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UNIVERSIDADE TIRADENTES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E AMBIENTE
Avaliação das Alterações Produzidas na Bexiga por
Fármacos em Sistemas Lipossomais Administrados Via
Intravesical
LORENA MAGALE DANTAS CIRINO
ARACAJU
Março - 2009
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UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
1
UNIVERSIDADE TIRADENTES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E AMBIENTE
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES PRODUZIDAS NA BEXIGA
POR FÁRMACOS EM SISTEMAS LIPOSSOMAIS
ADMINISTRADOS VIA INTRAVESICAL
Dissertação de Mestrado submetida à banca
examinadora para a obtenção do título de Mestre
em Saúde e Ambiente, na área de concentração
Saúde e Ambiente.
LORENA MAGALE DANTAS CIRINO
Orientadoras:
Profª. Francine Ferreira Padilha, D. Sc,
Profª. Juliana Cordeiro Cardoso, D. Sc.
ARACAJU
Março – 2009
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UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
2
C578a Cirino, Lorena Magale Dantas
Avaliação das Alterações Produzidas na Bexiga de Ratas por Fármacos e
m
Sistemas Lipossomais Administrados Via Intravesical
/ Lorena Magale
Dantas Cirino ; orientadores Francine Ferreira Padilha, Juliana Cordeiro
Cardoso . – Aracaju, 2009.
91 p. : il.
Inclui bibliografia
Dissertação ( Mestrado em Saúde e Ambiente) – Universidade
Tiradentes, 2009.
1. Resiniferatoxina. 2. Hiperatividade do detrusor. 3. Lipossomas..
4. Incontinência urinária. 5. Oxibutinina. I. Padilha, Francine Ferreira..
II. Cardoso, Juliana Cordeiro. III. Titulo.
CDU : 614
615.03
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
3
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES PRODUZIDAS NA BEXIGA DE RATAS POR
FÁRMACOS EM SISTEMAS LIPOSSOMAIS ADMINISTRADOS VIA INTRAVESICAL
Lorena Magale Dantas Cirino
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E
AMBIENTE DA UNIVERSIDADE TIRADENTES COMO PARTE DOS REQUISITOS
NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM SAÚDE E AMBIENTE
Aprovada por:
________________________________________________
Francine Ferreira Padilha, D.Sc.
Orientador
________________________________________________
Juliana Cordeiro Cardoso, D.Sc.
Orientador
________________________________________________
Thiers Deda Gonçalves, D.Sc.
Titular
________________________________________________
Sonia Oliveira Lima, D. Sc.
Titular
ARACAJU
Março - 2009
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
4
Dedico este trabalho:
Aos meus filhos Paulo e Henrique, por
serem a maior motivação para todas as
realizações pessoais e profissionais
desta vida.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
5
AGRADECIMENTOS
Para realizar este trabalho, foi necessária a participação de muitos, seja com esforço,
empenho, resignação, compreensão e até solidariedade de alguns que nada tinham com
tudo isso.
Quero agradecer primeiramente a Deus pela força e determinação de superar todos os
limites que até então desconhecia e ser capaz de chegar até o final desta jornada. Em
segundo lugar à minha família, em especial à minha mãe, Graça e ao meu marido Marcelo
pelo apoio nos momentos mais difíceis e compreensão diante das várias ausências
necessárias para completar os estudos.
Quero agradecer às minhas orientadoras, as Professoras Doutoras Juliana Cordeiro
Cardoso e Francine Ferreira Padilha pelo interesse, pelo empenho em fazer o melhor
sempre; por me ajudar a me reerguer quando tudo parecia perdido, e por não me deixar
desistir nunca. Obrigada por terem me guiado neste caminho tão cheio de dúvidas, e por
terem me ajudado a realizar este trabalho do qual tenho muito orgulho e que vai me
acompanhar por toda a vida profissional.
Agradeço especialmente ao Professor Doutor Ricardo Luiz Cavalcanti Albuquerque Jr,
essencial para a realização do trabalho, com paciência, seriedade e cuidado na avaliação
de todas as lâminas envolvidas no estudo; Agradeço à Nelly do LBME -ITP, pelo trabalho
delicado de elaboração das lâminas;
A Professora Ana Maria Guedes e ao Professor Malone Pinheiro pela parceria nas urinálises
e na detecção do lipossoma na urina dos animais;
Ao Sr. Elisandro do Departamento de Física da UFS, pela análise dos lipossomas
Aos amigos do Biotério: Gladstone, João e Max.
Aos amigos do Curso de Mestrado em Saúde e Ambiente da UNIT, pelo apoio pois só
quem passa pelo desafio de fazer um mestrado entende tudo o que representa uma defesa.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
6
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS..........................................................................................................
8
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................
9
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES..............................................................................
11
RESUMO........................................................................................................................,...
12
ABSTRACT........................................................................................................................
13
INTRODUÇÃO....................................................................................................................
14
CAPÍTULO 1. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................
16
1.1. Incontinência urinária............................................................................................ 17
1.2. Bexiga................................................................................................................... 18
1.3. Fisiologia da micção.............................................................................................. 21
1.4. Hiperatividade do detrusor.................................................................................... 23
1.5. Tratamento............................................................................................................ 24
1.5.1. Oxibutinina......................................................................................................... 25
1.5.2. Capsaicina......................................................................................................... 26
1.5.3. Resiniferatoxina................................................................................................. 27
1.6. Lipossomas........................................................................................................... 29
1.7. Avaliação morfológica........................................................................................... 31
1.8. Urinálise................................................................................................................ 32
1.9. Referências........................................................................................................... 34
CAPÍTULO 2. AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA BEXIGA DE RATAS
PRODUZIDAS POR OXIBUTININA E RESINIFERATOXINA EM SISTEMAS
LIPOSSOMAIS ADMINISTRADOS VIA INTRAVESICAL................................................
42
RESUMO...........................................................................................................................
43
ABSTRACT........................................................................................................................
44
2.1. Introdução............................................................................................................. 45
2.2. Material e métodos................................................................................................ 46
2.2.1. Preparação das formulações intra-vesicais....................................................... 46
2.2.2. Avaliação do tamanho de partícula e índice de polidispersividade.................... 46
2.2.3. Administração intravesical................................................................................ 47
2.2.4. Análise do sedimento urinário............................................................................ 48
2.2.5. Extração e histologia da bexiga dos ratos......................................................... 48
2.2.6. Análise estatística.............................................................................................. 50
2.3. Resultados............................................................................................................ 50
2.3.1. Avaliação do tamanho de partícula e índice de polidispersividade.................... 50
2.3.2. Achados cirúrgicos............................................................................................. 52
2.3.3. Macroscopia....................................................................................................... 52
2.3.4. Avaliação histológica.......................................................................................... 56
2.3.5. Urinálise............................................................................................................. 65
2.4. Discussão.............................................................................................................. 66
2.5. Conclusão............................................................................................................. 71
2.6. Referências........................................................................................................... 72
CAPÍTULO 3. AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES PRODUZIDAS NA BEXIGA POR
CAPSAICINA EXTRAÍDA DE CAPSICUM FRUTESCENS EM SISTEMAS
LIPOSSOMAIS................................................................................... ..............................
75
RESUMO............................................................................................................................
76
ABSTRACT........................................................................................................................
77
3.1. Introdução............................................................................................................. 78
3.2. Material e métodos................................................................................................ 79
3.2.1. Secagem da planta e obtenção do extrato........................................................ 79
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
7
3.2.2. Avaliação da extração por cormatografia líquida de alta eficiência (CLAE)...... 79
3.2.3. Obtenção do lipossoma..................................................................................... 80
3.2.4. Caracterização do lipossoma............................................................................. 80
3.2.5. Ensaio Biológico................................................................................................ 80
3.3. Resultados e discussão........................................................................................ 82
3.3.1. Extração e quantificação dos marcadores......................................................... 82
3.3.2. Caracterização dos lipossomas......................................................................... 83
3.3.3. Avaliação histológica......................................................................................... 85
3.4. Conclusão............................................................................................................. 87
3.5. Referências........................................................................................................... 88
4.CONCLUSÃO GERAL...................................................................................................
91
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Grupos de animais submetidos à administração intravesical 47
Tabela 2
Classificação dos parâmetros microscópicos da reação inflamatória
nas secções da bexiga coradas em hematoxilina-eosina (HE)
49
Tabela 3
Avaliação das secções histológica coradas com HE das bexigas
tratadas com salina (SAL), lipossomas (LIP), oxibutinina (OXI),
resiniferatoxina (RTX), oxibutinina em lipossomas (OXILIP) e
resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP)
62
Tabela 4
Resultados da urinálise realizada após 15 dias da instilação das
formulações
65
Tabela 5
Índice de polidispersividade das formulações lipossomais 85
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9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Urotélio de rato corado com hematoxilina/eosina no aumento 400 x 20
Figura 2
Visão macroscópica da bexiga e suas camadas 21
Figura 3
Reflexo da micção 22
Figura 4
Avaliação de presença de lipídios na urina 33
Figura 5
Distribuição do tamanho das vesículas lipossomais contendo
oxibutinina (A) e resiniferatoxina (B)
51
Figura 6
Índice de polidispersividade das formulações lipossomais após 3 e 42
dias da obtenção das mesmas
51
Figura 7
Hematúria macroscópica e presença de aderências vesicais
observadas durante a dissecção em rato do grupo com resiniferatoxina
após 7 dias
52
Figura 8
Avaliação do tamanho médio das bexigas dos animais (mm) após 1, 7
e 60 dias após a administração intravesical
53
Figura 9
Avaliação macroscópica das bexigas evidenciando tamanho (mm) e
pontos hemorrágicos no grupo salina (SAL) e em 1 (LIP-1), 7 (LIP-7) e
60 (LIP-60) dias após instilação das formulações
54
Figura 10
Avaliação macroscópica das bexigas evidenciando tamanho (mm) e
pontos hemorrágicos em 1, 7 e 60 dias após a instilação de oxibutinina
(OXI) e resiniferatoxina (RTX)
54
Figura 11
Avaliação macroscópica das bexigas evidenciando tamanho (mm) e
pontos hemorrágicos em 1, 7 e 60 após a instilação de oxibutinina em
lipossomas (OXILIP) e resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP)
55
Figura 12
Intensidade de pontos hemorrágicos nas bexigas após instilação das
formulações (A) após 1 dia; (B) após 7 dias
56
Figura 13
Secções histológicas dos grupos após um dia da instilação das
formulações com a coloração Hematoxilina/eosina (aumento 100X) dos
grupos salina (SAL-1), lipossoma (LIP-1), Oxibutinina (OXI-1),
Resiniferatoxina (RTX-1), Oxibutinina em lipossomas (OXILIP-1),
Resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP-1)
58
Figura 14
Secções histológicas dos grupos após 7 dias da instilação das
formulações com a coloração Hematoxilina/eosina (aumento 100X) dos
grupos salina (SAL-7), lipossoma (LIP-7), Oxibutinina (OXI-7),
Resiniferatoxina (RTX-7), Oxibutinina em lipossomas (OXILIP-7),
59
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
10
Resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP-7)
Figura 15
Secções histológicas dos grupos após 60 dias da instilação das
formulações com a coloração Hematoxilina/eosina (aumento 100X) dos
grupos salina (SAL-60), lipossoma (LIP-60), Oxibutinina (OXI-60),
Resiniferatoxina (RTX-60), Oxibutinina em lipossomas (OXILIP-60),
Resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP-60)
61
Figura 16
Secções histológicas dos grupos após 1, 7 e 60 dias da instilação das
formulações com a coloração Picrossírius (aumento 100X) dos grupos
salina (SAL), lipossoma (LIP-1, LIP-7 e LIP-60 respectivamente),
Oxibutinina (OXI-1, OXI-7 e OXI-60, respectivamente), Resiniferatoxina
(RTX-1, RTX7 e RTX60, respectivamente), Oxibutinina em lipossomas
(OXILIP-1, OXILIP-7 e OXILIP-60, respectivamente), Resiniferatoxina
em lipossomas (RTXLIP-1, RTXLIP-7 e RTXLIP-60, respectivamente)
64
Figura 17
Visualização das gotículas de gordura na urina dos ratos. (A) gotículas
de gordura, resíduos e cristais de fosfato triplo no grupo OXILIP-60; (B)
gotícula corada no grupo OXILIP-60; (C) gotícula corada e gotículas
menores não coradas no grupo RTXLIP-60; (D) gotícula corada no
grupo RTXLIP-60
65
Figura 18
Cromatograma do extrato contendo capsaicina e diidrocapsaicina (A) e
dos padrões de capsaicina e diidrocapsaicina (B)
83
Figura 19
Potencial zeta dos lipossomas sem capsaicina (LIP) e com capsaicina
(LIPCPS) durante 60 dias após obtenção das vesículas
84
Figura 20
Tamanho das vesículas sem (A) e com (B) capsaicina nos tempos 1, 7
e 14 dias
85
Figura 21
Secções histológicas das bexigas após 24 horas da instilação das
formulações com a coloração Hematoxilina/eosina aumento 100X (A) e
aumento 400X (B) dos grupos salina (SAL), lipossoma (LIP),
capsaicina (CPS) e capsaicina em lipossomas (LIPCPS)
86
Figura 22
Secções histológicas das bexigas após 24 horas da instilação das
formulações com a coloração picrossírius aumento 100X dos grupos
salina (SAL), lipossoma (LIP), capsaicina (CPS) e capsaicina em
lipossomas (LIPCPS)
87
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
11
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
BH - Bexiga Hiperativa
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CNI - Contrações Não-Inibidas
EMDA - Administração Eletromotiva De Drogas
GAG - Glicosaminoglicanas
HD - Hiperatividade do Detrusor
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IU - Incontinência Urinária
IUE - Incontinência Urinária de Esforço
OMS - Organização Mundial da Saúde
OXI - Oxibutinina
OXILIP - Oxibutinina Associada a Lipossomas
PIV - Polipeptídeo Intestinal Vasoativo
RTX - Resiniferatoxina
RTXLIP - Resiniferatoxina Associada a Lipossomas
CPS - Capsaicina
TPRV 1 - Receptor Vanilóide Transitório Potencial 1
VR1 - Receptor Vanilóide 1
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
12
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES PRODUZIDAS NA BEXIGA
DE RATAS POR FÁRMACOS EM SISTEMAS LIPOSSOMAIS
ADMINISTRADOS VIA INTRAVESICAL
Lorena Magale Dantas Cirino
A incontinência urinária interfere na vida pessoal e social da mulher causando-lhe
desconforto e constrangimento. Esta doença incide aproximadamente em 40% das
mulheres em menopausa, sendo que uma das causas pode ser atribuída a Hiperatividade
do Detrusor (HD). A oxibutinina tem sido extensivamente utilizada no tratamento da bexiga
hiperativa. A capsaicina e a resiniferatoxina são descritas como alternativas para o
tratamento da bexiga hiperativa pela via intravesical, entretanto, sua administração pode
ocasionar reações adversas com sintomas irritativos como dor pélvica e desconforto. Desta
forma, o objetivo do trabalho foi desenvolver formulações lipossomais contendo capsaicina,
resiniferatoxina ou oxibutinina para administração intravesical e avaliar o impacto
histomorfológico destas substâncias na bexiga após a instilação destas formulações. Os
lipossomas obtidos ou os fármacos em solução foram instilados via intravesical em ratas e
após 1, 7 e 60 dias foram realizados exames histopatológicos das bexigas das ratas para
avaliar a presença de reação inflamatória e alterações na estrutura do colágeno vesical. O
estudo do sedimento urinário das ratas foi realizado quinzenalmente em busca de
marcadores inflamatórios e da presença de lipossomas. O resultado encontrado foi uma
importante atenuação da agressão tecidual nos grupos com lipossomas. Verificou-se a
presença de lipossomas nas amostras de urina dos animais até o 60º dia. A estratégia de
obtenção de sistemas lipossomais para administração intravesical de fármacos utilizados na
hiperatividade do detrusor demonstrou ser eficiente, com diminuição da resposta
inflamatória.
Palavras-chave: resiniferatoxina, capsaicina, hiperatividade do detrusor, lipossomas,
tratamento intravesical, incontinência urinária, oxibutinina.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
13
EVALUATION OF ALTERATIONS PRODUCED IN BLADDER
BY DRUGS INTO LIPOSOMAL SYSTEMS FOR
INTRAVESICAL ADMINISTRATION
Lorena Magale Dantas Cirino
Urinary incontinence interferes in a social life, causing disconfort and embarassment and it
affects up to 40% of all women at menopause. Overactive Bladder (OB) which is one of the
many types of urinary incontinence, concerns pharmacological treatment with anticolinergics,
many times associated with unpleasant side effects such as dry mouth, constipation and
blurred vision. Capsaicin and resiniferatoxin are described as alternative intravesical
treatment to OB. Therefore its administration can cause irritative symptoms as pelvic pain
and discomfort. The aim of this work was obtain liposomes with capsaicin, resiniferatoxin or
oxybutinin for intravesical administration and evaluate these formulations under
hystomorphologycal impact in rat bladder. The drugs alone and encapsulated in liposomes
were instilled inside the rat bladder and after 1, 7 and 60 days, bladders were excised and
submitted to hystopathological analysis looking for inflammatory reaction and collagen
alterations. Rat urinalyses were made each 15 days in order to search infection markers and
liposomes. As results, an important reduction in tissue damage was seen on the liposome
with drug group. Liposomes presence was seen at urine samples until 60 days after
intravesical instillation. Liposomal systems strategy for intravesical drug administration for
OB treatment seemed efficient with decrease of inflammatory response.
Keywords: resniferatoxin, capsaicin, oxybutinin, urinary incontinence, overactive bladder,
liposomes, intravesical, treatment.
.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
14
INTRODUÇÃO
A preocupação com os aspectos da menopausa tem ganhado uma crescente
importância devido às modificações de papéis que a mulher passou a exercer na sociedade
no último século e especialmente nestas últimas décadas (BESSA, 2007).
A sociedade moderna tem trazido muitas vantagens, tais como conforto, acesso a
informação, saúde e educação, desenvolvimento das ciências e tecnologias. A melhora das
condições de saúde proporcionou um aumento significativo da longevidade. Segundo o
IBGE, a expectativa de vida da mulher brasileira passou de 65,7 anos em 1980 para 75,8
anos em 2005, assim surgindo à necessidade da comunidade científica preocupar-se mais
com os temas referentes à saúde do idoso. Com o aumento da expectativa de vida, e
estimando que a mulher entre na menopausa com cerca de 50 anos de idade (LIMA e
GIRÃO, 2003), ela pode passar um terço ou mais de sua vida neste período. Por esse
motivo, fez-se necessária a busca de alternativas para melhorar a qualidade de vida da
mulher nesta nova fase de sua vida.
Um dos aspectos físicos do início da menopausa é a diminuição da circulação
sanguínea nos órgãos pélvicos pela queda dos níveis hormonais. Concomitantemente,
ocorre um afrouxamento dos tecidos, favorecendo as distopias (alterações na posição dos
órgãos pélvicos) e a incontinência urinária (GIRÃO, 1998; SARTORI, 2001). A menopausa
relaciona-se diretamente ao aumento da incidência de incontinência urinária, que chega a
ser de 40% neste período (STANTON, 1985).
Neste contexto, a medicina tem avançado muito no campo da uroginecologia. O
tratamento da bexiga hiperativa iniciou-se em 1972 com a descoberta da oxibutinina. No
século XXI, começaram a aparecer novos fármacos para administração pela via oral, como
a tolterodina e a solifenacina (ANDERSSON e CHAPPLE, 2001). Porém, a administração
oral destes fármacos traz uma série de efeitos colaterais indesejáveis do tipo boca seca,
constipação, visão turva sendo associados ao efeito de primeira passagem no fígado, deste
modo o tratamento intravesical torna-se uma excelente via alternativa. Atualmente, o
caminho para o tratamento parenteral da bexiga hiperativa é feito também através de
adesivos com oxibutinina, através da bomba vesical que consiste em um reservatório
inserido na bexiga capaz de liberar a droga desejada de forma constante. Pela via
intravesical, podem ser utilizadas a toxina botulínica, a capsaicina (extraída de espécies de
pimenta) e a resiniferatoxina, extraída da planta Euphorbia resinífera, sendo esta 1000
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
15
vezes mais potente que a capsaicina segundo a escala de Scoville (APPENDINO e
SZALLASI, 1997).
Novas formas de tratamento têm sido buscadas, tais como a utilização da terapia
gênica com o uso das células tronco para esta doença (caráter experimental) e sistemas de
liberação prolongada, tais como lipossomas e bioadesivos. Estes sistemas permitem que o
princípio ativo seja incorporado em um veículo biológico ou sintético que se adere ao tecido
orgânico e que provoca a liberação gradual deste princípio ativo proporcionando um
tratamento contínuo e prolongado sem a necessidade de ficar ingerindo comprimidos, sem
efeito de primeira passagem, podendo usar doses menores do fármaco (FRÉZARD, et al.,
2005). A busca por novos sistemas de liberação sustentada de fármacos administrados
intravesicalmente e com efeitos colaterais mínimos pode proporcionar um incremento no
número de adesões das pacientes ao tratamento e incluir pacientes que estavam fora de
possibilidade terapêutica por não tolerarem o tratamento via oral ou serem resistentes ao
tratamento ou por não desejarem o tratamento cirúrgico (FRASER et al., 2002).
Os lipossomas são capazes de encapsular substâncias lipofílicas ou hidrofílicas e
através de difusão passiva, interagem com as membranas celulares de forma gradativa,
liberando a substância encapsulada de forma lenta (FRÉZARD et al., 2005). Ao mesmo
tempo, eles também são capazes de reforçar a proteção urotelial contra a agressão de
substâncias tóxicas, minimizando o dano tecidual (FRASER et al., 2003). Substâncias
lipofílicas como a capsaicina e a resiniferatoxina necessitam de um veículo com componente
alcoólico (etanol) para permitir sua dissolução (TYAGI et al., 2004). Entretanto, o etanol
exerce um efeito irritativo na mucosa vesical, tornando-se mais uma razão para a
associação lipossomal das substâncias.
A proposta de desenvolver um sistema de liberação prolongada utilizando os
fármacos como a oxibutinina, resiniferatoxina e capsaicina surgiu da necessidade de um
tratamento com maior durabilidade e menores efeitos colaterais.
Deste modo o objetivo do presente trabalho foi avaliar as alterações vesicais
provocadas pela resiniferatoxina, oxibutinina e capsaicina isoladamente e associadas a
lipossomas, utilizando modelo animal para aplicação intravesical.
O presente trabalho foi dividido, a em três partes, sendo que a primeira parte discorre
sobre a revisão da literatura sobre o tema proposto segunda parte compreende o artigo
sobre a resposta inflamatória vesical provocada pela oxibutinina e resiniferatoxina
administradas na bexiga na forma pura e associada a lipossomas. A última parte apresenta
um artigo sobre a extração da capsaicina da Capsicum frutescens pimenta malagueta e sua
encapsulação em lipossomas, avaliando in vitro e in-vivo suas propriedades .
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16
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DA LITERATURA
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
17
1. REVISÃO DA LITERATURA
A incontinência urinária (IU) é um problema físico e social que atinge principalmente
as mulheres no período da menopausa. Inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas na
busca de tratamentos eficazes, entretanto fazem-se necessários estudos aprofundados na
área de uroginecologia que envolvam todos os aspectos relacionados a esta doença, tais
como estudos da anatomia da bexiga, fisiopatologia da incontinência urinária por
instabilidade vesical e formas de tratamento disponíveis.
1.1 - INCONTINÊNCIA URINÁRIA (IU)
Segundo o COMITÊ DE PADRONIZAÇÃO DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE
CONTINÊNCIA (1991), a incontinência urinária é a perda involuntária de urina clinicamente
demonstrável que cause problema social ou higiênico. Existe a incontinência urinária de
esforço, que é definida como a perda urinária pelo meato uretral quando a pressão vesical
excede a pressão máxima de fechamento uretral na ausência de contração do músculo
detrusor. Enquanto a incontinência urinária por hiperatividade do detrusor é definida como
perda urinária pela presença de contrações espontâneas ou desencadeada por manobras
de esforço ou por estímulo dos órgãos dos sentidos, durante o enchimento vesical, estando
a paciente orientada a inibir a micção.
A incontinência urinária antigamente era vista como um problema sem solução, e as
mulheres simplesmente se conformavam com a condição não procurando atendimento
médico. Atualmente ainda não mencionam o problema aos médicos e nem mesmo aos
familiares, por vergonha ou embaraço causado pela condição desconfortante (GIRÃO et al.,
2002). Com o aumento da expectativa de vida, a medicina focou-se em procurar novas
alternativas para o tratamento desta doença. Sabe-se que a prevalência da IU entre as
mulheres é alta. Segundo Stanton et al. (1985), 26% das mulheres possuem algum tipo de
IU no período reprodutivo, sendo que esse índice aumenta para 40% no período pós-
menopausa. Trata-se, portanto, de doença com prevalência alta no período da menopausa.
A incontinência urinária por bexiga hiperativa acomete não somente as mulheres, mas
também os homens tanto na forma de instabilidade vesical como de hiperreflexia do
detrusor.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
18
1.2. A BEXIGA
A bexiga é constituída pelo epitélio vesical ou urotélio ou epitélio transicional que
consiste em um número variável de camadas de células, sendo que em humanos existem
entre 6 e 8 camadas (FRASER et al., 2002). Em todos os mamíferos, existem 3 zonas
distintas, que incluem a camada basal, as células intermediárias, e por último uma camada
de células “guarda-chuva” que são as maiores células epiteliais do corpo humano (Figura 1).
Estas células têm formato poliédrico e podem se esticar e encolher de acordo com a
pressão vesical, sua superfície é coberta por uma camada de glicosaminoglicanas (GAG),
cuja função é assunto controverso, relacionando-se à permeabilidade do urotélio e
dificultando a aderência bacteriana à parede vesical (PARSONS et al., 1990). Entre estas
células guarda-chuva, existem fortes junções celulares também responsáveis pela
impermeabilização do urotélio. As junções celulares estão localizadas na região apical e
lateral da membrana das células superficiais do urotélio. Sua função é impedir a difusão
paracelular de substâncias da urina para o sangue e representa uma das barreiras do
urotélio. As células das camadas intermediária e basal não apresentam as junções celulares
e não constituem uma barreira ao transporte paracelular através do urotélio (KEREC et al.,
2005).
Cerca de 70 a 90% da superfície da membrana apical das células superficiais
uroteliais é composta de proteínas específicas chamadas uroplaquinas, que estão dispostas
em placas que são mais espessas que as áreas de membrana normalmente encontradas
(KEREC et al., 2005). Estas são responsáveis pela maior parte do bloqueio da passagem
de água e uréia através do urotélio. Constituem a segunda barreira do urotélio à passagem
de substâncias da urina para o sangue. Acima das uroplaquinas encontra-se a camada de
glicosaminoglicanas. Compreende uma camada delgada de muco na superfície urotelial que
tem como função impedir a passagem de substâncias através do urotélio, sendo uma
terceira barreira do urotélio à difusão de substâncias (FRASER et al., 2002).
No urotélio, encontra-se o receptor vanilóide transitório potencial 1 (TRPV1), que é
um canal catiônico não seletivo que responde a vários estímulos nóxicos, tais como o calor
acima de 43ºC ou acidez com pH menor que 6. No trato urinário inferior, a expressão deste
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receptor TRPV1, tem sido documentada não apenas nas fibras nervosas, mas também está
presente nas camadas muscular, submucosa e mucosa e nas células uroteliais. Este
receptor tem um papel importante na fisiopatologia da bexiga nos estados de dor assim
como na hiperatividade vesical que acompanha a cistite e nas lesões raquimedulares
(SAITOH et al., 2008).
Na sua essência, a membrana apical do urotélio é responsável por 80% da
resistência à passagem de água e mais de 95% do fluxo de uréia, amônia e prótons. A urina
que está em contato com este urotélio é hipertônica, composta de toxinas e excretas do
nosso organismo, que devem ser expelidos. A impermeabilidade a todas as substâncias
presentes na urina ou no sangue é a primeira característica deste tipo de tecido
(HOHLBRUGGER et al., 1985). A sua geometria apresenta forma esférica e é ideal para que
exista um mínimo de superfície tecidual exposta à urina. O movimento através das células
uroteliais ocorre de duas maneiras: a via transcelular (através das células) e a via para-
celular (através das junções celulares e espaços laterais intracelulares). As junções
celulares e as membranas celulares devem ser impermeáveis à urina ou componentes do
sangue assim como medicamentos contidos em ambos os compartimentos. As
modificações nas células ou na permeabilidade das junções celulares podem levar a
alterações na eficácia da barreira urotelial (LEWIS, 1996) e situações envolvendo presença
de K
+
extracelular e hiperosmolaridade promovem a despolarização do músculo liso e geram
aumento da atividade do músculo detrusor, enquanto que hipo-osmolaridade produz
alterações opostas (GIANNANTONI et al., 2006).
A figura 1 apresenta o epitélio vesical, onde pode ser observado a camada de
glicosaminoglicanas, a camada de células guarda-chuva, a camada intermediária e a
camada basal.
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20
Figura 1. Urotélio de rato corado com hematoxilina/eosina no aumento 400 x.
A figura 2 exibe a anatomia da bexiga humana, a formação do trígono vesical com
limites dos orifícios ureterais e colo vesical. O trígono compreende a porção da bexiga onde
a densidade do músculo detrusor é maior. O músculo detrusor corresponde a toda a
musculatura lisa envolvendo a bexiga, responsável pela contração vesical e a eliminação da
urina através da uretra. O esfíncter interno ou esfíncter uretral, localiza-se no colo vesical é
constituído de musculatura lisa, é controlado pelo centro sacral da micção, enquanto o
esfíncter externo da uretra, inserido no diafragma urogenital é submetido ao controle do
córtex cerebral e atua sob controle voluntário (GIRÃO et al., 2002).
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21
Figura 2. Visão macroscópica da bexiga e suas camadas.
Fonte: Ivyrose Ltd.2006, online at www.ivy.rose.co.uk
1.3. FISIOLOGIA DA MICÇÃO
A bexiga é responsável pelo armazenamento da urina e pela sua eliminação através
da uretra. Para o seu adequado funcionamento, é necessária a harmonia entre os vários
arcos reflexos, circuitos e centros neurológicos, além da integridade das estruturas
intrínsecas à bexiga e à uretra (GIRÃO et al., 2002).
O primeiro evento neurológico da micção é o término da atividade eferente inibitória
do nervo pudendo, seguido da suspensão do tônus simpático na bexiga, o que permite o
relaxamento da musculatura esfincteriana uretral e a contração do músculo detrusor
(BLAIVAS, 1982).
Os circuitos neurológicos envolvidos na micção compreendem quatro alças
(BRADLEY et al., 1974). A alça I é um circuito formado entre o córtex cerebral e a
substância reticular pontomesencefálica e é responsável pelo controle voluntário da micção.
A alça II tem origem na substância reticular e termina no centro sacral da micção. Ela
mantém a contração do detrusor por tempo suficiente, permitindo o completo esvaziamento
vesical. A alça III é o circuito que interliga o detrusor ao centro sacral e este ao sistema
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esfincteriano uretral. Ela coordena a sincronia entre a contração do detrusor e o relaxamento
do esfíncter uretral e vice-versa. A alça IV é formada pela comunicação entre o córtex e o
centro sacral da micção e tem como função o controle voluntário do esfíncter externo da
uretra (Figura 3).
Figura 3. Reflexo da micção. Alças neurológicas do reflexo da micção. Alça I (seta preta);
Alça II (setas vermelhas); Alça III (setas verde, azul contínua, lilás e linhas azuis tracejadas);
Alça IV (setas ascendentes na medula espinhal).
Fonte: FORD et al., 2006.
Além destas alças principais, outros núcleos têm participação no controle da micção.
Os núcleos da base inibem a atividade contrátil do detrusor e quando acometidos, por
exemplo, na doença de Parkinson, podem produzir uma hiperreflexia do detrusor. O sistema
límbico nas situações de estresse emocional ou em pacientes com perfil psicológico alterado
pode fazer com que a bexiga responda com um aumento da freqüência e urgência
miccional. O cerebelo coordena a ação dos músculos envolvidos com o equilíbrio e a
postura durante a micção. Doenças cerebelares associam-se igualmente às contrações não
inibidas do detrusor e à perda do equilíbrio (GIRÃO et al., 2002). Estudos eletrofisiológicos
em gatos e ratos mostraram a presença de dois caminhos reflexos que controlam a micção,
o supraespinhal e o espinhal. Pequenas fibras aferentes mielinizadas (A) passam por um
centro na ponte e formam uma alça aferente de reflexo miccional (espinobulboespinhal). Em
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23
adição a este reflexo dominante, outro foi detectado em animais normais, o qual consiste de
longa resposta latente mediado por fibras C (DE GROAT, KAWATANI, HISAMITSU, 1990).
Em animais com transecção da medula, esta via de micção consiste principalmente de fibras
C não mielinizadas responsáveis pelo arco reflexo. Estas fibras estão presentes na bexiga
em diversas espécies de animais (MAGGIMELI, 1998).
A sensação de enchimento vesical é transmitida pelas fibras A delta que são
ativadas por estímulo mecânico. Já as fibras C aferentes que são menores e
desmielinizadas, somente respondem a estímulos mecânicos altos. Por outro lado elas são
ativadas por estímulos de irritação química ou pelo frio. Os receptores ativados são do tipo
TRPV 1, encontrado em terminações neuronais periféricas nociceptivas, que são canais
catiônicos não seletivos, com alta permeabilidade ao cálcio que também respondem a
estímulos dolorosos do tipo calor maior que 43ºC e pH menor que 5,5, assim como toxinas
vanilóides como a capsaicina e a resiniferatoxina (SAITOH et al., 2008). Portanto, sua
função é sinalizar eventos inflamatórios ou álgicos na bexiga ao sistema nervoso central. No
estado de irritação, estas fibras tornam-se responsivas a menores graus de distensão da
bexiga pelas fibras A-delta que são mecanorreceptivas (CHANCELLOR, 1999).
1.4. HIPERATIVIDADE DO DETRUSOR
Um estudo norte-americano recente demonstrou que a bexiga hiperativa tem uma
prevalência de 17% na população adulta (WEIN e RACKLEY, 2006), passando a valores
maiores com o aumento da idade, tanto para homens como para mulheres (STASKIN,
2005). Outro estudo realizado no Brasil encontrou uma incidência de 18,6% de bexiga
hiperativa na população geral, incluindo homens e mulheres entre 15 e 55 anos (TELOKEN
et al., 2006). A incontinência urinária do tipo bexiga hiperativa é subdividida em instabilidade
vesical e em hiperreflexia do detrusor. A primeira é a condição na qual se verificam
contrações não inibidas do músculo detrusor durante a cistometria (avaliação da pressão
intravesical) na ausência de doenças neurológicas. A hiperreflexia do detrusor se refere às
contrações não inibidas do músculo detrusor (CNIs) na presença de moléstia neurológica,
como por exemplo, a esclerose múltipla, doença de Parkinson, Alzheimer, lesão
raquimedular e neuropatia diabética (GIRÃO et al., 2002).
A bexiga hiperativa (BH) pode ocorrer a partir de anormalidades das vias intrínsecas
da micção. Podem existir distúrbios dos gânglios vesicais das vias nervosas
parassimpaticomiméticas, com a diminuição do polipeptídeo intestinal vasoativo (PIV) que é
um neuropeptídeo que age como inibidor destas vias, desencadeando as contrações
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vesicais. Distúrbios das células marca-passo vesicais, uma vez que o músculo detrusor
nunca está em repouso completo, podem gerar pequenas contrações localizadas as quais
podem dar origem à grandes contrações vesicais. Este tipo de BH sugere um distúrbio no
mecanismo neuromodulador intrínseco. Podem ocorrer também distúrbios generalizados do
músculo liso, como no caso dos pacientes com síndrome do cólon irritável, onde 50% deles
têm BH. Outra causa da BH é o aumento da densidade de nervos sensoriais subepiteliais na
parede vesical. A abundância de nervos aumenta a avaliação do enchimento vesical,
causando a urgência e polaciúria típicos da BH. Pacientes com hiperplasia prostática ou
submetidos a cirurgia que envolva a mobilização ou manipulação do colo vesical podem
desenvolver BH por interferir no suprimento nervoso autonômico da bexiga, podendo ainda
provocar BH a deficiência de prostaciclina. A irritação vesical local por quaisquer agentes e
ainda causas psicológicas, pode ser conduzida com hipnoterapia, treinamento vesical e
biofeedback, recursos estes também considerados importantes no tratamento da BH
(MONTELLA et al., 2006).
1.5. TRATAMENTO
O tratamento da BH pode ser conduzido por medidas comportamentais, como o
treinamento vesical e o biofeedback, tratamento com eletroestimulação e tratamento
farmacológico sendo este feito com o uso de antidepressivos tricíclicos, fármacos
bloqueadores dos canais de cálcio e anticolinérgicos, sendo estes os mais usados. A
reposição hormonal também é utilizada como coadjuvante no tratamento da bexiga
hiperativa (GIRÃO et al., 2002).
A oxibutinina (OXI) é atualmente o fármaco mais utilizado no tratamento da bexiga
hiperativa apresentando-se na forma de comprimidos, como adesivo, para via transdérmica
e na forma líquida para instilação livre na cavidade vesical. Recentemente, novos fármacos,
como a tolterodina (liberação imediata e prolongada), propiverina (liberação prolongada),
solifenacina, darifenacina, cloreto de tróspio e fesoterodina, recentemente descoberta, têm
sido propostos para tratamento oral (CHAPPLE et al., 2008). Estes fármacos têm
propriedades antimuscarínicas, e agem inibindo os receptores muscarínicos existentes na
bexiga e também em outras partes do corpo. Apesar de serem mais usados, os
antimuscarínicos são acompanhados de efeitos colaterais desagradáveis do tipo boca seca,
sonolência, constipação intestinal, alteração nos níveis tensionais, visão turva por bloqueio
do mecanismo de acomodação visual e aumento da freqüência cardíaca por bloqueio vagal
em graus variados de acordo com o medicamento. Esses efeitos, no caso da administração
de oxibutinina pela via oral, se devem à alta concentração sérica do metabólito ativo N-
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25
desetiloxibutinina após o efeito de primeira passagem do fígado. Este incômodo leva à
interrupção do tratamento em até 25% das pacientes, dependendo da dosagem utilizada
(ANDERSSON e CHAPPLE, 2001). Isto acontece porque os antagonistas dos receptores
muscarínicos não exibem seletividade para os receptores M3, subtipo que é mediador da
contração detrusora. Os anticolinérgicos também se ligam aos receptores M1 e M2,
presentes em várias partes do organismo (THIEL, 2002). Os anticolinérgicos são contra-
indicados em pacientes com glaucoma, obstrução intestinal e condições afins, miastenia
gravis, estados de colite, uropatia obstrutiva, gravidez e lactação, e em cardiopatas
(KATZUNG, 1994).
A administração eletromotiva de drogas (AEMD) é outra forma de tratamento para a
bexiga hiperativa e funciona facilitando o transporte de fármacos hidrossolúveis criando um
campo eletromagnético na bexiga, mas envolve um alto custo na aquisição do equipamento
(GIANNANTONI, 2006).
A toxina botulínica é outra forma de tratamento utilizada para os casos de bexiga
hiperativa. Esta tem se mostrado eficaz para o tratamento tanto dos casos idiopáticos como
neurológicos da bexiga hiperativa, consistindo na injeção de neurotoxina botulínica
diretamente em vários pontos do músculo detrusor da bexiga via cistoscópica e com
duração de cerca de 6 meses. Esta técnica apresenta como reação adversa a noctúria e a
redução progressiva do número de receptores suburoteliais. O resultado é obtido a partir do
5º dia após a injeção, com taxa de sucesso de 73% para os casos de base neurológica e até
86% para os casos de bexiga hiperativa idiopática (KALSI et al., 2008).
O tratamento intravesical constitui uma excelente via porque os efeitos colaterais
indesejáveis estão associados à administração medicamentosa pela via oral devido ao efeito
de primeira passagem no fígado. Inúmeros trabalhos vêm sendo desenvolvidos na busca
por novos sistemas de liberação para administração via intravesical com o objetivo de
minimizar os efeitos colaterais e aumentar assim a adesão das pacientes ao tratamento
(CHANCELLOR e DE GROAT, 1999; FRASER et al., 2003; KALSI et al., 2008;
GIANNANTONI et al., 2006).
1.5.1. OXIBUTININA (OXI)
A OXI é uma amina terciária que possui efeito antimuscarínico, relaxante muscular
fraca e possui ação anestésica local duas vezes mais potente que a lidocaína (BARROSO,
2000). Esta última propriedade é importante quando a via de administração é intravesical. O
tempo de meia vida plasmático é de cerca de 2 horas e sua afinidade é maior por receptores
tipo M1 e M3. Este fármaco atravessa a barreira hemato-encefálica, produzindo efeitos do
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26
tipo tonturas e alucinações além de alterações cognitivas (ANDERSSON e CHAPPLE,
2001).
É utilizada na forma de sal, cloreto de oxibutinina (massa molecular 393,95 e pKa
base livre de 8,04) e seu efeito intravesical têm sido associado à melhora dos parâmetros
cistométricos nos casos de bexiga hiperativa tanto em crianças como em adultos. Está
associada a uma redução de 76 a 83% dos episódios de urge-incontinência, embora a
incidência de efeitos colaterais é igualmente alta até 80% (ANDERSSON e CHAPPLE,
2001).
A utilização da OXI proporciona aumento da capacidade vesical de 25 a 100%. Em
estudos em humanos, a OXI se mostrou mais eficaz na administração intravesical do que na
administração pela via oral (BRENDLER et al., 1988). Da mesma forma, constitui-se uma
boa opção nos casos de pacientes com intolerância ao medicamento pela via oral. Após a
administração da mesma dosagem via oral e intravesical, a concentração plasmática do
fármaco foi maior depois da administração por esta última, com pico de ação mais tardio (3
horas) que a via oral (1 hora) e níveis séricos mais altos em 6 horas após sua administração
(MADERSCACHER et al., 1995).
Em estudo para avaliar os efeitos locais da OXI na mucosa vesical de ratos, não foi
detectada qualquer evidência de alteração da mucosa ou da parede vesical diretamente
relacionada a exposição à OXI. Apesar de não haver ainda nenhum estudo em humanos de
biópsias vesicais após um período longo de uso local da OXI, estes resultados sugerem
haver segurança com relação aos efeitos tópicos deste fármaco (BONNEY et al., 1993).
Entretanto, em estudo também em ratos, verificou-se que altas concentrações deste
fármaco foram irritantes à mucosa vesical destes animais(YOKOYAMA et al.,1996).
1.5.2. CAPSAICINA (CPS)
A capsaicina (CPS) é uma neurotoxina extraída das pimentas e tem sido utilizada em
pesquisas neurológicas para estimulação dos nervos sensoriais e para tratar inflamações na
bexiga. É encontrada também em apresentações tópicas para tratamento de artrites e
neuralgia, assim como em sprays para defesa pessoal (SPICER JR e ALMIRALL, 2005). A
CPS exerce seu efeito nas fibras nervosas sensoriais, interagindo com os receptores
vanilóides, promovendo a liberação da substância P assim como outras citocinas. A
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liberação das citocinas nos neurônios sensoriais periféricos causa sintomas irritativos,
provoca sensação de queimadura e intensa dor (CHANCELLOR et al., 1999).
Como neurotoxina, interrompe a condução das fibras aferentes C desmielinizadas,
que participam do centro sacral da micção. Esta dessensibilização do neurônio sensitivo é
de longa duração e reversível. A duração e o início de sua ação vão depender da dose e do
tempo de exposição à substância. Alguns estudos mostram sua eficácia apenas nos casos
em que a hiperatividade do detrusor é secundária a uma doença neurológica por bloquear
apenas a fibra C eferente.
Num primeiro momento, a CPS provoca as contrações vesicais e depois ocorre o
bloqueio das fibras nervosas de forma rápida no início e breves na duração (CHANCELLOR
et al., 1999). De Ridder et al. (1999) utilizaram injeção direta de capsaicina intravesical e
observaram que 44% das pacientes obtiveram uma continência satisfatória e 36% obtiveram
melhora na continência e apenas 20% não obtiveram sucesso com o tratamento. A maiorira
dos estudos clínicos mostraram uma melhora nos parâmetros urodinâmicos em até 2 meses
após a instilação da capsaicina intravesical e em alguns casos, a melhora dos parâmetros
urodinâmicos perdurou por até 9 meses (De RIDDER et al., 1997; CRUZ et al.,1997,
FOWLER et al., 1992).
1.5.3. RESINIFERATOXINA (RTX)
A resiniferatoxina (RTX) é uma neurotoxina 1000 vezes mais potente que a
capsaicina e apresenta efeitos colaterais mais brando em relação a capsaicina. Tais efeitos
incluem menor dor e menor liberação de neuropeptídeos inflamatórios. Este fármaco é
extraído da resina de plantas, dentre as quais a mais conhecida tem o nome científico de
Euphorbia resinifera, encontrada no Marrocos. Esta substância se mostrou útil no tratamento
de pacientes que não obtiveram sucesso com o tratamento convencional para bexiga
hiperativa. Em 1975, a RTX foi isolada e em 1989 foi reconhecida como um ultrapotente
análogo da capsaicina (APPENDINO e SZALLASI, 1997).
Como neurotoxina, a RTX interrompe a condução das fibras aferentes C
desmielinizadas, que participam do centro sacral da micção. Esta dessensibilização do
neurônio sensitivo é de longa duração e reversível. A duração e o início de sua ação vão
depender da dose e do tempo de exposição à substância (FRASER et al., 2002).
Quimicamente, a RTX é um éster forbol (APPENDINO e SZALLASI, 1997),
pertencente ao grupo homovanil (um elemento estrutural importante para atividade
biológica). Os compostos pertencentes a este grupo são chamados de vanilóides.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
28
Com a RTX, a indução das correntes de despolarização nervosa é lenta, no entanto,
com uma duração mais prolongada em relação a CPS. Isto ocorre porque a RTX tem massa
molecular maior (628,7) do que a CPS (305,1), o que torna a sua penetração na mucosa
vesical muito mais lenta. A CPS se liga aos receptores rapidamente, o que faz abrir os
canais ligados a estes receptores quase que simultaneamente, ao passo que a RTX ocupa
os receptores gradualmente (FRASER et al., 2002).
A primeira conseqüência da ligação da RTX com os receptores vanilóides presentes
no urotélio é a excitação neuronal devido à liberação de neuropeptídeos como a substância
P (SP), peptídeo gene-relacionado à calcitonina (CGRP) e interleucina (IL). A liberação
destes neuropeptídeos gera respostas nos vasos sangüíneos, mastócitos e linfócitos,
levando à inflamação neurogênica e reações alérgicas de hipersensibilidade, percebidas
como sensação de queimação e dor (SZALLASI e BLUMBERG, 1995). Este fenômeno
ocorre em segundos e consiste em uma despolarização e geração de um potencial de ação.
Este estágio inicial é admitido ser largamente dependente do influxo de sódio. A excitação
neuronal é seguida por uma temporária dessensibilização.
A RTX pode eliminar a necessidade de tratamento cirúrgico ou o uso de outros
fármacos no tratamento de disfunções miccionais em pacientes com lesões na medula
(FRASER et al., 2002). Seus efeitos podem ser neutralizados pelo antagonista dos
receptores TPRV 1, n-4-t-Butilfenil-4-3-cloropiridina-2-il-tetrahidropirazina-1(2H)-
carboxamida (BCTC), que é um inibidor potente da ativação do receptor induzida por ácido
ou CPS ou RTX em ratos. A RTX também exerce um papel analgésico nos modelos de
estudo de dor inflamatória e neuropática em ratos (SAITOH et al., 2008).
Em estudo realizado em mulheres com bexiga hiperativa, a instilação direta a
cavidade vesical de solução 50 a 100 nM de RTX em solução alcoólica a 10% durante 30
minutos mostrou como efeitos colaterais apenas prurido ou leve desconforto durante os
primeiros minutos do tratamento. Foi verificada uma diminuição entre 33 a 58% da
freqüência miccional, com resultados logo a partir do primeiro dia de administração, e os
efeitos puderam ser observados até 3 meses após a aplicação inicial (CRUZ et al.,1997).
LAZZERI et al., (1997) observaram aumento da capacidade vesical média de 175 para 281
mL imediatamente após a instilação direta de RTX intravesical porém com redução dos
efeitos após 4 semanas. Entretanto, neste estudo foi utilizada uma dose de 10 nM de RTX,
muito inferior a usada em outros trabalhos (PALMA et al., 2004; APOSTOLIDIS et al., 2006;
SILVA et al., 2000). APOSTOLIDIS et al. (2006) realizaram estudos em humanos com
hiperatividade vesical, utilizando a dose única intravesical de 50 nM e verificaram melhora
dos sintomas de urgência e frequência miccional, melhora dos parâmetros urodinâmicos e
da qualidade de vida por até 6 meses.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
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Estes estudos vêm trazer uma perspectiva diferenciada quanto ao uso da RTX para
os pacientes com incontinência urinária por hiperatividade vesical, observando-se resposta
de até 6 meses com instilação do fármaco puro, diretamente na cavidade vesical.
1.6. LIPOSSOMAS (LIP)
Como os fármacos utilizados no tratamento da bexiga hiperativa são extremamente
irritantes, faz-se necessário o desenvolvimento de formulações que minimizem estes efeitos,
contribuindo para a melhora terapêutica.
Os lipossomas foram descobertos em 1961 por Alec D. Bangham, durante
experimentos envolvendo fosfolipídios e coagulação sanguínea. A partir daí, eles têm se
tornado ferramentas versáteis nas áreas de biologia, bioquímica e medicina (TORCHILIN et
al., 2005).
Os lipossomas são preparados a partir do glicerofosfolipídio fosfatidilcolina e
colesterol e podem possuir diâmetro médio entre 20 a 5000 nm. São classificados de acordo
com o número de camadas lipídicas em lipossoma unilamelar que possuem uma bicamada
lipídica ou em lipossoma multilamelar que apresenta mais de uma bicamada lipídica. São
vesículas de formato esférico compostas de camadas lipídicas concêntricas, separadas por
compartimentos aquosos. Este arranjo espacial ocorre devido à polaridade do fosfolipídio
que apresenta regiões hidrofóbicas e hidrofílicas. Estes sistemas tem sido utilizados como
veículos para liberação de fármacos, tendo aplicação no tratamento contra o câncer, na
terapia gênica, em doenças infecto-parasitárias e no desenvolvimento de vacinas, entre
outros, pelo fato destas vesículas se incorporarem à superfície celular e se fundirem às
mesmas. São sistemas altamente versáteis, cujo tamanho, lamelaridade, superfície,
composição lipídica, volume e composição do meio aquoso interno podem ser manipulados
em função dos requisitos farmacêuticos e farmacológicos. Estas propriedades também são
influenciadas por parâmetros externos tais como temperatura, força iônica e pela presença
de certas moléculas. Os lipossomas são considerados sistemas interessantes devido às
propriedades gerais de surfactante, pela sua estabilidade estrutural na diluição, pela
variação da permeabilidade da bicamada às diferentes moléculas, pela capacidade de
encapsular tanto substâncias hidrofílicas como hidrofóbicas e liberá-las no ambiente
desejado. As moléculas hidrofílicas são armazenadas nas camadas aquosas, localizadas
entre as bicamadas lipídicas e as moléculas hidrofóbicas no interior da bicamada
(FRÉZARD et al., 2005).
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
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Os lipossomas puros injetados via intravesical podem reforçar a barreira urotelial de
um epitélio disfuncional e aumentar a resistência à penetração de agentes irritantes,
funcionando como uma camada extra de proteção ao urotélio (FRASER et al., 2003).
A esterilização dos lipossomas é preferencialmente realizada com filtros Millipore,
com poros de tamanho não maior que 0,22 nm uma vez que outros procedimentos podem
destruir a integridade da bicamada lipídica. Os filtros são feitos de materiais diferentes como
em placa de asbesto, porcelana, filtro de Pasteur e discos de vidro. Os fatores que impedem
a passagem de organismos são a porosidade, a carga elétrica do filtro, a carga elétrica dos
microrganismos e a natureza do fluido a ser filtrado (KELKAR, 2002).
Um dos maiores desafios para o desenvolvimento de sistemas lipossomais é a
estabilidade dos mesmos. Um sistema coloidal pode ser estabilizado eletrostaticamente,
estearicamente ou eletroestearicamente. Adicionalmente, os colóides podem sofrer outras
modificações como fusão ou mudança de fase após a agregação. A estabilidade física é
obtida pela preservação do tamanho dos lipossomas e da quantidade de material
encapsulado. Este tipo de estabilidade dependerá de características termodinâmicas e de
propriedades coloidais do sistema (BATISTA et al., 2007).
Os fosfolipídios são suscetíveis à hidrólise e oxidação, pois podem conter ácidos
graxos insaturados. A maioria das dispersões lipossomais fosfolipídicas utilizadas contém
uma cadeia acila insaturada como parte da estrutura molecular. Estas cadeias são
vulneráveis à degradação oxidativa. A reação de oxidação pode ocorrer durante o preparo, o
armazenamento ou durante o uso. A deterioração oxidativa dos lipídios encerra um
processo complexo envolvendo a degeneração de radicais livres e resulta na formação de
peróxidos cíclicos e hidroperóxidos (KELKAR et al.,2002).
A instabilidade dos lipossomas no plasma parece ser o resultado da transferência
dos lipídios para a albumina e para lipoproteínas de alta densidade. Adicionalmente, parte
da proteína é transferida das lipoproteínas para os lipossomas. Tanto a lecitina como o
colesterol também realizam trocas com as hemácias. Os lipossomas preparados com
fosfolipídios de cadeia mais longa são mais estáveis tanto em soluções tampão como no
plasma. A estabilidade lipossomal no plasma aumenta em proporção direta à taxa de
colesterol presente nos lipossomas (KELKAR et al., 2002).
O volume interno, eficiência da encapsulação, lamelaridade, potencial zeta, diâmetro
e distribuição de tamanho dos lipossomas são parâmetros geralmente estudados durante o
desenvolvimento de formulações lipossomais (YU et al., 1999).
O tamanho médio e a distribuição dos lipossomas são parâmetros importantes de
propriedades físicas e destino biológico dos lipossomas e das substâncias encapsuladas. O
tamanho dos lipossomas, assim como o índice de polidispersividade, pode ser obtido
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31
através da técnica de difusão de luz dinâmica (Dynamic Light Scattering), utilizando um
sistema computadorizado (KELKAR et al., 2002).
O potencial zeta é uma propriedade física importante para verificação da estabilidade
de suspensões e dispersões. Esta análise traz informações sobre o potencial de membrana
das vesículas lipossômicas (FERREIRA et al., 2005). A estabilidade de um sistema coloidal
é determinada pela soma das forças atrativas de Van der Walls e a força repulsiva da dupla
camada elétrica que existe entre as partículas. O resultado deste equilíbrio
(atração/repulsão) pode gerar um residual repulsivo, o qual previne que duas partículas se
aproximem umas das outras e se fundam. Caso exista uma colisão entre as partículas com
energia suficiente para transpor esta barreira repulsiva, ocorre a adesão entre as mesmas,
iniciando o processo de floculação. Entretanto, partículas que possuam repulsão alta o
suficiente, a dispersão resistirá a floculação e o sistema coloidal permanecerá estável
(BARCHINI et al., 2000).
Outros métodos, tais como, microscopia de luz e microscopia eletrônica com
congelação-fratura também podem ser utilizados para caracterização da distribuição de
vesículas multilamelares de grande tamanho e observação da estrutura morfológica dos
lipossomas.
1.7. AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA
A avaliação das modificações histomorfológicas no urotélio após a administração
intravesical de fármacos é realizada utilizando modelo animal.
SHUPP-BYRNE (1998), comparou grupos de ratos com e sem lesão da medula
espinhal, tratados com capsaicina (1 mM) em etanol. Os animais foram avaliados em 30
minutos, 1, 3 e 7 dias após a instilação intravesical. Nas secções do urotélio coradas com
hematoxilina/eosina e corante específico para mucina, foi verificado que a capsaicina
produziu um adelgaçamento do epitélio e edema submucoso. No grupo controle (etanol)
também foram verificadas as mesmas alterações, porém em grau menor que no grupo da
capsaicina. Não houve diferença entre o grupo com a medula seccionada e o controle. O
grau máximo de alteração foi verificado após 30 minutos, e continuou no grupo de 1 dia, e a
recuperação parcial foi notada após 3 dias. A recuperação completa foi observada no grupo
do 7º dia.
Em trabalho realizado por VERIT et al. (2002) foram estudadas as alterações
uroteliais após 5 aplicações intra-vesicais de capsaicina em ratas fêmeas sendo avaliadas
após 13 dias. Segundo os autores, as alterações foram semelhantes a uma cistite química,
provocando lesão urotelial, edema submucoso, ectasia vascular, congestão vascular e
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32
adelgaçamento do epitélio, porém não evidenciando ulceração da mucosa vesical. Foi
verificado infiltração eosinofílica em 25% dos casos.
Outro estudo avaliando a reação inflamatória da capsaicina em solução 1 mM no
epitélio vesical mostrou moderado grau de recuperação após 3 dias; no 7º dia, o epitélio
mostrava-se semelhante ao dos ratos do grupo controle (BYRNE et al., 1998) .
Em estudo realizado em coelhas, com a administração intravesical de oxibutinina
pura e outro grupo com oxibutinina com excipientes (comprimido macerado), diariamente
durante 30 dias (dose de 1 mg/kg), quando comparado com o grupo controle (solução
salina), evidenciou-se uma incidência de infiltrado eosinofílico nos cortes histológicos do
grupo de oxibutinina com excipientes (5/9 animais). A reação inflamatória observada foi
classificada como leve com predominância do infiltrado linfocítico, apresentando também
neutrófilos, porém de forma localizada na bexiga. A urina foi submetida a cultura após o
procedimento para afastar os casos de cistite (LANDAU et al., 1995).
Em outro estudo, foram analisadas alterações histológicas no urotélio de pacientes
com bexiga hiperativa após a injeção de toxina botulínica no músculo detrusor da bexiga. As
biópsias foram realizadas antes da aplicação, 4 e 16 semanas após a instilação. Foram
verificados sinais de inflamação crônica em 59,1% das biópsias basais, em 67,6% das
biópsias após a primeira aplicação e em 86,4% das biópsias realizadas em pacientes
submetidos a aplicações repetidas de toxina botulínica. Reação de fibrose foi encontrada em
2,2% dos pacientes e infiltrado eosinofílico foi encontrada predominantemente nos pacientes
submetidos a injeções repetidas. Não foram verificadas alterações do tipo displasia ou
hiperplasia nos cortes histológicos. Não houve diferença histológica entre os grupos com
bexiga hiperativa idiopática e neurogênica (APOSTOLIDIS et al.,2008).
1.8 . URIANÁLISE
A avaliação da presença de lipídios na urina pode ser feita através da visualização
direta com a microscopia ótica e se apresentam como estruturas redondas e refringentes
além do tamanho variável o que facilita sua diferenciação dos eritrócitos (HEINZ, 1993). A
gordura na urina, ou simplesmente, lipidúria, pode existir em situações patológicas como na
síndrome nefrótica, onde vêm acompanhadas de cilindros (figura 4B). Igualmente podem se
apresentar em processos degenerativos ou necrose, eclampsia, diabetes mellitus,
glomerulonefrite e em casos de embolia gordurosa após traumas, entre outros (GRAFF,
1987).
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33
Figura 4. Avaliação de presença de lipídios na urina. (A) gotículas de gordura, evidenciando
a presença do duplo halo; (B) gotículas de gordura organizadas em cilindros; (C) ésteres e
colesterol ou colesterol livre, visualizados sob luz polarizada, gerando imagens do tipo
“Cruz-de-Malta; (D) cristal de colesterol.
Fonte: HEINZ et al., 1994.
As gotículas de gordura presentes na urina aparecem de cor amarelo-castanho e
quando submetidas a coloração de Sudan-III apresentam-se com uma cor vermelho-
alaranjado. Gotículas de gordura incorporadas a uma célula ou cilindro ou flutuando
livremente são compostas por ésteres de colesterol ou por colesterol livre e são
anisotrópicas, formando imagens do tipo “Cruz de Malta” quando sob luz polarizada, mas
não se tingem com corantes específicos para gordura (Figura 4C). As gotículas que não
polarizam a luz, mas se coram com o Sudan III ou com o Oil Red O são formadas por
triglicérides ou por gordura neutra (HEINZ, 1994).
Os lipossomas são triglicerídeos, sendo, portanto possível a visualização dos
mesmos em amostras de urina coradas com Sudan-III.
Os cristais de colesterol (Figura 4D) formam quadrados incolores de tamanhos
variados e ângulos característicos e conservados. Sob luz polarizada podem apresentar
uma variedade de cores. Estes cristais se dissolvem facilmente em éter, clorofórmio ou
A
B
C
D
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34
álcool. São muito raros e predominam na quilúria, quando se observa a obstrução do fluxo
linfático abdominal, como é no caso de tumores ou da filariose (GRAFF, 1987).
A urinálise também serve como critério para exclusão de animais com infecção
vesical. A infecção pode ser uma complicação decorrente do procedimento de manipulação
das vias urinárias através do cateter e pode acontecer mesmo após a antibioticoprofilaxia. A
ceftriaxona pode ser administrada pela via intra-muscular, com penetração nas vias urinárias
e seu espectro de ação atinge a maioria das bactérias que comumente acometem o trato
genito-urinário, tais como, a Escherichia coli, Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Proteus sp.,
Enterobacter sp., Enterococcus sp., Staphylococcus sp. e Serratia marcescens
(MONTELLA, 2006). Portanto, este fármaco pode ser utilizado como profilaxia contra
infecção por manipulação do trato urinário no presente estudo.
1.9 – REFERÊNCIAS
ANDERSSON, K. E., CHAPPLE, C. R. Oxybutynin And The Overactive Bladder. World
Journal of Urology, 19, p. 319–323, 2001.
APOSTOLIDIS, A., JACQUES, T. S., FREEMAN, A.,KALSI, V., POPAT, R., GONZALES, G.,
DATTA, S. N., GHAZI-NOORI, S., ELNEIL, S., DASGUPTA, P., FOWLER, C. J. Histological
Changes In The Urothelium And Suburothelium Of Human Overactive Bladder Following
Intradetrusor Injections Of Botulinum Neurotoxin Type A For The Treatment Of Neurogenic
Or Idiopathic Detrusor Overactivity. European Urology, 53, p.1245–1253, 2008.
APPENDINO, G., SZALLASI, A. Euphorbium: Modern Research On Its Active Principle,
Resiniferatoxin, Revives An Ancient Medicine. Life Science, 60, p. 681-696, 1997.
ATIEMO, H., WYNES, J., CHUO, J., NIPKOW, L., SKLAR, G. N., CHAI, T. C. Effect Of
Botulinum Toxin On Detrusor Overactivity Induced By Intravesical Adenosine Triphosphate
And Capsaicin In A Rat Model. Urology, 65 (3), p. 622-626, 2005.
AVELINO, A., CRUZ, F. Peptide Immunoreactivity And Ultrastructure Of Rat Urinary Bladder
Nerve Fibers After Topical Desensitization By Capsaicin Or Resiniferatoxin. Autonomic
Neuroscience: Basic and Clinical ,86 p. 37-46, 2000.
BARCHINI, H. P., LEEUWEN, V., LYKLEMA, J. Eletrodynamics of Liposome Dispersions;
Langmuir , 16, p. 8238-8247, 2000.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
35
BARROSO, U.Jr., MACEDO, A.Jr., SROUGI, M. Efeitos Tópicos Da Oxibutinina Intravesical.
Artigo de Revisão EPM, Volume IV- 8ª Edição, Outubro-Dezembro/2000.[on line]. Disponível
na Internet via www url: http://www.uronline.unifesp.br/uronline/ed1000/oxibutinina.htm ,
arquivo capturado em 10 de dezembro de 2008.
BATISTA, C. M., CARVALHO, C. M. B., MAGALHÃES, N. S. S. Lipossomas E Suas
Aplicações Terapêuticas: Estado Da Arte. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas,
43(2), p.167-179, 2007.
BONEY W. W., ROBINSON R. A., THEOBALD R. J. JR. Topical Effect Of Intravesical
Oxybutinin. Journal of Urology, 150, p.1522-1525, 1993.
BRENDLER, C. B.; RADERAUGH, L. C.; MOHLER, J. Topical Oxybutynin Chloride For
Relaxation Of Dysfunctional Bladders. Journal of Urology, 141, p.1350-1352, 1988.
BYRNE, D., DAS, J., SEDOR, B. , HUANG, D. , RIVAS, H. , FLOOD, W. , DE GROAT, M.,
JORDAN, M., CHANCELLOR, P. Effect Of Intravesical Capsaicin And Vehicle On Bladder
Integrity In Control And Spinal Cord Injured Rats . The Journal of Urology,159 (3), p. 1074 –
1078, 1998.
CHANCELLOR, M.B., DE GROAT, W.C. Intravesical capsaicin and resiniferatoxin therapy:
Spicing Up The Ways To Treat The Overactive Bladder. The Journal of Urology, 162(1), p.3-
11, 1999.
CHAPPLE, C. R., KHULLAR, V., GABRIEL, Z., MUSTON, D., BITOUN, C.E., WEINSTEIN,
D. The Effects of Antimuscarinic Treatments in Overactive Bladder: An Update of a
Systematic Review and Meta-Analysis. European Urology. 54, p.543–562, 2008.
CRAFT, R.M., COHEN, S.M., PORRECA, F. Long Lasting Desensitization Of Bladder
Afferents Following Reseniferatoxin And Capsaicin In The Rat. Pain , 61, p.317-323, 1995.
CRUZ, F., GUIMARAES, M., SILVA, C., REIS, M. Suppression Of Bladder Hyperreflexia By
Intravesical Resiniferatoxin [letter]. Lancet. 350, p. 640-641, 1997.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
36
CRUZ, F., GUIMARAES, M., SILVA, C. Desensitization Of Bladder Sensory Fibers By
Intravesical Capsaicin Has Long-Lasting Clinical And Urodynamic Effects In Patients With
Hyperactive Or Hypersensitive Bladder Dysfunction. The Journal of Urology. 1997;157:585 -
589.
DE GROAT, W.C., KAWATANI, M., HISAMITSU, T. - Mechanisms Underlying The Recovery
Both Urinary Bladder Function Following Spinal Cord Injury. J. Autonomic Nervous System,
30, p. 71-77, 1990.
DE RIDDER, D., CHANDRAMANI, V., DASGUPTA, P., VAN POPPEL, H., BAERT, L.,
FOWLER, C. J. Intravesical Capsaicin as a Treatment for Refractory Detrusor Hyperreflexia:
A Dual Center Study With Long Term Follow-up. Journal of Urology, parte 2, 155, p. 2087,
1997.
FORD, A.P.D.W., GEVER, J.R., NUNN, P.A., ZHONG, Y., CEFALU, J.F., DILLON, M.P.,
COCKAYNE, D.A. Purinoceptors as Therapeutic Targets For Lower Urinary Tract
Dysfunction. British Journal of Pharmacology ,147, S132–S143, 2006.
FRASER, M.O.,
LAVELLE, J.P., SACKS, M.S., CHANCELLOR, M.B. The Future of Bladder
Control Intravesical Drug Delivery, a Pinch of Pepper, and Gene Therapy Review. Urology ,
4(1), p. 1-11, 2002.
FRASER, M.O., CHUANG, Y.C., TYAGI, P., YOKOHAMA, T., YOSHIMURA, N., HUANG, L.
Intravesical Liposome Administration - A Novel Treatment For Hyperactive Bladder In The
Rat. Urology, 61, p. 656, 2003.
FRÉZARD, F., SCHETTINI, D.A. Liposomes: Physicochemical And Pharmacological
Properties, Applications In Antimony-Based Chemotherapy. Quimica Nova, 28, (3), p. 511-
518, 2005.
FOWLER, C. J., JEWKES, D.M.C., DONARD, W.J., LYNN, B., DE GROAT, W.C.
Intravesical Capsaicin For Neurogenic Bladder Dysfunction. Lancet, 339, p.1239, 1992.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
37
GIANNANTONI, A., DI STASI, S.M.,CHANCELLOR, M.B., COSTANTINI, E., PORENA, M.
New Frontiers in Intravesical Therapies and Drug Delivery. European Urology, 50, p. 1183–
1193, 2006.
GIRÃO, M.J.B.C. incontinencia urinária de esforço. In: GIRÃO, M.J.B.C., SARTORI, M.G.S.,
BARACAT, E.C., LIMA, G.R.(eds) Cirurgia Vaginal e Uroginecologia. 2 ed., cap 11, Ed
Artes Médicas , 2002.
GRABOVAC V., GUGGI, D., BERNKOP-SCHNURCH, A. Comparison Of The Mucoadhesive
Properties Of Various Polymers. Advanced Drug Delivery Reviews, 57 , p. 1713– 1723,
2005.
GRAFF, S.L., Analisis de Orina – Atlas Color. 1 ed. Cap 3. Ed Médica Panamericana,
1987.
HEINZ, R., ALTHOF, S. El Sedimento Urinario. Atlas – Técnicas de Estúdio – Valoración.
5 ed., cap 2 e cap 3. Editorial Medica Panamericana, 1994.
HOBLER, H.J., JANIG, W., KOLTZENBURG, M. Activation of unmyelinated afferent fibres y
mechanical stimulation and inflammation of the urinary bladder in the cat. Journal of
Physiology, 425, p. 545 – 562, 1990.
HOHLBRUGGER.G., LENTSCH,P. Intravesical ions, osmolality and ph influence the volume
pressure response in the normal rat bladder and this is more pronounced after DMSO.
European Urology ,11, p.127-30, 1985.
JR.O.S., ALMIRALL J.R. Extraction of capsaicins in aerosol defense sprays from fabrics.
Talanta, 67, p. 377–382, 2005.
KALSI,V., APOSTOLIDIS, A., GONZALES, G., ELNEIL, S., DASGUPTA, P., FOWLER, C.J.
Early effect on the overactive bladder symptoms following botulinum neurotoxin type a
injections for detrusor overactivity. European Urology, 54 , p. 181–187, 2008.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
38
KARNKA, R., RAYANAKORN, M., WATANESK, S., VANEESORN, Y. Optimization of high
performance liquid chromatographic parameters for the determination of capsaicinoid
compounds using the simplex method. Analytical Sciences, 18, p. 661-665, 2002.
KATZUNG, B.G. Bloqueadores dos receptores colinérgicos. In: KATZUNG, B.G. (ed)
Farmacologia Básica e Clínica. 5 ed., cap 8, Ed Guanabara Koogan, 1994.
KELKAR, V.S., GADAGE, R., GADAGE, A. Liposomes: slow release vehicles. Express
Pharma Pulse [on line]. Disponível na internet via url:
www.expresspharmaonline.com/20020808/drugdel.shtml - 08/08/2002. Arquivo capturado
em 31 de março de 2009.
KEREC, M., BOGATAJ, M.,VERANI, P., MRHAR A. Permeability of pig urinary bladder wall:
the effect of chitosan and the role of calcium. European Journal of Pharmaceutical Sciences,
25, p. 113- 121, 2005.
KIM, J.H., RIVAS, D.A., SHENOT, P.J., GREEN, B., KENNELY, M., ERICKSON, J.M.,
O´LEARY, M., YOSHIMURA, N., CHANCELLOR, M.B. Intravesical resiniferatoxin for
refractory detrusor hyperreflexia: a multicenter, blinded, randomized, placebo-controlled trial.
Journal of Spinal Cord Medicine, 26, p.358-363, 2003.
LABANA, S., PANDEY, R., SHARMA, S., KHULLER, G.K. Chemotherapeutic activity against
murine tuberculosis of once weekly administered drugs (isoniazid and rifampicin)
encapsulated in liposomes. International Journal of Antimicrobian Agents, 20, p.301-304,
2002.
LANDAU, E.H., FUNG, L.C.T., THORNER, P.S., MITTELM, M.W., JAYANTHI,
V.R.,CHURCHILL, B.M., McLORIE, G.A., STECKLER R.A., KHOURY, A.E. Histologic
studies of intravesical oxybutynin in the rabbit. Journal of Urology,153, p. 2022-2024, 1995.
LAZZERI, M., BENEFORTI, P., TURINI, D. Urodynamic effects of intravesical resiniferatoxin
in humans: preliminary results in stable and unstable detrusor. Journal of Urology, 158,
p.2093-2096, 1997.
LECCI, A., CARINI, F., TRAMONTANA, M. Urodynamic effects induced by intravesical
capsaicin in rats and hamsters. Autonomic Neuroscience Basic Clinics, 91, p.37–46, 2001.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
39
LEWIS, S.A. Epithelial electrophysiology. In: WILLS N.K., REUSS, L., LEWIS, S.A.(eds)
Epithelial Transport: A Guide To Methods And Experimental Analysis. 1ed, p. 93–117,
editors London: Chapman & Hall; 1996.
LISH, P.M., LABUDDE, J.A., PETERS, E.L., ROBBINS, S.I. Oxybutynin - A musculotropic
antispasmodic drug with moderate anticholinergic action. Arch Int Pharmacodyn, 156, p. 467,
1965.
MADERSCACHER, H., KNOLL, M. Intravesical application of oxybutynine: mode of action in
controlling detrusor hypereflexia. European Urology, 28, p. 340-344, 1995.
MANNES, A.J., BROWN D.C., KELLER J.,CORDES, L.,ECKENHOFF, R. G.,CAUDLE, R.
M.,IADAROLA, M. J., MENGC, Q. C. Measurement of resiniferatoxin in serum samples by
high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B, 823, p. 184–188,
2005.
MONTELLA,J.M. Tratamento da bexiga hiperativa. In: BENT, A.E.,CUNDIFF, G.W.,
OSTERGARD, D.R., SWIFT, S.E. Ostergard, Uroginecologia e Disfunções do Assoalho
Pélvico. 5ª ed cap.20, Ed. Guanabara Koogan, 2006.
NICOLI, S., PENNA, E., PADULA, C., COLOMBO, P.,SANTI, P. New transdermal
bioadhesive film containing oxybutynin:in vitro permeation across rabbit ear skin.
International Journal of Pharmaceutics , 325 , p. 2–7, 2006.
OLIVEIRA, R.B., GIMENEZ, V.M.M., GODOY, S.A.P. Intoxicações com espécies da família
euphorbiaceae. Revista Brasileira de Biociências, 5, supl. 1, p. 69-71, jul. 2007.
PALMA, P., AGULLO, E.M., THIEL, M. Síndrome da bexiga hiperativa. In: PALMA,
P.,NETTO Jr, N.R.(eds) Uroginecologia Ilustrada. 1 ed, cap 3 Ed Roca , 2005.
PANDITA, R.K., ANDERSSON, K.E. Intravesical adenosine triphosphate stimulates the
micturition reflex in awake, freely moving rats. The Journal of Urology,168, p. 1230–1234,
2002.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
40
PARSONS, C. L., BOYCHUK, D., JONES, S., HURST, R., CALLAHAN, H., Bladder surface
glycosaminoglycans: an epithelial permeability barrier. The Journal of Urology,143(1), n.1,
p.139-142, 1990.
RIBEIRO, R.M., ROSSI, P., BARROS, J.P. Hiperatividade do detrusor In: GIRÃO, M.J.B.C.,
SARTORI, M.G.S., BARACAT, E.C., LIMA, G.R.(eds) Cirurgia Vaginal e Uroginecologia. 2
ed., cap 12, Ed Artes Médicas , 2002.
STANTON,S.L Introduction to the preoperative evaluation of incontinent patient . In:
OSTERGARD DR & BENT AE (eds). Gynecologic Urology and Urodynamics: Theory
and Practice. 2ª ed, chap. 3, Baltimore, Willians & Wilkins, p. 69, 1985.
STASKIN, D.R. Overactive bladder in the elderly: a guide to pharmacological management.
Drugs Aging , 22, p.1013–1028, 2005.
TELOKEN, C.,WEBER, F.A., CARAVER, F., TELOKEN, P.E., MORAES, J.F.,SOGAN,
P.R.,GRAZIOTIN, T.M., Overactive bladder: prevalence and implications in brazil. European
Urology, 49(6), p. 1087-1092, 2006.
TYAGI, P., CHANCELLOR, M.B., LI, Z., GROAT, W.C., YOSHIMURA, N., FRASER, M.O.,
HUANG, L. Urodynamic and immunohistochemical evaluation of intravesical capsaicin
delivery using thermosensitive hydrogel and liposomes. The Journal of Urology,171, p.483-
489, January 2004.
SAITOH, C., KITADA, C., UCHIDA, W., CHANCELLOR, M.B., DE GROAT, W.C.,
YOSHIMURA N. The differential contractile responses to capsaicin and anandamide in
muscle strips isolated from the rat urinary bladder. European Journal of Pharmacology, 570,
p. 182–187, 2007.
SAITOH, C., CHANCELLOR, M.B., DE GROAT W.C., YOSHIMURA, N. Effects of
intravesical instillation of resiniferatoxin on bladder function and nociceptive behavior in freely
moving, conscious rats . The Journal of Urology, 179, p. 359-364, January 2008.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
41
SPICER JR O., ALMIRALL, J.R. Extraction of capsaicins in aerosol defense sprays from
fabrics. Talanta, 67, p. 377–382, 2005.
THIEL M. Resiniferatoxina No Tratamento Da Instabilidade Do Detrusor Refratária Aos
Anticolinérgicos. Tese de Mestrado, UNICAMP/ Campinas, SP, Brasil, 2002.
TORCHILIN, V.P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carrier. Nature Rev.
Drug Disc London, 4, p. 145-160, 2005.
VERIT, A., ARSLAN, O., ZARDALI, I.,YENI, E.,UNAL, D. Topical Effects Of Intravesical
Capsaicin On Rat Bladder. Brazilian Journal of Urology, 28 (2), p. 154-158, 2002.
WEIN, A.J., RACKLEY, R.R.Overactive Bladder: A better understanding of pathophysiology,
diagnosis and management. The Journal of Urology,175, p. S5–S10, 2006.
YOKOYAMA, O., ISHIURA, Y., OHKAWA, M. Urodynamic effects of intravesical oxybutynin
chloride in conscious rats. The Journal of Urology, 155, p. 768-771, 1996.
YU, M., KRASNOPOL, S., STEPANOV,A.E., SHVETS, I. Some aspects of the technology for
liposomal medicinal preparations. Pharmaceutical Chemistry Journal, 33(10), p. 20–23,
1999.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
42
CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA BEXIGA DE RATAS
PRODUZIDAS POR OXIBUTININA E RESINIFERATOXINA EM SISTEMAS
LIPOSSOMAIS ADMINISTRADOS VIA INTRAVESICAL.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
43
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA BEXIGA DE RATAS
PRODUZIDAS POR OXIBUTININA E RESINIFERATOXINA
EM SISTEMAS LIPOSSOMAIS ADMINISTRADOS VIA
INTRAVESICAL
Lorena Magale Dantas Cirino
O uso de lipossomas para a liberação lenta de medicamentos tem apresentado resultados
promissores em diversas áreas da medicina. Neste estudo, a via intravesical foi utilizada
para a administração de lipossomas contendo fármacos, buscando comparar as alterações
histológicas causadas pela oxibutinina (OXI) e pela resiniferatoxina (RTX), associadas ou
não aos lipossomas. Os ensaios biológicos foram realizados em ratas da espécie Wistar
sendo instilados pela via intravesical através de catéter, oxibutinina (1,5 mM) ou
resiniferatoxina (100 nM) separadamente e associados a lipossomas. As bexigas foram
removidas e submetidas à análise histológica após 1, 7 e 60 dias após instilação das
formulações. Foram realizadas urinálises dos animais para verificar a presença de infecção
e de lipossomas durante o tempo de estudo. Como resultado, a RTX mostrou-se mais
agressiva, produzindo reação inflamatória atingindo todas as camadas da bexiga. Após 60
dias, verificou-se ainda a presença de alterações uroteliais, substituição do colágeno vesical
por fibrose e aderências abdominais, não vistas no grupo OXI. Os grupos contendo
lipossomas mostraram reação inflamatória mínima e dilatação vesical estatisticamente
significativa (p< 0,05) após os 60 dias de estudo. A urinálise confirmou a presença de
lipossomas na urina das ratas 60 dias após a administração intravesical das formulações.
Conclui-se que a RTX possui maior toxicidade vesical que a OXI. A administração
intravesical de OXI ou RTX em lipossomas minimizou a reação inflamatória, otimizando e
prolongando a presença destes fármacos na bexiga das ratas.
Palavras-chave: resiniferatoxina, oxibutinina, hiperatividade do detrusor, lipossomas,
tratamento intravesical, incontinência urinária.
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44
EVALUATION OF ALTERATIONS PRODUCED IN RAT
BLADDER BY OXIBUTININ AND RESIFINERATOXIN IN
LIPOSOMAL SYSTEMS FOR INTRAVESICAL
ADMINISTRATION
Lorena Magale Dantas Cirino
The use of liposomes for drug release has been presenting interesting results in many
medicine fields. In this study, intravesical liposome administration containing drugs was
used, in order to compare hystological changes caused by oxybutinin (OXI) and
resiniferatoxin (RTX) separately and associated to liposomes. The biological essay was
performed using Wistar female rats by instillation through intravesical catheter oxibutinin (1.5
mM) or resiniferatoxin (100 nM) solutions or in liposomes formulations. The bladders were
removed and submitted to histological analysis in 1, 7 and 60 days after instillation of
formulations. Urinalysis was made in order to verify the presence of infection and liposomes
during the study. RTX showed more bladder damage, with inflammatory reaction reaching all
bladder layers. After 60 days, there were urothelial alterations, collagen substitution by
fibrosis and also abdominal adherence, not seen in the OXI group. The liposome groups
showed minimal inflammatory reaction and statistically significative increased bladder size
after 60 days (p<0.05). Urinalysis confirmed liposome presence in urine of rat after 60 days
of intravesical administration of the formulations. Therefore, RTX produces more bladder
damage than OXI. The OXI or RTX intravesical administration in liposomes minimized
inflammatory reaction, optimizing and extending the drug effect on rats bladders.
Keywords: urinary incontinence, overactive bladder, liposomes, treatment, oxybutinin ,
resiniferatoxin.
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45
2.1. INTRODUÇÃO
A incontinência urinária interfere na vida pessoal e social da mulher causando-lhe
desconforto e constrangimento. Esta doença incide aproximadamente em 40% das
mulheres em menopausa, e uma das causas pode ser atribuída a Hiperatividade do
Detrusor (HD). Esta HD é definida como perda urinária pela presença de contrações
espontâneas ou desencadeada por manobras de esforço ou por estímulo dos órgãos dos
sentidos, durante o enchimento vesical, estando a paciente orientada a inibir a micção
(Sociedade Internacional de Continência, Comitê de Padronização, 1991).
A primeira escolha para o tratamento da HD é o uso de anticolinérgicos pela via oral,
sendo que este tratamento está associado a efeitos colaterais indesejáveis do tipo boca
seca, constipação e visão turva (BENT et al., 2006). Tem se procurado vias alternativas de
administração dos medicamentos, buscando minimizar seus efeitos colaterais, aumentar a
adesão das pacientes ao tratamento e visando a inclusão de pacientes que não toleram o
tratamento pela via oral. A instilação intravesical constitui-se uma excelente via pela ação do
medicamento diretamente no órgão-alvo, minimizando os efeitos colaterais sistêmicos do
medicamento (GIANNANTONI et al., 2006).
A oxibutinina (OXI) é um anti-colinérgico capaz de inibir as contrações do músculo
detrusor que tem sido extensivamente utilizado no tratamento de pacientes com bexiga
hiperativa (ANDERSSON E CHAPPLE, 2001). A resiniferatoxina (RTX) é um fármaco que
possui atividade agonista dos receptores vanilóides, resultando em dessensibilização e
bloqueio neuromuscular, utilizando doses extremamente baixas (SZALLASI et al., 1996). A
RTX tem seu uso indicado não só nos casos refratários de HD, mas também nos casos
idiopáticos (NICOLI et al., 2006) e se mostra como um fármaco promissor no campo da
uroginecologia. Estes fármacos, porém, possuem uma ação agressiva ao urotélio, podendo
gerar desconforto ao paciente (HASHIM et al., 2005). Além disso, a RTX possui baixa
solubilidade em água, sendo na maioria das vezes dissolvida em etanol a 30%, que também
tem efeito agressor na mucosa vesical (TYAGI et al., 2006). Desta forma, a busca por
formulações que eliminem a utilização de solventes tóxicos e que protejam o urotélio da
ação agressiva do fármaco tem sido proposta para minimizar estes efeitos adversos.
O objetivo deste estudo foi avaliar sistemas lipossomais contendo RTX e OXI
verificando as possíveis alterações causadas no urotélio pela administração intravesical e a
presença destes na urina após 60 dias da administração.
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46
2.2. MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES INTRAVESICAIS
A solução de oxibutinina (OXI) foi preparada na concentração de 1,5 mM em salina
(YOKOYAMA et al., 1996) para instilação direta. A solução de resiniferatoxina (RTX)
utilizada para administração intravesical em ratas foi preparada na concentração de 100 nM
de RTX em etanol diluído a 30% em salina (AVELINO e CRUZ, 2000; APOSTOLIDIS et al.,
2006).
Os lipossomas foram preparados adicionando o fosfolipídio da Nanosolv
(fosfatidilcolina 75% /Lipoid GMBH/ Lote 776095-1/ Gerbras), em 10 mL das soluções em
etanol diluído a 30% em salina contendo OXI ou RTX. A proporção utilizada de
fármaco:fosfolipídio foi de 1:10 (m:m). As dispersões foram submetidas à agitação mecânica
até sua total homogeneização. O solvente foi eliminado em rotaevaporador até formar uma
película na superfície do recipiente (AVELINO e CRUZ, 2000; FRÉZARD et al., 2005).
O filme formado foi re-dissolvido utilizando soro fisiológico a 0,9%. A reconstituição
gerou uma dispersão de cor branca que foi passada no filtro de nylon Milipore® de 0,22 µm
para limitar o tamanho das vesículas formadas (processo de extrusão) sem destruir as
vesículas e ao mesmo tempo realizar a esterilização a frio da formulação (KELKAR et al.,
2000). A dispersão final foi acondicionada a 4ºC em frascos âmbar até a instilação
intravesical nas ratas. As concentrações finais das formulações lipossomais foram de 15 mM
de OXI e 100 nM de RTX .
Uma formulação de lipossoma (10 mg.mL
-1
) sem fármacos também foi obtida pelo
mesmo procedimento descrito anteriormente.
2.2.2. AVALIAÇÃO DO TAMANHO DE PARTÍCULA E ÍNDICE DE POLIDISPERSIVIDADE
O tamanho dos lipossomas e o índice de polidispersividade foram determinados
através da técnica de difusão de luz dinâmica (Dynamic Light Scattering - DLS), utilizando
um sistema computadorizado Malvern Zetasizer Nanoseries (Nano-ZS - Malvern, UK) em
comprimento de onda de 633 nm e temperatura de 25°C. A amostra foi diluída na proporção
de 1:10 em água destilada, sendo realizado o procedimento com 3 e 42 dias após a
preparação do lipossoma.
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47
2.2.3. ADMINISTRAÇÃO INTRAVESICAL
Os animais utilizados foram ratas Wistar, com idade de dois meses, pesando 190 ± 30
g. Foram utilizados 6 animais em cada subgrupo, os quais foram submetidos aos
procedimentos para administração intravesical das formulações e sacrificados em diferentes
tempos como descrito no tabela 1. Os grupos salina (SAL) e lipossoma (LIP) foram
utilizados como controles negativos.
Tabela 1. Grupos de animais submetidos à administração intravesical
Tempo de Estudo
Grupos
1 dia 7 dias 60 dias
Solução salina a 0,9% SAL-1 SAL-7 SAL-60
Lipossoma (10 mg.mL
-1
) LIP-1 LIP-7 LIP-60
Oxibutinina 1,5 mM OXI-1 OXI-7 OXI-60
Resiniferatoxina 100 nM RTX-1 RTX-7 RTX-60
Oxibutinina em lipossoma 15 mM OXILIP-1 OXILIP-7 OXILIP-60
Resiniferatoxina em lipossoma 100 nM RTXLIP-1 RTXLIP-7 RTXLIP-60
As ratas foram mantidas em gaiolas com seis animais cada, identificadas e
separadas por grupo experimental e tiveram acesso a ração padrão Labina® e água ad
libitum. As recomendações da Lei Nacional nº 6.638 de 5 de novembro de 1979, para
manuseio de animais foram respeitadas, e o projeto aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Tiradentes através do Parecer Consubstanciado com número de
protocolo 060208.
As ratas foram submetidas à anestesia com quetamina na dose de 70 mg.kg
-1
e
midazolan na dose de 4 mg.kg
-1
, ambas sendo administradas pela via subcutânea, segundo
o protocolo do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da UFMG para
anestesia em animais de pequeno porte. Em seguida, foi administrado antibiótico ceftriaxone
intramuscular na dose de 57 mg.kg
-1
para a prevenção de cistite pela manipulação do trato
genito-urinário. Após 30 minutos foi realizada a limpeza do meato uretral com povidine
tópico, e então se realizou a cateterização vesical, utilizando catéter intra-venoso nº22. O
cateter foi totalmente introduzido para alcançar a bexiga do animal. Uma vez o catéter
posicionado, a bexiga foi preenchida com as formulações anteriormente descritas.
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48
2.2.4 ANÁLISE DO SEDIMENTO URINÁRIO
A coleta do material foi realizada de forma direta. Os animais reagem imediatamente
com a liberação dos esfíncteres no momento que são manipulados. Desta forma, após
higienização de superfície de aço inox com álcool 70º, os animais foram manipulados e o
conteúdo vesical eliminado sobre esta superfície. As fezes foram depositadas em local
diferente da urina também sobre a mesma superfície. A urina foi aspirada com uma seringa
estéril e colocada em recipiente adequado para urianálise. Os exames foram realizados
imediatamente após a coleta.
Este procedimento foi realizado após a instilação intravesical das formulações e
foram coletadas amostras de urina das ratas no 15º, 30º, 37º, 45º, 52º e 60º dias, com
tempo experimental de 60 dias.
O exame foi realizado utilizando microscópio óptico no aumento de 100x para
avaliação da presença de células e cristais e 400x para verificação da presença de piócitos,
bactérias e gotículas de gordura. Foram utilizadas tiras reativas para urinálise Biocolor
(Bioeasy, lote URS 7090057) para a identificação da densidade urinária, sangue, pH, nitrito
e leucócitos.
Foi assumido como critério de exclusão a presença de bactérias numerosas, piúria
ou hematúria tanto pela microscopia como pela tira de urianálise.
A presença de lipossomas na urina foi realizada pela visualização direta de gotículas
de gordura livres na amostra, de coloração amarelo-acastanhada, evidenciando a presença
do duplo halo. Para melhor visualização das gotículas, utilizou-se 2 gotas da coloração
Sudam III sobre a lâmina com a amostra de urina, homogeneizou-se a amostra, a mesma
foi submetida a aquecimento até 50ºC para observação no microscópio óptico. As gotículas
gordurosas após coloração com Sudam III devem se apresentar em tom vermelho-
alaranjado. Foram consideradas positivas as amostras contendo gotículas de gordura
compatíveis com as características descritas por HEINZ et al., 1994.
2.2.5 EXTRAÇÃO E HISTOLOGIA DA BEXIGA DOS RATOS
As ratas foram sacrificadas por deslocamento cervical. O procedimento de dissecção
foi guiado com auxílio de cateterismo vesical. A laparotomia mediana baixa foi realizada,
seguida de abertura da parede abdominal por planos e afastamento dos músculos
abdominais, exposição da bexiga e ressecção da mesma na sua totalidade.
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49
Os animais foram sacrificados em 1, 7 e 60 dias após a instilação intravesical das
diferentes formulações.
As peças cirúrgicas excisadas foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10%
por um período mínimo de 24 h. Na macroscopia, o corte foi realizado no sentido
longitudinal, na região mediana da bexiga e realizou-se a aferição do tamanho das bexigas
em milímetros. A presença de focos hemorrágicos, de coloração vermelha a violácea, foi
classificada como 0, na ausência de focos hemorrágicos; 1+ quando a área hemorrágica
correspondia a menos de 50% da peça e 2+ quando a área hemorrágica correspondia a
mais de 50% da peça.
Após fixação as amostras foram desidratadas com etanol, diafanizadas com xileno e
banhadas em parafina. A última etapa foi conduzida por inclusão na parafina. Cortes de
aproximadamente 3 µm de espessura foram realizados e os espécimes, processados de
acordo com diferentes protocolos de histoquímica (hematoxilina-eosina e picrossírius).
Para avaliação da morfologia e disposição das fibras colágenas depositadas na
parede da bexiga, secções histológicas foram submetidas previamente ao método de
coloração histoquímica do picrossírius e analisadas sob microscopia óptica com luz
polarizada para a descrição da fibroplasia detendo-se na identificação do colágeno.
As secções coradas com hematoxilina-eosina (HE) foram classificadas tanto na
porção superficial quanto profunda da parede vesical utilizando os parâmetros morfológicos
descritos na tabela 2.
Tabela 2. Classificação dos parâmetros microscópicos da reação inflamatória nas secções
da bexiga coradas em hematoxilina-eosina (HE).
Parâmetro
analisado
Classificação do parâmetro
Intensidade do
processo
inflamatório
células inflamatórias na parede da bexiga, independente de seu
fenótipo, constituírem:
+1: menos de 10% da população celular
+2: entre 10% a 50% da população celular
+3: mais de 50% da população celular.
Tipagem celular (N) neutrófilos; (E) eosinófilos; (L) linfócitos; (P) plasmócitos; (M)
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50
macrófagos; (G) células gigantes multinucleadas.
Categorização da
reação inflamatória
(fenótipo
inflamatório
predominante)
IA: Inflamação aguda: predominância de leucócitos
polimorfonucleares (N e/ou E).
IS: Inflamação subaguda: leucócitos polimorfonucleares (N e E) e
mononucleares (L, P e M) presentes em quantidade semelhante.
ICI: Inflamação crônica inespecífica: predominânica de L e/ou P.
ICE: Inflamação crônica específica (granulomatosa): predominância
de M e/ou G.
Edema (+) presente ou (-) ausente
Hiperemia (+) presente ou (-) ausente
Integridade do
urotélio
(+) íntegro ou (-) ulcerado
Necrose (+) presente ou (-) ausente
Outros (H) hialinização; (ME) metaplasia escamosa; (HE) hiperplasia
epitelial; (U) úlcera; (F) fibrose
2.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Foram utilizados os testes estatísticos ANOVA, seguido do teste de Tukey para os
valores encontrados na avaliação macroscópica entre os grupos em relação ao tamanho
das bexigas, considerando significativo o valor de p < 0,05.
2.3. RESULTADOS
2.3.1. AVALIAÇÃO DO TAMANHO DE PARTÍCULA E ÍNDICE DE POLIDISPERSIVIDADE
Os lipossomas contendo OXI e RTX apresentaram diâmetro médio de vesícula de
21,04 nm e 20,55 nm logo após a sua obtenção (Figura 5A e B). Após 42 dias do preparo,
foi observado que os lipossomas contendo resiniferatoxina (Figura 5B) apresentaram um
tamanho vesicular maior (50,75 nm) que o verificado no 3º dia.
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51
(A) (B)
Figura 5. Distribuição do tamanho das vesículas lipossomais contendo oxibutinina (A) e
resiniferatoxina (B).
O índice de polidispersividade da formulação de OXI não variou após 42 dias do
preparo, porém apresentou-se alto, em torno de 0,5. Na formulação contendo RTX houve
diminuição no índice de polidispersividade, ficando após 42 dias da obtenção das vesículas
menor que 0,3 (Figura 6).
0,379
0,509
0,285
0,518
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
RTXLIP OXILIP
Índice de Polidispersividade
3 dias 42 dias
Figura 6. Índice de polidispersividade das formulações lipossomais após 3 e 42 dias da
obtenção das mesmas.
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52
2.3.2. ACHADOS CIRÚRGICOS
A maioria dos animais não apresentou alterações na cavidade abdominal verificadas
durante a laparotomia. Somente no grupo RTX-7, três animais apresentaram aderência da
bexiga a outras estruturas abdominais e em dois destes animais foi verificada hematúria
macroscópica (Figura 7).
Neste estudo foram excluídos 4 animais (dois do grupo OXILIP-60 e dois do grupo
RTX-60) com o diagnóstico de infecção urinária após o procedimento de manipulação das
vias urinárias, 3 deles diagnosticados através da urianálise e 1 através do exame clínico
(piúria macroscópica). A piúria macroscópica foi evidenciada pela presença de secreção
purulenta na urina, visível a olho nu e ocorreu em um dos ratos do grupo de LIP-7. Estes
animais foram excluídos da análise histomorfológica, pois a instalação de uma infecção nas
vias urinárias pode alterar os achados histológicos.
Figura 7. Hematúria macroscópica e presença de aderências vesicais observadas durante a
dissecção em rato do grupo com resiniferatoxina após 7 dias.
2.3.3. MACROSCOPIA
Após avaliação macroscópica foram evidenciadas alterações no tamanho da bexiga
conforme pode ser observado nas figuras 8 a 11.
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53
0
2
4
6
8
10
12
SAL OXI OXILIP RTXLIP RTX LIP
Tamanho da bexiga (mm)
1 dia 7dias 60 dias
Figura 8. Avaliação do tamanho médio das bexigas dos animais (mm) 1, 7 e 60 dias após a
administração intravesical das formulações.
A figura 8 apresenta a média to tamanho das bexigas dos animais estudados ao
longo do tempo. Todos os grupos apresentaram tamanho de bexiga semelhante entre si
após um dia da instilação das formulações, com exceção do grupo de RTX-1 que
apresentou tamanho superior aos demais (p<0,05 em relação a todos os grupos).
O tamanho das bexigas do grupo SAL e LIP não apresentaram variação no decorrer
de 60 dias de experimento (p=0,0785). Os grupos LIP-1, LIP-7 e LIP-60 não mostraram
alteração significativa de diâmetro da peça em relação ao grupo controle (p= 0,4; p= 0,6 e
p=0,7 para cada grupo, respectivamente) (Figuras 8 e 9).
A OXI não apresentou interferência no tamanho da bexiga em 1 e 7 dias após
administração da mesma, sendo os valores encontrados semelhantes aos do grupo salina
(p=0,94 e p=0,082 respectivamente). Porém, a OXI-60 apresentou um pequeno aumento no
tamanho das bexigas, diferindo estatisticamente do grupo salina (p=0,0003), mas bem
menor que o encontrado no grupo OXILIP-60 (p = 0,001787). O grupo OXILIP apresentou
em 1 e 7 dias valores similares ao grupo SAL (p= 0,70 e 0,97), LIP-1 (p=1,00) e LIP-7 (p=
0,22), diferindo apenas após 60 dias de experimento (p<0,0004) (Figuras 8 a 11).
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54
Figura 9. Avaliação macroscópica das bexigas evidenciando tamanho (mm) e pontos
hemorrágicos no grupo salina (SAL) e em 1 (LIP-1), 7 (LIP-7) e 60 (LIP-60) dias após
instilação das formulações.
Figura 10. Avaliação macroscópica das bexigas evidenciando tamanho (mm) e pontos
hemorrágicos em 1, 7 e 60 dias após a instilação de oxibutinina (OXI) e resiniferatoxina
(RTX).
O efeito da RTX sobre o tamanho vesical já pode ser observada dentro das primeiras
24 horas após a administração, porém com diminuição gradativa nos tempos 7 e 60 dias. A
RTX apresentou inicialmente um aumento significativo da bexiga em relação aos demais
grupos, sendo que no tempo 7 dias o tamanho da bexiga diminuiu, porém ainda
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55
apresentando diferença significativa em relação ao grupo SAL (p=0,0001), mas não
sustentando este comportamento após 60 dias de administração da formulação, onde as
bexigas apresentaram tamanho estatisticamente igual ao controle (p=0,13) (Figuras 8 a 10).
Apenas o grupo RTX mostrou comportamento involutivo ao longo do tempo, com dilatação
imediata após 1 dia, comparável ao grupo RTXLIP-60 e voltando em 60 dias às dimensões
iguais ao grupo SAL (Figuras 8 a 11).
Os grupos tratados com lipossomas contendo RTX e OXI inicialmente não
apresentaram influência no tamanho da bexiga (1 e 7 dias) quando comparados ao grupo
salina e lipossoma (p>0,05). Após 60 dias, as formulações lipossomais contendo fármacos
apresentaram um aumento no diâmetro de bexiga semelhante, embora tenha sido
observada uma tendência de valores maiores para o grupo RTXLIP-60, porém sem
diferença estatística (p=0,09). Os dois grupos RTXLIP-60 e OXILIP-60 diferiram dos demais
grupos apresentando tamanho de bexiga maior (Figuras 8, 10 e 11).
Figura 11. Avaliação macroscópica das bexigas evidenciando tamanho (mm) e pontos
hemorrágicos em 1, 7 e 60 após a instilação de oxibutinina em lipossomas (OXILIP) e
resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP).
Em relação a presença de focos hemorrágicos, os grupos que apresentaram maior
potencial hemorrágico foram os da RTX. No grupo RTX-1, todas as bexigas foram
classificadas como +2, e apenas uma como +1 (Figura 12A). Após 7 dias, duas foram
classificadas como +2, três bexigas passaram a +1 e apenas uma foi classificada como 0
(Figura 12B). No grupo OXI-1, duas bexigas apresentaram focos hemorrágicos +1 e as
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
56
demais não apresentaram focos hemorrágicos (Figura 12A). Após 7 dias, todas foram
classificadas como 0 (Figura 12B). Em RTXLIP-1, 4 bexigas apresentavam focos +1, uma
como 0 e outra como +2 (Figura 12A), e sem focos hemorrágicos em todos animais após 7
dias (Figura 12B). No grupo OXILIP-1 apenas uma apresentou focos hemorrágicos do tipo
+1 (Figura 12A) e após 7 dias todas foram classificadas como 0 (Figura 12B). Em 60 dias,
nenhuma bexiga apresentou focos hemorrágicos macroscópicos.
(A) (B)
Figura 12. Intensidade de pontos hemorrágicos nas bexigas após instilação das formulações
(A) após 1 dia; (B) após 7 dias. Cada barra ( ) corresponde a um animal do grupo.
2.3.4. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
Na análise histológica das bexigas, observou-se importante diferença entre os
grupos. As principais alterações encontram-se expostas nas figuras 13, 14 e 15.
No grupo LIP-1 pode ser observado a integridade do epitélio e presença de
hiperemia acentuada (figura 13 LIP-1(A-B)), porém sem reação inflamatória evidente. O
grupo OXI-1 apresentou áreas de ulceração e adelgaçamento do urotélio (figura 13 OXI-
1(A)), com hemorragia intensa e hiperemia (figura 13 OXI-1 (B)). Neste grupo o infiltrado
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
57
inflamatório foi moderado, composto por linfócitos e plasmócitos com presença de edema
tecidual (figura 13 OXI-1(C)). No grupo RTX-1 foram observadas áreas de ulceração,
adelgaçamento do epitélio e necrose do mesmo (figura 13 RTX-1(A-C)). Este grupo
apresentou reação inflamatória aguda com presença de neutrófilos e mastócitos, além de
hemorragia intensa, hiperemia vascular e edema (figura 13 RTX-1(C-D)). No grupo OXILIP-1
tem-se um epitélio íntegro, porém, adelgaçado com discreto infiltrado inflamatório
mononuclear, presença de edema e hiperemia, porém, sem áreas de ulceração ou
hemorragia (figura 13 OXILIP-1(A-D)). O grupo RTXLIP-1 apresentou epitélio preservado,
escassas áreas hemorrágicas e infiltrado inflamatório crônico localizado, com presença de
edema moderado (figura 13 RTXLIP-1(A-D)).
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
58
Figura 13. Secções histológicas das bexigas após um dia da instilação das formulações com
a coloração Hematoxilina/eosina (aumento 100X) dos grupos salina (SAL-1), lipossoma
(LIP-1), Oxibutinina (OXI-1), Resiniferatoxina (RTX-1), Oxibutinina em lipossomas (OXILIP-
1), Resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP-1).
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
59
Figura 14. Secções histológicas das bexigas após 7 dias da instilação das formulações com
a coloração Hematoxilina/eosina (aumento 100X) dos grupos salina (SAL-7), lipossoma
(LIP-7), Oxibutinina (OXI-7), Resiniferatoxina (RTX-7), Oxibutinina em lipossomas (OXILIP-
7), Resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP-7).
No grupo LIP-7 foi observado epitélio íntegro e presença de hiperemia discreta
(figura 14 LIP-7(A)), sem evidência de infiltrado inflamatório (figuras 14 LIP-7(B-D)). No
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
60
grupo OXI-7, o epitélio já se encontrava reconstituído (figura 14 OXI-7(A, B e D)), porém
com reação inflamatória intensa caracterizada por infiltrado linfocitário, presença de
plasmócitos e polimorfonucleares (figura 14 OXI-7(A-B)). Neste grupo também foi verificado
reação de granulação focal, hiperemia e áreas de hialinização, com presença em algumas
secções de eosinófilos subepiteliais (figura 14 OXI-7(C)). O grupo RTX-7 apresentou áreas
de desnudamento epitelial (figura 14 RTX-7(D)), infiltrado inflamatório crônico moderado
(figura 14 RTX-7(A, C e D)) e edema intersticial (figura 14 LIP-7(C)). Em OXILIP-7 foi
observado um epitélio íntegro (figura 14 OXILIP-7(A, C e D)), presença de hiperemia (figura
14 OXILIP-7(B)) e infiltrado inflamatório discreto mononuclear, próximo aos vasos
sanguíneos, além de edema intersticial focal (figura 14 OXILIP-7(D)). Em RTXLIP-7 o
epitélio apresentou-se preservado (figura 14 RTXLIP-7(A, B e D)), com hiperemia (figura 14
RTXLIP-7(C)) e infiltrado inflamatório crônico de característica residual e focal, sem
presença de edema (figura 14 RTXLIP-7(A e C)) .
O grupo LIP-60 mostrou-se com todas as características da normalidade, com
epitélio íntegro e ausência de infiltrado inflamatório ou edema. Uma das bexigas exibiu focos
de hiperemia leve (figura 15 LIP-60(C)). No grupo de OXI-60, foi observada apenas uma
reação de hiperemia discreta (figura 15 OXI-60(D)), presença de escassos linfócitos
dispersos (figura 15 OXI-60(B e C)), ausência de eosinofilia e o epitélio encontrava-se
íntegro (figura 15 OXI-60(A-D)). Em RTX-60 houve aparecimento de uma reação de
hiperplasia no epitélio, assim como metaplasia escamosa, representada pela presença de
grânulos de querato-hialina na superfície urotelial (figura 15 RTX-60(B)). Foi observado
também infiltrado inflamatório crônico moderado, sem edema ou hiperemia (figura 15 RTX-
60(A)), com presença de áreas de fibrose. No grupo OXILIP-60, o epitélio apresentou-se
íntegro (figura 15 OXILIP-60(C e D)), com discreta reação inflamatória sub-epitelial
linfocitária (figura 15 OXILIP-60(A)), hiperemia (figura 15 OXILIP-60(B e D)), com edema
sub-epitelial e camadas musculares (figura 15 OXILIP-60(C e D)). Em RTXLIP-60 o epitélio
também se mostrou íntegro (figura 15 RTXLIP-60(C e D)), com presença de infiltrado
inflamatório linfocitário escasso (figura 15 RTXLIP-60(B)), na região sub-epitelial e presença
de edema (figura 15 RTXLIP-60(C e D)).
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61
Figura 15. Secções histológicas das bexigas após 60 dias da instilação das formulações
com a coloração Hematoxilina/eosina (aumento 100X) dos grupos salina (SAL-60),
lipossoma (LIP-60), Oxibutinina (OXI-60), Resiniferatoxina (RTX-60), Oxibutinina em
lipossomas (OXILIP-60), Resiniferatoxina em lipossomas (RTXLIP-60).
Tabela 3: resultados histológicos avaliados de acordo com cada sub-grupo do estudo.
Reação inflamatória: +1 = leve; +2 = moderada; +3 = intensa; Tipagem celular: L : linfócitos; P : plasmócitos; N: neutrófilos; E : eosinófilos;
M : macrófagos; Categorização: ICI : infiltrado crônico inespecífico; IA : inflamação aguda; IS: inflamação sub-aguda; Edema: Presente(+);
ausente (-); Hiperemia: presente(+); ausente (-); Integridade urotelial: presente(+); ausente (-); Necrose: presente(+); ausente (-); Outros: U:
ulceração; H: hialinização; ME: metaplasia escamosa; F: fibrose;
Avaliação Coloração
SAL
1
SAL
7
SAL
60
LIP
1
LIP
7
LIP
60
OXI
1
OXI
7
OXI
60
RTX
1
RTX
7
RTX
60
OXI
LIP
1
OXI
LIP
7
OXI
LIP
60
RTX
LIP
1
RTX
LIP
7
RTX
LIP
60
Reação inflamatória HE - - - - - - +3 +2 +1 +3 +2 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
Tipagem
HE
- - - - - - L +P N +E
+L+P
L N
+M
L +P L +P L
+P
L + P L L
+P
L
+P
L
Categorização
HE
- - - - - - IA IS ICI IA IS ICI ICI ICI ICI ICI ICI ICI
Edema
HE
- - - - - - + + - + + - + + + + - +
Hiperemia
HE
- - - + + - + + + + - - + + + + + -
Integridade urotelial
HE
+ + + + + + - + + - - + - + + + + +
Necrose
HE
- - - - - - - - - + - - - - - - - -
outros
HE
- - - - - - U H - U H/U H +
ME
+F
- - - - - -
A tabela 3 resume os principais achados histomorfológicos, bem como a
classificação do tipo de reação inflamatória presente em cada grupo estudado, observado
nas secções submetidas a coloração HE.
A análise das bexigas do grupo SAL-1, 7 e 60 em picrossírius sob luz polarizada
apresentaram predominância das fibras tipo I, de coloração dourada /avermelhada. Foi
observado também de fibras colágeno do tipo III. As fibras encontradas apresentaram-se
longas e com espaço interfibrilar pequeno. No grupo LIP-1, LIP-7 e LIP-60 não foram
verificadas diferenças em relação ao grupo SAL (Figura 16).
No grupo OXI-1 houve perda do colágeno tipo I nas áreas de reação inflamatória e
predomínio de fibras tipo III. Após 7 dias, foi observado uma rarefação das fibras colágenas.
Na periferia houve o aparecimento de colágeno tipo I e tipo III na região sub-epitelial. Após
60 dias novamente foi encontrado o predomínio das fibras tipo I sem sinais de fibrose ou
edema (Figura 16).
No grupo OXILIP-1 foi verificado perda do colágeno tipo I, porém em proporção
menor que no grupo OXI-1, e predominância de fibras do tipo III, retornando ao padrão
compatível com o grupo SAL após 7 e 60 dias. Em RTX-1 houve perda do colágeno tipo I,
em proporção menor que no grupo OXI-1, prevalecendo as fibras do tipo III. Após 7 dias, foi
observado ainda predominância de colágeno tipo III depositado nas áreas onde houve
hialinização e fibras do tipo I nas camadas mais profundas do tecido vesical. Após 60 dias, a
fibra do tipo I tornou a ser predominante, com uma rede entrelaçada densa de fibras grossas
e longas. Em RTXLIP-1 manteve-se o padrão de perda do colágeno do tipo I, prevalecendo
o tipo III, com grau de perda menor que o da RTX-1, retornando ao padrão compatível com
o grupo SAL após 7 e 60 dias.
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64
Figura 16. Secções histológicas das bexigas após instilação das formulações (1, 7 e 60 dias)
em coloração Picrossírius (aumento 100X) dos grupos salina (SAL), lipossoma (LIP-1, LIP-7
e LIP-60), Oxibutinina (OXI-1, OXI-7 e OXI-60), Resiniferatoxina (RTX-1, RTX7 e RTX60),
Oxibutinina em lipossomas (OXILIP-1, OXILIP-7 e OXILIP-60), Resiniferatoxina em
lipossomas (RTXLIP-1, RTXLIP-7 e RTXLIP-60).
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65
2.3.5. URINÁLISE
Os resultados de urinálise das amostras coletadas no 15º dia encontrados na maioria
dos animais estudados foram semelhantes e dentro da normalidade (tabela 4). Foram
excluídos do estudo 3 animais por apresentarem sinais de infecção urinária na microscopia.
Tabela 4. Resultados da urinálise realizada após 15 dias da instilação das formulações.
No grupo LIP, gotículas de gordura foram encontradas em todas as amostras até o
final do estudo. No RTXLIP, as gotículas de gordura foram igualmente identificadas em
todas as lâminas até o 60º dia. Entretanto, no grupo de OXILIP, a partir do 51º dia, foi
observado em 2 amostras ausência de gotículas de gordura e presentes nas demais
amostras. Este resultado se manteve na avaliação com 60 dias. Na figura 17, são
visualizadas as imagens das gotículas de gordura em suas formas de apresentação.
Figura 17. Visualização das gotículas de gordura na urina dos ratos. (A) gotículas de
gordura, resíduos e cristais de fosfato triplo no grupo OXILIP-60; (B) gotícula corada no
grupo OXILIP-60; (C) gotícula corada e gotículas menores não coradas no grupo RTXLIP-
60; (D) gotícula corada no grupo RTXLIP-60.
Parâmetro avaliado Valores encontrados
Presença de células Raras ou ausentes
Presença de bactérias Raras ou ausentes
Piócitos <1 por campo
Hemácias 0
A
B
C
D
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66
2.4. DISCUSSÃO
A utilização de formulações diferenciadas com a finalidade de diminuir a toxicidade
ou ação deletéria de determinados fármacos, como os bioadesivos e lipossomas, têm sido
propostas e têm obtido sucesso nas terapias intra-vesicais, expandindo sua utilização para
diversas doenças urinárias (GIANNANTONI et al., 2006). O uso de lipossomas como agente
carreador de capsaicina (fármaco também utilizado na terapia intravesical), tem
demonstrado efetividade clínica e diminuição dos efeitos não desejados do fármaco que
também possui característica irritante (CHANCELLOR e DE GROAT, 1999).
As formulações lipossomais são instáveis e podem sofrer agregação das vesículas
com o passar do tempo. O valor do índice de polidispersidade deve-se manter abaixo de 0,2
para que o sistema seja considerado estável fisicamente (CENTES e VEREMTTE, 2008;
SONG e KIM, 2006). Os valores encontrados nos lipossomas contendo RTX foram próximos
de 0,3 com tendência a queda após 42 dias da preparação da formulação. O tamanho das
vesículas destas formulações aumentou com o tempo. Estes resultados sugerem que pode
estar ocorrendo uma reorganização no tamanho das vesículas para acomodação energética
do sistema e consequentemente uma tendência para a estabilização física da formulação.
Apesar do aumento no tamanho das vesículas, estas ainda se encontram com dimensões
da ordem de nano, favorecendo sua interação com o sistema biológico.
A formulação lipossomal contendo OXI apresentou um índice de polidispersividade
alto (em torno de 0,5), porém estável durante o período avaliado. Apesar do índice alto, não
houve alteração no tamanho das vesículas, permanecendo as mesmas com diâmetro médio
em torno de 20 nm. O valor alto de polidispersidade evidencia uma dispersão heterogênea
no tamanho das vesículas (CENTES E VERMETTE, 2008; SONG E KIM, 2006).
Na avaliação macroscópica das bexigas, a ação da RTX pode ser observada dentro
das primeiras 24horas após a administração, provavelmente decorrente de edema
associado ao relaxamento do músculo detrusor e consequente aumento do tamanho vesical.
Em trabalho realizado em humanos, APOSTOLIDIS et al. (2006) observaram um maior
intervalo entre as micções, melhora dos parâmetros cistométricos de primeiro desejo
miccional e capacidade cistométrica máxima já nas primeiras 24horas após a instilação
intravesical de RTX. No presente estudo, a macroscopia das bexigas evidenciou no grupo
RTX-1 uma dilatação vesical comparável ao resultado final do grupo RTXLIP-60, mostrando
a potência do fármaco mesmo em doses nanomolares. A RTX apresentou perda da
dilatação de forma progressiva, associada a substituição das fibras colágenas por fibrose e
consequente perda de elasticidade. No estudo de SILVA et al. (2001), o qual os autores
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67
descrevem que não houve dano tecidual, a biopsia vesical é feita tardiamente (7 meses
após a última instilação intravesical).
A partir da análise dos focos hemorrágicos macroscópicos, verificou-se uma maior
agressividade da RTX ao epitélio vesical, com a recuperação parcial da bexiga após 7 dias.
Neste grupo, a presença de aderências e hematúria em alguns animais pode ser explicada
pela intensa reação inflamatória com focos hemorrágicos observados nos cortes histológicos
(Figura 13), envolvendo todas as camadas da bexiga. A reação transpõe o órgão e
acometeu estruturas adjacentes, gerando fibrose e a aderência entre as estruturas.
O uso da substância encapsulada em lipossomas proporcionou uma proteção à
bexiga, minimizando a agressão da RTX. A RTX foi preparada em etanol, substância
também irritante ao epitélio vesical (TYAGI et al., 2004). A presença de uma bexiga com
foco hemorrágico classificado como +2 no grupo RTXLIP-1 pode sugerir que a substância
pode não se encontrar totalmente encapsulada nos lipossomas ou já liberada e, portanto
agindo diretamente no urotélio, causando lesão. Segundo FRÉZARD et al. (2005), no
processo de encapsulação deve ser verificado se a substância lipofílica (RTX) está
efetivamente incorporada à membrana e não simplesmente adsorvida na sua superfície ou
associada na forma de microcristais em suspensão com os lipossomas. No caso de
substâncias hidrossolúveis (OXI), é teoricamente impossível atingir níveis de encapsulação
de 100% devido à necessidade da coexistência de compartimentos aquosos interno e
externo.
A cinética de liberação da substância através de difusão simples com lipossomas de
mesmo tamanho é exponencial, e determinada pelo coeficiente de permeabilidade da
substância e pelo tamanho do lipossoma. Quanto menor for o coeficiente de permeabilidade
ou quanto maior o tamanho dos lipossomas, mais lenta será a liberação da substância dos
lipossomas (FRÉZARD et al., 2005). O grupo OXI mostrou um grau moderado de irritação,
quando comparado à intensa reação inflamatória do grupo RTX, apresentando recuperação
total após 7 dias da instilação. A formulação lipossomal conferiu a proteção necessária à
substância, praticamente eliminando a formação de focos hemorrágicos macroscópicos
mesmo no grupo de 1 dia.
Em estudo realizado em humanos (SILVA et al., 2001), a RTX foi instilada na
cavidade vesical nas concentrações de 50 e 100 nM por repetidas vezes. Neste trabalho, os
pacientes relataram que a infusão não foi dolorosa e a cistoscopia, realizada entre 7 e 23
meses após a última instilação, todas as bexigas se mostraram com aspecto normal. As
biópsias também foram realizadas durante a cistoscopia e evidenciaram epitélio íntegro,
infiltrado inflamatório mínimo ou ausente, não houve casos de metaplasia, displasia ou
carcinoma urotelial. O presente estudo, utilizando concentração semelhante e instilação
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68
única, apresentou resultados discordantes de Silva et al. (2001), provavelmente porque as
biópsias foram realizadas muito tardiamente em relação à data da infusão (7 a 23 meses
após) e o número de pacientes estudados (n=7) também foi muito pequeno para afastar
qualquer alteração urotelial a longo prazo. Outros estudos realizados em humanos utilizaram
doses de RTX variando de 50 a 100 nM (APOSTOLIDIS et al., 2006; PALMA et al., 2004;
SILVA et al., 2000; SILVA et al., 2002; THIEL,2002), nos quais os pacientes referiram grau
de desconforto nulo ou mínimo após instilação, também não correspondendo à intensidade
da resposta inflamatória verificada. Esta ausência de dor, apesar da resposta inflamatória
gerada pelo fármaco, provavelmente pode ocorrer devido à rápida despolarização gerada
pela RTX sem que haja excitação nervosa prévia, como a provocada pela capsaicina
(FRASER et al., 2002).
Em relação à dor causada pela instilação intravesical direta, a OXI possui
propriedades anestésicas, com potência duas vezes maior que a lidocaína (BARROSO JR.
et al., 2000) e a RTX é um bloqueador neuromuscular de ação imediata, utilizado em
estudos em animais, com resultados satisfatórios para o tratamento de dor em casos de
câncer (MENENDEZ et al., 2006). A RTX também tem sido utilizada no tratamento da dor
de uma forma geral, com injeção perineural (NEUBERT et al., 2008). Estas propriedades
anestésicas acabam encobrindo a agressão vesical. Portanto, a ausência de queixas álgicas
do paciente durante a instilação intravesical não significa ausência de dano, pois não reflete
a intensidade da reação inflamatória produzida, observada nas secções histológicas deste
estudo. A primeira conseqüência da ligação da RTX com os receptores vanilóides presentes
no urotélio é a excitação neuronal devido à liberação de neuropeptídeos como a substância
P (SP), peptídeo gene-relacionado à calcitonina (CGRP) e interleucina (IL). A liberação
destes neuropeptídeos gera respostas nos vasos sangüíneos, mastócitos e linfócitos,
levando à inflamação neurogênica e reações alérgicas de hipersensibilidade (SZALLASI e
BLUMBERG, 1995).
Foi observado, porém, que existe a toxicidade urotelial, devido ao baixo índice
terapêutico da RTX e a necessidade da veiculação em solução alcoólica, que também vai
exercer uma ação irritativa no epitélio vesical (TYAGI et al., 2004). Por outro lado, os efeitos
farmacológicos da RTX podem ser observados até 6 meses depois da instilação do fármaco
puro, diretamente na cavidade vesical segundo APOSTOLIDIS et al. (2006).
No estudo de SILVA et al. (2002) foi realizada instilação de RTX intravesical em
humanos na dose de 50 nM e realizada avaliação dos parâmetros urodinâmicos após 30 e
90 dias e dos parâmetros de primeiro desejo miccional, capacidade cistométrica máxima
(capacidade máxima da bexiga em armazenar urina antes do seu esvaziamento), além do
sintoma de freqüência miccional (aumento do número de micções diárias) (MONTELLA,
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
69
2006). O autor relata uma melhora na avaliação de 30 dias e mostraram sinais de retrocesso
da resposta na avaliação após 90 dias. No trabalho realizado por PALMA et al. (2004), o
estudo urodinâmico foi realizado antes e 30 dias após a instilação intravesical de RTX 50 nM
e foi verificado um aumento da capacidade cistométrica máxima, porém sem diferença
estatística significativa e uma diminuição significativa na amplitude das contrações
involuntárias do músculo detrusor após a instilação intravesical de RTX 50 nM.
Os dados do trabalho realizado por SILVA et al. (2002) demonstraram um pico de
ação rápido em 30 dias seguido de um declínio de seus efeitos após 90 dias. O trabalho de
PALMA et al. (2004), também obteve resultados pouco significativos em relação aos
parâmetros urodinâmicos 30 dias após a instilação. A resposta ao medicamento, portanto,
pode ficar comprometida pela intensidade da reação inflamatória causada pelo mesmo,
ocorrendo a perda de fibras colágenas da parede vesical, e substituição das mesmas por
fibrose.
No estudo realizado por SAITOH et al. (2008), foram analisadas a capacidade vesical
e a resposta à dor em ratos, utilizando doses de 0,3 e 3 µM de RTX, onde foi verificada uma
diminuição da capacidade vesical e aumento da resposta álgica, provavelmente devido a
intensa reação inflamatória e fibrose causadas pela administração da RTX em doses muito
maiores que a utilizada no presente estudo.
Histologicamente, em 7 dias foi observado recuperação total do epitélio vesical em
todos os grupos com abrandamento da reação inflamatória. No grupo OXI-7 foi observado
reação de hialinização e infiltrado eosinofílico subepitelial em metade das lâminas. A
hialinização é descrita como achado histológico de marcador de lesão celular. Este processo
consiste no depósito de proteínas entre os tecidos ou dentro das células. O colágeno fibroso
presente nos tecidos cicatriciais pode ser hialinizado (COTRAN et al., 1994). Esta reação
pode ter ocorrido devido à dose mais alta de OXI intravesical utilizada e pela presença da
substância livre em solução, atuando diretamente sobre o epitélio. Entretanto, mesmo com a
dose de 6 mg/mL de OXI, a toxicidade da RTX em doses terapêuticas ainda foi maior,
podendo ser utilizada em doses menores para a instilação direta na cavidade vesical em
estudos posteriores.
No trabalho de LANDAU et al. (2005), o estudo histológico revelou a presença de
eosinófilos subepitelial no epitélio vesical em coelhos que receberam OXI intravesical na
forma de comprimido macerado, e não na forma de pó, sugerindo que o excipiente do
comprimido possa ter desencadeado uma reação alérgica em alguns animais. No presente
trabalho, a forma utilizada foi a OXI pura dissolvida em solução salina e também foi
verificada a presença de infiltrado eosinofílico subepitelial em 30% das secções do grupo
OXI-7. A eosinofilia subepitelial verificada sugere uma reação alérgica própria à OXI.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
70
O dano epitelial mostrou-se maior no grupo RTX, demandando mais de 7 dias para
sua total regeneração, além da reação inflamatória mais intensa, atingindo integralmente a
parede vesical, produzindo alterações em cada uma de suas camadas sendo encontradas
metaplasia escamosa no urotélio, fibrose e hialinização na sub-mucosa e no músculo
detrusor e aderência do órgão a outras estruturas abdominais pela reação inflamatória
ultrapassando os limites da camada serosa. No grupo OXI, esse infiltrado atingiu mais de
50% das camadas da bexiga.
De uma forma geral, verificou-se um padrão de agressividade decrescente ao
urotélio, respeitando a seqüência RTX > OXI > RTXLIP > OXILIP > LIP > SAL. A partir dos
resultados deste estudo, observou-se que a reação inflamatória gerada pela instilação de
OXI e RTX de forma livre na cavidade vesical foi capaz de causar dano tecidual
significativo.
Em relação às fibras colágenas, o grupo OXI apresentou maior perda de fibras
colágenas e maior lentidão na recuperação das fibras tipo I, predominando apenas na
avaliação de 60 dias. No grupo RTX, a recuperação das fibras tipo I já começa a ser vista
com 7 dias. Esta perda substancial do colágeno nos grupos OXI e RTX pode justificar a
reação de hialinização visualizada na avaliação histomorfológica, pelo depósito maciço de
proteína na bexiga. Embora num primeiro momento a substância exerça sua função no
urotélio, em um segundo momento, tais reações inflamatórias podem inclusive, em
pacientes submetidos a repetidas aplicações, comprometer a elasticidade vesical, e a
própria função do órgão, o que pode produzir efeito antagônico ao desejado, diminuindo a
capacidade vesical e a contratilidade do mesmo devido ao dano provocado capaz de atingir
todas as camadas da bexiga.
Os resultados encontrados nos fármacos em sistemas lipossomais (OXILIP e
RTXLIP) sugerem que os mesmos se encontravam em atividade após 60 dias,
provavelmente devido a encapsulação com a liberação lenta dos fármacos (FRÉZARD et al.,
2005) e à proteção extra conferida ao urotélio pelos lipossomas, ocorrendo uma diminuição
da resposta inflamatória (FRASER et al., 2003).
Os lipossomas puros são capazes de exercer um efeito protetor ao epitélio vesical,
complementando a barreira protetora urotelial e aumentando sua resistência aos agentes
agressores (GIANNANTONI et al., 2006). Da mesma forma, TYAGI et al. (2004)
demonstraram que os lipossomas ao serem associados à capsaicina, foram capazes de
liberar esta substância com a mesma eficácia de uma solução etanólica, porém com
acentuada redução da toxicidade vesical. Os lipossomas podem ser paulatinamente
incorporados à bicamada lipídica celular, promovendo a liberação gradual das substâncias.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
71
A associação dos fármacos aos lipossomas (OXILIP e RTXLIP) foi capaz de diminuir
substancialmente a agressão vesical em ambos os grupos, acelerando sua regeneração,
inclusive da matriz colagênica. A persistência da reação inflamatória leve e a presença do
edema mesmo após 60 dias indicam a presença de um agente agressor ao urotélio,
sugerindo a presença do fármaco em contato com a superfície urotelial.
Igualmente na urinálise, a confirmação da presença de gotículas de gordura na urina
após 60 dias demonstra a presença de lipossomas na cavidade vesical, sugerindo que os
fármacos se encontram em atividade após este período provavelmente devido a
encapsulação dos mesmos que promove uma liberação mais lenta do fármaco, minimizando
a resposta inflamatória e otimizando a atuação das substâncias na bexiga (TYAGI et al.,
2004). A urinálise realizada neste estudo foi importante para acompanhar a evolução dos
animais, buscando sinais de infecção uma vez que houve manipulação do trato urinário
assim como para o acompanhamento da eliminação dos lipossomas.
São necessários mais estudos para avaliar o tempo máximo de liberação
lipossomal na urina e estudos histológicos para verificar o tempo total necessário à
involução do processo inflamatório, assim como a utilização de doses menores de ambos
os fármacos visando minimizar a agressão tecidual. Da mesma forma estudos urodinâmicos
com as formulações lipossomais seriam necessários para comprovar os efeitos
cistométricos destas formulações.
2.5. CONCLUSÃO
A RTX em doses terapêuticas apresentou maior toxicidade vesical que a OXI
administrada em dose alta. Após 60 dias, verificou-se a presença de fibrose e metaplasia
escamosa no epitélio vesical no grupo RTX. Ambas as substâncias administradas
diretamente na cavidade vesical provocaram perda substancial da matriz colagênica vesical
nas doses administradas.
Os lipossomas contendo estas substâncias conferiram uma proteção extra ao
urotélio, minimizando a reação inflamatória, otimizando e prolongando o efeito destes
fármacos na bexiga dos animais. Após administração intravesical em dose única, os
lipossomas puros ou carreando substâncias encapsuladas permaneceram presentes
na cavidade vesical até 60 dias após o procedimento.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
72
2.6. REFERÊNCIAS
ANDERSSON, K.E., CHAPPLE,C.R. Oxybutynin and the Overactive Bladder. World Journal
of Urology, 19, p. 319–23, 2001.
APOSTOLIDIS, A., GONZALES, G.E., FOWLER C.J. Effect Of Intravesical Resiniferatoxin
(Rtx) On Lower Urinary Tract Symptoms, Urodynamic Parameters, And Quality Of Life Of
Patients With Urodynamic Increased Bladder Sensation. European Urology, 50, p. 1299–
1305, 2006.
AVELINO, A., CRUZ, F. Peptide Immunoreactivity And Ultrastructure Of Rat Urinary Bladder
Nerve Fibers After Topical Desensitization By Capsaicin Or Resiniferatoxin. Autonomic
Neuroscience: Basic and Clinical, 86, p. 37-46. 2000.
CHANCELLOR, M.B., DE GROAT, W.C. Intravesical Capsaicin And Resiniferatoxin Therapy:
Spicing Up The Ways To Treat The Overactive Bladder - Review . The Journal of Urology,
162(1), p. 3-11, jul. 1999.
COTRAN, R.S., KUMAR, V., ROBBINS, S.L.(eds). Inflammation and Repair. In: Robbins,
Pathologic Basis of Disease. 5 ed., chap 3. W.B.Saunders, 1994.
FRASER, M.O.,
LAVELLE, J.P., SACKS, M.S., CHANCELLOR, M.B. The Future of Bladder
Control”Intravesical Drug Delivery, a Pinch of Pepper, and Gene Therapy Review. Urology.
Winter; 4(1), p. 1-11, 2002.
GIANNANTONI, A., DI STASI, S.M.,CHANCELLOR, M.B., COSTANTINI, E., PORENA, M.
New Frontiers in Intravesical Therapies and Drug Delivery. European Urology, 50, p.1183–
1193, 2006.
HASHIM, H., ABRAMS, P. Treatment Of Overactive Bladder Syndrome And Detrusor
Overactivity . Reviews in Gynaecological Practice ,5 , p. 243–250, 2005.
KARNKA R, RAYANAKORN M, WATANESK S, VANEESORN Y. Optimization of High
performance liquid chromatographic parameters for the determination of capsaicinoid
compounds using the simplex method. Analytical Sciences,18, p.661-665, 2002.
LANDAU, E.H., FUNG, L.C.T.,THORNER, P.S.,MITTELM, M.W., JAYANTHI, V.R.,
CHURCHILL, B.M.,McLORIE, G.A.,STECKLER, R.E., KHOURY, A.E. Histologic Studies Of
Intravesical Oxybutynin In The Rabbit. The Journal Of Urology, 153, p. 2022-2024, June
1995.
MANNES, A.J.,BROWN D.C., KELLER J.,CORDES, L.,ECKENHOFF, R. G.,CAUDLE, R.
M.,IADAROLA, M. J., MENGC, Q. C. Measurement Of Resiniferatoxin In Serum Samples By
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
73
High-Performance Liquid Chromatography. Journal of Chromatography B, 823, p. 184–188,
2005.
MENÉNDEZ, L.,JUÁREZ, L.,GARCÍA, E., SUÁREZ, O.G.,HIDALGO, A., BAAMONDE, A..
Analgesic Effects Of Capsazepine And Resiniferatoxin On Bone Cancer Pain In Mice.
Neuroscience Letters , 393 (1), p. 70-73, 2006.
MONTELLA,J.M. Tratamento da Bexiga Hiperativa. In: MONTELLA, A.E.,CUNDIFF, G.W.,
OSTERGARD, D.R., SWIFT, S.E. Ostergard, Uroginecologia e Disfunções do Assoalho
Pélvico. 5ª ed cap.20, Ed. Guanabara Koogan, 2006.
NEUBERT, J.K., MANNES, A.J., KARAI,L.J.,JENKINS,A.C., ZAWATSKI, L.,ABU-
ASAB,M.,IADAROLA,M. Perineural Resiniferatoxin Selectively Inhibits Inflammatory
Hyperalgesia. Molecular Pain, 43, p.,2008
NICOLI, S., PENNA, E., PADULA, C., COLOMBO, P.,SANTI, P. New Transdermal
Bioadhesive Film Containing Oxybutynin:In Vitro Permeation Across Rabbit Ear Skin
International Journal of Pharmaceutics , 325 ,p. 2–7, 2006.
PALMA, P.C.R.,THIEL, M., RICCETTO, C.L.Z.,DAMBROS, M.,MIYAOKA, R.,NETTO JR,
N.R. Resiniferatoxin For Detrusor Instability Refractory To Anticholinergics. Brazilian Journal
of Urology, 30 (1), p.53-58, January - February, 2004.
SAITOH, C., CHANCELLOR, M.B., DE GROAT W.C., YOSHIMURA, N. Effects of
Intravesical Instillation of Resiniferatoxin on Bladder Function and Nociceptive Behavior in
Freely Moving, Conscious Rats . The Journal of Urology, 179, p. 359-364, January 2008.
SILVA, C., RIO, M.E., CRUZ, F. Desensitization Of Bladder Sensory Fibers By Intravesical
Resiniferatoxin, A Capsaicin Analog: Long-Term Results For The Treatment Of Detrusor
Hyperreflexia. In: Congress of the European Society for Urological Research nº 15, 38 (4),
p. 444-452, Istanbul , Turquie ,2000.
SILVA C, RIBEIRO MJ, CRUZ F. The Effect Of Intravesical Resiniferatoxin In Patients With
Idiopathic Detrusor Instability Suggests That Involuntary Detrusor Contractions Are Triggered
By C-Fiber Input. The Journal of Urology, 168, p. 575-579, 2002.
SILVA C, AVELINO A, SOUTO-MOURA C, CRUZ F. A Light- And Electronmicroscopic
Histopathological Study Of Human Bladder Mucosa After Intravesical Resiniferatoxin
Application. British Journal of Urology International , 88(4): p.355–360, 2001.
SZALLASI, A. e BLUMBERG, P.M. Vanilloid Receptors: New Insights Enhance Potential
As A Therapeutic Target. Pain, 61,p 195, 1996.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
74
TYAGI, P., CHANCELLOR, M.B., LI, Z., GROAT, W.C., YOSHIMURA, N., FRASER, M.O.,
HUANG, L. Urodynamic and Immunohistochemical Evaluation Of Intravesical Capsaicin
Delivery Using Thermosensitive Hydrogel And Liposomes. The Journal of Urology,171,
p.483-489, January 2004.
WACHTER, S., WYNDAELE, J.J. Intravesical Oxybutynin: A Local Anesthetic Effect On
Bladder C Afferents The Journal of Urology,169, p.1892–1895, May 2003.
YOKOYAMA O., ISHIURA, Y.,NAKAMURA, Y.,OHKAWA M. Urodynamic Effects of
Intravesical Oxybutynin Chloride in Conscious Rats. The Journal of Urology,
155 (2), p. 768-771, 1996.
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75
CAPÍTULO 3 - ALTERAÇÕES PRODUZIDAS NA BEXIGA DE RATAS POR
CAPSAICINA EXTRAÍDA DE CAPSICUM FRUTESCENS EM SISTEMAS
LIPOSSOMAIS.
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76
ALTERAÇÕES PRODUZIDAS NA BEXIGA DE RATAS POR CAPSAICINA
EXTRAÍDA DE CAPSICUM FRUTESCENS EM SISTEMAS LIPOSSOMAIS
RESUMO
A capsaicina é um fármaco extraído da pimenta Capsicum frutescens, atualmente utilizada
no tratamento da incontinência urinária por administração intravesical. Este fármaco provoca
irritação e edema local devido às suas características irritantes e por ser veiculado em
soluções alcoólicas. A incorporação deste fármaco em lipossomas pode diminuir a irritação
local e melhorar suas características de liberação. O objetivo deste trabalho foi realizar uma
análise preliminar do efeito dos lipossomas contendo capsaicina em urotélio de ratas, na
concentração de 3 mM. A capsaicina foi extraída da pimenta utilizando acetonitrila, e o
extrato submetido à CLAE para quantificação do fármaco. O lipossoma foi obtido utilizando
extrato seco e fosfolipídio na proporção de 1:10. A caracterização do lipossoma pela
determinação do potencial zeta, índice de polidispersividade e tamanho de partícula. Para o
ensaio in vivo, ratas Wistar foram submetidas a instilação das formulações contendo
lipossomas, capsaicina, lipossomas associados a capsaicina e o controle com solução
salina; após 24 horas foi realizada a avaliação histomorfológica do tecido vesical. O
tamanho das vesículas ficou entre 68 e 105 nm, com índice de polidispersividade menor que
0,2 e potencial zeta foi em torno de -30 mV. Os resultados indicam que as formulações
apresentaram estabilidade após 14 dias do preparo. O estudo histológico das bexigas do
grupo com capsaicina revelou uma reação inflamatória intensa em quase todas as camadas
da bexiga, e destruição de parte do epitélio. O grupo com lipossomas e capsaicina mostrou
reação inflamatória leve e áreas de hiperemia sem maiores danos à bexiga. Verificou-se que
as formulações lipossomais mantiveram-se estáveis durante o período estudado e a
presença dos lipossomas foi capaz de proteger a bexiga da ação irritativa da capsaicina.
Palavras-chave: capsaicina, lipossoma, incontinência urinária.
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77
RAT BLADDER ALTERATIONS OF CAPSAICIN EXTRACTED FROM CAPSICUM
FRUTESCENS IN LIPOSOMAL SYSTEMS
ABSTRACT
Capsaicin is a drug extracted from the pepper Capsicum frutescens, nowadays used as
treatment option in urinary incontinence for intravesical administration. This drug causes
irritation and local edema due to its irritant characteristics and due the need to be inserted in
in alcoholic solutions. The drug incorporation in liposomes can decrease the local irritation
and improve its characteristics of delivery. The objective of this work was the preliminar
analysis of alterations produced by liposomes containing capsaicin in rat bladder at a 3 mM.
The capsaicin was extracted from the pepper using acetonitrile, and the extract was
submitted to HPLC for drug quantification. Liposomes were obtained using dry extract and
phospholipids at the proportion 1:10. Liposome characterization was carried out by
determination of pH, refractions index, surface tension, zeta potential and size of vesicles.
For in vivo assay, Wistar rats were submitted to intravesical instillation of liposome; capsaicin
and lipossomes with capsaicin formulations. Saline instillation was used in control group.
After 24hours, bladders were removed and the histological analysis performed. The vesicle
size ranged from 68 to 105 nM with polidispersivity index smaller than 0.2 and zeta potential
around -30 mV. Liposome formulations maintained stability during the study. Histological
analysis of capsaicin group showed intense inflammatory reaction in almost all bladder layers
and ulcer formation. Liposome group with capsaicin showed smooth inflammatory reaction
and hiperemia. Liposome system was capable of protecting the bladder against capsaicin
irritative action.
Keywords: capsaicin, liposomes, urinary incontinence
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78
3.1. INTRODUÇÃO
A capsaicina é responsável pelo sabor pungente das pimentas, provocado
inicialmente pela excitação dos receptores vanilóides ativando os terminais periféricos
causando sintomas irritativos (FUJIMOTO et al., 2005; BARBERO et al., 2008), sendo muito
utilizada no tratamento da incontinência urinária. Esta doença consiste em uma condição
onde existe perda involuntária da urina e acomete geralmente mulheres no climatério
(GUARISI et al., 2001; SILVA e SANTOS, 2005; GARCÌA et al., 2005).
O tratamento da incontinência urinária utilizando capsaicina é realizado por
administração intravesical com resultados efetivos, porém com irritação e edema local. Além
disso, este fármaco possui características apolares o que o torna pouco solúvel em
solventes com compatibilidade biológica, tais como tampões e salina. Segundo TYAGI et al.
(2004) este fármaco é dissolvido em etanol, veículo que também tem potencial irritante,
portanto havendo a necessidade de desenvolver formulações que possam minimizar os
efeitos irritantes do fármaco e apresentar efetividade.
Desta forma, faz-se necessária a utilização de estratégias para a veiculação da
capsaicina, diminuindo os efeitos adversos produzidos pelo mesmo e facilitando a sua
incorporação na formulação pretendida. Os lipossomas tem sido muito utilizados como
veículo por terem capacidade de encapsular substâncias com diferentes polaridades, serem
biodegradáveis e biocompatíveis (GIANNANTONI et al., 2006; CENTIS E VERMETTE,
2008; SALVATi, et al., 2007).
Lipossomas são vesículas esféricas formadas de uma dupla camada lipídica e tem
sido utilizado em aplicações analíticas, terapêuticas e pesquisa, inclusive com incorporação
da capsaicina (MANOJLOVIC et al., 2008; GIANNANTONI et al., 2006; CENTIS e
VERMETTE, 2008; SALVATI et al., 2007).
O objetivo do presente trabalho foi extrair a capsaicina e diidrocapsaicina da
Capsicum frutescens, obter lipossomas contendo estas substâncias e avaliar o potencial
protetor do urotélio destes lipossomas em modelo animal.
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79
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL:
A pimenta fresca da espécie Capsicum frutescens foi adquirida no Mercado da
cidade de Aracaju/SE. Para preparação dos lipossomas foi utilizado fosfolipídio da Nanosolv
(fosfatidilcolina 75% /Lipoid GMBH/ Lote 776095-1/ Gerbras).
MÉTODOS:
3.2.1 Secagem da planta e obtenção do extrato
A pimenta foi seccionada e foram retiradas as sementes e a placenta. Estas foram
desidratadas em estufa a 55ºC por 24-30 horas. Após a desidratação, o material foi triturado
e peneirado em tamis de 60 mesh.
O pó de pimenta foi pesado e inserido em tubos de ensaio na proporção de 0,3 g de
pimenta para 10 mL de acetonitrila. Os tubos de ensaio foram submetidos a ondas de ultra-
som durante 60 minutos. Após a extração, o material foi filtrado e o solvente evaporado.
3.2.2 Avaliação da extração por CLAE
A quantificação dos capsainóides foi realizada segundo KARNKA et al. (2002),
conforme descrito a seguir:
Clean-up:
Uma pré-coluna C-8 foi condicionada com 0,5 mL de água milli-q, posteriormente
com 0,5 mL de metanol, seguido de 0,5 mL de acetonitrila. A amostra (0,5 mL) foi diluída na
pré-coluna condicionada e lavada por três vezes consecutivas com acetonitrila (0,5 mL). As
frações foram reunidas e filtradas em membrana millipore de 0,45 µm, diretamente em vials.
A amostra obtida foi analisada em CLAE com volume de injeção de 20 µL.
A cromatografia foi realizada utilizando uma coluna C-8. Foram injetados 20 µL de
amostra e eluídos utilizando acetonitrila como fase móvel.
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80
3.2.3. Obtenção do lipossoma
Uma solução de capsaicina foi obtida na concentração de 4,6 mg.mL
-1
em etanol
absoluto. Os lipossomas foram preparados homogeneizando-se o fosfolipídio em 10 mL da
solução de capsaicina, ficando uma proporção molar de 1:10 (fármaco:fosfolipídio). As
dispersões foram submetidas à agitação mecânica até sua total homogeneização. O
solvente foi eliminado em rotaevaporador até formar uma película na superfície do recipiente
(AVELINO E CRUZ, 2000; FRÉZARD E SCHETTINI, 2005). Este filme foi redissolvido
utilizando 50 mL de salina. A reconstituição gerou uma dispersão de cor branca que foi
passada no filtro de nylon Milipore® de 0,22 µm para limitar o tamanho das vesículas
formadas (processo de extrusão). A dispersão final foi acondicionada a 4ºC até o momento
das análises. A concentração final de capsaicina foi de 3 mM. Foram preparados também
lipossomas sem capsaicina da mesma maneira que descrito anteriormente.
3.2.4. Caracterização do lipossoma
Determinação do potencial zeta
O potencial zeta (Zetasizer Nanoseries, Malvern Instruments, UK) das amostras de
lipossomas com e sem capsaicina foi determinado através da medição da mobilidade
eletroforética das partículas carregadas a 25°C. As amostras foram diluídas na proporção de
1:10, sendo realizado o procedimento com 24 horas após a preparação do lipossoma, com 7
dias e 14 dias.
Avaliação do tamanho de partícula e índice de polidispersividade.
O tamanho dos lipossomas foi obtida através da técnica de difusão de luz dinâmica
(Dynamic Light Scattering - DLS), utilizando um sistema computadorizado Malvern Zetasizer
Nanoseries (Nano-ZS - Malvern, UK), a amostra foi diluída na proporção de 1:10 em água
destilada, com comprimento de onda de 633 nm e temperatura de 25°C. Além do tamanho
das vesículas, o índice de polidispersividade foi determinado pelo equipamento.
3.2.5. Ensaio biológico
Os animais utilizados foram ratas Wistar, com idade de dois meses, pesando 190 ± 30
g. Foram utilizados 6 animais em cada subgrupo, os quais foram submetidos aos
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81
procedimentos para administração intravesical das formulações e sacrificados após 24h. Os
grupos salina e lipossoma foram utilizados como controles negativos.
Os animais foram divididos em 4 grupos para análise após 24 horas da instilação
intravesical: grupo controle negativo com solução salina (SAL); grupo contendo lipossomas
(LIP); grupo contendo capsaicina (CPS) e grupo contendo capsaicina + lipossomas
(CPSLIP).
As ratas foram mantidas em gaiolas em grupos de seis animais identificados e
separados por grupo experimental com acesso a ração padrão Labina® e água ad libitum.
As recomendações da Lei Nacional nº 6.638 de 5 de novembro de 1979, para manuseio de
animais foram respeitadas, e o projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Tiradentes através do Parecer Consubstanciado com número de protocolo
060208.
As ratas foram submetidas à anestesia com ketamina na dose de 70 mg.kg
-1
e
midazolan na dose de 4 mg.kg
-1
, ambas sendo administradas pela via subcutânea, segundo
o protocolo do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da UFMG para
anestesia em animais de pequeno porte. Em seguida, foi administrado antibiótico ceftriaxone
intramuscular na dose de 57 mg.kg
-1
para a prevenção de cistite pela manipulação do trato
genito-urinário. Após 30 minutos foi realizada a limpeza do meato uretral com povidine
tópico, e então se realizou a cateterização vesical, utilizando cateter intra-venoso (Jelco)
nº22. O cateter foi totalmente introduzido para alcançar a bexiga do animal, posicionado
adequadamente para o preenchimento da bexiga com as formulações anteriormente
descritas.
As ratas foram sacrificadas por deslocamento cervical. O procedimento de dissecção
foi guiado com auxílio de cateterismo vesical. A laparotomia mediana baixa foi realizada,
seguida de abertura da parede abdominal por planos e afastamento dos músculos
abdominais, exposição da bexiga e ressecção da mesma na sua totalidade.
Os animais foram sacrificados após 24 horas da instilação intravesical das diferentes
formulações.
As peças cirúrgicas excisadas foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10%
por um período mínimo de 24 h. Após fixação as amostras foram desidratadas com etanol,
diafanizadas com xileno e banhadas em parafina. A última etapa foi conduzida por inclusão
na parafina. Cortes de aproximadamente 3 µm de espessura foram realizados e os
espécimes, processados de acordo com diferentes protocolos de histoquímica
(hematoxilina-eosina e picrossírius).
Para análise da morfologia e disposição das fibras colágenas depositadas na parede
da bexiga, secções histológicas foram submetidas previamente ao método de coloração
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82
histoquímica do picrossírius e analisadas sob microscopia óptica com luz polarizada para
análise descritiva da fibroplasia detendo-se na identificação do colágeno.
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1. Extração e quantificação dos marcadores
A determinação do teor dos ativos no extrato é imprescindível para o
desenvolvimento das formulações já que os valores de rendimento não garantem sua
presença no extrato. Desta forma, a quantificação dos ativos torna-se determinante para a
eficiência biológica do extrato. A concentração de capsaicina e diidrocapsaicina nos extratos
foi de 1,42 mg/g e 0,57 mg/g respectivamente. Estas concentrações de capsainóides estão
dentro dos valores encontrados por KARNKA et al., (2002), grupo que desenvolveu o
método de quantificação. Estes autores encontram entre 0,2-6,9 mg/g de capsaicina e 0,17-
5,10 mg/g de diidrocapsaicina em uma outra variedade de pimenta (Chili pods).
Os cromatogramas referentes à amostra extraída (A) e aos padrões (B) estão
apresentados na figura 18. No cromatograma da amostra pode-se observar que a etapa de
clean up foi efetiva, eliminando possíveis interferentes no cromatograma.
(A)
(B)
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83
Figura 18. Cromatograma do extrato contendo capsaicina e diidrocapsaicina (A) e dos
padrões de capsaicina e diidrocapsaicina (B).
3.3.2. Caracterização dos lipossomas
Os fosfolipídios (compostos anfifílicos contendo duas cadeias de hidrocarbonetos
longas) quando colocados em solução aquosa se hidratam e formam espontaneamente
vesículas com dupla camada de lipídios. As características físicas dos lipossomas
dependem do pH, da força iônica e da presença de cátions divalentes (GENNARO, 2000;
FERREIRA et al., 2005).
As interações dos fármacos com a bicamada lipídica dependem das propriedades do
próprio fármaco. A polaridade do mesmo indica a sua localização na membrana lipídica. A
capsaicina é um fármaco de polaridade intermediária, pois é extraído com solventes
apolares como a acetonitrila, porém apresenta-se parcialmente solúvel em solventes polares
(etanol 30%). Vesículas contendo fármacos com baixa solubilidade em água são preparadas
dissolvendo o princípio ativo na fase lipofílica. Quando o fármaco é hidrofílico, o mesmo é
dissolvido na solução aquosa de hidratação do filme lipídico (MAESTRELLI et al., 2005).
Neste caso, optou-se em dissolver a capsaicina no fosfolipídio em etanol para garantir sua
total solubilização. Desta forma, é provável que a capsaicina esteja localizada na interface
da matriz lipídica, tanto internamente como externamente caso a molécula não tenha sido
totalmente vesiculada.
Os sistemas lipossomais são dispersões coloidais e por isso comportam-se físico-
quimicamente como partículas parcialmente solúveis. Os lipossomas podem sofrer fusão,
agregação ou se romper durante o período de estocagem (GENNARO, 2000).
Um dos motivos da instabilidade do sistema é o potencial elétrico em sua superfície.
Vesículas com uma camada elétrica maior apresentam um maior potencial zeta. Esta
camada dificulta a aproximação de uma vesícula com a outra, impedindo a fusão ou
agregação das mesmas. A medida que potencial zeta se afasta de zero, mais estável será a
dispersão, pois as partículas tende a se repelir umas as outras.
A formulação lipossomal sem o fármaco apresentou diminuição do potencial zeta
(Figura 19) ao final de 7 dias (-40 mV). Esta diminuição demonstrou uma estabilização do
sistema, porém após 14 dias, o potencial volta a subir (-34 mV).
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84
Figura 19. Potencial zeta dos lipossomas
Problemas de estabilidade nas formulações coloidais são geralmente esperados nos
valores de pH menores que 4,0 (alta concentração de cargas positivas) ou maiores que 7,5
(concentração de cargas negativas aumentada). O limite de potencial zeta para a
instabilidade de sistemas coloidais fica entre -30 mV e +30 mV.
O potencial zeta das formulações contendo ou não o fármaco permaneceu menor
que -30 mV após 14 dias de experimento. Apesar dos valores obtidos encontrarem-se
próximos ao limiar da estabilidade, foi observado que permaneceu constante. Segundo
CENTES E VERMETTE (2008) a floculação ocorre entre 5 e 15 mV.
A medida do tamanho das vesículas é outro parâmetro importante para a observação
da estabilidade do sistema coloidal.
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85
(A) (B)
Figura 20: Tamanho das vesículas sem (A) e com (B) capsaicina nos tempos 1, 7 e 14 dias.
O tamanho das vesículas após 14 dias de preparo não variou, excetuando as
vesículas sem capsaicina que após uma semana apresentaram ligeiro aumento. O tamanho
médio das vesículas foi inferior a 100 nm, sendo que as formulações contendo capsacina
apresentaram tamanho menor (68 a 78 nm) do que as vesículas sem o fármaco (78 a 106
nm) (Figura 20). O diâmetro médio encontrado nas vesículas estudadas está de acordo com
as encontradas na literatura (CENTES E VERMETTE, 2008; SONG E KIM, 2006).
O índice de polidispersividade (IP) determina o nível de homogeneidade dos
tamanhos das vesículas. Valores de IP < 0,2 indicam uma homogeneidade das vesículas ao
passo que IP > 0,3 indicam uma heterogeneidade da partícula (CENTES E VERMETTE,
2008; SONG E KIM, 2006). Os valores de IP foram da ordem de 0,2 para as formulações
com e sem capsaicina, demonstrando homogeneidade do tamanho das vesículas no
sistema lipossomal. Foi observado também que após 14 dias o índice permaneceu
constante (Tabela 5).
Tabela 5. Índice de polidispersividade das formulações lipossomais
Índice de polidispersividade
Tempo (dias) Lipossoma sem capsaicina Lipossoma com capsaicina
1 0,279 0,273
7 0,257 0,273
14 0,261 0,276
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86
3.3.3 Avaliação Histológica
Em relação a analise histológica dos tecidos, no grupo LIP, verifica-se apenas áreas
de hiperemia discreta, sem infiltrado inflamatório, com aspecto muito semelhante ao grupo
SAL, desprovido de alterações histológicas (Figura 21, LIP 1 e 2). No grupo CPS, após
24horas, observa-se uma reação inflamatória intensa, com áreas de edema, ulceração e
hemorragia (Figura 21, CPS A e B). O infiltrado inflamatório atinge a camada muscular na
sua totalidade até a superfície urotelial. Evidenciou-se a presença de neutrófilos, linfócitos e
plasmócitos. Na coloração picrossírius foi verificado a predominância de fibras do tipo III, lise
do colágeno com aumento do espaço interfibrilar (Figura 22).
Figura 21. Secções histológicas das bexigas após 24 horas da instilação das
formulações com a coloração Hematoxilina/eosina aumento 100X (A) e aumento 400X (B)
dos grupos salina (SAL), lipossoma (LIP), capsaicina (CPS) e capsaicina em lipossomas
(LIPCPS).
No grupo com CPSLIP, foi observado edema e hiperemia, não se evidenciando
áreas de ulceração ou infiltrado inflamatório. Na coloração picrossírius, o aspecto do tecido
foi semelhante ao grupo controle.
SAL
A
SAL
2
LIP
A
LIP
B
CPS
A
CPS
B
CPSLIP
A
CPSLIP
B
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Figura 22. Secções histológicas das bexigas após 24 horas da instilação das
formulações com a coloração picrossírius aumento 100X dos grupos salina (SAL), lipossoma
(LIP), capsaicina (CPS) e capsaicina em lipossomas (LIPCPS).
Foi verificada uma agressão tecidual importante no grupo CPS, com presença
maciça de neutrófilos, linfócitos e plasmócitos. A lesão ocorreu em quase todas as camadas,
consonante com o trabalho de SHUPP BYRNE et al, (1998), onde também foi utilizada
capsaicina intravesical em solução etanólica a 30%, na concentração 1 mM . Neste estudo,
foi feita a avaliação em 30 minutos, 24 horas, 72 horas e 7 dias. A recuperação epitelial
completa foi verificada após 7 dias, entretanto, não houve a formação de áreas ulceradas.
Isto se deu provavelmente pela dose menor de capsaicina utilizada. No trabalho de VERIT
et al. (2002), foi realizada instilação intravesical de capsaicina em ratos na dose de 2, 4 e
40 mM, durante 30 minutos, seguida de lavagem da cavidade vesical após os dias 0,2,5,7,e
10. No 10º dia as bexigas foram extraídas e o exame histológico demonstrou
adelgaçamento do epitélio, edema, infiltrado inflamatório agudo, hiperemia em todos os
grupos, sem porém, encontrar áreas de ulceração. No grupo com 40 mM, foi encontrado
infiltrado eosinofílico em apenas um animal, sugerindo uma possível reação alérgica. Neste
estudo a análise histológica se deu apenas no 10º dia, além de ter sido realizada lavagem
vesical após 30 minutos de cada instilação, retirando o contato da capsaicina com o urotélio.
O grupo CPSLIP na coloração HE mostrou uma reação mais modesta (Figura 21),
compreendendo um infiltrado inflamatório crônico residual e hiperemia moderada. Não foi
visualizado áreas de edema ou hemorragia, apresentando epitélio íntegro. Na coloração
picrossírius, o colágeno apresentou-se semelhante ao controle negativo.
3.4 CONCLUSÃO
A extração da capsaicina e diidrocapsaicina a partir da Capsicum frutescens foi
eficiente. Os sistemas lipossomais propostos apresentaram estabilidade após 14 dias de
SAL
LIP
CPS
CPSLIP
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88
preparo com tamanho médio de vesículas menores que 100 nm. A associação da
capsaicina aos lipossomas foi capaz de reduzir a agressão tecidual, com dano mínimo após
24horas da instilação.
3.5 REFERÊNCIAS
AVELINO, A., CRUZ, F. Peptide Immunoreactivity And Ultrastructure Of Rat Urinary Bladder
Nerve Fibers After Topical Desensitization By Capsaicin Or Resiniferatoxin. Autonomic
Neuroscience: Basic and Clinical. 86, p. 37-46, 2000.
BARBERO, G.F., LIAZID, A., PALMA, M., BARROSO, C.G., Fast Determination Of
Capsaicinoids From Peppers By High-Performance Liquid Chromatography Using A
Reversed Phase Monolithic Column. Food Chemistry, 107, p. 1276-1282, 2008.
BARCHINI, H.P., LEEUWEN, V., LYKLEMA, J. Eletrodynamics Of Liposome Dispersions;
Langmuir , 16, p. 8238-8247, 2000.
CENTIS, V., VERMETTE, P. Physico-Chemical Properties And Cytotoxicity Assessment Of
PEG-Modified Liposomes Containg Human Hemoglobin. Biointerfaces, 65, p. 239-246, 2008.
FERREIRA, H., LÚCIO, M., SIQUET, C., REIS, S. Utilização de Modelos Membranares na
Avaliação da Atividade de Fármacos. Química, 99, p. 39-50, 2005.
FRÉZARD, F., SCHETTINI, D.A., Liposomes: Physicochemical And Pharmacological
Properties, Applications In Antimony-Based Chemotherapy. Quimica Nova, 28(3), p. 511-
518, 2005.
FUJIMOTO, S., MORI, M., TSUSHIMA, H., KUNIMATSU, M. Capsaicin-Induced,
Capsazepine-Insensitive Relaxation Of The Guinea- Pig Ileum. European Journal of
Pharmacology,.530, p. 144-151, 2006.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
89
GARCÍA, C.M., GUZMÁN, F., MORA, E., BUITRAGO G., REYES, L.E., GÓMEZ, A.,
Capsaicina Intravesical: Una Alternativa En Pacientes Con Vejiga Hiperactiva Idiopática De
Dificil Manejo. Revista Medica, 13, p. 70-74, 2005.
GENNARO, A. R., REMINGTON. A Ciência E A Prática Da Farmácia; 20 ed., p. 950-952:
Ed. Guanabara Koogan, 2000.
GIANNANTONI, A., STASI, S.M.D., CHANCELLOR, M.B., CONSTANTINI, E., PORENA, M.
New Frontiers In Intravesical Therapies And Drug Delivery. European Urology, v. 50, p.
1183-1193, 2006.
GUARISI, T., NETO, A.M.P., OSIS, M.J., PEDRO, A.O., PAIVA, L.H.C. Incontinência
Urinária Entre Mulheres Climatéricas Brasileiras: Inquérito Domiciliar. Revista Brasileira de
Saúde Pública,35, p. 428-435, 2001.
KARNKA, R., RAYANAKORN. M., WATANESK, S., VANEESORN, Y. , Optimization Of
High-Perfmorface Liquid Chromatographic Parameters For The Determination Of
Capsaicinoide Compounds Using The Simplex Method. Analytical Sciences, 18, p. 661-665,
2002.
MAESTRELLI, F., GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ, M.L., RABASCO, A.M., MOURA, P.
Preparation And Characterisation Of Liposomes Encapsulating Ketoprofen-Cyclodextin
Complexes For Transdermal Drug Delivery. International Journal Of Farmaceutics, 298, p.
55-67, 2005.
MANOJLOVIC, V., WINKLER, K ., BUNJES, V., NEUB, A., SCHUBERT, R., BUGARSKI, B.,
LENEWEIT, G. Membrane Interactions Of Ternary Phospholipid/Cholesterol Bilayers And
Encapsulation Efficiencies Of A RIP II Protein; Colloids and Surfaces, 64, p.284-296, 2008.
SALVATI, A., RISTORI, S., PIETRANGELI, D., OBERDISSE, J., CALAMI, L., MARTINI,G.,
RICCIARDI, G.Insertion Of Magnesiun(II)-Octacarboranyl(Hexylsulfanyl)Porphyrazine Into
Liposomes: A Physico-Chemical Study. Biophysical Chemistry, 131, p. 43-51, 2007.
SILVA, A.P.M., SANTOS, V.L.C.G. Prevalência Da Incontinência Urinária Em Adultos E
Idosos Hospitalizados. Revista da Escola de Enfermagem da USP, 39, p. 36-45, 2005.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
90
SHUPP-BYRNE, A., DAS, J., SEDOR, B., HUANG, D., RIVAS, H., FLOOD, W., DE GROAT,
M.,JORDAN, M., CHANCELLOR, P. Effect Of Intravesical Capsaicin And Vehicle On Bladder
Integrity In Control And Spinal Cord Injured Rats . The Journal of Urology, 159(3), p. 1074 –
1078, 1998.
TYAGI, P., CHANCELLOR, M. B., LI, Z., GROAT, W.C.D., YOSHOMURA, N., FRASER, M.
O., HUANG, L. Urodynamic and immunhohistochemical evalution of intravesical capsaicin
delivery using thermosensitive hydrogel and liposomes; The Journal Of Urology,171, p.483-
489, 2004.
VERIT, A., ARSLAN, O., OZARDALI, Y., YENI, E., UNAL D. Topical Effects Of Intravesical
Capsaicin On Rat Bladder. Brazilian Journal of Urology. 28 (2), p.154-158, March - April,
2002.
UNIT - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SAÚDE E AMBIENTE – LORENA M. DANTAS CIRINO
91
4. CONCLUSÃO GERAL
Após o desenvolvimento do presente trabalho, conclui-se que o uso de lipossomas
promove uma proteção à bexiga diante da toxicidade de fármacos como a oxibutinina,
resiniferatoxina e capsaicina, atenuando a lesão tecidual de forma significativa. Após 7 dias,
vê-se a reconstituição epitelial em todos os grupos estudados, exceto no grupo com
resiniferatoxina, que mostrou um dano tecidual maior, seguido pela oxibutinina, quando
comparado aos demais grupos.
Após 60 dias, ainda existe reação inflamatória nas bexigas após a administração de
fármacos com e sem lipossomas.
Os lipossomas administrados pela via intravesical continuam presentes na cavidade
vesical após 60 dias da instilação inicial.
Os sistemas lipossomais mostraram-se estáveis in vitro durante o período estudado,
mantendo o tamanho das gotículas menor que 100nM.
Diante dos resultados, tem-se a veiculação de fármacos pela via intravesical
associados a lipossomas como uma segura opção ao tratamento da bexiga hiperativa.
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