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Gláucia Pessin Vieira
Desenvolvimento de procedimento analítico automático para
determinação espectrofotométrica de microcistinas em águas
empregando o processo de multicomutação em fluxo
Tese apresentada ao Centro de Energia
Nuclear na Agricultura da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Doutor
em Ciências.
Área de concentração: Química na
Agricultura e no Ambiente.
Orientador: Prof. Dr. Boaventura Freire dos
Reis
Co-orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Marli de Fátima
Fiore
Piracicaba
2009
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Vieira, Gláucia Pessin
Desenvolvimento de procedimento analítico automático para determinação
espectrofotométrica de microcistinas em águas empregando o processo de
multicomutação em fluxo / Gláucia Pessin Vieira; orientador Boaventura Freire dos
Resis; Co-orientador Marli de Fátima Fiore. - - Piracicaba, 2009.
83 f.: il.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de
Concentração: Química na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia Nuclear na
Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Análise em fluxo contínuo 2. Espectrofotometria 3. Qualidade da água 4.
Química analítica 5. Toxinas I. Título
CDU 543.068.3:543.42
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Á DEUS
Por cada momento precioso que foi destinado nesta longa caminhada.....
Aos meus filhos, Felipe e Giovane
Valiosos presentes que Deus me concedeu.
Ao meu marido Fábio
Pelo carinho e respeito que sempre teve pelo meu trabalho.
Aos meus pais e meu irmão
Que sempre estiveram ao meu lado, e principalmente, fazendo confiar no futuro.
Por tudo que hoje sou.
DEDICO este TRABALHO
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que de alguma maneira puderam contribuir para a
realização deste trabalho.
Ao Professor Boaventura por toda a orientação, compreensão, paciência,
ensinamentos científicos e cultura geral. E principalmente, do grande exemplo de
vida.
Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura – CENA/USP,
particularmente ao Laboratório de Química Analítica “Henrique Bergamin Filho”
pela oportunidade oferecida.
Ao CNPq/CT-Hidro pela bolsa concedida para a realização deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação do CENA pela atenção.
As secretárias do Programa de Pós-Graduação do CENA pelos serviços
prestados.
A seção de biblioteca do CENA pela atenção e colaboração nas referências
bibliográficas.
A seção de Biologia Celular e Molecular, pelo ensinamento adquirido no
estágio realizado e atenção prestada, e principalmente, a Maria Estela Stênico,
por toda a ajuda prestada.
A professora e co-orientadora, Marli de Fátima Fiore pela atenção
dispensada.
Aos professores Elias A. G. Zagatto, Francisco J. Krug e Maria Fernanda
Guiné, pelos ensinamentos e convivência.
Ao professor Zé Santista pelas amostras cedidas.
Aos técnicos da Seção de Química Analítica, Iolanda Rufini (Tatinha),
Valdemir (Mi) e Fátima Patreze por todos os serviços prestados.
Um agradecimento especial à técnica Sheila Roberta pela atenção e
disposição para os serviços necessários e tantos outros mais.
Agradecimento especial também a pessoas que me ajudaram com a
correção deste trabalho.
Aos grandes colegas e amigos conquistados: Andréia, Tuane, Jeová e Mário
(Maranhão); Alessandra (João Pessoa); Marcelo, Milena e os pimpolhos (Marcelo
Henrique e Murilo Augusto, Mato Grosso do Sul); Carla, Marcos e o pequeno
Lucas (Piracicaba); Alexssandra, Richard e os lindos filhos (Andrey e Sophia,
Piracicaba); o grande amigo de Regeneração (PI), Milton; grande amigo
atualmente “pernambucano” André, (Recife, PE); a “loura” Rejane (Americana);
aos argentinos, Alfredo, Lorena e a linda Ana (Brasileira); a peruana Ausberta; ao
amigo desde 2003, Evandro (Araras); aos colegas do grupo do Chico, Lidiane
(MG), Lílian (Mineiros do Tietê), Quienly (PR), Paulino (Piracicaba), Dário (Belém),
Flávio, Kennedy, Marquinhos e Gabriel (Piracicaba); a cearense Janete
(Fortaleza); aos novos amigos espanhóis, Nestor e Idôia; ao “japa” Miltom (Tupã)
e a querida Paula Fortes (Botucatu), pela amizade e grande convivência.
Aos meus tios e primos, maternos e paternos, sogro e sogra, pela união
familiar e pelo incentivo, com os quais sempre estiveram presentes.
A todos os colegas e amigos da Química Analítica, pelos momentos de
descontração, apoio e colaboração.
Muito obrigada
"Quando o homem aprender a respeitar até o menor ser da
Criação seja animal ou vegetal; ninguém precisará ensiná-lo a
amar seu semelhante".
Albert Schwweitzer
Prêmio Nobel da Paz de 1952
RESUMO
VIEIRA, G.P. Desenvolvimento de procedimento analítico automático para
determinação espectrofotométrica de microcistinas em águas empregando o
processo de multicomutação em fluxo. 2009. 83 f. Tese (Doutorado em Ciências)
– Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba,
2009.
Neste trabalho, propõe-se o desenvolvimento de procedimento analítico
automático para determinação espectrofotométrica de microcistinas em águas
empregando o processo de multicomutação em fluxo. O módulo de análise para
implementar o procedimento analítico empregou um bomba de seringa para
propulsão de fluído e válvulas solenóide para controlar a amostragem. A bomba de
seringa foi construída no laboratório de Química Analítica, CENA/USP, onde foi
empregado um motor de passo para fazer o deslocamento do êmbolo da seringa.
Como detectores foram empregados, um fotômetro da Oriel Instrument e um
fotômetro desenvolvido no laboratório de Química Analítica, CENA/USP, baseado
em um fotodiodo da BURR-BRAWN e projetado para este procedimento. Uma cela
de fluxo com caminho óptico de 40 mm e volume interno de 32 µL, foi construída sob
medida para permitir fácil acoplamento da fonte de radiação (LED) e dos
fotodetectores, formando uma unidade compacta. O controle do sistema de fluxo,
incluindo o motor de passo, foi executado por um microcomputador usando um
software escrito em linguagem Quick Basic 4.5. Os sinais gerados pelos fotômetros
em diferença de potencial eram convertidos para digital por um multímetro e
enviados para o computador através da interface serial 232. O sistema proposto foi
empregado para determinação de microcistinas em águas de rios e lagoas. A
exatidão foi averiguada comparando com os dados obtidos empregando um
equipamento ELISA. A faixa de concentração situada entre (0,1 e 0,8 µgL
-1
) de
microcistina indica que o sistema proposto pode ser usado em serviços de
tratamento de águas onde o requerimento da ANVISA (Portaria n°518, 2004) deve
ser alcançado.
Palavra-chave: Análise por injeção em fluxo, Multicomutação, Microcistinas, Águas.
ABSTRACT
VIEIRA, G.P. Development of the automated analytical procedure for
spectrophotometric determination of microcystins in waters employing the
multicommutation process in flow. 2009. 83 f. Thesis (Doctoral) – Centro de
Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2009.
In this work, it was proposed the development of an automated analytical
procedure based on multicommutation for the photometric determination of
microcystins water. The flow module to implement the analytical procedure employed
a syringe pump for solution propelling and solenoid valves for sampling control. The
syringe pump was constructed in the laboratory CENA/USP, employed a step-motor
to carry out the displacement of the syringe piston. As photodetectors was employed
an Oriel Instrument photometer and a photometer developed in the laboratory
CENA/USP based on a BURR-BRAWN photodiode and designed to be used in this
procedure. A flow cell with optical pathlength of 40 mm and inner volume of 32 µL
was tailored to allow easily coupling of radiation source (LED) and photodetector,
forming a compact unit. The control of the flow system, including the step-motor was
performed by a microcomputer using a software wrote in Quick BASIC 4.5. The
signals generated by the photometers in difference of potential were converted to
digital by a digital multimeter and sent to the microcomputer through the serial
interface 232. The proposed system was employed for the photometric determination
of microcystins in water. Accuracy was assessed comparing the results with those
obtained using a ELISA instrument. The concentration response (0.1 - 0.8 µgL
-1
microcystins) and limit of detection lower than 0.01 µgL
-1
microcystins, indicated that
the proposed system can be used in plants of water treatment where the ANVISA
requirement must be maintained.
Keywords: Flow injection analysis, Multicommutation, Waters, Microcystins.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fórmula estrutural da molécula Microcistina............................................. 21
Figura 2. Modelo do processo de amostragem binária ............................................ 30
Figura 2. Vista em corte da cela de fluxo ................................................................. 39
Figura 4. Diagrama do fotômetro ............................................................................. 40
Figura 5. Diagrama da fonte de alimentação do fotômetro ...................................... 41
Figura 6. Diagrama da Interface de controle ............................................................ 42
Figura 7. Diagrama da Interface de controle) ......................................................... 43
Figura 8. Diagrama da fonte de alimentação da interface de controle ..................... 45
Figura 9. Desenho da bomba de seringa ................................................................. 46
Figura 10. Diagrama do módulo de análise com válvula solenóide de 3 vias. ......... 47
Figura 11. Diagrama com válvula solenóide de estrangulamento. .......................... 47
Figura 12. Fluxograma do procedimento do kit ELISA............................................. 52
Figura 13. Registros referentes à determinação fotométrica de microcistina .......... 58
Figura 14. Registros referentes à determinação fotométrica de microcistina. ......... 60
Figura 15. Resposta dos fotômetros ........................................................................ 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características de LEDs encontrados comercialmente ............................ 36
Tabela 2. Sequência de funcionamento do módulo de análise ................................ 48
Tabela 3. Comparação dos resultados dos padrões ................................................ 59
Tabela 4. Resultados obtidos variando do fundo de escala do fotômetro da Oriel .. 62
Tabela 5. Valores de absorbância das amostras analisadas ................................... 64
Tabela 6. Performance dos fotodetectores .............................................................. 65
Tabela 7. Determinação de microcistina em águas 67
Tabela 8. Comparação das características analíticas do sistema ............................ 68
Tabela 9. Resultado das análises das amostras águas ........................................... 69
Tabela 10. Características do sistema com fotômetro montado no laboratório. 70
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 13
2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 17
2.1 Cianobactérias .................................................................................................... 17
2.2 Microcistinas ....................................................................................................... 19
2.3 Espectrofotometria ............................................................................................. 26
2.4 Lei de Lambert-Beer ........................................................................................... 26
2.5 Análise por injeção em fluxo (FIA) ..................................................................... 27
2.6 Multicomutação .................................................................................................. 29
2.7 Sistemas com o processo de multicomutação .................................................... 30
2.8 LED como fonte de radiação em fotometria ...................................................... 36
3. PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................... 38
3.1 Equipamentos e acessórios ................................................................................ 38
3.2 Detalhamento da cela de fluxo .......................................................................... 39
3.3 Detalhamento do fotômetro ............................................................................... 40
3.4 Detalhamento das interfaces eletrônicas ........................................................... 42
3.5 Descrição da bombe de seringa ......................................................................... 45
3.6 Descrição dos módulos de análises .................................................................. 47
3.7 Reagentes e soluções ....................................................................................... 51
3.8 Procedimento do kit ELISA ................................................................................ 51
3.9 Instruções .......................................................................................................... 52
3.10 Especificação................................................................................................... 53
3.11 Cuidados com o Kit .......................................................................................... 53
3.12 Procedimentos de análise do kit ....................................................................... 54
3.13 Interpretação dos resultados ........................................................................... 55
3.14 Amostras ......................................................................................................... 55
3.15 Padrão de Microcistina .................................................................................... 56
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 57
4.1 Módulo de análise com válvulas de estrangulamento ....................................... 57
4.2 Estudo do efeito do fundo de escala................................................................... 61
4.3 Efeito do tempo de processamento da amostra para leitura ............................. 63
4.4 Comparação dos fotômetros ............................................................................. 64
4.5 Análise das amostras ......................................................................................... 66
4.6 Emprego do fotômetro montado no laboratório ................................................. 68
5. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 73
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 74
13
1. INTRODUÇÃO
As cianobactérias são organismos procariontes pertencentes ao grupo das
bactérias. Estima-se que o surgimento ocorreu há 3,5 bilhões de anos. Geralmente,
são encontradas em ambientes aquáticos (fitoplâncton) e apresentam um
crescimento em larga escala, conhecido como floração (bloom). São estáveis em
água, podendo resistir a variações de temperatura na faixa de 15 a 30 ºC e
variações de pH entre 6 e 9. Evoluem em exposição prolongada à radiação solar e
na presença de compostos nitrogenados e fosfatados, gerando a eutrofização dos
ambientes aquáticos (LEMES; YUNES, 2006).
O uso em larga escala de compostos nitrogenados e fosfatados, tais como
detergentes e fertilizantes, os quais terminam alcançando os corpos d´água, são
considerados os principais fatores relacionados às florações de cianobactérias em
águas superficiais, resultando na contaminação dos mananciais utilizados para o
abastecimento público (CARMICHAEL, 1994; LINDNER et al., 2004). As
cianobactérias normalmente apresentam-se em água limpa e de preferência com
material orgânico, que serve como alimentação para viver, crescer e se multiplicar. A
microcistina é a toxina que a cianobactéria libera para se defender no ambiente
aquático.
O risco de proliferação de cianobactéria é maior em regiões de alta densidade
populacional, onde não dispõem de eficiente sistema de tratamento de esgoto. O
crescimento rápido dos microrganismos em águas superficiais ocorre com o
predomínio de uma ou mesmo poucas espécies de cianobactérias produtoras de
toxinas, ou metabólitos que inibem a predação por microcrustáceos, larvas de
peixes, moluscos, etc. Esses consumidores primários irão preferir consumir as
microalgas não tóxicas e com maior valor nutricional, contribuindo para a redução
das microalgas, resultando em uma diminuição dos consumidores primários. Como
resultado desses processos, tende-se a aumentar no meio aquático a participação
das cianobactérias tóxicas como organismos fitoplanctônicos dominantes
(SIVONEN; JONES, 1999).
A principal preocupação com a ocorrência de florações de cianobactérias em
mananciais de abastecimento de água é a capacidade desses microrganismos de
produzir e liberar para o meio aquático toxinas (cianotoxinas), as quais podem trazer
14
sérios riscos à saúde humana. Esse risco pode ser relacionado à ingestão da água,
ao contato com atividades de recreação no ambiente ou consumo de pescado
contaminado. A principal via de intoxicação é oral através do consumo da água sem
tratamento para remoção das toxinas (FALCONER, 1998; KUIPER-GOODMAN;
FALCONER; FITZGERALD, 1999).
As florações de cianobactérias têm conseqüências danosas para os
organismos vivos e para o meio ambiente, alterando o equilíbrio dos ecossistemas
aquáticos. Geralmente são visíveis, criando um biofilme superficial de cor verde,
modificando a transparência da água e resultando a desoxigenação de lagos e rios.
As substâncias liberadas produzem gosto e odor desagradáveis, interferindo na
qualidade da água em reservatórios de uso humano.
A grande preocupação em relação às toxinas produzidas pelas cianobactérias
é que elas não são facilmente removidas por processos convencionais de tratamento
de água. Alguns estudos comprovam que tais toxinas resistem até mesmo à fervura.
Dentre as cianobactérias, a microcistina LR (leucina-arginina) é a encontrada com
maior freqüência (LEMES; YUNES, 2006).
Atualmente, há uma grande preocupação das autoridades sanitárias com a
presença de toxinas liberadas por cianobactérias em águas superficiais usadas para
abastecimento público. Essa preocupação tem como fundamento a comprovação de
que tais toxinas representam um grande risco para a saúde (RAPALA et al., 2002;
MORENO; REPETTO; CAMEÁN, 2003; NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1992).
Segundo a literatura, já foram identificados mais de 60 tipos de microcistinas (OHTA
et al., 1994; RAPALA et al., 2002), sendo citadas como as mais potentes causadoras
de tumores (NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1992; OHTA et al., 1994; RAPALA et
al., 2002; MORENO; REPETTO; CAMEÁN, 2003).
Embora a literatura documente a existência de vários tipos de toxinas
liberadas por cianobactérias em águas superficiais, (CARMICHAEL, 1994; LINDNER
et al., 2004) o foco das agências reguladoras está direcionado para as microcistinas
que apresentam alto potencial de toxidez (CARMICHAEL et al., 1988;
CARMICHAEL, 1994; RAPALA et al., 2002; SHEN et al., 2003; LINDNER et al.,
2004). Há registro de casos fatais ocorridos no Brasil relacionados à presença desta
toxina em solução de hemodiálise (JOCHIMSEN et al., 1998; CARMICHAEL, et al.,
2001; AZEVEDO et al., 2002; LAWTON et al., 2003).
15
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu em 1 µgL
-1
a
concentração máxima de microcistina em águas para consumo (LINDNER et al.,
2004; LAWTON et al., 2003). Este valor também foi adotado no Brasil através da
Portaria nº1469 do Ministério da Saúde, Monitoramento de Cianobactérias e
Cianotoxinas, a qual foi publicada em 29 de dezembro de 2000 (BRASIL, 2000). No
presente, está em vigência a portaria nº 518 de 25 de março de 2004 (BRASIL,
2004), a qual manteve os mesmos níveis de concentração para esta toxina.
Para atender este requisito é necessário dispor de procedimentos analíticos
de alta sensibilidade; em geral, tem sido empregada cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) (ZECK; WELLER; NIESSNER, 2001), cromatografia líquida
acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) (AVERSANO; EAGLESHAM,
QUILLIAM, 2004), eletroforese capilar com detecção por espectrofotometria
ultravioleta (VASAS et al., 2002), etc.
Segundo J. Rapala et al. (2002) os procedimentos baseados na inibição da
proteína fosfatase (Protein Phosphatase Inhibition Assay, PPI-Assay) e ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) são mais sensíveis que os baseados em
cromatografia. A literatura consultada evidencia a necessidade de se dispor de
procedimentos analíticos de fácil implementação, custo moderado e resposta rápida,
para permitir a tomada de decisão em tempo hábil, evitar possível contaminação da
água servida para consumo humano, da água destinada para recreação bem como
para outras atividades econômicas.
Observa-se na literatura que, em grande parte, os estudos com microcistinas
em águas empregam a metodologia ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays)
nos procedimentos para sua determinação (RAPALA et al., 2002; SHEN et al., 2003;
LEMES; YUNES, 2006). Esta metodologia emprega instrumentação de custo
moderado, baseada em detecção espectrofotométrica permitindo alcançar alta
sensibilidade. Em geral, os reagentes necessários são adquiridos no mercado na
forma de Kits, os quais são fornecidos acompanhados pelo receituário a ser seguido.
Dado à sua praticidade, esses Kits alcançaram grande aceitação em todo mundo,
pois dentre as vantagens oferecidas, está o fornecimento dos anticorpos
imobilizados em suporte sólido.
O crescimento em larga escala do processo FIA (Análise por Injeção em
Fluxo) juntamente com as virtudes de suas características analíticas como
versatilidade, baixo consumo de reagentes, equipamentos de baixo custo, etc,
16
permitiu obter grandes benefícios no desenvolvimento de procedimentos com
excelentes resultados e alta produtividade.
Com a evolução do processo FIA, surgiu a estratégia denominada
multicomutação, permitindo que a manipulação das soluções de amostras e
reagentes fossem controladas por um microcomputador. Como grande contribuição
para a Química Limpa, podemos considerar que as vantagens deste processo
permitem o controle necessário do tempo, garantindo uma boa repetibilidade dos
resultados, e principalmente, a economia dos reagentes. Empregando um
microcomputador com um software apropriado, é possível controlar o tempo de
funcionamento das válvulas solenóide, que compõem o módulo de análise,
garantindo a inserção de quantidade necessária de reagente para o
desenvolvimento da reação envolvida no procedimento analítico. Fato este muito
importante, tanto do ponto de vista econômico, como do ponto de vista ambiental,
onde podemos destacar uma menor quantidade de resíduo gerado. Outro fator de
suma importância é que, além do tempo da análise ser reduzido, o contato do
analista passa a ser menor, evitando assim possíveis contaminações.
Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de instrumentação e
procedimento automático para determinação de microcistinas em águas de represas,
rios, lagos, etc. O procedimento de determinação foi implementado á partir de um Kit
comercial, ELISA, o qual é composto por poços com anticorpo imobilizado e
reagentes para o desenvolvimento das reações. No plano de pesquisa, foi proposto
o desenvolvimento do instrumento de detecção fotométrica empregando LED como
fonte de radiação e fotodiodo de alto desempenho para converter a absorção da
radiação emitida pelo LED em diferença de potencial. Tendo em vista que, a
alteração do meio reacional para melhorar a sensibilidade do método poderia não
ser viável, foi desenvolvido um sistema de detecção fotométrica com sensibilidade
suficiente para atender as exigências do Ministério da Saúde, que estabelece em 1
µgL
-1
a concentração máxima de microcistina em águas para consumo.
17
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Cianobactérias
Florações de algas azuis-esverdeadas, conhecidas como cianobactérias, são
encontradas em lagos, tanques e rios eutrofizados no mundo todo. Em países
tropicais, os tanques que são facilmente poluídos e expostos à altas temperaturas
com uma intensa luminosidade, estabelecem ótimas condições para o crescimento
desses microorganismos, os quais podem multiplicar-se até proliferarem causando
uma chamativa coloração verde na água com aparência de um caldo. Prever como e
onde as florações serão formadas é uma tarefa muito difícil (PITOIS; JACKSON;
WOOD, 2000; TYAGI et al., 1999).
A duração e o tempo de permanência das florações de cianobactérias
dependem largamente das condições climáticas da região. Em zonas temperadas,
florações de cianobactérias tendem a surgir com mais freqüência durante o final do
verão e começo de outono com duração de 2 a 4 meses. Em regiões do
Mediterrâneo ou clima subtropicais, as florações talvez possam iniciar mais cedo e
persistir por um tempo maior. Na França, pode permanecer por um período de 4
meses. No Japão, em Portugal, Espanha, África do Sul e sul da Austrália as
florações podem persistir por um período de 6 meses ou até mais. Em anos com
seca predominante, áreas com clima tropical e subtropical da China, Brasil e
Austrália, as florações de cianobactérias talvez possam ocorrer quase o ano todo
(CHORUS; BARTRAM, 1999).
Um tópico a ser abordado é a produção de toxinas pelos organismos.
Cianobactérias são bactérias gram-negativas capazes de produzirem um alto índice
de toxinas como metabólitos, tais como, as cianotoxinas. A classe das
cianobactérias compreende 150 gêneros e aproximadamente 2000 espécies. Os
organismos responsáveis pelo envenenamento liberado pela toxina da cianobactéria
incluem aproximadamente 40 gêneros, sendo os mais conhecidos Anabaena,
Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Microcystis, Nostoc e Oscillatoria
(Planktothrix) (CARMICHAEL et al., 2001).
18
Cianotoxinas são classificadas como biotoxinas responsáveis pelo
envenenamento crônico e agudo de animais selvagens, domésticos e seres
humanos.
Geralmente as toxinas de cianobactérias mais encontradas são as
microcistinas e nodularinas. Infelizmente, as toxinas produzidas pelas cianobactérias
não são removidas pelo processo do tratamento de água convencional como a
floculação, sedimentação, filtração e cloração, e também, o tratamento que inclui
permanganato de potássio ou cloreto (PITOIS; JACKSON; WOOD, 2001).
Para o desenvolvimento das cianobactérias é conveniente que as condições
favoráveis do meio estejam com temperatura entre 15 a 30ºC, pH neutro ou alcalino
(entre 6 e 9), que haja presença de nutrientes como nitrogênio e fósforo e também a
presença de vento constante.
As cianobactérias quando morrem ou envelhecem também liberam toxinas,
potentes e as vezes, letais. Entre as toxinas liberadas podemos destacar a
microcistina-LR, que faz parte do grupo hepatotóxica e anatoxina-a(s), saxitoxina e
neosaxitoxina, que são consideradas neurotóxicas. Para que ocorra a morte de um
ser humano, via ingestão de água contaminada devemos considerar: a concentração
da toxina (em água), a quantidade presente, espécie, tamanho e idade da toxina
(TOKARS et al., 1997).
O primeiro registro sobre intoxicação com cianotoxinas foi em 1878, o qual
relatou mortes por envenenamento de gados, porcos, cachorros, peixes e morcegos
no sul da Austrália. Casos de envenenamento de seres humanos que estavam
praticando natação e canoagem, também na Austrália, foram relatados.
Um caso lamentável e bem conhecido no Brasil foi o ocorrido em Caruaru-PE
no mês de fevereiro de 1996. Com problemas de mau fornecimento e escassez de
água na cidade, um caminhão pipa abasteceu o reservatório do Instituto de Doenças
Renais (IDR) com água contaminada com a toxina, ou seja, sem tratamento
adequado. Os pacientes apresentaram muitos sintomas, entre eles toxemia
(presença de produtos tóxicos no sangue), coagulopatia (distúrbio coagulação
sanguínea), lentidão no sistema nervoso central e insuficiência hepática, levando a
óbito 65 pessoas que estavam passando pelo tratamento de hemodiálise (ISMAIL;
BECKER; HAKIM, 1996).
Devido a este grave acidente e ao melhor conhecimento dessa toxina, o
Ministério da Saúde decretou a portaria nº 1469, “Monitoramento de Cianobactérias
19
e Cianotoxinas”, que foi publicada em 29 de dezembro de 2000. Atualmente existem
recomendações sobre como deve ser o processo de retirada desses organismos da
água para esta ser utilizada no consumo da população (CARLILE, 1994).
2.2 Microcistinas
As microcistinas são caracterizadas como heptapeptídeos cíclicos produzidas
por cianobactérias, principalmente dos gêneros; Anabaena, Microcystis, Oscillatoria,
Planktothrix e Nostoc.
A microcistina é uma das toxinas mais comuns entre as existentes, sendo
liberada pela espécie Microcystis aeruginosa. É estimado que possam variar entre
500 e 4000 Daltons, entretanto, a maioria dos membros conhecidos estão entre 900
e 1100 Daltons, sendo conhecidas 65 isoformas da espécie. A maior causa de
envenenamento originada pelas cianobactérias é devido á presença da Microcistina-
LR (leucina-arginina). A diferença estrutural das diversas espécies de microcistinas
consiste na variação do grau de metilação e nas variáveis isoméricas dos L-
aminoácidos. Na Figura 1, é mostrada a forma estrutural da molécula da
microcistina-LR, considerando as formas: Adda: Ácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-
trimetil-10-fenildeca-4,6-dienóico; Mdha: N-Metil-dehidro-alanina; Glu: Ácido-y-
glutamínico; Ala: Alanina; β-Me-Asp: Ácido β-β-metil-aspártico (CARMICHEL, 2001).
20
Figura 1. Fórmula estrutural da molécula Microcistina-LR (Leucina (X) + Arginina
(Y)). (CHORUS; BARTRAM, 1999).
A microcistina-LR é uma molécula pequena, composta por sete aminoácidos
conforme descrito no item anterior. A sua forma de atuação tem mostrado que a
microcistina-LR atua inibindo enzimas intracelulares denominadas fosfatases,
removendo os grupamentos de fosfato das proteínas. Isso promove uma alteração
na estrutura do esqueleto celular, modificando a arquitetura e conseqüentemente a
função das células do fígado. Estudos mostram que doses sub-letais das
hepatotoxinas provenientes de cianobactérias estaria associada ao desenvolvimento
de câncer hepático, uma suposição muita investigada na China, um país que
apresenta um alto índice no crescimento da neoplasia (presença de tumores) na
população, é a possibilidade de existir a presença de cianobactérias nos mananciais
de água que abastece a população (CARMICHAEL, 1994).
Microcistinas são solúveis em água, metanol e etanol, e insolúveis em
acetona, éter, clorofórmio e benzeno. Apresentam comportamento estável em água
de reservatório, pelo prazo menor do que 01 semana, mas são estáveis por um
período muito longo em água filtrada e desionizada. São resistentes a hidrólise
química ou oxidação com pH próximo de neutro, resistindo a diversas horas de
aquecimento. Em temperatura de aproximadamente 40ºC e pH baixo (pH =1) pode
21
ocorrer hidrólise lenta em um período de 10 semanas, e em pH maior que 9, a
hidrólise pode ocorrer em 12 semanas. Hidrólise química rápida pode ocorrer
apenas sob condições de laboratório que são improváveis de serem alcançadas no
ambiente aquático, por exemplo, em HCl 6M (CHORUS; BARTRAM, 1999).
Microcistinas podem ser oxidadas pelo ozônio e outros agentes oxidantes
fortes, são muitos estáveis sob luz solar natural. Na presença de radiação ultra-
violeta com comprimento de onda próximo da região de máxima absorção da
microcistina-LR e microcistina-RR, elas se decompõem rapidamente (HITZFELD;
HOGER; DIETRICH, 2000).
Desde o início dos estudos ambientais (KAEBERNICK; NEILAN, 2001) há 20
anos, a formação de “blooms” de cianobactéria tem sido destacada, ocasionando
grande desenvolvimento de técnicas de análise dessas toxinas, gerando importantes
parâmetros para estudos na saúde pública e ambiental. Desde então, determinações
da estrutura química e estudos ambientais de parâmetros do meio ambiente
atingindo a produção de toxina têm proporcionado diversos caminhos para a
regulação e função de algumas das funções dessa toxina.
Estudos avaliando o potencial para o uso de “cladocerans” (pequenos
crustáceos) em biomonitoramento de toxinas de cianobactérias através de duas
espécies de zooplankton (Daphnia gessneri e Moina micrura) foram cultivados em
laboratórios para o uso de bioensaios em teste agudo (48 horas) e crônicos (10
dias). Amostras de água foram armazenadas em dois reservatórios e diluídas em
água mineral em concentrações diferentes. Análises do fitoplâncton em amostras de
água revelaram que as cianobactérias do grupo dominante foram representadas
pelo gênero Anabaena, Cylindrospermopsis
e Microcistina (FERRÃO-FILHO et al.,
2008).
Amostras de tecido de fígado humano (amostras de pacientes com a
síndrome de Caruaru-Brasil, 1996) contaminadas com a microcistina Microcystis
aeruginosa foram estocadas por um período de 10 anos em condições apropriadas
(-70ºC). As análises foram realizadas empregando os métodos ELISA, LC/MS e
GC/MS. Os resultados confirmaram a presença de microcistina Microcystis
aeruginosa (MCYST) após o período de estocagem, indicando notável estabilidade
ao longo do tempo (YUAN; CARMICHAEL; HILBORN, 2006).
Florações de cianobactérias tóxicas em corpos d’água usadas como fonte
para consumo humano, recreação e irrigação são freqüentes nos dias atuais, devido
22
a eutrofização do ambiente. O monitoramento das linhagens tóxicas é importante
para prevenção dos efeitos adversos gerados por suas toxinas na saúde humana e
animal. Métodos que podemos considerar rápidos e sensíveis, como contagem de
células de cianobactérias, sua identificação por microscopia ótica e análises das
toxinas para detecção, são usados em estações de abastecimento de água e em
programas de monitoramento de mananciais de total interesse. Métodos moleculares
estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnóstico rápido e sensível da
presença de cianobactérias tóxicas (FIORE et al., 2005).
O tratamento de água para hemodiálise, cuja função é a remoção da toxina
microcistina, deve ser realizado seguindo a desionização e/ou osmose reversa,
respeitando os critérios e manutenção adequada. Esses critérios variam de acordo
com a característica do serviço (volume de água utilizado, tipo de membrana,
freqüência de regeneração, etc.)
Caso ocorra a presença de microcistina na água fornecida pelo sistema
público, independente da sua concentração, aconselha-se a dosagem da
microcistina na água pós desionização e/ou osmose reversa para garantir a
eficiência da regeneração e manutenção do tratamento de água de cada Unidade.
Após desionização e/ou osmose reversa da água a microcistina não deve ser
encontrada (BRASIL, 2000).
Entre as diversas técnicas utilizadas para a determinação de microcistina em
água, não há nenhuma técnica que possa fornecer uma medida exata da
concentração da toxina em toxina de microcistina-LR equivalente, quando ocorre a
mistura completa da toxina em amostras de água. Cada técnica gera um valor que
requer suposições para derivar um resultado em toxicidade equivalente
(NICHOLSON; BURCH, 2001). As técnicas devem ser selecionadas dependendo
das informações disponíveis, ou seja, com informações simples, métodos de
controle rápidos como microscópicos, podem ser usados para tomar uma decisão do
tipo de bioensaio ou técnica físico-química a ser seguida (CHORUS; BARTRAM,
1999).
Sem considerar o método de detecção a ser seguido, há um número de
critérios na determinação da concentração de toxina em termos de toxicidade
equivalente de microcistina-LR:
1) A toxina deverá ser identificada;
23
2) Um padrão analítico deve estar disponível, da toxina específica, para a
concentração a ser determinada.
Microcistinas podem ser degradadas rapidamente, fotoquimicamente (durante
processos analíticos) e microbiologicamente (MERILUOTO, 1997). Diversos
procedimentos analíticos empregam a técnica de cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) para a determinação de microcistinas (NICHOLSON; BURCH,
2001). As fases estacionárias mais utilizadas são a RP C18 e C8. Entretanto, há um
excelente estudo no qual foi utilizado a coluna C16 e comparada com a C18. A fase
móvel usada para a detecção de microcistina com a coluna C18 é aquosa, podendo
ser metanol ou acetonitrila (MERILUOTO; CODD, 2005).
Diferentes avanços em LC-MS (cromatografia líquida com detector de
espectrometria de massa) tem resultado em pequenos (baixo) limites de detecção,
por exemplo a aplicação do microbore-LC associada com um IT-MS (íon trap
mobility spectrometer) para a análise de microcistina em amostra de água do meio
ambiente. O preço da análise pela técnica LC-MS/MS é relativamente alto para
análises de rotina, portanto as determinações iniciais nas amostras são realizadas
freqüentemente pelo método ELISA. Amostras positivas e negativas selecionadas
são confirmadas por LC-MS/MS depois da extração da fase sólida (SPE) (SPOOF et
al., 2003). Com o uso de Daphnia sp. microcistinas podem ser detectadas
sucessivamente, entretanto, a cultura padrão é realizada com trabalho muito intenso
(CHORUS; BARTRAM, 1999).
Atualmente existem diversos métodos analíticos para detecção de
microcistina, onde podemos comparar: características, seletividade, limite de
detecção, rapidez, etc.(MERILUOTO; CODD, 2005).
Microcistinas são encontradas na maioria da população de Microcystis spp.,
na qual freqüentemente estas cianobactérias formam espumas em alta
concentração. Isto também ocorre com microcistina encontrada em Anabaena spp..
Entretanto, Planktothrix agardhii nunca formam espumas e P.rubescens geralmente
não formam espumas e, ainda, uma alta concentração de microcistinas são
formadas em florações dessa classe. Oito microcistinas foram isoladas de treze
classes de Oscillatoria agardhii coletadas em águas de diferentes lagos (todas as
classes produzem de 2 a 5 microcistinas). Atualmente, a presença de microcistina foi
mostrada em diversas classes de cianobactérias, denominadas Microcystis
(aeruginosa, wesenbergii e viridis), Anabaena (flos-aquae), Nostoc, Oscillatoria
24
(Planktothrix) (agardhii, rubescens e tenius), Anabaenopsis, Haphalosiphon
(hibernicus) e Aphanocapsa (cumulus) (CHORUS; BARTRAM, 1999) e
(CARMICHAEL, 2001). Recentemente, duas novas microcistinas, seco [D-Asp]
microcystin-RR e [D-ASP, D-Glu (Ome)] microcystin-RR, com a [D-Asp] microcistina-
RR, foram isoladas de uma floração tóxica P.rubescens em Lake Bled, Eslovênia
(GRACH-PROGREBINSKY; SEDMAK; CARMELI, 2004).
Fatores ambientais que talvez possam influenciar o crescimento e produção
de cianobactérias como: nutrientes, luz, pH e temperatura, são estudados em
culturas contínuas e em batch. A quantidade da produção de microcistina pela
população de cianobactéria em cultura pode ser diretamente proporcional na razão
do crescimento da toxina, onde os fatores ambientais foram limitantes para o mesmo
(CHORUS; BARTRAM, 1999).
Magalhães, De Soares e Azevedo (2001), mostraram o acúmulo de
microcistina em tecido de músculo de peixe e crustáceos em uma costa do litoral do
Brasil. O máximo encontrado em tecido de músculo de caranguejo foi 103,3 µg de
microcistina eq/kg e em tecido de peixe 39,6 µg/kg pelo método ELISA. Em outro
estudo mais recente, esses autores demonstraram acúmulo de microcistina em
tecidos de vísceras e músculos de peixes, (Tilapia rendalli), da Lagoa de
Jacarepaguá, no Rio de Janeiro, Brasil.
Microcistinas são toxinas intracelulares e enquanto estiverem vivendo dentro
de células, são degradadas lentamente. São liberadas na água apenas quando as
células morrem através do processo de tratamento de água, como por exemplo, a
percloração ou aplicação de algum algicida. Uma vez liberada na água, as
microcistinas podem persistir por um período relativamente longo antes de começar
a ser afetada pela biodegradação ou fotólise (CHORUS; BARTRAM, 1999; DUY et
al., 2000).
Chorus e Bartram (1999) relataram estudo sobre a ingestão de água
contaminada após a natação com a cianobactéria Microcystis spp.
Aproximadamente 852 pessoas participaram do estudo, onde foram constatadas
evidências epidemiológicas no efeito da saúde depois da ingestão da água após a
recreação. Resultados mostraram um elevado índice de diarréia, vômitos, úlceras na
boca, febres, irritação nos olhos e orelhas em um período de 7 dias após a
exposição. Sintomas aumentaram significativamente com a duração do contato da
água e a densidade da célula da cianobactéria.
25
Diversos casos, aproximadamente 26, diagnosticaram doenças de pele e
sintomas sistêmicos múltiplos associados com a exposição (alguns com água
potável) em águas de rio ou água de chuva. Essas ocorrências foram relatadas na
Austrália no período de 1991 a 1992. A água foi estocada em tanques abertos
contendo florações Anabaena (WHO, 1998).
Um estudo foi realizado no Brasil entre novembro/1995 a outubro/1996, com
50 amostras de água coletadas em 05 regiões do Estado do Paraná. Neste estudo
as amostras foram analisadas para detectar a presença da Microcystis spp. e
microcystins M.aeruginosa pelo método ELISA, obtendo resultado positivo em todas
as amostras. Amostras de 2 fontes águas usadas para recreação (natação-pesca),
coletadas em maio/1996 apresentaram alta contaminação de microcistina (6,38 e
10,0 µgL
-1
). Nesse trabalho nenhum caso de doenças em seres humanos foi
registrado (HIROOKA et al. 1999).
Na China, há registro de um grande número de pessoas com carcinoma
hepatocelular (HCC), sendo uma das doenças com maior número de incidências,
podendo variar geograficamente de região para região. Há presença abundante de
cianobactérias em água de superfície no sudeste da China, onde a incidência de
carcinoma hepatocelular é muito alta (CHORUS; BARTRAM 1999).
Humanos podem estar expostos oralmente através da água de beber ou
consumo de alimentos naturais com algas e dermatologicamente através do uso de
água para recreação de lagos e rios (RAO et al., 2002). O menor caminho é a
inalação pela exposição através do uso de água de chuva (CARMICHAEL, 2001).
Um caso de gastroenterite (infecção causada por vírus) pela contaminação
com cianobactéria aconteceu com a população de várias cidades ao longo do rio
Ohio, USA, em 1931. Em Harare, Zimbabwe, durante os anos de 1960-1965,
crianças viviam em uma área da cidade onde bebiam água de um reservatório
particular e desenvolviam gastroenterites a cada ano que surgiam florações de
Microcystis. Outras crianças na cidade com diferentes distribuições de água não
foram afetadas e nenhum agente infeccioso foi identificado (CHORUS; BARTRAM
1999).
26
2.3 Espectrofotometria
Todas as substâncias podem absorver energia radiante quando a luz as
atravessa sendo parte dessa energia absorvida. A energia radiante não pode
produzir algum efeito sem ser absorvida. A absorção da radiação eletromagnética na
regiões ultravioleta (100-380 nm), vísivel (380-780nm) e infravermelho (780nm-1mm)
dependem das estruturas das moléculas e é característica para cada substância
química (HARRIS, 2005).
2.4 Lei de Lambert Beer
A Lei de Lambert-Beer, ou também conhecida como Lei de Beer, expressa o
fundamento da espectrofotometria e é relacionada à absorção de radição pela
seguinte equação:
Absorbância = -log(P/P
0
)
Onde P
0
e P representam as intensidades dos feixes de radiação antes e
depois de passar através da solução.
A absorbância representa uma relação direta com a concentração da espécie
absorvente de radiação e é expressa pela seguinte equação:
A = ε.b.c
Onde absorbância (A) é diretamente proporcional à concentração da espécie
de interesse na amostra e que absorve radiação em uma dada faixa de comprimento
de onda. Geralmente, a concentração da amostra (c) é expressa em moles por litro,
o caminho óptico (b) é expresso em centímetros (cm), a grandeza (ε) é conhecida
como absortividade molar, sendo expressa nas unidades molL
-1
cm
-1
.
27
Esta equação, em geral, é conhecida como lei de Lambert-Beer, sendo a
absorbância uma grandeza adimensional. A absortividade molar (ε) é uma
característica da substância em estudo.
2.5 Análise por injeção em fluxo (FIA)
Em 1975, o pesquisador Jaromir Ruzicka deu início ao processo de análise
em fluxo identificado e conhecido pela sigla FIA, do inglês, “Flow Injection Analysis”
(RUZICKA; HANSEN, 1975). Como vantagem desse processo, podemos citar a
diminuição da participação do analista, visando minimizar o risco de contaminação
da amostra, causando redução dos custos, além de obter uma diminuição do
consumo de amostras e reagentes em relação aos procedimentos manuais.
A análise química por injeção em fluxo tem como princípio básico a introdução
da solução da amostra em um fluído transportador, sendo deslocada para a cela de
fluxo onde ocorre a detecção. Ao longo do percurso analítico, a solução da amostra
pode receber a adição de reagentes e passar por diversas etapas de
processamento. Primeiramente, foi utilizada uma seringa hipodérmica para a
inserção da alíquota da amostra no percurso analítico, dando origem ao nome do
processo “Flow Injection Analysis”. Inovações posteriores contribuíram para o
desenvolvimento desse processo e entre eles podemos citar a utilização do injetor
proporcional e da válvula rotatória (BERGAMIN FILHO et al.,1978b; RUZICKA et al.,
1977).
Sistemas de análises em fluxo são classificados em fluxo segmentado por ar,
monossegmentado e não-segmentado; e também pela forma como a alíquota da
amostra é introduzida no percurso analítico, podendo ser contínua ou
discreta/intermitente. A amostragem contínua pode ser segmentada por bolhas de ar
ou não, enquanto a amostragem intermitente pode ser feita por aspiração, por
bombeamento ou injeção da amostra (REIS et al., 1994). O fluxo gerado por
aspiração contínua da amostra e reagente pode ser segmentado ou não,
correspondente à técnica de análise em fluxo contínuo (CFA). Neste caso, a zona da
amostra é segmentada pela adição controlada de várias bolhas de ar (KORN et al.,
1996). A inserção da amostra em um sistema de fluxo não-segmentado abrange os
28
sistemas FIA, sendo que em geral a solução transportadora é um fluído inerte e a
solução do reagente é adicionada por confluência (ALMEIDA et al., 2000). Em
sistema de análise baseado no processo de fluxo monossegmentado (MSFA), a
alíquota da solução da amostra é inserida no percurso analítico intercalada entre
duas bolhas de ar (SMIDERLE; REIS; ROCHA, 1999).
Entre as inovações relacionadas ao processo FIA podemos citar: sistema com
zonas coalescentes para minimizar o consumo de reagentes (BERGAMIN et al.,
1978b); extração por solvente orgânico para determinação de molibdênio em plantas
(BERGAMIN FILHO et al., 1978a); emprego do injetor proporcional na determinação
de cálcio, magnésio e potássio em digeridos de plantas (ZAGATTO et al., 1979a),
alumínio (REIS et al., 1979), nitrogênio total e fósforo também em plantas (REIS et
al., 1980); determinação simultânea de nitrato e nitrito em água (GINÉ et al., 1980);
pré-concentração com resina de troca iônica (BERGAMIN FILHO et al., 1980) para
determinação de amônio em água; adição de padrão (GINÉ et al., 1983) para
determinar nitrato em extrato de plantas; sistema monossegmentado para minimizar
a dispersão (REIS et al., 1988); dissolução eletrolítica, possibilitando análise de
amostras sólidas (metálicas) (BERGAMIN et al., 1988).
A versatilidade do sistema de análise em fluxo permitiu sua incorporação em
diversas áreas da química analítica: absorção atômica com chama (ZAGATTO et al.,
1979b); espectrometria de emissão atômica com plasma acoplado indutivamente
(JACINTHO et al., 1981); fluorescência atômica (MOREDA-PINEIRO; CERVERA;
DE LA GUARDIA, 1997); quimiluminescência (ZAITSU; NAKAYAMA; OHKURA,
1987), amperometria (ZHENG; ZHAN, 1999), espectrometria de plasma acoplada a
massa (MICHALOWSHI et al., 1993), potenciometria com eletrodos íons seletivos
(VIEIRA et al., 2003), etc.
29
2.6 Multicomutação
Com o passar do tempo surgiram modificações e inovações no processo FIA,
e entre tais inovações destacamos o processo de multicomutação em sistemas de
análise por injeção em fluxo (MCFIA) (REIS et al., 1994). O módulo de análise em
um processo FIA usual tem como dispositivo central o injetor proporcional ou
válvulas rotatórias de 6 e 8 vias (RUZICKA et al., 1977 e MURAKI et al., 1992). Em
sistema de análise baseado no processo de multicomutação o módulo de análise
tem como dispositivos básicos um conjunto de válvulas solenóides. O injetor
proporcional, ou as válvulas rotatórias tem dois estados de repouso com movimento
e solidário entre os dois estados. Desse modo, o deslocamento da parte móvel
produz uma comutação entre todas as linhas de entrada e saída. Então, o sistema
de análise em fluxo é projetado em função desta característica.
Em um sistema de análise em fluxo baseado no processo de multicomutação,
o módulo de análise é constituído por um conjunto de válvulas solenóides, em geral
uma para cada solução necessária ao procedimento analítico. As válvulas
solenóides são dispositivos eletro-mecânico, as quais podem ser organizadas no
módulo de análise para trabalhar como unidade de comutação discreta.
Os volumes das alíquotas das soluções da amostra e dos reagentes inseridos
no percurso analítico são definidos pelo tempo de acionamento das válvulas
solenóide e pela vazão do bombeamento ou aspiração das soluções. Estes
parâmetros podem ser ajustados por software, e sem reconfigurar a estrutura física
do módulo de análise. As válvulas solenóides foram empregadas para introdução de
pequenas alíquotas da amostra e das soluções de reagentes no percurso analítico
de modo independente. Esta técnica permite controlar de maneira independente, a
inserção no percurso analítico das alíquotas da amostra e das soluções dos
reagentes (ROCHA et al., 2002).
30
Figura 2. Modelo do processo de amostragem binária. Ilustração do aumento do
número de interfaces amostra/reagente1/reagente2 quando se empregam diferentes
ciclos de amostragem. fluído transportador, amostra, reagente 1, reagente
2 e produto da reação.
2.7 Sistemas com o processo de multicomutação
No primeiro trabalho sobre multicomutação (REIS et al., 1994), podemos citar
a determinação espectrofotométrica de Fe(III) em material digerido de plantas,
baseada na reação com tiocinato de potássio. Como parâmetros relevantes
envolvidos no conceito de multicomutação foram discutidos alguns aspectos básicos
referentes ao processo: emprego de um único canal de bombeamento para inserção
das alíquotas de amostra e do reagente e deslocamento da zona da amostra para o
detector; inserção de pequenos volumes controlados pelo tempo de inserção e
inserção intermitente, evitando o desperdício de reagente. Os resultados obtidos
foram comparados com os obtidos por espectrometria de emissão ótica com plasma
acoplado indutivamente (ICP-OES).
Dando seqüência ao processo de multicomutação, foi proposta a
determinação de creatinina em urina (ARAUJO et al., 1995) baseada na reação de
Jaffe´s. O módulo de análise foi construído em função da cinética da reação, a qual
era lenta, permitindo a parada de fluxo. O sistema proposto apresentou velocidade
analítica de 24 determinações por hora.
Tr
Tr
A
1 ciclo de amostragem
Tr Tr
2 ciclos de amostragem
A R1
Tr
Tr
4 Ciclos de Amostragem
R1
R1
A
4 ciclos de amostragem
R2
R2
R2
Tr
Tr
A
1 ciclo de amostragem
Tr Tr
2 ciclos de amostragem
A R1
Tr
Tr
4 Ciclos de Amostragem
R1
R1
A
4 ciclos de amostragem
R2
R2
R2
31
Um trabalho com procura binária foi proposto por Korn et al. (1995), em um
sistema de titulação espectrofotométrica empregando multicomutação, o qual
permitia encontrar o ponto final da titulação sem o emprego de curva analítica. O
procedimento analítico foi aplicado à titulação de um ácido forte (HCl) com base forte
(NaOH), usando fenolftaleína como indicador. Uma titulação completa era realizada
em menos de 3 minutos, tendo um consumo médio de 2 mL de titulante por
determinação, e a precisão dos resultados era em torno de 99,99%.
Um módulo de análise para implementar a determinação espectrofotométrica
seqüencial de amônio e fosfato em amostras de digeridos de plantas foi proposto por
Kronka et al. (1996). As determinações foram baseadas nos métodos de azul de
molibdênio e azul de indofenol. Neste módulo de análise seis soluções distintas
foram processadas empregando apenas um único canal de bombeamento.
Martelli et al. (1997) propuseram um sistema de análise em fluxo para
determinação espectrofotométrica de níquel em ligas metálicas e na especiação de
ferro(III) /ferro(II) em águas de rio, utilizando persulfato de potássio imobilizado em
resina aniônica AG1-X8 como agente oxidante. O diagrama de fluxo foi desenvolvido
para que a oxidação da espécie de interesse e o recondicionamento da resina
pudessem ser efetuados em linha. A determinação de níquel baseou-se no método
da dimetilglioxima, apresentando uma freqüência analítica de 80 determinações por
hora. Na determinação de Fe(III), foi usado tiocianato de potássio como reagente
cromogênico, alcançando uma frequência analítica de 60 determinações por hora.
Os resultados obtidos empregando o procedimento proposto para Fe(II) foram
comparados com aqueles obtidos com o método espectrofotométrico, baseado na
reação com 1,10 – fenantrolina.
Um procedimento para determinação de boro em material digerido de plantas
foi proposto por Tumang et al. (1998), empregando a reação com o reagente
cromogênico azometina-H. Tendo em vista que a cinética da reação era lenta, o
módulo de análise foi projetado para permitir a retenção de múltiplas zonas de
amostras. Empregando esta estratégia, foi possível estender o tempo de
desenvolvimento da reação para 200 s, e mesmo assim obtendo uma freqüência de
amostragem 36 determinações por hora.
Outro procedimento de análise em fluxo com amostragem binária foi
desenvolvido por Kronka e Reis (1998) para a determinação espectrofotométrica
32
sequencial de ferro e alumínio em material digerido de plantas, utilizando reagentes
cromogênicos, 1,10 fenantrolina e cromoazurol S, respectivamente.
Um sistema explorando amostragem binária foi desenvolvido por Paim et. al.,
(1998) para a determinação espectrofotométrica de ácido ascórbico em fármacos. A
reação foi baseada na destruição do complexo [Fe(SCN)
n
]
(+3-n)
n
pela redução do
Fe(III) com ácido ascórbico, sendo necessário manter um excesso do reagente
cromogênico (SCN
-
) em toda extensão da zona da amostra.
Um sistema em fluxo monossegmentado por ar implementado empregando
multicomutação foi proposto por Smiderle; Reis e Rocha (1999) para determinação
espectrofotométrica de Mn(II) em digeridos de soja. Neste caso, a reação tinha
cinética lenta, o sistema monossegmentado permitiu que várias zonas de amostra
fossem deslocadas através de um reator longo de 500 cm
para permitir o
desenvolvimento da reação, sem risco de interpenetração causada pela dispersão.
Embora, o tempo de residência da zona da amostra tenha sido de 5 min., a
frequência analítica foi de 50 determinações por hora.
Um procedimento para titulação automática em sistema de fluxo
monossegmentado com amostragem binária foi desenvolvido por Martelli et al.
(1999). A titulação potenciométrica ácido-base implementada, permitia que o volume
da solução da amostra fosse mantido constante e a fração volumétrica do titulante
variada, mantendo-se o volume final constante e adicionando-se diluente.
Comitre e Reis (2000) desenvolveram um procedimento simples e rápido para
realizar a determinação de etanol em bebidas alcoólicas (uísque, conhaque e
aguardente de cana) baseado em multicomutação e amostragem binária. O método
foi baseado na oxidação do etanol pelo dicromato de potássio, apresentando 40
determinações por hora.
Um procedimento para titulação espectrofotométrica automática de ácido
ascórbico em sucos de frutas e refrigerantes, baseada na variação da fração
volumétrica, utilizando a reação com 1,2 dicloroindofenol foi explorada por Paim e
Reis (2000). As etapas englobando as decisões dos volumes das soluções foram
definidas em função da resposta do detector, onde a freqüência de amostragem
apresentada foi de 5 e 30 determinações por hora, dependendo do número de
etapas até chegar ao final da titulação.
Um sistema em fluxo com a multicomutação para determinação
espectrofotométrica de ácido láctico em material ensilado empregando a reação
33
enzimática foi desenvolvido por Tumang, Borges e Reis (2001). O método
espectrofotométrico baseado na reação da enzima peroxidase oxidava o peróxido de
hidrogênio formado pela primeira reação enzimática, promovendo a oxidação e
condensação dos reagentes 4-clorofenol e 4 aminoantipirina pela enzima peroxidase
e o produto da reação, a quinoneimina, sendo monitorado a 510 nm.
Borges, Martelli e Reis (2000), desenvolveram um procedimento automático
de titulação potenciométrica baseada na técnica de análise em fluxo
monossegmentado, utilizando o conceito de multicomutação e amostragem binária.
O desempenho do sistema proposto foi avaliado para chegar até o ponto final na
inserção contínua, durante o percurso analítico de diferentes misturas entre
alíquotas de solução de amostra e de titulante. O volume da zona de amostra foi
mantido constante e as diferentes misturas foram separadas por bolhas de gás,
possibilitando a discriminação do sinal em relação a cada mistura.
Martelli et al. (2001), propuseram um sistema analítico para determinação de
ácido láctico em iogurte por quimiluminescência utilizando um espectrofotômetro UV-
Vis como detector. A reação enzimática com ácido lático produzida pela reação do
luminol com peróxido de hidrogênio, catalisada pelo hexacianoferrato(III) gerava
radiação eletromagnética (quimiluminescência) com máximo em torno de 420 nm,
sendo detectado pelo espectrofotômetro, o qual operava com a lâmpada desligada.
Tumang, Paim e Reis (2002), propôs um procedimento de titulação
espectrofotométrica automática em fluxo visando à determinação de acidez total em
material ensilado baseado no conceito de multicomutação e amostragem binária.
Este trabalho resultou em uma estratégia para minimizar problemas com amostras
coloridas, permitindo que as mesmas fossem analisadas sem nenhum tratamento
prévio.
O procedimento de extração líquido-líquido em um sistema de análise em
fluxo para a determinação espectrofotométrica de molibdênio em plantas proposto
por Comitre e Reis (2003), empregou o processo de multicomutação para minimizar
o consumo de reagentes e de solvente orgânico usado na extração. O método
baseado na reação do molibdênio com tiocianato, seguido pela redução com cloreto
estanhoso e extração com álcool isoamílico, apresentou uma redução do volume de
solvente de 85% em comparação com sistema FIA usual, desenvolvido por
Bergamin Filho et al. (1978a).
34
Sistemas de injeção em fluxo visando à determinação de parâmetros
metabólicos tais como 3-hidroxibutirato (PIRES et al. (2003a), glicose (PIRES et al.
(2003b) e colesterol (PIRES et al. (2003c)) em soro de sangue animal foram
desenvolvidos baseados no conceito de multicomutação em fluxo, utilizando válvulas
solenóides de três vias. Os métodos propostos foram baseados em reações
enzimáticas, sendo que as enzimas foram imobilizadas em suporte sólido, os quais
foram acoplados ao percurso analítico do módulo de análise. Neste caso, foi
empregado um canal de bombeamento para cada solução, tendo em vista que a
coluna de enzima apresenta um grande aumento da impedância hidrodinâmica do
módulo de análise, o que inviabiliza a possibilidade de deslocamento das soluções
por aspiração empregando um único canal de bombeamento. Entretanto, a adição
discreta das soluções de reagentes manteve a condição de baixo consumo e
redução do volume de efluente produzido.
Para a determinação de proteína total e albumina em plasma de sangue
animal, Luca e Reis (2004) propuseram diferentes sistemas, onde o primeiro era
constituído de injetor proporcional e válvula solenóide para a determinação de
proteína total, possibilitando a diluição em linha e o segundo era baseado no
conceito de multicomutação e amostragem binária, permitindo que uma alíquota da
solução da amostra inserida fosse dividida através de dois percursos analíticos
distintos, possibilitando as determinações de albumina e proteína total.
Fernandes et al. (2004), apresentaram um sistema de análise em fluxo para
determinação de glicerol em vinho sem tratamento prévio da amostra. O sistema em
fluxo empregou o conceito de multicomutação, onde a determinação de glicerol foi
baseada na reação com glicerol desidrogenase na presença do cofator NAD
+
,
resultando na oxidação do NAD
+
para NADH, monitorado a 340 nm.
Outro procedimento automático baseado em multicomutação foi desenvolvido
por Fernandes e Reis (2004) para determinação de etanol. O procedimento
empregou detecção por quimiluminescência, usando um detector constituído de uma
cela de fluxo acoplada entre dois fotodiodos formando uma unidade compacta que
foi acondicionada em uma caixa metálica. O procedimento para determinação de
etanol foi baseado na reação enzimática usando álcool oxidase, produzindo
acetaldeído e peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com o luminol
catalisado pelo hexacianoferrato de potássio, produzindo uma reação de
quimiluminescência, apresentando máximo de emissão em torno de 420 nm.
35
Comitre e Reis (2005) propuseram um procedimento de extração líquido-
líquido em um sistema de análise em fluxo para a determinação espectrofotométrica
de chumbo em plantas, baseado no processo de multicomutação para minimizar o
consumo de reagentes e solventes. O método foi baseado na reação do chumbo
com a ditizona formando um quelato, o ditizonato de chumbo, solúvel em tetracloreto
de carbono (CCl
4
), monitorado a 520 nm empregando um fotômetro baseado em
LED (Light Emitting Diode/Diodo Emissor de Luz) como fonte de radiação.
Um equipamento portátil para determinações seqüências de nitrato, nitrito,
Fe(II) e Fe(III) em águas de rios foi desenvolvido por Feres e Reis (2005). Os
procedimentos foram baseados no processo de multicomutação em fluxo, e a
detecção fotométrica foi efetivada empregando um fotômetro desenvolvido no
laboratório empregando um fototransistor (Til78) como detector e um LED (λ = 535
nm) como fonte de radiação.
Um procedimento automático baseado em multicomutação foi desenvolvido
por Fernandes e Reis (2006) para determinação de ácido tartárico em amostras de
vinho tinto. Foi empregado um módulo de análise de linha única, e o procedimento
foi baseado na reação com o vanadato e a detecção por espectrofotometria a 490
nm. O consumo de reagente apresentado neste trabalho, apresentou uma redução
em torno de 65% comparada com trabalhos anteriores.
Sistema de análise em fluxo utilizando fototransistor na determinação de
etanol em vinho tinto foi explorado por Borges, Frizzarin e Reis (2006), onde o
fototransistor funcionou como amplificador de corrente controlada pela absorção de
radiação eletromagnética.
36
2.8 LED como fonte de radiação em fotometria
Os diodos emissores de luz (LEDs) são dispositivos de baixo custo, e
atualmente são amplamente usados em detecção fotométrica. Como característica
importante apresentam emissão com ótima estabilidade em comprimento de onda,
intensidade do feixe de radiação, e largura espectral em torno de 30 nm
(DASGUPTA et al., 1993).
O LED é um diodo semicondutor (junção P-N) e quando é energizado emite
radiação eletromagnética. São empregados em maior escala em fotometria, os que
emitem na região visível (400 – 700 nm) do espectro eletromagnético. A radiação
emitida não é monocromática (como por exemplo, um laser), mas é composta por
uma banda espectral considerada estreita (∆λ ≈ 30 nm ), produzida pelas interações
energéticas do elétron. O processo de emissão de luz é denominado
eletroluminescência. Na tabela a seguir, são apresentados os LEDs mais utilizados
em instrumentação analítica e suas respectivas características de emissão
(BOYLESTAD, NASHELSKY, 1972).
Tabela 1. Características de LEDs encontrados comercialmente (DASGUPTA et al.,
1993).
LED Composição
λ
max
(nm)
Faixa de intensidade (nm)
Azul GaN 435,482 418-510
Verde GaP 565 548-576
Amarelo GaAsP/GaP 583 565-601
Vermelho GaAsP 655 643-667
Infravermelho GaAs 940 929-978
37
Fotodiodos ou fototransistores são geralmente utilizados como detectores da
radiação emitida pelos LEDs. Os fotodiodos têm uso mais geral, pois apresentam
menor tempo de resposta e maior faixa linear para a radiação incidente
(TROJANOWICZ; WORSFOLD; CLINCH, 1988). Para uma melhor performance do
fotômetro, utiliza-se fotodetectores conectados a amplificadores de sinal.
Um sistema FIA acoplado a um fotômetro com três LEDs para determinação
de ferro, zinco e alumínio utilizando o reagente cromogênico alaranjado de xilenol foi
proposto por Trojanowicz; Szpunarlobinska e Michalski (1991). Os LEDs verde,
amarelo e vermelho foram alinhados a um fotodetector e a radiação emitida foi
selecionada realizando as medidas fotométricas nas três regiões do espectro.
Sistemas de análise em fluxo para determinação simultânea de fosfato e
amônio em amostras de águas naturais, empregando dois fotômetros baseados em
LEDs como fonte de radiação, e fotodiodos como detectores foram propostos por
Fernandes e Reis (2002) e Rocha, Martelli e Reis (2004). Os sistemas utilizaram
LEDs vermelhos com máximo de emissão em 660 nm. Para garantir a sensibilidade
do método, Fernandes e Reis (2002) propuseram o aumento do tempo de residência
da zona de amostra, enquanto Rocha, Martelli e Reis (2004) utilizaram resinas de
troca aniônica e catiônica para a pré-concentração dos analitos.
O emprego de fotômetros baseados em LEDs e fotodiodos associados a
sistemas de análises em fluxo é um recurso que tem sido empregado para
miniaturização dos sistemas analíticos (DAYKIN; HASWELL, 1995; FERES; REIS,
2005), monitoramento de processos (HUANG et al., 1992; GABRIEL et al., 1998) e
medidas em campo (CLINCH; WORSFOLD; CASEY, 1987).
38
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Equipamentos e acessórios
A determinação de microcistina envolve muitas etapas sendo o volume final
de 200 µL, portanto não é possível empregar as condições de leitura usuais em
sistemas de análise química em fluxo, onde o volume usado por determinação, em
muitos casos, é maior do que este, mesmo quando a cela de fluxo tem volume da
ordem de 30 µL. O acoplamento do módulo de análise ao sistema de detecção
requer um volume bem maior. Visando contornar essa dificuldade, desenvolveu-se
os módulos de análise baseado no processo de multicomutação em análise por
injeção em fluxo (MCFIA) (LAVORANTE; FERES; REIS, 2006).
Na montagem dos módulos de análises foram empregados os seguintes
dispositivos: duas válvulas solenóide de estrangulamento modelos PN161P011,
PN161P021 (Nresearch); uma válvula solenóide de três vias, modelo PN161T031
(Nresearch) uma bomba de seringa construída no laboratório; uma cela de fluxo
projetada para este procedimento. Como fonte de radiação para detecção
fotométrica foi empregado um LED de alto brilho (λ
max
= 458 nm). Na detecção
fotométrica foram empregados dois dispositivos, um fotodetector modelo 70316
(Oriel Instruments) com ganho de 10
8
, e um fotômetro construído no laboratório para
este projeto, empregando o fotodetector OPT301 (BURR BRAWN) e o amplificador
instrumentação AD524 (Analog Devices), o qual foi configurado para ganho de 100
vezes. Para controlar o módulo de análise e realizar a aquisição de dados foi
empregado um microcomputador com um programa escrito em Quick BASIC 4.5. O
controle do motor de passo da seringa e o acionamento das válvulas solenóide
através da porta de impressora do microcomputador, foi realizado empregando uma
interface de potência baseada no circuito integrado ULN2803. Uma fonte de tensão
estabilizada em -12 e +12 V foi empregada para alimentar os dois fotômetros. A
conversão de sinal de analógico para digital foi realizada utilizando um multímetro de
bancada Minipa, modelo ET2231, resolução de 0,1 mV, o qual foi acoplado ao
microcomputador através da interface serial RS232. Uma bomba de seringa
39
construída no laboratório empregando um motor de passo DM 51 (Digimoto) e um
seringa de plástico com volume de 1mL também foram empregados.
3.2 Detalhamento da cela de fluxo
Na figura 3 é mostrado a cela de fluxo em corte, permitindo visualizar os
detalhes de sua configuração. O núcleo da cela é um tubo de vidro de borosilicato
com diâmetros internos e externo de 1,0 e 5,0 mm, respectivamente. Os dois
conjuntos de placas (Pv) foram usinadas de forma que ao serem ajustadas por meio
dos parafusos permitindo uma rigidez mecânica, além da vedação necessária para o
bombeamento de fluído sem vazamento.
Figura 3.Vista em corte da cela de fluxo. B = tira de borracha, espessura 0,5 mm;
P = parafusos; Tv = tubo de vidro,comprimento 40 mm, diâmetro externo 5 mm,
diâmetro interno 1,0 mm, An = anéis de vedação do tipo O´ring; Pv = placas de PVC,
superfície 5 X 10, espessura 5 mm; Cv = cilindros de vidro, 1,0 mm de diâmetro e 15
mm de comprimento; I
1
e I
2
= feixes de radiação entrando e saindo da cela de fluxo,
respectivamente; Ef e Sf = entrada e saída de fluído, tubos de Tygon com diâmetro
interno de 0,5 mm; LED
1
= λ
max
458 nm; LED
2
= λ
max
850 nm Det = fotodetector da
Oriel ou o fotodector construído para este trabalho.
40
Para simplificar a figura, foi omitido o acoplamento mecânico do LED e do
fotodetector à cela de fluxo, os quais formavam uma unidade compacta. Os tubos de
entrada e saída de fluído (Ef e Sf) foram colados nas placas de PVC em contato com
as tiras de Borracha (B) e passavam livre através da placa externa. Em cada tira de
borracha foi aberto um canal de 1 mm de largura para permitir o escoamento de
fluído através da cela de fluxo.
Esta cela de fluxo tem um caminho óptico de 40 mm e diâmetro interno de 1,0
mm, portanto o volume é de 32 µL. As extremidades da cela foram alargadas para 2
mm, tendo como objetivos encaixar a ponta do cilindro vidro para molhar a
transmissão de radiação e evitar retenção de bolhas de gás, em geral difícil de
serem removidas por causa do fluxo de pequeno diâmetro.
3.3 Detalhamento do fotômetro
Na figura 4 é mostrado o diagrama do fotômetro desenvolvido para este
trabalho. Este fotômetro tem como núcleo básico o fotodetector OPT301, o qual
responde na faixa de comprimento de onda do ultravioleta próximo (λ = 350 nm) ao
infravermelho próximo (λ = 1100 nm).
Figura 4. Diagrama do fotômetro. As linhas tracejadas indicam o invólucro do
fotodetector OPT301. AD524 = amplificador de instrumentação; S
0
= saída de sinal
em mV.
41
Este dispositivo tem um sistema de amplificação interna com ganho
estabelecido pela resistência de 1 MΩ, para isso devemos conectar externamente o
pino 4 ao pino de saída (5). O fabricante fornece ao usuário a possibilidade de
trabalhar com ganho mais alto, conectando externamente o pino 2 ao pino 5,
empregando um resistor de valor diferente, e neste caso, empregamos um resistor
de 20 MΩ. Seria possível aumentar o ganho de sinal empregado na malha de
realimentação um resistor de valor mais elevado, entretanto, verificou-se que o
aumento do nível de ruído inviabilizava este recurso, então optamos pelo emprego
um estágio de amplificação adicional. Neste estágio, empregamos um amplificador
de instrumentação, o qual trabalha no conceito de amplificação diferencial e tem
grande capacidade de rejeição de ruído. O amplificador de instrumentação AD524
permite escolher o ganho de sinal de 10, 100 e 1000 vezes. Neste caso,
selecionamos ganho de 100 vezes, conectando entre si os pinos 3 e12.
Figura 5. Diagrama da fonte de alimentação do fotômetro. D
1
, D
2
, D
3
e D
4
=
diodos retificadores para corrente de 1A; C
1
e C
3
= capacitores eletrolíticos de 1000
µF , tensão de trabalho 30 V; E, A, S = entrada, ajuste e saída, respectivamente; C
2
e C
4
= capacitores de tântalo de 2 µF. Terminais de saída do transformado 12 +12 V
e corrente de 1 A.
Os dois fotômetros empregados necessitavam de diferenças de potencial de -
12 V e + 12 V. Um parâmetro crucial em sistema de monitoramento de sinais é o
ruído eletrônico onde a fonte de alimentação pode ser um potencial causador de
ruído. As condições de alimentação do fotômetro da Oriel eram as mesmas do
42
fotômetro mostrado na Figura 4, portanto ambos foram alimentados com a mesma
fonte, a qual é mostrada na Figura 5. Esta fonte atende as condições requeridas,
estabilidade das diferenças de potenciais -12,0 V e +12,0 V e baixo nível de ruído.
As diferenças de potenciais de +12 e -12 V eram ajustadas através dos
resistores variáveis acoplados aos terminais de ajuste dos dois reguladores de
tensão.
3.4 Detalhamento das interfaces eletrônicas
O sinal de controle enviado pelo microcomputador através de cada linha da
porta de impressora é no padrão TTL (Transistor-Transistor- Logic), portanto em
nível lógico alto obedece a condição 2,5 < sinal <=5 V.
Figura 6. Diagrama da Interface de controle. d
0
, d
1
, d
2
, ..., d
7
= linhas de controle
conectadas à porta de impressora; MP = motor de passo; R
1
, R
2
, ..., R
5
= resistores
2,5 kΩ, 1/4W, R
6
, R
7
e R
8
= resistores variáveis de 5k Ω; V
1
= válvula solenóide de 3
vias. LED máximo de emissão em 458nm. Os LEDs acoplados aos resistores R
1
, R
2
,
..., R
5
tem a função de indicar que quando está aceso a respectiva linha está
ativada.
43
A intensidade da corrente fornecida em cada linha de controle é da ordem de
poucos miliamperes. O motor de passo empregado na seringa e as válvulas
solenóide necessitam de diferença de potencial de 12 Volts e intensidade de
corrente acima de 100 mA. Em visto disso, foi necessário empregar uma interface de
potência para permitir o controle dos dispositivos citados, através dos sinais gerados
pelo microcomputador e enviados através da porta de impressora. As interfaces
representadas nos diagramas das Figuras 6 e 7 permitem controlar diferença de
potencial de 12 V, tendo uma diferença de potencial de entrada no padrão TTL.
Figura 7. Diagrama da Interface de controle. R
6
, R
7
= resistores variáveis de 5k Ω;
LED
1
e LED
2
, λ
max
= 458 e 850 nm, respectivamente. Os outros símbolos já foram
definidos na Figura 4.
O circuito integrado ULN2803 pode drenar uma corrente de 400 mA em cada
linha. Os terminais de d
0
a d
7
indicados neste diagrama correspondem aos bits de D
0
a D
7
da porta da impressora, os quais se têm acesso através dos terminais de 2 a 9
do conector DB25. O terminal 9 foi ligado ao terminal 18 do conector DB25. Esta
interface foi acoplada ao computador usando um cabo (flat cable) de 10 vias.
Quando empregamos LEDs como fonte de radiação eletromagnética em
fotometrias, podemos ajustar a intensidade de emissão em função do fundo de
escala desejado. Visando encontrar o fundo de escala mais apropriado, o LED foi
acoplado à interface de controle para permitir a seleção de fundos de escala. Nesta
configuração, 3 valores de fundo de escala eram obtidos ativando por software as
linhas de controle d
6
, d
7
e d
8
do circuito integrado ULN2803 (Figura 6). Os valores
44
dos fundos de escala de 1200, 1950 e 2980 foram obtidos ajustando os resistores
variáveis R
6
, R
7
e R
8
.
Na descrição da cela de fluxo (Figura 3) foi indicado que o diâmetro interno é
de 1,0 mm. Bolhas de ar causam grandes distorções na detecção fotométrica
empregando sistemas de análise em fluxo, sendo que micro-bolha é muito difícil de
ser removida, principalmente em celas de fluxo de pequeno diâmetro interno. A
leitura de sinais em 2 comprimentos de onda é um recurso que tem sido usado para
contornar esse transtorno (ZAGATTO et al., 1990).
Imaginando que poderíamos ter esse tipo de problema, empregamos uma
interface mostrada na Figura 7 semelhante à Figura 6, diferenciando no arranjo do
acoplamento dos LEDs. No caso anterior, tínhamos um LED com 3 fundos de escala
selecionados por software, e neste caso temos dois LEDs acoplados aos bits d
6
e d
7
,
também selecionados por software. Utilizando este arranjo, o monitoramento da
amostra poderia ser realizado em 458 e 850 nm.
Para alimentar estas interfaces (Figura 6 e 7) também era necessário dispor
de uma de alimentação apropriada, isto é, capaz de fornecer a corrente necessária
para alimentar as bobinas do motor de passo mantendo constante uma diferença de
potencial de 12 V. O diagrama da fonte de alimentação desta interface é mostrado
na Figura 8 e é formada por 2 reguladores de voltagem para garantir o fornecimento
de corrente necessária, mantendo a diferença de potencial, a qual pode ser ajustada
através do resistor variável acoplado aos reguladores de voltagem LM317. Neste
caso foi empregado um transformador de voltagem com entrada de 127 V e saída -
12+12V e corrente de 2 A.
45
Figura 8. Diagrama da fonte de alimentação da interface de controle. D
1
e D
2
=
diodos retificadores para 3A; C = capacitor eletrolítico de 2000 µF, tensão de
trabalho 30 V; E, A e S = entrada, ajuste e saída, respectivamente do LM317.
3.5 Descrição da bomba de seringa
Na Figura 9 é mostrado o diagrama da montagem da bomba de seringa. Ao
eixo do motor de passo foi acoplado um parafuso, o qual foi usinado em latão com
diâmetro de 15 mm e rosca com passo de 1 mm. Uma porca para o fuso foi usinada
no centro de uma placa de latão de 10 cm de comprimento, 5 cm de largura e 0,5 de
espessura, onde foi fixado o êmbolo da seringa, conforme mostra a Figura 9.
O corpo da seringa foi preso por parafuso a uma placa de acrílico fixada na
placa de PVC usada como base de sustentação do motor de passo. Quando o motor
de passo era colocado em funcionamento, o parafuso girava solidário ao eixo do
motor, e deslocava o êmbolo da seringa para frente ou para trás, com o objetivo de
encher ou esvaziar a seringa, dependendo direção do movimento.
46
Figura 9. Desenho da bomba de seringa. Mp = motor de passo, Pm = parafuso
com rosca de passo de 1 mm; P = parafusos; Sp = placas de suporte; Se = seringa,
volume de 1mL.
O controle do interfaceamento do motor de passo, mostrado nas Figuras 6 e
7, foi realizado através do microcomputador, onde se observa que o mesmo foi
acoplado ao circuito integrado ULN2803 para ser controlado através dos bits d
0
, d
1
,
d
2
e d
3
. Nesta configuração, quando o microcomputador enviava seqüencialmente
aos bits d
0
, d
1
, d
2
e d
3
sinais de controle (pulsos 5 v), o motor girava no sentido
horário (direita). Quando a seqüência de pulsos era invertida d
3
, d
2
, d
1
e d
0
, o motor
girava no sentido anti-horário (esquerda).
O motor empregado tem um ângulo de rotação 7,5 graus por pulso, dessa
forma com uma sequência de 4 pulsos, o ângulo de rotação era de 30 graus. A
rosca do parafuso acoplado ao eixo do motor foi usinada com passo de 1,0 mm,
portanto eram necessários 48 passos para deslocar o êmbolo da seringa 1,0 mm
para frente e para trás, dependendo do sentido de rotação programado.
Estabeleceu-se em 0,05 s a duração de cada pulso de controle enviado às interfaces
de controle (Figuras 6 e 7), portanto a velocidade de deslocamento do êmbolo da
seringa era de 24 mm min
-1
.
47
3.6 Descrição dos módulos de análise
Figura 10. Diagrama do módulo de análise com válvula solenóide de 3 vias. B =
linha de fluxo, 20 cm, diâmetro interno 0,8 mm; V = válvula solenóide de 3 vias; Det
= fotômetro; A = amostra ou solução de referência; Desc = descarte; Mt = multímetro
digital com resolução de 0,1 mV; Int = interface de controle (Fig.6). Os outros
símbolos foram definidos na Figura 11.
Figura 11. Diagrama do módulo de análise com válvula solenóide de
estrangulamento. V
1
e V
2
= válvulas solenóides de estrangulamento, normalmente
fechada e normalmente aberta, respectivamente. A linha contínua e tracejada nos
símbolos de V
2
e V
1
indica passagem de fluído com a válvula desligada e ligada,
respectivamente. Os outros símbolos foram definidos na Fig.10.
As condições de preparo da amostra para determinação fotométrica de
microcistina resultavam em um volume final de 200 µL, assim o módulo de análise
foi desenvolvido considerando-se esta restrição e a necessidade de fazer as leituras
em triplicatas. Para propulsão de fluído foi empregada a bomba de seringa descrita
na Figura 9. Foram desenvolvidos dois módulos de análise e os respectivos
48
diagramas de fluxo são mostrados nas Figuras 10 e 11. A sequência de
funcionamento dos módulos de análise é mostrada na Tabela 2.
Tabela 2. Seqüência de funcionamento do módulo de análise.
Etapa
Atividade Rotação
do motor
Número
de ciclos
Válvula
V
1
Volume
(µL)
1 Seringa para o início Direita X 0 -
2 Operador coloca na
água
- - 0 -
3 Aspira água Esquerda 120 0 176,5
4 Lê a referência - - 0
5 Esvazia a cela Esquerda 120 0 176,5
6 Descarte Direita 240 1 352,8
7 Operador coloca na
água
- - 0
8 Aspira amostra Esquerda 80 0 117,6
9 Leitura de sinal - - 0
10 Aspira amostra Esquerda 20 0 29,4
11 Leitura de sinal - - 0
12 Aspira amostra Esquerda 20 0 29,4
13 Leitura de sinal - - 0
14 Esvazia a cela Esquerda 120 0 176,5
15 Descarte Direita 120 1 176,5
Os dois detectores empregados (Oriel) e o desenvolvido neste trabalho
(Figura 4) geravam os sinais analíticos em mV, sendo equivalente a leitura feita em
transmitância. Verificou-se que a magnitude do sinal gerado em mV dependia da
intensidade da radiação emitida pelo LED, dessa forma, visando verificar a
49
existência de alguma implicação no resultado da análise, foi elaborada a montagem
mostrada na Figura 4. O LED foi acoplado de modo que era possível selecionar três
valores distintos de fundo de escala, sendo que seus valores eram ajustados através
dos resistores variáveis acoplados entre o LED e os terminais de controle do circuito
integrado (CI) ULN2803.
Os dois fotômetros geravam os sinais referentes à absorção da amostra em
mV, portanto era necessário calcular a absorbância. As diferenças de potenciais
geradas pelos dois fotodetectores eram diretamente proporcionais às intensidades
dos feixes de radiação incididos sobre eles, então equação abaixo foi inserida no
software para calcular a absorbância.
Absorb = -[Log(Sv-Sv
0
)/(Rv- Sv
0
)] ; Equação(1)
Onde:
Sv = leitura com LED azul em mV;
Rv = leitura de referência em mV;
Sv
0
= leitura no escuro, realizada com o LED apagado.
A leitura no escuro do fotômetro da Oriel Instruments era em torno de 0,4 mV,
e do fotômetro montado no laboratório era em torno de 4mV. Embora estes sinais
fossem estáveis, o computador era instruído para os ler no início do processamento
de cada amostra. Os dados gerados em mV e em absorbância eram salvos no
formato ASCII para permitir posterior processamento.
O estudo referente ao efeito do fundo de escala foi realizado empregando o
interfaceamento mostrado na Figura 6. O LED está acoplado às linhas de controle
do CI ULN2803 através dos resistores variáveis R
6
, R
7
e R
8
. O dreno de corrente
através destes resistores era selecionado através dos bits de entrada d
5
, d
6
e d
7
.
Quando o computador enviava um sinal em torno de 5 V através do bit d
5
, fechava o
circuito formado pelo LED e pelo resistor R
6
. A corrente que fluia através do circuito
podia ser ajustada modificando o valor da resistência. A intensidade de emissão do
LED era proporcional à intensidade da corrente passando através do circuito, e o
sinal gerado pelo fotodetector era proporcional intensidade do feixe de radiação,
portanto o valor do fundo de escala era ajustado por meio desse resistor. Então,
50
valores distintos de fundo escala 1200, 1950 e 2980 foram ajustados através dos
resistores R
6
, R
7
e R
8
, respectivamente.
O controle do módulo de análise e a aquisição de dados era feita pelo
microcomputador utilizando um software escrito em linguagem Quick BASIC 4.5.
Quando o software era iniciado, solicitava os valores dos parâmetros de controle
mostrados na Tabela 2. Primeiro passo era posicionar o êmbolo da seringa na
posição de referência, o qual arbitrariamente foi definido o número 10 escrito no
corpo de seringa. O operador indicava a posição do êmbolo, e o microcomputador
calculava o número de passos (X) a serem executados. Após esta etapa era
solicitado ao operador para colocar o recipiente com água para aspiração, então a
etapa 3 era executada.
Após encher a cela com água, eram realizadas as leituras com o LED nos 3
fundos de escala. O microcomputador ativava em sequência as linhas d
5
, d
6
e d
7
e
realizava as leituras correspondentes aos fundos de escala de 1200, 1950 e 2980
mV (leituras de referência Rv
01
, Rv
02
, Rv
03
). Também, realizava as leituras no escuro
(Sv
01
, Sv
02
, Sv
03
) com o LED desligado. Estes dados eram salvos e usados para
calcular a absorbância.
A partir da etapa 8, o microcomputador executava todas as operações
indicadas e ao finalizar a etapa 15, voltava para de número 7 para iniciar o
processamento de outra amostra. Nesta sequência eram executadas 3 replicatas, e
as leituras eram feitas nos 3 fundos de escala estabelecidos. Após cada leitura, era
calculada a absorbância empregando a Equação(1) definida na página anterior.
Após a definição do fundo de escala, os experimentos foram realizados
empregando o interfaceamento mostrado na Figura 7. Observa-se nesta figura, que
os LEDs azul (λ = 458 nm) e o de infravermelho estão acoplados ao CI ULN2803
para serem ativados através das linhas de controle d
6
e d
7
. A forma de operação era
semelhante à descrita para o estudo dos fundos de escala. Entretanto, o
microcomputador era instruído para ativar somente as linhas de controle d
6
e d
7
. Em
cada caso eram feitas 10 leituras e as médias calculadas eram usadas como
referência (Rf e Rv) para calcular a absorbância. Neste caso, o fundo de escala do
LED azul (λ = 458 nm) foi ajustado para 3000 mV e o de infravermelho para 800mV.
51
3.7 Reagentes e soluções
Água purificada com condutividade elétrica menor que 0,1 µS cm
-1
foi utilizada
na lavagem de material e preparo das soluções.
Um Kit Microcistina Placa com 96 poços para análise quantitativa, seguindo o
Método de Imunoensaio competitivo – ELISA (Enzyme-Linked Imunosorbet Assay).
3.8 Procedimento do Kit ELISA
O kit da Beacon Microcistina utilizado para este ensaio compreende placa
com 96 poços, e o método de imunoensaio competitivo por ELISA (Enzyme-Linked
Imunosorbet Assay). O kit contém soluções de referência com concentrações de 0;
0,1; 0,3; 0,8; 1,0; e 2,0 µgL
-1
de microcistina, e permite a quantificação de
microcistina em águas tão baixas quanto 0,1 µg L
-1
. Os componentes que fazem
parte do kit são:
01 placa contendo 12 tiras com 8 poços com anticorpos imobilizados;
01 frasco de solução de lavagem concentrada (wash solution);
01 frasco de conjugado enzimático microcistina-HRP (microcystin-HRP);
01 frasco de anticorpo anti-microcistina (anti-microcystin);
01 frasco de substrato (substrate);
01 frasco de solução “STOP” (stop solution);
01 frasco controle negativo (0,0 µgL
-1
microcystin-LR);
01 frasco de cada solução de referência de microcistina-LR com
concentrações de 0,1 µgL
-1
; 0,3 µgL
-1
; 0,8 µgL
-1
; 2,0 µgL
-1
;
01 frasco com a solução de controle de microcistina (1,0 µgL
-1
).
52
Figura 12. Fluxograma do procedimento do kit ELISA.
3.9 Instruções
O Kit Microcistina utiliza anticorpos policlonais que se unem as microcistinas e
ao conjugado microcistina-enzima. A toxina microcistina presente na amostra
compete com o conjugado microcistina-enzima (peroxidase) por um número limitado
de sítios de ligação de anticorpos. Os anticorpos de cabra anti-IgG de coelho estão
INÍCIO
Acondicionamento das
soluções à temperatura
ambiente
FIM
2) Adição da
Microcistina ao
poço
1) Adição
microcistina-
enzima ao poço
4) Agitação por 30 s
10) Adição de
solução “TOP”
ao poço
3) Adição do
anticorpo ao poço
5) Incubação por 30 min
11) Efetua leitura em 450 nm
9) Incubação por 30
minutos
8) Adição do
substrato ao
poço
7) Lavagem do poço
6) Descarta-se o
conteúdo do poço
53
imobilizados nos poços da placa. Após a etapa de lavagem é adicionado o substrato,
sendo que o resultado do processo competitivo é visualizado com o desenvolvimento
de coloração azul. Após um intervalo de 30 min é adicionada a solução de ácido
clorídrico (1 molL
-1
) (solução stop) para interromper o processo reacional. Após essa
etapa a solução adquire uma coloração amarela. Como ocorre com todo
imunoensaio competitivo (Competitive Immunoassay), a concentração de toxina é
inversamente proporcional à intensidade da cor da solução. Então, a diminuição da
intensidade da cor apresenta uma correspondência com a concentração de
microcistina na amostra. Portanto, a solução que apresenta cor mais intensa tem
baixa concentração de microcistina e o inverso ocorre com a solução que apresenta
cor mais clara.
3.10 Especificação
O kit da Beacon Microcistina Placa não apresenta diferença entre
microcistina-LR e outras variantes de microcistina, porém detecta a quantificação em
vários níveis.
O kit demonstra as diversas variantes de microcistina que podemos
considerar: Microcistina-LR - 100% em reação cruzada; Microcistina-RR – 87%;
Microcistina-YR – 48% e Nodularina – 31%.
Como vantagem da técnica ELISA para detecção de microcistina, podemos
considerar a alta sensibilidade.
3.11 Cuidados com o Kit
Todos os componentes do Kit sem exceção, devem ser armazenados em
ambiente com temperatura entre 4 ºC e 8ºC, quando não estiveram em uso.
Os componentes não podem ser congelados, nem ser expostos a
temperatura superior a 37ºC.
54
Todos os reagentes e amostras devem alcançar a temperatura ambiente
antes de iniciar a análise.
O kit não deve ser usado após a data de validade.
Não se devem misturar reagentes ou tiras de placas de kits que apresentem
diferentes números de lote.
3.12 Procedimentos de análise do kit
O procedimento para a determinação de microcistina consiste nas seguintes
etapas:
1º- Reagentes do kit e amostras são mantidos à temperatura ambiente durante 30
minutos antes do teste;
2º- Prepara-se a solução de lavagem diluída adicionando 5 mL de solução de
lavagem concentrada em 495 mL de água;
3º- Adição do conjugado toxina-enzima peroxidase (50 µL) em cada poço;
4º- Adição das soluções de referência (soluções padrão) ou amostras (50 µL) nos
poços;
5º- Adição de anticorpo anti- toxina (50 µL) em cada poço;
6º- Agita-se a placa rápida e cuidadosamente (durante 20-30 segundos), e então
cobre-se os poços com parafilme;
7º- Espera-se um intervalo de tempo de 30 minutos;
8º- Após a incubação, descarta-se o conteúdo dos poços;
9º- Preenche-se os poços com a solução de lavagem diluída e descarta-se em
seguida. Esta operação é repetida 4 vezes, totalizando 5 lavagens. Inverte-se a
placa (poços) em papel absorvente para retirar o máximo de água possível;
10º- Adição de Substrato (100 µL) em cada poço;
11º- Cobre-se os poços e espera-se 30 minutos;
12º- Adição de 100 µL da solução “Stop”em cada poço;
13º- Leitura direta nos poços a 450 nm.
Nota: Para evitar contaminação, utiliza-se uma ponteira limpa para cada solução.
“Stop Solution”, ácido clorídrico 1mol L
-1
.
55
O procedimento usual (Beacon Analytical Systems) é feito utilizando um
equipamento Elisa (Drake Equipamentos, São Paulo), modelo Quick Elisa. Tal
procedimento é realizado no Laboratório Biologia Celular e Molecular do Centro de
Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP).
3.13 Interpretação dos resultados
Para verificar a eficiência de detecção do kit Beacon, utiliza o controle positivo
de Microcistina, 1,0 µgL
-1
(controle de microcistina), este valor deve estar dentro da
faixa que corresponde a 0,80 – 1,30 µgL
-1
.
3.14 Amostras
As amostras de água foram coletadas em vários lugares da cidade de
Piracicaba/SP: Pontos diversos do rio Piracicaba, lagoa da Rua do Porto, lagoas do
campus da ESALQ, lago de propriedade particular e ribeirão Corumbataí, Bairro
Guamium.
Para as amostras coletadas, fez-se o disco de Secchi, medindo a
profundidade da coleta e realizando algumas medidas físicas, como pH e
temperatura de cada coleta. Posteriormente, foram filtradas utilizando filtro 0,45 µm
(Whatman) para remoção de sólidos em suspensão e estocadas em frascos de
micro centrífuga (frasco ependorf) a temperatura de -4ºC.
56
3.15 Padrão de Microcistina
Foi adquirido um padrão de microcistina –LR com lote G001 800201, de
origem Cepa Microcystis RST 9501, grau de pureza > 90% com concentração de
500 µgml
-1
. O padrão MC-LR estava em meio de metanol e devido a isto, fez-se
estudo da preparação das soluções de referência em água e em meio metanol.
57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Módulo de análise com válvulas de estrangulamento
Conforme foi indicado no item 3.1, foram projetados dois módulos de análises,
sendo que um empregava válvulas solenóide 3 vias (Figura 10), e o outro válvulas
estrangulamento (Figura 11). Estes dois módulos de análises foram experimentados
visando selecionar aquele que permitisse o melhor aproveitamento do volume da
amostra, que era de 200 µL. Os registros mostrados nas Figuras 14 foram obtidos
empregando o módulo de análise da Figura 11.
O sexto conjunto de registros é um padrão de controle que acompanha o Kit,
e segundo o fornecedor o valor deve está entre 0,8 e 1,3 µgL
-1
microcistina.
Observa-se pela altura dos registros que a concentração de microcistina está dentro
da faixa esperada. Este resultado indica que não ocorreu erro de preparação das
soluções ou contaminação.
O sétimo registro corresponde à leitura do branco feito com a água usada
para preparar as soluções de referência a partir do padrão de microcistina adquirido
no mercado interno. Os registros obtidos com as soluções preparadas usando este
padrão de microcistina, apresentam uma tendência semelhante à observada com os
do Kit, exceto para a solução de 0,062 µg L
-1
microcistina, indicando que
provavelmente alguma micro-bolha possa ter ficado retida no caminho óptico da cela
de fluxo. Os registros seguintes correspondem às soluções de referência preparadas
em metanol e observa-se que as respostas não têm correspondência com o
esperado. Este teste foi realizado tendo em vista que a solução estoque estava em
metanol.
58
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
limpeza
limpeza
limpeza
limpeza
metanol
2,0 µg L
-1
1,0 µg L
-1
0,5 µg L
-1
0,1 µg L
-1
0,05 µg L
-1
0,031 µg L
-1
0,063 µg L
-1
0,125 µg L
-1
0,25 µg L
-1
0,5 µg L
-1
1,0 µg L
-1
água ultra pura
(0,8-1,3) µg L
-1
2,0 µg L
-1
0,8 µg L
-1
0,3 µg L
-1
0,1 µg L
-1
0,0 µg L
-1
absorbância (A)
tempo (min)
Figura 13. Registros referentes à determinação fotométrica de microcistina. A
partir da esquerda, os primeiros cinco conjuntos de registros correspondem às
soluções de referência do Kit Microcistina ELISA. Concentrações 0,0 ; 0,1; 0,3; 0,8 e
2,0 µgL
-1
Microcistina. O sexto conjunto corresponde ao padrão de controle que
acompanha o Kit. Os registros do sétimo ao décimo terceiro correspondem às
soluções de referências preparadas no laboratório diluindo com águas a solução
estoque de 500 µgmL
-1
. Os demais registros representam as mesmas soluções de
referência preparadas em metanol.
Na Tabela 3 são mostrados valores em absorbância, onde se observa que a
precisão é boa, principalmente considerando-se que as concentrações são muito
baixas. Considerando-se que os registros obtidos com as soluções de referências
preparadas em metanol, indicavam comportamento discrepante, os valores máximos
não foram processados para obter uma curva analítica.
59
Tabela 3. Comparação dos resultados dos padrões preparados no laboratório e os
obtidos com o Kit.
Amostra Concentração
(µg L
-1
)
Absorbância
(A ±
±±
± SD)
RSD
(%)
Padrão kit 1 0,00 1,45 ± 0,04 2,7
Padrão kit 2 0,10 1,32 ± 0,03 2,2
Padrão kit 3 0,30 1,16 ± 0,02 1,7
Padrão kit 4 0,80 0,96 ± 0,01 1,0
Padrão kit 5 2,00 0,72 ± 0,02 2,7
Padrão kit 6 controle (0,8-1,3) 0,95 ± 0,02 2,1
Água Ultra Pura Água (Branco) 1,47 ± 0,00 0,0
Amostra 1 1,00 1,08 ± 0,00 0,0
Amostra 2 0,50 1,22 ± 0,00 0,0
Amostra 3 0,25 1,30 ± 0,03 3,2
Amostra 4 0,13 1,42 ± 0,02 1,4
Amostra 5 0,06 1,64 ± 0,02 1,2
Amostra 6 0,03 1,43 ± 0,03 2,1
SD = Desvio padrão referente à 3 determinações consecutivas.
RSD = Desvio padrão relativo.
Aplicando-se um processamento de regressão linear usando os valores de
absorbância versus as respectivas concentrações de microcistina, encontramos as
seguintes equações lineares:
Y
1
= -0,321X
1
+ 0,615; R
2
= 0,9856
Y
2
= -0,291X
2
+ 1,37; R
2
= 0,9988
Onde Y
1
e X
1
representam a absorbância e concentração de microcistina nas
soluções de referência do Kit, respectivamente; e Y
2
e X
2
representam a
absorbância e a concentração de microcistina nas soluções de referência
preparadas no laboratório.
Estes dados indicam que poderíamos empregar essa solução estoque em
trabalho de rotina. Entretanto, há dois obstáculos que devem ser considerados. A
60
imprevisibilidade do fornecedor, pois demorou mais de um ano para se efetivar a
compra, e o segundo está relacionado ao acesso aos anticorpos, cuja
disponibilidade comercial está vinculada à aquisição do Kit.
Visando verificar a estabilidade da solução estoque preparada, o mesmo
experimento foi repetido no dia seguinte, obtendo os resultados mostrados no Figura
15. Comparando com os registros dessa figura com os da Figura 14, observa-se que
são idênticos, portanto a solução estoque preparada no laboratório poderia ser
usada em período mais longo.
0 500 1000 1500 2000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
água
água
0,031 µg L
-1
0,063 µg L
-1
0,125 µg L
-1
0,25 µg L
-1
0,5 µg L
-1
1,0 µg L
-1
água ultra pura
0,8-1,3 (controle) µg L
-1
2,0 µg L
-1
0,8 µg L
-1
0,3 µg L
-1
0,1 µg L
-1
0,0 µg L
-1
absorbância (A)
tempo (min)
Figura 14. Registros referentes à determinação fotométrica de microcistina. As
soluções de referência foram as mesmas usadas para obter os registros da Figura
14, e foram processadas na mesma ordem.
61
4.2 Estudo do efeito do fundo de escala
A intensidade do feixe de radiação emitido pelo LED aumenta com
intensidade da corrente circulando através do circuito elétrico do LED. A diferença de
potencial gerada pelo fotômetro é função da intensidade do feixe de radiação
incidindo sobre a superfície ativa do fotodetector. Então, controlando a intensidade
da corrente que drenava através do LED, poderíamos controlar a diferença de
potencial gerada pelo fotômetro. Absorbância é uma grandeza relativa, dada pela
equação A = -log(I/I
0
), onde I
0
e I representam as intensidades do feixe de radiação
eletromagnética antes e depois de atravessar o meio em estudo, respectivamente.
Em um meio ideal, onde não haveria absorção ou espalhamento de radiação I seria
igual I
0
.
Nos fotômetros desenvolvidos para este projeto, a diferença de potencial
gerada era diretamente proporcional a intensidade de corrente aplicada ao LED,
portanto a absorbância poderia ser calculada em função das diferenças de
potenciais geradas pelo fotômetro. Do ponto de vista técnico era mais fácil
determinar a diferença de potencial do que intensidade do feixe de radiação, ou a
intensidade de corrente. Neste caso, a absorbância foi calculada empregando a
Equação(1) descrita abaixo.
Absorb = -[Log(Sv-Sv
0
)/(Rv- Sv
0
)] ; Equação(1)
Onde:
Sv = leitura com LED azul em mV;
Rv = leitura de referência em mV;
Sv
0
= leitura no escuro, realizada com o LED apagado.
Segundo esta equação, o valor da absorbância não depende do valor inicial
do fundo de escala (Sv
0
), entretanto não saberíamos se a resposta dos dispositivos
eletrônicos dependeriam da intensidade do inicial do feixe de radiação. As interfaces
eletrônicas mostradas nas Figuras 6 e 7 permitem variar a intensidade de emissão
dos LEDs, variando a intensidade de corrente drenava através de sua malha de
alimentação, então este recurso foi empregado para gerar três fundos de escala. Os
experimentos foram realizados instruindo o software para ler cada solução nos 3
62
fundos de escala previamente estabelecidos e os resultados obtidos são mostrados
na Tabela 4.
Tabela 4. Resultados obtidos variando do fundo de escala do fotômetro da Oriel.
Fundo de
Escala
Equação linear R
2
LD
(µgL
-1
)
Curva analítica com 5 pontos: 0; 0,1; 0,3; 0,8 e 2,0 (µgL
-
1
)
(1200) mV y = 997,18 - 72,09x 0,9860 0,19
(1200) abs y = 0,79 - 0,12x 0,9686 0,27
(1950) mV y = 1726,85 - 22,87x 0,9858 0,17
(1950) abs y = 0,79 - 0,12x 0,9685 0,24
(2980) mV y = 2537,56 - 130,48x 0,9401 0,23
(2980) abs y = 0,79 - 0,12x 0,9689 0,23
Curva analítica com 4 pontos: 0; 0,1; 0,3 e 0,8 (µgL
-
1
)
(1200) mV y = 1002,44 - 93,63x 0,9720 0,15
(1200) abs y = 0,80 - 0,18x 0,9627 0,18
(1950) mV y = 1735,27 - 158,83x 0,9718 0,13
(1950) abs y = 0,80 - 0,18x 0,9621 0,16
(2980) mV y = 2563,03 - 234,82x 0,9724 0,13
(2980) abs y = 0,80-0,18x 0,9630 0,15
Curva analítica com 3 pontos 0; 0,1; e 0,3 (µgL
-
1
)
(1200) mV y = 1008,56 - 149,21x 0,9859 0,09
(1200) abs y = 0,82 – 0,31x 0,9887 0,11
(1950) mV y = 1745,95 - 255,84x 0,9898 0,08
(1950) abs y = 0,82 – 0,31x 0,9899 0,09
(2980) mV y = 2578,34 - 374,06x 0,9868 0,08
(2980) abs y = 0,82 – 0,31x 0,9895 0,09
LD = limite de detecção
R
2
= coeficiente de correlação linear
63
Os resultados obtidos em experimento anterior (Tabela 4) mostraram que o
método empregado não obedece a lei de Lambert-Beer. Para as medições feitas
com o equipamento ELISA, obteve-se coeficiente de correlação linear R
2
= 0,9856 e
para o fotômetro da Oriel R
2
= 0,9988. Observa-se que os dados da tabela acima
estão na mesma ordem. Tendo em vista que a resposta não perfeitamente linear,
investigou-se as curvas de regressão obtidas para 5, 4 e 3 pontos. Observa-se uma
melhoria significativa nos limites de detecção quando a curva analítica foi tomada
considerando as 3 soluções de referência de menor concentração. Observa-se
também, que este efeito foi independente do fundo de escala escolhido. Esta é uma
informação de suma importância, pois indica que a resposta do equipamento de
detecção não depende do fundo de escala estabelecido. Igualmente importante é
que o limite de detecção estimado é 10 vezes menor do que a concentração mínima
de microcistina estabelecida pela ANVISA para águas servidas para consumo
(BRASIL, 2001).
4.3 Efeito do tempo de processamento da amostra para leitura
Conforme indicado na parte experimental, o preparo das amostras para a
deteminação de microcistina envolve várias etapas, sendo que a etapa final inclui a
adição de uma solução ácida à amostra para interromper a reação. A partir desse
instante era necessário verificar se os valores de leitura permaneciam estáveis.
Então, um lote de amostras foi preparado e as leituras da absorção foram efetivadas
em duas etapas com intervalo de tempo de 3 horas entre eles. Analisando os
resultados mostrados na Tabela 5, observa-se que ocorreu um decréscimo em
média entre 5 e 10 %, portanto o tempo de leitura após o preparo da amostra é um
parâmetro que não pode ser desprezado, embora não seja crítico. Este fato alivia a
pressão sobre o operador, pois podemos imaginar que atrasos da ordem de 10 ou
20 minutos não terá efeito significativo sobre a exatidão dos resultados.
64
Tabela 5. Valores de absorbância das amostras analisadas na leitora Elisa e no
fotômetro, em um período de 3 horas.
1ºtira Abs. 2ºtira Abs. 3ºtira Abs.
am. 1 1,010 am. 9 1,065 am. 17 0,894
am. 2 1,082 am. 10 1,013 am. 18 0,989
am. 3 1,164 am. 11 1,152 am. 19 1,099
am. 4 1,155 am. 12 1,144 am. 20 1,116
am. 5 1,131 am. 13 0,573 am. 21 0,322
am. 6 1,196 am. 14 0,591 am. 22 0,319
am. 7 1,166 am. 15 1,104 am. 23 0,330
am. 8 1,145 am. 16 1,140 am. 24 0,323
Após 3 horas
1ºtira Abs. 2ºtira Abs. 3ºtira Abs.
am. 1 1,000 am. 9 1,023 am. 17 0,816
am. 2 1,067 am. 10 0,969 am. 18 0,896
am. 3 1,134 am. 11 1,084 am. 19 1,002
am. 4 1,126 am. 12 1,088 am. 20 1,004
am. 5 1,100 am. 13 0,534 am. 21 0,310
am. 6 1,158 am. 14 0,546 am. 22 0,303
am. 7 1,128 am. 15 1,038 am. 23 0,298
am. 8 1,122 am. 16 1,058 am. 24 0,318
4.4 Comparação dos fotômetros
Visando comparar o desempenho do fotômetro desenvolvido no laboratório
com o da Oriel, dois conjuntos de soluções de referência iguais foram processadas
com os dois instrumentos, empregando o módulo de análise com os mesmos
parâmetros descritos na Tabela 2. Observa-se nesta figura que há uma diferença
significativa entre os máximos dos registros relacionados às detecção do branco e
da solução de referência com a concentração de 0,1 µgL
-1
de microcistina. Este
resultado indica que o sistema tem sensibilidade para determinação de
concentrações de microcistina com valor menor do que 0,1 µgL
-1
.
65
400 600 800 1000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,8 µgL
-1
0,3 µgL
-1
0,1 µgL
-1
0,0 µgL
-1
absorbância (A)
tempo (min)
400 600 800 1000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,8 µgL
-1
0,3 µgL
-1
0,1 µgL
-1
0,0 µgL
-1
absorbância (A)
tempo (min)
Figura 15. Resposta dos fotômetros. Os registros da primeira figura obtidos com o
fotômetro da Oriel e os da segunda com o fotômetro do laboratório. Os números
sobre os registros são as concentrações de microcistina.
Tabela 6. Performance dos fotodetectores.
Fotômetro da Oriel
Limite de detecção (µgL
-
1
)
Y
1
= 0,4095 - 0,533X R
2
= 0,9989 0,04
Y
2
= 0,3804 - 0,2688X R
2
= 0,9381 0,08
Fotômetro do laboratório
Limite de detecção (µgL
-
1
)
Y
1
= 0,3689 - 0,357X R
2
= 1 0,02
Y
2
= 0,3535 - 0,2169X R
2
= 0,9720 0,03
66
Analisando os dados da Tabela 6, verifica-se que os limites de detecção
estimados para o fotômetro do laboratório são melhores que os obtidos para o da
Oriel. Os coeficientes de regressão linear são melhores, mas devemos levar em
conta as soluções de referências não foram as mesmas. Entretanto, o melhor limite
de detecção é um indicador de que o fotômetro desenvolvido no laboratório tem um
baixo nível de ruído.
4.5 Análises das amostras
Foram analisadas amostras coletadas no Rio Piracicaba e nas Lagoas da
ESALQ/USP. As análises foram feitas com as replicatas coletadas em cada ponto. A
temperatura e o pH de cada amostra foram medidos no momento da coleta. O valor
do pH variou entre 6,41 a 7,66 e a temperatura entre 23,2 a 24,2 °C.
Análises de amostras coletadas em um sítio de propriedade particular foram
realizadas seguindo o mesmo procedimento descrito anteriorrmente. Medidas como
temperatura e pH foram realizadas no momento da coleta, onde o pH variou entre
5,20 á 7,20 e a temperatura registrada foi de 24°C. Amostras do rio Corumbataí na
região do bairro Guamium, também foram coletadas em diversos pontos. Os
resultados obtidos são mostrados na Tabela 7.
67
Tabela 7. Determinação de microcistina em águas.
Amostra
Elisa
(µgL
-1
)
Fotômetro - Abs
(µgL
-1
)
Fotômetro - mV
(µgL
-1
)
padrão 1 0,00
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
padrão 2 0,10
0,10 ± 0,02 0,09 ± 0,01
padrão 3 0,30
0,32 ± 0,01 0,32 ± 0,01
padrão 4 0,80
0,80 ± 0,03 0,85 ± 0,01
padrão 5 2,00
1,95 ± 0,06 1,98 ± 0,09
controle 6 0,71
0,73 ± 0,02 0,74 ± 0,01
amostra 1 0,00
0,08 ± 0,00 0,07 ± 0,00
amostra 2 0,08
0,07 ± 0,00 0,07 ± 0,00
amostra 3 0,17
0,19 ± 0,02 0,19 ± 0,00
amostra 4 0,20
0,24 ± 0,00 0,23 ± 0,00
amostra 5 1,54
1,46± 0,05 1,60 ± 0,05
amostra 6 0,00
0,05 ± 0,01 0,06 ± 0,00
amostra 7 1,20
0,88 ± 0,02 0,89 ± 0,00
amostra 8 0,11
0,19 ± 0,02 0,18 ± 0,00
amostra 9 0,20
0,24 ± 0,00 0,24 ± 0,01
amostra 10 0,08
0,09 ± 0,01 0,09 ± 0,00
SD = desvio padrão referente a 3 replicatas
68
Tabela 8. Comparação das características analíticas do sistema com detector da
Oriel para a determinação de microcistina em águas. Curva analítica com 4 pontos.
Parâmetros
Elisa Fotômetro - Abs Fotômetro - mV
Resposta linear y= 0,525 - 0,434X
y= 0,404 - 0,191X y = 2020,7 - 818,97X
Concentração
(µgL
-1
)
0,1 - 0,8 0,1 - 0,8 0,1-0,8
Coeficiente de
correlação (R
2
)
0,9783 0,9986 0,9998
LD (µgL
-
1
) 0,04 0,005
LD = limite de detecção e SD = desvio padrão para n=3
Observa-se que a correlação linear obtida com os dados do fotômetro da Oriel
foi melhor que a obtida com os do detector ELISA. Estes dados foram obtidos com
um fundo de escala de 3000 mV. Então, comparando-os com os dados da Tabela 6
para este fundo de escala, observa-se que houve ganho significativo no limite de
detecção estimado.
4.6 Emprego do fotômetro montado no laboratório
Os resultados apresentados foram obtidos empregando o fotômetro da Oriel,
o qual apresentou bom desempenho. Trata-se de um equipamento comercial,
portanto era esperado que tivesse uma boa resposta. Conforme mostrado na parte
experimental (Figura 4), foi desenvolvido um fotômetro empregando fotodiodo e
amplificador operacional. Este equipamento foi desenvolvido tendo objetivo obter um
sistema de baixo custo e bom desempenho, e também adquirir experiência no
desenvolvimento de instrumento de detecção de alta sensibilidade.
O fotômetro foi utilizado para realizar os experimentos com o mesmo LED, a
mesma cela de fluxo e o mesmo módulo de análise empregado com o fotômetro da
Oriel. Os resultados obtidos empregando este equipamento são mostrados na
69
Tabela 9, onde observa-se que não há diferença significativa com os obtidos com o
equipamento ELISA.
Tabela 9. Resultado das análises das amostras águas para determinação de
microcistina empregando o fotômetro desenvolvido no laboratório.
Amostra
Elisa
(µgL
-1
)
Fotômetro - Abs
(µgL
-1
)
Fotômetro - mV
(µgL
-1
)
padrão 1 0,00
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
padrão 2 0,10
0,10 ± 0,00 0,10 ± 0,00
padrão 3 0,30
0,29 ± 0,00 0,30 ± 0,00
padrão 4 0,80
0,81 ± 0,03 0,76 ± 0,01
padrão 5 2,00
2,03 ± 0,01 2,01 ± 0,02
controle 6 1,04
1,1 ± 0,01 0,96 ± 0,00
amostra 1 0,04
0,10 ± 0,01 0,08 ± 0,01
amostra 2 0,14
0,14 ± 0,00 0,14 ± 0,00
amostra 3 0,09
0,09 ± 0,01 0,07 ± 0,00
amostra 4 0,07
0,08 ± 0,00 0,08 ± 0,00
amostra 5 0,07
0,09 ± 0,00 0,07 ± 0,00
amostra 6 0,10
0,10 ± 0,01 0,08 ± 0,00
amostra 7 0,13
0,11 ± 0,00 0,12 ± 0,00
amostra 8 0,06
0,09 ± 0,02 0,06 ± 0,00
amostra 9 0,26
0,24 ± 0,00 0,24 ± 0,00
amostra 10 0,15
0,17 ± 0,00 0,15 ± 0,00
SD = desvio padrão referente a 3 replicatas
Comparando os dados da Tabela 7 e 9, verifica-se que o desempenho do
fotômetro proposto é idêntico ao do fotômetro da Oriel. O equipamento da Oriel
custou US$ 1.200, 00 há 7 anos enquanto que no fotômetro proposto os
componentes importados são fotodetector e o amplificador de instrumentação, os
quais custaram há 4 anos US$ 22,00 e US$ 32,00, respectivamente. Este último tem
70
um custo muito menor e um desempenho semelhante ao importado, isso indica que
equipamento de alto desempenho pode ser desenvolvido no laboratório de química
analítica. A comparação estatística dos resultados mostrados através do test-t
pareado, indicaram que os mesmos não apresentam diferença significativa em um
nível de confiança de 95%.
Tabela 10. Características analíticas do sistema com fotômetro montado no
laboratório.
Parâmetros Elisa Fotômetro - Abs Fotômetro - mV
Equação linear y = 0,4233-0,2748x y = 0,369-0,364x y =1983,81 - 433,4x
Coeficiente de
correlação R
2
0,9693 0,9988 1
LD (µgL
-
1
) 0,01 0,002
LD = limite de detecção e SD = desvio padrão para n=3
O máximo de absorbância do composto é 450 nm e tem uma largura de
banda da ordem de 30 nm. O LED empregado tem máximo de emissão em 458 nm
e uma largura de banda de 25 nm, portanto há uma boa abrangência entre as
bandas de emissão do LED e de absorção do composto. Os resultados obtidos
demonstram que esta fonte de radiação é apropriada para determinação de
microcistina em águas. O emprego de um LED de alto brilho (10000 mcd) com feixe
de emissão em ângulo estreito (15
o
) permitiu o emprego de uma cela de fluxo com
caminho óptico de 40 mm. Os limites de detecção estimados com os dois
equipamentos permitem o emprego para o monitoramento de microcistina em águas
para consumo, onde segundo a resolução da ANVISA o limite máximo é 1 µgL
-1
. Os
limites de detecção mostrados nas Tabelas 8 e 10 indicam também que os dois
instrumentos podem ser usados para o monitoramento de águas para hemodiálise,
onde segundo a ANVISA, a microcistina deve estar ausente, portanto é necessário
dispor de equipamentos de alta sensibilidade.
O desempenho em termos de baixo limite de detecção em boa parte pode ser
atribuído à geometria da cela de fluxo mostrada na Figura 3, a qual foi desenvolvida
para este projeto. O emprego dos cilindros de vidro como guia de onda para levar
feixe de radiação do LED á solução dentro da cela de fluxo e desta até o foto
71
detector, é um fator de inovação ainda não explorado. Teve como vantagem
minimizar perda de radiação por espalhamento, efeito observado quando é usada
celas de fluxo feitas com tubos de vidro.
Conforme indicado na Tabela 2, entre o processamento de cada amostra, a
cela de fluxo era esvazida, aspirando ar através dela. Esta estratégia tinha como
objetivo evitar a diluição da amostra, que ocorreria se a cela estivesse cheia com
água como ocorre em sistemas FIA usuais. O volume da amostra era 200 µL,
portanto não poderia ser usado para lavar a cela de fluxo. A implementação desta
estratégia permitiu que mesmo com um volume de amostra tão pequeno, a detecção
fosse efetuada com 3 replicadas. A cela de fluxo foi montada na posição vertical, e
as extremidades do canal interno do tubo de vidro foram alargadas para 2 mm,
visando facilitar a liberação das bolhas de ar. Com esta geometria, as bolhas de ar
eram facilmente aspiradas para fora. Com isso, o esvaziamento da cela entre o
processamento das amostras pode ser implementado sem transtornos causados
pelas bolhas.
Tendo em vista que micro bolhas de ar poderiam ficar retidas na cela de fluxo,
foi instalado o LED de infravermelho (λ = 850 nm), visando usar o recurso de leitura
em dois comprimentos de onda para corrigir a variação causada pelas bolhas
(ZAGATTO et al., 1990). Dessa forma, na execução da etapa de leitura, o
computador ligava seqüencialmente os dois LEDs e fazia as respectivas leituras.
Analisando os dados verificou-se que não havia diferenças significativa entre eles,
indicando que não ocorreu retenção de bolhas na cela de fluxo. Então, os dados
referentes a essa correção não foram utilizados.
Como propulsor de fluído foi empregado uma bomba de seringa desenvolvida
para este projeto. Conforme indicado na parte experimental, o ângulo de rotação do
motor por passo era de 7,5 graus, portanto eram necessários 48 passos para
completar uma volta. O deslocamento da seringa era de 1,0 mm por volta, e o
volume deslocado, determinado por pesagem, era de 17,6 µL. Esta característica do
propulsor de fluído, facilitava a manipulação de pequenos volumes de amostra. Esta
facilidade foi explorada para conseguir a inserção de 3 replicadas da amostra. O
tubo que conduzia a amostra do recipiente (poço) até a entrada da cela de fluxo
tinha um volume de 20 µL. O volume da cela de fluxo era 32 µL. Na Tabela 2 está
indicado que na primeira etapa de amostragem (etapa 8 ) era aspirado 117,6 µL.
72
Este volume garantia o completo enchimento da cela de fluxo. Nas etapas seguintes
(10 e 12) era aspirado 29,4 µL em cada caso. Observa-se que no total era utilizado
178,4 µL da solução de referência ou da amostra.
73
5. CONCLUSÃO
O sistema de determinação proposto apresentou ótimo desempenho
permitindo alcançar limite de detecção abaixo do valor estabelecido pela ANVISA
para microcistina em águas potáveis.
O emprego da bomba de seringa em sistema baseado em multicomutação
mostrou que este dispositivo é viável, o que agrega valor ao trabalho, pois é um
dispositivo de baixo custo e alto desempenho como propulsor de fluído.
O fotômetro desenvolvido no laboratório apresentou sensibilidade suficiente
para atender as exigências do Ministério da Saúde, que estabelece em 1 µgL
-1
a
concentração máxima de microcistina em águas para consumo.
A cela de fluxo com caminho óptico de 40 mm e volume interno de 32 µL foi
um dispositivo chave para alcançar a sensibilidade necessária para atender os
objetivos do projeto.
Pela primeira vez em sistemas de análise química em fluxo foi empregado o
procedimento de esvaziamento da cela de fluxo entre as amostras. A geometria da
cela permitiu que esta etapa foi executada sem a retenção de bolhas no caminho
óptico, o que comprometeria os resultados.
74
REFERÊNCIAS
ALMEIDA, C.M.N.V.; ARAUJO, M.C.U.; LAPA, R.A.S.; LIMA, J.L.F.C.; REIS, B.F.;
ZAGATTO, E.A.G. Precipitation titrations using an automatic titrator based on a
multicommutated unsegmented flow system. Analyst, Cambridge, v.125, n.2, p.333-
340, 2000.
ARAÚJO, A.N.; LIMA, J.L.F.C.; REIS, B.F.; ZAGATTO, E.A.G. Multicommutation in
flow-analysis. 3. Spectrophotometric kinetic determination of creatinine in urine
exploiting a novel zone sampling approach. Analytica Chimica Acta, Amsterdam,
v.310, n.3, p.447-452, 1995.
AVERSANO, C.D.; EAGLESHAM, G.K.; QUILLIAM, M.A.J. Analysis of
cyanobacterial toxins by hydrophilic interaction liquid chromatography-mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, Amsterdam, v.1028, p.155-164,
2004.
AZEVEDO, S.M.F.O.; CARMICHAEL, W.W.; JOCHIMSEN, E.M.; RINEHART, K.L.;
LAU, S.; SHAW, G.R.; EAGLESHAM, G.K. Human intoxication by microcystins
during renal dialysis treatment in Caruaru-Brazil. Toxicology, Amsterdam,
v.181/182, p.441-446, 2002.
BEACON ANALYTICAL SYSTEMS INC. Kit Microcistina Placa. Portland.
BERGAMIN FILHO, H.; MEDEIROS, J.X.; REIS, B.F.; ZAGATTO, E.A.G. Solvent-
extraction in continuous-flow injection analysis. Determination of molybdenum in
plant material. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.101, n.1, p.9-16, 1978a.
BERGAMIN FILHO, H.; REIS, B.F.; JACINTHO, A.O.; ZAGATTO, E.A.G. Ion-
exchange in flow-injection analysis. Determination of Ammonium-Ions at the µg L
-1
level in Natural-Waters with Pulsed Nessler Reagent. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.117, p.81-89, 1980.
BERGAMIN FILHO, H.; ZAGATTO, E.A.G.; KRUG, F.J.; REIS, B.F. Merging zones in
flow injection analysis. Part 1. Double proportional injector and reagent comsumption.
Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.101, n.1, p.17-23, 1978b.
BERGAMIN, H.; KRUG, F.J.; REIS, B.F.; NOBREGA, J.A.; MESQUITA, M.; SOUZA,
I.G. Online electrolytic dissolution of alloys in flow-injection analysis. 2.
Spectrophotometric determination of molybdenum in steels. Analytica Chimica
Acta, Amsterdam, v.214, n.1-2, p.397-400, 1988.
BORGES, E.P.; MARTELLI, P.B.; REIS, B.F. Automatic stepwise potentiometric
titration in a monosegmented flow system. Mikrochimica Acta, Wien, v.135, n.3-4,
p. 179-184, 2000.
BORGES, S.S.; FRIZZARIN, R.M.; REIS, B.F. An automatic flow injection analysis
procedure for photometric determination of ethanol in red wine without using a
chromogenic reagent. Analytical and Bioanalytical Chemistry, Heidelberg, v.385,
n.1, p.197-202, 2006.
75
BOYLESTAD, R.L.; NASHELSKY, L. Electronic devices and circuit theory.
Englewood Cliffs: Prentice-Hall, 1972. 794 p.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Portaria nº
518, 25 de março 2004. Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos
ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão
de potabilidade, e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, 26 mar.
2004. p.266-270.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº 1469, 29 dezembro 2000. Estabelece os
procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da
água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências.
Diário Oficial da União, Brasília, 19 jan. 2001. p.18-22.
CARLILE, P.R. Further studies to investigate Microcystin-LR and Anatoxin-A
removal from water. Buckinghamshire: Foundation for Water Research, 1994. 44p.
(FWR Reports, FR0458). Disponível em: http://www.atlas.c…listons/fr0458.htm,
Acesso em: April, 1994.
CARMICHAEL, W.W. Health effects of toxin-producting cyanobacteria, “The
CyanoHabs”. Human and Ecological Risk Assessment, Oxford, v.7, p.1393-1407,
2001.
CARMICHAEL, W.W. The toxins of cyanobacteria. Scientific American, New York,
v.270, p.78, 1994.
CARMICHAEL, W.W.; AZEVEDO, M.F.O.; AN, J.S.; MOLICA, R.J.R.; JOCHIMSEN,
E.M.; LAU, S.; RINEHART, K.L.; SHAW, G.R.; EAGELSHAM, G.K. Human fatalities
from cyanobacteria: chemical and biological evidence for cyanotoxins.
Environmental Health Perspectives, Research Triangle Park, v.109, n.7, p.663-
668, 2001.
CARMICHAEL, W.W.; BEASLEY, V.R.; BUNNER, D.L.; ELOFF, J.N.; FALCONER,
I.R; GORHAM, P.R.; HARADA, K.I.; YU, M.J.; KRISHNAMURTHY, T.; MOORE,
R.E.; RINEHART, K.L.; RUNNEGAR, M.T.C.; SKULBERG, O.M.; WATANABE, M.
Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (blue-green algae). Toxicon,
Oxford, v.26, p.971-973, 1988.
CHORUS, I.; BARTRAM, J. (Ed.). Toxic cyanobacteria in water. A Guide to their
public health consequences, monitoring and management. London: E&FN Spon,
1999. 416p.
CLINCH, J.R.; WORSFOLD, P.J.; CASEY, H. An automated spectrophotometric
field-monitor for water-quality parameters – determination of nitrate. Analytica
Chimica Acta, Amsterdam, v.200, n.1, p.523-531, 1987.
COMITRE, A.L.D.; REIS, B.F. Automatic flow procedure based on multicommutation
exploiting liquid-liquid extraction for spectrophotometric lead determination in plant
material. Talanta, London, v.65, n.4, p.846-852, 2005.
76
COMITRE, A.L.D.; REIS, B.F. Automatic multicommutated flow system for ethanol
determination in alcoholic beverages by spectrophotometry. Laboratory Robotics
and Automation, New York, v.12, n.1, p.31-36, 2000.
COMITRE, A.L.D.; REIS, B.F. Liquid-liquid extraction procedure exploiting
multicommutation in flow system for the determination of molybdenum in plants.
Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.479. n.2, p.185-190, 2003.
DASGUPTA, P.K.; BELLAMY, H.S.; LIU, H.H.; LOPEZ, J.L.; LOREE, E.L.; MORRIS,
K.; PETERSEN, K.; MIR, K.A. Light-emitting diode based flow-through optical-
absorption detectors. Talanta, London, v.40, n.1, p.53-74, 1993.
DAYKIN, R.N.C.; HASWELL, S.J. Development of a micro flow-injection manifold for
the determination of orthophosphate. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.313,
n.3, p.155-159, 1995.
DUY, T.N.; LAM, P.K.S.; SHAW, G.; CONNELL, D.W. Toxicology and risk
assessment of freshwater cyanobacterial (blue-green algal) toxins in water. Reviews
of Environmental Contamination & Toxicology, New York, v.163, p.113-186,
2000.
FACCHIN, I.; MARTINS, J.W.; ZAMORA, P.G.P.; PASQUINI, C. Single-phase liquid-
liquid extraction on monosegmented continuous-flow systems. Analytica Chimica
Acta, Amsterdam, v.285, n.3, p.287-292, 1994.
FALCONER, I.R. Algal toxins and human health. In: HRUBEC, J. (Ed.). The
handbook of environmental chemistry. Part C. Quality and treatment of drinking
water II. Heidelberg: Springer-Verlag, 1998, v.5, p.53-82.
FERES, M.A.; REIS, B.F. A downsized flow set up based on multicommutation for
the sequential photometric determination of iron (II)/iron (III) and nitrite in surface
water. Talanta, London, v.68, n.2, p.422-428, 2005.
FERNANDES, E.N.; DE CAMPOS MOURA, M.N.; LIMA, J.L.F.C.; REIS, B.F.
Automatic flow procedure for the determination of glycerol in wine using enzymatic
reaction and spectrophotometry. Microchemical Journal, New York, v.77, n.2,
p.107-112, 2004.
FERNANDES, E.N.; REIS, B.F. Automatic flow procedure for the determination of
ethanol in wine exploiting multicommutation and enzymatic reaction with detection by
chemiluminescence. Journal of AOAC International, Arlington, v.87, n.4, p.920-
926, 2004.
FERNANDES, E.N.; REIS, B.F. Automatic spectrophotometric procedure for the
determination of tartaric acid in wine employing multicommutation flow analysis
process. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.557, n.1-2, p.380-386, 2006.
FERNANDES, R.N.; REIS, B.F. Flow system exploiting multicommutation to increase
sample residence time for improved sensitivity. Simultaneous determination of
77
ammonium and ortho-fosfato in natural water. Talanta, London, v.58, n.4, p.729-737,
2002.
FERRÃO-FILHO, A.S.; SOARES, M.C.S.; MAGALHÃES, V.F.; AZEVEDO, S.M.F.O.
Biomonitoring.of cyanotoxins in two tropical reservoirs by cladoceran toxicity
bioassays. Ecotoxicology and Environmental Safety, Amsterdam, v.72, n.2,
p.479-489, 2008.
FIORE, M.F.; ETCHEGARAY, A.; LORENZI, A.S.; SILVA, C.S.P. Monitoramento de
cianobactérias produtoras de toxinas através de métodos moleculares. In: REUNIÃO
BRASILEIRA FICOLOGIA, 2005, Salvador-BA. Formação ficólogos: um
compromisso com a sustentabilidade dos recursos aquáticos. Salvador: Sociedade
Brasileira de Ficologia, 2005. p.33-56.
GABRIEL, D.; BAEZA, J.; VALERO, F.; LAFUENTE, J. A novel FIA configuration for
the simultaneous determination of nitrate and nitrite and its use for monitoring an
urban waste water treatment plant based on N/D criteria. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.359, n.1-2, p.173-183, 1998.
GINÉ, M.F.; BERGAMIN, H.; ZAGATTO, E.A.G.; REIS, B.F. Simultaneous
determination of nitrate and nitrite by flow-injection analysis. Analytica Chimica
Acta, Amsterdam, v.114, p.191-197, 1980.
GINÉ, M.F.; PACKER, A.P.; BLANCO, T.; REIS, B.F. Flow system based on a binary
sampling process for automatic dilutions prior to flame atomic spectrometry.
Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.323, p.47-53, 1996.
GINÉ, M.F.; REIS, B.F.; ZAGATTO, E.A.G.; KRUG, F.J.; JACINTHO, A.O. A simple
procedure for standard additions in flow-injection analysis-spectrophotometric
determination of nitrate in plant-extracts. Analytica Chimica Acta, Amsterdam,
v.155, p.131-138, 1983.
GRACH-POGREBINSKY, O.; SEDMAK, B.; CARMELI, S. Seco [D-Asp]microcystin-
RR and [D-Asp
3
] microcystin-RR and [D-Asp
3
, D-Glu(OMe)
6
] microcystin-RR, two
new microcystins from a toxic water bloom of the cyanobacterium Planktothrix
rubescens. Journal of Natural Products, Pittsburg, v.67, n.3, p. 337-342, 2004.
HARRIS, D.C. Análise química quantitativa. 6ºed. Rio de Janeiro: LTC Editora,
2005. 876p.
HIROOKA, E.Y.; PINOTTI, M.H.P.; TSUTSUMI, T.; YOSHIDA, F.; UENO, Y. Survey
of microcystins in water between 1995 and 1996 in Paraná, Brazil using ELISA.
Natural Toxins, New York, v.7, p.103-109, 1999.
HITZFELD, B.C.; HOGER, S.J.; DIETRICH, D.R. Cyanobacterial toxins, removal
during drinking water treatment, and human risk assessment. Environmental Health
Perspectives, Research Triangle Park, v.108, p.113-122, 2000.
78
HUANG, J.; LIU, H.; TAN, A.; XU, J.; ZHAO, X. A dual wavelength light-emitting
diode based detector for flow-injection analysis process analysers. Talanta, London,
v.39, n.6, p.589-592, 1992.
ISMAIL, N.; BECKER, B.; HAKIM, R.M. Water treatment for hemodialysis. American
Journal of Nephrology, Basel, v.16, p.60-72, 1996.
JACINTHO, A.O.; ZAGATTO, E.A.G.; BERGAMIN, H.; KRUG, F.J.; REIS, B.F.;
BRUNS, R.E.; KOWALSKI, B.R. Flow-injection systems with inductively-coupled
argon plasma atomic emission-spectrometry. 1. Fundamental considerations.
Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.130, n.2, p. 243-255, 1981.
JOCHIMSEN, E.M.; CARMICHAEL, W.W.; An, J.; CARDO, D.; COOKSON, S.T.;
HOLMES, C.E.M.; ANTUNES, M.B.C.; MELO FILHO, D.A.; LYRA, T.M.; BARRETO,
V.; AZEVEDO S.M.F.O.; JARVIS, W.R. Liver failure and after exposure to
microcystins at a hemodialysis center in Brazil. New England Journal of Medicine,
Waltham, v.338, n.13, p.873-878, 1998.
KAEBERNICK, M.; NEILAN, B.A. Ecological and molecular investigations of
cyanotoxin production. FEMS Microbiology Ecology, Amsterdam, v.35, p.1-9, 2001.
KALBERG, B.; PACEY, G.E. Flow injection analysis: a practical guide. Amsterdam:
Elsevier, 1989. (Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, 10).
KORN, M.; GOUVEIA, L.F.B.P.; DE OLIVEIRA, E.; REIS, B.F. Binary search in flow
titration employing photometric end-point detection. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.313, n.3, p.177-187, 1995.
KORN, M.; PAIM, A.P.S.; BARROS, V.A.F.; REIS, B.F. Development of software to
perform data acquisition and processing in routine analysis employing flow injection
analysis. Química Nova, São Paulo, v.19, n.3, p.302-306, 1996.
KRONKA, E.A.M.; REIS, B.F. Spectrophotometric determination of iron and
aluminum in plant digests employing binary sampling in flow analysis. Química
Analítica, São Paulo, v.17, n.1, p.15-20, 1998.
KRONKA, E.A.M.; REIS, B.F.; KORN, M.; BERGAMIN FILHO, H. Multicommutation
in flow analysis. Part 5: Binary sampling for sequential spectrophotometric
determination of ammonium and phosphate in plant digests. Analytica Chimica
Acta, Amsterdam, v.334, n.3, p.287-293, 1996.
KUIPER-GOODMAN, T.; FALCONER, I.R.; FITZGERALD, D.J. (1999). Human
health aspects. In: CHORUS, I.; BARTRAM, J. (Ed.). Toxic cyanobacteria in water.
A Guide to their public health consequences, monitoring and management. London:
E&FN Spon, 1999. p.114-153.
LAVORANTE, A.F.; FERES, M.A.; REIS, B.F. Multi-commutation in flow analysis: A
versatile tool for the development of the automatic analytical procedure focused on
the reduction of reagent consumption. Spectroscopy Letters, London, v.39, n.6,
p.631-650, 2006.
79
LAWTON, L.A.; ROBERTSON, P.K.J.; CORNISH, B.J.P.A.; MARR, I.L.; JASPARS,
M. Processes influencing surface interaction and photocatalytic destruction of
microcystins on titanium dioxide photocatalysts. Journal of Catalysis, New York,
v.213, p.109-113, 2003.
LEMES, G.A.F.; YUNES, J.S. O ambiente e as cianobactérias. Ecos, Carreiros, v.25,
p.9-11, 2006.
LINDNER, P.; MOLZ, R.; YACOUB-GEORGE, E.; DÜRKOP, A.; WOLF, H.
Development of a highly sensitive inhibition immunoassay for microcystin-LR.
Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.521, p.37-44, 2004.
LUCA, G.C.; REIS, B.F. Simultaneous photometric determination of albumin and total
protein in animal blood plasma employing a multicommutated flow system to carried
out on line dilution and reagents solutions handling. Spectrochimica Acta Part A-
Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Oxford, v.60, n.3, p.579-583, 2004.
MAGALHÃES, V.F.; De SOARES, R.M.; AZEVEDO, S.M.F.O. Microcystin
contamination in fish from the Jacarepaguá Lagoon (Rio de Janeiro, Brazil),
ecological implication and human health risk. Toxicon, Oxford, v.39, p.1077-1085,
2001.
MARTELLI P.B.; REIS, B.F.; ARAUJO, A.N.; CONCEIÇÃO, M.; MONTENEGRO,
B.S.M. A flow system with a conventional spectrophotometer for the
chemiluminescent determination of lactic acid in yoghurt. Talanta, London, v.54, n.5,
p.879-855, 2001.
MARTELLI, P.B.; REIS, B.F.; KORN, M.; LIMA, J.L.F.C. Automatic potentiometric
titration in monosegmented flow system exploiting binary search. Analytica Chimica
Acta, Amsterdam, v.387, n.2, p.165-173, 1999.
MARTELLI, P.B.; REIS, B.F.; KORN, M.; RUFINI, I.A. The use of ion exchange resin
for reagent immobilization and concentration in flow systems. Determination of nickel
in steel alloys and iron speciation in waters. Journal of the Brazilian Chemical
Society, São Paulo, v.8, n.5, p.479-485, 1997.
MERILUOTO, J. Chromatography of microcystins. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.352, p.277-298, 1997.
MERILUOTO, J.; CODD, G.A. (Ed.). TOXIC: cyanobacterial monitoring and
cyanotoxin analysis. Abo, Finland: Abo Akademi University Press, 2005.
MICHALOWSHI, J.; KOJLO, A.; TROJANOWICK, M.; SZOSTEK, B.; ZAGATTO,
E.A.G. Simultaneous determination of sucrose and reducing sugars using indirect
flow-injection biamperometry. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.271, n.2,
p.239-246, 1993.
MOREDA-PINEIRO J.; CERVERA, M.L.; DE LA GUARDIA M. Direct determination of
arsenic in sea-water by continuous-flow hydride generation atomic fluorescence
80
spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, London, v.12, n.12,
p.1377-1380, 1997.
MORENO, I.; REPETTO, G.; CAMEÁN A. Interés toxicológico de las microcistinas.
Revista de Toxicología, Pamplona, v.20, p.159-165, 2003.
MURAKI, H.; HIGUCHI, K.; SASAKI, M.; KORENAGA, T.; TÔEI, K. Fully automated
system for the continuous monitoring of ammonium ion in fish farming plant sea
water by flow-injection analysis. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.261, n.1-2,
p.345-349, 1992.
NICHOLSON, B.C.; BURCH, M.D. Evaluation of analytical methods for detection
and quantification of cyanotoxins in relation to Australian drinking water
guidelines. Canberra: Commonwealth of Australia, 2001. 64p.
NISHIWAKI-MATSUSHIMA, R.; OHTA, T.; NISHIWAKI, S.; SUGANUMA, M.;
KOHYAMA, K.; ISHIKAWA, T.; CARMICHAEL, W.W.; FUJIKI, H. Liver tumor
promotion by the cyanobacterial cyclic peptide toxin mycrocistin-LR. Journal of
Cancer Research and Clinical Oncology, Berlin, v.118, p.420-424, 1992.
OHTA, T.; SUEOKA, E.; IIDA, N.; KOMORI, A.; SUGANUMA, M.; NISHIWAKI, R.;
TATEMATSU, M.; KIM, S.J.; CARMICHAEL, W.W.; FUJIKI, H. Nodularin, a potent
inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A, is a new environmental carcinogen in
male F344 rat liver. Cancer Research, Baltimore, v.54, p.6402-6406, 1994.
PAIM, A.P.S.; KRONKA, E.A.M.; REIS, B.F.; KORN, M. Spectrophotometric
determination of ascorbic acid in drugs employing binary sampling in flow system.
Química Nova, São Paulo, v.21, n.1, p.47-50, 1998.
PAIM, A.P.S.; REIS, B.F. An automatic spectrophotometric titration procedure for
ascorbic acid determination in fruit juices and soft drinks based on volumetric fraction
variation. Analytical Sciences, Tokyo, v.16, n.5, p.487-491, 2000.
PIRES, C.K.; MARTELLI, P.B.; REIS, B.F.; LIMA, J.L.F.C.; SARAIVA, M.L.M.F.S. An
automatic flow procedure for the determination of 3-hydroxybutyrate in animal serum
and plasma. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v.51, n.9,
p.2457-2460, 2003a.
PIRES, C.K.; MARTELLI, P.B.; REIS, B.F.; LIMA, J.L.F.C.; SARAIVA, M.L.M.F.S.
Multicommuted flow system for the determination of glucose in animal blood serum
exploiting enzymatic reaction and chemiluminescence detection. Journal of
Automated Methods & Management in Chemistry, Nasr City, Cairo, v.25, n.5,
p.109-114, 2003b.
PIRES, C.K.; REIS, B.F.; GALHARDO C.X.; MARTELLI, P.B. A multicommuted flow
procedure for the determination of cholesterol in animal blood serum by
chemiluminescence. Analytical Letters, New York, v.36, n.14, p.3011-3024, 2003c.
81
PITOIS, S.; JACKSON, M.H.; WOOD, B.J.B. Problems associated with the presence
of cyanobacteria in recreational and drinking waters. International Journal of
Environmental Health Research, London, v.10, p.203-218, 2000.
PITOIS, S.; JACKSON, M.H.; WOOD, B.J.B. Sources of the eutrophication problems
associated with toxic algae, an overview. Journal of Environmental Health, Denver,
v.64, p.25-32, 2001.
RAO, P.V.L.; GUPTA, N.; BHASKAR, A.S.B.; JAYARAJ, R. Toxins and bioactive
compounds from cyanobacteria and their implications on human health. Journal of
Environmental Biology, New Delhi, v.23, p.215-224, 2002.
RAPALA, J.; ERKOMAA, K.; KUKKONEN, J.; SIVONEN, K.; LAHTI, K. Detection of
microcystins with protein phosphatase inhibition assay, high-performance liquid
chromatography-UV detection and enzyme-linked immunosorbent assay.
Comparison of methods. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v. 466, p.213-231,
2002.
REIS, B.F.; ARRUDA, M.A.Z.; ZAGATTO E.A.G.; FERREIRA, J.R. An improved
monosegmented continuous-flow system for sample introduction in flame atomic
spectrometry. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.206, n.1-2, p.253-262, 1988.
REIS, B.F.; BERGAMIN, H.; ZAGATTO, E.A.G.; KRUG, F.J. Merging zones in flow
injection analysis. 3. Spectrophotometric determination of aluminum in plant and soil
materials with sequential addition of pulsed reagents. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.107, p.309-317, 1979.
REIS, B.F.; GINE, M.F.; ZAGATTO, E.A.G.; LIMA, J.L.F.C.; LAPA, R.A.
Multicommutation in flow-analysis. 1. Binary sampling-concepts, instrumentation and
spectrophotometric determination of iron in plant digests. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.293, n.1-2, p.129-138, 1994.
REIS, B.F.; ZAGATTO, E.A.G.; JACINTHO, A.O.; KRUG, F.J.; BERGAMIN, H.
Merging zones in flow-injection analysis. 4. Simultaneous spectrophotometric
determination of total nitrogen and phosphorus in plant-material. Analytica Chimica
Acta, Amsterdam, v.119, n.2, p.305-311, 1980.
ROCHA, F.R.P.; REIS, B.F.; ZAGATTO, E.A.G.; LIMA, J.L.F.C.; LAPA, R.A.S.;
SANTOS, J.L.M. Multicommutation in flow analysis: concepts, applications, and
trends. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.468, n.1, p.119-131, 2002.
RODENAS-TORRALBA E.; ROCHA F.R.P.; REIS B.F.; MORALES-RUBIO A.; DE LA
GUARDIA M. Evaluation of a multicommuted flow system for photometric
environmental measurements. Journal of Automated Methods & Management In
Chemistry, Nasr City, Cairo, art. nº 20384, 2006.
RUZICKA, J.; HANSEN, E.H. Flow injection analyses. Part I. A new concept of fast
continuous flow analysis. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.78, n.1, p.145-157,
1975.
82
RUZICKA, J.; HANSEN, E.H.; MOSBAEK, H; KRUG, F.J. Exchange of comments-
pumping pressure and reagent consumption in flow injection analysis. Analytical
Chemistry, Washington, v.49, n.12, p.1858-1861, 1977.
SHEN, P.P.; SHI, Q.; HUA. Z.C.; KONG, F.X.; WANG, Z.G.; ZHUANG, S.X.; CHEN,
D.C. Analysis of microcystins in cyanobacteria blooms and surface water samples
from Meiliang Bay, Taihu Lake, China. Environment International, New York, v.29,
p.641-647, 2003.
SIVONEN, K.; JONES, G. Cyanobacterial toxin. In: CHORUS, I.; BARTRAM, J. (Ed.).
Toxic cyanobacteria in water. A Guide to their public health consequences,
monitoring and management. London: E&FN Spon, 1999. p.41-111.
SMIDERLE, M.; REIS, B.F.; ROCHA, F.R.P. Monosegmented flow system exploiting
multicommutation applied to spectrophotometric determination of manganese in
soybean digests. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.386, n.1-2, p.129-135,
1999.
TOKARS, J.I.; ALTER, M.J.; MILLER, E.; MOYER, L.A.; FAVERO, M.S. National
surveillance of dialysis associated diseases in the United States - 1994. ASAIO
Journal, Lippincott, v.43, n.1, p.108-119, 1997.
TROJANOWICZ M.; WORSFOLD, P.J.; CLINCH, J.R. Solid-state photometric
detectors for flow-injection analysis. Trends in Analytical Chemistry, Amsterdam,
v.7, n.8, p.301-305, 1988.
TROJANOWICZ, M.; SZPUNARLOBINSKA, J.; MICHALSKI, Z. Multicomponent
analysis with a computerized flow-injection system using led photometric detection.
Mikrochimica Acta, Vienna, v.1, n.3-4, p.159-169, 1991.
TUMANG, C.A.; BORGES, E.P.; REIS, B.F. Multicommutation flow system for
spectrophotometric L (+) lactate determination in silage material using an enzymatic
reaction. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.438, n.1-2, p.59-65, 2001.
TUMANG, C.A.; PAIM, A.P.S.; REIS, B.F. Automatic flow system titration based on
multicommutation for spectrophotometric determination of total acidity in silage
extracts. Journal of AOAC International, Arlington, v.85, n.2, p.328-332, 2002.
TUMANG, C.D.; DE LUCA, G.C.; FERNANDES, R.N.; REIS, B.F.; KRUG, F.J.
Multicommutation in flow analysis exploiting a multizone trapping approach
spectrophotometric determination of boron in plants. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.374, n.1, p.53-59, 1998.
TYAGI, M.B.; THAKUR, J.K.; SINGH, D.P.; KUMAR, A. et al. Cyanobacterial toxins,
the current status. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, Basel,
v.9, p.9-21, 1999.
VASAS, G.; GÁSPÁR, A.; SURÁNYI, G.; BATTA, G.; GYÉMÁNT, G.; HAMVAS, M.
M.; MÁTHÉ, C.; GRIGORSZKY, I.; MOLNÁR, E.; BORBÉLY, G. Capillary
electrophoretic assay and purification of Cylindrospermopsin, a cyanobacterial toxin
83
from Aphanizomenon ovalisporum, by plant test (Blue-Green Sinapis Test).
Analytical Biochemistry, New York, v.302, p.95-103, 2002.
VIEIRA, J.A.; RAIMUNDO JUNIOR, I.M.; REIS, B.F.; CONCEIÇÃO, M.;
MONTENEGRO, M.C.B.S.M.; ARAÚJO, N.N. Monosegemented flow potentiometric
titration for the determination of chloride in milk and wine. Journal of the Brazilian
Chemical Society, São Paulo, v.14, n.2, p.259-264, 2003.
WHO, Guidelines for drinking-water quality: addendum to volume 2, health criteria
and other supporting information. Geneva: WHO, 1998. p.94-110.
YUAN, M.; CARMICHAEL, W.W.; HILBORN, E.D. Microcystin analysis in human
sera and liver from human fatalities in Caruaru, Brazil 1996. Toxicon, Oxford, v.48,
p.627-640, 2006.
ZAGATTO, E.A.G.; KRUG, F.J.; BERGAMIN FILHO, H.; JORGENSEN, S.S.; REIS,
B.F. Merging zones in flow injection analysis. Part 2. Determination of Calcium,
Magnesium and Potassium in Plant Material by Continuous Flow Injection Atomic
Absorption and Flame Emission Spectrometry. Analytica Chimica Acta,
Amsterdam, v.104, n.2, p.279-284, 1979a.
ZAGATTO, E.A.G.; KRUG, F.J.; BERGAMIN, H.; JORGENSEN, S.S.; REIS, B.F.
Merging zones in flow injection analysis. 2. Determination of calcium, magnesium
and potassium in plant material by continuous-flow injection atomic-absorption and
flame emission spectrometry. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.104, n.2,
p.279-284, 1979b.
ZAGATTO, E.A.G.; ARRUDA, M.A.Z.; JACINTHO, A.O.; MATTOS, I.L.
Compensation of the Schilieren effect in flow-injection analysis by using dual-
wavelength spectrophotometry. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.234, n. 1, p.
153-160, 1990.
ZAITSU, K.; NAKAYAMA, M.; OHKURA, Y. Sensitive flow-injection determination of
L-lactate in human blood with immobilized enzyme columns and fluorimetric
detection. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v.201, p.351-355, 1987.
ZECK A.; WELLER M.G.; NIESSNER, R. Multidimensional biochemical detection of
microcystins in liquid chromatography. Analytical Chemistry, Washington, v.73,
p.5509-5517, 2001.
ZHENG, X.; ZHAN, Z. Flow injection chemiluminescence determination of ionized
using on-line electrogenerated BrO-as an oxidant. Analyst, Cambridge, v.124, p.763-
766, 1999.
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