dentre essas
características destacam-se a presença de insaturação e também a configuração obtida com
essa insaturação, isto é, cis ou trans. Cadeias alquilas saturadas de tamanho C
10
-C
12
acompanhadas de um grupo polar se apresentam como potentes promotores. Para cadeias
insaturadas, os promotores apresentando cadeia C
18
apresentam uma atividade promotora
máxima. Entre os ácidos graxos insaturados com ação promotora consagrada, a configuração
cis promove maior desorganização dos lipídeos intercelulares do que a configuração trans
(OH, H.; OH, Y. & KIM, 2001; AUNGST, 1989; AUNGST, ROFERS & SHEFTER, 1986).
Esses resultados justificam, por analogia da estrutura química, o porquê do AO ser
considerado um dos mais eficientes ácidos graxos empregados como promotor de penetração.
Esse ácido graxo vem sendo empregado no aumento da permeação cutânea de
substâncias lipofílicas como, por exemplo, a nifedipina (SQUILLANTE et al., 1998), o
tenoxicam (LARRUCEA et al., 2001), a hipericinea (BOIY, ROELANDTS & DE WITTE,
2007) e o meloxicam (JANTHARAPRAPAP & STAGNI, 2007). O AO também pode atuar
58
melhorando a penetração e retenção de ativos hidrofílicos tais como o 5-ALA (PIERRE et al.,
2006).
Ele apresenta atividades em concentrações de 5 a 30% e pode atuar de forma sinérgica
quando utilizado em veículos como propilenoglicol (ABOOFAZELI; ZIA & NEEDHAM,
2002; OH, H.; OH, Y. & KIM, 2001). Esse promotor exerce sua atividade por interagir com
domínios lipídicos do EC levando a uma desorganização reversível da estrutura ordenada em
bicamada, o que acarreta uma fluidificação do meio intercelular lipídico (WILLIAMS &
BARRY, 2004).
Outro promotor químico de penetração muito empregado é o próprio propilenoglicol
(Figura 12). Esse composto ainda pode atuar tanto como veículo para formulações de uso
tópico, como um adjuvante auxiliando no aumento da viscosidade da formulação, já que um
produto final de baixa viscosidade complicaria sua administração cutânea pela possibilidade
deste atingir regiões onde o tratamento não se faz necessário. O propilenoglicol mostra uma
atividade promotora sinérgica com o AO por também ser um promotor de penetração e/ou
permeação cutânea (ABOOFAZELI; ZIA & NEEDHAM, 2002; OH, OH & KIM, 2001),
além de atuar como co-solvente da ZnPc (WILLIAMS & BARRY, 2004).
Figura 12. Estrutura molecular do propilenoglicol. (A) Modelo de linha de ligação. (B) modelo de
bola e vareta. Disponível em: www.wikipedia.org.
Este composto, de fórmula molecular C
3
H
8
O
2
, apresenta dois isômeros, sendo um o
propilenoglicol normal ou
β, que é o 1,3-propanodiol, com densidade de 1,065 g/mL. O
59
segundo, que é o isômero utilizado como solvente na farmácia, é conhecido como
propilenoglicol ordinário ou 1,2-propanodiol, com densidade de 1,036 g/mL (PRISTA et al.,
2006).
Sua atividade promotora se deve a sua boa capacidade de permeação pelo EC. Esse
fato pode alterar a atividade termodinâmica do fármaco no veículo, o que modificaria a força
de difusão. Da mesma forma, esse veículo pode sofrer partição para o tecido facilitando a
entrada do fármaco na pele. Além disso, ele pode aumentar a fluidez do domínio lipídico por
se encontrar no estado líquido promovendo uma separação de fase do estado sólido em que se
encontram os lipídeos de membrana. (WILLIAMS & BARRY, 2004).
60
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Desenvolvimento, caracterização e avaliação in vitro/in vivo de uma formulação
contendo ZnPc e ácido oléico para uso no tratamento do câncer de pele do tipo não melanoma
empregando a TFD.
3.2 Objetivos específicos
• Avaliação da solubilidade da ZnPc em solventes orgânicos;
• Estudos espectroscópicos de absorção e emissão de florescência;
• Padronização da metodologia analítica para a quantificação da ZnPc por
espectrofluorimetria em meio aquoso;
• Padronização da metodologia analítica para a quantificação da ZnPc por
espectrofluorimetria em meio orgânico;
• Preparo das formulações e verificação dessas por microscopia óptica;
• Avaliação da estabilidade das formulações propostas;
• Pesquisa de interferentes cutâneos na leitura fluorimétrica;
• Estudos de liberação in vitro da ZnPc utilizando membrana sintética;
• Estudos de penetração e permeação in vitro da ZnPc utilizando membrana natural;
• Estudos de penetração e retenção pela técnica de tape-stripping;
• Avaliação microscópica da eficiência de retirada do EC por fitas adesivas;
• Avaliação da distribuição do fotossensibilizante nas camadas da pele por microscopia a
laser de varredura confocal (MVLC);
• Estudos de toxicidade e fototoxicidade cutânea in vivo em modelo animal.
61
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Matérias-primas
• Zinco ftalocianina – Sigma Aldrich
• Ácido oléico – Vetec
• Propilenoglicol – Pharma Nostra
• 1-metil-2-pirrolidona – Tedia Company. Inc.
4.2 Reagentes e solventes
• Acetona - Vetec
• Água destilada – Farmácia Universitária – Universidade Federal do Rio de Janeiro
• Fosfato de sódio dibásico anidro - Farmos
• Fosfato de potássio monobásico anidro - Vetec
• Cloreto de sódio - Farmos
• Solução de ácido clorídrico 3N - Farmácia Universitária – Universidade Federal do
Rio de Janeiro
• Dodecilsulfato de sódio (SDS) - Vetec
• Millonig de Carson - Laboratório de Histologia Animal e Comparada, vinculado ao
Programa de Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
• Álcool 70° - Laboratório de Histologia Animal e Comparada, vinculado ao Programa
de Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
• Álcool 80° - Laboratório de Histologia Animal e Comparada, vinculado ao Programa
de Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
• Álcool 90° - Laboratório de Histologia Animal e Comparada, vinculado ao Programa
de Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
62
• Álcool absoluto – Isofar
• Xilol – Química Especializada Erich LTDA
• Parafina – Easy Path
• Hematoxilina de Harris - Laboratório de Histologia Animal e Comparada, vinculado
ao Programa de Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da
UFRJ
• Eosina - Laboratório de Histologia Animal e Comparada, vinculado ao Programa de
Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
• Tissue -Tek® O.C.T. Compound – Miles Inc.
• Entelan - Entellan® new – Merck
• Immersol
TM
518F – Zeiss
• Glicerina - Galena
4.3 Equipamentos
• Balança analítica – Bioprecisa – FA2104N
• Potenciômetro - Analyser
• Agitador magnético - Corning
• Banho de ultra-som – Thornton
• Vortex – Phoenix – AP56
• Espectrofotômetro – Jasco – V-630
• Espectrofluorímetro Jasco – FP 6500
• Ultra Turrax
®
- Ika
®
- T18 Basic
• Centrifuga – Beckman Coulter – Avanti
TM
J-25
• Membrana de acetato de celulose - Sigma-Aldrich - MW 12,000–14,000
63
• Fita adesiva - Transpore, Nexcare, 3M
• Placa de aquecimento - Corning
• Microscópio óptico – Leica - DMLS
• Microscópio confocal – Zeiss – LSM 510 META
• Laser – Photon Lase I, D.M.C.
• Processador histológico – Shandon – CITADEL 2000
• Vácuo acoplado – Shandon
• Inclusor – Shandon – Histocenter 2
• Micrótomo - American Optical - Spencer 45
• Criostato – Leica – CM1900
4.4 Métodos
4.4.1 Avaliação da solubilidade da ZnPc em solventes orgânicos
Na solubilização da ZnPc, vêm sendo empregados alguns solventes como o
dimetilsulfóxido (DMSO) (MACHADO et al., 2009), a dimetilformamida (DMF) (KMENT
et al., 2009) e 1-metil-2-pirrolidona (ISELE et al., 1994). Dessa forma, a solubilidade desse
fotossensibilizante foi avaliada nesses solvenes.
Para tal foi pesado 1mg de ZnPc para cada um dos três tubos falcon utilizados no
experimento. Em seguida, esses tubos foram acrescidos de 1mL de cada solvente, colocados
em ultrassom e agitados em vórtex, ambos por 1minuto (min). Caso não fosse observada a
solubilização era acrescentado mais 1mL de solvente, com repetição de todo procedimento.
4.4.2 Estudos espectroscópicos de absorção e emissão de fluorescência
De acordo Ricci-Júnior & Marchetti (2006a), a análise do perfil dos espectros de
absorção e emissão de fluorescência permite detectar possíveis alterações fotofísicas,
64
degradação ou dimerização, da ZnPc. Além disto, esse estudo possibilita a determinação da
faixa de comprimento de onda para a absorção e a emissão de fluorescência do fármaco.
Sendo assim, uma solução padrão de ZnPc foi preparada da seguinte forma: 5,0mg do
fármaco foi dissolvido em balão volumétrico de 5ml com auxílio de 1-metil-2-pirrolidona.
Duas diluições foram preparadas para cada um dos solventes, o aquoso (tampão fosfato com
SDS 2%) e o orgânico (1-metil-2-pirrolidona), com o objetivo de determinar os comprimentos
de onda de absorção e emissão de fluorescência do fármaco.
Para os espectros de absorção, alíquotas de 100µL foram retiradas da solução padrão e
diluídas em balões volumétricos de 20mL com álcool etílico absoluto ou 1-metil-2-
pirrolidona, obtendo soluções com concentração de 5µg/mL de ZnPc. A partir dessas,
alíquotas de 1mL foram retiradas de cada balão e diluídas em balões volumétricos de 5mL,
obtendo soluções com concentração de 1µg/mL de ZnPc. As alíquotas provenientes da
solução alcoólica foram diluídas em tampão fosfato com 2% de SDS, enquanto as alíquotas
provenientes da solução com 1-metil-2-pirrolidona foram diluídas com esse mesmo solvente.
Ambas as soluções com 1µg/mL de ZnPc foram analisadas quanto às suas propriedades de
absorção na faixa de 350 a 800nm utilizando-se um espectrofotômetro.
Para a análise das propriedades de emissão de fluorescência, alíquotas de 50µL foram
retiradas da solução padrão e diluídas em balões volumétricos de 20mL com álcool etílico
absoluto ou 1-metil-2-pirrolidona, obtendo soluções com concentração de 2,5µg/mL de ZnPc.
A partir dessas, alíquotas de 400µL foram retiradas de cada balão e diluídas em balões
volumétricos de 5mL, obtendo soluções com concentração de 200ng/mL de ZnPc. As
alíquotas provenientes da solução alcoólica foram diluídas em tampão fosfato com 2% de
SDS, enquanto as alíquotas provenientes da solução com 1-metil-2-pirrolidona foram diluídas
com esse mesmo solvente. Ambas as soluções, contendo 200ng/mL de ZnPc, foram excitadas
65
no comprimento de onda de 608nm e posteriormente, analisadas na faixa de 630 a 800nm
para registro do espectro de emissão de fluorescência.
Ao final, os espectros de absorção e de emissão das amostras foram comparados,
visando à detecção de possível degradação ou dimerização do fármaco.
4.4.3 Padronização da metodologia analítica para a quantificação de ZnPc por
espectrofluorimetria em meio aquoso
A ZnPc é um composto fluorescente, sendo identificado e quantificado por emissão de
fluorescência, utilizando-se um espectrofluorímetro. A emissão de fluorescência é um método
espectrofotométrico que se aplica às substâncias fluorescentes, ou seja, aquelas que são
capazes de absorver energia radiante e emitir luz. A espectrofluoriometria quantitativa baseia-
se na medida da intensidade de emissão de fluorescência em função da concentração da
espécie fluorescente na solução. Assim, a intensidade da emissão de fluorescência é
proporcional à concentração do fármaco em estudo (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002).
A padronização da metodologia analítica em meio aquoso, ou seja, em solução tampão
fosfato pH 7.4, contendo 2% de dodecilsulfato de sódio (SDS), foi realizada para a
quantificação de ZnPc liberada ou permeada durante os estudos in vitro de liberação e de
penetração/permeação cutânea, respectivamente.
O preparo desta solução tampão envolveu a pesagem dos constituintes em balança
analítica e a dissolução desses em água destilada até um volume estabelecido e pré-
determinado. Dessa forma, foram pesados 0,9520g de fosfato de sódio dibásico anidro,
0,0760g de fosfato de potássio monobásico anidro e 3,2000g de cloreto de sódio. Esses sais
foram dissolvidos em 500mL de água destilada e posteriormente o pH foi corrigido para 7.4
com uma solução de ácido clorídrico 3N, usando para tal um potenciômetro. Para a
solubilização do fármaco, 20g de SDS foram dissolvidos, com auxílio de um banho de ultra-
66
som por 10 minutos (min), em quantidade suficiente de tampão fosfato para se completar
1000mL, obtendo-se uma solução na concentração de 2%.
Após leituras de soluções de ZnPc na concentração de 1µg/mL e 200ng/mL em meio
aquoso contendo 2% de SDS, foi verificado que esta molécula apresenta um pico de absorção
na faixa de 607 a 610nm e emite fluorescência na faixa de 650 a 750nm, respectivamente.
A seguir, preparou-se uma solução estoque de ZnPc na concentração de 1mg/mL. Para
tal, pesou-se 5mg deste fotossenssibilizante, que foi dissolvido em balão volumétrico de 5mL
com 1-metil-2-pirrolidona. Dessa solução, retirou-se uma alíquota de 100µL, avolumando-se
para 20mL com álcool etílico absoluto, obtendo-se uma solução na concentração de 5µg/mL.
A partir dessa, foram feitas diluições em solução tampão fosfato contendo 2% SDS, obtendo
as seguintes concentrações: 30, 50, 70, 100, 150, 200 e 300ng/mL do fármaco. Estas
concentrações constituíram os pontos de leitura da fluorescência no preparo da curva
analítica, conforme executado por Ricci-Júnior (2005).
As soluções foram excitadas utilizando-se um comprimento de onda de excitação (λ
ex
)
de 608nm, e a emissão de fluorescência foi registrada no comprimento de onda de emissão
(λ
em
) de 674nm utilizando um espectrofluorímetro. A curva analítica foi obtida em triplicata
(n=3), relacionando-se os valores da concentração do referido fármaco, no eixo das abscissas
(x), com os valores de emissão de fluorescência obtida para cada concentração, no eixo das
ordenadas (y) (RICCI-JÚNIOR, 2005).
O método analítico para a quantificação da ZnPc em meio aquoso por emissão de
fluorescência foi padronizado pela determinação da linearidade, da precisão (DPR%) e da
exatidão (E%) intra-dia e inter-dias. A linearidade é a capacidade de uma metodologia
analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado (BRASIL, 2003). A
linearidade foi obtida pela análise de diferentes concentrações e posterior determinação do
67
Coeficiente de determinação (R
2
) e do Coeficiente de correlação de Pearson (r). Já a precisão
se caracteriza por envolver a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série
de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra, enquanto a exatidão de um
método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação
ao valor verdadeiro (BRASIL, 2003).
A curva analítica e triplicatas (n=3 determinações) de duas concentrações da curva
analítica (50, 100 ng/ml) foram preparadas em dois dias diferentes e foram determinadas a
precisão e a exatidão intra-dia e inter-dia. A precisão foi expressa como o desvio padrão
relativo (DPR) das medidas, de acordo com a equação:
DPR (%) = (desvio padrão / média) x 100. (Equação 5)
A exatidão corresponde à diferença entre o valor obtido e o valor teórico, sendo
calculada pela equação:
E (%) = [(valor obtido – valor real) / valor real] x 100 (Equação 6) (CAUSON, 1997).
4.4.4 Padronização da metodologia analítica para a quantificação de ZnPc por
espectrofluorimetria em meio orgânico
Uma segunda curva analítica foi padronizada utilizando 1-metil-2-pirrolidona como
meio orgânico, sendo esta empregada na quantificação de ZnPc dos estudos in vitro de
retenção/penetração cutânea. No preparo da referida curva analítica, pesou-se 1mg de ZnPc,
que foi dissolvida em balão volumétrico de 10mL com 1-metil-2-pirrolidona (solução estoque
100 µg/mL de fármaco). Dessa solução, retirou-se uma alíquota de 0,5mL, avolumou-se em
balão volumétrico de 10mL com o mesmo solvente. A partir dessa solução, foram feitas novas
68
diluições com 1-metil-2-pirrolidona obtendo as seguintes concentrações: 10, 30, 50, 100, e
200 ng/mL de ativo, as quais constituíram os pontos de leitura da fluorescência no preparo da
curva analítica, conforme executado por Ricci-Júnior (2005).
As soluções foram excitadas utilizando-se um comprimento de onda de excitação (λ
ex
)
de 608nm, e a emissão de fluorescência foi registrada no comprimento de onda de emissão
(λ
em
) de 671nm utilizando um espectrofluorímetro. Da mesma forma, o método analítico para
a quantificação da ZnPc em meio orgânico por emissão de fluorescência foi padronizado pela
determinação da linearidade, da precisão (DPR%) e da exatidão (E%) intra-dia e inter-dias
descritos no item 4.4.2.
4.4.5 Preparo das formulações
Foram desenvolvidas cinco formulações empregando o propilenoglicol como veículo e
ZnPc na concentração de 200µg/mL, previamente dissolvida em 1-metil-2-pirrolidona. Dentre
essas, uma não apresentava AO, enquanto as outras quatro continham esse promotor químico
nas concentrações de 5, 10, 20 e 30%, conforme descrito na Tabela 1.
Tabela 1. Composição das formulações
Solução de ZnPc
(1mg/mL)
Quantidade
de AO
Concentração
de AO (%)
Propilenoglicol
Formulação
A
2mL 0,5mL 5% qsp 10mL
Formulação
B
2mL 1mL 10% qsp 10mL
Formulação
C
2mL 2mL 20% qsp 10mL
Formulação
D
2mL 3mL 30% qsp 10mL
Formulação
E
2mL -- -- qsp 10mL
69
Estas formulações foram preparadas a partir de uma solução estoque de ZnPc em 1-
metil-2-pirrolidona. Para tal, pesou-se em balança analítica 5,0mg do fármaco, que foi
dissolvido em balão volumétrico de 5mL com o solvente citado anteriormente, obtendo-se
uma solução estoque na concentração final de 1mg/mL de ZnPc. Para dissolução, utilizou-se
por duas vezes o ultra-som durante 10 min, seguido de agitação em vórtex por 1 min. Dessa
solução estoque, foi transferida uma alíquota de 2mL, com pipeta automática, para balão
volumétrico de 10mL e quantidades pré-determinadas de AO foram acrescentadas. A seguir,
foi realizada uma homogeneização em vórtex (1min), o volume final foi completado com
quantidade suficiente de propilenoglicol, obtendo-se uma solução na concentração de
200µg/mL de ZnPc (conforme Tabela 1), após completa homogeneização.
Todas as formulações foram armazenadas sob proteção da luz e em local refrigerado
para garantir a estabilidade do fotossensibilizante.
4.4.6 Avaliação microscópica das formulações propostas
A partir de todas as formulações propostas foram preparadas lâminas para visualização
microscópica visando a verificação da presença de possíveis cristais de ZnPc. Para tal, uma
gota de cada formulação foi colocada na superfície de sua respectiva lâmina, sendo
posteriormente coberta por uma lamínula para facilitar a visualização. As lâminas preparadas
foram observadas com microscopia de campo claro e de luz polarizada, ambas com um
aumento de 400x.
4.4.7 Avaliação da estabilidade das formulações propostas
As formulações preparadas como descrito no item 4.4.5 foram diluídas na proporção
de 1:20 em propilenoglicol e avaliadas quanto a sua capacidade absortiva. Para tal, foram
obtidos espectros de absorção na faixa de comprimento de onda compreendida entre 350 e
70
800nm, com auxílio de um espectrofotômetro. Esses foram comparados, posteriormente, com
o espectro de absorção de uma solução de ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona na mesma
concentração das formulações propostas, obtido nas mesmas condições anteriores. Para essa
solução foi utilizado um branco de 1-metil-2-pirrolidona, enquanto que para a formulação E
foi utilizado o propilenoglicol e para as outras (formulações A, B, C, D) foi utilizada uma
solução de 5% de AO em propilenoglicol.
4.4.8 Análise de interferentes
A análise de interferentes foi realizada com o objetivo de verificar a presença de
constituintes da pele suína na faixa de comprimento de onda de emissão de fluorescência do
fármaco (630 a 750nm).
Para tal, foi utilizada uma amostra de pele total excisada de orelha de suínos com área
de 1,54 cm
2
. Essa foi cortada em pequenos pedaços, acondicionada em um tubo Falcon e
adicionada de 7mL de tampão fosfato contendo 2% de SDS, preparado conforme descrito no
ítem 3.4.2. Em seguida, a pele foi triturada, utilizando um homogeneizador de tecidos (Ultra
Turrax
®
), e centrifugada (10000 x g) durante 25 minutos. O sobrenadante obtido foi filtrado
por membrana hidrofílica e excitado no comprimento de onda de 608nm, sendo
posteriormente, analisado na faixa de 630 a 750nm para registro do espectro de emissão de
fluorescência. O mesmo ensaio foi realizado com o solvente orgânico (1-metil-2-pirrolidona).
Os espectros de emissão de fluorescência das referidas amostras foram comparados
com os espectros de emissão de fluorescência da ZnPc na concentração de 200ng/mL, obtidos
em ambos os solventes conforme descrito no item 4.4.2.
71
4.4.9 Estudos in vitro
Nos estudos in vitro de liberação, penetração e/ou permeação, foi empregado um
sistema de difusão vertical, composto por um compartimento doador, um receptor e uma
membrana. Para os ensaios de liberação, utilizou-se membrana sintética (acetato de celulose)
e para os ensaios de penetração e/ou permeação utilizou-se membrana natural (pele suína). A
área de difusão foi de 1,54 cm
2
e o volume utilizado do compartimento receptor foi de 40mL.
O meio receptor foi mantido a 37ºC
+
0,5 sob agitação constante (300 rpm) a fim de assegurar
sua homogeneidade (FREITAS, 2005). Teve-se o cuidado de monitorar a presença de bolhas
de ar abaixo de cada membrana.
4.4.9.1 Estudos in vitro de liberação da ZnPc em membrana sintética
Inicialmente, as membranas de acetato de celulose (poros com diâmetro de 0,2µm),
tiveram suas laterais cortadas para que, em seguida, fossem separadas sob água corrente.
Após separação, as faces foram submetidas à hidratação (três vezes, por 5 min, em água
destilada a 100°C). Após hidratação, as membranas foram armazenadas em pote plástico
branco leitoso, contendo água destilada e mantidas sob refrigeração por uma semana. Esta
membrana sintética é muito utilizada nestes experimentos por não apresentar resistência à
passagem do fármaco do compartimento doador para o compartimento receptor (HAIGH &
SMITH, 1994), sendo o ativo quantificado em função de sua partição entre o veículo e o meio
aceptor.
A solução receptora empregada foi tampão fosfato isotônico (pH 7.4), contendo 2% de
SDS, preparada conforme indicado no item 4.4.3. Este meio foi selecionado de acordo com
Ricci-Júnior (2005).
O sistema de difusão vertical foi preparado 30 min antes da aplicação da formulação
para que o equilíbrio entre membrana e meio receptor fosse atingido (FREITAS, 2005). Após
72
este tempo, um volume de 1000µL da formulação foi aplicado no compartimento doador, com
auxílio de pipeta automática. No tempo zero e em intervalos de tempo pré-determinados (1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 e 12 horas), foi retirada uma alíquota de 2ml do compartimento receptor, com
auxílio de pipeta automática, havendo reposição da solução receptora. As amostras foram
analisadas por espectrofluorimetria, de acordo com as condições analíticas pré-estabelecidas
no item 4.4.3. A quantidade acumulada de ZnPc coletada a partir da célula de difusão
(µg/cm
2
) foi relacionada com o tempo (h) para construção do perfil de liberação in vitro. Os
dados do perfil de liberação in vitro foram utilizados para o estudo da cinética de liberação do
fotossensibilizante. Os modelos matemáticos de cinética de liberação testados foram o de
Ordem zero e Higuchi (1962). Os modelos matemáticos foram aplicados nos dados do perfil
de liberação in vitro no intervalo de 3 à 12 horas (hs) garantindo a condição de fluxo
constante do fotossensibilizante para a solução receptora. No modelo de Ordem zero efetuou-
se uma regressão linear direta da quantidade acumulada de ZnPc no meio receptor da célula
de difusão (µg/cm
2
) em função do tempo (h) e no modelo de Higuchi (1962) a regressão
linear foi obtida relacionando-se a quantidade acumulada de ZnPc (µg/cm
2
) em função da raiz
quadrada do tempo (h
1/2
). O modelo matemático que melhor se ajusta a cinética de liberação
do fotossensibilizante é aquele que fornecer o maior valor de coeficiente de correlação de
Pearson (r) após aplicação da regressão linear. Após escolha do modelo efetuou-se o cálculo
do fluxo de equilíbrio (K) e o lag time (t
Lag
). O K foi determinado a partir valor do
componente “a” da equação da reta (y = ax + b) ou inclinação. O t
Lag
foi determinado pela
intersecção da reta no eixo x (hs).
Os resultados foram expressos como a Média (M.D.) ± Desvio padrão (D.P.) de três
experimentos para cada uma das formulações desenvolvidas, conforme item 4.4.3.
73
4.4.9.2 Estudos in vitro de Retenção, Penetração e Permeação Cutânea
Os estudos de retenção, penetração e permeação da ZnPC foram realizados no sistema
de difusão vertical exposto no item 4.4.9.
4.4.9.2.1 Preparo da pele suína
As orelhas utilizadas nesse experimento foram obtidas de porcos machos saudáveis
com idade de aproximadamente seis meses, criados sob supervisão de veterinários. Estes
animais foram abatidos no Setor de Suinocultura da Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro (UFRRJ). Após o abate, as orelhas foram separadas, limpas e acondicionadas em
recipiente sob refrigeração para serem transportadas para o Laboratório de Desenvolvimento
Galênico (LADEG) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), em um tempo não
superior a 2hs. No mesmo dia, as orelhas foram lavadas com água destilada para remoção de
manchas de sangue. A pele da parte posterior auricular foi retirada com auxilio de pinça e
bisturi, conforme evidenciado na figura 13 (quadros A e B). Após a separação da cartilagem,
os vasos sanguíneos e grande parte dos tecidos adiposos subjacente foram retirados com
auxílio de pinça e tesoura, conforme evidenciado na figura 13 (quadro C). Os pelos
superficiais foram cuidadosamente cortados com auxílio de uma tesoura. Dessa forma, foram
obtidas amostras de pele contendo EC, epiderme viável, derme e isenta de vasos sanguíneos
(Figura 13, quadro D). A seguir, pedaços circulares de pele com aproximadamente 11,0 cm
2
de área foram acondicionados em filme de cloreto de polivinila (PVC) com remoção de ar e
devidamente etiquetados e armazenados a 20
o
C negativos por no máximo quatro semanas
antes do uso.
74
Figura 13. Obtenção da amostra de pele suína para realização de estudos de penetração e permeação
cutânea. (A) Orelha limpa. (B) Retirada da pele. (C) Retirada do tecido adiposo subjacente. (D)
Amostra de pele obtida.
4.4.9.2.2 Protocolo da Permeação in vitro das formulações contendo ZnPc
Os estudos in vitro de penetração e permeação cutânea, das formulações desenvolvidas
contendo ZnPc, foram realizados empregando o sistema de difusão vertical, conforme descrito
no item 4.4.9. Nesse sistema, entre o compartimento doador e o receptor, foi utilizada a
membrana natural , proveniente de suínos conforme descrito em 4.4.9.2.1.
A pele suína total excisada foi montada na célula de difusão com o EC faceando o
compartimento doador. O compartimento receptor foi preenchido com uma solução de
tampão fosfato isotônico pH 7.4, contendo 2% de SDS, preparada conforme descrito no item
4.4.3. A membrana natural permaneceu em contato com o meio receptor por uma hora antes
do início do experimento, permitindo, assim, a obtenção de um equilíbrio do sistema. A
75
seguir, aplicou-se uniformemente 1000µL da formulação no compartimento doador, com
auxílio de pipeta automática. No tempo zero e em intervalos de tempo pré-determinados (1, 2,
3, 4, 6, 8, 12 e 24 hs), foi retirada uma alíquota de 2ml do compartimento receptor, com
auxílio de pipeta automática, havendo reposição da solução receptora. As amostras foram
analisadas por espectrofluorimetria, de acordo com as condições analíticas pré-estabelecidas
no item 4.4.3.
No perfil de permeação in vitro, o fluxo de equilíbrio, expresso em µg.cm
-2
.h
-1
, foi
calculado a partir da equação da reta obtida após ser efetuada a regressão linear do intervalo.
Os resultados foram expressos como a M.D. ± D.P. de três experimentos para cada uma das
formulações desenvolvidas, conforme item 4.4.3.
4.4.9.2.3 Protocolo da penetração e retenção in vitro das formulações contendo ZnPc
A técnica de tape stripping ou “remoção do estrato córneo” por fita adesiva é uma
ferramenta útil para determinar a penetração de fármacos na pele, mais precisamente no EC
(SHAH, 1995, SHAH et al., 1998, PERSHING, 2001).
A fase inicial dos estudos in vitro de penetração e retenção da ZnPc, presente nas
formulações desenvolvidas, foi realizada de acordo com o procedimento descrito em 4.4.9.2.2.
Após 4 hs, o sistema de difusão foi desmontado, a pele suína foi retirada com auxílio de uma
pinça, a formulação foi removida com auxílio de algodão, a pele foi limpa com algodão
umedecido em água destilada e seca com lenço de papel (duas vezes).
A seguir, o EC foi seqüencialmente retirado 11 vezes com a fita adesiva (1,54 cm
2
), a
qual foi pressionada à pele por um bastão de vidro (Figura 14, quadro A) rolando
regularmente dez vezes (HERAI et al., 2007; FREITAS, 2005). Posteriormente, a fita foi
retirada de uma só vez, por meio de uma pinça, com um movimento unilateral, conforme
evidenciado na figura 14(quadro B). A primeira fita foi descartada com o objetivo de evitar
76
uma quantidade superestimada de ZnPc. As dez fitas posteriores foram colocadas em tubos
Falcon com tampa contendo 7mL de 1-metil-2-pirrolidona. Os tubos foram agitados para melhor
contato do solvente com as fitas, resultando na extração da ZnPc. Após 24 hs de extração, as fitas
foram retiradas da solução com auxílio de pinça, a mesma foi centrifugada (10.000 x g) e filtrada
em membrana hidrofílica. A quantidade de ZnPc extraída das fitas adesivas foi quantificada por
espectrofluorimetria em meio orgânico, conforme descrito em 4.4.4.
Figura 14. Modelo de fixação (A) e retirada (B) de fitas para realização do tape-stripping.
A pele remanescente foi cortada em pequenos pedaços e triturada, com auxílio de tesoura
e ultra turrax
®
, respectivamente. A seguir, os fragmentos cutâneos foram acondicionadas em
tubos Falcon contendo 3mL de 1-metil-2-pirrolidona e vortexados por um minuto intercalados
em três períodos de 20 min. Após 24 hs, os tubos foram novamente agitados em vórtex por um
minuto e centrifugados (10.000 x g). A seguir o sobrenadante foi filtrado em millex
®
(com poro
de 0,20µm) e analisado por espectrofluorímetro meio orgânico, conforme descrito em 4.4.4.,
objetivando quantificar a ZnPc retida na pele remanescente.
77
4.4.9.2.4 Avaliação microscópica da remoção de camadas do estrato córneo por fitas
adesivas
A técnica denominada “tape-stripping” vem sendo empregada em vários trabalhos
com intuito de remoção do EC e quantificação de determinada substância retida nesse ou na
pele remanescente. Sabe-se que a quantidade de corneócitos retidos na fita vai diminuindo a
cada nova remoção (LADEMANN et al., 2009), porém as divergências ficam por conta da
quantidade de fitas necessárias para a total de remoção dessa camada da pele. Alguns autores
citam 11 fitas (FREITAS, 2005), 15 fitas (DURACHER et al., 2009); 20 fitas
(DRAGICEVIC-CURIC et al., 2009) ou 21 fitas (FRELICHOWSKA et al., 2009).
A metodologia para remoção do EC por “tape-stripping” empregada no presente
trabalho foi baseada nos estudos de Freitas (2005) empregando 11 fitas adesivas, e para
confirmar a retirada dessa camada da epiderme foi realizada uma microscopia em campo claro
de secções de peles suínas submetidas a essa metodologia.
Para tal, todo procedimento inicial descrito no item 4.4.9.2.2 foi repetido com a
aplicação de 1mL do placebo contendo 10% de AO e propilenoglicol como veículo.
Conforme descrito em 4.4.9.2.3, o sistema foi desmontado após 4 horas e os fragmentos de
pele retirados foram submetidos à técnica de “tape-stripping”.
Ao final dessa metodologia os fragmentos de pele remanescente foram acondicionadas
em cassetes para evitar dobramento e fixadas em solução Millonig de Carson pH 7.4
(KIERNAN, 1991) para estudos histológicos com microscopia de luz de campo claro.
Em processador histológico automático adicionado de um vácuo, os fragmentos da
pele foram processados segundo a técnica histológica para obtenção de cortes incluídos em
parafina (LILLIE & FULLMER, 1972). Nessa, as peles foram lavadas em água destilada para
retirar o excesso de formol e em seguida desidratadas utilizando-se concentrações crescentes
de álcool etílico (70º; 80º; 90º; 99,6º) em banhos de 20min para cada. Após a desidratação, o
78
material foi clarificado (diafanação) em dois banhos sucessivos de xilol (15min cada) no
interior da capela. Posteriormente, esse foi impregnado utilizando-se dois banhos de parafina
(15min cada) em estufa (60°C), para que, em seguida, fosse incluído em parafina pura, em
inclusor (Figura 15).
Figura 15. Esquema da técnica histológica de inclusão.
A partir desses blocos, foram obtidas secções de 5µm de espessura com o auxílio de
um micrótomo, que caiam diretamente em uma bacia contendo água na temperatura ambiente,
onde eram mergulhadas lâminas para captura deste material, sendo armazenadas em estufa a
37ºC durante 24hs para secagem.
Em seguida, as lâminas contendo o material seccionado foram submetidas a um
processo de coloração realizado em capela com a utilização de borréis e pinça (Figura 16).
Inicialmente, as lâminas foram desparafinizadas em três banhos seguidos de xilol (10s, em
cada). A partir desse ponto, foi iniciada uma hidratação em soluções hidroalcoólicas de
diferentes graduações (99,6°; 90º; 80º e 70º, respectivamente), visando a retirada de toda
79
parafina residual. Após essa lavagem, o material foi mergulhado em água destilada para que,
em seguida, fosse submetido à colorações seqüenciais pela hematoxilina de Harris e pela
eosina, respectivamente, intercaladas por banho em água destilada e com duração de 2s cada.
Neste método, as estruturas basófilas, como o núcleo, coram-se em azul e as estruturas
acidófilas, como citoplasma, coram-se em róseo. Após rápida lavagem em água destilada, os
cortes foram desidratados, conforme descrito acima no processo de inclusão, e montados com
lamínulas, utilizando-se entelan para melhorar a visualização (LILLIE & FULLMER, 1972).
Finalmente, foram catalogadas e reservadas em caixas próprias para posterior análise em
microscópio ótico com câmera fotográfica acoplada.
Figura 16. Bateria de coloração com hematoxilina e eosina, utilizando borreis.
4.4.10 Avaliação da distribuição da ZnPc nas camadas da pele por microscopia de
varredura a laser confocal (MVLC)
A MVLC possibilita estudos detalhados de um fotossensibilizante em materiais
biológicos como tecidos e células, apresentando a vantagem de facilitar a visualização de alta
resolução focada em pequenos sítios. Dessa forma, possibilita o estudo de localização celular
80
ou tecidual de um fotossensibilizante por meio de emissão de fluorescência, em nível
tridimensional e de alta exatidão.
A fase inicial dos estudos in vitro para a avaliação por microscopia confocal da ZnPc,
presente na formulação B (contendo 10% de AO), foi realizada de acordo com o
procedimento descrito em 4.4.9.2.2. Após 4hs, o sistema de difusão foi desmontado, a pele
suína foi retirada com auxílio de uma pinça, a formulação foi removida com auxílio de
algodão, a pele foi limpa com algodão umedecido em água destilada e seca com lenço de
papel (duas vezes). A seguir, o segmento cutâneo foi acondicionado em meio para
congelamento tecidual (Tissue-Tek
®
O.C.T. Compound) utilizando um molde cilíndrico de
papel laminado. Posteriormente, este material foi mergulhado em nitrogênio líquido, com
auxílio de pinça, e armazenado em temperatura de 80
o
C negativos.
A seguir, os blocos congelados (Figura 17, quadro A) foram seccionados no criostato,
obtendo-se cortes de 7µm, captados diretamente em lâminas de vidro (Figura 17, quadro B).
Figura 17. Preparo de cortes para realização da microscopia confocal. Fixação do bloco de material
congelado(A). Corte em criostato(B).
Sobre os cortes era adicionada uma gota da mistura 9:1 de glicerina e tampão fosfato,
visando à manutenção da fluorescência, e em seguida uma lamínula. As lâminas preparadas
foram acondicionadas em freezer para posterior análise em microscópio confocal.
81
O experimento foi realizado na Sessão de Microscopia Confocal do Laboratório de
Patologia da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). Para tal, foi utilizado para excitação da ZnPc
o comprimento de onda de 633nm, e para a detecção da emissão de fluorescência foi utilizado
um filtro Long Pass 650nm, que capta a emissão nos comprimentos de onda superiores a este
valor, até 750nm. As lâminas eram adicionadas de uma gota de óleo de imersão para
microscopia de fluorescência (Immersol
TM
518F), e fotografadas em uma ampliação de 400x.
4.4.11 Estudos de fototoxicidade e toxicidade cutânea in vivo em modelo animal
Os estudos de fototoxicidade são importantes para avaliar se a formulação contendo
um fotossensibilizante, na presença de luz, é capaz de produzir uma resposta fotobiológica e,
conseqüentemente, fototerápica em um sistema biológico in vivo.
A avaliação da toxicidade de uma formulação permite verificar se a mesma, quando
aplicada na pele, desencadeia uma resposta inflamatória local na ausência de uma fonte
luminosa.
Nos estudos in vivo de fototoxicidade e toxicidade cutânea foram utilizados
camundongos. Em comparação a outros animais utilizados em pesquisa, esses apresentam
vantagens como tamanho reduzido, manuseio simples e custo relativamente reduzido. Dentre
suas espécies, podemos destacar os camundongos sem pêlo, espécies nude ou hairless, que
apresentam maior semelhança com a pele humana. Nesses animais a probabilidade de dano ao
tecido cutâneo é diminuída pela falta da necessidade de remoção dos pêlos (GODIN &
TOUITOU, 2007).
Os estudos foram conduzidos utilizando-se a pele do dorso de camundongos sem pêlo.
Esses eram do sexo feminino, com idade de 12 semanas, pesando por volta de 20g e foram
cedidos pelo Biotério do Laboratório de Imunofarmacologia, pertencente ao Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF-UFRJ), coordenado pela professora Dra. Bartira Rossi
82
Bergmann. Os animais foram mantidos em alimentação convencional, hidratados com água
destilada e divididos em três diferentes grupos, conforme consta no Protocolo de Uso e
Cuidados com Animais aprovado sob o número de referência DFBCICB 031 pela Comissão
de Ética com Uso de Animais (CEUA) (ANEXO). A avaliação da fototoxicidade e da
toxicidade da formulação B foi realizada no Laboratório de Histologia Animal e Comparada,
vinculado ao Programa de Pesquisa em Glicobiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da
UFRJ, com colaboração da professora Dra. Lycia de Brito Gitirana.
Em três camundongos sem pêlo foram aplicados 200 µL da formulação B na região
dorsal direita e esquerda (área delimitada de 4 cm
2
), enquanto a região dorsal superior foi
considerada controle (figura 18) (sem aplicação da formulação B). Em seguida, todos foram
alojados por 48hs em gaiolas sob abrigo da luz.
Figura 18. Modelo utilizado no estudo (A) e camundongo hairless com a formulação teste
administrada em área delimitada (B).
83
Após 4hs sob abrigo da luz, tempo considerado necessário para uma penetração e uma
possível retenção do fármaco nos tecidos cutâneos, os três camundongos foram irradiados
com laser conforme evidenciado na figura 19. Em seguida, esses voltaram para o abrigo da
luz, onde permaneceram por 48hs, até serem sacrificados. Conforme observado por Kassab et
al. (2000), as reações de fotossensibilização ocorrem por volta de 12 a 48hs após a
iluminação, com as evidências histológicas diminuindo após esse tempo.
Figura 19. Aplicação de laser na região delimitada de aplicação da formulação.
O aparelho utilizado para a irradiação foi o Photon Lase I (Figura 20), que emite luz
no comprimento de onda de 660nm, região do visível correspondente à luz vermelha, onde
ocorre máxima absorção de energia pela ZnPc. No experimento foi utilizada a potência de
50mW, em uma dose de 100J/cm
2
, com duração de 56s.
84
Figura 20. Aparelho Photon Lase I utilizado na irradiação dos camundongos.
Após 48hs, todos os camundongos envolvidos no estudo foram sacrificados em cuba
de vidro fechada por exposição prolongada em atmosfera saturada de éter. Em seguida, os
animais foram avaliados macroscopicamente, objetivando verificar possíveis alterações
cutâneas. Suas peles foram cortadas com auxílio de bisturi e tesoura, lavadas com solução
fisiológica, acondicionadas em cassetes para evitar dobramento e fixadas em solução Millonig
de Carson pH 7.4 (KIERNAN, 1991) para estudos histológicos com microscopia de luz de
campo claro.
Os fragmentos da pele foram processados segundo a técnica histológica para obtenção
de cortes incluídos em parafina (LILLIE & FULLMER, 1972) e corados, conforme descrito
no item 4.4.9.2.4. O material foi catalogado e reservado em caixas próprias para posterior
análise em microscópio ótico com câmera fotográfica acoplada.
4.4.12 Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados estatisticamente empregando-se análise de
variância (ANOVA – um fator) com nível de significância (α) de 5%, com auxílio do
programa InStat for Windows (GraphPad Software).
85
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação da solubilidade da ZnPc em solventes orgânicos
O dimetilsulfóxido (DMSO) foi avaliado como possível solvente e promotor de
permeação cutânea para as formulações desenvolvidas contendo ZnPc na concentração de
200µg/mL. Foi verificado que para dissolver 1mg de tal fotossensibilizante, foi necessário
completar o volume para 20mL com DMSO agitando-se sucessivas vezes. Portanto, a
quantidade desse solvente empregado para o preparo da formulação seria elevada. De acordo
com Williams & Barry (2004), concentrações elevadas do referido solvente podem ser tóxicas
e liberar metabólitos indesejáveis, por isso sua utilização foi descartada.
O mesmo problema foi evidenciado com a utilização de um derivado do DMSO, a
dimetilformamida (DMF). Foi verificado que para dissolver 1mg de ZnPc foi necessário que
se completasse o volume para 10mL com esse solvente, além de sucessivas agitações. Dessa
formas, sua utilização também foi descartada pelo fato desse solvente em concentrações
elevadas ser possivelmente tóxico (W
ILLIAMS
&
B
ARRY
,
2004).
A solubilidade da ZnPc foi também avaliada na 1-metil-2-pirrolidona. Nesse caso, foi
verificado que para dissolver 1mg de ZnPc foi necessário completar o volume para 1mL com
o referido solvente. Esse procedimento resultou em uma solução estoque límpida, de
coloração azul intenso, odor característico e estável.
Em virtude desses resultados, o solvente de escolha para o preparo da solução inicial
de ZnPc empregada no preparo das cinco formulações e nos estudos relacionados a ZnPc foi a
1-metil-2-pirrolidona.
5.2 Estudos espectroscópicos de absorção e emissão de fluorescência
O espectro de absorção da ZnPc na concentração de 1µg/mL em 1-metil-2-pirrolidona
ou em tampão fosfato contendo 2% SDS está representado na figura 21.
86
Figura 21. Espectro de absorção da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona e em tampão fosfato pH 7.4
contendo 2% de SDS. Parâmetros de espectrofotômetro: band width de excitação 1,5nm; resposta
média; data pitch 0,5nm e velocidade de leitura 200nm/min.
A ZnPc é uma substância apolar e pouco solúvel em água necessitando de um
tensoativo para dispersão do fotossensibilizante no meio aquoso dos estudos de liberação e
permeação in vitro. O tensoativo utilizado é o dodecilsulfato de sódio (SDS) que leva a
formação de micelas em meio aquoso criando um microambiente apolar no núcleo micelar. A
ZnPc se mantém em sua forma monoméria e estável no interior das micelas de SDS,
conservando suas propriedades espectroscópicas, conseqüentemente.
Ambos os espectros de absorção foram registrados na faixa de comprimento de onda
(λ) de 350 a 800nm. Pela análise desses pode-se observar um conjunto de bandas Q na região
de 600 a 710nm e uma banda Soret na região de 350nm. De acordo com Eichwurzel,
Pevzener & Roder (2000), as bandas Q correspondem aos níveis vibracionais referentes ao
87
primeiro e ao segundo estado eletronicamente excitado singleto, enquanto que, a banda Soret,
consiste em mais de dez transições eletrônicas com diferentes orientações e tamanhos de
momentos de dipolo.
A determinação dos espectros de absorção da ZnPc em tampão fosfato e em 1-metil-2-
pirrolidona foi importante par se determinar qual comprimento de onda deveria ser utilizado
nos estudos de quantificação por emissão de fluorescência. Nos dois espectros foi observado
que o fotossensibilizante apresenta forte absorção na região do visível correspondente à
coloração vermelha, com máximo de absorção ocorrendo nos comprimentos de onda de
671nm e 670nm, quando foram utilizados tampão fosfato e 1-metil-2-pirrolidona,
respectivamente. Estes resultados são semelhantes os dados experimentais obtidos por Ricci
& Marchetti (2006) e Sibata, Tedesco & Marchetti (2004) para a ZnPc em etanol.
Estudos prévios demonstraram que o espectro de absorção da ZnPc e seus derivados
apresenta, tipicamente, uma banda próxima a 635nm referente à dimerização e uma banda
próxima a 675nm, referente à absorção da molécula na forma monomérica (KOSTKA et al.,
2006). Dessa forma, foi possível verificar que em ambos os meios o fotossensibilizante se
encontrava estabilizado na forma monomérica, já que suas bandas mais intensas estavam
próximas de 670nm.
A ZnPc, por apresentar absorção máxima na região do visível referente a luz
vermelha, tem baixa energia de transição eletrônica, compreendendo um sistema π-π*. Esse
tipo de transição faz com que a molécula excitada seja mais polar do que é em seu estado
fundamental. De acordo com Ogunsipe, Maree & Nyokong (2003), podem ser encontrados
desvios para direita nos espectros de absorção desde que o solvente consiga desestabilizar o
maior orbital molecular ocupado (HOMO) ou estabilizar o menor orbital molecular
desocupado (LUMO). Sendo assim, vem sendo proposto que solventes de coordenação, como
a água contendo SDS e 1-metil-2-pirrolidona, conseguem estabilizar o LUMO (LAW et al.
88
apud OGUNSIPE, MAREE & NYOKONG, 2003). Um leve desvio batocrômico foi
verificado na região do vermelho para a amostra presente em tampão fosfato, sugerindo que
esse solvente consiga estabilizar melhor o orbital.
A intensidade de absorção se apresenta menor quando o espectro é obtido em tampão
fosfato contendo 2% de SDS, possivelmente, pela presença desse tensoativo interiorizando o
fotossensibilizante em micelas, diminuindo a capacidade absortiva da molécula de ZnPc. Em
contra partida, quando presente na 1-metil-2-pirrolidona, a ZnPc se encontra em sua forma
molecular, livremente dispersa em meio orgânico, não alterando suas características de
absorção.
A grande absorção de energia por parte da ZnPc na região do vermelho é muito
interessante pois estas bandas localizam-se na chamada “faixa terapêutica” da TFD, isto é, a
região do espectro de maior utilidade no tratamento de tumores. Isso acontece pelo fato de ser
nessa região onde existe maior penetração tecidual da luz e baixa absorção por cromóforos
endógenos existentes nos tecidos biológicos (LUI et al., 2004).
Outra forma de se investigar o comportamento do fotossensibilizante em diferentes
meios consiste no estudo de suas propriedades fluorescentes. A emissão de luz por parte dos
fluoróforos é sensível ao seu micro ambiente, gerando informações sobre suas propriedades
fotofísicas, que podem ser obtidas a partir de seu espectro de emissão de fluorescência
(CUCCOVIA, QUINA & CHAIMOVICH, 1982).
A determinação do comprimento de onda no qual ocorre máxima emissão de
fluorescência da ZnPc para cada meio estudado foi importante, pois esses juntos das
intensidades de fluorescência viabilizaram uma possível observação de degradação ou
agregação (dimerização) do fotossensibilizante durante o processo de preparo das
formulações ou nos estudos in vitro de liberação, permeação e retenção (SIBATA, TEDESCO
& MARCHETTI, 2004).
89
Na figura 22 estão apresentados os espectros de emissão de fluorescência da ZnPc na
concentração de 200ng/mL em 1-metil-2-pirrolidona e em tampão fosfato pH 7.4 contendo
SDS na concentração de 2%.
Figura 22. Espectro de emissão de fluorescência da Zinco ftalocianina em 1-metil-2-pirrolidona e em
tampão fosfato pH 7.4 com 2% de SDS. Parâmetros de fluorímetro: band width de excitação 5nm;
band width de emissão 10nm; resposta média; sensitividade média; data pitch 0,5nm e velocidade de
leitura 200nm/min.
Conforme demonstrado na figura 22 existe uma grande semelhança entre os espectros
de emissão de fluorescência obtidos nos dois meios, indicando que não houve alteração na
forma monomérica da ZnPc. Em 1-metil-2-pirrolidona, o fotossensibilizante apresentou
máxima emissão de fluorescência em 671nm, enquanto que, em tampão fosfato esse máximo
foi em 674nm, possivelmente resultante do deslocamento verificado no espectro de absorção
para esse fotossensibilizante no solvente aquoso.
90
Comparando-se os espectros de ambos os meios, verificou-se que ocorreu uma queda
na intensidade de emissão de fluorescência da ZnPc quando essa estava presente em tampão
fosfato. Esse fato foi corroborado por Ricci & Marchetti (2006), estando relacionado à
hidrofobicidade característica do fotossensibilizante. Dessa forma, quando dissolvidas em 1-
metil-2-pirrolidona, as moléculas de ZnPc emitiram diretamente a fluorescência originada
pelo retorno dessas ao estado fundamental de energia após excitação. Entretanto, como o
fármaco é insolúvel em meio aquoso, a inclusão de SDS interiorizou esse em micelas,
acarretando uma queda na intensidade de fluorescência desencadeada por uma diminuição na
absorção verificada quando este fotossensibilizante se encontrava nesse meio (Figura 21).
Esse fato ocorreu, possivelmente, pelo fato da intensidade de fluorescência estar diretamente
relaciona à intensidade de absorção (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). Segundo
Ogunsipe, Maree e Nyokong (2003), a maior intensidade na emissão de fluorescência pode
estar relacionada a uma menor velocidade de degradação da ZnPc no solvente após excitação,
confirmando os estudos desses mesmos autores de que solventes orgânicos apresentam
melhor ambiente para a estabilidade desse fotossensibilizante.
5.3 Padronização da metodologia analítica para a quantificação de ZnPc por
espectrofluorimetria em meio aquoso
Conforme evidenciado no espectro de absorção apresentado no item 5.2, o
comprimento de onda de máxima absorção do cromóforo (ZnPc) em tampão fosfato pH 7.4
contendo SDS na concentração de 2% corresponde à 671nm. Entretanto, para evitar
problemas durante as medidas espectroscópicas em que a ZnPc tenha absorção em 671nm e
emissão de fluorescência em 674nm, o comprimento de onda de excitação utilizado para
obtenção do espectro de emissão de fluorescência foi de 608nm, uma banda de menor
intensidade de absorção, porém apresentando um pico significativo (RICCI & MARCHETTI,
91
2006; SIBATA, TEDESCO & MARCHETTI, 2004). Essa alteração se torna viável, pois o
comprimento de onda de excitação utilizado irá influenciar apenas na intensidade de
fluorescência e não no perfil do espectro de emissão (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002).
A figura 23 apresenta os espectros obtidos com concentrações de ZnPc definidas para
elaboração da curva analítica em tampão fosfato contendo 2% de SDS, além da curva sem a
presença desse fluoróforo.
Figura 23. Espectros de emissão de fluorescência da ZnPc em tampão fosfato pH 7.4 com 2% de SDS
nas concentração utilizadas para elaboração da curva padrão. Parâmetros de fluorímetro: band width
de excitação 10nm; band width de emissão 5nm; resposta média; sensitividade média; data pitch
0,5nm e velocidade de leitura 200nm/min.
Após análise dos espectros presentes na figura 23, foi fixado o comprimento de onda
de excitação em 608nm e registradas as intensidades de emissão de fluorescência em 674nm
para todas as amostras.
As tabelas 2 e 3 estão apresentados os dados utilizados na elaboração das curvas
analíticas da ZnPc feitas em dois dias consecutivos durante a padronização da metodologia
92
analítica. A padronização dos procedimentos analíticos tem por objetivo demonstrar que o
método de ensaio utilizado apresenta resultados que permitem avaliar objetivamente a
qualidade do analito, conforme os parâmetros especificados. Os parâmetros utilizados foram
linearidade, especificidade, exatidão e precisão.
Tabela 2. Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da ZnPc em tampão fosfato pH
7.4 contendo 2% de SDS durante a padronização da metodologia (1º Dia)
Concentração (ng/mL) Intensidade de emissão de fluorescência
1º 2º 3º Média±D.P.
k'
30 78 77 78 77±1,7320 0,3896
50 134 137 134 135±1,7243 0,3703
70 174 179 175 176±2,6457 0,3910
100 278 276 283 279±3,6055 0,3861
150 363 358 362 361±3,6457 0,4155
200 492 488 490 490±2,0530 0,4081
300 693 690 684 689±4,5825 0,4354
Desvio Padrão (DP) = 0,0217
Media= 0,3994
Desvio Padrão Relativo (DPR) = 5,43% {DPR=(Media/DP)x100}
k'= concentração/intensidade de emissão de fluorescência
Tabela 3. Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da ZnPc em tampão fosfato pH
7.4 contendo 2% de SDS durante a padronização da metodologia (2º Dia)
Concentração (ng/mL) Intensidade de emissão de fluorescência
1º 2º 3º Média±DP
k'
30 82 80 78 80±2,0783 0,3750
50 144 136 137 139±4,3588 0,3597
70 167 175 174 172±4,3123 0,4069
100 252 256 251 253±2,6457 0,3952
150 375 376 383 378±4,3471 0,3968
200 479 480 484 481±2,6157 0,4158
300 712 716 717 715±2,6317 0,4195
Desvio Padrão (DP)= 0,0217
Media= 0,3955
Desvio Padrão Relativo (DPR) = 5,5% {DPR=(Media/DP)x100}
k'= concentração/intensidade de emissão de fluorescência
93
A intensidade de emissão de fluorescência da ZnPc em tampão fosfato contendo 2%
de SDS correlacionou-se linearmente com a concentração numa faixa de 30 à 300ng/mL
(Figuras 24 e 25). Os Coeficientes de determinação (R
2
) calculados durante os dois dias de
validação do método foram de 0,995 para o 1º dia e 0,997 para o 2º dia. O valor de R
2
é uma
medida que relaciona o quanto uma variável modifica em relação à variação da outra. O R
2
é
o quadrado do coeficiente de correlação de Pearson (r) ou simplesmente r de Pearson. Esse
mede o grau de correlação entre duas variáveis. A correlação é linear e perfeita quando r se
iguala a 1, sendo assim, valores de r próximos a 1 indicam excelente correlação linear. Os
valores de r calculados durante os 2 dias de validação do método foram de 0,9975 para o 1º
dia e 0,9985 para o 2º dia, indicando excelente linearidade (SHABIR, 2003). O método de
quantificação da ZnPc em meio aquoso apresentou alta sensibilidade (ng/mL), permitindo a
determinação de pequenas quantidades do fotossensibilizante nas amostras estudadas. O
limite de quantificação foi de 30 ng/mL.
Figura 24. Curva analítica da ZnPc em tampão fosfato pH 7.4 contendo 2% de SDS obtida no 1º dia
da padronização da metodologia analítica. Os dados são referentes à média de 3 determinações.
94
Figura 25. Curva analítica da ZnPc em tampão fosfato pH 7.4 contendo 2% de SDS obtida no 2º dia
da padronização da metodologia analítica. Os dados são referentes à média de 3 determinações.
Os resultados de precisão e exatidão intra e inter-dias do método analítico para
quantificação da ZnPc em meio aquoso estão apresentados na tabela 4. A precisão e a
exatidão do método apresentaram valores satisfatórios, com variação menor do que 5% para a
precisão, como recomendado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
(BRASIL, 2003). O método de emissão de fluorescência para a quantificação de ZnPc em
meio aquoso foi considerado preciso e exato.
95
Tabela 4. Precisão e exatidão intra-dia e inter-dias do método analítico de quantificação da ZnPc em
meio aquoso.
Concentração
Teórica
(ng/ml)
Concentração
Obtida
(ng/ml)
Precisão (%) Exatidão (%)
Intra-
Dia
Dia 1
50
49,8675
50,3254
48,5458
49,5796 ± 0,9241 *
1,9 -1,0
Dia 2
51,4867
49,5032
51,9763
50,9887 ± 1,3059*
2,6 2,0
Inter-Dia
50,2842 ± 1,2741
2,5 0,6
Intra-
Dia
Dia 1
100
99,6544
100,0568
102,4679
100,7264 ± 1,5216*
1,6 0,8
Dia 2
102,8862
101,2357
102,0439
102,0553 ± 0,8253*
0,8 2,1
Inter-Dia
101,3908 ± 1,3146
1,3 1,4
* média ± Desvio padrão de n=3 determinações.
5.4 Padronização da metodologia analítica para a quantificação da ZnPc por
espectrofluorimetria em meio orgânico
A análise do espectro de absorção do fotossensibilizante em 1-metil-2-pirrolidona
evidenciado no item 5.2 mostrou que o comprimento de onda de absorção máxima ocorreu à
670nm, entretanto, o comprimento de onda de excitação utilizado para obter o espectro de
emissão de fluorescência foi de 608nm. A mudança foi efetuada para evitar que a ZnPc
96
tivesse absorção em 670nm e emissão de fluorescência em 671nm, conforme evidenciado
pelo espectro de emissão de fluorescência exposto no item 5.2.
Na figura 26 estão apresentados os espectros obtidos com concentrações de ZnPc
definidas para elaboração da curva analítica em 1-metil-2-pirrolidona, além da curva sem a
presença desse fluoróforo.
Figura 26. Espectros de emissão de fluorescência da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona nas concentração
utilizadas para elaboração da curva padrão. Parâmetros de fluorímetro: band width de excitação 10nm;
band width de emissão 5nm; resposta média; sensitividade média; data pitch 0,5nm e velocidade de
leitura 200nm/min.
Com a análise dos espectros evidenciados na figura 26, fixou-se o comprimento de
onda de excitação em 608nm e registrou-se a intensidade de emissão de fluorescência em
671nm.
Nas tabelas 5 e 6 estão apresentados os dados utilizados na elaboração das curvas
analíticas da ZnPc realizadas em dois dias consecutivos durante a padronização da
metodologia analítica em meio orgânico.
97
Tabela 5. Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona
durante a validação da metodologia (1º Dia).
Concentração
(ng/mL)
Intensidade de emissão de fluorescência
1º 2º 3º Média±DP
k'
10 33 32 37 34±2,6543 0,2941
30 105 109 104 106±2,4972 0,2830
50 160 159 170 163±6,0827 0,3067
100 315 316 320 317±2,6457 0,3154
200 651 646 653 650±3,6055 0,3077
Desvio padrão= 0,0128
Media= 0,3014
Desvio Padrão Relativo (DPR)= 4,25% [DPR=(Media/Desvio padrão)x100)]
k'= concentração/intensidade de emissão de fluorescência
Tabela 6. Parâmetros utilizados para a elaboração da curva analítica da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona
durante a validação da metodologia (2º Dia).
Concentração
(ng/mL)
Intensidade de emissão de fluorescência
1º 2º 3º Média±DP
k'
10 43 37 46 42±4,5821 0,2480
30 98 108 97 106±6,0365 0,2970
50 175 170 177 174±3,6055 0,2873
100 319 315 320 318±2,6457 0,3144
200 629 628 636 631±4,3588 0,3169
Desvio padrão= 0,02784
Media= 0,2927
Desvio Padrão Relativo( DPR)= 9,3% [DPR=(Media/Desvio padrão)x100)]
k'= concentração/intensidade de emissão de fluorescência
A intensidade de emissão de fluorescência da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona
correlacionou-se linearmente com a concentração numa faixa de 10 à 300ng/mL (Figuras 27 e
28). Os coeficientes de determinação (R
2
) calculados durante os dois dias de validação do
método foram de 0,9994 para o 1º dia e 0,9981 para o 2º dia. Os valores do coeficiente de
correlação de Pearson (r) calculados foram de 0,9997 para o 1º dia e 0,999 para o 2º dia,
indicando excelente linearidade (SHABIR, 2003). O método de quantificação da ZnPc em
meio orgânico apresentou alta sensibilidade (ng/mL), permitindo a determinação de pequenas
quantidades do fotossensibilizante nas amostras estudadas. O limite de quantificação foi de 10
ng/mL.
98
Figura 27. Curva analítica da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona obtida no 1º dia da padronização da
metodologia analítica.
Figura 28. Curva analíticas da ZnPc em 1-metil-2-pirrolidona obtida no 2º dia da padronização da
metodologia analítica.
99
Os resultados de precisão e exatidão intra e inter-dias do método analítico para
quantificação da ZnPc em meio orgânico estão apresentados na tabela 7. A precisão e a
exatidão do método apresentaram valores satisfatórios, com variação menor do que 5% para a
precisão, como recomenda a ANVISA (BRASIL, 2003). O método de emissão de
fluorescência para a quantificação de ZnPc em meio orgânico foi considerado preciso e exato.
Tabela 7. Precisão e exatidão intra-dia e inter-dias do método analítico de quantificação da ZnPc em
meio orgânico.
Concentração
Teórica
(ng/ml)
Concentração
Obtida
(ng/ml)
Precisão
(%)
Exatidão
(%)
Intra-
Dia
Dia 1
30
29,5309
30,7641
28,3285
29,5411 ± 1,2178*
4,1 -1,52
Dia 2
31,3098
29,7652
32,6592
31,2447 ± 1,4409*
4,6 4,1
Inter-Dia
30,3929 ± 1,5174
4,9 1,3
Intra-
Dia
Dia 1
100
103,9473
102,3420
102,6621
102,9838 ± 0,8496*
0,83 3,0
Dia 2
103,8862
99,9534
101,5322
101,7906 ± 1,9709*
2,0 1,8
Inter-Dia
102,3872 ± 1,5108
1,5 2,4
* média ± Desvio padrão de n=3 determinações.
100
5.5 Preparo das formulações
Quatro formulações foram preparadas dispersando 2ml da solução de ZnPc (1mg/mL
de fotossensibilizante em 1-metil-2-pirrolidona), em diferentes concentrações de AO, 5, 10,
20 e 30%, sendo o volume completado para 10mL com propilenoglicol, resultando em
formulações contendo 200µg/mL de ZnPc. A quinta formulação foi preparada sem AO, com a
dispersão direta de 2mL da referida solução em propilenoglicol, sendo o volume completado
para 10mL com esse último.
Uma análise microscópica das microestruturas das cinco formulações foi realizada
empregando a microscopia óptica de campo claro e de luz polarizada. Essa metodologia tem
sido utilizada como método preliminar de observação da microestrutura da formulação ou
sistema de liberação proposto (TAO et al., 2009; BADENS et al., 2009; MARQUELE-
OLIVEIRA et al., 2007).
O microscópio de luz pode ser utilizado como microscópio de polarização desde que
seja acrescido de dois prismas ou dois discos polaróides, que permitem estudar certos
aspectos da organização molecular dos constituintes. O feixe de luz ao atravessar a lâmina
pode evidenciar estruturas cristalinas mesomórficas que exibem propriedades ópticas típicas
desse estado, que são a anisotropia (direção óptica), a birrefringência (MORAIS, 2006) e o
dicromismo (FERRARI, SILVEIRA & BETRAMI-JUNIOR, 2004).
Embora a resolução do microscópio óptico seja em torno de 1µm, este método foi útil
para se observar a possível presença de partículas grandes de cristais, bem como a dispersão
das mesmas.
Dessa forma, as imagens obtidas para cada formulação em microscopia de campo
claro e de luz polarizada estão representadas na figura 29.
101
Figura 29. Microscopia de campo claro (lado esquerdo) e de luz polarizada (lado direito) para cada
formulação proposta (400x).
Foi possível evidenciar que existe uma similaridade na morfologia das formulações
propostas tanto na microscopia de campo claro quanto na microscopia de luz polarizada.
Nessa última, a ausência de formas capazes de desviar o plano de luz incidente, indicou a
102
ausência de cristais líquidos anisotrópicos lamelares ou hexagonais nas formulações
desenvolvidas, esses resultados foram corroborados por Formariz et al. (2005).
Da mesma forma, a microscopia óptica de campo claro realizada para todas as
formulações não evidenciou a presença de qualquer cristal do fármaco em suspensão. Esse
fato ratificou ainda mais a existência da forma farmacêutica solução, pois segundo Prista et al.
(2008), para que se consiga uma suspensão de determinada substância, o tamanho de partícula
dessa deve ser superior a 0,1µm.
Os resultados acima sugerem que as formulações desenvolvidas atuaram como um
bom solvente para a ZnPc. Sendo assim, foram preparadas soluções, uma forma galênica que
desempenha condições ideais para a penetração de fármacos no organismo, sendo por esse
motivo, tão empregada para a administração de fármacos (PRISTA
et al., 2006).
5.6 Avaliação da estabilidade das formulações
A instabilidade de formulações contendo ZnPc pode ser evidenciada por uma
agregação, que é usualmente descrita como uma associação coplanar dos anéis evoluindo de
monômeros para dímeros, e assim sucessivamente. Isso irá depender da concentração,
natureza do solvente, substituintes periféricos, íons metálicos complexados e temperatura
(DOMINQUEZ, SNOW, SHIRK, et al. apud DURMUS, BIYIKLIOGLU & KANTEKIN,
2009; SIMON & BASSOUL, 1993). No estado agregado, a estrutura eletrônica do anel
complexado da ftalocianina é perturbada resultando em uma alteração dessa estrutura tanto
estado fundamental como no estado excitado, alterando seus padrões de absorção e emissão
de fluorescência (NALWA & SHIRK apud DURMUS, BIYIKLIOGLU & KANTEKIN,
2009).
As propriedades fotofísicas das formulações desenvolvidas foram avaliadas 24hs após
a preparação. Os espectros de absorção da ZnPc na concentração de 10µg/ml, obtidas de
103
diluições das formulações propostas e de uma solução em 1-metil-2-pirrolidona, estão
evidenciados na figura 30.
Figura 30. Espectros de absorção da ZnPc (10µg/mL) obtidos de diluições preparadas a partir das
formulações propostas e de uma solução de 1-metil-2-pirrolidona. Parâmetros de espectrofotômetro:
band width de excitação 1,5nm; resposta média; data pitch 0,5nm e velocidade de leitura 200nm/min
.
Avaliando a figura 30, foi verificado que todos os espectros apresentam o mesmo
perfil, ou seja, todas as formulações propostas e a diluição em 1-metil-2-pirrolidona
apresentaram espectros de absorção onde o pico máximo foi encontrado na região de 670nm.
Dessa forma, partindo do princípio de que a 1-metil-2-pirrolidona se caracteriza por ser um
ambiente favorável à estabilidade da ZnPc (OGUNSIPE, MAREE & NYOKONG, 2003),
todas as formulações propostas mantiveram suas estabilidades, fato esse evidenciado pela
semelhança de suas propriedades de absorção com a da ZnPc nesse solvente. Essa semelhança
foi encontrada principalmente na faixa de comprimento de onda da luz vermelha, que se
caracteriza por ser a “faixa terapêutica” da TFD. Nessa região não são encontrados
104
deslocamentos batocromicos ou hipsocromicos nos espectros. Isso garante uma boa
capacidade de excitação desse fotossensibilizante, em presença de uma fonte luminosa
emitindo nessa faixa de comprimento de onda, quando veiculado nesse tipo de formulação.
A intensidade de absorção decaiu com a diminuição da quantidade de AO na
formulação, o que pode estar relacionado ao fato da ZnPc se apresentar mais estável em
ambientes hidrofóbicos ou orgânicos. Dessa forma, dentre as formulações propostas, as que
mais se aproximam do valor de absorbância de 3,2582 obtido pela solução de 1-metil-2-
pirrolidona são a D (30% de AO) e a C (20% de AO), com valores de absorbância de 3,1387 e
3,1163, respectivamente. As formulações A (5% de AO) e B (10% de AO) também se
aproximaram do máximo com valores na casa de 2,99, enquanto a formulação E (sem AO)
apresentou o menor valor (2,4544). Dessa forma, espera-se que a melhor resposta terapêutica
será conseguida com uma das formulações contendo AO como promotor.
A estabilidade física da formulação foi acompanhada por sete dias, sendo suas
imagens macroscópicas apresentadas na figura 31.
105
Figura 31. Imagens macroscópicas das formulações d
urante os dias de avaliação.
Todas as formulações preparadas com AO mantiveram sua estabilidade nas primeiras
24hs quando conservadas ao abrigo da luz e sob refrigeração, apresentando características
organolépticas adequadas. Estas se apresentavam límpidas, com coloração azul intenso, odor
característico. A exceção ficou por conta da formulação sem AO (E), que após 24h passou a
apresentar resíduos de sedimento provavelmente resultante de dimerização e salting out. Isso
acontece, possivelmente, pelo fato da presença do AO tornar o meio mais hidrofóbico e
conseqüentemente mais atrativo para a molécula hidrofóbica de ZnPc, ou seja, de baixa
atividade termodinâmica. Já com a sua ausência, a força de interação entre as moléculas de
propilenoglicol e 1-metil-2-pirrolidona pode ser maior que a força de interação dessa última
com a molécula de ZnPc, resultando em um deslocamento de solubilidade e precipitando o
fotossensibilizante.
106
Após cinco dias de estocagem, as formulações contendo 10, 20 e 30% de AO
apresentaram estabilidade satisfatória. Nesse ponto a formulação A, contendo apenas 5% de
AO, começou a apresentar o mesmo problema de salting out encontrado na formulação E, o
que pode estar relacionado à baixa concentração de AO no meio. No sétimo dia de avaliação,
as formulações com concentrações de 10, 20 e 30% de AO continuaram mantendo sua
estabilidade física, enquanto as formulações A e E se apresentavam com uma coloração
esverdeada, diferente do azul presente no dia do preparo. Essa alteração da cor pode estar
relacionada com o fenômeno de salting out da ZnPc nessas formulações, que apresentavam a
tonalidade azulada no primeiro dia justamente pela presença do fármaco em solução.
Os resultados obtidos sugerem que as formulações contendo 10, 20 e 30% de AO são
as de maior estabilidade, visto que permanecem por sete dias sem alterações organolépticas.
Dessa forma, o preparo extemporâneo dessas formulações seria uma saída viável e
interessante do ponto de vista farmacotécnico e terapêutico. Além da estabilidade física da
formulação, uma preparação extemporânea também significaria um maior aproveitamento do
efeito terapêutico da ZnPc, já que essa, por ser uma molécula degradável pela luz e
temperatura, necessitaria de cuidados especiais para que não perdesse sua atividade. Esse fato
é de elevada significância quando se fala da forma farmacêutica solução, pois nessa as
substâncias se encontram na forma molecular e consequentemente estão mais expostas a
fatores de degradação por apresentarem maior superfície de contato (PRISTA et al., 2006).
5.7 Análise de interferentes
Na figura 32 estão apresentados os espectros de emissão de fluorescência obtidos com
a análise de interferentes.
107
Figura 32. Espectro de emissão de fluorescência da ZnPc (200 ng/mL) e da pele em 1-metil-2-
pirrolidona e em tampão fosfato pH 7.4 contendo 2% de SDS. Parâmetros de fluorímetro: band width
de excitação 10nm; band width de emissão 5nm; resposta média; sensitividade média; data pitch
0,5nm e velocidade de leitura 200nm/min.
Nenhuma banda de emissão de fluorescência foi observada nas amostras de pele em 1-
metil-2-pirrolidona ou em tampão fosfato contendo 2% de SDS utilizando-se como
comprimento de onda de excitação 608nm e faixa de emissão de fluorescência de 630 a
750nm. Os componentes da pele não interferiram na determinação da ZnPc em meio aquoso
ou orgânico. Esses resultados indicam que o método de determinação da ZnPc em meios
aquoso e orgânico é seletivo.
Os resultados obtidos foram corroborados por aqueles apresentados por Carrer,
Vermehren & Bagatolli (2008) e por Laiho et al. (2005) onde a autofluorescência da pele de
porco é representa pelo espectro em uma faixa de comprimento de onda de 400 a 600nm. De
acordo com Pena et al. (2005) o sinal presente entre 450 e 550nm pode estar relacionado à
presença de queratina. Da mesma forma, a presença de flavinas pode intensificar a
108
fluorescência em 530nm, enquanto componentes derivados de contaminação da superfície
cutânea por parte do sebo e outras substâncias podem influenciar o espectro de emissão de
fluorescência da pele de porco (CARRER, VERMEHREN & BAGATOLLI, 2008).
Entretanto, como a ZnPc apresenta um espectro de emissão de fluorescência na faixa de 650 a
730nm, aproximadamente, nenhum desses componentes citados anteriormente seria capaz de
diminuir a seletividade do método utilizado.
5.8 Estudos de liberação in vitro em membrana sintética
Na figura 33 estão apresentados o perfil de liberação in vitro da ZnPc nas formulações
propostas.
Figura 33. Perfil de liberação in vitro da ZnPc a partir das formulações desenvolvidas. Media ±
Desvio padrão de n=3 determinações.
Todas as formulações propostas apresentaram um perfil de liberação modelizado.
Analisando o gráfico verifica-se que a diminuição da lipofilicidade da formulação ocorrida
pela redução do teor de AO aumenta a quantidade de ZnPc liberada. Esse fato pode estar
109
relacionado à termodinâmica do sistema, onde substâncias lipossolúveis, como a ZnPc,
tendem a escapar de meios termodinamicamente ativos para ela, isto é, meios com baixa
característica hidrofóbica. Por outro lado, quando se tem 20 ou 30% de AO, a atividade
termodinâmica desse meio para o fármaco em questão foi reduzida, já que este proporcionou
uma maior interação com a molécula de ZnPc e dessa forma dificultou sua liberação.
Os dados do perfil de liberação in vitro foram tratados utilizando modelos
matemáticos para estudo da cinética de liberação. Os modelos matemáticos de Ordem zero e
Higuchi (1962) foram testados. No modelo matemático de Ordem zero a quantidade de
fotossensibilizante acumulada no meio receptor do estudo de liberação (µg/cm
2
) foi
relacionada com o tempo (h) no período de 3 a 12hs, conforme evidenciado na figura 34.
Figura 34. Regressão linear obtida após aplicação do modelo matemático de ordem zero nos dados do
perfil de liberação in vitro. Os dados representam a Média
+
Desvio padrão de 3 determinações.
No modelo proposto por Higuchi (1962) a quantidade acumulada de
fotossensibilizante (µg/cm
2
) foi relacionada com a raiz quadrada do tempo (h
1/2
) no mesmo
período de tempo do modelo de Ordem zero, conforme evidenciado na figura 35.
110
Figura 35. Regressão linear obtida após aplicação do modelo matemático de Higuchi nos dados do
perfil de liberação in vitro. Os dados representam a Média
+
Desvio padrão de 3 determinações.
Para ambos os modelos foi determinada a equação da reta e o coeficiente de correlação
de Pearson (r), que expressa o grau de correlação entre as duas variáveis. A comparação entre
os coeficientes obtidos para cada modelo pode indicar qual deles se ajusta melhor a cinética
de liberação do fotossensibilizante.
A tabela 8 apresenta os coeficientes de correlação de Pearson (r) calculados. A
comparação entre os coeficientes mostra que o modelo matemático de Ordem zero ajusta-se
melhor a cinética de liberação in vitro do fotossensibilizante a partir das formulações
desenvolvidas, já que todos os seus valores estimados foram superiores a 0,9950.
Tabela 8. Coeficiente de correlação de Pearson (r) obtido após regressão linear dos dados de liberação
in vitro ajustados de acordo com modelos matemáticos de ordem zero e Higuchi (1962).
Modelos
matemáticos
Coeficiente 0% AO 5% AO 10% AO 20% AO 30% AO
Ordem zero
r 0,9996 0,9985 0,9992 0,9955 0,9950
Higuchi
r 0,9928 0,9867 0,9891 0,9816 0,9792
111
No modelo cinético de Ordem zero a membrana não interferiu na liberação e no fluxo
do fármaco. Provavelmente, a hidrofobicidade do permeante e o grau de lipofilia da
formulação são os dois fatores que podem ter interferido na liberação e no fluxo do
fotossensibilizante. A ZnPc por ser hidrofóbica apresentou uma liberação lenta e sustentada
para o meio receptor aquoso do estudo de liberação in vitro. O aumento da lipofilicidade da
formulação causada pela elevação da concentração de AO diminuiu o fluxo do
fotossensibilizante pela membrana.
A partir da cinética de Ordem Zero, foram encontrados o fluxo de equilíbrio (J
ss
)
(µg.cm
-2
.h
-1
) do fotossensibilizante liberado das formulações e o Lag-time (t
Lag
) (h),
representados na tabela 9. O fluxo (J
ss
) foi estimado a partir da constante “a” da equação da
reta (y = ax + b), ou inclinação. O Lag-time (t
Lag
) foi calculado pela intersecção da reta no
eixo das abscissas (eixo x), isto é, onde a variável “y” da equação se iguala a zero.
Tabela 9. Fluxo de equilíbrio (J
ss
) da ZnPc da formulação controle e das formulações contendo
diferentes concentrações de AO e correspondentes Lag time (t
Lag
).
Formulação J
ss
(µg.cm
-
2
.h
-
1
) t
L
ag
(h)
Propilenoglicol
1,1314 ± 0,02508 2,41
Propilenoglicol contendo 5% AO
1,0335 ± 0,02107 2,65
Propilenoglicol contendo 10% AO
0,7690 ± 0,01974 2,77
Propilenoglicol contendo 20% AO
0,5650 ± 0,02789 3,24
Propilenoglicol contendo 30% AO
0,2319 ± 0,02742 3,14
Os dados representam a Média ± Desvio padrão de 3 determinações.
A liberação do fotossensibilizante a partir da formulação E, sem a presença de AO, foi
rápida com fluxo de 1,1314±0,02508 µg.cm
-2
.h
-1
. A adição de 5% de AO alterou
significativamente a liberação (p = 0,0066, ou seja, p < 0,05) resultando em um fluxo inferior
ao da formulação E (Tabela 9). Em seqüência, a liberação do fotossensibilizante diminuiu
significativamente (p < 0,05) para todas as formulações estudadas quando estas eram
comparadas com as outras formulações contendo menor quantidade de AO. Enquanto a
112
formulação B, contendo 10% do promotor, apresentou um fluxo de 0,7679±0,01974 µg.cm
-
2
.h
-1
, as formulações com 20 e 30% de AO apresentaram liberação muito lenta (Tabela 9).
Resultados similares foram obtidos para os estudos de liberação in vitro em membrana
sintética para o tenoxicam (LARRUCEA et al., 2001) e doxorrubicina (HERAI et al., 2007).
Larrucea et al. (2001) estudaram o perfil liberação in vitro do tenoxicam a partir de
géis de Carbopol
®
contendo diferentes concentrações de ácido oléico (AO) (0 até 15%) e
propilenoglicol (0 a 40%). O AO foi utilizado como promotor de penetração cutânea para o
tenoxicam. Os géis com 3, 5 e 10% de AO e sem propilenoglicol não alteraram o fluxo do
tenoxicam em comparação com a formulação controle (gel com 20% propilenoglicol).
Entretanto, a formulação com 15% de AO e sem propilenoglicol diminuiu significativamente
o fluxo do tenoxicam. A diminuição do fluxo foi causada pelo aumento da lipofilicidade da
formulação.
Herai et al. (2007) estudaram o perfil de liberação in vitro da doxorrubicina a partir de
formulações a base de propilenoglicol contendo diferentes concentrações de monoleína (0 a
20%). A monoleína é um ácido graxo estruturalmente semelhante ao ácido oléico e foi
utilizada como promotor de permeação cutânea. As formulações com 5% de monoleína não
alteraram significativamente o fluxo do fármaco em relação à formulação controle contendo
apenas propilenoglicol. Entretanto, as formulações contendo altas concentrações do promotor
reduziram significativamente o fluxo da doxorrubicina. Os autores atribuem a diminuição do
fluxo do fármaco ao aumento da lipofilia da formulação (HERAI et al., 2007).
A diminuição na liberação de ativos lipossolúveis se deve ao aumento da lipofilicidade
da formulação causada pelo aumento da concentração do ácido graxo (HERAI et al., 2007;
LARRUCEA et al., 2001). Assim, para fármacos lipofílicos, como a ZnPc, o aumento da
lipofilicidade causada pela presença do AO na formulação criou um ambiente mais favorável
para o fotossensibilizante alterando sua atividade termodinâmica. O aumento da concentração
113
do AO na formulação com o intuito de aumentar a permeação cutânea do ativo deve ser
avaliada cuidadosamente para evitar a diminuição da liberação desse último.
Na tabela 9 também estão apresentados os dados do Lag-time (t
Lag
) do estudo de
liberação in vitro das formulações desenvolvidas. Esse está relacionado ao tempo necessário
para obtenção do estado estacionário onde há fluxo constante do permeante pela membrana. A
formulação sem AO apresentou uma liberação rápida com baixo valor de t
Lag
. O aumento da
concentração desse ácido graxo tornou a formulação gradativamente mais lipofílica ocorrendo
diminuição do fluxo do fotossensibilizante e, conseqüentemente, aumentando o t
Lag
. As
formulações contendo 20 e 30% de AO apresentaram liberação muito lenta e atingiram o
estado estacionário (SS) em aproximadamente 3hs após o início do estudo de liberação in
vitro.
5.9 Estudos de permeação in vitro em pele suína
A detecção da ZnPc no meio receptor do estudo de permeação in vitro só foi possível
após 24hs de ensaio, com os resultados apresentados na figura 36.
114
Figura 36. Quantidade acumulativa de ZnPc no meio receptor dos estudos de permeação in vitro
utilizando pele suína após 24 hs. Dados referentes à Média ± Desvio padrão de 3 determinações.
A concentração de ZnPc no meio receptor do estudo de permeação permaneceu abaixo
de 100ng/mL. Para as formulações contendo 0, 5 e 10% de AO os resultados obtidos
apresentaram uma diferença estatisticamente significante entre si (p = 0,0042). A
concentração do fármaco no meio receptor derivada da formulação C (contendo 20% de AO)
foi próxima do limite de quantificação da curva analítica (30ng/mL), enquanto que para
formulação D (contendo 30% de AO), não foi detectada leitura de emissão de fluorescência
no meio receptor.
As formulações desenvolvidas foram adequadas porque proporcionaram baixa
permeação cutânea do fotossensibilizante. Dessa forma, os resultados se apresentam de forma
satisfatória, visto que o presente trabalho visou o desenvolvimento de uma formulação para
administração tópica da ZnPc, no qual esse fotossensibilizante deve permanecer nas camadas
115
superficiais da pele. A permeação desse para a corrente sanguínea é indesejável, pois poderia
resultar na sua biodistribuição com conseqüente fotossensibilização sistêmica.
5.10 Estudos de penetração e retenção cutânea
A quantidade de ZnPc encontrada no EC e na pele suína remanescente provenientes
dos estudos de penetração e retenção cutânea, estão representados na figura 37 e na tabela 10.
Os resultados foram obtidos para cada uma das formulações propostas após 4hs de
permeação.
Figura 37. Quantidade de ZnPc (ng/cm
2
) extraída do estrato córneo (EC) e epiderme sem EC mais
derme após a aplicação das formulações contendo ZnPc (200µg/mL) em propilenoglicol contendo
diferentes concentrações de AO (5, 10, 20 e 30%) e ZnPc (200µg/mL) em propilenoglicol sem AO.
Dados referentes à Média ± Desvio padrão de 3 determinações.
116
Tabela 10. Quantidade de ZnPc (ng/cm
2
) extraída do EC e epiderme remanescente + Derme após os
estudos de penetração e retenção cutânea. Dados referentes média
+
Desvio padrão de 3 determinações.
Quantidade retida de ZnPc (ng/cm
2
)
% AO na
formulação
0% 5% 10% 20% 30%
Estrato córneo
(EC)
1851,3
+
130 3710,3
+
250 5563,2
+
220 1371,4
+
90
1121,4
+
130
Epiderme
remanescente +
Derme
899,4
+
180
1757,1
+
102
2569,6
+
160
821,2
+
210
573,2
+
93
Os dados da tabela 10 mostraram que a formulação contendo 5% de AO dobrou a
quantidade de fotossensibilizante retida no EC e na pele remanescente (Epiderme
remanescente + Derme) quando comparada à formulação sem o AO com diferença
estatisticamente significativa (p < 0,05). As quantidades do fotossensibilizante retidas no EC e
na pele remanescente a partir da formulação contendo 10% de AO foram 3 e 2,8 vezes maior
do que a formulação controle (p < 0,05), respectivamente. Entretanto, as quantidades do
fotossensibilizante retidas no EC e pele remanescente a partir da formulação contendo 20 e
30% de AO foram menores do que a formulação controle.
A adição de AO na formulação modificou a penetração e retenção do
fotossensibilizante na pele. As formulações contendo 5 e 10% de AO proporcionaram maior
penetração e retenção do fotossensibilizante na pele do que a formulação sem o promotor. De
acordo com a literatura o AO pode alterar a estrutura de bicamadas de fosfolipídeos do EC
(WILLIAMS E BARRY, 2004; NAIK et al., 1995) devido a sua cadeia insaturada alquílica de
dezoito carbonos (C
18
). A longa cadeia alquílica com configuração cis é capaz de interagir e
desorganizar a camada estruturada e compacta de lipídeos do EC (WILLIAMS E BARRY,
2004) reduzindo a função de barreira e aumentando a penetração cutânea de fármacos
hidrofóbicos. O ácido oléico foi capaz de aumentar a penetração e retenção do
117
fotossensibilizante na pele sem promover aumento da absorção do ativo, como observado nos
estudos de permeação (Figura 36).
Resultados similares foram obtidos por Herai et al. (2007) nos estudos de permeação
in vitro da doxorrubicina utilizando a monoleína como promotor de permeação cutânea. A
monoleína aumentou a penetração e retenção da doxorrubicina no EC promovendo mínima
permeação do fármaco para o meio receptor do estudo de permeação in vitro (HERAI et al.,
2007). O AO pode melhorar a penetração do fotossensibilizante para o EC e epiderme mais
derme como pode ser evidenciado na figura 37, entretanto, a difusão do fármaco pelas
camadas mais profundas da pele, principalmente na derme, depende de outros fatores como:
solubilidade, coeficiente de partição e difusão, além do peso molecular. A ZnPc é um
fotossensibilizante hidrofóbico capaz de interagir com os lipídeos do interior do EC
dificultando a sua permeação cutânea. Ela é uma molécula de tamanho médio (PM=577,91)
com problemas de solubilidade em água o que pode dificultar sua permeação cutânea.
Entretanto, é fato que o AO aumentou a retenção do fotossensibilizante na pele, incluindo EC
e pele remanescente (epiderme remanescente e derme), porém não promoveu aumento da
concentração do ativo na solução receptora do estudo de permeação in vitro.
As formulações A e B (contendo 5 e 10% de AO, respectivamente) proporcionaram
maior penetração e retenção cutânea do fotossensibilizante do que as formulações C e D
(contendo 20 e 30%, respectivamente) do promotor. Possivelmente, esse fato pode estar
relacionado às características mais hidrofóbicas das formulações C e D, por essas
apresentarem maior teor de AO, o que torna o ambiente mais favorável ao fotossensibilizante,
diminuindo assim, sua difusão pela formulação e sua partição para a pele.
118
5.11 Avaliação microscópica da retirada de camadas do EC por fitas adesivas
As imagens da microscopia óptica de campo claro dos fragmentos de pele suína
submetidos à metodologia de “tape-stripping” estão representadas na figura 38.
Figura 38. Microscopia óptica de campo claro dos fragmentos de pele suína submetidos à técnica de
“tape-stripping”. (A) 100x; (B) e (C) 200x; (D) e (E) 400x.
119
O quadro A dessa figura apresenta uma ampliação de 100x da imagem tecidual
referente ao local de divisa (linha preta pontilhada) entre as áreas com e sem EC (removido).
Pode ser observado que o campo presente no lado esquerdo não apresenta os filamentos
compostos de lipídios e corneócitos, que são típicos do EC (ELIAS et al., 1983). Com a
ampliação dos campos (Figura 38, quadros B e D), observou-se a presença de núcleos
celulares corados presentes na camada mais externa. Esse tipo de pigmentação é característico
de células constituintes da epiderme, sendo assim, as imagens sugerem uma remoção
satisfatória do EC com a aplicação sucessiva de 11 fitas adesivas, após um estudo de
permeação de 4hs. Esse resultado pode ser ainda mais evidenciado pela comparação com os
quadros C (200x) e E (400x) da figura 38, que apresentam a camada córnea íntegra. Com a
observação dessas imagens pode ser percebido que é removida a maior parte do EC, cuja
espessura, na pele suína, situa-se entre 21 e 26µm (JACOBI et al., 2007; DICK & SCOTT,
1992). Esse fato confirma os resultados obtidos nos estudos de retenção do presente trabalho,
onde foi verificado que a maior parte da ZnPc que penetra na pele fica retida no EC.
5.12 Avaliação da distribuição da ZnPc nas camadas da pele por microscopia de
varredura a laser confocal (MVLC)
O microscópio confocal de fluorescência por varredura a laser utiliza a fluorescência
emitida por moléculas/substâncias para a aquisição de imagens. Nesse tipo de microscopia,
usualmente compostos químicos, chamados fluoróforos, são utilizados para produzir a
fluorescência do material a ser analisado. Nesse sistema, utiliza-se uma fonte de laser para
promover a excitação dos fluoróforos. Alguns materiais, ao serem excitados por esse laser,
também são capazes de emitir fluorescência, sendo assim, factível a sua utilização em estudos
pela MVLC, como no caso dos estudos de material com fluorescência fraca resultante da ação
de um fotossensibilizante em um determinado tecido.
120
De acordo com Peng, Moan & Nesland (1996), a maior vantagem dessa técnica é que
um feixe de laser expandido pode gerar luz altamente colimada que por sua vez pode ser
focada em pontos extremamente reduzidos, fornecendo alta resolução. Além disso, partindo
do princípio que este sistema apresenta separadamente as atividades óptica e confocal, é
possível avaliar a localização da fluorescência celular ou tecidual proveniente do
fotossensibilizante por um nível tridimensional com muita precisão.
Dessa forma, cortes histológicos congelados de pele suína, obtidos em criostato, foram
analisados pela MVLC. As imagens histológicas obtidas estão apresentadas na figura 39.
Figura 39. Fotomicrografia obtida por microscopia confocal de secções com espessura de 7µm
derivadas de fragmentos de pele suína tratada com a formulação B (10% de AO e 200µg/mL de ZnPc)
(400x). (A) campo claro contrastando com tecido cutâneo. (B) campo escuro evidenciando a
fluorescência do composto. Linha tracejada – limite aproximado entre a derme e a epiderme.
As imagens acima foram provenientes do tratamento com a formulação B proposta
contendo 10% de AO, 200µg/mL de ZnPc e propilenoglicol como veículo. Essa formulação
esteve em contato com o tecido por 4 horas, conforme estabelecido no item 4.4.9.2.4. A
análise das imagens revelou regiões de coloração vermelha intensa correspondentes a emissão
de fluorescência da ZnPc. Por meio dessa coloração foi possível verificar que a maior parte do
fotossensibilizante ficou retida na camada córnea e lúcida da pele. Não foi visualizada a
fluorescência da ZnPc nas outras camadas da epiderme, isto é, nas camadas granulosa,
121
espinhosa e germinativa, e nem na derme. A análise ao MVCL corroborou os resultados
provenientes dos estudos de penetração e/ou permeação cutânea, além dos estudos de retenção
cutânea. Esses resultados evidenciaram que ZnPc administrada topicamente com a formulação
B (10% de AO) proposta consegue penetrar à pele; porém, não atravessa totalmente essa,
ficando retida em sua maior parte na camada córnea.
Esse fato se apresenta interessante pelo motivo de que a formulação proposta tinha
como objetivo o tratamento tópico do câncer de pele. Isso porque os cânceres do tipo não
melanoma (CCB, CCS e BC) são menos graves por serem superficiais e menos invasivos
(BAGNATO et al., 2005; DAUDA & SHEHU, 2005; RODRIGUEZ, NONAKA & KUHN,
2005).
A fluorescência obtida em regiões próximas ao EC pode gerar dúvidas quanto a
possibilidade de substâncias constituintes desse tecido auto-fluorescerem na mesma faixa de
comprimento de onda da ZnPc. Os estudos de Carrer, Vermehren & Bagatolli (2008), Laiho et
al. (2005) e Pena et al. (2005) confirmaram que esses constituintes da pele suína apresentam
um espectro de emissão de fluorescência na faixa de comprimento de onda de 400 a 600nm.
Esse fato foi comprovado, no presente trabalho, pelo espectro de emissão de fluorescência
obtido da solução extratora da pele suína, no qual não foi evidenciada a fluorescência por
parte de constituintes cutâneos (Figura 32).
Da mesma forma, as imagens apresentadas na figura 40 evidenciaram que a
fluorescência na região da epiderme foi proveniente da ZnPc. A sua intensidade de
fluorescência apresenta um pico máximo próximo à região de 671nm, seguindo o padrão do
espectro de emissão de fluorescência obtido a partir de uma solução desse fotossensibilizante,
conforme apresentado nas figuras 23 e 26. Assim, à medida que a varredura da MVLC se
afasta de 652nm e se aproxima de 673nm a intensidade de fluorescência aumenta, iniciando
uma decadência ao passar de 684nm.
122
Figura 40. Imagens da pele suína por MVLC em determinados comprimentos de onda.
5.13 Estudos de fototoxicidade e toxicidade cutânea in vivo em modelo animal
Baseado nos resultados dos estudos anteriores, a formulação B, que apresentava 10%
de AO, foi eleita para a realização dos estudos in vivo. Isso se deveu a sua estabilidade
adequada na forma de solução pelo prazo mínimo de uma semana quando comparada às
formulações A e E, a melhor velocidade de liberação do fármaco quando comparada às
formulações C e D e principalmente por ao melhor perfil de penetração e retenção do fármaco
na pele. Dessa forma, a formulação recém preparada foi aplicada em áreas delimitadas de
4cm
2
do dorso de camundongos sem pêlos utilizados nos experimentos. O dorso de cada
animal foi dividido em três áreas, sendo uma área definida como controle negativo, isto é,
123
sem formulação e sem exposição ao laser; outra área para aplicação da formulação sem a
presença de irradiação; e uma terceira área para a aplicação da formulação com posterior
irradiação.
Após 48hs de repouso os camundongos foram avaliados macroscopicamente para a
verificação de possíveis lesões externas. Na figura 41 estão apresentadas as áreas observadas
macroscopicamente de um dos animais utilizados no estudo.
Figura 41. Camundongos fotografados 48hs após a aplicação da formulação e a irradiação. (A)
Região de controle negativo. (B) Região de aplicação da formulação sem irradiação. (C) Região de
aplicação da formulação com irradiação.
124
Comparando-se as imagens macroscópicas das áreas utilizadas no experimento, foi
possível verificar a presença de descamação cutânea na porção direita do dorso dos
camundongos, sugestiva da atividade fotossensibilizante da ZnPc. Essa área correspondeu à
região utilizada para a aplicação da formulação com posterior iluminação por laser.
Possivelmente a lesão tecidual evidenciada não foi tão extensa pelo fato de se tratar de uma
pele íntegra e sadia, pois se houvesse uma lesão neoplásica prévia, a função de barreira da
pele estaria danificada, o que poderia resultar em um maior acúmulo de fotossensibilizante na
região, e conseqüentemente em uma exacerbação de uma lesão preexistente.
Após observação macroscópica, os animais foram sacrificados e suas peles retiradas
para análise microscópica conforme descrito no item 4.4.11. A microscopia de luz permite
uma avaliação tecidual detalhada e vem sendo muito empregada para verificação dos
resultados de pesquisas envolvendo TFD (HYE-MI et al., 2009; LONGO et al., 2009;
DOGNITZ et al., 2008).
Na figura 42 está apresentado o corte histológico, corado em hematoxilina de Harris e
eosina, para a área utilizada como controle negativo do experimento in vivo.
Figura 42. Microscopia de luz de campo claro da pele de ratos sem aplicação da formulação e sem
irradiação luminosa. E = epiderme; D = derme; F = folículos pilosos pouco desenvolvidos; Gs =
glândulas sebáceas associadas ao folículo piloso (coloração: hematoxilina-eosina) (A) 200x. (B) 400x.
125
As imagens histológicas obtidas das áreas sem contato com a formulação e sem
irradiação evidenciaram que a pele é formada por uma fina epiderme, sendo a camada córnea
(apontada pela seta preta) a mais externa e bem aderida ao restante da epiderme. A derme,
localizada abaixo da epiderme, é constituída por um tecido conjuntivo rico em fibras
colagenosas com orientação irregular. Nos cortes histológicos, podem ser ainda visualizadas
glândulas sebáceas associadas a folículos pilosos. Apesar de se tratar de camundongos da
espécie hairless, foi possível identificar folículos pilosos pouco desenvolvidos, indicando que
a designação sem pêlo não se refere à ausência total de folículo piloso, mas sim que os pêlos
propriamente ditos são pouco desenvolvidos.
Os resultados histológicos encontrados no controle negativo estão de acordo com
aqueles evidenciados por Kassab et al. (2000) em experimentos com camundongos Balbi/c
tratados com derivados da ZnPc. Nesse mesmo trabalho foi evidenciado que a aplicação de
luz realizada por laser não provocou qualquer alteração no tecido cutâneo.
Por outro lado, a aplicação apenas da formulação sem a presença de irradiação pode
desencadear uma alteração epitelial de baixa intensidade, conforme demonstrado na figura 43.
Figura 43. Microscopia de luz de campo claro da pele de ratos com aplicação de 200µL da
formulação e sem irradiação luminosa. E = epiderme; D = derme; F = folículos pilosos pouco
desenvolvidos; Gs = glândulas sebáceas associadas ao folículo piloso; H = hipoderme. (coloração
hematoxilina-eosina) (A) 200x. (B) 400x.
126
Nesse caso, a formulação, mesmo na ausência de uma fonte emitindo luz no
comprimento de onda referente à coloração vermelha, provocou um ligeiro espessamento da
epiderme e uma maior quantidade de material queratinizado desprendido do fragmento
(apontado pela seta preta). Esse fato pode estar associado à presença de dois promotores de
penetração cutânea na formulação, o AO e o propilenoglicol. De fato, os estudos de Naik et
al. (1995) evidenciaram que a pele tratada com AO tem seu EC muito mais facilmente
removido por meio da técnica de tape-stripping do que aquela que não passa pelo tratamento
com esse promotor. Sendo assim, pelo fato da coesão do EC estar relacionada à sua
constituição lipídica (SCHURER & ELIAS apud NAIK et al., 1995), essa facilidade no
desprendimento dessa camada da epiderme verificado na pele do camundongo pode estar
associada ao fato de que o AO modifica a rede de organização lipídica do EC por estar no
estado líquido e, conseqüentemente, por reduzir a viscosidade dessa rede lipídica.
Os resultados obtidos são satisfatórios, pois a formulação B desenvolvida atuou sobre
o EC facilitando a penetração da ZnPc e, conseqüentemente, aumentando seu poder
fototerápico. Além disso, essa formulação não deveria apresentar qualquer dano ao tecido
epitelial na ausência de luz, isto é, não deveria ser tóxica, o que realmente foi evidenciado
pelos exames histológicos.
As alterações mais significantes foram encontradas nas amostras de pele provenientes
da região onde houve tanto a aplicação da formulação B como também a irradiação com o
Photon Lase I, conforme evidenciado na figura 44.
127
Figura 44. Microscopia de campo claro da pele de ratos com aplicação de 200µL da formulação e
com irradiação luminosa. E = epiderme; D = derme; F = folículos pilosos pouco desenvolvidos; Gs =
glândulas sebáceas associadas ao folículo piloso. Notar aumento de células mononucleares () na
derme. (coloração hematoxilina-eosina) (A) e (C) 200x. (B) e (D) 400x.
O aspecto histológico verificado nessa região do dorso dos camundongos foi sugestivo
de uma consistente atividade inflamatória, com extravasamento de líquidos de vasos
sanguíneos. Esse infiltrado foi visualizado tanto nas camadas mais superficiais da derme
quanto nas camadas mais profundas. Além disso, associado com um aumento da espessura da
epiderme houve aumento da queratinização, havendo áreas onde há um desprendimento da
camada córnea (apontadas pelas setas pretas). Nesse material liberado foi possível identificar
o núcleo das células desprendidas, sugerindo que não somente a camada córnea é descolada,
mas também camadas da epiderme com perfil nuclear, como a camada granulosa e espinhosa.
Logo abaixo desse material tecidual liberado pode ser observada a formação de uma
nova camada córnea. Esse processo sugere uma possível reação tecidual em termos de
128
cicatrização, que é importante para a recuperação total da pele após a execução da TFD
cutânea.
Os resultados encontrados com a aplicação da TFD estão de acordo com aqueles
evidenciados nos estudos in vitro. Nesses a maior concentração do fármaco ficou localizada
no EC e na porção superior da epiderme viável. Dessa forma, o que foi verificado nas
imagens histológicas da pele dos camundongos foi que as áreas mais impactadas foram as
camadas mais superficiais.
A formulação B, contendo 10% de AO, se mostrou capaz de desencadear uma resposta
inflamatória com extravasamento vascular, típica da atividade fotodinâmica das ftalocianinas
(FINGAR et al., 1993). Da mesma forma, uma intensa descamação com rápida reposição
tecidual na região da epiderme é interessante para uma terapia que se baseia na indução de
uma lesão com posterior cicatrização. Assim, para o sucesso de uma terapia de combate ao
câncer de pele do tipo não-melanoma, a formulação proposta se mostra promissora, já que
essa patologia se restringe a essas camadas cutâneas (BAGNATO et al., 2005; DAUDA &
SHEHU, 2005; RODRIGUEZ, NONAKA & KUHN, 2005).
129
6 CONCLUSÕES
• Os estudos espectroscópicos de absorção e emissão de fluorescência evidenciaram que
a ZnPc se apresentou na sua forma monomérica tanto em 1-metil-2-pirrolidona, como
em tampão fosfato pH 7,4 com 2% de SDS.
• A metodologia analítica para determinação da ZnPc em meio aquoso e orgânico foi
adequada, pois o método empregado é sensível, reprodutível e rápido.
• A análise das formulações propostas por microscopia de campo claro e de luz
polarizada evidenciou a ausência de cristais líquidos anisotrópicos e sugeriram que
essas formavam uma solução, com ausência de cristais suspensos.
• Todas as formulações propostas apresentaram um espectro de absorção com um perfil
que evidenciou a estabilidade da ZnPc. Porém a intensidade de absorção do
fotossensibilizante diminuiu com a redução da concentração de ácido oléico.
• As formulações B, C e D se apresentaram estáveis durante uma semana, mantendo
suas características organolépticas. As formulações A e E apresentaram um saltint out
da ZnPc no quinto dia de estocagem e após 24h de preparo, respectivamente.
• A análise de interferentes mostrou que os componentes da pele não interferiram na
determinação do fotossensibilizante tanto em meio orgânico como em meio aquoso,
mostrando-se um método seletivo.
• Os estudos de liberação in vitro demonstraram que a cedência da ZnPc para o meio
receptor foi dependente da concentração de AO (E>A>B>C>D).
• Os estudos de penetração e permeação in vitro evidenciaram que todas as formulações
propostas não promoveram a permeação da ZnPc.
• Os estudos de penetração e retenção in vitro evidenciaram que as formulações A e B,
contendo 5 e 10% de ácido oléico, respectivamente, promoveram melhor penetração e
retenção da ZnPc na pele.
130
• A análise microscópica dos fragmentos de pele suína obtidos após serem submetidos à
técnica de tape-stripping evidenciou que a mesma foi capaz de remover grande parte
do EC.
• A análise por MVLC confirmou a presença da ZnPc nas camadas superficiais da
epiderme.
• Os estudos in vivo evidenciaram, macroscopicamente, uma escara presente na região
irradiada, sugerindo atividade fototerápica por parte da formulação B.
Microscopicamente, o efeito fototerápico foi evidenciado pela observação de uma
intensa descamação da epiderme e pela formação de cápsulas de infiltrados
inflamatórios.
• As imagens microscópicas obtidas dos estudos in vivo evidenciaram a atividade
promotora do AO sobre a epiderme em função de um aumento da espessura dessa
camada e de um afrouxamento do EC.
• Os resultados obtidos sugerem que a formulação B, contendo 200µg/mL de ZnPc,
10% de AO e propilenoglicol como veículo, apresentou potencial para ser empregada
em tratamentos tópicos de câncer de pele do tipo-não melanoma.
131
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABOOFAZELI, R.; ZIA, H.; NEEDHAM, T.E. Transdermal delivery of nicardipine: an
approach to in vitro permeation enhancement. Drug Delivery. v. 9, p. 239-247, 2002.
AGACHE, P. Histiophysiologie du stratum corneum. In:___ Physiologie de la peau et
exploitations fonctionnelles cutanées. Editions M´edicales Internationales, p. 101-106 2000.
ALBERY, W.J.; HADGRAFT, J. Percutaneous absorption: in vivo experiments. Journal of
Pharmacy and Pharmacology. v.31, p.140-147, 1979.
ALLISON, R.R.; DOWNIE, G.H.; CUENCA, R. Photosensitizers in clinical PDT.
Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. v.1, n.1, p.27-42, 2004.
ALLISON, R.R.; MANG, T.S.; WILSON, B.D. Photodynamic therapy for the treatment of
nonmelanomatous cutaneous malignancies. Seminars in Cutaneous Medicine and Surgry.
v.17, p.153-163, 1998.
AUNGST, B.J. Structure-effects studies of fatty acid isomers as skin penetration enhancers
and skin irritants. Pharmaceutical Research. v. 6, p. 244-247, 1989.
AUNGST, B.J.; ROGERS, N.J.; SHEFTER, E. Enhancement of naloxone penetration through
human skin in vitro using fatty acids, fatty alcohols, surfactants, sulfoxides and amides.
International Journal of Pharmaceutics. v. 33, p. 225-234, 1986.
BADENS, E. et al. Comparison of solid dispersions produced by supercritical antisolvent and
spray-freezing technologies. International Journal of Pharmaceutics, 2009.
BAGHERI, M.M.; SAFAI, B. Cutaneous malignancies of keratinocytic origin. Clinics in
Dermatology. v. 19, p. 244-252, 2001.
BAGNATO, V.S. et al. PDT experience in Brazil: A regional profile. Photodiagnosis and
Photodynamic Threrapy. v.2, p.107-118, 2005.
BALL, D.J. A comparative study of the celular uptake and photodynamic efficacy of three
novel zinc phthalocyanines of differing charge. Photochemistry and Photobiology. v.69,
n.3, p.390-396, 1999.
BARRY, B.W. Liberação transdérmica de fármacos. In: AULTON, M.E. Delineamento de
Formas Farmacêuticas. 5
a
ed. Porto Alegre, Artmed Editora, 2005. cap. 33, p. 504-536.
BARRY, B.W. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug
delivery. European Journal of Pharmaceutical Science. v.14, p.101-114, 2001.
BODDE, H.E. et al. Visualization of in vitro percutaneous penetration of mercuric chloride;
transport through intercellular space versus cellular uptake through desmosomes. Journal of
Controlled Release, v.15, p.227-236, 1991.
132
BOIY, A.; ROELANDTS, R.; DE WITTE, P.A.M. Influence of application and formulation
factors on the penetration of hypericin in normal mouse skin and UV induced skin tumors.
Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v. 89, p. 156-162, 2007.
BOMMANNAN, D.; POTTS, R.O.; GUY, R.H. Examination of stratum corneum barrier
function in vivo by infrared spectroscopy. Journal of Investigative Dermatology. v. 95, p.
403– 408, 1990.
BOYLE, R.W. Biological activities of phthalocyanines. Effect of hydrophobic
phthalimidomethyl groups on the in vitro phototoxicity and mechanism of photodynamic
action of sulphonated Al phthalocyanines. Radiation Science, v.5, p.813-817, 1992.
BRASIL. Estimativas 2008 : Incidência de Câncer no Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria
de Atenção à Saúde. Instituto Nacional do Câncer, Rio de Janeiro, p. 23-36, 2007.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE no 899, de 29
de maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial
[da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 jun. 2003. Seção 1, p.56-59.
BRASILEIRO FILHO, G. Distúrbios do crescimento e diferenciação celular.. In:
BRASILEIRO FILHO, G.; PITTELLA, J. E.; PEREIRA, F. E.; BAMBIRRA, E. A.;
BARBOSA, A. J. Bogliolo Patologia. 5º Ed., Guanabara Koogan S.A. Belo Holizonte; Cap.
8, p. 144-186, 1994.
BRASSEUR, N. Biological activities of phthalocyanines-III. Photoinactivation of V-79
Chinese hamster cells by tetrasulfophthalocyanines. Photochemistry and Photobiology.
v.42, p.515-521, 1985.
CAIRNDUFF, F. et al. Superficial photodynamic therapy with topical 5-aminolevulenic acid
for superficial primary and secundary skin cancer. British Journal of Cancer. v.69, p.605-
608, 1994.
CARRE, V. Chronology of the apoptotic events induced in the K562 cell line by
photodynamic treatment with hematoporphyrin and monoglucosylporphyrin. Photochemistry
and Photobiology. v.69, n.1, p.55-60, 1999.
CARRER, D.C.; VERMEHREN, C.; BAGATOLLI, L.A. Pig skin structure and transdermal
delivery of liposomes: A two photon microscopy study. Journal of Controlled Release. v.
132, p. 12–20, 2008.
CASTANO, A.P.; MROZ, P.; HAMBLIN, M.R. Photodynamic Therapy and anti-tumour
immunity. Nature Reviews Cancer. v. 6, p. 535-545, 2006.
CASTANO, A.P.; DEMIDOVA, T.; HAMBLIM, M.R. Mechanisms in photodynamic
therapy: Part three—Photosensitizer pharmacokinetics, biodistribution, tumor localization and
modes of tumor destruction. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. v. 2, p. 91-106,
2005a.
133
CASTANO, A.P.; DEMIDOVA, T.; HAMBLIM, M.R. Mechanisms in photodynamic
therapy: Part two—cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.
Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 2, p. 1-23, 2005b.
CAUSON, R. Validation of chromatographic methods in biomedical analysis, viewpoint and
discussion. Journal of Chromatography B: Biomedical Apllications. v. 686, p. 175-180,
1997.
CHEN, Q.; CHEN, H.; HETZEL, F.W. Tumor oxygenation changes post-photodynamic
therapy. Photochemistry and Photobiology. v. 63, p. 128-131, 1996.
CUCCOVIA, M.; QUINA, F.H.; CHAIMOVICH, H. A remarkable enhancement of the rate
of the Ester thiolysis by sinthetic amphiphile vesicles. Tetrahedron. v. 38, p. 917-920, 1982.
CZARNECKI, D. et al. The majority of cutaneous squamous cell carcinomas arise in actinic
keratoses. Journal of Cutaneous Medicine and Surgery. v. 6, p. 207-209, 2002.
CSÓKA, I. el at. In vitro and in vivo percutaneous absorption of topical dosage forms: case
studies. International Journal of Pharmaceutics. v. 291, p.11-19, 2005.
DARWENT, J. et al. Metal phthalocyanines and porphyrins as photosensitizers for reduction
of water to hydrogen. Coordination Chemistry Reviews. v.44, p.83-126, 1982.
DAUDA, M.M.; SHEHU, S.M. Malignant melanoma: a review. Nigerian Postgraduate
Medical Journal. v.12, n.2, p.125-130, 2005.
DAVIES, M.J. Singlet oxygen-mediated demage to proteins and its consequences.
Biochemical and Biophysical Research Communications. v. 305, p. 761-770, 2003.
DE ROSA, F.S.; BENTLEY, M.V.L.B. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers,
clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. v.17, p.1447-1455, 2000.
DERYCKE, A.S.L.; DE WITTE, V.A.M. Liposomes for photodynamic therapy. Advanced
Drug Delivery Reviews. v.56, p.17-30, 2004.
DICK, I.P.; SCOTT,R.C. Pig ear skin as an in vitro model for human skin permeability.
Journal of Pharmacy and Pharmacology. v. 44, p. 640-645, 1992.
DING, X. et al. Hematoporphyrin monomethyl ether photodynamic damage on HeLa cells by
means of reactive oxygen species production and cytosolic free calcium concentration
elevation. Cancer Letters. v. 216, p. 43-54, 2004.
DOGNITZ, N. et al. Comparison of ALA- and ALA hexyl-ester-induced PpIX depth
distribution in human skin carcinoma. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. v. 93, p. 140-148, 2008.
DOUGHERTY, T.J. et al. Photodynamic Therapy. Journal of the National Cancer
Institute. v. 90, p. 889-905, 1998.
134
DOUGHERTY, T.J.; POTTER, W.R. Of what value is a highly absorbing photosensitizer in
PDT?. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v.8, p.223-225, 1991.
DRAGICEVIC-CURIC, N. et al. Development of different temoporfin-loaded invasomes-
novel nanocarriers of temoporfin: Characterization, stability and in vitro skin penetration
studies. Colloids and Surfaces B: Biointeraction. v. 70, p. 198-206, 2009.
DURACHER, L. et al. The influence of alcohol, propylene glycol and 1,2-pentanediol on the
permeability of hydrophilic model drug through excised pig skin. International Journal of
Pharmaceutics. v. 374, p. 39-45, 2009.
DURMUS, M.; BIYIKLIOGLU, Z.; KANTEKIN, H. Synthesis, photophysical and
photochemical properties of crown ether substituted zinc phthalocyanines
Synthetic Metals, 2009.
DURMUS, M. et al. The synthesis and photophysicochemical behaviour of novel water-
soluble cationic indium(III) phthalocyanine. Dyes and Pigments. v. 82, p. 24-250, 2009.
ERDOGMUS, A.; OGUNSIPE, A.; NYOKONG, T. Synthesis, photophysics and
photochemistry of novel tetra(quinoxalinyl)phthalocyaninato zinc(II) complexes. Journal of
Photochemistry and Photobiolgy A: Chemistry. v. 205, p. 12-18, 2009.
EICHWURZEL, I.; PEVZENER, H.; RODER, B.; Photophysical studies of the pheophorbide
a dimmer. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v. 54, p. 194-200,
2000.
ELIAS, P.M. et al. The intercorneocyte space. In: MARKS, R.; PLEWIG, G.; Stratum
corneum. New York: Springer-Verlag; p. 53-67.1983.
ESTADOS UNIDOS. What is cancer. American Cancer Society, 24 fev. 2009. Disponível
em http://www.cancer.org/docroot/home/index.asp. Acesso em: 05 mar. 2009.
ESTADOS UNIDOS. Understanding cancer series: cancer. National Cancer Institute, , 09
jan. 2006. Disponível em http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancer.
Acessado em: 05 mar. 2009, il. col.
FABRIS, C. et al. Zn(II)-phthalocyanines as phototherapeutic agents for cutaneous diseases.
Photosensitization of fibroblasts and keratinocytes. Journal of Photochemistry and
Photobiology B : Biology. v.83, p.48-54, 2006.
FERRARI, C.; SILVEIRA, F.R.X.; BELTRAMI-JUNIOR, L.M. Uso de cristais líquidos em
cosméticos. 2004. 94p. Monografia (Pós-Graduação) – Faculdade de Ciências da Saúde,
Universidade Metodista de Piracicaba, Piracicaba, 2004.
FINGAR, V.H.; WIEMAN, T.J.; HAYDON, P.S. The effects of thrombocytopenia on vessel
stasis and macromolecular leakage after photodynamic therapy using photofrin.
Photochemistry and Photobiology., v. 66, p. 513–517, 1997.
135
FINGAR, V.H. Vascular effects of photodynamic therapy. Journal of Clinical Laser
Medicine and Surgery. v. 14, p. 323-328, 1996.
FINGAR, V.H. et al. The effects of photodynamic therapy using differently substituted zinc
phthalocyanines on vessel constriction, vessel leakage and tumor response. Photochemistry
and Photobiology. v. 58, p. 251–258, 1993.
FLORENCE A.T.; ATTWOOD D. Princípios Fisico-Químicos em Farmácia. São
Paulo:Editora da Universidade de São Paulo, 2003. p. 534-542.
FORMARIZ, T.P. et al. Microemulsões e fases líquidas cristalinas como sistemas de
liberação de fármacos. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. v. 41, p. 301-313,
2005.
FRELICHOWSKA, J. et al. Topical delivery of lipophilic drugs from o/w Pickering
emulsions. International Journal of Pharmaceutics. v. 371, p. 56-63, 2009.
FREITAS, Z.M.; Avaliação biofarmacotécnica de formulações dermatológicas semi-
sólidas de cetoconazol. Tese de Doutorado – Faculdade de Ciências Farmacêuticas –
Universidade de São Paulo, 2005.
GALLAGHER, S.J.; TROTTED, L.; HEARD, C.M. Ketoprofen: release from, permeation
across and rheology of simple gel formulations that simulate increasing dryness.
International Journal of Pharmaceutics. v. 268, p. 37-45, 2003.
GANTCHEV, T.G.; VAN LIER, J.E. Catalase inactivation following photosensitization with
metalophtalocyanines. Photochemistry and Photobiology. v.62, p.123-134, 1995.
GEZE, M. et al. Lysosomes, a key target of hydrophobic photosensitizers proposed for 137
photochemotherapeutic applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. v. 20, p. 23-35, 1993.
GELLER, A.C.; ANNAS, G.D.; Epidemiology of melanoma and nonmelanoma skin cancer.
Seminars in Oncology Nursing. v.19, n.1, p.2-11, 2003.
GODIN, B.; TOUITOU, E.; Transdermal skin delivery: Predictions for humans from in vivo,
ex vivo and animal models. Advanced Drugs Delivery Reviews. v. 59, p. 1152-1161, 2007.
GOSHI, K.O.; IGUCHI, M.; TAGAMI H. Functional analysis of the stratum corneum of
scalp skin: studies in patients with alopecia areata and androgenetic alopecia. Archives of
Dermatological Research. v. 292, p. 605–611, 2000.
HADGRAFT, J. Skin deep. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics.
v.58, p.291-299, 2004.
HADGRAFT, J. Skin, the final frontier. International Journal of Pharmaceutics. v.224,
p.1-18, 2001.
136
HADJUR, C. et al. Production of free radicals by irradiation of the photosensitizer Zn (II)
phthalocyanine. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v. 38, p. 196-
202, 1997.
HAIGH, J.M.; SMITH, E.W. The selection and use of natural and synthetic membranes for in
vitro diffusion experiments. European Journal of Pharmaceutical Science. v. 2, p. 311-
330, 1994.
HEISIG, M. et al. Non-steady-state descriptions of drug permeation through stratum corneum.
Pharmaceutical Research. v.13, p.421-426, 1996.
HENDERSON, B.; DOUGHERTY, T.J. How does photodynamic therapy work?
Photochemistry and Photobiology. v. 55, p.145-157, 1992.
HERAI, H. et al. Doxorubicin skin penetration from monoolein-containing propylene glycol
formulations. International Journal of Pharmaceutics. v. 329, p. 88-93, 2007.
HIGUCHI, T. Analysis of rate on the medicament release from ointment. Journal of
Pharmaceutical Science. v. 51, p. 802-804, 1962.
HOELLER, S.; SPERGER, A.; VALENTA, C.; Lecithin based nanoemulsions: A
comparative study of the influence of non-ionic surfactants and the cationic phytosphingosine
on physicochemical behavior and skin permeation. International Journal Pharmaceutics.
v. 370, p. 181-186, 2009.
HSIEH, Y.J. et al. Subcellular localization of Photofrin determines the death phenotype of
human epidermoid carcinoma A431 cells triggered by photodynamic therapy: when plasma
membranes are the main targets. Journal of Cell Physiology. v. 194, p. 363-375, 2003.
HUTCHESON, A.C.; FISHER, A.H.; LANG JR, P.G. Basal cell carcinomas with unusual
histological patterns. Journal of the American Academy of Dermatology. v. 53, p. 833-837,
2005.
ISELE, U. et al. Large-scale production of liposomes containing monomeric zinc
phthalocyanine by controlled dilution of organic solvents. Journal of Pharmaceutical
Science. v. 83, p. 1608-1616, 1994.
JACOBI, U. et al. Lademann porcine ear skin: an in vitro model for human skin. Skin
Research Tecnology. v. 13, p. 19-24, 2007.
JANTHARAPRAPAP, R.; STAGNI, G. Effects of penetration enhancers on in vitro
permeability of meloxicam gels. International Journal of Pharmaceutics. v. 343, p. 26-33,
2007.
JORI, G.; SPIKES, J.D. Photothermal sensitizers: Possible use in tumor therapy. Journal of
Photochemistry and Photobiology B: Biology. v.6, p.93-101, 1990.
137
JUZENIENE, A.; NIELSEN, K.P.; MOAN, J. Biophysical Aspects of Photodynamic
Therapy. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and Oncology, v. 25, p. 7,
2006.
KALIA, Y.N. et al. Assentment of topical bioavailability in vivo: the importance of stratum
corneum thickness. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. v.14, p. 82-86, 2001.
KANITAKIS, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin,
European. Journal of Dermatology. v.12, p. 390–397, 2002.
KASSAB, K. et al. Skin-photosensitizing properties of Zn(II)-2(3), 9(10), 16(17), 23(24)-
tetrakis-(4-oxy-N-methylpiperidinyl) phthalocyanine topically administered to mice. Journal
of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v.55, p.128-137, 2000.
KENNEDY, J.C.; POTTIER, R.H.; PROSS, D.C. Photodynamic therapy with endogenous
protoporphyrin : IX: Basic principles and present clinical experience. Journal
Photochemistry Photobiology B: Biology. v.6, p.143-148, 1990.
KIERNAN, J.A. Histological and Histochemical Methods - Theory and Practice. 2nd ed.,
Frankfurt: Pergamon Press., 1990. p. 172-177
KIERSTAN, K.T.E. et al. UV-spetrophotometry study of membrane transport processes with
a novel diffusion cell. International Journal of Pharmaceutics. v.229, p.87-94, 2001.
KIERSZENBAUM, A.L. Sistema Tegumentar. In: ___ Histologia e Biologia Celular: Uma
Introdução à Patologia. Rio de Janeiro, Elsevier Editora, 2004. cap. 11, p. 319-338.
KMENT, S. et al. Preparation of thin phthalocyanine layers and their structural and
absorption properties. Thin Solid Films. v. 517, p. 5274-5279, 2009.
KNORST, M.T.; NEUBERT, R.; WOHLRAB, W. Release of urea from semisolid
formulations using a multilayer membrane system. Drug Development and Industial
Pharmacy. v.23, n.3, p.253-257, 1997.
KNUTSON, K. et al. Macro- and molecular physical-chemical considerations in
understanding drug transport in the stratum corneum. Journal of Controlled Release. v.2,
p.67-87, 1985.
KONAN, Y.N.; GURNY, R.; ALLEMANN, E. State of the art in the delivery of
photosensitizers for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology
B: Biology. v.66, p.89-106, 2002.
KOSTKA, M. et al. Comparison of aggregation properties and photodynamic activity of
phthalocyanines and azaphthalocyanines. Journal of Photochemistry and Photobiology A:
Chemistry. v. 178, p. 16-25, 2006.
KORBELIK, M. et al. Nitric oxide production by tumour tissue: impact on the response to
photodynamic therapy. British Journal of Cancer. v. 82, p. 1835-1843, 2002.
138
KORBELIK, M.; SHIBUYA, H.; CECIC, I. Relevance of nitric oxide to the response of
tumours tophotodynamic therapy. SPIE. v. 3247, p. 98-105, 1998.
KORBELIK, M. Induction of tumor immunity by photodynamic therapy. Journal of Clinical
Laser Medicine and Surgery. v. 14, p. 329-334, 1996.
KULLAVANIJAYA, P.; LIM, H.; Photoprotection. Journal of the American Academy of
Dermatology. v. 52, n.6, p.937 - 958, 2005.
KURK, N.N. et al. Photophysics of the cationic 5,10,15,20,-tetrakis(4-n-methylpyridyl)
Porphyrin bound to DNA: interaction with molecular oxygen studies by porphyrin triplet-
triplet absorption and singlet oxygen luminescence. Journal of Photochemistry and
Photobiology B: Biology. v. 42, p. 181-190, 1998.
KURWA, H.A.; BARLOW, R.J. The role of photodynamic therapy in dermatology. Clinical
and Experimental Dermatology. v.24, n.3, p.143-148, 1999.
LADEMANN, J. et al. The tape stripping procedure – evaluation of some critical parameters.
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v. 72, p. 317–323, 2009.
LAIHO, L.H. et al. Two-photon 3-D mapping of ex vivo human skin endogenous
fluorescence species based on fluorescence emission spectra. Journal of Biomedical Optics.
v. 10, 2005.
LARRUCEA, E. et al. Combined effect of oleic acid and propylene glycol on the
percutaneous penetration of tenoxicam and its retention in the skin. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v. 52, p. 113-119, 2001.
HYE-MI, L. et al. Nanoparticles up-regulate tumor necrosis factor-α and CXCL8 via reactive
oxygen species and mitogen-activated protein kinase activation. Toxicology and Applied
Pharmacology, 2009.
LEVY, J.G. Photodynamic therapy. Trends in Biotechnology. v. 13, p. 14-18, 1995.
LILLIE, R.D.; FULLMER, H.M. Histopathologic Technique and Practical
Histochemistry. 4th ed. New York: Mac Graw-Hill Book Co., 1976. p. 208-701.
LIPSON, R.L.; GRAY, M.J.; BALDES, E.J. Hematoporphyrin derivative for detection and
management of cancer. Ninth International Cancer Congress. Tokyo,Japan, p. 393, 1966.
LOFFLER, H.; DREHER, F.; MAIBACH, H.I. Stratum corneum adhesive tape stripping:
influence of anatomical site, application pressure, duration and removal. Brazilian Journal of
Dermatology. v. 151, p. 746–752, 2004.
LONGO, J.P. et al. Photodynamic therapy with aluminum-chloro-phtalocyanine induces
necrosis and vascular damage in mice tongue tumors. Journal of Photochemistry and
Photobiology B: Biology. v. 94, p. 143-146, 2009.
139
LUI, H. et al. Photodynamic therapy of multiple nonmelanoma skin cancers with verteporfin
and red light–emitting diodes. Archives in Dermatology. v. 140, p. 26-32, 2004.
MAC DONALD, I.J.; DOUGUERT, T.J. Basic principles of photodynamic therapy. Journal
of Porphyrins and Phthalocyanines. v.5, p.105-129, 2001.
MACGUIRE, J.F. ; GE, N.N. ; DYSON, N. Nomelanoma skin cancer of the head and neck I :
histopathology and clinical behavior. American Journal of Otolaryngology – Head and
Neck Medicine and Surgery. v. 30, p. 121-133, 2009.
MACHADO, A.H.A. et al. Cellular and molecular studies of the initial process of the
photodynamic therapy in HEp-2 cells using LED light source and two different
photosensitizers. Cell Biology International. v. 33, p. 785-795, 2009.
MARKS, R. The stratum corneum barrier: the final frontier. Journal of Nutrition. v. 134
820, p. 2017S–2021S, 2004.
MARQUELE-OLIVEIRA, F. et al. Development of topical functionalized formulations
added with propolis extract: Stability, cutaneous absorption and in vivo studies. International
Journal of Pharmaceutics. v. 342, p. 40-48, 2007.
MARTIN, A. et al. Lack of selectivity of protoporphyrin IX fluorescence for basal cell
carcinoma after topical aplication of 5-aminolevulenic acid: implications for photodynamic
treatment. Archives of Dermatological Research. v. 287, p. 665-674, 1995.
MCMAHON, K.S. et al. Effects of photodynamic therapy using mono-L-aspartyl chlorin e6
on vessel constriction, vessel leakage, and tumor response. Cancer Research. v. 54, p. 5374–
5379, 1994.
MELERO, A. et al. Nortriptyline for smoking cessation: Release and human skin diffusion
from patches. International Journal of Pharmaceutics. 2009.
MERWALD, H. et al. UVA-induced oxidative damage and cytotoxicity depend on the mode
of exposure. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v.79, p.197-207,
2005.
MIGRATORI, S. In situ determination of partition and diffusion coefficients in the lipid
bilayers of stratum corneum. Pharmaceutical Research. v.17, p.1026-1029, 2000.
MOAN, J.; BERG, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the
lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. v. 53, p. 549–553, 1991.
MORAIS, G.G. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade de emulsões O/A com
cristais líquidos acrescidos de xantina para o tratamento da hidrolipodistrofia ginóide
(celulite). 2006. p. 158. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)-Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
MOSER, K. et al. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro.
European Journal of Pharmaceutical Science. v.52, p.103-112, 2001.
140
NAIK, A. et al. Mechanism of oleic acid-induced skin penetration enhancement in vivo in
humans. Journal of Controlled Release. v. 37, p. 299-306, 1995.
NEMANIC, M.K.; ELIAS, P.M. In situ precipitation: A novel cytochemical technique for
visualization of permeability pathways in mammalian stratum corneum. Journal of
Histochemistry and Cytochemistry. v.28, p.573-578, 1980.
NIGRO, J.M. et al. Mutations in the p53 gene occurs in diverse human tumour types. Nature.
v. 342, p. 705-708, 1989.
NUNES, S.M.; SGUILLA, F.S.; TEDESCO, A.C. Photophysical studies of zinc
phthalocyanine and chloroaluminum phthalocyanine incorporated into liposomes
in the presence of additives. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. v. 37,
p. 273-284, 2004.
OCHSNER, M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of
tumours. Journal Photochemistry Photobiology B: Biology. v.39, p.1-18, 1997.
OGUNSIPE, A.; MAREE, D.; NYOKONG, T. Solvent effects on the photochemical and
fluorescence properties of zinc phthalocyanine derivatives. Journal of Molecular Structure.
v. 650, p. 131-140, 2003.
OH, H.; OH, Y.; KIM, C. Effects of vehicles and enhancers on transdermal delivery of
melatonin. International Journal of Pharmaceutics. v. 212, p. 63-71, 2001.
OLEINICK, N.L.; MORRIS, R.L.; BELICHENKO, I. The role of apoptosis in response to
photodynamic therapy: what, where, why and how. Photochemical and Photobiological
Science. v. 1, p. 1-21, 2002.
OLEINICK, N.L.; EVANS, H.H. The photobiology of photodynamic therapy: cellular targets
and mechanisms. Radiation Research. v.150, p.146-156, 1998.
OWENS, J.W. et al. Photophysical properties of porphyrins, phthalocyanines, and
benzochlorins. Inorganica Chimica Acta. v.279, p.226-231, 1998.
PENA, A.-M. et al. Spectroscopic analysis of keratin endogenous signal for skin multiphoton
microscopy. Optics Express. v. 13, p. 6268–6274, 2005.
PENG, Q. et al. 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: clinical research and
future chalenges. Cancer. v.79, p.2282-2308, 1997a.
PENG, Q. et al. 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: principals and
experimental research. Photochemistry and Photobiology. v.65, p.235-251, 1997b.
PENG, Q.; MOAN, J.; NESLAND. J.M. Correlation of subcellular and intratumoral
photosensitizer localization with ultrastructural features after photodynamic therapy.
Ultrastructural Pathology. v. 20, p. 109–129, 1996.
141
PERSHING L.K. Dermatopharmacokinetics for assessing bioequivalence of topically applied
products in human skin. Cosmetic and Toiletries, v.115, n.5, p.43-51, 2001.
PIERRE, M.B. et al. Oleic acid as optimizer of the skin delivery of 5-aminolevulinic acid in
photodynamic therapy. Pharnaceutical Research. v. 23, p. 360-366, 2006.
PLAETZER, K. et al. Apoptosis following photodynamic tumor therapy: induction,
mechanism and detection. Current Pharmaceutical Design. v. 11, p. 1151, 2005.
POLICARD, A. Etudes sur les aspects offerts par des tumeurs experimentales examinees a la
lumiere de Wood. C. R. Soc. Biol. v.91, p.1423, 1924.
PONTEN, J. et al. Biology and natural history of breast cancer. International Journal of
Cancer - Supplement. v. 5, p. 5-21, 1990.
POTTS, R.O.; GUY, R.H. Predicting skin permeability. Pharmaceutical Research. v.9,
p.663-669, 1992.
POTTS, R.O.; FRANCOEUR, M.L. The influence of stratum corneum morphology on water
permeability. Journal of Investigative. Dermatology. v.96, p.495-499, 1991.
PRIMO, F.L. et al. In vitro studies of cutaneous retention of magnetic nanoemulsion loaded
with zinc phthalocyanine for synergic use in skin cancer treatment. Journal of Magnetism
and Magnetic Materials. v. 320, p. 211-214, 2008.
PRISTA, L.N. et al. Administração de Medicamentos. In: ___ Tecnologia Farmacêutica. 7ª
Ed, Lisboa, Fundação Calouste Gulbenkian, 2008, v. 1, cap. 4, p. 41-191.
PRISTA, L.N. et al. Formas farmacêuticas obtidas por dispersão molecular: soluções. In: ___
Tecnologia Farmacêutica. 5ª Ed, Lisboa, Fundação Calouste Gulbenkian, 2006, v. 2, cap. 9,
p. 787-1110.
RAAB, O. Uber die wirkung fluoreszierender stoffe auf infusorien. Zeitschrift fur Biologie.
v. 39, p. 524, 1900.
REGE, P.R.; VILIVALAM, V.D.; COLLINS, C.C. Development in release testing of topical
dosage forms: use of the enhancer cell
TM
automated sampling. Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analisis. v. 17, p. 1225-1233, 1998.
RICCI-JÚNIOR, E.; MARCHETTI, J.M. Zinc(II) phthalocyanine loaded PLGA nanoparticles
for photodynamic therapy use. International Journal of Pharmaceutics. v.310, p.187-195,
2006a.
RICCI-JÚNIOR, E.; MARCHETTI, J.M. Preparation, characterization, photocytotoxicity
assay of PLGA nanoparticles contaning zinc(II) phthalocyanine for photodynamic therapy
use. Journal of Microencapsulation, v. 23, n.5, p.523-538, 2006b.
142
RICCI-JÚNIOR, E. Nanopartículas de PLGA contend Zinco (II) ftalocianina para uso na
Terapia Fotodinâmica. 2005. Dissertação (Doutorado em Ciências Farmacêuticas)-
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2005.
ROBERTS, D.J.H. et al. Tumour vascular shutdown following photodynamic therapy based
on polyhaematoporphyrin or 5-aminolaevulinic acid. International Journal of Oncology. v.
5, p. 763–768, 1994.
RODER, B. Photophysical properties of phorbides. Journal of Photochemistry and
Photobiology B.: Biology. v. 4, p. 37-34, 2000.
RODRIGUEZ, J.; NONAKA, D.; KUHN, E. Combined high-grade basal cell carcinoma and
malignant melanoma of the skin. American Journal of Dermatopathology. v.27, n.4, p.314-
318, 2005.
ROSENTHAL, I. et al. The effect of substituents on phthalocyanine photocytotoxicity.
Photochemistry and Photobiology. v.46, n.6, p.959-963, 1987.
RÜCK, A. et al. Dynamic fluorescence changes during photodynamic therapy in vivo and in
vitro of hydrophilic A1 (III) phthalocyanine tetrasulphonate and lipophilic ZN(II)
phthalocyanine administered in liposomes. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. v.36, p.127-133, 1996.
SCALIA, S. et al. Incorporation of the sunscreen agent, octyl methoxycinnamate in a
cellulosic fabric grafted with β-cyclodextrin. International Journal of Pharmaceutics.
v.308, p.155-159, 2006.
SCALIA, S. et al. Comparative studies of the influence of cyclodextrins on the stability of the
sunscreen agent, 2-ethylhexyl-p-methoxycinnamate. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. v.30, p.1181-1189, 2002.
SCRIVENER, Y.; GROSSHANS, E.; CRIBIER, B. Variations of basal cell carcinomas
according to gender, age, location and histopathological subtype. British Journal of
Dermatology. v. 147, p.41-47, 2002.
SEKKAT, N.; KALIA, Y.N.; GUY, R.H. Biophysical study of porcine ear in vitro and its
comparison to human in vivo. Journal of Pharmaceutical Science. v. 91, p. 2376-2381,
2002.
SHABIR, G.A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for
pharmaceutical analysis: Understanding the differences and similarities between validation
requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the
International Conference on Harmonization. Journal of Chromatography A. v. 987, p. 57-
66, 2003.
SHAH, V.P.; ELKINS, J.S.; WILLIAMS, R.L. Evaluation of the test system used for in vitro
release of drugs for topical dermatological drug products. Pharmaceutical Development and
Technology. v. 4, p. 377-385, 1999.
143
SHAH, V.P. et al. Bioequivalence of topicaldermatological dosage forms: methods of
evaluation of bioequivalence. Pharmaceutical Research. v.15, n.2, p.167-171, 1998.
SHAH, V.P. Challenges in evaluating bioequivalence of dermatological drug products.
Current Problems in Dermatology. v.22, p.152-157, 1995.
SHAH, J.C. Analysis of permeation data: evaluation of the lag time method. International
Journal of Pharmaceutics. v.90, p.161-169, 1993.
SHARMAN, W.M.; VAN LIER, J.E.; ALLEN, C.M. Targeted photodynamic therapy via
receptor mediated delivery systems. Advanced Drug Reviews. v.56, p.53-76, 2004.
SIBATA, M.N.; TEDESCO, A.C.; MARCHETTI, J.M. Photophysicals and photochemicals
studies of zinc(II) phthalocyanine in long time circulation micelles for Photodynamic Therapy
use. European Journal of Pharmaceutical Science. v. 23, p. 131-138, 2004.
SIBATA, C. H. et al. Photodynamic therapy: a new concept in medical treatment. Brazilian
Journal of Medical and Biological Research. v.33, p.869-880, 2000.
SILVA, C.L. et al. Stratum corneum hydration: Phase transformations and mobility in stratum
corneum, extracted lipids and isolated corneocytes. Biochimica et Biophysica Acta-
Biomembranes. v. 1768, p. 2647-2659, 2007.
SIMON, J.; BASSOUL, P. Phthalocyanine based liquid crystals: towards submicronic
devices. In: Leznoff, C.C.; Lever, A.B.P. Phthalocyanines: Properties and Applications,
VCH Publishers, New York, 1993, vol. 2, p. 223.
SIMON, G.A.; MAIBACH, H.I. The pig as an experimental animal model of percutaneous
permeation in man: qualitative and quantitative observations – an overview. Skin
Pharmacology and Applied Skin Physiology. v. 13, p. 229-234, 2000.
SIMONETTI, L.D. et al. Assessment of the percutaneous penetration of cisplatin: The effect
of monoolein and the drug skin penetration pathway. European Journal of Pharmaceutics
and Biopharmaceutics. 2009.
SKOOG, A.C.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A.; Introdução aos métodos espectrométricos.
In: ___. Princípios de Análise Instrumental.; 5ª. ed. Porto Alegre, Bookman Editora, 2002.
cap. 6, p. 116-138.
SQUILLANTE, E. et al. Optimization of in vitro nifedipine penetration enhancement through
hairless mouse skin. International Journal of Pharmaceutics, v. 169, p. 143-154, 1998.
STIEF, T.W. The physiology and pharmacology of singlet oxygen. Medical Hypotheses. v.
60, p. 567-572, 2003.
SUBER, C. et al. Optimization of topical therapy: partitioning of drugs into stratum corneum.
Pharmaceutical Research. v.7, n.12, p.1320-1324, 1990.
144
TANOJO, E.L. Fatty acids as enhancers of drugs permeation across human skin. An
integrated in vivo/in vitro study. Tese de Douotrado, Leiden University, 1996.
TAKEMURA, T. et al. Critical importance of the triplet lifetime ofthe photosensitizer in
photodynamic therapy of tumors, Photochemistry and Photobiology. v. 50, p. 339-344,
1989.
TAO, Y. et al. Development of mucoadhesive microspheres of acyclovir with enhanced
bioavailability. International Journal of Pharmaceutics, 2009.
TAPPEINER, V. H.; JODLBAUER, A. Die sensibilisierende wirkung fluorescierender
substanzen: Gesam melte untersuchugen uber die photodynamische erscheinung.
Leipzig, Germany, F.C.W. Vogel, p.1, 1907.
TAPPEINER, V. H.; JESIONEK, A. Therapeutiche Versuche mit fluoreszierenden stoffen.
Muench Med Wochenschr. v.47, p.2042, 1903.
TSAI, J.C. et al. Properties of adhesive tapes used for stratum corneum stripping.
International Journal of Pharmaceutics. v. 72, p. 227–231, 1991.
VALDUGA, G. et al. Interaction of hydro- or lipophilic phthalocyanines with cells of
different metastatic potential. Biochemical Pharmacology. v.51, p.585-590, 1996.
WAINWRIGHT, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Antimicrobial
Chemotherapy. v.42, n.1, p.13-28, 1998.
WELIN-BERGER, K.; NEELISSEN, J.A.M.; BERGENSTAHL, B. The effect of rheological
behavior of a topical anaesthetic formulation on the release and permeation rates of the active
compound. European Journal of Pharmaceutical Science. v.13, p.309-318, 2001.
WEISHAUPT, K.R.; GOMER, C.J.; DOUGHERTY, T.J. Identification of singlet oxygen as
the cytotoxic agent in photo-inactivation of a murine tumor. Cancer Research. v.36, p. 2326-
2329, 1976.
WELCH, H.G.; WOLOSHIN, S.; SCHWARTZ, L.M.; Skin biopsy rates and incidence of
melanoma: population based ecological study. British Medical Journal. v. 331, p. 481 – 484,
2005.
WERTZ, P.W.; DOWNING, D.T. Stratum corneum: biological and biochemical
considerations. In: HADGRAFT, J.; GUY, R.H. Transdermal drug delivery
Developmental Issues and research initiatives, New York: Marcel Dekker, p. 1-22, 1989.
WICKETT, R.R.; VISSCHER, M.O. Structure and fuction of the epidermal barrier.
American Journal of Infect Control. v. 34, p.98-110, 2006.
WIECHERS, J.W. et al. Formulating for efficacy. International Journal of Cosmetic
Science, v. 26, p. 173-182, 2004.
145
WIEDEMANN, M.K.; CACA, K. General principles of photodynamic therapy (PDT) and
gastrointestinal applications. Current Pharmaceutical Biotechnology. v. 5, p. 1-12, 2004.
WILLIAMS, A.C.; BARRY, B.W. Penetration enhancers. Advanced Drug Delivery
Reviews, v.56, p.603-618, 2004.
WILSON, B.D.; MANG, T. Photodynamic therapy for cutaneous malignancies. Clinics in
Dermatology, v.13, p.91-96, 1995.
WISSING, S.A.; MÜLLER, R.H. Solid lipid nanoparticles as carrier for sunscreens: in vitro
release and in vivo skin penetration. Journal of Controlled Release, v.81, p.225-233, 2002.
WOLF, P.; KERL, H. Photodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid: a promissing
concept for the treatmet of cutaneous tumors. Dermatology. v.190, p.183-185, 1995.
WOOTEN, R.S. et al. Prospective study of cutaneous phototoxicity after systemic
hematoporphyrin derivatives. Laser Surgery and Medicine, v.8, p.294-300, 1988.
YAMAMOTO, Y. Role of active oxygen species and antioxidants in photoaging. Journal of
Dermatological Sciences. v. 27, p.S1-S4, 2001.
ZATZ, J.L. Drug release from semisolids: effect of membrane permeability on sensitivity to
product parameters. Pharmaceutical Research. v.12, n.5, p.787-789, 1995.
ZEITOUNI, N.C.; OSEROFF, A.R.; SHIEH, S. Photodynamic therapy for nonmelanoma skin
cancers: Current review and update. Molecular Immunology. v.39, p.1133-1136, 2003.
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