( PDF ) Detecção molecular de herpesvírus bovino (bohv) em bovinos com doenças neurológicas no estado de Mato Grosso

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

DETECÇÃO MOLECULAR DE HERPESVÍRUS BOVINO (BOHV) EM

BOVINOS COM DOENÇAS NEUROLÓGICAS NO ESTADO DE MATO

GROSSO

LAURA PEIXOTO DE ARRUDA

C u i a b á - MT

2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

DETECÇÃO MOLECULAR DE HERPESVÍRUS BOVINO (BOHV) EM

BOVINOS COM DOENÇAS NEUROLÓGICAS NO ESTADO DE MATO

GROSSO

Autor: Laura Peixoto de Arruda

Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel

Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Universidade Federal de Mato Grosso para a

obtenção do título de Mestre em Ciências

Veterinárias.

Área de Concentração: Sanidade Animal.

Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel.

Co-Orientador: Prof. Luciano Nakazato

C u i a b á - MT

2009

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

O p Arruda, Laura Peixoto.

Detecção molecular de Herpesvírus Bovino tipo 1 e 5 (BoHV 1 e BoHV5) em

amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso

conservadas em formol e infiltradas em parafina.

Laura Peixoto de Arruda - Cuiabá, 2009.

63f.

Dissertação (Mestre em Ciência Veterinária) – Programa de Pós- Graduação em

Ciências Veterinárias, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,

Universidade Federal de Mato Grosso.

Orientador(a): Prof Dr. Edson Moleta Colodel

Co-orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato

1. Medicina Veterinária. 2. Patologia Veterinária. 3. Herpesvírus Bovino (BoHV-1 e

BoHV-5) 4. Reação em cadeia pela Polimerase 5. Doenças neurológicas 6. Mato

Grosso I. Universidade Federal de Mato Grosso

CDU

CERTIFICADO DE APROVAÇÃO

Aluna: LAURA PEIXOTO DE ARRUDA

Título: Detecção molecular de Herpesvírus Bovino (BoHV) em bovinos com

doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Universidade Federal de Mato Grosso para a

obtenção do título de Mestre em Ciências

Veterinárias

Aprovado em:

Banca Examinadora:

Prof. Dr.: Edson Moleta Colodel (Orientador)

Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT

Assinatura:___________________________

Prof. Dr.: Ricardo Antônio Amaral de Lemos (Membro)

Instituição: FMVZ/UFMS

Assinatura:___________________________

Profª. Dra.: Caroline Argenta Pescador (Membro)

Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT

Assinatura:___________________________

Profº. Dr.: Luciano Nakazato (Suplente)

Instituição:CLIMEV/FAMEV/UFMT

Assinatura:___________________________

Dedicatória

Dedico este trabalho à Laurita

e Anacleto, meus queridos

pais, os maiores dharmas que

ganhei na minha existência;

aos meus irmãos Felipe e

Thales, que também sempre

foram dharmas na minha vida.

Juntos, formamos o quinteto

fantástico.

Agradecimentos

A Deus, à minha Mãe e meu Pai, por me impulsionarem a cada dia nesta

existência difícil.

Aos meus pais Anacleto e Laurita, os quais sempre estiveram ao meu lado,

fonte eterna de carinho, compreensão, amor, exemplo, dedicação, apoio, e que

tornaram possível a realização deste mestrado.

Aos meus irmãos Felipe, Thales e também Larissa, por toda a companhia,

amor e carinho, principalmente todos os dias quando eu chegava à noite em casa e

cansada. Obrigada pelas brincadeiras, piadas, abraços, sustos, puxões de orelha,

ombro para desabafar e por todos os momentos de alegria, estresse, ansiedade ou

tristeza vividos.

Ao meu orientador Edson Moleta Colodel, por todo aprendizado que tive, pela

paciência em todas as situações difíceis ou estressantes, pelo companheirismo em

todos os momentos compartilhados no laboratório ou fora dele, por toda ajuda, por

toda compreensão, por ser um exemplo de sabedoria, e sabe, sempre me

entusiasmei e fiquei feliz ao ser chamada de uma das “crias do Moleta”.

À equipe do laboratório de Patologia Veterinária da UFMT (LPV-UFMT), cuja

convivência diária chegou a ser quase maior do que com minha própria família,

sendo, portanto, minha segunda família por todo este período. Primeiramente à

Raquel e Naiani, que me proporcionaram infinitos motivos para sorrir, tornaram mais

fáceis e divertidas as diversas situações estressantes ou trabalhosas vividas no lab

e fora dele. Amigas eternas. Agradeço também à Fabiana Boabaid, Zebu (Eduardo),

Nádia, Patrícia, Danúbia, Paulo Ricardo, Frodo e Sam (Gustavo e Flávio), Mayara,

Natália, Pâmela, Daniel, Salsicha, também ao técnico e amigo Manoel, por todos os

momentos inesquecíveis vividos.

Ao professores amigos queridos Marcos Souza e Caroline Pescador, por

todo aprendizado, ajuda e companheirismo que me proporcionaram no LPV.

À minha querida amiga e psicóloga Evelyn Arruda, pelos ótimos momentos de

alegrias e risadas, pelo apoio, paciência, pela parceria ímpar e por todos os

passeios de moto quando eu sempre cantarolava na garupa.

Aos meus queridos companheiros de Orquestra Sinfônica da UFMT, em

especial meu professor de trompa e amigo Edson Lopes, Odenil, Patrícia Andrade,

Cecília, maestro Fabrício e demais músicos. Confesso que esta terceira família me

proporcionou sempre um maravilhoso bem estar quando as diversas músicas e

sinfonias faziam parte das nossas vidas.

Aos amigos distantes Luciana Dalcin, Eduardo Guaraná, Rodrigo Prado, aos

parentes distantes Romeuzinho e Raquel Peixoto, Lídia, Nanci, Reginalda, Aridelço,

que mesmo não estando sempre presentes, me acompanharam nesta jornada.

Também aos amigos Baby (Bárbara Provenzano), Lucas Andreatta, Fernando e

Ricardo Moraes, Marcos Zarzenon, Rafael Paes, Simone e Tatiane Hirata, Hilvanete,

Juliana Normando e Ana Paula Nicolini, pela amizade e convivência nos mais

diversos momentos.

Ao “Lê”, “huumm”, “Shrimp”, meu anjo, meu lindo Leandro Lima Uliano, que

me faz até faltar as palavras. Conseguiu me fazer companhia e ser tão presente em

minha vida mesmo estando distante.

Aos avós Avany, Anacleto e também vovó Laura, embora eu não faça mais

parte da sua memória em função do Alzheimer.

Ao laboratório de Microbiologia Veterinária e Biologia Molecular Veterinária,

em especial ao professor e co-orientador Luciano Nakazato, Professora Valéria

Dutra, por todo auxílio e acompanhamento; à Daphine e Juçara, pelo aprendizado,

paciência e por serem meu primeiro socorro quando as dúvidas apareciam. Aos

mestrandos Ana Carolina e João, por todo companheirismo e compartilhar os

diversos momentos noturnos, finais de semana e até a incrível situação de falta de

luz; a amizade e todas as situações vividas são inesquecíveis.

Aos meus novos amigos da Unic, em especial ao querido amigo e

companheiro de trabalho Dulcindo, à Glenda Teles e demais estagiários do

Laboratório de Patologia do Hovet-Unic e ao Lázaro Camargo, chefe e amigo ao

qual eu admiro intensamente por ser um exemplo de pessoa e profissional.

Aos animais, em especial July, Cléo e Figura. Ao Tufo e Flecha, que deixaram

saudades, e a todos os animais que contribuíram para o conhecimento e

aprendizado.

RESUMO

Infecção por Herpesvirus é uma das principais causas de doença do sistema

nervoso em bovinos na região Centro-Oeste do Brasil. O uso de técnicas

moleculares para caracterização diagnóstica representa uma contribuição importante

para o estudo dessa doença. Relatamos o uso de técnica específica de PCR

multiplex para identificar o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) e tipo 1 (BoHV-1) em

76 amostras de encéfalo de bovinos fixados em formol e incluídos em parafina, com

9 destas em duplicidade para tecidos congelados. Com base nas alterações

histológicas as amostras foram separadas em 2 grupos. Dentre 40 amostras de

meningoencefalite necrosante com características histológicas de infecção por BoHV

houve amplificação de DNA de BoHV-5 em 16 amostras e em 36 amostras com

lesões histológicas classificadas como encefalite não purulenta inespecífica ocorreu

amplificação do DNA de BoHV-5 em 12 amostras. Não houve amplificação de

BoHV-1 nos encéfalo estudadas.

Termos de indexação: Herpesvírus bovino, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato

Grosso.

ABSTRACT

Herpesvirus is one of the main causes of neurological diseases of cattle in the

Midwest Region of Brazil. The application of molecular diagnostic techniques

represents an important contribution for herpesvirus study. This report describes the

detection of BoHV-5 and BoHV-1 by a specific multiplex PCR assay in seventy-six

central nervous system (CNS) samples including paraffin-embedded, and in nine

samples those both in fresh frozen and paraffin-embedded. The samples were

divided in 2 groups according to histological features: Group 1-necrotizing

meningoencephalitis characteristic of BoHV infecction (40 samples), Group 2-

mononuclear encephalitis nonspecific (36 samples). The positive case for BoHV-5 in

paraffin-embebbed tissues in each group was 40% and 33,3%, respectively. BoHV-1

was negative in all samples tested.

Index terms: Bovine herpesvirus, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso.

LISTA DE FIGURAS

Páginas

Figura 1: Meningoencefalite por Herpesvírus bovino. A- Infiltrado

inflamatório mononuclear perivascular moderado (manguito

perivascular). HE. Obj. 40X. B- Corpúsculo de inclusão

intranuclear eosinofílico em astrócito (seta). HE. Obj. 100X.

Figura 2: Meningoencefalite necrosante. A- Desaparecimento do

córtex encefálico e infiltrado inflamatório predominando

macrófagos (células guitter). HE. Obj 10X. B- Células

guitter em fagocitose (detalhe da Fig. 2.A ). HE. Obj 40X

Figura 3: PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5.

Eletroforese em gel de agarose a 2%. Amostras em

parafina.

Figura 4: PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5.

Eletroforese em gel de agarose a 2%. Amostra congelada.

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1: Municípios de procedência das amostras 59

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATP: adenosina trifosfato

BoHV-1.3: Herpesvírus Bovino tipo 1.3

BoHV-1: Herpesvírus Bovino tipo 1

BoHV-5: Herpesvírus Bovino tipo 5

BSE: Encefalopatia Espongiforme Transmissível

BT: células turbinadas de bovino para cultivo celular

DNA: ácido desoxirribonucléico

ELISA: enzime-linked immunosorbent assay

gB: glicoproteína B

HS1 e HS2: Herpes Simples Humano 1 e 2

IBR: Rinotraqueíte Infecciosa Bovina

IFD: Imunofluorescência direta

IHQ: imuno-histoquímica

IIC: Inoculação intracerebral em camundongo

IPV: Vulvovaginite Pustular Infecciosa

IPX: imunoperoxidase

Kb: kilobase

mg/kg: miligrama por kilo de peso vivo

Nested-PCR:

NO: óxido nítrico

pb: pares de base

PCR: Reação em cadeia pela polimerase

PEM: polioencefalomalacia

PI: pós-infecção

SNC: Sistema Nervoso Central

UC: região ultra curta do DNA

UL: região ultra longa do DNA

ANEXOS

Páginas

1. Protocolo de Extração de DNA – Material Congelado

2. Protocolo de Extração de DNA – Material em parafina

SUMÁRIO

Páginas

1. Introdução

2. Revisão Bibliográfica

2.1. Meningoencefalite por Herpesvírus tipo 5

1.1. Etiologia

2.1.2

Epidemiologia

2.1.3. Patogenia

e sinais clínicos

.1.4. Achados de

ecropsia e histopatológico

2.1.5. Diagnóstico

1.6. Diagnóstico Diferencial

2.1.6.1. Polioencefalomalacia

1.6.2. Meningoencefalites

1.7. Tratamento e profilaxia

3. Material e Métodos

4. Resultados

5. Discussão

6. Conclusão

Referências Bibliográficas

Considerações Iniciais

1. INTRODUÇÃO

Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos abrangem

um grupo de enfermidades importantes que incluem principalmente as doenças

infecciosas e degenerativas (RIET-CORREA et al., 2002). A identificação, em

meados da década de 1980, da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e o

surgimento da variante da doença humana Creutzfeldt-Jakob (vCJD) realçou a

importância socio-econômica e de saúde pública das doenças que acometem o

SNC (BARROS et al., 2006).

Na região Centro-Oeste, assim como em várias regiões do país as

principais enfermidades que afetam o SNC de bovinos são causadas por vírus,

destacando-se entre elas a raiva, meningoencefalite por BoHV-5 e febre

catarral maligna (BARROS et al., 2006; SANCHES et al., 2000; MENDONÇA et

al., 2008). A polioencefalomalacia é uma doença degenerativa importante nesta

região, que pode estar associada com intoxicação por enxofre (GOULD, 1998),

sal (NAKAZATO et al., 2000), chumbo (DRIEMEIER & BARROS, 2007),

distúrbios no metabolismo da tiamina (LEMOS & RIET-CORREA, 2007), mas

que permanece com a patogenia ainda não completamente elucidada.

A ocorrência de meningoencefalite por herpesvirus em bovino foi

relatada no Estado de Mato Grosso (COLODEL et al., 2002) sendo a doença

neurológica inflamatória mais importante para bovinos no Estado, depois da

raiva bovina (UBIALI et al., 2008).

O BoHV-5 é um vírus pertencente à família Herpesviridae, subfamília

Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ROIZMAN, 1992). Devido às

semelhanças com estirpes virais respiratórias e genitais, o BoHV-5 foi

inicialmente classificado como BoHV-1.3. Posteriormente, com base em

diferenças epidemiológicas, antigênicas e moleculares, houve a proposta de

reclassificação, na qual o BoHV-5 passou a compor uma nova espécie da

família Herpesviridae. Com relação à composição genômica, o DNA do BoHV-5

apresenta similaridade de 85% com o BoHV-1 (DELHON et al., 2003). Embora

surtos de meningoencefalite por herpesvírus sejam previamente atribuídos a

BoHV-1 em países, como Austrália, Estados Unidos, Canadá e Uruguai, a

maior freqüência desta enfermidade tem sido observada principalmente no

hemisfério sul, em países como Argentina e Brasil (BARROS et al., 2006).

Neste último, a doença foi relatada no Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, São

Paulo, Mato Grosso do Sul (SILVA et al., 2007a), Goiás (PAULA et al., 2005),

Pará (RIET-CORREA et al., 2006), Minas Gerais (GOMES et al., 2002) e Mato

Grosso (COLODEL et al., 2002).

A infecção pelo BoHV-5 em bovinos determina um quadro neurológico

que inclui diversos sinais clínicos. Entretanto, estudos demonstram que tanto o

BoHV-1 como o BoHV-5 podem não estar estritamente associados às suas

respectivas síndromes clínicas e estarem envolvidos em casos clínicos

classicamente atribuídos ao outro vírus (SILVA et al., 2007a; GOMES et al.,

2003).

Diversos estudos têm proposto a utilização de técnicas moleculares na

rotina de diagnóstico do BoHV-5 e diferenciação do BoHV-1, como a PCR e

nested-PCR (SILVA et al. 2007, CLAUS et al. 2005, ASHBAUGH et al. 1997,

ELY et al. 1996) sendo estas específicas e práticas, além de outras técnicas

existentes, a imuno-histoquímica (HÜBNER et al. 2005, VOGUEL et al. 2003,

MEYER et al. 2001), cultivo celular (SOUZA et al. 2002) e análise de restrição

enzimática (D’ARCE et al. 2002).

Métodos que permitam detecção viral em materiais inclusos em parafina

auxiliam a expansão do conhecimento sobre a importância dos herpevírus

bovinos permitindo estudos retrospectivos de prevalência de BoHV-5 e BoHV-

1, já que a similaridade entre os dois vírus e a dificuldade em diferenciação

sorológica não permitiam levantamento adequado da prevalência de infecção

por esses vírus (ROEHE et al. 1998).

Neste trabalho, demonstramos uma técnica para detecção molecular, de

Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5) e o Herpesvírus Bovino 1 (BoHV-1), em

amostras, infiltradas em parafina, de encéfalo de bovinos com doença

neurológica. Selecionamos amostras do arquivo do Laboratório de Patologia

Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT) entre os

anos 1999 a 2008 que foram testadas negativas para Raiva e que tinham como

principais alterações meningoencefalite necrótica e meningoencefalite não

purulenta inespecífica.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Meningoencefalite por Herpesvirus tipo 5

2.1.1 ETIOLOGIA

O Herpesvirus Bovino tipo 5 (BoHV-5) é um vírus pertencente à família

Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ROIZMAN

et al., 1992). Nesta família estão incluídos importantes vírus como o Herpes

Simples Humano (HS1 e 2), vírus da doença de Aujeszky e da rinopneumonite

eqüina, entre outros (HALFEN & RIET-CORREA, 2007). Os vírus da subfamília

Alphaherpervirinae apresentam como características gerais o diâmetro de

aproximadamente 70 a 110 nm, genoma DNA linear de fita dupla com

aproximadamente 137 kilobases (Kb) constituído por uma região única longa

(UL) e outra única curta (US); nucleocapsídeo icosaédrico com 162

capsômeros e envelope glicoprotéico (FENNER et al., 1993). Os herpesvírus

codificam várias enzimas envolvidas no metabolismo do ácido nucléico como a

timidina kinase (TK), timidina sintetase, dUTPase e ribonucleotídeo redutase,

além daquelas que participam da síntese do DNA como a DNA polimerase, a

helicase e a primase (ROIZMAN et al., 1992). Atualmente são descritas 10

glicoproteínas do envelope viral, denominadas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK ,

gL, e gM. Estas glicoproteínas possuem diferentes propriedades antigênicas,

funções na replicação viral e interações com a célula infectada (ACKERMANN

et al., 1982). As glicoproteínas gB, gC e gD são importantes componentes

imunogênicos e estão envolvidas nas interações iniciais com a célula

hospedeira. A gC é considerada a mais imunogênica e está relacionada à

adsorção, enquanto a gB e a gD estão envolvidas na penetração e fusão da

partícula viral às células alvo (BABIUK et al., 1996). Uma das propriedades

biológicas mais importantes da família Herpesviridae é a habilidade de

estabelecer latência em neurônios dos gânglios sensoriais após a infecção

aguda (STEVENS, 1994). A capacidade de estabelecer e posteriormente

reativar da infecção latente desempenha um papel fundamental na

perpetuação desse vírus na natureza (ROCK, 1994).

Os primeiros isolamentos de herpesvírus a partir de animais com sinais

clínicos neurológicos foram atribuídos ao BoHV-1, vírus associado a várias

síndromes, tais como a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite

pustular infecciosa (IPV), balanopostite, conjuntivite e abortos. Porém, estudos

preliminares já apontavam diferenças entre os herpesvírus isolados de focos de

encefalite, daqueles isolados de focos de problemas respiratórios e/ou genitais

(METZLER et al., 1986; RIET-CORRÊA et al., 1989; COLLINS et al., 1993;

D’OFFAY et al., 1993). Devido às semelhanças com estirpes virais respiratórias

e genitais, inicialmente o BoHV-5 foi classificado como BoHV-1.3.

Posteriormente, com base em diferenças epidemiológicas, antigênicas e

moleculares, houve a proposta de reclassificação, na qual o BoHV-5 passou a

compor uma nova espécie da família Herpesviridae. Entretanto, a maior

diferença entre o BoHV-1 e o BoHV-5 está na capacidade do BoHV-5 invadir e

replicar-se no SNC, determinando enfermidade neurológica (ROIZMAN et al.,

1992; BELKNAP et al., 1994). Com relação à composição genômica, o DNA do

BoHV-5 apresenta similaridade de 85% com o BoHV-1. Sugere-se que as

diferenças na seqüência de nucleotídeos entre esses dois vírus estejam

distribuídas por todo o genoma (CHOWDHURY, 1995).

2.1.2 EPIDEMIOLOGIA

A diferenciação sorológica entre o BoHV-1 e o BoHV-5 é de difícil

realização devido à ocorrência de reações cruzadas que não permitem o

estabelecimento da proporção de animais supostamente infectados com o

BoHV-1, que na verdade foram infectados com o BoHV-5. Dessa forma é

desconhecida a prevalência do BoHV-5 no mundo (ROEHE et al., 1997).

Porém, surtos de meningoencefalite necrosante herpética têm sido relatados

em vários países como Austrália (JOHNSTON et al., 1962), Estados Unidos

(BARENFUS et al., 1963), Hungria (BARTHA et al., 1969), Canadá (BECK,

1975), Argentina (CARRILLO et al., 1983) e Uruguai (DIAS et al., 1982). No

Brasil já foram descritos casos clínicos ocorridos nos Estados do Rio Grande

do Sul (RIET-CORRÊA et al., 1989; WEIBLEN et al., 1989; SCHILD et al.,

1994; ELIAS et al., 2004), Mato Grosso (COLODEL et al., 2002), Mato Grosso

do Sul (SALVADOR et al., 1998), Goiás (PAULA et al., 2005), São Paulo

(SALVADOR et al., 1998), Paraná (HALFEN & RIET-CORREA, 2007), Rio de

Janeiro, Minas Gerais (SILVA et al., 2007a; GOMES et al., 2002) e Pará (RIET-

CORRÊA et al., 2006). Embora não existam relatos da infecção em outros

Estados, sugere-se que o BoHV- 5 seja enzoótico em todo o país (SOUZA et

al., 2002).

A faixa etária acometida é ampla e a doença ocorre na forma de surtos

ou casos esporádicos. Em Mato Grosso, surtos de meningoencefalite por

herpes afetaram animais de 2 a 72 meses, embora o maior número de casos

ocorreu em bovinos com idade próxima a 24 meses (COLODEL et al., 2002).

No Rio Grande do Sul, surtos ocorrem em animais jovens, entre 1 e 18 meses

de idade (RISSI et al., 2006) embora em alguns casos sejam descritas

ocorrências até 2 anos e meio de idade (RIET-CORREA et al., 1996). No

Brasil, a maioria dos casos ocorre em animais jovens de 13-18 meses

(BARROS et al., 2006).

A morbidade e mortalidade geralmente são baixas, variando de 0,05 a

5% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006). Considerando a morbidade e

mortalidade estipulada dentro de um lote afetado, os índices de morbidade e

mortalidade variam entre 0,8 e 22% (COLODEL et al., 2002). A letalidade

geralmente é próxima a 100% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006)

embora em alguns surtos sejam encontrados índices de letalidade em torno de

75% ou menos (ELIAS et al., 2004).

A meningoencefalite por herpes não possui caráter sazonal e afeta

bovinos de ambos os sexos e diferentes raças. Atinge principalmente animais

criados extensivamente em pastagens e raramente ocorre em animais

confinados (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al. 2002;ELIAS et al., 2004).

Os surtos da doença geralmente estão associados a condições de estresse

relacionadas a diversas práticas de manejo, como desmame, castração,

vacinação, transporte, troca de pastos, modificações na alimentação ou

intempéries (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et al. 2006). A

enfermidade também pode estar associada a introdução de bovinos de outros

locais, favorecendo a disseminação viral em novos rebanhos (COLODEL et al.

2002; SALVADOR et al., 1998).

2.1.3 PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS

O Herpesvírus Bovino tipo 5 é transmitido principalmente por contato

direto, embora também possa ocorrer por contato indireto. A mucosa nasal,

orofaríngea e ocular são sítios de replicação primária. O vírus invade

terminações nervosas e é transportado ao encéfalo, onde o BoHV-5 pode se

replicar ativamente ou estabelecer latência (ENGELS & ACKERMANN, 1996;

VOGUEL et al., 2003). A principal via de acesso do vírus ao encéfalo, segundo

estudos experimentais em coelhos e bovinos, é através da mucosa nasal e

trato olfatório (VOGUEL et al. 2003; BELTRÃO et al., 2000) embora o vírus

possa utilizar outras rotas de acesso, como as fibras sensoriais e autonômicas

que compõem o nervo trigêmeo, sendo este um acesso mais lento e menos

eficiente (BELTRÃO et al., 2000; DIEL et al., 2005).

O período de incubação é em geral de 10-15 dias, mas o vírus pode ficar

latente, e a doença pode ocorrer vários meses após a infecção (PEREZ et al.,

2002). O gânglio de Gasser constitui o principal local de latência, embora o

DNA viral também seja detectado, por PCR, no córtex cerebral, tálamo,

mesencéfalo, ponte, medula, cerebelo e menos frequentemente no bulbo

olfatório (VOGUEL et al., 2003). A reativação e excreção do vírus pode ocorrer

naturalmente, em situações de estresse e experimentalmente com

administração de dexametasona (PEREZ et al., 2002; VOGUEL et al., 2003).

Geralmente, na reativação viral os animais não apresentam sinais clínicos, mas

em infecções experimentais em bovinos, o reaparecimento dos sinais e

desenvolvimento de enfermidade neurológica tem sido frequente (VOGUEL et

al., 2003; PEREZ et al., 2002). A eliminação de BoHV-5 ocorre até o 17º dia

pós-infecção (PI) nas secreções nasais e até o 9º dia PI nas secreções orais; o

pico de eliminação viral ocorre 4-7 dias PI (BARROS et al., 2006).

Os animais afetados apresentam sinais clínicos caracterizados por

anorexia, corrimento nasal e ocular, isolamento do rebanho (COLODEL et al.,

2002; SALVADOR et al., 1998, HALFEN & RIET, 2007), depressão profunda

(RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002;

RISSI et al., 2006), febre (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et

al., 2006), sialorréia (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et

al., 2006), cegueira (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998;

COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; HALFEN &

RIET 2007), nistagmo (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002),

marcha para trás ou andar em círculos (SALVADOR et al., 1998; ELIAS et al.,

2004), pressão da cabeça contra objetos (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al.,

2004; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET 2007), tremores musculares

(COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004), deambular cambaleante,

inabilidade para ingestão de água ou apreensão de alimentos, paralisia da

língua (COLODEL et al., 2002; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET, 2007),

bruxismo (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006), decúbito prolongado com

dificuldade para voltar à estação e, decúbito esternal evoluindo para decúbito

lateral, movimentos de pedalagem, opistótono e morte (RIET-CORREA et al.,

1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004;

BARROS et al., 2006; RISSI et al., 2006; HALFEN & RIET, 2007). O curso da

enfermidade é de 3-15 dias, com evolução média de 6 dias (BARROS et al.,

2006). Nos casos de evolução mais longa os animais também apresentam

emagrecimento progressivo (SALVADOR et al., 1998).

2.1.4 ACHADOS DE NECROPSIA E HISTOPATOLÓGICO

Na necropsia com frequência não são evidenciadas lesões significativas

(SALVADOR et al., 1998; MEYER et al., 2001; COLODEL et al., 2002; RISSI et

al., 2006;). As alterações encontradas variam de acordo com a intensidade de

lesões degenerativas e inflamatórias do encéfalo. As principais alterações

macroscópicas incluem malácia cortical, comumente localizada no córtex

frontal telencefálico, iniciando como áreas tumefeitas, marrom-amareladas ou

hemorrágicas e que se tornam gelatinosas e acinzentadas com a progressão

da doença (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; BARROS et al.,

2006; RISSI et al., 2006). Em outras porções do encéfalo também são descritas

eventualmente a ocorrência de áreas gelatinosas na substância cinzenta

(malácia) do tálamo, núcleos da base e cápsula interna (ELIAS et al., 2004;

RISSI et al., 2006). Nos casos mais avançados ocorrem depressões

acentuadas indicando desaparecimento segmentar do córtex telencefálico, por

vezes com aspecto granular ao corte (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al.,

2004; RISSI et al., 2006). Outras alterações encontradas incluem hiperemia

difusa das leptomeninges (RISSI et al., 2006; BARROS et al., 2006),

achatamento de circunvoluções, protrusão cerebelar pelo forâmen magno,

congestão e focos de hemorragia submeningeana (RIET-CORREA et al., 1989;

SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002, PEREZ et al. 2002).

Microscopicamente, a infecção por herpesvírus causa meningoencefalite

não-supurativa com malácia em diversas áreas do SNC, caracterizada por

gliose focal e/ou difusa, infiltrado inflamatório perivascular misto, principalmente

composto por linfócitos, plasmócitos e macrófagos, por vezes com número

discreto de neutrófilos, localizados tanto na substância branca quanto cinzenta,

mais pronunciados na substância branca, podendo formar até 16 camadas

(SALVADOR et al., 1998; ELIAS et al., 2004). Há necrose não laminar

ocorrendo principalmente na substância cinzenta do córtex cerebral, cujas

alterações variam de acordo com o grau de evolução da doença. As lesões

mais recentes são caracterizadas por necrose neuronal aguda (neurônios

eosinofílicos e retraídos, satelitose, neuronofagia), tumefação do endotélio

vascular, aumento do espaço perineuronal e perivascular, espongiose da

neurópila em camadas corticais profundas (COLODEL et al., 2002; BARROS et

al., 2006). Corpúsculos de inclusão eosinofílicos intranucleares são observados

em neurônios, mas principalmente astrócitos tumefeitos com núcleo aumentado

de volume e com cromatina rebatida formando um halo periférico.

Ocasionalmente, são encontrados corpúsculos basofílicos que ocupam todo o

núcleo de tamanho aumentado (RIET-CORREA et al., 1989;; SALVADOR et

al., 1998;COLODEL et al., 2002; RISSI et al., 2006). Em alguns relatos os

corpúsculos de inclusão não são encontrados (BARENFUS et al., 1963;

CARRILLO et al., 1983) ou raramente vistos (GEORGE et al., 1991). Com a

progressão da enfermidade, superior a 3 dias observa-se infiltrado de

macrófagos de citoplasma espumoso (células Gitter) nas áreas de malácia e

região submeningeana. Ocasionalmente encontram-se áreas descorticadas,

com substituição da neurópila por células Gitter e as meninges repousando

sobre os vasos sanguíneos. No tálamo, cápsula interna, núcleos da base,

tubérculo quadrigêmeo, ponte, cerebelo e medula oblonga e medula cervical a

malácia geralmente é caracterizada por múltiplos nódulos gliais nos casos

menos avançados e por acúmulos focais de macrófagos nos casos com lesões

mais severas (SALVADOR et al., 1998) ou também são vizualizadas áreas

contendo neurônios retraídos, fortemente eosinofílicos, gliose difusa ou

multifocal e aumento dos espaços perivasculares (ELIAS et al., 2004). Segundo

RISSI et al. (2006) a intensidade das lesões quanto a localização no encéfalo,

foi mais acentuada, em ordem decrescente, na região cortical dos lobos

frontais do telencéfalo, na cápsula interna e núcleos da base, no tálamo, no

tronco encefálico, no córtex parietal, córtex occipital e cerebelo.

2.1.5 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da Meningoencefalite por Herpesvírus tipo 5 pode ser

presuntivo com base na anamnese, epidemiologia, sinais clínicos, achados de

necropsia e histopatológicos característicos (ELIAS et al., 2004; RISSI et al.,

2006; COLODEL et al., 2006). No entanto, a histopatologia associada a

inclusões intranucleares não distingue entre BoHV-5 e BoHV-1.

No diagnóstico laboratorial indireto, a sorologia tem valor limitado, uma

vez que os métodos rotineiros disponíveis para a detecção de anticorpos não

diferenciam animais infectados pelo BoHV-5 daqueles infectados pelo BoHV-1

(TEIXEIRA et al., 2001). Entretanto, há diferenciação sorológica entre os dois

vírus através da técnica ELISA de bloqueio monoclonal para glicoproteína E

(gE) de BoHV-1, que permite distinguir anticorpos anti-BoHV-1 de anticorpos

anti-BoHV-5 (WELLEMBERG et al., 2001).

As técnicas de diagnóstico confirmatórias envolvem o isolamento do

BoHV- 5 do encéfalo ou de secreção nasal dos animais doentes, podendo ser

realizado em células de linhagem de rim bovino CRIB, MDBK (Madin Darby

bovine kidney), cultivos primários de células de testículo de terneiro (TT), de

pulmão de feto bovino e de células turbinadas de bovino (BT),observando o

efeito citopático e confirmação através de testes de soroneutralização ou

imunofluorescência (RIET-CORRÊA et al., 1989; BELKNAP et al., 1994;

D’OFFAY et al., 1995; SALVADOR et al., 1998; MEYER et al., 2001;

KUNRATH et al., 2004), cuja distinção entre BoHV-5 e BoHV-1 pode ser

realizada através de utilização de anticorpos monoclonais contra as

glicoproteínas do envelope viral (OLDONI et al., 2004; KUNRATH et al., 2004).

O mesmo pode ser realizado através da prova de imunoperoxidase (IPX) sobre

cultivo de células infectadas (ROEHE et al., 1997; VOGUEL et al., 2002).

Em tecidos fixados em formol e inclusos em parafina, a imuno-

histoquímica (IHQ) é a técnica mais indicada. A marcação por anticorpo

primário para BoHV-5 detecta antígenos virais com concentrações diferentes

em vários locais do sistema nervoso central, sendo mais intenso na região

cortical do telencéfalo. Há marcação de neurônios, células da glia, macrófagos

(D’OFFAY et al., 1995) e células mononucleares do infiltrado perivascular

(HÜBNER et al., 2005). A otimização da técnica permite a detecção inclusive

em material de arquivo, através de métodos adequados de recuperação

antigênica associado a anticorpos eficazes na detecção de BoHV-5 (HÜBNER

et al., 2005). Geralmente, a quantidade de vírus isolado não tem correlação

com a detecção através da IHQ. A técnica revela a presença de antígenos do

BoHV-5 essencialmente nos locais do SNC que demonstram lesões

inflamatórias (MEYER et al., 2001).

As técnicas moleculares, para a detecção do genoma viral, como a PCR

e nested-PCR (GOMES et al., 2002) podem ser empregadas com sucesso para

o diagnóstico da infecção pelo BoHV-5. O multiplex PCR foi desenvolvido para

diferenciação de BoHV-1 e BoHV-5 simultaneamente a partir da codificação de

região genômica da glicoproteína B (COSTA et al., 2005), glicoproteína D

(ALEGRE et al., 2001) ou glicoproteína C (ASHBAUGH et al., 1997; CLAUS et

al., 2005). A técnica tem sido empregada tanto em tecido fresco quanto em

material incluso em parafina (ELY et al., 1996; GOMES et al., 2002; FERRARI

et al., 2007). Também pode ser utilizada além destas técnicas, a análise de

restrição enzimática no genoma (D’ARCE et al., 2002) para diferenciação entre

os dois herpesvírus.

2.1.6 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

O herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) é o agente causador da

meningoencefalite herpética em bovinos (ROIZMAN et al., 1992), embora

ocasionalmente o herpesvírus bovino tipo 1(BHV-1) possa também causar

encefalites (SILVA et al., 2007a). A enfermidade pode ser confundida com

polioencefalomalacia, intoxicação pelo chumbo e outros agentes que

conduzam a sinais clínicos neurológicos (RIET-CORREA et al., 2002).

2.1.6.1 Polioencefalomalacia

Polioencefalomalacia (PEM) é um termo descritivo para a necrose com

amolecimento (malácia) da substância cinzenta (pólio) do encéfalo, também

designada necrose cerebrocortical (BARROS et al., 2006). O termo PEM, no

entanto, tem gerado controvérsia, pois foi empregado para designar uma

doença específica de ruminantes associada à deficiência de tiamina, e não

somente a uma lesão (JENSEN et al., 1956). Portanto, polioencefalomalacia

pode ser um termo utilizado em doenças como a intoxicação por sal (privação

hídrica) em suínos e bovinos (NAKAZATO et al., 2000), intoxicação por

chumbo em bovinos (DRIEMEIER & BARROS et al., 2007), meningoencefalite

por BoHV-5 (RIET-CORREA et al., 2006) e intoxicação por enxofre (GOULD,

1998).

Também se denomina como polioencefalomalacia uma doença

neurológica associada a distúrbios do metabolismo da tiamina. Os ruminantes

dependem de síntese de tiamina pelas bactérias ruminais, portanto, alterações

da flora ruminal podem levar à diminuição na produção de tiamina por falta de

bactérias que a sintetizam ou por presença de bactérias que produzem

tiaminases,que hidrolizam a tiamina (JENSEN et al., 1956; LEMOS & RIET-

CORREA, 2007). A deficiência de tiamina causa alteração da glicólise e

alteração da produção de ATP, pois é cofator para enzima transcetolase que

atua na via pentose fosfato, essencial para produção da maioria do ATP. A

tiamnina também é cofator de outras enzimas do cliclo de Krebs (CEBRA &

CEBRA, 2004).

No Brasil, a PEM tem sido diagnosticada em vários Estados, sem que a

etiologia tenha sido esclarecida. Alguns surtos são associados com intoxicação

por cloreto de sódio/privação hídrica e outros a altos níveis de enxofre (LEMOS

& RIET-CORREA, 2007). Ocorre principalmente em bovinos adultos, em

pastejo extensivo, apresentando-se tanto na forma isolada como em surtos,

com morbidade variando em torno de 1%, podendo chegar a 14%, e letalidade

de 43% a 100% (BARROS et al., 2006).

Os sinais clínicos são diversos, incluindo cegueira total ou parcial de

origem central, andar a esmo ou em círculos, movimentos involuntários,

incoordenação, tremores musculares, pressão da cabeça contra objetos,

opistótono, nistagmo, estrabismo lateral, ataxia, diminuição dos reflexos

palpebral e pupilar, diminuição do tônus da língua, depressão, tendência a

afastar-se do rebanho, decúbito esternal e lateral e morte. Nas fases iniciais o

animal pode apresentar agressividade e excitação (NAKAZATO et al., 2000;

CEBRA & CEBRA, 2004; LIMA et al., 2005; LEMOS & RIET-CORREA, 2007;

KUL et al., 2006; BARROS et al., 2006).

Os achados de necropsia variam com a severidade e curso clínico da

doença. Nos estudos de NAKAZATO et al. (2000) a maioria dos casos de PEM

não havia relato de alterações macroscópicas. Dentre as alterações freqüentes,

nos casos de evolução rápida o encéfalo está tumefeito por edema com

achatamento dos giros cerebrais e herniação da porção caudal do telencéfalo

pelo forâmen magno. As lesões corticais do telencéfalo variam desde

alterações leves de cor (marrom-amarelada) até amolecimento e alteração

acentuada na coloração do córtex telencefálico. Nos casos com evolução mais

prolongada nota-se encéfalos de tamanho reduzido com desaparecimento do

córtex cerebral (NAKAZATO et al., 2000; LIMA et al., 2005; BARROS et al.,

2006).

Histologicamente a PEM se caracteriza por necrose laminar do córtex

cerebral, observando-se aumento dos espaços perineuronais e perivasculares,

e aumento da eosinofilia do citoplasma neuronal com picnose, proliferação dos

vasos sangüíneos com células endoteliais tumefeitas e de núcleos

arredondados (NAKAZATO et al., 2000), vacuolização da neurópila, esferóides

axonais, hemorragias e discretos astrócitos reativos, gliose e infiltrado

inflamatório mononuclear (LIMA et al., 2005). Dependendo do tempo de

evolução é seguida de infiltração por macrófagos grandes com núcleos

periféricos e citoplasma espumoso (células gitter) e cavitação. Em casos

crônicos o córtex é substituído por células gitter. Pode ocorrer malácia dos

núcleos da base, tálamo e mesencéfalo (LEMOS & RIET-CORREA, 2007). Nos

casos associados à intoxicação por cloreto de sódio podem ocorrer discreta a

moderada infiltração de eosinófilos principalmente nos espaços

submeningeanos e perivasculares do córtex cerebral, e em alguns casos na

neurópila, associados a hemorragia moderada a severa (NAKAZATO et al.,

2000).

O diagnóstico é realizado com base nos achados histopatológicos e

reforçado pela epidemiologia, quadro clínico, achados de necropsia. A resposta

ao tratamento com tiamina também auxilia o diagnóstico. As dosagens dos

níveis de enxofre da água e pastagem, somando-se às quantidades da mistura

mineral e verificando as quantidades consumidas pelos animais, complementa

os quadros suspeitos de intoxicação por enxofre, assim como o nível de gás

sulfeto de hidrogênio da camada gasosa dorsal do rúmen (LIMA et al., 2005;

BARROS et al., 2006). Em suspeitas de intoxicação por sal, a confirmação

pode ser obtida por dosagem dos níveis de sódio no líquor. A

meningoencefalite por BoHV-5 possui semelhanças histológicas que dificultam

e podem confundir com PEM, principalmente devido às extensas áreas de

malácia cortical e infiltrado de células gitter. A diferenciação pode ser feita pela

presença de lesões inflamatórias na substância branca e corpúsculos de

inclusão intranucleares nos casos de infecção por BoHV-5 (LEMOS & RIET-

CORREA, 2007).

No início da enfermidade, os animais apresentam boa resposta ao

tratamento com 10-20mg/kg de tiamina e 0,2mg/kg de dexametasona via

intramuscular, repetindo o protocolo a cada 4 ou 6 horas, dependendo da

gravidade do caso (BARROS et al., 2006). Desconhece-se se a tiamina tem

alguma ação no tratamento da intoxicação por cloreto de sódio, mas nos casos

observados no Uruguai não houve resposta ao tratamento com tiamina

(LEMOS & RIET-CORREA, 2007).

2.1.6.2 Meningoencefalites

Diversas doenças infecciosas em bovinos causam alterações

microscópicas relacionadas a inflamações do sistema nervoso central,

caracterizadas por infiltrado inflamatório perivascular, vasculite, infiltrado

inflamatório meningeano, gliose multifocal ou difusa. As doenças de origem

viral causam inflamações não-supurativas, predominando linfócitos,

plasmócitos e macrófagos; por vezes há infiltrado inflamatório misto com

predomínio de células mononucleares (BARROS et al., 2006). No Brasil, a

Raiva é a principal doença inflamatória de origem viral do sistema nervoso de

bovinos, atribuído pelo caráter zoonótico e pelo índice elevado de ocorrência

em levantamentos realizados em animais que morreram com sintomatologia

nervosa (SANCHES et al., 2000; UBIALI et al., 2007). No estudo

histopatológico, nem sempre são visualizados corpúsculos de inclusão

intracitoplasmáticos, sendo as técnicas de Imunofluorescência direta (IFD) e

inoculação intracerebral em camundongos recém nascidos (IIC) os testes

padrões de diagnóstico (MAPA, 2005). Nos casos histologicamente

classificados como meningoencefalite ou meningoencefalomielite não-

supurativa aguda, o auxílio das técnicas IFD, IIC e imuno-histoquímica são

necessárias para relacionar a inflamação com a infecção pelo vírus da Raiva

(PEDROSO et al., 2008).

Além da raiva, outras enfermidades virais são importantes como causa

de inflamação no sistema nervoso em bovinos, como a Febre Catarral Maligna,

doença de Aujeszky (BARROS et al., 2006).

2.1.7 TRATAMENTO E PROFILAXIA

Nos casos de meningoencefalite por herpes não há tratamento e

geralmente a letalidade é próxima a 100%. Há animais que se recuperam mas

o percentual é baixo (RIET-CORREA et al., 1989; ELIAS et al, 2004). Não há

medidas de controle e profiláticas diretas para os casos de infecção por BoHV-

5. A doença pode ser minimizada reduzindo situações de estresse,

principalmente no desmame, quando há diminuição dos níveis de anticorpos da

imunidade passiva (RISSI et al., 2006). Adicionalmente há necessidade de

examinar animais antes da introdução dos mesmos no plantel, podendo testá-

los sorologicamente; isolar animais afetados e eliminar do rebanho animais

sorologicamente positivos quando o número de animais reagentes for pequeno.

Como método de controle, principalmente em surtos, aponta-se a

vacinação do rebanho como uma possível alternativa. Estudos demonstram

que há proteção cruzada entre os vírus BoHV-1 e BoHV-5, pois a vacina

contendo antígenos apenas de BoHV-1 induz a produção de anticorpos com

atividade neutralizante contra o BoHV-5 (VOGUEL et al., 2002). Os testes in

vivo, de vacinas inativadas produzidas com amostra de BoHV-5, produzidas de

suspensões virais com títulos altos e adjuvante oleoso, induzem a produção de

níveis satisfatórios de anticorpos após a terceira dose (HALFEN et al., 2000).

Em coelhos, os animais imunizados com vacina contendo antígenos

para BoHV-1 obtiveram grau de proteção contra BoHV-5 (BELTRÃO et al.,

2000).

3 MATERIAL E MÉTODOS

Nos anos 1999, 2000, 2005, 2006, 2007 e 2008, um total de 402 amostras de

encéfalo de bovinos com quadro clínico neurológico, foram coletadas por

veterinários autônomos e veterinários do Instituto de Defesa e Agropecuária do

Mato Grosso (INDEA-MT) e encaminhadas ao Laboratório de Patologia

Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Estas

amostras foram negativas no teste de imunofluorescência direta e prova

biológica que caracterizam o diagnóstico de infecção pelo vírus da raiva. Deste

grupo foram selecionadas 76 amostras sendo assim distribuídas: 1999 (n=3),

2000 (n=9), 2005 (n=17), 2006 (n=26), 2007 (n=14) e 2008 (n=7). As amostras

foram recebidas no LPV-UFMT em solução formalina e deste total, 9 amostras

de encéfalos foram encaminhadas contendo também fragmentos refrigerados e

congelados. Preferencialmente selecionaram-se fragmentos de regiões do

córtex telencefálico, corpo estriado, tálamo e mesencéfalo para análise

molecular, principalmente de áreas que tinham lesões microscópicas mais

evidentes. Algumas amostras (16) continham apenas medula oblonga e

cerebelo.

As amostras de encéfalo enviadas foram processadas por métodos

convencionais para análise histológica e coradas pela hematoxilina-eosina. As

amostras foram classificadas em dois grupos distintos: Grupo 1. Amostras

classificadas como meningoencefalite necrosante e não purulenta associadas

com BoHV-5, sendo caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório

mononuclear meningeano e perivascular, áreas multifocais de malácia com

gliose, células gitter e corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos e/ou

neurônios (em 9 amostras), representando 22,5% dos casos ou amostras com

lesões sugestivas de Meningoencefalite por BoHV-5, com lesões

características sem que se tenha encontrado corpúsculos de inclusão. Grupo

2. Amostras classificadas como encefalite não purulenta inespecífica, quando

havia apenas variável intensidade de infiltrado inflamatório mononuclear

perivascular, freqüentemente focal ou multifocal, e por vezes com infiltrado

meningeano discreto.

As amostras de encéfalo pertencentes a estes 2 grupos foram

submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para BoHV-1 e BoHV-5

(CLAUS et al. 2005). A extração de DNA foi obtida de amostras inclusas em

parafina ou material fresco congelado, por método fenol-clorofórmio

(SAMBROOK et al. 1989) modificado. Os primers utilizados foram B1,

específico para BoHV-1 (5-CAA CCG AGA CGG AAA GCT CC-3 nt. 185–204),

B5, para BoHV-5 (5-CGG ACG AGA CGC CCT TGG-3nt. 322–339) e Bcon,

primer consenso [5-AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3nt. 519–538 (BoHV-1)

e nt. 461–480 (BoHV-5)]. A leitura foi feita por eletroforese em gel de agarose

2,0%, corados com brometo de etídeo e analisadas em transluminador (UV-

300nm). Controles negativos e positivos para BoHV1 e BHV5 foram inseridos

em cada PCR.

Além disso, testou-se 30 amostras de encéfalo bovino, aparentemente

sadios, sem alterações macro e microscópicas significativas. Estas amostras

foram obtidas em abatedouro com Inspeção Federal (SIF 585) mantendo-se

fragmentos de encéfalo sobre refrigeração e em solução de formalina 10% e

após 30 dias foram processados por técnicas rotineiras para estudo histológico.

Adicionalmente, de 11 bovinos deste grupo, coletaram-se amostras dos

gânglios de Gasser, que foram divididos, sendo que parte foi refrigerada e

parte foi mantida em solução de formalina 10%.

Para controle positivo da reação foi utilizado DNA provenientes dos

isolados SV-56/90 de BoHV-1 e SV-507/99 de BoHV-5 (SILVA et al. 2007a)

obtidas no Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária

Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria.

4 RESULTADOS

De 402 amostras de encéfalo de bovino, que foram testadas negativas para

raiva bovina nos anos 1999 e 2000, 2005 a 2008, encaminhadas para o LPV-

UFMT, 76 (18,90%) foram classificadas dentro dos dois Grupos de estudo

propostos para esse trabalho. Destas, 40 (52,63%) tinham lesões

características ou sugestivas de infecção por BoHV-5 (Grupo 1) e 36 (47,36%)

tinham encefalite não purulenta inespecífica (Grupo 2).

Neste estudo não houve amplificação de BoHV-1 em amostras inclusas

em parafina ou congeladas. Identificou-se DNA de BoHV-5 em material incluso

em parafina em 40% (16/40) das amostras do Grupo 1 e em 33,33% (12/36) do

Grupo 2 (Figuras 1 e 2).

Do total de 76 amostras enquadradas dentro dos dois grupos de estudo,

67 amostras possuíam apenas material incluso em parafina, que ficou por

diferentes períodos em solução de formol a 10%. Algumas amostras foram

deixadas por períodos longos de fixação, variando de menos de um mês até

pouco mais de um ano. Houve diminuição crescente de positividade

principalmente nas amostras que permaneciam fixadas por 50 dias ou mais.

Outras nove amostras tinham materiais de encéfalo em parafina e

conservados sob congelamento, seis pertencentes ao Grupo 1, e três ao Grupo

2. Identificou-se DNA de BoHV-5 em quatro das 6 amostras do Grupo 1 e em

duas das 3 amostras do Grupo 2. Dessas mesmas amostras em parafina,

apenas duas do Grupo 1 e uma do Grupo 2 foram positivas, havendo um

decréscimo em 50% de positividade das mesmas amostras quando a análise

foi realizada utilizando-se o material encaminhado em formalina e incluso em

parafina.

Dos materiais obtidos em frigorífico, uma amostra de gânglio Gasser

amplificou DNA de BoHV-5 em material congelado , as demais foram negativas

tanto para BoHV-5 como BoHV-1.

5 DISCUSSÃO

Nesse trabalho, detectou-se DNA de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5)

através da técnica de PCR em 40% das amostras do Grupo 1 e em 33,33%

das amostras do Grupo 2.

FERRARI et al. (2007) encontraram 75% de positividade na PCR para

BoHV-5 em amostras de encéfalos com meningoencefalite necrosante que

permaneceram por uma semana ou mais em formalina tamponada a 10%. Nos

estudos retrospectivos realizados por ELY et al. (1996), demonstraram que em

32 casos de meningoencefalite não supurativa, 7 (21,87%) amostras foram

detectadas como positivas para BoHV-5 e 1 (3,25%) detectado como BoHV-1,

através das técnicas PCR e imunoperoxidase em amostras inclusas em

parafina, as outras 24 amostras permaneceram sem diagnóstico. Em nosso

estudo as amostras ficaram por períodos variáveis em solução de formalina, de

poucos dias a mais de um ano. O tempo de fixação causa degradação do DNA

e compromete o resultado da análise (KARLSEN et al. 1994). Nos estudos de

GARMATZ et al. (2004), em 6 bovinos com diagnóstico histopatológico de febre

catarral maligna (FCM) resultaram negativos no teste da PCR, atribuindo-se ao

tempo prolongado de fixação em formol a discordância entre achados

histopatológicos característicos e os resultados do teste da PCR. Nos estudos

de CRAWFORD et al. (1999) a PCR para FCM, em períodos de fixação

superiores a 45 dias produziram resultados negativos ou fraco positivos.

A influência do tempo de fixação também pôde ser avaliada em relação

às amostras testadas fixadas em formalina e congeladas. Do total de 6

amostras positivas na PCR realizada em fragmentos de tecido congelado, a

positividade caiu em 50% quando realizada a PCR do mesmo material incluso

em parafina. Dentre as amostras com tecido congelado do Grupo 1, duas foram

negativas no PCR tanto em material fresco quanto incluso em parafina.

Quantidades insuficientes de DNA viral no tecido, quantidade escassa de

amostra e falhas na extração do DNA são as principais causas que podem

levar a ocorrência de resultados negativos, assim como ausência do DNA.

Encefalite não-purulenta inespecífica é frequentemente encontrada em

bovinos em nosso laboratório (UBIALI et al. 2008), aparenta uma condição

inflamatória no encéfalo mas sem caracteristicas morfológicas compatíveis com

etiológicas conhecidas. Esta lesão é por vezes encontrada em bovinos sem

manifestação clínica neurológica, incluindo amostras obtidas em frigoríficos. No

presente estudo, todas as amostras do Grupo 2 eram de bovinos que tinham

no histórico sinais clínicos de distúrbios no sistema nervoso central e em 33,3%

das amostras havia DNA de BoHV-5, o que caracteriza nestas amostras a

infecção pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 como determinante do quadro clínico-

patológico. Sabe-se que nem todos os casos de meningoencefalite por herpes

apresentam a característica evidente de malácia. Nos estudos de RISSI et al.

(2006), em um estudo de 19 casos, todos os bovinos apresentavam como

principal característica a meningoencefalie não-supurativa, sendo apenas

alguns casos destes com malácia, variando quanto à localização e intensidade.

Há também estudos de cepas de BoHV-5 com neurovirulência diferentes, o que

poderia determinar padrões morfológicos distintos (FLORES et al. 2009). Para

determinar a importância deste achado, a ausência de amplificação de BoHV-5

em 77% das amostras pode ter ocorrido devido as amostras serem negativas

ou falso-negativas relacionadas ao local de coleta. A coleta e encaminhamento

de amostras de locais pertinentes são importantes para confiabilidade

diagnóstica dos resultados. Trabalhos em bovinos infectados

experimentalmente por BoHV-5 relatam que o vírus encontra-se na maioria dos

casos presente no córtex frontal, gânglio de Gasser, mesencéfalo e tálamo

(VOGUEL et al. 2003). Dentre as 36 amostras do Grupo 2, doze foram

encaminhadas ao laboratório, sem partes pertinentes principais, impedindo

análise histológica de locais onde as lesões são mais constantes, ou

diferenciação entre outras patologias que causam lesões histológicas

semelhantes. Também é necessário diferenciar a infecção do BoHV com

outras infecções virais que acomete bovinos, principalmente pela infecção

pelos vírus da raiva e febre catarral maligna. Neste estudo, as amostras foram

testadas para Raiva pelos métodos de imunofluorescência direta e prova

biológica, resultando negativas. Sabe-se que em alguns casos de raiva podem

ocorrer resultados discrepantes entre as duas provas laboratoriais de eleição

(PEIXOTO et al. 2000, LEMOS 2005) e, dependendo da localização das lesões

e das amostras analisadas, ambos diagnósticos podem ser negativos (SILVA et

al. 1974). A vasculite é a principal alteração em casos de febre catarral

maligna, porém infiltrado perivascular mononuclear são achados no encéfalo

de bovinos com esta patologia. A intensidade dessas lesões varia no sistema

nervoso central (SNC) de acordo com a região anatômica afetada. As lesões

mais proeminentes são encontradas nos vasos da rete mirabile carotídea,

leptomeninge, espaços de Virchow-Robin e lesões menos graves no

parênquima, especialmente na substância branca (GARMATZ 2004).

Dentre o Grupo de amostras obtidas em frigorífico uma amostra

amplificou BoHV-5, possivelmente associada característica do herpesvírus em

estabelecer latência em gânglios sensoriais após infecção aguda (VOGUEL et

al. 2003) e indicando a importância de associar as técnicas de caracterização

etiológica com a observação de alterações morfológicas para complementação

diagnóstica.

Neste estudo trabalhamos também com amostras de encéfalo de bovinos com

polioencefalomalacia (COLODEL, 2009 dados não publicados). BoHV-5 e

BoHV-1 têm sido isolados de casos onde não se observam lesões inflamatórias

significativas da infecção viral (RISSI et al. 2008, SILVA et al. 2007b). BoHV-5

pode ser detectado através do isolamento viral em caso caracterizado

histologicamente como PEM (COLODEL et al. 2002). Realizamos PCR para

BoHV-1 e BoHV-5 em 27 amostras inclusas em parafina, originárias de bovinos

com PEM no Estado de Mato Grosso e do Mato Grosso do Sul. Dentre estas, 9

amostras amplificaram DNA de BoHV-5, sugerindo que o vírus poderia estar se

replicando em conseqüência de fatores relacionados com o desenvolvimento

de PEM, ou que estava em estado de latência (DAVID et al. 2007).

A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no

Estado de Mato Grosso é desconhecida. Meningoencefalite associada ao

BoHV-1 foi observada por SILVA et al. (2007a) em diferentes Estados; dentre

26 amostras isoladas de doença neurológica, cinco (19,3%) eram por BoHV-1.

A utilização de um método molecular para detectar simultaneamente BOHV- 1

e BoHV-5 facilita este levantamento. No presente estudo, todas as amostras

testadas foram negativas para BoHV-1.

6 CONCLUSÃO

A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no

Estado de Mato Grosso é desconhecida. A utilização de um método molecular

para detectar simultaneamente BOHV- 1 e BoHV-5 facilita este levantamento.

No presente estudo, todas as amostras testadas obtiveram resultado negativo

para BoHV1.

Nos quatro grupos avaliados neste trabalho detectou-se DNA de

Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) através da técnica de PCR.

Existem diversos métodos de detecção de BoHV-5. Dentre eles, os mais

usados são imuno-histoquímica, PCR e isolamento viral. Entretanto, fatores

como intensidade e distribuição de lesões, autólise e tempo de fixação em

formol são variáveis importantes a serem levadas em consideração para que

se tenha sucesso no diagnóstico (ELY et al. 1996; KARLSEN et al. 1994).

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APÊNDICE A- Artigo submetido para a revista Pesquisa Veterinária

Brasileira

Detecção molecular de Herpesvírus Bovino tipo 1 e 5 (BoHV 1 e BoHV5)

em amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no

Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas em parafina

Laura P. Arruda

, Luciano Nakazato

, Valéria Dutra

, Ricardo A. A. Lemos

Ana P.A. Nogueira

, Danielle A. das Neves

, Veronique M.C.L. Cortada

Raquel A.S. Cruz

, Caroline A. Pescador

, Edson M. Colodel

ABSTRACT.- Arruda, L.P., Nakazato, L., Dutra, V., Lemos, R.A.A., Nogueira,

A.P.A., Das Neves, D.A., Cortada, V.M.C.L.,Cruz, R.A.S., Pescador, C.A. &

Colodel, E.M. 2008. [Molecular detection of Bovine Herpesvirus type 1 and

5 (BoHV) in formalin fixed and paraffin-embedded samples of neurological

diseases in cattle of Mato Grosso State, Brazil]. Detecção molecular do

Herpesvírus Bovino (BoHV) em amostras de encéfalo de bovinos com doenças

neurológicas no Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas

em parafina. Pesquisa Veterinária Brasileira. Departamento de Clínica

Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,

Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa s/n,

Bairro Coxipó, Cuiabá, MT 78068-900, Brazil. E-mail: moleta@ufmt.br

Herpesvirus is one of the main causes of neurological diseases of cattle in the

Midwest Region of Brazil. The application of molecular diagnostic techniques

represents an important contribution for herpesvirus study. This report

describes the detection of BoHV-5 and BoHV-1 by a specific multiplex PCR

Aceito em

Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT)

Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá, MT 78068-900.

Departamento de Clinica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,

Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó,

Cuiabá, MT 78068-900. email: moleta@ufmt.br

Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Mato

Grosso do Sul, Cx. Postal 649, Campo Grande, MS 79070-900

Agência Estadual de Defesa Sanitária Animal e Vegetal de MS, Laboratório de Diagnóstico de Doenças

Animais e Análises de Alimentos. R: Senador Filinto Muller, 1146 - Campo Grande, MS - 79074-902

assay in seventy-six central nervous system (CNS) samples including paraffin-

embedded, and in nine samples those both in fresh frozen and paraffin-

embedded. The samples were divided in 2 groups according to histological

features: Group 1-necrotizing meningoencephalitis characteristic of BoHV

infecction (40 samples), Group 2- mononuclear encephalitis nonspecific (36

samples). The positive case for BoHV-5 in paraffin-embebbed tissues in each

group was 40% and 33,3%, respectively. BoHV-1 was negative in all samples

tested.

Index terms: Bovine herpesvirus, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso.

RESUMO

Infecção por Herpesvirus é uma das principais causas de doença do

sistema nervoso em bovinos na região Centro-Oeste do Brasil. O uso de

técnicas moleculares para caracterização diagnóstica representa uma

contribuição importante para o estudo dessa doença. Relatamos o uso de

técnica específica de PCR multiplex para identificar o herpesvírus bovino tipo 5

(BoHV-5) e tipo 1 (BoHV-1) em 76 amostras de encéfalo de bovinos fixados

em formol e incluídos em parafina, com 9 destas em duplicidade para tecidos

congelados. Com base nas alterações histológicas as amostras foram

separadas em 2 grupos. Dentre 40 amostras de meningoencefalite necrosante

com características histológicas de infecção por BoHV houve amplificação de

DNA de BoHV-5 em 16 amostras e em 36 amostras com lesões histológicas

classificadas como encefalite não purulenta inespecífica ocorreu amplificação

do DNA de BoHV-5 em 12 amostras. Não houve amplificação de BoHV-1 nos

encéfalo estudadas.

Termos de indexação: Herpesvírus bovino, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato

Grosso.

INTRODUÇÃO

Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos abrangem um

grupo de enfermidades importantes que incluem principalmente as doenças

infecciosas e degenerativas (Riet-Correa et al. 2002). A identificação, em

meados da década de 1980, da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e a

relação com a variante da doença humana Creutzfeldt-Jakob (vCJD) realçou a

importância socio-econômica e de saúde pública das doenças que acometem o

SNC (Barros et al. 2006).

As principais enfermidades que afetam o SNC de bovinos são causadas

por vírus, destacando-se a raiva, meningoencefalite por BoHV-5 e febre

catarral maligna (Barros et al. 2006; Sanches et al. 2000, Mendonça et al.

2008). A ocorrência de meningoencefalite por herpesvirus em bovino foi

relatada no Estado de Mato Grosso (Colodel et al. 2002) sendo a doença

neurológica inflamatória mais importante para bovinos no Estado, depois da

raiva bovina (Ubiali et al. 2008) e tem sido relatada em vários outros Estados,

como Rio Grande do Sul (Rissi et al. 2006), Rio de Janeiro (Silva et al. 2007),

São Paulo, Mato Grosso do Sul (Salvador et al. 1998), Goiás (Paula et al.

2005), Pará (Riet-Correa et al. 2006), Paraná e Minas Gerais (Claus et al.

2007; Gomes et al. 2002).

A infecção pelo BoHV-5 em bovinos determina um quadro neurológico

que inclui diversos sinais clínicos. Entretanto, estudos demonstram que tanto o

BoHV-1 como o BoHV-5 podem não estar estritamente associados às suas

respectivas síndromes clínicas e estarem envolvidos em casos clínicos

classicamente atribuídos ao outro vírus (Silva et al. 2007a). Diversos estudos

têm proposto a utilização de técnicas moleculares na rotina de diagnóstico do

BoHV-5 e diferenciação do BoHV-1, como a PCR e nested-PCR (Silva et al.

2007a; Claus et al. 2005, Ashbaugh et al. 1997; Ely et al. 1996) sendo estas

específicas e práticas, além de outras técnicas existentes, a imuno-

histoquímica (Hübner et al. 2005, Voguel et al. 2003, Meyer et al. 2001), cultivo

celular (Souza et al. 2002) e análise de restrição enzimática (D’arce et al.

2002).

Métodos que permitam detecção viral em materiais inclusos em parafina

auxiliam a expansão do conhecimento a respeito dos herpevírus bovinos em

amostras negativas para raiva, bem como em qualquer amostra arquivada em

laboratórios de rotina histopatológica, permitindo estudos retrospectivos de

prevalência do Bohv-5, já que a similaridade entre os dois vírus e a dificuldade

em diferenciação sorológica não permitiam boa documentação da prevalência

do BoHV-5 no Brasil e no mundo (Roehe et al. 1998).

Este trabalho tem por objetivo detectar o Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5)

e o Herpesvírus Bovino 1 (BoHV-1) em encéfalos de bovinos testados

negativos para Raiva e característicos de meningoencefalite por BoHV-5, além

de bovinos diagnosticados com meningoencefalite não purulenta inespecífica,

em amostras conservadas em formol e inclusas em parafina, ocorridos nos

anos 1999 a 2008 no Estado de Mato Grosso.

MATERIAL E MÉTODOS

Nos anos 1999 a 2008, um total de 402 amostras de encéfalo de bovinos

com quadro clínico neurológico, foram coletadas por veterinários autônomos e

veterinários do Instituto de Defesa e Agropecuária do Mato Grosso (INDEA-MT)

e encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade

Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Estas amostras foram negativas no teste

de imunofluorescência direta e prova biológica que caracterizam o diagnóstico

de infecção pelo vírus da raiva. Deste grupo foram selecionadas 76 amostras

sendo assim distribuídas: 1999 (n=3), 2000 (n=9), 2005 (n=17), 2006 (n=26),

2007 (n=14) e 2008 (n=7). As amostras foram recebidas no LPV-UFMT em

solução formalina e deste total, 9 amostras de encéfalos foram encaminhadas

contendo também fragmentos refrigerados e congelados. Preferencialmente

selecionaram-se fragmentos de regiões do córtex telencefálico, corpo estriado,

tálamo e mesencéfalo para análise molecular, principalmente de áreas que

tinham lesões microscópicas mais evidentes. Algumas amostras (16)

continham apenas medula oblonga e cerebelo.