( PDF ) Sensibilização epileptogênica de ratos jovens expostos à isquemia e/ou hipóxia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

JULIO CESAR MODESTO VALÉRIO

SENSIBILIZAÇÃO EPILEPTOGÊNICA DE RATOS

JOVENS EXPOSTOS À ISQUEMIA E/OU HIPÓXIA

São João del Rei

2009

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SENSIBILIZAÇÃO EPILEPTOGÊNICA DE RATOS JOVENS EXPOSTOS À

ISQUEMIA E/OU HIPÓXIA

Julio Cesar Modesto Valério

Dissertação apresentada ao Curso

de pós graduação multidisciplinar

em Química, Física e

Neurociências da Universidade

Federal de São João del Rei, como

requisito parcial para a obtenção de

título de Mestre em Ciências.

São João del Rei

Departamento de Engenharia Biomédica

Universidade Federal de São João del Rei

2009

SENSIBILIZAÇÃO EPILEPTOGÊNICA DE RATOS JOVENS EXPOSTOS À

ISQUEMIA E/OU HIPÓXIA

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Julio Cesar Modesto Valério

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FÍSICA, QUÍMICA E NEUROCIÊNCIA DA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI COMO PARTE DOS

REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM

CIÊNCIAS EM NEUROFÍSICA.

Aprovada por:

________________________________________________

Prof. Dr. Antônio-Carlos Guimarães de Almeida

(Presidente)

________________________________________________

Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza

________________________________________________

Prof. Dr. Mário Antônio Duarte

SÃO JOÃO DEL-REI, MG - BRASIL

OUTUBRO DE 2009

Agradecimentos & Dedicatórias.

Ao Tunico que, servindo como terapeuta lacaniano, me trouxe de volta à

realidade em momentos de grandes e pequenas crises e serviu como , confesso,

inesperado amigo.

Ao Antônio-Carlos Guimarães de Almeida que , servindo como orientador

também lacaniano, resolveu grandes imbroglios com intervenções, curtas, diretas e

profícuas. E sempre que estava muito bravo com nossas travessuras (desmontar

equipamentos do laboratório para “reciclar”, por exemplo), chamávamos o Tunico de

volta, e tudo se resolvia....

Ao Gláucio que é tão dono desse trabalho quanto eu, pela inestimável ajuda (às

vêzes penso que EU era o ajudante, na verdade) que sempre me forneceu. Sem ele, eu

não teria chegado ao final.

À Maizinha, a fada do set-up, que, por várias vezes, carregou o piano enquanto

eu tocava para a platéia. Sem esquecer que seu abraço amigo, durante uma crise que

quase me tirou do Mestrado, me deu tranquilidade para dormir de noite e forças para

acordar na manhã seguinte.

À Lívia por ter insistido em existir, com acidente e tudo, só para continuar a ser

esse sopro de vida e alegria que me nutriu nos mais negros momentos.

Last but not least, à Lidia que foi parte do problema, mas também da solução.

Por ter me aguentado, com ou sem crise, e me estimulado a começar, insistir e terminar

esse curso. E à doutora Lidia, por ter me orientado nas normas da ABNT, na disposição

geral do trabalho, no estilo...em tudo!

A todos não citados aqui, mas que fizeram e, espero, farão parte integrante de

minha família. Não os cito nominalmente, porque a boa norma indica que não nos

devemos estender mais que uma página nessas dedicatórias.

De toda forma, agradeço e dedico esse trabalho a todos vocês do Lanec, alunos e

professores, meus amigos, irmãos e companheiros nessa jornada.

PS.: Clarice e Nina, papai está de volta!

“Às vêzes o homem prefere o sofrimento à paixão”

Dostoiévsky

Fiódor Mikhailovich Dostoiévski , – ocasionalmente grafado como Dostoievsky – em cirílico,

Фёдор Миха́йлович Достое́вский. — nasceu em Moscou em 1821. Dostoiévski foi um escritor

considerado um dos maiores romancistas da literatura russa e um dos mais inovadores artistas de todos os

tempos. É tido como o fundador existencialismo e, de acordo com Walter Kaufmann, pode ser

considerado como a "melhor proposta para o existencialismo já escrita." A obra dostoievskiana

explora a autodestruição, a

humilhação e o assassinato, além de analisar estados patológicos que levam ao

suicídio, à loucura e ao homicídio: seus escritos são chamados por isso de "romances de idéias", pela

retratação filosófica e atemporal dessas situações. O

modernismo literário e várias escolas da teologia e

psicologia foram influenciados por suas idéias.

Dostoiévski, aos 17 anos, teve uma grande crise epiléptica após saber que seu pai havia sido

assassinado pelos próprios colonos, e deixou o exército cinco anos depois para dedicar-se integralmente à

atividade literária. Dostoiévski afastou-se das armas, mas acabou envolvendo-se em conspirações

revolucionárias, das quais passou pela

prisão e pela condenação de morte, embora a pena tenha sido

comutada. Alguns autores acreditam que essas dificuldades pessoais auxiliariam Fiódor a se estabelecer

como um dos maiores romancistas do mundo, mas de fato seu reconhecimento definitivo como "escritor

universal" veio somente depois dos anos 1860, com a publicação de seus grandes romances:

O Idiota e

Crime e Castigo, este publicado em 1866, considerado por muitos como uma das obras mais primorosas

da literatura mundial.

Seu último romance,

Os Irmãos Karamazov, foi considerado por Sigmund Freud como o melhor

romance já escrito.

A obra de Dostoiévski exerce uma grande influência no romance moderno, legando a

ele um estilo caótico, desordenado e que apresenta uma realidade alucinada.

(Modificado de <www.wikipedia..org >, acesso em 09/08/2009)

Dostoiévsky permaneceu epilético durante toda a sua produtiva vida. A epilepsia nunca

o impediu de ser um escritor genial, pelo contrário, serviu-lhe de inspiração em seus momentos

de aura. Teve, contudo, sorte Fiódor e, mais ainda, nós seus leitores, já que um status

epilepticus não o levou à morte, em uma época em que inexistiam tratamentos adequados para

essa moléstia.

Que todos nós, que de alguma forma lidamos com a epilepsia, desavisados, não

deixemos fenecer algum novo “dostoiévski” que passe por nós em nossas clínicas, laboratórios

ou em nossa vida!

Resumo da Dissertação apresentada à FIQUINE/UFSJ como parte dos requisitos

necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (M.Sc.).

SENSIBILIZAÇÃO EPILEPTOGÊNICA DE RATOS JOVENS EXPOSTOS A

CONDIÇÕES DE ISQUEMIA E/OU HIPÓXIA

Julio Cesar Modesto Valério

Setembro/2009

Orientador: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida

Programa: FIQUINE

Departamento: Engenharia Biomédica

As síndromes hipoxêmicas perinatais representam uma das principais causas de

epilepsia de instalação tardia em seres humanos. Os mecanismos não-sinápticos que

subjazem aos processos epileptogênicos, apesar de representarem atores importantes na

gênese, instalação e curso das síndromes epilépticas, têm escassa representação na

literatura. Também são raros, ou inexistentes, trabalhos envolvendo modelos de

hipoxemia em ratos da raça Wistar, frequentemente empregados em laboratórios de

Neurociência. Neste trabalho desenvolveu-se um modelo animal, utilizando ratos Wistar

jovens, numa faixa etária (P10) em que se pode simular a hipoxemia neo-natal humana,

objetivando estudar eletrofisiologicamente a fase pós aguda da exposição à isquemia

e/ou hipóxia, enfocando as atividades epileptiformes sustentadas por mecanismos não-

sinápticos, em cortes de hipocampo nutridos por um meio que contém alto potássio e

nenhum cálcio. Os resultados indicam sensibilização epileptogênica em dois dos três

grupos experimentais, que apresentaram maior duração dos eventos epileptiformes e

níveis mais negativos no potencial lento das despolarizações (níveis DC).

Contrariamente à expectativa, de acordo com a literatura, o grupo submetido à hipóxia

sensibilizou-se mais do que o grupo submetido à isquemia. Mais surpreendente e

paradoxal demonstra-se o grupo submetido ao procedimento combinado isquemia +

hipóxia, que tornou-se relativamente mais resistente do que o grupo controle. Conclui-

se que a morte neuronal seletiva tenha contribuído de forma decisiva para esses

resultados.

Abstract of Dissertation presented to FIQUINE/UFSJ as a partial fulfillment of the

requirements for obtaining the degree of Master of Science (M. Sc.)

EPILEPTOGENIC SENSIBILIZATION OF YOUNG RATS EXPOSED TO

ISCHEMIA AND/OR HYPOXIA

Julio Cesar Modesto Valério

September/2009

Advisor: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida

Program: FIQUINE

Department: biomedical Engineering

The hypoxemic syndromes of the newborn are one of the most frequent causes

of late onset epilepsy in human beings. Non-synaptic mechanisms underlying

epileptogenic processes, despite being important actors in the genesis, instalation and

course of the epileptic illnesses, are under-represented in the literature. There is very

little research dealing with models of hipoxemia in Wistar rats, animals that are

frequently used in Neuroscience labs. In this project an animal model was developed,

using Wistar rats, at an age (P10) that can simmulates human peri-natal hipoxemia. The

study aimed at the eletrophysiological exam of the post-acute phasis after exposition to

ischemia and/or hypoxia, focusing in the epileptiform activities sustained by non-

synaptic mechanisms, in hippocampal slices nurtured by a medium with high potassium

and no calcium. Results shows epileptogenic sensibilization ocurring in two out of three

experimental groups, as indicated by longer epileptiform events and also by more

negative slow potentials in depolarizations (DC levels). However, the group that was

exposed to hypoxia showed greater epileptogenic sensibilization than the ischemized

group. More surprisingly, the third group, exposed to a combination of ischemia

followed by hypoxia, exhibited a paradoxical response, becaming relativelly more

resistant than the control group. It is concluded that selective neuronal death is the main

factor affecting the results obtained in this work.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figuras Pág.

1.1- Tamponamento glial de potássio.

…...................................................................45

2.1- Ligadura da artéria cervical comum.

…...................................................................73

2.2- Foto da incisão cirúrgica.

…...................................................................74

2.3- Foto do equipamento anestésico.

…...................................................................75

2.4- Foto do equipamento cirúrgico.

…...................................................................75

2.5- Instalação para manobra de hipóxia.

…...................................................................77

2.6- Esquema do termômetro retal.

…...................................................................78

2.7- Desenho do encéfalo e hipocampo.

…...................................................................79

2.8- Procedimento para retirada do cérebro.

…...................................................................80

2.9- Preparação de fatias do hipocampo.

…...................................................................81

2.10- Esquema da câmara de perfusão.

…...................................................................83

2.11- Foto da câmara de interface.

…...................................................................84

2.12- Foto do fatiador de tecidos.

…...................................................................85

2.13- Diagrama da instalação para registros.

…...................................................................86

4.1- Diagrama do MEC, célula e Na

-K

-ATPase

…...................................................................129

4.2- Diagrama do MEC, célula e gradientes.

…...................................................................131

4.3- Esquema da morte neuronal seletiva.

…...................................................................134

4.4- Corte do hipocampo e camadas celulares.

…...................................................................136

4.5- Esquema de populações homogêneas.

…...................................................................137

4.6- Esquema de populações heterogêneas (1).

…...................................................................138

4.7- Esquema de populações heterogêneas (2).

…...................................................................139

4.8- Analogia hidráulica populações homogêneas

…...................................................................140

4.9 Analogia hidráulica populações heterogêneas

…...................................................................140

4.10- Efeito do Eugenol sobre AE em MNS.

…...................................................................141

A.1- Efeito de campo.

…...................................................................157

A.2- Flutuações iônicas.

…...................................................................160

A.3- transmissão efáptica

…...................................................................161

A.4- Junções de hiato.

…...................................................................163

B.1- Planos de corte anatômicos.

…...................................................................166

B.2- Eixos anatômicos.

…...................................................................167

B.3- Eixos anatômicos em roedores.

…...................................................................168

B.4- Eixos anatômicos em humanos.

…...................................................................169

B.5- Sistema límbico.

…...................................................................171

B.6- Lobo temporal.

…...................................................................172

B.7- Formação hipocampal.

…...................................................................173

C.1- Captura de tela (1).

…...................................................................184

C.2- Captura de tela (2).

…...................................................................185

Gráficos

Pág.

3.1- Ajuste polinomial de curvas.

…...................................................................97

3.2- Exemplos de saídas gráficas do Matlab© .

…...................................................................98

3.3- Sobreposição de curvas.

…...................................................................99

3.4- Histograma do parâmetro DC.

…...................................................................100

3.5- Histograma do parâmetro PS..

…...................................................................101

3.6- Histograma do parâmetro DE.

…...................................................................102

3.7- Histograma do parâmetro IE.

…...................................................................103

3.8- Histograma do parâmetro PM.

…...................................................................104

3.9- Gráfico “tipo caixa” do parâmetro DC.

…...................................................................106

3.10- Gráfico “tipo caixa” do parâmetro PS. …...................................................................108

3.11- Gráfico “tipo caixa” do parâmetro DE.

…...................................................................110

3.12- Gráfico “tipo caixa” do parâmetro IE.

…...................................................................112

3.13- Gráfico “tipo caixa” do parâmetro PM.

…...................................................................114

3.14- Multicomparação do parâmetro DC.

…...................................................................117

3.15- Multicomparação do parâmetro PS.

…...................................................................118

3.16- Multicomparação do parâmetro DE.

…...................................................................119

3.17- Multicomparação do parâmetro IE.

…...................................................................120

3.18- Multicomparação do parâmetro PM.

…...................................................................121

3.19- Gráfico de dispersão de 4 parâmetros.

…...................................................................122

3.20- Registro típico do grupo Hip.

…...................................................................123

3.21- Registro típico do grupo Isq (1).

…...................................................................124

3.22- Registro típico do grupo Isq (2).

…...................................................................125

3.23- Registro típico do grupo Mix.

…...................................................................126

3.24- Comparação entre registros.

…...................................................................127

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadros Pág.

1.1- Extrato da CID-10: Paroxismos.

…...................................................................20

2.1- Protocolo Contínuo de Hipóxia (PCH).

…...................................................................71

2.2- Protocolo Progressivo de Hipóxia I (PPH1).

…...................................................................72

2.3- Protocolo Progressivo de Hipóxia II (PPH2).

…...................................................................72

Tabelas Pág.

3.1- Anova do parâmetro DC.

…...................................................................107

3.2- Kruskal-Wallis do parâmetro DC.

…...................................................................107

3.3- Anova do parâmetro PS.

…...................................................................109

3.4- Kruskal-Wallis do parâmetro PS.

…...................................................................109

3.5- Anova do parâmetro DE.

…...................................................................111

3.6- Kruskal-Wallis do parâmetro DE.

…...................................................................111

3.7- Anova do parâmetro IE.

…...................................................................113

3.8- Kruskal-Wallis do parâmetro IE.

…...................................................................113

3.9- Anova do parâmetro PM.

…...................................................................115

3.10- Kruskal-Wallis do parâmetro PM.

…...................................................................115

3.11- Sumário das análises de variância.

…...................................................................128

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AE: Atividades Epileptiformes

AMPA: Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-

isoxazolepropionico

Anova: Análise de variância

ATP: Trifosfato de adenosina

CA1: Área 1 do Corno de Amon

CA2: Área 2 do Corno de Amon

CA3: Área 3 do Corno de Amon

: Íon(s) cálcio

[Ca

]

: Íons cálcio intracelulares

[Ca

]

: Íons cálcio extracelulares

: Íon(s) cloreto

[Cl

]

: Íons cloreto intracelulares

[Cl

]

: Íons cloreto extracelulares

CID 10: Classificação Estatística Internacional de

Problemas Relacionados à Saúde- 10

Revisão

CO: Monóxido de carbono

: Dióxido de Oxigênio; gás carbônico

CPH: Células Piramidais Hipocampais

CPLA

: Fosfolipase citossólica A

DA: Depressão Alastrante de Leão

DC: Parâmetro queda de tensão (Direct Current)

DE: Parâmetro Duração do Evento

DG: Giro denteado (Dentate Gyrus)

EE: Eventos Epileptiformes

EHIN: Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica do Recém

Nato

EIH: Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica

ELT: Epilepsia do Lobo Temporal

EMLT: Epilepsia Mesial do Lobo Temporal

ERO: Espécie Reativa de Oxigênio

FADH: Flavina-adenina-dinucleotídeo (forma ativa)

GABA: Ácido Gama Amino Butírico

GDH: Giro Denteado Hipocampal

GUI: Interface gráfica com o usuário (Graphic User

Interface)

Hip: Grupo Experimental Hipóxia

IE: Parâmetro Intervalo entre Eventos

IL-6: Interleucina-6

IOS: Sinal óptico intrínseco (Intrinsic Optical Sign)

Isq: Grupo Experimental Isquemia

: Íon(s) potássio

]

: Íons potássio intracelulares

]

Íons potássio extracelulares

LANEC: Laboratório de Neurociência Experimental e

Computacional

Manova: Análise de variância multiparamétrica

MAP: Proteína ativada por mitogênio

MEC: Meio Extra Celular

Mix: Grupo Experimental Isquemia + Hipóxia

mM: Milimole

mV: Milivolt

MDA: Ativação Denteada Máxima

: Íon(s) magnésio

[Mg

]

: Íons magnésio intracelulares

[Mg

]

: Íons magnésio extracelulares

MNS: Mecanismos Não Sinápticos

MSK: Eletrodos seletivos para potássio

: Nitrogênio molecular

: Íon(s) sódio

[Na

]

: Íons sódio intracelulares

[Na

]

: Íons sódio extracelulares

-K

-ATPase: Enzima representante da bomba de

sódio/potássio

NADH: Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (forma

ativa)

NO: Óxido nítrico

NMDA: n-metil-d-aspartato

: Oxigênio molecular

1,2,3...n

: Faixa etária em dias, como referido pelo índice.

PC: Paralisia Cerebral

PCH: Protocolo de Hipóxia Contínua (teores

invariantes de gases)

PCO

: Taxa de CO

em um dado tecido

PEPS: Potenciais Excitatórios Pós Sinápticos

PH: Potencial hidrogeniônico

PM: Parâmetro Máxima ponta coletiva (population

spike)

: Taxa de oxigenação em um dado tecido

PPH1, PPH2: Protocolos de Hipóxia (teores variáveis de

gases)

PS: Parâmetro Pontas Coletivas (Population

Spikes)

ROS: Espécies reativas de Oxigênio (Reactive Oxygen

Species); Radicais Livres

SDH: Despolarização hipóxica semelhante à

Depressão Alastrante (Hipoxic Spreading

Depression-like Depolarization)

SNC: Sistema Nervoso Central

UFSJ: Universidade Federal de São João del Rei

VET/ Imagem VET: Visualização da evolução espaço-temporal do

IOS

: Potencial de membrana

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

…............................ pág.19

Aspectos etimológicos do termo epilepsia

…............................ pág.19

Aspectos clínicos e taxonômicos das epilepsias

…............................ pág.20

Aspectos epidemiológicos das epilepsias

…............................ pág.22

Objetivos da pesquisa

…............................ pág.26

1-REVISÃO DA LITERATURA

…............................ pág.28

1.1-Mecanismos não sinápticos na epileptogênese

…............................ pág.28

1.1.1- Possíveis mecanismos para a epileptogênese

…............................ pág.29

1.1.2- Mecanismos não-sinápticos: perfil do esforço de pesquisa

…............................ pág.32

1.1.3-A relação entre a susceptibilidade etária e os mecanismos não

sinápticos

…............................ pág.35

1.1.4- Conexões não sinápticas: uma definição

................................ pág.36

1.1.5- O papel do giro denteado na epileptogênese

…............................ pág.36

1.1.6-O giro denteado hipocampal e a plasticidade neuronal

…............................ pág.39

1.1.7- A importância da glia nos mecanismos não sinápticos

…............................ pág.43

1.1.8- O papel da glia na homeostase iônica

…............................ pág.43

1.1.9- O papel da glia na geração e disseminação de atividades

epileptiformes

…............................ pág.45

1.1.10- A importância do pH nos eventos não sinápticos no giro

denteado

…............................ pág.48

1.2- Uma visão panorâmica do estado da arte em modelagem

…............................ pág. 49

1.2.1- A modelagem de epilepsias derivadas de síndromes

hipóxico-isquêmicas

…............................ pág. 55

1.2.2- Modelos isquemia/hipóxia escolhidos como referência

…............................ pág.56

1.3- Fisiopatologia dos episódios hipóxico-isquêmicos

…............................ pág. 57

1.3.1- Estadiamento fisiopatológico do episódio hipóxico-

isquêmico

…............................ pág.58

1.3.2- O papel do óxido nítrico e do monóxido de carbono na

isquemia/hipóxia: a importância do edema na fisiopatologia

hipoxêmica

…............................ pág.60

1.3.3- A importância da homeostase iônica nos quadros hipóxico-

isquêmicos

…............................ pág.62

1.3.3.1- O cloreto

…............................ pág.62

1.3.3.2- Outros íons e proteínas

…............................ pág.63

1.3.4- A importância das citocinas na resposta ao episódio

hipóxico-isquêmico

…............................ pág.64

1.3.5- Histologia de tecido cerebral exposto à hipóxia crônica

…............................ pág.65

1.3.6- Imunohistoquímica dos tecidos submetidos à

hipóxia/isquemia

…............................ pág.66

1.3.7- Hipóxia, asfixia e isquemia: similaridades e diferenças

…............................ pág.69

1.4- Resumo do capítulo

…............................ pág.70

2- MATERIAIS E MÉTODOS

…............................ pág.71

2.1- Procedimentos típicos do estudo

…............................ pág.71

2.1.1- Protocolos de hipóxia

…............................ pág.71

2.1.2- Procedimentos cirúrgicos para a isquemia

…............................ pág.72

2.1.3- Equipamentos desenvolvidos para a pesquisa

…............................ pág.76

2.1.3 a) Câmara de hipóxia

…............................ pág.76

2.1.3 b) Termômetro retal

…............................ pág.77

2.2- Procedimentos gerais do estudo

…............................ pág.79

2.2.1- Procedimentos cirúrgicos para obtenção dos hipocampos

…............................ pág.82

2.2.2- Eletrofisiologia

…............................ pág.84

2.2.3- Processamento dos registros eletrofisiológicos

…............................ pág.85

2.2.3 a) Aquisição e pré-processamento dos sinais …............................ pág.85

2.2.3 b) Pós-processamento dos sinais

…............................ pág.86

2.2.4- Análise estatística dos dados

…............................ pág.88

2.2.4.1- Tipos de dados

…............................ pág.89

2.2.4.2- A escolha do método

…............................ pág.89

2.2.4.2 a) Métodos paramétricos

…............................ pág.90

2.2.4.2 b) Métodos não-paramétricos

…............................ pág.91

2.2.4.2 c)Métodos de comparações pareadas versus comparações

múltiplas

…............................ pág.92

2.2.5- Análise histopatológica

…............................ pág.93

3-APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS

…............................ pág.94

3.1- Estudos preliminares de isquemia seguida de hipóxia

…............................ pág.94

3.2- Resultados dos grupos experimentais

…............................ pág.96

3.2.1- Tabulação dos dados

…............................ pág.96

3.2.1.1- Ajuste de curvas

…............................ pág.96

3.2.1.2- Histogramas dos grupos experimentais e controle

…............................ pág.100

3.2.1.2- A) Histograma do parâmetro DC

…............................ pág.100

3.2.1.2- B)Histograma do parâmetro PS

…............................ pág.101

3.2.1.2- C)Histograma do parâmetro DE

…............................ pág.102

3.2.1.2- D)Histograma do parâmetro IE

…............................ pág.103

3.2.1.2- E)Histograma do parâmetro PM

…............................ pág.104

3.3- Análises estatísticas

…............................ pág.105

3.3.1- “Box Plot” e análise de variância do parâmetro DC (Anova e

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.106

3.3.2- “Box Plot” e análise de variância do parâmetro PS (Anova e

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.108

3.3.3- “Box Plot” e análise de variância do parâmetro DE (Anova e

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.110

3.3.4- “Box Plot” e análise de variância do parâmetro IE (Anova e

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.112

3.3.5- “Box Plot” e análise de variância do parâmetro PM (Anova e

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.114

3.3.6- Multicomparação dos parâmetros avaliados nos grupos

experimentais versus controle

…............................ pág.116

3.3.6.1- Multicomparação do parâmetro DC (Anova versus

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.116

3.3.6.2- Multicomparação do parâmetro PS (Anova versus

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.117

3.3.6.3- Multicomparação do parâmetro DE (Anova versus

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.118

3.3.6.4- Multicomparação do parâmetro IE (Anova versus

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.119

3.3.6.5- Multicomparação do parâmetro PM (Anova versus

Kruskal-Wallis)

…............................ pág.120

3.3.7- Análise multivariada (Manova) de todos os grupos,

considerando quatro parâmetros

…............................ pág.121

3.3.7.1- Resultados de Manova

…............................ pág.122

3.3.8- Exemplos de registros dos diversos parâmetros/grupos

…............................ pág.123

3.3.8- A) grupo exp. Hip

…............................ pág.123

3.3.8- B) grupo exp. Isq

…............................ pág.124

3.3.8- C) grupo exp. Mix

…............................ pág.126

3.3.8- D) comparação entre os registros dos três grupos exp.

…............................ pág.127

3.4- Sumário da análise estatística dos resultados

…............................ pág.127

4- DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

…............................ pág.129

Aumento dos níveis DC e DE nos grupos Hip e Isq.

….......................... pág. 129

Expansão do MEC e sensibilização: um paradoxo?

…............................ pág.130

PS ou PM, qual o melhor indicador de sensibilização?

…............................ pág.132

O grande paradoxo do grupo Mix

…............................ pág.133

O pequeno paradoxo dos grupos Hip e Isq

…............................ pág.142

Mecanismos comuns subjacentes à sensibilização epileptogênica e

morte neuronal

…............................ pág.143

5-CONCLUSÕES E SUGESTÕES

…............................ pág.145

6-REFERÊNCIAS

…............................ pág.147

APÊNDICE A: CONEXÕES NÃO-SINÁPTICAS

…............................ pág.157

A.1) Efeito de campo elétrico

…............................ pág.157

A.2) Flutuações iônicas

…............................ pág.158

A.3) Interações efápticas

…............................ pág.161

A.4) Interação eletrotônica via gap-junctions

…............................ pág.162

APÊNDICE B: ASPECTOS ANATÔMICOS E

NEUROFISIOLÓGICOS DO HIPOCAMPO E

ESTRUTURAS ASSOCIADAS

…............................ pág.166

B.1) Planos de corte e posicionamento anatômico

…............................ pág.166

B.2) Aspectos neuroanatômicos do hipocampo e outras regiões de

interesse

…............................ pág.169

B.2.1) O sistema límbico

…............................ pág.169

B.2.2) Aspectos anatômicos do hipocampo

…............................ pág.174

B.3) Aspectos eletrofisiológicos do hipocampo

…............................ pág.174

B.3.1) Registros de eletroencefalografia e a sincronização no

hipocampo

…............................ pág.174

B.3.2) A organização da circuitaria hipocampal e o fluxo

processual de informações

…............................ pág.176

ANEXO (Código Fonte)

…............................ pág.178

INTRODUÇÃO

Aspectos etimológicos do termo epilepsia.

A palavra epilepsia foi tomada do termo equivalente em latim, e este do grego

επιληψσια

, que significa interrupção brusca. Esse termo, por sua vez, provém de

επιλαμβανειν

que poderia ser traduzido como tomar, interceptar ou atacar

(CORMINOS,1954). O Dicionário Etimológico da Língua Portuguesa (NASCENTES,

1955) também traduz o termo grego como ato de surpreender, coisa súbita, e

epileptógeno como derivado do grego επιλεπτοσ

, tomado de surpresa, tendo como

sufixo ‘gen’, raiz de γιγνομαι

, gerar.

Da mesma forma o Diccionário Etimológico de la Lengua Castellana considera

o termo grego para epilepsia como derivado de επιλαμβανειν, composto do prefixo

επι, ou sobre, e λαμβανειν, traduzido como tomar, sobretomar ou surpreender porque

“el epiléptico cae como sobrecogido y entra de improviso em convulsión” (MONLAM,

1941: 308). Percebe-se, portanto, que já nas suas remotas origens históricas, talvez tão

antigas quanto a própria humanidade (PENFIELD e JASPER, 1954 apud LONGO e

BLANCO, 2007) o termo epilepsia poderia ensejar a percepção de que algo externo ao

indivíduo o invadisse de surpresa, abruptamente, e por fim tomasse o controle de seu

corpo e de sua mente, levando-o ao chão.

De fato, os povos antigos assim acreditavam, considerando que o paciente de

epilepsia era possuído por maus espíritos ou demônios. Essa concepção perdurou pelo

menos até 200-400 a.C., quando Hipócrates e Plínius centraram seus estudos na

identificação da epilepsia como doença que tem origem no cérebro, assim inaugurando

a perspectiva clínica na abordagem desta nosologia (NIEDERMAYER,1990 apud

LONGO e BLANCO, 2007).

Aspectos clínicos e taxonômicos das epilepsias.

Transliterado como epilépsia

Transliterado como epilâmbanó

Transliterado como epileptós

4 Transliterado como ginomai

Contemporaneamente, a Classificação Estatística Internacional de Doenças e

Problemas Relacionados à Saúde [CID-10] (ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DA

SAÚDE / ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2000) relaciona a epilepsia

dentre os transtornos episódicos paroxísticos, conforme o quadro abaixo:

QUADRO 1.1

Extrato da classificação dos transtornos episódicos paroxísticos conforme a CID-10

G40.0 Epilepsia e síndromes epilépticas idiopáticas definidas por sua ................

...................localização (focal) (parcial) com crises de início focal

Epilepsia da criança

•Benigna com espículas-ondas centro-temporais no EEG

•Com paroxismos occipitais no EEG

G40.1 Epilepsia e síndromes epilépticas sintomáticas definidas por sua ................

...................localização (focal) (parcial) com crises parciais simples

Crises

•Parciais simples evoluindo para crises secundariamente generalizadas

•Sem perda de consciência

G40.2 Epilepsias e síndromes epilépticas sintomáticas definidas por .....sua

................localização (focal) (parcial) com crises parciais complexas

Crises

•Com alteração da consciência, freqüentemente com automatismos

•Parciais complexas evoluindo para crises secundariamente generalizadas

G40.3 Epilepsia e síndromes epilépticas generalizadas idiopáticas

Convulsões neonatais benignas (familiares)

Crises epilépticas não identificadas

•Atônicas

•Clônicas

•Mioclônicas

•Tônicas

•Tônico-clônicas

Epilepsia (de)

•Ausências da adolescência

•Ausências da infância [picnolepsia]

•Com crises de grande mal ao despertar

•Mioclônica benigna da infância

•Mioclônica juvenil [pequeno mal impulsivo]

G40.4 Outras epilepsias e síndromes epilépticas generalizadas

Crises de Salaam

Encefalopatia mioclônica precoce sintomática

Epilepsia com:

•Ausências mioclônicas

•Crises astato-mioclônicas

Espasmos infantis / Síndrome de:

• Lennox-Gastaut

• West

G40.5 Síndromes epilépticas especiais

Crises epilépticas relacionadas aos seguintes fatores:

•Álcool

•Medicamentos

•Modificações hormonais

•Privação de sono

•“Stress”

Epilepsia parcial contínua

Como se pode observar na CID-10

, admite-se hoje dois grandes grupos de

síndromes epilépticas no que concerne à origem e curso das crises, quais sejam,

epilepsias inicialmente focais, posteriormente generalizadas ou não, e epilepsias

generalizadas já na instalação da crise. Essa classificação também contempla os grupos

de crises com ou sem comprometimento motor (listadas no grupo G40.3).

A CID-10 também lista (não transcrito aqui) epilepsias mal identificadas ou sem

diagnóstico definido (anteriormente denominadas criptogenéticas), além do estado de

mal epiléptico, ou status epilepticus, definido por Kandel (2000) como estado de crises

generalizadas repetidas, sem retorno à consciência plena entre crises.

O estado de mal epiléptico constitui uma verdadeira emergência médica pois,

segundo Epstein e O’Connor (1966), se não for interrompido, pode levar o paciente a

graves distúrbios de oxigenação, com asfixia e edema cerebral, que, repercutindo em

centros encefálicos, são capazes de levar à morte. Lowenstein e Alldredge (1993)

realizaram um amplo estudo sobre o status epilepticus na década de 1980, encontrando

um percentual de êxito letal de 1,3% e prognóstico mais sombrio na vigência de choque

ou anóxia como desancadeantes das crises.

No que tange à etiopatogenia das síndromes epilépticas, a CID-10 divide-as em

idiopáticas e sintomáticas. Considera-se idiopática, também conhecida como essencial

ou genuína, a síndrome epiléptica primária, sem relação com substâncias exógenas,

Contemporaneamente, prefere-se a classificação da ILAE (International League Against

Epilepsy), a qual se encontra em processo de revisão por um grupo de especialistas e, por este motivo,

não a incluímos aqui, mantendo a classificação de uso generalizado pelos clínicos, em nosso país. A

ILAE, assim como a CID-10, divide as epilepsias em dois grupos principais: focais e generalizadas, sendo

as primeiras subdivididas em Idiopáticas, Familiares e Sintomáticas; cita também essa classificação as

epilepsias Reflexas, Mioclônicas Progressivas e as Encefalopatias com manifestações epilépticas.

síndromes orgânicas, massas intracranianas ou qualquer tipo de mal formação cerebral

Já nas epilepsias sintomáticas identifica-se (ou potencialmente poder-se-ia identificar,

nos quadros anteriormente designados como criptogênicos) a doença ou condição que

subjaz à síndrome epiléptica.

Merece destaque especial a epilepsia do lobo temporal, que pode cursar com um

cortejo de manifestações psíquicas. Essas manifestações podem, inclusive, levar a um

diagnóstico errôneo por parte de um clínico menos atento, confundindo-se com quadros

neuróticos ou psicóticos. Manifestações comuns neste tipo de epilepsia são alucinações

(auditivas, visuais, olfativas e gustativas), fenômenos ilusórios (macropsia, micropsia,

“jamais vu” e “déjà vu”) e alterações do humor (ROZMAN,1974).

O autor acima também cita a poriomania, ou impulso de emigrar, quadro

bastante estranho onde os pacientes empreendem longas viagens sem, no entanto, dar

aos observadores quaisquer mostras de se acharem perturbados. Quando, enfim,

regressam, ao terminar o acesso, não se recordam do que fizeram, no máximo tendo do

episódio uma vaga lembrança, como num sonho.

Aspectos epidemiológicos das epilepsias.

No que concerne aos aspectos epidemiológicos, "a epilepsia é tão freqüente

quanto o diabetes" e “pode estar mascarada de tantas formas que mesmo um clínico

experiente pode estar tratando um paciente epiléptico com ou sem conhecimento do

fato” (BOSHES e GIBBS,1976:7).

Cockerel e Shorvon (1997) consideram a epidemiologia como essencial para

nossa compreensão da epilepsia, já que estudos de prevalência e mortalidade fornecem

medidas fundamentais da freqüência e dos encargos desta doença, assim permitindo o

correto planejamento de serviços. Os custos, principalmente sociais e laborativos, para

além dos encargos monetários envolvidos na epilepsia também poderiam nortear e

quantificar o investimento público e privado na pesquisa, tanto clínica quanto básica

desta entidade nosológica.

Segundo o Pequeno Dicionário da Língua Portuguesa (FERREIRA, 1972) idiopatia

refere-se à doença que não é conseqüência de outra.

Segundo esses últimos autores referidos, a incidência (ou número de

novos casos na população definida) de epilepsia em todo o mundo mostra uma ampla

faixa de variação, com o mínimo de 11/100.000 e o máximo de 134/100.000 casos

novos/habitantes. Transportando esses dados para o Brasil, teríamos entre nós um

mínimo de 19.800 e um máximo de 251.200 novos casos por ano. Já quanto à

prevalência (número de todos os casos na população definida), ainda com esses autores,

esta situa-se, internacionalmente, entre 1,5 e 31 casos por 1000 habitantes.

Segundo Guerreiro e Guerreiro (1996), a taxa de incidência varia de 11 a

131/100.000 por ano e a prevalência de 1,5-30/1000. Marino et al encontraram

prevalência na Grande São Paulo de 11,9/1000. Mais recentemente, Fernandes et al

determinaram uma prevalência de 16,5 e 20,3/1000 respectivamente para epilepsia ativa

e inativa em Porto Alegre. A faixa etária mais acometida é a infantil, particularmente

abaixo de 2 anos de idade e em segundo lugar, idosos com mais de 65 anos. A maioria

dos estudos mostra que há discreto predomínio nos homens em relação às mulheres (1,1

a 1,7 vezes).

Outros autores corroboram o acima citado, situando a prevalência no Brasil em

torno de 10,6/1000 casos/habitantes (ou seja, cerca de dois milhões de casos), em média

(BORGES, ZANETTA, e BORGES, 2002 ; BORGES et al, 2004).

É mister observar, porém, que outros estudos demonstram um perfil assimétrico

na distribuição da doença, com maior concentração de casos (novos ou existentes) nas

faixas de menor renda (RABELO et al,2006).

Esta face cruel da epilepsia, ou seja, atingir preferencialmente a camada da

população que já tem naturalmente dificultado seu acesso aos serviços de saúde, por

força de sua baixa renda (dificuldades no transporte, menor educação formal e informal,

impossibilidade de contratar planos e serviços de saúde privados etc.), termina por

penalizar duplamente os mais necessitados, gerando uma “dívida social”, de forma

alguma desprezível.

Este, talvez, seja o mais forte argumento a favor de um suficientemente grande

investimento em pesquisa básica, potencialmente capaz de alterar, senão a incidência,

através de novas formas de profilaxia da doença, pelo menos o curso desta entidade

nosológica, por meio da melhor compreensão dos mecanismos básicos de instalação e

progresso da epilepsia nos tecidos e funções afetados.

No que tange à localização cerebral do foco epiléptico primário, a epilepsia do

lobo temporal é uma das mais freqüentes epilepsias humanas e uma das de mais difícil

controle medicamentoso. De acordo com Rozman (1974) a epilepsia temporal responde

por aproximadamente 18% das epilepsias, sendo que destas cerca de 50% são

acompanhadas de transtornos psíquicos ou mentais, mais ou menos graves.

De acordo com Pedley (1996), a epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma

mais comum de epilepsia em adultos, responsabilizando-se por pelo menos 40% de

todos os casos. Crises que se originam do lobo temporal, incluindo a amígdala,

hipocampo e giro para-hipocampal, constituem um tipo distinto baseado na fisiologia

ictal, nos achados do EEG, na patologia e na resposta à cirurgia. Há muito menos

informação sobre a epilepsia neocortical do lobo temporal, e a maioria das definições

são expressas em termos negativos que enfatizam a ausência de características típicas da

epilepsia mesial do lobo temporal (também chamada epilepsia mesiobasal e epilepsia

límbica).

Conforme McNamara, Huang e Leonard (2006) 60% das epilepsias são parciais

(simples e complexas) e as epilepsias límbicas representam 40% de todas as epilepsias

em adultos. Destas, 30% seriam consideradas como fármaco-resistentes.

Observa-se que os autores acima citados não incluem em suas estatísticas as

epilepsias temporais corticais, apenas as límbicas, excluindo, por exemplo, a epilepsia

sintomática cortical temporal secundária a neoplasias. Tal fato nos leva a supor que o

percentual de epilepsias envolvendo o lobo temporal deve ser maior do que o estimado

pelos autores em questão.

Um resumo dos aspectos epidemiológicos das epilepsias não estaria completo se

deixássemos de mencionar a Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica Neonatal (EHIN),

como fator etiológico da mais alta relevância na epileptogênese humana.

Araujo e Diniz (2008) definem asfixia perinatal como a síndrome que se

caracteriza pela deficiência no suprimento de oxigênio tecidual, a qual ocorre no

período que antecede ao parto ou mesmo no trabalho de parto. A complicação mais

comum do acidente hipóxico-isquêmico peri-natal, segundo os autores referidos, é a

encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal , que se constitui na afecção neurológica

mais comum nesta fase da vida humana.

Gherpelli, (2008), confirma essa asserção e acrescenta que modelos

experimentais demonstram claramente os efeitos deletérios da hipóxia e isquemia sobre

o sistema nervoso central. De acordo com Gherpelli, a diminuição de suprimento de O

para os tecidos pode ocorrer por duas vias, quais sejam, a hipoxemia que é a diminuição

do oxigênio circulante e a isquemia que é a diminuição da quantidade de sangue que

perfunde determinado tecido. O fenômeno asfíxico, prossegue o autor, é derivado e

resultante desses dois fatores: hipoxemia e isquemia, associados à hipercapnia (aumento

no CO

Segundo Greggio e Costa (2008) as síndromes hipóxico-isquêmicas perinatais

constituem o principal distúrbio associado às crises epilépticas neonatais. As crises

convulsivas incidem, segundo os autores citados, em 0,2 a 1,4 % de todos os nascidos

vivos, em seu primeiro ano de vida. Ademais, dos recém natos que apresentaram crises

epileptiformes derivadas de síndromes hipóxico-isquêmicas, 70% apresentarão seqüelas

que variarão de leves à graves, aí incluídas as epilepsias rebeldes e a paralisia cerebral.

O prognóstico dos recém natos que apresentaram crises convulsivas, de qualquer

origem, também não é dos mais favoráveis, ainda segundo Greggio e Costa (2008).

Cinquenta por cento dessas crianças evoluirão para o óbito ou apresentarão seqüelas

graves.

Também é importante destacar o comentário desses autores de que não está

esclarecida a relação das crises hipóxicas/isquêmicas conduzentes à crises convulsivas e

as subseqüentes lesões hipocampais, observadas a médio e longo prazos nesses

indivíduos .

Segundo Rotta (2002), surgem no Brasil cerca de 17000 novos casos/ano de

Paralisia Cerebral (PC), sendo a imensa maioria dos casos subseqüente à

hipóxia/isquemia perinatal. Volpe ( 2001) considera a hipóxia pré-natal responsável por

20% dos casos de encefalopatia hipóxico-isquêmica do recém nato (EHIN), a hipóxia

perinatal seria responsável por 35% dos casos e ambas, conjuntamente, por outros 35%,

restando para a hipóxia pós-natal os 10% restantes nesta etiopatogenia.

Bergamasco e colaboradores (1984), num estudo prospectivo, citam a EHIN

como a mais importante causa isolada de doenças neurológicas perinatais. Afirma ainda

Bergamasco que sua revisão da literatura indica que tais patologias perinatais são

responsáveis por uma grande porcentagem de epilepsias adquiridas.

Ainda mais importante se afigura o fato, citado por Bergamasco, de que o risco

de desenvolver epilepsias tardias em recém natos que padeceram de um ou mais

episódios hipóxico-isquêmicos é 5,1 vezes maior do que o grupo controle.

Gonzáles, Gonzáles e Hernándes (2001) reportam que de cada 1000 neonatos a

termo, 2 a 4 sofrerão um episódio hipóxico-isquêmico; de 15 a 20 % das crianças

asfixiadas que tenham apresentado EHIN, morrerão no período pós-natal e, dos que

sobreviverem, 25% apresentarão danos neurológicos permanentes.

Dugan e Kim-Han (2006) reforçam a importância epidemiológica dos acidentes

hipóxico-isquêmicos afirmando que tal lesão continua responsável por um terço das

causas de morte nos Estados Unidos, afetando mais de meio milhão de novas vítimas a

cada ano. Dessas vítimas, prosseguem os autores, 1/3 morrerá e outro terço será deixado

com limitações severas e permanentes.

Haja vista a importância clínica, epidemiológica e social dessa doença, o relevo

da pesquisa básica para uma melhor compreensão dos mecanismos que precipitam,

desencadeiam e sustentam a epilepsia, e ainda a relevância epidemiológica das

síndromes hipóxico-isquêmicas na epileptogênese humana, resta-nos uma pergunta:

qual a forma mais apropriada de estudar esta entidade nosológica em nosso

laboratório? É o que pretendemos desenvolver a seguir.

Objetivos da pesquisa.

Considerando que são raríssimos os estudos de mecanismos não sinápticos das

epilepsias derivadas de condições agudas de baixa oxigenação cerebral, em especial no

giro denteado hipocampal e, ademais, levando em conta a capacitação técnica do

LANEC para análises eletrofisiológicas, parece-nos de todo oportuno que escolhamos

uma linha de pesquisa que contemple a modelagem dessa situação clínica .

Este, portanto, revelou-se o nosso objetivo principal de estudo, ou seja, a análise

eletrofisiológica in vitro de fatias hipocampais, na região do giro denteado, de ratos

submetidos às condições de isquemia crônica e/ou hipóxia aguda, para observar a

eventual sensibilização epileptogênica sustentada por mecanismos não sinápticos nesses

animais jovens, como descreveremos em detalhes no capítulo Materiais e Métodos.

Nosso estudo limitou-se à observação da fase pós aguda da reação à hipoxemia.

Face à inexistência, até onde pudemos pesquisar, de modelos que se utilizam de

ratos Wistar, bem como a ausência de relatos na literatura de fenômenos não sinápticos

em qualquer raça de ratos após isquemia e/ou hipóxia, resolvemos desenvolver um

protocolo próprio para preencher essa lacuna experimental. Decidiu-se traçar um

protocolo combinado a partir dos protocolos de Williams , Dou e Dudek (2004) e o de

Sanchez e Jensen (2006), conforme descreveremos no capítulo Materiais e Métodos.

No presente trabalho obedeceremos ao seguinte desenvolvimento:

a) no capítulo 1, proceder-se-á a uma revisão da literatura destacando o esforço de

pesquisa concernente aos mecanismos não sinápticos da epileptogênese (MNS) e os

Modelos Experimentais de importância para o presente trabalho;

b) no capítulo 2, abordaremos da forma mais detalhada possível, os materiais e métodos

empregados na presente pesquisa;

c) no capítulo 3, exporemos nossos resultados;

d) no capítulo 4, discutiremos nossos resultados e os colocaremos em perspectiva,

utilizando-nos da base de dados existente;

e) finalmente, no capítulo 5, apresentaremos as conclusões gerais do trabalho, as

contribuições dessa pesquisa para a neurociência, de uma forma geral, e indicaremos

futuras linhas de pesquisa possíveis (e interessantes) a partir do trabalho que realizamos.

No Apêndice A, faremos uma descrição detalhada dos diversos tipos conhecidos

de conexões não-sinápticas; no Apêndice B, traçaremos algumas considerações sobre

aspectos anatômicos e anátomo-fisiológicos que podem ser úteis na leitura e

interpretação do presente trabalho. No Anexo, reproduziremos o código fonte do

aplicativo do qual nos utilizamos para análise dos dados eletrofisiológicos.

CAPÍTULO 1

Revisão da Literatura

1.1- Mecanismos não sinápticos na epileptogênese.

Dudek, Yasumura e Rash (1998) afirmam que "um dos mais antigos e

controversos itens em neurociência centra-se no papel de comunicações químicas versus

comunicações elétricas entre neurônios". Os autores prosseguem afirmando que hoje em

dia os neurocientistas geralmente aceitam que as sinapses químicas constituem a

principal forma de comunicação sob condições normais e que uma anormalidade na

transmissão química é a base de muitas desordens neurológicas.

Não obstante, esses mesmos autores reconhecem que há um vasto corpo de

dados apoiando a hipótese de que outros mecanismos "não-sinápticos" contribuem para

a geração e disseminação da atividade epiléptica e que o acoplamento eletrotônico

através de "gap-junctions" possa desempenhar um importante papel na sincronização

neural durante eventos epileptiformes.

Já na última vintena do século passado, Taylor e Dudek (1982) demostravam

que, mesmo com a transmissão sináptica bloqueada, estímulos elétricos antidrômicos

podiam evocar pós-descargas de até nove segundos de duração. Esses autores enfatizam

que, durante essas descargas, os potenciais de ação medidos a partir de um neurônio

isolado estavam sincronizados com as population spikes, registradas extracelularmente.

Prosseguem os autores sugerindo que outros mecanismos que não os sináptico-

químicos poderiam estar sincronizando e recrutando tais eventos. Tais mecanismos

poderiam estar representados, por exemplo, pelos campos elétricos, nas interações

efápticas

, ou pelas concentrações iônicas extracelulares, em especial quando

mecanismos não-sinápticos estivessem envolvidos, acrescentaríamos nós. Como

podemos constatar na literatura, inúmeros trabalhos posteriores, de diversos autores,

vieram a confirmar o que foi antecipado por Taylor e Dudek (1982).

1.1.1- Possíveis mecanismos para a epileptogênese

De acordo com mensurações transmembrânicas por eles realizadas. Vide Apêndice A para uma

descrição detalhada desse tipo de conexão.

De acordo com Mello (1996), no capítulo "Mecanismos básicos", do livro

"Epilepsia" , mecanismos sinápticos e não sinápticos poderiam explicar a

epileptogênese. Dentre os mecanismos sinápticos, o autor cita:

1.Diminuição da inibição GABAérgica,

a) por gradiente diminuído, isto é, aumento do cloro intracelular secundariamente a um

aumento do potássio extracelular, ou então uma falha no co-transporte de cloro-

potássio

;

b) por Diminuição na condutância pós-sináptica ao cloro devido, por exemplo, à

inibição de liberação de GABA pela ação pré-sináptica do GABA (dessensibilização

dos receptores?).

2.Ativação dos receptores do NMDA,

a) por potenciais excitatórios pós sinápticos (PEPS) dependentes de voltagem.

b) por potenciação dos PEPS por alta freqüência.

3.Ação de moduladores,

a) por diminuição do pós-potencial hiperpolarizante e da acomodação da freqüência de

potenciais de ação devido à noradrenalina e/ou à acetilcolina;

b) por diminuição da condutância de potássio não dependente de voltagem devido à

noradrenalina, serotonina e/ou acetilcolina.

Já dentre os mecanismos não sinápticos, Mello relaciona:

1.Alterações no microambiente iônico, por exemplo aumento do potássio e

diminuição do cálcio extracelulares.

2.Diminuição do espaço extracelular.

3.Falha do transporte iônico, isto é, da bomba de sódio-potássio e do co-transporte

de cloro-potássio.

4.Surto de disparos do terminal pré-sináptico.

5.Interações efáticas.

Mello (1996) prossegue afirmando que qualquer das alterações acima pode ser

inata ou adquirida. Mesmo nos casos onde o início das crises está claramente associado

É, no mínimo, curiosa a inclusão pelo autor deste subitem nos mecanismos sinápticos. Não nos

parece que o aumento de [Cl

]

, secundário ao incremento de [K

]

tenha qualquer relação direta com

mecanismos sinápticos, ao contrário, tais alterações interfeririam diretamente com os MNS. Da mesma

forma, surtos de disparos no terminal pré sináptico não desempenhariam qualquer papel em condições

não-sinápticas de epileptogênese.

a um evento ambiental, ainda é possível considerar uma maior susceptibilidade

individual dependente de fatores genéticos.

Esta observação se nos afigura importante em nossa argumentação pois,

obviamente, os fatores genéticos não apenas envolvem a expressão de receptores pós-

sinápticos para neurotransmissores, dentre outros fatores importantes para os

mecanismos sinápticos, quanto de outros padrões fenotípicos, tais como a relação

espaço intra/extra celular, determinantes da susceptibilidade individual à epileptogênese

mediada por mecanismos não-sinápticos (MNS).

A existência de um intervalo entre o suposto evento epileptogênico e o

aparecimento de crises recorrentes, diz Mello, sugere um processo de amadurecimento

no qual emerge a epilepsia clínica. Mais adiante constataremos a importância desse

processo na gênese das atividades epileptiformes (AE) recorrentes, ou seja, do que

entendemos especificamente como epilepsia.

O desenvolvimento de um modelo experimental progressivo da epilepsia,

denominado de abrasamento (kindling), e o achado de um padrão progressivo de lesões

e/ou alterações morfológicas em algumas epilepsias humanas e em modelos

experimentais reforçou, afirma Mello, a idéia de que várias epilepsias seriam precedidas

por um período de amadurecimento.

Prossegue o autor dizendo que em diversos pacientes é possível traçar uma

história natural das crises epilépticas, onde, por exemplo, alguns meses ou anos após um

traumatismo crâneo-encefálico (TCE) o indivíduo passa a apresentar crises convulsivas

recorrentes (epilepsia). Da mesma maneira, em modelos experimentais de epilepsia, à

indução de estado de mal epiléptico associa-se o aparecimento de crises convulsivas

espontâneas.

Mello (1996) sustenta ainda que, no entanto, em ambas as situações, é

importante dissociar as crises agudas (que podem ser únicas e, por definição, não

epilépticas) das crises remotas (em geral recorrentes). É por este motivo que

convenciona-se chamar os paroxismos que surgem nos modelos animais de atividades

epileptiformes e não epilépticas.

Deve-se destacar nesse texto a afirmação da presença de uma janela de

susceptibilidade aumentada, dependente da faixa etária, favorecendo a epileptogênese e,

eventualmente, a cronificação posterior da doença.

Também Pedley (1996) fala a favor da existência desta janela de susceptibilidade

sustentando que a epilepsia mesial de lobo temporal (EMLT), na maioria das vezes

começa na infância tardia ou adolescência.

Sem dúvida, seria de enorme importância identificar que padrão, ou padrões,

alteram-se de forma significativa em encéfalos maduros que os fazem tornar-se mais

resistentes à epileptogênese. Seriam essas alterações basicamente ligadas aos fatores

predisponentes de ordem sináptica, não sináptica ou a ambos?

Em qualquer caso, cremos que seria relevante respondermos às seguintes

questões:

zOs mecanismos não-sinápticos (MNS) são necessários e suficientes para

explicar a epileptogênese?

zOs MNS são imprescindíveis para a epileptogênese?

zOs MNS poderiam, se inibidos, evitar uma crise epiléptica?

zOs MNS poderiam, se controlados, evitar a epilepsia a partir do estímulo

desencadeante primário, na janela terapêutica?

zOs MNS poderiam representar uma alternativa farmacológica para o controle

da epilepsia?

zOs MNS podem constituir uma alternativa eficaz para o entendimento da

gênese dos processos epilépticos, agudos ou crônicos?

zMesmo na presença de mecanismos quimio-sinápticos, os MNS permanecem

como atores importantes na epileptogênese?

Desde já adiantamos que cremos firmemente que os MNS não podem ser

desprezados numa abordagem séria e completa da neurofisiologia do SNC, em especial

no que respeita à epileptogênese.

1.1.2- Mecanismos Não-Sinápticos: Perfil do Esforço de Pesquisa

Uma pesquisa no sítio de busca Google (disponível em <http://www.google.com.br>,

acesso em 15 nov. 2007) com as palavras chave non-synaptic AND epileptogenesis

OR epilepsy retorna 12.300 páginas. Já outra pesquisa com os termos synaptic AND

epileptogenesis OR epilepsy retorna 140.000 páginas. Resultados similares são obtidos

em outros sítios de busca, como o Alta Vista, por exemplo.

Esses resultados espelham de forma bem aproximada o percentual de esforço

científico hoje dedicado aos mecanismos não-sinápticos da epileptogênese, menos que

10% das pesquisas abordam este processo.

Talvez fosse oportuno introduzir aqui um relato anedótico de Murray Gell-Mann

(GUELL-MANN,1994), sobre Gerald Durrel, fundador do zoológico da ilha de Jersey,

quando este último deparou com uma cobra do oeste da África que ele “sabia” tratar-se

de uma espécie cega e inofensiva, como a cobra-de-vidro européia. Pois, de fato,

tratava-se de uma nova espécie, extremamente venenosa que, ao abrir os olhos e morder

Durrel, quase o levou à morte.

A ênfase excessiva nos mecanismos sinápticos talvez esteja a reproduzir um

esquema mal-adaptativo, uma crença resiliente, e esteja deixando de lado outros

processos intervenientes na epileptogênese que poderão vir a demonstrar-se mais

essenciais, no sentido de representarem um fenômeno mais básico, disseminado e geral

do que os processos que envolvem os diversos neurotransmissores e seus receptores.

Talvez a comunidade científica esteja considerando, como Durrel, os mecanismos não-

sinápticos como uma curiosidade desimportante quando, na verdade, tenham se

deparado com um fenômeno novo e mal conhecido, potencialmente tão letal quanto a

cobra de Durrel.

Apesar das relativamente escassas referências aos mecanismos não-sinápticos na

literatura, 12.300 referências já representam um banco de dados considerável que nos

permitirá traçar uma linha histórica bastante abrangente desde a descoberta do

fenômeno não sináptico até nossos dias.

Há 22 anos, Konnerth, Heinemann e Yaarly (1986) já publicavam uma pesquisa

sobre a epileptogênese não sináptica in vitro no hipocampo de mamíferos. Nesse

trabalho, foi estudada a atividade epileptiforme induzida em fatias de hipocampo de

ratos, com registros intra e extra celulares, através da redução do [Ca

]

. Perfundindo

as fatias com baixo Ca

(menor ou igual a 0.2 mM) ou soluções contendo EGTA (um

quelante que sequestra cálcio) os autores observaram bloqueio das respostas sinápticas

das células piramidais hipocampais (CPH). Apesar do bloqueio, paroxismos

espontâneos, por eles denominados eventos epileptiformes (EE), apareceram em CA1 e

recorreram com freqüência estável. Hipóxia transiente acelerou o desenvolvimento e

aumentou a freqüência dos EE. Quando o [Ca

]

foi incrementado em etapas, os EE

desapareceram aos 0.3 mM.

Este constitui um dos registros mais antigos na literatura que comprovam que as

atividades epileptiformes independem de mecanismos sinápticos para sua gênese,

disseminação e manutenção.

Ainda nesse trabalho (KONNERTH, HEINEMANN e YAARI, 1986), os autores

ressaltam que a partir de um registro extracelular do estrato piramidal de CA1, um EE

caracterizava-se por um grande desvio negativo no potencial de campo, o qual

perdurava por vários segundos, como até hoje caracteriza-se o registro eletrofisiológico

de atividades epileptiformes em modelos animais.

Durante esse período, uma grande população neuronal de CA1 descarregava

intensamente e, freqüentemente, em sincronia, como se conclui pela freqüente aparição

de population spikes

. A sincronização, observam os autores, entretanto não

representava um precursor necessário para o desenvolvimento de atividade paroxística,

parecendo antes denotar o resultado final de uma generalizada excitação neuronal.

Tais observações são ainda hoje pertinentes e chamam a atenção para o fato de

que a excitação coletiva de uma grande população neuronal antecede à sincronização de

disparos neuronais, este último fenômeno mais evidente do que a silenciosa excitação

que lhe precede. De fato, esta cronologia dos eventos não nos deveria surpreender se

consideramos sua essência não sináptica, apoiada em mecanismos que envolvem

gradientes iônicos extra celulares, campos eletrotônicos ou efápticos e outros que tais,

os quais independem de conexões sinápticas e, assim, tendem a recrutar grande número

de células neuronais expostas ao mesmo micro ambiente local.

Concluem os autores que a área hipocampal CA1 é capaz de gerar e sustentar

atividade epileptiforme máxima na ausência de transmissão sináptica.Tal é atribuído ao

desenvolvimento de uma retro-alimentação (ou feedback) intensa e positiva na

circuitaria neuronal através de interações excitatórias não sinápticas, as quais não são

restritas por mecanismos inibitórios dependentes do [Ca

]

e dos mecanismos

estabilizadores operando no microambiente iônico normal.

É digno de nota, ainda no trabalho em pauta, a hipótese levantada pelos autores

de que a acumulação e dispersão espacial do K

no interstício de CA1 desempenhe um

Population spikes (pontas populacionais ou coletivas), representam o registro de pontas agudas

geradas por uma coleção neuronal disparando em sincronia. As population spikes correspondem a

"variações rápidas observadas em medidas do potencial extracelular, quando ocorrem descargas neuronais

síncronas" (ENGEL, 1989; VARONA et al., 2000). Mantivemos o termo em Inglês face a sua

generalizada adoção em neurociência.

papel primário neste processo. Esta hipótese é aprofundada em um trabalho publicado

junto ao primeiro, em que investiga-se o papel do potássio extracelular na

epileptogênese não sináptica em hipocampo de mamíferos (YAARI, KONNERTH e

HEINEMANN, 1986-b).

Na pesquisa cima citada, estudou-se o papel do K

extracelular ( [K

]

) na

epileptogênese induzida na área CA1 de fatias hipocampais de ratos, através da redução

do cálcio extracelular ([Ca

]

), com a utilização de microeletrodos seletivos para K

(MSK).

EE espontâneos associaram-se aos incrementos fásicos de [K

]

;

pequenas

reduções do [K

]

ocasionaram efeitos contrários..

A retirada de [Ca

]

foi acompanhada por um incremento tônico do [K

]

Crises máximas (EE) espontâneas ou induzidas por estímulos apareceram quando o

]

estava aproximadamente 0.5 mM acima da linha base inicial de 5 mM, revertendo

tais mudanças no meio normal.

Quando o [K

]

foi injetado sob pressão no estrato piramidal de CA1 de fatias

espontaneamente ativas, uma subida local de [K

]

de 0.5 mM era necessária para

disparar um EE. Um "limiar" similar foi associado aos EE evocados por estimulação

elétrica. O aumento pequeno e incremental de K

(1 mM) na solução de perfusão,

acentuou a freqüência e velocidade de propagação dos EE, diminuindo o período

refratário absoluto que se segue a cada paroxismo. Mudanças similares ocorreram nos

períodos de hipóxia transitória.

Em registros simultâneos de [K

]

em duas camadas, estes transientes

mostraram-se maiores (até 3.5 mM a partir da linha de base) e subiram de forma mais

abrupta no estrato piramidal. Aventaram os autores a hipótese de que as fontes

principais para esses transientes de [K

]

são os corpos celulares das CPH, as quais

descarregam intensamente durante um EE, e que um excesso de [K

]

está

espacialmente disperso em torno da zona de descarga do paroxismo.

1.1.3- A relação entre a susceptibilidade etária e os mecanismos não sinápticos

Há muito tempo se observa, como apresentamos na introdução deste trabalho, a

predileção da incidência de epilepsia em menores faixas etárias, evidenciando a maior

susceptibilidade do tecido cerebral imaturo à essa doença. Mais uma vez aqui a

explicação parece encontrar-se nos mecanismos não sinápticos que subjazem às

atividades epileptiformes.

Segundo Roper, Obenaus e Dudek (1993), num trabalho em que demonstram a

existência de uma janela de susceptibilidade epileptogênica aumentada em ratos de 2 a 3

semanas de idade, os MNS seriam os verdadeiros responsáveis por esse fato. No

trabalho acima, observou-se que o bursting ocorria mais freqüentemente nessa faixa

etária tanto em CA1 quanto no GDH, em condições de inibição da atividade sináptica.

Outra demonstração dessa pesquisa foi a de que, através da imersão das fatias

hipocampais em meio contendo manitol, soluto impermeável à membrana, cessavam as

AE. O que basicamente ocorria nesse banho de manitol era o encolhimento das células

e expansão relativa do meio extracelular, alterando concentração iônica e

osmolaridade do sistema, e reproduzindo, de certa forma, a situação do encéfalo adulto,

mais resistente à epileptogênese.

Esse estudo demonstrou cabalmente que a atividade aumentada de receptores

NMDA, que se aventava como mecanismo básico da maior susceptibilidade

epileptogênica dos tecidos imaturos, não era de nenhuma forma necessária para a

gênese desses fenômenos, uma vez que toda a atividade sináptica estava abolida nesses

referidos experimentos.

1.1.4- Conexões não sinápticas: uma definição.

Já que até aqui vimos falando, e ainda o faremos, de mecanismos não sinápticos,

importa que definamos um pouco melhor do que tratamos quando nos referimos a

conexões não sinápticas. Na verdade, lato senso, tratamos também aqui de sinapses,

apenas não nos referimos às sinapses clássicas, i.e., químicas. Etimologicamente

sinapse deriva diretamente do grego σιναψση (sinapsé), significando união. Entretanto,

em virtude da grande relevância para a comunicação interneuronal das sinapses

químicas, dependentes de neurotransmissores, o uso consagrou a estas últimas a

denominação genérica de sinapses, apenas, exigindo uma sufixação para os outros tipos

de conexões sinápticas.

Disto resulta que, quando nos referimos a outros tipos de conexão interneuronal

que não as mediadas por neurotransmissores, as chamemos de não sinápticas, querendo

com isso dizer que não dependem de sinais químicos mediados por neurotransmissores.

Dito isto, reconhecem-se hoje quatro tipos de conexões não sinápticas, quais

sejam, conexões dependentes do efeito de campo elétrico, conexões derivadas da

interação eletrotônica, via gap-junctions

, conexões dependentes de flutuações iônicas

e as derivadas de interações efápticas.

Para uma descrição pormenorizada de cada um dos tipos de conexões não-

sinápticas recomendamos consultar o Apêndice A, “Conexões não sinápticas”.

1.1.5- O papel do giro denteado na epileptogênese

Talvez por razões meramente circunstanciais e históricas, a maior parte dos

trabalhos que versam sobre mecanismos não sinápticos da epileptogênese (MNS)

baseiam-se em registros eletrofisiológicos obtidos das sub regiões do Corno de Amon

(CA), e não do giro denteado hipocampal (GDH).

Esta última região, entretanto, parece desempenhar relevante papel na

epileptogêse, talvez representando o substrato mais essencial na fisiopatologia das

epilepsias essenciais focais humanas.

Alguns dos mais representativos pesquisadores dos MSN na epileptogênese em

modelos animais acentuam que o giro denteado pode ser considerado como uma válvula

para a entrada da atividade neuronal no hipocampo e que esta função forneceria a esta

estrutura um papel crítico na propagação da atividade epiléptica naquela região

(SCHWEITZER, PATRYLO e DUDEK, 1992).

Um dos prováveis motivos que levaram a comunidade científica a desprivilegiar

o GDH em benefício de áreas e subáreas CA talvez prenda-se ao fato de que as

concentrações extracelulares de cálcio e potássio apropriadas para desencadear

atividades epileptogênicas (AE) não sinápticas no cornu Amonis, são absolutamente

inadequadas para ativar o GDH, o que, de início, levou a considerar esta última

estrutura como resistente à epileptogênese e, assim, de menor importância no

processo

De fato, como acentuavam os últimos autores citados, o ponto proeminente da

atividade epileptiforme no próprio giro denteado, freqüentemente chamada de "ativação

Junções de hiato ou junções comunicantes, numa tradução livre. Mantivemos o termo em Inglês,

ao longo do trabalho, face a sua generalizada adoção em Neurociências.

As concentrações ideais de [K

]

para desencadear AE em CA são de 5.5 a 8.5 mM enquanto

que para o GDH se situariam em torno de 9 mM ou mais.

denteada máxima" (maximal dentate activation-MDA), não havia ainda sido

reproduzida in vitro, à época (SCHWEITZER, PATRYLO e DUDEK,1992).

Porém, as condições encontradiças in vivo, onde ocorre intensa atividade

neuronal, ou seja, baixo [Ca

]

e alto [K

]

concomitantemente, uma vez simuladas

desencadeiam AE no GDH com facilidade, como demonstrou-se no trabalho acima

referido.

Enfatizaríamos nós que, se tais condições ocorrem in vivo, modelos que as

reproduzam se encontrarão, por certo, mais próximos das condições desejáveis para o

estudo da epilepsia do que aqueles que se afastam, de forma um tanto artificial, da

fisiopatologia dessa entidade nosológica.

No trabalho de Schweitzer, Patrylo e Dudek (1992), registraram-se salvas

(bursts, como são habitualmente referidas) bastante similares à MDA, consistindo de

desvios negativos prolongados no potencial extracelular com population spikes de

grande amplitude. Mais uma vez, como registram os autores, "deleção de [Ca

] do

banho, adição de bicuculina, DNQX ou ambos não bloquearam bursts de campo

antidromicamente evocados ou bursts espontâneos prolongados no denteado. Assim, os

mecanismos que mantém e propagam esses eventos não requerem transmissão sináptica

mediada por aminoácidos", consistindo, portanto, em típicos MNS.

Ainda de acordo com Schweitzer, Patrylo e Dudek (1992), parece-nos que hoje

já possuímos suficientes evidências de que o GDH serviria, normalmente, como uma

válvula fechada que preveniria AE de entrarem no cornu Amonis. Durante a MDA,

porém, o GDH, perdendo sua função protetora, funcionaria como um amplificador da

atividade epileptiforme. O GDH deve ter, assim, um papel central na epilepsia

hipocampal e a compreensão dos mecanismos subjacentes à MDA nas camadas

hipocampais de células piramidais é de extremo relevo para a compreensão desta

doença.

Também aqui seria importante citar Mc Ewen (2000) quando este afirma que o

GDH é único no cérebro, possuindo contínua neurogênese de neurônios granulares

durante a vida adulta. Uma explicação do porquê de o GDH produzir novas células

neuronais na vida adulta, tanto quanto livrar-se de outras tantas, explica o autor, pode

estar contido no papel do GDH no processamento de informação espacial e aspectos

relacionados da memória espacial

Ainda com Mc Ewen (2000), este afirma que a formação hipocampal,

expressando grande número de receptores para esteróides adrenais, é uma estrutura

plástica importante para certos tipos de aprendizagem e memória. Esta estrutura também

é vulnerável a agressões tais como choque, crises epileptiformes e trauma crânio-

encefálico. O estresse e os hormônios sexuais regulam 3 tipos de plasticidade estrutural

no hipocampo de adultos, quais sejam:

a) sinaptogênese;

b) reorganização de dendritos; e

c )neurogênese no giro denteado. (grifo nosso).

Liu et al (1998) também falam de vigorosa neurogênese no GDH, multiplicando

por doze vezes a taxa normal de divisão celular, em roedores jovens, iniciando-se

poucas horas após exposição à hipoxemia.

Veremos, a seguir, a importância dessa neurogênese hipocampal na

sensibilização epileptogênica.

1.1.6- O giro denteado hipocampal e a plasticidade neuronal

Sabe-se hoje que a plasticidade neuronal acarretando a recircuitagem

hipocampal é de extrema importância na cronificação da epilepsia mesial do lobo

temporal (EMLT) e, portanto, esse papel representado pelo GDH não pode ser

desprezado na compreensão da etiopatogenia da epilepsia.

Para ilustrar esta última afirmação, citaríamos Purves (2005) quando afirma que

a atividade anormal associada à epilepsia gera alterações plásticas nos circuitos corticais

que desempenham um papel na patogênese da doença. Prossegue Purves dizendo

que a importância da plasticidade sináptica na epilepsia é indicada claramente por um

modelo animal de produção de convulsões chamado de ignição ou abrasamento (do

inglês kindling, em referência ao uso de pequenos cavacos e gravetos para acender um

fogo). Na indução do kindling elétrico, um eletrodo de estimulação é implantado no

A maior flexibilidade do GDH em machos explicaria o melhor desempenho, em relação às

fêmeas, em tarefas que exigem memória espacial. O preço a pagar, entretanto, seria sua maior

susceptibilidade à epilepsia.

encéfalo, freqüentemente na amígdala (um componente do sistema límbico que faz

conexões com o córtex, com o tálamo e com outras estruturas límbicas, incluindo o

hipocampo).

Afirma ainda Purves (2005) que as mudanças nos padrões elétricos da atividade

encefálica detectada em animais submetidos ao kindling assemelham-se àquelas da

epilepsia humana onde as manifestações comportamentais das crises epilépticas em

pacientes humanos variam de um leve tremor de uma extremidade até a perda da

consciência e convulsões incontroláveis, as quais por sua vez podem levar à

excitotoxicidade. A excitotoxicidade, por sua vez, implicando em morte neuronal,

representa um dos principais desencadeantes da recircuitagem neuronal.

Ainda segundo Purves (2005), a maior parte das evidências sugere que uma

atividade anormal em pequenas áreas do córtex cerebral (chamadas focos) fornece o

gatilho para uma crise que então se espalha a outras regiões conectadas sinapticamente

(e mesmo as não conectadas, através de mecanismos não sinápticos, acrescentaríamos

nós).

Ainda no que respeita a esse tema, a recircuitagem neuronal implicada na

epiletogênese e cronificação da epilepsia e a importância do GDH nesse processo, seria

também oportuno citar Margerison e Cosellis (1966) que fazem várias observações

críticas que oferecem pistas para o desenvolvimento da epilepsia mesial do lobo

temporal (ELMT).

Esses últimos autores estabeleceram a perda celular hipocampal como

característica patológica fundamental da EMLT e demonstraram que a lesão mostrou

grande variedade de expressão, de leve perda celular a severa atrofia com diminuição de

toda formação hipocampal. Eles ainda enfatizaram que, exceto nos casos mais graves,

nem todos os tipos celulares ou regiões foram igualmente afetados. Em particular,

apontaram que a perda de neurônios hilares denteados era sempre evidente e, algumas

vezes, a única anormalidade observada (esclerose do endofolium).

De fato, segundo Margerison e Cosellis (1966), a perda de neurônios no hilo

denteado poderia ser vista como lesão mínima, porque quando a perda neuronal era

mais extensa, comprometendo outras áreas do hipocampo, havia quase sempre perda de

células hilares. Finalmente, eles confirmam que quando o padrão completo da esclerose

hipocampal estava presente, incluindo perda de neurônios hilares e de células piramidais

em CA1 e CA3, perda neuronal também estava presente em locais extra-hipocampais,

incluindo córtex entorrinal, giro para-hipocampal, amígdala, tálamo e cerebelo.

Entretanto, perda neuronal extra-hipocampal não ocorreu a menos que também

houvesse perda neuronal hipocampal e “assim, o hilo do giro denteado parece ser

especialmente vulnerável a agressões e é algumas vezes a única lesão em pacientes com

EMLT.”

Ainda segundo Margerison e Cosellis (1966), mesmo no giro denteado,

entretanto, nem todos os neurônios são afetados igualmente pelas crises ou por outras

formas de lesão. Como já observado, as células granulares são relativamente

resistentes, como também as células em cesto (basket cells) que contém GABA e seus

plexos axo-somáticos na camada de células granulares. Por outro lado, neurônios

vulneráveis no denteado são reduzidos em número ou desaparecem completamente após

atividade crítica repetida ou mantida, incluindo as células musgosas e interneurônios

imunoreativos à somatostatina e neuropeptídeo Y.

Outro fato interessante é que o GDH, conforme escreve Mc Ewen (2000), forma-

se após o Corno de Amon e sua maturação ocorre nas duas primeiras semanas do rato

recém-nascido, relacionando-se ao desenvolvimento da emocionalidade, como pode ser

constatado pelos efeitos de manipulação néo-natal.

Poderia ser, portanto, mais que coincidental a susceptibilidade aumentada à

epileptogênese (e à cronificação dos paroxismos) na janela de 2 a 3 semanas de idade se

o GDH estiver de alguma forma envolvido nesse processo.

Notavelmente, diz Mc Ewen, o GDH em machos é maior do que em fêmeas e

aqueles possuem também maior número de neurônios granulares. O volume do GDH

em fêmeas aumenta se, durante o período de desenvolvimento, receberem andrógenos.

Também há diferenças relacionadas ao gênero sexual no que tange ao padrão de

ramificação dendrítica e densidade de espinhas dendríticas em neurônios piramidais de

CA3.

Ambos os fatores talvez expliquem a maior susceptibilidade à epileptogênese em

machos do que em fêmeas de roedores utilizados nos modelos animais de epilepsia.

Outros autores citados por Mc Ewen reforçam ainda mais essas conclusões

(TERASAWA e TIMIRAS, 1968 apud Mc EWEN,2000), quando colocam que machos

e fêmeas utilizam-se de diferentes estratégias no aprendizado e memória espaciais e o

hipocampo exibe grande número de diferenças anatômicas entre os dois sexos.

Mais ainda, durante o ciclo estral da rata, novas espinhas sinápticas excitatórias

são tanto produzidas como eliminadas e "isto pode explicar a variação na sensibilidade

a crises epileptiformes do hipocampo dorsal durante o ciclo estral com marcado

decréscimo na sensibilidade no proestro, no pico dos níveis de estrogênio e

progesterona".

Para encerrar este tópico citaríamos textualmente Sloviter (1994):

Crises repetidas levam à formação de nova ramificação axonal e dos terminais de

células granulares (brotamento ou sprouting) nos hipocampos de humanos e animais

cronicamente epilépticos. Descrito inicialmente em animais com crises desencadeadas

por kindling, mas posteriormente reconhecido em espécimes de lobo temporal também

de pacientes com crises parciais complexas intratáveis. O brotamento reflete uma

reorganização sináptica de fibras musgosas que provavelmente ocorre em

conseqüência de atividade dependente do comportamento neuronal tal como ocorre

durante as crises. Alguns investigadores consideram o fenômeno como

“maladaptativo” assumindo que as ramificações axonais novas estabelecem conexões

excitatórias recorrentes que contribuem à excitabilidade patológica no hipocampo.

Outros encontraram que o brotamento pode ser restabelecido na sua inibição

aumentada. Finalmente, um estudo recente concluiu que o brotamento pode

estabelecer novos circuitos excitatórios, mas estes são suprimidos e não aumentam o

nível de excitabilidade, quando a inibição é normal. Talvez todas as observações

estejam corretas. Na reorganização sináptica das fibras musgosas induzida por crises

[talvez ocorra] fundamentalmente um epifenômeno, cujos efeitos funcionais são

complexos e variáveis, dependentes de outros fatores que afetam a interação entre

excitação e inibição.

No texto acima reproduzido, nos parece importante, no contexto de nossa

argumentação, destacar a última frase, onde Sloviter (1994) opina que a reorganização

sináptica induzida por crises trata-se, na verdade, de um epifenômeno dependente de

outros fatores que afetariam a interação entre excitação e inibição neuronais. Nos parece

que aí surgem as condições para a interveniência de mecanismos não sinápticos na

epileptogênese, dentre eles o papel da relação volume celular/ extracelular,

osmolaridade/ concentração iônicas do meio extracelular, interações efápticas, e

comunicação inter-neuronal via gap-junctions, dentre outros.

Finalmente, no que tange à sincronização de grandes populações neuronais,

evidenciadas como um fenômeno secundário à hiperexcitação, porém praticamente

inescapável nas AE, como evidenciado pelas population spikes, os mecanismos não

sinápticos seriam, a nosso ver, os grandes atores.

Desaparece o mistério da hipersincronização quando consideramos que um

grande número de células está exposto ao mesmo microambiente local, tornando pois,

desnecessária a comunicação interneuronal mediada por sinais químicos, demasiado

lenta para provocar esse recrutamento em bloco que observamos nas AE.

Não há "comunicação de estado" entre neurônios, simplesmente todos disparam

em sincronia porquanto todos estão igualmente hiperexcitados, a partir de um meio

ambiente que assim os tornou. Longe de desprezar a importância dos mecanismos

sinápticos na gênese da epilepsia, queremos sim é acentuar que não podemos ignorar os

MNS na instalação, curso e progressão desta doença.

Podemos agora responder a algumas das questões que formulamos na abertura

deste capítulo. Por tudo que até aqui vimos, cremos que, se ainda não foi feito, a

pesquisa futura demonstrará que os MNS, se inibidos, evitariam uma crise epiléptica ou

impediriam a cronificação da doença a partir do estímulo desencadeante primário.

Achamos mais que, se os MNS não são imprescindíveis para a epileptogênese, são pelo

menos inevitáveis nesse processo e, por certo, representam uma alternativa

farmacológica para o controle da epilepsia.

Os mecanismos não sinápticos são, sem dúvida, atores importantes na

epileptogênese. Talvez os mais importantes.

1.1.7- A importância da glia nos mecanismos não sinápticos.

mediada por difusão no espaço extracelular". Ao contrário dos neurônios entre si, as

células gliais não se comunicam através de sinapses com os primeiros. Elas utilizam o

espaço extracelular ou meio extracelular (MEC), que é o microambiente onde se alojam

células neuronais e gliais, para a comunicação neurônio-glial. Por vezes, esta

movimentação iônica extracelular é conhecida como "transmissão extrasináptica" ,

"transmissão por difusão" ou ainda, "transmissão por volume".

O MEC, afirmam Syková e Chvatál, sofre alterações dinâmicas tanto durante a

atividade neuronal quanto durante estados patológicos. A partir de sua liberação, um

grande número de substâncias neuroativas, tais como íons, neurotransmissores e

metabólitos, difundem-se pelo MEC alcançando alvos distantes de seu sítio de

liberação.

As células gliais afetam a composição e volume do MEC e, desta forma, também afetam a difusão e

glial.

Estudos recentes, relatam Skyová e Chvatál (2000), indicam, também que a difusão pelo MEC é tam

1.1.8- O papel da glia na homeostase iônica

Tal fenômeno mostra-se relevante na propagação de ondas de depressão alastrante (ALMEIDA

et al, 2004) Cremos que esta "macro-membrana" virtual represente fenômeno de relevo também para as

atividades epileptiformes de origem não sináptica.

Ainda conforme Skyová e Chvatál (2000), uma grande quantidade de estudos, tanto in vitro quanto i

concentração do [Ca

]

que acompanham a atividade neuronal em diferentes regiões do

cérebro.

A redistribuição das mudanças iônicas relacionadas à atividade neuronal, muito

importante para a manutenção da homeostase, ocorre, em larga escala, através de ações

gliais. O mecanismo neuronal de transporte de Na

- ATPase, por exemplo, também

ocorre nas células gliais; além disso a glia mantém, segundo Skyová e Chvatál (2000),

três outros mecanismos de relevo para a manutenção da homeostase do MEC, quais

sejam:

a) tamponamento espacial de K

(buffering de K

);

b) retirada de KCl do MEC; e

c) canais de K

ativados por Ca

Segundo Horio (2001), a regulação do K

extracelular é indispensável para a função

cerebral uma vez que o aumento do [K

]

implica no conseqüente aumento do [K

]

, em

virtude da atuação dos canais retificadores de K

dos neurônios, assim chamados pois

deslocam íons potássio para o meio intracelular ( K

inward rectifying channels -KIR,

em Inglês). As células gliais são, de acordo com Horio, indispensáveis para a

manutenção estável do [K

]

, impedindo excitação neuronal indesejável, pelo

mecanismo de tamponamento espacial de K

, realizado através dos canais tipo KIR da

própria glia .

Este mecanismo leva as células gliais a tomarem do MEC íons de potássio onde sua

concentração extracelular é maior, distribuí-los no meio intracelular glial e devolvê-los

ao MEC onde sua concentração extracelular é menor. O trabalho pioneiro de Kuffler,

citado por Horio (2001), demonstrava que impulsos nervosos causavam uma lenta

despolarização das células gliais, observada de 50 a 150 ms após o estímulo, seguida tal

despolarização por um lento declínio, enquanto a corrente de ação neuronal persistia por

meros 30 ms. Isto demonstraria que a glia havia tomado K

liberado pela ação neuronal

do MEC, sendo a célula glial, então, despolarizada por este influxo iônico. A FIG 1.1, a

seguir, ilustra esse mecanismo.

FIGURA 1.1- Tamponamento glial de potássio. Os altamente seletivos canais retificadores

de potássio (KIR-K

Inward Rectifiers Channels) tomam o excesso deste íon do meio

extracelular para o citoplasma glial, transportam-no ao longo de seus processos gliais e, a

seguir, devolvem esses íons onde sua concentração no meio extracelular é mais baixa.

Além dos três mecanismos acima citados, Skyová e Chvatál (2000) discorrem sobre um quarto mecanis

glial, tornando evidente o papel da glia na manutenção de níveis adequados de pH no

SNC.

1.1.9- O papel da glia na geração e disseminação de atividades epileptiformes.

Laming (2000), abordando o papel no comportamento representado pela sinalização de potássio no cére

resposta ao potássio extracelular, conforme se segue:

a) agindo como meio condutor e sensoriador para informação derivada de neurônios;

b) despolarizando e contribuindo para os desvios lentos de potencial (SPS) associado

com o despertar comportamental;

c) mediando mudanças associadas com os estágios precoces do aprendizado;

d) mediando mudanças associadas com a produção hormonal e o estado motivacional;

e) ativando processos metabólicos.

Aqui nos interessa diretamente o papel desempenhado pela glia nas alíneas a) e e) e, indiretamente, seu

precoces do aprendizado, interfere com o brotamento axonal (sprouting) que

acompanha as alterações mnêmicas, alterando a intercomunicação neuronal e gerando,

eventualmente, os circuitos reverberantes, auto regeneradores observados nas formas

crônicas de epilepsia.

Steinhäuser e Seifert (2002) elaboraram uma revisão bastante pertinente quanto ao

papel de canais e receptores gliais na geração e disseminação de AE, marcando a

relevância patogênica da glia na epilepsia humana. É a partir do trabalho desses autores

que elaboramos o compacto resumo que se segue.

a- Canais gliais de Na

Canais de Na

chaveados por voltagem (Voltage-gated channels) representam um pré-requisito básic

poderiam contribuir para a regulação do [Cl

]

e, assim, controlar a atividade de

transportadores dependentes de Na

, tais como Na

- glutamato e Na

- ATPase. Em

apoio a essa hipótese, evidenciou-se uma dramática sobre-regulação da densidade de

corrente de Na

em cultura de astrócitos isolados do tecido obtido de foco epiléptico

humano.

Dessa forma, astrócitos sobre-expressando canais de Na

poderiam apoiar a

disseminação de atividade paroxística através de regiões do SNC nas quais a

transmissão sináptica foi interrompida, em virtude da perda neuronal.

b- Canais gliais de Ca

Canais de Ca

chaveados por voltagem mediam o influxo de íons cálcio na

despolarização membrânica e regulam vários processos intracelulares tanto em células

excitáveis quanto nas eletricamente inexcitáveis. Epilepsias agudas e crônicas estão

associadas a um maior influxo de Ca

através dos canais de Ca

. Especula-se que,

além dos neurônios, os canais de Ca

possam contribuir para a depleção do [Ca

]

durante a atividade paroxística, representando assim um possível alvo para drogas

antiepilépticas. Em favor dessa hipótese, cita-se a sobre-regulação de canais de Ca

tipo L

observada em

astrócitos (em coloração por métodos imunoquímicos) no modelo

de kainato da epilepsia, sugerindo um captura facilitada de Ca

extracelular por esses

astrócitos no SNC lesionado, in vivo.

c- Canais gliais de K

Como já citado, durante a atividade neuronal ocorre elevação transiente de [K

]

, causando a despolariz

pelo menos, os efeitos do Ca

durante estímulo induziu mudanças no K

extracelular,

que sugeriram significativa redução dos canais retificadores de potássio (KIR), em

astrócitos de CA1, em ratos epilépticos.

A mesma abordagem experimental levou à observação de que ocorria prejuízo da regulação de [K

]

supunha que era a expressão diminuída de KIR astroglial, o fator subjacente importante

do tamponamento reduzido de [K

]

na esclerose hipocampal, e não as alterações na

atividade Na

- ATPase ou na captura passiva de KCl.

d- gap-junctions gliais.

O acoplamento por gap-junctions, formando um sincício funcional entre astrócitos,

parece ser essencial na perfeita regulação na homeostase de íons potássio no SNC.

Ainda mais, gap-junctions em astrócitos estão envolvidas no espalhamento das ondas de

intracelulares, através da rede glial, dessa forma influenciando a atividade

neuronal. Ondas de Ca

podem, por esse motivo, trafegar para regiões que não estão

sinapticamente acopladas. Isto também sugere, porém, que o acoplamento astroglial

aumentado possa favorecer a hipersincronização e disseminação das AE.

O papel do acoplamento astroglial, portanto, é duplo e conflitante. Se, por um lado,

favorece a homeostase de íons potássio extracelulares, evitando hiperestimulação

neuronal, por outro lado também favorece as AE, se estas já estão presentes. De

qualquer forma, a glia revela-se importante também aqui.

1.1.10- A importância do pH nos eventos não sinápticos no giro denteado.

Schweitzer et al. (2000) ressaltam a sensibilidade ao pH dos field bursts (salvas com

ação no campo) que ocorrem sob condições de inibição dos mecanismos sinápticos por

exposição do GDH a baixo [Ca

]

e alto [K

]

. Nessas condições, as fatias exibem in

vitro fenômenos que ocorrem nas condições observadas in vivo, tal como a ativação

denteada máxima (MDA).

Nesse trabalho, Schweitzer et al. demonstram que os field bursts eram extremamente

sensíveis a faixa de pH entre 7.0 e 7.6, sendo suprimidos em pH baixo e facilitados em

pH alto. A sensibilidade ao pH não foi suprimida pelo bloqueio de recetores NMDA,

não NMDA e GABA

, em concentrações de agentes bloqueadores suficiente para

eliminar tanto potenciais espontâneos quanto evocados.

Tais autores citam a sensibilidade das gap-junctions ao pH como estando na base

desses fenômenos, constituindo o pH fator similar ao do bloqueio das junções

eletrotônicas através de agentes como o octanol, oleamida e carbenoxolona. Como a

perfusão das fatias com bloqueadores químicos das gap-junctions ou com pH ácido

suprimiu os field bursts mas não bloqueou o disparo espontâneo de unidades isoladas ou

múltiplas, sugerem os autores que a sensibilidade ao pH e os fenômenos epileptiformes

in vivo, dependem em grande parte de mecanismos outros que não os mediados por

NMDA, ou outros neurotransmissores excitatórios, que ocorrem na transmissão

sináptica.

Schweitzer et al.(2000) concluem que as alterações no acoplamento eletrotônico, via

gap-junctions, afetando a sincronização de campo, possa constituir um processo como

tal, alternativo à transmissão sináptica.

Concluído este pequeno resumo dos mecanismos não-sinápticos da epileptogênese,

devemos abordar agora a modelagem experimental da epileptogênese, com ênfase nos

modelos que contemplam tais mecanismos.

1.2- Uma visão panorâmica do estado da arte em modelagem.

Hoje em dia, a imensa maioria das pesquisas sobre epilepsia utiliza-se de

modelos, prioritariamente animais, para estudo de todas as fases da doença e de sua

farmacoterapia.

Jefferys (2003), citando o “pai” da cibernética, Norbert Wiener, nos lembra a

frase “O melhor modelo de um gato é um gato, preferivelmente o mesmo gato.”

Infelizmente, prossegue Jefferys, utilizar seres humanos com epilepsia para

identificar mecanismos básicos apresenta-nos muitos problemas, notadamente éticos,

além das dificuldades na reprodutibilidade do experimento, perturbações provenientes

das medicações em uso e a virtual impossibilidade de medir diretamente vários

processos celulares e sinápticos que contribuem para a atividade epiléptica.

Mesmo tendo se provado úteis, registros de fatias cerebrais humanas obtidas

cirurgicamente (pacientes de epilepsias medicamente intratáveis) são, prossegue

Jefferys, de disponibilidade muito reduzida, excessivamente variáveis e guardam uma

história médica muito complexa para que possam constituir o veio principal da pesquisa

básica em epilepsia. Tudo isso aponta para a necessidade, ou mesmo inevitabilidade, do

uso de modelos animais neste campo de pesquisa.

Dada a alta prevalência e importância clínica da epilepsia temporal em humanos,

modelos animais desta forma de epilepsia devem merecer especial atenção dos

pesquisadores em neurociência. Afortunadamente, humanos compartilham com outros

mamíferos a sensibilidade epileptógena do lobo temporal, em especial do hipocampo e

estruturas peri-hipocampais.

Segundo Chen e Buckmaster (2005) modelos com animais de laboratório são

essenciais para que se aprenda mais sobre os mecanismos que subjazem à epilepsia do

lobo temporal, uma vez que, pelo menos nos modelos baseados em status epilepticus, os

padrões de perda neuronal e reorganização neuronal são similares àqueles encontrados

em pacientes portadores de epilepsia do lobo temporal. Estes autores afirmam ainda que

os neurônios hilares do giro denteado hipocampal podem ser os neurônios mais

vulneráveis no paciente com epilepsia do lobo temporal.

Vimos, portanto, a importância dos modelos animais na pesquisa da epilepsia,

mas, a essa altura, outra dúvida nos poderia surgir: serão esses modelos suficientes para

toda e qualquer pesquisa sobre essa doença?

Responderíamos afirmando que, apesar dos modelos animais de epilepsia,

especialmente na epilepsia focal temporal, terem trazido (e ainda o fazerem) inestimável

contribuição na elucidação dos mecanismos básicos desse processo, estes possuem

limitações, talvez intransponíveis, que impedem que sejam utilizados com

exclusividade. Dito de outra forma, são necessários porém não são suficientes.

Ainda com Chen e Buckmaster (2005:141), “ ... modelos também exibem

características que não se casam perfeitamente com a epilepsia do lobo temporal. Uma

de tais características é a extensão do dano extra-hipocampal.”

Nem sempre poderemos, como recomenda Jefferys (2003) no artigo em pauta,

testar e corroborar o que os modelos experimentais em animais indicaram com trabalhos

em material humano e, mesmo quando isto se revelar possível, dadas as já citadas

limitações deste material, permanecerá ainda uma lacuna de conhecimento a ser

preenchida.

Exatamente aí surge o espaço, cada vez mais definido, para a simulação

computacional. Esta será mais poderosa e fidedigna se, a todo o tempo, retornar ao

experimento físico, desta forma corroborando as conclusões do modelo.

Outra virtude da modelagem computacional, menos visível num primeiro

momento, é proporcionar ao experimentador uma intuição mais apurada, ou feeling, dos

fenômenos sob estudo. Esta compreensão mais profunda pode, e deve, retroalimentar a

pesquisa física, tornando-a mais objetiva e profícua, apontando para os mecanismos

realmente essenciais do fenômeno sob estudo.

A modelagem computacional é um complemento dos modelos animais, e um

complemento cada vez mais necessário, por certo.

Retornando a Jefferys (2003), no artigo acima citado, uma boa forma de lidar

com o sistema não linear e de dinâmica complexa, representado pela rede neural e suas

conexões, é através do uso de simulações computacionais realísticas, as quais podem

mostrar se as propriedades conhecidas do sistema em questão são necessárias e

suficientes para produzir a atividade epiléptica emergente.

Jefferys (2003) enfatiza que é muito difícil construir elos confiáveis entre os

mecanismos de descargas epilépticas observadas em preparações reduzidas _fatias de

tecido neural _ em diferentes níveis de análise, seja escala acima em direção à

preparação intacta, seja escala abaixo para as propriedades de neurônios isolados e suas

sinapses. É árduo conectar níveis sucessivos de reducionismo, em especial se levarmos

em conta que, em sistemas complexos, surgem propriedades emergentes que não

poderiam ser antecipadas a partir da observação das partes isoladas desse sistema.

A favor da simulação computacional, diz Jefferys (2003), em seu artigo que,

quando limitadas pela evidência biológica real, as simulações computacionais ajudam a

identificar lacunas importantes em nosso conhecimento. Através da elaboração de

predições experimentalmente testáveis, elas demonstram se o que conhecemos nos

níveis celular e subcelular é necessário e suficiente para explicar as características da

atividade epiléptica.

Reforçando a importância da simulação computacional, Allman e Rhodes (2004)

observam que interações entre as ciências matemáticas e biológicas têm crescido

rapidamente nos anos recentes, tanto em tópicos tradicionais, tais como a modelagem

de populações e de doenças, quanto em novos tópicos. Segundo esses autores, inúmeros

grupos e pesquisadores individuais prevêem que esta área continuará a exibir enorme

crescimento.

O célebre físico Murray Gell-Mann, laureado com o prêmio Nobel, nos traz

comentários bastante pertinentes a este tópico (GELL-MANN,1994):

Uma outra grande área para a aplicação de computadores é a simulação do

comportamento de sistemas adaptativos complexos. A característica mais.marcante

destas simulações é a emergência de comportamento complexo a partir.de regras

simples. Estas regras implicam regularidades gerais, mas a resolução.de um caso

individual mostra regularidades especiais adicionais...O truque ao ....projetar uma

simulação controlável é podar as regras de modo a torná-las mais ..simples ainda, mas

de tal maneira que a maioria dos tipos de comportamento emergente permaneçam...[a

intuição de como podar as regras] baseia-se parcialmente em raciocínio a priori e em

parte na experiência em mexer com as ...regras e depois observar o que acontece sob as

regras modificadas com rodadas de computador particulares. Ainda assim, o projeto de

simulações simples, ricas em conseqüências interessantes, permanece mais uma arte do

que uma ciência.

Gell-Mann prossegue no seu texto formulando três importantes questões, quais

sejam, se as simulações forneceriam intuição válida para situações reais, se elas

revelariam comportamentos possíveis que não foram antes pensados e se indicariam

novas explicações possíveis para os fenômenos conhecidos.

Àquela época em que o texto foi elaborado, mais de treze anos atrás, Guell-

Mann responde às suas próprias perguntas com o comentário de que na maioria dos

campos de atividade as simulações seriam ainda muito primitivas para que se pudesse

responder afirmativamente a estas questões, não obstante demonstrar-se espantoso

como, em certos casos, um conjunto simples de regras possa fornecer um insight

realmente valioso da efetiva operação de um sistema adaptativo complexo no mundo

real.

Devemos, porém, considerar que, em treze anos, o poder computacional de

nossas máquinas cresceu extraordinariamente, possibilitando hoje em dia que um

pequeno cluster de computadores processe, paralelamente, informação de uma forma só

obtenível em grandes supercomputadores, em 1994.

Esse avanço nos traz um novo horizonte para a simulação computacional de

sistemas adaptativos complexos, como sói tratar-se o SNC. Analogamente, a expertise

no desenvolvimento de softwares e estratégias para lidar com tais simulações também

cresceu de forma quase exponencial ao longo da última década do século passado,

possibilitando hoje feitos há pouco impensáveis.

A escolha de utilização de um modelo animal, subsidiado ou não por simulações

computacionais, não esgota, porém, a necessária tarefa preliminar de bem especificar

nossas condições de contorno, bem como explicitar os pressupostos básicos que

norteiam nossa pesquisa. Em relação a isto, devemos contextualizar duas classes de

mecanismos importantes na epileptogênese, quais sejam, mecanismos sinápticos e não-

sinápticos, intervenientes nas crises epileptiformes.

Como poderemos constatar na literatura, inúmeros trabalhos posteriores, de

diversos autores, vieram a confirmar o que foi antecipado por Taylor e Dudek (1982).

Parece-nos, portanto, que se impõe um modelo animal, subsidiado ou não por

simulações computacionais, se necessário e possível. Mais ainda, já pudemos constatar

que os mecanismos não-sinápticos são merecedores de nossa atenção. Deveremos,

entretanto, situar uma derradeira questão no que respeita à modelagem para que não

incorramos no pecado da omissão. Devemos citar também a possibilidade de

realizarmos estudos in vivo.

Até recentemente, a imensa maioria dos estudos sobre mecanismos não-

sinápticos da epilepsia utilizaram-se de preparações in vitro, normalmente fatias de

tecido cerebral, em especial do hipocampo, amígdala cerebral e outras estruturas peri-

hipocampais. Raramente, aliás, tais estudos foram apoiados por simulações

computacionais dos fenômenos sob observação.

Estas preparações simplificadas impõem, porém, um limite para a generalização

dos fenômenos observados para o organismo completo e atuante, representado pelo ser

vivo. O enfoque reducionista esbarra, por vezes, em sérias dificuldades quando tenta

lidar com sistemas complexos, de comportamento não-linear e dinâmica caótica

Sem dúvida, é deste tipo de sistema que tratamos no estudo neurofisiológico do

Sistema Nervoso Central (SNC), particularmente quando estão envolvidas no processo

variáveis como ritmo, sincronização (e hipersincronização), correntes iônicas e outras

que tais, como sói ocorrer na epilepsia . Em síntese, quanto mais pudermos nos

aproximar das condições reais em nossos experimentos, mais fidedignos serão nossos

resultados e mais apropriadas nossas conclusões.

Caótica no sentido estritamente matemático do termo: sistema complexo, não linear, onde

pequenas alterações nas condições iniciais podem levar a grandes e não computáveis alterações no estado

final do sistema.

Para apoiar nossa argumentação quanto à complexidade, não-linearidade e

dinâmica caótica do SNC, citaríamos Davies (2000):

Todas as formas conhecidas de vida são espantosamente complexas. Até os

organismos unicelulares como as bactérias são verdadeiras colméias de atividade

envolvendo milhões de componentes. Em parte essa complexidade é o que

garante a imprevisibilidade dos organismos. Por outro lado, um furacão e uma

galáxia também são muito complexos. Os furacões são notoriamente

imprevisíveis. Muitos sistemas não vivos são o que os cientistas chamam de

caóticos_ o seu comportamento é demasiado complicado para ser previsto,

podendo ser até aleatório. Talvez o significativo não seja a complexidade per se,

mas a complexidade organizada...

Em um experimento envolvendo células cardíacas de embrião de galinha, as

quais guardam certas analogias com os neurônios (ambas células são, de alguma forma,

sensíveis ao ritmo dos estímulos aferentes) , Guevara, Glass e Schrier (1981)

observaram que ali aplicava-se a dinâmica caótica. Esses autores assim se expressaram:

“O comportamento dinâmico exótico, visto antes nos estudos matemáticos das ciências

físicas, pode em geral estar presente quando os osciladores biológicos são perturbados

periodicamente”.

James Gleick (1989), divulgador de Ciência no New York Times, relaciona em

seu livro “Caos” inúmeros comentários de pesquisadores afirmando que os tecidos e

órgãos biológicos devem ter seu comportamento entendido em termos de uma

matemática não-linear e dinâmica caótica.

Tudo o que acima expusemos fala a favor da importância de complementarmos

nossas pesquisas com modelos in vivo, mais próximos das condições reais de

funcionamento dos organismos do que as representadas pela preparações simplificadas.

É mister comentar que tais modelos são aplicáveis tanto aos protocolos de gênese

aguda, que representam mais apropriadamente as crises epilépticas do que a epilepsia,

quanto aos protocolos que buscam reproduzir o curso crônico da doença, sendo

especialmente favoráveis ao estudo de mecanismos não-sinápticos da epileptogênese.

Deveríamos, entretanto, enfatizar que os modelos in vivo complementam mas

não substituem os modelos in vitro, uma vez que os últimos podem proporcionar

condições de contorno mais restritas que podem ensejar, em princípio, maior

objetividade, simplicidade, controle e facilidade de execução do experimento,

respondendo mais diretamente à pergunta subentendida na hipótese formulada. Menos

ainda, substituem os modelos computacionais, que cremos já haver demonstrado serem

de imenso relevo na neurofisiologia.

Um trabalho completo para o estudo das atividades epileptiformes (AE) não

sinápticas envolvendo o giro denteado hipocampal (GDH), portanto, deveria contemplar

três conjuntos experimentais, quais sejam, modelagem animal in vivo, in vitro e

simulação computacional dos fenômenos observados

1.2.1- A modelagem de epilepsias derivadas de síndromes hipóxico-isquêmicas.

Para finalizarmos este esboço das técnicas de modelagem hodiernamente

empregadas, cremos oportuno enfatizar que, seja qual for a abordagem experimental (in

vivo, in vitro ), é altamente desejável um modelo animal que reproduza o mais fielmente

possível as condições naturais da gênese da epilepsia humana.

Neste particular, assumem significância estatística, como vimos na Introdução

deste trabalho, as síndromes perinatais hipóxicas/isquêmicas tais como a circular de

cordão. Afortunadamente, essas condições patogênicas são facilmente reproduzidas em

modelos animais, exigindo do pesquisador apenas uma certa habilidade cirúrgica além

da disponibilização de um set-up relativamente fácil de disponibilizar.

1.2.2- Modelos isquemia/hipóxia escolhidos como referência.

Segundo Sanchez e Jensen (2006), o modelo animal que se utiliza de hipóxia

aguda para geração de atividades epileptiformes foi melhor estudado no rato Long-

Evans, raça na qual se observa claramente a susceptibilidade dependente da idade do

animal.

Neste tipo de rato a maior susceptibilidade ocorre em torno de P9 a P12, com

pico de atividade em P10. Já quanto à raça Sprague-Dawley parece haver maior

sensibilidade à hipóxia em torno de P8-P9. Estes autores não mencionam, e também não

encontramos referências em outra parte, ratos da raça Wistar em modelos de hipóxia.

Apesar de, em última análise, o maior interesse clínico da atual pesquisa

relacionar-se à hipóxia perinatal humana, não seria interessante utilizar-se um modelo

Naturalmente, tal estudo parece delinear uma linha geral de pesquisas e não um trabalho isolado,

fugindo, portanto, do escopo de uma dissertação de mestrado, em face, principalmente, da limitação do

tempo concedido para a consecução dos experimentos.

de hipóxia em ratos recém natos, exatamente face à menor sensibilidade epileptogênica

observada nessa faixa etária. Em verdade, também humanos podem ser mais

naturalmente resistentes à hipóxia no período perinatal , embora não tenha sido bem

definida a janela de maior susceptibilidade em humanos.

Assim, como ratos escolhidos aleatoriamente não devem apresentar especial

susceptibilidade à epileptogênese, deve-se privilegiar no estudo com modelos a faixa

etária de maior sensibilidade da população em geral dos animais na tentativa de

mimetizar as condições encontradiças em humanos mais susceptíveis.

O melhor modelo não é, necessariamente, o que mais se aproxima das condições

ambientais modeladas e sim o que produz resultados no animal de experimentação mais

análogos aos observados nos casos clínicos, como parece tratar-se o modelo em lide.

No protocolo dos autores acima citados, submeteu-se os animais à breve e

gradual exposição à hipóxia, iniciando-se com uma taxa de O

de 7% por 7 minutos, 6%

por 4 minutos, 5% por 3 minutos e, finalmente, 4% por um minuto perfazendo, assim,

um total de 15 minutos de hipóxia. A concentração de oxigênio requerida foi obtida por

mistura com N

em câmara selada. Os animais foram mantidos aquecidos através de

uma manta térmica.

Nestes experimentos observaram-se alterações simultâneas exibindo tanto

atividades epileptiformes neocorticais quanto hipocampais. Animais mais velhos ou

mais novos do que os das faixas relacionadas não exibiram atividades ictais e os

animais P20 mostraram diminuição da atividade elétrica cortical em resposta à hipóxia.

É digno de nota o comentário dos autores observando que P10, nesses animais,

cai numa janela desenvolvimental onde ocorre grande aumento na expressão de

receptores AMPA permeáveis ao Ca

Sanchez e Jensen (2006) enfatizam que este modelo é especialmente adequado

para o estudo de modificações relacionadas exclusivamente a sobre-regulação dos

circuitos excitatórios, uma vez que não ocorre morte celular significativa pós hipóxia e,

portanto, não se observa reorganização de vias neuronais em conseqüência de perda

celular. A baixa mortalidade observada (em torno de 2%) também fala a favor da

utilização deste modelo.

Já Williams, Dou, e Dudek. (2004) utilizam-se de um modelo combinado

Isquemia/Hipóxia em ratos Sprague-Dawley, P7, os quais desenvolvem

espontaneamente epilepsia tardia. Neste modelo, os ratos são submetidos à ligadura

unilateral da carótida cervical comum e, após a recuperação cirúrgica, submetem-se à

hipóxia em atmosfera de 8% de O

por duas horas. Monitorados por um período de 7 a

24 meses pós procedimento, antes de eutanásia para observação histológica, 40% dos

animais sobreviventes exibiram crises motoras espontâneas e significativo brotamento

(sprouting) das fibras musgosas do giro denteado ipsilateral. Interessante observar que

apenas os ratos que exibiram crises espontâneas evidenciaram brotamento também

contralateral, numa espécie de foco espelho nesses ratos epilépticos.

1.3- Fisiopatologia dos episódios hipóxico-isquêmicos.

Retornando a Araujo e Diniz (2008), a EHIN envolve alguns mecanismos

bioquímicos bastante prováveis, quais sejam:

1. Alterações regionais na produção de ATP (diminuída na via anaeróbica);

2. Acúmulo de K

extracelular (importante para mecanismos não sinápticos,

acrescentaríamos nós);

3. Acidose intracelular (íons H

e lactato);

4. Peroxidação lipídica (responsável por alterações permanentes, ou de longo prazo,

nas condições do plasmalema);

5. Fluxo alterado de íons (aumento do Ca

intracelular, implicando em maior

ativação do glutamato excitatótrio); e

6. Fluxo alterado de neurotransmissores.

Pond et al.(2006), num trabalho sobre isquemia in vitro, citam o efeito da baixa

de PO

sobre a homeostase iônica com destaque para o equilíbrio do cloreto.

Dugan e Kim-Ham (2006) abordam, entre outros fatores, o efeito dos episódios

hipóxico-isquêmicos sobre a bomba de sódio-potássio e sobre os canais iônicos.

Todas as condições acima referidas constituem-se em potenciais objetos de

pesquisa experimental, para avaliar sua contribuição relativa na gênese de atividades

epileptiformes, em organismos submetidos à condições hipóxico-isquêmicas por volta

de seus primeiros dias de vida.

1.3.1- Estadiamento fisiopatológico do episódio hipóxico-isquêmico.

De acordo com Graf et al. (2008), o processo da lesão cerebral hipóxica inclui

quatro períodos:

1.efeito direto da deficiência de oxigênio;

2.distúrbio da hemodinâmica geral e cerebral;

3.recuperação e estimulação do desenvolvimento (“compensação”); e

4.mudanças atróficas progressivas no cérebro.

A cascata de processos fisiopatológicos desencadeada pelo evento hipóxico-

isquêmico, inicia-se com uma transição do metabolismo oxidativo para o anaeróbico

(glicólise), do que resulta a acumulação de NADH, FADH, lactato e íons H

A glicólise anaeróbica não consegue prover energia suficiente para as células e,

como resultado, o funcionamento das bombas celulares fica prejudicado e, desta forma,

, Ca

, Cl

e água acumulam-se nas células (edema citotóxico). Este edema celular,

porém, é breve. No dia subsequente, os neurônios terão ou desaparecido por lise celular,

ou sobrevivido com mais ou menos lesões em diversas organelas, incluindo a membrana

celular.

O estágio inicial do processo, conhecido como estágio excitotóxico (que

corresponde às primeiras horas), inclui a liberação de aminoácidos excitatórios

(principalmente glutamato) para o espaço extracelular e o aumento das Espécies

Reativas de Oxigênio (ERO, ROS ou radicais livres).

O glutamato, por sua vez, ativa os receptores celulares, o que leva a um influxo

de Na

e de Ca

e um efluxo de K

resultando, portanto, na despolarização da

membrana. Uma alta concentração de glutamato e de outros aminoácidos excitatórios

induz não só à despolarização da membrana, porém também à abertura dos receptores

glutamaérgicos do subtipo NMDA e ao consequente influxo de Ca

para as células.

Os receptores NMDA são passivamente abertos quando o potencial de

membrana decresce nos episódios hipóxicos, mesmo com baixas concentrações de

glutamato. Outros receptores de glutamato, tais como os receptores AMPA, por

exemplo, podem também iniciar uma cascata neurotóxica que termina por levar à morte

celular.

Já Somjen (2004), relaciona, acentuando a observação eletrofisiológica e/ou

eletroencefalográfica, nove fases na fisiopatologia hipóxica em condições controladas

em laboratório, onde o CO

é mantido constante no ar inspirado quais sejam:

1.Um breve intervalo inicial livre de sintomas, o Intervalo Livre;

2.O período de ativação, onde o EEG mostra sinais de atividade rápida e irregular de

baixa voltagem. Pode ocorrer nessa fase, entretanto, hiperexcitabilidade neuronal

genuína nos estágios iniciais da desinibição;

3.Atividade breve de baixa frequência α ou, alternativamente, podem aparecer spindles

(fusos);

4.Atividade α e spindles convertidos em ondas lentas δ ;

5.Cessação espontânea das oscilações e disparos neuronais; o EEG isoelétrico;

6.Falha geral da transmissão sináptica;

7.Despolarização similar à Depressão Alastrante (Hipoxic Spreadind Depression-like

Depolarization: SDH);

8.se o oxigênio não é restabelecido, ocorre o dano neuronal hipóxico; e

9.Mesmo com o fluxo de oxigênio restabelecido, a morte de certas células neuronais: a

degeneração neuronal tardia.

Somjen (2004), pontua que a HSD é inicialmente reversível porém, na ausência

de reoxigenação, ocorre dano neuronal permanente.

1.3.2- O papel do óxido nítrico (NO) e monóxido de carbono (CO) na

hipóxia/isquemia: a importância do edema na fisiopatologia hipóxico-isquêmica.

Embora haja evidência de que o NO e o CO estejam envolvidos na patogênese

do dano hipóxico-isquêmico, poucos estudos examinaram o papel do CO na lesão

cerebral. Recentemente, um papel para o CO na lesão hipóxico-isquêmica foi

demonstrado por Yuan et al.(2000), concluindo que tanto o monóxido de carbono

quanto o óxido nítrico estão relacionados com a severidade do dano cerebral após

encefalopatia hipóxico-isquêmica (EIH).

Evidências indicam que a expressão basal da heme-oxigenase1 (HO-1), que

parece ter papel neuroprotetor , está elevada durante a hipóxia. Essas evidências

indicam também que o CO endógeno funciona como um modulador fisiológico das

respostas ventilatórias à hipóxia, por via de suas ações sobre os corpos carotídeos e,

talvez, sobre neurônios do tronco cerebral.

Ademais, o CO pode desempenhar um papel na adaptação ventilatória à hipóxia.

Quando ratos de uma semana foram submetidos à isquemia unilateral por coagulação de

uma das carótidas, seguida por hipóxia de duas horas (8% O

2 ,

92% N

), as análises

imunocitoquímicas e de Western-Blot mostraram aumento da coloração para HO-1 no

córtex ipsilateral, hipocampo e estriado, de 12/24 horas até 7 dias pós procedimento. O

envolvimento do CO na EIH neonatal pode ser assim sumariado:

• A HO-1 expressa por células musculares lisas e seu produto, o CO, podem

regular o tônus vascular sob condições fisiológicas, sendo estimulada a

atividade HO-1 em condições hipóxicas, aumentando marcadamente a produção

de CO. O CO sobreproduzido pode mudar o tono vascular através da regulação

de cGMP, o que resulta em edema cerebral.

• A HO-1 expressa por macrófagos, e seu produto, o CO, tanto quanto a

biliverdina, podem ter efeito protetor por suas ações antioxidantes, porém a

sobreprodução dessas substâncias pode ser tóxica para o cérebro.

• O CO

16,

como um neuromensageiro putativo, pode ter influência significativa

no cérebro, quando sua produção está marcadamente alterada depois de um

episódio hipóxico-isquêmico.

O NO, por sua vez, ainda de acordo com os autores citados, tem papel central na

regulação do fluxo sanguíneo cerebral em resposta à hipóxia, uma vez que a inibição da

NO-sintetase aumenta a resistência vascular e diminui a resposta vasodilatatória

durante isquemia e/ou hipóxia. Estudos em carneiros neonatos, ainda de acordo com

Yuan et al.(2000), sugeriram que o bloqueio imediato de NO após exposição à hipóxia

e/ou isquemia possa reduzir o dano cerebral, provavelmente porque esse bloqueio reduz

significativamente o edema intersticial.

A presença de edemas, tanto celular quanto intersticial, nas síndromes hipóxicas

também é abordado por Sutcliffe (2007). Essa autora cita duas origens para o edema

intersticial, a vasogênica e a hidrostática; no primeiro caso ocorrendo vazamento de

líquido seroso rico em proteínas para o MEC, enquanto no segundo o conteúdo proteico

é baixo.

No caso do edema vasogênico, ocorre ruptura da barreira hemato-encefálica por

ação de mediadores inflamatórios, aí incluído o fator de necrose tumoral α (TNFα ) e a

interleucina-6 (IL-6), além de outras citoquinas. Já o edema hidrostático ocorre quando

há um súbito aumento na pressão capilar transmural. Apesar de ambos serem citados

por Sutcliffe (2007) nos episódios hipóxicos, nós cremos que o edema intersticial

vasogênico seja, senão exclusivo, dominante no quadro.

Assim como o NO, é importante frisar.

A vasodilatação representa o principal desencadeante do edema intersticial.

Nedelcu et al (2009) afirmam que o edema intersticial vasogênico pós

isquemia/hipóxia mostra-se bifásico, a primeira fase ocorrendo dentro de uma hora após

a hipoxemia e interessando 52+/- 9% do cérebro e a segunda fase atingindo extensão

máxima de 45+/- 10% da área cerebral cerca de 24 horas pós-procedimento, ambos

acompanhados também por edema celular citotóxico. Esses autores também citam uma

área de infarto cístico, atingindo 35 +/- 12% do volume cerebral, a qual ocorre (ou

persiste) até cinco dia pós hipóxia.

1.3.6- A importância das alterações da homeostase iônica nos quadros hipóxico-

isquêmicos .

1.3.6.1- O cloreto.

Pond et al. (2006) realizaram um interessante trabalho com um modelo de

isquemia in vitro, expondo fatias hipocampais à baixa oxigenação e a baixos teores de

glicose, simultaneamente. Esse procedimento, conhecido como privação de oxigênio-

glicose (Oxygen-Glucose Deprivation, OGD), consiste em submeter as fatias isoladas

de ratos transgênicos Clomeleon a oito minutos de OGD, medindo a fluorescência

ressonante nesses tecidos, a qual constitui um indicador indireto da concentração de

cloreto.

O estudo demonstrou dois picos de [Cl

]

, o primeiro durante a manobra de OGD

e o segundo na reoxigenação com normalização do suprimento de glicose. Pond et

al.(2006) atribuem esses picos à ação da OGD sobre o cotransportador Na

– K

- Cl

isoforma 1, (NKCC

1) ,

presente de forma ubíqua no cérebro e em outros tecidos.

Apesar da OGD também exercer efeitos sobre o [pH]

acidificando-o pela

acumulação de ácido lático intracelular, na via anaeróbica, essa queda foi pequena

(resultando em lesões leves, observadas três horas pós-procedimento) e foram tais

efeitos neutralizados na análise dos resultados, demonstrando assim que a ação

predominante da OGD foi sobre NKCC.

Dentre as várias maneiras em que o incremento de cloreto intracelular atua para

produzir dano celular, pode-se citar a mais óbvia, sua ação sobre a regulação do fluxo

de [Cl

] através dos receptores GABA

Em condições normais, a equação de Nernst indica um V

(o potencial de

membrana) que oscila entre -56 e -70 mV, e um E

de -80 mV, o que propicia um

gradiente de cloreto dirigido para o interior da célula e, por via disto, uma resposta

hiperpolarizante, inibitória, ao GABA. Setenta e cinco minutos de reoxigenação, como

indicado no trabalho de Pond et al.(2006), trouxeram E

para um valor de -58 mV.

Se V

é positivo em relação a E

, a ação do GABA será hiperpolarizante porém

se V

cair abaixo de -58mV (dentro da oscilação fisiológica, portanto), isto causará

efluxo de cloreto, despolarização do neurônio e hiperexcitabilidade, acarretando dano

neuronal.provendo uma carga elétrica iônica para o cotransporte de sódio para dentro

dos neurônios e a subsequente entrada compensatória de água no citoplasma.

Em suma, concluem os autores que a subida de [Cl

]

provocada pela manobra

OGD foi suficiente e necessária para causar dano neuronal _um fator etiológico da

lesão, não uma consequência desse dano.

1.3.6.2- Outros íons e proteínas.

De acordo com Dugan e Kim-Han (2006), quando hipóxia e/ou isquemia

cerebrais ocorrem, imediatamente caem os níveis de ATP necessários para o

funcionamento das bombas iônicas da membrana citoplasmática, tal como a Na-K-

ATPase, levando à ruptura dos gradientes iônicos transmembrânicos normais. Este

desequilíbrio iônico acarreta a despolarização membrânica, abertura dos canais iônicos

voltagem-sensíveis e uma cascata de eventos que podem levar à morte celular.

Nos primeiros segundos de um insulto isquêmico, ainda com Dugan e Kim-Han

(2006), a atividade elétrica cessa, como resultado da ativação de canais de K

generalizada hiperpolarização neuronal, numa resposta presumivelmente protetora.

Esta resposta possivelmente ocorre em reação às mudanças agudas de concentrações

locais de ATP, H

ou Ca

e/ou, talvez, à associação alterada de metaloproteínas (em

especial as que contém Zn

em sua estrutura) aos canais de potássio específicos. Somjen

(2004) corrobora o ponto de vista de uma função protetora na cessação da atividade

neuronal, acentuando que esta interrupção ocorre antes da depleção dos fosfatos de alta

energia, sugerindo, também, que exista um sensor celular de oxigênio que atue como

um sentinela da ameaça hipóxica.

Decorridos minutos da agressão hipoxêmica, contudo, esse mecanismo protetor

falha em preservar os níveis de fosfato de alta energia requeridos, com a generalizada

baixa da fosfocreatina e do ATP. À queda da PO

, segue-se o aumento da produção de

ácido lático e queda do pH do tecido alvo para algo em torno de 6.8 a 6.2. Aumentam

os níveis intracelulares de Na

e Ca

enquanto cai o Mg

. Em acréscimo, efluxo de K

dos neurônios despolarizados resulta em duradouro aumento do [K

]

e, após algum

tempo, na maciça despolarização celular conhecida como Depressão Alastrante (DA)

que se propaga pra os tecidos vizinhos.

1.3.1- A importância das citocinas na resposta ao episódio hipóxico-isquêmico.

As citocinas, invariavelmente liberadas pela micróglia, durante a resposta

imunológica básica padrão, influenciam fortemente os neurônios, em especial no que

tange a sua habilidade de processar informações, fazendo da inflamação um fator

determinante na patogênese das lesões cerebrais que sucedem a um episódio hipóxico-

isquêmico. De acordo com Sun, Calvert e Zhang (2005), os efeitos biológicos dessas

citocinas pró-inflamatórias incluem o estímulo e síntese de outras citocinas, indução de

infiltração leucocitária, influência na expressão genética glial e estimulação da síntese

de fatores tróficos.

A resposta inflamatória parece constituir o fator determinante, em última análise,

das alterações observadas nos parâmetros eletrofisiológicos medidos neste tipo de

estudo. A resposta inflamatória altera, de forma significativa, tanto o espaço extracelular

quanto o citoplasma e a membrana, em conjunto. Dessa forma, a alteração de

parâmetros eletrofisiológicos pode ser a expressão de variáveis alteradas na matriz

complexa que envolve a célula e seu meio ambiente imediato, a matriz extracelular.

Dados experimentais, que apoiaram essas conclusões, demonstram que existe

uma associação significativa entre anormalidades no desempenho neurológico e altas

concentrações de citocina medidas no sangue do cordão umbilical retirado de crianças

expostas. Tanto as crianças que padeceram de corioamniotite ( infecção disseminada

para córion e saco amniótico) quanto as crianças expostas à asfixia perinatal exibiram

altos níveis de citocinas, demonstrando, assim, que a inflamação constitui a resposta

padrão, genérica, a ambos os tipos de processo.

Bazan (2006), acentua que os fosfolipídeos nas membranas sinápticas

constituem um alvo importante nas crises epilépticas, doenças neurodegenerativas e

isquemia cerebral. Essas membranas altamente excitáveis possuem conteúdo

enriquecido de fosfolipídeos esterificados com ácidos graxos poli-insaturados que são

Ou HSD, mais apropriadamente (SOMJEN, 2004).

atacados pela MAP-quinase fosfolipase citossólica A

2 (

cPLA

liberada tanto na

epilepsia quanto no episódio hipóxico-isquêmico.

Bazan (2006) reforça essa conjetura citando achados recentes, onde

camundongos knock-out para o cPLA

exibem infartos e déficits neurológicos

consideravelmente menores do que animais normais, num modelo de Acidente Vascular

Cerebral (AVC) isquêmico.

1.3.3- Histologia de tecido cerebral exposto à hipóxia crônica.

Yu, Bakay e Lee (1972), expuseram ratos Sprague-Dawley à hipóxia contínua

(10% O

/ 90% N

) por períodos que variaram de 1 a 24 dias, realizando eutanásia de um

grupo em cada período de 24 horas. Fazemos, a seguir, um resumo de algumas

observações histológicas realizadas pelos autores para diversos tipos celulares:

•Astrócitos.

Nos primeiros 6 dias de hipóxia, a única alteração observada em astrócitos, tanto

na matéria branca quanto cinza, consistiu numa moderada dilatação da cisterna do

retículo endoplasmático (RE) , particularmente nos processos perivasculares. Alterações

severas foram observadas a partir do sétimo dia; na matéria branca ocorreu uma profusa

acumulação de gliofilamentos citoplasmáticos, enquanto na matéria cinza muitos

astrócitos exibiram marcada distensão com translucência aumentada no citoplasma,

cisternas do RE bastante dilatadas e feixes de gliofilamentos caoticamente dispostos no

citoplasma.

•Oligodendrócitos.

Não foram observadas alterações morfológicas, na substância cinzenta, durante a

primeira semana. Em períodos posteriores, mudanças definitivas foram observadas, tais

como marcadas dilatações das cisternas do RE, particularmente na zona periférica do

perinúcleo. Tais dilatações eram mais frequentemente observadas em células adjacentes

às convoluções de processos astrocíticos.

•Pequenos vasos sanguíneos.

A resposta precoce à hipóxia pareceu consistir no aumento no número e

tamanho de mitocôndrias de células de pequenos vasos sanguíneos, acompanhado

por um espessamento da lâmina basal, seguida esta reação inicial por extensas

alterações de outros componentes vasculares em períodos mais tardios. As mudanças

mais pronunciadas ocorreram em pericitos, os quais continham muitos corpúsculos

osmiófilos e se apresentavam marcadamente hipertróficos.

•Espaço extracelular.

Algum alargamento do espaço extracelular foi observado na matéria branca

durante as primeiras duas semanas de hipóxia. Não houve dilatação do espaço

extracelular na matéria cinza em qualquer momento.

Conclui-se, da observação acima, que nas camadas de expressão do corpo

neuronal, tais como as que constituem nosso objeto de estudo no hipocampo, não

ocorreu alteração macroscópica no espaço extracelular

. O mesmo não pode ser

afirmado em relação aos corpos celulares. Astrócitos sofreram alterações difusas e

disseminadas em todas as camadas de tecido encefálico bastante precocemente.

Destacamos alterações na “máquina” de proteínas, o RE, e alterações que modificaram

marcadamente o citoplasma, como grupos de gliofilamentos irregularmente dispersos

no citossol, que foram citados.

Por outro lado, devemos enfatizar que esses autores citam o aumento do número

de mitocôndrias em células de pequenos vasos, sugerindo processo ativo de

neovascularização

capilar e, por consequência, maior propensão ao edema intersticial,

principalmente se houver lesões de paredes vasculares, frequentemente presentes nos

quadros inflamatórios.

Quanto ao dano neuronal, Pond et al. (2006), verificaram, após isquemia in

vitro, encolhimento (desidratação) e discreta picnose em neurônios piramidais, sem

necrose maciça, três horas pós-procedimento.

1.3.4- Imunohistoquímica dos tecidos submetidos à hipóxia/isquemia.

De acordo com Cowell, (2002), em modelos animais de choque neonatal, a

lesão hipóxico-isquêmica elicia uma reação inflamatória aguda, caracterizada por

expressão aumentada de mediadores pró-inflamatórios, rápida resposta

microglial/monocítica e gliose, que persiste por, pelo menos, cinco semanas. A gliose,

Devemos enfatizar, entretanto, que o estudo referido utilizou-se de exposição crônica à hipóxia,

ao contrário do que realizamos em nosso trabalho (hipóxia aguda e/ou isquemia crônica).

O aumento no número de mitocôndrias sugere maior consumo energético demandado pela

atividade celular mais exuberante. Dois processos comumente exigem mais energia: reparação de lesões e

divisão celular. Ambos devem estar presentes nesse caso, bem como o aumento da permeabilidade

capilar, todos típicos dos processos inflamatórios. A neovasculogênese exibe-se também em outros

processos isquêmicos, como na revascularização capilar por colaterais no pós-infarto do miocárdio.

então, pode ser incluída como um fator seguramente presente em amostras

experimentais colhidas até P35.

As quimocinas β, incluindo aí a proteína inflamatória de macrófagos (MIP1−α )

e proteína-1 quimio-atrativa de monócitos (MCP-1), têm sido implicadas como

moduladores potenciais da resposta inflamatória aguda no cérebro

. Em roedores neonatos, lesões derivadas de episódios hipóxico-isquêmicos

resultam na expressão de MCP-1 em múltiplas células do território lesionado. Em

contraste com os resultados reportados em modelos adultos de choque, nos quais os

astrócitos constituam a fonte primordial de MCP-1, nos neonatos eram os próprios

neurônios que representavam a principal fonte dessa proteína.

Ainda com Cowell (2002), em ratos P7 a P12, como demonstrado por

imunoensaios, os neurônios exibiam deficiente imunocoloração tanto nuclear quanto

citoplasmática. Isto quer dizer, de forma direta e sintética, que tanto núcleo quanto

citoplasma foram atingidos pela resposta inflamatória aos baixos teores de O

, sofrendo

alterações tanto estruturais quanto dinâmicas sendo que, em muitos casos, essa

deficiência de coloração significa simplesmente a morte neuronal.

Comparando ratos P7 controle com animais lesionados, em períodos que

variaram de 8 a 72 horas após lesão, observou-se que em 24 e 48 horas pós-lesão era

mais pronunciada a perda de imunocoloração na camada piramidal hipocampal e no giro

denteado hipocampal, regiões alvo de nosso presente estudo.

Apenas para registro, com 72 horas pós-lesão, houve marcada perda ocorrendo

em todo prosencéfalo lesionado e alguma perda, sutil, no hemisfério contralateral,

refletindo apoptose remota à região principal de lesão.

Nos deparamos aqui, como vimos, com um quadro de profundas modificações

na estrutura e funções do hipocampo, aí abrangida nossa área de maior interesse, o giro

denteado. Houve morte neuronal e, só por este motivo, também teria se alterado o

espaço extracelular (menor número de células presentes na matriz), apesar de poder não

ter havido modificações na densidade e composição médias do MEC, como relataram

Yu, Bakay e Lee (1972). Em conclusão, alteraram-se tanto espaço intracelular ( nas

células sobreviventes) quanto extracelular.

Segundo Galasso, Harrison e Silverstein (1998), está demonstrado que a lesão

excitotóxica estimula o RNA mensageiro CCR5 e a expressão proteica no cérebro

neonatal de ratos. Esta expressão aumentada de mRNA CCR5 foi consistentemente

observada nas 24 horas pós lesão; a expressão proteica de CCR5 foi primeiramente

evidente nas 32 horas e persistiu até 72 horas pós lesão, não sendo mais observada após

cinco dias.

A expressão aumentada de CCR5, prosseguem os autores, ocorreu em regiões

vulneráveis ao dano tecidual irreversível, i.e., hipocampo ipsilateral e estriado posterior

adjacente, córtex e hipotálamo. A característica mais surpreendente da expressão de

CCR5 foi a sua distribuição anatômica; a CCR5 foi identificada em duas populações

celulares distintas. As células intensamente imunoreativas espalhadas no interior de

hipocampos lesionados foram identificadas como células microgliais/monocíticas

ativadas, baseado tanto nas características morfológicas destas células quanto na

ativação de antígeno específico para macrófagos (ED-1).

Ainda de acordo com Galasso, Harrison e Silverstein (1998), ensaios

imunocitoquímicos demonstraram padrões distintos em dois tipos celulares: uma

coloração intensa e homogênea nas células microgliais/monocíticas e um outro padrão

pontual e disseminado característico de receptores de membrana, em outros tipos

celulares. Recordemos que Araújo e Diniz (2008), como vimos na Introdução deste

trabalho, também citaram o surgimento de peroxidação lipídica após isquemia/hipóxia,

acarretando modificações de longo prazo (ou mesmo permanentes) no plasmalema.

Esse último padrão deve aqui ser por nós ressaltado: a resposta inflamatória

alterou de forma disseminada receptores de membrana. Infelizmente, o trabalho de

Galasso, Harrison e Silverstein (1998), não discerne quais receptores podem ter sido

alterados ou danificados.

Tanto as lesões excitotóxicas quanto as lesões hipóxico-isquêmicas eliciaram

uma robusta resposta microglial no cérebro do rato recém-nato. As lesões envolvendo

NMDA eliciaram uma rápida resposta monocítico-microglial em ratos P7, como

previamente reportado.

Baseando-se em estudos morfológicos que se utilizaram da histoquímica da

lecitina, citados por Galasso, Harrison e Silverstein (1998), pode-se afirmar que uma

fração substancial dessas células infiltrantes é constituída por micróglia ativada. Neste

estágio desenvolvimental, há uma densa população de células microgliais ativadas

fisiologicamente no corpo caloso; os dados sugerem que ocorra uma redistribuição de

micróglia ativada do corpo caloso para o hipocampo lesionado.

Tanto micróglia residente no hipocampo quanto células microgliais ativadas no

corpo caloso adjacente podem responder à lesão aguda excitotóxica.

1.3.7- Hipóxia, asfixia e isquemia: similaridades e diferenças.

Apesar da consequência mais evidente dos quadros de hipóxia, asfixia e

isquemia consistir na privação, aguda ou crônica, de oxigênio, há particularidades tanto

etiológicas quanto fisiopatológicas nos três quadros que exigem um melhor

detalhamento.

A sufocação, ou asfixia, pode ter como causa qualquer obstrução das vias aéreas,

externa ou interna, como por exemplo o soterramento, no primeiro caso, ou doença

pulmonar obstrutiva, no segundo caso. Na asfixia a hipercapnia é dominante sobre a

hipóxia, lembrando-se que a sensibilidade dos sensores orgânicos é muito mais evidente

para a detecção de alto P

do que para o baixo P

, o que resulta num quadro

subjetivamente muito mais angustiante na asfixia do que, por exemplo, no “mal da

montanha”, onde coexistem baixos teores de oxigênio e de gás carbônico.

Somjen (2004) lembra-nos, inclusive, que a hipóxia pura, sem aumento da

, só acontece sob restritas condições no laboratório, em experimentos in vitro com

contínua retirada de gás carbônico do sistema. Nos quadros clínicos, portanto, a

hipercapnia domina sobre a hipóxia nos pacientes submetidos a baixos teores

ambientais de oxigênio, pelo menos no início do processo, já que os quimioceptores

específicos para detecção de P

só serão ativados na fase final da hipóxia, com muito

baixos teores de oxigênio.

Já na isquemia, além do deficit de O

também encontra-se prejudicado o

suprimento de glicose e outros substratos metabólicos, bem como a retirada de

catabólitos, em especial dos subprodutos ácidos do metabolismo, que serão relevantes

para os efeitos cerebrais agudos desse quadro (SOMJEN,2004).

De toda forma, os efeitos imediatos da anóxia e da isquemia serão similares,

com evolução mais rápida deste último quadro, entretanto (GRAHAM, 1992). As

consequências da depressão do metabolismo oxidativo dominam tanto as síndromes de

isquemia cerebral agudas quanto os quadros de anóxia aguda e, também, da

hipoglicemia (DUCHEN, 1992a).

Não se pode, contudo, perder de vista o fato de que a a sensibilização

epileptogênica que sucede à isquemia é mais vigorosa do que a que ocorre após

manobra isolada de hipóxia (SOMJEN, 2004).

1.4- Resumo do capítulo.

Neste capítulo, vimos a importância dos mecanismos não-sinápticos na

epileptogênese; vimos também o estado da arte em modelagem, apontando para nossas

referências em modelos experimentais apropriados e exequíveis.

Finalmente, vimos neste capítulo um resumo da neuro-fisiopatologia do acidente

hipóxico-isquêmico, que deverá nos apoiar quando escolhermos nossa metodologia e

avaliarmos nossos resultados.

Desejamos que este corte amostral através da literatura tenha sido suficiente

para embasar nossas justificativas para seleção de nosso objeto de estudo. Desejamos,

também, que nos sustente mais adiante, quando discutirmos os resultados deste

trabalho.

CAPÍTULO 2

Materiais e Métodos

Conforme vimos na Introdução deste trabalho, utilizaremos aqui como guia os

trabalhos de Williams , Dou e Dudek (2004) e os de Sanchez e Jensenn (2006),

adaptados, após ensaios preliminares, para ratos da raça Wistar, comumente utilizados

em nosso laboratório.

2.1- Procedimentos típicos do estudo.

Utilizou-se no estudo fêmeas de ratos Wistar, submetidas aos procedimentos

hipoxemiantes na faixa etária P9-P10 e eutanasiadas para eletrofisiologia na faixa P23-

P25. O número de animais em cada grupo experimental e no grupo controle foi de seis,

excetuando o grupo utilizado para ensaios preliminares, dez animais (P9) dos quais dois

foram eutanasiados para eletrofisiologia , um em P10 e outro em P24, para referência

(resultados não exibidos aqui).

2.1.1- Protocolos de hipóxia .

Foram ensaiados três protocolos de hipóxia, um de exposição contínua a baixos

teores de oxigênio e dois com exposição a níveis decrescentes desse gás, nomeados

respectivamente Protocolo Continuo de Hipóxia (PCH), Protocolo Progressivo de

Hipóxia 1 (PPH1) e Protocolo Progressivo de Hipóxia 2 (PPH2). Tais protocolos estão

sumariados nos Quadros a seguir.

Quadro 2.1

Protocolo Contínuo de Hipóxia

(l/min) O

(l/min) % O

Tempo de exposição

(minutos)

38 2 5 15

Quadro 2.2

Protocolo Progressivo de Hipóxia - I

(l/min) O

(l/min) % O

Tempo de exposição

(segundos)

20 2 9,09 420

22 2 8,33 240

24 2 7,69 180

28 2 6,66 60

Quadro 2.3

Protocolo Progressivo de Hipóxia - II

(l/min) O

(l/min) % O

Tempo de exposição

(segundos)

20 2 9,09 210

22 2 8,33 120

24 2 7,69 90

28 2 6,66 30 (ou até

manifestação

clínica)

2.1.2 - Procedimentos cirúrgicos para isquemia.

Para a isquemização unilateral do encéfalo dos animais de experimentação,

procedeu-se à ligadura permanente da carótida comum esquerda, utilizando-se de uma

laçadura com fio de algodão 4.0, não absorvível. A anestesia processou-se com éter

sulfúrico em câmara fechada, na indução, e por fluxo contínuo, a céu aberto, com o uso

de nebulizador alimentado por compressor de ar, ao longo do procedimento cirúrgico

propriamente dito. A FIG.2.1 , a seguir, ilustra esquematicamente a incisão cirúrgica e

os diversos planos de interesse para o procedimento.

FIGURA 2.1- Desenho esquemático ilustrando o procedimento de

ligadura da atéria carótida cervical comum. Deve ter-se cautela com a

eventual confusão entre a atéria e a veia carótida, esta mais superficial,

em animais que apresentem hipotensão, uma vez que a pulsação

arterial pode não ser aparente nesses casos. A artéria sempre estará

situada mais profundamente , normalmente oculta sob camadas de

gordura e tecido celular subcutâneo. Exibindo-se ambos os vasos

torna-se mais simples identificar o vaso arterial, mais calibroso, mais

profundo e de coloração mais rosada do que a veia. Não é necessário

dissecar completamente a artéria que pode ser ligada em bloco com o

tecido adjacente.

Apesar da aparente banalidade do procedimento, deve-se ressaltar que a situação real

diverge bastante da esquemática. Excesso de anestésicos, por exemplo, fazem cair

bastante os níveis pressóricos do animal impossibilitanto identificar a artéria por suas

pulsações, que praticamente desaparecem, bem como pela coloração deste vaso que,

nessa situação, passa de rosada a branca, confundindo-se com o tecido celular

subcutâneo.

É, portanto, muito importante regular apropriadamente o fluxo de éter sulfúrico de

forma a garantir profundidade anestésica suficiente, porém sem hipotensão arterial.

Quanto ao controle da efetividade da isquemização, pudemos observar, durante os

ensaios preliminares, em animais eutanasiados em p11 (24 horas pós procedimento) a

isquemia hemiencefálica bem aparente, no procedimento de remoção do encéfalo. Em

p24, entretanto, não existem sinais remanescentes macroscópicos dessa isquemização.

A FIG. 2.2 que se segue exibe fotos da incisão cirúrgica, demonstrando a dificuldade de

visualização das diversas estruturas em tempo real.

FIGURA 2.2- Foto da incisão cirúrgica no tempo imediatamente anterior à ligadura carotídea.

A seta aponta para a carótida cervical já isolada.

Para encerrar este tópico, ilustramos a seguir o equipamento anestésico e o

material cirúrgico nas FIG. 2.3 e 2.4.

FIGURA 2.3- Foto do equipamento anestésico utilizado nos

procedimentos cirúrgicos.

FIGURA 2.4- Foto do conjunto básico de instrumentação cirúrgica.

2.1.3- Equipamentos desenvolvidos para a pesquisa

a)Câmara de hipóxia

Levando em conta os altos custos envolvidos, bem como a excessiva demora para

recebimento dos equipamentos, decidimos desenvolver por meios próprios nosso set-up

para submeter os animais de experimentação à hipóxia.

O equipamento consistiu de dois frascos de vidro com tampa rosqueável de

material plástico, que receberam reforço de borracha de silicone para aumentar sua

estanqueidade, tanto na rosca quanto nos furos realizados para passagem dos tubos,

também de silicone, que conduziriam os gases. Dois cilindros padrão, um de oxigênio

medicinal e outro de nitrogênio industrial, conectavam-se às câmaras ( câmara de

hipóxia e câmara selante) através de válvulas reguladoras de fluxo.

A primeira câmara, com atmosfera e temperatura controladas, continha o animal de

experimentação. A temperatura era mantida, por uma manta térmica que forrava o

assoalho desta câmara, em torno de 34

C. Uma segunda câmara, com água até 1/3 de

seu volume, provia um selo d'água que evitava a contaminação da câmara principal pelo

ar ambiente.

A temperatura corporal do animal era verificada antes e após o procedimento,

nunca tendo sido observada temperatura inferior a 31

C, que caracterizaria hipotermia,

ou acima de 34

C, que caracterizaria hipertermia.

A FIG.2.5, a seguir, ilustra de forma esquemática o set-up desenvolvido para

executar o procedimento de hipóxia.

FIGURA 2.5- Desenho esquemático do set-up para hipóxia.

b) Termômetro retal

Como comentado no subitem anterior, inexistia no mercado local um

termômetro apropriado para animais de pequeno porte como os ratos Wistar p24 que

utilizamos, de forma que também desenvolvemos com recursos do LANEC tal

equipamento. Para a extremidade sensora, utilizamos uma ponta metálica de caneta

esferográfica adaptada a um tubo de silicone de pequeno diâmetro, preenchidos, o tubo

e a ponta, com pasta térmica convencional. Para transdução e leitura do sinal, utilizamos

um termômetro digital convencional, genérico, composto por um par termelétrico na

extremidade transdutora e por um conjunto formado por amplificador e display na

extremidade de leitura já existente no LANEC.

A FIG.2.6, a seguir, esquematiza o equipamento desenvolvido no LANEC.

FIGURA 2.6- Ilustração esquemática do termômetro retal para roedores de pequeno

porte adaptado de um modelo comercial. Utilizou-se uma ponta de caneta

esferográfica padrão como sonda retal (rectal probe), de forma a atingir essa região

anatômica sem traumatizar o animal utilizado para experimentação. A mesma

sonda serviu para monitoramento da temperatura da manta térmica (thermical pad)

utilizada nos procedimentos cirúrgicos e durante a manobra de hipóxia. Em branco

está representado o par termelétrico, no interior da ponta.

2.2- Procedimentos gerais do estudo.

2.2.1 - Procedimentos cirúrgicos para obtenção dos hipocampos

Os procedimentos para obtenção dos hipocampos, imediatamente após a

eutanásia do animal (tempo máximo para o procedimento: 5 minutos), estão sumariados

nas FIG. que se seguem. Para uma melhor compreensão das interrelações entre o

hipocampo, estruturas associadas e o encéfalo como um todo, sugerimos consultar o

Apêndice A, Aspectos neuroanatômicos e neurofisiológicos do hipocampo e estruturas

associadas.

FIGURA 2.7- Em (A) vista em perspectiva do encéfalo de rato onde

pode ser observada a estrutura hipocampal com a indicação do ângulo

de corte para obtenção das fatias. Em (B), podemos observar cortes

coronais seriados do encéfalo de ratos, exibindo o hipocampo. No

desenho da fatia (C), podem ser identificadas as regiões CA1, CA3 e o

DG. (Gráficos obtidos de

www.neuroscience.com, acesso em

24/06/09)

FIGURA 2.8- Procedimento realizado para a retirada do cérebro de

rato da cavidade craniana. Abertura do escalpo ( 1); o sentido de corte

para a abertura do crânio (1b); abertura da calota craniana (2);

retirada do cérebro da cavidade craniana (3); remoção do cérebro para

um Becker contendo solução nutriente resfriada (4). (A partir de

CARVALHO, 2003).

FIGURA 2.9- Preparação de fatias de hipocampo em cérebro de

rato. Os quadros 1, 2, 3, 4 e 5 mostram os cortes realizados para

facilitar a dissecação. No quadro 6, é mostrado um detalhe da

separação do tálamo feita com a ajuda de micro-espátulas. Em 7 e 8

o hipocampo foi isolado do restante do córtex (retirado de

CARVALHO, 2003).

2.2.2- Eletrofisiologia

Realizamos as análises eletrofisiológicas de acordo com os

procedimentos padrão do LANEC nos set-ups já existentes no laboratório.

Descreveremos aqui tais procedimentos de forma bastante resumida, já que maiores

detalhes estão disponíveis para consulta nas dissertações de mestrado que se utilizaram

dessa metodologia relacionadas nas Referências (veja-se, por exemplo CARVALHO,

2003; CARVALHO, 2005; PEREIRA, 2005; e VIVAS, 2005).

Após a remoção do encéfalo do animal eutanasiado e a retirada do

hipocampo (vide tópico anterior), mantendo-se baixa a temperatura do tecido por

gotejamento de solução salina resfriada, a peça é fatiada por meio de equipamento

desenvolvido no LANEC (vide FIG. 2.12) e as fatias, com 40 μm, são transportadas

para a câmara de perfusão (vide FIG. 2. 10) onde permanecerão por cerca de 40

minutos, para evitar danos celulares por excitotoxicidade em decorrência da manobra

cirúrgica. As fatias descansam em uma rede de nylon, que fica situada no ramo com

maior diâmetro. Todo o sistema é preenchido com solução de Ringer normal (em mM:

127 NaCl, 2.0 KCl, 1.5 MgSO

, 1.1 KH

, 26 NaHCO

, 2 CaCl

, 10 glicose, pH

equilibrado em 7.4, através do borbulhamento constante de carbogênio (95% O

e 5%

). Através do borbulhamento com carbogênio, também é estabelecido um fluxo de

solução que permite uma perfusão suave e adequada das fatias, sempre mantendo-as em

descanso sobre a rede de nylon. Através do banho-maria, a câmara de perfusão

permanece com temperatura controlada de aproximadamente 31,5

C. Em seguida, as

fatias selecionadas serão transportadas para a câmara de interface (vide FIG. 2.11), onde

ocorrerão os registros eletrofisiológicos e/ou registros de IOS (sinal óptico intrínseco) e

imagem VET. Ambos os equipamentos foram também projetados e construídos no

LANEC.

Em nossa pesquisa, utilizamos a imagem VET

apenas para nos assegurarmos

do correto posicionamento do eletrodo na região de maior atividade na fatia, que

corresponde ao foco principal de AE. Não registramos sinais de IOS ou imagem VET.

Imagem VET: software de aquisição e processamento de imagens desenvolvido no LANEC. Basicamente, traça-se uma

poligonal sobre a imagem da camada granular do Giro Denteado e o programa fornece um gráfico em falsas cores, correspondendo

aos níveis DC, que evidencia a disseminação espaço-temporal das atividades epileptiformes ao longo de um vetor que representa a

imagem retificada (daí o nome imagem VET).

100

FIGURA 2.10-Visão esquemática da câmara de perfusão, montada com tubos e

conexões em PVC, onde são mantidas as fatias de hipocampo por um período de 40

minutos, antes do transporte para a câmara de interface. A câmara é preenchida com

solução de Ringer normal, mantidas constantes a temperatura e a oxigenação. As fatias

são depositadas no cilindro de maior diâmetro sobre uma fina rede de nylon. O banho-

maria é composto de 4 resistências (5 Ω, 20 W) ligadas em paralelo e encerradas em

invólucros de vidro. Duas delas são vistas na FIG. III.6, indicadas pelo número 5. As

resistências são alimentadas com tensões contínuas até 12 V, permitindo o aquecimento

da água destilada dentro da câmara. As tensões são controladas via um software

desenvolvido por CARVALHO (2003) em plataforma LABVIEW 6.1 (NATIONAL

INSTRUMENTS). A intensidade da tensão é calculada de acordo com a temperatura

desejada através de um módulo de controle eletrônico. Esse módulo é comandado por

meio de uma placa AD/DA (modelo PCI-6071E – NATIONAL INTRUMENTS) em

conjunto com o software. O equipamento é capaz de manter temperaturas constantes em

torno de 34

C, com precisão de um décimo de grau. A água contida no banho-maria

aquece as paredes do tubo, enrolado ao cilindro central no interior do recipiente , que

conduz a solução para a cuba, permitindo a perfusão das fatias com a temperatura da

solução devidamente controlada. Tubos de plástico conduzem o carbogênio ao interior do

banho-maria para ser distribuído, por meio de borbulhadores , dentro da água. Assim, o

carbogênio é aquecido e umidificado para, a seguir, ser direcionado sobre a face superior

das fatias mantidas na cuba.

101

FIGURA 2.11- Câmara de interface. Construída em material acrílico

transparente e tubos de PVC. Consiste de dois compartimentos: a cuba, que é

a parte superior da câmara (mostrada à esquerda por uma visão superior), e o

banho-maria, que consiste da parte inferior (apresentada com detalhes à

direita através da vista lateral). A cuba é composta por três cilindros, sendo

dois de PVC e um, o exterior, de acrílico transparente. Possui também uma

base em acrílico transparente, a qual é acoplada à parte superior do banho-

maria. O cilindro central delimita com o intermediário um compartimento que

é preenchido com a solução de banho. As fatias são depositadas sobre uma

membrana (0.4 µm Millicell culture plate inserts; Millipore, Bedford, MA,

USA) que se torna transparente quando perfundida na solução. À esquerda,

vista superior mostrando em detalhe a constituição da cuba. Em 1, está o local

onde as fatias foram depositadas; em 2, o recipiente por onde é controlado o

nível da solução de banho das fatias; em 3, o termômetro responsável pelo

controle da temperatura da solução de banho das fatias; e, em 4, os orifícios

por onde chegam o oxigênio na câmara. E, à direita, a vista lateral mostrando

o banho-maria. Em 5, são mostradas duas das quatro resistências envolvidas

em invólucros de vidro; em 6, o tubo enrolado no cilindro central por onde

passa a solução de banho aquecida; em 7, o local por onde o carbogênio chega

na câmara; e em 8, um dos dois borbulhadores de oxigênio existentes na

câmara.

102

FIGURA 2.12- Fatiador de tecidos com ajuste micrométrico

2.2.3- Processamento dos registros eletrofisiológicos.

a) Aquisição e pré-processamento dos sinais.

Foram utilizados eletrodos formados por um fio de prata e uma micropipeta de

vidro (modelo THINWALL, TW150F-3 – WPI). As pipetas foram preparadas com

ajuda de um puxador de pipetas (modelo DMZ UNIVERSAL PULLER – ZEITZ-

INSTRUMENTS) e preenchidas com solução de NaCl 1,0 M. Para se evitar o efeito de

bateria, provocado pela acumulação de cargas na interface líquido-metal, o fio de prata

foi cloretado. A cloretagem foi realizada por processo galvanoplástico, com uma fonte

de corrente contínua aplicada, durante cerca de 15minutos a uma tensão aproximada de

1,0V entre os filamentos dos eletrodos de prata, utilizando-se solução de 1,0 M de HCl.

Um filme escuro de AgCl i forma-se sobre a superfície do eletrodo ligado ao terminal

positivo (catodo), que atrai íons Cl

, enquanto o outro terminal (anodo) atrai íons H

Após cloretados, os microeletrodos foram conectados a headstages (modelo AI

402 ×50, ULTRALOW NOISE AMPLIFIER – AXON INSTRUMENTS) interligadas a

amplificadores (modelo CYBERAMP 380 – AXON INSTRUMENTS). O programa

SAE (Sistema Auxiliar de Experimentos), desenvolvido no LANEC (SILVA, 2000)

para a plataforma de software LabView, foi utilizado para controle dos amplificadores,

digitalização, exibição em tempo real e armazenamento em arquivos ( no formato *.sgl).

A taxa de aquisição do sinal foi de 10000 Hz, com uma amplificação média em torno de

500 vezes. A captura, amplificação e filtragem dos sinais foi realizada através do

pCLAMP 8.0 (AXON INSTRUMENTS). Na aquisição dos sinais, foi empregado um

computador Pentium III de 1 GHz e 512 MB de memória RAM.

103

Foi utilizada uma mesa, suspensa por câmaras de ar, que evitam distúrbios

devido a vibrações durante experimentos. O ajuste do nível da mesa foi feito através

dessas câmaras de ar. Para se evitar interferências eletromagnéticas sobre os

equipamentos foi utilizada uma gaiola de Faraday envolvendo a mesa (FIG. 2.13).

FIGURA 2.13- Diagrama esquemático da montagem experimental para indução

de atividades epileptiformes e registro do potencial extracelular. Um microscópio

(A) preso a braços ajustáveis está conectado a uma câmara CCD (B) para

visualização do IOS (C) . Os eletrodos são conectados a headstages por meio de

holders (D). As headstages são interligadas a um amplificador (E). Os sinais são

armazenados em um computador (F). As fatias são depositadas na superfície da

câmara de interface (G), apoiada sobre uma mesa X-Y (H). Todo o conjunto

apóia-se em mesa de grande massa (I), por sua vez apoiada em câmaras de ar (J)

para isolar vibrações externas. Todo o set-up está contido em uma gaiola de

Faraday (K), para evitar radio-interferências externas.

b)- Pós-processamento dos sinais

Após coleta e registro dos sinais eletrofisiológicos on-line, estes foram

posteriormente analisados e gravados off-line em diversos formatos gráficos, através de

um aplicativo por nós desenvolvido em plataforma Matlab© v.7.14, a partir de alguns

programas anteriormente desenvolvidos por Rodrigues (2003). O código fonte está

disponibilizado no Anexo.

104

Em relação aos programas originais, nosso aplicativo apresenta os seguintes

aperfeiçoamentos:

• Todas as funções, antes dispersas em vários programas, foram reunidas em só

aplicativo (dcscan.m);

• A interface com o usuário foi aprimorada e simplificada, tornando mais fácil e

confiável a utilização do programa;

• Muitos processos manuais foram automatizados, gerando maior confiabilidade e

padronização das medidas;

• Vetores de parâmetros passaram a ser automaticamente armazenados para uso futuro ;

• O software permite, interativamente, a escolha dos formatos gráficos para

armazenagem, prosseguir, ou não, analisando outras sessões experimentais e exibir na

tela, ou não, os parâmetros analisados;

• O aplicativo envia para as saídas gráficas o registro dos valores, por burst analisado,

de todos os parâmetros medidos; e

•O programa fornece (e salva) uma estatística preliminar do comportamento dos

diversos parâmetros.

Processaram-se, para fins de arquivo e consulta, 12 arquivos do tipo

*.sgl, a partir dos arquivos gravados em cada sessão experimental. Nos arquivos #1 e

#2, processaram-se dois bursts em cada, bem como nos arquivos #10,# 11 e #12, apenas

para registro. Nos arquivos de #3 a #9, todos os bursts foram processados e pré

analisados através do aplicativo dcscan.m.

Para análise estatística, desses bursts processados e pré analisados, escolheram-

se três ou quatro eventos sequenciais em cada arquivo (3 ou 4, por sorteio: lançamento

de moeda), a partir do primeiro evento em condições de análise, até o total de 20

bursts/indivíduo, totalizando 120 bursts por grupo experimental e controle.

Foram analisados, portanto, 480 eventos, nos quais enfocou-se cinco parâmetros,

resultando em 2400 análises de eventos epileptiformes de origem não sináptica.

2.2.4-Análise estatística dos dados

A questão do tratamento estatístico dos dados, em especial no que concerne à

escolha dos métodos de análise, não é de somenos importância. Como bem enfatiza

Riffenburgh (2007), é o processo causativo, gerador dos dados observados, e não os

dados , de per si, que são de interesse nessa análise.

105

Riffenburgh (2007) destaca ainda que o processamento estatístico está envolvido

nas três etapas clássicas na aquisição de conhecimento científico: descrição da classe de

eventos, explicação desses eventos e predição da ocorrência de eventos similares.

A questão mais relevante da análise estatística dos resultados é, sem sombra de

dúvida, a fidedignidade das conclusões que nos levariam, ou não, a aceitar ou rejeitar, a

hipótese nula. A confiabilidade no instrumento de análise empregado afigura-se como a

questão crucial, sine qua non, na escolha das ferramentas adequadas à análise que se

quer empreender.

Existem inúmeras ferramentas estatísticas disponíveis para o tratamento de

dados. A capacidade de resposta ao problema apresentado, não se prende à limitação na

quantidade de meios utilizáveis para o tratamento estatístico de dados. O problema

central no tratamento estatístico de dados tem a ver com a qualidade da ferramenta

empregada.

Assim, deve preceder à utilização de uma ferramenta determinada, determiná-la:

diagnosticar o tipo e o padrão geral dos resultados, tentar adequá-los a uma função, ou

funções, a uma curva, ou a um conjunto de curvas e, só então, identificar as ferramentas

adequadas para o tratamento dos dados. Na análise estatística, o primeiro passo é,

portanto, elaborar um diagnóstico do padrão geral de resposta.

Tal diagnóstico, apesar de se antecipar temporalmente à elaboração deste

capítulo, será exposto e discutido no próximo, nos Resultados, já que se trata, de fato, de

uma análise bastante preliminar, fortemente aderida aos próprios resultados. Temos,

porém, que antecipar que serão utilizados métodos analíticos paramétricos e não-

paramétricos. Uma apresentação geral e o escopo de emprego de tais métodos será

desenvolvida nos próximos tópicos.

2.2.4.1- Tipos de dados

Ainda com Riffenburgh (2007), os dados quantitativos podem ser de três tipos

principais:

1.Contínuos (também chamados intervalares), constituídos pelos registros analógicos,

de uma forma geral;

2.Ordinais (rank-ordered ), agrupados em faixas que expressam a frequência absoluta

ou relativa desses dados no conjunto; e

3.Categóricos (ou nominais), onde procede-se à contagem de classes de dados.

106

Dados discretos, prossegue o autor, podem ser considerados um subconjunto de

dados contínuos, apenas armazenados como valores distintos, com um intervalo

determinado entre dois dados adjacentes. Assim também podem ser vistas as razões

entre dados. Apesar de alguns autores considerarem estas como um quarto tipo de

dados, as razões comportam-se, mais das vezes, como dados contínuos e, assim, não

devem ser separadas destes.

Riiffenburgh (2007) chama a atenção para duas classes de dados que exigem a

abordagem ordinal, quais sejam, quando pode-se avaliar o estado de um indivíduo, após

o procedimento experimental mas não se pode medir a variável subjacente, ou quando a

variabilidade das variáveis medidas é excessiva, com grandes distâncias entre faixas de

valores. A abordagem intervalar nesses casos, por vezes leva a conclusões absurdas,

com implicações clinicas disparatadas, devendo, assim, ser evitada.

A classificação apropriada dos dados, portanto, afigura-se como passo essencial

no tratamento estatístico dos dados experimentais, influenciando decisivamente na

escolha do método de análise estatística a ser empregado, como veremos a seguir.

2.2.4.2- A escolha do método

Dados contínuos são, em princípio,adequados para os métodos de análise

conhecidos como paramétricos. Exemplos deste tipo de análise são o teste t de Student,

normalmente utilizado para análise intragrupal ou intergrupal, quando só um grupo

compara-se ao controle, neste último caso, e a análise de variância, quando mais de um

grupo experimental é comparado ao controle.

A análise paramétrica é válida e aplicável, para dados contínuos, se

consideramos a distribuição da população como aproximadamente normal e se nos

assegurarmos da aleatoriedade e independência das amostras utilizadas.

Se os dados, porém, não se comportam desta forma_se a distribuição das

amostras não é gaussiana ou se os dados apresentam variações extremas intragrupais_

não se pode asseverar aprioristicamente que uma análise paramétrica fornecerá

resultados robustos e confiáveis.

No caso de dados não-contínuos, ou discretos, as análises paramétricas são, por

natureza, inadequadas, afinal são paramétricas, i.e., lidam com valores analógicos,

contínuos ( além de presumidos como derivados de uma população com distribuição

normal).

107

A alternativa à análise paramétrica é, obviamente, a análise não paramétrica,

apropriada para lidar com dados discretos e/ou agrupados em faixas de valores (ou

ranking de valores). Ambos os métodos, apresentam abordagens variantes, em

diversos “sabores”, que serão mais ou menos adequadas para tratar de vetores de dados

com grande número de elementos extremos, fora-de-faixa, ou outliers. Há abordagens

mais convenientes, também, para lidar com amostras reduzidas em tamanho ou, ao

contrário, amostras extensas. A seguir, abordamos os métodos estatísticos que

selecionamos para o presente estudo.

a) Métodos paramétricos

Dentre os métodos paramétricos existentes, a análise de variância (Anova)

afigura-se como dos mais robustos e confiáveis, em especial quando se tratam vários

grupos experimentais em relação a um controle. Nós nos utilizamos aqui do algoritmo

para Anova da plataforma Matlab©, versão 7.14, do módulo Stats ToolBox, bem

adaptado ao nosso número e tipo de amostras.

Anova-1, o aplicativo Matlab©, perfaz uma Anova unidirecional, comparando as

médias de duas ou mais colunas de dados numa matriz m X n, em que cada coluna n

representa uma amostragem independente de m observações. Em nosso caso, os rótulos

das colunas representam nossos grupos experimentais (Hipóxia, Isquemia, Isquemia +

Hipóxia e Controle); as 120 linhas representam obervações em seis indivíduos, de cada

qual retiramos 20 amostras de cinco parâmetros, quais sejam, DC, PS, DE, IE e PM.

Tais parâmetros serão apresentados e discutidos no próximo capítulo, Resultados.

Anova-1 retorna o p-value para a hipótese nula de que todas as amostras da

matriz provém da mesma população ou de diferentes populações com a mesma média.

Baixos valores de p-value lançam dúvidas sobre a hipótese nula e sugerem que pelo

menos uma amostra difere significativamente das outras médias do grupo. A função

testa a variabilidade dos resultados tanto intra quanto intergrupalmente, dessa forma

assegurando resultados mais rigorosos, mesmo nas condições extremas de emprego do

método como, por exemplo, diferente número de amostras em diversos grupos de

observação ou distribuições irregulares nos grupos experimentais.

Por razões que ficarão claras no próximo capítulo, nós cotejamos os resultados

de análises paramétricas com suas contrapartes não-paramétricas, mencionadas a seguir.

108

Também pode ser de interesse do investigador comparar, de uma só vez, vários

parâmetros pesquisados nos grupos experimentais versus controle para concluir, ou não,

que o grupo como um todo varia significativamente em relação ao mero acaso sem,

porém, determinar quais parâmetros estão diretamente implicados nessa variância. Nós

o fizemos aqui, por meio da análise paramétrica multivariada Manova-1 (Matlab©

v.7.14, Stats ToolBox).

b) Métodos não- paramétricos

Como antes mencionado, a adoção de procedimentos paramétricos para a análise

de variância depende de certas assunções, tal como a distribuição normal dos erros. Em

alguns casos, esta assunção não está garantida. Por exemplo, se a distribuição dos erros

é assimétrica ou tende para valores extremos de outliers, há uma violação na presunção

de erros normais.

Os testes não-paramétricos não partem da presunção de que haja uma, e

qualquer, distribuição específica. Riffenburgh (2007), acentua que tais testes são um

salvo-conduto para conclusões errôneas, se algumas premissas, tais como a presença

de uma distribuição normal, não estão seguramente contempladas.

No que tange aos métodos não-paramétricos, o teste de Kruskal-Wallis pode ser

considerado como a contrapartida não-paramétrica de Anova. Este teste é robusto, não-

complacente e fidedigno, quando se trata de uma amostragem com perfil não

convencional, e foi utilizado aqui.

Há testes não-paramétricos mais tolerantes a valores extremos ou outliers, como

o teste de Mood por exemplo, mas, como comparamos os resultados de Anova,

paramétrica e resistente a outliers e Kruskal-Wallis, não paramétrica e rígida, não foi

necessária a utilização desse último método.

O teste de Kruskal-Wallis, como outros métodos não-paramétricos, assume que

as medidas provenham de uma distribuição contínua, mas não necessariamente normal.

O teste está baseado numa análise de variância que se utiliza do rankings dos valores

dos dados, não dos dados, por si mesmos. Suas saídas ( “Box-plots” e tabelas)

assemelham-se às saídas de Anova e podem ser diretamente comparadas, entre si.

O contorno geral das saídas de Kruskal-Wallis é o mesmo de Anova e seria

tedioso reproduzi-lo aqui. A única diferença consiste na substituição da estatística F

pela estatística χ_quadrado, na avaliação da significância das diferenças entre médias.

109

c) Métodos de comparações pareadas versus comparações múltiplas.

Quando procedemos a um teste t simples de um grupo contra seu controle,

especificamos um nível de significância que determina o valor de corte da estatística t.

Se especificamos, por exemplo, um valor para α = 0.05, nos asseguramos que, quando

não há diferença real, concluiríamos erroneamente existir diferença em não mais que

5% dos casos.

Quando, porém, há vários grupos experimentais, existem também muitos pares

a comparar; se aplicamos um teste t comum nesta situação, o valor α se aplicaria a cada

comparação, dessa forma multiplicando a chance de uma conclusão incorreta, a qual

cresce proporcionalmente com o número de comparações pareadas.

Os procedimentos de multicomparação são desenhados de forma a estabelecer

um teto ou barreira superior que limita a chance de se encontrar resultados

incorretamente classificados como significativos. Utilizamos aqui os métodos de

multicomparação (Matlab© v 7.14/ Stats Toolbox) ligados à Anova, no caso da análise

paramétrica, e a Kruskal-Wallis, no caso não-paramétrico, comparando ambos os

métodos em gráficos de sobreposição, como veremos no capítulo Resultados.

2.2.5- Análise histopatológica.

Não foi realizada análise histopatológica dos tecidos sob estudo, por exiguidade de

tempo, porém, após a eletrofisiologia, fatias de 40 μm, tanto do hipocampo analisado

quanto do hipocampo contralateral, foram preservadas em solução de paraformol e

conservadas sob refrigeração, para posterior análise histopatológica. Várias fatias de 40

μm foram incluídas em blocos de agar-agar e refatiadas para 10 μm, para possibilitar a

confecção de lâminas, que poderão receber diversas colorações, para análise posterior.

CAPÍTULO 3

Apresentação dos Resultados

O fato de lidarmos, neste trabalho, com uma raça de ratos (Wistar) sem registro

de emprego anterior na literatura, no modelo experimental escolhido

, nos forçou a

realizar alguns ensaios preliminares, visando atender simultaneamente a dois objetivos:

maximizar resultados e minimizar perdas de animais, atendendo tanto a princípios

éticos, quanto práticos. Assim, sumariamos a seguir, o desenrolar desses ensaios

preliminares.

3.1- Estudos preliminares de isquemia seguida de hipóxia.

Preliminarmente procedemos a um estudo com dois animais P10, onde após a

ligadura da carótida cervical comum esquerda, já havendo recuperação cirúrgica_cerca

de duas horas após o procedimento_ ambos os animais foram submetidos a 15 minutos

de hipóxia em atmosfera continuamente renovada com 5% de O

e 95% de N

(PCH,

vide Materiais e Métodos), ajustados por meio de fluxômetros, com a temperatura

corporal mantida em níveis satisfatórios por meio de manta térmica, sendo aferida a

temperatura antes e após o procedimento por um termômetro retal adaptado de um

modelo comercial em nosso laboratório.

Nenhum dos dois animais exibiu hipo ou hipertermia, permanecendo sempre a

temperatura retal na faixa de 31

C a 34

C, em conformidade com o habitualmente

prescrito para esse tipo de manobra (SANCHEZ e JENSEN, 2006). Esses animais foram

monitorados e eutanasiados em p24, para eletrofisiologia (dados em arquivo, não

exibidos aqui). Curiosamente, esses animais organicamente resistentes aos

procedimentos foram os únicos a exibir status epilepticus após o procedimento

cirúrgico, por quase todo o tempo de recuperação.

Entretanto, após este sucesso inicial, foi total a mortalidade observada nos oito

procedimentos combinados isquemia-hipóxia subsequentes, ou seja, 80% da amostra

observada, ou oito em dez animais. Decidimos, portanto, optar por um protocolo de

hipóxia mais assemelhado ao de Sanchez e Jensen (2006), que se utilizam de níveis

gradativamente menores de O

na câmara hipobárica.

Mecanismos não-sinápticos da epileptogênese derivada de processos hipóxico-isquêmicos

perinatais.

Utilizamos, de início, fluxo contínuo de O

a 1l/min. e fluxo crescente de N

por 15 minutos de exposição total, numa reprodução bastante fiel do protocolo de

Sanchez e Jensen (2006), como segue:

12 l/min (aproximadamente 7,1% de O

) por 7 minutos;

14 l/min (aproximadamente 6,1% de O

) por 4 minutos;

20 l/min. ( 5% de O

) por 3 minutos e, finalmente,

24 l/min. (aproximadamente 4,1% de O

) no último minuto.

Este esquema apresentou o inconveniente de não permitir ajustes precisos nas

válvulas reguladoras de fluxo, bem como não propiciar pressão interna suficiente, nas

câmaras utilizadas, para um selo de alta eficácia. Assim, dobramos a taxa de fluxo de

ambos os gases e ajustamos essas taxas para faixas de valores standard, impressos nas

escalas dos cilindros de controle das válvulas ( o protocolo nomeado PPH1, vide

Materiais e Métodos).

Apesar deste protocolo derivado de Sanchez e Jensen (2006) proporcionar maior

índice de sobrevivência, a mortalidade permaneceu ainda excessivamente alta para o

grupo submetido ao procedimento combinado Isquemia+Hipóxia (em torno de 70%, em

seis novos experimentos) , o que nos levou a ensaiar ainda outro protocolo, com os

mesmos teores de O

porém com menor tempo de exposição, levando em consideração a

possibilidade de que ratos Wistar possam ser mais sensíveis à hipóxia, uma vez que não

há relatos na literatura de procedimentos de isquemia/hipóxia que se utilizem desta raça

(PPH2, vide Materiais e Métodos).

De fato, com o novo protocolo, a sobrevivência do grupo submetido à isquemia

+ hipóxia aproximou-se de 100% (apenas dois êxitos letais em todo o experimento),

embora consistentemente tenham surgido sinais clínicos, tais como cianose de

extremidades, taquipnéia e prostração, a qual sempre permaneceu por cerca de duas

horas após o procedimento, em todos os animais submetidos à hipóxia.

3.2- Resultados dos grupos experimentais.

Ao longo deste capítulo, procederemos à tabulação e subsequente análise dos

resultados do experimento para quatro grupos, quais sejam: Hip (para o grupo

submetido à hipóxia isoladamente), Isq (para o grupo submetido à isquemia, por

ligadura da carótida cervical comum, isoladamente), Mix (para o grupo submetido à

hipóxia cerca de duas horas após a cirurgia para ligação da carótida cervical comum) e

Cnt (grupo controle, não submetido a nenhum procedimento).

Serão avaliados os seguintes parâmetros: DC (queda de tensão), PS (population

spikes), DE (duração do evento), IE (intervalo entre eventos) e PM (máxima population

spike).

3.2.1-Tabulação dos dados.

3.2.1.1- Ajuste de curvas (curve fitting) dos dados tabulados

à guiza de exemplo, procedemos no FIG . seguinte, a um ajuste polinomial das

curvas dos dados, de forma a tentar melhor visualizar sua distribuição. Adotamos como

o polinômio de escolha o primeiro que apresentasse menor norma de resíduos.

Como se pode observar, apenas o grupo Hip. proporcionou um ajuste

aproximado à curva de dados, com um polinômio de 6

grau. Os outros grupos não

puderam ser ajustados, mesmo com polinômios de graus maiores, o que não acrescenta

informação de relevo à análise

Tal situação reproduziu-se para os demais grupos paramétricos, onde o ajuste

manual/visual foi mais adequado do que o ajuste polinomial. Desta forma, não

insistimos nesse procedimento e buscamos outras formas de auxílio para proceder a esse

ajuste de curvas.

Teoricamente sempre se pode encontrar um polinômio que descreva a curva sob análise mas ,

da mesma forma que listar todas as alturas individuais em uma população não nos indica qualquer

tendência, um polinômio de grau elevado também não o faz.

FIGURA 3.1- Ajuste polinomial de curvas. Em azul, os

dados e, em vermelho, as curvas ajustadas.

Outra forma exequível de “curve fitting”, ou seja, outra maneira de acentuar as

características gerais de distribuição em cada histograma, é utilizar um aplicativo

desenhado para essa função tal como a ferramenta disponibilizada na plataforma

Matlab©, em interface gráfica para o usuário (GUI), na caixa de utilidades (Toolbox)

estatísticas.

Utilizamos largamente essa ferramenta, disponível na versão 7.14 do Matlab©,

como forma pessoal de auxílio na pré-análise dos dados compilados. À guisa de

ilustração, exibimos a seguir, algumas saídas gráficas fornecidas pelo aplicativo.

Utilizamos o parâmetro DC como exemplo e referência, para permitir uma comparação

com o ajuste anteriormente ilustrado, que se utilizava de desenvolvimentos polinomiais

na identificação das tendências gerais dos histogramas.

Não exibimos os outros resultados, que foram utilizados neste trabalho apenas

como guias auxiliares na visualização dos envelopes de frequência dos diversos

histogramas.

FIGURA 3.2- Reprodução simplificada das saídas gráficas da ferramenta dfittool

componente da 'caixa de ferramentas' do Matlab© v.7.14/ Stats Toolbox. No sentido

horário, a partir da margem superior esquerda: ajuste normal; ajuste não-paramétrico;

ajuste logarítmico-normal e ajuste para valores extremos. Observe-se que nenhuma

saída exibe um ajuste perfeito. (Outras saídas não foram representadas aqui).

A seguir, exibimos outro gráfico onde sobrepusemos duas saídas do aplicativo

em pauta, demonstrando que esse ajuste combinado proporcionaria um encaixe quase

perfeito com a série de dados sob análise. De fato, este ajuste combinado aproxima-se

do ajuste polinomial de sexto grau anteriormente exibido. Fica patente a tendência à

distribuição bimodal do parâmetro DC.

A ferramenta dfittool utiliza no seu núcleo, ou kernel,uma função para suavizar a curva,

aproximando-a de uma normal. Utilizamos o ajuste default, teoricamente otimizado para o processo, bem

como o ajuste padrão para a divisão em bandas, evitando excessiva suavização ou, ao contrário, excessiva

aspereza da curva.

FIGURA 3.3- Sobreposição (graphic overlay) de duas saídas da ferramenta Matlab© para

ajuste de curvas. Foram sobrepostas as saídas de ajuste não-paramétrico e a de valores

extremos. O aspecto fuzzy (ou enevoado ) do gráfico é proposital para destacar a inevitável

imprecisão desses ajustes.

3.2.1.2- Histogramas dos grupos experimentais e controle

A-Histogramas do parâmetro DC ( Direct Current / Queda de voltagem) em

grupos experimentais e controle.

Neste conjunto de histogramas observa-se a distribuição bimodal do parâmetro

DC no grupo Hip. O grupo Isq apresenta distribuição gaussiana com desvio para a faixa

de menores valores; o grupo Mix apresenta distribuição exótica (menor expressão de

valores medianos) e o grupo Cnt(controle) apresenta forte concentração de valores à

esquerda.

FIGURA 3.4- Histogramas relativos ao parâmetro DC. No eixo x estão

representados os valores pertinentes a cada parâmetro (mV para DC, PS e PM;

tempo em segundos para DE e IE); no eixo y o número de indivíduos em cada

faixa de valores. Em azul (quadrante superior esquerdo), o grupo Hip, em

vermelho (quadrante superior direito), Isq, em verde (quadrante inferior

esquerdo), Mix e, em amarelo (quadrante inferior direito), Cnt.

B-Histograma do parâmetro PS ( 'Population Spikes') em grupos

experimentais e controle.

Neste conjunto de histogramas destaca-se a distribuição gaussiana left-tailed

tanto do grupo Hip quanto de Cnt, com Isq e Mix denotando certa tendência à

distribuição bimodal.

FIGURA 3.5- Histogramas relativos ao parâmetro PS.No eixo x estão

representados os valores pertinentes a cada parâmetro (mV para DC, PS e PM;

tempo em segundos para DE e IE); no eixo y o número de indivíduos em cada

faixa de valores. Em azul (quadrante superior esquerdo), o grupo Hip, em

vermelho (quadrante superior direito), Isq, em verde (quadrante inferior

esquerdo), Mix e, em amarelo (quadrante inferior direito), Cnt.

C-Histograma do parâmetro DE (Duração do Evento) em grupos

experimentais e controle

Neste conjunto de gráficos, observa-se distribuição levemente gaussiana em

todos os grupos, com tendência right-tail no grupo Mix e left-tail nos grupos controle e,

mais discretamente,no grupo Isq. O grupo Hip apresenta uma faixa de exclusão nos

valores medianos, reproduzindo, de forma menos marcada, o aspecto bimodal desse

grupo em registro anterior (DC).

FIGURA 3.6- Histogramas relativos ao parâmetro DE.

No eixo x estão representados os valores pertinentes a cada parâmetro (mV para DC,

PS e PM; tempo em segundos para DE e IE); no eixo y o número de indivíduos em cada

faixa de valores. Em azul (quadrante superior esquerdo), o grupo Hip, em vermelho

(quadrante superior direito), Isq, em verde (quadrante inferior esquerdo), Mix e, em

amarelo (quadrante inferior direito), Cnt.

D- Histograma do parâmetro IE ( Intervalo entre Eventos) em grupos

experimentais e controle.

Todos os histogramas deste parâmetro apresentam distribuição

aproximadamente gaussiana, sendo que o grupo controle apresenta left-tail, i.e., desvio

em direção aos valores mais baixos.

FIGURA 3.7 -Histogramas relativos ao parâmetro IE. No eixo x estão

representados os valores pertinentes a cada parâmetro (mV para DC, PS e

PM; tempo em segundos para DE e IE); no eixo y o número de indivíduos

em cada faixa de valores. Em azul (quadrante superior esquerdo), o grupo

Hip, em vermelho (quadrante superior direito), Isq, em verde (quadrante

inferior esquerdo), Mix e, em amarelo (quadrante inferior direito), Cnt.

E- Histograma do parâmetro PM (PS máxima) em grupos experimentais e

controle.

Os histogramas do parâmetro PM, ou PS máxima no burst, apresentam

distribuição mais aproximadamente gaussiana do que o parâmetro PS, ou média das

population spykes . Não se observa aqui a curva exótica do grupo Mix, observada em

PS; o grupo Hip está bem distribuído, com leve tendência left-tail, mais exuberante em

Isq e Cnt. O grupo Mix apresenta tendência inversa, right-tail.

FIGURA 3.5- Histogramas relativos ao parâmetro PM. No eixo x estão representados

os valores pertinentes a cada parâmetro (mV para DC, PS e PM; tempo em segundos para

DE e IE); no eixo y o número de indivíduos em cada faixa de valores. Em azul (quadrante

superior esquerdo), o grupo Hip, em vermelho (quadrante superior direito), Isq, em verde

(quadrante inferior esquerdo), Mix e, em amarelo (quadrante inferior direito), Cnt.

3.3-Análises estatísticas

Como observamos no tópico anterior, alguns parâmetros exibiram uma

distribuição diversa da gaussiana padrão, o que dificulta a análise puramente

paramétrica, como a análise de variância conhecida como Anova. Este tipo de análise

estatística pressupõe, além de variáveis independentes, distribuição aproximadamente

normal da população, o que poderia ser questionável em distribuições bimodais ou

fortemente desviadas para um dos extremos, como parece ser o caso de alguns

parâmetros aqui avaliados.

Decidimos, portanto, cotejar as saídas da Anova com um método não

paramétrico como o de Kruskal-Wallis, utilizado aqui. Tais métodos, que se utilizam de

escalonamento (ou ranking) das variáveis sem levar em conta seus valores absolutos (

apenas seus desvios), apesar de possuírem menor conteúdo informacional (menor

fidedignidade do Intervalo de Confiança, por exemplo), são intrinsecamente mais

robustos na avaliação da significância dos desvios da média dos diversos grupos em

relação ao controle. Por motivos talvez estéticos, contrapusemos todos os parâmetros

avaliados com Anova ao método de Kruskal-Wallis, mesmo os que apresentaram

distribuição aproximadamente normal.

Como, evidentemente, não há diferença nos diagramas “tipo caixa” entre

métodos paramétricos ou não, já que representam a distribuição dos elementos

componentes dos grupos, suas medianas e seus desvios padrão, basta uma representação

para ambos os métodos. Já para a multicomparação, os resultados paramétricos foram

contrastados com os não paramétricos, bem como procedeu-se à comparação entre as

tabelas que sumariam os resultados das duas análises-tipo.

A seguir, exibiremos gráficos e tabelas, com comentários, para os diversos

parâmetros avaliados neste experimento.

3.3.1- “Box Plot” e Análise de Variância do parâmetro DC (Anova e Kruskal-

Wallis).

Observamos aqui a distribuição mais simétrica do grupo Mix, bem como a

presença de muitos elementos fora-de-faixa (outliers) no grupo Cnt (controle). Os

grupos Hip e Isq apresentam tendência de desvio em direção a valores mais altos,

especialmente Hip, em contraste com Cnt, com tendência inversa. Observa-se também

que as medianas dos diversos grupos não coincidem.

FIGURA 3.6 - Gráfico “tipo caixa” ou Box-Plot do parâmetro DC. As

linhas vermelhas na estrangulação do polígono representam as medianas; as

linhas tracejadas representam os desvios padrão das médias e as cruzes em

vermelho os valores fora de faixa ou outliers.

Como se pode observar na próxima Tabela , p-value aproxima-se de zero para

um valor F de 11.77, fortemente significativo, portanto. Podemos ver na TAB.3.2 que a

análise não-paramétrica de kruskal-Wallis corrobora os resultados de Anova, i.e., a

probabilidade das diferenças da média deverem-se apenas ao acaso aproxima-se de zero.

Tabela 3.1

Tabela da análise de variância (Anova) do parâmetro DC

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de

Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

Estatística F Probabilidade

>F (p-value)

Colunas 516,49 3 172,16 11,77 1,90E-007

Erro 6965,35 476 14,63

Total 7481,83 479

Tabela 3.2

Tabela da análise de variância (Kruskal-Wallis) do parâmetro DC

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

-quadrado

Probabilidade

-quadrado

Colunas 478844,4 3 159614,8 24,89 1,63E-005

Erro 8737115,1 476 18355,3

Total 9215959,5 479

3.3.2- “Box Plot” e Análise de Variância do parâmetro PS (Anova e Kruskal-

Wallis).

Observamos aqui a distribuição mais simétrica do grupo Hip (hipóxia), bem

como a presença de muitos elementos fora-de-faixa (outliers) no grupo Cnt (controle).

Este grupo, desprezados os outliers, apresenta distribuição essencialmente simétrica.

Deve-se atentar também para as medianas que, neste caso, dispõe-se, de forma bastante

aproximada, ao longo de uma única linha horizontal, i.e., têm valores muito próximos

entre si.

FIGURA 3.7 - Gráfico “tipo caixa” ou Box-Plot do parâmetro DC. As

linhas vermelhas na estrangulação do polígono representam as medianas; as

linhas tracejadas representam os desvios padrão das médias e as cruzes em

vermelho os valores fora de faixa ou outliers.

A seguir, se observa na TAB. 3.3, que ao contrário do parâmetro DC, PS não

apresenta desvio significativo da média nessa estatística.

Tabela 3.3

Tabela da análise de variância (Anova) do parâmetro PS.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de

Liberdade (GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

Estatística

Probabilidade

>F (p-value)

Colunas 0,02 3 0,01 0,48 6,94E-001

Erro 7,42 476 0,02

Total 7,45 479

Já na TAB. 3.4, no que respeita ao parâmetro PS, KW apresenta um resultado

marginalmente significativo (25% de chance das diferenças deverem-se ao acaso).

Neste caso, deve-se privilegiar o resultado da análise paramétrica, i.e., os desvios da

média devem-se ao acaso.

Tabela 3.4

Tabela da análise de variância (Kruskal-Wallis) do parâmetro PS.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de

Liberdade (GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

quadrado

Probabilidade

-quadrado

Colunas 256043,4 3 85347,9 13,31 4

Erro 8959914,6 476 18355,3

Total 9215958 479

3.3.3- “Box Plot” e Análise de Variância do parâmetro DE (Anova e Kruskal-

Wallis).

Nesta observação, o grupo Cnt, como nos casos anteriores, mostra-se simétrico

porém com forte presença de elementos fora-de-faixa, mais concentrados na região de

maiores valores. O grupo experimental de maior simetria é o grupo Hip. O grupo Isq

apresenta-se desviado em direção a valores mais altos e, curiosamente, o grupo Mix

apresenta tendência contrária. Neste gráfico, as medianas dos grupos Hip e Isq estão

dispostas ao longo de uma linha horizontal, bem como Mix e Cnt. Os dois pares de

grupos, entretanto, situam-se em linhas diversas (mais altas, no primeiro par).

FIGURA 3.8 - Gráfico “tipo caixa” ou Box-Plot do parâmetro DE. As

linhas vermelhas na estrangulação do polígono representam as medianas;

as linhas tracejadas representam os desvios padrão das médias e as cruzes

em vermelho os valores fora de faixa ou outliers.

Na próxima análise, observam-se desvios da média fortemente significativos

para o parâmetro DE,com F, inclusive, sendo representado por quase o dobro do valor

encontrado para DC..

Tabela 3.5

Tabela da análise de variância (Anova) do parâmetro DE.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados (SQ)

Graus de

Liberdade (GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

Estatística F Probabilidade

>F (p-value)

Colunas 10243,3 3 3414,43 22,21 1,78E-013

Erro 73176,2 476 153,73

Total 83419,5 479

Como se pode observar na próxima TAB., aqui, KW concorda inteiramente com

Anova: o resultado é fortemente significativo.

Tabela 3.6

Tabela da análise de variância (Kruskal-Wallis) do parâmetro DE.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

-quadrado Probabilidade >

quadrado

Colunas 868199,8 3 322733,3 50,32 6,82E-011

Erro 8247759,8 476 17327,2

Total 9215959 479

3.3.4- “Box Plot” e Análise de Variância do parâmetro IE (Anova e Kruskal-

Wallis).

Todos os grupos nesta observação mostram-se bastante simétricos, com exceção

de Mix, com leve tendência para a faixa de maiores valores. É digna de nota a presença

de valores extremos ou fora-de-faixa em todos os grupos, sempre em direção aos

valores mais altos.

FIGURA 3.9 - Gráfico “tipo caixa” ou Box-Plot do parâmetro IE. As

linhas vermelhas na estrangulação do polígono representam as

medianas; as linhas tracejadas representam os desvios padrão das

médias e as cruzes em vermelho os valores fora de faixa ou outliers.

Também o intervalo entre eventos apresenta, sob o prisma da Anova, desvio

significativo da média, embora menor que o desvio dos parâmetros anteriores, p-value

aproxima-se de zero, porém F é bem menor na TAB. exibida a seguir.

Tabela 3.7

Tabela da análise de variância (Anova) do parâmetro IE.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados (SQ)

Graus de

Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

Estatística F Probabilidade

>F (p-value)

Colunas 5132,1 3 1710,71 3,17 2,42E-002

Erro 256935,9 476 539,78

Total 262068 479

O resultado de KW para IE não indica desvio significativo, contrapondo-se à

Anova, como a seguir exibido. Neste caso a análise não paramétrica tem maior peso que

Anova.

Tabela 3.8

Tabela da análise de variância (Kruskal-Wallis) do parâmetro IE.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

quadrado

Probabilidade

-quadrado

Colunas 18710,1 3 6236,7 0,97 8,08E-001

Erro 9192662,9 476 19312,3

Total 9211373 479

3.3.5- “Box Plot” e Análise de Variância do parâmetro PM (Anova e Kruskal-

Wallis).

Todos os grupos apresentam assimétricos e com desvios em direção aos valores

mais altos, em especial o grupo controle. O grupo Isq apresenta maior número de

outliers, em direção à faixa de altos valores, seguido de Mix, com outliers direcionados

para valores mais baixos. Não há coincidência de medianas entre quaisquer grupos.

FIGURA 3.10 - Gráfico “tipo caixa” ou Box-Plot do parâmetro IE. As linhas

vermelhas na estrangulação do polígono representam as medianas; as linhas

tracejadas representam os desvios padrão das médias e as cruzes em vermelho

os valores fora de faixa ou outliers.

Observamos nessa próxima tabela que Anova indica cerca de 20% de

chance das diferenças deverem-se apenas ao acaso (p-value de 0.19) para uma

estatística F de pequeno valor (1.59). Não há diferenças significativas, portanto, para

Anova-1, não se podendo rejeitar H

Tabela 3.4

Tabela da análise de variância (Anova) do parâmetro PM.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de

Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

Estatística F Probabilidade >F

(p-value)

Colunas 24,27 3 8,09 1,59 0,19

Erro 2418,32 476 5,08

Total 2442,59 479

A análise não-paramétrica exibida a seguir, entretanto, ao contrário de Anova,

exibe significância para as diferenças entre médias encontradas. De fato, p-value

aproxima-se de zero para um χ – quadrado de 43,71.

Tabela 3.5

Tabela da análise de variância (Kruskal-Wallis) do parâmetro PM.

Fonte dos

dados

Soma dos

Quadrados

(SQ)

Graus de Liberdade

(GL)

Médias dos

Quadrados

(SQ/GL)

-quadrado Probabilidade >

quadrado

Colunas 840909 3 280303 43,71 1,74E-009

Erro 8374989 476 17594,5

Total 92515898 479

3.3.6-Multicomparação dos parâmetros avaliados nos grupos experimentais versus

controle.

3.3.6.1-Multicomparação do parâmetro DC (Anova versus Kruskal-Wallis).

A análise Anova indica diferença estatisticamente significativa entre controle e

os grupos Hip e Mix (Hipóxia + Isquemia), bem como ausência de diferença ente Cnt e

Isq. Já a análise não-paramétrica de Kruskal-Wallis (KW), só indica diferenças entre o

Grupo Hip e os grupos Isq e Mix, com uma discreta sobreposição, entretanto, na

comparação desse primeiro grupo e o grupo controle. Deve-se recordar que o parâmetro

DC apresentou distribuição bimodal no grupo Hip e gaussiana left-tailed no grupo Isq,

restringindo, assim, a aplicabilidade do método paramétrico.

FIGURA 3.11- Multicomparação relativa ao parâmetro DC. Em azul (mais escuro) estão

representados os intervalos obtidos com o método paramétrico Anova (Matlab© v.7/ Stats

ToolBox) e, em vermelho (mais claro), os intervalos do método não-paramétrico de Kruskal-

Wallis. As barras representam os desvios da média; quanto mais sobrepostas, menor a

significância das diferenças entre os grupos.

3.3.6.2-Multicomparação do parâmetro OS

Curiosamente, na análise KW, mais exigente, há diferença estatisticamente

significativa entre controle e grupo Hip, não presente na análise Anova. KW indica

também diferenças entre o grupo Hip e os grupos Isq (marginal) e Mix (forte), também

ausentes em Anova. A robustez e não complacência do método não-paramétrico fala a

favor de considerar tal resultado como válido.

FIGURA 3.12- Multicomparação relativa ao parâmetro PS. Em azul (mais escuro) estão

representados os intervalos obtidos com o método paramétrico Anova (Matlab© v.7/ Stats

ToolBox) e, em vermelho (mais claro), os intervalos do método não-paramétrico de Kruskal-

Wallis. As barras representam os desvios da média; quanto mais sobrepostas, menor a

significância das diferenças entre os grupos.

3.3.6.3-Multicomparação do parâmetro DE

Surge aqui uma diferença importante no posicionamento do grupo controle nas

duas análises, ocorrendo desvio para a esquerda (menores valores , ou ranking de

valores, no caso) na análise não paramétrica. Anova indica diferença estatisticamente

significativa entre controle e Hip, entre controle e Mix e, diferença marginal entre

controle e Isq (os extremo dos intervalos se tocam).Já KW indica diferenças apenas

entre Cnt e Hip ou Isq, e não entre controle e Mix.

FIGURA 3.13- Multicomparação relativa ao parâmetro DE. Em azul (mais escuro) estão

representados os intervalos obtidos com o método paramétrico Anova (Matlab© v.7/ Stats

ToolBox) e, em vermelho (mais claro), os intervalos do método não-paramétrico de Kruskal-

Wallis. As barras representam os desvios da média; quanto mais sobrepostas, menor a

significância das diferenças entre os grupos.

3.3.6.4-Multicomparação do parâmetro IE

A análise Anova aponta diferenças estatisticamente significativas entre controle

e Hip e, marginalmente significativas (há pequena sobreposição de intervalos) entre Cnt

e Isq ou Mix. Na análise KW, não há diferenças entre quaisquer grupos.

FIGURA 3.14- Multicomparação relativa ao parâmetro IE. Em azul (mais escuro) estão

representados os intervalos obtidos com o método paramétrico Anova (Matlab© v.7/ Stats

ToolBox) e, em vermelho (mais claro), os intervalos do método não-paramétrico de

Kruskal-Wallis. As barras representam os desvios da média; quanto mais sobrepostas,

menor a significância das diferenças entre os grupos.

3.3.6.5-Multicomparação do parâmetro PM

Curiosamente, também aqui Anova não aponta diferenças significativas entre

quaisquer grupos mas, ao contrário, a análise não paramétrica de Kruskal-Wallis indica

diferenças significativas entre o grupo controle e todos os grupos experimentais. Se

considerarmos a não complacência e robustez do último método, devemos considerar

que existem diferenças consideráveis neste caso. A excessiva variabilidade intragrupal

pode ter contribuído para a análise deficiente do método paramétrico. Devemos também

recordar que PM representa um caso particular de PS (PS máxima versus PS média) e,

destarte, deve acompanhar, de alguma forma, as análises desse último parâmetro.

FIGURA 3.15- Multicomparação relativa ao parâmetro PM. Em azul (mais escuro) estão

ToolBox) e, em vermelho (mais claro), os intervalos do método não-paramétrico de

Kruskal-Wallis. As barras representam os desvios da média; quanto mais sobrepostas,

menor a significância das diferenças entre os grupos.

3.3.7- Análise multivariada (Manova) de todos os grupos (Hip, Isq, Mix, Cnt)

considerando quatro parâmetros (DC,PS,DE e IE).

O parâmetro PM foi excluído da análise, já que representa um caso especial de

PS, e sua inclusão tornaria menos legíveis os resultados. A seguir, um gráfico. de

dispersão com plotagem agrupada em matriz, uma das saídas de Manova

FIGURA 3.16- Gráfico de dispersão, combinado com histogramas, de todos os

grupos considerando os parâmetros DC,PS,DE e IE.

O gráfico acima não fornece dados claros sobre as diferenças globais entre os

diversos grupos; os dados sobrepõe-se e agrupam-se de forma marcada, não exibindo

tendência definida. A análise Manova, porém, pode esclarecer melhor esta

multicomparação grupal, de múltiplas variáveis, como veremos a seguir.

3.3.7.1- Resultados da Manova.

Manova fornece o parâmetro d, para uma estimativa da dimensão das médias

grupais; neste caso, d=3, ou seja, a máxima diferença possível (GL3) para quatro grupos

sob comparação (zero indicaria médias num mesmo ponto,ou seja médias

estatisticamente iguais; 1, diferenças ao longo de uma linha; 2, diferenças dispostas em

um plano e 3, como no caso presente, diferenças situadas na superfície de um sólido

geométrico). Portanto, mesmo levando em consideração que o parâmetro IE não

apresentou diferenças significativas, o grupo como um todo diverge em relação ao

acaso.

A segunda saída fornecida por Manova é o parâmetro p, um vetor de p-values

para a sequência de testes, iniciando com o teste para a dimensão zero e prosseguindo

até a última dimensão pertinente. Neste caso, Manova fornece o seguinte vetor p:

= 0.0000

= 0.0029

= 0.0113

Como todos os valores de p são pequenos, estima-se que a dimensão seja igual a

A última saída de Manova corresponde à estrutura stats, com vários campos

3.3.8- Exemplos de registros dos diversos parâmetros/grupos.

A- Grupo Hip.

O registro reproduzido acima, sintetiza os achados no grupo Hip para os

parâmetros DC, DE e PS. Observamos aqui um exuberante DC (-16.7991 mV) e um

grande DE (64.2982 s); PS, porém, não diverge significativamente do controle e o IE

encaixa-se perfeitamente no padrão geral.

- W/Conteúdos de campos (soma de quadrados intra-grupais e produtos cruzados da matriz B): 4 X 4

(double); B (soma de quadrados inter-grupais e produtos cruzados da matriz T):4 X 4 (double); T (soma total dos

quadrados e produtos cruzados da matriz GL [graus de liberdade] em W):4 X 4 (double); dfW (Graus de liberdade

para W.GL.B):476; dfB (Graus de liberdade para B.GL.T):3; dfT (Graus de liberdade para T λ ):479; λ (vetor de

valores para o teste estatístico λ de Wilks, para testar a dimensionalidade das médias/Qui quadrado): 3 X1 (double);

Qui-quadrado (Transformação de λ para aproximar-se a uma distribuição qui-quadrado): 3 X1 (double); chisqdf

(Graus de liberdade para os eigenvalores de qui-quadrado):4 X 1 (double);eigenval (eigenvalores do eigenvetor): 4 X

1 (double); eigenvec (eigenvetor): 4 x4 (double); além de variáveis canônicas C, distâncias de Mahalanobis, etc.,

necessárias para os cálculos executados pela rotina.

FIGURA 3.17- Registro do potencial extracelular de fatia de hipocampo de

animal do grupo Hip. Na parte inferior do gráfico, podemos ver uma ampliação

do burst analisado, o quarto a partir da esquerda.

B- Grupo Isq.

Neste registro fica bem ilustrado o comportamento do grupo Isq. Observamos

um grande DE (64.0675 s.) para um DC dentro do padrão de variação (-6.1741 mV) e

um PS pequeno, no exemplo, inclusive, menor que a média.

É interessante notar, como representado no próximo registro, o que parece ser

uma tendência nesse grupo: a proporcionalidade inversa de PS e DE.

FIGURA 3.18- Registro do potencial extracelular de fatia de hipocampo de

animal do grupo Isq. Na parte inferior do gráfico, podemos ver uma ampliação

do burst analisado, o primeiro a partir da esquerda.

IEE:27 seg

FIGURA 3.19- Outro registro do potencial extracelular de fatia de hipocampo de

animal do grupo Isq, que apresenta PS de maior valor. Na parte inferior do

gráfico, podemos ver uma ampliação do burst analisado, o quarto a partir da

esquerda.

IEE: 47 seg.

C- Grupo Mix.

Neste grupo, submetido a um protocolo mais leve de hipóxia (PPII), tanto DC

quanto DE foram menores, como pode ser observado no registro típico, exibido a

seguir.

FIGURA 3.20- Registro do potencial extracelular de fatia de hipocampo de

animal do grupo Mix. Na parte inferior do gráfico, podemos ver uma ampliação

do burst analisado, o primeiro a partir da esquerda.

D- Comparação entre os registros dos três grupos experimentais

A seguir, para facilitar a análise, exibimos um gráfico comparando os três

grupos experimentais, ajustados para a mesma escala.

FIGURA 3.21- Comparação de registros típicos dos três grupos experimentais,

ajustados com a escala do eixo y do grupo Hip (0 a 15 mV).

3.4- Sumário da análise estatística dos resultados.

Para facilitar uma visão geral dos resultados das análises de variância

paramétricas e não-paramétricas, sumariamos a seguir as saídas de Anova e Kruskal-

Wallis. Representamos aqui o inverso do parâmetro IE, para maior clareza na

comparação dos resultados, uma vez que quanto menor o IE, maior a sensibilização

epileptogênica.

TABELA 3.6 Sumário das análises de variância

Anova Kruskal-Wallis Valores em relação ao Controle

PARÂMETRO

Mais altos Mais baixos

1+ (FORTE) 1+ (FORTE) HIP MIX

-1 (NS) 0 (Marginal) HIP/ISQ/MIX _______

-1 (NS) 1+ (FORTE) HIP/ISQ/MIX _______

1+ (FORTE) 1+ (FORTE) HIP/ISQ MIX

1/IE

0 (Marginal) 1+ (FORTE) HIP/ISQ/MIX ________

É digno de nota o comportamento do grupo Mix, apresentando valores médios

inferiores ao grupo controle tanto para DC quanto para DE. O que teria levado esse

grupo a apresentar essa resposta ( pelo menos aparentemente) paradoxal?

Tentaremos deslindar esta e outras questões, a seguir.

Capítulo 4

Discussão dos Resultados

Aumento dos níveis DC e duração dos eventos nos grupos Hip e Isq.

Os resultados mostraram que houve clara sensibilização epileptogênica nos

grupos Hip e Isq, conforme evidenciam os maiores níveis DC e maiores períodos DE

Uma alteração que poderia explicar essa sensibilização, indicada pelos

parâmetros em pauta, seria a modificação da razão volumétrica intra/extracelular,

provavelmente pela expansão do MEC, ocasionada por edema intersticial residual na

segunda semana pós-indução. De acordo com Kramer e Gonic (1974), a bomba de

sódio/potássio pode sofrer sobrecarga na situação de expansão do MEC, dificultando o

restabelecimento do potencial de repouso e, assim, mantendo os neurônios mais

próximos do potencial de ação. A Fig 4.1, a seguir, exemplifica esta situação, deixando

claro que a bomba tem que se esforçar mais para atingir o nível de equilíbrio à esquerda

do que à direita..

FIGURA 4.1- Ilustração diagramática do MEC , representado pelo cilindro de

vidro externo e da célula, representada pelo cilindro interno; a bomba em azul,

representa a Na

- K

-ATPase. O líquido amarelo representa a concentração

iônica do sódio. À esquerda o MEC está expandido, à direita, normal ou

contraído.

Expansão do MEC e sensibilização: um paradoxo?

Nossa argumentação até aqui estaria impecável, não fosse por um pequeno

óbice: nos cérebros adultos, mais resistentes à epileptogênese, o MEC está

proporcionalmente aumentado, e não diminuído, como demonstram trabalhos com

cérebros adultos e tecidos expostos ao manitol, que provoca encolhimento celular (cf.

ROPER, OBENAUS e DUDEK, 1993).

A sobrecarga da Na

– K

- ATPase não será determinante na epileptogênese,

mas um contribuinte de peso no que respeita, especificamente, aos parâmetros que são

influenciados pelo ritmo e velocidade do restabelecimento do potencial de repouso, ie,

da repolarização celular. Outras alterações, especialmente agindo sobre o plasmalema

(canais, cotransportadores, etc.) é que contribuirão de forma mais direta para outros

tipos de sensibilização epileptogênica, agindo sobre um outro conjunto de parâmetros.

O atraso da repolarização acarretará um período maior para a duração das AE

(parâmetro DE); importará também numa janela temporal maior de exposição do

neurônio ainda não recuperado em seu potencial a um novo disparo (facilitação das PS).

Alterações nas dinâmicas dos canais iônicos, seja por ação direta sobre esses

canais por alterações proteicas no plasmalema, seja por ação indireta sobre co-

transportadores, trarão consequências diretas para o gradiente iônico transmembrânico e

potenciais de Nernst de diversas espécies iônicas. Indiretamente, canais alterados

afetarão a velocidade das trocas iônicas, ATP-dependentes ou não, e influirá também

na intensidade (ddp) das PS.

Devemos acrescentar porém, que nas situações descritas por Roper, Obenaus e

Dudek (1993), houve diminuição do volume celular, como mecanismo básico, não a

expansão primária do MEC, que ocorreria na presença de edema intersticial. No

primeiro caso estariam, portanto, preservados concentrações e gradientes iônicos no

meio ambiente da matriz celular.

Já em nossa situação experimental, se ocorreu alteração da relação volumétrica

intra/extracelular, esta deveu-se primariamente à expansão do MEC, diluindo sua

concentração iônica.

A FIG. 4.2, a seguir, ilustra esse raciocínio, tomando como exemplo uma única

espécie iônica, apenas para maior clareza do esquema.

FIGURA 4.2- As esferas amarelas representam íons Na

; os círculos representam

células. Observe que o número de íons intracelulares é o mesmo em ambas as

situações. As setas representam o gradiente relativo em ambas as situações.

Se olharmos com atenção para a figura acima, podemos observar que na situação

1, de célula contraída e MEC normal, o gradiente intra/extra celular é menor do que na

situação 2. Esta é apenas outra forma de representar o que esquematizamos na FIG. 4.1,

anterior a esta: a bomba terá um esforço maior para restabelecer o potencial de repouso

na situação de MEC expandido do que na vigência de MEC normal porém com a célula

contraída.

A situação representada por nossos experimentos é, portanto, diversa da

representada pelo trabalho de Roper, Obenaus e Dudek (1993), ocorrendo aqui maior

sobrecarga da Na

– K

- ATPase e dificultando, por esse motivo, o restabelecimento

do potencial de repouso, o que acarretará maiores períodos DE e, por força dos maiores

gradientes iônicos, maiores níveis DC .

PS ou PM, qual o melhor indicador de sensibilização?

parâmetro PS, ao levar em consideração a média de amplitude dos sinais das

population spykes, tende a diluir ou suavizar excessivamente os desvios da média. Na

análise estatística de PS, na verdade consideramos médias de médias, “achatando” as

curvas sob análise e, dessa forma, ocultando do observador algumas características

relevantes.

O parâmetro PM, por sua vez, fornece uma medida mais expressiva, capaz de

melhor quantificar a intensidade desse recrutamento. Na média, dois eventos podem

apresentar o mesmo valor de PS, porém um evento pode apresentar um recrutamento de,

digamos, 100.000 neurônios, por um breve instante, e o outro de apenas 10.000 ao

longo do evento. As condições ambientais no primeiro exemplo serão radicalmente

distintas das condições ambientais no segundo exemplo. Para o segundo, haveria um

“teto” de 10.000 neurônios, não para o primeiro, onde dez vezes mais neurônios

poderiam disparar sincronamente.

Devemos recordar que as population spikes representam um fenômeno coletivo,

o resultado do recrutamento de muitos neurônios expostos ao mesmo microambiente,

processo de relevo para os mecanismos não-sinápticos porque não haveria tempo para

esse recrutamento se dar por meio de sinalização química, a nível sináptico. Se

considerarmos os focos longínquos que podem surgir, nem a comunicação direta, via

gap-junctions, poderia explicar esse disparo simultâneo e hipersíncrono que constitui as

PS.

Levando em conta o acima exposto, consideramos que o parâmetro PM, ou valor

máximo da PS em cada burst, possa representar melhor os fenômenos que subjazem

aos registros apurados.

No que respeita a esse parâmetro, KW encontrou desvios significativos da

média, em direção a valores mais altos, em todos os grupos experimentais em

comparação com o grupo controle, demonstrando que houve alterações que envolvem o

microambiente, os neurônios ou, mais provavelmente, ambos.

O grande paradoxo do grupo Mix.

Parece não restar dúvidas de que as manobras de isquemia e/ou hipóxia

resultaram em significativas modificações da sensibilidade epileptogênica de origem

não-sináptica em todos os grupos experimentais, conforme evidencia a eletrofisiologia

realizada cerca de duas semanas pós-procedimento. Em todos os grupos experimentais,

à exceção do grupo Mix, todos os parâmetros relevantes indicativos de sensibilização

epileptogênica de origem não-sináptica aumentaram em relação ao controle .

Nossa argumentação, nesse ponto, seria linear e direta, não fôra o

comportamento aparentemente paradoxal do grupo Mix, submetido a dois

procedimentos que se revelaram isoladamente sensibilizantes mas que, ainda assim,

levaram esse grupo a tornar-se relativamente mais resistente do que o grupo controle,

pelo menos no que respeita à intensidade e persistência da despolarização (valores mais

baixos de DC e DE).

Duas linhas de raciocínio apresentam-se para nossa argumentação:

1. De alguma forma o procedimento de isquemização teria minimizado os efeitos da

manobra de hipóxia que sucedeu a cirurgia; e

2. As manobras combinadas resultaram em algum tipo de seleção de neurônios

resistentes à epileptogênese.

Evidentemente, a primeira linha de raciocínio justificaria a maior resistência do

grupo Mix em relação ao grupo Hip, porém não em relação ao controle. De fato,

poderíamos nos valer desta linha de argumentação em outro momento de nossa

discussão, para compararmos os grupos experimentais entre si, porém neste momento

parece que temos que aderir à segunda linha.

Por razões talvez fortuitas, as manobras combinadas de isquemia sucedida de

hipóxia podem ter levado à morte celular os neurônios que se tornariam mais

sensibilizados às AE de origem não sináptica.

Talvez as razões que motivaram a necrose ou apoptose dessa população neuronal

sensível não tenham sido assim tão fortuitas; parece, de fato, tratar-se de um limiar (ou

limiares) de sensibilização, num primeiro patamar, e de morte celular, num segundo

nível, envolvendo ambos os limiares os mesmos processos intra e/ou extracelulares.

A Fig. 4.3, a seguir, esquematiza essa situação.

FIGURA 4.3- Seleção de populações neuronais. Na linha superior não houve

seleção significativa, apesar de poder ter havido sensibilização geral dos

neurônios; na linha média apenas os neurônios mais sensíveis sofreram necrose

ou apoptose; na linha inferior, apenas neurônios epilepto-resistentes

sobreviveram.

De acordo com o esquema acima exibido, no grupo Mix correspondendo à linha

inferior, apenas neurônios epilepto-resistentes sobreviveram, tornando esse grupo,

portanto, mais resistente do que o grupo controle, composto por neurônios com

diversos graus de resistência à epileptogênese

. O grupo Isq, na linha média, teve

sacrificados seus neurônios mais sensíveis, exibindo por conta deste fato, uma resposta

mediana de sensibilização; já o grupo Hip, na linha superior, todos os tipos neuronais

foram sensibilizados, o que acarretou resposta de sensibilização epileptogênica mais

exuberante, uma vez que os neurônios mais sensíveis foram poupados neste grupo.

Naturalmente, esta é uma representação apenas esquemática da realidade. Terão sobrevivido

neurônios de todos os tipos, em todos os grupos. Os neurônios citados como sobreviventes, contudo,

representarão a esmagadora maioria da população neuronal.

Recordemos aqui Margerison e Cosellis (1996) que afirmam que os neurônios

hilares denteados constituem a população mais sensível à excitotoxidade que se segue à

hipoxemia ou a repetidas crises epilépticas, sendo os primeiros a desaparecer após tal

tipo de manobra. Após estes, prosseguem os autores, os próximos neurônios na escala

de sensibilidade serão as células piramidais de CA1 e CA3.

Prosseguem os autores afirmando que dentre os neurônios hilares, entretanto, nem

todos são igualmente sensíveis. A sensibilidade é máxima para células musgosas e

alguns interneurônios (imunoreativos à somatostatina e polipeptídeo Y).

Margerison e Cosellis (1996) destacam ainda que tanto células granulares quanto

células em cesto (basket cells) são bastante resistentes à agressão excitotóxica.

É oportuno lembrar também Pond e colaboradores (2006) que citam que

neurônios piramidais que, apesar de exibir picnose, não sofrem necrose maciça nas três

horas pós-hipoxemia.

Além dos autores acima, Chen e Buckmaster (2005), Cowell (2002), Mc Ewen

(2000) e Graham (2002), já referidos neste trabalho, também citam a morte neuronal

após lesões, destacando com maior ou menor ênfase a seletividade dependente do tipo

celular, apoiando, assim, nossa hipótese da seleção neuronal residir na base mesma da

sensibilização epileptogênica observada em nossos grupos experimentais.

Se a seleção neuronal é tipo-dependente, como parece, a morte neuronal não se

deu de forma aleatória, antes disso, processou-se de forma heterogênea porém bem

determinada, atingindo mais fortemente algumas sub-regiões do GDH. Por outro lado,

também deve ter ocorrido neurogênese no GDH nessas duas semanas após a exposição

à manobras hipoxemiantes. Liu e colaboradores (1998), fazem-nos incluir essa

possibilidade em nossa situação experimental.

Em seu artigo, versando sobre neurogênese denteada após isquemia transitória

em gerbils, os autores descrevem neurogênese até o décimo-quarto dia após isquemia,

em sub-áreas do GDH (zona subgranular) Em torno do 26

dia, ocorre manifesta

maturação neuronal, as partir das células tronco que se dividiram na zona subgranular e

migraram para o hilus ou permaneceram em seu local de origem.

O mapa funcional hipocampal ter-se-á modificado consideravelmente após essa

neurogênese, alterando a extensão ou densidade de sub-regiões ocupadas por

determinados tipos celulares. A próxima FIG. nos fornece um guia geral para algumas

estruturas hipocampais, em condições normais.

FIGURA 4.4- Corte sagital do hipocampo mostrando áreas do Corno de

Amon e, ao centro, o Giro Denteado, com falsas cores sobrepostas. Em verde, a

camada celular piramidal; em azul, a camada polimórfica; em vermelho, a

camada celular granular; em amarelo, a camada molecular e, em laranja, a área

aproximada onde foram inseridos os eletrodos para o registro eletrofisiológico

extracelular.

Podemos observar na figura acima que nossa área de registro engloba uma

camada de células com resistência de intermediária à forte (células piramidais), de

acordo com a observação de Pond et al (2006). Podemos ver também que, num extremo

vizinho à área de registro encontram-se concentradas células granulares, muito

resistentes (MARGERISON e COSELLIS, 1996).

Essa justaposição de áreas com diversas sensibilidades (tanto à epileptogênese

quanto à morte neuronal, acentue-se) pode provocar um fenômeno que apelidamos de

“efeito capacitor”, a partir de uma exposição que nos foi feita por Almeida (2009). As

FIG. 4.4 e 4.5 darão início a nossa discussão desse efeito.

FIGURA 4.5- Representação altamente esquemática de duas populações

neuronais homogêneas no que respeita a intensidade e duração dos eventos

epileptiformes. O multímetro representa o eletrodo de registro com um terminal

no meio extracelular e o outro ligado à terra, o dreno das correntes elétricas. Não

há qualquer obstáculo para o livre fluxo de correntes, neste caso.

FIGURA 4.6- Representação altamente esquemática de duas populações

neuronais heterogêneas no que respeita a intensidade e duração dos eventos

epileptiformes. A população neuronal 'A' encontra-se em seu estado mais

excitado, enquanto 'B' está em repouso ou tem pequeno nível de excitação. Num

segundo momento haverá inversão desses estados., com prejuízo do fluxo se 'A'

envolver espacialmente 'B'.

Nas figuras acima, representamos as situações de homogeneidade ou não de

duas populações neuronais. Nesse esquema linear quer criamos, talvez não seja

intuitivo o desenrolar dos eventos no tempo e no espaço e, assim, na próxima FIG.

representamos o momento subsequente das atividades em populações heterogêneas, já

numa representação planar.

FIGURA 4.7- A população neuronal 'B', agora em seu pico de atividade

encontra-se circundada pela população neuronal 'A', em seu período

refratário. Não há livre fluxo de corrente em direção ao dreno e, assim, existe

a tendência de 'B' atingir maiores diferenças de potencial do que ocorreria se

o fluxo estivesse normal.

Como sempre se pode traçar uma analogia entre fluxos e potenciais elétricos e

hidráulicos, talvez as FIG. seguintes sejam mais esclarecedoras. Na FIG. 4.8

representamos duas populações neuronais homogêneas, com fluxo livre e sem “efeito

capacitor”; na FIG. 4.9, representamos, com a analogia hidráulica, a situação

esquematizada na figura acima.

FIGURA 4.8- Analogia hidráulica da situação de duas populações neuronais homogêneas

com mesmo nível de DC e mesma duração dos eventos. Não há obstáculo para o fluxo e, por

conta disto, ocorre baixa pressão no recipiente à direita, representando a população 'B'.

FIGURA 4.9- Analogia hidráulica da situação de duas populações neuronais heterogêneas

com diversos níveis DC e diferente duração dos eventos. Há obstáculo para o fluxo e, por

conta disto, ocorre alta pressão no recipiente à direita, representando a população 'B'.

Tudo leva a crer que tenha ocorrido esse “efeito capacitor”, no grupo

experimental Mix pelo menos. Esse efeito explicaria o porque do grupo Mix, apesar de

exibir baixos níveis DC, apresentar population spikes maiores do que o controle: o

“tamponamento” da população neuronal que recebeu o eletrodo de registro, por outra

população neuronal, em seu período refratário, elevou a tensão daqueles disparos

síncronos.

Apesar dos pequenos gradientes iônicos diferenciais no segmento medido no

grupo Mix, ocorreu aqui a oportunidade para que PS e, em especial, PM, se elevassem.

De fato, uma situação análoga foi observada em um trabalho em que se empregava o

Eugenol como bloqueador em AE sustentadas por mecanismos não-sinápticos. A FIG. a

seguir foi retirada de um poster ilustrativo do referido trabalho (PEREIRA,

RODRIGUES e ALMEIDA, 2009).

IGURA 4.10- Efeito do Eugenol sobre a expressão das AE. A barra colorida vertical indica o

nível dos potenciais, de negativo, em azul, a positivo, em vermelho. O tamanho da mancha

colorida indica a extensão espacial da despolarização; quanto mais saturada de azul, maior a

intensidade (negativa) do nível DC.

Na figura acima, observamos à esquerda atividade que se espalha por uma

grande área, conforme demostra o IOS representado em cores acima do registro

eletrofisiológico. Já à direita, o IOS mostra apenas uma pequena área de abrangência

das AE, porém as population spikes são muito mais exuberantes do que no registro à

esquerda. Provavelmente ocorreu aqui também o “efeito capacitor”, tal como deve ter

ocorrido no grupo Mix e, talvez, no grupo Isq.

O pequeno paradoxo dos grupos Hip e Isq.

Outro aparente paradoxo, que agora consideramos pequeno, consiste na inversão

da sensibilidade epileptogênica de nossos grupos experimentais em relação à

expectativa, digamos, clássica: o grupo Isq deveria, em princípio, constituir o grupo

mais sensibilizado, já que a isquemia provoca, além da hipoxemia, distúrbios

metabólicos tais como deficiência do aporte energético (hipoglicemia) e saturação por

catabólitos (acidose lática, por exemplo).

Não foi isto que ocorreu com nossos grupos experimentais. O grupo Hip

revelou-se mais sensibilizado do que o grupo Isq, numa clara inversão de expectativas.

Novamente aqui, nosso esquema justificaria tal achado: o grupo Hip

corresponde à linha superior da figura 4.3, onde o estímulo nóxico foi subliminar, não

ocorrendo, portanto, qualquer seleção de populações neuronais. O grupo Hip, então,

contém neurônios sensíveis, resistentes e normais_assim como o grupo controle_todos

sensibilizados, porém, pela manobra de hipóxia e, assim, hiper-reativos.

Já o grupo Isq, correspondendo à linha média da figura, sofreu uma seleção que

eliminou neurônios especialmente sensíveis à epileptogênese, porquanto o estímulo

liminar levou esses neurônios à morte celular por necrose ou apoptose. Disso resultou

uma população neuronal menos sensibilizada do que no grupo Hip, que manteve vivos

seus neurônios sensíveis.

Como já expusemos, o grupo Mix corresponde à linha inferior, onde apenas

neurônios resistentes_diversamente do grupo controle e do grupo Hip_sobreviveram.

Este é o grupo de estímulo supraliminar, além do normal, mais resistente à

epileptogênese do que a média da população.

Em última análise, este fato explica também porque ocorreu uma taxa de 80% de

êxito letal nos animais submetidos ao protocolo mais forte de hipóxia, PPH1, após a

isquemia, nos ensaios preliminares: o estímulo nóxico foi, nesse caso, muito superior ao

limiar, resultando em morte neuronal maciça e êxito letal dos animais.

Por último, a menor população sobrevivente no grupo Mix, justificaria a maior

intensidade de sincronização, representada pelas population spikes, observada neste

grupo em relação aos demais grupos experimentais como vimos no tópico anterior.

Mecanismos comuns subjacentes à sensibilização epileptogênica e morte neuronal.

Aqui desaparecem os paradoxos; o mecanismo de sensibilização epileptogênica

foi o mesmo em todos os grupos experimentais e ocorre, basicamente, na membrana

celular.

Nossa janela de observação, duas semanas pós-indução, representa a fase semi-

crônica do processo, i.e., o momento em que os processos agudos_tais como os edemas

citotóxico e intersticial primário_ já desapareceram porém ainda não surgiram

repercussões crônicas, conduzentes à epilepsia verdadeira .

Nessa fase, algumas modificações serão, senão permanentes, bastante

duradouras. Algumas modificações ainda presentes nessa janela de observação podem

consistir, por exemplo, no edema intersticial residual, observado por alguns autores

(NEDELCU,2009, por exemplo) até o quinto dia após o episódio

hipoxêmico/inflamatório.

Outra alteração bastante provável nessa fase é representada pela gliose

(COWELL, 2002). A sobre-expressão da glia no tecido afetado traria duas

consequências, de mesmos efeitos, na interrelação célula/meio ambiente, quais sejam:

1.Diminuição do MEC, agora ocupado por maior número de células gliais; e

2.Aumento da recaptação de K

(buffering glial) pelos astrócitos neo-formados.

Ambos os processos acima referidos falariam contra a sensibilização

epileptogênica: a redução do MEC favoreceria a atuação da Na

-K

-ATPase, facilitando

o restabelecimento do potencial de repouso bem como a recaptação de K

pela

astróglia, através do tamponamento glial de potássio também atuaria no mesmo sentido,

favorecendo a hiperpolarização neuronal.

Temos, porém, que aduzir aqui algumas observações. A gliose observada nessas

fase dá-se às custas, basicamente, de células microgliais, o equivalente no SNC dos

macrófagos existentes na circulação corporal, incapazes de participar do buffering glial

De acordo com a literatura (DOU e DUDEK, 2004; WILLIAMS e JANSEN, 2006 e outros), os

modelos de isquemia e/ou hipóxia foram concebidos para o estudo da fase crônica do processo, pelo

menos um ano após a indução. Nossa abordagem difere da daqueles autores no presente trabalho.

de potássio; além disso, a glia neoformada organiza-se em locais determinados do

neuropill, não de forma disseminada por todo o MEC e, assim, não altera de forma

significativa seu volume ou composição.

Além disso, conforme Yu, Bakay e Lee (1972), a astróglia encontra-se bastante

alterada, a partir do sétimo dia , exibindo marcada distensão e translucência

citoplasmática e, portanto, os astrócitos não terão a competência normal para realizar o

tamponamento de K

, prejudicando a homeostase iônica.

Por outro lado, conforme Galasso, Harrison e Silverstein (2008) e também

Araújo e Diniz (2008), a peroxidação lipídica (dentre outras alterações) derivada da

agressão hipoxêmica/inflamatória, poderá ter lesionado, até de forma definitiva, alguns

componentes do plasmalema essenciais para o transporte iônico. As células

sobreviventes ao edema citotóxico trarão em suas membranas cicatrizes funcionais

importantes que prejudicarão a homeostase iônica.

A população mitocondrial dos neurônios terá sido reduzida pelo excesso de

[Ca

]

ocasionado, dentre outros fatores, pela descarga glutamaérgica, trazendo

transtornos definitivos para o funcionamento dos mecanismos de transporte ATP-

dependentes, nessas células com reduzida eficiência energética.

Teremos, então, um leftover de neurônios incompetentes para executar a

dinâmica normal, incapazes de restabelecer com rapidez os gradientes iônicos

necessários para a retomada do potencial de repouso. Em outras palavras, neurônios

epilepto-sensíveis.

Capítulo 5

Conclusões e Sugestões

Nossa principal conclusão é a de que ocorreu franca sensibilização epileptogênica

envolvendo AE sustentadas por MNS, duas semanas após manobras hipoxemiantes,

em dois grupos experimentais, o grupo Hip e o grupo Isq. Ocorreu também relativa

dessensibilização ou aumento de resistência, dificultando o aparecimento de AE de

origem não-sináptica no grupo Mix, conforme evidenciado por menores níveis DC e

menores intervalos DE, apesar da manutenção nesse grupo de alto nível PS/PM.

A seleção neuronal tipo-dependente parece consistir no mecanismo básico que

gerou tais resultados, talvez secundada por alterações no MEC provenientes de edema

intersticial residual no momento das análises eletrofisiológicas.

Permaneceram em aberto algumas questões, ao final de nosso trabalho, que, se

respondidas poderiam confirmar ou não nossas hipóteses, quais sejam:

1.Que tipos de estruturas membrânicas foram de fato alteradas no processo?

2.Que tipos de lesões ocorreram, se ocorreram, no hipocampo contralateral à ligadura da

artéria cervical comum?

3.Confirma-se ou não a presença de edema intersticial residual 14 dias pós hipoxemia?

4.Como evoluiriam essas lesões pós-agudas a longo prazo, tornando-se crônicas?

Para responder a essas questões seria necessário um projeto mais complexo e de

mais longo prazo, talvez só cabível em uma tese de doutoramento ou num esforço

global de pesquisa, envolvendo diversos especialistas. Em relação a esse desdobramento

da pesquisa, elaboramos a seguir uma lista sintética de sugestões:

1.Realizar análises histológicas e imunohistoquímicas nos cortes submetidos à

eletrofisiologia versus grupo controle, para identificar as microestruturas envolvidas na

sensibilização epileptogênica;

2.Registrar o IOS em paralelo à eletrofisiologia, para identificar as áreas de atividade,

mensurando sua extensão;

3.Realizar eletrofisiologia no hipocampo contralateral à isquemia, nos grupos

pertinentes, para verificar se a isquemização tem algum efeito protetor na subsequente

exposição à hipóxia;

4.realizar, em paralelo, comparações estatísticas, com os métodos apropriados, em

grupos de controle obtidos da mesma ninhada que os grupos experimentais, para

eliminar qualquer flutuação intergrupal de sensibilidade que pudesse falsear os

resultados; e

5.Realizar estudos seriados em diversas faixas etárias até a cronificação, cerca de um

ano após a indução, aí incluída a observação comportamental dos animais, para verificar

o surgimento de crises espontâneas.

Sabemos não haver esgotado aqui o rol de possibilidades de estudos futuros

sobre o tema, contudo cremos que essas sugestões podem nortear o planejamento de

próximas pesquisas.

Esperamos que esse trabalho tenha contribuído, senão com respostas claras, pelo

menos com novas questões relevantes para o estudo de atividades epileptiformes

sustentadas por mecanismos não-sinápticos, desencadeadas por exposição à hipoxemia,

no período equivalente ao perinatal humano, modelando síndromes da maior gravidade

em neonatos de nossa espécie.

Finalmente, desejamos, do mais fundo de nossa alma, que o sacrifício de seres

que compartilham conosco mais de 90% de seus genes não tenha ocorrido em vão.

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Apêndice A

Conexões Não-Sinápticas

A.1- Efeito de campo elétrico

Os efeitos de campo elétrico ocorrem quando correntes elétricas produzidas por

atividades neuronais mudam a excitabilidade de outros neurônios vizinhos não

conectados. Ou seja, a corrente gerada por um neurônio é conduzida através do meio

extracelular e atinge outros neurônios causando despolarizações em suas membranas

(JEFFERYS, 1995).

FIGURA A.1 – Efeito produzido pela interação de campo elétrico entre dois neurônios observado através

da medida do potencial transmembrânico (Vm) subtraído do potencial intracelular (Vi) do potencial

extracelular vizinho, Vo (modificado de TAYLOR e DUDEK, 1984).

O efeito de campo é mais facilmente identificado em experimentos de indução

de atividades epileptiformes (AE), pois, nesse caso, as correntes extracelulares, devidas

aos potenciais de ação, são maiores por causa do sincronismo. TAYLOR e DUDEK

(1984) mediram o potencial transmembrânico de um neurônio, durante atividades

neuronais sincronizadas, e observaram o efeito de campo elétrico através de espículas

de despolarização, que ocorrem simultaneamentes às population spikes no meio

extracelular. (FIG. A.1).

A.2- Flutuações iônicas

Uma vez que a membrana celular neuronal é sensível às variações de

concentrações iônicas nas suas faces intra e extracelular, diversos íons presentes no

meio extracelular podem alterar a polarização desta membrana, diminuindo ou

aumentando seu limiar para disparo de um potencial de ação e, assim, contribuir

decisivamente para a comunicação neuronal, independentemente da sinalização químio-

sináptica. Desta forma, o gradiente de concentração iônica no meio extra celular,

quando se altera, pode carrear um sinal que sensibilizará um grande número de

neurônios expostos ao micro-ambiente local.

Potássio, cálcio, sódio, cloreto e magnésio são os principais íons que ocorrem em grandes quantidades

Tanto experimentalmente quanto por meio de simulações computacionais,

observa-se que a variação da concentração extracelular de K

causa grande alterações na

excitabilidade neuronal (XIONG e STRINGER, 2000; RODRIGUES, 2003; ALMEIDA

et al, 2004). O aumento da concentração extracelular de K

gera a despolarização das

membranas celulares neuronais. Com a despolarização da membrana neuronal, o

potencial transmembrânico aproxima-se do limiar de deflagração de potenciais de ação

e, conseqüentemente, o tecido torna-se mais excitável.

Sob o ponto de vista da comunicação interneuronal, pode-se dizer que a

liberação de K

por um neurônio, devido à ocorrência nele de um potencial de ação,

acarretará alteração local da concentração extracelular desse íon. Logo, a movimentação

de K

ao longo do meio extracelular afetará as membranas de outros neurônios,

causando sucessivas despolarizações. Assim, o íon K

pode funcionar como um

sinalizador ao longo do meio extracelular e a flutuação de sua concentração pode causar

despolarizações simultâneas em todos os neurônios de uma determinada área.

Carvalho (2003), demonstrou experimentalmente que o aumento da flutuação da

concentração extracelular de K

, principalmente pela redução do nível de atividade da

bomba de Na/K, ocasionada pelo aumento do consumo de energia pelo tecido, pode

levar à transição do estado de atividades epileptiformes para o de DA.

As variações das concentrações extracelulares de Ca

e Mg

modificam a

excitabilidade neuronal através da blindagem elétrica, onde cátions bivalentes atraídos

por cargas negativas na membrana neuronal tendem a aumentar o campo elétrico que

tem influência direta sobre os canais iônicos embebidos na membrana. A redução das

concentrações dos cátions bivalentes diminui a blindagem elétrica e diminui a atuação

do campo elétrico transmembrânico. Este efeito é semelhante à despolarização da

membrana. Por outro lado, o Ca

e o Mg

têm efeitos opostos sobre as transmissões sinápticas. As

A influência do íon Na

sobre a excitabilidade neuronal não é tão grande quanto a do íon K

, uma

alterações do potencial transmembrânico, que causam variação positiva abrupta

(despolarização) do potencial transmembrânico durante o potencial de ação. Os modelos

utilizados para o cálculo do potencial transmembrânico e, conseqüentemente, para a

reprodução de potenciais de ação, mostram que o potencial transmembrânico depende,

além de outras variáveis, da concentração extracelular de Na

(HODGKIN e HUXLEY,

1952; RODRIGUES, 2003). Apesar dessa dependência ser pequena no repouso, durante a oco

potenciais de ação, contribuem para a interação neuronal.

Para o caso do íon Cl

, uma prova de sua contribuição para a interação neuronal pode ser observ

alastrante. Variações das concentrações extra e intracelulares de Cl

mostram ter grande

influência sobre a excitabilidade neuronal.

No trabalho de Rodrigues (2003), observa-se que reduções na concentração

extracelular de Cl

geram aumento da excitabilidade neuronal e vice-versa. A Fig A.2

ilustra esse fenômeno levantado aqui por Rodrigues.

FIGURA 1.2- Flutuações iônicas. O neurônio na origem da seta deflagrou um potencial de

ação, liberando íons potássio, no exemplo. Os demais neurônios no campo de ação

tridimensional do neurônio despolarizado recebem os efeitos do aumento de [K

]

, num

gradiente decrescente a partir do centro de origem do estímulo, disparando também dentro da

esfera supraliminar de estímulo iônico. Apesar do exemplo utilizar o K

, qualquer íon vai se

comportar do mesmo modo exercendo sua influência hiper ou despolarizante nas células

vizinhas; quanto mais compacto o conjunto neuronal, maior a influência de cada neurônio por

indução de flutuações iônicas, favorecendo a hipersincronização.

A.3- Interações efápticas

Geralmente há uma confusão entre interação por efeito de campo elétrico e interação efáptica. O acoplam

(CARVALHO, 2003; RODRIGUES, 2003). Não se trata, absolutamente, deste caso.

As interações efápticas ocorrem entre neurônios cujas membranas estejam muito

próximas entre si, não estando porém em contato direto.

As primeiras observações desse tipo de interação neuronal foram em pares de

axônios não mielinizados de crustáceos colocados próximos e submersos em óleo

(JEFFERYS, 1995). Neste experimento, observou-se que as flutuações de correntes

extracelulares, promovidas por um neurônio, afetavam rapidamente a célula vizinha,

despolarizando-a e promovendo significativos efeitos sobre a excitabilidade dessa

célula.

Na figura a seguir , é exibido um exemplo desse tipo de interação neuronal

entre axônios gigantes de lula, conforme foi observado por Ramón e Moore (1978).

FIGURA A..3– Evidência experimental da transmissão efáptica em axônios gigantes de

lula próximos. Em A, um eletrodo foi colocado no meio extracelular entre os dois axônios

vizinhos e o outro eletrodo no meio intracelular de um dos axônios. Em B, os registros

foram obtidos a partir de dois eletrodos colocados nos meios intracelulares dos neurônios

banhados com água do mar. Finalmente, em C, são os registros captados por eletrodos

intracelulares dos dois axônios banhados com óleo mineral. A escala eqüivale a 5 mV para

o registro que mostra o efeito pós-efáptico na parte inferior de B (retirado de JEFFERYS,

1995).

Sob essas condições experimentais, o espaço extracelular encontra-se

amplamente restrito, o que implica num aumento da resistência extracelular e, portanto,

as correntes que fluem durante um potencial de ação produzem uma grande componente

extracelular (Vo),nesse caso, maior do que a variação do potencial intracelular (Vi).

Já quando os axônios são mergulhados em água de mar, muito mais condutora, o

potencial em um axônio induz um potencial pós-efáptico (traçado inferior) na célula

vizinha, de apenas 2 mV, no máximo.

Quando os axônios são banhados em óleo mineral, bastante isolante, o efeito é

aumentado devido ao grande potencial extracelular provocando uma despolarização

suficiente para gerar um potencial de ação na célula vizinha.

A superposição dos dois sinais mostra a rápida comunicação entre as células

(JEFFERYS, 1995).

A.4- Interação eletrotônicas (via gap-junctions)

As gap-junctions são macromoléculas de proteínas, chamadas conexinas que

formam canais de aproximadamente 1,5 nm de diâmetro que permitem a comunicação

direta entre os meios citoplasmáticos de duas células adjacentes, como pode ser visto na

FIG. 1.4. As gap-junctions ligam as membranas de duas células adjacentes mantendo-as

a uma distância de 3,5 nm, enquanto que numa sinapse química a distância entre as

membranas é de 30 a 50 nm. Dessa forma, quando ocorrem potenciais de ação em uma

célula, correntes fluem rapidamente através das gap-junctions e despolarizam a célula

vizinha. O acoplamento por gap-junctions ocorre entre regiões dos corpos celulares e,

principalmente, entre axônios. (JEFFERYS, 1995).

FIGURA A.4– Modelo de interação entre duas células diferente via gap-junctions. As bicamadas

lipídicas são penetradas por proteínas chamadas conexinas. Cada conexão é formada de anéis com seis

conexinas. As conexões dessas conexinas formam canais onde atravessam as substâncias entre os dois

meios citoplasmáticos. No detalhe, a estrutura de uma sub-unidade da macroproteína. (Imagem obtida de

www. NatureReviews_neuroscience.com)

As gap-junctions podem ser detectadas através da técnica de microscopia eletrônica conhecida como

experimentais quanto a modelagem computacional (RODRIGUES, 2003) têm mostrado

a importância da atuação das gap-junctions para a comunicação neuronal.

Carlen et al. (2000) fazem uma interessante revisão do papel das gap-junctions nas

crises epilépticas, no trabalho em referência, afirmando que essas conexões têm um

papel seminal para a geração de crises paroxísticas. Uma das razões para que o cérebro

imaturo seja mais tendente à epilepsia do que o encéfalo de adultos, segundo os autores,

poderia residir no fato de que há mais conexões eletrotônicas, por gap-junctions, no

primeiro do que no último.

Prosseguem Carlen et al. (2000) afirmando que o bursting por correntes

despolarizantes em CA1 só é observado em células conjuntamente coradas (pelo

amarelo de Lúcifer, por exemplo) e, portanto, unidas por gap-junctions. Além disso,

afirmam que o acoplamento eletrotônico também media as oscilações de alta freqüência,

em torno de 200 MHz, observadas in vitro no hipocampo.

Em trabalhos de seu próprio laboratório, Carlen e colaboradores (2000) demonstraram que em mo

junctions, como o uso de halotano ou octanol, também reduziam as AE induzidas por

exposição a meio livre de cálcio. Outra evidência fornecida pelos autores em pauta

prende-se à sobre-regulagem da expressão e função das proteínas formadoras de gap-

junctions na abstinência alcoólica, causa essa comum de crises epilépticas em

internações hospitalares.

Na conclusão de seu trabalho, Carlen e colaboradores (2000) relacionam algumas

evidências clínicas sugestivas do papel desempenhado pelas gap-junctions na gênese de

paroxismos epilépticos.

Sabe-se, por exemplo, que a manobra de hiperventilação é utilizada para provocar crises epilépticas

intracelular. De forma inversa, prosseguem, a eficácia da dieta cetogênica, utilizada para

o tratamento de epilepsias resistentes, pode bloquear a comunicação via gap-junctions,

por meio da acidose intracelular ou, talvez, por subprodutos químicos resultantes deste

tipo de dieta. De fato, relatam os autores, tem sido evidenciado que a presença dos

ácidos α−linoleico não esterificado e linoleico na dieta cetogênica funcionam como

agentes anticonvulsivantes em modelos animais de epilepsia e que esses ácidos inibem a

comunicação eletrotônica, via gap-junctions.

Apêndice B

ASPECTOS NEUROANATÔMICOS E NEUROFISIOLÓGICOS DO

HIPOCAMPO E ESTRUTURAS ASSOCIADAS

B.1- Planos de corte e posicionamento anatômico

Para maior clareza do jargão anatômico, traçaremos algumas considerações

preliminares, antes de entrarmos propriamente no conteúdo deste Apêndice.

Utilizam-se habitualmente três planos de corte anatômicos, quais sejam,

coronal, sagital e horizontal. A figura A.1 a seguir exemplifica tais cortes.

FIGURA B.1- Os três planos cardinais tipicamente utilizados nas secções para análise anatômica.

(Adaptado de Kandel, 2000)

No corte coronal as posições são as convencionais: direita, esquerda, superior e

inferior. Para a localização anatômica, nos cortes sagital e horizontal usam-se também

como ponto de reparo as posições rostral, mais próxima do nariz, e caudal, mais

próxima da nuca. No corte sagital pode-se fazer referência às posições superior e

inferior e, no corte horizontal às posições direita e esquerda. Em qualquer corte, refere-

se às posições mais próximas da região estudada como proximais e às mais distantes

como distais. Estudando-se o tórax, por exemplo, os dedos das mãos seriam mais

distais que os ombros, e estes mais proximais.

Outras notações, porém, são comumente utilizadas e deve-se prestar atenção ao

plano de corte que gerou a figura pois um mesmo termo pode denotar localizações

distintas, bem como há uma sinonímia que varia de acordo com o eixo considerado. As

próximas figuras deverão melhor esclarecer esse ponto.

FIGURA B.2 - Eixos látero-lateral e dorso-ventral, exibindo cortes coronal, em B1 e horizontal, em B2.

Observe que a direção dorsal também é conhecida como posterior e que a ventral também é chamada de

anterior. Utilizou-se um cérebro de roedor para o esquema. (modificado de Kandel, 2000)

FIGURA B.3- Eixos rostral-caudal e dorso-ventral em roedores e outros mamíferos

inferiores. Em mamíferos inferiores a orientação dos eixos rostro-caudal (em

direção ao nariz e à cauda, respectivamente) é mantida na vida adulta, diversamente

dos primatas superiores, como veremos na próxima figura. (Adaptado de Kandel,

2000)

FIGURA B .4- Em humanos e outros primatas superiores, o eixo longitudinal flete-se na topografia do

tronco cerebral em torno de 110

. Em virtude dessa inflexão, os termos posicionais são usados de uma

maneira levemente diferente, dependendo de estar a parte do SNC em questão acima ou abaixo da

inflexão ( do tronco cerebral, portanto). Abaixo do tronco cerebral, na medula espinhal, rostral significa

em direção à cabeça; caudal, em direção ao cóccix; ventral, em direção ao abdomen, ou ventre; e dorsal,

naturalmente, em direção ao dorso. Acima da inflexão, porém, rostral significa em direção ao nariz e

caudal em direção à nuca; ventral, em direção ao maxilar e dorsal em direção ao topo da cabeça. O termo

superior é freqüentemente usado como sinônimo de dorsal e inferior significando o mesmo que ventral.

(Adaptado de Kandel, 2000)

B.2- Aspectos neuroanatômicos do hipocampo e outras regiões de interesse

B.2.1- O sistema límbico

O termo sistema límbico é derivado da palavra latina limbus (limbo, em

português), significando uma fronteira, e foi introduzido por Pierre Paul Broca para

descrever o giro de anéis que circundam o tronco cerebral (GREENSTEIN e

GREENSTEIN, 2000). James Papez (PAPEZ, 1937 apud GREENSTEIN e

GREENSTEIN, 2000) descreveu um circuito

que ele sugeriu formar um sítio anatômico para a emoção, consistindo do hipotálamo,

corpos mamilares, núcleo talâmico anterior, giro cingulado e formação hipocampal.

Segundo Greenstein e Greenstein (2000) a proposta básica de Papez (1937)

ainda mantém-se, embora o circuito haja sido estendido para incluir outras estruturas.

Hoje, além

das estruturas enumeradas por Papez, o sistema límbico inclui a área septal, o núcleo

acumbens,e áreas neocorticais incluindo amígdala e córtex órbito-frontal.

As estruturas límbicas são filogeneticamente muito antigas e a formação

hipocampal inclui uma forma primitiva de córtex subjacente ao neocórtex,

evolucionalmente mais novo (GREENSTEIN e GREENSTEIN, 2000).

Também Kandel (2000), citando Papez, Broca e Paul MacLean, considera o

sistema límbico como apoiado pelas estruturas acima enumeradas. Kandel afirma que

estudos anatômicos modernos demonstraram a existência de conexões diretas extensas

entre áreas neocorticais, a formação hipocampal e a amígdala. Kandel afirma ainda que

Papez estava correto ao atribuir importante papel ao córtex cingulado e giro

parahipocampal na percepção da emoção e sentimentos estando, contudo, este último

enganado quanto ao papel coordenador do hipotálamo, que Papez acreditava ser

desempenhado pelo hipocampo quando, de fato, é a amígdala que exerce esta função. A

FIG. B.5, a seguir, ilustra, de forma esquemática o sistema límbico e suas estruturas

anatômicas.

FIGURA B.5- Visão esquemática do sistema límbico. (Reproduzida de Kandel, 2000)

B.2.2-Aspectos anatômicos do hipocampo.

Finalmente, no presente tópico descreveremos, a partir de Greenstein e

Greenstein (2000), a estrutura do lobo límbico que nos interessa mais de perto em nosso

trabalho: o hipocampo. A formação hipocampal é constituída pelo hipocampo

propriamente dito e regiões temporais vizinhas, o giro denteado e o subículo. O subículo

está localizado no giro parahipocampal. Ademais, a região hipocampal inclui a área

entorrinal e o giro parahipocampal.

Traub e Miles, no livro "Neuronal networks of the hippocampus" (1996) dizem

que o hipocampo é anatomicamente o tipo mais simples de córtex, com os corpos

celulares dos principais neurônios alinhados em uma camada única, tendo esse fato

interesse para a

experimentação fisiológica nessa estrutura. Ressaltam também os autores que, em

roedores, o hipocampo toma grande parte do cérebro.

Retornando a Greenstein e Greenstein (2000), o hipocampo é reconhecido

anatomicamente como uma protuberância medial no corno temporal do ventrículo

lateral. Esta protuberância é causada pela invaginação da parede ventricular e que

resulta de uma dobra chamada fissura hipocampal.

O giro denteado é uma faixa estreita ao longo do aspecto medial do hipocampo.

O GDH e o hipocampo propriamente dito compõem uma parte do alocórtex, o qual tem

uma estrutura laminar similar à do neocórtex, embora com menos camadas e um tanto

mais simples do que este último. O alocórtex é filogeneticamente mais antigo que o

neocórtex mas, ainda assim, tem uma estrutura altamente complexa.

O hipocampo possui uma camada claramente definida de grandes células

piramidais, as quais se comunicam extensivamente através de interneurônios

GABAérgicos conhecidos como células em cesto (basket cells). As células piramidais

comunicam-se com camadas acima e abaixo da camada piramidal através de numerosos

e extensos processos axonais e dendríticos.

O hipocampo costuma ser dividido em três áreas denominadas CA1, CA2 e CA3

( CA , de Corno de Amon), por sua vez divididas em sub-áreas. O giro denteado

consiste principalmente de neurônios menores, denominados células granulares, as

quais estabelecem sinapses com os dendritos das células piramidais. Os axônios das

células granulares são conhecidos como fibras musgosas (mossy fibers) e terminam

principalmente nos dendritos apicais das células piramidais de CA3. As células de CA3,

por sua vez, projetam as colaterais de Schaeffer para os dendritos apicais de CA. De

CA1 parte um dominante input aferente para o subículo e daí para a área entorrinal.

A principal aferência para o hipocampo provém da área entorrinal do giro

hipocampal e há um input menor do núcleo septal. O caminho da área entorrinal para o

hipocampo é denominado via perfurante e possui três interrupções sinápticas en route

para o hipocampo, onde muitos axônios terminam no giro denteado.

O hipocampo projeta fibras eferentes principalmente para a área entorrinal, o

subículo e o núcleo septal. Dessa forma, o hipocampo atua diretamente principalmente

nas áreas vizinhas, entretanto pode influenciar indiretamente regiões mais distantes, tais

como o hipotálamo, corpos mamilares e neocórtex, particularmente o giro cingulado,

através de conexões do hipocampo com o subículo e área entorrinal.

O hipocampo é uma estrutura bilobada onde os dois lados comunicam-se através

das fibras comissurais. A via que constitui o circuito hipocampo-área entorrinal-

hipocampo é toda excitatória.

As figuras, a seguir, dão uma idéia mais aproximada da situação anatômica do

hipocampo.

FIGURA B.6 - A formação hipocampal (modificado de Greenstein e Greenstein, 2000)

FIGURA B.7 - A formação hipocampal (modificado de Greenstein e Greenstein, 2000)

B.3-Aspectos eletrofisiológicos do hipocampo.

B.3.1- Registros de eletroencefalografia e a sincronização no hipocampo.

Segundo Traub e Miles (1996), os comportamentos populacionais mais óbvios

em neurônios, envolvem a sincronização de disparos neuronais. Prosseguem os autores,

destacando que tais atividades síncronas incluem ondas rítmicas de EEG, ondas agudas

(sharp waves) e outros transientes de eletroencefalografia, tanto normais quanto

patológicos, como crises paroxísticas.

Traub e Miles (1996) enfatizam que a observação de todos os constituintes de uma

população neuronal de tamanho suficientemente grande é, na prática, impossível,

restando-nos a simulação computacional para um estudo dessa abrangência. De forma

similar, prosseguem os autores, é muito difícil registrar o comportamento individual de

um grupo celular neuronal disparando em sincronia.

Mais das vezes, pontuam Traub e Miles (1996), o que de fato se mede é um

reflexo da atividade neuronal, suposto como representativo do comportamento

eletrofisiológico não diretamente observado. A maioria dos estudos in vivo, dizem eles,

constituem-se de:

a) registros do potencial no espaço extracelular entre neurônios; e

b) o potencial registrado a uma certa distância da substância cerebral, como o

EEG standard, por exemplo.

Claramente, prosseguem os autores, os sinais medidos pelo EEG não definem

precisamente as atividades neuronais, mas sim provêem "um conjunto de limitantes para

o que os neurônios possam estar fazendo". Correntes extracelulares produzidas pelo

somatório das correntes sinápticas, constituem a principal fonte de sinais para o EEG,

exceto, porém, para freqüências muito baixas, estas produzidas por câmbios no meio

extracelular , os quais são induzidos pela atividade celular (MNS, acrescentaríamos

nós).

Segundo Traub e Miles (1996), os padrões de EEG mais freqüentemente citados

são:

a) ondas teta ( ritmo igual ou menor que 4Hz);

b) atividade lenta rítmica;

c) pontas-onda; e

d) atividades ictais ou paroxísticas.

Dois mecanismos gerais foram aventados por esses autores para o

comportamento neuronal coletivo observado no EEG. O primeiro admitiria um

comportamento neuronal coletivo, correspondente ao registro eletroencefalográfico,

ocorrendo numa estrutura de entrada de sinais, possivelmente um ou mais núcleos

subcorticais; o segundo mecanismo, por outro lado, poderia explicar-se por algum

comportamento autonômico coletivo observado naquela estrutura, a partir de um

determinado "ajuste geral de parâmetros" gerado pelo organismo. A nosso ver, fala-se

aqui de MNS.

Traub e Miles (1996) discorrem sobre a importância dos experimentos in vitro

de forma a isolar, nas fatias da preparação, os estímulos de entrada de outras estruturas,

permitindo ainda a manipulação da composição do meio.

Registro aqui esse comentário apenas para reafirmar que experimentos in vivo

não afastam a necessidade de experimentos in vitro, ambos os modos são necessários e

complementares. Retomo também o comentário de Traub e Miles, feito no início deste

tópico, apontando a utilidade de modelos computacionais, fechando a tríade in vitro, in

vivo e "in silicon".

B.3.2- A organização da circuitaria hipocampal e o fluxo processual de

informações

Amaral e Menno (2004), estabelecem que a informação proveniente de fontes

corticais constituem o substrato dominante através do qual a formação hipocampal

desempenha suas funções mnêmicas e cognitivas. O hipocampo está, assim,

profundamente ligado, do ponto de vista anátomo-funcional, ao córtex cerebral e,

acreditamos nós, lesões corticais que venham a exibir manifestações de

hipersincronização devem afetar o hipocampo de alguma forma.

Já as aferências subcorticais, ainda de acordo com os autores acima citados, são

consideradas modulatórias e podem refletir, de uma maneira bem geral, o estado

comportamental do organismo. Lopes da Silva (1990, Apud AMARAL e MENNO,

2004), crê que as projeções de retorno hipocampais para o sub-córtex provejam

feedback sobre a atividade hipocampal, em marcha, para os sistemas modulatórios. Isto

não é menos importante, cremos, para avaliar o papel do hipocampo na geração e

manutenção de atividades epileptiformes generalizadas a partir de um foco inicial.

Amaral e Menno (2004) enfatizam que, desde os anos 70, considera-se o

conceito lamelar na organização das estruturas hipocampais como base para os dados

neuroanatômicos e eletrofisiológicos obtidos, acatando a sugestão de que todos os

principais caminhos excitatórios hipocampais estejam orientados perpendicularmente ao

longo do maior eixo dessa estrutura, com pouca ou nenhuma disseminação septo-

temoral.

Muitas das conexões hipocampais intrínsecas, entretanto, são amplamente

distribuídas tanto ao longo do eixo transverso quanto ao longo do eixo septo-temporal.

Assim, de acordo com Amaral e Menno (2004), uma visão mais consistente com a

neuroanatomia conhecida é a de que o hipocampo disponha de uma série de

interconexões tridimensionais formando várias redes anatomo-funcionais, com regras

de conectividade próprias para cada uma dessas redes. Vê-se aqui, novamente, espaço

para o surgimento de comportamento emergente e cáos.

Parece que a projeção do giro denteado para CA3 esteja organizada de uma

maneira lamelar; as projeções CA3 para CA1, entretanto, estão organizadas como

gradientes, enquanto a projeção de CA1 para o subículo está organizada de uma forma

colunar.

Bernard e Wheal, citados por Amaral e Menno (BERNARD e WHEAL, 1994,

Apud AMARAL e MENNO, 2004) registram, por outro lado, que simulações

computacionais e dados eletrofisiológicos mais sofisticados indicam o funcionamento,

pelo menos em parte, da rede hipocampal de uma forma lamelar. Seria assunto para

todo um capítulo (pelo menos) discutirmos os conceitos de processamento

serial/paralelo e circuitaria tri-sináptica,

entre outros, que freqüentam a literatura especializada em nossos dias, mas permanece-

nos uma certeza : ainda há muito o que se pesquisar sobre a anatomofisiologia

hipocampal.

Anexo

dos dados eletrofisiológicos

C.1- Código fonte.

%DCscan v.9.0

%Este script, analisa registros eletrofisiológicos em amostra

adquirida %

%via LabView, utilizando Transformadas de Fourier e suas inversas.

%O programa solicita se o usuário quer ou não analisar outros bursts

%no trecho atual, analisar outro trecho do mesmo experimento ou

realizar %

% análise de outro experimento. Depois, a figura é salva como arquivo

%com o formato geral DDMMAANoXBurstY,onde X é o numero do arquivo e Y

%o numero sequencial do burst, no arquivo. Escolhas por menu nesta

%versão.

%Ao mudar de arquivo, o programa exibe na tela as médias de intervalos

%entre eventos,DCs e Des. Adaptado de pgms originais de autoria de

%Rodrigues,A.M./LANEC. Outubro/2008.Vetores paramétricos são gerados

como %

%comentado nas mensagens abaixo.

%Compilações,Modificações, Correções, Acréscimos, Comentários por:

%************ Valerio,J.C.M./LANEC *****************************

%************ [email protected]

**********************************%

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%%%

msg='Este programa gera automaticamente vetores de 5 parâmetros

(DC,DE,IE,PS e PM),';

msg1='com o formato dctemp/pstemp/detemp/ietemp/pmtemp. Para salvar,

ao final atribua';

msg2='imediatamente os vetores às variáveis de sua escolha (exemplo:

dc_hip=dctemp) e';

msg3='salve com o nome escolhido (exemplo:"save dc_hip") , após

encerrar o programa.';

clc;

disp (msg);disp(msg1);disp(msg2);disp(msg3);

pause(5)

disp(' '); disp(' ');

msg='ATENÇÃO: Para analisar o Intervalo Entre Eventos (IE) é

necessário';

msg1='avaliar bursts SEQUENCIALMENTE a partir do segundo no arquivo!';

disp (msg); disp (msg1);

pause(5);

clear all;close all;clc;

session_flag=0;

Mdc=0;Mde=0;Mie=0;Mps=0;

px1=zeros(1,20);px2=zeros(1,20);

dc=0;de=0;ps=0;ie=0;

upacifier=('Aguarde,os ultimos bursts demandam mais tempo para

análise...');

dctemp=[ ];pstemp=[ ];detemp=[ ];ietemp=[ ];pmtemp=[ ];

salvar=menu('Deseja salvar os arquivos gráficos ? ','Sim', 'Não');

if salvar == 1

forma=menu('Clique em sua escolha de arquivo

gráfico:','bitmap','jpeg','emf','tiff','png','pcx','adobe','eps(gray)'

);

switch forma

case 1

ext=('-dbmp');

case 2

ext=('-djpeg');

case 3

ext=('-dmeta');

case 4

ext=('-dtiff');

case 5

ext=('-dpng');

case 6

ext=('-dpcx25b');

case 7

ext=('-dill');

case 8

ext=('-deps2');

otherwise

disp('Clique na opcão..')

end

dot=menu('Clique na resolucão desejada em

dpi:','75','100','150'

,'200','300');

switch dot

case 1

res=('75');

case 2

res=('100');

case 3

res=('150');

case 4

res=('200');

case 5

res=('300');

end

dots= (['-r',res]);

end

tela=menu('Deseja eco de parâmetros na tela?','Sim','Não');

Session=1;

bcounter=0;

while Session==1;

data=input ('Data do experimento (DDMMAA) ', 's');

ini=input('Arquivo inicial:');

fim=input('Arquivo final: ');

numfiles=(fim-ini)+1;

prefix=data;

prefix=[prefix, 'No'];

MDC=zeros(1,numfiles);MDE=zeros(1,numfiles);MPS=zeros(1,numfiles);MIE=

zeros(1,numfiles);

mdc=zeros(1,14);mde=zeros(1,14);mps=zeros(1,14);mie=zeros(1,15);

for fcounter=ini:fim

numero=num2str(fcounter);

close all;

arquivo=strcat(prefix, numero);

arquivo=[arquivo '.sgl'];

taxa=10000;

vie=zeros(1,20);

vps=zeros(1,20);

vdc=zeros(1,20);

vde=zeros(1,20);

mdci=zeros(1,numfiles);mpsi=mdci;mdei=mdci;miei=mdci;

Bursts=1;

bfile=0;

mie=0;mdc=0;mps=0;mde=0;

while Bursts==1%

fid=fopen(arquivo,'r','ieee-be');

y=fread(fid,'float');

fclose(fid);

t=0:1/taxa:(length(y)-1)/taxa;

figure(1),h1=subplot(2,1,1);plot(t,y,'k','linewidth',0.7);grid on;

title(['ESCOLHA O BURST arq.:'

arquivo],'fontsize',14,'fontweight','bold','color','r');

ylabel( 'Amplitude (mV)','fontsize',12,'fontweight','bold');axis

tight;

box off;set(h1,'linewidth',1.5,'fontsize',12,'fontweight','bold');

t_final_arquivo=t(length(t));

[X]=ginput(2);

disp('Aguarde...')

bfile=bfile+1;

fnames=['C:\DCscan\', data,'\',data ,'F', num2str(numero) ,'Burst'

num2str(bfile)];

bcounter=bcounter+1;

x_inicial=round(X(1));

x_final=round(X(2));

px1(bfile)=x_inicial;

px2(bfile)=x_final;

x_minus=x_inicial-(taxa/2);

hold on;

Xplot=(x_inicial:x_final);

plot (Xplot,0,'r','LineWidth',4);hold on;

title(['Burst analisado Potencial extracelular arq.:'

arquivo],

'fontsize',14,'fontweight','bold','color','k');

ylabel( 'Amplitude (mV)','fontsize',12,'fontweight','bold');axis

tight;

box off;set(h1,'linewidth',1.5,'fontsize',12,'fontweight','bold');

y1=y(x_inicial*taxa:x_final*taxa,1);

t1=t(1,x_inicial*taxa:x_final*taxa);

clear y t;

y=y1; clear y1;

t=t1; clear t1;

npontos=length(t);

if(npontos/2~=fix(npontos/2))

y1=y(1:npontos-1);clear y

t1=t(1:npontos-1);clear t

y=y1;clear y1;

t=t1;clear t1;

npontos=length(y);

end

n=npontos;

F2=(0:fix(n/2)-1)./n*taxa;

F=[-F2 F2];

Y=fft(y);

Y_fft=abs(Y(1:fix(n/2)))/n;

Y1=Y;

Y1abs=abs(Y);

fcorte=10;%fcorte=input('Qual a frequencia de corte em Hz?');

p_corte=abs(fix(fcorte*n/taxa));

ZERO=ones(p_corte,1);

UM=zeros(length(F)/2-p_corte,1);

Degrau=[UM;ZERO]';

Degrau1=[ZERO;UM]';

Degrau=[Degrau1 Degrau]';

Y_dc=Y1.*Degrau;

y_dc=ifft(Y_dc);

t1=t;

y_dc=real(y_dc);

figure(1),h2=subplot(2,1,2);

axis equal; axis square;

plot(t1,y,'b',t1,y_dc,'r');hold on;

ylabel('V (mV)');xlabel('t (s)');

y_spike=y-y_dc;

y_sp_mod=abs(y_spike);

pm=max(y_sp_mod);

pmtemp=[pmtemp,pm];

if bfile>3

disp (upacifier);

end

taux=find(t1>=x_minus & t1<=x_inicial);

if bfile>1

ie=px1(bfile)-px2(bfile-1);

mie=mie+ie;

ietemp=[ietemp,ie];

elseif bcounter>1

ie=round(mean(ietemp));

if session_flag==1

ie=0;

session_flag=0;

end

ietemp=[ietemp,ie];

else ie=0;

ietemp=[ietemp,ie];

end

yaux=(y_dc(taux));

lb=zeros(1,length(y_dc));

lb(:)=mean(yaux);

plot(t1,lb,'b','linewidth',2);hold on;

dc=abs(min(min(real(y_dc))-mean(yaux)));

ti_min=find(y_dc==min(min((y_dc))));

delta_y_dc=abs((y_dc-mean(yaux)));

ti=find(delta_y_dc>=0.195*dc & delta_y_dc<=0.22*dc);

tinic=t1(ti(1));

ti_fim=find(ti>ti_min);

ti_fim1=ti(ti_fim(1));

tfim=t1(ti_fim1);

de = (tfim-tinic);detemp=[detemp,de];

txi1=find(t1==tinic);

txi2=find(t1==tfim );

y_sp_mod1=y_sp_mod(txi1:txi2);

tx=t1(txi1:txi2);

ps=trapz(tx,y_sp_mod1)/de;

dc=dc*(-1);dctemp=[dctemp,dc];

if tela ==1

disp(['DC = ' num2str(dc) ' mV']);

disp(['DE = ' num2str(de) ' s']);

disp(['PS = ' num2str(ps) ' mV']);

disp(['PM = ' num2str(pm) ' mV']);

disp(['Instante inicial do burst= ' num2str(tinic) ' s']);

disp(['Instante final do burst= ' num2str(tfim) ' s']);

disp(['Instante final do arquivo = ' num2str(t_final_arquivo)]);

end

DCs=['DC = ' num2str(dc) ' mV'];

DEs=['DE = ' num2str(de) ' s'];

PSs=['PS = ' num2str(ps) ' mV'];

T=['Linha de base Burst# ',num2str(bfile),' inicio/fim = ',

num2str(tinic),'/ ',num2str(tfim) 's'];

subplot (2,1,2);

title (T);

xlabel([' IEE= ',num2str(ie) 's PSMax= ',num2str(pm) ' mV Total

bursts analisados: ', num2str(bcounter)]);

legend(DCs,DEs,PSs, 'Location','BestOutside');

hold off;

if salvar==1

print(ext,dots,fnames);

end

disp(' ')

Bursts=menu('CONTINUAR A ESCOLHER NESTE TRECHO?','Sim','Não');

if Bursts==1

subplot(2,1,1),plot(Xplot,0,'g','LineWidth',4);

else close(1);

end

if tela ==1

disp(' ')

disp (['Neste arquivo ( ',data,'Arquivo#',num2str(fcounter),') :']

)

disp(['Intervalo medio entre eventos=

',num2str(round(mean(ietemp))),' s'])

disp(['DC medio= ',num2str(mdc), ' mV'])

disp(['Duracao media dos eventos= ',num2str(mde),' s'])

end

Session=menu('Escolher outra sessao de experimento?','Sim','Não');

session_flag=1;

%Means after session

mdc=mean(dctemp);ldc=length(dctemp);

mde=mean(detemp);lde=length(detemp);

mie=mean(ietemp);lie=length(ietemp);

mps=mean(pstemp);lps=length(pstemp);

mpm=mean(pmtemp);lpm=length(pmtemp);

l=[ldc,lde,lps,lpm,lie];

lMax=max(l);

ParamLenMax=lMax;

retamdc=zeros(1,ldc);vectordc=retamdc;

retamde=zeros(1,lde);vectorde=retamde;

retamps=zeros(1,lps);vectorps=retamps;

retamie=zeros(1,lie);vectorie=retamie;

retampm=zeros(1,lpm);vecrorpm=retampm;

for n=1:ParamLenMax

retamdc(1:ldc)=mdc;

retamde(1:lde)=mde;

retamps(1:lps)=mps;

retampm(1:lpm)=mpm;

retamie(1:lie)=mie;

vectordc=(1:ldc);

vectorde=(1:lde);

vectorps=(1:lps);

vectorpm=(1:lpm);

vectorie=(1:lie);

%graphs

figure(1);

box off;

subplot(2,2,1);

plot(vectordc,retamdc, 'LineStyle',':'),title([data,' DC medio: ',

num2str(mdc)]),xlabel('Bursts'),ylabel('mV');

hold on;

plot(vectordc,dctemp,'Marker','o','MarkerSize',3,'MarkerFaceColor','r'

);

subplot(2,2,2);

plot(vectorps,retamps,'LineStyle',':'),title(['PS medio: ',

num2str(mps),'

Arq:',num2str(fcounter)]),xlabel('Bursts'),ylabel('mV');

hold on;

plot(vectorps,pstemp,'Marker','o','MarkerSize',3,'MarkerFaceColor','r'

);

hold off;

subplot(2,2,3);

plot(vectorde,retamde,'LineStyle',':'),title(['DE medio: ',

num2str(mde)]),xlabel('Bursts'),ylabel('t(s)');

hold on;

plot(vectorde,detemp,'Marker','o','MarkerSize',3,'MarkerFaceColor','r'

);

hold off;

subplot(2,2,4);

plot(vectorie,retamie,'LineStyle',

':'),title(['IEE medio:

',num2str(mie)]),xlabel('Bursts'),ylabel('t(s)');

hold on;

plot(vectorie,ietemp,'Marker','o','MarkerSize',3,'MarkerFaceColor','r'

);

hold off;

if salvar==1

fnames=['C:\DCscan\',data,'\Medias\Locais',num2str(fcounter)];

print(ext,dots,fnames);

end

if tela==1

disp (['Total de bursts analisados =',num2str(bcounter)])

end

C.2-Exemplo de telas (snapshots) gráficas do aplicativo.

FIGURA B.1- Snapshot da tela de seleção do burst a ser analisado.

FIGURA C.2- Snapshot da tela após análise do burst escolhido.

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