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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FABIANA IERVOLINO
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PACU (Piaractus
mesopotamicus) (Characiformes: Characidae) NA BACIA DO ALTO
PARAGUAI POR MEIO DO POLIMORFISMO DO DNA MITOCONDRIAL
Mogi das Cruzes, SP
2008
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FABIANA IERVOLINO
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PACU (Piaractus
mesopotamicus) (Characiformes: Characidae) NA BACIA DO ALTO
PARAGUAI POR MEIO DO POLIMORFISMO DO DNA MITOCONDRIAL
Orientador: Prof
º Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf
Mogi das Cruzes, SP
2008
Dissertação apresentada à Universidade de
Mogi das Cruzes para a obtenção do Título
de Mestre em Biotecnologia.
Área de concentração: Ambiental.
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F
ICHA
C
ATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Iervolino, Fabiana
Análise da variabilidade genética do Pacu (Piaractus
mesopotamicus) (Characiformes: Characidae) na bacia
do Alto Paraguai por meio do poliformismo do DNA
mitocondrial / Fabiana Iervolino. – 2009.
76 f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) -
Universidade de Mogi das Cruzes, 2008
Área de concentração: Ciências Ambientais
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf
1. Pacu – Variabilidade genética 2. Piaractus
mesopotamicus 3. DNA mitocondrial I. Hilsdorf,
Alexandre Wagner Silva
CDD 597
DEDICATÓRIA
Dedico esta minha conquista,
Aos meus pais, Primo Edson Iervolino e Terezinha de Jesus Iervolino,
pela educação que me deram e por sempre incentivarem a lutar pelos
meus sonhos.
Ao meu noivo, Lourenço, pelo amor e companheirismo e, principalmente
pela paciência, muita paciência, durante esse período.
Aos meus irmãos, Andrea e Emerson, e ao meu sobrinho, Tarik, por
simplesmente fazerem parte da minha vida.
AGRADECIMENTOS
De modo especial gostaria de agradecer ao meu orientador
Professor Doutor Alexandre Wagner Silva Hilsdorf por abrir as
portas e confiar em mim, pelo exemplo de profissionalismo, pelo
apoio durante o desenvolvimento do trabalho, e acima de tudo
pela amizade.
Primeiramente a Deus, a quem deposito minha fé e esperança, e que nunca me
faltou.
À Universidade de Mogi das Cruzes, por ter sido minha segunda casa em todos
esses anos, e pelo espaço físico.
A todos os professores do programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade
de Mogi das Cruzes, pela competência e seus ensinamentos.
Ao Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aqüicultura (LAGOAA), a
Embrapa - Pantanal e FUNDECT pelo fornecimento dos recursos.
As minhas eternas amigas (por ordem alfabética, para não gerar conflito): Carol, Co,
Ju, Ka, Paola, Sarita e Taty, pela amizade, pelo companheirismo, pelo carinho, pelas
maravilhosas risadas, enfim por tudo que passamos juntas, o meu eterno
agradecimento, vocês moram em meu coração.
À Ângela Aparecida Moreira, pelo exemplo de vida, pelos ensinamentos fornecidos
com tanto carinho, e principalmente pela amizade, o meu eterno agradecimento.
Aos amigos do LAGOAA, Fernanda Gallinaro, Gustavo, Márcia e Luiza, pela
agradável convivência e amizade.
As funcionárias do Núcleo Integrado de Biotecnologia, Renata e Neilce, pela
prestatividade e ajuda quando precisei.
Aos amigos do Laboratório de Virologia, Alex, Fê, Fernanda Faria, Bruno e César,
pela convivência e pela ajuda, sempre que precisei.
Ao pessoal do Laboratório de Genômica, principalmente a Daiene e ao Deibs, por se
prontificarem a colocar as reações no seqüenciador, muito obrigada pela atenção e
ajuda.
À Professora Vivian Schimidt, pelo tempo dedicado a me ensinar a técnica de
seqüenciamento.
À Renata Mesquita, secretária da pós-graduação, obrigada pela atenção nas
situações burocráticas.
Aos professores Dr. Vitor Miranda e Dr. Wellington de Araújo, pela participação na
banca de qualificação, pelas valiosas discussões e sugestões dadas a este trabalho.
Aos professores Dr. Fauto Foresti e Dr. Vitor Miranda, por aceitarem o convite para
participar da banca de defesa.
A minha família e ao meu noivo, por fazerem parte de todos os momentos de minha
vida, amo vocês.
A minha tia Bili, por sempre incentivar a enfrentar os obstáculos da vida e por sua
amizade.
A todas as pessoas que contribuíram, direta ou indiretamente, para a consolidação
deste trabalho, muito obrigada.
Muito obrigada por tudo.
RESUMO
Os peixes neotropicais compõem a ictiofauna mais diversificada e rica do mundo.
Contudo, apesar desta diversidade de espécies de peixes e da sua grande
importância econômica para o homem, ainda pouco se conhece sobre suas
características biológicas, ecológicas e genéticas. A identificação e a conservação
de estoques geneticamente diferenciados e adaptados ao seu habitat representam
um ponto fundamental para o setor pesqueiro, pela sua relação direta com a
produtividade total e o uso sustentável dos recursos. O pacu (Piaractus
mesopotamicus) é uma espécie de grande ocorrência nos rios da bacia hidrográfica
do Alto Paraguai. A pesca do pacu tem sido monitorada e vem mostrando a grande
importância desta espécie. A manutenção dos estoques de pacu em nível de uso
sustentável depende dentre outras da conservação da variabilidade genética
populacional. Para isso, é necessário o conhecimento do grau de diferenciação
genética das populações de pacu, o que pode ser conseguido por meio de
marcadores moleculares. O presente estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a
estrutura intra e inter populacional do pacu por meio de análises de seqüências da
região controle (d-loop) do mtDNA. Cem amostras de quatro sub-bacias, Cuiabá,
Taquari, Negro e Miranda mais do Rio Paraguai foram escolhidas para a avaliação.
O DNA total das amostras foi extraído da nadadeira caudal, os primers desenhados
para a espécie (P. mesopotamicus) foram utilizados para a amplificação da região
do d-loop, foi feita a purificação das amostras amplificadas e estas foram então
seqüenciadas em um seqüenciador automático ABI3100. Cada amostra foi
seqüenciada duas vezes para se obter uma seqüência consenso. As seqüências
foram analisadas pelo programa CodonCode (versão 1.4.1). As seqüências foram
alinhadas pelo ClustalW através do programa MEGA (versão 4). As análises
estatísticas foram conduzidas por meio dos programas Arlequin (versão 3.01) e
DnaSP (versão 4.50.1). Os resultados da análise AMOVA mostraram que 100% da
variabilidade está dentro das populações, indicando que as populações não são
variáveis entre si. O valor calculado de Ф
ST
= -0,00121 (P<0,05) é indicativo de baixa
estruturação genética entre as populações avaliadas. Valores de moderada
estruturação (Ф
ST
= 0,04807 P<0,05) foram revelados pela comparação entre
indivíduos do Negro e do Paraguai. O teste de mantel (r = 0,50) mostrou que não há
correlação entre distância genética e distância geográfica. A falta de estruturação
pode ser explicada pela característica migradora da espécie em conjunto com a
topografia da região pantaneira. Desta forma, pela análise das seqüências as
populações devem ser manejadas com uma meta-população.
Palavras-chave: Pacu, Piaractus mesopotamicus, DNAmt, Conservação
ABSTRACT
The neotropical fish conceive the most diversified and rich ichthyofauna of the world.
However, in spite of this fish species diversity and its great economical importance
for human kind, little is known of its biological, ecological and genetic characteristics.
The identification and conservation of stock genetically diversified and adapted to its
habitat represent a key point to the fishery sector, because of its direct relation to
total productivity and sustainable use (management) of resources. Pacu (Piaractus
mesopotamicus) is a species of great occurrence in rivers from the hydrographic
basin of High Paraguai. Pacu’s fisheries is being monitorated and this has been
showing this species great importance. The maintenance of pacu’s stock in a
sustainable level depends, among others, on the populational genetic variability
conservation. For that to happen, the knowledge of pacu’s populations genetic
differentiation level is needed, which can be achieved by using molecular markers.
The present study was accomplished with the goal to evaluate pacu’s inner and
interpopulational structuring by analyzing sequences from the mtDNA’s control region
(d-loop). One hundred samples from four sub-basin, Cuiaba, Taquari, Negro and
Miranda were chosen for the evaluation. Total DNA was extracted from the caudal fin
of the samples, primers designed to the species (P. mesopotamicus) were used to
amplify d-loop region, purification of the amplified samples were performed followed
by its sequencing in ABI3100 automatic sequencer. Each sample was sequenced
twice, therefore a consensus sequence was generated. The sequences were
analysed through software CodonCode (Version 1.4.1). Sequences were aligned
using ClustalW feature from the MEGA software (Version 4). Statistical analyses
were performed using Arlequin (version 3.01) and DnaSP (version 4.50.1) softwares.
AMOVA analysis showed that 100% of variability is within populations, demonstrating
populations aren’t different from themselves. Calculated value of Ф
ST
= -0,00121
(P<0,05) indicate low genetic structuring between evaluated populations. Moderated
structuring values (Ф
ST
= 0,04807 P<0,05) were revealed in the compare between
individuals from Negro and Paraguai. Mantel test (r=0,50) showed there’s no
correlation between genetics and geographic distances. Lack of structure can be
explained by species migration characteristic along with Pantanal’s topography.
Therefore concluded by the sequences analysis, populations of pacu should be
manage as a metapopulation.
Keywords: Pacu, Piaractus mesopotamicus, mtDNA, Conservation.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Distribuição das amostragens de pacus nos locais de coleta .............. 30
TABELA 2. Seqüência do par de primers utilizados para a amplificação da região d-
loop do DNAmt de Piaractus mesopotamicus ......................................................... 33
TABELA 3. Componentes e concentrações dos reagentes utilizados nas reações de
PCR.......................................................................................................................... 34
TABELA 4. Condições dos ciclos de amplificação do programa de gradiente de
temperatura.............................................................................................................. 34
TABELA 5. Distribuição das amostras de Piaractus mesopotamicus de acordo com
as localidades geográficas e haplótipos encontrados. (-) haplótipos não
encontrados.............................................................................................................. 43
TABELA 6. Sítios polimórficos entre os haplótipos de Piaractus mesopotamicus.
Os números dos haplótipos estão listados na coluna à esquerda e as posições
polimórficas no alto da tabela. Os nucleotídeos do haplótipo 01 representam os
demais nucleotídeos na mesma posição. Nos sítios polimórficos os nucleotídeos
diferentes são indicados na tabela. Nucleotídeos idênticos são representados por (.)
................................................................................................................................. 45
TABELA 7. Diversidade genética. Dados de diversidade haplótipica (Hd),
diversidade nucleotídica (π) e testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu ...... 46
TABELA 8. Divergência nucleotídica (δ) entre as amostras de Piaractus
mesopotamicus estudadas em todas as localidades .............................................. 50
TABELA 9. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de populações
de Piaractus mesopotamicus, considerando todas sub-bacias como um único grupo
................................................................................................................................. 51
TABELA 10. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de
populações de Piaractus mesopotamicus, considerando cada sub-bacia como um
único grupo ............................................................................................................. 51
TABELA 11. Valores de Фst, que revelam a estrutura populacional ou ausência
dela, para as amostras dos rios estudados (abaixo da linha diagonal) e os valores P
(acima da linha diagonal) ........................................................................................ 52
TABELA 12. Valores do número de migrantes (Nm) entre os indivíduos de todos os
Rios estudados ........................................................................................................ 53
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1. Região controle (d-loop) do DNAmt Fonte: Selwood, S. P. et al.
2000................................................................................................................................. 15
FIGURA 2. Mapa dos rios da Bacia do Alto Paraguai. Fonte: Projeto GEF Alto Paraguai
......................................................................................................................................... 18
FIGURA 3. Pacu (Piaractus mesopotamicus, Holmberg, 1887). Fonte: Lovshin,
(FISHBASE)..................................................................................................................... 20
FIGURA 4. Quantidade total de pescado capturado (toneladas) na Bacia do Alto
Paraguai, MS, no período de 1994 a 2003. Fonte:SCPESCA/MS .................................. 24
FIGURA 5. Rios do Pantanal Mato Grossense e indicações dos locais de coleta (em
azul) Fonte : Embrapa –Pantanal..................................................................................... 31
FIGURA 6. Gel de agarose: DNA total extraído de amostras dos indivíduos de pacu da
Sub-bacia do Rio Cuiabá................................................................................................. 38
FIGURA 7. Gel de agarose: resultado do teste de gradiente de temperatura com a
amostra de DNA do indivíduo nº 5 do Rio Paraguai Mirim.............................................. 39
FIGURA 8. Gel de agarose: resultado do teste de concentração de MgCl
2,
as bandas
circuladas em vermelho são na concentração de 3,0mM, as bandas circuladas em azul
são de 1,5mM................................................................................................................... 40
FIGURA 9. Gel de agarose: resultados do teste de diluição do DNA total. As bandas
circuladas em vermelho estão na concentração de 1:18, as bandas circuladas em azul
são 1:9, as demais não amplificaram............................................................................... 41
FIGURA 10. Gel de agarose: resultado da purificação das amostras amplificadas de
amostras diversificadas.................................................................................................... 41
FIGURA 11. Gel de agarose: amplificação da amostra nº 7 do Rio Miranda, as bandas
circuladas em vermelho mostram uma região amplificada inespecífica (~600pb) de não
interesse........................................................................................................................... 42
FIGURA 12. Mapa esquemático – gráficos mostrando a freqüência dos haplótipos
distribuídos entre os Rios estudados............................................................................... 44
FIGURA 13. Árvore enraizada por Neighbor-joining (NJ) mostrando a distância entre os
34 haplótipos estimada por Tamura-Nei.......................................................................... 47
Figura 14. Rede de haplótipos – resultado mostra a relação entre os haplótipos
encontrados pela análise da região d-loop através do programa TCS. (
◦) representa cada
passo mutacional............................................................................................................. 48
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 10
1.1 Biodiversidade e conservação dos ecossistemas de água doce ................... 11
1.2 DNA mitocondrial (DNA) ................................................................................ 12
1.3 O Pantanal ..................................................................................................... 16
1.4 Pacu (Piaractus mesopotamicus) ................................................................... 20
1.5 Pesca: volumes e importância ....................................................................... 22
1.6 Populações – Unidades de Conservação ...................................................... 25
1.7 Filogeografia ................................................................................................... 27
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 29
2.1 Geral ............................................................................................................. 29
2.2 Específicos ................................................................................................... 29
3 METODOLOGIA .................................................................................................. 30
3.1 Processo de amostragem ............................................................................. 30
3.2 Extração do DNA total .................................................................................. 32
3.3 Análise de seqüências da região do D-loop mitocondrial ............................. 33
3.3.1 Amplificação por PCR ............................................................................. 33
3.3.2 Purificação do produto de PCR ............................................................... 34
3.3.3 Seqüenciamento do DNA ........................................................................ 35
3.4 Análise Estatística ......................................................................................... 36
4 RESULTADOS ..................................................................................................... 38
4.1 Extração do DNA total ................................................................................... 38
4.2 Amplificação da região do d-loop mitocondrial .............................................. 39
4.3 Região do d-loop mitocondrial ....................................................................... 42
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 54
5.1 Análise do polimorfismo da região controle (d-loop) do DNA mitocondrial ... 54
5.1.1 Variabilidade genética nas populações selvagens de pacu .................... 54
5.1.2 Neutralidade ............................................................................................. 56
5.2 Diversidade genética das populações de Piaractus mesopotamicus ........... 57
5.2.1 Fluxo gênico ........................................................................................... 60
5.2.2 Migração ................................................................................................. 61
5.3 Metapopulação .............................................................................................. 63
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 64
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 66
10
1 INTRODUÇÃO
Entre os vertebrados os peixes são os que apresentam a maior riqueza de
espécies, quase equivalente ao número aproximado de todas as espécies dos
demais grupos (MACHADO, 2003).
Apesar da sua relativa insignificância em termos de área, 1% da superfície da
terra, o ecossistema de água doce contém 43% de todas as espécies aquáticas.
Entre as 30.185 espécies de peixes descritas, cerca de 14 mil são espécies de água
doce, enquanto as restantes 16.937 espécies vivem em hábitats marinhos que
cobrem 70% da superfície (FISHBASE, 2008). Das 170 famílias de espécies de
peixes de água doce, a maior parte pertence às ordens Characiformes,
Cypriniformes, Siluriformes e Gymnotiformes, Perciformes, e Cyprinodontiformes.
Os peixes neotropicais compõem a ictiofauna mais diversificada e rica do
mundo. Segundo Lundberg et al. (2000) existe uma previsão entre 5.000 e 8.000
espécies para a ictiofauna neotropical. Aproximadamente 14% das espécies do
mundo são encontradas no Brasil (LEWINSOHN & PRADO, 2002). No entanto, essa
extraordinária biodiversidade ainda é pobremente conhecida (AGOSTINHO et al.,
2005). São aproximadamente 2600 espécies catalogadas para o país, do total de
4500 conhecidas até o momento (FISHBASE, 2008).
O número de espécies nos ecossistemas brasileiros ainda é impreciso e difícil
de ser estimado. Entre as dificuldades destacam-se o número de bacias
hidrográficas pouco inventariadas, o insuficiente número de ictio-taxonomistas, a
falta de infra-estrutura necessária para os processos de amostragem e a dificuldade
na divulgação das informações que freqüentemente são de difícil acesso
(AGOSTINHO et al., 2005).
A “Lista das Espécies Ameaçadas” produzida pelo Ministério do Meio
Ambiente relaciona 135 espécies de peixes de água doce em estado de
vulnerabilidade ou em risco de extinção no país (BRASIL, 2004).
Contudo, apesar desta diversidade de espécies de peixes e da sua grande
importância econômica para o homem, ainda pouco se conhece sobre suas
características biológicas, ecológicas e genéticas. A “IUCN – The World
11
Conservation Union” avaliou que de todas as espécies de peixes listadas, apenas
6% das espécies têm sido avaliadas na IUCN Red List, sendo 631 destas
exclusivamente de água doce (FISHBASE, 2005). Apesar dos dados da IUCN terem
sua origem em apenas algumas áreas geográficas do planeta há fortes indicativos
de que a ameaça sobre a ictiofauna no mundo é maior do que a já observada como,
por exemplo, no leste da África onde 27% de peixes de água doce estão sob
ameaça ou na América do Norte onde 20% também estão ameaçados (BAILLIE et
al., 2004).
1.1 Biodiversidade e conservação dos ecossistemas de água doce
Assim como ocorre com a biodiversidade terrestre, os estudos com
ecossistemas aquáticos são fortemente direcionados para organismos
comercialmente atrativos. Neste sentido não é surpresa observar que os peixes têm
recebido a maior atenção (AGOSTINHO et al., 2005).
Atualmente, os conceitos de “biodiversidade” e “conservação” são
considerados indispensáveis para o desenvolvimento sustentável nas diversas
regiões do mundo. A biodiversidade engloba a abundância, a diversidade de
espécies, a diversidade genética, por sua vez, reflete a variedade de genes e pode
ser estudada em nível de espécie ou de populações de uma mesma espécie.
O conhecimento da diversidade biológica é fundamental para manutenção
das espécies no que concerne à sua habilidade de adaptação e resposta às
freqüentes mudanças ambientais (BARKER & TINGEY, 1992).
A perda da biodiversidade compromete o funcionamento dos ecossistemas,
sendo, então, de suma importância a conservação dos mesmos (EHRLICH &
EHRLICH, 1992). Os ambientes aquáticos, por exemplo, são considerados um dos
mais ameaçados à perda da diversidade, por serem alvo de grande acesso e
utilização antrópica (MACHADO, 2003). Como conseqüência, a vulnerabilidade de
peixes aumenta intensamente e sua diversidade acaba sendo comprometida.
De acordo com Bruton (1995), fatores como a deterioração dos ambientes
aquáticos por poluição, assoreamento, barramento de rios, pesca predatória e
12
introdução de espécies exóticas, são algumas das causas relacionadas com o
declínio da diversidade de peixes e da variabilidade dos mesmos.
A conservação da variabilidade genética das populações de peixes ou outros
organismos aquáticos é, portanto, uma etapa fundamental para manutenção da
viabilidade destas populações a médio e longo prazo (PULLIN et al.,1999).
Sob o ponto de vista populacional, a diversidade genética dos peixes pode de
um modo geral, ou estar homogeneamente espalhada por toda a área de
distribuição geográfica de uma determinada espécie de peixe, ou estar concentrada
em determinadas subáreas populacionais, designadas como unidades de manejo
(MORITZ, 1994). As unidades de manejo podem ser reconhecidas como
subpopulações que se distinguem umas das outras através de diferenças significas
na composição genética, que pode ser detectada por meio de marcadores
moleculares, nucleares ou mitocondriais.
Nos últimos anos, o uso de marcadores moleculares tem crescido
consideravelmente em estudos de genética populacional de peixes. O uso dos
marcadores permite analisar a variabilidade populacional, como pode revelar uma
estrutura genética na população. O emprego de marcadores moleculares em peixes
vem sendo feito com o intuito de estudar variações genéticas dentro e entre
populações, ou estudar as relações filogenéticas entre espécies, famílias e ordens.
Atualmente, a análise do DNA representa uma boa opção de estudo para se testar
hipóteses filogenéticas e biogeográficas, além de testar hipóteses de isolamento de
populações.
A ictiofauna de água doce no Brasil apresenta um papel fundamental, tanto
em termos ambientais como em sua contribuição para o conjunto da biodiversidade
de diversos ecossistemas e também pela sua importante contribuição para a
economia e alimentação de diversas populações ribeirinhas e urbanas. Desta forma,
estabelecer programas de conservação de espécies e também de populações de
peixes de forma a garantir sua sobrevivência em longo prazo não somente é uma
questão de importância ecológica, mas também uma estratégia de desenvolvimento
econômico.
13
1.2 DNA mitocondrial (DNAmt)
O DNA mitocondrial (DNAmt) animal é uma molécula circular pequena
fechada covalentemente, com tamanho variável, em geral de 16 a 20 kb (AVISE et
al., 1987). Apresenta um conteúdo gênico altamente conservado que contém 37
genes, representado por dois genes que codificam RNAs ribossômicos (12s e 16s),
22 genes que codificam RNAs transportadores (tRNAs) e 13 genes que codificam
proteínas envolvidas no transporte de elétrons e na síntese de ATP (7 subunidades
da NADH desidrogenase, 3 subunidades da citocromo c oxidase, 2 subunidades da
ATP sintase e do citocromo b) (CLAYTON, 1984).
Além das características ímpares deste genoma, o amplo conhecimento desta
molécula está relacionado à facilidade de purificação, quando comparada a qualquer
outro fragmento de DNA nuclear. Essa facilidade de purificação é devida à sua
densidade incomum, à ocorrência de grande número de cópias e ao fato de estar
localizado em uma organela e não no núcleo (WILSON et al., 1985). Outras
características do DNAmt tais como: 1. alta taxa de substituição de nucleotídeos
(cinco a dez vezes superior ao DNA nuclear) (BROWN et al., 1982); 2. herança
materna (DAWID & BLACKLER, 1972); 3. conservação do tamanho, conteúdo e
ordem gênica (WALLACE, 1982), transformaram-no em uma ferramenta muito
utilizada para detectar diferenças genéticas intra e interespecíficas bem como um
marcador molecular muito utilizado na caracterização de estoques selvagens e
cultivados de peixes (BROUGHTON & DOWLING, 1994).
Os peixes parecem apresentar uma taxa de substituição de nucleotídeos do
DNAmt menor do que a dos vertebrados superiores (KOCHER et al., 1989). Algumas
hipóteses foram levantadas para explicar a alta taxa evolutiva do DNAmt, entre elas
está a ineficiência dos mecanismos de reparo para corrigir as mutações que surgem
durante a replicação; o relaxamento de função e/ou da seleção; e a grande
exposição do DNAmt a danos oxidativos (CLAYTON, 1984).
Praticamente todo o genoma mitocondrial está envolvido em funções
codificadoras, sendo que íntrons, DNA repetitivo e seqüências espaçadoras entre
genes são raras ou ausentes. Porém, existe nos vertebrados uma região não-
codificadora chamada região controle “d-loop” (Figura 1), que recebeu este nome
14
por conter o “displacement loop”, com cerca de 800pb que contém os promotores da
transcrição das cadeias leve e pesada, assim como a origem de replicação da
cadeia pesada (CLAYTON, 1984). A taxa de evolução da região controle é de duas
a cinco vezes superior à dos genes mitocondriais que codificam proteínas e essa
região é a mais variável do DNAmt, apresentando a maior taxa de substituição de
nucleotídeos, assim como a maior variação no número de seqüências repetidas em
tandem (200 - 4100 pb). Essas seqüências são consideradas como as principais
responsáveis pelas variações no tamanho do genoma mitocondrial de vertebrados
(MORITZ et al., 1987).
15
Figura 1. Região controle (d-loop) do DNAmt. Fonte: Selwood, S. P. et al., 2000.
A região controle também contém a mais alta freqüência de mutações no
comprimento em nível de população. Dos três tipos de mutações que ocorrem nas
seqüências, as substituições de bases (em vertebrados as transições são mais
freqüentes que as transversões) algumas envolvem pequenas adições/deleções de
16
nucleotídeos e outras são causadas por diferenças no tamanho da molécula do
DNAmt. Adições e deleções são freqüentemente mais observadas na região controle
e nos espaçadores intergênicos. Outros genes mitocondriais ou nucleares podem ter
taxas de substituição mais adequada para questões particulares. Analisando base
por base a região controle pode fornecer mais informações sobre o nível
populacional e contêm mais (até três vezes mais) informações filogenéticas que o
citocromo b (MEYER, 1994).
Estudos de variação geográfica do DNAmt vêm sendo realizados em diversas
espécies de peixes, em escalas espaciais e temporais. Em razão de apresentar uma
alta taxa de evolução e de gerar marcadores genéticos que distinguem populações
geográficas com grande eficiência, o DNAmt é capaz de fornecer informações
relacionadas à estrutura populacional e à história evolutiva de uma grande variedade
de organismos (MEYER, 1994).
1.3 O Pantanal
O Pantanal é uma vasta planície alagável localizada na Bacia do Alto
Paraguai (BAP), que abrange áreas do Brasil, Paraguai e Bolívia. Considerado
Patrimônio Nacional pela Constituição Federal de 1988, e reconhecido em 2000,
como Reserva da Biosfera e Patrimônio Natural da Humanidade pela Organização
das Nações Unidas para a Educação, Ciência e Cultura (UNESCO). Esta região
apresenta um regime hidrológico peculiar que se caracteriza pela alteração sazonal
dos níveis dos rios, chamado pulso de inundação, que está entre os principais
fatores que regem o funcionamento do sistema e garantem a biodiversidade da
região (EMBRAPA, 1997).
A área de abrangência total da Bacia do Alto Paraguai (BAP) equivale a
496.000 km
2
, ocupando o centro da América do Sul em territórios do Brasil, Paraguai
e Bolívia, estando compreendida entre os paralelos 14º e 22º S e os meridianos 53º
e 61º W (CARVALHO, 1986). Em território Brasileiro, a BAP ocupa 361.666 km
2
,
inteiramente compreendida nos estados de Mato Grosso ao norte e Mato Grosso do
Sul ao sul (BRASIL, 1997).
17
O Pantanal ocupa uma área de 138.183 km
2
tendo o Rio Paraguai como a
espinha dorsal do sistema de drenagem. O Rio Paraguai corre no sentido norte-sul,
recebendo água dos Rios Jaurú, Cabaçal e Sepotuba pela margem direita e Rios
Cuiabá (com seus afluentes São Lourenço e Piquiri), Taquari, Miranda (com seu
afluente Aquidauana), Negro e Apa pela margem esquerda, sendo que esse último
delimita a BAP ao sul, estabelecendo a fronteira Brasil-Paraguai (Figura 2). Nesse
trecho, ao deixar a BAP, o Rio Paraguai apresenta uma vazão média de 1.430 m
3
/s,
indo juntar-se ao Rio Paraná somente depois de cruzar todo o Paraguai, logo acima
da cidade de Corrientes, na Argentina (BRASIL, 1982; CARVALHO, 1986; BRASIL,
1997).
O Rio Paraguai, bem como os outros rios pantaneiros, apresenta uma baixa
declividade, cerca de 20 a 30 cm por quilômetro. A diferença no nível das águas
entre as estações de seca e de cheia é em média de quatro metros, mas devido à
baixa declividade pode alagar todo o Pantanal (POR et al., 1997).
O Pantanal está situado em uma região de clima seco onde a pluviosidade de
1.100 mm/ano é ultrapassada pela evaporação média que é de 1.400 mm/ano. As
chuvas estão concentradas nos poucos meses de verão e são seguidas por uma
longa seca de inverno. O Pantanal seria semi-árido não fossem as águas trazidas
pelos rios que surgem de fora desta região (POR et al., 1997). Os ecossistemas são
caraterizados por cerrados e cerradões sem alagamento periódico, campos
inundáveis e ambientes aquáticos, como lagoas de água doce ou salobra, rios,
vazantes e corixos. Apesar do seu caráter arenoso, o Pantanal é uma das maiores e
mais complexas áreas úmidas do mundo (RESENDE, 2003).
A região do Pantanal abriga flora e fauna diversificadas, num total de 1.863
espécies de plantas superiores, 122 de mamíferos, 93 de répteis, 263 de peixes e
656 de aves, como sintetizou Da Silva (2000) a partir de vários autores.
18
Figura 2. Mapa dos rios da Bacia do Alto Paraguai. Fonte: Projeto GEF Alto Paraguai
http://www.ana.gov.br/gef/graficos/MapaGEF.jpg
Os peixes são os animais mais estudados no Pantanal. No entanto, ainda
existem muitas lacunas, muitas áreas ainda não estão suficientemente amostradas e
a história de vida é pouco conhecida. Britski et al. (1999) listam 263 espécies de
peixes pertencentes a 161 gêneros e 36 famílias nesta região. A ordem
Characiformes, com 65 gêneros e 129 espécies e Siluriformes com 61 gêneros e
19
105 espécies predominam, um padrão que é característico em ambientes de água
doce neotropical.
Segundo Bánárescu (1990) devido seu passado geológico a maioria das
espécies da ictiofauna pantaneira é de origem amazônica, mas há também espécies
que são características da Bacia Paraná-Paragua. Entretanto, por ser principalmente
um corredor, não abriga uma fauna endêmica tão rica quanto a da Amazônia (POR
et al., 1997). Além disso, em lugar de inúmeras bacias de rios isolados como na
Amazônia, todos os rios do Pantanal comunicam-se entre si durante as cheias,
havendo uma permanentemente mistura da ictiofauna.
A BAP representa uma importante região para a pesca continental. Nesta
região, a pesca é a segunda atividade de importância econômica, correspondendo à
principal fonte de renda de milhares de famílias e, mais recentemente, de empresas
ligadas ao turismo pesqueiro. Assim, além de sua importância ecológica, os recursos
pesqueiros são fundamentais para a pesca de subsistência, amadora ou esportiva,
profissional e artesanal (CATELLA & ALBUQUERQUE, 2007).
A pesca esportiva na planície pantaneira tem crescido nos últimos dez anos
tornando-se a segunda atividade econômica mais importante, perdendo somente
para pecuária, com a chegada de 56.000 pescadores a cada ano no sul do Pantanal.
O número de visitantes ao norte do Pantanal é desconhecido, mas 65.000 são
estimados para o Pantanal inteiro (RESENDE, 2003).
Total da área protegida corresponde a 360.000 ha (2,6% do Pantanal
brasileiro) (http://www.ibama.gov.br/). Entretanto, os agentes da Polícia Florestal e
do IBAMA não são suficientes para fiscalizar toda área, o que facilita a caça e a
pesca predatórias das espécies pantaneiras.
Nas últimas três décadas, a região vem sofrendo agressões pelo homem,
praticadas principalmente nos planaltos adjacentes. Atualmente, os impactos
ambientais e sócio-econômicos no Pantanal são bastante evidentes, decorrentes da
inexistência de um planejamento que garanta a sustentabilidade dos recursos
naturais desse importante bioma. A Embrapa Pantanal vem respondendo aos
desafios de gerar uma nova base de informação tecnológica, capaz de conciliar o
desenvolvimento econômico com a conservação ambiental. As pesquisas mostram
que é possível utilizar de forma sustentável os recursos naturais da região,
proporcionando a elevação da renda e melhoria da qualidade de vida da população
20
pantaneira, além de estudar alternativas como o ecoturismo, gerando empregos e
garantindo a conservação do meio ambiente (EMBRAPA, 1997).
As pesquisas efetuadas ao longo dos últimos 20 anos, por pesquisadores de
diferentes áreas, vêm mostrando que o pulso de inundação é o processo ecológico
chave a ser mantido para a manutenção e conservação de rios com grandes
planícies de inundação. Há necessidade de continuidade de estudos para refinar o
entendimento dessa dinâmica, considerando principalmente o efeito das variações
plurianuais dos pulsos de inundação que ocorrem na região.
1.4 Pacu (Piaractus mesopotamicus)
Piaractus mesopotamicus (HOLMEBERG, 1887) é o peixe mais
representativo do Pantanal e ocorre em quase todas as regiões durante o período
das cheias. A espécie é conhecida popularmente como pacu-caranha, pacu-guaçu,
ou simplesmente pacu (Figura 3) (RESENDE, 2003).
Figura 3. Pacu (Piaractus mesopotamicus, Holmberg, 1887). Fonte: Lovshin, (FishBase).
21
Pertencente a família Characidae, historicamente era encontrado ao longo de
toda Bacia do Paraná-Paraguai (RESENDE, 2003). Contudo, de acordo com Quirós
(1993) está desaparecido do Rio La Plata desde 1980 e dificilmente é encontrado
nos rios Paraná Baixo e Uruguai. Trata-se de uma das espécies de grande valor
comercial e de grande potencial para o desenvolvimento da piscicultura nacional
(CALCAGNOTTO et al., 2001).
O pacu possui corpo ovalado e robusto com dorso cinza escuro e ventre
amarelado, podendo atingir 82 cm de comprimento total. Sua coloração pode mudar
de quase preto, quando ocorre nas áreas inundadas, na época das cheias, a
amarelo-brilhante, quando se encontra nas cabeceiras dos rios para a reprodução.
Sua alimentação onívora, com grande tendência à herbivoria, demonstra seu
alto grau de oportunismo quanto à exploração dos diferentes tipos de alimentos em
várias épocas do ano, o que parece garantir o sucesso na exploração dos recursos
ambientais (MACHADO, 2003). Possui como característica marcante uma dentição
própria para mastigar e triturar, os dentes são do tipo molariformes grandes
multicuspidados, especialmente adaptados para quebrar e esmagar os frutos e
sementes que compõem a sua alimentação na fase adulta (BRITSKI, 1970).
Apresenta respiração branquial obrigatória, sobrevivendo tanto em ambiente natural
quanto em viveiros de criação. Quando submetido à baixa tensão de oxigênio
dissolvido, desenvolve a formação de uma expansão temporária do lábio inferior,
vulgarmente chamada beiço (FERRAZ DE LIMA et al., 1995).
Assim como a maioria das espécies comerciais do Mato Grosso, o pacu é um
peixe de ambiente lótico que desova após um longo período de migração. A
maturação dos ovários leva quatro meses para se completar (entre julho a outubro)
e a desova acontece geralmente em novembro na cabeceira do Rio Cuiabá
(FERRAZ DE LIMA et al., 1984). Há descrições da ocorrência de adultos em
reprodução também nas cabeceiras do Rio Taquari (RESENDE, 2003).
Segundo Silva & Silva (1985) no período da enchente, as sementes e os
frutos constituem os itens mais importantes na dieta alimentar do pacu nas áreas
alagáveis. As proteínas obtidas nestas estruturas de plantas são armazenadas como
reservas de gorduras para investir em processos reprodutivos e migratórios. Na
época da vazante, indivíduos de cinco ou seis meses de idade deixam os campos
inundados e concentram-se nos alagados permanentes até o terceiro ano de vida,
quando começam a compor os cardumes e a migrar anualmente rio acima. É um
22
peixe altamente sensível à variação do nível de água, sendo o primeiro a sair do
campo inundado, quando as águas começam a baixar (AGOSTINHO et al., 2003).
Mesmo sendo uma espécie de grande importância econômica do Pantanal,
pouco se sabe sobre sua biologia, especialmente sobre sua migração. No entanto, a
maior parte dos estudos sobre a espécie é voltado a sua reprodução artificial,
nutrição e patologia.
1.5 Pesca: volumes e importância
As atividades humanas têm deixado sua marca em riachos e rios durante
milhares de anos. Como conseqüência da industrialização e do crescimento da
população humana, a pressão sobre a água natural e seus hábitats tem-se
intensificado através da história, e a degradação dos hábitats aquáticos tem-se
acelerado com conseqüências negativas para as espécies aquáticas e, portanto,
também para a pesca.
A utilização sustentável de recursos naturais, especialmente de recursos
pesqueiros, é um desafio formidável que necessita ser encarado sob o ponto de
vista técnico, político, econômico e social. Os recursos pesqueiros podem ser
utilizados economicamente pela pesca profissional e amadora (esportiva), bem
como pelas comunidades ribeirinhas como fonte de proteína nobre para a
alimentação, através da pesca de subsistência. Assim como em vários outros
países, a pesca profissional de águas interiores possui um expressivo valor
econômico e social no Brasil, particularmente na Amazônia e no Pantanal
(RESENDE, 2005).
As características físicas do Pantanal, associadas à ocorrência das
inundações anuais, propiciam uma grande produção natural de peixes, que é
utilizada pela pesca, razão pela qual se tornou uma das principais atividades
econômicas, sociais e ambientais da região. Essa atividade é praticada em três
modalidades, que também configuram os principais atores do setor: pesca
profissional artesanal, amadora (ou esportiva) e de subsistência (CATELLA, 2006). A
atividade pesqueira no Pantanal traz benefício local direto (apropriação e
23
comercialização de pescado, geração de empregos) e indireto (valor agregado ao
turismo de pesca – despesas em hotéis, restaurantes e empresas de turismo da
região) (RESENDE, 2005).
A pesca no Pantanal está centrada em poucas espécies de importância
comercial. Assim, a pressão de pesca sobre essas espécies é muito grande,
principalmente se levarmos em conta que existem mais de 260 espécies de peixes
na região e milhares de pescadores a cada ano (MORAES et al., 2002).
O pacu é uma das espécies nativas mais cultivadas no Brasil. Características
como rusticidade, crescimento rápido e facilidade em aceitar ração, bem como
potencial para pesca esportiva e carne muito bem aceita pelo mercado consumidor
tornaram o pacu uma espécie importante para a aqüicultura interior (CASTAGNOLLI
& CYRINO, 1986).
A pesca do pacu tem sido monitorada desde 1994 pela Embrapa Pantanal e
vem mostrando a grande importância desta espécie para a pesca tanto esportiva
como profissional, em contra ponto tem se observado a diminuição do estoque com
o aumento do esforço pesqueiro mostrando que a exploração estava acima de sua
capacidade de regeneração, levando a espécie de primeiro lugar em volume de
captura no Pantanal para o terceiro lugar em 2003 (Figura 4) (CATELLA &
ALBUQUERQUE, 2007). Para a manutenção das populações selvagens de pacu no
Pantanal do Mato Grosso vem sendo dada especial atenção à conservação das
zonas inundadas quanto à vegetação e à qualidade da água (CALCAGNOTTO,
1998).
Figura 4. Quantidade total de pescado capturado (toneladas) na Bacia do Alto Paraguai, MS, no
período de 1994 a 2003. Fonte: SCPESCA/MS.
24
A fim de manejar a exploração excessiva, foi estabelecido um tamanho
mínimo de captura do pacu de 40 a 45 cm (RESENDE, 2003). O tamanho mínimo de
captura é aquele acima do qual todos os indivíduos de uma determinada espécie já
se reproduziram pelo menos uma vez. Levando-se em conta que uma única
reprodução de um peixe significa a produção de milhares de ovos e dezenas de
novos indivíduos, ao se adotar o tamanho mínimo de captura, se considera que
estão sendo capturados indivíduos que já deram uma contribuição significativa para
a sua população de origem (RESENDE, 2005).
Apesar de ser uma das bacias mais importantes em termos da pesca
esportiva e comercial, poucos têm sido os estudos sobre o padrão de estruturação
genética de populações de peixes na Bacia do Alto Paraguai.
Para a conservação e uso sustentado dos recursos naturais a Embrapa
Pantanal vem há anos estudando os recursos pesqueiros, a fim de conhecer a
biologia, ecologia e genética da espécie para gerar subsídios para sua conservação
e uso sustentado.
O manejo de estoques pesqueiros utiliza medidas de ordenamento como a
definição de épocas de pesca, respeitando, por exemplo, o período de reprodução
das espécies - chamado “período de defeso”; restrição do uso de apetrechos de
pesca, proibindo aqueles equipamentos pouco seletivos, que, portanto, desfalcariam
as populações em várias faixas etárias, incluindo os juvenis; e definindo os
tamanhos dos indivíduos capturados – “tamanho mínimo de captura”, evitando que
sejam capturados os indivíduos que nunca se reproduziram.
1.6 Populações - Unidades de Conservação
A conservação de um determinado recurso biológico aquático requer o
conhecimento de variáveis fisiológicas, comportamentais e ecológicas, que são
importantes na determinação de como uma dada população sobrevive e se reproduz
em diferentes ambientes (DANZMANN et al., 1991). Um dos pontos centrais destes
fatores é o entendimento da estrutura populacional da espécie para que se
25
determinem tanto as respostas fisiológicas às variações ambientais como as
estratégias de manejo das populações naturais (RYMAN & UTTER, 1987).
O conceito de populações locais, subpopulações, estoques ou demes (DIZON
et al., 1992) pode diferir em relação ao grau de homogeneidade genética,
importância quanto ao isolamento reprodutivo e ao potencial para a exploração
(GULLAND, 1969). No caso de recursos pesqueiros o conceito de população local
se complica ainda mais por fatores políticos, econômicos e sociais (CARVALHO &
HAUSER, 1994).
Uma abrangente definição de populações locais foi proposta por Ihssen et al.
(1981), que descreveram uma população local como “um grupo intraespecífico de
indivíduos que se reproduz ao acaso com integridade espacial e temporal”. Esta
definição, quando aplicada a um recurso biológico potencialmente explorável, com
baixo grau de integridade, as diferenças genéticas e fenotípicas entre as populações
não são levadas em consideração. Assim, neste caso, as populações abrangem
apenas os indivíduos cuja abundância depende das taxas de recrutamento e
mortalidade. Já o conceito populacional, dentro de um ponto de vista genético,
atribui a tal unidade biológica um alto grau de integridade que leva em consideração
o isolamento reprodutivo, diferenciação genética de outras populações,
especialização ecológica e adaptação local.
Desta forma, o conceito de população descrito por Ihssen et al.(1981) pode
ser interpretado de acordo com o manejo a ser implementado, aqui especificamente,
sobre um recurso biológico aquático. Por um lado, temos uma estratégia a curto
prazo cuja preocupação básica é a manutenção do recurso, evitando sua redução
pelo excesso de captura; por outro, temos uma estratégia de conservação a longo
prazo, que leva em consideração a diversidade genética dentro e entre populações.
De qualquer modo a existência destas diferenças oferece a oportunidade de
obter informações sobre a estrutura genética de populações, podendo-se assim
traçar estratégias de conservação, bem como, o conhecimento e identificação das
melhores estirpes a serem usadas em programas de melhoramento.
Sem dúvida, esforços no sentido de explorar ou manejar uma espécie de
peixe pode alterar a estrutura genética desta espécie. Têm-se observado alterações
produzidas pela captura intensiva de populações naturais ou pelo estabelecimento
em larga escala de populações produzidas em centrais de produção de alevinos por
muitas gerações. Tais atividades aumentam em magnitude e intensidade a
26
necessidade de metodologias de análises que permitam descrever as características
genéticas e com isso avaliar a extensão destas alterações.
Desta forma, torna-se necessário a descrição da estrutura genética de
populações naturais, do desenvolvimento de marcadores genéticos com os quais um
simples peixe possa ser identificado e pelo desenvolvimento de sistemas de
monitoramento das mudanças quantitativas e qualitativas dos recursos aquáticos
provenientes das várias atividades de manejo, isto é, por métodos sensíveis para se
estimar a perda de variação genética nas populações naturais.
Em várias partes do mundo o manejo da ictiofauna, seja ele no contexto da
conservação da biodiversidade ou pela manutenção e incremento da produção
pesqueira, tem forte apelo sócio-econômico e ambiental. Por isso mesmo tem sido
alvo de grandes esforços em conhecimento e recurso financeiro por parte das
iniciativas públicas e privadas (SILVA, 2006).
Os programas mais modernos de manejo da ictiofauna utilizam diversas
técnicas para alcançar seus resultados, entre elas, podemos destacar a implantação
de períodos de defeso, definição de cotas de captura, normatização dos tipos de
equipamentos permitidos para captura, vitalização das áreas de desova e
crescimento, potencialização de ambientes naturais, recuperação de ambientes
degradados, educação ambiental, repovoamento, estudos de facilidades para
transposição de peixes migradores, entre outros (SILVA, 2006).
1.7 Filogeografia
Sob o ponto de vista populacional, a diversidade genética dos peixes pode de
um modo geral, ou estar homogeneamente espalhada por toda a área de
distribuição geográfica de uma determinada espécie de peixe, ou estar concentrada
em determinadas subáreas populacionais designadas como estoques, bancos
genéticos naturais, ou unidades de manejo (MORITZ, 1994). As unidades de manejo
podem ser reconhecidas como subpopulações que se distinguem através de
diferenças significativas na composição genética detectada por meio de marcadores
genéticos moleculares (CALCAGNOTTO, 1998).
27
Sob o ponto de vista biogeográfico, tem-se procurado caracterizar a
distribuição da biodiversidade ictiogenética usando uma hierarquia de quatro
padrões filogeográficos do DNAmt e a existência ou não de barreiras zoogeográficas
(AVISE, 1994).
A partir da década de 80, a utilização de dados obtidos através de estudos
com DNAmt desencadeou uma mudança de atitude em relação a hipótese
filogenética no que diz respeito à estrutura populacional intraespecífica de vários
grupos biológicos. Avise et al. (1987) propuseram o conceito de “filogeografia” para
abranger o estudo dos princípios e processos que seriam responsáveis pela
distribuição geográfica de várias categorias biológicas, especialmente das
intraespecíficas. Avise (1989) sugeriu a criação de quatro categorias populacionais,
baseadas em dois critérios principais: 1. distância genética estimada através de
dados do nível de divergência entre as seqüências de DNAmt. 2. localização
geográfica dos agrupamentos de haplótipos de DNAmt.
Categoria Filogeográfica I: Engloba populações alopátricas que apresentam
diferenças genéticas significativas entre si. A hipótese mais aceita para explicar as
grandes diferenças genéticas que apresentam distribuição geográfica seria a
existência de barreiras físicas extrínsecas antigas ao fluxo gênico. Outra
possibilidade seria a extinção de genótipos intermediários nos casos de espécies
com dispersão e fluxo gênico limitados. Em termos de conservação genética, as
populações incluídas na Categoria I devem ser tratadas como unidades separadas
(AVISE, 1989).
Categoria Filogeográfica II: Constituída por populações que apresentam
diferenças genéticas entre si, mas que se encontram em simpatria. Este tipo de
situação poderia surgir com o aparecimento de áreas de contato secundárias
recentes ou a existência de barreiras intrínsecas, como, por exemplo, barreiras
devidas ao isolamento reprodutivo. Geograficamente, não haveria razão para não
serem consideradas como uma única população, mas a ocorrência de diferenças
morfológicas e genéticas poderia ser indicativa de algum grau de isolamento
reprodutivo (AVISE, 1989).
Categoria Filogeográfica III: Nesta categoria são encontradas populações
alopátricas que, no entanto, são geneticamente semelhantes que ocupam regiões
geográficas distintas e que, entretanto, apresentam pouca ou nenhuma diferença
genética, ou seja, menos de 1% de divergência de DNAmt. Uma explicação para a
28
separação geográfica de clones de DNAmt neste caso envolveria fluxo gênico
historicamente limitado entre espécies que não estejam subdivididas por barreiras
zoogeográficas antigas (AVISE et al., 1987).
Categoria Filogeográfica IV: Nesta categoria estão incluídas as populações
cujas diferenças entre os haplótipos de DNAmt e suas freqüências são pequenas ou
praticamente inexistentes e que ocupam a mesma área, não se encontram
subdivididas por barreiras geográficas antigas ou recentes. Nesses casos haveria
pouco ou nenhum isolamento reprodutivo. Esta categoria propõe que as populações
de espécies tenham tido contato recente por meio de fluxo gênico intenso (AVISE et
al., 1987).
A estrutura filogeográfica pode variar desde as evolutivamente “rasas”, isto é,
com diferenças genéticas relativamente pequenas e restritas a apenas alguns genes
e a certas populações geográficas até as evolutivamente “profundas”, isto é, que
apresentam diferenças genéticas significativas em relação a vários genes e com
distribuição geográfica concordante (AVISE, 1994).
29
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Testar a hipótese de panmixia das populações de Piaractus mesopotamicus
em Rios do Pantanal.
2.2 Específicos
Avaliar a variabilidade genética de populações selvagens de Piaractus
mesopotamicus amostradas em quatro sub-bacias do Pantanal formadas
pelos Rios Cuiabá, Taquari, Miranda, Negro e o próprio Rio Paraguai,
formadores da grande Bacia do Alto Paraguai, por meio de análises de
seqüências da região controle (d-loop) do DNA mitocondrial;
Analisar a variabilidade genética entre e dentro das populações selvagens do
pacu da Bacia do Alto Paraguai;
Avaliar o uso da região d-loop como marcador molecular em estudos de
genética populacional;
Sugerir estratégias de conservação das populações de pacu de acordo com
os resultados obtidos pelo presente estudo.
30
3 METODOLOGIA
3.1 Processo de amostragem
A coleta de material biológico para a extração de DNA total de Piaractus
mesopotamicus foi realizada ao longo de um ano em várias expedições por meio de
redes de espera estabelecidas em pontos de ocorrência da espécie nos rios
escolhidos (Tabela 1 e Figura 5). As coletas foram realizadas pela Embrapa –
Pantanal. As amostras de nadadeira caudal e/ou adiposa foram armazenadas em
álcool etílico a 95% e estocadas a -20°C. Posteriormente foram enviadas para o
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aqüicultura (LAGOAA) / Núcleo
Integrado de Biotecnologia / Universidade de Mogi das Cruzes, onde todos os
procedimentos laboratoriais foram realizados.
O número amostral estabelecido, 10 amostras por localidade, está dentro do
padrão utilizado em estudos populacionais de espécies neotropicais com o
seqüenciamento do DNAmt (SANTOS et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2006; SUN et
al., 2004; MARTINS et al., 2003; SIVASUNDAR et al., 2001).
Tabela 1. Distribuição das amostragens de pacus nos locais de coleta.
Localidade
Local de amostragem
N
Coordenadas geográficas
latitude Sul
longitude Oeste
Cuiabá
Rio Cuiabá (Parque Nacional-Foz) 10 17°51'49" 57°30"36"
Rio São Lourenço 10 17°50"48" 57°23'29"
Rio Cuiabá (Sesc Pantanal) 10 16°44'28,7" 56°29'18,6"
Taquari
Rio Taquari (Caronal) 10 18°15'01,5" 56°08'16,3"
Rio Taquari (Palmeiras) 10 18°21'49" 54°36'49"
Negro Rio Negro 10 ----- -----
Miranda Rio Miranda (Formoso) 10 21°04'53" 56°'''45"
Paraguai
Rio Paraguai (Mirim) 10 18°51'52" 57°25'26"
Rio Paraguai (Corumbá) 10 19°00'36" 57°31'46"
Rio Paraguai (Cáceres) 10 16°03'49" 57°41'34"
31
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GRANDE
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DO LEVEGER
CHAPADA
GUIMARÃES
CUIABÁ
MIMOSO
RONDONOPOLIS
BARÃO DE MELGAÇO
Tangará da
Serra
Barra do
Bugre
Alto
Paraguai
Diamantino
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Rosário do
Oeste
Descalvados
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Corumbá
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Rio Negro
Rio Verde do
Mato Grosso
São Gabriel
do Oeste
Camapuã
Miranda
Bandeirantes
Aquidauana
Anastácio
Terenos
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Grande
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Porto São
Francisco
15º S
60º W
55º W
20º S
B O L I V I A
P A R A G U A I
0 50 100 km
Figura 5: Rios do Pantanal Mato Grossense e indicações dos locais de coleta (em azul). Fonte: Embrapa
Pantanal.
32
3.2 Extração do DNA total
A extração do DNA total das amostras foi realizada de acordo com o protocolo
descrito por Taggart et al. (1992), modificado com a adição de tampão STE (0,1 M
NaCl, 0,05 M Tris-HCl e 0,001 M EDTA, pH 8,0) com concentração reduzida de
EDTA, visto que este pode reagir com o MgCl
2
e reduzir a eficiência das
amplificações por PCR.
O tecido das nadadeiras foi cortado em pedaços menores e hidratado em
tampão TE (Tris-HCl e EDTA, pH 7,5) durante 1h e 30min. Ao final deste tempo,
todo o TE foi substituído por 500 µl de tampão STE, 30 µl de SDS a 10% (Dodecil
Sulfato de Sódio) e 10 µl de proteinase K (Invitrogen) a 20mg/ml. O material foi
agitado vigorosamente e incubado a 65°C por aproximadamente 1 hora. Novamente
o material foi agitado após a adição de 5 µl de RNAse A (Invitrogen) a 10mg/ml e
incubado a 37°C por mais 1 hora.
O processo de separação do DNA total dos restos celulares, foi feito com a
adição de 400 µl de fenol equilibrado e 200 µl de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1)
e posterior centrifugação a 12000 rpm a 10 minutos. Cerca de 600 µl do
sobrenadante foram transferidos para novos microtubos de 1,5 ml e uma segunda
purificação foi feita, porém apenas com clorofórmio/álcool isoamílico (600 µl) e
centrifugação a 12000 rpm por mais 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para
novos microtubos de 1,5 ml. A precipitação do DNA foi feita com adição ao
sobrenadante, de 1,0 ml de etanol gelado a 100% e 30 µl de acetato de sódio a 3,0
M (pH 5,2).
As amostras foram armazenadas a -20°C por 16 horas e, então, centrifugadas
a 4°C por 30 minutos, a 12000 rpm, para a obtenção de precipitado. A fase líquida
foi desprezada e, as amostras, lavadas com etanol gelado a 70%. Novamente, o
líquido foi descartado e o precipitado foi liofilizado e, então, hidratado com 100 µl de
tampão TE (pH 7,5).
A integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de
agarose a 0,8%, corado com brometo de etídio. A qualidade do DNA extraído foi
avaliada por comparação com o marcador
λ HindIII (Invitrogen). A quantificação do
33
DNA template foi feita por espectrofotometria através de um espectrofotômetro de
alta precisão NanoDrop
Tm
1000 (Thermo Scientific).
3.3 Análise de seqüências da região do D-loop mitocondrial
3.3.1 Amplificação por PCR
As amplificações para obtenção da região do d-loop foram feitas pela reação
em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”, PCR), utilizando os primers
L2910 e H3010 (Tabela 2) desenhados por Hilsdorf (2004) a partir de seqüências do
DNAmt de Piaractus mesopotamicus depositadas no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Testes de concentração de MgCl
2
, temperatura de
anelamento dos primers e diluição do DNA total foram realizados para se obter
produto de PCR consistente. Os componentes da reação de PCR e as condições de
amplificação dos mesmos estão apresentados na Tabela 3 e Tabela 4,
respectivamente. As reações de PCR foram realizadas no termociclador
“Termociclador MJ Research, Inc. - PTC-0200 DNA Engine”.
Tabela 2. Seqüência do par de primers utilizados para a amplificação da região d-loop do DNAmt de
Piaractus mesopotamicus.
Primers
Região
Seqüência
L2910 D-loop 5´CTA ACT CCC AAA GCT AGT ATT C 3`
H3010 D-loop 5´ C TTC AGT GTT ATG CTT TAT TTA AGC TAC 3´
Fonte: Hilsdorf (2004) não publicado.
34
Tabela 3. Componentes e concentrações dos reagentes utilizados nas reações de PCR.
Reagentes
Concentração
do esto
que
Tampão 10x
dNTPs 2,5mM
MgCl
2
3,0mM
Primers (forward e reverse)
10mM
Taq DNA polimerase 5U/µl
DNA 80-200ng/µl
H
2
O MilliQ (para completar reação de 50 µl) ------
Tabela 4. Condições dos ciclos de amplificação do programa de gradiente de temperatura.
Os produtos da amplificação foram analisados em gel de agarose 1%
submerso em tampão TAE 1X (0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA) em eletroforese a
80 - 100 V, utilizando como marcador Ladder 100 bp (“Invitrogen Life Technologies”).
O gel foi corado com brometo de etídio (1,0 µg/ml), observado e fotografado sob luz
ultravioleta no equipamento de foto-documentação ImageQuant 300 (GE
Healthcare).
3.3 2 Purificação do produto de PCR
Após checagem em gel de agarose o produto amplificado da região de
interesse foi purificado para a utilização na reação de seqüenciamento. Na
purificação foi retirado o excesso de primers e outros produtos não incorporados na
Etapas
Temperatura
Tempo
Denaturação Inicial 94°C 3 minutos
Denaturação 94°C 1 minuto
Anelamento 50°C a 60°C 45 segundos
Extensão 72°C 1 minuto e 30 segundos
Recomeçar ciclo desde a denaturação - 34 vezes
Extensão final 94°C 10 minutos
35
amplificação como dNTPs e sais que pudessem interferir o seqüenciamento. Para a
purificação foi utilizado o kit “GFX
TM
PCR DNA e Gel Band Purification” (GE
Healthcare), de acordo com os procedimentos descritos pelo fabricante.
3.3.3 Seqüenciamento do DNA
Todas as amostras de cada população amplificadas e purificadas foram
submetidas à reação de seqüência composta por 1, 2, 3 ou 4 µl de amostra
(dependendo do resultado da purificação), 1 µl do primer forward (L2910 10mM), 3 µl
de tampão Save Money, 2 µl de Big Dye versão 3.1 (Applied Biosystems), em uma
reação de volume final de 10 µl. A reação foi colocada em um termociclador
“Termociclador MJ Research, Inc. - PTC-0200 DNA Engine” nas seguintes
condições: 96ºC por 2 minutos; 25 ciclos de 96ºC por 45 segundos, 52ºC por 30
segundos e por fim 60ºC por 4 minutos. Após os ciclos, a reação foi transferida para
um microtubo de 1,5ml e adicionado 80 µl de isopropanol 75%, os microtubos foram
centrifugados por 30 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado foi lavado com etanol 70% (200 µl), os microtubos foram centrifugados
por mais 10 minutos. Novamente o sobrenadante foi descartado e os microtubos
secos no banho seco à 96ºC por 2 minutos. Após secos foram adicionados 10 µl de
formamida. As amostras foram transferidas para uma microplaca com 96 poços e
levadas para desnaturar a 95ºC por 5 minutos depois resfriadas no gelo. As mesmas
foram seqüenciadas em um seqüenciador automático ABI 3100 (Applied
Biosystems).
O resultado do seqüenciamento foi analisado pelo programa CodonCode
Aligner versão 1.4.1 (2005) para avaliar a qualidade da seqüência e, gerar
seqüências consensos. Os consensos (contigs) foram gerados a partir da
comparação de duas ou mais seqüências da mesma amostra. Os contigs servem
para confirmar cada nucleotídeo seqüenciado, descartando erros no processo de
seqüenciamento.
O CodonCode é um programa que realiza a identificação de bases a partir do
eletroforetograma (base-calling) e determina a confiabilidade de cada base, levando
em conta anomalias na migração eletroforética decorrente da inserção dos
36
terminadores e do espectro de emissão dos fluoróforos. O programa utiliza os dados
de seqüência contidos no arquivo do eletroforetograma processado inicialmente pelo
seqüenciador automático. Em seguida é executado um procedimento em 4 fases
para determinar a seqüência de bases mais confiável a partir desse arquivo: (1)
primeiramente é determinada a localização dos picos ideais usando a idéia de que
os fragmentos são regularmente espaçados ao longo da matriz no capilar e, dessa
forma, estimar o número correto de bases e suas localizações em regiões onde os
picos não estão bem resolvidos; (2) em seguida os picos observados são
identificados e (3) alinhados com os picos ideais; (4) finalmente os picos observados
que não parearam com os picos ideais na fase anterior são analisados e, se for
encontrada correspondência, a base é inserida na seqüência.
As seqüências consenso foram, em seguida, comparadas com as do banco
de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através da ferramenta BLAST
(ALTSCHUL et al., 1990).
3.4 Análise Estatística
As seqüências foram visualmente analisadas para se determinar os
haplótipos gerados em cada população. O alinhamento foi feito pelo Clustal W
(THOMPSON et al., 1994) através do programa Mega 4 (TAMURA et al., 2007).
Foi utilizado o método Neighbour-Joining (NJ) para construir uma árvore
enraizada pelo método do grupo externo, usando o modelo de evolução nucleotídica
Tamura-Nei, através do programa Mega 4 (TAMURA et al., 2007).
Uma rede de haplótipos foi construída através do método de parcimônia
estatística, com o programa TCS v. 1.21 (CLEMENT et al., 2000).
Os testes estatísticos D de Tajima (1989) e Fs de Fu (1997) foram estimados
com o programa DnaSP v. 4.50.1 (ROZAS et al., 2008) e aplicado para testar a
existência de pressão seletiva agindo sobre as substituições.
Com o programa DnaSP v. 4.50.1 (ROZAS et al., 2008) foram medidas as
diversidades nucleotídicas (π) e haplotípicas (Hd) dentro de cada população (NEI,
37
1977). O programa foi utilizado para testar a hipótese de distribuição não-aleatória
dos haplótipos (sob a hipótese de panmixia).
A estrutura populacional foi averiguada empregando-se a análise de variância
molecular (AMOVA) (EXCOFFIER et al., 1992) para gerar estimativas da variância
genética em diferentes níveis hierárquicos, que utiliza a estatística F de Wright
(1951) denominado como Ф estatística, que incorpora as freqüências alélicas e as
distâncias evolutivas entre os haplótipos indicando o grau de subdivisão geográfica,
através do programa Arlequin 3.11 (EXCOFFIER et al., 2006).
Os parâmetros de Ф (Ф
ct
, Ф
sc
e Ф
st
) são medidas de correlação para cada
nível de subdivisão populacional. De maneira que Ф
ct
é a correlação de haplótipos
tirados ao acaso de um grupo de populações em relação ao total da espécie; Ф
sc
é a
correlação de haplótipos retirados ao acaso de uma população em relação ao
haplótipos do grupo; Ф
st
é a correlação de haplótipos retirados ao acaso de uma
população em relação ao total de haplótipos da espécie (EXCOFFIER et al., 1992).
A significância da Ф – estatística foi determinada pelas permutações não-
paramétricas (EXCOFFIER et al., 1992) com 1000 permutações.
Também foi calculado o índice Φ
st
entre pares de amostras, o qual pode ser
usado como uma estimativa da distância genética entre as populações. A
significância foi testada através de testes não-paramétricos de permutação com
10000 replicações, com índice de significância de 0,05 (EXCOFFIER et al., 1992).
O componente de variância inter-populacional é extraído por equações das
esperanças de quadrado médio (QMD), conforme a análise de variância
convencional das freqüências alélicas, utilizadas para estimar o Φ
st
. O mesmo
procedimento pode ser empregado com base no desdobramento da soma de
quadrado entre as distâncias, utilizando as estatísticas-Φ. Neste caso, Φ
st
é
interpretado como a correlação de haplótipos aleatórios dentro de populações. O
teste de Mantel (10.000 permutações) testou o isolamento pela distância entre as
populações (BELKHIR, 1999), através do programa GENETIX versão 4.01.
38
4 RESULTADOS
4.1 Extração do DNA total
Após a aplicação dos protocolos para extração de DNA, verificou-se que as
amostras apresentavam material degradado (Figura 6). Algum nível de degradação
geralmente é esperado já que em campo o material é conservado somente em
etanol sem resfriamento. Devido aos diferentes níveis de degradação das amostras
de DNA extraído, foi necessário realizar testes para padronização das amostras para
se obter uma amplificação satisfatória das regiões do DNA em estudo.
pb
23.130
9.416
6.557
4.361
2.322
Figura 6. Gel de agarose: DNA total extraído de amostras dos indivíduos de pacu da Sub-
bacia do Rio Cuiabá.
39
4.2 Amplificação da região do d-loop mitocondrial
Os primers para região do d-loop do DNA mitocondrial de pacu foram
desenhados a partir da seqüência desta região depositada no Genbank (AF283959).
Os primers desenhados anelaram-se na região do RNA transportador da prolina (L-
2910) e da fenilalanina (H-3010) que flanqueiam toda seqüência de 1.100 pb da
região de controle (d-loop) do mtDNA do pacu. Como mostra a figura 7 os testes
com gradiente de temperatura de anelamento (de 50
o
C a 60
o
C) com estes primers
mostraram uma satisfatória eficiência de amplificação, sendo que os melhores
resultados foram obtidos a temperatura de anelamento de 59,8°C (circulado em
vermelho). Os testes de concentração de MgCl
2
mostraram melhor resultado na
concentração de 3,0 mM (Figura 8).
1.100 pb
pb
2072
1500
Figura 7. Gel de agarose: resultado do teste de gradiente
de temperatura com a amostra de DNA do indivíduo nº 5
do Rio Paraguai Mirim.
40
Devido às amostras de DNA total estarem degradas e outras estarem muito
concentradas, foram feitas diluições do DNA estoque para estabelecer uma
concentração ideal a ser utilizada nas reações de PCR. Os resultados desse teste
mostraram que a concentração de DNA utilizada para PCR variou de amostra para
amostra, para maioria os melhores resultados foram nas diluições de 1:9 e 1:18
(Figura 9).
Figura 8. Gel de agarose: resultado do teste de concentração de
MgCl
2,
as bandas circuladas em vermelho são na concentração de
3,0mM, as bandas circuladas em azul são de 1,5mM.
pb
1500
1000
1100 pb
41
Os resultados obtidos na purificação com o kit GFX foram satisfatórios, tanto
para purificação feita com a reação direta do produto de PCR como para purificação
realizada com a banda cortada do gel (Figura 10). Em algumas amostras, além da
região d-loop, regiões inespecíficas (Figura 11) também foram amplificadas. Sendo
assim, a banda correspondente a região d-loop foi excisada do gel para que se
pudesse realizar a purificação desta.
pb
1500
1000
500
1100 pb
Figura 9. Gel de agarose: resultados do teste de diluição do DNA total. As bandas
circuladas em vermelho estão na concentração de 1:18, as bandas circuladas em azul
são 1:9, as demais não amplificaram.
Figura 10. Gel de agarose: resultado da purificação
das amostras amplificadas de amostras diversificadas.
pb
1500
1000
1100 pb
42
4.3 Região do d-loop mitocondrial
O alinhamento final das seqüências da região controle do DNAmt, com 814
pares de bases de comprimento, obtidas das 99 amostras de cinco populações de
Piaractus mesopotamicus analisadas: Cuiabá, Taquari, Negro, Miranda, Paraguai,
gerou uma matriz de dados que definiu um total de 34 haplótipos (Tabela 5 e Figura
12). A média de bases nucleotídicas calculadas foi de 34,2% de adenina, 33,5% de
timina, 13% de guanina e 19,3% de citosina, evidenciando a prevalência de AT na
composição genética dessa região. Vinte e sete sítios polimórficos foram
encontrados (Tabela 6).
pb
1500
1000
500
1100pb
600pb
Figura 11. Gel de agarose: amplificação da amostra
nº 7 do Rio Miranda, as bandas circuladas em
vermelho mostram uma região amplificada
inespecífica (~600pb) de não interesse.
43
Tabela 5. Distribuição das amostras de Piaractus mesopotamicus de acordo com as localidades geográficas e haplótipos encontrados. (-) haplótipos não
encontrados.
Haplótipos
Rios
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
Cuiabá-Foz 5 - - - 1 1 1 - - - - 1 1 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
São Lourenço 3 2 1 - - - - 1 - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - -
Cuiabá-Sesc 3 - 1 1 1 - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - -
Taquari-Caronal 5 - - - - 1 - 1 - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - -
Taquari-Palmeiras 5 - - 2 - - - - 1 - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - -
Negro 6 2 2 - - - 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Miranda 4 2 - - 1 - - - - 1 - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - -
Paraguai-Mirim 3 1 - 1 1 - - - - - 1 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - -
Paraguai-
Corumbá
3 - - 1 1 1 - - 1 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - 1 1 1 1 1
Paraguai-
Cárceres
1 2 2 1 - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Total
38 9 6 6 5 3 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
44
Cuiabá Foz
São Lourenço
Cuiabá Sesc
Taquari Caronal
Taquari Palmeiras
Negro
Miranda
Paraguai Mirim
Paraguai Corumbá
Paraguai Cáceres
LEGENDA
Figura 12. Mapa esquemático – gráficos mostrando a freqüência dos haplótipos distribuídos entre os Rios
estudados.
45
Tabela 6. Sítios polimórficos entre os haplótipos de Piaractus mesopotamicus. Os números dos
haplótipos estão listados na coluna à esquerda e as posições polimórficas no alto da tabela. Os
nucleotídeos do haplótipo 01 representam os demais nucleotídeos na mesma posição. Nos sítios
polimórficos os nucleotídeos diferentes são indicados na tabela. Nucleotídeos idênticos são
representados por (.).
Do total de haplótipos obtidos (34), 11 são compartilhados entre populações e
23 são restritos, sendo oito restritos à população Cuiabá, quatro restritos ao Taquari,
dois restritos ao Miranda, dez restritos ao Paraguai. O haplótipo 1 é o mais
1
5
7
1
9
5
1
9
9
2
0
1
2
1
4
2
1
5
2
1
8
2
3
2
2
3
9
2
5
0
2
5
8
2
6
1
2
6
9
2
7
2
2
7
9
2
8
2
2
9
0
2
9
4
2
9
8
3
0
4
3
0
5
3
0
6
3
1
0
3
1
1
3
1
2
3
1
3
3
1
7
H01 (38) C C A T A
G
G
A
T
T
A
T
A
T
T T
T
C
A
T
C
C
C
A
A
G
T
H02 (7) . . . . . . . . . . C
. . C
. C
. . . .
. . . . . . .
H03 (6) T . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .
H04 (6) . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . .
. . . . . . .
H05 (5) . . . . . . A
. . . . . . . . . C
. . .
. . . . . . .
H06 (3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . G
. . .
H07 (3) . . . . . . A
. . . C
. . . . C
. . . .
. . . . . . .
H08 (2) . . . . . A
. . . . . . . . . . . . T
.
. . . . . . .
H09 (2) . . . . . . . . . . G
. . . . . . . . .
. . . . . . .
H10 (2) . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. .
. . . . . . .
H11 (2) . . . . . . . . . . C
. . . . C
C
. . .
. . . . . . .
H12 (1) . . . . . . . T
. A
. . . C
. . . . . .
. . . G
. . .
H13 (1) . . . . . . . . . . . . G
. . . . . . .
. . . . . . .
H14 (1) . . . . . . . . . . . . . . . C
. . . .
. . . . . . .
H15 (1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. T . . . . .
H16 (1) . . . C . . . . . . . . . . . . . . . .
. . T
. . . .
H17 (1) . . . . . . . . . . . . . C
. . . . . .
. . . . . . .
H18 (1) . . . . . . . . C
. C
. . . . C
C
. . .
. . . . . . .
H19 (1) . . . C . . . . . . . C
. . . . . . . .
. . . . . . .
H20 (1) . . . . G
. . . . . . . . . . . . T
. .
. . . . . . .
H21 (1) . . . . . . A
. . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .
H22 (1) . . . . . . . . . . C
. . . . C
. . . .
. . . . T
. .
H23 (1) . . G . . . . . . . C
. . . . C
. . . .
. . . . . . C
H24 (1) . . . . . . . . . . C
. . C
. . . . . .
. . . . . . .
H25 (1) . . . . . . . . . . . . . . . . C
. . .
. . . . . . C
H26 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
. C
. . . .
. . . T
. . .
H27 (1) T . . . . . . A
. T
. . . T
. . . . . .
. . T
A
. . .
H28 (1) . . . . . A
. A
. T
. . . T
. . C
. . .
. . . A
. A
.
H29 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
C
. . . . .
. . . A
. . .
H30 (1) . . . . . . . . . T
. . . T
. . . T
. .
. . . A
. . .
H31 (1) . . . . . . . . . T
. . . T
. C
. . . C
. . . . . . .
H32 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
. C
. . . .
. . . A
T
. .
H33 (1) . . . . . . . A
. T
C
. . . . C
. . . .
T T . A
. . .
H34 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
. . . . . .
. . . . . . .
46
freqüente, sendo o único estando presente em todas a populações. A maior
diversidade haplotípica (Hd) (0,94318) é encontrada na região dos rios do Paraguai
onde são encontrados 18 haplótipos, sendo que 10 são exclusivos para essa
população. A menor diversidade haplotípica (0,62222) é encontrada na sub-bacia do
Rio Negro onde apenas 3 haplótipos foram evidenciados (Tabela 7). Esta baixa
diversidade haplotípica pode ser explicada pela baixa amostragem, do mesmo modo
ocorre com a sub-bacia do Miranda.
A diversidade nucleotídica (π) (Tabela 7) dentro de cada população varia de
0,9% no Taquari-Palmeiras a 5,2% no Negro.
O teste estatístico Tajima (D) (TAJIMA, 1983) e de Fu (F
s
) (FU, 1997) para os
dados totais não mostraram desvio significativo da expectativa neutra das mutações
para as populações estudadas (D = -1,73022; P > 0,05; F
s
= -10,93 ; P > 0,05),
exceto quando testadas as amostras separadamente, Taquari e Cuiabá revelaram
valores significativos (P < 0,05), D = -2,00205 e -1,85913 e F
s
= -2,72419 e -2,85390,
respectivamente (Tabela 7).
Rios
N°
haplótipos
Média ± diversidade
haplótipica (Hd)
Média ± diversidade
nucleotidica (π)
D de Tajima Fs de Fu
Cuiabá-Foz 8 2,509±0,818 12,200±0,028 -1,673 -1,847
Cuiabá-Sesc 6 2,489±0,911 3,048±0,011 -0,352 -0,732
São Lourenço 6 1,714±0,857 3,911±0,012 -1,964* -2,298*
Taquari Caronal 5 1,778±0,722 7,833±0,022 -1,331 -1,607
Taquari Palmeiras 5 0,833±0,694 3,889±0,009 -1,751* -2,054
Negro 4 1,955±0,622 32,533±0,052 -1,025 -1,047
Miranda 6 3,000±0,844 4,311±0,012 -0,861 -1,656
Paraguai-Mirim 7 2,778±0,911 3,333±0,012 -0,253 -0,270
Paraguai-
Corumbá
12 2,222±0,933 2,222±0,012 -1,320 -1,225
Paraguai-
Cárceres
6 3,718±0,987 8,308±0,024 -1,164 -0,835
Todos
2,41270±0,84045 13,225±0,02707 -1,730 -2,130
*P<0,05
O método Neighbor-joining (NJ) gerou uma árvore enraizada através do grupo
externo Colossoma macropomum, apontando uma distribuição aleatória dos
haplótipos entre as populações (Figura 13). A rede de haplótipos (Figura 14)
evidencia a complexa relação entre os haplótipos, mostrando várias conexões
possíveis e o haplótipo 04 como sendo o haplótipo de origem.
Tabela 7. Diversidade genética. Dados de diversidade haplótipica (Hd), diversidade
nucleotídica (π) e testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu.
47
Hap02
Hap11
Hap04
Hap29
Hap05
Hap34
Hap03
Hap24
Hap10
Hap16
Hap14
Hap27
Hap12
Hap08
Hap18
Hap28
Hap19
Hap23
Hap20
Hap30
Hap31
Hap01
Hap17
Hap07
Hap09
Hap26
Hap32
Hap33
Hap13
Hap15
Hap21
Hap25
Hap22
Hap06
Colossoma macropomum
0.02
Figura 13. Árvore enraizada por Neighbor-joining (NJ) mostrando a distância entre
os 34 haplótipos estimada por Tamura-Nei.
48
Figura 14. Rede de haplótipos – resultado mostra a relação entre os haplótipos encontrados pela
análise da região d-loop através do programa TCS. (◦) representa cada passo mutacional.
49
Os valores de divergência (δ) (Tabela 8) entre as amostras variaram de
1,03% a 1,57%. Os maiores valores foram encontrados entre Paraguai e as outras
sub-bacias (média de 1,41%), refletindo a alta similaridade das seqüências dentro as
populações.
O resultado do teste de Mantel (r = 0,50) revelou que não existe nenhuma
correlação entre a distância genética e a distância geográfica dos indivíduos de pacu
analisados.
50
Tabela 8. Divergência nucleotídica (δ) entre as amostras de Piaractus mesopotamicus estudadas em todas as localidades.
Cuiabá
Foz
São
Lourenço
Cuiabá
Sesc
Taquari
Coronal
Taquari
Palmeiras
Negro Miranda
Paraguai
Corumbá
Paraguai
Mirim
Paraguai
Cárceres
Cuiabá Foz -----
São Lourenço 0,01206 -----
Cuiabá Sesc 0,01653 0,01317 -----
Taquari Coronal 0,02058 0,01422 0,01724 -----
Taquari Palmeiras 0,01450 0,00711 0,01089 0,01340 -----
Negro 0,01841 0,00985 0,01053 0,01562 0,01079 -----
Miranda 0,01462 0,01235 0,01187 0,01651 0,01057 0,01066 -----
Paraguai Corumbá 0,01224 0,01097 0,01309 0,01111 0,00829 0,01189 0,01389 -----
Paraguai Mirim 0,01332 0,01251 0,01099 0,01662 0,00982 0,01069 0,01126 0,01297 -----
Paraguai Cárceres 0,02251 0,01593 0,01773 0,02090 0,01448 0,01589 0,01703 0,01613 0,01702 -----
51
Análises parciais para testar a hipótese nula de panmixia total foram
realizadas por meio do teste de AMOVA (Análise Molecular de Variância). Em todas
as análises aplicadas, independentemente da forma como se estruturou os
conjuntos, os resultados mostraram que grande parte da variabilidade genética está
concentrada dentro das populações, com menor percentagem entre elas.
As análises de AMOVA foram feitas a partir da formação de dois conjuntos
diferentes. Primeiro as sub-bacias e rio Paraguai formando um grupo único. Outro
com cinco grupos, onde cada grupo é formado por cada sub-bacia e o rio Paraguai
Ao analisar as populações como um único conjunto de dados, verifica-se que
100% da variabilidade está dentro das populações (Ф
ST
= -0,00121), indicando que
as populações não são variáveis entre si (Tabela 9). O mesmo resultado foi
observado analisando cada sub-bacia mais o rio Paraguai como cada um sendo um
grupo (99,97%) (Tabela 10).
Tabela 9. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de populações de Piaractus
mesopotamicus, considerando todas sub-bacias como um único grupo.
Fonte da variação
Componentes
da variância
Porcentagem da
variância %
Ф - estatísticas
P
Entre as populações -0,00055 -0,12 Ф
ST
= -0,00121 >0,48680
Dentro das populações 0,45411 100,12
*P<0,05
Tabela 10. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de populações de Piaractus
mesopotamicus, considerando cada sub-bacia como um único grupo.
Fonte da variação
Componentes
da variância
Porcentagem da
variância %
Ф - estatísticas
P
Entre as sub-bacias 0,00433 0,95 Ф
st
= 0,00954 >0,20626
Entre as populações dentro
das sub-bacias
-0,00419 -0,92 Ф
sc
= 0,00031 >0,81134
Dentro das populações 0,45411 99,97 Ф
ct
= -0,00932 <0,49756
*P<0,05
Os valores de
Ф
st
pareado e o número de migrantes estão representados nas
tabelas Tabela 11 e Tabela 12, respectivamente .
52
Tabela 11. Valores de Фst, que revelam a estrutura populacional ou ausência dela, para as amostras dos rios estudados (abaixo da linha diagonal) e os
valores P (acima da linha diagonal).
Cuiabá
Foz
São
Lourenço
Cuiabá
Sesc
Taquari
Coronal
Taquari
Palmeiras
Negro Miranda
Paraguai
Corumbá
Paraguai
Mirim
Paraguai
Cárceres
Cuiabá Foz ----- 0,6259 0,7138 0,6103 0,6884 0,3076 0,5459 0,9990 0,9990 0,2919
São Lourenço -0,0106 ----- 0,4199 0,3232 0,3271 0,1787 0,2031 0,9990 0,5957 0,9990
Cuiabá Sesc -0,0212 0,0038 ----- 0,4873 0,6894 0,2109 0,9990 0,8945 0,9990 0,1123
Taquari Coronal -0,0133 0,0244 -0,0069 ----- 0,6250 0,4199 0,6826 0,3789 0,6396 0,1123
Taquari Palmeiras -0,0208 0,0103 -0,0254 -0,0108 ----- 0,2050 0,4316 0,7529 0,8369 0,1435
Negro 0,0059 0,0448 0,0326 -0,0064 0,0278 ----- 0,4052 0,1337 0,2587
0,04505*
Miranda -0,0154 0,0259 -0,0575 -0,0203 0,0003 0,0138 ----- 0,5507 0,9990 0,07617
Paraguai Corumbá -0,0268 -0,0174 -0,0265 0,00515 -0,0375 0,0493 -0,0012 ----- 0,9990 0,7568
Paraguai Mirim -0,0333 -0,0084 -0,0600 -0,0198 -0,0382 0,0196 -0,0457 -0,0386 ----- 0,4072
Paraguai Cárceres 0,0060 -0,0224 0,0206 0,0471 0,0283
0,0792*
-0,0385 -0,0125 -0,0018 -----
*P<0,05
53
Tabela 12. Valores do número de migrantes (Nm) entre os indivíduos de todos os Rios estudados.
Cuiabá
Foz
São
Lourenço
Cuiabá
Sesc
Taquari
Coronal
Taquari
Palmeiras
Negro Miranda
Paraguai
Corumbá
Paraguai
Mirim
Paraguai
Cárceres
Cuiabá Foz ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
São Lourenço ∞ ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
Cuiabá Sesc ∞ 33,07 ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
Taquari Coronal ∞ 12,15 ∞ ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
Taquari Palmeiras ∞ 21,96 ∞ ∞ ----- ----- ----- ----- ----- -----
Negro 83,73 6,84 14,80 ∞ 17,42 ----- ----- ----- ----- -----
Miranda ∞ 12,20 ∞ 96,66 ∞ 35,50 ----- ----- ----- -----
Paraguai Corumbá ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ----- ----- -----
Paraguai Mirim ∞ 145,00 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ----- -----
Paraguai Cárceres 82,71 ∞ 23,70 10,11 17,11 5,80 12,46 ∞ ∞ -----
54
5 DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISE DO POLIMORFISMO DA REGIÃO CONTROLE (D-LOOP)
DO DNA MITOCONDRIAL
Dados revelados pela seqüência de DNA têm sido amplamente utilizados em
estudos de evolução molecular e genética populacional (AVISE, 1994). O
seqüenciamento da região do d-loop de Piaractus mesopotamicus permitiu inferir
sobre o polimorfismo do DNAmt da espécie, ao mostrar uma alta variabilidade da
região, indicando que esta é informativa para o estudo populacional da espécie
citada.
Os resultados sugerem que as populações de pacu analisadas apresentam-
se em panmixia. De acordo com Avise et al. (1988), uma população é panmítica
quando o nível de diversidade genética é proporcional ao tamanho efetivo da
população e à taxa de mutação, assumindo uma constância dos dois ao longo do
tempo.
O polimorfismo total do DNAmt está relacionado ao tamanho efetivo das
populações de fêmeas ao longo do tempo evolutivo (AVISE et al., 1988). No
presente estudo, foram utilizados marcadores mitocondriais, o que reflete a estrutura
populacional das fêmeas. Isto poderia ser considerado um viés neste estudo. No
entanto, não há relatos na literatura de migração diferencial entre machos e fêmeas
(SILVA, 2006).
5.1.1 Variabilidade genética nas populações selvagens de pacu
A variabilidade genética entre diferentes populações e também entre os
indivíduos de uma mesma população é essencial para adaptação às mudanças
55
ambientais. A maior parte das populações naturais é caracterizada por elevados
níveis de variação genética (SOLÉ-CAVA, 2001).
A diversidade haplotípica é um índice que reflete a probabilidade de dois
haplótipos escolhidos ao acaso em uma população serem diferentes, enquanto que
a diversidade nucleotídica reflete a probabilidade de dois nucleotídeos homólogos
escolhidos ao acaso serem diferentes em uma população (NEI & LI, 1979).
A análise das amostras de pacu evidenciou a ocorrência de 34 haplótipos do
d-loop. Entre estes, 11 são compartilhados entre as populações das sub-bacias e 23
são restritos ou exclusivos. Uma hipótese para a ocorrência de haplótipos exclusivos
é a de que nas populações em que não foram encontrados, esses haplótipos
possivelmente sejam raros e ocorram em uma freqüência baixa. Desta forma é
possível que o número amostral pode não ter sido suficientemente grande para
encontrar haplótipos raros nas populações. É possível que com a pesca intensa que
o pacu vem sofrendo nesses últimos anos, esses haplótipos tenham se tornado
ainda mais raros considerando-se ainda que talvez seja uma influência de onde as
amostras foram coletadas.
Os valores de diversidade nucleotídica (π) estimados para as amostras
analisadas são altos e estão dentro do esperado para populações da mesma
espécie, exceto para as amostras do Rio Taquari (0,9%) as quais revelaram uma
baixa diversidade nucleotídica. Este fato pode ser correlacionado ao declínio das
populações de peixes no Rio Taquari devido ao assoreamento causado pela erosão
e deposição de sedimentos no rio, tornando este o maior problema ambiental do
Pantanal (GALDINO et al., 2006).
Os valores de diversidade de seqüência do DNAmt entre peixes pertencentes
a mesma espécie variam de menos de 0,1% em Morone saxatilis (WIRGIN et al.,
1989) até 10% em Leporinus microlophus (BERMINGHAM & AVISE, 1986). O valor
máximo de diversidade detectado em espécies de água doce (10%) é maior do que
os encontrados em espécies anádromas (5%), catádromas (2%) e marinhas (4,4%)
(BILLINGTON & HEBERT, 1991). Resultados a partir do DNAmt de salmão da
região setentrional do Japão mostraram baixa diversidade nucleotídica, variando de
0,07% a 0,35% (KITANISHI et al., 2007). Nos peixes de água doce neotropicais,
Colossoma macropomum, a diversidade nucleotídica varia de 1,1% a 1,2%
(SANTOS et al., 2007), e varia de 0,12% a 0,3% para Macrodon ancylodon na costa
brasileira (SANTOS et al., 2006).
56
Altos níveis de diversidade genética parecem ser comumente observados em
peixes migratórios com grandes populações panmitícas. Isto porque o grande
tamanho efetivo da população e o alto padrão de migração minimizam o efeito de
deriva gênica (SANTOS et al., 2007). Como parece acontecer com as populações de
pacu estudadas.
5.1.2 Neutralidade
Os haplótipos encontrados nas populações analisadas são seletivamente
equivalentes e sugerem que as populações se encontram em equilíbrio em relação a
esses haplótipos do DNAmt, segundo mostram os resultados estatísticos não
significantes (P>0,05) de D de Tajima e Fs de Fu.
Os testes de Tajima e Fu revelaram um valor significativo (P<0,05) para
amostras do Taquari e do Cuiabá quando analisadas separadamente. Um valor
significante pode aparecer devido a efeito seletivo, expansão populacional, efeito
gargalo, ou heterogeneidade das taxas de mutação (SANTOS et al., 2006).
Entretanto, valores não significativos, mas negativos, podem ser um indício de uma
rápida expansão demográfica (HARTL & CLARK, 1997). Em Santos et al. (2006)
resultado similar, valores significativos, foi encontrado para apenas duas populações
dentre as doze estudadas.
Ambos os testes Tajima e Fu foram desenvolvidos para testar neutralidade
seletiva; contudo, interpretações demográficas também são válidas em situações
onde neutralidade seletiva não podem ser descartadas, como na região controle do
DNAmt (HARTL & CLARK, 1997). O teste Fs de Fu foi concebido especificamente
para detectar a expansão da população, sendo este mais sensível à presença de
haplótipos restritos, como no presente caso (Tabela 7: Fs= -10,93).
57
5.2 DIVERSIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE Piaractus
mesopotamicus
Os resultados da AMOVA (Ф
ST
= -0,00121) para todas as populações
evidenciam ausência de estruturação entre as populações. Valores de Ф
ST
entre
0,05 e 0,15 são indicativos de moderada diferenciação genética entre populações.
Valores de Ф
ST
menores que 0,05, são indicativos de baixa estruturação genética
(WRIGHT, 1978). Valores negativos, não significativos e abaixo de 0,05 sugerem
ausência de estruturação populacional.
De acordo com Wright (1978), podemos observar três tipos de estruturação
de populações: a) isolamento por distância, em que a distância geográfica é um fator
determinante para não haver panmixia; b) modelo de ilhas, no qual a distância não é
a causa da diferenciação, os recrutas são oriundos de uma única população com
tamanho finito; c) modelo passo a passo (stepping stones) no qual cada
subpopulação faz troca gênica somente com as populações vizinhas.
Dados recentes de Suganuma et al. (2008) mostraram, através de
marcadores microssatélites, a ausência de estruturação entre populações selvagens
de pacu coletadas na sub-bacia do Cuiabá.
Neste trabalho apenas os valores de Ф
ST
pareado do Rio Negro com o rio
Paraguai revelaram uma estruturação moderada.
São muitos os relatos de estruturação ou diferenciação populacional dentro
de um único sistema hidrográfico relacionadas com fatores ambientais, biológicos,
ou antropogênicos (HASSANIEN et al., 2004). Uma hipótese para essa baixa
estruturação encontrada entre Negro e Paraguai pode estar associada às coletas
terem sido realizadas em períodos reprodutivos distintos já que o comportamento
reprodutivo constitui um fator decisivo para a subdivisão populacional da espécie.
Sanches & Galetti (2007) mostraram através de marcadores RAPD, uma alta
estruturação, na sub-bacia do Miranda, em populações de Brycon hilarii, coletadas
em épocas não-reprodutivas, porém os fatores que levaram a essa diferenciação
genética são ainda desconhecidos, já que estes peixes apresentam uma enorme
mobilidade migratória.
58
A ausência de estruturação encontrada nas populações de pacu pode ser
explicada pela topografia do Pantanal, bem como sua hidrografia atípica e pelo fato
do pacu ser uma espécie de grande amplitude migratória, chegando a percorrer
anualmente centenas de quilômetros, apresentando uma ampla distribuição no Alto
Paraguai (RESENDE, 1992).
O pantanal está situado em um cinto circunglobal de instabilidade climática,
onde as drásticas mudanças climáticas durante o quartanário levaram a diferentes
modelos de descarga do Rio Paraguai e seus tributários e a diferentes padrões de
erosão e sedimentação dentro do Pantanal (JUNK & DE CUNHAB, 2005). Um
mosaico de formações geomorfológicas é o resultado de eventos climáticos
passados e atuais. O pantanal é, na verdade, um mosaico de ecossistemas
diferentes, que tiveram gêneses distintas, fato que caracteriza a região como vários
“pantanais” (AB’SABER, 1988). As características climáticas da região do Pantanal,
especialmente as cheias anuais, podem contribuir para a homogeneidade genética
das populações de pacu. Durante o período de cheia, os rios extravasam seus leitos
e as áreas inundadas formam uma rede de lagoas, baías e baixadas interligadas por
cursos d’ água perenes (corixos) ou efêmeros (vazantes) (POR et al., 1997).
Desse modo há uma intensa mistura de animais provenientes de diferentes
rios. Além disso, é durante a época de enchentes que acontece a migração
reprodutiva, levando em consideração que por mais que os peixes adultos não se
encontrem, as larvas e os alevinos levados pelas correntezas podem ter um fluxo
gênico com os demais provindos de outros rios. Portanto, a grande mobilidade da
espécie talvez constitua a razão principal da ausência de estruturação genética entre
as populações de diferentes sub-bacias.
A mobilidade constitui um fator importante da estrutura genético-populacional,
já que espécies que apresentam grande mobilidade, como peixes migradores e
aves, exibem níveis de estruturação populacional menos complexos (WARD et al.,
1992), ou seja, não apresentam inúmeras sub-populações ou bancos genéticos,
como os encontrados em organismos sedentários, como é o caso de alguns anfíbios
e também de alguns peixes não migradores (AVISE, 1994).
Segundo Avise (1994), outros fatores, além da mobilidade, que podem
influenciar o grau de fluxo gênico e a estrutura populacional de uma espécie são: a
presença de barreiras física ou ecológicas; características comportamentais (como
filopatria); história de vida do organismo; padrões de dispersão e fluxo gênico
59
ligados ao sexo (no caso de marcadores genéticos com transmissão uniparental);
influência diferencial da seleção natural em locos nucleares e mitocondriais; eventos
demográficos que rompem o equilíbrio entre fluxo gênico e deriva genética; e a
distância geográfica entre as sub-populações.
Padrões como o observado neste estudo como a ausência de estruturação e
alto fluxo gênico entre as populações de diferentes rios são comuns em grandes
migradores neotropicais que habitam locais sem barreiras geográficas. Em Santos et
al. (2007) resultados similares foram observados em Colossoma macropomum na
Bacia Amazônica, localizada em uma região topograficamente semelhante ao
Pantanal.
Ao contrário da idéia de que espécies migratórias de água doce formam
grandes populações panmíticas, vários estudos indicam a existência de estruturação
populacional, diferentemente do encontrado para o pacu. Em Prochilodus argenteus
(citada como P. marggravii), análise de RAPD foi capaz de revelar diferenciação
genética entre três localidades no Rio São Francisco, (HATANAKA & GALETTI,
2003). Estudos populacionais de Brycon opalinus da bacia do Rio Paraíba do Sul
através do DNAmt por Hilsdorf et al. (2002) indicaram uma estrutura atribuída ao
reduzido fluxo gênico entre as populações estudadas. Mais tarde, este resultado foi
confirmado por Barroso et al. (2005) com marcadores microssatélites.
Na espécie marinha Macrodon ancylodon ocorre uma separação genética
entre duas populações, subtropical e tropical, evidenciada pela falta de fluxo gênico
em nível do DNAmt. Porém, ambas populações não se diferenciam
morfologicamente uma da outra. Em conclusão Santos et al. (2006) sugerem que as
populações subtropical e tropical são diferentes espécies sob o conceito filogenético.
Embora tenham sido relatados trabalhos com resultados de estruturação
populacional, estes foram descritos em outras bacias hidrográficas, mostrando como
a topografia da bacia do Alto Paraguai influencia na dinâmica das populações do
pacu.
Diferentemente do encontrado para o pacu, Benites (2008) em sua tese de
doutorado encontrou uma estruturação genética entre 11 populações selvagens do
pintado (Pseudoplatystoma corruscans) na Bacia Paraná-Paraguai. Em seu estudo é
relatado que apesar da espécie ter grande mobilidade migratória, a estruturação
genética foi evidenciada através de marcadores microssatélites e pode estar
60
associada aos pulsos de inundações observados na região, à uma capacidade
máxima de migração e à períodos migratórios distintos nas populações.
Comparando os resultados obtidos neste estudo com os resutados de Benites
(2008), é relevante que topografia da região em conjunto com a biologia da espécie
são determinantes para haver, ou não, estruturação nas populações. Neste estudo a
topografia pantaneira, com suas cheias, e a mobilidade migratória do pacu permitem
que as populações da Bacia do Alto Paraguai não apresentem estruturação
genética. Já em Benites (2008), a mesma topografia e capacidade migratória são
responsáveis pela estruturação genética das populações do pintado.
5.2.1 Fluxo gênico
Um dos problemas na análise da estrutura populacional é a estimativa da
quantidade de fluxo gênico, que é o determinante mais importante da estrutura
populacional. Se o fluxo gênico entre as populações vizinhas é baixo, cada
população evolui de forma quase independente. Assim, uma alta diferenciação entre
as populações é esperada quando há um fluxo gênico baixo (Nm < 1), enquanto que
um fluxo gênico alto (Nm > 1) é suficiente para impedir uma diferenciação
substancial devido à deriva e seleção natural (SOFIA et al., 2006).
Segundo Kimura & Maruyama (1971) quando a estimativa de Nm assumir
valores maiores que quatro, as populações panmíticas podem ser consideradas
como uma única unidade populacional; quando Nm for menor que um, as
populações podem ser consideradas diferenciadas.
Além disso, acredita-se que as estimativas de fluxo gênico, que geralmente
são baseados em modelos que supõem que as populações estão em equilíbrio,
grosseiramente superestimam o verdadeiro número de migrantes nas condições
reais (WIDMER & SCHMID-HEMPEL, 1999).
O alto valor de migrantes (N
f
m = 26,55) e o baixo valor de Ф
ST
(-0,00121)
encontrados neste estudo indicam que há uma intensa troca gênica ocorrendo entre
os indivíduos das quatro sub-bacias mais/e o rio Paraguai, e essa troca é suficiente
para evitar a diferenciação genética. Conseqüentemente, a ausência de
61
diferenciação genética e a existência de alto fluxo gênico suportam a hipótese de
existir uma única e grande população panmítica ocupando grande parte da bacia do
Alto Paraguai, como também sugerido por Calcagnotto (1998) ao analisar
populações selvagens e cultivadas de pacu e tambaqui.
Resultado equivalente foi encontrado por Hrbek et al. (2007) através da
análise de 14 locos microssatélites e fragmentos de 2.347 pb do DNAmt de 126
indivíduos de pirarucu (Arapaima gigas), que sugerem que a espécie forma uma
grande população panmítica com grande fluxo gênico entre as sete localidades
amostradas na bacia Amazônica. Ocyurus chrysurus, uma espécie marinha, também
se comporta como uma única unidade populacional, com um gradiente latitudinal de
sua morfologia ao longo da costa brasileira, revelada por marcadores do DNAmt e
aloenzimas (VASCONCELLOS et al., 2008).
O alto fluxo gênico aqui relatado para o pacu provavelmente é resultado de
sua adaptação à vida nas áreas alagadas do Pantanal, do mesmo modo que a
migração e o transporte passivo de ovos e larvas também contribuem para a
transferência genética e com a ausência de estruturação entre as populações aqui
estudadas.
Com base nos resultados obtidos através de análises de seqüências do
DNAmt propõem-se a inclusão das populações de pacu aqui estudadas na categoria
filogeográfica IV, proposta por Avise (1989), as quais apresentam intenso fluxo
gênico e não sofreram separação por barreiras geográficas históricas ou atuais.
5.2.2 Migração
A maioria dos peixes de importância econômica do Alto Paraguai são
migradores. A maior parte destas espécies são Characiformes, os primeiros
iniciarem a migração rio acima e entre estes se encontra o pacu. A rota migratória do
pacu é ainda pouco conhecida, com algumas hipóteses baseadas em dados da
pesca e estudos biológicos de adultos e de larvas. (RESENDE, 2003).
Espécies migratórias são provavelmente o grupo mais vulnerável de todos, e
somando-se ao fato destas espécies serem fonte de renda e alimento para a
62
população local a situação delas torna-se preocupante. Entre os problemas
encontrados pelas espécies migratórias do Alto Paraguai incluem-se a poluição
industrial e agrícola, o desmatamento, a introdução de espécies exóticas e
principalmente a pesca predatória (RESENDE, 2003).
Um grande percentual das espécies de peixes pantaneiros é considerado
como sendo de piracema. Após um período de seca, os peixes migram para os
corpos de água maiores; iniciam assim vários deslocamentos, primeiro das áreas
alagadas para os rios e depois rio acima (AGOSTINHO et al., 2003). Bittencourt &
Cox-fernandes (1990) afirmaram que a migração é uma adaptação dos peixes às
condições adversas decorrentes do pulso de inundação da água, aproveitando a
abundante fonte de alimentos disponível sazonalmente em diferentes locais. Os
peixes migradores usam diferentes habitats para alimentação, abrigo e para
reprodução. No Alto Paraguai, os habitats usados para alimentação são as áreas
alagadas, canais temporários, lagoas marginais, ao longo do rio Paraguai, o canal
principal do rio é usado para migração e as cabeceiras para reprodução (RESENDE,
2003).
As estratégias migratórias variam entre as espécies e as bacias. Considera-se
um padrão de migração de reprodução uma desova a montante, seguido por uma
dispersão de ovos a jusante, finalizando com as larvas e adultos exaustos em áreas
de várzea. A passagem a jusante de larvas e juvenis é o padrão migratório mais
comum na América do Sul (AGOSTINHO et al., 2003).
Durante a piracema, o apelo para conservação da espécie é tão intenso que
os peixes se descuidam de suas estratégias de proteção, tornando-se presa fácil. A
viagem de centenas de quilômetros os deixa extenuados, e muitos pescadores
aproveitam-se dessa fragilidade para capturá-los facilmente e em grandes
quantidades. Agindo desse modo, interferem em todo o processo de perpetuação da
espécie e renovação dos estoques, que será sentido na diminuição do tamanho dos
peixes e na quantidade disponível para a pesca nos anos subseqüentes, por essa
razão sendo importante proteger os peixes na época da piracema. O defeso da
Piracema é determinado pela Lei n° 7.679, de 23 de novembro de 1988, e
estabelecido anualmente pelo IBAMA, com a colaboração de órgãos, instituições e
associações envolvidas com a pesca em cada bacia hidrográfica (RESENDE, 2005).
63
5.3 METAPOPULAÇÃO
Baseados nas análises das seqüências do DNA mitocondrial, o resultado
sugere que a espécie migradora, Piaractus mesopotamicus, não forma populações
geneticamente estruturadas, apresentando-se como uma metapopulação.
Uma metapopulação pode ser conceituada como “uma população de
populações” – um grupo de várias populações locais cuja viabilidade é mantida pela
migração de indivíduos através de corredores que conectam fragmentos (HANSKI,
1999). A teoria de metapopulação analisa a dinâmica dos grupos de populações
semi-independentes ligadas por dispersão (HANSKI & GILPIN, 1991). O termo
metapopulação, ou “população da população”, foi proposto por Levins (1970), em
seu modelo, uma metapopulação é uma rede de subpopulações propensas a
extinção ocupando um mosaico de habitats.
Apesar de explorada comercialmente a espécie P. mesopotamicus ainda
evidencia altos níveis de variabilidade genética. Os resultados são encorajadores
para a elaboração de planos de manejo sustentável, de conservação dos estoques e
para atuar como fonte de reserva para a aqüicultura popular dessas espécies.
Políticas de manejo e conservação necessitam não somente proteger a espécie,
mas também considerar as necessidades socioeconômicas locais.
A baixa diferenciação genética entre as populações avaliadas e conseqüente
alta conectividade genética entre as populações é um importante dado para a
implantação de programas de monitoramento e conservação da espécie no Pantanal
Mato grossense. Os resultados obtidos têm implicações claras para gestão e
conservação com base no modelo de “source-sink metapopulation”, como sugerido
por Hrbek et al.(2007) para populações de Arapaima gigas em reservas de várzea
da Bacia Amazônica. O modelo de manejo “source-sink” implica em uma única
população genética em que populações locais afetadas por redução populacional
com conseqüente efeito de deriva e perda de variabilidade podem ser reconstituídas
por imigrantes das reservas de conservação implantada.
64
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Para a região d-loop do DNA mitocondrial, foi verificado que a maior parte da
variabilidade é encontrada dentro das populações, sugerindo a ausência de
estruturação entre os as sub-bacias e o rio Paraguai.
As populações de pacu aqui estudadas pertencentes a quatro sub-bacias:
Cuiabá, Taquari, Negro e Miranda e o rio Paraguai constituem uma única
população panmítica.
A ausência de estruturação genética entre as populações pode ser explicada
pelo intenso fluxo gênico decorrente da grande amplitude migratória da
espécie, exceto para Rio Negro e Paraguai, onde foi evidenciada uma baixa
estruturação entre estes rios, fato este que pode estar associado a coletas
feitas em períodos reprodutivos distintos.
Todos os índices de Ф
ST
apresentados são baixos e não mostram
significância entre os valores par a par; as populações de pacu não se
diferenciam, suportando a hipótese de não estruturação populacional e de
panmixia. O alto número de migrantes evidencia um grande fluxo gênico entre
as populações de pacu estudadas.
Do ponto de vista econômico, Piaractus mesopotamicus é a espécie mais
importante da região pantaneira. A avaliação da estrutura genética de
espécies de interesse comercial é uma importante condição para qualquer
planejamento de controle da pesca. Este estudo focaliza este papel
corroborando com outros estudos já realizados com o pacu.
No presente estudo, foram utilizados apenas marcadores mitocondriais, o que
reflete a estrutura populacional das fêmeas. Marcadores nucleares podem ser
usados para elucidar se a estrutura populacional observada através do d-loop
65
reflete ou não uma estrutura relacionada ao sexo, embora não haja relatos na
literatura de migração diferencial entre machos e fêmeas para a espécie.
A amostragem estudada permitiu esclarecer a variabilidade genética da
espécie Piaractus mesopotamicus na bacia do Alto Paraguai, porém um
aumento no tamanho amostral incluindo outros pontos de coleta e uma
ampliação dos estudos com marcadores nucleares, por exemplo
microssatélites, poderá vir a confirmar os resultados obtidos neste trabalho e
subsidiar estratégias para a conservação da espécie.
Através do resultado obtido pode-se considerar que as populações de pacu
aqui estudadas formam uma metapopulação. Este resultado contribui para a
gestão e conservação desta espécie.
Os resultados aqui apresentados podem ser a base para futuros trabalhos de
monitoramento visando acompanhar a variabilidade genética dentro de cada
uma das populações, inclusive daquelas a serem protegidas pela implantação
de parques. Também estudos mais detalhados poderão ser feitos para se
verificar o nível de homogeneização genética encontrada neste trabalho.
66
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FABIANA IERVOLINO
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PACU (Piaractus
mesopotamicus) (Characiformes: Characidae) NA BACIA DO ALTO
PARAGUAI POR MEIO DO POLIMORFISMO DO DNA MITOCONDRIAL
Mogi das Cruzes, SP
2008
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FABIANA IERVOLINO
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PACU (Piaractus
mesopotamicus) (Characiformes: Characidae) NA BACIA DO ALTO
PARAGUAI POR MEIO DO POLIMORFISMO DO DNA MITOCONDRIAL
Orientador: Prof
º Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf
Mogi das Cruzes, SP
2008
Dissertação apresentada à Universidade de
Mogi das Cruzes para a obtenção do Título
de Mestre em Biotecnologia.
Área de concentração: Ambiental.
F
ICHA
C
ATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Iervolino, Fabiana
Análise da variabilidade genética do Pacu (Piaractus
mesopotamicus) (Characiformes: Characidae) na bacia
do Alto Paraguai por meio do poliformismo do DNA
mitocondrial / Fabiana Iervolino. – 2009.
76 f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) -
Universidade de Mogi das Cruzes, 2008
Área de concentração: Ciências Ambientais
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf
1. Pacu – Variabilidade genética 2. Piaractus
mesopotamicus 3. DNA mitocondrial I. Hilsdorf,
Alexandre Wagner Silva
CDD 597
DEDICATÓRIA
Dedico esta minha conquista,
Aos meus pais, Primo Edson Iervolino e Terezinha de Jesus Iervolino,
pela educação que me deram e por sempre incentivarem a lutar pelos
meus sonhos.
Ao meu noivo, Lourenço, pelo amor e companheirismo e, principalmente
pela paciência, muita paciência, durante esse período.
Aos meus irmãos, Andrea e Emerson, e ao meu sobrinho, Tarik, por
simplesmente fazerem parte da minha vida.
AGRADECIMENTOS
De modo especial gostaria de agradecer ao meu orientador
Professor Doutor Alexandre Wagner Silva Hilsdorf por abrir as
portas e confiar em mim, pelo exemplo de profissionalismo, pelo
apoio durante o desenvolvimento do trabalho, e acima de tudo
pela amizade.
Primeiramente a Deus, a quem deposito minha fé e esperança, e que nunca me
faltou.
À Universidade de Mogi das Cruzes, por ter sido minha segunda casa em todos
esses anos, e pelo espaço físico.
A todos os professores do programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade
de Mogi das Cruzes, pela competência e seus ensinamentos.
Ao Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aqüicultura (LAGOAA), a
Embrapa - Pantanal e FUNDECT pelo fornecimento dos recursos.
As minhas eternas amigas (por ordem alfabética, para não gerar conflito): Carol, Co,
Ju, Ka, Paola, Sarita e Taty, pela amizade, pelo companheirismo, pelo carinho, pelas
maravilhosas risadas, enfim por tudo que passamos juntas, o meu eterno
agradecimento, vocês moram em meu coração.
À Ângela Aparecida Moreira, pelo exemplo de vida, pelos ensinamentos fornecidos
com tanto carinho, e principalmente pela amizade, o meu eterno agradecimento.
Aos amigos do LAGOAA, Fernanda Gallinaro, Gustavo, Márcia e Luiza, pela
agradável convivência e amizade.
As funcionárias do Núcleo Integrado de Biotecnologia, Renata e Neilce, pela
prestatividade e ajuda quando precisei.
Aos amigos do Laboratório de Virologia, Alex, Fê, Fernanda Faria, Bruno e César,
pela convivência e pela ajuda, sempre que precisei.
Ao pessoal do Laboratório de Genômica, principalmente a Daiene e ao Deibs, por se
prontificarem a colocar as reações no seqüenciador, muito obrigada pela atenção e
ajuda.
À Professora Vivian Schimidt, pelo tempo dedicado a me ensinar a técnica de
seqüenciamento.
À Renata Mesquita, secretária da pós-graduação, obrigada pela atenção nas
situações burocráticas.
Aos professores Dr. Vitor Miranda e Dr. Wellington de Araújo, pela participação na
banca de qualificação, pelas valiosas discussões e sugestões dadas a este trabalho.
Aos professores Dr. Fauto Foresti e Dr. Vitor Miranda, por aceitarem o convite para
participar da banca de defesa.
A minha família e ao meu noivo, por fazerem parte de todos os momentos de minha
vida, amo vocês.
A minha tia Bili, por sempre incentivar a enfrentar os obstáculos da vida e por sua
amizade.
A todas as pessoas que contribuíram, direta ou indiretamente, para a consolidação
deste trabalho, muito obrigada.
Muito obrigada por tudo.
RESUMO
Os peixes neotropicais compõem a ictiofauna mais diversificada e rica do mundo.
Contudo, apesar desta diversidade de espécies de peixes e da sua grande
importância econômica para o homem, ainda pouco se conhece sobre suas
características biológicas, ecológicas e genéticas. A identificação e a conservação
de estoques geneticamente diferenciados e adaptados ao seu habitat representam
um ponto fundamental para o setor pesqueiro, pela sua relação direta com a
produtividade total e o uso sustentável dos recursos. O pacu (Piaractus
mesopotamicus) é uma espécie de grande ocorrência nos rios da bacia hidrográfica
do Alto Paraguai. A pesca do pacu tem sido monitorada e vem mostrando a grande
importância desta espécie. A manutenção dos estoques de pacu em nível de uso
sustentável depende dentre outras da conservação da variabilidade genética
populacional. Para isso, é necessário o conhecimento do grau de diferenciação
genética das populações de pacu, o que pode ser conseguido por meio de
marcadores moleculares. O presente estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a
estrutura intra e inter populacional do pacu por meio de análises de seqüências da
região controle (d-loop) do mtDNA. Cem amostras de quatro sub-bacias, Cuiabá,
Taquari, Negro e Miranda mais do Rio Paraguai foram escolhidas para a avaliação.
O DNA total das amostras foi extraído da nadadeira caudal, os primers desenhados
para a espécie (P. mesopotamicus) foram utilizados para a amplificação da região
do d-loop, foi feita a purificação das amostras amplificadas e estas foram então
seqüenciadas em um seqüenciador automático ABI3100. Cada amostra foi
seqüenciada duas vezes para se obter uma seqüência consenso. As seqüências
foram analisadas pelo programa CodonCode (versão 1.4.1). As seqüências foram
alinhadas pelo ClustalW através do programa MEGA (versão 4). As análises
estatísticas foram conduzidas por meio dos programas Arlequin (versão 3.01) e
DnaSP (versão 4.50.1). Os resultados da análise AMOVA mostraram que 100% da
variabilidade está dentro das populações, indicando que as populações não são
variáveis entre si. O valor calculado de Ф
ST
= -0,00121 (P<0,05) é indicativo de baixa
estruturação genética entre as populações avaliadas. Valores de moderada
estruturação (Ф
ST
= 0,04807 P<0,05) foram revelados pela comparação entre
indivíduos do Negro e do Paraguai. O teste de mantel (r = 0,50) mostrou que não há
correlação entre distância genética e distância geográfica. A falta de estruturação
pode ser explicada pela característica migradora da espécie em conjunto com a
topografia da região pantaneira. Desta forma, pela análise das seqüências as
populações devem ser manejadas com uma meta-população.
Palavras-chave: Pacu, Piaractus mesopotamicus, DNAmt, Conservação
ABSTRACT
The neotropical fish conceive the most diversified and rich ichthyofauna of the world.
However, in spite of this fish species diversity and its great economical importance
for human kind, little is known of its biological, ecological and genetic characteristics.
The identification and conservation of stock genetically diversified and adapted to its
habitat represent a key point to the fishery sector, because of its direct relation to
total productivity and sustainable use (management) of resources. Pacu (Piaractus
mesopotamicus) is a species of great occurrence in rivers from the hydrographic
basin of High Paraguai. Pacu’s fisheries is being monitorated and this has been
showing this species great importance. The maintenance of pacu’s stock in a
sustainable level depends, among others, on the populational genetic variability
conservation. For that to happen, the knowledge of pacu’s populations genetic
differentiation level is needed, which can be achieved by using molecular markers.
The present study was accomplished with the goal to evaluate pacu’s inner and
interpopulational structuring by analyzing sequences from the mtDNA’s control region
(d-loop). One hundred samples from four sub-basin, Cuiaba, Taquari, Negro and
Miranda were chosen for the evaluation. Total DNA was extracted from the caudal fin
of the samples, primers designed to the species (P. mesopotamicus) were used to
amplify d-loop region, purification of the amplified samples were performed followed
by its sequencing in ABI3100 automatic sequencer. Each sample was sequenced
twice, therefore a consensus sequence was generated. The sequences were
analysed through software CodonCode (Version 1.4.1). Sequences were aligned
using ClustalW feature from the MEGA software (Version 4). Statistical analyses
were performed using Arlequin (version 3.01) and DnaSP (version 4.50.1) softwares.
AMOVA analysis showed that 100% of variability is within populations, demonstrating
populations aren’t different from themselves. Calculated value of Ф
ST
= -0,00121
(P<0,05) indicate low genetic structuring between evaluated populations. Moderated
structuring values (Ф
ST
= 0,04807 P<0,05) were revealed in the compare between
individuals from Negro and Paraguai. Mantel test (r=0,50) showed there’s no
correlation between genetics and geographic distances. Lack of structure can be
explained by species migration characteristic along with Pantanal’s topography.
Therefore concluded by the sequences analysis, populations of pacu should be
manage as a metapopulation.
Keywords: Pacu, Piaractus mesopotamicus, mtDNA, Conservation.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Distribuição das amostragens de pacus nos locais de coleta .............. 30
TABELA 2. Seqüência do par de primers utilizados para a amplificação da região d-
loop do DNAmt de Piaractus mesopotamicus ......................................................... 33
TABELA 3. Componentes e concentrações dos reagentes utilizados nas reações de
PCR.......................................................................................................................... 34
TABELA 4. Condições dos ciclos de amplificação do programa de gradiente de
temperatura.............................................................................................................. 34
TABELA 5. Distribuição das amostras de Piaractus mesopotamicus de acordo com
as localidades geográficas e haplótipos encontrados. (-) haplótipos não
encontrados.............................................................................................................. 43
TABELA 6. Sítios polimórficos entre os haplótipos de Piaractus mesopotamicus.
Os números dos haplótipos estão listados na coluna à esquerda e as posições
polimórficas no alto da tabela. Os nucleotídeos do haplótipo 01 representam os
demais nucleotídeos na mesma posição. Nos sítios polimórficos os nucleotídeos
diferentes são indicados na tabela. Nucleotídeos idênticos são representados por (.)
................................................................................................................................. 45
TABELA 7. Diversidade genética. Dados de diversidade haplótipica (Hd),
diversidade nucleotídica (π) e testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu ...... 46
TABELA 8. Divergência nucleotídica (δ) entre as amostras de Piaractus
mesopotamicus estudadas em todas as localidades .............................................. 50
TABELA 9. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de populações
de Piaractus mesopotamicus, considerando todas sub-bacias como um único grupo
................................................................................................................................. 51
TABELA 10. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de
populações de Piaractus mesopotamicus, considerando cada sub-bacia como um
único grupo ............................................................................................................. 51
TABELA 11. Valores de Фst, que revelam a estrutura populacional ou ausência
dela, para as amostras dos rios estudados (abaixo da linha diagonal) e os valores P
(acima da linha diagonal) ........................................................................................ 52
TABELA 12. Valores do número de migrantes (Nm) entre os indivíduos de todos os
Rios estudados ........................................................................................................ 53
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1. Região controle (d-loop) do DNAmt Fonte: Selwood, S. P. et al.
2000................................................................................................................................. 15
FIGURA 2. Mapa dos rios da Bacia do Alto Paraguai. Fonte: Projeto GEF Alto Paraguai
......................................................................................................................................... 18
FIGURA 3. Pacu (Piaractus mesopotamicus, Holmberg, 1887). Fonte: Lovshin,
(FISHBASE)..................................................................................................................... 20
FIGURA 4. Quantidade total de pescado capturado (toneladas) na Bacia do Alto
Paraguai, MS, no período de 1994 a 2003. Fonte:SCPESCA/MS .................................. 24
FIGURA 5. Rios do Pantanal Mato Grossense e indicações dos locais de coleta (em
azul) Fonte : Embrapa –Pantanal..................................................................................... 31
FIGURA 6. Gel de agarose: DNA total extraído de amostras dos indivíduos de pacu da
Sub-bacia do Rio Cuiabá................................................................................................. 38
FIGURA 7. Gel de agarose: resultado do teste de gradiente de temperatura com a
amostra de DNA do indivíduo nº 5 do Rio Paraguai Mirim.............................................. 39
FIGURA 8. Gel de agarose: resultado do teste de concentração de MgCl
2,
as bandas
circuladas em vermelho são na concentração de 3,0mM, as bandas circuladas em azul
são de 1,5mM................................................................................................................... 40
FIGURA 9. Gel de agarose: resultados do teste de diluição do DNA total. As bandas
circuladas em vermelho estão na concentração de 1:18, as bandas circuladas em azul
são 1:9, as demais não amplificaram............................................................................... 41
FIGURA 10. Gel de agarose: resultado da purificação das amostras amplificadas de
amostras diversificadas.................................................................................................... 41
FIGURA 11. Gel de agarose: amplificação da amostra nº 7 do Rio Miranda, as bandas
circuladas em vermelho mostram uma região amplificada inespecífica (~600pb) de não
interesse........................................................................................................................... 42
FIGURA 12. Mapa esquemático – gráficos mostrando a freqüência dos haplótipos
distribuídos entre os Rios estudados............................................................................... 44
FIGURA 13. Árvore enraizada por Neighbor-joining (NJ) mostrando a distância entre os
34 haplótipos estimada por Tamura-Nei.......................................................................... 47
Figura 14. Rede de haplótipos – resultado mostra a relação entre os haplótipos
encontrados pela análise da região d-loop através do programa TCS. (
◦) representa cada
passo mutacional............................................................................................................. 48
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 10
1.1 Biodiversidade e conservação dos ecossistemas de água doce ................... 11
1.2 DNA mitocondrial (DNA) ................................................................................ 12
1.3 O Pantanal ..................................................................................................... 16
1.4 Pacu (Piaractus mesopotamicus) ................................................................... 20
1.5 Pesca: volumes e importância ....................................................................... 22
1.6 Populações – Unidades de Conservação ...................................................... 25
1.7 Filogeografia ................................................................................................... 27
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 29
2.1 Geral ............................................................................................................. 29
2.2 Específicos ................................................................................................... 29
3 METODOLOGIA .................................................................................................. 30
3.1 Processo de amostragem ............................................................................. 30
3.2 Extração do DNA total .................................................................................. 32
3.3 Análise de seqüências da região do D-loop mitocondrial ............................. 33
3.3.1 Amplificação por PCR ............................................................................. 33
3.3.2 Purificação do produto de PCR ............................................................... 34
3.3.3 Seqüenciamento do DNA ........................................................................ 35
3.4 Análise Estatística ......................................................................................... 36
4 RESULTADOS ..................................................................................................... 38
4.1 Extração do DNA total ................................................................................... 38
4.2 Amplificação da região do d-loop mitocondrial .............................................. 39
4.3 Região do d-loop mitocondrial ....................................................................... 42
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 54
5.1 Análise do polimorfismo da região controle (d-loop) do DNA mitocondrial ... 54
5.1.1 Variabilidade genética nas populações selvagens de pacu .................... 54
5.1.2 Neutralidade ............................................................................................. 56
5.2 Diversidade genética das populações de Piaractus mesopotamicus ........... 57
5.2.1 Fluxo gênico ........................................................................................... 60
5.2.2 Migração ................................................................................................. 61
5.3 Metapopulação .............................................................................................. 63
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 64
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 66
10
1 INTRODUÇÃO
Entre os vertebrados os peixes são os que apresentam a maior riqueza de
espécies, quase equivalente ao número aproximado de todas as espécies dos
demais grupos (MACHADO, 2003).
Apesar da sua relativa insignificância em termos de área, 1% da superfície da
terra, o ecossistema de água doce contém 43% de todas as espécies aquáticas.
Entre as 30.185 espécies de peixes descritas, cerca de 14 mil são espécies de água
doce, enquanto as restantes 16.937 espécies vivem em hábitats marinhos que
cobrem 70% da superfície (FISHBASE, 2008). Das 170 famílias de espécies de
peixes de água doce, a maior parte pertence às ordens Characiformes,
Cypriniformes, Siluriformes e Gymnotiformes, Perciformes, e Cyprinodontiformes.
Os peixes neotropicais compõem a ictiofauna mais diversificada e rica do
mundo. Segundo Lundberg et al. (2000) existe uma previsão entre 5.000 e 8.000
espécies para a ictiofauna neotropical. Aproximadamente 14% das espécies do
mundo são encontradas no Brasil (LEWINSOHN & PRADO, 2002). No entanto, essa
extraordinária biodiversidade ainda é pobremente conhecida (AGOSTINHO et al.,
2005). São aproximadamente 2600 espécies catalogadas para o país, do total de
4500 conhecidas até o momento (FISHBASE, 2008).
O número de espécies nos ecossistemas brasileiros ainda é impreciso e difícil
de ser estimado. Entre as dificuldades destacam-se o número de bacias
hidrográficas pouco inventariadas, o insuficiente número de ictio-taxonomistas, a
falta de infra-estrutura necessária para os processos de amostragem e a dificuldade
na divulgação das informações que freqüentemente são de difícil acesso
(AGOSTINHO et al., 2005).
A “Lista das Espécies Ameaçadas” produzida pelo Ministério do Meio
Ambiente relaciona 135 espécies de peixes de água doce em estado de
vulnerabilidade ou em risco de extinção no país (BRASIL, 2004).
Contudo, apesar desta diversidade de espécies de peixes e da sua grande
importância econômica para o homem, ainda pouco se conhece sobre suas
características biológicas, ecológicas e genéticas. A “IUCN – The World
11
Conservation Union” avaliou que de todas as espécies de peixes listadas, apenas
6% das espécies têm sido avaliadas na IUCN Red List, sendo 631 destas
exclusivamente de água doce (FISHBASE, 2005). Apesar dos dados da IUCN terem
sua origem em apenas algumas áreas geográficas do planeta há fortes indicativos
de que a ameaça sobre a ictiofauna no mundo é maior do que a já observada como,
por exemplo, no leste da África onde 27% de peixes de água doce estão sob
ameaça ou na América do Norte onde 20% também estão ameaçados (BAILLIE et
al., 2004).
1.1 Biodiversidade e conservação dos ecossistemas de água doce
Assim como ocorre com a biodiversidade terrestre, os estudos com
ecossistemas aquáticos são fortemente direcionados para organismos
comercialmente atrativos. Neste sentido não é surpresa observar que os peixes têm
recebido a maior atenção (AGOSTINHO et al., 2005).
Atualmente, os conceitos de “biodiversidade” e “conservação” são
considerados indispensáveis para o desenvolvimento sustentável nas diversas
regiões do mundo. A biodiversidade engloba a abundância, a diversidade de
espécies, a diversidade genética, por sua vez, reflete a variedade de genes e pode
ser estudada em nível de espécie ou de populações de uma mesma espécie.
O conhecimento da diversidade biológica é fundamental para manutenção
das espécies no que concerne à sua habilidade de adaptação e resposta às
freqüentes mudanças ambientais (BARKER & TINGEY, 1992).
A perda da biodiversidade compromete o funcionamento dos ecossistemas,
sendo, então, de suma importância a conservação dos mesmos (EHRLICH &
EHRLICH, 1992). Os ambientes aquáticos, por exemplo, são considerados um dos
mais ameaçados à perda da diversidade, por serem alvo de grande acesso e
utilização antrópica (MACHADO, 2003). Como conseqüência, a vulnerabilidade de
peixes aumenta intensamente e sua diversidade acaba sendo comprometida.
De acordo com Bruton (1995), fatores como a deterioração dos ambientes
aquáticos por poluição, assoreamento, barramento de rios, pesca predatória e
12
introdução de espécies exóticas, são algumas das causas relacionadas com o
declínio da diversidade de peixes e da variabilidade dos mesmos.
A conservação da variabilidade genética das populações de peixes ou outros
organismos aquáticos é, portanto, uma etapa fundamental para manutenção da
viabilidade destas populações a médio e longo prazo (PULLIN et al.,1999).
Sob o ponto de vista populacional, a diversidade genética dos peixes pode de
um modo geral, ou estar homogeneamente espalhada por toda a área de
distribuição geográfica de uma determinada espécie de peixe, ou estar concentrada
em determinadas subáreas populacionais, designadas como unidades de manejo
(MORITZ, 1994). As unidades de manejo podem ser reconhecidas como
subpopulações que se distinguem umas das outras através de diferenças significas
na composição genética, que pode ser detectada por meio de marcadores
moleculares, nucleares ou mitocondriais.
Nos últimos anos, o uso de marcadores moleculares tem crescido
consideravelmente em estudos de genética populacional de peixes. O uso dos
marcadores permite analisar a variabilidade populacional, como pode revelar uma
estrutura genética na população. O emprego de marcadores moleculares em peixes
vem sendo feito com o intuito de estudar variações genéticas dentro e entre
populações, ou estudar as relações filogenéticas entre espécies, famílias e ordens.
Atualmente, a análise do DNA representa uma boa opção de estudo para se testar
hipóteses filogenéticas e biogeográficas, além de testar hipóteses de isolamento de
populações.
A ictiofauna de água doce no Brasil apresenta um papel fundamental, tanto
em termos ambientais como em sua contribuição para o conjunto da biodiversidade
de diversos ecossistemas e também pela sua importante contribuição para a
economia e alimentação de diversas populações ribeirinhas e urbanas. Desta forma,
estabelecer programas de conservação de espécies e também de populações de
peixes de forma a garantir sua sobrevivência em longo prazo não somente é uma
questão de importância ecológica, mas também uma estratégia de desenvolvimento
econômico.
13
1.2 DNA mitocondrial (DNAmt)
O DNA mitocondrial (DNAmt) animal é uma molécula circular pequena
fechada covalentemente, com tamanho variável, em geral de 16 a 20 kb (AVISE et
al., 1987). Apresenta um conteúdo gênico altamente conservado que contém 37
genes, representado por dois genes que codificam RNAs ribossômicos (12s e 16s),
22 genes que codificam RNAs transportadores (tRNAs) e 13 genes que codificam
proteínas envolvidas no transporte de elétrons e na síntese de ATP (7 subunidades
da NADH desidrogenase, 3 subunidades da citocromo c oxidase, 2 subunidades da
ATP sintase e do citocromo b) (CLAYTON, 1984).
Além das características ímpares deste genoma, o amplo conhecimento desta
molécula está relacionado à facilidade de purificação, quando comparada a qualquer
outro fragmento de DNA nuclear. Essa facilidade de purificação é devida à sua
densidade incomum, à ocorrência de grande número de cópias e ao fato de estar
localizado em uma organela e não no núcleo (WILSON et al., 1985). Outras
características do DNAmt tais como: 1. alta taxa de substituição de nucleotídeos
(cinco a dez vezes superior ao DNA nuclear) (BROWN et al., 1982); 2. herança
materna (DAWID & BLACKLER, 1972); 3. conservação do tamanho, conteúdo e
ordem gênica (WALLACE, 1982), transformaram-no em uma ferramenta muito
utilizada para detectar diferenças genéticas intra e interespecíficas bem como um
marcador molecular muito utilizado na caracterização de estoques selvagens e
cultivados de peixes (BROUGHTON & DOWLING, 1994).
Os peixes parecem apresentar uma taxa de substituição de nucleotídeos do
DNAmt menor do que a dos vertebrados superiores (KOCHER et al., 1989). Algumas
hipóteses foram levantadas para explicar a alta taxa evolutiva do DNAmt, entre elas
está a ineficiência dos mecanismos de reparo para corrigir as mutações que surgem
durante a replicação; o relaxamento de função e/ou da seleção; e a grande
exposição do DNAmt a danos oxidativos (CLAYTON, 1984).
Praticamente todo o genoma mitocondrial está envolvido em funções
codificadoras, sendo que íntrons, DNA repetitivo e seqüências espaçadoras entre
genes são raras ou ausentes. Porém, existe nos vertebrados uma região não-
codificadora chamada região controle “d-loop” (Figura 1), que recebeu este nome
14
por conter o “displacement loop”, com cerca de 800pb que contém os promotores da
transcrição das cadeias leve e pesada, assim como a origem de replicação da
cadeia pesada (CLAYTON, 1984). A taxa de evolução da região controle é de duas
a cinco vezes superior à dos genes mitocondriais que codificam proteínas e essa
região é a mais variável do DNAmt, apresentando a maior taxa de substituição de
nucleotídeos, assim como a maior variação no número de seqüências repetidas em
tandem (200 - 4100 pb). Essas seqüências são consideradas como as principais
responsáveis pelas variações no tamanho do genoma mitocondrial de vertebrados
(MORITZ et al., 1987).
15
Figura 1. Região controle (d-loop) do DNAmt. Fonte: Selwood, S. P. et al., 2000.
A região controle também contém a mais alta freqüência de mutações no
comprimento em nível de população. Dos três tipos de mutações que ocorrem nas
seqüências, as substituições de bases (em vertebrados as transições são mais
freqüentes que as transversões) algumas envolvem pequenas adições/deleções de
16
nucleotídeos e outras são causadas por diferenças no tamanho da molécula do
DNAmt. Adições e deleções são freqüentemente mais observadas na região controle
e nos espaçadores intergênicos. Outros genes mitocondriais ou nucleares podem ter
taxas de substituição mais adequada para questões particulares. Analisando base
por base a região controle pode fornecer mais informações sobre o nível
populacional e contêm mais (até três vezes mais) informações filogenéticas que o
citocromo b (MEYER, 1994).
Estudos de variação geográfica do DNAmt vêm sendo realizados em diversas
espécies de peixes, em escalas espaciais e temporais. Em razão de apresentar uma
alta taxa de evolução e de gerar marcadores genéticos que distinguem populações
geográficas com grande eficiência, o DNAmt é capaz de fornecer informações
relacionadas à estrutura populacional e à história evolutiva de uma grande variedade
de organismos (MEYER, 1994).
1.3 O Pantanal
O Pantanal é uma vasta planície alagável localizada na Bacia do Alto
Paraguai (BAP), que abrange áreas do Brasil, Paraguai e Bolívia. Considerado
Patrimônio Nacional pela Constituição Federal de 1988, e reconhecido em 2000,
como Reserva da Biosfera e Patrimônio Natural da Humanidade pela Organização
das Nações Unidas para a Educação, Ciência e Cultura (UNESCO). Esta região
apresenta um regime hidrológico peculiar que se caracteriza pela alteração sazonal
dos níveis dos rios, chamado pulso de inundação, que está entre os principais
fatores que regem o funcionamento do sistema e garantem a biodiversidade da
região (EMBRAPA, 1997).
A área de abrangência total da Bacia do Alto Paraguai (BAP) equivale a
496.000 km
2
, ocupando o centro da América do Sul em territórios do Brasil, Paraguai
e Bolívia, estando compreendida entre os paralelos 14º e 22º S e os meridianos 53º
e 61º W (CARVALHO, 1986). Em território Brasileiro, a BAP ocupa 361.666 km
2
,
inteiramente compreendida nos estados de Mato Grosso ao norte e Mato Grosso do
Sul ao sul (BRASIL, 1997).
17
O Pantanal ocupa uma área de 138.183 km
2
tendo o Rio Paraguai como a
espinha dorsal do sistema de drenagem. O Rio Paraguai corre no sentido norte-sul,
recebendo água dos Rios Jaurú, Cabaçal e Sepotuba pela margem direita e Rios
Cuiabá (com seus afluentes São Lourenço e Piquiri), Taquari, Miranda (com seu
afluente Aquidauana), Negro e Apa pela margem esquerda, sendo que esse último
delimita a BAP ao sul, estabelecendo a fronteira Brasil-Paraguai (Figura 2). Nesse
trecho, ao deixar a BAP, o Rio Paraguai apresenta uma vazão média de 1.430 m
3
/s,
indo juntar-se ao Rio Paraná somente depois de cruzar todo o Paraguai, logo acima
da cidade de Corrientes, na Argentina (BRASIL, 1982; CARVALHO, 1986; BRASIL,
1997).
O Rio Paraguai, bem como os outros rios pantaneiros, apresenta uma baixa
declividade, cerca de 20 a 30 cm por quilômetro. A diferença no nível das águas
entre as estações de seca e de cheia é em média de quatro metros, mas devido à
baixa declividade pode alagar todo o Pantanal (POR et al., 1997).
O Pantanal está situado em uma região de clima seco onde a pluviosidade de
1.100 mm/ano é ultrapassada pela evaporação média que é de 1.400 mm/ano. As
chuvas estão concentradas nos poucos meses de verão e são seguidas por uma
longa seca de inverno. O Pantanal seria semi-árido não fossem as águas trazidas
pelos rios que surgem de fora desta região (POR et al., 1997). Os ecossistemas são
caraterizados por cerrados e cerradões sem alagamento periódico, campos
inundáveis e ambientes aquáticos, como lagoas de água doce ou salobra, rios,
vazantes e corixos. Apesar do seu caráter arenoso, o Pantanal é uma das maiores e
mais complexas áreas úmidas do mundo (RESENDE, 2003).
A região do Pantanal abriga flora e fauna diversificadas, num total de 1.863
espécies de plantas superiores, 122 de mamíferos, 93 de répteis, 263 de peixes e
656 de aves, como sintetizou Da Silva (2000) a partir de vários autores.
18
Figura 2. Mapa dos rios da Bacia do Alto Paraguai. Fonte: Projeto GEF Alto Paraguai
http://www.ana.gov.br/gef/graficos/MapaGEF.jpg
Os peixes são os animais mais estudados no Pantanal. No entanto, ainda
existem muitas lacunas, muitas áreas ainda não estão suficientemente amostradas e
a história de vida é pouco conhecida. Britski et al. (1999) listam 263 espécies de
peixes pertencentes a 161 gêneros e 36 famílias nesta região. A ordem
Characiformes, com 65 gêneros e 129 espécies e Siluriformes com 61 gêneros e
19
105 espécies predominam, um padrão que é característico em ambientes de água
doce neotropical.
Segundo Bánárescu (1990) devido seu passado geológico a maioria das
espécies da ictiofauna pantaneira é de origem amazônica, mas há também espécies
que são características da Bacia Paraná-Paragua. Entretanto, por ser principalmente
um corredor, não abriga uma fauna endêmica tão rica quanto a da Amazônia (POR
et al., 1997). Além disso, em lugar de inúmeras bacias de rios isolados como na
Amazônia, todos os rios do Pantanal comunicam-se entre si durante as cheias,
havendo uma permanentemente mistura da ictiofauna.
A BAP representa uma importante região para a pesca continental. Nesta
região, a pesca é a segunda atividade de importância econômica, correspondendo à
principal fonte de renda de milhares de famílias e, mais recentemente, de empresas
ligadas ao turismo pesqueiro. Assim, além de sua importância ecológica, os recursos
pesqueiros são fundamentais para a pesca de subsistência, amadora ou esportiva,
profissional e artesanal (CATELLA & ALBUQUERQUE, 2007).
A pesca esportiva na planície pantaneira tem crescido nos últimos dez anos
tornando-se a segunda atividade econômica mais importante, perdendo somente
para pecuária, com a chegada de 56.000 pescadores a cada ano no sul do Pantanal.
O número de visitantes ao norte do Pantanal é desconhecido, mas 65.000 são
estimados para o Pantanal inteiro (RESENDE, 2003).
Total da área protegida corresponde a 360.000 ha (2,6% do Pantanal
brasileiro) (http://www.ibama.gov.br/). Entretanto, os agentes da Polícia Florestal e
do IBAMA não são suficientes para fiscalizar toda área, o que facilita a caça e a
pesca predatórias das espécies pantaneiras.
Nas últimas três décadas, a região vem sofrendo agressões pelo homem,
praticadas principalmente nos planaltos adjacentes. Atualmente, os impactos
ambientais e sócio-econômicos no Pantanal são bastante evidentes, decorrentes da
inexistência de um planejamento que garanta a sustentabilidade dos recursos
naturais desse importante bioma. A Embrapa Pantanal vem respondendo aos
desafios de gerar uma nova base de informação tecnológica, capaz de conciliar o
desenvolvimento econômico com a conservação ambiental. As pesquisas mostram
que é possível utilizar de forma sustentável os recursos naturais da região,
proporcionando a elevação da renda e melhoria da qualidade de vida da população
20
pantaneira, além de estudar alternativas como o ecoturismo, gerando empregos e
garantindo a conservação do meio ambiente (EMBRAPA, 1997).
As pesquisas efetuadas ao longo dos últimos 20 anos, por pesquisadores de
diferentes áreas, vêm mostrando que o pulso de inundação é o processo ecológico
chave a ser mantido para a manutenção e conservação de rios com grandes
planícies de inundação. Há necessidade de continuidade de estudos para refinar o
entendimento dessa dinâmica, considerando principalmente o efeito das variações
plurianuais dos pulsos de inundação que ocorrem na região.
1.4 Pacu (Piaractus mesopotamicus)
Piaractus mesopotamicus (HOLMEBERG, 1887) é o peixe mais
representativo do Pantanal e ocorre em quase todas as regiões durante o período
das cheias. A espécie é conhecida popularmente como pacu-caranha, pacu-guaçu,
ou simplesmente pacu (Figura 3) (RESENDE, 2003).
Figura 3. Pacu (Piaractus mesopotamicus, Holmberg, 1887). Fonte: Lovshin, (FishBase).
21
Pertencente a família Characidae, historicamente era encontrado ao longo de
toda Bacia do Paraná-Paraguai (RESENDE, 2003). Contudo, de acordo com Quirós
(1993) está desaparecido do Rio La Plata desde 1980 e dificilmente é encontrado
nos rios Paraná Baixo e Uruguai. Trata-se de uma das espécies de grande valor
comercial e de grande potencial para o desenvolvimento da piscicultura nacional
(CALCAGNOTTO et al., 2001).
O pacu possui corpo ovalado e robusto com dorso cinza escuro e ventre
amarelado, podendo atingir 82 cm de comprimento total. Sua coloração pode mudar
de quase preto, quando ocorre nas áreas inundadas, na época das cheias, a
amarelo-brilhante, quando se encontra nas cabeceiras dos rios para a reprodução.
Sua alimentação onívora, com grande tendência à herbivoria, demonstra seu
alto grau de oportunismo quanto à exploração dos diferentes tipos de alimentos em
várias épocas do ano, o que parece garantir o sucesso na exploração dos recursos
ambientais (MACHADO, 2003). Possui como característica marcante uma dentição
própria para mastigar e triturar, os dentes são do tipo molariformes grandes
multicuspidados, especialmente adaptados para quebrar e esmagar os frutos e
sementes que compõem a sua alimentação na fase adulta (BRITSKI, 1970).
Apresenta respiração branquial obrigatória, sobrevivendo tanto em ambiente natural
quanto em viveiros de criação. Quando submetido à baixa tensão de oxigênio
dissolvido, desenvolve a formação de uma expansão temporária do lábio inferior,
vulgarmente chamada beiço (FERRAZ DE LIMA et al., 1995).
Assim como a maioria das espécies comerciais do Mato Grosso, o pacu é um
peixe de ambiente lótico que desova após um longo período de migração. A
maturação dos ovários leva quatro meses para se completar (entre julho a outubro)
e a desova acontece geralmente em novembro na cabeceira do Rio Cuiabá
(FERRAZ DE LIMA et al., 1984). Há descrições da ocorrência de adultos em
reprodução também nas cabeceiras do Rio Taquari (RESENDE, 2003).
Segundo Silva & Silva (1985) no período da enchente, as sementes e os
frutos constituem os itens mais importantes na dieta alimentar do pacu nas áreas
alagáveis. As proteínas obtidas nestas estruturas de plantas são armazenadas como
reservas de gorduras para investir em processos reprodutivos e migratórios. Na
época da vazante, indivíduos de cinco ou seis meses de idade deixam os campos
inundados e concentram-se nos alagados permanentes até o terceiro ano de vida,
quando começam a compor os cardumes e a migrar anualmente rio acima. É um
22
peixe altamente sensível à variação do nível de água, sendo o primeiro a sair do
campo inundado, quando as águas começam a baixar (AGOSTINHO et al., 2003).
Mesmo sendo uma espécie de grande importância econômica do Pantanal,
pouco se sabe sobre sua biologia, especialmente sobre sua migração. No entanto, a
maior parte dos estudos sobre a espécie é voltado a sua reprodução artificial,
nutrição e patologia.
1.5 Pesca: volumes e importância
As atividades humanas têm deixado sua marca em riachos e rios durante
milhares de anos. Como conseqüência da industrialização e do crescimento da
população humana, a pressão sobre a água natural e seus hábitats tem-se
intensificado através da história, e a degradação dos hábitats aquáticos tem-se
acelerado com conseqüências negativas para as espécies aquáticas e, portanto,
também para a pesca.
A utilização sustentável de recursos naturais, especialmente de recursos
pesqueiros, é um desafio formidável que necessita ser encarado sob o ponto de
vista técnico, político, econômico e social. Os recursos pesqueiros podem ser
utilizados economicamente pela pesca profissional e amadora (esportiva), bem
como pelas comunidades ribeirinhas como fonte de proteína nobre para a
alimentação, através da pesca de subsistência. Assim como em vários outros
países, a pesca profissional de águas interiores possui um expressivo valor
econômico e social no Brasil, particularmente na Amazônia e no Pantanal
(RESENDE, 2005).
As características físicas do Pantanal, associadas à ocorrência das
inundações anuais, propiciam uma grande produção natural de peixes, que é
utilizada pela pesca, razão pela qual se tornou uma das principais atividades
econômicas, sociais e ambientais da região. Essa atividade é praticada em três
modalidades, que também configuram os principais atores do setor: pesca
profissional artesanal, amadora (ou esportiva) e de subsistência (CATELLA, 2006). A
atividade pesqueira no Pantanal traz benefício local direto (apropriação e
23
comercialização de pescado, geração de empregos) e indireto (valor agregado ao
turismo de pesca – despesas em hotéis, restaurantes e empresas de turismo da
região) (RESENDE, 2005).
A pesca no Pantanal está centrada em poucas espécies de importância
comercial. Assim, a pressão de pesca sobre essas espécies é muito grande,
principalmente se levarmos em conta que existem mais de 260 espécies de peixes
na região e milhares de pescadores a cada ano (MORAES et al., 2002).
O pacu é uma das espécies nativas mais cultivadas no Brasil. Características
como rusticidade, crescimento rápido e facilidade em aceitar ração, bem como
potencial para pesca esportiva e carne muito bem aceita pelo mercado consumidor
tornaram o pacu uma espécie importante para a aqüicultura interior (CASTAGNOLLI
& CYRINO, 1986).
A pesca do pacu tem sido monitorada desde 1994 pela Embrapa Pantanal e
vem mostrando a grande importância desta espécie para a pesca tanto esportiva
como profissional, em contra ponto tem se observado a diminuição do estoque com
o aumento do esforço pesqueiro mostrando que a exploração estava acima de sua
capacidade de regeneração, levando a espécie de primeiro lugar em volume de
captura no Pantanal para o terceiro lugar em 2003 (Figura 4) (CATELLA &
ALBUQUERQUE, 2007). Para a manutenção das populações selvagens de pacu no
Pantanal do Mato Grosso vem sendo dada especial atenção à conservação das
zonas inundadas quanto à vegetação e à qualidade da água (CALCAGNOTTO,
1998).
Figura 4. Quantidade total de pescado capturado (toneladas) na Bacia do Alto Paraguai, MS, no
período de 1994 a 2003. Fonte: SCPESCA/MS.
24
A fim de manejar a exploração excessiva, foi estabelecido um tamanho
mínimo de captura do pacu de 40 a 45 cm (RESENDE, 2003). O tamanho mínimo de
captura é aquele acima do qual todos os indivíduos de uma determinada espécie já
se reproduziram pelo menos uma vez. Levando-se em conta que uma única
reprodução de um peixe significa a produção de milhares de ovos e dezenas de
novos indivíduos, ao se adotar o tamanho mínimo de captura, se considera que
estão sendo capturados indivíduos que já deram uma contribuição significativa para
a sua população de origem (RESENDE, 2005).
Apesar de ser uma das bacias mais importantes em termos da pesca
esportiva e comercial, poucos têm sido os estudos sobre o padrão de estruturação
genética de populações de peixes na Bacia do Alto Paraguai.
Para a conservação e uso sustentado dos recursos naturais a Embrapa
Pantanal vem há anos estudando os recursos pesqueiros, a fim de conhecer a
biologia, ecologia e genética da espécie para gerar subsídios para sua conservação
e uso sustentado.
O manejo de estoques pesqueiros utiliza medidas de ordenamento como a
definição de épocas de pesca, respeitando, por exemplo, o período de reprodução
das espécies - chamado “período de defeso”; restrição do uso de apetrechos de
pesca, proibindo aqueles equipamentos pouco seletivos, que, portanto, desfalcariam
as populações em várias faixas etárias, incluindo os juvenis; e definindo os
tamanhos dos indivíduos capturados – “tamanho mínimo de captura”, evitando que
sejam capturados os indivíduos que nunca se reproduziram.
1.6 Populações - Unidades de Conservação
A conservação de um determinado recurso biológico aquático requer o
conhecimento de variáveis fisiológicas, comportamentais e ecológicas, que são
importantes na determinação de como uma dada população sobrevive e se reproduz
em diferentes ambientes (DANZMANN et al., 1991). Um dos pontos centrais destes
fatores é o entendimento da estrutura populacional da espécie para que se
25
determinem tanto as respostas fisiológicas às variações ambientais como as
estratégias de manejo das populações naturais (RYMAN & UTTER, 1987).
O conceito de populações locais, subpopulações, estoques ou demes (DIZON
et al., 1992) pode diferir em relação ao grau de homogeneidade genética,
importância quanto ao isolamento reprodutivo e ao potencial para a exploração
(GULLAND, 1969). No caso de recursos pesqueiros o conceito de população local
se complica ainda mais por fatores políticos, econômicos e sociais (CARVALHO &
HAUSER, 1994).
Uma abrangente definição de populações locais foi proposta por Ihssen et al.
(1981), que descreveram uma população local como “um grupo intraespecífico de
indivíduos que se reproduz ao acaso com integridade espacial e temporal”. Esta
definição, quando aplicada a um recurso biológico potencialmente explorável, com
baixo grau de integridade, as diferenças genéticas e fenotípicas entre as populações
não são levadas em consideração. Assim, neste caso, as populações abrangem
apenas os indivíduos cuja abundância depende das taxas de recrutamento e
mortalidade. Já o conceito populacional, dentro de um ponto de vista genético,
atribui a tal unidade biológica um alto grau de integridade que leva em consideração
o isolamento reprodutivo, diferenciação genética de outras populações,
especialização ecológica e adaptação local.
Desta forma, o conceito de população descrito por Ihssen et al.(1981) pode
ser interpretado de acordo com o manejo a ser implementado, aqui especificamente,
sobre um recurso biológico aquático. Por um lado, temos uma estratégia a curto
prazo cuja preocupação básica é a manutenção do recurso, evitando sua redução
pelo excesso de captura; por outro, temos uma estratégia de conservação a longo
prazo, que leva em consideração a diversidade genética dentro e entre populações.
De qualquer modo a existência destas diferenças oferece a oportunidade de
obter informações sobre a estrutura genética de populações, podendo-se assim
traçar estratégias de conservação, bem como, o conhecimento e identificação das
melhores estirpes a serem usadas em programas de melhoramento.
Sem dúvida, esforços no sentido de explorar ou manejar uma espécie de
peixe pode alterar a estrutura genética desta espécie. Têm-se observado alterações
produzidas pela captura intensiva de populações naturais ou pelo estabelecimento
em larga escala de populações produzidas em centrais de produção de alevinos por
muitas gerações. Tais atividades aumentam em magnitude e intensidade a
26
necessidade de metodologias de análises que permitam descrever as características
genéticas e com isso avaliar a extensão destas alterações.
Desta forma, torna-se necessário a descrição da estrutura genética de
populações naturais, do desenvolvimento de marcadores genéticos com os quais um
simples peixe possa ser identificado e pelo desenvolvimento de sistemas de
monitoramento das mudanças quantitativas e qualitativas dos recursos aquáticos
provenientes das várias atividades de manejo, isto é, por métodos sensíveis para se
estimar a perda de variação genética nas populações naturais.
Em várias partes do mundo o manejo da ictiofauna, seja ele no contexto da
conservação da biodiversidade ou pela manutenção e incremento da produção
pesqueira, tem forte apelo sócio-econômico e ambiental. Por isso mesmo tem sido
alvo de grandes esforços em conhecimento e recurso financeiro por parte das
iniciativas públicas e privadas (SILVA, 2006).
Os programas mais modernos de manejo da ictiofauna utilizam diversas
técnicas para alcançar seus resultados, entre elas, podemos destacar a implantação
de períodos de defeso, definição de cotas de captura, normatização dos tipos de
equipamentos permitidos para captura, vitalização das áreas de desova e
crescimento, potencialização de ambientes naturais, recuperação de ambientes
degradados, educação ambiental, repovoamento, estudos de facilidades para
transposição de peixes migradores, entre outros (SILVA, 2006).
1.7 Filogeografia
Sob o ponto de vista populacional, a diversidade genética dos peixes pode de
um modo geral, ou estar homogeneamente espalhada por toda a área de
distribuição geográfica de uma determinada espécie de peixe, ou estar concentrada
em determinadas subáreas populacionais designadas como estoques, bancos
genéticos naturais, ou unidades de manejo (MORITZ, 1994). As unidades de manejo
podem ser reconhecidas como subpopulações que se distinguem através de
diferenças significativas na composição genética detectada por meio de marcadores
genéticos moleculares (CALCAGNOTTO, 1998).
27
Sob o ponto de vista biogeográfico, tem-se procurado caracterizar a
distribuição da biodiversidade ictiogenética usando uma hierarquia de quatro
padrões filogeográficos do DNAmt e a existência ou não de barreiras zoogeográficas
(AVISE, 1994).
A partir da década de 80, a utilização de dados obtidos através de estudos
com DNAmt desencadeou uma mudança de atitude em relação a hipótese
filogenética no que diz respeito à estrutura populacional intraespecífica de vários
grupos biológicos. Avise et al. (1987) propuseram o conceito de “filogeografia” para
abranger o estudo dos princípios e processos que seriam responsáveis pela
distribuição geográfica de várias categorias biológicas, especialmente das
intraespecíficas. Avise (1989) sugeriu a criação de quatro categorias populacionais,
baseadas em dois critérios principais: 1. distância genética estimada através de
dados do nível de divergência entre as seqüências de DNAmt. 2. localização
geográfica dos agrupamentos de haplótipos de DNAmt.
Categoria Filogeográfica I: Engloba populações alopátricas que apresentam
diferenças genéticas significativas entre si. A hipótese mais aceita para explicar as
grandes diferenças genéticas que apresentam distribuição geográfica seria a
existência de barreiras físicas extrínsecas antigas ao fluxo gênico. Outra
possibilidade seria a extinção de genótipos intermediários nos casos de espécies
com dispersão e fluxo gênico limitados. Em termos de conservação genética, as
populações incluídas na Categoria I devem ser tratadas como unidades separadas
(AVISE, 1989).
Categoria Filogeográfica II: Constituída por populações que apresentam
diferenças genéticas entre si, mas que se encontram em simpatria. Este tipo de
situação poderia surgir com o aparecimento de áreas de contato secundárias
recentes ou a existência de barreiras intrínsecas, como, por exemplo, barreiras
devidas ao isolamento reprodutivo. Geograficamente, não haveria razão para não
serem consideradas como uma única população, mas a ocorrência de diferenças
morfológicas e genéticas poderia ser indicativa de algum grau de isolamento
reprodutivo (AVISE, 1989).
Categoria Filogeográfica III: Nesta categoria são encontradas populações
alopátricas que, no entanto, são geneticamente semelhantes que ocupam regiões
geográficas distintas e que, entretanto, apresentam pouca ou nenhuma diferença
genética, ou seja, menos de 1% de divergência de DNAmt. Uma explicação para a
28
separação geográfica de clones de DNAmt neste caso envolveria fluxo gênico
historicamente limitado entre espécies que não estejam subdivididas por barreiras
zoogeográficas antigas (AVISE et al., 1987).
Categoria Filogeográfica IV: Nesta categoria estão incluídas as populações
cujas diferenças entre os haplótipos de DNAmt e suas freqüências são pequenas ou
praticamente inexistentes e que ocupam a mesma área, não se encontram
subdivididas por barreiras geográficas antigas ou recentes. Nesses casos haveria
pouco ou nenhum isolamento reprodutivo. Esta categoria propõe que as populações
de espécies tenham tido contato recente por meio de fluxo gênico intenso (AVISE et
al., 1987).
A estrutura filogeográfica pode variar desde as evolutivamente “rasas”, isto é,
com diferenças genéticas relativamente pequenas e restritas a apenas alguns genes
e a certas populações geográficas até as evolutivamente “profundas”, isto é, que
apresentam diferenças genéticas significativas em relação a vários genes e com
distribuição geográfica concordante (AVISE, 1994).
29
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Testar a hipótese de panmixia das populações de Piaractus mesopotamicus
em Rios do Pantanal.
2.2 Específicos
Avaliar a variabilidade genética de populações selvagens de Piaractus
mesopotamicus amostradas em quatro sub-bacias do Pantanal formadas
pelos Rios Cuiabá, Taquari, Miranda, Negro e o próprio Rio Paraguai,
formadores da grande Bacia do Alto Paraguai, por meio de análises de
seqüências da região controle (d-loop) do DNA mitocondrial;
Analisar a variabilidade genética entre e dentro das populações selvagens do
pacu da Bacia do Alto Paraguai;
Avaliar o uso da região d-loop como marcador molecular em estudos de
genética populacional;
Sugerir estratégias de conservação das populações de pacu de acordo com
os resultados obtidos pelo presente estudo.
30
3 METODOLOGIA
3.1 Processo de amostragem
A coleta de material biológico para a extração de DNA total de Piaractus
mesopotamicus foi realizada ao longo de um ano em várias expedições por meio de
redes de espera estabelecidas em pontos de ocorrência da espécie nos rios
escolhidos (Tabela 1 e Figura 5). As coletas foram realizadas pela Embrapa –
Pantanal. As amostras de nadadeira caudal e/ou adiposa foram armazenadas em
álcool etílico a 95% e estocadas a -20°C. Posteriormente foram enviadas para o
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aqüicultura (LAGOAA) / Núcleo
Integrado de Biotecnologia / Universidade de Mogi das Cruzes, onde todos os
procedimentos laboratoriais foram realizados.
O número amostral estabelecido, 10 amostras por localidade, está dentro do
padrão utilizado em estudos populacionais de espécies neotropicais com o
seqüenciamento do DNAmt (SANTOS et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2006; SUN et
al., 2004; MARTINS et al., 2003; SIVASUNDAR et al., 2001).
Tabela 1. Distribuição das amostragens de pacus nos locais de coleta.
Localidade
Local de amostragem
N
Coordenadas geográficas
latitude Sul
longitude Oeste
Cuiabá
Rio Cuiabá (Parque Nacional-Foz) 10 17°51'49" 57°30"36"
Rio São Lourenço 10 17°50"48" 57°23'29"
Rio Cuiabá (Sesc Pantanal) 10 16°44'28,7" 56°29'18,6"
Taquari
Rio Taquari (Caronal) 10 18°15'01,5" 56°08'16,3"
Rio Taquari (Palmeiras) 10 18°21'49" 54°36'49"
Negro Rio Negro 10 ----- -----
Miranda Rio Miranda (Formoso) 10 21°04'53" 56°'''45"
Paraguai
Rio Paraguai (Mirim) 10 18°51'52" 57°25'26"
Rio Paraguai (Corumbá) 10 19°00'36" 57°31'46"
Rio Paraguai (Cáceres) 10 16°03'49" 57°41'34"
31
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OESTE
SONORA
PEDRO
GOMES
CÁCERES
Poconé
VÁRZEA
GRANDE
STO ANTONIO
DO LEVEGER
CHAPADA
GUIMARÃES
CUIABÁ
MIMOSO
RONDONOPOLIS
BARÃO DE MELGAÇO
Tangará da
Serra
Barra do
Bugre
Alto
Paraguai
Diamantino
R
i
o
C
u
i
a
b
á
Rosário do
Oeste
Descalvados
Poxoréu
MATO GROSSO
GOIÁS
MATO GROSSO
DO SUL
Porto
estrela
Jaciara
R
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C
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V
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Tiquira
ALCINÓPOLIS
COXIM
R
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T
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r
í
Corumbá
Lagoa jacadigo
N
e
g
r
o
R
i
o
Rio Negro
Rio Verde do
Mato Grosso
São Gabriel
do Oeste
Camapuã
Miranda
Bandeirantes
Aquidauana
Anastácio
Terenos
Campo
Grande
A
q
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Bodoquena
Bonito
Nioaque
Sidrolândia
Guia Lopes
Jardim
M
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g
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Caracol
Bela Vista
R
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A
p
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Porto
Murtinho
P
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d
i
d
o
R
i
o
R
i
o
C
a
r
a
c
o
l
Porto São
Francisco
15º S
60º W
55º W
20º S
B O L I V I A
P A R A G U A I
0 50 100 km
Figura 5: Rios do Pantanal Mato Grossense e indicações dos locais de coleta (em azul). Fonte: Embrapa
Pantanal.
32
3.2 Extração do DNA total
A extração do DNA total das amostras foi realizada de acordo com o protocolo
descrito por Taggart et al. (1992), modificado com a adição de tampão STE (0,1 M
NaCl, 0,05 M Tris-HCl e 0,001 M EDTA, pH 8,0) com concentração reduzida de
EDTA, visto que este pode reagir com o MgCl
2
e reduzir a eficiência das
amplificações por PCR.
O tecido das nadadeiras foi cortado em pedaços menores e hidratado em
tampão TE (Tris-HCl e EDTA, pH 7,5) durante 1h e 30min. Ao final deste tempo,
todo o TE foi substituído por 500 µl de tampão STE, 30 µl de SDS a 10% (Dodecil
Sulfato de Sódio) e 10 µl de proteinase K (Invitrogen) a 20mg/ml. O material foi
agitado vigorosamente e incubado a 65°C por aproximadamente 1 hora. Novamente
o material foi agitado após a adição de 5 µl de RNAse A (Invitrogen) a 10mg/ml e
incubado a 37°C por mais 1 hora.
O processo de separação do DNA total dos restos celulares, foi feito com a
adição de 400 µl de fenol equilibrado e 200 µl de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1)
e posterior centrifugação a 12000 rpm a 10 minutos. Cerca de 600 µl do
sobrenadante foram transferidos para novos microtubos de 1,5 ml e uma segunda
purificação foi feita, porém apenas com clorofórmio/álcool isoamílico (600 µl) e
centrifugação a 12000 rpm por mais 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para
novos microtubos de 1,5 ml. A precipitação do DNA foi feita com adição ao
sobrenadante, de 1,0 ml de etanol gelado a 100% e 30 µl de acetato de sódio a 3,0
M (pH 5,2).
As amostras foram armazenadas a -20°C por 16 horas e, então, centrifugadas
a 4°C por 30 minutos, a 12000 rpm, para a obtenção de precipitado. A fase líquida
foi desprezada e, as amostras, lavadas com etanol gelado a 70%. Novamente, o
líquido foi descartado e o precipitado foi liofilizado e, então, hidratado com 100 µl de
tampão TE (pH 7,5).
A integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de
agarose a 0,8%, corado com brometo de etídio. A qualidade do DNA extraído foi
avaliada por comparação com o marcador
λ HindIII (Invitrogen). A quantificação do
33
DNA template foi feita por espectrofotometria através de um espectrofotômetro de
alta precisão NanoDrop
Tm
1000 (Thermo Scientific).
3.3 Análise de seqüências da região do D-loop mitocondrial
3.3.1 Amplificação por PCR
As amplificações para obtenção da região do d-loop foram feitas pela reação
em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”, PCR), utilizando os primers
L2910 e H3010 (Tabela 2) desenhados por Hilsdorf (2004) a partir de seqüências do
DNAmt de Piaractus mesopotamicus depositadas no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Testes de concentração de MgCl
2
, temperatura de
anelamento dos primers e diluição do DNA total foram realizados para se obter
produto de PCR consistente. Os componentes da reação de PCR e as condições de
amplificação dos mesmos estão apresentados na Tabela 3 e Tabela 4,
respectivamente. As reações de PCR foram realizadas no termociclador
“Termociclador MJ Research, Inc. - PTC-0200 DNA Engine”.
Tabela 2. Seqüência do par de primers utilizados para a amplificação da região d-loop do DNAmt de
Piaractus mesopotamicus.
Primers
Região
Seqüência
L2910 D-loop 5´CTA ACT CCC AAA GCT AGT ATT C 3`
H3010 D-loop 5´ C TTC AGT GTT ATG CTT TAT TTA AGC TAC 3´
Fonte: Hilsdorf (2004) não publicado.
34
Tabela 3. Componentes e concentrações dos reagentes utilizados nas reações de PCR.
Reagentes
Concentração
do esto
que
Tampão 10x
dNTPs 2,5mM
MgCl
2
3,0mM
Primers (forward e reverse)
10mM
Taq DNA polimerase 5U/µl
DNA 80-200ng/µl
H
2
O MilliQ (para completar reação de 50 µl) ------
Tabela 4. Condições dos ciclos de amplificação do programa de gradiente de temperatura.
Os produtos da amplificação foram analisados em gel de agarose 1%
submerso em tampão TAE 1X (0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA) em eletroforese a
80 - 100 V, utilizando como marcador Ladder 100 bp (“Invitrogen Life Technologies”).
O gel foi corado com brometo de etídio (1,0 µg/ml), observado e fotografado sob luz
ultravioleta no equipamento de foto-documentação ImageQuant 300 (GE
Healthcare).
3.3 2 Purificação do produto de PCR
Após checagem em gel de agarose o produto amplificado da região de
interesse foi purificado para a utilização na reação de seqüenciamento. Na
purificação foi retirado o excesso de primers e outros produtos não incorporados na
Etapas
Temperatura
Tempo
Denaturação Inicial 94°C 3 minutos
Denaturação 94°C 1 minuto
Anelamento 50°C a 60°C 45 segundos
Extensão 72°C 1 minuto e 30 segundos
Recomeçar ciclo desde a denaturação - 34 vezes
Extensão final 94°C 10 minutos
35
amplificação como dNTPs e sais que pudessem interferir o seqüenciamento. Para a
purificação foi utilizado o kit “GFX
TM
PCR DNA e Gel Band Purification” (GE
Healthcare), de acordo com os procedimentos descritos pelo fabricante.
3.3.3 Seqüenciamento do DNA
Todas as amostras de cada população amplificadas e purificadas foram
submetidas à reação de seqüência composta por 1, 2, 3 ou 4 µl de amostra
(dependendo do resultado da purificação), 1 µl do primer forward (L2910 10mM), 3 µl
de tampão Save Money, 2 µl de Big Dye versão 3.1 (Applied Biosystems), em uma
reação de volume final de 10 µl. A reação foi colocada em um termociclador
“Termociclador MJ Research, Inc. - PTC-0200 DNA Engine” nas seguintes
condições: 96ºC por 2 minutos; 25 ciclos de 96ºC por 45 segundos, 52ºC por 30
segundos e por fim 60ºC por 4 minutos. Após os ciclos, a reação foi transferida para
um microtubo de 1,5ml e adicionado 80 µl de isopropanol 75%, os microtubos foram
centrifugados por 30 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado foi lavado com etanol 70% (200 µl), os microtubos foram centrifugados
por mais 10 minutos. Novamente o sobrenadante foi descartado e os microtubos
secos no banho seco à 96ºC por 2 minutos. Após secos foram adicionados 10 µl de
formamida. As amostras foram transferidas para uma microplaca com 96 poços e
levadas para desnaturar a 95ºC por 5 minutos depois resfriadas no gelo. As mesmas
foram seqüenciadas em um seqüenciador automático ABI 3100 (Applied
Biosystems).
O resultado do seqüenciamento foi analisado pelo programa CodonCode
Aligner versão 1.4.1 (2005) para avaliar a qualidade da seqüência e, gerar
seqüências consensos. Os consensos (contigs) foram gerados a partir da
comparação de duas ou mais seqüências da mesma amostra. Os contigs servem
para confirmar cada nucleotídeo seqüenciado, descartando erros no processo de
seqüenciamento.
O CodonCode é um programa que realiza a identificação de bases a partir do
eletroforetograma (base-calling) e determina a confiabilidade de cada base, levando
em conta anomalias na migração eletroforética decorrente da inserção dos
36
terminadores e do espectro de emissão dos fluoróforos. O programa utiliza os dados
de seqüência contidos no arquivo do eletroforetograma processado inicialmente pelo
seqüenciador automático. Em seguida é executado um procedimento em 4 fases
para determinar a seqüência de bases mais confiável a partir desse arquivo: (1)
primeiramente é determinada a localização dos picos ideais usando a idéia de que
os fragmentos são regularmente espaçados ao longo da matriz no capilar e, dessa
forma, estimar o número correto de bases e suas localizações em regiões onde os
picos não estão bem resolvidos; (2) em seguida os picos observados são
identificados e (3) alinhados com os picos ideais; (4) finalmente os picos observados
que não parearam com os picos ideais na fase anterior são analisados e, se for
encontrada correspondência, a base é inserida na seqüência.
As seqüências consenso foram, em seguida, comparadas com as do banco
de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através da ferramenta BLAST
(ALTSCHUL et al., 1990).
3.4 Análise Estatística
As seqüências foram visualmente analisadas para se determinar os
haplótipos gerados em cada população. O alinhamento foi feito pelo Clustal W
(THOMPSON et al., 1994) através do programa Mega 4 (TAMURA et al., 2007).
Foi utilizado o método Neighbour-Joining (NJ) para construir uma árvore
enraizada pelo método do grupo externo, usando o modelo de evolução nucleotídica
Tamura-Nei, através do programa Mega 4 (TAMURA et al., 2007).
Uma rede de haplótipos foi construída através do método de parcimônia
estatística, com o programa TCS v. 1.21 (CLEMENT et al., 2000).
Os testes estatísticos D de Tajima (1989) e Fs de Fu (1997) foram estimados
com o programa DnaSP v. 4.50.1 (ROZAS et al., 2008) e aplicado para testar a
existência de pressão seletiva agindo sobre as substituições.
Com o programa DnaSP v. 4.50.1 (ROZAS et al., 2008) foram medidas as
diversidades nucleotídicas (π) e haplotípicas (Hd) dentro de cada população (NEI,
37
1977). O programa foi utilizado para testar a hipótese de distribuição não-aleatória
dos haplótipos (sob a hipótese de panmixia).
A estrutura populacional foi averiguada empregando-se a análise de variância
molecular (AMOVA) (EXCOFFIER et al., 1992) para gerar estimativas da variância
genética em diferentes níveis hierárquicos, que utiliza a estatística F de Wright
(1951) denominado como Ф estatística, que incorpora as freqüências alélicas e as
distâncias evolutivas entre os haplótipos indicando o grau de subdivisão geográfica,
através do programa Arlequin 3.11 (EXCOFFIER et al., 2006).
Os parâmetros de Ф (Ф
ct
, Ф
sc
e Ф
st
) são medidas de correlação para cada
nível de subdivisão populacional. De maneira que Ф
ct
é a correlação de haplótipos
tirados ao acaso de um grupo de populações em relação ao total da espécie; Ф
sc
é a
correlação de haplótipos retirados ao acaso de uma população em relação ao
haplótipos do grupo; Ф
st
é a correlação de haplótipos retirados ao acaso de uma
população em relação ao total de haplótipos da espécie (EXCOFFIER et al., 1992).
A significância da Ф – estatística foi determinada pelas permutações não-
paramétricas (EXCOFFIER et al., 1992) com 1000 permutações.
Também foi calculado o índice Φ
st
entre pares de amostras, o qual pode ser
usado como uma estimativa da distância genética entre as populações. A
significância foi testada através de testes não-paramétricos de permutação com
10000 replicações, com índice de significância de 0,05 (EXCOFFIER et al., 1992).
O componente de variância inter-populacional é extraído por equações das
esperanças de quadrado médio (QMD), conforme a análise de variância
convencional das freqüências alélicas, utilizadas para estimar o Φ
st
. O mesmo
procedimento pode ser empregado com base no desdobramento da soma de
quadrado entre as distâncias, utilizando as estatísticas-Φ. Neste caso, Φ
st
é
interpretado como a correlação de haplótipos aleatórios dentro de populações. O
teste de Mantel (10.000 permutações) testou o isolamento pela distância entre as
populações (BELKHIR, 1999), através do programa GENETIX versão 4.01.
38
4 RESULTADOS
4.1 Extração do DNA total
Após a aplicação dos protocolos para extração de DNA, verificou-se que as
amostras apresentavam material degradado (Figura 6). Algum nível de degradação
geralmente é esperado já que em campo o material é conservado somente em
etanol sem resfriamento. Devido aos diferentes níveis de degradação das amostras
de DNA extraído, foi necessário realizar testes para padronização das amostras para
se obter uma amplificação satisfatória das regiões do DNA em estudo.
pb
23.130
9.416
6.557
4.361
2.322
Figura 6. Gel de agarose: DNA total extraído de amostras dos indivíduos de pacu da Sub-
bacia do Rio Cuiabá.
39
4.2 Amplificação da região do d-loop mitocondrial
Os primers para região do d-loop do DNA mitocondrial de pacu foram
desenhados a partir da seqüência desta região depositada no Genbank (AF283959).
Os primers desenhados anelaram-se na região do RNA transportador da prolina (L-
2910) e da fenilalanina (H-3010) que flanqueiam toda seqüência de 1.100 pb da
região de controle (d-loop) do mtDNA do pacu. Como mostra a figura 7 os testes
com gradiente de temperatura de anelamento (de 50
o
C a 60
o
C) com estes primers
mostraram uma satisfatória eficiência de amplificação, sendo que os melhores
resultados foram obtidos a temperatura de anelamento de 59,8°C (circulado em
vermelho). Os testes de concentração de MgCl
2
mostraram melhor resultado na
concentração de 3,0 mM (Figura 8).
1.100 pb
pb
2072
1500
Figura 7. Gel de agarose: resultado do teste de gradiente
de temperatura com a amostra de DNA do indivíduo nº 5
do Rio Paraguai Mirim.
40
Devido às amostras de DNA total estarem degradas e outras estarem muito
concentradas, foram feitas diluições do DNA estoque para estabelecer uma
concentração ideal a ser utilizada nas reações de PCR. Os resultados desse teste
mostraram que a concentração de DNA utilizada para PCR variou de amostra para
amostra, para maioria os melhores resultados foram nas diluições de 1:9 e 1:18
(Figura 9).
Figura 8. Gel de agarose: resultado do teste de concentração de
MgCl
2,
as bandas circuladas em vermelho são na concentração de
3,0mM, as bandas circuladas em azul são de 1,5mM.
pb
1500
1000
1100 pb
41
Os resultados obtidos na purificação com o kit GFX foram satisfatórios, tanto
para purificação feita com a reação direta do produto de PCR como para purificação
realizada com a banda cortada do gel (Figura 10). Em algumas amostras, além da
região d-loop, regiões inespecíficas (Figura 11) também foram amplificadas. Sendo
assim, a banda correspondente a região d-loop foi excisada do gel para que se
pudesse realizar a purificação desta.
pb
1500
1000
500
1100 pb
Figura 9. Gel de agarose: resultados do teste de diluição do DNA total. As bandas
circuladas em vermelho estão na concentração de 1:18, as bandas circuladas em azul
são 1:9, as demais não amplificaram.
Figura 10. Gel de agarose: resultado da purificação
das amostras amplificadas de amostras diversificadas.
pb
1500
1000
1100 pb
42
4.3 Região do d-loop mitocondrial
O alinhamento final das seqüências da região controle do DNAmt, com 814
pares de bases de comprimento, obtidas das 99 amostras de cinco populações de
Piaractus mesopotamicus analisadas: Cuiabá, Taquari, Negro, Miranda, Paraguai,
gerou uma matriz de dados que definiu um total de 34 haplótipos (Tabela 5 e Figura
12). A média de bases nucleotídicas calculadas foi de 34,2% de adenina, 33,5% de
timina, 13% de guanina e 19,3% de citosina, evidenciando a prevalência de AT na
composição genética dessa região. Vinte e sete sítios polimórficos foram
encontrados (Tabela 6).
pb
1500
1000
500
1100pb
600pb
Figura 11. Gel de agarose: amplificação da amostra
nº 7 do Rio Miranda, as bandas circuladas em
vermelho mostram uma região amplificada
inespecífica (~600pb) de não interesse.
43
Tabela 5. Distribuição das amostras de Piaractus mesopotamicus de acordo com as localidades geográficas e haplótipos encontrados. (-) haplótipos não
encontrados.
Haplótipos
Rios
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
Cuiabá-Foz 5 - - - 1 1 1 - - - - 1 1 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
São Lourenço 3 2 1 - - - - 1 - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - -
Cuiabá-Sesc 3 - 1 1 1 - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - -
Taquari-Caronal 5 - - - - 1 - 1 - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - -
Taquari-Palmeiras 5 - - 2 - - - - 1 - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - -
Negro 6 2 2 - - - 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Miranda 4 2 - - 1 - - - - 1 - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - - - - - -
Paraguai-Mirim 3 1 - 1 1 - - - - - 1 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - - - -
Paraguai-
Corumbá
3 - - 1 1 1 - - 1 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 1 - - 1 1 1 1 1
Paraguai-
Cárceres
1 2 2 1 - - - - - 1 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Total
38 9 6 6 5 3 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
44
Cuiabá Foz
São Lourenço
Cuiabá Sesc
Taquari Caronal
Taquari Palmeiras
Negro
Miranda
Paraguai Mirim
Paraguai Corumbá
Paraguai Cáceres
LEGENDA
Figura 12. Mapa esquemático – gráficos mostrando a freqüência dos haplótipos distribuídos entre os Rios
estudados.
45
Tabela 6. Sítios polimórficos entre os haplótipos de Piaractus mesopotamicus. Os números dos
haplótipos estão listados na coluna à esquerda e as posições polimórficas no alto da tabela. Os
nucleotídeos do haplótipo 01 representam os demais nucleotídeos na mesma posição. Nos sítios
polimórficos os nucleotídeos diferentes são indicados na tabela. Nucleotídeos idênticos são
representados por (.).
Do total de haplótipos obtidos (34), 11 são compartilhados entre populações e
23 são restritos, sendo oito restritos à população Cuiabá, quatro restritos ao Taquari,
dois restritos ao Miranda, dez restritos ao Paraguai. O haplótipo 1 é o mais
1
5
7
1
9
5
1
9
9
2
0
1
2
1
4
2
1
5
2
1
8
2
3
2
2
3
9
2
5
0
2
5
8
2
6
1
2
6
9
2
7
2
2
7
9
2
8
2
2
9
0
2
9
4
2
9
8
3
0
4
3
0
5
3
0
6
3
1
0
3
1
1
3
1
2
3
1
3
3
1
7
H01 (38) C C A T A
G
G
A
T
T
A
T
A
T
T T
T
C
A
T
C
C
C
A
A
G
T
H02 (7) . . . . . . . . . . C
. . C
. C
. . . .
. . . . . . .
H03 (6) T . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .
H04 (6) . . . . . . . . . . C
. . . . . . . . .
. . . . . . .
H05 (5) . . . . . . A
. . . . . . . . . C
. . .
. . . . . . .
H06 (3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . G
. . .
H07 (3) . . . . . . A
. . . C
. . . . C
. . . .
. . . . . . .
H08 (2) . . . . . A
. . . . . . . . . . . . T
.
. . . . . . .
H09 (2) . . . . . . . . . . G
. . . . . . . . .
. . . . . . .
H10 (2) . . . . . . . . . . . . . . . . . T
. .
. . . . . . .
H11 (2) . . . . . . . . . . C
. . . . C
C
. . .
. . . . . . .
H12 (1) . . . . . . . T
. A
. . . C
. . . . . .
. . . G
. . .
H13 (1) . . . . . . . . . . . . G
. . . . . . .
. . . . . . .
H14 (1) . . . . . . . . . . . . . . . C
. . . .
. . . . . . .
H15 (1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. T . . . . .
H16 (1) . . . C . . . . . . . . . . . . . . . .
. . T
. . . .
H17 (1) . . . . . . . . . . . . . C
. . . . . .
. . . . . . .
H18 (1) . . . . . . . . C
. C
. . . . C
C
. . .
. . . . . . .
H19 (1) . . . C . . . . . . . C
. . . . . . . .
. . . . . . .
H20 (1) . . . . G
. . . . . . . . . . . . T
. .
. . . . . . .
H21 (1) . . . . . . A
. . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .
H22 (1) . . . . . . . . . . C
. . . . C
. . . .
. . . . T
. .
H23 (1) . . G . . . . . . . C
. . . . C
. . . .
. . . . . . C
H24 (1) . . . . . . . . . . C
. . C
. . . . . .
. . . . . . .
H25 (1) . . . . . . . . . . . . . . . . C
. . .
. . . . . . C
H26 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
. C
. . . .
. . . T
. . .
H27 (1) T . . . . . . A
. T
. . . T
. . . . . .
. . T
A
. . .
H28 (1) . . . . . A
. A
. T
. . . T
. . C
. . .
. . . A
. A
.
H29 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
C
. . . . .
. . . A
. . .
H30 (1) . . . . . . . . . T
. . . T
. . . T
. .
. . . A
. . .
H31 (1) . . . . . . . . . T
. . . T
. C
. . . C
. . . . . . .
H32 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
. C
. . . .
. . . A
T
. .
H33 (1) . . . . . . . A
. T
C
. . . . C
. . . .
T T . A
. . .
H34 (1) . . . . . . . A
. T
. . . T
. . . . . .
. . . . . . .
46
freqüente, sendo o único estando presente em todas a populações. A maior
diversidade haplotípica (Hd) (0,94318) é encontrada na região dos rios do Paraguai
onde são encontrados 18 haplótipos, sendo que 10 são exclusivos para essa
população. A menor diversidade haplotípica (0,62222) é encontrada na sub-bacia do
Rio Negro onde apenas 3 haplótipos foram evidenciados (Tabela 7). Esta baixa
diversidade haplotípica pode ser explicada pela baixa amostragem, do mesmo modo
ocorre com a sub-bacia do Miranda.
A diversidade nucleotídica (π) (Tabela 7) dentro de cada população varia de
0,9% no Taquari-Palmeiras a 5,2% no Negro.
O teste estatístico Tajima (D) (TAJIMA, 1983) e de Fu (F
s
) (FU, 1997) para os
dados totais não mostraram desvio significativo da expectativa neutra das mutações
para as populações estudadas (D = -1,73022; P > 0,05; F
s
= -10,93 ; P > 0,05),
exceto quando testadas as amostras separadamente, Taquari e Cuiabá revelaram
valores significativos (P < 0,05), D = -2,00205 e -1,85913 e F
s
= -2,72419 e -2,85390,
respectivamente (Tabela 7).
Rios
N°
haplótipos
Média ± diversidade
haplótipica (Hd)
Média ± diversidade
nucleotidica (π)
D de Tajima Fs de Fu
Cuiabá-Foz 8 2,509±0,818 12,200±0,028 -1,673 -1,847
Cuiabá-Sesc 6 2,489±0,911 3,048±0,011 -0,352 -0,732
São Lourenço 6 1,714±0,857 3,911±0,012 -1,964* -2,298*
Taquari Caronal 5 1,778±0,722 7,833±0,022 -1,331 -1,607
Taquari Palmeiras 5 0,833±0,694 3,889±0,009 -1,751* -2,054
Negro 4 1,955±0,622 32,533±0,052 -1,025 -1,047
Miranda 6 3,000±0,844 4,311±0,012 -0,861 -1,656
Paraguai-Mirim 7 2,778±0,911 3,333±0,012 -0,253 -0,270
Paraguai-
Corumbá
12 2,222±0,933 2,222±0,012 -1,320 -1,225
Paraguai-
Cárceres
6 3,718±0,987 8,308±0,024 -1,164 -0,835
Todos
2,41270±0,84045 13,225±0,02707 -1,730 -2,130
*P<0,05
O método Neighbor-joining (NJ) gerou uma árvore enraizada através do grupo
externo Colossoma macropomum, apontando uma distribuição aleatória dos
haplótipos entre as populações (Figura 13). A rede de haplótipos (Figura 14)
evidencia a complexa relação entre os haplótipos, mostrando várias conexões
possíveis e o haplótipo 04 como sendo o haplótipo de origem.
Tabela 7. Diversidade genética. Dados de diversidade haplótipica (Hd), diversidade
nucleotídica (π) e testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu.
47
Hap02
Hap11
Hap04
Hap29
Hap05
Hap34
Hap03
Hap24
Hap10
Hap16
Hap14
Hap27
Hap12
Hap08
Hap18
Hap28
Hap19
Hap23
Hap20
Hap30
Hap31
Hap01
Hap17
Hap07
Hap09
Hap26
Hap32
Hap33
Hap13
Hap15
Hap21
Hap25
Hap22
Hap06
Colossoma macropomum
0.02
Figura 13. Árvore enraizada por Neighbor-joining (NJ) mostrando a distância entre
os 34 haplótipos estimada por Tamura-Nei.
48
Figura 14. Rede de haplótipos – resultado mostra a relação entre os haplótipos encontrados pela
análise da região d-loop através do programa TCS. (◦) representa cada passo mutacional.
49
Os valores de divergência (δ) (Tabela 8) entre as amostras variaram de
1,03% a 1,57%. Os maiores valores foram encontrados entre Paraguai e as outras
sub-bacias (média de 1,41%), refletindo a alta similaridade das seqüências dentro as
populações.
O resultado do teste de Mantel (r = 0,50) revelou que não existe nenhuma
correlação entre a distância genética e a distância geográfica dos indivíduos de pacu
analisados.
50
Tabela 8. Divergência nucleotídica (δ) entre as amostras de Piaractus mesopotamicus estudadas em todas as localidades.
Cuiabá
Foz
São
Lourenço
Cuiabá
Sesc
Taquari
Coronal
Taquari
Palmeiras
Negro Miranda
Paraguai
Corumbá
Paraguai
Mirim
Paraguai
Cárceres
Cuiabá Foz -----
São Lourenço 0,01206 -----
Cuiabá Sesc 0,01653 0,01317 -----
Taquari Coronal 0,02058 0,01422 0,01724 -----
Taquari Palmeiras 0,01450 0,00711 0,01089 0,01340 -----
Negro 0,01841 0,00985 0,01053 0,01562 0,01079 -----
Miranda 0,01462 0,01235 0,01187 0,01651 0,01057 0,01066 -----
Paraguai Corumbá 0,01224 0,01097 0,01309 0,01111 0,00829 0,01189 0,01389 -----
Paraguai Mirim 0,01332 0,01251 0,01099 0,01662 0,00982 0,01069 0,01126 0,01297 -----
Paraguai Cárceres 0,02251 0,01593 0,01773 0,02090 0,01448 0,01589 0,01703 0,01613 0,01702 -----
51
Análises parciais para testar a hipótese nula de panmixia total foram
realizadas por meio do teste de AMOVA (Análise Molecular de Variância). Em todas
as análises aplicadas, independentemente da forma como se estruturou os
conjuntos, os resultados mostraram que grande parte da variabilidade genética está
concentrada dentro das populações, com menor percentagem entre elas.
As análises de AMOVA foram feitas a partir da formação de dois conjuntos
diferentes. Primeiro as sub-bacias e rio Paraguai formando um grupo único. Outro
com cinco grupos, onde cada grupo é formado por cada sub-bacia e o rio Paraguai
Ao analisar as populações como um único conjunto de dados, verifica-se que
100% da variabilidade está dentro das populações (Ф
ST
= -0,00121), indicando que
as populações não são variáveis entre si (Tabela 9). O mesmo resultado foi
observado analisando cada sub-bacia mais o rio Paraguai como cada um sendo um
grupo (99,97%) (Tabela 10).
Tabela 9. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de populações de Piaractus
mesopotamicus, considerando todas sub-bacias como um único grupo.
Fonte da variação
Componentes
da variância
Porcentagem da
variância %
Ф - estatísticas
P
Entre as populações -0,00055 -0,12 Ф
ST
= -0,00121 >0,48680
Dentro das populações 0,45411 100,12
*P<0,05
Tabela 10. Análise molecular de variância (AMOVA) para o conjunto de populações de Piaractus
mesopotamicus, considerando cada sub-bacia como um único grupo.
Fonte da variação
Componentes
da variância
Porcentagem da
variância %
Ф - estatísticas
P
Entre as sub-bacias 0,00433 0,95 Ф
st
= 0,00954 >0,20626
Entre as populações dentro
das sub-bacias
-0,00419 -0,92 Ф
sc
= 0,00031 >0,81134
Dentro das populações 0,45411 99,97 Ф
ct
= -0,00932 <0,49756
*P<0,05
Os valores de
Ф
st
pareado e o número de migrantes estão representados nas
tabelas Tabela 11 e Tabela 12, respectivamente .
52
Tabela 11. Valores de Фst, que revelam a estrutura populacional ou ausência dela, para as amostras dos rios estudados (abaixo da linha diagonal) e os
valores P (acima da linha diagonal).
Cuiabá
Foz
São
Lourenço
Cuiabá
Sesc
Taquari
Coronal
Taquari
Palmeiras
Negro Miranda
Paraguai
Corumbá
Paraguai
Mirim
Paraguai
Cárceres
Cuiabá Foz ----- 0,6259 0,7138 0,6103 0,6884 0,3076 0,5459 0,9990 0,9990 0,2919
São Lourenço -0,0106 ----- 0,4199 0,3232 0,3271 0,1787 0,2031 0,9990 0,5957 0,9990
Cuiabá Sesc -0,0212 0,0038 ----- 0,4873 0,6894 0,2109 0,9990 0,8945 0,9990 0,1123
Taquari Coronal -0,0133 0,0244 -0,0069 ----- 0,6250 0,4199 0,6826 0,3789 0,6396 0,1123
Taquari Palmeiras -0,0208 0,0103 -0,0254 -0,0108 ----- 0,2050 0,4316 0,7529 0,8369 0,1435
Negro 0,0059 0,0448 0,0326 -0,0064 0,0278 ----- 0,4052 0,1337 0,2587
0,04505*
Miranda -0,0154 0,0259 -0,0575 -0,0203 0,0003 0,0138 ----- 0,5507 0,9990 0,07617
Paraguai Corumbá -0,0268 -0,0174 -0,0265 0,00515 -0,0375 0,0493 -0,0012 ----- 0,9990 0,7568
Paraguai Mirim -0,0333 -0,0084 -0,0600 -0,0198 -0,0382 0,0196 -0,0457 -0,0386 ----- 0,4072
Paraguai Cárceres 0,0060 -0,0224 0,0206 0,0471 0,0283
0,0792*
-0,0385 -0,0125 -0,0018 -----
*P<0,05
53
Tabela 12. Valores do número de migrantes (Nm) entre os indivíduos de todos os Rios estudados.
Cuiabá
Foz
São
Lourenço
Cuiabá
Sesc
Taquari
Coronal
Taquari
Palmeiras
Negro Miranda
Paraguai
Corumbá
Paraguai
Mirim
Paraguai
Cárceres
Cuiabá Foz ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
São Lourenço ∞ ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
Cuiabá Sesc ∞ 33,07 ----- ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
Taquari Coronal ∞ 12,15 ∞ ----- ----- ----- ----- ----- ----- -----
Taquari Palmeiras ∞ 21,96 ∞ ∞ ----- ----- ----- ----- ----- -----
Negro 83,73 6,84 14,80 ∞ 17,42 ----- ----- ----- ----- -----
Miranda ∞ 12,20 ∞ 96,66 ∞ 35,50 ----- ----- ----- -----
Paraguai Corumbá ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ----- ----- -----
Paraguai Mirim ∞ 145,00 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ----- -----
Paraguai Cárceres 82,71 ∞ 23,70 10,11 17,11 5,80 12,46 ∞ ∞ -----
54
5 DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISE DO POLIMORFISMO DA REGIÃO CONTROLE (D-LOOP)
DO DNA MITOCONDRIAL
Dados revelados pela seqüência de DNA têm sido amplamente utilizados em
estudos de evolução molecular e genética populacional (AVISE, 1994). O
seqüenciamento da região do d-loop de Piaractus mesopotamicus permitiu inferir
sobre o polimorfismo do DNAmt da espécie, ao mostrar uma alta variabilidade da
região, indicando que esta é informativa para o estudo populacional da espécie
citada.
Os resultados sugerem que as populações de pacu analisadas apresentam-
se em panmixia. De acordo com Avise et al. (1988), uma população é panmítica
quando o nível de diversidade genética é proporcional ao tamanho efetivo da
população e à taxa de mutação, assumindo uma constância dos dois ao longo do
tempo.
O polimorfismo total do DNAmt está relacionado ao tamanho efetivo das
populações de fêmeas ao longo do tempo evolutivo (AVISE et al., 1988). No
presente estudo, foram utilizados marcadores mitocondriais, o que reflete a estrutura
populacional das fêmeas. Isto poderia ser considerado um viés neste estudo. No
entanto, não há relatos na literatura de migração diferencial entre machos e fêmeas
(SILVA, 2006).
5.1.1 Variabilidade genética nas populações selvagens de pacu
A variabilidade genética entre diferentes populações e também entre os
indivíduos de uma mesma população é essencial para adaptação às mudanças
55
ambientais. A maior parte das populações naturais é caracterizada por elevados
níveis de variação genética (SOLÉ-CAVA, 2001).
A diversidade haplotípica é um índice que reflete a probabilidade de dois
haplótipos escolhidos ao acaso em uma população serem diferentes, enquanto que
a diversidade nucleotídica reflete a probabilidade de dois nucleotídeos homólogos
escolhidos ao acaso serem diferentes em uma população (NEI & LI, 1979).
A análise das amostras de pacu evidenciou a ocorrência de 34 haplótipos do
d-loop. Entre estes, 11 são compartilhados entre as populações das sub-bacias e 23
são restritos ou exclusivos. Uma hipótese para a ocorrência de haplótipos exclusivos
é a de que nas populações em que não foram encontrados, esses haplótipos
possivelmente sejam raros e ocorram em uma freqüência baixa. Desta forma é
possível que o número amostral pode não ter sido suficientemente grande para
encontrar haplótipos raros nas populações. É possível que com a pesca intensa que
o pacu vem sofrendo nesses últimos anos, esses haplótipos tenham se tornado
ainda mais raros considerando-se ainda que talvez seja uma influência de onde as
amostras foram coletadas.
Os valores de diversidade nucleotídica (π) estimados para as amostras
analisadas são altos e estão dentro do esperado para populações da mesma
espécie, exceto para as amostras do Rio Taquari (0,9%) as quais revelaram uma
baixa diversidade nucleotídica. Este fato pode ser correlacionado ao declínio das
populações de peixes no Rio Taquari devido ao assoreamento causado pela erosão
e deposição de sedimentos no rio, tornando este o maior problema ambiental do
Pantanal (GALDINO et al., 2006).
Os valores de diversidade de seqüência do DNAmt entre peixes pertencentes
a mesma espécie variam de menos de 0,1% em Morone saxatilis (WIRGIN et al.,
1989) até 10% em Leporinus microlophus (BERMINGHAM & AVISE, 1986). O valor
máximo de diversidade detectado em espécies de água doce (10%) é maior do que
os encontrados em espécies anádromas (5%), catádromas (2%) e marinhas (4,4%)
(BILLINGTON & HEBERT, 1991). Resultados a partir do DNAmt de salmão da
região setentrional do Japão mostraram baixa diversidade nucleotídica, variando de
0,07% a 0,35% (KITANISHI et al., 2007). Nos peixes de água doce neotropicais,
Colossoma macropomum, a diversidade nucleotídica varia de 1,1% a 1,2%
(SANTOS et al., 2007), e varia de 0,12% a 0,3% para Macrodon ancylodon na costa
brasileira (SANTOS et al., 2006).
56
Altos níveis de diversidade genética parecem ser comumente observados em
peixes migratórios com grandes populações panmitícas. Isto porque o grande
tamanho efetivo da população e o alto padrão de migração minimizam o efeito de
deriva gênica (SANTOS et al., 2007). Como parece acontecer com as populações de
pacu estudadas.
5.1.2 Neutralidade
Os haplótipos encontrados nas populações analisadas são seletivamente
equivalentes e sugerem que as populações se encontram em equilíbrio em relação a
esses haplótipos do DNAmt, segundo mostram os resultados estatísticos não
significantes (P>0,05) de D de Tajima e Fs de Fu.
Os testes de Tajima e Fu revelaram um valor significativo (P<0,05) para
amostras do Taquari e do Cuiabá quando analisadas separadamente. Um valor
significante pode aparecer devido a efeito seletivo, expansão populacional, efeito
gargalo, ou heterogeneidade das taxas de mutação (SANTOS et al., 2006).
Entretanto, valores não significativos, mas negativos, podem ser um indício de uma
rápida expansão demográfica (HARTL & CLARK, 1997). Em Santos et al. (2006)
resultado similar, valores significativos, foi encontrado para apenas duas populações
dentre as doze estudadas.
Ambos os testes Tajima e Fu foram desenvolvidos para testar neutralidade
seletiva; contudo, interpretações demográficas também são válidas em situações
onde neutralidade seletiva não podem ser descartadas, como na região controle do
DNAmt (HARTL & CLARK, 1997). O teste Fs de Fu foi concebido especificamente
para detectar a expansão da população, sendo este mais sensível à presença de
haplótipos restritos, como no presente caso (Tabela 7: Fs= -10,93).
57
5.2 DIVERSIDADE GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE Piaractus
mesopotamicus
Os resultados da AMOVA (Ф
ST
= -0,00121) para todas as populações
evidenciam ausência de estruturação entre as populações. Valores de Ф
ST
entre
0,05 e 0,15 são indicativos de moderada diferenciação genética entre populações.
Valores de Ф
ST
menores que 0,05, são indicativos de baixa estruturação genética
(WRIGHT, 1978). Valores negativos, não significativos e abaixo de 0,05 sugerem
ausência de estruturação populacional.
De acordo com Wright (1978), podemos observar três tipos de estruturação
de populações: a) isolamento por distância, em que a distância geográfica é um fator
determinante para não haver panmixia; b) modelo de ilhas, no qual a distância não é
a causa da diferenciação, os recrutas são oriundos de uma única população com
tamanho finito; c) modelo passo a passo (stepping stones) no qual cada
subpopulação faz troca gênica somente com as populações vizinhas.
Dados recentes de Suganuma et al. (2008) mostraram, através de
marcadores microssatélites, a ausência de estruturação entre populações selvagens
de pacu coletadas na sub-bacia do Cuiabá.
Neste trabalho apenas os valores de Ф
ST
pareado do Rio Negro com o rio
Paraguai revelaram uma estruturação moderada.
São muitos os relatos de estruturação ou diferenciação populacional dentro
de um único sistema hidrográfico relacionadas com fatores ambientais, biológicos,
ou antropogênicos (HASSANIEN et al., 2004). Uma hipótese para essa baixa
estruturação encontrada entre Negro e Paraguai pode estar associada às coletas
terem sido realizadas em períodos reprodutivos distintos já que o comportamento
reprodutivo constitui um fator decisivo para a subdivisão populacional da espécie.
Sanches & Galetti (2007) mostraram através de marcadores RAPD, uma alta
estruturação, na sub-bacia do Miranda, em populações de Brycon hilarii, coletadas
em épocas não-reprodutivas, porém os fatores que levaram a essa diferenciação
genética são ainda desconhecidos, já que estes peixes apresentam uma enorme
mobilidade migratória.
58
A ausência de estruturação encontrada nas populações de pacu pode ser
explicada pela topografia do Pantanal, bem como sua hidrografia atípica e pelo fato
do pacu ser uma espécie de grande amplitude migratória, chegando a percorrer
anualmente centenas de quilômetros, apresentando uma ampla distribuição no Alto
Paraguai (RESENDE, 1992).
O pantanal está situado em um cinto circunglobal de instabilidade climática,
onde as drásticas mudanças climáticas durante o quartanário levaram a diferentes
modelos de descarga do Rio Paraguai e seus tributários e a diferentes padrões de
erosão e sedimentação dentro do Pantanal (JUNK & DE CUNHAB, 2005). Um
mosaico de formações geomorfológicas é o resultado de eventos climáticos
passados e atuais. O pantanal é, na verdade, um mosaico de ecossistemas
diferentes, que tiveram gêneses distintas, fato que caracteriza a região como vários
“pantanais” (AB’SABER, 1988). As características climáticas da região do Pantanal,
especialmente as cheias anuais, podem contribuir para a homogeneidade genética
das populações de pacu. Durante o período de cheia, os rios extravasam seus leitos
e as áreas inundadas formam uma rede de lagoas, baías e baixadas interligadas por
cursos d’ água perenes (corixos) ou efêmeros (vazantes) (POR et al., 1997).
Desse modo há uma intensa mistura de animais provenientes de diferentes
rios. Além disso, é durante a época de enchentes que acontece a migração
reprodutiva, levando em consideração que por mais que os peixes adultos não se
encontrem, as larvas e os alevinos levados pelas correntezas podem ter um fluxo
gênico com os demais provindos de outros rios. Portanto, a grande mobilidade da
espécie talvez constitua a razão principal da ausência de estruturação genética entre
as populações de diferentes sub-bacias.
A mobilidade constitui um fator importante da estrutura genético-populacional,
já que espécies que apresentam grande mobilidade, como peixes migradores e
aves, exibem níveis de estruturação populacional menos complexos (WARD et al.,
1992), ou seja, não apresentam inúmeras sub-populações ou bancos genéticos,
como os encontrados em organismos sedentários, como é o caso de alguns anfíbios
e também de alguns peixes não migradores (AVISE, 1994).
Segundo Avise (1994), outros fatores, além da mobilidade, que podem
influenciar o grau de fluxo gênico e a estrutura populacional de uma espécie são: a
presença de barreiras física ou ecológicas; características comportamentais (como
filopatria); história de vida do organismo; padrões de dispersão e fluxo gênico
59
ligados ao sexo (no caso de marcadores genéticos com transmissão uniparental);
influência diferencial da seleção natural em locos nucleares e mitocondriais; eventos
demográficos que rompem o equilíbrio entre fluxo gênico e deriva genética; e a
distância geográfica entre as sub-populações.
Padrões como o observado neste estudo como a ausência de estruturação e
alto fluxo gênico entre as populações de diferentes rios são comuns em grandes
migradores neotropicais que habitam locais sem barreiras geográficas. Em Santos et
al. (2007) resultados similares foram observados em Colossoma macropomum na
Bacia Amazônica, localizada em uma região topograficamente semelhante ao
Pantanal.
Ao contrário da idéia de que espécies migratórias de água doce formam
grandes populações panmíticas, vários estudos indicam a existência de estruturação
populacional, diferentemente do encontrado para o pacu. Em Prochilodus argenteus
(citada como P. marggravii), análise de RAPD foi capaz de revelar diferenciação
genética entre três localidades no Rio São Francisco, (HATANAKA & GALETTI,
2003). Estudos populacionais de Brycon opalinus da bacia do Rio Paraíba do Sul
através do DNAmt por Hilsdorf et al. (2002) indicaram uma estrutura atribuída ao
reduzido fluxo gênico entre as populações estudadas. Mais tarde, este resultado foi
confirmado por Barroso et al. (2005) com marcadores microssatélites.
Na espécie marinha Macrodon ancylodon ocorre uma separação genética
entre duas populações, subtropical e tropical, evidenciada pela falta de fluxo gênico
em nível do DNAmt. Porém, ambas populações não se diferenciam
morfologicamente uma da outra. Em conclusão Santos et al. (2006) sugerem que as
populações subtropical e tropical são diferentes espécies sob o conceito filogenético.
Embora tenham sido relatados trabalhos com resultados de estruturação
populacional, estes foram descritos em outras bacias hidrográficas, mostrando como
a topografia da bacia do Alto Paraguai influencia na dinâmica das populações do
pacu.
Diferentemente do encontrado para o pacu, Benites (2008) em sua tese de
doutorado encontrou uma estruturação genética entre 11 populações selvagens do
pintado (Pseudoplatystoma corruscans) na Bacia Paraná-Paraguai. Em seu estudo é
relatado que apesar da espécie ter grande mobilidade migratória, a estruturação
genética foi evidenciada através de marcadores microssatélites e pode estar
60
associada aos pulsos de inundações observados na região, à uma capacidade
máxima de migração e à períodos migratórios distintos nas populações.
Comparando os resultados obtidos neste estudo com os resutados de Benites
(2008), é relevante que topografia da região em conjunto com a biologia da espécie
são determinantes para haver, ou não, estruturação nas populações. Neste estudo a
topografia pantaneira, com suas cheias, e a mobilidade migratória do pacu permitem
que as populações da Bacia do Alto Paraguai não apresentem estruturação
genética. Já em Benites (2008), a mesma topografia e capacidade migratória são
responsáveis pela estruturação genética das populações do pintado.
5.2.1 Fluxo gênico
Um dos problemas na análise da estrutura populacional é a estimativa da
quantidade de fluxo gênico, que é o determinante mais importante da estrutura
populacional. Se o fluxo gênico entre as populações vizinhas é baixo, cada
população evolui de forma quase independente. Assim, uma alta diferenciação entre
as populações é esperada quando há um fluxo gênico baixo (Nm < 1), enquanto que
um fluxo gênico alto (Nm > 1) é suficiente para impedir uma diferenciação
substancial devido à deriva e seleção natural (SOFIA et al., 2006).
Segundo Kimura & Maruyama (1971) quando a estimativa de Nm assumir
valores maiores que quatro, as populações panmíticas podem ser consideradas
como uma única unidade populacional; quando Nm for menor que um, as
populações podem ser consideradas diferenciadas.
Além disso, acredita-se que as estimativas de fluxo gênico, que geralmente
são baseados em modelos que supõem que as populações estão em equilíbrio,
grosseiramente superestimam o verdadeiro número de migrantes nas condições
reais (WIDMER & SCHMID-HEMPEL, 1999).
O alto valor de migrantes (N
f
m = 26,55) e o baixo valor de Ф
ST
(-0,00121)
encontrados neste estudo indicam que há uma intensa troca gênica ocorrendo entre
os indivíduos das quatro sub-bacias mais/e o rio Paraguai, e essa troca é suficiente
para evitar a diferenciação genética. Conseqüentemente, a ausência de
61
diferenciação genética e a existência de alto fluxo gênico suportam a hipótese de
existir uma única e grande população panmítica ocupando grande parte da bacia do
Alto Paraguai, como também sugerido por Calcagnotto (1998) ao analisar
populações selvagens e cultivadas de pacu e tambaqui.
Resultado equivalente foi encontrado por Hrbek et al. (2007) através da
análise de 14 locos microssatélites e fragmentos de 2.347 pb do DNAmt de 126
indivíduos de pirarucu (Arapaima gigas), que sugerem que a espécie forma uma
grande população panmítica com grande fluxo gênico entre as sete localidades
amostradas na bacia Amazônica. Ocyurus chrysurus, uma espécie marinha, também
se comporta como uma única unidade populacional, com um gradiente latitudinal de
sua morfologia ao longo da costa brasileira, revelada por marcadores do DNAmt e
aloenzimas (VASCONCELLOS et al., 2008).
O alto fluxo gênico aqui relatado para o pacu provavelmente é resultado de
sua adaptação à vida nas áreas alagadas do Pantanal, do mesmo modo que a
migração e o transporte passivo de ovos e larvas também contribuem para a
transferência genética e com a ausência de estruturação entre as populações aqui
estudadas.
Com base nos resultados obtidos através de análises de seqüências do
DNAmt propõem-se a inclusão das populações de pacu aqui estudadas na categoria
filogeográfica IV, proposta por Avise (1989), as quais apresentam intenso fluxo
gênico e não sofreram separação por barreiras geográficas históricas ou atuais.
5.2.2 Migração
A maioria dos peixes de importância econômica do Alto Paraguai são
migradores. A maior parte destas espécies são Characiformes, os primeiros
iniciarem a migração rio acima e entre estes se encontra o pacu. A rota migratória do
pacu é ainda pouco conhecida, com algumas hipóteses baseadas em dados da
pesca e estudos biológicos de adultos e de larvas. (RESENDE, 2003).
Espécies migratórias são provavelmente o grupo mais vulnerável de todos, e
somando-se ao fato destas espécies serem fonte de renda e alimento para a
62
população local a situação delas torna-se preocupante. Entre os problemas
encontrados pelas espécies migratórias do Alto Paraguai incluem-se a poluição
industrial e agrícola, o desmatamento, a introdução de espécies exóticas e
principalmente a pesca predatória (RESENDE, 2003).
Um grande percentual das espécies de peixes pantaneiros é considerado
como sendo de piracema. Após um período de seca, os peixes migram para os
corpos de água maiores; iniciam assim vários deslocamentos, primeiro das áreas
alagadas para os rios e depois rio acima (AGOSTINHO et al., 2003). Bittencourt &
Cox-fernandes (1990) afirmaram que a migração é uma adaptação dos peixes às
condições adversas decorrentes do pulso de inundação da água, aproveitando a
abundante fonte de alimentos disponível sazonalmente em diferentes locais. Os
peixes migradores usam diferentes habitats para alimentação, abrigo e para
reprodução. No Alto Paraguai, os habitats usados para alimentação são as áreas
alagadas, canais temporários, lagoas marginais, ao longo do rio Paraguai, o canal
principal do rio é usado para migração e as cabeceiras para reprodução (RESENDE,
2003).
As estratégias migratórias variam entre as espécies e as bacias. Considera-se
um padrão de migração de reprodução uma desova a montante, seguido por uma
dispersão de ovos a jusante, finalizando com as larvas e adultos exaustos em áreas
de várzea. A passagem a jusante de larvas e juvenis é o padrão migratório mais
comum na América do Sul (AGOSTINHO et al., 2003).
Durante a piracema, o apelo para conservação da espécie é tão intenso que
os peixes se descuidam de suas estratégias de proteção, tornando-se presa fácil. A
viagem de centenas de quilômetros os deixa extenuados, e muitos pescadores
aproveitam-se dessa fragilidade para capturá-los facilmente e em grandes
quantidades. Agindo desse modo, interferem em todo o processo de perpetuação da
espécie e renovação dos estoques, que será sentido na diminuição do tamanho dos
peixes e na quantidade disponível para a pesca nos anos subseqüentes, por essa
razão sendo importante proteger os peixes na época da piracema. O defeso da
Piracema é determinado pela Lei n° 7.679, de 23 de novembro de 1988, e
estabelecido anualmente pelo IBAMA, com a colaboração de órgãos, instituições e
associações envolvidas com a pesca em cada bacia hidrográfica (RESENDE, 2005).
63
5.3 METAPOPULAÇÃO
Baseados nas análises das seqüências do DNA mitocondrial, o resultado
sugere que a espécie migradora, Piaractus mesopotamicus, não forma populações
geneticamente estruturadas, apresentando-se como uma metapopulação.
Uma metapopulação pode ser conceituada como “uma população de
populações” – um grupo de várias populações locais cuja viabilidade é mantida pela
migração de indivíduos através de corredores que conectam fragmentos (HANSKI,
1999). A teoria de metapopulação analisa a dinâmica dos grupos de populações
semi-independentes ligadas por dispersão (HANSKI & GILPIN, 1991). O termo
metapopulação, ou “população da população”, foi proposto por Levins (1970), em
seu modelo, uma metapopulação é uma rede de subpopulações propensas a
extinção ocupando um mosaico de habitats.
Apesar de explorada comercialmente a espécie P. mesopotamicus ainda
evidencia altos níveis de variabilidade genética. Os resultados são encorajadores
para a elaboração de planos de manejo sustentável, de conservação dos estoques e
para atuar como fonte de reserva para a aqüicultura popular dessas espécies.
Políticas de manejo e conservação necessitam não somente proteger a espécie,
mas também considerar as necessidades socioeconômicas locais.
A baixa diferenciação genética entre as populações avaliadas e conseqüente
alta conectividade genética entre as populações é um importante dado para a
implantação de programas de monitoramento e conservação da espécie no Pantanal
Mato grossense. Os resultados obtidos têm implicações claras para gestão e
conservação com base no modelo de “source-sink metapopulation”, como sugerido
por Hrbek et al.(2007) para populações de Arapaima gigas em reservas de várzea
da Bacia Amazônica. O modelo de manejo “source-sink” implica em uma única
população genética em que populações locais afetadas por redução populacional
com conseqüente efeito de deriva e perda de variabilidade podem ser reconstituídas
por imigrantes das reservas de conservação implantada.
64
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Para a região d-loop do DNA mitocondrial, foi verificado que a maior parte da
variabilidade é encontrada dentro das populações, sugerindo a ausência de
estruturação entre os as sub-bacias e o rio Paraguai.
As populações de pacu aqui estudadas pertencentes a quatro sub-bacias:
Cuiabá, Taquari, Negro e Miranda e o rio Paraguai constituem uma única
população panmítica.
A ausência de estruturação genética entre as populações pode ser explicada
pelo intenso fluxo gênico decorrente da grande amplitude migratória da
espécie, exceto para Rio Negro e Paraguai, onde foi evidenciada uma baixa
estruturação entre estes rios, fato este que pode estar associado a coletas
feitas em períodos reprodutivos distintos.
Todos os índices de Ф
ST
apresentados são baixos e não mostram
significância entre os valores par a par; as populações de pacu não se
diferenciam, suportando a hipótese de não estruturação populacional e de
panmixia. O alto número de migrantes evidencia um grande fluxo gênico entre
as populações de pacu estudadas.
Do ponto de vista econômico, Piaractus mesopotamicus é a espécie mais
importante da região pantaneira. A avaliação da estrutura genética de
espécies de interesse comercial é uma importante condição para qualquer
planejamento de controle da pesca. Este estudo focaliza este papel
corroborando com outros estudos já realizados com o pacu.
No presente estudo, foram utilizados apenas marcadores mitocondriais, o que
reflete a estrutura populacional das fêmeas. Marcadores nucleares podem ser
usados para elucidar se a estrutura populacional observada através do d-loop
65
reflete ou não uma estrutura relacionada ao sexo, embora não haja relatos na
literatura de migração diferencial entre machos e fêmeas para a espécie.
A amostragem estudada permitiu esclarecer a variabilidade genética da
espécie Piaractus mesopotamicus na bacia do Alto Paraguai, porém um
aumento no tamanho amostral incluindo outros pontos de coleta e uma
ampliação dos estudos com marcadores nucleares, por exemplo
microssatélites, poderá vir a confirmar os resultados obtidos neste trabalho e
subsidiar estratégias para a conservação da espécie.
Através do resultado obtido pode-se considerar que as populações de pacu
aqui estudadas formam uma metapopulação. Este resultado contribui para a
gestão e conservação desta espécie.
Os resultados aqui apresentados podem ser a base para futuros trabalhos de
monitoramento visando acompanhar a variabilidade genética dentro de cada
uma das populações, inclusive daquelas a serem protegidas pela implantação
de parques. Também estudos mais detalhados poderão ser feitos para se
verificar o nível de homogeneização genética encontrada neste trabalho.
66
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