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Universidade de Brasília
Pós-Graduação em Biologia Molecular
Análise da variabilidade genética, filogenia e expressão gênica
de HPV de alto risco no Distrito Federal
Tainá Raiol Alencar
Brasília
2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Universidade de Brasília
Pós-Graduação em Biologia Molecular
Análise da variabilidade genética, filogenia e expressão gênica
de HPV de alto risco no Distrito Federal
Tese apresentada ao Departamento de Biologia Celular do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília,
como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em
Biologia Molecular.
Tainá Raiol Alencar
Orientadora
Dra. Laura Sichero
Profª Dra. Cláudia Renata Fernandes Martins (in memoriam)
Brasília
2009
ads:
Universidade de Brasília
Pós-Graduação em Biologia Molecular
Análise da variabilidade genética, filogenia e expressão gênica
de HPV de alto risco no Distrito Federal
Banca Examinadora
Profª Dra. Paula Rahal – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
(UNESP) - São José do Rio Preto, SP
Profª Dra. Ildinete Silva Pereira– Universidade de Brasília
Profª Dra. Andréa Queiroz Maranhão – Universidade de Brasília
Profª Dra. Cynthia Kyaw – Universidade de Brasília
Prof° Dr. Marcelo de Macedo Brígido – Universidade de Brasília (suplente)
Brasília
2009
“Se enxerguei um pouco mais longe, foi por
estar sobre ombros de gigantes.”
Isaac Newton
À minha mãe, que me formou como sou e por
isso é parte de cada conquista minha.
Ao Júnior, que incansavelmente me estimula a
seguir em frente apesar dos obstáculos.
À Claudia Renata, pessoa e profissional
batalhadora com quem tanto aprendi.
Às vítimas do HPV, que anonimamente
tornaram possível este trabalho.
Agradecimentos
À minha mãe Sueli Raiol, aos meus irmãos Taiguara e Tunai, meu pai Celmo
Alencar, minha cunhada Michele Oliveira e meus sobrinhos Isabel e Samuel pelo
carinho, compreensão, apoio e incentivo constantes.
Ao meu namorado e amigo Josenilto Júnior, pela participação e incentivo em todas as
minhas realizações.
À Profª Cláudia Renata Fernandes Martins, pela amizade, confiança e apoio em
todas as etapas da minha formação profissional. Pelo exemplo de vida que foi para
todos aqueles que tiveram o privilégio de conviver e trabalhar ao seu lado.
À Dra. Laura Sichero, pela amizade, por ter me permitido ser sua orientanda e me
apoiado no momento mais difícil do desenvolvimento deste trabalho. Pela contribuição
inestimável para o meu aprimoramento técnico e por ter me ajudado a enfrentar a vida
em São Paulo.
À Dra. Luisa Villa, pelo apoio, exemplo de profissionalismo, compreensão e
colaboração indispensável na execução deste trabalho.
À amiga Regina Amorim, por ter participado ativamente do desenvolvimento deste
trabalho e pelo companheirismo e incentivo. Por ter sido minha parceira na luta para
continuar e concluir os últimos projetos de pesquisa iniciados pela Profª Cláudia
Martins.
Às amigas Patrícia Wyant, Daniela Cerqueira e Natália Milanezi do grupo de
pesquisa em virologia da UnB, por participarem desse estudo, ajudando-me em todas as
etapas e tornando-se indispensáveis para a obtenção dos resultados aqui apresentados.
Aos amigos Claudiner Oliveira, Daniella Moraes, Eduardo Ramalho, Márcio
Rojas, Verônica Salles, do grupo de pesquisa em virologia da Universidade de Brasília,
pela amizade e colaboração na execução deste trabalho.
Ao grupo de Virologia do Instituto Ludwig de pesquisa sobre o câncer, especialmente a
Aline Bolpetti, Ana Paula Lepique, Carina Manzini, Enrique Boccardo, João
Sobrinho, José Carlos Prado, Lara Termini, Laura Cardeal, Maria Antonieta
Andreoli, Maria Cecilia Costa, Maria Stella Hering, Neide Ferreira, Tatiana
Rabachini e Zanith Cook, por terem me acolhido e colaborado com a execução deste
trabalho.
Ao Pedro Galante do Grupo de Bioinformática do Instituto Ludwig pela colaboração
indispensável na realização das análises estatísticas deste estudo.
À Profª Mariza Ferreira, Profº Marcelo Brígido, Profª Sônia Báo, Dr. José Paulo
Leite e Geni Nocetti pela disponibilidade e apoio essenciais ao desenvolvimento deste
trabalho.
Aos técnicos Evânia, Léa, Isabel e Maria Cristina do Instituto Ludwig e César,
Marivaldo, Arenildo e Francisca do laboratório de Fitopatologia da UnB, pela
importante e freqüente colaboração.
Aos membros da Banca Examinadora, pela participação e auxílio na consolidação
deste estudo.
Ao Marcos, Camila, Luciana e Mário, pela inestimável colaboração no
seqüenciamento automático realizado no Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade de Brasília e na plataforma de sequenciamento da EMBRAPA.
À Ana e Sandra, funcionárias da Secretaria do Departamento de Biologia Celular, por
me atender sempre com respeito e eficiência.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular.
Ao CNPq e Programa Nacional de AIDS/DST pelo apoio financeiro.
Aos meus familiares e amigos pelo constante companheirismo, aprendizado e carinho.
I
Sumário
RESUMO __________________________________________________________________________ 10
ABSTRACT ________________________________________________________________________ 11
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________ 12
LISTA DE TABELAS ________________________________________________________________ 14
LISTA DE SIGLAS E DE ABREVIATURAS_____________________________________________ 15
1.
I
NTRODUÇÃO
___________________________________________________________ 17
2.
R
EVISÃO
B
IBLIOGRÁFICA
_________________________________________________ 18
2.1.
E
STRUTURA DA PARTÍCULA VIRAL E ORGANIZAÇÃO DO GENOMA
_________________ 18
2.2.
T
AXONOMIA DOS
HPV___________________________________________________ 19
2.3.
A
S PROTEÍNAS VIRAIS E O CICLO DE INFECÇÃO VIRAL
___________________________ 21
2.3.2. A replicação viral ________________________________________________ 23
2.3.3. A transformação celular ___________________________________________ 23
2.3.4. A montagem viral e liberação das partículas ___________________________ 27
2.4.
A
REGIÃO REGULADORA
(LCR)____________________________________________ 28
2.4.1. Fatores de transcrição envolvidos na transcrição viral ____________________ 29
2.5.
O
CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
____________________________________________ 31
2.5.1. Co-fatores no desenvolvimento do câncer cervical ______________________ 34
2.5.2. Prevenção ______________________________________________________ 35
2.5.3. Vacinas contra o câncer cervical_____________________________________ 35
2.6.
E
PIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO POR
HPV_____________________________________ 36
2.7.
E
STUDOS DA VARIABILIDADE GENÉTICA
_____________________________________ 40
2.8.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA E POTENCIAL ONCOGÊNICO
_________________________ 47
3.
J
USTIFICATIVA E
O
BJETIVOS
______________________________________________ 49
4.
M
ATERIAL E
M
ÉTODOS
___________________________________________________ 51
4.1.
P
ROCEDÊNCIA DAS AMOSTRAS
____________________________________________ 51
4.2.
A
MPLIFICAÇÃO DO
DNA
V
IRAL
___________________________________________ 51
4.3.
C
LONAGEM DOS PRODUTOS DE
PCR ________________________________________52
4.3.1. Obtenção dos plasmídios recombinantes ______________________________ 52
4.3.2. Transformação de bactérias E. coli___________________________________ 53
4.4.
S
EQUENCIAMENTO DE
DNA ______________________________________________ 54
4.5.
A
NÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE
DNA
OBTIDAS
_________________________________ 54
4.6.
P
REDIÇÃO DE SÍTIOS DE LIGAÇÃO PARA FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR ________ 55
4.7.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA
__________________________________________________ 55
4.8.
A
NÁLISE DA ATIVIDADE TRANSCRICIONAL DO PROMOTOR DE
E6/E7
DE VARIANTES DE
HPV-58 ___________________________________________________________________ 56
4.8.1. Amplificação da LCR_____________________________________________ 56
4.8.2. Digestão dos produtos de PCR obtidos________________________________ 57
4.8.3. Ligação dos produtos de PCR ao vetor pGL3-Basic _____________________ 57
4.8.4. Transformação e obtenção dos plasmídios recombinantes_________________ 58
4.8.5. Mutagênese Sítio-Dirigida _________________________________________ 58
4.8.6. Sequenciamento dos plasmídios_____________________________________ 59
4.8.7. Isolamento do DNA dos vetores recombinantes em larga escala (Maxi-
preparação) __________________________________________________________ 60
II
4.8.8. Purificação do DNA extraído por gradiente de densidade _________________61
4.8.9. Cultura celular da linhagem C33 ____________________________________ 62
4.8.10. Transfecção da linhagem celular C33________________________________ 62
4.8.11. Ensaio de Luciferase e β-Galactosidase ______________________________ 63
4.8.12. Análise estatística _______________________________________________ 63
5.
R
ESULTADOS
___________________________________________________________ 65
5.1.
C
ARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
_________________________________________ 65
5.2.
P
REDIÇÃO DE SÍTIOS DE LIGAÇÃO PARA FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR ________ 66
5.3.
HPV-31 ______________________________________________________________ 72
5.4.
HPV-33 ______________________________________________________________ 75
5.5.
HPV-35 ______________________________________________________________ 78
5.6.
HPV-52 ______________________________________________________________ 81
5.7.
HPV-58 ______________________________________________________________ 85
5.8.
A
NÁLISE DAS DISTÂNCIAS GENÉTICAS INTRATÍPICAS
___________________________ 88
5.9.
A
NÁLISE DA EXPRESSÃO DO PROMOTOR DE
E6/E7
DE VARIANTES DE
HPV-58 _______ 89
6.
D
ISCUSSÃO
_____________________________________________________________ 93
6.1.
A
NÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE VARIANTES DE
HPV-31,
-33,
-35,
-52
E
-58. 93
6.2.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA DOS
HPV-31,
-33,
-35,
-52
E
-58. _______________________ 97
6.3.
A
NÁLISE DA ATIVIDADE TRANSCRICIONAL DO PROMOTOR DE
E6/E7
DE VARIANTES DE
HPV-58. ___________________________________________________________________ 99
7.
C
ONCLUSÕES
__________________________________________________________ 104
8.
B
IBLIOGRAFIA
_________________________________________________________ 105
ANEXO I: ARTIGO PUBLICADO - RAIOL ET AL. (2009) _______________________________ 125
ANEXO II: SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS DE NOVOS VARIANTES DE HPV __________ 133
10
Resumo
Mais de 100 tipos de HPV foram descritos, dos quais 13 são classificados como
de alto risco devido à sua associação com o desenvolvimento do câncer cervical. O
presente estudo investigou a variabilidade e filogenia dos HPV de alto risco -31, -33, -
35, -52 e -58, isolados a partir de amostras do Distrito Federal. Para tanto, a LCR e os
genes E6 e L1 foram sequenciados. Diversos variantes foram detectados, incluindo 13
novos variantes de todos os tipos analisados. A análise filogenética dos isolados de
HPV-31, -33, -35 e -58 não revelaram agrupamentos étnicos ou geográficos como
observados previamente para os HPV-16 e -18. A análise do HPV-35 mostrou uma
topologia dicotômica característica de subtipos do HPV. Interessantemente, quatro
agrupamentos foram identificados na análise de variantes de HPV-52, dos quais dois
puderam ser classificados como ramos Asiático e Europeu. Além disso, nós
comparamos a atividade do promotor de E6/E7 de variantes moleculares do HPV-58
detectados no Distrito Federal, uma vez que este é o segundo tipo mais frequentemente
detectado em lesões cervicais de alto grau nessa região. Para este propósito, as
sequências da LCR do protótipo do HPV-58 e de três variantes foram amplificadas e
clonadas à montante do gene repórter luciferase e transfectados transientemente em
células C33. Para comparação, também foram analisadas as sequências da LCR dos
HPV-18 e -16. O protótipo do HPV-58 e os variantes Bsb-329 e Bsb-327 mostraram
atividade transcricional similar ao HPV-16, mas cerca de seis vezes menor que o HPV-
18. Interessantemente, o variante de HPV-58 Bsb-295 apresentou uma alta atividade
transcricional, mesmo comparável ao HPV-18. Esse variante de HPV-58 é o único
isolado em que foi detectada a substituição nucleotídica na posição 7788. Foram
construídos mutantes por meio de mutagênese sítio-dirigida com o intuito de analisar o
impacto dessa alteração nucleotídica na atividade do promotor viral. A introdução da
mutação 7788 no isolado protótipo do HPV-58 levou a uma atividade transcricional
similar ao observado para o variante Bsb-295 e o protótipo do HPV-18. Em conjunto, os
dados indicam que essa única variação é capaz de aumentar a atividade do promotor
viral e poderia levar a uma maior expressão dos oncogenes virais E6 e E7 in vivo.
Entretanto, estudos adicionais são necessários para identificar os fatores transcricionais
celulares envolvidos nessa regulação. O estudo dos variantes de HPV é crucial para
entender a sua distribuição geográfica e as diferenças biológicas desses vírus,
contribuindo ainda para estudos sobre sua infectividade e patogenicidade.
11
Abstract
More than 100 HPV types have been described, of which 13 are classified as
high-risk due to their association with the development of cervical cancer. The present
study explores nucleotide variability and phylogeny of high-risk HPV-31, -33, -35, -52
and -58, isolated from samples from Distrito Federal. For this purpose, the LCR and E6
and L1 genes were sequenced. Several variants of these HPV types were detected,
including 13 new variants among all types analyzed. The phylogenetic analysis of HPV-
31, -33, -35 and -58 isolates did not reveal any ethnic or geographical clustering, as
observed previously for HPV-16 and -18. HPV-35 analysis showed a dichotomic
branching characteristic of HPV subtypes. Interestingly, four clusters relative to the
analysis of HPV-52 variants were identified, of which two could be classified as Asian
and European branches. In addition, we compared E6/E7 promoter activity of HPV-58
molecular variants detected in Distrito Federal, since this is the second most frequent
type detected among high-grade cervical lesions in this geographical area. For this
porpouse, complete LCR sequences from HPV-58 prototype and three more variants
were amplified, cloned upstream of the luciferase reporter gene and transiently
transfected in C33 cells. For comparison, plasmids containing HPV-18 or -16 prototype
LCR sequences were also analyzed. HPV-58 prototype and HPV-58 variants Bsb-329
and Bsb-327 showed promoter activity similar to HPV-16 but about six times lower
than HPV-18. Interestingly, HPV-58 variant Bsb-295 presented a high promoter
activity, even comparable to HPV-18. This HPV-58 variant is the only isolate in which
we detected a substitution in nucleotide position 7788. Mutants were constructed by
site-direct mutagenesis in order to analyze the impact of this nucleotide alteration on
viral promoter activity. The introduction of the 7788 mutation in the HPV-58 prototype
isolate led to a transcription activity similar to that observed for HPV-58 variant Bsb-
295 and HPV-18 prototype. Taken together, these data indicate that this single
nucleotide variation is capable of enhancing viral promoter activity and could lead to a
higher expression of E6 and E7 viral oncogenes in vivo. Nevertheless, additional studies
are necessary to further identify cellular transcriptional factors involved in this
regulation. The study of HPV variants is crucial to understand the intrinsic geographical
relatedness and biological differences of these viruses and further contributes to studies
concerning their infectivity and pathogenicity.
12
Lista de Figuras
F
IGURA
1.
M
ICROGRAFIA ELETRÔNICA DE PARTÍCULAS DE PAPILOMAVÍRUS
. ______________________18
F
IGURA
2.
R
EPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO GENOMA DO
HPV.______________________________19
F
IGURA
3.
Á
RVORE FILOGENÉTICA DOS PAPILOMAVÍRUS BASEADA NA ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DO GENE
L1.
20
F
IGURA
4.
C
ICLO DE INFECÇÃO PELO
HPV.________________________________________________22
F
IGURA
5.
A
SSOCIAÇÃO DE
E7
DE
HPV
A PROTEÍNA DO RETINOBLASTOMA
. ______________________25
F
IGURA
6.
D
EGRADAÇÃO DE P
53
MEDIADA POR
E6
DE
HPV. __________________________________26
F
IGURA
7.
R
EPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA
LCR
DO
HPV-16. ______________________________29
F
IGURA
8.
H
ISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO PELO
HPV._____________________________________32
F
IGURA
9.
P
ROGRESSÃO DAS LESÕES DO COLO DO ÚTERO
. ____________________________________33
F
IGURA
10.
D
ISTRIBUIÇÃO DE TIPOS DE
HPV
EM MULHERES CITOLOGICAMENTE NORMAIS POR REGIÃO
.
F
ONTE
:
M
ODIFICADO DE
C
LIFFORD ET AL
.
(2005)_______________________________________37
F
IGURA
11.
D
ISTRIBUIÇÃO DE TIPOS DE
HPV
NO CÂNCER CERVICAL
. ___________________________38
F
IGURA
12.
Á
RVORE FILOGENÉTICA DO
HPV-16. __________________________________________40
F
IGURA
13.
D
IVERSIDADE INTRAGENÓTIPO DO
HPV-31._____________________________________42
F
IGURA
14.
D
IVERSIDADE INTRAGENÓTIPO DO
HPV-33.
____________________________________43
F
IGURA
15.
D
IVERSIDADE INTRAGENÓTIPO DO
HPV-35._____________________________________44
F
IGURA
16.
D
IVERSIDADE INTRAGENÓTIPO DO
HPV-52._____________________________________45
F
IGURA
17.
D
IVERSIDADE INTRAGENÓTIPO DO
HPV-58._____________________________________46
F
IGURA
18.
M
APEAMENTO DE POTENCIAIS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR
DO
HPV-31
PROTÓTIPO
._____________________________________________________________67
F
IGURA
19.
M
APEAMENTO DE POTENCIAIS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR
DO
HPV-33
PROTÓTIPO
._____________________________________________________________68
F
IGURA
20.
M
APEAMENTO DE POTENCIAIS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR
DO
HPV-35
PROTÓTIPO
._____________________________________________________________69
F
IGURA
21.
M
APEAMENTO DE POTENCIAIS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR
DO
HPV-52
PROTÓTIPO
._____________________________________________________________70
F
IGURA
22.
M
APEAMENTO DE POTENCIAIS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO NA
LCR
DO
HPV-58
PROTÓTIPO
._____________________________________________________________71
F
IGURA
23.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA DA
LCR
E DOS GENES
E6
E
L1
DE ISOLADOS DE
HPV-31. _____72
F
IGURA
24.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA DO
HPV-31.__________________________________________74
F
IGURA
25.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA DA
LCR
E DOS GENES
E6
E
L1
DE ISOLADOS DE
HPV-33. _____75
F
IGURA
26.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA DE
L1
DO
HPV-33._____________________________________77
F
IGURA
27.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA DA
LCR
E DOS GENES
E6
E
L1
DE ISOLADOS DE
HPV-35. _____78
F
IGURA
28.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA DO
HPV-35.__________________________________________80
F
IGURA
29.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA DA
LCR
E DOS GENES
E6
E
L1
DE ISOLADOS DE
HPV-52. _____82
F
IGURA
30.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA DO
HPV-52.__________________________________________84
F
IGURA
31.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA DA
LCR
E DOS GENES
E6
E
L1
DE ISOLADOS DE
HPV-58. _____85
F
IGURA
32.
A
NÁLISE FILOGENÉTICA DO
HPV-58.__________________________________________87
13
F
IGURA
33.
V
ARIABILIDADE GENÉTICA DA
LCR
DOS ISOLADOS DE
HPV-58. _____________________90
F
IGURA
34.
R
AZÕES RELATIVAS DE UNIDADES DE LUMINESCÊNCIA
(RLU)
DETECTADAS ENTRE OS
ISOLADOS DE
HPV-58,
-16
E
-18. ___________________________________________________90
F
IGURA
35.
U
NIDADES
R
ELATIVAS DE
L
UMINESCÊNCIA
(RLU)
DETECTADAS ENTRE OS ISOLADOS DE
HPV-58,
-16
E
-18.______________________________________________________________91
F
IGURA
36.
A
NÁLISE ESTATÍSTICA DAS MÉDIAS DE UNIDADES RELATIVAS DE LUCIFERASE
(RLU). ____92
14
Lista de Tabelas
T
ABELA
1.
I
MPLICAÇÕES FUNCIONAIS DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO
HPV. ____________________48
T
ABELA
2.
I
NICIADORES ESPECÍFICOS DESENHADOS PARA A AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO
LCR
DO
HPV-33
E
DO GENE
E6
DOS
HPV-33
E
-58.____________________________________________________52
T
ABELA
3.
I
NICIADORES UTILIZADOS PARA A AMPLIFICAÇÃO DA
LCR
DOS VARIANTES DE
HPV-58. ____56
T
ABELA
4.
D
ADOS DA LESÃO CITOPATOLÓGICA
,
IDADE DAS PACIENTES
,
CO
-
INFECÇÃO COM DIFERENTES
TIPOS DE
HPV
E DETECÇÃO DE
HIV
DE AMOSTRAS DE
HPV-31,
-33,
-35,
-52
E
-58
COLETADAS NO
D
ISTRITO
F
EDERAL
. _____________________________________________________________65
T
ABELA
5.
C
OMPARAÇÃO DO NÚMERO DE VARIAÇÕES NUCLEOTÍDICAS RELATIVAS AO TOTAL DE
NUCLEOTÍDEOS SEQUENCIADOS E MÁXIMAS DISTÂNCIAS GENÉTICAS INTRATÍPICAS ENTRE OS
ISOLADOS DE
HPV-31,
-33,
-35,
-52
E
-58
DETECTADOS NO
D
ISTRITO
F
EDERAL
._______________89
15
Lista de Siglas e de Abreviaturas
AA - Variante Asiático–Americano
Af - Variante Africano
AP-1 - Proteína Ativadora 1 (Activator Protein-1)
As - Variante Asiático
ATCC – American Type Culture Collection
BLAST - Ferramenta básica de alinhamento local (Basic Local Alignment Search
Tool)
C/EBP - Proteína de ligação à seqüência CCAAT (CCAAT enhancer binding
protein);
CDK - quinase dependente de ciclina (Cyclin Dependent Kinase)
CENARGEN - Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia
cMyc - Cellular myelocytomatosis oncogene
DF - Distrito Federal
DNA - ácido desoxirribonucléico
E - Variante Europeu
E6AP – Proteína de associação a E6 (E6 Associated Protein);
EGF-R - Receptor do Fator de Crescimento Epidermal (epidermal growth factor
receptor)
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
G1- Fase de Gap 1 do ciclo celular
GenBank – Banco de dados de sequências do Centro de Informação sobre
Biotecnologia Nacional (NCBI - National Center for Biotechnology Information )
GRE - Elemento de resposta a glicocorticóide (Glucocorticoid Response Element);
HPV - Papilomavírus humano (Human Papillomavirus)
HDAC - Histona Deacetilase
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA - Antígeno Leucocitário Humano
16
HSIL - Lesão escamosa epitelial de alto grau (High-grade squamous intraepithelial
lesion)
hTERT – Subunidade catalítica da enzima telomerase (human Telomerase Reverse
Transcriptase)
IARC - Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (International Agency
for Research on Cancer)
INCA - Instituto Nacional do Câncer
LCR - Região Longa de Controle (Long Control Region)
LSIL - Lesão escamosa epitelial de baixo grau (Low-grade squamous intraepithelial
lesion);
NF1 - Fator nuclear 1 (Nuclear Factor 1)
NIC - Neoplasia Intra-Epitelial Cervical
Oct-1 - Fator de ligação a octâmero (Octamer binding factor -1)
ORF - Região Aberta de Leitura (Open Reading Frame)
pb - pares de bases
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction)
pRb - Proteína do Retinoblastoma (Retinoblastoma protein)
PRE - Elemento de Resposta à Progesterona (Progesterone Response Element)
RFLP - Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos de Restrição (Restriction
Fragment Length Polymorphism)
RLU - Unidades Relativas de Luminescência (Relative Light Unit)
RR - Risco Relativo
S - Fase de síntese do ciclo celular
Sp1 - Fator promotor seletivo -1 (Selective promoter factor 1)
TBP - Proteína de Ligação a TATA (TATA binding protein)
TEF-1 - Fator de Aumento Transcricional (Transcriptional enhancer factor-1)
VLP - Partícula Semelhante a Vírus (Virus Like Particle)
WHO - World Health Organization
YY1 - Fator yin-yang
17
1. Introdução
O câncer de colo do útero é a segunda causa de morte na população feminina no
mundo (IARC, 2007) e, também, no Brasil (INCA, 2008). Esta doença está associada à
infecção pelos papilomavírus humanos (Human papillomavirus - HPV), detectados em
mais de 99% dos casos de câncer de colo do útero. A infecção por HPV é considerada
um passo intermediário necessário para o desenvolvimento do câncer cervical (Franco
et al., 2003; Walboomers et al., 1999). A infecção por HPV está entre as doenças de
transmissão sexual de etiologia viral mais comum. Estima-se que 75% da população em
idade reprodutiva esteja infectada com HPV genital e que a maioria das mulheres
sexualmente ativas irá adquirir infecção por HPV ao longo da vida (Ho et al., 1998).
Oitenta por cento dos casos de câncer de colo do útero ocorrem em países em
desenvolvimento e, em algumas regiões, esta é a neoplasia mais comum entre as
mulheres (IARC, 2007; INCA, 2008). No Brasil, estimou-se em cerca de 19.000 o
número de novos casos de câncer de colo do útero no ano de 2008. Excluindo-se os
tumores de pele não melanoma, o câncer de colo do útero foi o mais incidente na região
Norte, com 22 casos para cada 100.000 mulheres (22/100.000), o segundo mais
incidente nas regiões Sul (24/100.000), Centro-Oeste (19/100.000) e Nordeste
(18/100.000), e o quarto mais incidente na região Sudeste (18/100.000) (INCA, 2008).
Na região Centro-Oeste, a estimativa foi de 1.350 novos casos para 2008, sendo 220 no
Distrito Federal (INCA, 2008). Esses números podem estar subestimados, visto que,
tanto o câncer de colo do útero, quanto a infecção por HPV, não são doenças de
notificação compulsória (Ministério da Saúde, 2003).
Devido à grande morbidade e mortalidade causadas por esses vírus, grupos de
pesquisa médica, epidemiológica e básica tem dado grande atenção aos HPV, a fim de
entender melhor sua patogenicidade e infectividade, e, assim, estabelecer terapias mais
adequadas às infecções e lesões causadas por esses vírus.
18
2. Revisão Bibliográfica
2.1.
Estrutura da partícula viral e organização do genoma
Os papilomavírus (PV) são um grupo diverso de vírus encontrados em mais de
20 espécies de mamíferos, bem como em aves e répteis. Devido à grande importância
médica, os papilomavírus humanos (HPV) têm sido os mais estudados. Os HPV são
vírus não envelopados de simetria icosaédrica e medem aproximadamente 55nm de
diâmetro (Fauquet et al., 2005) (Figura 1).
Figura 1. Micrografia eletrônica de partículas de papilomavírus. Fonte: Stannard (1995).
O genoma dos HPV é constituído de um DNA dupla fita circular de
aproximadamente 8.000 pares de base (pb) associado às histonas celulares H2a, H2b,
H3 e H4, formando um complexo semelhante à cromatina. O genoma viral possui 8
fases abertas de leitura (Open Reading Frames - ORF) e uma região não codificadora,
LCR (Long Control Region), que contém elementos de regulação da replicação viral e
expressão gênica (zur Hausen, 1996; Bernard, 2002).
Estruturalmente, o genoma viral pode ser dividido em três partes: uma região
precoce (E-early) com cerca de 4kb, a qual codifica as proteínas não estruturais E1, E2,
E4, E5, E6 e E7; uma região tardia (L-late) com, aproximadamente 3kb, que codifica as
duas proteínas do capsídeo L1 e L2; e a região reguladora, LCR, de cerca de 1kb, que
engloba elementos regulatórios e sítios de ligação para fatores de transcrição celulares e
viral (zur Hausen, 2002). A representação esquemática do genoma do HPV está
mostrada na Figura 2.
19
Figura 2. Representação esquemática do genoma do HPV. Observam-se na figura, em azul, a região
precoce, responsável pela síntese das proteínas não estruturais E1, E2, E4, E5, E6 e E7, em vermelho, a
região tardia, que codifica as proteínas estruturais L1 e L2, e, em lilás, a região reguladora ou LCR (long
control region). As setas, ao final de cada gene, indicam a direção única em que ocorre a transcrição dos
genes do HPV. Na parte interna da figura estão indicadas as posições nucleotídicas no genoma viral a
cada 1000pb. Fonte: Modificado de Burk et al. (1999).
2.2.
Taxonomia dos HPV
Os HPV pertencem à família Papillomaviridae e aos gêneros
Alphapapillomavirus, HPV que preferencialmente infectam a mucosa oral ou anogenital
em humanos e primatas; Betapapillomavirus, Gammapapillomavirus, Nupapillomavirus
e Mupapillomavirus, HPV que infectam preferencialmente a pele de humanos (Fauquet
et al., 2005) (Figura 3).
20
Figura 3. Árvore filogenética dos papilomavírus baseada na análise da sequência do gene L1. Os
números nas pontas dos ramos identificam os tipos de HPV, c seguido de um número indica um novo
candidato a tipo de HPV. Todas as outras abreviações se referem a tipos de papilomavírus que infectam
animais. Os semicírculos externos identificam os gêneros e os semicírculos internos, as espécies. Setas
vermelhas indicam as espécies contendo HPV de alto risco oncogênico. Fonte: Modificado de de Villiers
et al. (2004).
A classificação dos HPV baseia-se na diversidade genômica da sequência
completa do gene L1, que é muito conservado entre os diferentes tipos virais. A família
Papillomaviridae engloba 16 gêneros que apresentam entre si uma diferença maior que
40% na sequência nucleotídica do gene L1, enquanto as espécies apresentam diferença
entre 30% e 40%. As espécies são denominadas pelo tipo de HPV mais estudado entre
os tipos que as compõem. Além da classificação em família, gênero e espécie, os
papilomavírus são classificados em tipos, subtipos e variantes. Um tipo de HPV difere
de outro quando apresenta ao menos 10% de divergência na sequência do gene L1. A
classificação em subtipo ocorre quando uma sequência do gene L1 diverge entre 2% a
10% daquela do tipo mais próximo. Os variantes de tipos de HPV diferem em menos de
2% na sequência de nucleotídeos de L1, e em até 5% na LCR (Ho et al., 1993; de
Villiers et al., 2004; IARC, 2007).
Até o momento, foram descritos mais de 100 tipos de HPV. Os tipos são
nomeados pela sigla HPV seguida de um número que é dado sequencialmente, à medida
que diferentes tipos são caracterizados (de Villiers et al., 2004). Os tipos de HPV são
21
classificados ainda em cutâneos e mucosotrópicos, dependendo do tropismo pelo tecido
infectado. Os tipos cutâneos são aqueles que infectam a pele e os mucosotrópicos são os
que infectam as mucosas urogenitais, anais e oro-respiratórias. Os HPV mucosotrópicos
podem também ser divididos em baixo ou alto risco oncogênico, de acordo com o
potencial de progressão do tecido infectado para neoplasias. Os HPV de alto risco
oncogênico estão mais frequentemente associados ao risco de desenvolvimento de
câncer cervical, sendo considerados os principais causadores de neoplasias cervicais em
todo o mundo. Infecções pelos tipos oncogênicos de HPV representam 50% a 75% de
todas as infecções por estes vírus (Muñoz et al., 2003, Clifford et al., 2005). Os 13 tipos
de HPV considerados de alto risco pertencem ao gênero Alphapapillomavirus e às
espécies Human Papillomavirus 16, Human Papillomavirus 18 e Human
Papillomavirus 53, separadas em três ramos filogenéticos distintos (de Villiers et al.,
2004; Fauquet et al., 2005) (Figura 3).
2.3.
As proteínas virais e o ciclo de infecção viral
O ciclo de infecção dos papilomavírus é dependente da diferenciação dos
queratinócitos. A fim de que os HPV do gênero Alphapapillomavirus, que infectam
mucosas, atinjam as células da camada basal do epitélio, parece ser necessária uma
quebra do epitélio estratificado, como microlesões ou abrasão, que ocorrem na pele ou
mucosa por contato direto, como resultado, por exemplo, de atividade sexual ou durante
o parto normal (Doorbar, 2005) (Figura 4).
22
Figura 4. Ciclo de infecção pelo HPV. Micro-traumas no epitélio expõem as células basais e facilitam a
infecção pelo HPV. Após a entrada na célula, o vírus é desnudado e o genoma viral alocado no núcleo
celular. O DNA viral permanece como um epissomo e se divide simultaneamente, mas de forma
independente, do genoma da célula hospedeira. Após a divisão, as células migram da camada basal
passando pela intermediária e atingindo a superficial. Durante esse processo as células infectadas
continuam se multiplicando, o que resulta na amplificação do genoma viral em milhares de cópias por
célula. Na camada intermediária do epitélio, as proteínas L1 e L2 que compõe o capsídeo são expressas.
A montagem dos vírions e o empacotamento do DNA celular ocorrem na camada superficial, sendo as
partículas infecciosas liberadas com a esfoliação das células. Fonte: Adaptado de Doorbar (2005) e Merk
(2006).
2.3.1. A entrada do vírus na célula
A natureza do receptor responsável pela entrada do vírus na célula ainda é
controversa. Evander et al. (1997) sugeriram que a entrada da partícula do
papilomavírus na célula é mediada pela ligação à integrina α6, enquanto estudos mais
recentes sugerem que proteoglicanas heparan-sulfato são os receptores celulares
responsáveis pelo reconhecimento e ligação inicial dos vírions às células, pela interação
com a região C-terminal da proteína do capsídeo L1 (Joyce et al., 1999; Shafti-Keramat
et al., 2003). Porém, Patterson et al. (2005) demonstraram que a infecção de
queratinócitos pelo HPV-31 não é dependente de heparan-sulfato, sugerindo haver
diferença de receptores celulares na ligação e internalização dos diferentes tipos do
HPV. Foi observado para os HPV-16 e -58, que a internalização parece ocorrer por
endocitose mediada por clatrinas, enquanto que o HPV-31 parece ser internalizado por
meio da membrana caveolar
(Bousarghin et al., 2003).
Após a internalização, as partículas do HPV são desmontadas em endossomos
tardios e/ou em lisossomos, seguida da transferência do DNA viral para o núcleo da
célula. Essa transferência parece ser facilitada pela proteína do capsídeo viral L2 (Day
et al., 2004). Inicialmente, o genoma permanece nas células da camada basal, como um
23
epissomo estável, sem integração ao genoma da célula hospedeira, onde ocorre síntese
das proteínas precoces E1, E2, E4 e E5 (Doorbar, 2006) (Figura 4).
2.3.2. A replicação viral
E1 e E2 são as principais proteínas virais envolvidas na replicação viral. A
proteína precoce E1 tem importante papel na manutenção do DNA viral na forma
epissomal (Wilson et al., 2002). Durante a infecção, E1 é expressa em níveis muito
baixos e requer a presença de E2 para se ligar de forma eficiente ao seu sítio de ligação
na LCR. A formação de um complexo entre E1 e E2 na origem de replicação induz uma
modificação no DNA viral, facilitando o recrutamento de moléculas adicionais de E1 e
o eventual desligamento de E2 (Sarafi e McBride, 1995). Além disso, E2 facilita a
correta segregação do genoma viral durante a divisão celular (McPhillips et al., 2005).
Foi demonstrado que o genoma viral se replica junto com o DNA da célula durante a
fase S do ciclo celular, e os genomas replicados são particionados igualmente durante a
divisão celular (You et al., 2004)
Embora E1 e E2 sejam primordiais para a amplificação do genoma, as proteínas
virais E4 e E5 também contribuem nesse processo (Genther et al., 2003; Wilson et al.,
2005
)
. Genomas dos HPV-16 e -31 mutantes em E5 exibem níveis mais baixos de
amplificação do genoma em relação ao tipo selvagem, e isso pode ser devido à
habilidade de E5 em modular a sinalização celular estar comprometida nesses mutantes.
E5 é uma proteína transmembrana que reside predominantemente no retículo
endoplasmático, mas que pode se associar com a ATPase de prótons vacuolar inibindo
diretamente a bomba de prótons. O mecanismo de ação de E5 reduz a acidificação dos
endossomos, inibindo a degradação do receptor do fator de crescimento epidermal
(EGF-R) internalizado e assim, mantendo um ambiente favorável para a replicação viral
nas camadas superiores do epitélio (Straight et al., 1993; Disbrow et al., 2005).
Em contraste, o papel de E4 na amplificação do genoma ainda não foi
completamente estabelecido. E4 se acumula na célula no momento da amplificação do
genoma viral e quantidades reduzidas dessa proteína parecem prejudicar o processo de
replicação viral (Nakahara et al., 2005; Wilson et al., 2005
)
.
2.3.3. A transformação celular
Em lesões cervicais causadas por HPV, o aumento da proliferação das células
epiteliais suprabasais é atribuído principalmente à expressão dos oncogenes virais E6 e
24
E7. Durante a infecção, a atividade dessas proteínas estimula a divisão de um pequeno
número de células infectadas, aumentando o número de células que, subseqüentemente,
irão produzir partículas infecciosas. A habilidade de E6 e E7 em conduzir as células até
a fase S é também necessária, juntamente com E1 e E2, para a replicação de epissomos
virais acima da camada basal (Doorbar, 2006).
As células mais distais do epitélio estratificado tem o ciclo celular interrompido
e passam ao processo de diferenciação terminal, produzindo uma barreira de proteção
de queratina, encontrada nas camadas superficiais da mucosa. Em queratinócitos
infectados por HPV de alto risco oncogênico, entretanto, a parada da progressão do
ciclo celular é perdida, o que provoca inibição da diferenciação terminal (Sherman et
al., 1997).
Em lesões cervicais de alto grau e nos tumores, o DNA do HPV está geralmente
integrado ao genoma do hospedeiro. Esse evento promove a perda dos genes E1 e o
rompimento do gene E2 (Baker et al., 1987). No entanto, os genes E6 e E7 são
preservados e expressos em linhagens celulares de câncer cervical e neoplasias
associadas ao HPV. Isso resulta no término da amplificação do DNA viral e na ativação
constante do promotor precoce do HPV (Stoler et al., 1992; zur Hausen, 2002).
O mecanismo pelo qual os papilomavírus estimulam a progressão do ciclo
celular é atribuído principalmente às proteínas virais E6 e E7. A proteína E5 parece
também ter um papel na tumorigênese, uma vez que foi demonstrado que E5 induz
fibroblastos a formar colônias em soft agar (Straight et al., 1993), aumenta a eficiência
da imortalização de queratinócitos por E6 e E7 (Stöppler et al., 1996b), além de
prejudicar significativamente a comunicação célula-célula (Oelze et al., 1995).
Adicionalmente, foi relatado que E5 inibe a expressão do supressor de tumor p21, o que
sugere que pode existir uma cooperação com E6 e E7 no processo de transformação de
queratinócitos (Tsao et al., 1996). É também possível que E5 interfira com a habilidade
do sistema imune em eliminar as células infectadas por prejudicar a sinalização celular
(Kabsch e Alonso, 2002).
A associação de E7 a membros da família de proteínas do retinoblastoma,
incluindo pRb, p107 e p130, explica como E7 exerce seus efeitos estimulatórios na
proliferação celular (Münger e Howley, 2002). A proteína do retinoblastoma (pRb) é
uma reguladora negativa do ciclo celular na transição da fase G1 para S, e seu estado de
fosforilação é regulado durante o ciclo celular. No estado hipofosforilado, pRb se liga
ao fator transcricional E2F durante a fase G1. Devido à fosforilação de pRb por
25
quinases dependentes de ciclinas (CDK), em resposta a sinais de proliferação celular, o
complexo pRb/E2F se dissocia e E2F é liberado e ativa transcricionalmente genes
envolvidos na progressão do ciclo celular. A associação de E7 à pRb impede a ligação
desta a E2F, promovendo então a progressão contínua para a fase S do ciclo celular
(Dyson et al., 1989; Cheng et al., 1995) (Figura 5).
Figura 5. Associação de E7 de HPV a proteína do retinoblastoma. A fosforilação sequencial da
proteína do retinoblastoma (Rb) por complexos ciclina/CDK inibem sua atividade repressora do ciclo
celular. A proteína E7 de HPV se liga a Rb em sua forma hipofosforilada. Essa ligação desfaz o complexo
entre Rb e o fator de transcrição celular E2F, resultando na liberação deste fator, o que permite que a
célula entre na fase S do ciclo celular. Fonte: Modificado de Jo e Kim (2005).
Além da ligação a membros da família Rb, E7 influencia a transcrição induzida
por E2F por outros meios. Foi demonstrado que E7 interage com histona deacetilases
(HDAC), que atuam como repressores transcricionais. A ligação de E7 a HDAC
aumenta especificamente os níveis de transcrição mediada por E2F em células em
diferenciação, assim levando as células à fase S (Longworth e Laimins, 2004).
A função da proteína viral E6 complementa a de E7 e, nos HPV de alto risco, as
duas proteínas são expressas simultaneamente a partir de um único mRNA bicistrônico
(Tang et al., 2006). O processo de apoptose, devido à liberação de E2F mediada por E7
nas células das camadas suprabasais, é impedido pela atividade da proteína E6 dos HPV
de alto risco, que se liga à proteína supressora de tumor p53. Isso ocorre através da
proteína de associação a E6 (E6AP), um polipeptídeo celular que tem atividade de
ubiquitina ligase, formando assim um complexo trimérico. Esse complexo atua
marcando especificamente p53 para a degradação, por meio da ubiquitinação (Werness
et al., 1990; Huibregtse et al., 1991; Scheffner et al., 1993) (Figura 6).
26
Embora as proteínas E6 de todos os HPV genitais tenham provavelmente
alguma propriedade de ligação à p53, somente as dos tipos de alto risco se ligam
com alta afinidade e provocam sua degradação (Lechner e Laimins 1994; Hiller et
al., 2006). O papel anti-apoptótico de E6 é chave para o desenvolvimento de cânceres
cervicais, pois compromete a efetividade de reparo celular do DNA, permitindo o
acúmulo de mutações secundárias.
Figura 6. Degradação de p53 mediada por E6 de HPV. Danos ao DNA induzem a ativação de p53
levando tanto à parada do ciclo celular quanto à apoptose. E6 se liga a E6-AP e o complexo formado se
liga a p53. E6-AP ubiquitina p53, que é rapidamente degradada pelo proteassomo. Fonte: Modificado de
Jo e Kim (2005).
A proteína E6 de HPV de alto risco se liga a várias outras proteínas
celulares (zur Hausen, 2002). Foi demonstrado que E6 interage e leva à degradação de
proteínas contendo domínios PDZ que estão envolvidas na sinalização celular e adesão
célula-célula. A associação de E6 com proteínas PDZ parece ter um papel importante no
ciclo viral, podendo ainda contribuir para carcinogênese, uma vez que algumas delas
têm funções de supressoras de tumor (Lee et al., 2000; Massimi et al., 2004). Outra
importante função da proteína E6 dos HPV de alto risco é a ativação da telomerase em
células infectadas (Klingelhutz et al., 1996). Nas células normais, os vários ciclos de
replicação do DNA resultam no encurtamento dos telômeros, eventualmente levando à
instabilidade cromossomal e senescência celular. Foi demonstrado que a proteína E6
27
dos HPV de alto risco ativam a subunidade catalítica da enzima telomerase (human
Telomerase Reverse Transcriptase - hTERT) aumentando, assim, o comprimento dos
telômeros nas células epiteliais. Além de estender a vida das células epiteliais para
produção da progênie viral, esse efeito também influencia a carcinogênese induzida por
HPV pois a super-expressão de hTERT aliada à expressão de E7 é suficiente para
imortalizar queratinócitos humanos primários (Kiyono et al., 1998; Veldman et al.,
2001).
2.3.4. A montagem viral e liberação das partículas
O estágio final do ciclo replicativo dos HPV envolve o empacotamento dos
genomas em partículas infecciosas. Nas camadas suprabasais do epitélio, as proteínas
do capsídeo (L1 e L2) se acumulam (Figura 4), com a expressão de L2 precedendo a
expressão de L1 (Florin et al., 2002). Após a síntese no citoplasma, L1 e L2 são
direcionadas para o núcleo, onde ocorre a montagem das novas partículas virais (Day et
al., 1998; Buck et al., 2004).
Além das proteínas que compõem o capsídeo viral, foi sugerido que E2 pode
também ser necessária para a encapsidação do genoma do HPV por aumentar a
eficiência deste evento durante a infecção natural (Zhao et al., 2000). A proteína L1 é o
principal elemento estrutural do capsídeo viral, o qual é formado por 360 cópias de L1
organizadas em 72 capsômeros arranjados na superfície do icosaedro, sendo cada
capsômero composto por 5 moléculas de L1. Estudos mostram que existem apenas 12
cópias da proteína L2 por vírion (Trus et al., 1997; Modis et al., 2002). Embora as
partículas de HPV tenham a capacidade de auto-montagem na ausência de L2, a
presença desta proteína contribui para o empacotamento eficiente e aumenta a
infectividade do vírus. Em HPV-31 foi demonstrado que a perda de L2 resulta em uma
redução de 10 vezes na eficiência do empacotamento, além de uma redução de 100
vezes na infectividade viral, quando comparado ao HPV-31 selvagem (Holmgren et al.,
2005).
A liberação eficiente das partículas virais parece ser facilitada pela proteína E4
que se associa a filamentos intermediários do citoesqueleto quando expressa in
vitro. Isso pode levar a um aumento da fragilidade da célula infectada, facilitando
a lise celular e, portanto, a liberação das partículas virais (Doorbar et al., 1991;
Wang et al., 2004). Os vírions são liberados durante a descamação celular, na superfície
da lesão (Turek e Smith, 1996).
28
2.4.
A região reguladora (LCR)
A LCR é um segmento não codificador de aproximadamente 850pb que se
localiza entre o final do gene L1 e o início do gene E6 (Figura 7). Esta região controla a
replicação viral e apresenta vários sítios de ligação para fatores transcricionais celulares
e viral (O’Connor et al., 1995). A LCR pode ser dividida em 3 segmentos: a região 5', o
segmento central e a região 3', que está localizada diretamente a montante dos genes E6
e E7. Na região 3’ da LCR localiza-se o promotor responsável pela transcrição dos
genes precoces, incluindo os oncogenes E6 e E7 (O’Connor et al., 1995). O segmento
central da LCR engloba o enhancer epitélio-específico que caracteriza-se por ser mais
ativo em células epiteliais que em outros tipos celulares. Sítios para vários fatores de
transcrição celulares, incluindo AP-1 (Chan et al., 1990; Offord et al., 1990), NF-1 (Apt
et al., 1993), Oct-1 (Hoppe-Seyler et al., 1991; O’Connor e Bernard, 1995), TEF-1
(Ishiji et al., 1992) e YY1 (May et al., 1994; O'Connor et al., 1996), e para hormônios
esteróides (Chan et al., 1989) foram identificados nessa região (Figura 7). A
especificidade do enhancer e, assim, do tropismo do HPV, parece ser definida por uma
combinação de sítios de ligação a fatores de transcrição no enhancer, além de diferenças
quantitativas e qualitativas desses fatores transcricionais ou co-fatores celulares entre as
células epiteliais e as de outros tecidos (Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987). A região
5' da LCR contém sinais para terminação e poliadenilação de transcritos virais tardios,
além de um sítio de ligação à matriz nuclear (Tan et al., 1998).
A composição dos sítios de ligação para fatores de transcrição na LCR de HPV,
até o momento, tem sido investigada apenas para os tipos -16 e -18. Nesses tipos, o
promotor de E6/E7 contém quatro elementos conservados: os sítios 3 e 4 de ligação a
E2, um sítio de ligação para o fator de transcrição promotor-seletivo 1 (Selective
promoter factor 1- Sp1) sobreposto ao sítio 3 de E2, além do sítio 4 de ligação a E2
sobreposto ao “TATA-box” (Figura 7). A ocupação alternada desses sítios pelo
respectivo fator de reconhecimento promove diferentes níveis de atividade do promotor
de E6/E7 (Gloss et al., 1990; Tan et al., 1992).
29
Figura 7. Representação esquemática da LCR do HPV-16. Quatro sítios de ligação a E2 estão
presentes na LCR, sendo que dois deles dividem a LCR em segmentos funcionais distintos, os quais são
denominados segmento 5’, central e 3’. O segmento 5’ contém o sinal de terminação, denotado “pA”, o
segmento central é o enhancer epitélio específico, o qual contém a maioria dos sítios de ligação para
fatores de transcrição, e o segmento 3’ contém a origem de replicação e o promotor E6/E7. Fonte:
Modificado de O’Connor et al. (1995).
2.4.1. Fatores de transcrição envolvidos na transcrição viral
E2: Em adição ao seu papel na replicação e segregação do genoma, E2 atua como fator
de transcrição regulando o promotor viral precoce e controlando a expressão dos
oncogenes virais E6 e E7. A proteína E2 existe como um homodímero e se liga
especificamente à sequência nucleotídica ACCG(N
4
)GCCT (McBride et al., 1991).
Existem 4 sítios de ligação para E2 na LCR dos HPV-16 e -18 (Bernard, 2002). Em
baixos níveis, E2 atua como um ativador transcricional. No HPV-16, supõe-se que os
sítios de ligação 1 e 2 são os primeiros a serem ocupados, levando à ativação do
promotor. Com o aumento nos níveis de E2, a ocupação dos demais sítios de ligação
impede a ligação dos fatores de transcrição Sp1 (Transcription Factor Specificity
Protein 1) e TBP (TATAbox Binding Protein) que são necessários para a ativação do
promotor (Dong et al., 1994).
Proteína ativadora 1 (Activator Protein-1 - AP-1): AP-1 se liga ao sítio de ligação
como heterodímeros formados por proteínas derivadas das famílias de genes jun e fos
(Zerial et al., 1989). Foi sugerido que o heterodímero junB e fra-2 que reconhecem
sítios de ligação para AP-1 na LCR do HPV-18 estariam presentes apenas em
queratinócitos (Thierry et al., 1992; Bouallaga et al., 2000). Desta forma, AP-1 poderia
contribuir para a ativação epitélio-específica do enhancer, tendo um papel crítico
durante a expressão de genes precoces do HPV, em particular na expressão das
oncoproteínas E6 e E7 (O'Connor et al., 1995).
30
Fator nuclear 1 (Nuclear Factor 1 - NF1): Atribui-se a NF1 também parte da
especificidade epitelial do enhancer do HPV. Esse gene é expresso a partir de um dentre
quatro genes de uma mesma família, dependendo do tipo celular. Em células epiteliais,
NF1 é composto principalmente de subunidades derivadas do gene NF1-C, cujos
produtos ativam a transcrição do HPV. Em células não epiteliais, entretanto, NF1 é
composto principalmente de subunidades derivadas do gene NF1-X, cujos produtos não
ativam a transcrição viral (Apt et al., 1993, 1994).
Fator de ligação em octâmero -1 (Octamer Binding Factor -1, Oct-1): Quando
presente em células epiteliais em concentrações fisiológicas, Oct-1 se liga a NF-1
estabilizando a ligação deste ao seu sítio de reconhecimento. Esse evento provoca um
aumento dos níveis de transcrição do genoma viral (O’Connor e Bernard, 1995).
Elementos de Resposta à Progesterona (Progesterone Response Element, PRE) e a
glicocorticóides (Glucocorticoid Response Element, GRE): Elementos de resposta à
progesterona e a glicocorticóides estão presentes em enhancers de alguns HPV genitais.
PRE e GRE estimulam a transcrição viral, o que resulta na transformação aumentada de
células em cultura (Chan et al., 1989; Pater et al., 1988). Essas observações in vitro
fornecem uma explicação molecular para a evidência epidemiológica de que mulheres
que são expostas a altos níveis de progesterona por longos períodos apresentam um
maior risco de desenvolverem câncer cervical (Smith et al., 2003).
Fator YY1 (Yin-Yang Factor -1): YY1 é um fator de transcrição multifuncional que
ativa ou reprime a transcrição de muitos genes celulares e virais. Essa versatilidade
funcional pode ser atribuída aos seus múltiplos domínios transcricionais. Foi
demonstrado que YY1 atua sobre a transcrição dos HPV-16 e -18. No HPV-16, atua
como um repressor transcricional (Galvin e Shi, 1997), enquanto que no HPV-18 o fator
YY1 ativa a transcrição. A proteína YY1 pode reprimir a transcrição suprimindo a
atividade de AP-1 (O’Connor et al., 1996) por competir com AP-1 pela ligação a seus
respectivos sítios, que estão sobrepostos na LCR do HPV-16 (Dong e Pfister, 1999). No
contexto da LCR completa do HPV-18, YY1 atua como um ativador ao formar um
complexo com C/EBPβ e se ligar à região localizada a montante do sítio de ligação de
YY1 próximo ao promotor. Os resultados sugerem que o complexo C/EBPβ-YY1 é um
regulador positivo do HPV-18, tendo um papel crítico na regulação da atividade da LCR
(Bauknecht e Shi, 1998).
C/EBP
β (CCAAT Enhancer Binding Protein - beta): C/EBP é um membro de uma
família de fatores transcricionais envolvidos na diferenciação celular. Em células
31
infectadas por HPV-18, um aumento nos níveis de C/EBPβ resulta em forte repressão
da atividade da LCR, por impedir a ligação da proteína TBP, componente do complexo
de iniciação da transcrição, ao sítio de reconhecimento TATA-box na LCR (Bauknecht
e Shi, 1998).
Sp1 (Transcription Factor Specificity Protein 1): Foi demonstrado que Sp1 é essencial
para a transcrição viral a partir do promotor de E6/E7, possivelmente por Sp1 facilitar a
ligação de TBP ao TATA-box na região promotora, aumentando o acesso desse fator ao
seu sítio de reconhecimento na LCR (Gloss et al., 1990; Tan et al., 1994; Rose et al.,
1998).
c-Myc (Cellular Myelocytomatosis Oncogene): Os genes c-myc compreendem uma
pequena família de genes cuja expressão está envolvida no surgimento de diferentes
tipos de tumores em humanos. Na sua forma dimerizada com a proteína c-Max, c-Myc
requer sequências específicas de ligação ao DNA (Berberich et al., 1992). A ligação
deste dímero à LCR é capaz de aumentar a expressão viral dirigida pelo promotor de
E6/E7 de HPV-16 (Nünberg et al., 1995). Adicionalmente, a expressão desregulada de
c-myc leva à um aumento na proliferação celular, inibe a diferenciação celular, reduz a
adesão celular e promove metástase
e instabilidade genômica. Muitos cânceres,
inclusive o câncer cervical, apresentam níveis elevados de c-Myc (Abba et al., 2004;
Adhikary e Eilers, 2005).
2.5.
O câncer do colo do útero
Muitas mulheres adquirem infecções por HPV na adolescência através de
transmissão sexual. Em aproximadamente 80% dessas mulheres, a infecção é
transitória, e não resulta em anormalidades epiteliais. Nas 20% restantes, a infecção por
HPV resulta no desenvolvimento de lesões no colo uterino além de infecção persistente,
um pré-requisito para a transformação maligna (Villa, 1997; Ho et al., 1998) (Figura 8).
32
Figura 8. História natural da infecção pelo HPV. A maior parte das infecções por HPV é subclínica
(sem sintomas). A resposta imune pode erradicar a infecção ou suprimir-la a níveis não detectáveis.
Algumas infecções são suprimidas, mas o genoma do HPV é mantido em estado latente (infecção
subclínica com um pequeno número de células mantendo poucas cópias virais). Ainda não está claro
como ocorre a latência em hospedeiros imunocompetentes e os mecanismos que levam à reativação do
HPV a um estado detectável. Fonte: Modificado de Merk (2006).
O câncer cervical progride a partir de lesões pré-malignas não invasivas,
denominadas neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) ou lesões intraepiteliais
escamosas
(squamous intraepithelial lesions – SIL). Essas lesões pré-malignas são
classificadas histologicamente com base nas atipias
das células epiteliais: NIC I
corresponde a uma displasia
branda; NIC II à displasia moderada e NIC III à displasia
severa e carcinoma
in situ. NIC I é também classificada citologicamente como lesão
intraepitelial escamosa de baixo grau (low-grade SIL – LSIL) e NIC II/III como lesão
intraepitelial escamosa de alto grau (high-grade SIL– HSIL). A infecção, tanto por HPV
oncogênicos como não oncogênicos, pode causar LSIL na cérvice uterina, enquanto que
a maioria das lesões cervicais classificadas como HSIL, carcinoma in situ ou câncer
invasivo apresenta infecção por tipos oncogênicos do HPV (Baseman e Koutsky, 2005;
Doorbar, 2006) (Figura 9).
33
Acreditava-se, até recentemente, que o câncer cervical sempre progredia a partir
de lesões cervicais de baixo grau para moderado e, posteriormente, para de alto grau.
Estudos de história natural, entretanto, têm questionado a noção de estágios pré-
cancerosos progressivos contínuos e levado os pesquisadores a concluir que lesões
cervicais de baixo e alto-grau são processos distintos de infecção por HPV. LSIL parece
ser uma manifestação transitória da infecção viral produtiva, onde o epitélio infectado
por HPV passa pela diferenciação e maturação e exibe apenas pequenas anormalidades
celulares. HSIL, precursor do câncer cervical, ocorre quando a infecção pelo HPV
impede a diferenciação de células epiteliais, levando à replicação celular continua e ao
acúmulo de anormalidades genéticas, que levam ao surgimento de células cancerosas.
LSIL pode se estabelecer antes, ao mesmo tempo, ou na ausência de HSIL (Moscicki et
al., 2006).
Figura 9. Progressão das lesões do colo do útero. As células da camada basal do epitélio cervical se
localizam sobre a membrana basal, que é sustentada pela derme. Os HPV acessam as células basais por
meio de micro abrasões no epitélio cervical. Após a infecção, os genes precoces E1, E2, E4, E5, E6 e E7
são expressos e o DNA viral se replica como DNA epissomal (núcleo roxo). Nas camadas superiores do
epitélio (camadas intermediária e superficial) o genoma viral é replicado em maior escala, e os genes E4,
L1 e L2 são expressos. L1 e L2 promovem a encapsidação dos genomas virais no núcleo, iniciando novas
infecções. Nas lesões epiteliais de baixo grau ocorre a replicação viral produtiva. Uma parte das infecções
por HPV de alto risco progridem para a neoplasia intraepitelial de alto grau (NIC III). A progressão de
lesões não tratadas ao câncer invasivo está associada com a integração do genoma do HPV ao
cromossomo do hospedeiro (núcleo vermelho), com a perda ou rompimento de E2, e a subsequente
superexpressão dos oncogenes E6 e E7. Fonte: Modificado de Woodman et al. (2007).
34
2.5.1. Co-fatores no desenvolvimento do câncer cervical
Embora muitas mulheres sejam infectadas por HPV, a maioria não irá
desenvolver o câncer cervical. Portanto, outros fatores provavelmente estão envolvidos
no desenvolvimento desta neoplasia. Os três principais grupos de co-fatores são (Muñoz
et al., 2000):
• Co-fatores ambientais ou exógenos, incluindo contraceptivos hormonais,
tabagismo, número de partos e co-infecções com outros agentes sexualmente
transmissíveis;
• Co-fatores virais, como infecção por tipos oncogênicos de HPV, co-infecção
com outros tipos de HPV ou variantes, carga viral e integração viral;
• Co-fatores do hospedeiro, incluindo hormônios endógenos, fatores genéticos e
outros fatores relacionados à resposta imune.
O número elevado de partos leva à manutenção da zona de transformação
na exocérvice por longos períodos, sendo associada a um maior risco de
desenvolvimento de lesão cervical (Autier et al., 1996). Desta forma, esse fator de
risco poderia permitir uma exposição mais prolongada da zona de transformação
ao HPV. Os efeitos do tabagismo no desenvolvimento do carcinoma incluem
redução da resposta imune na cérvice uterina e dano genético direto causado pela
carcinogênese relacionada ao tabaco (Vaccarella et al., 2008). Os contraceptivos
hormonais podem agir como co-fatores no desenvolvimento do câncer cervical
devido ao aumento da expressão gênica do HPV na cérvice através de elementos de
resposta a hormônios (estrógeno e/ou progesterona) presentes na LCR do HPV
(Chan et al., 1989).
Fatores genéticos também podem constituir um risco adicional para o
desenvolvimento do câncer do colo do útero. Os polimosfismo nos genes HLA
(human leucocyte antigen), cujas proteínas expressas estão envolvidas na
apresentação de peptídeos antigênicos às células T CD4+, parecem estar
envolvidos na susceptibilidade genética ao desenvolvimento de câncer cervical
(Maciag et al., 2002). A resposta imunológica do hospedeiro também parece ser
um fator importante no desenvolvimento de câncer cervical, uma vez que mulheres
infectadas com HIV têm uma probabilidade aproximadamente quatro vezes maior
de serem infectadas por HPV. Além disso, a infecção por HPV em mulheres co-
infectadas com HIV tem maior probabilidade de se tornar persistente (del Mistro e
Bianchi, 2001).
35
2.5.2. Prevenção
A estratégia mais utilizada para prevenção do desenvolvimento do câncer de
colo do útero é o exame de Papanicolau. Este baseia-se na coloração de células
epiteliais obtidas da cérvice, na expectativa de que anormalidades nucleares detectáveis
sejam representativas de lesões subjacentes definidas histologicamente. Esse exame
reduz a incidência do câncer de colo do útero ao permitir a detecção, possibilitando a
excisão das neoplasias intraepiteliais cervical (NIC) ou do adenocarcinoma
in situ (AIS)
antes do desenvolvimento do câncer invasivo. Apesar de o diagnóstico ser subjetivo, o
exame de Papanicolau é considerado o procedimento de maior sucesso no controle do
câncer cervical, sendo observada uma redução em até 70% na incidência de câncer
cervical, com a aplicação efetiva desse exame em países desenvolvidos (Bosch e
Harper, 2006).
2.5.3. Vacinas contra o câncer cervical
Nos últimos anos as atenções se voltaram para a possibilidade de prevenir lesões
pré-cancerosas e o câncer cervical por meio de vacinação contra o HPV (Harper et al.,
2004; Reddy et al., 2004; Franco e Harper, 2005; Villa et al., 2005; Lowy e Schiller,
2006). As duas vacinas profiláticas que foram desenvolvidas e comercializadas, até o
momento, têm como alvos erradicar as infecções por HPV-16, -18, -6 e -11 (Harper et
al., 2004; Villa et al., 2005). Esses tipos de HPV foram escolhidos devido aos HPV-16
e -18 serem os tipos mais frequentemente associados ao desenvolvimento do câncer
cervical no mundo, e responsáveis por cerca de 70% dos casos de câncer de colo do
útero e neoplasias intraepiteliais de alto grau; e os HPV de baixo risco -6 e -11 causarem
cerca de 90% das verrugas anogenitais. A vacina fabricada pelo laboratório Merck
Sharp e Dhome, internacionalmente conhecida como Gardasil®, é uma vacina
quadrivalente que apresenta partículas semelhantes à vírus (VLP - virus like particles)
dos HPV-16, -18, -6 e -11 (Villa et al., 2005), e a desenvolvida pela empresa Glaxo
SmithKline, denominada Cervarix®, é uma vacina bivalente, contendo VLP dos HPV-
16 e -18 (Harper et al., 2004). As vacinas mostraram uma eficiência de 100% na
proteção contra o desenvolvimento de lesões cervicais pré-cancerosas e, no caso da
Gardasil®, verrugas genitais causados pelos tipos de HPV presentes na vacina, com
pouco ou nenhum efeito colateral. A expectativa é de que os efeitos de proteção das
vacinas durem pelo menos quatro anos e meio a partir do início da vacinação. Ambas as
36
vacinas foram aprovadas pelas autoridades regulatórias dos Estados Unidos e pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) no Brasil.
Em adição às vacinas preventivas, estão sendo realizadas pesquisas para o
desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra HPV. Em geral, essas vacinas têm
como alvo as oncoproteínas E6 e E7. Dessa forma, espera-se que a resposta imune
contra essas duas oncoproteínas possa erradicar os tumores já estabelecidos (Roden et
al., 2004).
As vacinas contra HPV prometem contribuir muito para a prevenção do câncer
cervical. Entretanto, algumas questões ainda não foram suficientemente discutidas,
como a população alvo, a duração da proteção, o custo, a aceitação pública e o potencial
para distribuição mundial (Speck e Tyring, 2006). Além disso, não está clara a extensão
em que ocorre reatividade cruzada na resposta imune entre variantes intratipo e entre
tipos do HPV. Substituições de aminoácidos observadas na proteína L1 de HPV-16 e
localizadas perto de epítopos neutralizantes sugerem que infecções por variantes podem
evoluir para o escape da neutralização pelo sistema imune do hospedeiro (Varsani et al.
2006). Assim, mutações pontuais poderiam afetar seriamente a eficácia das vacinas
contra HPV, sendo importante determinar os efeitos das mutações sobre a neutralização.
Além disso, é possível que a esperada diminuição do número de infecções pelos tipos
contemplados nessas vacinas seja acompanhada pelo aumento de infecções por outros
tipos de HPV mucosotrópicos de alto risco.
2.6.
Epidemiologia da infecção por HPV
Mundialmente, nota-se uma distribuição diversificada da prevalência dos
diferentes tipos de HPV, no entanto, essa observação ainda tem determinantes
desconhecidos. Estudo sobre a distribuição mundial dos tipos de HPV em mulheres
assintomáticas revelam que o HPV-16 é o mais comum no mundo todo. Esse tipo foi, ao
menos, duas vezes mais freqüente que qualquer outro tipo de alto risco oncogênico em
todas as regiões, com exceção da África sub-Saariana, onde o HPV-35 é igualmente
comum. Em seguida, os tipos de HPV mais comumente detectados no mundo entre
mulheres citologicamente normais foram -42, -58, -31 e -18, com diferenças
significativas entre as regiões. O segundo tipo de HPV mais comum foi o -33 na Ásia, -
58 na América do Sul e -31 na Europa (Clifford et al., 2005). Essa heterogeneidade na
distribuição mundial dos tipos do HPV pode ter implicações no desenvolvimento e no
impacto de testes de diagnóstico e vacinas (Figura 10).
37
Figura 10. Distribuição de tipos de HPV em mulheres citologicamente normais por região. Fonte:
Modificado de Clifford et al. (2005)
A associação de tipos específicos de HPV com lesões cervicais de alto grau
refletem o maior potencial oncogênico desses tipos. Os HPV -6, -11 e -42 estão
associados, principalmente, ao desenvolvimento de verrugas genitais benignas e NIC de
baixo grau (Wiley et al., 2002), enquanto outros tipos, como -16, -18 e, menos
freqüentemente, -45, -31, -33, -58, -52, e -35, foram identificados como os principais
causadores da maioria dos casos de câncer cervical e suas lesões precursoras de alto
grau (Clifford et al., 2003) (Figura 11).
O HPV-16 é encontrado em mais de 50% dos cânceres cervicais escamosos,
seguido do HPV-18, enquanto que, nos casos de adenocarcinoma, se observa o
contrário, sendo o HPV-18 mais prevalente que o HPV-16 (Arends et al., 1993; Lizano
et al., 1997). Esses dois tipos virais são responsáveis por dois terços de todos os
38
carcinomas cervicais no mundo. Estima-se que o HPV-16 seja responsável por cerca de
60% dos cânceres cervicais, com o HPV-18 contribuindo com 10 a 20% (Clifford et al.,
2003).
Taxonomicamente, os HPV dos tipos -31, -33, -35, -52, -58 pertencem à espécie
Human Papillomavirus 16 do gênero Alphapapillomavirus, e estão entre os oito tipos de
HPV mais prevalentes no câncer cervical invasivo (Clifford et al., 2003) (Figura 3).
Apesar de serem tipos virais relacionados ao HPV-16, as prevalências mundiais desses
tipos no câncer cervical é bastante distinta (Figura 11). Comparado com a citologia
normal, o risco relativo para câncer cervical invasivo dos tipos relacionados ao HPV-16
foi de 14,88, além de terem sido observados riscos elevados para os HPV-31 (RR= 3,4),
-33 (RR= 3,4), -52 (RR =12,8) e -58 (RR= 11,2) (Ferrera et al., 1999).
Figura 11. Distribuição de tipos de HPV no câncer cervical. (A) Número total de casos de câncer
cervical no mundo por tipo histológico, (B) Número total de casos de câncer cervical na Ásia. Fonte:
Modificado de Clifford et al. (2003).
É interessante observar que os HPV-52 e -58 são particularmente mais
prevalentes na Ásia (Clifford et al., 2003) (Figura 11). No Japão, o segundo genótipo
mais comum entre lesões de alto grau é o HPV-58, cuja prevalência é de 15%,
seguido do HPV-52 (12%) (Sasagawa et al., 2001). Assim como no Japão, em
Hong Kong, China, o segundo genótipo mais freqüentemente detectado é o HPV-
58 (23,8%). Nesse estudo, foi observado que o HPV-58 apresentou uma associação
significativa com o desenvolvimento de NIC e carcinoma cervical (RR = 3,98),
além de uma tendência significativa de aumento da prevalência desses tipos com o
aumento da severidade das lesões (Chan et al., 1999). Lin et al. (2006) também
observaram que o HPV-52 é o segundo tipo de HPV mais prevalente (21,3%),
seguido do HPV-58 (19,9%) em amostras de mulheres infectadas com tipos de alto
risco em Taiwan, China. Além disso, o HPV-52 (23,2%) é o tipo de HPV mais
A B
39
prevalente nas Filipinas em amostras de mulheres com lesão cervical, seguido dos
HPV-16 (19,6%) e -58 (10,7%) (Miyashita et al., 2009).
A alta prevalência do HPV-58 também tem sido relatada em outros continentes,
em regiões geográficas específicas. Interessantemente, em um estudo na fronteira entre
os Estados Unidos e o México, foi observado que o HPV-16 é o genótipo mais
comumente encontrado, tendo sido detectado em 27,3% das mulheres mexicanas e em
12,5% das mulheres americanas que apresentavam lesões de alto grau. O segundo
genótipo mais frequentemente detectado na população mexicana é o HPV-58, enquanto
que, entre as mulheres americanas, é o HPV-18 (Giuliano et al., 2001). Em um estudo
com pacientes da população em geral na Espanha, as mulheres de origem latina
apresentavam como segundo anticorpo mais prevalente o anti-HPV-58, o qual foi
detectado em 42,7% das mulheres. Entretanto, entre as mulheres européias estudadas, o
segundo anticorpo mais detectado foi o anti-HPV-31 (29,3%), seguido do anti-HPV-18
(24,1%) (Touze et al., 2001).
Os dados sobre as prevalências dos diferentes tipos de HPV no Brasil ainda são
bastante limitados, entretanto, a distribuição desses tipos não parece ser homogênea por
todo país. Como relatado mundialmente, o HPV-16 (35,5%) é o tipo mais prevalente
entre amostras de HSIL de mulheres do Rio de Janeiro, sendo o segundo tipo mais
prevalente o HPV-18 (11,2%), seguido dos HPV-35 (4,6%) e -58 (3,9%) (Pereira et al.,
2007) Um estudo, realizado em Recife, Pernambuco, em amostras de mulheres com
lesão cervical, mostrou que o HPV-16 (55,1%) é o tipo de HPV mais frequentemente
detectado, seguido dos HPV-31 (15,6%), HPV-33 (10,2%), HPV-58 (8,2%) e HPV-18
(4,7%) (Lorenzato et al., 2000). Em Belém, Pará, Noronha et al. (1999) observou que
21,2% das amostras de neoplasia intraepitelial cervical II e III (NIC II e III)
apresentavam HPV dos genótipos -31, -33 e -58. Em estudos desenvolvidos pelo nosso
grupo de pesquisa no Distrito Federal com amostras de lesão cervical, a prevalência do
HPV-16 é de 49,2%, seguido pelo HPV-58 (13,43%). O HPV-31, terceiro tipo mais
frequentemente detectado, apresentou uma prevalência de 11,9%; os HPV-18 e -33,
4,5%, sendo os quintos tipos mais prevalentes; e os HPV-35 e -52, sétimos tipos mais
freqüentes, apresentaram a prevalência de 1,5% (Câmara et al., 2003). A análise de
amostras HIV positivas revelou a prevalência de HPV-16 e HPV-52 em 14,1% e 9,2%,
das amostras, respectivamente. O terceiro genótipo mais prevalente é o HPV-35 (7,8%),
seguido dos HPV-58 (4,7%) e -31 (3,1%) (Cerqueira et al., 2007).
40
2.7.
Estudos da variabilidade genética
Há indicações de que variantes do mesmo tipo de HPV diferem em suas
propriedades biológicas e patogênicas (Xi et al., 2007; Bernard, 2005). Tais diferenças
podem contribuir para as disparidades na incidência de câncer cervical em todo o
mundo. Variantes de um mesmo tipo de HPV também parecem apresentar diferenças
quanto ao risco de progressão das lesões. A variabilidade genética dos HPV de alto
risco, mais frequentemente ligados ao câncer anogenital, -16 e -18, têm sido
extensivamente estudados (Xi et al., 1997; Zehbe et al., 1998; Schmidt et al., 2001;
Tornesello et al., 2000; Arias-Pulido et al., 2005; de Boer et al., 2004, 2005; Wu et al.,
2006; Xi et al., 2006; Alencar et al., 2007).
Estudos de variabilidade genética de isolados de HPV-16 e HPV-18 coletados
nos 5 continentes revelaram uma co-evolução destes vírus com os três maiores ramos
filogenéticos humanos (africanos, caucasianos e asiáticos) (Ho et al., 1993; Ong et al.,
1993). A Figura 12 mostra a árvore filogenética do HPV-16, destacando os cinco clados
nos quais os variantes foram agrupados: Europeu (E), Asiático (As), Asiático–
Americano (AA), Africano 1 (Af-1) e Africano 2 (Af-2) (Ho et al.,1993).
Figura 12. Árvore filogenética do HPV-16. Os variantes foram caracterizados baseado na seqüência
de um fragmento de 364pb da LCR. Foram analisadas 301 amostras provenientes de 25 grupos étnicos
distintos. Fonte: Ho et al. (1993).
Estudos foram realizados com o objetivo de investigar se os modelos de
diversidade intratipo observados para os HPV-16 e -18 poderiam ser aplicados para
outros HPV de alto risco associados ao câncer cervical. Esses estudos multicêntricos
41
analisaram a diversidade genética da LCR dos HPV-31, -35, -52 e -58 (Calleja-Macias
et al., 2004, 2005) e dos HPV-53, -56 e -66 (Prado et al., 2005; Kocjan et al., 2007).
Além disso, Khouadri et al. (2006) analisaram filogenéticamente as sequências de
variantes do HPV-33. Em geral, esses autores observaram poucas semelhanças com os
padrões observados na análise de variantes dos HPV-16 e -18, mostrando uma alta
conservação das sequências da LCR entre os variantes destes tipos virais. Alguns ramos
com poucos isolados de lugares geográficos específicos foram encontrados entre os
variantes dos HPV-31, -52, -53 e -56, além da ramificação dicotômica das árvores dos
HPV-33, -35, -53 e -56, nunca antes descrita para variantes de HPV, e a ausência de
qualquer associação geográfica para os variantes do HPV-58 e -66.
A análise filogenética de 67 amostras de HPV-31, nos quais foram detectados 28
variantes distintos, revelou a presença de dois ramos com poucos isolados de regiões
restritas, um com amostras da África do Sul e outro com amostras do México (Calleja-
Macias et al., 2004, 2005) (Figura 13). Em ambos estudos conduzidos por Calleja-
Macias et al. (2004) e Khouadri et al. (2006), 25 variantes de HPV-33 (Figura 14) e 12
variantes de -35 (Figura 15) analisados formaram dois agrupamentos marcadamente
separados pela ausência ou presença de uma deleção de 78pb e uma inserção de 16pb,
respectivamente, na LCR desses isolados, o que conferiu à árvore filogenética de ambos
tipos virais uma topologia dicotômica. Similarmente à filogenia do HPV-16, foi
sugerida a presença de um ramo Asiático-Nativo Americano, formado por isolados de
Hong Kong, Taiwan, Tailândia, Brasil e México, na análise filogenética de 66 amostras
do HPV-52 (Figura 16). A árvore filogenética de 97 isolados (21 variantes) do HPV-58
mostrou a mais alta conservação das sequências da LCR entre os tipos relacionados
taxonomicamente ao HPV-16 (Figura 17).
42
Figura 13. Diversidade intratípica do HPV-31. As árvores filogenéticas mostram a relação entre os
28 variantes obtidos a partir da análise da LCR de 67 amostras. Os triângulos indicam as sequências dos
variantes detectados e utilizadas na árvore menor. São Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei,
México (MX); Cidade do Cabo, África do Sul (SA); Estados Unidos (USA); Marrocos (MR); Noruega
(NW); Mali (ML); Timor-Leste (TL); Taipei, Taiwan (TW). Fonte: Calleja-Macias et al. (2005).
43
Figura 14. Diversidade intratípica do HPV-33. As árvores filogenéticas mostram a relação entre os
25 variantes obtidos a partir da análise da LCR de amostras de HPV-33. As árvores mostram a relação
entre os nove variantes obtidos a partir da análise da LCR de 44 amostras. BR: São Paulo, Brasil; MT:
Montreal, Fonte: Khouadri et al. (2006).
44
Figura 15. Diversidade intratípica do HPV-35. As árvores filogenéticas mostram a relação entre os
12 variantes obtidos a partir da análise da LCR de 46 amostras. Os triângulos indicam as sequências dos
variantes detectados e utilizadas na árvore menor. São Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei,
México (MX); Cidade do Cabo, África do Sul (SA) e Estados Unidos (USA); Marrocos (MR); Noruega
(NW); Heidelberg, Alemanha (HE); Taipei, Taiwan (TW). Fonte: Calleja-Macias et al. (2005).
45
Figura 16. Diversidade intratípica do HPV-52. As árvores filogenéticas mostram a relação entre os
17 variantes obtidos a partir da análise da LCR de 66 amostras. Os triângulos indicam as sequências dos
variantes detectados e utilizadas na árvore menor. São Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei,
México (MX); Edimburgo, Escócia (ED); Cidade do Cabo, África do Sul (SA) e Oklahoma, Estados
Unidos (OK); Marrocos (MR); Noruega (NW); Heidelberg, Alemanha (HE); Filipinas (PH); Taipei,
Taiwan (TW). Fonte: Calleja-Macias et al. (2005).
46
Figura 17. Diversidade intratípica do HPV-58. As árvores filogenéticas mostram a relação entre os
21 variantes obtidos a partir da análise da LCR de 97 amostras. Os triângulos indicam as sequências dos
variantes detectados e utilizadas na árvore menor. São Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei,
México (MX); Edimburgo, Escócia (ED); Cidade do Cabo, África do Sul (SA) e Oklahoma, Estados
Unidos (OK); Taipei, Taiwan (TW) e Filipinas (PH). Fonte: Calleja-Macias et al. (2005).
47
2.8.
Variabilidade genética e potencial oncogênico
Algumas diferenças na sequência de nucleotídeos encontradas entre os
variantes de um tipo, podem levar a alteração nos aminoácidos codificados, levando a
potenciais oncogênicos distintos entre os diferentes variantes. Mutações na sequência de
nucleotídeos da região LCR poderiam resultar na perda da capacidade de ligação de um
fator transcricional específico, na mudança do seu sítio de reconhecimento, aumentando
ou diminuindo a afinidade de fator de transcrição específico, ou, ainda, na alteração de
sua habilidade em interagir com outras proteínas (Bernard, 2002). Na proteína L1, uma
ou mais alterações de aminoácidos poderia representar uma mudança conformacional na
proteína do capsídeo e, assim, poderia afetar, também, a conformação de epitopos
relevantes para neutralização viral (Sichero e Villa, 2006) (Tabela 1).
Diferentes estudos têm sido conduzidos com o intuito de analisar a associação
entre um maior risco de infecção persistente e/ou desenvolvimento de lesões cervicais e
variantes específicos dos HPV-16 e -18. Os diferentes tipos de HPV têm potencial
oncogênico distinto e, da mesma forma, os variantes intratipo também podem apresentar
oncogenicidade diferenciada. Vários estudos sugerem que os variantes Europeus estão
associados a um menor risco de desenvolvimento de lesões de alto grau, enquanto que
variantes não-Europeus estariam associados a um maior risco de incidência e
prevalência dessas lesões (Xi et al., 1997; Villa et al., 2000; Berumen et al., 2001,
Hildesheim et al., 2001; Xi et al., 2006). Além disso, variantes não-Europeus, tanto do
HPV-16 quanto do HPV-18, têm sido associados com um maior risco de infecções
persistentes (Villa et al., 2000; Xi et al., 2006).
48
Tabela 1. Implicações funcionais da variabilidade genética do HPV. Fonte: Modificado de Sichero e
Villa (2006).
Região
variável
Implicações funcionais
Mudança na afinidade de ligação de diferentes fatores celulares de transcrição
Criação ou eliminação de sítios de ligação de fatores transcricionais
LCR
Mudança na atividade transcricional
Maior ativação da telomerase
Mudança na ligação e degradação de proteínas celulares
Mudança na ativação de vias celulares
Geração e manutenção do fenótipo transformado
E6
Monitoramento imune do hospedeiro
Mudança na ligação a proteínas celulares
Mudança na ativação de vias celulares E7
Geração e manutenção do fenótipo transformado
E5 Mudança na atividade de transformação
L1
Alteração de epitopos de L1 dependentes de conformação e que são relevantes
para neutralização viral
Mudança na atividade transcricional
Maior tendência de integração E2
Maior eficiência na replicação
Até o momento, foram realizados poucos estudos sobre os variantes de outros
tipos de HPV de alto risco menos prevalentes que os HPV-16 e -18. O conhecimento
sobre a variabilidade genética desses tipos e sua relação com o desenvolvimento de
câncer cervical, portanto, ainda é bastante limitado. Foi observada uma associação entre
variantes específicos dos HPV-33, -35, -52 e -58 com a persistência da infecção e com a
severidade da neoplasia. Gagnon et al. (2004) mostraram que a presença de uma
deleção de 78pb na LCR de variantes de HPV-33 e polimorfismos específicos do gene
E7 de variantes de HPV-35 estão associados com a persistência da infecção por esses
vírus. Além disso, foi detectada uma associação entre um polimorfismo na seqüência da
LCR do HPV-33 e a presença de HSIL (Khouadri et al., 2006). A variabilidade genética
na LCR de variantes de HPV-52 também foi associada à persistência da infecção (Aho
et al., 2004). Na análise da diversidade das sequências de E6 e E7 de variantes de HPV-
58 (Chan et al., 2002) e -52 (Aho et al., 2003), foi observado que a variabilidade
genética era maior na região do gene E7 que em E6, em contraste com o HPV-16, onde
E6 apresenta maior variabilidade que E7 (Zehbe et al.,1998; Nindl et al., 1999). Além
disso, foi observado que variantes de E7 de HPV-58 contendo a substituição T20I/G63S
estavam significativamente associados com o aumento do risco de desenvolver câncer
cervical (Chan et al., 2002).
49
3. Justificativa e Objetivos
Até o momento, poucos estudos foram realizados envolvendo os variantes de
tipos de HPV de alto risco oncogênico menos prevalentes que os HPV-16 e -18. Estudos
sobre a variabilidade genética intra-típica de HPV são importantes, visto a associação
positiva de variantes específicos de HPV-16 e -18 e o risco de desenvolvimento de
lesões cervicais (Xi et al., 2006; Sichero et al., 2007), além das diferenças bioquímicas
e biológicas exibidas entre esses variantes (Stöppler et al., 1996a; Choo et al., 2000;
Lichtig et al., 2006).
A análise da atividade transcricional viral tem sido empregada no intutito de
estabelecer relações entre substituições nucleotídicas específicas na LCR e diferenças
no potencial de malignidade entre os diferentes variantes de HPV-16 e 18 (Veress et al.,
1999; Kämmer et al., 2000; Tornesello et al., 2000; Sichero et al., 2005). Ao contrário
do que é observado para os HPV-16 e -18, nenhum trabalho até o momento analisou a
atividade transcricional de variantes de outros tipos de HPV de alto risco.
Em algumas regiões do Brasil, incluindo a Centro-Oeste, existe uma carência de
dados sobre os variantes intratipo de HPV em amostras de câncer cervical,
especialmente no que concerne a tipos menos prevalentes. Nosso grupo iniciou a
caracterização de variantes dos HPV de alto risco oncogênico de amostras oriundas do
Distrito Federal, além dos HPV-16 e -18. Cerqueira et al. (2003) e Veras et al. (2005)
analisaram sequências de L1 de amostras do Distrito Federal previamente
genotipadas como HPV-53, -58 e -66, permitindo a caracterização de novos
variantes, contendo ou não substituições não silenciosas. A detecção de novos
variantes também foi observada no estudo desenvolvido por Wyant (2007) onde
foram analisadas a variabilidade genética da LCR e dos genes E6 e L1, além da
filogenia dos HPV-53, -56 e -66.
Adicionalmente, as seqüências da LCR de variantes de HPV-58 foram objeto de
pesquisa do nosso grupo de estudo. Três variantes de HPV-58 detectados no Distrito
Federal foram caracterizadas juntamente com outras obtidas de amostras de HPV-58
oriundas de São Paulo, como parte do estudo internacional multicêntrico coordenado
internacionalmente pelo Dr. Hans-Ülrich Bernard (Universidade da Califórnia-Irvine,
EUA) e no Brasil pela Dra. Luisa Lina Villa (Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o
Câncer, São Paulo) (Calleja-Macias et al., 2005).
50
Devido à importância epidemiológica do HPV-58 em vários países do
mundo, torna-se fundamental ampliar o conhecimento acerca de suas
características e propriedades moleculares para que este tipo de HPV seja
considerado na elaboração de vacinas e para compreender a associação do HPV-58
com determinadas populações, como o que é observado em alguns países da Ásia,
América Latina e nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste do Brasil (Câmara et
al., 2003, Chan et al., 1999, Giuliano et al., 2001, Lorenzato et al., 2000, Noronha
et al.,1999, Touze et al., 2001, Sasagawa et al., 2001).
Estudos epidemiológicos mostraram que os HPV-31, -33, -35, -52 e -58 estão
entre os dez tipos de HPV mais prevalentes em amostras de câncer cervical (Clifford et
al., 2003; IARC, 2007). O presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento
sobre a variabilidade genética desses tipos de HPV de alto risco oncogênico, além
de verificar a possível implicação que as variações nucleotídicas na LCR podem
ter sobre a atividade transcricional dos variantes de HPV-58 detectados no Distrito
Federal. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram:
3.1.
Gerar dados sobre a variabilidade genética da LCR e dos genes L1 e E6 de
isolados de HPV-31, -33, -35, -52 e -58 encontrados no Distrito Federal;
3.2.
Descrever a composição de potenciais sítios de ligação para fatores
transcricionais celulares e viral na LCR do variante protótipo destes tipos
virais;
3.3.
Verificar quais alterações na sequência de nucleotídeos da LCR dos
variantes moleculares poderiam estar associadas à diferenças na ligação de
fatores de transcrição celulares e viral;
3.4.
Verificar se as variações nucleotídicas nos genes E6 e L1 resultam em
subtituições de aminoácidos conservativas ou não;
3.5.
Comparar a variabilidade genética das regiões LCR, E6 e L1 dos isolados
do Distrito Federal com a descrita na literatura;
3.6.
Realizar a análise filogenética desses cinco tipos de HPV e comparar os
resultados obtidos em outros estudos;
3.7.
Analisar a atividade transcricional dos variantes e mutantes de HPV-58
detectados no Distrito Federal;
3.8.
Divulgar os resultados obtidos por meio de publicações científicas e em
eventos nacionais e internacionais sobre o tema.
51
4. Material e Métodos
4.1.
Procedência das amostras
Amostras de DNA de doze isolados de HPV-31, sete de HPV-33, seis de HPV-35,
quatro de HPV-52 e oito de HPV-58 foram obtidas a partir da descamação de células do
colo uterino de pacientes atendidas em hospitais da rede pública do DF e entorno em
estudos conduzidos por Câmara et al. (2003) e Cerqueira et al. (2007). Para todas as
pacientes, foram realizadas análises citológicas e ambos os estudos foram aprovados
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Secretaria de Estado de Saúde do Governo do
Distrito Federal. Essas amostras foram previamente genotipadas por meio da
amplificação de um fragmento do gene L1 com os iniciadores MY09/11, seguida da
digestão do produto amplificado com sete enzimas de restrição (Bam HI, DdeI, HaeIII,
HinfI, PstI, RsaI e Sau3AI) e posterior análise do perfil de digestão (Bernard et al.,
1994) ou por seqüenciamento automático.
4.2.
Amplificação do DNA Viral
Para a análise de variabilidade genética foram amplificadas as regiões
genômicas LCR, E6 e L1 das amostras de HPV-31, -33, -35, -52 e -58 descritas
anteriormente. Para a amplificação das regiões LCR e E6 de amostras de HPV-31, -35, -
52 e do gene E6 de amostras de HPV-58 foram utilizados iniciadores específicos
descritos por Calleja-Macias et al. (2004, 2005). Iniciadores específicos foram também
desenhados para a amplificação da LCR e do gene E6 de amostras de HPV-33 e da LCR
de amostras de HPV-58 (Tabela 2). Adicionalmente, as amostras de todos os tipos virais
analisados foram amplificadas utilizando-se os iniciadores MY09/MY11 para a análise
da sequência de um fragmento de aproximadamente 450pb do gene L1 (Manos et al.,
1989).
52
Tabela 2. Iniciadores específicos desenhados para a amplificação da região LCR do HPV-33 e do
gene E6 dos HPV-33 e -58.
Iniciador
*
Posição
nucleotídica
**
Sequência do iniciador
Tamanho do
fragmento
33LCR-F 7057 – 7076 cacatcgtctgcaaaacgca
33LCR-R 154 – 174 agttgtctccaatgcttggca
1027pb
33E6-F 29 - 50 gtagggtgtaaccgaaagcggt
33E6-R 580 - 601 tcctttaacgttggcttgtgtc
573pb
58LCR-F 7091 - 7115 cctactacccgtgcaccatccacc
58LCR-R 121 – 145 cgcagaggagaaaccacggacattg
878pb
*
Os iniciadores estão na orientação 5’ → 3’.
**
Posições relativas às sequências protótipos do HPV-33 (número de acesso: M12732) e HPV-58
(número de acesso: D90400), disponíveis no GenBank.
As reações de PCR (Polimerase Chain Reaction) foram realizadas no
termociclador MJ Research PTC-100 (GMI, Minnesota, EUA), em um volume final de
50µL, contendo 10-15µL do material genômico obtido, 1,5mM de MgCl
2
(Invitrogen,
Califórnia, EUA), 250µM de dATP, dCTP, dTTP e dGTP (Invitrogen, Califórnia,
EUA), 40pmoles de cada iniciador e 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen,
Califórnia, EUA). As seguintes condições foram adotadas: 40 ciclos de desnaturação a
95°C por 1minuto, anelamento a 51 ou 55°C por 1minuto e alongamento a 72°C por
2minutos. A desnaturação do primeiro ciclo e o alongamento do último ciclo foram
estendidos por 5 e 8 minutos, respectivamente.
Todas as reações de PCR incluiram controles negativos consistindo da mistura
de reação, porém sem DNA. Os produtos de PCR obtidos foram analisados por
eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio a 0,5%.
4.3.
Clonagem dos produtos de PCR
4.3.1. Obtenção dos plasmídios recombinantes
Após a amplificação, 3 amostras de HPV-58 foram purificadas utilizando-se o
kit DNA and gel band purification (Amersham Biosciences, Nova Jérsei, EUA), de
acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, a eficiência da purificação foi
avaliada por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio a 0,5%.
A reação de ligação dos produtos de PCR ao plasmídio pGEM-T easy (Promega,
Madison, EUA) foi realizada seguindo as instruções do fabricante.
53
Além disso, os produtos de PCR de 8 amostras que apresentavam co-infecção
por mais de um tipo de HPV também foram clonados em pGEM-T easy (Promega,
Madison, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Este procedimento foi
realizado para a seleção dos clones que apresentavam fragmentos de DNA referente a
um dos cinco tipos de HPV analisados neste estudo. Foram sequenciados pelo menos
dois clones do mesmo tipo viral para cada região genômica.
4.3.2. Transformação de bactérias E. coli
Os plasmídios recombinantes foram utilizados para transformar bactérias E. coli
da linhagem DH5α, pelo método de choque térmico. Inicialmente, 10µL da solução
contendo os plasmídios foram incubados com 300µL das células competentes em gelo
por 30 minutos. Em seguida, as células foram submetidas a 42°C por 2 minutos, em
banho-maria, e novamente transferidas para o gelo por 1 minuto. Foram adicionados aos
tubos 700µL de meio líquido 2xYT (1,6mg/mL de triptona, 1,0mg/mL de extrato de
levedura e 85,6mM de NaCl) que em seguida foram incubados a 37 °C por 1 hora. Após
a incubação, os tubos foram centrifugados por 1 minuto a 10.000 rpm na centrífuga
Jouan A14/V1 (Jouan,
St-Herblain, França)
, e 700µL do sobrenadante foram
removidos por aspiração. As bactérias foram espalhadas em placas de Petri contendo
meio sólido 2xYT (ágar a 1,5%), contendo 16,7 nmol de IPTG, 800ng de X-Gal e
4mg/mL de ampicilina.
As placas de Petri foram incubadas por aproximadamente 12 horas em estufa a
37°C. As colônias formadas foram de dois tipos: azuis, quando apenas o vetor re-
circularizado foi incorporado, e brancas, indicando a presença do fragmento de interesse
inserido no vetor, uma vez que o gene Lac-Z fica interrompido. Assim, a enzima β-
galactosidase não é codificada e, portanto, mesmo na presença do indutor (IPTG), o
análogo da lactose (X-gal) não é clivado e, não há deposição do pigmento azul. As
colônias brancas, correspondendo aos clones recombinantes, foram transferidas para um
tubo contendo 6ml de meio de cultura líquido 2xYT e 6µl de ampicilina (50µg/ml), e
incubadas a 37°C por aproximadamente 12 horas, sob agitação.
O DNA plasmidial foi extraído utilizando-se o o kit Wisard
TM
Plus SV Minipreps
DNA Purification System (Promega, Madison, EUA) seguindo as instruções do
fabricante.
54
4.4.
Sequenciamento de DNA
Os produtos de PCR que apresentaram o tamanho esperado foram
purificados por precipitação com acetato de amônio 7,5M e etanol 100% e
sequenciados automaticamente pelo método dideoxi-terminal fluorescente
utilizando-se o DYEnamic™ ET Dye Terminator Kit (MegaBACE™ Amersham
Pharmacia Biotech, NY, USA), no Sistema Molecular Dynamics MegaBACE 500 plus
(Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA) no laboratório de Biologia Molecular da
Universidade de Brasília, ou na plataforma de seqüenciamento da EMBRAPA –
CENARGEN utilizando-se o Kit ABI PRISM® BigDye
TM
Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction (Applied Biosystems, Califórnia, EUA). As reações de
sequenciamento foram realizadas com os mesmos iniciadores utilizados para a
amplificação das amostras. Os plasmídios recombinantes obtidos da clonagem dos
produtos amplificados das amostras com infecção por múltiplos tipos de HPV
foram sequenciados diretamente utilizando-se os iniciadores universais M13, que
anelam na sequência do vetor pGEM-T easy próximo ao sítio de clonagem
múltiplo, amplificando, assim, a sequência introduzida.
4.5.
Análise das sequências de DNA obtidas
A qualidade das sequências obtidas nas reações de sequenciamento automático
foi analisada pelo programa PHRED (Ewing et al., 1998). As comparações foram
realizadas usando-se o programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
(Altschul et al., 1990), disponível no sítio www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. As
sequências foram analisadas quanto às divergências nucleotídicas em relação às
sequências protótipos dos HPV-31 (número de acesso: J04353), -33 (número de acesso:
M12732), -35 (número de acesso: M74117), -52 (número de acesso: X74481) e -58
(número de acesso: D90400), disponíveis no GenBank, no sítio www.ncbi.nlm.nih.gov.
O alinhamento das sequências protótipos e das amostras em ambas as orientações foi
realizado pelo programa CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) e otimizado por
inspeção visual do cromatograma gerado para cada sequência por meio do programa
Chromas© (Technelysium Pty). As sequências de aminoácidos foram deduzidas e
comparadas à sequência protótipo correspondente ao tipo dos isolados virais. A
conservação das propriedades físico-químicas dos aminoácidos substituidos também foi
verificada pelo programa BLAST.
55
As sequências da LCR dos isolados de HPV-31, -35, -52 e -58 foram utilizadas
para a determinação da distância genética intratípica. Para tanto, a sequência de cada
isolado de todos os tipos de HPV analisados foi comparada com as outras sequências
caracterizadas neste estudo e, também, com aquelas disponíveis no GenBank do
respectivo tipo viral. O mesmo procedimento foi aplicado às sequências de L1 dos
isolados de HPV-33. As deleções e inserções detectadas foram consideradas como
eventos únicos. As sequências dos variantes ainda não descritos na literatura foram
depositadas no GenBank, com os seguintes números de acesso: LCR Bsb-36 -
FJ202000; LCR Bsb-299 - FJ202001; E6 Bsb-216 - FJ202002; E6 Bsb-233 - FJ202003;
L1 Bsb-23 - FJ202004; L1 Bsb-24 - FJ202005; L1 Bsb-31 - FJ202006; LCR Bsb-121 -
FJ202007; LCR Bsb-15 - FJ202008; L1 Bsb-20- FJ202009; LCR Bsb-295 - FJ202010;
LCR Bsb-329 - FJ202011; LCR Bsb-367 - FJ202012 (Anexo II).
4.6.
Predição de sítios de ligação para fatores de transcrição na LCR
Prováveis sítios de ligação para fatores de transcrição na LCR dos HPV-31, -33,
-35, -52 e -58 foram preditos utilizando-se as sequências protótipos de cada um dos
cinco genótipos por meio do programa MATCH™ (Kel et al., 2003), disponível no sítio
www.gene-regulation.com/pub/programs.html#match. O programa MATCH utiliza uma
biblioteca de matrizes de nucleotídeos do programa TRANSFAC® 7.0 (Wingender et
al., 1996) e procura sequências que combinem entre as matrizes de nucleotídeos que
definem um sítio de ligação para um determinado fator de transcrição e uma sequência a
ser analisada. Valores de cut-off e níveis de coincidência estabelecidos pelo programa
foram utilizados a fim de minimizar o número de falsos negativos e falsos positivos.
Nestas análises foram usadas as matrizes dos sítios de ligação dos fatores de transcrição
AP-1, E2, GRE, NF-1, Oct-1, “TATA-box”, YY1, CEBP, Sp1 e c-Myc/c-Max, uma vez
que já foi demonstrado que estes se ligam nas LCR dos HPV-16 e -18.
4.7.
Análise filogenética
As sequências da LCR obtidas dos HPV-31, -35, -52 e -58 foram usadas na
construção das árvores filogenéticas, juntamente com as sequências previamente
descritas por Calleja-Macias et al. (2004, 2005) depositados no GenBank. Para a análise
filogenética dos HPV-31, -35, -52 e -58 foram usados fragmentos da LCR de 503pb,
514pb, 631pb, e 607pb, respectivamente. No total foram utilizadas para a análise
56
filogenética, 79 sequências de HPV-31, 51 de HPV-35, 71 de HPV-52 e 102 de HPV-
58.
Para a análise filogenética do HPV-33 foram utilizados fragmentos de 330pb do
gene L1 gerados neste estudo, além de sequências de isolados descritos por Stewart et
al. (1996) depositadas no GenBank, totalizando 9 sequências.
O alinhamento das sequências foi realizado por meio do programa CLUSTAL
W (Thompson et al., 1994) e a construção das árvores filogenéticas pelo método de
Máxima Parsimônia utilizando-se o conjunto de programas PHYLIP (Lake, 1987). Os
valores de bootstrap foram calculados pelo método UPGMA com algorítmo Log Det e
1000 réplicas. A sequência do outgroup utilizada em cada análise filogenética foi
escolhida por meio da análise de Dot Plot no programa BioEdit (Hall, 1999). As árvores
obtidas para os HPV-31, -35, -52 e -58 foram comparadas àquelas descritas por Calleja-
Macias et al. (2005).
4.8.
Análise da atividade transcricional do promotor de E6/E7 de variantes de
HPV-58
4.8.1. Amplificação da LCR
Inicialmente, as amostras contendo os três variantes moleculares e a sequência
protótipo do HPV-58 (Matsukura e Sugase, 1990) foram clonadas em pGEM conforme
descrito no item 4.3.1. Em seguida, estes plasmídios foram utilizados para a
amplificação de um fragmento do genoma de 794pb correspondendo à LCR completa.
As sequências dos iniciadores utilizados encontram-se na Tabela 3.
Tabela 3. Iniciadores utilizados para a amplificação da LCR dos variantes de HPV-58.
Iniciador
*
Posição nucleotídica
**
Sequência do Iniciador
***
H58LCR-F 7140 – 7158 cgtattGGTACCccattgtctgttgggtaat
H58LCR-R 91 – 115 atgacgAAGCTTggccgtgcgttagctacac
*
Os iniciadores estão na orientação 5’ → 3’.
**
Posições relativas à sequência protótipo do HPV-58 (número de acesso: D90400), disponível no
GenBank.
***
GGTACC e AAGCTT são as sequências reconhecidas pelas endonucleases de restrição KpnI e
BamHI, respectivamente.
As amplificações foram realizadas no termociclador MJ Research PTC-100
(GMI, Minnesota, EUA), em um volume final de 50µL, contendo 50ng de cada
plasmídio, 60mM de Tris-SO
4
(pH=8,9), 18mM de (NH
4
)
2
SO
4
, 5mM de MgSO
4
,
57
250µM de dATP, dCTP, dTTP e dGTP (Invitrogen, Califórnia, EUA), 2U de
PLATINUM
Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, Califórnia, EUA) e
200nM de cada iniciador. As seguintes condições foram adotadas: 40 ciclos de
desnaturação a 95°C por 1minuto, anelamento a 51 ou 55°C por 1minuto e alongamento
a 72°C por 2 minutos. A desnaturação do primeiro ciclo e o alongamento do último
ciclo foram estendidos por 5 e 8 minutos, respectivamente. Os produtos de PCR
obtidos foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com
brometo de etídio a 0,5% para verificação da qualidade do DNA.
Em seguida, os produtos de PCR foram purificados por meio do kit Wizard SV
Gel and PCR Clean Up System (Promega, Madison, EUA), seguindo as instruções do
fabricante.
4.8.2. Digestão dos produtos de PCR obtidos
Cada produto de PCR purificado foi digerido em uma reação contendo 1U de
BamHI e 4µl do respectivo tampão de reação (Biolabs, Massachusetts, EUA) em um
volume final de 15µl. A reação foi incubada por 12 horas a 37°C, sendo em seguida a
enzima inativada pela purificação do DNA utilizando o kit Wizard SV Gel and PCR
Clean Up System (Promega, Madison, EUA), seguindo as instruções do fabricante.
O DNA purificado foi digerido com 1U de KpnI e 4µl do tampão de reação (Promega,
Madison, EUA) em um volume final de 15µl A reação foi incubada a 37ºC por 12
horas, sendo em seguida a enzima inativada da mesma maneira anteriormente descrita.
Além dos fragmentos de PCR, o vetor pGL3-Basic (Promega, Madison, EUA) foi
digerido nas mesmas condições.
4.8.3. Ligação dos produtos de PCR ao vetor pGL3-Basic
Anteriormente à ligação aos amplicons referentes à LCR completa dos variantes
moleculares, o vetor pGL3-Basic foi tratado com fosfatase alcalina (Calf Instestinal
Alkaline Phosphatase, Invitrogen, Califórnia, EUA), seguindo as instruções do
fabricante, visando minimizar a sua re-circularização. A fosfatase alcalina foi inativada
pela purificação do vetor utilizando-se o kit Wizard SV Gel and PCR Clean Up
System (Promega, Madison, EUA). Quatro microlitros do vetor e das amostras
purificadas foram submetidos à eletroforese por eletroforese em gel de agarose 1%
58
corado por brometo de etídio a 0,5%, juntamente com o marcador Low DNA Mass
(Invitrogen, Califórnia, EUA) a fim de quantificar os DNA obtidos.
Na reação de ligação foram utilizados de 25 a 50ng do produto de PCR digerido
e de vetor de maneira que se pudesse obter uma relação 4 de fragmento:1 de vetor em
número de moléculas. Para isso considera-se o tamanho dos fragmentos de DNA e as
respectivas concentrações. A ligação foi realizada utilizando-se 1µl de T4 DNA ligase
(400 U/µl, Biolabs, Massachusetts, EUA), 2µl de tampão de reação 10X em um volume
final de 20µl a 16°C por 16 horas. Finalmente, a ligase foi inativada utilizando-se o kit
Wizard SV Gel and PCR Clean Up System (Promega, Madison, EUA).
4.8.4. Transformação e obtenção dos plasmídios recombinantes
A tranformação foi realizada conforme descrito no item 4.3.2, exceto pela
utilização de bactérias E.coli JM109. Os plamídios foram extraídos utilizando-se o kit
Wisard
TM
Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, EUA),
seguindo as instruções do fabricante.
4.8.5. Mutagênese Sítio-Dirigida
Para a construção das sequências virais mutantes foi utilizado o kit GeneTailor
Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen, Califórnia, EUA), de acordo com as
intruções do fabricante. Foram utilizados como molde os vetores recombinantes
contendo a LCR completa do variante Bsb-367 e da sequência protótipo do HPV-58, a
montante do gene da luciferase, no vetor pGL3-Basic. Em resumo, 100ng de DNA de
cada vetor foram incubados com DNA metilase a 37°C por 1 hora. O DNA metilado foi
posteriormente amplificado em uma reação de PCR mutagênica utilizando-se dois
iniciadores que se sobrepõe, sendo que um deles possui a mutação alvo. O produto desta
reação é linear dupla fita. Os iniciadores utilizados para a amplificação dos vetores estão
apresentados na Tabela 4. O nucleotídio marcado em negrito no iniciador HPV-58mut-F
insere a mutação de G para A na posição 7788 na sequência da LCR dos plasmídios
gerados.
59
Tabela 4. Iniciadores utilizados para a mutagênese sítio-dirigida da LCR de HPV-58.
Iniciador
*
Posição nucleotídica
**
Sequência do Iniciador
HPV-58 mut-F 7788 – 7801 aggtgtggactaaccgttttAggtcacattgttc
HPV-58 mut-R 7757 – 7787 catttattgccaggtgtggactaaccgtttt
*
Os iniciadores estão na orientação 5’ → 3’.
**
Posições relativas à sequência protótipo do HPV-58 (número de acesso: D90400), disponível no
GenBank.
As amplificações foram realizadas em um volume final de 50µL, contendo 20ng
de cada plasmídio, 60mM de Tris-SO
4
(pH=8,9), 18mM de (NH
4
)
2
SO
4
, 5mM de
MgSO
4
, 300µM de cada dNTP, 2U de Platinum
Taq DNA Polymerase High Fidelity
(Invitrogen, Califórnia, EUA) e 0,3µM dos iniciadores. Inicialmente, foram realizados
25 ciclos de amplificação no termociclador MJ Research PTC-100 (GMI, Minnesota,
EUA): 30 segundos de desnaturação a 94°C, 30 segundos de anelamento a 55°C e 7
minutos de alongamento a 68°C. O primeiro ciclo foi precedido por 30 segundos a 94°C
e o último ciclo foi estendido por 10 minutos a 68°C. Os produtos de PCR obtidos
foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de
etídio a 0,5% para verificação da qualidade do DNA.
Em seguida, 2µl do produto de reação foram transformados em bactérias E. coli
DH-5α. Esta célula recirculariza o DNA linear mutado e a endonuclease McrBC
bacteriana digere o DNA metilado, deixando apenas o produto mutado não metilado.
Uma colônia para cada amostra foi crescida em meio 2xYT contendo ampicilina
(100µg/ml) a 37°C por 12 horas, sob agitação vigorosa. Seguiu-se a extração do DNA
dos vetores retrovirais utilizando-se o kit Wizard
Plus SV minipreps DNA Purification
System (Promega, Madison, EUA) seguindo instruções do fabricante.
4.8.6. Sequenciamento dos plasmídios
Todos os DNA extraídos foram submetidos ao seqüenciamento pelo método
desenvolvido por Sanger et al. (1977) empregando-se o kit DYEnamic
TM
ET
Terminator Cycle Sequencing Premix kit (Pharmacia, Califórnia, EUA) em um
sequenciador automático ABI PRISM
TM
377 DNA Sequencer (Perkin Elmer,
Massachusetts, EUA). Para se obter a sequência completa do fragmento inserido no
60
vetor, foram utilizados para o seqüenciamento iniciadores complementares ao vetor
pGL3-Basic (pGL5: 5’-TAGCAAAATAGGCTGTCCC-3’ e pGL3:
3’TATGTTTTTGGCGTCTTC5’).
4.8.7. Isolamento do DNA dos vetores recombinantes em larga escala (Maxi-
preparação)
O DNA dos vetores recombinantes contendo a LCR dos três diferentes variantes
moleculares e a sequência protótipo de HPV-58, além das duas construções mutantes
obtidas foi isolado por maxi-preparação de acordo com Sambrook e Russel (2001).
Inicialmente foi feito um esfregaço em placa de L.B.-agar 1,5% (10 g/L de triptona, 5
g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl) contendo ampicilina a 100µg/ml de cada
um dos crescidos bacterianos contendo os vetores construídos. Em seguida, uma colônia
de cada vetor recombinante foi inoculada em 30ml de meio de cultura Terrific Broth
(12g de triptona, 24g de extrato de levedura, 4ml de glicerol 89%, 100ml de solução
KH
2
PO
4
0,17M e K
2
HPO
4
0,72M para 1 litro de solução) acrescido de ampicilina a
100µg/ml, e crescido a 37°C, a 240 rpm até que a D.O.
600
medida fosse 0,6. Nesse
momento, 25ml de cada cultura citada foi incubada em 500ml de meio de cultura
Terrific Broth acrescido de ampicilina a 100µg/ml por mais 12-16 horas, a 37°C, 240
rpm, em frascos para cultura bacteriana com capacidade de 2 litros. A solução foi então
centrifugada a 3000 rpm, por 15 minutos, a 4°C, sendo, em seguida descartado o
sobrenadante. Cada pellet foi ressuspendido em 200ml de STE gelado (Tris-HCl 10mM,
pH=8, NaCl 0,1M, EDTA 1mM), e centrifugado a 3000 rpm, durante 15 minutos, a
4°C, e novamente o sobrenadante foi descartado. Cada pellet foi, então, ressuspendido
em 18ml de solução de ressuspenssão (glicose 50mM, Tris-HCl 25mM, pH=8, EDTA
10mM). Foram em seguida adicionados 2ml de lisozima a 10mg/ml, e 20ml de solução
de lise (NaOH 0,2N, SDS 1%), e após mistura por inversão, foi incubado a temperatura
ambiente por 7 minutos. Foram então adicionados 20ml de solução de neutralização
(acetato de potássio 3M, 11,5ml de ácido acético glacial para 100ml de solução), e após
mistura por inversão e incubação em gelo por 10 minutos, foi centrifugado a 5000 rpm
por 40 minutos, a 4°C. Posteriormente o sobrenadante foi vertido em uma proveta e foi
adicionado 0,6 vezes do volume medido de isopropanol, misturado bem e incubado por
10 minutos a temperatura ambiente. Seguiu-se uma centrifugação a 5000 rpm por 15
minutos a temperatura ambiente; o sobrenadante foi descartado, o pellet lavado com
61
etanol 70%, e secado sobre papel toalha. Finalmente, o pellet foi ressuspendido em 3ml
de tampão T.E., pH=8. Todo o procedimento foi realizado utilizando-se uma centrífuga
Sorvall
RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge com um rotor Sorvall
H1000B.
4.8.8. Purificação do DNA extraído por gradiente de densidade
Após a extração por maxi-preparação, os DNA dos vetores recombinantes
contendo a LCR dos três variantes moleculares e da sequência protótipo de HPV-58,
além dos dois mutantes construídos, foram purificados por gradiente de centrifugação
contínuo de cloreto de césio de acordo com Sambrook e Russel (2001). Para tanto, os
pellets dissolvidos em tampão T.E. foram pesados e para cada grama de solução foi
adicionado 1,01g de CsCl sólido (Invitrogen, Califórnia, EUA). Após a dissolução
completa do sal na solução tampão-DNA, foram adicionados 100µl de brometo de
etídio 10mg/ml para cada 5g de solução de DNA original. As amostras foram então
centrifugadas na centrífuga Sorvall
RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge
utilizando-se um rotor Sorvall
H1000B, a 3000 rpm, por 5 minutos, a temperatura
ambiente. Utilizando-se uma seringa descartável, a solução vermelha foi transferida
para um tubo de ultracentrifugação (Ultra Clear
Tubes, 16 x 76mm, Beckman), e os
tubos foram preenchidos até aproximadamente 3cm da borda com solução de 1,01g de
cloreto de césio por mililitro de tampão T.E. (pH=8), sendo o resto do tubo preenchido
com óleo mineral (Nujol). Os tubos foram então fechados com as tampas apropriadas e
centrifugados no rotor 50 Ti da ultracentrífuga Beckman L8-M, a 45000 rpm, a 20°C.
Após 48 horas, em uma sala com pouca luz, a banda referente ao DNA dupla fita
circular plasmidial foi removida utilizando-se uma agulha de 19G conectada a uma
seringa de 5ml de capacidade. Essa solução contendo os DNA de interesse foi
transferida para um tubo de polipropileno, e o brometo de etídio foi removido por
sucessivos ciclos de adição de n-butanol saturado, mistura, centrifugação a 3000 rpm e
retirada da fase orgânica, até que a solução contendo o DNA estivesse completamente
transparente (aproximadamente 4 ciclos).
Com o objetivo de retirar o cloreto de césio das soluções de DNA, estas foram
dialisadas em 2 litros de tampão T.E. 1X utilizando-se os tubos para diálise Prepared
Dialysis Tubing (BRL), por 20 horas, durante as quais o tampão T.E. foi trocado por 3
vezes. A solução com DNA foi então removida do tubo de diálise e precipitada por 12
horas a -70°C, com 2,5 volumes de etanol 100% e 0,1 volumes de acetato de sódio 3M.
62
Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12.000rpm, a 4ºC e por 30min. Os pellets
de DNA foram lavados com etanol 95%, repetindo-se a etapa de centrifugação nas
mesmas condições, e, então, foram ressuspendidos em 3ml de água destilada e
deionizada. Posteriormente, os DNA foram novamente sequenciados, e a D.O.
260
foi
medida para estimativa da concentração da solução.
4.8.9. Cultura celular da linhagem C33
As células C33 (queratinócitos derivados de carcinoma de colo de útero HPV
negativo e p53 mutado) (ATCC n° HTB-31) foram cultivadas em meio DMEM
(Dulbecco´s Modified Eagle Medium, Invitrogen, Califórnia, EUA) suplementado com
10% de soro fetal bovino (SFB), ou meio D10. As células foram mantidas em estufa
úmida, a 37°C, e com 5% de CO
2
. Para o congelamento, aproximadamente 10
6
células
foram congeladas em 1ml de meio de cultura D10 acrescido de SFB 10% e
dimetilsulfóxido 10% (DMSO, Sigma Aldrish, Missouri, EUA).
4.8.10. Transfecção da linhagem celular C33
Além dos vetores contendo a LCR dos variantes da sequência protótipo e das
construções mutantes de HPV-58, também foram transfectados plasmídios contendo a
sequência da LCR dos HPV-16 (número de acesso: K02718) e -18 (número de acesso:
X05015) protótipo. As transfecções foram realizadas com o uso de lipofectamina
(Invitrogen, Califórnia, EUA) em placas de cultura de células de 10cm de diâmetro
(Corning, Massachussetts, EUA). Inicialmente, 4x10
6
células foram plaqueadas em
10ml de meio D10. As células foram incubadas a 37°C com 5% de CO
2
por
aproximadamente 24 horas. Misturam-se 4µg de cada vetor pGL3 recombinante a 1µg
do vetor pCMV-βGal (McGregor e Caskey, 1989) em DMEM, volume final de 100µl,
sendo o último vetor utilizado como controle interno da eficiência da transfecção. Todos
os plasmídios foram transfectados em triplicata, em um total de no mínimo sete
experimentos. Em outro tubo foram misturadas 50µl de lipofectamina (1mg/ml) a 50µl
de DMEM por placa a ser transfectada. Essas misturas foram incubadas a temperatura
ambiente por 15 minutos. Após esse período, 100µl da mistura contendo DNA dos
vetores e DMEM foi misturada à 100µl da mistura contendo lipofectamina e DMEM;
essa nova mistura foi incubada a temperatura ambiente por mais 15 minutos. As células
foram lavadas com 5ml de DMEM. Em seguida, às misturas de lipofectamina e DNA
63
supracitadas foram adicionados 4,5ml de DMEM, e esta foi gotejada cuidadosamente
sobre as células. As células foram incubadas a 37°C com 5% de CO
2
por 6 horas, e o
meio de transfecção foi substituído por 10ml de D10 por 48 horas. Como controle
negativo foi transfectado o vetor pGL3 recombinante na ausência do vetor pCMV-βGal
e vice-versa. Em uma placa não foi transfectado nenhum dos vetores, sendo somente
adicionada a lipofectamina.
4.8.11. Ensaio de Luciferase e
β
ββ
β
-Galactosidase
Após 48 horas da transfecção, as células foram lavadas 2 vezes com 5ml de PBS
1X a temperatura ambiente. Em seguida, foi pingado sobre as placas 900µl de Repórter
Lysis Buffer (Promega, Madison, EUA) e incubado por 15 minutos. Foi passado um
scraper sobre as células e o lisado foi transferido para um tubo eppendorf. Seguiu-se
uma centrifugação a 12.000rpm por 1min e o sobrenadante foi transferido e utilizado
nos ensaios, sendo depois armazenado a -70°C. A concentração de proteína extraída
desta maneira foi medida por reação com o reagente de Bradford (Bio-Rad, Califórnia,
EUA), e leitura a 595nm em um microplate Benchmark (Bio-Rad, Califórnia, EUA ).
Para o ensaio de luciferase foi utilizado o kit The Promega luciferase assay
system (Promega, Madison, EUA) conforme instruções do fabricante. Em resumo, 20µl
do lisado foram adicionados a 50µl de luciferase assay reagent e as leituras de unidades
relativas de luciferase foram feitas em um luminômetro Monolight
3010 (Analytical
Luminescence Laboratory).
Para o ensaio de β-Galactosidase foi utilizado o kit The Promega
β
-
Galactosidase enzyme assay system (Promega, Madison, EUA) conforme instruções do
fabricante. Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços. A 50µl do lisado foram
adicionados 50µl de Assay 2X Buffer. A mistura foi incubada a 37°C até que fosse
observada a coloração amarela na mistura. Em seguida a reação foi inativada por adição
de 150µl de Na
2
CO
3
1M. A atividade relativa da enzima β-Galactosidase foi medida por
leitura a 420nm em um microplate Benchmark (Bio-Rad, Califórnia, EUA).
4.8.12. Análise estatística
As atividades relativas de luciferase obtidas dos extratos de células transfectados
com o HPV-16, -18 e os variantes moleculares e mutantes de HPV-58, foram
normalizadas com os valores obtidos no ensaio de β-Galactosidase e Bradford.
64
Inicialmente, foi realizado o teste de homogeneidade de variâncias, e como observou-se
que as médias não eram homogêneas, optou-se por utilizar o teste não-paramétrico
Wilcoxon Rank-Sum para comparação das médias dos diferentes grupos. Um valor de p
menor que 0,05 foi considerado como significativo. Todas as análises estatísticas foram
realizadas utilizando-se o sistema estatístico R (R Development Core Team, 2007).
65
5. Resultados
5.1.
Caracterização das amostras
Foram analisadas as regiões genômicas LCR, E6 e L1 de amostras de HPV-31,
-33, -35, -52 e -58 provenientes do Distrito Federal, cujas características estão
descritas na Tabela 5.
Tabela 5. Dados da análise citológica, idade das pacientes e co-infecção com
diferentes tipos de HPV de amostras de HPV-31, -33, -35, -52 e -58 coletadas no
Distrito Federal.
Tipo de HPV Amostra Análise Citológica* Co-infecção** Idade
Bsb-36 Normal - 32
Bsb-133 Normal - 36
Bsb-140 NICII - 24
Bsb-193 NICII HPV-31 e -33 29
Bsb-216 NICIII - 37
Bsb-227 NICIII - 65
Bsb-233 *** - ***
Bsb-299 NICII - 21
Bsb-330 NICII - 35
Bsb-350 NICIII - 27
Bsb-358 NICIII - 20
Bsb-370 NICIII - 37
Bsb-23 Normal - 24
Bsb-24 NICII HPV-33 e -66 29
Bsb-31 HPV - 53
Bsb-98 NICIII HPV-33, -16 e -39 25
Bsb-193 NICII HPV-33 e -31 29
Bsb-369 HPV - 29
Bsb-404 HPV HPV-33, -66 e -61 20
Bsb-56 ASCUS - 24
Bsb-59 NICIII - 27
Bsb-74 HPV - 44
Bsb-82 Normal HPV-35 e -18 36
Bsb-121 NICI - 24
Bsb-185 NICIII HPV-35 e -58 53
Bsb-15 Normal - 47
Bsb-20 HPV HPV-52 e -11 36
Bsb-86 HPV - 25
Bsb-406 HPV - 55
Bsb-93 NICI - 26
Bsb-128 HPV HPV-58 e -53 28
Bsb-185 NICIII HPV-58 e -35 53
Bsb-204 HPV - 39
Bsb-271 NICIII - 34
Bsb-295 CAESCA - 57
Bsb-329 NICIII - 35
Bsb-367 NICIII - 33
HPV-58
HPV-31
HPV-33
HPV-35
HPV-52
* HPV: Efeito citopático compatível com infecção por HPV; ASCUS: Células atípicas de significado
indeterminado; NIC I: Neoplasia intraepitelial de grau I; NIC II: Neoplasia intraepitelial de grau II; NIC III:
Neoplasia intraepitelial de grau III; CAESCA: carcinoma escamoso. ** Infecção por mais de um tipo de HPV em
uma mesma amostra. O hífen indica infecção por um único tipo viral. *** Dados indisponíveis.
66
A maioria das amostras analisadas foi obtida a partir de lesões cervicais, sendo que
algumas apresentavam co-infecção por mais de um tipo viral. Apenas uma parte do total de
amostras pode ser analisada nas três regiões genômicas, LCR, E6 e L1, devido à
quantidades insuficientes de DNA ou falhas na amplificação do DNA.
5.2.
Predição de sítios de ligação para fatores de transcrição na LCR
As Figuras 18 a 22, mostram o mapeamento dos potenciais sítios de ligação de
fatores de transcrição na LCR, gerado pelo programa MATCH™, utilizando-se as
sequências protótipo para cada tipo de HPV. Foram analisados sítios de ligação
previamente observados nas LCR dos HPV-16 e -18 e cujas matrizes estavam disponíveis
no programa TRANSFAC®.
As LCR dos HPV-31, -33 e -52 apresentaram quatro sítios de ligação para a
proteína viral E2, permindo a divisão da LCR em três segmentos distintos: 5’, enhancer e
3’ (O’Connor et al., 1995). No entanto, as sequências da LCR dos HPV-35 e -58
apresentaram três e cinco sítios, respectivamente.
Em relação aos sítios de ligação para fatores transcricionais celulares, de maneira
geral, foram observadas semelhanças entre a composição da LCR dos tipos analisados,
incluindo um grande número de sítios de reconhecimento para os fatores repressores da
transcrição viral YY-1 e C/EBP, e para Oct-1, um ativador transcricional. Por outro lado,
foram observadas diferenças, como a ausência dos sítios de ligação para Sp-1 e AP-1 nas
LCR dos HPV-33 e -31, respectivamente, além da ausência do TATA-box na LCR dos
HPV-33 e -52. O elemento de resposta a glicocorticóide (GRE) foi observado apenas na
LCR do HPV-52 e o sítio de ligação para cMyc/cMax não foi detectado nas LCR dos tipos
virais analisados.
67
<----------------YY1 <-------...YY1
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<----------------YY1
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<------...OCT1
-------...CEBPB
<------...CEBPB
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--------OCT1 ---------------->YY1 <----------------YY1
------>CEBPB
-------CEBPB --------------->E2
<---------------E2
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<-----------------NF1 <-----------------NF1 ---------------->YY1
<---------SP1 <--------------OCT1
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---------------->YY1 ---------------->YY1 <----------...OCT1
-------...YY1
aactgtagttcaactatgtgtcatgcacatatattatattatcctacacaccttaaactgcttttaggcacatattttgtagattatctatatccttgattgcagtgctggcttttgcac 7786
----OCT1 ---------------->YY1 <---...TATA
--------->YY1 ------------->OCT1
<--------------OCT1
---------------->YY1
<--------------OCT1
--------------->E2
<---------------E2
atgtttaaactgccaaggttgtgtcatgcattataaataagttgtatgttactcatataattaattgcatataggtattacaccgttttcggttacagttttacaagcaattgttctttt 7906
------TATA ------------->CEBPB
--------->TATA <-------------CEBPB
--------------->E2
<---------------E2
--------------->E2
<---------------E2
tatacttaataataataatcttagtataaaaaagtagggagtgaccgaaagtggtgaaccgaaaacggttggtatataaagcacatagtattttgtgcaaacctacagacgcc 107
Figura 18. Mapeamento de potenciais sítios de ligação de fatores de transcrição na LCR do HPV-31 protótipo. Em azul estão descritos os nomes dos fatores de
transcrição sendo a extensão de cada sítio indicada por hífens que demarcam a localização do mesmo na sequência de nucleotídeos da LCR abaixo. A direção da seta indica o
sentido da fita de DNA na qual cada fator possívelmente se liga, sendo que o símbolo -> indica o sentido 5’-3’ e <-, o sentido 3’-5’.
68
------------->CEBPB
<-------------CEBPB
cactttgtgtaattgtgttatgttgttgttttgttctgtctatgtactttgtgttgttgtgttgtgttgttgtttgttttttgtgtatgtgttacaatgtatgttatgttgtatgttact 7213
---------------->YY1 <----------------YY1 <--------------OCT1
-------------->OCT1 <-----...YY1
gtgtttgttttatgtgtacttgtttgtgtgcatgttctatgtacttgtcagtttcctgtttgtgtatatgttaataaaacattgtgtgtatttgttaaactatttgtatgtatgttatgt 7333
------------->CEBPB <----------------YY1
-----------YY1 ---------------->YY1
<----------------YY1 ------------->CEBPB
atatgggtgtacctatatgagtaaggagttgtattgcttgccctaccctgcattgcaatgtacctacctttatttccctatatttgtagtacctacatgtttagtattgctttacctttt 7453
---------------->YY1
---------------->YY1 ----------------->NF1
<---------------E2
--------------->E2
<--------------OCT1
gacatactagtgtccatattgtacaatttcctccattttgtatgcctaaccgttttcggttacttggcatacataccctatgacattggcagaacagttaatccttttctttcctgcact 7573
------------->CEBPB ------------->CEBPB
<--------------OCT1 ---------->AP1
----------------->NF1 ---------------->YY1
<-----------...YY1
gtgtttgtctgtacttgctgcattggcatacataccctatgacattggcagaacagttaatccttttctttcctgcactgtgtttgtctgtacttgctgcattgactcatatatacatgc 7693
-------------->OCT1 ---------------->YY1 ----------------->NF1
------------->CEBPB
<-------------CEBPB
-----YY1 <---------------...NF1
------------->CEBPB <--------------...OCT1
<-------------CEBPB
agtgcaattgcaaaatacttaattgtactaatagtttacacatgcttttaggcacatatttttactttactttcaaaccttaagtgcagttttggcttacacaattgctttgtatgccaa 7813
<----------AP1 <---------------E2 -------------->OCT1
---------------->YY1
--NF1 ---------------->YY1
actatgccttgtaaaagtgagtcactacctgtttattaccaggtgtggactaaccgttttaggtcatattggtcatttataatcttttatataatagtaaactataatgccaagttttaa 24
--------------->E2 ---------------->YY1
<---------------E2
<---------------E2
--------------->E2
---------------->YY1
aaaagtagggtgtaaccgaaagcggttcaaccgaaaacggtgcatatataaagcaaacattttgcagtaaggtactgcacgact 108
Figura 19. Mapeamento de potenciais sítios de ligação de fatores de transcrição na LCR do HPV-33 protótipo. Em azul estão descritos os nomes dos fatores de
transcrição sendo a extensão de cada sítio de ligação indicada por hífens que demarcam a localização do mesmo na sequência de nucleotídeos da LCR abaixo. A direção da seta
indica o sentido da fita de DNA na qual cada fator possivelmente se liga, sendo que o símbolo -> indica o sentido 5’-3’ e <- o sentido 3’-5’.
69
<----------------YY1
<--------...CEBPB
---------...CEBPB
tgtgtaaatgtgtatgcatgtatactgtgtgttatgtgttgtagtgcttgtatatatattatgtgttgtggtgcctgtttgtgttgtacatggcgtgtaaatgtgtgtataatattgtgc 7229
<--------------OCT1 <---------------- YY1
-----CEBPB <-------------OCT1 --------... YY1
---->CEBPB
aatgtgttgtacgtgggtgttttttgtatgtatgttgttgtatgtatgtcagtacgcaataaaagtgatgtgtgtgtttataattaacactgtattgttgtatgactatgggtgcaccca 7349
---------------->YY1
-------->YY1 <--------------OCT1 --------------...NF1
<-----------------CEBPB
------------->CEBPB <---------------E2
<-------------CEBPB --------------->E2
tatgacttacataattacagtacacgctatatgttgtatataacaattctacctccattttgtgtgttagtgtcctttacattacctttcaaccgatttcggttgctgttggcaagcttt 7469
<-----------------NF1 --------------...YY1
--->NF1 <-----------------NF1
----------------->NF1
atatgttttttacaaaaacattcctacctcagcagaacacttaatccttgtgttcctgatatatattgtttgccaactttatattggcttttgccaatctttaaacttgattcatcttgc 7589
-->YY1 ---------------->YY1 <------------...OCT1
<----------AP1 <--------------OCT1 -----------...YY1
---------------->YY1 <-------------CEBPB
<--------------OCT1
agtattagtcatttttcatacttgtggtccacccacacttgtaacacttgtaacagtgcttttaggcacatattttttgcatttctaaagggctttaattgcacacttggctttacatat 7709
--OCT1 <-----------------NF1 ------------->OCT1
----->YY1 <---------SP1 <----------------YY1
<-----------------NF1 <----------------YY1 <------...OCT1
-------------->OCT1
tatgtgtgtttgccaacaccaccctacacatcctgccaactttaagttaaaacatgcatgtaaaacattactcactgtattacacattgttatatgcacacaggtgtgtccaaccgattt 7829
--------->TATA <---------------E2
--------OCT1 --------------->E2
<---------------E2
--------------->E2
---------------->YY1
--------->TATA
ggattacagttttataagcatttctttttattatagttagtaacaattatccctataaaaaaaacagggagtgaccgaaaacggtcgtaccgaaaacggttgccataaaagcagaagtgc 70
acaaaaaagcagaagtggacagacattgtaaggtgcggt 109
Figura 20. Mapeamento de potenciais sítios de ligação de fatores de transcrição na LCR do HPV-35 protótipo. Em azul estão descritos os nomes dos fatores de
transcrição sendo a extensão de cada sítio indicada por hífens que demarcam a localização do mesmo na sequência de nucleotídeos da LCR abaixo. A direção da seta indica o
sentido da fita de DNA na qual cada fator possivelmente se liga, sendo que o símbolo -> indica o sentido 5’-3’ e <- o sentido 3’-5’.
70
------------->CEBPB -------------->OCT1 <-------------CEBPB -----------...YY1
<-------------CEBPB ---------------->YY1 <------------...OCT1
------------->CEBPB
ccattgtctgttgggtaattgtctgtgtcatgtatgtgttgtgtatgtcaaacacaggttaaaaggtaaccattgtttgttatgtaattgttttgtgtgtgtactgtgttgtttgcatgt 7274
----->YY1 <----------AP1 ------------->CEBPB
--OCT1
---------------->YY1
tatgtatgtgtgtgcatgtttgttgtatttgtcagttcctgtatgtatgttttgtgtatgtattaataaagtactgtatttactaaactatttatagtagtcttatgttatgttatggtt 7394
<---------SP1 -------...YY1
<---------SP1
gcacccacatgagtaacaatacagttgctcctaatctattgcatctcctgccctaccctgtgtcccctgccctaccctgtgtcctactttgttacactactaattagccttatactctcc 7514
--------->YY1 --------------->E2 ----------------->NF1
---------------->YY1 <---------------E2 <-------------CEBPB
---------------->YY1
attttgtaccattttgtactatccaccattttaaatcctaaccgaattcggttggtcttggcacaactttggttgtccttggcacagtaacaactatttttatataagtttcagcaaact 7634
<---------SP1 <-----------------CEBP
---------->AP1 <-------------CEBPB
---------->AP1 ------------->CEBPB
---------...YY1
gcttaatcctttggtttcctgcagtccactggtctacacttgttgtcccgcctaaactgacttcttgctgactcacaggtcctgcagtgcagctaaacaatacattgcctaacattgcat 7754
---------------->YY1 ------------->CEBPB <----------------YY1
<----------------YY1
------->YY1
gttttaaactgcttttaggcacatattttatttaaactttcaatgcactaattacagtgttggcttacacaagtacatcctacgccaaatatgtcttgtaaaacatgattaaatactgtt 7874
<---------------E2 <---------------E2
--------------->E2 --------------->E2
--...E2
<-...E2
actcaccaggtgtgcactacacgaccggttacggttaccgtacccacaaccacttttttttataattataaattataatcttatactagtaaaaaatagggtgtaaccgaaaacggtcag 52
<---------------GRE
------------->E2
--------------E2
accgaaaccggtgtatatatatagaacacagtgtagctaacgcacggcc 101
Figura 21. Mapeamento de potenciais sítios de ligação de fatores de transcrição na LCR do HPV-52 protótipo. Em azul estão descritos os nomes dos fatores de
transcrição sendo a extensão de cada sítio indicada por hífens que demarcam a localização do mesmo na sequência de nucleotídeos da LCR abaixo. A direção da seta indica o
sentido da fita de DNA na qual cada fator possivelmente se liga, sendo que o símbolo -> indica o sentido 5’-3’ e <- o sentido 3’-5’.
71
---------------->YY1
cctactacccgtgcaccatccaccaaacgcaaaaaggttaaaaaataattgttgtggtacttacactattttattatacatgtttgtttgttttatgtatgtgttgtctgtttgtttatg 7211
<----------------YY1 ---------------->YY1 <----------------YY1 <-----------...OCT1
tttgtgtatatgttgtatgtgttatgtgtcatgtttgtgtacatgttctatgtccttgtcagtttcctgtttctgtatatatgtaataaactattgtgtgtattgtaaactatttgtatt 7331
---OCT1 ------------->CEBPB <--------------OCT1 --...YY1
<---------SP1 <---------TATA
<---------SP1
gtttgggtgtatctatgagtaaggtgctgtccctaaattgccctaccctgccctgcctattatgcatacctatgtaatagtatttgtatgatatgtattttatagtttttaacagtactg 7451
-------------->YY1
---------------->YY1
--------------->E2
<---------------E2
cctccattttactttacctccattttgtgcatgtaaccgatttcggttgctggcacaaacgtgttttttttaaactacaatttaaacaatacagttaatcctttcccttcctgcactgct 7571
<--------------OCT1 <-------------CEBPB ---------------->YY1
---------->AP1 <----------------YY1
---------------->YY1
<----------------YY1
------------->CEBPB
<----------------YY1
tttgcctatacttgcatatgtgactcatatatacatgcagtgcagttgcaaaatgtttaattatactcatagtttaaacatgcttataggcacatattttaacttactttcaatgcttaa 7691
----------------->NF1 ---------->AP1 <---------------E2
<-------------CEBPB <---------------E2
------------->CEBPB ---------------->YY1
-------...YY1
gtgcagttttggcttgcacaatagtttgttatgccaaactatgtcttgtaaaagtgactcactaacatttattgccaggtgtggactaaccgttttgggtcacattgttcatgtttcaac 7811
-------------->OCT1
--------------->E2
<---------------E2
--------->YY1
<---------------E2
--------------->E2
---------------->YY1
attttatataatactaaactataatgccaaatcttgtaaaaactagggtgtaaccgaaaacggtctgaccgaaaccggtgcatatataaagcagacattttttggtaggctactgcaggact 109
Figura 22. Mapeamento de potenciais sítios de ligação de fatores de transcrição na LCR do HPV-58 protótipo. Em azul estão descritos os nomes dos fatores de
transcrição sendo a extensão de cada sítio indicada por hífens que demarcam a localização do mesmo na sequência de nucleotídeos da LCR abaixo. A direção da seta indica o
sentido da fita de DNA na qual cada fator possivelmente se liga, sendo que o símbolo -> indica o sentido 5’-3’ e <-, o sentido 3’-5’.
72
5.3.
HPV-31
A Figura 23 apresenta as variações nucleotídicas encontradas na LCR e nos genes
E6 e L1 das amostras de HPV-31. Na análise de sequência da LCR de doze isolados, foram
detectados cinco variantes compreendendo treze variações nucleotídicas pontuais em
relação à sequência protótipo do HPV-31. Dentre estas, onze substituições nucleotídicas
foram previamente descritas por Gagnon et al. (2005) e Calleja-Macias et al. (2004). As
substituições de G para C e A para C nas posições 7860 e 3, respectivamente, ainda não
estão descritas na literatura. Na posição 7860, além da variação de G para A já relatada na
literatura, foi detectada a variação de G para C. Nesta posição localiza-se um potencial
sítio de ligação de YY1 e Oct-1 (Figura 23).
Figura 23. Variabilidade genética da LCR e dos genes E6 e L1 de isolados de HPV-31. Em cinza,
nucleotídeos conservados em relação à sequência protótipo; hachurado, variações nucleotídicas previamente
relatadas na literatura (Calleja-Macias et al., 2004; Gagnon et al., 2005; Garbuglia et al., 2007), e em negrito,
variações de nucleotídeos não descritas na literatura e substituições de aminoácidos não-conservativas. Os
novos variantes moleculares detectados neste estudo estão marcados com asteriscos. Ref: sequência protótipo
do HPV-31; ND: sequência não determinada, H: histidina, Y: tirosina, A: alanina, V: valina, R: arginina, G:
glicina.
Entre os onze isolados em que foi analisada a sequência do gene E6, foram
detectados seis variantes moleculares diferentes. Entre estes, quatro variantes aprentaram
três substituições ainda não descritas na literatura (Figura 23).
As variações
nas posições
305 e 306 são silenciosas, enquanto aquela na posição 537 leva a uma substituição de
aminoácido não conservativa de arginina (R) para glicina (G) no códon 144. Na sequência
HPV-31
7
7
7
7
7
7
7
7
6
6
6
6
6
6
5
6
7
7
7
7
8
8
2
2
2
3
3
3
4
4
5
5
5
5
5
7
7
8
8
7
4
0
1
4
5
6
6
1
1
3
4
4
8
9
0
0
2
0
2
2
3
8
6
8
7
9
1
6
5 2 7 0 9 4
0
5
3
7 8 7 5 8 5 7
5 6
0 4 8 0
7
0 8 6 2 6 7 2
Ref
T C A C A C
G
T
A
A G G G T C A
T T
A G A C
C
G T T G G C C
Bsb-36*
C
A
G
C
C
G
T
T
T
C
T
A
G
T
A
1
Bsb-133
5
Bsb-193
A
1
Bsb-216*
C
A
G
C
A
G
T
A
T
C
T
A
G
T
A
G
A
A
1
Bsb-227
C
T
A
G
C
G
T
T
C
A
A
A
T
1
Bsb-233*
C
A
1
Bsb-299*
C G 1
Bsb-330
1
YY1/Oct-1
H60Y
A138V
R144G
LCR
Isolados
TATA-Box
E2
ND
Número de
amostras
ND
E6 L1
ND
73
de L1 de dez isolados de HPV-31, foram detectadas seis variações nucleotídicas já
descritas na literatura entre os quatro diferentes variantes moleculares detectados.
A análise filogenética da LCR do HPV-31 foi realizada baseada na sequência de
um fragmento de 503pb de 79 isolados, dos quais doze eram oriundos do Distrito Federal e
as demais sequências foram obtidas no banco genômico GenBank, depositadas por Calleja-
Macias et al. (2004). Dez isolados do Distrito Federal ficaram próximos da sequência
protótipo do HPV-31, mas em um ramo com valor de boostrap abaixo de 50%. Isso
também foi observado com os isolados Bsb-36 e Bsb-216 que agruparam em um ramo com
valor de bootstrap baixo, porém, distinto de onde a sequência protótipo do HPV-31 se
localizou (Figura 24).
74
Figura 24. Análise filogenética do HPV-31. Em adição às amostras analisadas neste estudo (amostras
marcadas com asteriscos para facilitar a localização) foram utilizadas amostras descritas por Calleja-Macias
et al. (2004). As siglas que antecedem o número das amostras indicam a procedência geográfica: São Paulo,
Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei, México (MX); Cidade do Cabo, África do Sul (SA); Estados
Unidos (USA); Marrocos (MR); Noruega (NW); Mali (ML); Timor-Leste (TL); Taipei, Taiwan (TW).
Árvore de Máxima Parsimônia enraizada com o HPV-35 como grupo externo. Os valores nos ramos
correspondem aos valores de bootstrap calculados pelo método UPGMA e algoritmo LogDet e 1000 réplicas.
São mostrados valores de bootstrap acima de 50%. O valor da barra de escala no canto esquerdo inferior
representa a distância genética em substituições por nucleotídeo do fragmento analisado. A sequência do
HPV-31 protótipo está destacada por um retângulo.
75
5.4.
HPV-33
Foram analisadas as sequências da LCR de duas amostras de HPV-33,
caracterizando dois variantes distintos com 16 variações nucleotídicas: 15 substituições
pontuais e uma deleção de 78pb. Seis substituições nucleotídicas ainda não descritas na
literatura estão localizadas sobrepostas a potenciais sítios de ligação para os fatores de
transcrição YY1, Oct-1 e E2. A deleção de 78pb detectada nos isolados Bsb-23 e Bsb-31
leva à perda de potencias sítios de ligação para YY1, NF-1 e C/EBP (Figura 25).
Figura 25. Variabilidade genética da LCR e dos genes E6 e L1 de isolados de HPV-33. Em cinza,
nucleotídeos conservados em relação à sequência protótipo; hachurado, variações nucleotídicas previamente
relatadas na literatura (Stewart et al., 1996; Xin et al., 2001; Gagnon et al., 2004; Khouadri et al., 2006) e em
negrito, e em negrito, variações de nucleotídeos não descritas na literatura e substituições de aminoácidos
não-conservativas. Os novos variantes moleculares detectados neste estudo estão marcados com asteriscos.
Ref: sequência protótipo do HPV-33; D: Deleção de 78pb, ND: sequência não determinada, K: lisina, N:
asparagina, H: histidina, E: glutamato, D: aspartato.
A análise da sequência do gene E6 de seis isolados de HPV-33 revelou dois
variantes compreendendo três alterações nucleotídicas pontuais. As substituições
nucleotídicas de A para C na posição 364 leva à substituição de aminoácido conservativa
de asparagina (N) para histidina (H) no códon 86, e na posição 213, à substituição não
conservativa de lisina (K) para asparagina (N) no códon 35 (Figura 25). Todas as
substituições detectadas no gene E6 já foram previamente descritas por Xin et al. (2001).
Em relação à sequência de um fragmento do gene L1, foram analisados sete
isolados que apresentaram três variantes distintos (Figura 25). Foram detectadas duas
variações nucleotídicas ainda não descritas na literatura nas posições 6544, de A para G, e
6748, de A para C, que leva à substituição de aminoácido conservativa de glutamato (E)
para aspartato (D) no códon 385. O isolado Bsb-23 apresentou o maior número de
variações.
HPV-33
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
6
6
6
2
2
4
4
4
4
5
5
5
7
8
2
3
4
5
6
7
0
2
0
2
4
5
3
3
9
3
7
1
5
6
8
1
6
8
4
6
4
4 7 4 2 3 4 5 7 6 2
9 6 8 4 5 1
3 4 0
4
4
8
Ref
G G T G C G G C C
A C G A T A
A A A
A
A
A
Bsb-23*
A
A
A
T
T
A
A
A
D
G
G
G
A
C
C
C
T
G
G
C
1
Bsb-24
G
1
Bsb-31*
A
A
T
T
A
A
A
D
A
G
A
G
C
C
C
T
G
G
1
Bsb-98*
G
4
YY1
C/EBP
YY1, NF-1,
C/EBP
E2/YY1
Oct-1
E2
E2/YY1
YY1
K35N
N86H
E385D
ND
Número de
amostras
LCR
Isolados
E6 L1
ND ND
76
Uma vez que as sequências da LCR de HPV-33 descritas em outros estudos, até o
momento, não estão disponíveis no GenBank, a análise filogenética deste tipo viral foi
realizada baseada nas sequências de um fragmento do gene L1 de cinco isolados de HPV-
33 do Distrito Federal, além de sequências de L1 depositadas no GenBank por Stewart et
al. (1996) (Figura 26). No total, foram utilizadas sequências de 449pb de 9 isolados de
HPV-33. Na árvore filogenética construida, não foram observados agrupamentos com
valor de bootstrap significativo.
77
Figura 26. Análise filogenética de L1 do HPV-33. Em adição às amostras analisadas neste estudo
(amostras marcadas com asterisco para facilitar a localização) foram utilizadas amostras analisadas por
Stewart et al. (1996). Árvore de Máxima Parsimônia enraizada com o HPV-35 como grupo externo. Os
valores nos ramos correspondem aos valores de bootstrap calculados pelo método UPGMA e algoritmo
LogDet e 1000 réplicas. São mostrados valores de bootstrap acima de 50%. O valor da barra de escala no
canto esquerdo inferior representa a distância genética em substituições por nucleotídeo do fragmento
analisado. A sequência do HPV-33 protótipo está destacada por um retângulo.
78
5.5.
HPV-35
Nas quatro amostras de HPV-35 em que foi analisada a sequência da LCR, foram
observados quatro variantes distintos compreendendo cinco variações nucleotídicas: três
substituições pontuais, uma deleção pontual e uma inserção de 16pb. O isolado Bsb-121
apresentou a substituição de A para G na posição 7418 ainda não descrita na literatura. A
variação de T para C na posição 7535 e a variação na posição 7758 de A para G se
localizam sobrepostos a potenciais sítios de ligação dos fatores transcricionais celulares
NF-1 e YY1, respectivamente. A inserção de 16pb, já descrita na literatura, foi detectada
em dois isolados (Bsb-59 e Bsb-82), inserindo um potencial sítio de ligação a YY1 na LCR
desses isolados (Figuras 27).
Figura 27. Variabilidade genética da LCR e dos genes E6 e L1 de isolados de HPV-35. Em cinza,
nucleotídeos conservados em relação à sequência protótipo do HPV-35; hachurado, variações nucleotídicas
previamente relatadas na literatura (Calleja-Macias et al., 2004, 2005, Gagnon et al., 2004; Hiller et al.,
2006) e em negrito, e em negrito, variações de nucleotídeos não descritas na literatura e substituições de
aminoácidos não-conservativas. O novo variante molecular detectado neste estudo está marcado com
asterisco. Ref: sequência protótipo do HPV-35; D: Deleção de T, I: Inserção de 16pb, ND: sequência não
determinada, I: isoleucina, V: valina, W: triptofano, R: arginina, S: Serina, T: treonina.
Na sequência do gene E6, foram observadas seis variações nucleotídicas pontuais já
descritas por Calleja-Macias et al. (2005), sendo detectados três variantes distintos entre as
seis amostras de HPV-35 analisadas. A substituição de T para C na posição 341 foi
detectada em quatro isolados, e leva à substituição de aminoácido não conservativa de
triptofano (W) para asparagina (R) no códon 78 (Figura 27).
Foi possível analisar a sequência do fragmento do gene L1 de apenas uma amostra
(Bsb-59), na qual foi observada uma substituição nucleotídica de T para A na posição
HPV-35 L1
7
7
7
7
7
6
4
4
4
5
7
1
1
1
2
3
3
6
1
1
8
3
5
2
3
3
9
2
4
4
2
8
0 5 8 7 1 6 5 6 1 2
Ref A
T T A T C T A A T T
Bsb-56
C
A
C
T
C
ND
1
Bsb-59
I
D
C
G
C
A
C
T
C
A
1
Bsb-74
C
G
A
T
ND
1
Bsb-82
I
D
C
G
C
A
C
T
C
ND
1
Bsb-121*
G
A
T
G
ND
1
Bsb-185 C A C T C ND
1
YY1
NF-1
YY1
I73V
W78R
S348T
ND
E6
ND
Número de
amostras
LCR
Isolados
79
6642, que resulta na substituição de aminoácido não conservativa de serina (S) para
treonina (T) no códon 348 previamente descrita por Stewart et al. (1996) e Calleja-Macias
et al. (2005) (Figura 27).
Para a realização da análise filogenética da LCR do HPV-35, foram utilizadas
sequências de 653pb oriundos de 51 isolados. Destes, quatro eram provenientes do Distrito
Federal e 47 foram obtidos do estudo desenvolvido por Calleja-Macias et al. (2004)
envolvendo amostras de diferentes regiões do mundo (Figura 28).
Foi observada uma ramificação dicotômica na análise filogenética da sequência de
um fragmento da LCR do HPV-35 com valores de bootstrap significativo. A dicotomia foi
marcada pela presença ou ausência de um fragmento de 16pb entre as posições 7412 e
7413. No agrupamento A, todos os isolados apresentam o fragmento de 16pb e no
agrupamento B, nenhum dos isolados apresentam essa inserção. Essa topologia também foi
observada por Calleja-Macias et al. (2005).
Dentre as quatro amostras analisadas neste estudo, duas (Bsb-74 e Bsb-121) estão
no agrupamento B, onde está localizada a sequência protótipo do HPV-35. O isolado Bsb-
121 ficou mais próximo da sequência protótipo que o isolado Bsb-74, apesar do valor de
bootstrap ter sido abaixo de 50%. Os isolados do Distrito Federal não formaram um
aglomerado único, comforme esperado, uma vez que as sequências da LCR obtidas eram
idênticas a outras já depositadas no GenBank, com exceção da amostra Bsb-121 que
apresentou uma variação ainda não descrita na literatura (Figuras 27 e 28). Analogamente
ao observado para os HPV-31 e -33 e também descrito por Calleja-Macias et al. (2005), a
análise filogenética do HPV-35 não apresentou aglomerados étnicos ou geográficos
específicos.
80
Figura 28. Análise filogenética do HPV-35. Em adição às amostras analisadas neste estudo (amostras
marcadas com asterisco para facilitar a localização) foram utilizadas amostras do estudo de Calleja-
Macias et al. (2005). As siglas que antecedem o número das amostras indicam a procedência geográfica:
São Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei, México (MX); Cidade do Cabo, África do Sul
(SA) e Estados Unidos (USA); Marrocos (MR); Noruega (NW); Heidelberg, Alemanha (HE); Taipei,
Taiwan (TW). Nos agrupamentos A e B estão os isolados com ou sem a inserção de 16pb,
respectivamente. Árvore de Máxima Parsimônia enraizada com o HPV-16 como grupo externo. Os
valores nos ramos correspondem aos valores de bootstrap calculados pelo método UPGMA e algoritmo
LogDet e 1000 réplicas. São mostrados valores de bootstrap acima de 50%. O valor da barra de escala no
canto esquerdo inferior representa a distância genética em substituições por nucleotídeo do fragmento
analisado. A sequência protótipo de HPV-35 está destacada por um retângulo.
Agrupamento A
Agrupamento B
81
5.6.
HPV-52
Entre todos os tipos virais analisados neste estudo, os variantes de HPV-52 foram
os que apresentaram a maior variabilidade genética. Foram analisadas as sequências de
quatro amostras de HPV-52, tendo sido detectados dois variantes compreendendo 23
variações nucleotídicas: 19 substituições pontuais, duas deleções e duas inserções. No
estudo realizado por Calleja-Macias et al. (2005), 65 dos 66 isolados analisados
apresentaram a deleção de 5pb entre as posições nucleotídicas 7387 e 7391 na LCR. Pelo
exposto, o isolado protótipo original do HPV-52 foi sequenciado novamente a fim de
verificar a presença, desta deleção. De acordo com os autores, um erro na análise da
sequência da LCR protótipo resultou na presença destes 5pb no isolado protótipo. Essa
deleção também foi detectada em todos os isolados do Distrito Federal analisados no
presente estudo (Figuras 29)
Sete variações nucleotídicas, já descritas na literatura, estão localizadas sobrepostas
a potenciais sítios de ligação a E2, C/EBP e AP-1. A inserção de 6pb entre as posições
7702 e 7703 no isolado Bsb-15 resulta na alteração da sequência do potencial sítio de
ligação a AP-1, além de criar um possível sítio de ligação a Sp-1 na mesma localização.
Adicionalmente, o isolado Bsb-15 apresentou nove variações na LCR ainda não descritas
na literatura. Entre estas, as substituições nas posições 7207, e 7861 e 7865 se localizam
sobrepostas a potenciais sítios para Oct-1 e E2, respectivamente (Figura 29).
A sequência do gene E6 do isolado Bsb-15 revelou quatro variações nucleotídicas
silenciosas pontuais já descritas por Aho et al. (2003) e Calleja-Macias et al. (2005). Nos
outros três isolados analisados, Bsb-20, Bsb-86 e Bsb-406, não foram observadas variações
em relação à sequência protótipo do gene E6 (Figura 29).
82
Figura 29. Variabilidade genética da LCR e dos genes E6 e L1 de isolados de HPV-52. Em cinza,
nucleotídeos conservados em relação à sequência protótipo; hachurado, variações nucleotídicas previamente
relatadas na literatura (Aho et al., 2003, Calleja-Macias et al., 2005, Gagnon et al., 2007) e em negrito,
variações de nucleotídeos não descritas na literatura e substituições de aminoácidos não-conservativas. Os
novos variantes moleculares detectados neste estudo estão marcados com asteriscos. Ref: sequência protótipo
do HPV-52; D1: deleção de 5bp entre os nt 7387-7391; D2: deleção de G no nt 7713; I1: inserção de TG
entre os nt 7288-7289; I2: inserção de CTAAAC entre os nt 7702-7703; ND: sequência não determinada, C:
cisteína, D: aspartato, E: glutamato, K: lisina, T: treonina, S: serina.
Em relação ao fragmento do gene L1 analisado, os isolados Bsb-86 e Bsb-406 não
apresentaram substituições nucleotídicas em relação à sequência protótipo (Figura 29). O
isolado Bsb-20 apresentou uma variação nucleotídica ainda não descrita na literatura na
posição 6922 que leva à substituição conservativa de serina (S) para cisteína (C) no códon
453. Analogamente às sequências da LCR e de E6, a maior variabilidade no gene L1
também foi detectada no isolado Bsb-15. Foram observadas no fragmento do gene L1
analisado 12 variações nucleotídicas previamente descritas por Gagnon et al. (2007).
Dentre essas, a mutação na posição 6983 leva a substituição de aminoácido conservativa de
aspartato (D) para glutamato (E) no códon 473, enquanto que as alterações nas posições
6703 e 6711 resultam em substituições não conservativas de lisina (K) para treonina (T) no
códon 380 e de serina (S) para aspartato (D) no códon 383, respectivamente.
A análise filogenética da LCR do HPV-52 foi realizada utilizando-se uma
sequência de 631pb obtida de 71 isolados. Foram incluídos quatro amostras do Distrito
Federal sendo as demais 66 sequências oriundas de diversas regiões do mundo e
previamente caracterizadas no estudo conduzido por Calleja-Macias et al. (2005).
Quatro clados distintos foram observados na filogenia do HPV-52 com valores
de bootstrap significativo (Figura 30). Os isolados Bsb-15 e BR0258 (Calleja-Macias et
al., 2005) formaram um ramo distante filogeneticamente dos demais isolados de HPV-52.
Ambos variantes foram detectados até o momento apenas no Brasil, o que levou à
HPV-52
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
2 2 2 3 3
3
4
5
5
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
8 8 9
2
3
4
4
6
7
7
7
9
9
9
9
9
9
9
9
0
0 4 8 8 8
8 2 7 7 2 2 9 9 9 0 0 1 1 4
6 6 1 2
3 5 2 7 5 0 1 1 1 2
2
3 4 8 8 9 4
7 9 8 1 2
7 4 1 9 2 4 5 6 9 0 2 2 3 3
1 5 7 8
7 0 5 1 9 3 1 2 7 0
2
5 1 0 3 2 9
Ref C G G T
T C C A G T C T T T G G C
G A C A
C G G C G A A G C T
C
T A G C T T
Bsb-15*
A
C
I1
T
G
D1
T
G
C
A
G
T
G
C
C
I2
C
D2
A
G
G
G
T
T
T
A
A
C
G
A
A
G
A
G
A
G
C
C
1
Bsb-20*
D
G
1
Bsb-86
D
1
Bsb-406 D C T
1
Oct-1
E2
C/EBP
K380T
S383D
S453C
D473E
Isolados
L1
C/EBP
AP-1
E2
LCR E6
Número de
amostras
83
classificação preliminar como um ramo Brasileiro. Outro ramo não pode ser classificado
baseado em composição étnica ou geográfica, uma vez que é composto por amostras
provenientes do Marrocos, Brasil e México. Todos os isolados coletados na Europa
ficaram agrupados em um ramo juntamente com amostras de outras partes do mundo,
levando à classificação de um ramo Europeu. Finalmente, o último ramo foi classificado
como um ramo Asiático por ser composto quase na totalidade por amostras de origem
asiática. Os isolados do Distrito Federal Bsb-20, Bsb-86 e Bsb-406 se agruparam no ramo
Europeu, onde também está localizada a sequência protótipo do HPV-52 (Figura 30).
84
Figura 30. Análise filogenética do HPV-52. Em adição às amostras analisadas neste estudo (amostras
marcadas com asterisco para facilitar a localização) foram utilizadas amostras do estudo de Calleja-
Macias et al. (2005). As siglas que antecedem o número das amostras indicam a procedência geográfica:
São Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei, México (MX); Edimburgo, Escócia (ED); Cidade
do Cabo, África do Sul (SA) e Oklahoma, Estados Unidos (OK); Marrocos (MR); Noruega (NW);
Heidelberg, Alemanha (HE); Filipinas (PH); Taipei, Taiwan (TW). Árvore de Máxima Parsimônia
enraizada com o HPV-35 como grupo externo. Os valores nos ramos correspondem aos valores de
bootstrap calculados pelo método UPGMA e algoritmo LogDet e 1000 réplicas. São mostrados valores de
bootstrap acima de 50%. O valor da barra de escala no canto esquerdo inferior representa a distância
genética em substituições por nucleotídeo do fragmento analisado. A sequência protótipo do HPV-52 está
destacada por um retângulo.
Ramo Brasileiro
Ramo Asiático
Ramo Indeterminado
Ramo Europeu
85
5.7.
HPV-58
A análise da sequência da LCR de oito isolados de HPV-58 revelou três variantes
compreendendo quatro variações nucleotídicas pontuais em relação à sequência protótipo.
As substituições nas posições 7266 e 7714 foram detectadas em todos isolados de HPV-58
analisados. Esta última está localizada sobreposta a potenciais sítios de ligação aos fatores
NF-1 e C/EBP. Adicionalmente, a variação de G para A na posição 7788 localiza-se
sobreposto a um potencial sítio de ligação para E2. As substituições de C para G e C para
T nas posições 7265 e 7266, respectivamente, ainda não estão descritas na literatura
(Figuras 31).
Figura 31. Variabilidade genética da LCR e dos genes E6 e L1 de isolados de HPV-58. Em cinza,
nucleotídeos conservados em relação à sequência protótipo; hachurado, variações nucleotídicas previamente
relatadas na literatura (Stewart et al., 1996; Xin et al., 2001; Calleja-Macias et al., 2005) e em negrito,
variações de nucleotídeos não descritas na literatura. Os novos variantes moleculares detectados neste estudo
estão marcados com asteriscos. Ref: sequência protótipo do HPV-58; ND: sequência não determinada.
Em relação à análise da sequência do gene E6 das amostras de HPV-58, foi
detectado o mesmo variante nos oito isolados analisados contendo uma substituição
nucleotídica silenciosa de C para T na posição 307 previamente descrita por Xin et al.
(2001) e Calleja-Macias et al. (2005) (Figura 31).
Sete isolados de HPV-58 tiveram a sequência de um fragmento do gene L1
analisada. Foram detectadas duas variações nucleotídicas silenciosas, sendo que a
substituição de C para T na posição 6727 ainda não foi relatada na literatura (Figura 31).
A análise filogenética da LCR do HPV-58 foi realizada a partir de fragmentos de
461pb de 102 isolados, dos quais, oito isolados eram oriundos do Distrito Federal e as
HPV-58 E6
7
7
7
7
6
6
2
2
7
7
3
6
7
6
6
1
8
0
4
2
5 6
4 8 7 1
7
Ref C C
A G C G
C
Bsb-128
G
T
G
T
1
Bsb-185
G
T
G
T
A
3
Bsb-295*
T
G
A
T
A
2
Bsb-329*
T
G
T
A
1
Bsb-367*
G T
G T A
T
1
NF-1/C/EBP
E2
Número de
amostras
L1
ND
LCR
Isolados
86
demais sequências foram obtidas a partir do banco genômico GenBank, depositadas por
Calleja-Macias et al. (2005). Os isolados Bsb-93 e Bsb-295 formaram um agrupamento
isolado com bootstrap significativo, justificado pela presença de uma mutação na posição
7788, detectada apenas nesses dois isolados (Figura 32). Os demais isolados do Distrito
Federal se agruparam com baixo valor de boostrap, no ramo onde estão a maioria das
amostras incluídas nesta análise filogenética. Não foram observados aglomerados étnicos
ou geográficos específicos na análise filogenética do HPV-58.
87
Figura 32. Análise filogenética do HPV-58. Em adição às amostras analisadas neste estudo (amostras
marcadas com asterisco para facilitar a localização) foram incluídas amostras do estudo de Calleja-Macias
et al. (2005). As siglas que antecedem o número das amostras indicam a procedência geográfica: São
Paulo, Brasil (BR); Hong Kong (HK); Monte Rei, México (MX); Edimburgo, Escócia (ED); Cidade do
Cabo, África do Sul (SA), Oklahoma, Estados Unidos (OK), Taipei, Taiwan (TW), Tailândia (TH) e
Filipinas (PH). Árvore de Máxima Parsimônia enraizada com o HPV-16 como grupo externo. Os valores
nos ramos correspondem aos valores de bootstrap calculados pelo método UPGMA e algoritmo LogDet e
1000 réplicas. São mostrados valores de bootstrap acima de 50%. O valor da barra de escala no canto
esquerdo inferior representa a distância genética em substituições por nucleotídeo do fragmento
analisado. A sequência protótipo do HPV-58 está destacada por um retângulo.
88
5.8.
Análise das distâncias genéticas intratípicas
A distância genética intratípica foi determinada pela comparação das sequências
da LCR dos isolados de HPV-31, -35, -52 e -58 detectados no Distrito Federal com
todas as sequências depositadas até o momento no banco de dados GenBank. Para a
análise da distância genética do HPV-33, foram comparadas as sequências de um
fragmento do gene L1 dos isolados do Distrito Federal com aquelas depositadas no
GenBank por Stewart et al. (1996), uma vez que sequências da LCR de HPV-33 obtidas
em outros estudos não estão disponíveis no banco genômico.
As máximas distâncias genéticas encontradas entre quaisquer duas sequências,
incluindo a sequência protótipo de cada tipo viral, estão descritas na Tabela 6. A partir
da análise da LCR, a máxima distância genética foi de 12 variações nucleotídicas de um
fragmento de 504pb (2,38%) para o isolado Bsb-227 de HPV-31, seis variações de um
fragmento de 664pb (0,90%) para o isolado Bsb-121 de HPV-35, e oito variações de um
fragmento de 461pb (1,73%) para os isolados Bsb-93 e Bsb-295 de HPV-58. O isolado
Bsb-15 de HPV-52 apresentou a maior distância genética: 23 variações de 797pb
(3,03%) em relação à sequência da LCR do HPV-52 protótipo. Além disso, a máxima
distância genética, entre os isolados de HPV-33, foi de quatro variações de um
fragmento de L1 de 406pb (0,98%) para os isolados Bsb-23 e Bsb-31. No total, foram
descritos 13 novos variantes em relação à respectiva sequência protótipo, cujas
sequências estão apresentadas no Anexo II.
89
Tabela 6. Comparação do número de variações nucleotídicas
relativas ao total de nucleotídeos sequenciados e máximas
distâncias genéticas intratípicas entre os isolados de HPV-31, -33, -
35, -52 e -58 detectados no Distrito Federal.
5.9.
Análise da expressão do promotor de E6/E7 de variantes de HPV-58
A sequência completa da LCR de três variantes distintos de HPV-58 detectados
no Distrito Federal foi clonada a montante do gene repórter luciferase, no vetor pGL3-
Basic. A Figura 33 mostra as quatro variações nucleotídicas pontuais detectadas entre
estes variantes naturais de HPV-58 (Bsb-295, Bsb-329 e Bsb-367). Além disso, a
sequência da LCR do HPV-58 protótipo (HPV-58prot) também foi clonada no vetor
pGL3-Basic.
Bsb-36
1,59
1
Bsb-133
2,15
1
Bsb-140
2,00
1
Bsb-193
1,98
5
Bsb-216
0,80
1
Bsb-227
2,38
1
Bsb-299 2,18 1
Bsb-23
0,98
2
Bsb-24 0,74 5
Bsb-59 0,46 1
Bsb-74
0,42
1
Bsb-82
0,58
1
Bsb-121 0,90 1
Bsb-15
3,03
1
Bsb-20 2,05 3
Bsb-93
1,73
2
Bsb-128
1,51
5
Bsb-329 1,30 1
HPV-58
Número de
amostras
HPV-31
HPV-33
HPV-35
Máxima distância
genética (%)
Tipo de HPV
HPV-52
Isolados
90
Figura 33. Variabilidade genética da LCR dos isolados de HPV-58. Em cinza, nucleotídeos sem
alteração em relação à sequência protótipo.
As construções obtidas foram transfectadas em células C33, juntamente com
o vetor pCMV-βgal, utilizado como controle da eficiência das transfecções. Também
foram transfectados vetores recombinantes contendo a LCR completa dos isolados
protótipo de HPV-16 e -18 previamente construídos por Sichero et al. (2005). Foram
realizados ao menos sete experimentos nos quais os vetores recombinantes foram
transfectados em triplicata. Os valores relativos de unidades de luminescência obtidos
em cada experimento foram normalizados pelo conteúdo protéico e pela atividade da
enzima β-galactosidase, e posteriormente comparados aos valores medidos para o HPV-
16 protótipo, determinando-se, desta forma, razões relativas (Figura 34).
Figura 34. Razões relativas de unidades de luminescência (RLU) detectadas entre os isolados de
HPV-58, -16 e -18. Foram realizados no mínimo sete experimentos nos quais os vetores recombinantes
foram transfectados em triplicata. Aos valores de RLU referente ao HPV-16 protótipo foi atribuído o
valor 1. Os valores de RLU detectados nos demais isolados foram comparados àqueles obtidos para o
HPV-16 em cada experimento. O hífen indica que no experimento 1 não foram analisadas as atividades
transcricionais dos isolados indicados.
A Figura 35 mostra graficamente os resultados obtidos. Conforme esperado, o
HPV-18 protótipo apresentou uma atividade transcricional cerca de sete vezes maior
que a do HPV-16 protótipo (Sichero et al., 2005). Pode-se observar que o HPV-58
7
7
7
7
2
2
7
7
6
6
1
8
5 6 4 8
Ref
C
C
A
G
Bsb-295
T
G
A
Bsb-329
T
G
Bsb-367
G
T
G
HPV-58prot
HPV-58mut
A
Bsb-367mut
G
T
G
A
Isolados
LCR
1 2 3 4 5 6 7 8
HPV-16 1 1 1 1 1 1 1 1 1,00 0,00
HPV-18 7,15 7,49 9,38 9,74 7,73 3,25 4,07 2,90 6,97 2,70
Bsb-295 7,96 4,85 5,03 7,04 4,76 2,80 3,26 3,66 5,10 1,80
Bsb-329 0,49 0,47 0,45 0,87 0,54 0,19 0,41 0,63 0,49 0,19
Bsb-367 0,62 0,92 1,37 1,49 1,95 0,76 0,41 1,30 1,08 0,51
HPV-58 prot - 1,20 1,82 1,21 1,25 0,68 0,54 1,53 1,12 0,45
HPV-58 mut - 2,99 4,94 6,15 3,48 2,01 1,40 3,55 3,50 1,63
Bsb-367mut - 0,06 0,02 0,03 0,04 0,02 0,01 0,03 0,03 0,02
Média
Desvio
padrão
Isolados
Experimentos (razões relativas)
91
protótipo e os variantes Bsb-329 e Bsb-367 de HPV-58 apresentaram atividade
transcricional similar ao HPV-16. Por outro lado, o variante Bsb-295 apresentou uma
atividade trancricional cinco vezes maior que o HPV-16 protótipo, e similar ao HPV-18
protótipo (Figuras 34 e 35). As atividades transcricionais obtidas pelo HPV-18 protótipo
e pelo variante Bsb-295 não foram estatísticamente diferentes (Figura 36).
A análise das variações nucleotídicas detectadas indica que a única diferença na
sequência da LCR entre os variantes Bsb-295 e Bsb-329 é a substituição na posição
7788. Desta forma, essa variação parece ser a responsável pelo aumento transcricional
observado para o variante Bsb-295.
A fim de verificar a influência da variação na posição 7788 isoladamente sobre a
atividade do promotor de E6/E7, foi construído, por meio da técnica de mutagênese
sítio-dirigida, o mutante HPV-58mut contendo, na sequência da LCR do HPV-58
protótipo, apenas essa variação. Além disso, foi também construído o mutante Bsb-
367mut que apresenta na sequência da LCR as quatro variações nucleotídicas detectadas
entre os isolados de HPV-58 do Distrito Federal (Figura 33).
Figura 35. Unidades Relativas de Luminescência (RLU) detectadas entre os isolados de HPV-58, -
16 e -18. As médias de RLU, obtidas a partir das razões de cada experimento realizado, foram plotadas
juntamente com os respectivos desvios padrões. Os asteriscos indicam que os isolados indicados não
foram estatisticamente diferentes entre si, mas foram estatisticamente diferentes em relação aos demais
isolados (p<0,005, IC:95%).
A inserção da substituição na posição 7788 na sequência da LCR protótipo
resultou no aumento da atividade transcricional em aproximadamente 3,2 vezes em
relação ao HPV-58 protótipo (Figuras 34 e 35). As atividades transcricionais observadas
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
HPV-16 HPV-18 Bsb-295 Bsb-329 Bsb-367 HPV-58prot HPV-58mut Bsb-367mut
Variantes
RLU
*
*
*
92
para o variante Bsb-295, o mutante HPV-58mut e o HPV-18 não foram estatisticamente
diferentes, no entanto, eram estatisticamente distintas dos demais variantes analisados
(Figura 36). Em conjunto esses dados indicam que a alteração na posição 7788 parece
ser a principal causa do aumento da atividade transcricional observada para o variante
Bsb-295.
Figura 36. Análise estatística das médias de unidades relativas de luciferase (RLU). O resultado
obtido foi gerado a partir do teste não paramétrico de Wilcoxon, por meio do sistema estatístico R. O
intervalo de confiança considerado foi de 95%.
O mutante Bsb-367mut que apresenta todas as variações nucleotídicas
detectadas no presente estudo apresentou uma atividade transcricional muito baixa
indicando que a presença artificial das quatro variações parece inibir fortemente o
promotor de E6/E7 de HPV-58.
HPV-16 HPV-18 Bsb-295 Bsb-329 Bsb-367 HPV-58 prot HPV-58 mut
HPV-16
HPV-18 0,0004
Bsb-295 0,0004 0,3282
Bsb-329 0,0004 0,0001 0,0001
Bsb-367 1,0000 0,0001 0,0001 0,0207
HPV-58 prot 0,1489 0,0003 0,0003 0,005 0,955
HPV-58 mut 0,0005 0,0540 0,1893 0,0003 0,0012 0,0023
Bsb-367mut 0,0005 0,0010 0,0014 0,0014 0,0014 0,0021 0,0021
Valor de p - Teste de Wilcoxon
Variantes
93
6. Discussão
No mundo, o tipo de HPV mais prevalente é o HPV-16, detectado em
aproximadamente 30 a 40% das lesões cervicais de alto grau. Entretanto, a
prevalência dos outros tipos virais de alto risco varia entre os diferentes países e
mesmo entre as regiões geográficas de um mesmo país. A distribuição dos genótipos
do HPV no Brasil parece ser complexa, já que sua prevalência pode diferir
significativamente mesmo entre cidades bem próximas (IARC, 2007). Portanto, os
dados coletados em uma cidade ou município não podem ser generalizados para todo
o país ou mesmo para uma região geográfica específica. A distribuição diferenciada
dos tipos de HPV no mundo tem determinantes ainda desconhecidos.
Até o momento, poucos estudos foram conduzidos mundialmente com o
intuito de analisar a variabilidade genética de tipos de alto risco menos prevalentes
que os HPV-16 e -18. O estudo dos variantes moleculares dos diversos tipos de HPV
em diferentes regiões geográficas é de grande importância para a caracterização de
polimorfismos intratípicos específicos, além da análise da distribuição destes
genótipos ao redor do mundo. Esses estudos podem fornecer evidências sobre a
existência de diferenças biológicas na transmissibilidade e patogênese entre os
variantes moleculares do HPV, além de contribuir para o desenvolvimento e
utilização efetiva de vacinas.
Os diferentes tipos de HPV apresentam uma organização genômica similar, no
entanto podem diferir nos níveis de expressão gênica. A transcrição dos genes virais é
um processo complexo envolvendo fatores transcricionais celulares e virais que atuam
concomitantemente, podendo resultar na estimulação ou repressão da transcrição das
proteínas oncogênicas do HPV (Bernard, 2002). Variantes moleculares distintos,
apesar de pertencerem ao mesmo tipo viral, podem apresentar uma expressão gênica
diferenciada (Kämmer et al., 2000; Sichero et al., 2005), uma vez que a variabilidade
na LCR pode atingir até 5% entre esses isolados (Ho et al.,1993).
6.1.
Análise da variabilidade genética de variantes de HPV-31, -33, -35, -52 e -
58.
O estudo da variabilidade intratípica do HPV permite a verificação das
diferentes formas genéticas desse vírus e o estudo da origem e propagação dos
diversos variantes ao redor do mundo. Além disso, a análise da variabilidade do HPV
94
é uma ferramenta importante em estudos epidemiológicos, visto que a infecção por
determinados variantes moleculares apresentam uma tendência maior a se tornar
persistente, um fator de risco para o desenvolvimento de lesões cervicais (Villa et al.,
2000; Xi et al., 2006; Aho et al., 2004; Gagnon et al., 2007). A caracterização
molecular destes isolados pode também contribuir para o conhecimento da associação
de variantes específicos com uma maior oncogenicidade, além de ter potenciais
implicações para o desenvolvimento e eficácia de uma vacina (Sichero e Villa, 2006),
e de testes de diagnóstico e de marcadores laboratoriais da infecção.
Neste estudo, foi realizada a caracterização das sequências de nucleotídeos
completas da LCR e do gene E6, além de um fragmento do gene tardio L1 de
amostras oriundas do Distrito Federal infectadas com os HPV-31, -33, -35, -52 e -58.
Alterações de aminoácidos detectadas nas proteínas E6 e L1 poderiam interferir na
atividade destas. Além disso, substituições na LCR poderiam influenciar a localização
e afinidade de sítios de ligação para fatores transcricionais celulares e viral.
A composição de sítios de ligação para fatores de transcrição na LCR, predita
pelo programa MATCH
TM
,
revelou algumas diferenças entre os cinco tipos de HPV
analisados. Para esta análise, foram pesquisados sítios de ligação para fatores
transcricionais que ativam (AP-1, E2, GRE, NF-1, Oct-1, TATA-box, Sp1 e c-Myc/c-
Max) ou reprimem (YY1 e C/EBP) a transcrição viral (Bernard, 2002), previamente
observados nas LCR dos HPV-16 e -18 e disponíveis na biblioteca de matrizes do
programa TRANSFAC®. Na LCR do HPV-16 foram descritos quatro sítios de
ligação para a proteína E2 viral, definindo a LCR em três segmentos distintos: 5’,
enhancer e 3’ (O’Connor et al., 1995). As LCR dos HPV-31, -33 e -52 também
apresentaram quatro sítios de ligação para E2, enquanto que as dos HPV-35 e -58
apresentaram três e cinco sítios, respectivamente. Em geral, o maior número de sítios
de ligação foi detectado para o fator de transcrição celular YY1, seguido de sítios para
os fatores Oct-1 e C/EBP. Esses dados são similares aos descritos para o HPV-16
(O’Connor et al., 1996; Bauknecht et al., 1996), exceto pelo menor número de sítios
de ligação para o fator Oct-1 observado na LCR do HPV-16 (O’Connor e Bernard,
1995). Sítios de ligação para o fator NF-1 na LCR do HPV-16 foram descritos apenas
na região do enhancer (Chong et al., 1991), entretanto, essa característica foi
detectada apenas para os HPV-31 e -33. Foram também observadas algumas
particularidades: a ausência de sítios de ligação para Sp-1 no HPV-33, para AP-1 no
HPV-31 e do TATA-box nos HPV-33 e -52. Além disso, apenas na LCR do HPV-52
95
foi detectado um sítio para o elemento de resposta a glicocorticoíde (GRE) e, em
nenhum dos tipos virais analisados foram detectados sítios de ligação para c-Myc/c-
Max. É possível que a não observação de sítios para esses fatores se deva aos altos
valores de coincidência utilizados nesta análise. De qualquer maneira, são necessários
estudos que comprovem a existência e a relevância para a atividade transcricional
viral dos sítios detectados nas posições preditas.
Apesar de laborioso e oneroso, o procedimento mais comumente utilizado
para a caracterização dos diferentes variantes presentes em uma amostra biológica, até
o momento, é o sequenciamento do DNA obtido a partir da amplificação por PCR
utilizando-se iniciadores consensos ou específicos. Entretanto, o sequenciamento
direto de um produto de PCR não é adequado para a caracterização de sequências
oriundas de múltiplos tipos de HPV em uma mesma amostra, já que será detectado
preferencialmente o tipo de HPV mais representado na mesma (Vernon et al., 2000).
Nas amostras deste estudo em que foram detectados previamente mais de um tipo de
HPV, foi realizada a clonagem dos amplicons antes do sequenciamento. Desta forma,
foi possível analisar os diferentes variantes presentes em 8 amostras que
apresentavam co-infecção. O sequenciamento direto ou clonagem de produtos de duas
reações de PCR independentes, além do sequenciamento de ao menos dois clones de
cada variante detectado, garante a ausência de erros introduzidos durante a reação de
amplificação.
Por meio da análise da sequência da LCR, pode-se observar que o tipo de HPV
que apresentou a maior variabilidade genética foi o HPV-52 (3,03%), seguido do
HPV-31 (2,38%), -58 (1,73%) e -35 (0,90%). Adicionalmente, a análise da sequência
de um fragmento do gene L1 entre os isolados de HPV-33 revelou que a máxima
distância genética foi de 0,98%. Neste estudo, 13 novos variantes foram
caracterizados. O grande número de novos variantes detectados pode ser explicado
por terem sido conduzidos poucos estudos, até o momento, acerca da variabilidade
genética desses HPV menos prevalentes. Substituições de nucleotídeos que resultam
na parada precoce da tradução ou em mudança na fase de leitura não foram detectadas
nas sequências de E6 ou L1 analisadas.
É válido ressaltar que um fragmento de 545pb da LCR de três dos oito
isolados de HPV-58 analisados neste estudo foram previamente caracterizados no
estudo conduzido por Calleja-Macias et al. (2005). Entretanto, no presente estudo,
96
foram analisados não só um maior número de isolados de HPV-58, como também um
fragmento do gene L1 e a sequência de nucleotídeos completa da LCR e do gene E6.
Os isolados de HPV-31 apresentaram variações nucleotídicas ainda não
descritas na literatura nas posições 7860 e 3 da LCR, e nas posicões 305, 306 e 537 do
gene E6. Interessantemente, o isolado Bsb-36 apresentou a variação de G para C na
posição 7860, ao invés de G para A previamente descrito por Calleja-Macias et al.
(2004) e também detectada no isolado Bsb-216. Essa substituição se localiza
sobreposta a um potencial sítio de ligação aos fatores de transcrição celular YY1 e
Oct-1. Entretanto, o efeito das substituições encontradas sobre a ligação dos mesmos à
LCR é ainda desconhecido.
As sequências da LCR dos dois isolados de HPV-33 analisados apresentaram
uma deleção de 78pb previamente descrita na literatura (Gagnon et al., 2004;
Khouadri et al., 2006). Foi observado que a ausência dessa deleção está associada
com a persistência viral (Gagnon et al., 2004), sugerindo, portanto, um papel
supressivo para a presença do fragmento de 78pb in vivo. Além disso, a variação
nucleotídica de C para G na posição 7732, detectada no isolado Bsb-23, foi associada
com a presença de lesões cervicais de alto grau (Khouadri et al., 2006).
Foi detectado um novo variante de HPV-35 (Bsb-121) que apresentou a
variação nucleotídica de A para G na posição 7418 da LCR. Esta substituição não está
localizada sobreposta a nenhum sítio de ligação aos fatores de transcrição analisados
neste estudo utilizando-se o programa MATCH. Entretanto, é importante ressaltar que
a atividade de uma região regulatória depende não só da presença dos motivos cis-
responsivos, mas também das seqüências adjacentes (Ondek et al., 1988).
O HPV-52 não só foi o tipo de HPV que apresentou a maior variabilidade nas
três regiões genômicas analisadas, mas também aquele que apresentou o maior
número de variações nucleotídicas ainda não descritas na literatura. Nove novas
variações nucleotídicas foram detectadas na LCR do isolado Bsb-15, sendo muitas
delas localizadas sobrepostas a potenciais sítios de ligação a fatores transcricionais
celulares e viral. A substituição nucleotídica de T para G ou C na posição 7624 foi
detectada em 2 de 4 amostras analisadas. Interessantemente, a mutação nessa posição
parece estar associada com a persistência da infecção por HPV-52 (Aho et al., 2004).
Entretanto, o pequeno número de amostras analisadas neste estudo impossibilita
considerações adicionais. Em relação ao gene L1, um novo variante foi detectado
97
(Bsb-20), apresentando uma variação nucleotídica não-sinônima na posição 6922,
ainda não descrita na literatura.
Embora tenham sido detectadas quatro variações nucleotídicas na LCR dos
isolados de HPV-58, observou-se que as sequências de E6 eram altamente
conservadas, apresentando uma única variação em todos os isolados analisados. Isso é
esperado, visto que o segmento da LCR está sob menor pressão seletiva que a região
codificadora, e portanto pode apresentar um número maior de variações nucleotídicas
(Yamada et al., 1995).
As LCR dos isolados de HPV-31, -35 e -58 e, principalmente, as de HPV-33 e
-52 analisados neste estudo, apresentaram um grande número de substituições
nucleotídicas, sendo que algumas delas se encontram sobrepostas a potenciais sítios
de ligação para fatores de transcrição, podendo, portanto, influenciar a expressão dos
oncogenes virais. Além disso, as inserções e deleções detectadas podem modificar a
estrutura da fita de DNA, podendo afetar a interação de fatores de transcrição com
seus sítios de ligação localizados na LCR. Experimentos envolvendo deleções e
mutações pontuais de nucleotídios da LCR indicaram que a atividade do enhancer
viral depende da ativação cooperativa de muitos fatores de transcrição, sendo sua
atividade muito reduzida pela eliminação dos sítios de ligação para AP-1 e NF-1
(Chong et al., 1991). Adicionalmente, substituições nucleotídicas podem resultar na
supressão da capacidade de ligação de fatores de transcrição específicos, ou pela
redução da afinidade destes pelos seus sítios de reconhecimento, ou devido a alteração
de sua habilidade em interagir com outras proteínas (Bernard, 2002).
Entre as amostras de HPV estudadas, foram detectadas substituições não
silenciosas em ambos os genes E6 e L1, sendo que algumas resultaram em alterações
não conservativas de aminoácidos. As substituições não conservativas levam a
alteração das propriedades físico-químicas dos aminoácidos. No entanto, o efeito de
cada mutação pontual sobre a atividade da proteína depende da posição e função do
aminoácido alterado, além da combinação com outras variações possivelmente
detectadas na mesma proteína.
6.2.
Análise filogenética dos HPV-31, -33, -35, -52 e -58.
A análise da variabilidade nucleotídica intratípica dos HPV-16 e -18 tem sido
extensivamente estudada e serve como ferramenta importante para traçar a filogenia e
evolução destes vírus. Através da análise filogenética baseada em seqüências parciais
98
da LCR, foi descrito que os diferentes variantes dos HPV-16 e -18 parecem ter co-
evoluído com os três maiores ramos filogenéticos humanos (africanos, caucasianos e
asiáticos). Os variantes do HPV-16 foram agrupados em cinco clados distintos:
Europeu (E), Asiático (As), Asiático–Americano (AA), Africano 1 (Af–1) e Africano
2 (Af–2) (Ho et al., 1993; Chan et al., 1992). A árvore filogenética de isolados do
HPV-18 revela os ramos Africano (Af), Europeu (E) e Asiático Americano (AA)
(Ong et al., 1993). Variantes de cada um desses ramos estão diferentemente
distribuídas nas diversas regiões geográficas (Ong et al., 1993; Yamada et al., 1997)
A análise filogenética dos HPV-31, -33 e -58 não revelou agrupamentos
étnicos ou geográficos específicos como relatado para os HPV-16 e -18 (Ho et al.,
1993; Ong et al., 1993), uma vez que as amostras de diferentes locais do mundo se
localizaram por todos os ramos. Isso era esperado devido à pequena variabilidade
detectada nas LCR dos HPV-31 e -58, e na sequência de L1 dos isolados de
HPV-33, o que também justifica os valores de bootstrap não significativos na
maioria das entradas dos ramos.
Baseado nas sequências de fragmentos da LCR, árvores dicotômicas foram
previamente observadas para os variantes de HPV-33, -35, -53 e -66 (Calleja-Macias
et al., 2005; Khouadri et al.,2006; Prado et al., 2005). No presente estudo, não foi
possível realizar a análise filogenética das sequências da LCR de isolados de HPV-33,
já que as sequências obtidas em outros estudos não estão disponíveis no GenBank.
Uma vez que essa dicotomia foi somente detectada entre subtipos de HPV, pode-se
sugerir que o HPV-35 e -33, assim como os HPV-53 e -56, podem estar em um
processo evolutivo que pode levar a novos subtipos e eventualmente a novos tipos de
HPV (Prado et al., 2005).
No estudo conduzido por Calleja-Macias et al. (2005), a análise filogenética
do HPV-52 foi realizada a partir de sequências parciais da LCR de 66 amostras de
diferentes regiões geográficas de várias partes do mundo, e 18 variantes genômicos
distintos foram caracterizados. Foi sugerido a existência de um ramo Ásiatico-Nativo
Americano. No presente estudo, a filogenia das sequências de HPV-52 divergiram
marcadamente em quatro ramos distintos que apresentaram valores altos de bootstrap.
Foi possível caracterizar ramos Asiático e Europeu, uma vez que as sequências de
amostras provenientes desses continentes estavam concentradas nesses agrupamentos.
Além disso, outro ramo era composto somente por duas sequências oriundas do Brasil
(Bsb-15 and BR0258), podendo ser preliminarmente classificado como um ramo
99
Brasileiro. A formação deste ramo Brasileiro pode ser justificada pela alta
variabilidade genética detectada exclusivamente na LCR destes isolados. Entretanto,
outras amostras oriundas do Brasil estão localizadas em todos os outros ramos
filogenéticos. O quarto ramo não mostrou relação étnica ou geográfica específica já
que era composto por isolados originários do Brasil, México e Marrocos. Pelo
exposto, pode-se sugerir que os variantes moleculares de HPV-52 co-evoluíram com
os maiores grupos étnicos humanos, analogamente ao observado para os HPV-16 e -
18, embora em uma taxa evolutiva mais lenta (Calleja-Macias et al., 2005; Ho et al.,
1993; Ong et al., 1993). Entretanto, estudos com um maior número de amostras
são necessários para consolidar a filogenia do HPV-52 observada no presente
estudo.
A ausência de aglomerados étnicos ou geográficos específicos foi observada
para genótipos de HPV que são raros quando comparados à alta prevalência do HPV-
16. Não se sabe o motivo de diferentes genótipos de HPV apresentarem prevalência
distinta, mas é provável que tipos mais abundantes se dispersem mais rápido que os
genótipos raros. Consequentemente, a diversificação dos tipos raros do HPV ocorreria
em uma escala de tempo diferente que a do HPV-16, portanto, não associada à
dispersão dos principais grupos étnicos humanos no mundo (Prado et al., 2005).
Os resultados obtidos neste estudo foram recentemente publicados (Raiol et
al., 2009) e estão apresentados na forma de artigo científico no Anexo I. Até o
momento, este é o estudo mais extenso acerca da variabilidade genética e da filogenia
dos tipos de HPV de alto risco HPV-31, -33, -35, -52 e -58 detectados no Distrito
Federal, ampliando o conhecimento sobre a divesidade desses vírus cujos dados
disponíveis ainda são muito limitados.
6.3.
Análise da atividade transcricional do promotor de E6/E7 de variantes
de HPV-58.
Durante as últimas décadas, a comunidade científica tem se interessado em
inferir funcionalmente a importância da variabilidade genética sob o potencial
oncogênico dos diferentes variantes moleculares de HPV. A fim de avaliar o efeito
das mutações sobre a atividade transcricional viral, ensaios que envolvem a
quantificação da expressão de um gene repórter ligado a montante da LCR tem sido
utilizados. Entretanto, é importante ressaltar que esses experimentos refletem uma
situação artificial na qual a atividade está sendo medida utilizando-se um plasmídio
100
epissomal, em um meio celular definido e em uma cultura in vitro. Apesar dessas
limitações, esses experimentos funcionais ainda são a melhor forma disponível de
averiguar os efeitos das variações nucleotídicas sob a expressão viral.
Até o momento, não foram realizados estudos funcionais envolvendo variantes
moleculares de outros tipos de HPV de alto risco menos prevalentes que os HPV-16 e
-18. Foi observado que variantes moleculares de HPV-16 e -18 apresentam atividades
transcricionais distintas (Kämmer et al., 2000; Sichero et al., 2005). Adicionalmente,
a variabilidade das oncoproteínas E6 e E7 também tem significância funcional, como
sugerido por estudos in vivo e in vitro (Stöppler et al., 1996a; Choo et al., 2000;
Grodzki et al., 2006; Contreras-Paredes et al., 2009; Zehbe et al., 2009).
Alguns estudos sugerem que funcionalmente variantes não-Europeus de HPV-
16 são mais oncogênicos quando comparados a variantes Europeus. A maior
oncogenicidade observada por esses variantes pode ser atribuída a um aumento na
atividade transformante dos oncogenes E6 e E7 (Choo et al., 2000; Zehbe et al.,
2009), a uma maior eficiência da replicação viral (Hubert, 2005) ou a uma maior
estimulação da expressão dos genes precoces (Veress et al., 1999; Kämmer et al.,
2000; Sichero et al., 2005). Adicionalmente, a maior parte dos estudos biológicos e
epidemiológicos conduzidos em populações com composição multi-étnica indicam
que variantes Asiático-Americanos de HPV-16 e -18 são mais oncogênicos que
variantes Europeus (Villa et al., 2000, Berumen et al., 2001; Hildesheim et al., 2001;
Sichero et al., 2007; Xi et al., 2007). Entretanto, estudos adicionais são necessários
para avaliar o significado da variabilidade intratípica e a possível correlação com os
dados gerados em estudos epidemiológicos.
No Distrito Federal, o HPV-58 é o segundo tipo mais prevalente, tendo sido
detectado em 13,43% das amostras de lesões cervicais de alto grau analisadas
(Câmara et al., 2003). A alta prevalência de HPV-58 também foi relatada em amostras
oriundas do Norte (7,1%) e Nordeste (8,2%) do Brasil (Lorenzato et al., 2000;
Noronha et al., 1999), assim como em amostras provenientes do México (27,3%),
Espanha (42,7%) e alguns países asiáticos, como Japão (15%) e China (23,8%) (Chan
et al., 1999; Giuliano et al., 2001; Sasagawa et al., 2001; Touze et al., 2001).
Apesar da alta prevalência do HPV-58 em diferentes regiões do mundo, este é
o único estudo conduzido até o momento, com o objetivo de analisar as consequências
da variabilidade genética do HPV-58 sobre o potencial oncogênico do mesmo. Para
tanto, objetivou-se analisar o efeito da variabilidade da LCR dos diferentes variantes
101
moleculares de HPV-58, detectados no Distrito Federal, sobre a atividade do
promotor de E6/E7, localizado na LCR. Analogamente aos estudos realizados
anteriormente utilizando-se variantes de HPV-16 (Kämmer et al., 2000; Veress et al.,
1999) e -18 (Sichero et al., 2005), as sequências da LCR completas do HPV-58
protótipo e de três variantes detectados no Distrito Federal foram clonadas a montante
do gene repórter luciferase e transfectados transientemente em células C33. No
presente estudo, foi observado que a LCR do HPV-18 protótipo é sete vezes mais
ativa que a do HPV-16 protótipo. Esse dado é similar ao observado anteriormente por
Sichero et al. (2005). Apesar do HPV-58 ser detectado com menos frequência no
câncer cervical quando comparado ao HPV-16 (Clifford et al., 2003), o HPV-58
protótipo apresentou uma atividade transcricional similar ao HPV-16 protótipo. Até o
momento, o HPV-58 protótipo foi detectado apenas no Japão, quando foi descrito esse
tipo viral (Matsukura e Sugase, 1990; Kirii et al., 1991; Calleja-Macias et al., 2005).
Esses achados sugerem que é possível que o HPV-58 protótipo seja um variante
molecular raro e geográficamente restrito. Outros dois variantes (Bsb-329 e Bsb-367)
também apresentaram atividade transcricional similar ao dos HPV-16 e -58 protótipo.
Assim, as variações nas posições 7265, 7266 e 7714 da LCR parecem ter pouca
influência sobre a atividade do promotor de E6/E7 de HPV-58.
Por outro lado, o variante Bsb-295 de HPV-58 apresentou uma alta atividade
transcricional, cerca de cinco vezes mais ativo que o HPV-58 e o HPV-16 protótipo, e
estatisticamente similar ao HPV-18 protótipo. Isso sugere que o variante Bsb-295 de
HPV-58 pode estar associado a um alto potencial oncogênico. Foi proposto que os
variantes moleculares de HPV-18 diferem na patogênese do câncer cervical e que
pequenas diferenças genômicas nas oncoproteínas E6 e E7 têm impacto substancial na
progressão dessa doença (de Boer et al., 2005). O HPV-18 está mais freqüentemente
associado ao desenvolvimento de adenocarcinoma do colo do útero que é
caracterizado por ser um tipo de tumor mais agressivo, menos diferenciado e
associado a um pior prognóstico quando comparado a tumores escamosos (Rose et al.,
1991). As propriedades de transformação e imortalização do HPV foram mapeados a
LCR-E6-E7, sendo possível portanto que variações nucleotídicas nessas regiões
afetem as propriedades oncogênicas do HPV-18, e de outros tipos virais (Villa e
Schlegel, 1991).
A substiuição nucleotídica na posição 7788 é a característica distintiva do
isolado Bsb-295 em relação aos outros variantes de HPV-58. Assim, o impacto dessa
102
variação sobre a atividade transcricional foi avaliada utilizando-se a técnica de
mutagênese sítio-dirigida. Em comparação ao HPV-58 protótipo, a inserção da
substituição nucleotídica na LCR do mutante Bsb-58mut induziu um aumento na
atividade transcricional, estatisticamente similar à detectada para o isolado Bsb-295 e,
inclusive, para o HPV-18 protótipo. Por outro lado, o mutante Bsb-329mut, que
apresenta todas as variações detectadas na LCR dos isolados de HPV-58
caracterizados neste estudo, mostrou uma atividade transcricional muito baixa. Isso
sugere que, apesar da substituição na posição 7788 induzir o promotor de E6/E7, na
presença das outras três substituições nucleotídicas a atividade transcricional é
inibida. Entretanto, o mecanismo molecular que levou a esse resultado ainda é
desconhecido.
No presente estudo, foi realizada uma análise da composição de sítios de
ligação para fatores de transcrição na LCR do HPV-58 protótipo in silica. De acordo
com essa análise, a substituição nucleotídica na posição 7788 não se localiza
sobreposta a nenhum sítio de ligação para fatores transcricionais celulares testados.
Entretanto, estudos adicionais são necessários para averiguar a possível presença de
sítios de ligação para fatores transcricionais celulares não pesquisados neste estudo e a
influência que a variação na posição 7788 poderia ter sobre a ligação de fatores
transcricionais a sítios próximos.
Os estudos conduzidos com variantes moleculares de HPV-16 e -18 revelaram
que nenhuma alteração nucleotídica individual é responsável pelo aumento da
atividade transcricional (Veress et al., 1999; Kämmer et al., 2000; Sichero et al.,
2005) Assim, acredita-se que a combinação das alterações nucleotídicas da LCR nos
variantes moleculares seja responsável pelas diferenças funcionais observadas. No
entanto, a análise da atividade transcricional do isolado Bsb-295 revelou que uma
única variação nucleotídica é capaz de aumentar a atividade do promotor, podendo,
por consequência, levar a uma expressão elevada dos oncogenes virais in vivo.
Os estudos sobre a variabilidade genética do HPV-58 e de outros tipos de alto
risco mais raros que HPV-16 e -18 ainda são muito limitados. Entretanto, futuros
estudos epidemiológicos e sobre os variantes de HPV-58 poderão averiguar a relação
entre uma maior prevalência de variantes moleculares de HPV-58 com um maior
potencial oncogênico, como possivelmente o variante Bsb-295, e regiões geográficas
onde o HPV-58 tem sido mais frequentemente associado a lesões cervicais de alto
grau.
103
A incidência de câncer cervical é muito maior nos países em desenvolvimento,
principalmente na África e América Latina, que nos países desenvolvidos. Isso pode
ser explicado em parte pela alta fertilidade, má nutrição e pela pequena cobertura dos
sistemas de saúde pública nos países em desenvolvimento (WHO, 2007). É também
importante ressaltar que variantes moleculares específicos de HPV podem apresentar
um maior potencial oncogênico, podendo constituir um fator de risco adicional
contribuindo para a maior prevalência de câncer cervical em populações em
desenvolvimento nas diferentes regiões do mundo. Pelo exposto, a importância da
variabilidade nucleotídica do HPV na prevalência do câncer do colo do útero deve ser
afetada não apenas pela prevalência de cada variante nas diferentes populações, mas
também por diferenças funcionais intrínsecas de cada variante.
104
7. Conclusões
• Foram detectados 13 novos variantes: 4 de HPV-31, 3 de HPV-33, 1 de HPV-
35, 2 de HPV-52 e 3 de HPV-58.
• A variabilidade genética do HPV-52 (3,03%) foi a maior, seguido dos HPV-31
(2,38%), -58 (1,73%) e -35 (0,90%).
o A máxima distância genética do HPV-33 foi de 0,98%.
• A composição de potenciais sítios de ligação na LCR difere entre os cinco
tipos de HPV analisados e em relação ao HPV-16.
• Um grande número de variações nucleotídicas estavam localizadas em
potenciais sítios de ligação, especialmente entre os variantes de HPV-33 e -52.
• A filogenia do HPV-52 revelou a presença de 4 clados distintos (Europeu,
Asiático, Indeterminado e Brasileiro)
o Ramos étnicos ou geográficos não foram encontrados para os outros
tipos virais.
o A filogenia dos HPV-31, -35 e -58 descrita na literatura foi confirmada
neste estudo.
• O variante Bsb-295 de HPV-58 apresentou alta atividade transcricional similar
ao HPV-18.
o A variação nucleotídica na posição 7788 da LCR do variante Bsb-295
foi a principal responsável pelo aumento transcricional observado.
o Os resultados sugerem que variantes de outros tipos de alto risco
também podem apresentar potenciais oncogênicos distintos como de
HPV-16 e -18
105
8. Bibliografia
Abba MC, Laguens RM, Dulout FN, Golijow CD (2004) The c-myc activation in
cervical carcinomas and HPV 16 infections. Mutat Res 557(2): 151-8.
Adhikary S, Eilers M (2005) Transcriptional regulation and transformation by by
Myc proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biol 6: 635-645.
Aho J, Hankins C, Tremblay C, Forest P, Pourreaux K, Rouah F, Coutlee F,
Canadian Women's HIV Study Group (2004) Genomic polymorphism of
human papillomavirus type 52 predisposes toward persistent infection in
sexually active women. J Infect Dis, 190(1): 46-52.
Aho J, Hankins C, Tremblay C, Lang F, Forest P, Pourreaux K, Rouah F,
Coutlee F, The Canadian Women's HIV Study Group (2003) Molecular
analysis of human papillomavirus type 52 isolates detected in the genital tract
of human immunodeficiency virus-seropositive and -seronegative women. J
Infect Dis 188(10): 1517-27.
Alencar TR, Cerqueira DM, da Cruz MR, Wyant PS, Ramalho ED, Martins CR
(2007) New HPV-16 European and non-European variants in Central Brazil.
Virus Genes 35(1): 1-4.
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Apt D, Chong T, Liu Y, Bernard HU (1993) Nuclear factor I and epithelial cell-
specific transcription of human papillomavirus type 16. J Virol 67: 4455-
4463.
Apt D, Liu Y, Bernard HU (1994) Cloning and functional analysis of spliced
isoforms of human nuclear factor I-X: interference with transcriptional
activation by NFI/CTF in a cell-type specific manner. Nucleic Acids Res 22:
3825-3833.
Arends M, Donaldson Y, Duvall E, Wyllie A, Bird C (1993) Human
papillomavirus type 18 associates with more advanced cervical neoplasia
than human papillomavirus type 16. Hum Pathol 24, 432–437.
Arias-Pulido H, Peyton CL, Torrez-Martinez N, Anderson DN, Wheeler CM
(2005) Human papillomavirus type 18 variant lineages in United States
populations characterized by sequence analysis of LCR-E6, E2, and L1
regions. Virology 338(1): 22-34.
106
Autier P, Coibion M, Huet F, Grivegnee AR (1996) Transformation zone
location and intraepithelial neoplasia of the cervix uteri. Br J
Cancer 74(3): 488-490.
Baker CC, Phelps WC, Lindgren V, Braun MJ, Gonda MA, Howley PM (1987)
Structural and translational analysis of human papillomavirus type 16
sequences in cervical carcinoma cell lines. J Virol 61: 962–971.
Baseman JG, Koutsky LA (2005) The epidemiology of human papillomavirus
infections. J Clin Virol 32 Suppl 1: S16-24.
Bauknecht T, See RH, Shi Y (1996) A Novel C/EBP b-YY1 Complex Controls
the Cell-Type-Specific Activity of the Human Papillomavirus Type 18
Upstream Regulatory Region. J Virol 70(11): 7695–7705.
Bauknecht T, Shi Y (1998) Overexpression of C/EBPbeta Represses Human
Papillomavirus Type 18 Upstream Regulatory Region Activity in HeLa Cells
by Interfering with the Binding of TATA-Binding Protein. J.Virol 72: 2113 -
2124.
Berberich S, Hyde-DeRuyscher N, Espenshade P, Cole M. (1992) max encodes a
sequence-specific DNA-binding protein and is not regulated by serum growth
factors. Oncogene 7(4):775-9.
Bernard HU (2002) Gene expression of genital human papillomaviruses and
considerations on potential antiviral approaches. Ant Ther 7: 219-237.
Bernard HU (2005). The clinical importance of the nomenclature, evolution and
taxonomy of human papillomaviruses. J Clin Virol 32: S1-6.
Bernard HU, Chan SY, Manos MM, Ong CK, Villa LL, Delius H, Peyton CL,
Bauer HM, Wheeler CM (1994). Identification and assessment of known and
novel human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification,
restriction fragment length polymorphisms, nucleotide sequence, and
phylogenetic algorithms. J Infect Dis 170(5), 1077-1085.
Berumen J, Ordoñez RM, Lazcano E, Salmeron J, Galvan SC, Estrada RA,
Yunes E, Garcia-Carranca A, Gonzales-Lira G, de La Campa AM (2001)
Asian-American variants of human papillomavirus type 16 and risk for
cervical cancer: a case-control study. J Natl Cancer Inst 93(17): 1325
–
1330.
Bosch X, Harper D (2006) Prevention strategies of cervical cancer in the HPV
vaccine era. Gynec Oncol 103: 21–24.
107
Bouallaga I, Massicard S, Yaniv M, Thierry F (2000). An enhanceosome
containing the Jun B/Fra-2 heterodimer and the HMG-I(Y) architectural
protein controls HPV 18 transcription. EMBO Rep 1(5): 422-7.
Bousarghin L, Touzé A, Sizaret PY, Coursaget P (2003) Human Papillomavirus
Types 16, 31, and 58 Use Different Endocytosis Pathways To Enter Cells. J
Virol 77: 3846-3850.
Buck CB, Pastrana DV, Lowy DR, Schiller JT (2004) Efficient Intracellular
Assembly of Papillomaviral Vectors. J Virol 78: 751 - 757.
Calleja-Macias IE, Kalantari M, Huh J, Ortiz-Lopez R, Rojas-Martinez A,
Gonzalez-Guerrero JF, Williamson AL, Hagmar B, Wiley DJ, Villarreal L,
Bernard HU, Barrera-Saldana HA. 2004. Genomic diversity of human
papillomavirus-16, 18, 31, and 35 isolates in a Mexican population and
relationship to European, African, and Native American variants. Virol
319(2): 315-23.
Calleja-Macias IE, Villa LL, Prado JC, Kalantari M, Allan B, Williamson A-L,
Chung L-P, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Chu T-Y, Cubie HA, Cuschieri
K, von Knebel-Doeberitz M, Martins CR, Sanchez GI, Bosch FX, Munoz N,
Bernard HU (2005) Worldwide Genomic Diversity of the High-Risk Human
Papillomavirus Types 31, 35, 52, and 58, Four Close Relatives of Human
Papillomavirus Type 16. J Virol 79: 13630 - 13640.
Camara GNL, Cerqueira DM, Oliveira APG, Silva EO, Carvalho LGS, Martins
CRF (2003) Prevalence of human papillomavirus types in women with pre-
neoplastic and neoplastic cervical lesions in the Federal District of Brazil.
Mem Inst Oswaldo Cruz 98(7): 879
–
883.
Cerqueira DM, Camara GNL, Cruz MR, Silva EO, Brígido MM, Carvalho LGS,
Martins CRF (2003) Variants of human papillomavirus types 53, 58, 66
identified in central Brazil. Virus Genes 26(1): 83-87.
Cerqueira DM, Moraes DS, Camara GN, Amaral FA, Oyama CN, dos Santos,
MQ, Martins CR (2007). High HPV genetic diversity in women infected with
HIV-1 in Brazil. Arch Virol 152(1): 75-83.
Chan PKS, Lam CW, Cheung TH, Li, WH, Lo, KWK, Chan, MYM, Cheng, AF,
Cheung, JLK (2002) Association of human papillomavirus type 58 variant
with the risk of cervical cancer. J. Natl. Cancer Inst. 94: 1249 – 1253.
108
Chan PKS, Li WH, Ma WI, Cheung JLK, Cheng AF (1999) High prevalence of
human papillomavirus type 58 in Chinese women with cervical cancer and
pre-cancerous lesions J Med Virol 59: 232-238.
Chan WK, Chong T, Bernard HU, Kiock G (1990) Transcription of the
transforming genes of the oncogenic human papillomavirus-16 is stimulated
by tumor promotors through AP1 binding sites. Nucleic Acids Res 18: 763-
769.
Chan WK, Klock G, Bernard HU (1989) Progesterone and glucocorticoid
response elements occur in the long control regions of several human
papillomaviruses involved in anogenital neoplasia. J Virol 63:3261-3269.
Cheng S, Schmidt-Grimminger DC, Murant T, Broker TR, Chow LT (1995)
Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7
gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated
keratinocytes. Genes Dev 9: 2335-2349.
Chong T, Apt D, Gloss B, Isa M, Bernard HU (1991) The enhancer of human
papillomavirus-16: binding sites for the ubiquitous transcription factors oct-
1, NFA, TEF-2, NF1 and AP1 participate in the epithelial specific
transcription. J Virol 65(11): 5933-5943.
Choo KB, Wang TS, Huang CJ (2000) Analysis of relative binding activity of
E7-pRB of human papillomavirus type 16 clinical variants using the yeast
two-hybrid system. J Med Virol 61: 298-302.
Clifford GM, Gallus S, Herrero R, Muñoz N, Snijders PJF, Vaccarella S, Anh
PTH, Ferreccio C, Hieu NT, Matos E, Molano M, Rajkumar R, Ronco G, de
Sanjosé S, Shin HR, Sukvirach S, Thomas JO, Tunsakul S, Meijer CJML,
Franceschi S, The IARC HPV Prevalence Surveys Study Group (2005)
Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically
normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV
prevalence surveys: a pooled analysis. Lancet 366: 991–98.
Clifford GM, Smith JS, Aguado T, Franceschi S (2003) Comparison of HPV type
distribution in high-grade cervical lesions and cervical cancer: a meta-
analysis. Br J Cancer 89(1): 101-5.
Contreras-Paredes A, De la Cruz-Hernandez E, Martinez-Ramirez I, Duenas-
Gonzalez A, Lizano M (2009) E6 variants of human papillomavirus 18
109
differentially modulate the protein kinase B/phosphatidylinositol 3-kinase
(akt/PI3K) signaling pathway. Virol 383(1): 78-85.
Cripe TP, Haugen TH, Turk JP, Tabatabai F, Schmid PG, Durst M, Gissmann L,
Roman A, Turek LP (1987) Transcriptional regulation of the human
papillomavirus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer,
and by viral E2 trans-activator and repressor gene products: implications for
cervical carcinogenesis. EMBO J 6(12): 3745-3753.
Day PM, Baker CC, Lowy DR, Schiller JT (2004) Establishment of
papillomavirus infection is enhanced by promyelocytic leukemia protein
(PML) expression. PNAS 101: 14252-14257.
Day PM, Roden RB, Lowy DR, Schiller JT (1998) The papillomavirus minor
capsid protein, L2, induces localization of the major capsid protein, L1, and
the viral transcription/replication protein, E2, to PML oncogenic domains. J
Virol 72(1): 142-150.
de Boer MA, Peters LA, Aziz MF, Siregar B, Cornain S, Vrede MA, Jordanova
ES, Fleuren GJ (2005). Human papillomavirus type 18 variants:
histopathology and E6/E7 polymorphisms in three countrie. Int J Cancer
114(3): 422-5.
de Boer MA, Peters LA, Aziz MF, Siregar B, Cornain S, Vrede MA, Jordanova
ES, Kolkman-Uljee S, Fleuren GJ (2004). Human papillomavirus type 16 E6,
E7, and L1 variants in cervical cancer in Indonesia, Suriname, and The
Netherlands. Gynecol Oncol 94(2): 488-494.
de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Haunsen H (2004).
Classification of papillomaviruses. Virol 324(1): 17-27.
del Mistro A, Chieco Bianchi L (2001) HPV-related neoplasias in HIVinfected
individuals. Eur J Cancer 37(10): 1227-35.
Disbrow GL, Hanover JA, Schlegel R (2005) Endoplasmic Reticulum-Localized
Human Papillomavirus Type 16 E5 Protein Alters Endosomal pH but Not
trans-Golgi pH. J Virol 79: 5839-5846.
Dong G, Broker TR, Chow LT (1994) Human papillomavirus type 11 E2
proteins repress the homologous E6 promoter by interfering with the binding
of host transcription factors to adjacent elements. J Virol 68: 1115-1127.
110
Dong XP, Pfister H (1999) Overlapping YY1- and aberrant SP1-binding sites
proximal to the early promoter of human papillomavirus type 16. J Gen Virol
80: 2097-2101.
Doorbar J (2005) The papillomavirus life cycle. J Clin Virol , 32 Suppl 1, S7-
S15.
Doorbar J (2006) Molecular biology of human papillomavirus infection and
cervical cancer. Clin Sci (Lond) 110(5): 525-541.
Doorbar J, Ely S, Sterling J, McLean C, Crawford L (1991) Specific interaction
between HPV-16 E1-E4 and cytokeratins results in collapse of the epithelial
cell intermediate filament network. Nature 352(6338): 824-7.
Dyson N, Howley PM, Münger K, Harlow E (1989) The human papillomavirus
16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product. Science
243: 934-937.
Evander M, Frazer IH, Payne E, Qi YM, Hengst K, McMillan NA (1997)
Identification of the alpha6 integrin as a candidate receptor for
papillomaviruses. J Virol 71: 2449-2456.
Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P (1998) Base-calling of automated
sequencer traces using phred I Accuracy assessment. Genome Res 8(3):175-
185.
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (2005). Virus
Taxonomy: The Eighth Report of the International Committee on Taxonomy
of Viruses. (Elsevier, Ed.) Academic Press.
Ferrera A, Velema JP, Figueroa M, Bulnes R, Toro LA, Claros JM, de Barahona
O, Melchers WJ (1999) Human papillomavirus infection, cervical dysplasia
and invasive cervical cancer in Honduras: a case-control study. Int J Cancer
82(6): 799-803.
Florin L, Sapp C, Streeck RE, Sapp M (2002). Assembly and Translocation of
Papillomavirus Capsid Proteins. J Virol 76: 10009-10014.
Franco E, Schlecht NF, Saslow D (2003) The epidemiology of cervical cancer.
Cancer J. 9:348-359.
Franco EL, Harper DM (2005) Vaccination against human papillomavirus
infection: a new paradigm in cervical cancer control. Vaccine 23(17-18):
2388-94.
111
Gagnon S, Hankins C, Money D, Pourreaux K, The Canadian Women's HIV
Study Group, Franco E, Coutlée F (2007) Polymorphism of the L1 capsid
gene and persistence of human papillomavirus type 52 infection in women at
high risk or infected by HIV. J Acquir Immune Defic Syndr 44:61-65.
Gagnon S, Hankins C, Tremblay C, Forest P, Pourreaux K, Coutlee F, Canadian
Women's HIV Study Group (2004) Viral polymorphism in human
papillomavirus types 33 and 35 and persistent and transient infection in the
genital tract of women. J Infect Dis 190(9): 1575-85.
Gagnon S, Hankins C, Tremblay C, Pourreaux K, Forest P, Rouah F, The
Canadian Women’s HIV Study Group, Coutlée F (2005) Polymorphism of
human papillomavirus type 31 isolates infecting the genital tract of HIV-
seropositive and HIV-seronegative women at risk for HIV infection. J Med
Virol 75: 213-221.
Galvin KM, Shi Y (1997) Multiple mechanisms of transcriptional repression by
YY1. Mol Cell Biol 17, 3723 - 3732.
Garbuglia AR, Carletti F, Minosse C, Piselli P, Zaniratti MS, Serraino D,
Capobianchi MR. 2007. Genetic variability in E6 and E7 genes of human
papillomavirus -16, -18, -31 and -33 from HIV-1-positive women in Italy.
New Microbiol 30(4): 377-82.
Genther SM, Sterling S, Duensing S, Münger K, Sattler C, Lambert PF (2003)
Quantitative Role of the Human Papillomavirus Type 16 E5 Gene during the
Productive Stage of the Viral Life Cycle. J Virol 77: 2832 - 2842.
Giuliano AR, Papenfuss M, Abrahamsen M, Denmanc C, de Zapien JG, Henzen
JLN, Ortega L, de Gala EMB, Stephan J, Feng J, Baldwin S, Garcia F, Hatch
K (2001) Human papillomavirus infection at the United States-Mexico
border: implications for cervical cancer prevention and control. Cancer
Epidemiol. Biomarkers and Prevention 10: 1129-1136.
Gloss B, Bernard HU (1990) The E6/E7 promoter of human papillomavirus type
16 is activated in absence of E2 proteins by a sequence-aberrant SpI distal
element. J Virol 64: 5577-5584.
Gloss B, Bernard HU Seedorf K, Klock G (1987) The upstream regulatory region
of the human papilloma virus-16 contains an E2 protein-independent
enhancer which is specific for cervical carcinoma cells and regulated by
glucocorticoid hormones. EMBO J 6(12): 3735-3743.
112
Grodzki M, Besson G, Clavel C, Arslan A, Franceschi S, Birembaut P,
Tommasino M, Zehbe I (2006) Increased Risk for Cervical Disease
Progression of French Women Infected with the Human Papillomavirus Type
16 E6-350G Variant. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15: 820-822.
Hall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor
and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser 41:95-
98.
Harper DM, Franco EL, Wheeler C, Ferris DG, Jenkins D, Schuind A, Zahaf T,
Innis B, Naud P, de Carvalho ND, Roteli-Martins CM, Teixeira J, Blatter
MM, Korn AP, Quint W, Dubin G, Glaxosmithkline HPV Vaccine Study
Group (2004) Efficacy of a bivalent L1 virus-like particle vaccine in
prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young
women: a randomised controlled trial. Lancet 364(9447): 1757-65.
Hildesheim A, Schiffman M, Bromley C, Wacholder S, Herrero R, Rodriguez A,
Bratti MC, Sherman ME, Scarpidis U, Lin QQ, Terai M, Bromley RL,
Buetow K, Apple RJ, Burk RD (2001) Human papillomavirus type 16
variants and risk of cervical cancer. J Natl Cancer. Inst 93: 315-318.
Hiller T, Poppelreuther S, Stubenrauch F, Iftner T (2006) Comparative Analysis
of 19 Genital Human Papillomavirus Types with Regard to p53 Degradation,
Immortalization, Phylogeny, and Epidemiologic Risk Classification.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15: 1262 - 1267.
Ho GY, Bierman R, Beardsley L, Chang CJ, Burk RD (1998) Natural history of
cervicovaginal papillomavirus infection in young women. N Engl J Med
338:423-8.
Ho H, Chan SY, Burk RD, Das BC, Fuginaga K, Icenogle JP, Kahn T, Kiviat N,
Lancaster W, Mavromara-Nazos P, Labropoulou V, Mitrani-Rosenbaum S,
Norrild B, Pillai MR, Stoerker J, Syrjaenen K, Syrjaenen S, Tay SK, Villa
LL, Wheeler CM, Williamson AL, Bernard HU (1993) The genetic drift of
human papillomavirus type 16 is a means of reconstructing prehistoric viral
spread and the movement of ancient human populations. J Virol 67(11):
6413–6423.
Holmgren SC, Patterson NA, Ozbun MA, Lambert PF (2005) The Minor Capsid
Protein L2 Contributes to Two Steps in the Human Papillomavirus Type 31
Life Cycle. J Virol 79: 3938-3948.
113
Hoppe-Seyler F, Butz K, zur Hausen H (1991) Repression of the human
papillomavirus type 18 enhancer by the cellular transcription factor Oct-1. J
Virol 65(10): 5613-5618.
Hubert WG (2005) Variant Upstream Regulatory Region Sequences
Differentially Regulate Human Papillomavirus Type 16 DNA Replication
throughout the Viral Life Cycle. J Virol 79(10): 5914-5922.
Huibregtse JM, Scheffner M, Howley PM (1991) A cellular protein mediates
association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16
or 18. EMBO J 10(13): 4129-4135.
IARC (2007) IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans, Vol. 90, Smokeless Tobacco Products, Lyon, InC 689 p.
INCA (2008), Ministério da Saúde. Instituto Nacional do Câncer. Disponível na
internet: http://www.incAgov.br/estimativas/2008/index.asp.
Ishiji T, Lace MJ, Parkkinen S, Anderson RD, Haugen TH, Cripe TP, Xiao JH,
Davidson I, Chambon P, Turek LP (1992) Transcriptional enhancer factor
(TEF)-1 and its cell-specific co-activator activate h papillomavirus-16 E6 and
E7 oncogene transcription in keratinocytes and cervical carcinoma cells.
EMBO J 11: 2271-2281.
Joyce JG, Tung JS, Przysiecki CT, Cook JC, Lehman ED, Sands JA, Jansen KU,
Keller M (1999) The L1 Major Capsid Protein of Human Papillomavirus
Type 11 Recombinant Virus-like Particles Interacts with Heparin and Cell-
surface Glycosaminoglycans on Human Keratinocytes. J Biol Chem 274(9):
5810-5822.
Kabsch K, Alonso A (2002) The human papillomavirus type 16 E5 protein
impairs TRAIL- and FasL-mediated apoptosis in HaCaT cells by different
mechanisms. J Virol 76(23):12162-72.
Kämmer C, Warthorst U, Torrez-Martinez N, Wheeler CM, Pfister H (2000)
Sequence analysis of the long control region of human papillomavirus type
16 variants and functional consequences for P97 promoter activity. J Gen
Virol 81: 1975-1981.
Kel AE, Gößling E, Reuter I, Cheremushkin E, Kel-Margoulis OV, Wingender E
(2003) MATCH: a tool for searching transcription factor binding sites in
DNA sequences. Nucleic Acids Res 31, 3576 - 3579.
114
Khouadri S, Villa LL, Gagnon S, Koushik A, Richardson H, Ferreira S, Tellier P,
Simao J, Matlashewski G, Roger M, Franco EL, Coutlee F (2006) Human
papillomavirus type 33 polymorphisms and high-grade squamous
intraepithelial lesions of the uterine cervix. J Infect Dis 194(7): 886-94.
Kirii Y, Iwamoto S, Matsukura T (1991) Human papillomavirus type 58 DNA
sequence. Virol 185(1):424-7.
Kiyono T, Foster SA, Koop Jenn I, McDougall JK, Galloway DA, Klingelhutz
AJ (1998) Both Rb/p16ink4a inactivation and telomerase activity are required
to immortalize human epithelial cells. Nature 396: 84-88.
Klingelhutz AJ, Foster SA, McDougall JK (1996). Telomerase activation by the
E6 gene product of human papillomavirus type 16. Nature 380:79-82.
Kocjan BJ, Seme K, Mocilnik T, Jancar N, Vrtacnik-Bokal E, Poljak M (2007).
Genomic diversity of human papillomavirus genotype 53 in an
ethnogeographically closed cohort of white European women. J Med Virol
79(4), 431 - 438.
Lake JA (1987) A rate-independent technique for analysis of nucleic acid
sequences: evolutionary parsimony. Mol Biol Evol 4: 167-191.
Lechner MS, Laimins LA (1994). Inhibition of p53 DNA binding by human
papillomavirus E6 proteins. J Virol 68, 4262-4273.
Lee SS, Glaunsinger B, Mantovani F, Banks L, Javier RT (2000) Multi-PDZ
domain protein MUPP1 is a cellular target for both adenovirus E4-ORF1 and
high-risk papillomavirus type 18 E6 oncoproteins. J Virol 74:9680-9693.
Lichtig H, Algrisi M, Botzer Le, Abadi T, Verbitzky Y, Jackman A, Tommasino
M, Zehbe I, Sherman L (2006) HPV16 E6 natural variants exhibit different
activities in functional assays relevant to the carcinogenic potential of E6.
Virol
350(1): 216-227.
Lin H, Ma YY, Moh JS, Ou YC, Shen SY, ChangChien CC (2006) High
prevalence of genital human papillomavirus type 52 and 58 infection in
women attending gynecologic practitioners in South Taiwan. Gynecol Oncol
101(1): 40-5.
Lizano M, Berumen J, Guido MC, Casas L, Garcia-Carranca A (1997)
Association between human papillomavirus type 18 variants and
histopathology of cervical cancer. J Natl Cancer Inst 89:1227-1231.
115
Longworth MS, Laimins LA (2004) The binding of histone deacetylases and the
integrity of zinc finger-like motifs of the E7 protein are essential for the life
cycle of human papillomavirus type 31. J Virol 78:3533-3541.
Lorenzato, F., Ho, L., Terry, G., Singers, A., Santos, L. C., De Lucena Batista,
R. & Lubambo, T. (2000) The use of human papillomavirus typing in
detection of cervical neoplasia in Recife (Brazil). Int J Gynecol Cancer 10:
143 – 150.
Lowy DR, Schiller JT (2006) Prophylactic human papillomavirus vaccines. J
Clin Invest 116: 1167-1173.
Maciag PC, Schlecht NF, Souza PS, Rohan TE, Franco EL, Villa LL (2002)
Polymorphisms of the Human Leukocyte Antigen DRB1 and DQB1 Genes
and the Natural History of Human Papillomavirus Infection. J Infect Dis
186:164-172.
Manos MM, Ting Y, Wright DK, Lewis AJ, Broker TR, Wolinsky SM (1989)
Use of polymerase chain reaction amplification for the detection of genital
human papillomaviruses. Cancer Cells 7: 209-214.
Massimi P, Gammoh N, Thomas M, Banks L (2004) HPV E6 specifically targets
different cellular pools of its PDZ domain-containing tumour suppressor
substrates for proteasome-mediated degradation. Oncogene 23(49): 8033-9.
Matsukura T, Sugase M (1990) Molecular cloning of a novel human
papillomarvirus (type 58) from an invasive cervical carcinoma. Virol 177(2):
833-6.
May M, Dong XP, Beyer-Finkler E, Stubenrauch F, Fuchs PG, Pfister H (1994)
The E6/E7 promoter of extrachromossomal HPV-16 DNA in cervical cancers
escapes from cellular repression by mutation of target sequences for YY1.
EMBO J 13: 1460-1466.
McBride AA, Romanczuk H, Howley PM (1991) The papillomavirus E2
regulatory proteins. J Biol Chem 266: 18411-18414.
McPhillips MG, Ozato K, McBride AA (2005) Interaction of Bovine
Papillomavirus E2 Protein with Brd4 Stabilizes Its Association with
Chromatin. J Virol 79, 8920-8932.
Ministério da Saúde (2003). Lista Nacional de Agravos de Notificação
Compulsória. Disponível em Site do Ministério da Saúde:
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/portaria2325.pdf
116
Miyashita M, Agdamag DM, Sasagawa T, Matsushita K, Salud LM, Salud CO,
Saikawa K, Leano PS, Pagcaliwagan T, Acuna J, Ishizaki A, Kageyama S,
Ichimura H (2009) High-risk HPV types in lesions of the uterine cervix of
female commercial sex workers in the Philippines. J Med Virol 81(3):545-51.
Modis Y, Trus BL, Harrison SC (2002) Atomic model of the papillomavirus
capsid. EMBO J 21(18): 4754-4762.
Moscicki AB, Schiffman M, Kjaer S, Villa LL (2006) Chapter 5: Updating the
natural history of HPV and anogenital cancer. Vaccine 24S3: 42-51.
Münger K, Howley PM (2002) Human papillomavirus immortalization and
transformation functions. Virus Res 89:213-228.
Muñoz N (2000) Human papillomavirus and cancer: the epidemiological
evidence. J Clin Virol 19: 1-5.
Muñoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV,
Snijders PJF, Meijer CJLM (2003) Epidemiologic Classification of Human
Papillomavirus Types Associated with Cervical Cancer. N Engl J Med
348(6): 518-527.
Nakahara T, Peh WL, Doorbar J, Lee D, Lambert, P F (2005) Human
papillomavirus type 16 E1ˆE4 contributes to multiple facets of the
papillomavirus life cycle. J Virol 79, 13150–13165.
Nindl I, RindFleisch K, Lotz B, Scheider A, Dürst M (1999) Uniform
distribution of HPV 16 E6 and E7 variants in patients with normal histology,
cervical intra-epithelial neoplasia and cervical cancer. Int J Cancer 82: 203-
207.
Noronha V, Mello W, Villa LL, Macedo R, Bisi F, Mota R, Sassamoto K,
Monteiro T, Linhares A (1999) Human Papillomavirus associated with cervix
lesions. Ver Soc Bras Med Trop 32: 235-240.
Nürnberg W, Artuc M, Vorbrueggen G, Kalkbrenner F, Moelling K, Czarnetzki
BM, Schadendorf D (1995) Nuclear proto-oncogene products transactivate
the human papillomavirus type 16 promoter. Br J Cancer 71(5):1018-24.
O’Connor M, Bernard HU (1995) Oct-1 activates the epithelial-specific enhancer
of human papillomavirus type 16 via a synergistic interaction with NF1 at a
conserved composite regulatory element. Virol 207: 77-88.
117
O’Connor MJ, Tan SH, Tan CH, Bernard HU (1996) YY1 represses human
papillomavirus type 16 transcription by quenching AP-1 activity, J Virol 70:
6529-6539.
O'Connor M, Chan SY, Bernard HU (1995) Transcription Factor Binding Sites in
the Long Control Region of Genital HPVs. In: Human Papillomaviruses 1995
Compendium disponível na Internet: http://hpv-
web.lanl.gov/stdgen/virus/hpv/ compendium/htdocs/
Oelze I, Kartenbeck J, Crusius K, Alonso A (1995) Human papillomavirus type
16 E5 protein affects cell-cell communication in an epithelial cell line. J
Virol 69: 4489-94.
Offord EA, Beard P (1990). A member of the activator protein 1 family found in
keratinocytes but not in fibroblasts required for transcription from a human
papillomavirus type 18 promoter. J Virol 64: 4792-4798.
Ondek B, Gloss L, Herr W (1988) The SV40 enhancer contains two distinct
levels of organization. Nature 333, 40-45.
Ong CK, Chan SY, Campo MS, Fujinaga K, Mavromara-Nazos P, Lapropoulou
V, Pfister H, Tay SK, ter Meulen J, Villa LL, Bernard HU (1993) Evolution
of human papillomavirus type 18: an ancient phylogenetic root in Africa and
intratype diversity reflect coevolution with human ethnic groups. J Virol
67(11): 6424 – 6431.
Pater MM, Hughes GA, Hyslop DE, Nakshatri H, Pater A (1988) Glucocorticoid-
dependent oncogenic transformation by type 16 but not type 11 human
papilloma virus DNA. Nature 335: 832-835.
Patterson NA, Smith JL, Ozbun MA (2005) Human Papillomavirus Type 31b
Infection of Human Keratinocytes Does Not Require Heparan Sulfate. J Virol
79, 6838 - 6847.
Pereira CR, Rosa ML, Vasconcelos GA, Faria PC, Cavalcanti SM, Oliveira LH
(2007) Human papillomavirus prevalence and predictors for cervical cancer
among high-risk women from Rio de Janeiro, Brazil. Int J Gynecol Cancer
17(3): 651-60.
Prado JC, Calleja-Macias IE, Bernard HU, Kalantari M, Macay SA, Allan B,
Williamson AL, Chung LP, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Ortiz-Lopez R,
Barrera-Saldana HA, Cubie HA, Cuschieri K, von Knebel-Doeberitz M,
Sanchez GI, Bosch FX, Villa LL (2005) Worldwide genomic diversity of the
118
human papillomaviruses-53, 56, and 66, a group of high-risk HPVs unrelated
to HPV-16 and HPV-18. Virol 340(1): 95-104.
R Development Core Team (2007) R: A language and environment for statistical
computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL
http://www.Rproject.org.2007.
Raiol T, Wyant PS, Amorim RMS, Cerqueira DM, Milanezi NG, Brígido MM,
Sichero L, Martins CRF (2009) Genetic variability and phylogeny of the
high-risk HPV-31, -33, -35, -52 and -58 in Central Brazil. J Med Virol
81(4):685-692.
Reddy KJ, Banapour B, Anderson DE, Lee SH, Marquez JP, Carlos MP, Torres
JV (2004) Induction of immune responses against human papillomaviruses by
hypervariable epitope constructs. Immunol 112(2): 321-327.
Roden RB, Ling M, Wu T C (2004) Vaccination to prevent and treat cervical
cancer. Hum Pathol 35(8): 971-982.
Rose B, Steger G, Dong XP, Thompson C, Cossart Y, Tattersall M, Pfister H
(1998) Point mutations in SP1 motifs in the upstream regulatory region of
human papillomavirus type 18 isolates from cervical cancers increase
promoter activity. J Gen Virol 79: 1659-1663.
Rose BR, Thompson CH, Cossart YE, Elliot PE, Tattersall MH (1991)
Papillomavirus DNA and prognosis in cervical cancer. Lancet 337(8739):
489.
Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA Sequencing with Chain-
Terminating Inhibitors. PNAS 74: 5463 - 5467.
Sarafi TR, McBride AA (1995) Domains of the BPV-1 E1 replication protein
required for origin-specific DNA binding and interaction with the E2
transactivator. Virology 211(2): 385-396.
Sasagawa T, Basha W, Yanazaki H, Inoue M (2001) High-risk and multiple
human papillomavirus infections associated with cervical abnormalities in
Japanese women. Cancer Epidem Biomarkers Prev 10: 45-52.
Scheffner M, Huibregtse JM, Vierstra RD, Howley PM (1993) The HPV-16 E6
and E6-AP Complex Functions as a Ubiquitin- Protein Ligase in the
Ubiquitination of p53. Cell 75: 495-505.
119
Schmidt M, Kedzia W, Gozdzicka-Jozefiak A (2001) Intratype HPV16 sequence
variation within LCR of isolates from asymptomatic carriers and cervical
cancers. J Clin Virol 23: 65 - 77.
Shafti-Keramat S, Handisurya A, Kriehuber E, Meneguzzi G, Slupetzky K,
Kirnbauer R (2003). Different Heparan Sulfate Proteoglycans Serve as
Cellular Receptors for Human Papillomaviruses. J Virol 77: 13125-13135.
Sherman L, Jackman A, Itzhaki A, Stoppler MC, Koval D, Schlegel R (1997)
Inhibition of serum- and calcium-induced differentiation of human
keratinocytes by HPV16 E6 oncoprotein: role of p53 inactivation. Virol
37(2): 296-306.
Sichero L, Ferreira S, Trottier H, Duarte-Franco E, Ferenczy A, Franco EL, Villa
LL (2007) High grade cervical lesions are caused preferentially by non-
European variants of HPVs 16 and 18. Int J Cancer 120(8): 1763-8.
Sichero L, Franco EL, Villa LL (2005) Different P105 promoter activities among
natural variants of human papillomavirus type 18. J Infect Dis 191(5): 739-
42.
Sichero L, Villa LL (2006) Epidemiological and functional implications of
molecular variants of human papillomavirus. Braz J Med Biol Res 39:707-
717.
Smith JS, Green J, de Gonzalez AB, Appleby P, Peto J, Plummer M, Franceschi
S, and Bera V (2003) Cervical cancer and use of hormonal contraceptives: a
systematic review. Lancet 361(9364): 1159-67.
Speck LM, Tyring SK (2006) Vaccines for the prevention of human
papillomavirus infections. Skin Therapy Lett 11(6): 1-3.
Stewart AC, Eriksson AM, Manos MM, Munoz N, Bosch FX, Peto J, Wheeler
CM (1996) Intratype variation in 12 human papillomavirus types: a
worldwide perspective. J Virol 70: 3127 - 3136.
Stoler MH, Rhodes CR, Whitbeck A, Wolinsky SM, Chow LT, Broker TR
(1992) Human papillomavirus type 16 and 18 gene expression in cervical
neoplasias. Hum Pathol 23(2): 117-128.
Stöppler MC, Ching K, Stöppler H, Clancy K, Schlegel R, Icenogle J (1996a)
Natural variants of human papillomavirus type 16 E6 protein differ in their
abilities to alter keratinocyte differentiation and to induce p53 degradation. J
Virol 70: 6987-6993.
120
Stöppler MC, Straight SW, Tsao G, Schlegel R and McCance DJ (1996b)
The E5 gene of HPV-16 enhances keratinocyte immortalization by full-length
DNA. Virol 223(1): 251-4.
Straight SW, Hinkle PM, Jewers RJ, McCance DJ (1993) The E5 oncoprotein of
human papillomavirus type 16 transforms fibroblasts and effects the
downregulation of the epidermal growth factor receptor in keratinocytes. J
Virol 67, 4521-4532.
Tan SH, Bartsch D, Schwartz E, Bernard HU (1998) Nuclear attachment regions
of human papillomavirus type 16 point toward conservation of these genomic
elements in all genital papillomaviruses. J Virol 72(5): 3610-3622.
Tan SH, Gloss B, Bernard HU (1992). During negative regulation of the human
papillomavirus-16E6 promoter, the viral E2 protein can displace Sp1 from a
proximal promoter element. Nucleic Acids Res 20: 251-256.
Tan SH, Leong LE, Walker PA, Bernard HU (1994). The human papillomavirus
type 16 E2 transcription factor binds with low cooperativity to two flanking
sites and represses the E6 promoter through displacement of Sp1 and TFIID.
J Virol 68: 6411-6420.
Tang S, Tao M, McCoy JP, Zheng ZM (2006) The E7 Oncoprotein Is Translated
from Spliced E6*I Transcripts in High-Risk Human Papillomavirus Type 16-
or Type 18-Positive Cervical Cancer Cell Lines via Translation Reinitiation.
J Virol 80: 4249 - 4263.
Thierry F, Spyrou G, Yaniv M, Howley P (1992) Two API Sites Binding JunB
Are Essential for Human Papillomavirus Type 18 Transcription in
Keratinocytes. J Virol 66(6): 3740-3748.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994). CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic
Acids Res 22: 4673-4680.
Tornesello ML, Buonaguro FM, Buonaguro L, Salatiello I, Belth-Giraldo E,
Giraldo G (2000) Identification and functional analysis of sequence
rearrangements in the long control region of human papillomavirus type 16
Af-1 variants isolated from Ugandan penile carcinomas. J Gen Virol 81:
2969-2982.
121
Touze A, de Sanjose S, Coursaget P, Almirall M R, Palacio V, Meijer CJL,
Kornegay J, Bosch FX (2001) Prevalence of anti-human papillomavirus type
16, 18, 31 and 58 virus-like particles in women in the general population and
in prostitutes J Clin Microbiol 39: 4344-4348.
Trus BL, Roden RB, Greenstone HL, Vrhel M, Schiller JT, Booy FP (1997)
Novel structural features of bovine papillomavirus capsid revealed by a three-
dimensional reconstruction to 9 A resolution. Nat Struct Biol 4(5), 413-420.
Tsao YP, Li LY, Tsai TC, Chen SL (1996) Human papillomavirus type 11 and
16 E5 represses p21(WafI/SdiI/CipI) gene expression in fibroblasts and
keratinocytes. J Virol 70:7535–9
Turek LP, Smith EM (1996). The genetic program of genital human
papillomaviruses in infection and cancer. Obstet Gynecol Clin North Am
23(4): 735-758.
Vaccarella S, Herrero R, Snijders PJF, Dai M, Thomas JO, Hieu NT, Ferreccio
C, Matos E, Posso H, de Sanjosé S, Shin HR, Sukvirach S, Lazcano-Ponce1
E, Muñoz N, Meijer CJLM, Franceschi S, the IARC HPV Prevalence Surveys
(IHPS) Study Group (2008) Smoking and human papillomavirus infection:
pooled analysis of the International Agency for Research on Cancer HPV
Prevalence Surveys. Int J Epidem 37(3): 536-546.
Varsani A, Williamson AL, Jaffer MA, Rybicki EP (2006). A deletion and point
mutation study of the human papillomavirus type 16 major capsid gene. Virus
Research, 122: 154-163.
Veldman T, Horikawa I, Barrett JC, Schlegel R (2001)Transcriptional activation
of the telomerase hTERT gene by human papillomavirus type 16 E6
oncoprotein. J Virol 75:4467-4472.
Veras VS, Cerqueira DM, Martins CRF (2005) L1 sequence of a new human
papillomavirus type-58 variant associated with cervical intraepithelial
neoplasia. Braz J Med Biol Res 38(1): 1-4.
Veress G, Szarka K, Dong XP, Gergely L, Pfister H (1999) Functional
significance of sequence variation in the E2 gene and the long control region
of human papillomavirus type 16. J Gen Virol 80: 1035-1043.
Vernon SD, Unger ER, Williams D (2000) Comparison of Human
Papillomavirus Detection and Typing by Cycle Sequencing, Line Blotting,
and Hybrid Capture. J Clin Microb
38(2):
651–655
122
Villa LL (1997) Human papillomaviruses and cervical cancer. Adv Cancer
Res 71: 321-341
Villa LL, Costa RL, Petta CA, Andrade RP, Ault KA, Giuliano AR, Wheeler C,
Koutsky L, Malm C, Lehtinen M (2005) Prophylactic quadrivalent human
papillomavirus (types 6, 11, 16, and 18) L1 virus-like particle vaccine in
young women: a randomised double-blind placebo-controlled multicentre
phase II efficacy trial. Lancet Oncol 6(5): 271-278.
Villa LL, Sichero L, Rahal P, Caballero O, Ferenczy A, Rohan T, Franco EL
(2000) Molecular variants of human papillomavirus type 16 and 18
preferentially associated with cervical neoplasia. J Gen Virol 81: 2959-2968.
Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV,
Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz NJ (1999). Human papillomavirus is a
necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. Pathol 189: 12-19.
Wang Q, Griffin H, Southern S, Jackson D, Martin A, McIntosh P, Davy C,
Masterson PJ, Walker PA, Laskey P, Omary MB, Doorbar J (2004)
Functional Analysis of the Human Papillomavirus Type 16 E1{wedge}E4
Protein Provides a Mechanism for In Vivo and In Vitro Keratin Filament
Reorganization. J Virol 78: 821-833.
Werness BA, Levine AJ, Howley PM (1990) Association of human
papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science 248:76-79.
WHO, 2007. WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV
Information Centre). Summary report on HPV and cervical cancer statistics
in Brazil. 2007. Disponível na Internet: www. who. int/ hpvcentre.
Wiley DJ, Douglas J, Beutner K, Tom C, Fife K, Moscicki AB, Fukumoto L
(2002) External Genital Warts: Diagnosis, Treatment, and Prevention Clin
Infec Dis 35:S210–S224.
Wilson R, Fehrmann F, Laimins LA (2005) Role of the E1{wedge}E4 Protein in
the Differentiation-Dependent Life Cycle of Human Papillomavirus Type 31.
J Virol 79: 6732 - 6740.
Wilson VG, West M, Woytek K, Rangasamy D (2002) Papillomavirus E1
proteins: form, function, and features. Virus Genes 24(3): 275-290.
Wingender E, Dietze P, Karas H, Knuppel R (1996) TRANSFAC: a database on
transcription factors and their DNA binding sites. Nucleic Acids Res 24: 238-
241.
123
Wu Y, Chen Y, Li L, Yu G, He Y, Zhang Y (2006) Analysis of mutations in the
E6/E7 oncogenes and L1 gene of human papillomavirus 16 cervical cancer
isolates from China. J Gen Virol, 87: 1181-8.
Wyant (2007) Caracterização Molecular dos HPVs de Alto Risco dos Genótipos
-53, -56 e -66 Infectando Mulheres no Distrito Federal e Entorno. Dissertação
de Mestrado em Biologia Molecular, Universidade de Brasília, 98p.
Xi LF, Kiviat NB, Hildesheim A, Galloway DA, Wheeler CM, Ho J, Koutsky LA
(2006) Human papillomavirus type 16 and 18 variants: race-related
distribution and persistence. J Natl Cancer Inst 98:1045-1052.
Xi LF, Koutsky LA, Galloway DA, Kyspers J, Hughes JP, Wheeler CM (1997)
Genomic variation of human papillomavirus type 16 and risk for high grade
cervical intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 89(11): 796-802.
Xi LF, Koutsky LA, Hildesheim A, Galloway DA, Wheeler CM, Winer RL, Ho
J, Kiviat NB (2007) Risk for high-grade cervical intraepithelial neoplasia
associated with variants of human papillomavirus types 16 and 18. Cancer
Epidem Biomarkers Prev 16(1): 4-10.
Xin CY, Matsumoto K, Yoshikawa H, Yasugi T, Onda T, Nakagawa S, Yamada
M, Nozawa S, Sekiya S, Hirai Y, Shiromizu K, Fujii T, Taketani Y (2001)
Analysis of E6 variants of human papillomavirus type 33, 52 and 58 in
Japanese women with cervical intraepithelial neoplasia/cervical cancer in
relation to their oncogenic potential. Cancer Lett 170(1): 19-24.
Yamada T, Manos MM, Peto J, Greer CE, Muñoz N, Bosch FX, Wheeler CM
(1997) Human papillomavirus type 16 sequence variation in cervical cancers:
a worldwide perspective. J Virol 71(3): 2463-2472.
Yamada T, Manos MM, Wheeler CM, Halpern AL, Stewart ACM, Hildesheim A,
Jenison SA (1995) Human papillomavirus type 16 variant lineages in United
States populations characterized by nucleotide sequence analysis of E6, L2,
and L1 coding segmenta. J Virol 69(12): 7743-7753.
You J, Croyle JL, Nishimura A, Ozato K, Howley PM (2004) Interaction of the
bovine papillomavirus E2 protein with Brd4 tethers the viral DNA to host
mitotic chromosomes. Cell 117(3): 349-360.
Zehbe I, Richard C, DeCarlo CA, Shai A, Lambert PF, Lichtig H, Tommasino M,
Sherman L (2009) Human papillomavirus 16 E6 variants differ in their
124
dysregulation of human keratinocyte differentiation and apoptosis. Virol
383(1): 69-77.
Zehbe I, Wilander E, Delius H, Tommasino M (1998) Human papillomavirus 16
E6 variants are more prevalent in invasive cervical carcinoma than the
prototype. Cancer Res 58: 829-833.
Zerial M, Toschi L, Ryseck R-P, Schuermann M, Muller R, Bravo R (1989). The
product of a novel growth factor activated gene, fos B, interacts with JUN
proteins enhancing their DNA binding activity. EMBO J 8(3): 805-813,
Zhao KN, Hengst K, Liu WJ, Liu YH, Liu XS, McMillan NA, Frazer IH (2000).
BPV1 E2 Protein Enhances Packaging of Full-Length Plasmid DNA in BPV1
Pseudovirions. Virology 272: 382-393.
zur Hausen H (1996) Papillomavirus infections - a major cause of human cancer.
Biochim Biophys Acta 1288: F55-78.
zur Hausen H (2002) Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical
application. Nat Rev Cancer 2(5): 342-50.
125
Anexo I: Artigo publicado - Raiol et al. (2009)
126
127
128
129
130
131
132
133
Anexo II: Sequências nucleotídicas de novos variantes de HPV
LCR HPV-31
Bsb-36 (GenBank: FJ202000)
AGTAGTTCTGCGGTTTTTGGTTTCCTGAATACTAGTTTTTGCCAACATCCTGGCTTGTAGTT
TCCTGCCTAACACACCTTGCCAACATATAATCCAGTCCAACTTTGCAATTATAATATGAAT
CATGTTTGTTTAAATACAACTGTAGTTCAACTATGTGTCATGCACATATATTATATTGTCCT
ACACACCTTAAACTGCTTTTAGGCACATATTTTGTAGCTTATCTATATCCTTGATTGCAGTG
CTGGCTTTTGCACATGTTTAAACTGCCAAGGTTGTGTCATGCATTATAAATAAGTTGTATG
TTACTCATATAATTAATTGCATATACGTATTACACCGTTTTCGGTTACAGTTTTACAAGCAA
TTGTTCTTTTTATACTTAATAATAATAATCTTGTTATAAAAAAGTAGGGAGTGACCGAAAT
TGGTGAACCGAAAACGGTTGGTATATAAAGCACATAGTATTTTGTGCAAACCTACAGACG
CCATGTTCAAAAATCCTGCAGAAAG
Bsb-299 (GenBank: FJ202001)
AGTAGTTCTGCGGTTTTTGGTTTCCTGAATACTAGTTTTTGCCAACATTCTGGCTTGTAGTT
TCCTGCCTAACACACCTTGCCAACATATAATCCAGTCCAACTTTGCAATTATACTATGAAT
CATGTTTGTTTAAATACAACTGTAGTTCAACTATGTGTCATGCACATATATTATATTATCCT
ACACACCTTAAACTGCTTTTAGGCACATATTTTGTAGATTATCTATATCCTTGATTGCAGTG
CTGGCTTTTGCACATGTTTAAACTGCCAAGGTTGTGTCATGCATTATAAATAAGTTGTATG
TTACTCATATAATTAATTGCATATAGGTATTACACCGTTTTCGGTTACAGTTTTACAAGCA
ATTGTTCTTTTTATACTTACTAATAATAATCTTAGTATAAAAAAGTAGGGAGTGACCGAAA
GTGGTGAACCGAAAACGGTTGGTATATAAAGCACATAGTATTTTGTGCAAACCTACAGAC
GCCATGTTCAAAAATCCTGCAGAAAGACCTCGG
E6 HPV-31
Bsb-216 (GenBank: FJ202002)
AAAAGTAGGGAGTGACCGAAAGTGGTGAACCGAAAACGGTTGGTATATAAAGCACATAG
TATTTTGTGCAAACCTACAGACGCCATGTTCAAAAATCCTGCAGAAAGACCTCGGAAATT
GCATGAACTAAGCTCGGCATTGGAAATACCCTACGATGAACTAAGATTGAATTGTGTCTA
CTGCAAAGGTCAGTTAACAGAAACAGAGGTATTAGATTTTGCATTTACAGATTTAACAAT
AGTATATAGGGACGACACACCATACGGAGTGTGTACAAAATGCTTAAGATTTTATTCTAA
AGTAAGTGAATTTAGATGGTATAGATATAGTGTGTATGGAACAACATTAGAAAAATTGAC
AAACAAAGGTATATGTGATTTATTAATTAGGTGTATAACGTGTCAGAGACCGTTGTGTCCA
GAAGAAAAACAAAGACATTTGGATAAAAAGAAACGATTCCACAACATAGGAGGAAGGTG
GACAGGACGTTGCATAGTATGTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAAACATG
CGTGGAGAAACACCTACATTGCAAGACTATGTGTTAGATTTGCAACCTGAGGCAACTGAC
CTCCACTGTTATGAGCAATTACCCGA
Bsb-233 (GenBank: FJ202003)
AAAAGTAGGGAGTGACCGAAAGTGGTGAACCGAAAACGGTTGGTATATAAAGCACATAG
TATTTTGTGCAAACCTACAGACGCCATGTTCAAAAATCCTGCAGAAAGACCTCGGAAATT
GCATGAACTAAGCTCGGCATTGGAAATACCCTACGATGAACTAAGATTGAATTGTGTCTA
CTGCAAAGGTCAGTTAACAGAAACAGAGGTATTAGATTTTGCATTTACAGATTTAACAAT
AGTATATAGGGACGACACACCACACGGAGTGTGTACAAAATGTCTAAGATTTTATTCAAA
AGTAAGTGAATTTAGATGGTATAGATATAGTGTGTATGGAACAACATTAGAAAAATTGAC
AAACAAAGGTATATGTGATTTGTTAATTAGGTGTATAACGTGTCAAAGACCGTTGTGTCCA
GAAGAAAAACAAAGACATTTGGATAAAAAGAAACGATTCCACAACATAGGAGGAAGGTG
GACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAAACATG
CGTGGAGAAACACCTACGTTGCAAGACTATGTGTTAGATTTGCAACCTGAGGCAACTGAC
CTCCACTGTTATGAGCAATTACCCGA
134
L1 HPV-33
Bsb-23 (GenBank: FJ202004)
CGTGCACAGGGTCATAATAATGGTATTTGTTGGGGCAATCAGGTATTTGTTACTGTGGTAG
ATACCACTCGCAGTACTAATATGACTTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTACATATA
AAAATGAGAATTTTAAAGAATATATAAGACATGTTGAAGAATATGATCTACAGTTTGTTTT
TCAACTATGCAAAGTTACCTTAACTGCAGACGTTATGACATATATTCATGCTATGAATCCA
GATATTTTAGAAGATTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCATCTGCTAGTTTACAGGATA
CCTATAGGTTTGTTACCTCTCAGGCTATTACGTGTCAAAAAACAGTACCTCCAAAGGAAAA
GGAAGACCCCTTAGGTAAATATACATTTTGGGAAGTGGATTTAAAGGAAAAATTTTCAGC
AGATTTAGATCAGTTTCC
Bsb-24 (GenBank: FJ202005)
CGTGCACAGGGTCATAATAATGGTATTTGTTGGGGCAATCAGGTATTTGTTACTGTGGTAG
ATACCACTCGCAGTACTAATATGACTTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTACATATA
AAAATGAAAATTTTAAAGAATATATAAGACATGTTGAAGAATATGATCTACAGTTTGTTTT
TCAACTATGCAAAGTTACCTTAACTGCAGAAGTTATGACATATATTCATGCTATGAATCCA
GATATTTTAGAAGATTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCATCTGCTAGTTTACAGGATA
CCTATAGGTTTGTTACCTCTCAGGCTATTACGTGTCAAAAAACAGTACCTCC
Bsb-31 (GenBank: FJ202006)
CGTGCACAGGGTCATAATAATGGTATTTGTTGGGGCAATCAGGTATTTGTTACTGTGGTAG
ATACCACTCGCAGTACTAATATGACTTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTACATATA
AAAATGAGAATTTTAAAGAATATATAAGACATGTTGAAGAATATGATCTACAGTTTGTTTT
TCAACTATGCAAAGTTACCTTAACTGCAGAAGTTATGACATATATTCATGCTATGAATCCA
GATATTTTAGAAGATTGGCAATTTGGTTTAACACCTCCTCCATCTGCTAGTTTACAGGATA
CCTATAGGTTTGTTACCTCTCAGGCTATTACGTGTCAAAAAACAGTACCTCCAAAGGAAAA
GGAAGACCCCTTAGGTAAATATACATTTTGGGAAGTGGATTTAAAGGAAAAATTTTCAGC
AGATTTAGATCAGTTTCC
LCR HPV-35
Bsb-121 (GenBank: FJ202007)
GGTGCCTGTTTGTGTTGTACATGGCGTGTAAATGTGTGTATAATATTGTGCAATGTGTTGT
ACGTGGGTGTTTTTTGTATGTATGTTGTTGTATGTATGTCAGTACGCAATAAAAGTGATGT
GTGTGTTTATAATTAACACTGTATTGTTGTATGACTATGGGTGCACCCATATGACTTACAT
AATTACAGTACACGCTATATGTTGTATATAACAATTCTACCTCCATTTTGTGTGTTGGTGTC
CTTTACATTACCTTTCAACCGATTTCGGTTGCTGTTGGCAAGCTTTATATGTTTTTTACAAA
AACATTCCTACCTCAGCAGAACACTTAATCCTTGTGTTCCTGATATATATTGTTTGCCAACT
TTATATTGGCTTTTGCCAATCTTTAAACTTGATTCATCTTGCAGTATTAGTCATTTTTCATA
CTTGTGGTCCACCCACACTTGTAACACTTGTAACAGTGCTTTTAGGCACATATTTTTTGCAT
TTCTAAAGGGCTTTAATTGCACACTTGGCTTTACATATTATGTGTGTTTGCCAACACCACCC
TACACATCCTGCCAACTTTAAGTTAAAACATGCATGTAAAACATTACTCACTGTATTACAC
ATTGTTATATGCACACAGGTGTGTCCAACCGATTTGGATTACAGTTTTATAAGC
LCR HPV-52
Bsb-15 (GenBank: FJ202008)
CCATTGTCTGTTGGGTAATTGTCTGTGTCATGTATGTGTTGTGTATGTCAAAAACAGGTTA
AAAGGTAACCATTGTTTGTTATGTAATTGTTTTCTGTGTGTACTGTGTTGTTTGCATGTTAT
GTATGTGTGTGTGCATGTTTGTTGTATTTGTCAGTTCCTGTATGTATGTTTTGTGTATGTATT
AATAAAGTACTGTATTTACTAAACTATTTATAGTAGTCTTATTGTATGGTTGCACCCACAT
GAGTAACAATACAGTTGCTTCTAATCTATTGCATCTCCTGCCCTACCCTGTGTCCCCTGCCC
TACCCTGTGTCCTACTTTGTTACACTACTAATTAGCCTTATACTCTCCATTTTGTACCATTTT
GTACTATCCACCATTTTAAATCCTAACCGAATTCGGTTGGTGTTGGCACCACTTTGGTTGTC
CTTGGCACAGTAACAACTATTTTTATATAAATGTCAGCAAACTGCTTAATCCTTTGGTTTCC
TGCAGTCCACTGGTCTACACTTGTTGTCCCGCCTAAACTGATGTCCCGCCTAAACTGACTC
ACACTCCTGCAGTGCAGCTAAACAATACATTGCCTAACATTGCATGTTTTAAACTGCTTTT
AGGCACATATTTTATTTAAACTTTCAATGCACTAATTACAGTGTTGGCTTACACAAGTACA
TCCTACGCCAAATATGTCTTGTAAAACATAATTGAATACTGTTACTCACCAGGTGTGCACT
ACACGACCGGTTACGGTTACCGTAGCCACAACCACTTTTTGTTATAATTATAAATTATAAT
135
CTTATACTAGTAAAAAGTAGGGTGTAACCGAAAACGGTCAGACCGAAACCGGTGTATATA
TATAGAACACAGTGTAGCTAACGCACGGCC
L1 HPV-52
Bsb-20 (GenBank: FJ202009)
ATAATGGCATATGTTGGGGCAATCAGTTGTTTGTCACAGTTGTGGATACCACTCGTAGCAC
TAACATGACTTTATGTGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAA
GGAATACCTTCGTCATGGCGAGGAATTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTGTGCAAAATT
ACATTAACAGCTGATGTTATGACATACATTCATAAGATGGATGCCACTATTTTAGAGGACT
GGCAATTTGGCCTTACCCCACCACCGTCTGCATCTTTGGAGGACACATACAGATTTGTCAC
TTGTACTGCTATAACTTGTCAAAAAAACACACCACCTAAAGGAAAGGAAGATCCTTTAAA
GGACTATATGTTTTGGGAGGTGGATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGATTTAGATCAGTTT
CC
LCR HPV-58
Bsb-295 (GenBank: FJ202010)
TTGTTGTGGTACTTACACTATTTTATTATACATGTTTGTTTGTTTTATGTATGTGTTGTCTGT
TTGTTTATGTTTGTGTATATGTTGTATGTGTTATGTGTCATGTTTGTGTACATGTTCTATGTC
TTTGTCAGTTTCCTGTTTCTGTATATATGTAATAAACTATTGTGTGTATTGTAAACTATTTG
TATTGTTTGGGTGTATCTATGAGTAAGGTGCTGTCCCTAAATTGCCCTACCCTGCCCTGCCT
ATTATGCATACCTATGTAATAGTATTTGTATGATATGTATTTTATAGTTTTTAACAGTACTG
CCTCCATTTTACTTTACCTCCATTTTGTGCATGTAACCGATTTCGGTTGCTGGCACAAACGT
GTTTTTTTTAAACTACAATTTAAACAATACAGTTAATCCTTTCCCTTCCTGCACTGCTTTTG
CCTATACTTGCATATGTGACTCATATATACATGCAGTGCAGTTGCAAAATGTTTAATTATA
CTCATAGTTTAAACATGCTTATAGGCACATATTTTAACTTACTTTCAATGCTTAAGTGCAGT
TTTGGCTTGCACAATGGTTTGTTATGCCAAACTATGTCTTGTAAAAGTGACTCACTAACAT
TTATTGCCAGGTGTGGACTAACCGTTTTAGGTCACATTGTTCATGTTTCAACATTTTATATA
ATACTAAACTATAATGCCAAATCTTGTAAAAACTAGGGTGTAACCGAAAACGGTCTGACC
GAAACCGGTGCATATATAAAGCAGACATTTTTTGGTAGGCTACTGCAGGACT
Bsb-329 (GenBank: FJ202011)
TTGTTGTGGTACTTACACTATTTTATTATACATGTTTGTTTGTTTTATGTATGTGTTGTCTGT
TTGTTTATGTTTGTGTATATGTTGTATGTGTTATGTGTCATGTTTGTGTACATGTTCTATGTC
TTTGTCAGTTTCCTGTTTCTGTATATATGTAATAAACTATTGTGTGTATTGTAAACTATTTG
TATTGTTTGGGTGTATCTATGAGTAAGGTGCTGTCCCTAAATTGCCCTACCCTGCCCTGCCT
ATTATGCATACCTATGTAATAGTATTTGTATGATATGTATTTTATAGTTTTTAACAGTACTG
CCTCCATTTTACTTTACCTCCATTTTGTGCATGTAACCGATTTCGGTTGCTGGCACAAACGT
GTTTTTTTTAAACTACAATTTAAACAATACAGTTAATCCTTTCCCTTCCTGCACTGCTTTTG
CCTATACTTGCATATGTGACTCATATATACATGCAGTGCAGTTGCAAAATGTTTAATTATA
CTCATAGTTTAAACATGCTTATAGGCACATATTTTAACTTACTTTCAATGCTTAAGTGCAGT
TTTGGCTTGCACAATGGTTTGTTATGCCAAACTATGTCTTGTAAAAGTGACTCACTAACAT
TTATTGCCAGGTGTGGACTAACCGTTTTGGGTCACATTGTTCATGTTTCAACATTTTATATA
ATACTAAACTATAATGCCAAATCTTGTAAAAACTAGGGTGTAACCGAAAACGGTCTGACC
GAAACCGGTGCATATATAAAGCAGACATTTTTTGGTAGGCTACTGCAGGACT
Bsb-367 (GenBank: FJ202012)
TTGTTGTGGTACTTACACTATTTTATTATACATGTTTGTTTGTTTTATGTATGTGTTGTCTGT
TTGTTTATGTTTGTGTATATGTTGTATGTGTTATGTGTCATGTTTGTGTACATGTTCTATGTG
TTTGTCAGTTTCCTGTTTCTGTATATATGTAATAAACTATTGTGTGTATTGTAAACTATTTG
TATTGTTTGGGTGTATCTATGAGTAAGGTGCTGTCCCTAAATTGCCCTACCCTGCCCTGCCT
ATTATGCATACCTATGTAATAGTATTTGTATGATATGTATTTTATAGTTTTTAACAGTACTG
CCTCCATTTTACTTTACCTCCATTTTGTGCATGTAACCGATTTCGGTTGCTGGCACAAACGT
GTTTTTTTTAAACTACAATTTAAACAATACAGTTAATCCTTTCCCTTCCTGCACTGCTTTTG
CCTATACTTGCATATGTGACTCATATATACATGCAGTGCAGTTGCAAAATGTTTAATTATA
CTCATAGTTTAAACATGCTTATAGGCACATATTTTAACTTACTTTCAATGCTTAAGTGCAGT
TTTGGCTTGCACAATGGTTTGTTATGCCAAACTATGTCTTGTAAAAGTGACTCACTAACAT
TTATTGCCAGGTGTGGACTAACCGTTTTGGGTCACATTGTTCATGTTTCAACATTTTATATA
136
ATACTAAACTATAATGCCAAATCTTGTAAAAACTAGGGTGTAACCGAAAACGGTCTGACC
GAAACCGGTGCATATATAAAGCAGACATTTTTTGGTAGGCTACTGCAGGACT
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