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PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA EM CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO:
ALTERAÇÕES EM MÓDULOS FUNCIONAIS
ASSOCIADAS À BIOLOGIA E AO COMPORTAMENTO
DOS TUMORES
ANNA ESTELA LUIZA COLÓ
Tese de Doutorado apresentada à Fundação
Antônio Prudente para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Área de Concentração: Oncologia
Orientador: Dr. Alex Fiorini de Carvalho
Co-Orientador: Dr. Luiz Fernando Lima Reis
São Paulo
2009
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente
Coló, Anna Estela Luiza
Perfil de expressão gênica em carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço: alterações em módulos funcionais associadas à
biologia e ao comportamento dos tumores / Anna Estela Luiza Coló –
São Paulo, 2009.
107p.
Tese (doutorado) Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração:
Oncologia.
Orientador: Alex Fiorini de Carvalho
Descritores: 1. EXPRESSÃO GÊNICA. 2. CARCINOMA
EPIDERMOIDE. 3. CÂNCER DE CABEÇA E PESCOÇO. 4. BIOLOGIA
MOLECULAR. 5. NEOPLASIAS/genética.
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Do not follow where the path may lead.
Go instead where there is no path and leave a trail.
Muriel Strode
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer pela ajuda na realização desse trabalho (em ordem
cronológica):
Aos meus orientadores Alex e Luiz Fernando, pelos ensinamentos,
confiança e amizade desde minha iniciação científica.
Ao Instituto Ludwig, Hospital AC Camargo e Fundação Antônio
Prudente, pela oportunidade.
À FAPESP e CAPES, pelas bolsas de mestrado e doutorado,
respectivamente.
Aos pacientes, por autorizar a utilização das amostras.
Ao Dr André Carvalho e Luiz Paulo Kowalski, pelos ensinamentos e
ajuda com prontuários.
Ao SAME, pelos prontuários.
Ao Dr Hugo, André Abreu, Louise Mota, Ellen Bastos e Waleska
Martins pelas amostras do Banco de Tumores e de RNA.
Ao Severino e Miyuki, pelas lâminas histológicas.
À Leia e Isabel, do Instituto Ludwig, Chamberlein e Anderson, do
Hospital AC Camargo pela esterilização de materiais e água.
À Bianca, Mariana Martins e Chamberlein, pela ajuda na extração de
RNA.
À Regina Nomizo e Evânia, pelo acompanhamento na cultura de
células.
À Bianca e Ana Helena, pelo trabalho em equipe para obtenção do
RNA referência.
À Sarah, pelo auxílio na amplificação de RNA.
À Bianca e Chamberlein, pela ajuda na quantificação das imagens de
microarray.
À Dra Helena Brentani, Artur Fabri, César Torres, Diogo Patrão, Fábio
Mathias e Luiz Paulo Camargo, do Laboratório de Biotecnologia, pelo auxílio
com banco de dados clínicos e com as pré-análises de microarray.
Ao Dr Eduardo Jordão Neves, Dra Ana Carolina Simões e Lucas
Fahham, do IME-USP, pela análise matemática e estatística dos dados de
microarray.
À Mariana Maschietto, pelas dicas na análise de vias.
À Aline Pacífico, Ana Paula Lepique, Enrique Boccardo, Lara Termini,
Patrícia Possik e Vladmir Lima, por toda ajuda e ensinamentos.
À Elisa Napolitano, Mariana Morato, Juliana Monte Real, Nair Muto e
Ricardo Moura, pelos ensinamentos sobre PCR quantitativa.
À Camila Melo, minha companheira de PCR quantitativa.
À Pós-graduação e Biblioteca, pela presteza com documentos e
artigos.
Aos departamentos de TI do Instituto Ludwig e do Hospital AC
Camargo, pela resolução de problemas com computador.
À Suely Francisco, pela revisão da tese.
Gostaria também de agradecer:
Aos colegas do LABRI e agregados de todos os tempos Adriana
Abalen, Aline Pacífico, Ana Helena, Anderson Souza, Bárbara Melo, Beatriz
Stolf, Bianca Barreto, Chamberlein Neto, Eduardo Abrantes, Graziela
Spilborghs, Juliana Monte Real, Lara Termini, Letícia Lerner, Luciana
Gomes, Mariana Martins, Mariana Morato, Marina Baeta, Nair Muto, Patrícia
Possik, Regina Nomizo, Sarah Marques, Sibele Meireles, Suzana Diniz,
Tatiana Munhoz, Vladmir Lima, Waleska Martins, pela amizade, companhia,
festas, jogos, almoços e risadas.
À Ana Paula Hidalgo, companhia insubstituível de corridas e para
todos os momentos.
À Alexandra Dumont, Ana Cintra, Andréa Sendoda, Elisa Napolitano,
Felícia Cavalher, Maíra Rossi, Mariana Hortelani e Mariana Morato, por toda
amizade e união durante tantos anos.
Ao Celso, pelo amor que não tenho palavras para descrever.
Aos meus pais, Ahuwa e Caetano, minha avó, Ester, meus irmãos
Laura, Gabriela e Juliano, e Yumi, por todo amor e apoio durante toda minha
vida.
RESUMO
Colo AEL. Perfil de expressão gênica em carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço: alterações em módulos funcionais associadas à
biologia e ao comportamento dos tumores. São Paulo; 2009. [Tese de
Doutorado-Fundação Antônio Prudente].
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço se origina do epitélio
estratificado escamoso através do acúmulo de alterações genéticas, devido
principalmente ao consumo de álcool e tabaco. Em cabeça e pescoço, o
carcinoma epidermóide acomete a cavidade nasal e seios paranasais,
cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe. Apesar dos esforços para o
aprimoramento dos métodos de diagnóstico e tratamento, o carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço ainda é uma doença que apresenta
alguns obstáculos no seu manejo, já que indivíduos com tumores clinica e
patologicamente semelhantes, que recebem o mesmo tratamento,
apresentam respostas bastante heterogêneas. Como se originam do mesmo
tecido, o estudo de alterações moleculares do carcinoma epidermóide nas
diferentes topografias de cabeça e pescoço permite uma melhor
compreensão da biologia da doença, possibilitando uma nova forma de
classificação desses tumores. Além disso, a análise de alterações de
expressão gênica relacionadas ao comportamento do tumor permite
identificar alterações relacionadas à progressão tumoral. Ao comparar a
expressão gênica de carcinoma epidermóide de diferentes topografias de
cabeça e pescoço, observa-se que, para os genes representados na
plataforma utilizada, a topografia não é o fator que mais influencia o perfil de
expressão gênica global ou de genes individualmente. Incluindo amostras de
CE de esôfago, pulmão e colo de útero na análise de expressão gênica
global, os dados sugerem a existência de duas classes “moleculares” de
amostras de CECP, que apresentam expressão diferencial de genes e
alteração em módulos funcionais relacionados à agressividade e progressão
tumoral, e não à topografia. Em relação ao comportamento do carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço, as amostras de CECP N0 apresentaram
inativação de módulos com os genes AKT1, AREG, CCL20, EGFR, IL1B,
INHBA e SPHK1, que pode não proporcionar a sobrevivência das células
tumorais nos linfonodos. Em relação ao tumores “avançados” (T3-4N+), os
tumores “iniciais” (T1-2 N0) apresentaram inativação de módulo que contém
MMP9, cujo bloqueio impede a progressão tumoral in vivo (KATORI et al.
2002; YAMASHITA et al. 2003). Os casos de CECP N+, tratados com
radioterapia e que apresentaram recidivas mostraram ativação de módulos
com EGLN3, um possível marcador de resistência a radioterapia, e POSTN,
relacionado à transição epitelial-mesenquimal e metástases. O conjunto de
vias e módulos funcionais alterados nas diversas comparações indicam que
os tumores de perfil agressivo apresentam mudanças na expressão de
genes relacionados à comunicação entre microambiente, MEC e a célula
tumoral. Isso pode estimular vias de sinalização que promovem a
progressão tumoral através da inibição de apoptose, estímulo de
sobrevivência e proliferação celular, angiogênese, invasão e mobilidade de
células tumorais.
SUMMARY
Coló AEL. [Gene expression profile in head and neck squamous cell
carcinoma: alterations in functional modules associated to tumor
biology and behavior]. São Paulo; 2009. [Tese de Doutorado-Fundação
Antônio Prudente].
Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) arise from the
squamous epithelium cells as result of multiple genetic alterations, mainly
due to alcohol e tobacco consumption. HNSCC affects the nasal cavity and
paranasal sinus, oral cavity, oropharynx, hipopharynx and larynx. Despite
efforts for the improvement in diagnosis and treatment, the management of
head and neck cancer is still difficult, since similar patients, affected by
tumors with similar clinicopathological parameters and undergoing the same
treatment, show significant heterogeneity in their outcome. Since these tumor
share same histological origin, gene expression analysis of tumor from
different subsites provides a better understanding of the biologic features of
the disease, leading to new approaches for the classification of HNSCC. In
addition, analysis of gene expression alterations related to tumor behavior
may allow the identification of changes associated with tumor progression.
Considering the set of genes represented in the platform, analysis of HNSCC
from different subsites shows that either global gene expression or single
gene expression is not strongly influenced by tumor site. When global gene
expression of squamous cell carcinoma of the head and neck, esophagus,
lung and cervix was assessed, two molecular types of HNSCC samples were
highlighted, which are classificated according to the differential expression of
genes and activation of modules associated with aggressiveness and tumor
progression, and not associated with tumor subsite. Regarding HNSCC
behavior, alterations in pathways and functional modules indicate that
negative lymph node HNSCC samples (N0) present inactivation of modules
with AKT1, AREG, CCL20, EGFR, IL1B, INHBA, and SPHK1. This alteration
may not allow the survival of tumor cells within lymph nodes. Comparing
“advanced” (T3-4N+) and “early” (T1-2 N0), the last ones show inactivation of
MMP9. According to the literature, its blockade inhibits in vivo tumor
progression (KATORI et al. 2002; YAMASHITA et al. 2003). Samples from
N+ patients, treated with adjuvant radiotherapy and presenting recurrent or
metastatic disease show activation of modules containing EGLN3, a putative
marker of radiotherapy resistance, and POSTN, related to the epithelial-
mesenquimal transition and to the development of metastasis. The set of
altered functional modules indicates that tumors with aggressive profile
present changes in the expression of genes implicated in communication
between the microenvironment, the extracellular matrix and tumor cells. This
may led to the activation of pathways which promote tumor progression
through apoptosis inhibition, cell survival, proliferation, angiogenesis,
invasion and tumor cell motility.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de instabilidade genética e progressão do CECP a
partir do epitélio escamoso normal........................................... 2
Figura 2 Eletroforese em gel de agarose de RNA total e amplificado
de amostras de carcinoma epidermóide e linhagens
celulares do RNA referência..................................................... 23
Figura 3 Imagem digitalizada obtida após o experimento de
microarray e quantificação dos dados...................................... 25
Figura 4 Normalização dos dados de microarray................................... 27
Figura 5 Curvas para análise de resultados de amplificação das
reações de PCR quantitativa.................................................... 32
Figura 6 Produto de PCR quantitativa fracionado em gel de acrilamida
8% obtido em reações com 400, 200 e 100 η M dos
iniciadores dos genes INHBA e MCM2.................................... 33
Figura 7 Curva padrão de reações de PCR quantitativa........................ 34
Figura 8 Frequência de comprometimento linfonodal nos casos de
Carcinoma Epidermóide de CNSP, cavidade oral, orofaringe,
hipofaringe e laringe.................................................................
39
Figura 9 Distribuição da razão do sinal de Alexa 647/Alexa 555 para
cada um dos 48 quadrantes de uma lâmina de microarray.....
40
Figura 10 Correlação entre os dados de duplicatas de lâminas de
microarray.................................................................................
41
Figura 11 Expressão gênica global e dados clínico e anátomo-
patológicos de amostras de carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço..................................................................... 44
Figura 12 Agrupamento hierárquico não supervisionado construído
com os 67 genes do perfil de expressão “intrínseco” descrito
por CHUNG et al (2004)...........................................................
45
Figura 13 Expressão gênica global de carcinoma epidermóide e dados
clínicos e anátomo-patológicos dos casos de CECP..............
50
Figura 14 Agrupamento hierárquico não supervisionado construído
com os 119 genes da assinatura de comprometimento
linfonodal de ROEPMAN et al (2005, 2006)............................. 55
Figura 15 Agrupamento hierárquico não supervisionado construído
com os 156 genes da assinatura de metástases de
RICKMAN et al (2008).............................................................. 59
Figura 16
Expressão gênica de amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço com ou sem recidivas
avaliada por PCR quantitativa..............................................
63
Figura 17
Expressão gênica de amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço com ou sem
comprometimento linfonodal avaliada por PCR quantitativa
64
Figura 18 Genes pertencentes a vias e módulos alterados em
Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço e suas
interações no contexto celular.................................................. 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Amostras de carcinoma epidermóide utilizadas no estudo......... 19
Tabela 2 Linhagens celulares selecionadas para compor o RNA
referência..................................................................................... 21
Tabela 3 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados em reações de PCR
quantitativa dos genes normalizadores e genes selecionados
na análise de vias e de módulos alterados em carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço.............................................. 31
Tabela 4 Dados clínicos e anátomo-patológicos dos pacientes
portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.....
37
Tabela 5 Homogeneidade da distribuição das variáreis clínicas dentre os
casos de carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço........................................................................ 39
Tabela 6 Quantidade de genes diferencialmente expressos entre as
cinco topografias de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço....................................................................................... 45
Tabela 7 Genes diferencialmente expressos entre amostras de
carcinoma epidermóide de cavidade oral e orofaringe............... 46
Tabela 8 Vias e módulos funcionais alterados em amostras de
carcinoma epidermóide de diferentes topografias de cabeça e
pescoço....................................................................................... 46
Tabela 9 Homogeneidade da distribuição das variáreis clínicas dentre
os casos de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço
dos braços 1 e braço 2 definidos no agrupamento hierárquico
não supervisionado construído com dados de expressão
gênica de todos os genes representados na lâmina de
microarray para as amostras de CECP, de esôfago, pulmão e
colo de útero................................................................................
49
Tabela 10 Genes mais diferencialmente expressos entre o braços 1 e
braço 2 de amostras de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço definidos no agrupamento hierárquico não
supervisionado construído com dados de expressão gênica de
todos os genes representados na lâmina de microarray para
as amostras de CECP, de esôfago, pulmão e colo de útero...... 51
Tabela 11 Vias preferencialmente representadas pelos genes
diferencialmente expressos entre o braço 1 e braço 2 de
amostras de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço
definidos no agrupamento hierárquico não supervisionado
construído com dados de expressão gênica de todos os genes
representados na lâmina de microarray para as amostras de
CECP, de esôfago, pulmão e colo de útero................................ 52
Tabela 12 Vias e módulos funcionais ativos no braço 1 e inativos braço 2
de amostras de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
definidos no agrupamento hierárquico não supervisionado
construído com dados de expressão gênica de todos os genes
representados na lâmina de microarray para as amostras de
CECP, de esôfago, pulmão e colo de útero................................ 52
Tabela 13 Vias e módulos funcionais alterados em amostras de
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço de pacientes
com comprometimento linfonodal................................................
56
Tabela 14 Vias e módulos funcionais alterados em amostras de
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço pT1 ou pT2 que
não apresentam metástases linfonodais no exame anátomo-
patológico do material obtido do esvaziamento cervical.............
57
Tabela 15 Vias e módulos funcionais alterados em amostras de
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço de pacientes
com comprometimento linfonodal e recidivas após tratamento
com cirurgia, esvaziamento cervical e radioterapia adjuvante.... 60
Tabela 16 Vias e módulos funcionais alterados em amostras de
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço localizadas (sem
comprometimento linfonodal, sem tratamento por radioterapia
adjuvante e sem recidivas).......................................................... 61
Tabela 17 Resumo dos resultados obtidos com a análise de dados de
microarray e de PCR quantitativa dos genes pertencentes a
vias e módulos alterados em carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço com comprometimento linfonodal e com
recidivas......................................................................................
65
LISTA DE ABREVIATURAS
aRNA RNA amplificado
ATCC “american type cell collection”
BSA albumina sérica bovina
CDK “cyclin depedent kinase”
cDNA DNA complementar
CE carcinoma epidermóide
CECP carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
cN status linfonodal clínico
CNSP cavidade nasal e seios paranasais
CP cabeça e pescoço
Ct “cycle threshold”
DMSO Dimetilssufóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTP desoxinucleotídeo trifosfato
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
EGFR “epidermal growth factor receptor”
FDR “false discovery rate”
FW “foward”
GO “gene ontology”
HPV “human papillomavirus”
INCA Instituto Nacional do Câncer
KEGG “Kyoto encyclopedia of genes and genomes”
LB “Luria-Bertani medium”
M Molar
MAPK “mitogen activated protein kinase”
MEC matriz extracelular
mM Milimolar
MMP “matrix metalloprotease”
mRNA RNA mensageiro
N status linfonodal
N+ presença de linfonodo acometido pelo tumor
N0 ausência de linfonodo acometido pelo tumor
ORESTES “open reading frames ESTs”
PCR reação em cadeia da polimerase
PI3K “phosphoinositide-3-kinase”
pT tamanho do tumor no exame anátomo-patológico
RNA ácido ribonucléico
rNTP ribonucleotídeo trifosfato
RV “reverse”
S “slope”
SDS lauril sulfato de sódio
SSC solução-tampão de cloreto de sódio e citrato de sódio
T tamanho do tumor
TEM transição epitelial-mesenquimal
TNM tamanho do tumor, status linfonodal, metástase a
distância
µg Micrograma
µL Microlitro
ηm
Nanômetro
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO......................................................................................1
1.1 O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço..................................1
1.2 Alterações moleculares em carcinoma epidermóide de cabeça
e pescoço..............................................................................................7
1.3 Expressão gênica em carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço..9
2 JUSTIFICATIVA.................................................................................13
3 OBJETIVO..........................................................................................15
4 MATERIAL E MÉTODO.....................................................................17
4.1 Confecção das lâminas de cDNA microarray.....................................17
4.2 Coleta de amostras.............................................................................18
4.3 Extração de RNA e amplificação........................................................21
4.4 Síntese do cDNA marcado, hibridização e captura dos dados...........23
4.5 Análises dos dados.............................................................................26
4.6 PCR quantitativa.................................................................................29
5 RESULTADOS...................................................................................36
5.1 Análise dos dados clínicos e anátomo-patológicos dos pacientes de
CECP..................................................................................................36
5.2 Análise de qualidade dos dados de microarray..................................40
5.3 Aspectos moleculares do carcinoma epidermóide em diferentes
topografias..........................................................................................42
5.3.1 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço...............................................................................42
5.3.2 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço utilizando carcinoma epidermóide de esôfago,
pulmão e colo de útero.......................................................................48
1051
5.4 Aspectos moleculares do comportamento de carcinoma epidermóide
de cabeça e pescoço..........................................................................53
5.4.1 Aspectos moleculares da metástase linfonodal em carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço.....................................................53
5.4.2 Aspectos moleculares de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço em estágios iniciais e avançados.........................................56
5.4.3 Aspectos moleculares do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço com recidivas........................................................................57
5.4.4 Aspectos moleculares de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço localizado e colonizador.......................................................60
5.4.5 PCR quantitativa.................................................................................63
6 DISCUSSÃO.......................................................................................66
6.1 Análise dos dados clínicos e anátomopatológicos dos pacientes de
CECP..................................................................................................67
6.2 Análise de qualidade dos dados de microarray..................................67
6.3 Aspectos moleculares do carcinoma epidermóide em diferentes
topografias..........................................................................................68
6.3.1 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço...............................................................................68
6.3.2 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço utilizando carcinoma epidermóide de esôfago,
pulmão e colo de útero.......................................................................70
6.4 Aspectos moleculares do comportamento de carcinoma epidermóide
de cabeça e pescoço..........................................................................73
6.4.1 Aspectos moleculares da metástase linfonodal de carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço.....................................................73
6.4.2 Aspectos moleculares de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço em estágios iniciais e avançados.........................................77
6.4.3 Aspectos moleculares do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço com recidivas........................................................................78
6.4.4 Aspectos moleculares do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço localizado e colonizador.......................................................81
6.4.5 Interação entre os genes e vias alterados..........................................82
7 CONCLUSÃO.....................................................................................87
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................88
ANEXOS
Anexo 1 Expressão gênica global e dados clínicos de CECP
(Figura 11)
Anexo 2 Vias e módulos alterados em CE de diferentes topografias
de CP (versão completa da Tabela 8)
Anexo 3 Expressão gênica global de CE e dados clínicos de CECP
(Figura 13)
Anexo 4 Vias e módulos alterados no braço 1 e braço 2 (versão
completa da Tabela 12)
Anexo 5 Vias e módulos alterados em tumores localizados (versão
completa da Tabela 16)
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 O CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o quinto
tipo de câncer mais comum no mundo e representa 90% dos tumores dessa
topografia (SANKARANARAYANAN et al. 1998). Segundo estimativas do
Instituto Nacional do Câncer (INCA), devem surgir no Brasil 14.160 novos
casos de câncer de cavidade oral em 2008 (Ministério da Saúde 2007).
O carcinoma epidermóide (CE), também chamado carcinoma
espinocelular ou de células escamosas, é uma neoplasia maligna originada
da camada basal de qualquer epitélio estratificado escamoso do corpo
(KUMAR et al. 2005). O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço pode
se originar de lesões como a hiperplasia e displasia, devido ao contínuo
acúmulo de mutações e alterações genéticas (Figura 1).
2
Fonte: Modificado de HADDAD e SHIN (2008).
Figura 1 - Modelo de instabilidade genética e progressão do CECP a partir
do epitélio escamoso normal.
Em cabeça e pescoço, o carcinoma epidermóide acomete quase toda
a extensão das vias aerodigestivas superiores: cavidade nasal e seios
paranasais, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe. Em termos
anatômicos, a cavidade oral inclui a mucosa ou região jugal, o assoalho
bucal, a língua oral (dois terços anteriores do órgão), as gengivas inferior e
superior, o palato duro e área retromolar. A faringe é dividida em três
regiões: nasofaringe, orofaringe e hipofaringe. A nasofaringe é contínua à
cavidade nasal e à orofaringe. A orofaringe é constituída pela base da língua
(terço posterior da língua), valécula, loja amigdaliana, pilares e sulcos
glosso-amigdalianos, palato mole, úvula e pela parede faríngea posterior
entre a hipofaringe e a nasofaringe. A hipofaringe é delimitada pelo osso
hióide e pela cartilagem cricóide. É dividida em três regiões: área pós-
cricóide, seios piriformes e parede posterior. A laringe é anatomicamente
dividida em supraglótica, glótica e subglótica. A região supraglótica inclui a
epiglote, as falsas cordas vocais, os ventrículos, as pregas ariepiglóticas e
3
as aritenóides. A região glótica é constituída pelas pregas vocais e pelas
comissuras anterior e posterior. A região subglótica tem 2 cm de extensão e
se estende desde as cordas vocais até a traquéia (SIDRANSKY 2008).
Os principais fatores de risco envolvidos no desenvolvimento do
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço são o tabagismo e o etilismo,
mas o HPV, a dieta pobre em vitaminas A e C e a exposição a agentes
carcinogênicos ocupacionais e ambientais são outros fatores de risco para
esse tumor (GILLISON et al. 2000; KOWALSKI et al. 2005).
O tabaco é responsável por cerca de 90% dos casos de câncer de
cabeça e pescoço (WYNDER e STELLMAN 1977). O risco para CECP
associado ao tabaco é dose dependente, podendo ser de 5 a 25 vezes maior
nos indivíduos tabagistas quando comparados a indivíduos não fumantes. O
risco para o desenvolvimento de um segundo tumor primário é 4 vezes maior
em pacientes tabagistas ao diagnóstico e geralmente acomete os pulmões
(FRANCO et al. 1989).
O consumo de álcool também está associado a maior risco para o
desenvolvimento CECP (JOHNSON et al. 1996), e quando associado ao
tabaco, o efeito é sinérgico (FRANCO et al. 1989). Resumidamente, os
efeitos carcinogênicos desses dois produtos se devem ao dano oxidativo
causado por espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio derivadas da
fumaça do tabaco e do acetaldeído formado pela metabolização do álcool.
As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio levam à peroxidação de
lipídios, o que gera mais espécies reativas, propagando os danos às outras
moléculas de lipídios, proteínas e DNA. O dano oxidativo ao DNA pode
4
causar modificação de bases (transformando guanina em uma base que
pareia com timina, ao invés de citosina), formação de adutos (introduzindo
erros durante a replicação de DNA) e quebras na fita de DNA (HALLIWELL e
GUTTERDGE 2007a e b).
O HPV é detectado em CECP, sendo a incidência maior em
orofaringe, chegando a aproximadamente 50% dos casos (GILLISON et al.
2003; HERRERO et al. 2003). A variante de alto risco HPV 16 é a mais
encontrada (GILLISON et al. 2000; SCHIFFMAN et al. 2005). Assim como
para câncer cervical, o comportamento sexual de risco, infecção oral por
HPV e exposição a HPV 16 estão epidemiologicamente associados ao CE
de orofaringe (D´SOUZA et al. 2007). A população de pacientes portadores
de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço HPV-positiva parece ser
biologicamente e clinicamente diferente da população negativa. O carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço HPV-positivo é menos associado ao
álcool e tabaco e a mediana de idade ao diagnóstico é 5 anos menor
(GILLISON et al. 2000; RITCHIE et al. 2003; D´SOUZA et al. 2007).
A escolha do tratamento é baseada no estadiamento dado pelo
sistema TNM, onde T é o tamanho do tumor, N representa linfonodos
regionais acometidos ou comprometidos pela doença e M, as metástases a
distância. Em cabeça e pescoço, as modalidades de tratamento tradicionais
são a radioterapia exclusiva, a cirurgia, seguida ou não de radioterapia, e a
radio e quimioterapia concomitantes, principalmente com cisplatina. A
terapia direcionada a EGFR combinada com radioterapia têm mostrado
resultados promissores (revisado em HADDAD e SHIN 2008), entretanto,
5
nos últimos anos a cirurgia tem ganho cada vez mais importância com o
advento da cirurgia robótica transoral (transoral robotic surgery ou TORS)
(O´MAILLEY et al. 2006).
Quando a cirurgia é o tratamento escolhido, é indicado o
esvaziamento cervical em todos os casos de linfonodos palpáveis ao exame
clínico. Devido às características anatômicas de cada topografia, o
esvaziamento cervical também é realizado em lesões de cavidade oral com
espessura igual ou superior a 3 mm situadas no andar inferior: língua,
assoalho, gengiva inferior, retromolar e região jugal. O carcinoma
epidermóide de orofaringe (valécula, loja amigdaliana, base da língua e
palato mole T2 a T4) e de hipofaringe também necessitam de esvaziamento
cervical. Mesmo com a incorporação de técnicas de reconstrução imediata, a
cirurgia pode trazer deformidades, perda de voz e incapacidade de se
alimentar através da boca. O esvaziamento cervical, apesar de necessário
para o controle regional da doença, também leva a grande impacto estético
e funcional, como desconforto, dor e complicações no ombro (SHORT et al.
1984; VAN WILGEN et al. 2003).
Algumas características anátomo-patológicas do carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço podem auxiliar na determinação do
prognóstico do paciente, como tamanho do tumor (pT), extravasamento
extracapsular, padrão de invasão vascular e perineural e margem da
ressecção cirúrgica. Entretanto, a detecção de linfonodos cervicais
acometidos pelo tumor é crucial no seguimento dos pacientes de CECP, pois
sua presença está associada a maior risco para recorrência regional,
6
metástases à distância e pior sobrevida (PANTEL e BRAKENHOFF 2004). A
sobrevida para pacientes sem acometimento linfonodal detectável nos
exames anátomopatológicos pode chegar a 85%; já para pacientes com
metástases em linfonodos cervicais a sobrevida cai para menos de 54%
(SIDRANSKY 2008). No entanto, acredita-se que 20% a 50% dos casos sem
linfonodos comprometidos ao exame clínico-patológico apresentem
micrometástases e, por essa razão, desenvolvem recorrências da doença
(KHAFIF et al. 1991; JONES et al. 1993; HIRATSUKA et al. 1997). Portanto,
pacientes que apresentam metástases linfonodais são encaminhados para
radioterapia adjuvante.
Após o tratamento, recorrências locorregionais e a distância ocorrem
em 60 e 20% dos pacientes de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço, respectivamente (GENDEN et al. 2003). Assim, a recorrência
locorregional é a maior causa de morbidade e mortalidade (SMITH e
HAFFTY 1999). O sítio mais frequente para metástases a distância é o
pulmão. Aproximadamente metade das metástases são diagnosticadas após
9 meses do diagnóstico do tumor primário e 90% são detectadas até 3 anos
após o tumor primário (SIDRANSKY 2008). Devido às recorrências e à
dificuldade em tratá-las, a sobrevida em cinco anos é de 30 a 50%
(FORASTIERE et al. 2001; LE TOURNEAU et al. 2005).
Outra característica importante dos carcinoma epidermóide de cabeça
e pescoço é a alta taxa de ocorrência de segundos tumores primários.
Segundo a Sociedade Brasileira de Cirurgia de Cabeça e Pescoço a
possibilidade de desenvolvimento de segundos tumores primários
7
sincrônicos do trato aerodigestivo superior (cavidade oral, faringe, laringe,
traquéia e esôfago cervicais) é estimada em 5% a 35%. A explicação sobre
a alta taxa de ocorrência de segundos tumores primários é a presença dos
chamados campos de cancerização (SLAUGHTER et al. 1953). De acordo
com esse conceito, múltiplas lesões malignas poderiam ocorrer ao longo de
toda a mucosa das vias aerodigestivas devido à sua exposição contínua a
agentes carcinogênicos, como o tabaco.
Com a combinação de terapias, como cirurgia e radioterapia, houve
melhora no controle local da doença, porém a taxa de sobrevida em 5 anos
não mudou significativamente nos últimos 20 anos (RIES et al. 2006). Em
muitos casos, tumores com mesmo estadiamento clínico e tratamento
apresentam evolução diferente, sugerindo a necessidade identificar novos
fatores que determinem o prognóstico do paciente (HALL et al. 1998;
PARTRIDGE et al. 1999; SANCHEZ-CESPEDES et al. 2000; GROOME et
al. 2001; NUNES et al. 2001; OGI et al. 2002).
1.2 ALTERAÇÕES MOLECULARES EM CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO
A carcinogênese é um processo de múltiplos passos, envolvendo
deleção e amplificação cromossômica, perda de heterozigosidade e
alteração de expressão de genes. As alterações moleculares clássicas em
CECP são a amplificação ou expressão aumentada de ciclina D1 e EGFR,
perda de expressão de p16 e mutações em p53. Além disso, a integração do
8
genoma do HPV nas células infectadas leva a alterações importantes na
atividade de p53 e pRb (revisado em CHANG e CALIFANO 2008;
ALMADORI et al. 2008; PALKA et al. 2008).
A ciclina D1 pertence a uma família de proteínas reguladoras de
CDKs ou quinases dependentes de ciclinas. CDK4 e CDK6 formam
complexos com a ciclina D1, os quais levam à progressão do ciclo celular da
fase G1 para S (revisado em KNUDSEN et al. 2006). O complexo ciclina D1-
CDK4/6 pode ser inibido por p16, cuja perda de heterozigosidade é
freqüentemente observada em CECP (OHTA et al. 2009). p53 é uma
proteína que atua na resposta a diferentes formas de estresse celular,
através da regulação da expressão de genes de parada do ciclo celular,
apoptose, senescência e reparo de DNA. Por isso, alterações na função de
p53 estão diretamente associadas à instabilidade genômica. Mutações que
inativam p53 ocorrem frequentemente em vários tipos de tumor, inclusive em
carcinoma epidermóide (revisado em FERRIS e GRANDIS 2007).
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) é um receptor de
membrana com função tirosina-quinase que ativa as vias de MAPK, PI3K e
Jak/STAT, levando a proliferação, sobrevivência celular, invasão e
metástases. EGFR está mais expresso em carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço e de outras topografias e por isso foi alvo para
desenvolvimento de alguns medicamentos, como Cetuximab (anticorpo
monoclonal), Lapatinib, Erlotinib e Gefitinib (inibidores da porção tirosina-
quinase de EGFR) (revisado em CHANG e CALIFANO 2008). Cetuximab
demonstrou eficácia CECP em ensaios clínicos de fase III, principalmente
9
em combinação com radioterapia (BONNER et al. 2006). Entretanto a
eficácia está limitada a subgrupos de pacientes devido a algumas mutações
em EGFR em CECP (SOK et al. 2006) e em outros pontos de sua via de
sinalização, como k-Ras, descritos em câncer colorretal (LIÈVRE et al. 2006;
KHAMBATA-FORD et al. 2007).
O HPV possui as oncoproteínas virais E6 e E7, que se ligam e
inativam os supressores de tumor p53 e pRb, respectivamente, levando à
transformação do epitélio (MUNGER e HOWLEY 2002). Tumores HPV-
positivos demonstram perda de expressão de pRb e p21, expressão
aumentada de p16, raras mutações em p53 (MUNGER et al. 1992; OLSHAN
et al. 1997) e melhor resposta à quimio e radioterapia (DEWEESE et al.
1997).
1.3 EXPRESSÃO GÊNICA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE
CABEÇA E PESCOÇO
Muitos estudos de marcadores moleculares têm utilizado a
metodologia de cDNA microarray ou microarranjos de cDNA para identificar
genes diferencialmente expressos ou perfis de expressão gênica para
predição de recorrências e prognóstico em CECP (BELBIN et al. 2002;
CROMER et al. 2004; GINOS et al. 2004; GIRI et al. 2006; CHUNG et al.
2006). Esses trabalhos ressaltaram genes relacionados a proliferação e
sobrevivência celular, adesão e matriz extracelular, invasão e angiogênese.
10
Recentemente, RICKMAN et al. (2008) determinaram um quarteto de
genes para predição de metástases a distância com acurácia de 79% em
validação em amostras independentes. Os pacientes com assinatura
molecular de metástase a distância poderiam então receber tratamentos
mais agressivos ou serem encaminhados para terapia sistêmica (CROMER
et al. 2004; GIRI et al. 2006). Empregando análise supervisionada, CHUNG
et al. (2004) observaram que a casuística utilizada se dividia em 4 subgrupos
segundo seu perfil de expressão gênica: assinatura de EGFR, assinatura
semelhante a células mesenquimais, assinatura semelhante a epitélio
normal e assinatura de enzimas anti-oxidantes. Assim, concluíram
posteriormente que, devido à heterogeneidade dos tumores, possivelmente
apenas pequenos subgrupos de pacientes se beneficiem de cada terapia
(CHUNG et al. 2006).
Entretanto, um dos marcadores moleculares mais úteis na escolha do
tratamento seria uma assinatura ou perfil de acometimento linfonodal.
NAGATA et al. (2003) e SCHMALBACH et al. (2004) identificaram genes
diferencialmente expressos em amostras de CECP de pacientes com
metástases linfonodais, como genes relacionados à matriz extracelular,
adesão celular, motilidade e inflamação. Os genes de maior expressão em
experimentos de microarray com amostras de CECP com comprometimento
linfonodal se localizam em regiões cromossômicas amplificadas associadas
a mau prognóstico (WARNER et al. 2004). Os trabalhos mais completos
nessa área são os de ROEPMAN et al. (2005) e O’DONNELL et al. (2005),
que encontraram assinaturas preditoras de acometimento de linfonodos em
11
CE de cavidade oral e orofaringe validadas em amostras independentes.
Apesar de promissores, os marcadores descritos acima ainda não foram
incorporados à rotina e aguardam validação em estudos prospectivos
multicêntricos.
Nos últimos anos, novas metodologias de análise de dados de
microarray têm sugerido que alterações significativas na expressão gênica
podem manifestar-se no âmbito de vias ou conjuntos de genes co-regulados
(EISEN et al. 1998; MOOTHA et al. 2003; SEGAL et al. 2003, 2004). SEGAL
et al. propôs um modelo probabilístico para identificar módulos
funcionalmente coerente a partir de dados de expressão gênica de
Saccharomyces cerevisiae. Em seguida, o autor utilizou amostras de
diversos tipos de câncer para analisar o comportamento dos módulos ou
grupos de genes que atuam conjuntamente para desempenhar determinada
função, caracterizando os tumores através de um perfil de módulos ativos e
inativos (SEGAL et al. 2004). O objetivo de encontrar genes de uma mesma
via metabólica expressos conjuntamente é promover um maior entendimento
de processos biológicos (SEGAL et al. 2003). Outra vantagem do método
proposto por SEGAL et al. (2003, 2004) é não se basear em genes
diferencialmente expressos, possibilitando a identificação de conjuntos de
genes alterados em amostras heterogêneas, sendo que cada amostra pode
contribuir com a ativação de uma parte do conjunto de genes.
Empregando a abordagem de análise de dados através de vias e
módulos funcionais, um estudo do nosso grupo utilizando tecidos normais e
alterados de esôfago e estômago identificou módulos com atividade alterada
12
em metaplasia e adenocarcinoma, como os relacionados ao metabolismo de
lipídios e inflamação, revelando mecanismos importantes na gênese dessas
doenças (GOMES et al. 2005).
13
2 JUSTIFICATIVA
O carcinoma epidermóide pode se originar em diferentes topografias
de cabeça e pescoço. Apesar de particularidades anatômicas de cada
topografia, o carcinoma epidermóide apresenta fatores etiológicos e
morfologia semelhantes. Assim, como se originam do mesmo tecido, o
estudo dos aspectos moleculares do CE nas diferentes topografias de
cabeça e pescoço permite uma melhor compreensão da doença,
possibilitando uma forma alternativa de classificação desses tumores.
Apesar dos esforços contínuos para o aprimoramento dos métodos de
diagnóstico e tratamento, o carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
ainda é uma doença que apresenta alguns obstáculos no seu manejo.
Atualmente, a escolha do tratamento do CECP leva em conta principalmente
achados histo-patológicos e radiográficos, mas esse sistema pode falhar em
estratificar os pacientes de acordo com o risco de recorrências (DE BREE et
al. 2000), uma vez que indivíduos com tumores clinica e patologicamente
semelhantes, que recebem o mesmo tratamento, apresentam respostas
bastante heterogêneas (ALMADORI et al. 2008). Por exemplo, o
estadiamento clínico dos linfonodos cervicais tem acurácia limitada e dessa
forma, pacientes N0 e N+ podem ser hipo e hipertratados, respectivamente.
Após o tratamento, pacientes pN+ apresentam prognóstico reservado.
Enquanto uma parcela dos pacientes evoluem bem, sem desenvolver
recorrências, cerca de 60 e 20% dos pacientes apresentam recidivas
14
locorregionais e metástases a distância, respectivamente (GENDEN et al.
2003).
Portanto, estudos moleculares representam uma oportunidade de
direcionar o tratamento e aperfeiçoar o seguimento, a fim de diminuir a
mortalidade e morbidade em pacientes de CECP. Utilizando amostras de
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço com histórico médico
conhecido, é possível estudar a expressão de genes através de vias e
módulos funcionais, identificando alterações relacionadas a diversos
aspectos da doença, não só com a finalidade de compreensão da biologia
do tumor mas também para determinar alterações relacionadas à
progressão tumoral.
15
3 OBJETIVOS
1. Analisar a expressão gênica em carcinoma epidermóide de diferentes
topografias de cabeça e pescoço:
9 comparar a expressão gênica em carcinoma epidermóide de
cavidade nasal e seios paranasais, cavidade oral, orofaringe,
hipofaringe e laringe através da análise da expressão gênica
global, assinaturas já publicadas, genes diferencialmente
expressos, vias metabólicas e módulos funcionais com atividade
alterada;
9 comparar a expressão gênica global em carcinoma epidermóide
de das diferentes topografias de cabeça e pescoço com carcinoma
epidermóide de outras topografias (esôfago, pulmão e colo de
útero) e estudar os subgrupos de CECP obtidos.
2. Identificar alterações de expressão gênica relacionadas ao
comportamento biológico do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço:
9 estudar a expressão gênica em amostras de CECP com
acometimento linfonodal através de assinaturas já publicadas,
genes diferencialmente expressos, vias metabólicas e módulos
funcionais com atividade alterada;
9 estudar a expressão gênica em tumores “iniciais” (T1-2 N0) e
“avançados” (T3-4 N+) através de genes diferencialmente
16
expressos, vias metabólicas e módulos funcionais com atividade
alterada;
9 estudar a expressão gênica em casos de CECP N+ com ou sem
recidivas após o tratamento adjuvante através de assinaturas já
publicadas, genes diferencialmente expressos, vias metabólicas e
módulos funcionais com atividade alterada;
9 estudar a expressão gênica em amostras de CECP “localizado”
(N0, sem tratamento radioterápico e sem recidivas) e “colonizador”
(N+ e/ou com recidivas) através de genes diferencialmente
expressos, vias metabólicas e módulos funcionais com atividade
alterada.
17
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONFECÇÃO DE LÂMINAS DE CDNA MICROARRAY
As lâminas de cDNA microarray utilizadas neste trabalho foram
produzidas no Laboratório de Inflamação, do Instituto Ludwig de Pesquisa
sobre o Câncer, sob coordenação do Dr. Alex Fiorini de Carvalho. A lâmina
ou plataforma possui 4.800 elementos ou spots contendo fragmentos de
cDNA escolhidos dentre as sequências ORESTES (Open Reading Frames
Expressed Sequence Tags) geradas no Projeto Genoma do Câncer
(FAPESP/Ludwig) (DIAS NETO et al. 2000; CAMARGO et al. 2001). As
ORESTES escolhidas atendem aos critérios estabelecidos por BRENTANI et
al. (2005): os fragmentos correspondem a genes de sequências completas e
conhecidas; as sequências não apresentam identidade maior que 85%
quando comparadas a quaisquer fragmentos de 100 pares de bases do
genoma humano; produzem um único alinhamento no genoma humano;
correspondem à extremidade mais 3’ do gene, mas sempre 5’ao primeiro
sítio de poli-adenilação; e são maiores que 300 pares de bases.
Os clones bacterianos contendo as sequências ORESTES escolhidas
foram cultivados em meio LB com ampicilina (100 mg/mL). O inserto foi
amplificado por Polymerase Chain Reaction (PCR) usando 1X Sanger PCR
Buffer, 0,3 mM dNTP mix, 300 ηM de oligonucleotídeos iniciadores Forward
e Reverse M13, 3 unidade de Taq polymerase (Promega, EUA) e 2 µL de
18
cultura de bactéria, em volume final de 100 µL. A reação iniciou-se com
incubação a 95
o
C por 5 minutos, 30 ciclos 95
o
C 30 segundos, 60
o
C 30
segundos, 72
o
C 1 minuto e etapa final de 72
o
C por 7 minutos. Uma alíquota
do produto da reação foi fracionado em gel de agarose 1% para controle da
amplificação. O restante foi purificado em coluna de gel-filtração Sephadex
G50 (GE Healthcare, RU), precipitado em presença de 0,1 volume de
acetato de sódio e 1 volume de isopropanol, e solubilizado em 50% DMSO.
Alíquotas foram depositadas sobre lâminas de vidro silanizadas CMT-GAPS
Coated Slides (Corning, EUA) com auxílio do robô Flexys (Genomics
Solutions, EUA). Em seguida, as lâminas foram tratadas em luz ultravioleta e
incubadas a 80
o
C por 2 horas.
4.2 COLETA DE AMOSTRAS
Este estudo foi realizado sob aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital AC Camargo. Foram coletadas amostras de tumores
primários de carcinoma epidermóide, sem tratamento prévio de qualquer
natureza. As amostras pertenciam ao Banco de Tumores do Projeto
Genoma do Câncer e ao Banco de Tumores do Hospital AC Camargo, e
estavam armazenadas em nitrogênio líquido ou a -140
o
C. Após a
confirmação do tipo histológico, as amostras foram dissecadas manualmente
pelo Dr. Hugo Campos, do Departamento de Anatomia Patológica, retirando
tecido não tumoral, infiltrado inflamatório e necroses, de forma a obter um
material com no mínimo 70% de tecido tumoral viável.
19
O levantamento dos dados clínicos e anatomopatológicos dos
pacientes foi acompanhado pelo Dr. André Carvalho. As informações foram
obtidas dos prontuários através dos registros das consultas no
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço (da data do diagnóstico até
Outubro de 2008), no Departamento de Radioterapia (para tratamento
adjuvante) e Avaliação préanestésica da cirurgia para remoção do tumor
primário. Os dados foram armazenadas em um banco on-line desenvolvido
pelo Laboratório de Biotecnologia do Hospital A.C. Camargo. Para verificar
se as variáveis clínicas são aleatoriamente distribuídas frente às topografias
de CP estudadas (cavidade nasal e seios paranasais ou CNSP, cavidade
oral, orofaringe, hipofaringe e laringe), foi utilizado o Teste do Qui-quadrado
de Pearson ou Teste Exato de Fisher.
Tabela 1 - Amostras de Carcinoma Epidermóide utilizadas no estudo.
Localização topográfica Quantidade
CNSP 7
Cavidade Oral 55
Orofaringe 35
Hipofaringe 6
Laringe 18
Esôfago 22
Pulmão 9
Útero 19
Total 171
Nos experimentos de microarray, todas as amostras foram
comparadas contra uma referência comum, como proposto por POLLACK
(2002), de modo a permitir comparações horizontais. Assim, a expressão de
20
cada gene de cada amostra foi calculada através da razão entre a
intensidade do sinal na amostra sobre a intensidade do sinal na referência; e
as amostras puderam ser comparadas entre si através da razão das razões.
Segundo POLLACK (2002), a referência ideal seria aquela que produz um
sinal mínimo em todos os elemento do array, além de ser facilmente
produzida e reprodutível, não só no tempo mas também em diferentes
laboratórios. Dessa forma, o que mais se aproxima da referência ideal seria
um pool de RNA de linhagens celulares, como o utilizado na Universidade de
Stanford (PEROU et al. 1999, 2000; ROSS et al. 2000). No presente estudo,
um novo conjunto de 15 linhagens celulares foi escolhido, tomando o
cuidado de selecionar tipos celulares equivalentes (Tabela 2). Todas as
linhagens foram cultivadas no meio sugerido da ATCC (American Type Cell
Collection, www.atcc.org), suplementados com 10% de soro fetal bovino. As
linhagens foram mantidas a 37
o
C na presença de 5% de CO
2
até
alcançarem 80-90% de confluência.
21
Tabela 2 - Linhagens celulares selecionadas para compor o RNA referência.
Nome Tecido
Daudi Linfoma de Burkitt
DLD-1 Adenocarcinoma de Cólon
DU 145 Carcinoma de Próstata
FaDu Carcinoma Epidermóide de Faringe
GM 637 Fibroblasto Humano diplóide
H 146 Carcinoma de Pulmão
H 1080 Fibrossarcoma
HB4α Célula Luminal de Mama
HEK 293 Rim embrionário Humano
Jurkat Leucemia Aguda de Células T
Saos-2 Osteossarcoma
SK-BR-3 Adenocarcinoma de Mama
SK-MEL-28 Melanoma
T24 Carcinoma de Bexiga
T98G Glioblastoma
4.3 EXTRAÇÃO DE RNA E AMPLIFICAÇÃO
A extração de RNA total foi realizada pelo método do Trizol
(Invitrogen, EUA) com auxílio do homogenizador Polytron (Kinematica AG,
Suíça) ou com RNeasy Midi Kit (Quiagen, Alemanha) (linhagens GM 637 e H
146). A qualidade do RNA foi avaliada através de leitura de absorbância nos
comprimentos de onda de 230, 260 e 280 ηm em espectrofotômetro (ND-
1000, NanoDrop, EUA) e de fracionamento em gel de agarose 1% sob
condições desnaturantes (Figura 2b).
O protocolo de amplificação baseou-se no método de Eberwine,
descrito por VAN GELDER et al. (1990), onde o RNA total de cada amostra
é submetido à transcrição reversa na presença de oligo-(dT)-T7 (que possui
22
a sequência promotora da T7 RNA polimerase). Em seguida, o RNA é
parcialmente digerido, originando iniciadores para a síntese da segunda fita
de cDNA, que ocorre com Polimerase I. A fita dupla de cDNA é então
submetida à transcrição in vitro dirigida pela enzima T7 RNA polimerase e o
RNA amplificado resultante é purificado.
A transcrição reversa iniciou-se com 3 µg de RNA total de cada
amostra e 0,5 µg de oligo-dT
24
-T7 (que possui a sequência promotora da T7
RNA polimerase) (Integrated DNA Technologies IDT), que foram
desnaturados a 70
o
C por 10 minutos e mantidos em gelo. Após o
anelamento do oligo, a reação foi realizada em 6 mM MgCl
2
, 1mM dNTP mix
(Eppendorf, Alemanha), 1X Fisrt Strand Buffer, 20 unidades de RNasin e 1
µL de Improm II (Promega, EUA), em volume final de 20 µl a 42
o
C por 2
horas. A síntese da segunda fita ocorreu a 0,2 mM dNTP mix (Eppendorf,
Alemanha), 1X Second Strand Buffer, 0,6 unidades de RNase H (USB
Corporation, EUA), 5 unidades de Ligase (New England Biolabs, EUA) e 10
unidades de DNA Pol I (Invitrogen, EUA), a 16
o
C por 2 horas. A dupla fita de
DNA foi completada adicionando 5 unidades de T4 DNA Pol (Invitrogen,
EUA) e incubando a 16
o
C por 10 minutos. Após extração por
fenol/clorofórmio, a transcrição in vitro a partir do sítio da T7 RNA polimerase
foi realizada com o kit RiboMax (Promega, EUA): 7,5 mM rNTP mix, 1X
Reaction buffer e 2,5 µL de Enzyme mix em volume final de 25 µL. O RNA
amplificado (aRNA) foi purificado usando TRIzol (Invitrogen, EUA) e sua
qualidade é verificada como já descrito acima (Figura 2d).
23
Quantidades iguais do RNA total das linhagens que compõem o RNA
referência (Figura 2a) foram misturadas e o RNA referência foi amplificado
em dois ciclos (Figura 2c), onde o segundo ciclo se inicia com iniciadores
pd(N)
6
(GE Healthcare, RU).
Legenda - A - RNA total de linhagens do RNA referência Daudi, DLD-1, DU 145, FaDU, GM
637, H 146, H 1080, Jurkat, Saos-2, SK-BR-3, SK-MEL-28, T24, T98G, RNA referência. B -
RNA total de amostras de CE. C – RNA referência total, amplificado do 1º e 2º round. D –
RNA amplificado de amostras tumorais. Em A e B estão indicadas as subunidades de RNA
ribossômico 28S e 18S. Em C e D, o padrão de tamanho molecular apresenta o tamanho de
fragmentos de DNA dupla fita em pares de bases. As amostras foram fracionadas em gel de
agarose 1% sob condições desnaturantes.
Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose de RNA total e amplificado de
amostras de Carcinoma Epidermóide e linhagens celulares do RNA
referência.
4.4 SÍNTESE DO CDNA MARCADO, HIBRIDIZAÇÃO E CAPTURA
DOS DADOS
O RNA amplificado das amostras de CECP e do RNA referência
foram utilizados na síntese de cDNA marcado pela incorporação indireta de
fluoróforos Alexa 555 e Alexa 647 (Molecular Probes, EUA), baseado no
protocolo descrito por DE RISI (2002). Nesse protocolo o RNA amplificado é
1051
1 234567
24
submetido à transcrição reversa na presença de iniciadores pd(N)
6
,
transcriptase reversa e aminoallyl-dUTP. Após a hidrólise alcalina do RNA,
ocorre o acoplamento dos fluoróforos ao aminoallyl. O produto é purificado e
a eficiência da marcação é verificada em espectrofotômetro. Assim, 3 µg de
RNA amplificado e 10 µg de iniciadores pd(N)
6
(GE Healthcare, RU), foram
desnaturados a 70
o
C por 10 minutos e mantidos em gelo. A transcrição
reversa ocorreu em presença de 6 mM MgCl
2
, 0,5 mM dNTP mix Low T (0,5
mM de dCTP, dGTP e dATP; 0,2 mM de dTTP) (Eppendorf, Alemanha) com
0,3 mM Aminoallyl-dUTP (Sigma-Aldrich, EUA), 1X Fisrt Strand Buffer, 20
unidades de RNasin e 1 µL de Improm II (Promega, EUA), em volume final
de 20 µL, a 42
o
C por 2 horas. O aRNA foi degradado com 0,42 M NaOH e
14 mM EDTA a 70
o
C por 10 minutos. Após precipitação com etanol e
acetato de sódio, 3 µg de cDNA foram marcados com Alexa Dye 555 ou 647
(Invitrogen, EUA) e purificado com o kit QIAquick PCR Purification (Qiagen,
Alemanha).
Após a eficiência da marcação ser verificada em espectrofotômetro
(ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop, EUA) amostra e referência foram
misturadas e transferidas para um tubo contendo 4 µg de poli(A) DNA
(Amersham Biosciences, EUA), 2 µg de Cot-1 DNA (Invitrogen, EUA), 10 µg
de DNA de esperma de salmão (Amersham Biosciences, EUA), 5X SSC, 5X
de solução Denhardt´s, 0,1% SDS, 50% formamida, e desnaturados a 95
o
C
por 5 minutos. A mistura foi hibridizada a 42
o
C durante 16-18 horas na
estação Gene TAC Hybridization Station (Genomic Solutions, RU), utilizando
as lâminas descritas pré-tratadas em 5X SSC, 0,2% SDS, 1% BSA e 5X
25
Denhardt’s durante 6 ou mais horas a 42
o
. Após a hibridização, as lâminas
foram lavadas sob agitação a 42
o
C em 2X SSC 0,1% SDS por 4 minutos,
0,1X SSC 0,1% SDS 4 minutos e 0,1X SSC por 4 minutos. As imagens
foram digitalizadas com auxílio de scanner a laser confocal ScanArray
Express Microarray Scanner (Packard Biosciences, EUA) e a quantificação
dos dados foi realizada com o software ScanArray Express Microarray
Scanner (Packard Biosciences, EUA), utilizando o método do histograma.
Figura 3 - Imagem digitalizada obtida após o experimento de microarray e
quantificação dos dados.
26
4.5 ANÁLISES DOS DADOS
A análise matemática e estatística dos dados foi realizada em
colaboração com Dra. Helena Brentani, do Laboratório de Biotecnologia do
Hospital do Câncer, e com o grupo do Dr. Eduardo J. Neves, do Instituto de
Matemática e Estatística da Universidade de São Paulo.
Inicialmente os dados foram submetidos a um controle de qualidade
dos dados gerados, realizado pelo Laboratório de Biotecnologia. Essa etapa
avalia reprodutibilidade e possíveis variações nos experimentos introduzidas
na confecção das lâminas e por manipulação, artefatos e corantes.
Para avaliar a qualidade de manufatura das lâminas foi elaborado um
boxplot com 48 caixas, onde cada caixa mostra a distribuição da razão Alexa
647/Alexa 555 dos spots de um dos 48 quadrantes de uma lâmina,
representado então a distribuição dos spots desenhados por uma mesma
agulha do robô em uma caixa.
A fim de avaliar a reprodutibilidade dos experimentos de microarray,
para cada duplicata (lâmina main com amostra marcada com Alexa 555 e
referência com Alexa 647 e lâmina swap com os corantes invertidos) foi
calculado o coeficiente de correlação de Pearson, que reflete o grau de
semelhança, ou mais especificamente, de relação linear entre as duas
lâminas.
Em seguida, o tratamento dos dados foi realizado pelo grupo do Dr.
Eduardo Neves. Elementos com sinal menor ou igual ao background são
eliminados. O background é subtraído dos elementos restantes e os dados
27
gerados pelos fluoróforos Alexa 555 e 647 são normalizados, visando corrigir
tendências introduzidas por variações experimentais intensidade-
dependentes e variações aleatórias, incorporação ou fluorescência
diferentes dos corantes. Para isso, foi empregado o método não linear de
Loess (Locally Scatter-plot Smoothing).
Legenda - Distribuição dos dados de uma lâmina de microarray não normalizados (A) e
normalizados pelo método não linear de Loess (B). A média de intensidade de fluorescência
dos spots está representada na abscissa e na ordenada, a razão Alexa 647/Alexa 555.
Figura 4 - Normalização dos dados de microarray.
Para iniciar a análise da biologia dos tumores, foi elaborado um
agrupamento ou cluster hierárquico não-supervisionado, utilizando distância
euclidiana completa, a fim de avaliar a expressão gênica global.
Para verificar o poder de classificação de assinaturas moleculares já
publicadas, foram identificados os genes comuns à plataforma utilizada no
presente estudo e às assinaturas descritas em CHUNG et al. (2004),
ROEPMAN et al. (2005, 2006) e RICKMAN et al. (2008). Com os genes
identificados, foram construídos agrupamentos hierárquicos não
supervisionados.
28
Para identificar genes diferencialmente expressos foi empregado o
teste não paramétrico de Wilcoxon, com correção por False Discovery Rate
(FDR), quando aplicável. Os genes diferencialmente expressos foram ainda
utilizados para identificar vias preferencialmente representadas através da
ferramenta Pathway Express (KHATRI et al. 2002; DRAGHICI et al. 2003).
As vias e módulos funcionais alterados foram identificados também
através da metodologia descrita por SEGAL et al. (2004) com modificações
(GOMES et al. 2005). O método de módulos funcionais é baseado no
conhecimento biológico dos genes e não visa a identificação de genes
diferencialmente expressos. Os genes presentes na lâmina de microarray
são classificados em funções ou vias, conforme descrito no KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes) (KANEHISA e GOTO 2000;
KANEHISA et al. 2006, 2008), Gene Ontology (ASHBURNER et al. 2000) e
GeneDeck (RON et al. 2005). Em uma dada comparação, a média de
expressão de cada gene é calculada considerando todas as amostras
utilizadas na comparação. Para cada lâmina, é calculada a diferença entre a
expressão de cada gene e a respectiva média. Os genes com diferença
maior que 1 e menor que -1 são discretizados em +1 e -1, respectivamente.
Os valores entre 1 e -1 são marcados como 0. Em cada lâmina, é avaliado
através da distribuição hipergeométrica se cada módulo apresenta uma
distribuição de +1, -1 e 0 diferente em relação à lâmina em que está contido.
Assim, os módulos são classificados em cada lâmina como ativos, inativos
ou inalterados. Em seguida é avaliado, para cada módulo, se um subgrupo
de amostras apresenta distribuição de ativo, inativo e inalterado diferente do
29
total das amostras. È calculado p-valor para cada gene através de bootstrap.
Assim, o módulo é classificado em ativo, inativo ou inalterado no subgrupo
estudado. Entretanto, não se pode considerar o módulo biologicamente ativo
ou inativo, pois os genes que contribuíram para a alteração podem ser tanto
estimuladores como inibidores da via.
4.6 PCR QUANTITATIVA
Genes pertencentes a vias e módulos alterados e genes
normalizadores foram selecionados para experimentos de PCR quantitativa.
Para a síntese de cDNA, foi adicionado 0,5 µg de oligo-dT
15
a 2 µg de
RNA total em volume final de 5 µl e incubado a 70
o
C por 10 minutos e
resfriamento em gelo para anelamento do oligo. A transcrição reversa
ocorreu a 3 mM MgCl
2
, 1 mM dNTP mix (Eppendorf, Alemanha), 1X 1st
Strand Buffer, 20 unidades de RNasin e 1 µL de Improm II (Promega, EUA )
no volume final de 20 µl a 42
o
C por 1 hora, seguido de incubação a 70
o
C por
15 minutos. A eficácia da reação foi avaliada através de uma reação de
PCR comum para o gene da β-actina e o produto foi fracionado em gel de
agarose 1%. Alíquotas do cDNA obtido foram diluídas 10 vezes e
armazenadas.
Oligonucleotídeos iniciadores ou primers para os genes selecionados
foram desenhados através do software Primer Express 3.0 (Applied
Biosystems) (Tabela 3), utilizando como parâmetros conteúdo de citosina-
guanina entre 30 e 80%, temperatura de anelamento entre 58
o
C e 60
o
C,
30
iniciadores que não possuíssem capacidade de anelamento entre si ou de
formar estrutura secundária e amplicon de 50 a 150 pares de base. Além
desses parâmetros, os iniciadores foram desenhados em éxons diferentes,
evitando a possibilidade de amplificação simultânea a partir de DNA
genômico contaminante de amplicon de mesmo tamanho do obtido a partir
do transcrito. Foram escolhidos éxons comuns às variantes de splicing
alternativo e localizados na extremidade 3’ do gene para garantir maior
representatividade de todos os transcritos.
Todas as reações de padronização assim como as reações para
medir a expressão gênica nas amostras estudadas foram realizadas em
duplicata com 1X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 µL
de cDNA diluído 10 vezes (exceto curva padrão) e os iniciadores na
concentrações selecionadas, em volume final de 20 µL. Para os controles
negativos de cada iniciador foi utilizado água estéril da mesma alíquota
utilizada para completar o volume da reação de amplificação. As reações
foram realizadas no termociclador ABI Prism
®
7300 Sequence Detection
System (Applied Biosystems), a 95
o
C por 10 minutos, 40 ciclos de 95
o
C 15
segundos e 60
o
C 1 minuto, e finalizando com a curva de dissociação
realizada a 95
o
C 15 segundos, 60
o
C 15 segundos e 95
o
C 15 segundos.
31
Tabela 3 - Oligonucleotídeos iniciadores utilizados em reações de PCR quantitativa dos genes normalizadores e genes
selecionados na análise de vias e de módulos alterados em Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço.
Gene Sequência do iniciador FW Sequência do iniciador RV
Concentração final (ηM) Eficiência
AKT1 TCACGGCCCAGATGATCAC TCCACACACTCCATGCTGTCA
100 2,03
AREG CGACAAGAGAATGGAAATGTACATG TTATGGCTATGACTTGGCAGTGA
100 1,86
BCR2 CCTTCGACGTCAATAACAAGGA CCTGCGATGGCGTTCAC
200 1,97
BST2 AGCGCTCTGCTGCAGTGA AGGACGGACCTTCCAAGATGT
400 1,85
CCL20 TCCAAAACAGACTTGGGTGAAA CCATTCCAGAAAAGCCACAGTT
100 2,11
EGFR TCAGTGGCGATCTCCACATC GGAGGAGTATGTGTGAAGGAGTCA
100 2,02
EGLN3 AGAAGCCAAAAAGAAATTCAGGAA GAGCACGGTCAGTCTTCAGTGA
100 1,84
FOSB GAACGAAATAAACTAGCAGCAGCTAA TTTTCTTCCTCCAACTGATCTGTCT
100 1,94
HBMS GGCAATGCGGCTGCAA GGGTACCCACGCGAATCAC
100 1,96
HPRT1 CCCACGAAGTGTTGGATATAAGC GGGCATATCCTACAACAAACTTGTC
400 1,88
IL1B TCCTGCGTGTTGAAAGATGATAA TTGGGTAATTTTTGGGATCTACACT
100 1,85
IL1F9 AACAGCCCACATTGCAGCTAA GCTCGGGTTGGCCATACA
200 1,88
INHBA GGAGCAGACCTCGGAGATCA CAGCGTCTTCCTGGCTGTTC
25 2,27
KLK6 TGAGAAGTACGGGAAGGATTCC TCGGAGGTGGTCTCCACATAC
100 1,87
MCM2 CACACAGAAGTTCAGCGTCATG AATGAAAGGTAGCGGGCAAA
200 1,92
MYC CACCACCAGCAGCGACTCT TTCCACAGAAACAACATCGATTTC
100 2,05
PCNA TTCAACGGTGACACTCAGTATGTCT TCCCATATCCGCAATTTTATACTCT
100 1,93
PLAU TGGCACAAGCTGTGAGATCAC CAGCTGCTCCGGATAGAGATAGTC
200 1,94
POSTN AAGAGACACGAGAAGAACGAATCA TCTGTTTCTCCACCTCCAGTAGAA
200 2,02
SERPINA3 TGCTCCCAGAGACCCTGAAG TTTGGCAGGTAGAGCTCACCTAT
200 1,93
32
Após o término da reação, a qualidade dos dados foi analisada
através do software SDS 2.3 (Applied Biosystems). As curva de dissociação
foram analisadas quanto à amplificação de DNA genômico, dímeros de
iniciadores e variantes de splicing. Com auxílio das curvas de amplificação
ou amplification plot, foi ajustado na fase exponencial do gráfico o threshold
ou limiar de intensidade de fluorescência na qual foram tomados os valores
de ciclos ou Ct (cycle threshold) de cada reação. As reações apresentaram
curva de dissociação do amplicon e de amplificação conforme o exemplo a
seguir (Figura 5), onde não se observa amplificação inespecífica e é possível
estabelecer uma mesma linha de Ct adequada para toda a placa,
respectivamente. Foram consideradas aceitáveis duplicatas com desvio
padrão menor que 0,5.
Legenda - A. Curva de dissociação do amplicon gerado com iniciadores do gene PLAU. Na
abscissa está representada a temperatura. Na ordenada está representada a intensidade de
fluorescência. B. Curva de amplificação de amostras com iniciadores do gene PLAU. Na
abscissa estão representados os ciclos de amplificação. Na ordenada está representada a
intensidade de fluorescência.
Figura 5 - Curvas para análise de resultados de amplificação das reações
de PCR quantitativa.
A
B
33
As reações de amplificação foram padronizadas inicialmente variando
a concentração de iniciadores com reações de concentração final de 400,
200 e 100 ηM (ou menor em alguns casos) e os produtos foram fracionados
em gel de acrilamida 8% (Figura 6). Foi escolhida a concentração mais
adequada para cada par de iniciadores considerando-se menor Ct, a maior
intensidade da banda no gel e a ausência de dímeros de iniciadores.
Figura 6 - Produto de PCR quantitativa fracionado em gel de acrilamida 8%
obtido em reações com 400, 200 e 100 η M do iniciadores dos genes INHBA
e MCM2.
Em seguida foram realizadas reações para determinar a eficiência de
amplificação de cada par de iniciadores. Para isso foi construída uma curva
padrão utilizando quantidades decrescentes de cDNA, obtidas diluindo
seriadamente 10 vezes a cada etapa (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000)
(Figura 7). A inclinação ou slope (S) da curva foi utilizado para o cálculo da
eficiência segundo a fórmula proposta por RASMUSSEN et al. (2001), onde
Eficiência = 10
1/S
.
34
Legenda - Curva construída com o resultado de reações de PCR quantitativa para o gene
EGFR. Na abscissa estão representadas quantidades decrescentes de cDNA de RNA
referência (obtidas diluindo 10 vezes seriadamente). Na ordenada estão representados os
valores de Ct (cycle threshold). No canto direito superior, o software fornece o Slope ou
inclinação da curva.
Figura 7 - Curva padrão de reações de PCR quantitativa.
As reações de PCR quantitativa foram realizadas para as amostras
utilizadas nos experimentos de microarray e em cada placa foi incluído o
RNA referência. Para os genes normalizadores (BCR2, HMBS e HPRT) foi
calculado a diferença entre Ct
ref
e Ct
amostra
. Os valores obtidos foram
utilizados para o cálculo do fator de normalização através do software
GeNorm (VANDESOMPELE et al. 2002). A expressão relativa dos genes
selecionados foi calculada baseando-se na fórmula proposta por PFAFFL
(2001), adicionando-se o fator de normalização:
35
A expressão relativa dos genes selecionados nos grupos com
acometimento linfonodal (item 5.4.1) e com recidivas (item 5.4.3) foram
comparados através do teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
(Ct
REF
- Ct
amostra
)
Expressão
amostra
= Eficiência
gene-alvo
Fator de normalização
36
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE DOS DADOS CLÍNICOS E ANÁTOMO-
PATOLÓGICOS DOS PACIENTES DE CECP
Os dados clínicos e anátomo-patológicos dos pacientes portadores de
CECP foram coletados dos prontuários médicos (vide resumo na Tabela 4) e
analisados quanto à sua distribuição nas cinco topografias de cabeça e
pescoço, utilizando o Teste Exato de Fisher e o Teste do Qui-quadrado de
Pearson (Tabela 5). Isso permite analisar se cada topografia apresenta a
mesma proporção de consumidores de álcool, tabaco, comprometimento
linfonodal, etc., evitando que, ao comparar duas topografias, sejam
encontradas diferenças decorrentes das características clínico-patológicas,
ao invés das diferenças entre topografias.
Foi observado que consumo de álcool é menos freqüente em
cavidade oral. Há menor freqüência de amostras pouco diferenciadas entre
os casos de CE de cavidade oral e laringe. As amostras de CNSP
apresentam menos invasão perineural e comprometimento linfonodal (Figura
8).
37
Tabela 4 - Dados clínicos e anátomo-patológicos dos pacientes portadores de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço.
% dos pacientes % dos pacientes
Idade (anos) Topografia
23-30 2 CNSP 6
31-40 2 Cavidade oral 45
41-50 16 Orofaringe 29
51-60 32 Hipofaringe 5
61-70 29 Laringe 15
71-80 12
81-89 5 Tamanho do tumor
pT1 8
Sexo pT2 23
Feminino 21 pT3 21
Masculino 79 pT4 45
Consumo de tabaco Comprometimento linfonodal
Não consumidor 23 pN0 25
Consumidor 52 pN+ 62
Ex-consumidor (pelo menos 1 ano) 25 não esvaziado 13
Consumo de álcool Extravasamento capsular
Não consumidor 40 Sem extravasamento 17
Consumidor 35 Com extravasamento 31
Ex-consumidor (pelo menos 1 ano) 25 Não se aplica/não informado 52
38
Recidivas Grau de diferenciação
Sem recidiva em 2 anos 44 Bem diferenciado 45
Com recidiva 39 Moderadamente diferenciado 46
Indeterminado 17 Pouco diferenciado 7
Recidiva local 27 Invasão Vascular
Recidiva regional 16 Sem invasão 83
Metástase a distância 17 Com invasão 12
Não informado 4
Segundo tumor primário 12
Invasão Perineural
Sobrevida após a cirurgia Sem invasão 53
até 1 ano 28 Com invasão 43
1 a 2 anos 21 Não informado 4
2 a 3 anos 7
3 a 4 anos 12 Radioterapia Adjuvante
4 a 5 anos 6 Não realizou 31
mais de 5 anos 26 Realizou 69
Status
Vivo sem câncer 34
Vivo com câncer 3
Óbito pelo câncer 32
Óbito por outras causas 27
Perdido de vista 3
39
Tabela 5 - Homogeneidade da distribuição das variáreis clínicas dentre os
casos de Carcinoma Epidermóide das cinco topografias de Cabeça e
Pescoço (CNSP, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe).
Variável
Teste Exato de
Fisher (p-valor)
Teste do qui-quadrado de
Pearson (p-valor)
Idade 0,566 0,421
Consumo de tabaco 0,085 0,094
Consumo de álcool 0,028 0,033
Grau de diferenciação 0,003 0,007
Invasão vascular 0,088 0,195
Invasão perineural 0,032 0,088
Comprometimento linfonodal 9,97E-5 4,79E-7
Extensão Extracapsular 0,343 0,257
Recidivas 0,598 0,660
0
20
40
60
80
100
CNSP cav. Oral orofaringe hipofaringe laringe
Comprometimento linfonodal (%)
Figura 8 - Frequência de comprometimento linfonodal nos casos de
Carcinoma Epidermóide de CNSP, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e
laringe.
40
5.2 ANÁLISE DE QUALIDADE DOS DADOS DE MICROARRAY
Os dados de microarray foram analisados quanto sua qualidade em
relação à confecção da lâmina e à reprodutibilidade da hibridização em
duplicata.
Para cada lâmina, a razão Alexa 647/Alexa 555 foi representada em
um boxplot, onde cada caixa representa a distribuição dos elementos
depositados por uma mesma agulha do robô. Todas as lâminas
apresentaram um boxplot semelhante ao exemplo abaixo, onde não se
observa nenhum erro sistemático, seja provocado por problemas de
deposição ou de hibridização.
Figura 9 - Distribuição da razão do sinal de Alexa 647/Alexa 555 para cada
um dos 48 quadrantes de uma lâmina de microarray.
Agulha de deposição
Alexa 647 / Alexa 555
41
A fim de avaliar a reprodutibilidade dos experimentos de microarray,
para cada duplicata foi calculado o coeficiente de correlação de Pearson,
que reflete a relação linear entre as réplicas. A média e mediana para as 171
amostras foi 0,90, com desvio padrão de 0,04.
Legenda - A lâmina main contém a amostra marcada com Alexa 555 e a referência
marcada com Alexa 647. A lâmina swap foi realizada com inversão dos corantes da amostra
e referência. Em cada eixo está representada a razão Alexa 647/Alexa 555 de todos os
elementos de uma lâmina.
Figura 10 - Correlação entre os dados de duplicatas de lâminas de
microarray.
42
5.3 ASPECTOS MOLECULARES DO CARCINOMA
EPIDERMÓIDE EM DIFERENTES TOPOGRAFIAS
5.3.1 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço
A fim de avaliar a expressão gênica global de um tumor de mesma
origem histológica mas que se manifesta em diferentes topografias, os
dados de expressão de todos os genes representados na lâmina das 121
amostras de CECP foram empregados na construção de um cluster ou
agrupamento hierárquico, não supervisionado, com distância euclidiana
completa (Figura 11). As amostras de CECP parecem não se agrupar de
acordo com a topografia, informações clínicas (consumo de tabaco, álcool,
diferenciação pT, pN e recidivas) ou variáveis experimentais (lote de lâmina
ou reagentes).
Os genes do perfil de expressão “intrínseco” descrito por CHUNG et
al. (2004) que se encontravam na plataforma utilizada nesse estudo (67
genes) foram empregados na construção de um agrupamento hierárquico
não supervisionado. O trabalho demonstra a classificação de amostras de
CECP em 4 tipos, porém tal classificação não pode ser reproduzida na
plataforma e nas amostras aqui utilizadas(Figura 12).
Para analisar cada gene independentemente, os dados de expressão
gênica das topografias foram comparados, dois a dois, utilizando o teste de
Wilcoxon e correção por FDR (Tabelas 6 e 7). Dentre os cerca de 4.600
43
genes, foi encontrada expressão diferencial apenas quando comparadas
amostras de cavidade oral e orofaringe.
Para estudar a biologia dos tumores de diferentes topografias de
cabeça e Pescoço, foi utilizada a metodologia de módulos funcionais, que
identificou módulos ativos e inativos em cavidade nasal e seios paranasais,
cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe (Tabela 8).
44
Legenda - Agrupamento hierárquico não supervisionado construído com dados de expressão gênica de amostras de Carcinoma Epidermóide de
Cabeça e Pescoço. Abaixo do cluster estão representados dados dos respectivos casos.
Figura 11 - Expressão gênica global e dados clínicos e anátomo-patológicos de amostras de Carcinoma Epidermóide de
Cabeça e Pescoço.
45
Figura 12 - Agrupamento hierárquico não supervisionado construído com os
67 genes do perfil de expressão “intrínseco” descrito por CHUNG et al.
(2004) e amostras de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço.
Tabela 6 - Quantidade de genes diferencialmente expressos entre as cinco
topografias de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço. Os genes
diferencialmente expressos apresentam p-valor menor que 0,05, calculado
através do teste de Wilcoxon e correção por FDR.
Topografia CNSP Cavidade Oral Orofaringe Hipofaringe
Cavidade Oral
0
Orofaringe
0
6
Hipofaringe
0 0 0
Laringe
0 0 0 0
46
Tabela 7 - Genes diferencialmente expressos entre amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cavidade Oral e Orofaringe. Fold representa a razão de
expressão cavidade oral/orofaringe. O p-valor se refere ao obtido através do
teste de Wilcoxon e correção por FDR.
Gene
Fold
p-valor
Função
EDN3 -1,2927 0,007
diferenciação da crista neural
KRTCAP3 1,4336 0,0078
proteína associada a queratinócitos
HMGB2 1,6402 0,0108
flexibilidade do DNA para aproximar elementos em cis
LRRC48 -1,1003 0,0152
função desconhecida
MCM2 1,7156 0,0196
iniciação da replicação do DNA
POLR2H 1,3948 0,0367
subunidade da RNA polimerase II
Tabela 8 - Vias e módulos funcionais alterados em amostras de Carcinoma
Epidermóide de diferentes topografias de Cabeça e Pescoço (verde
representa módulo inativo e vermelho, ativo). Versão resumida, vide versão
completa em anexo.
Topografia Módulo Gene p-valor
Cavidade Via de calicreínas KLK13 2,4E-18
Nasal e KLK7 2,8E-7
Seios
Desenvolvimento (GO7275) FOSB 3,5E-50
Paranasais
Desenvolvimento da epiderme (GO8544) KLK7 4,2E-10
EVPL 1,0E-2
Região extracelular (GO5576) POSTN 3,4E-25
KLK13 3,1E-17
INHBA 1,1E-14
KLK6 1,4E-13
AREG 8,9E-11
MMP9 1,0E-6
Espaço extracelular (GO5615) MMP13 4,5E-2
Sinalização célula-célula (GO7267) BST2 2,6E-17
Atividade de fatores de crescimento AREG 3,1E-9
(GO8083) INHBA 3,9E-8
Interação MEC-receptor (GeneDeck) COL6A3 2,3E-22
47
Cont/ Tabela 8
Ligantes de cálcio (GO5509) S100P 6,6E-11
Resposta ao stress (GO6950) IL1F9 5,9E-43
INHBA 3,9E-15
BST2 2,9E-14
KLK6 1,2E-11
CCL18 3,9E-8
CCL20 1,9E-6
IL1B 9,5E-3
Cavidade
Região extracelular (GO5576) POSTN 3,4E-25
Oral KLK13 3,1E-17
INHBA 1,1E-14
KLK6 1,4E-13
AREG 8,9E-11
MMP9 1,0E-6
Proteólise (GO6508) KLK6 1,1E-29
MMP9 5,7E-7
Via de IGF2/IGFBP4 PLAU 2,3E-10
Orofaringe
Via de Wnt (GeneDeck) MYC 2,6E-10
Via de sinalização de Toll-like Receptor (GeneDeck) IL1B 1,3E-2
Regulação de transcrição (GO6355) FOSB 1,5E-29
MYC 3,3E-11
Hipofaringe
Resposta ao stress (GO6950) IL1F9 5,9E-43
INHBA 3,9E-15
BST2 2,9E-14
KLK6 1,2E-11
CCL18 3,9E-8
CCL20 1,9E-6
IL1B 9,5E-3
Laringe
Ciclo celular (GO7049) FOSB 3,6E-21
MYC 3,9E-17
INHBA 1,7E-5
48
5.3.2 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço utilizando carcinoma epidermóide de esôfago,
pulmão e colo de útero
Para analisar o impacto da topografia na expressão gênica global
utilizando uma abordagem diferente, foram incluídas amostras de carcinoma
epidermóide de outras topografias (esôfago, pulmão e colo de útero). Os
dados de expressão gênica de todos os genes da plataforma de 171
amostras de carcinoma epidermóide foram empregados na construção de
um cluster ou agrupamento hierárquico, não supervisionado, com distância
euclidiana completa (Figura 13).
A primeira divisão do agrupamento separa um pequeno grupo de
amostras de CE de esôfago, pulmão e colo de útero de um grande grupo
com o restante das amostras. Esse grande grupo por sua vez também se
divide em dois grupos: um braço com amostras de CECP exclusivamente
(braço 2) e outro grupo que se ramifica em um braço com amostras de
esôfago, pulmão e colo de útero e um braço apenas com CECP (braço 1).
A homogeneidade da distribuição dos dados clínicos e
anatomopatológicos nos casos do braço 1 e 2 foi avaliada através do Teste
Exato de Fisher e o Teste do Qui-quadrado de Pearson. Os dois grupos não
apresentam freqüências distintas de características clínicas e
anatomopatológicas, com exceção de grau de diferenciação (Tabela 9). O
braço 2 apresenta 7 dos 8 tumores pouco diferenciados. Para determinar as
diferenças responsáveis por essa separação, foram calculados os genes
49
diferencialmente expressos (Tabela 10) e módulos alterados nos braços 1 e
2 de amostras de CP (Tabela 12). Os 796 genes diferencialmente expressos
foram utilizados para identificar vias preferencialmente representadas
através da ferramenta Pathway Express
(http://vortex.cs.wayne.edu/Projects.html) (Tabela 11).
Tabela 9 - Homogeneidade da distribuição das variáreis clínicas dentre os
casos de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço dos braços 1 e
braço 2 definidos no agrupamento hierárquico não supervisionado
construído com dados de expressão gênica de todos os genes
representados na lâmina de microarray para as amostras de CECP, de
esôfago, pulmão e colo de útero.
Variável
Teste Exato de
Fisher (p-valor)
Teste do qui-quadrado de
Pearson (p-valor)
Idade 0,100 0,113
Consumo de tabaco 1,000 0,838
Consumo de álcool 0,268 0,338
Grau de diferenciação 0,041 0,071
Invasão vascular 0,582 0,693
Invasão perineural 1,000 0,863
Comprometimento linfonodal 0,147 0,148
Extensão Extracapsular 0,236 0,238
Recidivas 0,466 0,462
50
Legenda - Agrupamento hierárquico não supervisionado construído com dados de expressão gênica de amostras de Carcinoma Epidermóide de
Cabeça e Pescoço, Esôfago, Pulmão e Colo de útero. Os números se referem ao braços do cluster citados no texto. Abaixo do cluster estão
representados os dados dos respectivos casos. (Figura também inclusa no Anexo)
Figura 13 - Expressão gênica global de Carcinoma Epidermóide e dados clínicos e anatomopatológicos dos casos de
CECP.
51
Tabela 10 - Genes mais diferencialmente expressos entre o braços 1 e
braço 2 de amostras de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço
definidos no agrupamento hierárquico não supervisionado construído com
dados de expressão gênica de todos os genes representados na lâmina de
microarray para as amostras de CECP, de esôfago, pulmão e colo de útero.
Fold representa a razão de expressão braço 1/braço 2. O p-valor se refere
ao obtido através do teste de Wilcoxon e correção por FDR.
Nome
Fold
p-valor
ANKRD10 1,8 0
ACTR3 1,48 0
KCNJ15 1,39 1,0E-4
CIRH1A 1,39 1,0E-4
MAP2K1 1,34 1,0E-4
ILF2 1,30 1,0E-4
TMCC1 1,17 1,0E-4
CAB39 1,02 1,0E-4
PLP1 -1,25 1,0E-4
CASK -1,27 1,0E-4
GALNT10 -1,62 1,0E-4
TFE3 -1,62 1,0E-4
HNRPA0 -1,82 1,0E-4
S100A16 1,78 2,0E-4
HDAC4 -1,31 2,0E-4
PBXIP1 -1,45 2,0E-4
DNM3 -1,50 2,0E-4
UBXD1 -1,77 2,0E-4
IL1B 1,51 3,0E-4
SCOC 1,23 3,0E-4
ATXN2 -1,25 3,0E-4
LRRC37A2 -1,30 3,0E-4
KLK2 -1,66 3,0E-4
C6orf107 -1,67 3,0E-4
MRPS17 -1,80 3,0E-4
PPP2R1A 1,41 4,0E-4
PPP4C 1,40 4,0E-4
SERINC2 1,36 4,0E-4
DHRS1 1,31 4,0E-4
STYXL1 1,28 4,0E-4
SETD3 1,19 4,0E-4
52
Tabela 11 - Vias preferencialmente representadas pelos genes
diferencialmente expressos entre o braço 1 e braço 2 de amostras de
Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço definidos no agrupamento
hierárquico não supervisionado construído com dados de expressão gênica
de todos os genes representados na lâmina de microarray para as amostras
de CECP, de esôfago, pulmão e colo de útero.
Grupo Vias representadas e genes participantes p-valor
Braço 1
Via de sinalização de ErbB 0,002
AKT1, AREG, CRK, EGFR, HB-EGF, MAP2K1, MYC, SHC1
Via de sinalização de GnRH 0,009
EGFR, HB-EGF, ITPR3, MAP2K1, MAP2K3, PLD2
Regulação de citoesqueleto de actina 0,014
ARPC3, ARPC5, DOCK1, EGFR, GNG12,ITGA5, MAP2K1
Adesão focal 0,014
CRK, EGFR, DOCK1, PPP1CA, MAP2K1, SHC1, CAPN2, ITGA5
Braço 2
Interações de SNARE em transporte de vesículas 0,012
SNAP25, STX10, STX18
Tabela 12 - Vias e módulos funcionais ativos no braço 1 e inativos braço 2
de amostras de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço definidos no
agrupamento hierárquico não supervisionado construído com dados de
expressão gênica de todos os genes representados na lâmina de microarray
para as amostras de CECP, de esôfago, pulmão e colo de útero. Versão
resumida, vide versão completa em anexo.
Via Gene p-valor
Sinalização célula-célula (GO7267) IL1F9 3,73E-41
AREG 3,26E-23
BST2 2,65E-17
Proteólise (GO6508) KLK13 1,40E-36
KLK6 1,11E-29
MMP9 5,79E-7
Resposta ao stress (GO6950) IL1F9 5,98E-43
CCL18 3,93E-8
CCL20 1,98E-6
IL1B 9,56E-3
Regulação da progressão do ciclo celular (GO0074) FOSB 1,47E-31
INHBA 7,26E-10
MYC 2,15E-5
SPHK1 5,50E-2
53
5.4 ASPECTOS MOLECULARES DO COMPORTAMENTO DO
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO
O banco de dados construído com dados clínicos e
anatomopatológicos permite comparar grupos segundo hábitos do paciente,
como consumo de tabaco e álcool, ou de acordo com características do
tumores, como diferenciação, invasão vascular e perineural. Neste trabalho,
as análises da biologia do CECP se concentraram em identificar alterações
relacionadas a dados clínicos e anatomopatológicos que determinam o
tratamento e prognóstico dos pacientes, como tamanho, comprometimento
ou metástases linfonodais e recorrências após o tratamento.
5.4.1 Aspectos moleculares da metástase linfonodal em Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço
Em CECP, o tratamento cirúrgico de pacientes clinicamente
diagnosticados com metástases linfonodais inclui o esvaziamento cervical,
que traz diversas complicações ao paciente (SHORT et al. 1984; VAN
WILGEN et al. 2003). Entretanto, após exame histológico, verifica-se que 10
a 20% dos pacientes clinicamente N+ não apresentam acometimento
linfonodal detectável (WOOLGAR 1999), enquanto 20 a 50% dos pacientes
cN0 possuem metástases cervicais ocultas e desenvolvem doença
metastática, geralmente nos 2 primeiros anos de seguimento (KHAFIF et al.
1991; JONES et al. 1993; HIRATSUKA et al. 1997). Assim, para evitar falsos
negativos, muitos pacientes N0 são submetidos a esvaziamento cervical.
54
Portanto, devido a limitações em detectar metástases linfonodais antes da
cirurgia, pacientes N+ e N0 são hiper e hipotratados, respectivamente.
Para identificar alterações relacionadas às metástases linfonodais,
foram comparados os dados de expressão gênica de amostras de CE de
cavidade oral e orofaringe de pacientes que apresentaram (61 amostras) ou
não (20 amostras) linfonodos comprometidos pela doença no exame
anátomo-patológico das peças cirúrgicas de esvaziamento cervical.
Utilizando o teste de Wilcoxon e correção por FDR, não foram
encontrados genes diferencialmente expressos, isto é, com p-valor menor
que 0,05.
Os genes da assinatura de comprometimento linfonodal de
ROEPMAN et al. (2005, 2006) que se encontravam na plataforma utilizada
nesse estudo (119 genes) foram empregados na construção de um
agrupamento hierárquico não supervisionado (Figura 14). Na casuística
utilizada, estes genes não se mostraram capazes de classificar as amostras
em N0 (sem acometimento linfonodal) e N+ (com acometimento linfonodal).
Foi utilizada também a metodologia de vias e módulos funcionais
descrita por SEGAL et al. (2003) (Tabela 13). Dos módulos alterados, foram
selecionados genes para avaliação por PCR quantitativa (Tabela 17, item
5.4.5).
55
Figura 14 - Agrupamento hierárquico não supervisionado construído com os
119 genes da assinatura de comprometimento linfonodal de ROEPMAN et
al. (2005, 2006) e amostras de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço.
56
Tabela 13 - Vias e módulos funcionais alterados em amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço de pacientes com comprometimento
linfonodal (verde representa módulo inativo e vermelho, ativo).
Grupo Módulo Gene p-valor
Linfonodo Via de calicreínas KLK13 4,0E-15
positivo KLK7 2,8E-5
(61
KLK6 1,5E-2
amostras)
SERPINA3 1,7E-2
Linfonodo
Via de calicreínas KLK13 4,0E-15
negativo KLK7 2,8E-5
(20
KLK6 1,5E-2
amostras)
SERPINA3 1,7E-2
Tabela Whitfield 2 (ciclo celular) PCNA 1,6E-2
Protein binding (GO5515) FOSB 4,1E-31
KLK6 5,7E-18
AREG 1,3E-11
CCL20 4,0E-8
EFNB2 9,1E-8
IL1B 7,5E-5
MYC 2,0E-04
MCM2 2,0E-4
INHBA 7,0E-3
EGFR 1,4E-2
AKT1 2,1E-2
Regulação de apoptose (GO42981) SPHK1 9,0E-9
INHBA 9,0E-9
AKT1 9,7E-3
5.4.2 Aspectos moleculares do Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço em estágios iniciais e avançados
Com o objetivo de estudar o perfil de expressão gênica de tumores
em estágios inicial e avançado, foram comparadas 10 amostras de
carcinoma epidermóide de cavidade oral e orofaringe pT1 ou pT2 N0
(estágio inicial) e 45 amostras pT3 ou pT4 N+ (estágio avançado). Não
57
foram identificados genes diferencialmente expressos com p-valor corrigido
menor que 0,05. A análise de vias e módulos funcionais identificou
alterações em tumores em estágios iniciais.
Tabela 14 - Vias e módulos funcionais alterados em amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço pT1 ou pT2 que não apresentam
metástases linfonodais no exame anátomo-patológico do material obtido do
esvaziamento cervical (verde representa módulo inativo e vermelho, ativo).
Grupo Módulo gene p-valor
Tumores Angiogênese (GO1525) SPHK1 2,3E-3
em Migração do leucócito transendotelial (KEGG) MMP9 5,8E-5
estágios
ACTN1 1,0E-3
iniciais
PIK3R3 3,5E-2
(11
Regulação de crescimento celular (GO1558) SPHK1 2,3E-3
amostras)
Via das calicreínas KLK13 1,2E-10
KLK7 6,2E-4
KLK6 3,3E-2
Metabolismo de nicotina e nicotinamida (KEGG) NT5E 4,5E-4
5.4.3 Aspectos moleculares do Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço com recidivas
As recidivas são as principais responsáveis pela mortalidade nos
pacientes portadores de CECP tratados com intenção curativa. A ausência
de acometimento linfonodal é um forte indicador de sobrevivência (LE
TOURNEAU et al. 2008), porém, muitas vezes, pacientes com prognóstico
reservado em função da detecção de doença em linfonodos, evoluem bem,
sem apresentar recorrências. Assim, para identificar marcadores que
possam diferenciar pacientes pN+ de bom ou mau prognóstico, foram
comparadas 20 amostras de paciente com CE de cavidade oral, orofaringe,
hipofaringe e laringe, submetidos a esvaziamento cervical, com
58
acometimento linfonodal, margens livres, tratados com radioterapia
adjuvante e que apresentaram recidivas e 27 amostras de pacientes com
mesmo tratamento mas que, ao contrário do prognóstico mais reservado,
não apresentaram recidivas no período de dois anos.
A comparação de casos com ou sem recidiva independente do status
linfonodal também foi realizada utilizando a mesma abordagem e constitui o
Projeto de Mestrado de Camila Morais Melo, em andamento na Fundação
Antônio Prudente. Nesse trabalho, foi destacado o gene EGLN3, que
também foi utilizado para PCR quantitativa no presente estudo.
Na análise de genes diferencialmente expressos, não foram
encontrados genes com p-valor menor que 0,05, utilizando o teste de
Wilcoxon e correção por FDR.
RICKMAN et al. (2008) descreveram uma assinatura preditora de
metástases em CECP. Os genes desta assinatura que se encontravam na
plataforma utilizada no presente estudo (156 genes) foram empregados na
construção de um agrupamento hierárquico não supervisionado (Figura 15),
os quais não se mostraram capazes de classificar as amostras de CECP
utilizadas segundo a ocorrência de recidivas.
Utilizou-se também a metodologia de vias e módulos funcionais
descrita por SEGAL et al. (2003) (Tabela 15). Dos módulos alterados, foram
selecionados genes para avaliação por PCR quantitativa (Tabela 17, item
5.4.5).
59
Figura 15 - Agrupamento hierárquico não supervisionado construído com os
156 genes da assinatura de metástases de RICKMAN et al. (2008) e
amostras de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço.
60
Tabela 15 - Vias e módulos funcionais alterados em amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço de pacientes com comprometimento
linfonodal e recidivas após tratamento com cirurgia, esvaziamento cervical e
radioterapia adjuvante (verde representa módulo inativo e vermelho, ativo).
Grupo Módulo Gene p-valor
Com
Sinalização célula-célula (GO7267) IL1F9 4,1E-20
recidiva AREG 5,5E-15
(20
INHBA 1,5E-12
amostras)
BST2 7,6E-10
CCL20 2,1E-3
KLK6 8,9E-3
Sem
Sinalização célula-célula (GO7267) IL1F9 4,1E-20
recidiva AREG 5,5E-15
(27
INHBA 1,5E-12
amostras)
BST2 7,6E-10
CCL20 2,1E-3
KLK6 8,9E-3
Região extracelular (GO5576) INHBA 6,6E-15
POSTN 3,0E-9
KLK13 1,9E-6
AREG 2,4E-6
MMP13 7,3E-4
KLK6 1,6E-2
Assinatura de metástase COL6A3 5,5E-6
COL6A3 1,75E-3
PLAU 1,9E-3
Via de sinalização de TGF-β (KEGG) INHBA 9,1E-11
5.4.4 Aspectos moleculares de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço “localizado” e “colonizador”
O acometimento linfonodal e as recidivas regionais se tratam do
mesmo fenômeno, ou seja, capacidade da célula tumoral de alcançar,
sobreviver e se multiplicar nos linfonodos cervicais. A diferença de
nomenclatura decorre apenas da época em que ocorrem: antes ou após a
61
cirurgia. O comprometimento dos linfonodos pelo tumor é também um
indicador de maior probabilidade de metástases a distância. Dessa forma,
para comparar os tumores que se mostraram mais indolentes e os mais
agressivos em qualquer tempo, foram comparadas amostras de CE de
cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe considerado “localizado” (sem
acometimento linfonodal, sem tratamento por radioterapia adjuvante e sem
recidivas; 9 amostras) e “colonizador” (com acometimento linfonodal e/ou
recidiva; 85 amostras). Mais uma vez, não foram encontrados genes
diferencialmente expressos (p-valor menor que 0,05). Na análise de vias e
módulos funcionais, os tumores localizados apresentaram vários módulos
alterados.
Tabela 16 - Vias e módulos funcionais alterados em amostras de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço localizadas (sem comprometimento
linfonodal, sem tratamento por radioterapia adjuvante e sem recidivas)
(verde representa módulo inativo e vermelho, ativo). Versão resumida, vide
versão completa em anexo.
Grupo Módulo Gene p-valor
Tumores Espaço extracelular (GO5615) MMP9 1,3E-5
localizados CCL20 3,7E-4
(9 amostras)
MMP13 2,8E-2
Matriz extracelular (GO5578) POSTN 3,7E-12
LAMA4 7,8E-4
Protein binding (GO5515) FOSB 1,1E-19
KLK6 1,7E-11
AREG 1,3E-10
EFNB2 2,7E-6
NTRK2 3,7E-4
IL1B 3,7E-4
MYC 5,0E-4
62
Cont/ Tabela 16
CCL18 5,8E-4
PAWR 9,9E-4
MYH10 1,4E-3
GRB7 1,7E-3
EGFR 2,2E-3
GPR56 2,8E-3
Ciclo celular (GeneDeck) MCM2 3,3E-7
CDKN1B 3,1E-6
Tabela Whitfield 2 (ciclo celular) CCNB2 4,1E-6
Assinatura de metástase S100P 6,6E-9
CYR61 2,8E-7
CCL18 2,8E-7
PLAU 1,6E-2
Moléculas de adesão celular CYR61 1,7E-6
(KEGG)
Adesão focal (KEGG) COL1A2 1,0E-29
ACTN1 3,4E-4
LAMB1 9,6E-4
VAV3 4,7E-2
Adesão focal (GeneDeck) THBS4 4,6E-27
COL6A3 1,9E-21
LAMA4 5,3E-6
VWF 1,9E-2
TTN 2,4E-2
Degradação de nitrobenzeno (KEGG) PRMT2 2,7E-7
Junção intercelular (GO5911) EVPL 3,2E-5
Via das calicreínas KLK13 2,2E-12
KLK7 8,9E-5
KLK6 3,9E-3
63
5.4.5 PCR quantitativa
Foi calculada a expressão relativa dos genes pertencentes a módulos
alterados em amostras de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço com
acometimento linfonodal (item 5.4.1) e com recidivas (item 5.4.3). A
expressão relativas nos grupos estudados foi comparada através do teste de
Mann-Whitney (Tabela 17).
Observa-se que, apesar de muitos não apresentarem valores
significativos na comparação direta utilizando dados de microarray (teste de
Wilcoxon), alguns genes em cada módulo foram capazes de distinguir os
grupos estudados através PCR quantitativa: BST2 e EGLN3, em relação às
recidivas pós-tratamento(Figura 16), e CCL20, INHBA e EGFR em relação
ao acometimento linfonodal (Figura 17).
p-valor= 0,0142
Rec- Rec+
0
2
4
6
expressão relativa / BST2
p-valor= 0,0167
Rec- Rec+
0
2
4
6
8
expressão relativa / EGLN3
Legenda - A - Expressão relativa do gene BST2. B - Expressão relativa do gene EGLN3.
Figura 16 - Expressão gênica de amostras de Carcinoma Epidermóide de
Cabeça e Pescoço com ou sem recidivas avaliada por PCR quantitativa.
A
B
64
p-valor= 0,0142
N0 N+
0
10
50
60
expressão relativa / INHBA
p-valor= 0,009
N0 N+
5
15
90
100
110
expressão relativa / CCL20
p-valor= 0,006
N0 N+
0
1
2
3
4
5
expressão relativa / EGFR
Legenda - A - Expressão relativa do gene CCL20. B - Expressão relativa do gene EGFR. C
- Expressão relativa do gene INHBA. N+ e N0 representam casos com e sem
comprometimento linfonodal, respectivamente.
Figura 17 - Expressão gênica de amostras de Carcinoma Epidermóide de
Cabeça e Pescoço com ou sem comprometimento linfonodal avaliada por
PCR quantitativa.
A
B
C
65
Tabela 17 - Resumo dos resultados obtidos com a análise de dados de microarray e de PCR quantitativa dos genes
pertencentes a vias e módulos alterados em Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço com comprometimento
linfonodal e com recidivas.
Microarray PCR quantitativa
Comparação Gene Módulos funcionais, p-valor teste de Wilcoxon, p-valor fold teste de Mann-Whitney, p-valor fold
CCL20 4,0E-8 0,17 1,32 0,009 3,40
EGFR 0,0140 0,10 1,23 0,006 1,70
INHBA 9,0E-9 0,41 1,20 0,014 2,05
MCM2 0,0002 7,0E-4 1,64 0,22 1,36
SERPINA3 0,0170 0,007 -1,84 0,07 -2,43
AKT1 0,0097 0,19 - 0,13 -
AREG 1,3E-11 0,92 - 0,41 -
FOSB 4,1E-31 0,17 - 0,59 -
IL1B 0,0001 0,31 - 0,07 -
KLK6 5,7E-18 0,34 - 0,45 -
MYC 0,0002 0,89 - 0,17 -
Linfonodo
Positivo
(61 amostras)
x
Linfonodo
Negativo
(20 amostras)
PCNA 0,0160 0,62 - 0,43 -
BST2 7,6E-10 0,048 -1,67 0,0142 -1,70
EGLN3 3,2E-03 1,67 0,0167 2,49
IL1F9 4,1E-20 0,051 1,80 0,061 1,91
POSTN 3,0E-9 4,9E-3 2,20 0,058 2,47
PLAU 0,0019 0,046 1,58 0,11 1,64
AREG 5,5E-15 0,41 - 0,67 -
CCL20 0,0021 0,15 - 0,19 -
INHBA 6,6E-15 0,41 - 0,55 -
Com Recidiva
(20 amostras)
x
Sem Recidiva
(27 amostras)
KLK6 0,0089 0,63 - 0,76 -
66
6 DISCUSSÃO
Em cabeça e pescoço, o epitélio estratificado escamoso constitui o
revestimento contínuo que recobre as vias aerodigestivas superiores e sua
transformação origina o carcinoma epidermóide. Apesar de serem
consideradas doenças clinicamente distintas, os CE de diferentes
topografias de CP apresentam semelhanças como a morfologia e etiologia.
Atualmente, a escolha do tratamento do CECP leva em conta
principalmente achados histo-patológicos e radiográficos, mas esse sistema
pode falhar em estratificar os pacientes de acordo com o risco de
recorrências (DE BREE et al. 2000), já que, de forma geral, o carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço apresenta respostas bastante
heterogêneas.
Portanto, estudos moleculares representam uma oportunidade de
direcionar o tratamento e aperfeiçoar o seguimento, a fim de diminuir a
mortalidade e morbidade em pacientes de CECP.
Com o objetivo de estudar aspectos moleculares do carcinoma
epidermóide de diferentes topografias de cabeça e pescoço e identificar
alterações relacionadas ao comportamento desses tumores, foi analisado o
perfil de expressão gênica de amostras de CECP, principalmente no âmbito
de vias metabólicas e módulos funcionais.
67
6.1 ANÁLISE DOS DADOS CLÍNICOS E ANÁTOMO-
PATOLÓGICOS DE PACIENTES DE CECP
Inicialmente foram realizadas análises para avaliar a homogeneidade
dos dados clínicos frente às cinco topografias de CP. A distribuição dos
dados clínicos e anátomo-patológicos mostrou-se homogênea nas cinco
topografias de CP (CNSP, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe),
com algumas exceções (Tabela 5). Fica assim assegurado que ao dividir e
comparar estas amostras segundo esses critérios (por exemplo, com ou sem
recidivas), estão sendo encontradas as diferenças relativas às recidivas e
não características de um ou outra topografia que apresentasse maior ou
menor frequência de recidivas.
Verificou-se, entretanto, a ocorrência de menor frequência de
comprometimento linfonodal nos casos de CE em CNSP (Figura 8). Essa
distribuição heterogênea era esperada pois os tumores dessa topografia têm
menor probabilidade de desenvolver metástases linfonodais. Dessa forma, a
fim de resguardar a confiabilidade das análises, as sete amostras de CNSP
não foram utilizadas em todas as comparações do item 5.4.
6.2 ANÁLISES DE QUALIDADE DOS DADOS DE MICROARRAY
Na análise da qualidade dos dados de microarray, foi visto que, tanto
na manufatura das lâminas quanto na reprodutibilidade da hibridização das
duplicatas, os experimentos de microarray apresentaram dados confiáveis,
68
sendo possível prosseguir com as análises que visam estudar a biologia do
tumor (Figuras 9 e 10).
6.3 ASPECTOS MOLECULARES DO CARCINOMA
EPIDERMÓIDE EM DIFERENTES TOPOGRAFIAS
6.3.1 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço
O perfil de expressão gênica de amostras de carcinoma epidermóide
de cavidade nasal e seios paranasais, cavidade oral, orofaringe, hipofaringe
e laringe foi obtido através da técnica de microarray e os dados foram
empregados para estudar o CE em diferentes topografias.
Segundo o agrupamento hierárquico não supervisionado das
amostras de CECP, não foi possível observar diferenças marcantes entre as
cinco topografias ou outras variáveis clínico e anátomo-patológicas, pelo
menos com base nos genes representados (Figura 11). Provavelmente o
método mais adequado no sentido de proporcionar uma maior cobertura do
transcriptoma seja o emprego de capture arrays que possuem todos os
éxons conhecidos, seguido de sequenciamento em larga escala de terceira
geração (LEDFORD 2008), mas que ainda é muito dispendioso.
Foram analisados perfis de expressão já publicados capazes de
classificar molecularmente grupos de amostras. Com o perfil de expressão
descrito por CHUNG et al. (2004) não foi observada a classificação das
amostras em grupos com assinatura de EGF, TEM, etc. (Figura 12),
69
possivelmente porque a lâmina utilizada contém apenas 67 do 582 genes
descritos ou devido a diferenças metodológicas experimentais e
matemáticas. Outros trabalhos observaram que amostras de CECP se
separam em subgrupos que exibiam perfil de expressão genes implicados
em invasão, sinalização de Ras, interação células-MEC e angiogênese
(GINOS et al. 2004), sinalização de TGF-β, moléculas de transporte,
metabolismo de oxigênio e processamento de RNA e tradução (BELBIN et
al. 2002) ou características como pT3-4 N+ (WARNER et al. 2004) e
diferenciação (RICKMAN et al. 2008). Analisando dados de microarray de
CECP, ROEPMAN et al. (2006) concluíram que é possível determinar várias
assinaturas distintas capazes de classificar amostras da mesma maneira.
Dessa forma, as assinaturas moleculares devem ser interpretadas com
precaução pois elas se aplicam às amostras utilizadas na construção da
assinatura, e não necessariamente se aplicam a outras amostras.
Analisando as amostras de carcinoma epidermóide de diferentes
topografias de cabeça e pescoço através da expressão de genes
individualmente, apenas a comparação Cavidade Oral versus Orofaringe
apresentou genes diferencialmente expressos (Tabelas 6 e 7). Nessa
comparação foram identificados 6 genes diferencialmente expressos, isto é,
aproximadamente 4.600 genes não são diferencialmente expressos entre
nenhuma das topografias. Isso sugere, em relação ao genes estudados, que
o carcinoma epidermóide de diferentes topografias de cabeça e pescoço não
apresenta grandes diferenças de expressão gênica. O mesmo resultado não
foi encontrado por REIS et al. (2005), que identificou 248 genes com
70
expressão diferencial entre cavidade oral, faringe e laringe através do estudo
in silico de ORESTES.
A análise de vias e módulos funcionais nas diferentes topografias de
CECP mostrou a ativação ou inativação de 20 de um total de 147 módulos
estudados (Tabela 8). As amostras de cavidade nasal e seios paranasais
parecem apresentar um perfil diferenciado dos demais pois concentra a
maioria das alterações: apresentou 11 dos 20 módulos alterados. Dentre
esses, Resposta ao stress, está inativo em CNSP e ativo em Hipofaringe; e
Região extracelular está inativo em CNSP e ativo em Cavidade Oral. O
módulo de Resposta ao stress, inativo em CNSP e ativo em Hipofaringe,
corresponde às alterações de expressão gênica, produção e secreção de
fatores como IL1B e quimiocinas. O módulo de Região extracelular
representa características marcantes em câncer pois possui vários genes
relacionados à progressão tumoral, como remodelamento de matriz
extracelular (MMP9) e proliferação celular (AREG ou anfirregulina). É
possível que a inativação destes módulos funcionais contribuam para a
menor capacidade do carcinoma epidermóide de CNSP de desenvolver
metástases linfonodais.
6.3.2 Comparação do carcinoma epidermóide das cinco topografias de
cabeça e pescoço utilizando carcinoma epidermóide de esôfago,
pulmão e colo de útero
Na tentativa de identificar outras maneiras de classificar o carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço, este foi comparado ao carcinoma
71
epidermóide de outras topografias. Nesse caso, as amostras de cabeça e
pescoço se dividem nitidamente em dois grupos, sugerindo que a topografia
onde se origina o tumor não é o principal fator que caracteriza
molecularmente o CECP (Figura 13). Uma parte das amostras de cabeça e
pescoço, o braço 1, se assemelha mais a um grupo de amostras de CE de
esôfago, pulmão e colo de útero do que às outras amostras de CP (braço 2),
sugerindo vias de sinalização comuns aos carcinomas epidermóides.
Ao comparar as amostras presentes nos dois “braços” de CECP,
observa-se que o braço 1 é caracterizado por uma maior expressão de
genes e ativação de módulos relacionados a sobrevivência, proliferação,
motilidade e invasão celular, como AKT1, AREG, EGFR, ITGA5, MMP9,
MYC e SPHK1, entre outros (Tabelas 11 e 12).
MMPs ou metalo-proteases constituem uma família de enzimas
proteolíticas dependentes de zinco e cálcio. MMP9 participa na degradação
de MEC em processos normais, como desenvolvimento embrionário e
remodelamento de tecidos, ou em processos patológicos, como artrite e
câncer. MMP9 é particularmente importante em neoplasias epiteliais porque
degrada Colágeno tipo IV, principal componente da membrana basal
(revisado em DERYUGINA e QUIGLEY 2006). KLK6 é uma serino-protease
que cliva in vitro fibronectina, laminina e vitronectina (GHOSH et al. 2004),
fibrinogênio e colágeno tipo I e IV (MAGKLARA et al. 2003), além de
desmogleína 1 (BORGOÑO et al. 2007) e portanto pode ter um papel em
remodelamento de matriz.
72
ITGA5 codifica para uma proteína da família das integrinas. A
integrina-α5 se liga à integrina-β1 para formar um receptor de fibronectina,
mediando adesão e interações célula-MEC (HUVENEERS et al. 2008).
EGFR é um receptor de membrana tirosina-quinase que ativa as vias
de MAPK, PI3K e Jak/STAT, levando à proliferação, sobrevivência celular,
invasão e metástases. Mutações nesses genes não são frequentes em
CECP, mas sua amplificação e/ou maior expressão estão associadas a
menor sobrevida livre de doença e pior prognóstico (revisado em CHANG e
CALIFANO 2008). AREG, junto com TGF-α, são considerados os mais
importantes ligantes endógenos de EGFR em CECP enquanto EGF tem
menor importância (HARRIS et al. 2003; ZHANG et al. 2004). MYC codifica
uma fosfoproteína nuclear, um fator de transcrição que atua na progressão
do ciclo celular, apoptose e transformação celular
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene, MAGLOTT et al. 2005).
AKT/PKB é ativada através de PI3K, o qual pode ser ativado por
EGFR. AKT fosforila e inativa componentes da maquinaria de apoptose,
além de regular proliferação, invasão e expressão de proteínas relacionadas
à hipóxia (para revisão, vide BUSSINK et al. 2008). SPHK1 é uma quinase
que fosforila esfingosina em esfingosina-1-fosfato (S1P ou sphingosine-1-
phosphate) (TSUKAHARA et al. 2002). Além de seu papel estrutural na
membrana celular, S1P atua como efetor na transdução de sinal em vários
aspectos ligados à progressão tumoral, como ativação de PI3K (LE SCOLAN
et al. 2005).
73
6.4 ASPECTOS MOLECULARES DO COMPORTAMENTO DE
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE CABEÇA E PESCOÇO
6.4.1 Aspectos moleculares da metástase linfonodal de Carcinoma
Epidermóide de Cabeça e Pescoço
A detecção de linfonodos cervicais acometidos pelo tumor é um passo
importante no estadiamento e escolha do tratamento de pacientes de CECP.
Pacientes com metástases linfonodais detectadas no exame clínico podem
ser tratados com esvaziamento cervical. Após o exame anatomopatológicos,
se o comprometimento dos linfonodos é confirmado, o paciente é
encaminhado para radioterapia adjuvante. Porém, o diagnóstico tanto de
metástases linfonodais quanto de linfonodos livres de tumor apresenta
dificuldades (KHAFIF et al. 1991; JONES et al. 1993; HIRATSUKA et al.
1997; WOOLGAR 1999).
Portanto, visando identificar alterações de expressão gênica em
amostras com acometimento linfonodal, os dados de expressão gênica de
amostras de pacientes de carcinoma epidermóide de cavidade oral e
orofaringe com ou sem linfonodos acometimentos pelo tumor foram
comparados utilizando diferentes métodos de análise.
Ao comparar os casos de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço que apresentam ou não acometimento linfonodal, não foram
encontrados genes diferencialmente expressos. Outra abordagem muito
empregada em microarray são as assinaturas moleculares. Em vários tipos
de tumor, as assinaturas moleculares estão ainda em desenvolvimento e
74
apesar dos possíveis benefícios, essas ferramentas estão sendo analisadas
de forma crítica (RANSOHOFF 2004; MIKLOS e MALEZKA 2004; MICHIELS
et al. 2005; REID et al. 2005). No presente estudo, os 109 genes da
assinatura de metástase linfonodal de ROEPMAN et al. (2005, 2006) não
discriminaram os casos N0 e N+ (Figura 14). No estudo de 2006, o autor
demonstra que usando grupos de 100 dos 825 genes preditores, obtinha
acurácia de 80 a 90% na predição de metástases linfonodais. Novamente,
tais diferenças provavelmente se devem às diferenças metodológicas ou
mesmo à falta de reprodutibilidade das assinaturas moleculares.
Utilizando a estratégia de vias e módulos funcionais para comparar
amostras N0 e N+, observa-se a ativação do módulo da Via das calicreínas
em linfonodos negativos e sua inativação em linfonodos positivos (Tabela
13). KLK13 e KLK7 degradam os principais componentes de MEC in vitro
(KAPADIA et al. 2004) e proteínas dos desmossomos corneodesmosina e
desmocolina 1 (CAUBET et al. 2004), respectivamente. A maioria dos
trabalhos descrevem calicreínas como indicadores de comportamento
agressivo em vários tumores. Em Cabeça e Pescoço, entretanto, já foram
descritas a expressão diminuída do mRNA de KLK7 em uma assinatura
molecular preditora de metástases linfonodais (CHUNG et al. 2004) e maior
expressão de KLK13 em casos N0 (TORUNER et al. 2004).
Neste módulo, há alterações também em SERPINA3 ou α-1-anti-
quimiotripsina, um inibidor de serino-proteases. A ativação de SERPINA3
pode conferir menor agressividade aos tumores sem acometimento
75
linfonodal pois está relacionada à baixa probabilidade de metástases ósseas
em câncer de próstata (KIKUCHI et al. 2006).
KLK6 está presente no módulo das calicreínas e também no de
Protein binding, onde apresenta maior concordância com o comportamento
do módulo (p-valor 1,5E-2 no módulo de calicreínas e 1,7E-18 no módulo de
Protein binding). KLK6 parece ter um papel no perfil invasivo em câncer
gástrico (NAGAHARA et al. 2005). Em carcinoma de cólon, KLK6 participa
na migração celular através da ativação das vias de k-Ras e MAPK
(HENKHAUS et al. 2008) e está mais expresso em amostras de pacientes
com metástase hepáticas (OGAWA et al. 2005).
O módulo Protein binding, inativo em amostras N0, apresenta genes
relacionados à progressão tumoral, como AREG (anfirregulina), EGFR e
MYC, e mediadores inflamatórios, como a quimiocina CCL20 (macrophage
inflammatory protein-3α) e a citocina IL1B. Alguns mediadores infamatórios
também podem contribuir para a evolução do tumor. Por exemplo, em
tumores hepáticos, a expressão aumentada de CCL20 e seu receptor CCR6
estão associadas à progressão tumoral (RUBIE et al. 2006). IL-1β é uma
citocina secretada após stress ou injúrias, promovendo sobrevivência e
levando à secreção de outras citocinas pró-inflamatórias e angiogênese
(AURON 1998).
Nessa comparação, o módulo de Regulação da apoptose, inativo em
tumores linfonodo negativo, é representado pelos genes SPHK1, AKT1 e
INHBA. A menor expressão de SPHK1 em linhagem de câncer de mama
MCF-7 reduziu o crescimento estimulado por EGF e soro, além de aumentar
76
a sensitividade a doxorrubicina (SARKAR et al. 2005), pois a atividade de
SPHK1 pode conferir sobrevivência. Em amostras de câncer de mama, a
alta expressão de SPHK1 está relacionada a pior prognóstico
(RUCKHÄBERLE et al. 2007). Em relação a metástases em linfonodos, LIM
et al. (2005) observou correlação positiva entre a expressão de pAkt e
comprometimento linfonodal. Em ensaios clínicos, a expressão de Akt
ativado está fortemente associada à falha no tratamento cirúrgico e
radioterápico (LIM et al. 2005; MASSARELLI et al. 2005). INHBA codifica
para as subunidades do homodímero activina A (duas subunidades de
INHBA ligadas), que leva à agressividade tumoral em CE de esôfago
(YOSHINAGA et al. 2008).
Em suma, os dados indicam que a biologia dos CECP N0 é
caracterizada principalmente pela inativação de grupos de genes que
participam de vias de proliferação e sobrevivência celular. A inativação de
genes que conferem sobrevivência parece ser uma fator que não
proporciona a disseminação ou sobrevivência das células tumorais nos
linfonodos, ressaltando que a apoptose é um processo que regula a
formação de metástases (revisado em MEHLEN e PUISIEUX 2006).
CCL20, INHBA e EGFR são promissores indicadores de
acometimento linfonodal utilizando PCR quantitativa (Tabela 17 e Figura 16).
Em microarray, os três genes participam da assinatura de metástase
linfonodal de O’DONNELL et al. (2005). EGFR foi muitas vezes relacionado
a pior prognóstico ou menor sobrevida, mas seu poder preditor de
metástases linfonodais ainda não está bem documentado (revisado em
77
CHANG e CALIFANO 2008). Em relação a CCL20 e INHBA, há poucos
relatos destes como marcadores tumorais. A expressão protéica sérica de
CCL20 era maior em pacientes com carcinoma de nasofaringe avançado ou
recorrente (CHANG et al. 2008) e pacientes de CECP com maior expressão
gênica de INHBA tiveram menor sobrevida livre de doença (SHIMIZU et al.
2007).
6.4.2 Aspectos moleculares de Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço em estágios iniciais e avançados
Com o objetivo de estudar o perfil de ativação de vias e módulos
funcionais em tumores em estágios inicial e avançado, foram comparadas
amostras de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço T1-2 N0 e T3-4
N+ (Tabela 14). Nessa comparação, os módulos de Angiogênese e
Regulação do crescimento celular estão inativos em tumores iniciais, sendo
representados pelo gene SPHK1. Como já citado, a quinase codificada por
SPHK1 produz fatores relacionados a vários aspectos ligados à progressão
tumoral, como proliferação e sobrevivência celular.
Nos tumores iniciais, o módulo de Migração do leucócito
transendotelial está inativo e contém PIK3R3 e MMP9. Essa via mostra,
entre outras coisas, a ativação de MMPs através de PI3K em células
endoteliais após interação com leucócitos. PIK3R3, uma subunidade
regulatória de PI3K, está amplificado e mais expresso (mRNA e proteína) em
câncer de ovário e o bloqueio de sua expressão por RNAi aumenta a taxa de
apoptose na respectiva linhagem (ZHANG et al. 2007).
78
A expressão de MMP9 já foi bastante descrita em CECP. A maior
expressão ou atividade de MMP9 foi significativamente relacionada à
expressão de VEGF (RIEDEL et al. 2000), maior densidade de microvasos
(FRANCHI et al. 2002), invasão (KURAHARA et al. 1999), recidivas
regionais (KATAYAMA et al. 2004), metástases (HONG et al. 2000) e menor
sobrevida em CECP (RIEDEL et al. 2000; YORIOKA et al. 2002). Além
disso, já foi demonstrada relação entre níveis elevados de MMP9 detectada
no plasma de pacientes com CECP e menor sobrevida livre de doença e
dessa forma, MMP9 poderia se tornar um marcador sérico de prognóstico
(RUOKOLAINEN et al. 2005). A inativação de MMP9 parece ser um
mecanismo importante de impedir a progressão tumoral, já testado em
modelo animal (KATORI et al. 2002; YAMASHITA et al. 2003).
Portanto, além da via de sobrevivência celular, a inativação de genes
de remodelamento de MEC parece ser um fator importante que impede o
crescimento e a progressão dos tumores “iniciais”.
6.4.3 Aspectos moleculares do Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço com recidivas
A busca de marcadores de recidivas é um processo complexo pois
envolve o tipo de tratamento, tempo de seguimento, além da capacidade do
tumor de invadir tecidos e de sobreviver fora do sítio primário. Por exemplo,
RICKMAN et al. (2008) descreveu uma assinatura de metástases mas os
156 genes que se encontravam representados na lâmina de um total de 729
genes encontrados pelo autor não tiveram o mesmo poder preditor nas
79
amostras utilizadas neste estudo (Figura 15). BRAAKHUIS et al. (2006)
comparou amostras de CECP com comprometimento linfonodal sem
qualquer recidiva e com comprometimento linfonodal e metástase a distância
exclusivamente (sem recorrência locorregional) e concluiu que expressão
gênica não tem poder preditor nesse caso, pois em CECP os linfonodos são
necessários para disseminação hematológica.
Através do emprego do método de vias e módulos alterados, observa-
se que no grupo de casos que apresentou recidiva, o módulo de Sinalização
célula-célula está ativo e inativo no grupo sem recidivas (Tabela 15). Esse
módulo se refere a qualquer processo de transferência de informação de
uma célula a outra e contém principalmente genes de mediadores
inflamatórios (IL1F9 e CCL20) e ligantes de receptores (AREG).
IL1F9 está localizado no mesmo locus que IL1B (NICKLIN et al.
2002), sugerindo que surgiram do mesmo gene ancestral e foram duplicados
posteriormente. IFN-γ, TNF-α e IL-1β estimulam a expressão desta citocina
em queratinócitos (MAGLOTT et al. 2005).
BST2 (bone marrow stromal cell antigen 2) é um fator presente em
células estromais de medula óssea que participam no desenvolvimento de
células B mas sua função não é ainda conhecida em detalhes (MAGLOTT et
al. 2005). Em cabeça e pescoço, BST2 está mais expresso em relação ao
tecido normal (SILVEIRA et al. 2008). Segundo dados se microarray e de
PCR quantitativa (Tabela 17), BST2 está mais expresso nos casos sem
recidiva, porém seu significado não está esclarecido.
80
EGLN3 foi incluído nos experimentos de PCR quantitativa e está mais
expresso nos casos com recidiva. O gene codifica para a proteína PHD3,
que em normóxia marca HIF-1α para degradação via proteassomo (BRUICK
e MCKNIGHT 2001). Entretanto, durante hipóxia crônica, situação que pode
ocorrer em tumores, PHD3 está mais expressa e apresenta maior atividade.
Nesse caso, a degradação massiva de HIF-1α protege as células contra
morte por necrose, porém o mecanismo responsável não está esclarecido
(GINOUVÈS et al. 2008). Portanto, este gene pode ser um importante
indicador de resistência à radioterapia já que permite as células
sobreviverem em hipóxia por períodos prolongados.
Nos casos sem recidivas, o módulo Região extracelular está inativo e
contém o gene POSTN, também conhecido como periostina ou fator
específico de osteoblastos. POSTN é expressa pelos fibrosblastos de câncer
de cólon (KIKUCHI et al. 2008) e por células estromais de melanoma
(TILMAN et al. 2007). Periostina pode atuar na adesão focal através de sua
ligação à integrina αvβ3 (GILLAN et al. 2002), a qual ativa Akt e promove
sobrevivência em células tumorais e endoteliais (BAO et al. 2004). Periostina
pode ter um papel importante na formação de metástases. Durante esse
processo, células tumorais epiteliais adquirem um fenótipo semelhante a
fibroblastos, processo conhecido como transição epitelial-mesenquimal
(TEM), o qual contribui para o comportamento agressivo dos tumores. YAN e
SHAO (2006) descreveram que a expressão de periostina em linhagem
293T tornou o fenótipo da linhagem semelhante à TEM, com aumento de
migração, invasão e adesão celular. Em linhagem celular de CECP, POSTN
81
promove invasão, crescimento independente de ancoragem além de
metástases espontâneas em linfonodos cervicais e pulmão em modelo
murino. Em amostras de CECP, a intensidade de expressão de POSTN se
correlacionou à invasividade (KUDO et al. 2006). POSTN também é um fator
relacionado à angiogênese. Em CE oral, a densidade de vasos é maior em
casos positivos para periostina e in vitro periostina recombinante aumenta a
formação de vasos de maneira dose-dependente. Assim, sugere-se que
periostina promove invasão e angiogênese em CE oral e pode ser um forte
marcador de metástases nesse pacientes (SIRIWARDENA et al. 2006).
Assim, é possível também que os tumores que não apresentaram recidivas
possuam uma menor interação com o estroma tumoral.
Utilizando o método de análise de vias e módulos funcionais e PCR
quantitativa, foram identificados genes que se mostram potenciais
marcadores do desenvolvimento de recidivas: BST2 e EGLN3 (Tabela 17 e
Figura 17). Esses genes foram identificados também em trabalhos que
demonstraram associação com acometimento linfonodal (O’DONNELL et al.
2005) e profundidade de infiltração (TORUNER et al. 2004), mas não com a
ocorrência de recidivas pós-tratamento.
6.4.4 Aspectos moleculares do Carcinoma Epidermóide de Cabeça e
Pescoço localizado e colonizador
Os carcinomas são geralmente caracterizados pela invasão do tecido
conjuntivo vizinho e migração das células tumorais para formar metástases
em outros sítios. Esse processo requer alterações na interação célula-célula
82
e célula-MEC. Como as moléculas de adesão celular têm um papel central
nessa interação, elas são muito estudadas no processo de invasão e
metástases (revisado em ZIOBER et al. 2006).
Ao comparar amostras de CECP “localizado” (sem comprometimento
linfonodal, sem tratamento com radioterapia e sem recidivas) e “colonizador”
(com comprometimento linfonodal e/ou recidivas), observa-se em tumores
“localizados” ocorre a inativação de módulos como Metaloendopeptidase,
Espaço extracelular, Matriz extracelular, Protein binding, Ciclo celular,
Moléculas de adesão celular, Adesão focal e Assinatura de metástases
(Tabela 16). Sabe-se que em tecidos epiteliais, moléculas da MEC como
colágenos e lamininas atuam na adesão célula-MEC ligando-se aos
receptores da família das integrinas,
(www.genome.jp/kegg/pathway/hsa/hsa04510.html). Assim, os dados
obtidos sugerem que a inativação deste conjunto de genes parece limitar a
capacidade de invadir e migrar para outros sítios.
6.4.5 Interação entre os genes e vias alterados
Utilizando o método de vias e módulos alterados para comparar as
amostras de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço segundo critérios
relacionados ao comportamento do tumor (metástases linfonodais, tamanho,
recidivas), foram identificados um conjunto de módulos/genes alterados,
alguns deles pouco estudados em CECP ou câncer de forma geral. Nos
estudos de expressão gênica já publicados em CECP, os genes
relacionados ao comprometimento linfonodal e metástases seriam
83
principalmente os ligados às junções oclusivas, integrinas, vias de
sinalização de cálcio, VEGF, p53, apresentação de antígenos, quimiocinas e
extravasamento de leucócitos (YU et al. 2008).
O cenário formado pelos módulos alterados no presente estudo
mostra que a biologia do CECP é caracterizadas por alterações
consideradas clássicas ou já bem descritas (alterações em EGFR, MMP9 e
PLAU) e também por alterações pouco estudadas nesse tumor (alterações
em CCL20, IL1F9, SPHK1, POSTN).
As alterações identificadas podem ocorrer tantos nos passos iniciais
da carcinogênese, com aumento da sinalização de proliferação epitelial
(EGFR, AREG) e sinalização antiapoptótica (PI3K, AKT), quanto mais
tardiamente, durante a progressão e disseminação tumoral, como aumento
de genes relacionados ao perfil metastático (MMP9, POSTN). Entretanto,
algumas amostras de perfil menos agressivo podem não apresentar tais
alterações. Por exemplo, o gene SERPINA3 está ativo em casos N0 e se
situa no locus 14q, que pode sofrer perda de heterozigosidade na
transformação da displasia para carcinoma in situ e invasivo (revisado em
HADDAD e SHIN 2008).
É interessante ressaltar que os resultados de diferentes comparações
parecem convergir no sentido de indicarem as mesmas alterações de genes
relacionadas aos grupos com perfil mais ou menos agressivo. ; e podem
representar características comuns aos carcinomas epidermóide de cabeça
e pescoço.
84
Segundo os dados da literatura citados e as vias apresentadas pelo
KEGG, podem ser apontados vários pontos de sinalização entre os genes
pertencentes a módulos alterado, mostrando a comunicação da célula
tumoral com o microambiente (Figura 18).
A expressão de EGFR e MMP9 aumenta em resposta à expressão de
POSTN em linhagem 293T (YAN e SHAO 2006). MMP9 é ativada por PLAU
e inibida por SERPINA3 (HAN et al. 2008). A ligação de CCL20 ao seu
receptor CCR6 acarreta na atividade de MMP, que libera moléculas de
anfirregulina (AREG) que estavam embebidas na MEC; a anfirregulina
liberada no meio extracelular se liga a EGFR, ativando toda a cascata
clássica de EGF: fosforilação das tirosinas, ativação da via de MAP quinase,
proliferação, migração e ativação do mediador de sobrevivência Akt/PKB
(GSCHWIND et al. 2003; KEATES et al. 2007).
Activina A ativa Akt e estimula a expressão gênica de VEGF em
carcinoma hepatocelular (WAGNER et al. 2004; DO et al. 2008). A via
PI3K/AKt também é ativada através de SPHK1, conferindo sobrevivência e
resistência à apoptose por um mecanismo envolvendo as vias de ERK1/2
(LE SCOLAN et al. 2005). SPHK1 pode ser ativado por IL-1β
(MASTRANDREA et al. 2005), que também desencadeia sinalização que
promove sobrevivência celular através de inibição e degradação de IκB (DI
DONATO et al. 1995), seguida de translocação de NF-κB para o núcleo
(SHIRAKAWA e MIZEL 1989; STYLIANOU et al. 1992). IL1F9 desencadeia
uma sinalização semelhante a IL-1, com ativação de NF-κB (TOWNE et al.
2004).
85
Dessa forma, as alterações identificadas pelo método de análise de
vias e módulos funcionais permitem uma melhor compreensão de uma
doença complexa e heterogênea. Esses conhecimentos abrem novas
perspectivas de pesquisas com ensaios funcionais para avaliar o papel
desses genes em modelos, além de identificar possíveis novos marcadores
moleculares e novos alvos terapêuticos.
86
Figura 18 - Genes pertencentes a vias e módulos alterados em Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço e suas
interações no contexto celular.
87
7 CONCLUSÃO
1. Referente ao objetivo 1
Ao comparar a expressão gênica de carcinoma epidermóide de
diferentes topografias de cabeça e pescoço, observa-se que, em relação aos
genes contidos na plataforma, a topografia não é o fator de maior impacto no
perfil de expressão gênica global ou de genes individualmente.
Os dados de expressão gênica global de carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço, esôfago, pulmão e colo de útero sugerem a classificação
de amostras de CECP em dois grupo, baseado na ativação de módulos
funcionais e expressão aumentada de genes relacionados à agressividade e
progressão tumoral, e não à topografia.
2. Referente ao objetivo 2
Em relação ao comportamento do carcinoma epidermóide de cabeça
e pescoço (comprometimento de linfonodos, tamanho do tumor e recidivas),
as alterações de expressão gênica nos tumores de perfil mais agressivo
foram identificados através da análise de vias e módulos funcionais. As
alterações identificadas indicam que o perfil agressivo em CECP está
relacionado à comunicação entre microambiente, MEC e a célula tumoral.
Essa sinalização pode promover a progressão tumoral através da inibição de
apoptose, estímulo de sobrevivência e proliferação celular, angiogênese,
invasão e mobilidade de células tumorais.
88
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Anexo 1
Anexo 2 – (Tabela 8) Vias e módulos funcionais alterados nas cinco topografias
de CECP (verde representa módulo inativo e vermelho, ativo).
Topografia Módulo Gene p-valor
Cavidade Via de calicreínas KLK13 2,4E-18
Nasal KLK7 2,8E-7
e Seios
KLK6 4,2E-5
Paranasais
Desenvolvimento (GO7275) FOSB 3,5E-50
KLK7 3,3E-37
KLK6 7,2E-31
POSTN 6,1E-28
BST2 8,0E-24
INHBA 4,2E-20
EVPL 3,5E-7
Desenvolvimento da epiderme (GO8544) KLK7 4,2E-10
EVPL 1,0E-2
Região extracelular (GO5576) POSTN 3,4E-25
KLK13 3,1E-17
INHBA 1,1E-14
KLK6 1,4E-13
AREG 8,9E-11
MMP9 1,0E-6
Espaço extracelular (GO5615) AREG 4,6E-10
MMP9 6,3E-9
CCL20 3,0E-4
MMP13 4,5E-2
Sinalização célula-célula (GO7267) IL1F9 3,7E-41
AREG 3,2E-23
KLK6 3,3E-19
INHBA 1,3E-17
BST2 2,6E-17
CCL18 1,5E-5
CCL20 2,2E-3
Atividade de fatores de crescimento AREG 3,1E-9
(GO8083) INHBA 3,9E-8
Interação MEC-receptor (GeneDeck) COL6A3 2,3E-22
COL6A3 9,5E-17
Ligantes de cálcio (GO5509) S100P 6,6E-11
Resposta ao stress (GO6950) IL1F9 5,9E-43
INHBA 3,9E-15
BST2 2,9E-14
KLK6 1,2E-11
CCL18 3,9E-8
CCL20 1,9E-6
IL1B 9,5E-3
Atividade de transdução de sinal (GO4871) AKT1 1,4E-3
Cavidade
Região extracelular (GO5576) POSTN 3,4E-25
Oral KLK13 3,1E-17
INHBA 1,1E-14
KLK6 1,4E-13
AREG 8,9E-11
MMP9 1,0E-6
Proteólise (GO6508) KLK13 1,4E-36
KLK6 1,1E-29
MMP9 5,7E-7
Via de IGF2/IGFBP4 MMP9 8,2E-2
PLAU 2,3E-10
Orofaringe
Via de Wnt (GeneDeck) MYC 2,6E-10
Via de sinalização de Toll-like Receptor (GeneDeck) IL1B 1,3E-2
Regulação de transcrição (GO6355) FOSB 1,5E-29
MYC 3,3E-11
Hipofaringe
Transporte para o núcleo (GO6606) FAF1 9,6E-3
Resposta ao stress (GO6950) IL1F9 5,9E-43
INHBA 3,9E-15
BST2 2,9E-14
KLK6 1,2E-11
CCL18 3,9E-8
CCL20 1,9E-6
IL1B 9,5E-3
Laringe
Ciclo celular GO7049 FOSB 3,6E-21
MYC 3,9E-17
INHBA 1,7E-5
Anexo 3
Anexo 4 – (Tabela 12) Vias e módulos funcionais alterados no braço 1 e braço
2 de CECP definidos no agrupamento hierárquico não supervisionado
construído com dados de expressão gênica de todos os genes representados
na lâmina de microarray para as amostras de CECP, de esôfago, pulmão e colo
de útero (verde representa módulos inativos e vermelho, ativo).
Grupo Via Gene p-valor
Ativo Sinalização célula-célula (GO7267) IL1F9 3,73E-41
no Braço 1 AREG 3,26E-23
e inativo
KLK6 3,38E-19
no Braço 2
INHBA 1,33E-17
BST2 2,65E-17
CCL18 1,54E-5
CCL20 2,21E-3
Atividade de fatores de crescimento (GO8083) AREG 3,11E-9
INHBA 3,93E-8
Proteólise (GO6508) KLK13 1,40E-36
KLK6 1,11E-29
MMP9 5,79E-7
Desenvolvimento (GO7275) FOSB 3,52E-50
KLK7 3,33E-37
KLK6 7,25E-31
POSTN 6,14E-28
BST2 8,03E-24
INHBA 4,25E-20
CYR61 2,48E-8
MTSS1 3,63E-8
FXYD5 1,01E-7
EVPL 3,53E-7
ETS2 2,59E-5
GPR56 1,47E-4
EMP1 3,17E-4
Resposta ao stress (GO6950) IL1F9 5,98E-43
INHBA 3,98E-15
BST2 2,90E-14
KLK6 1,23E-11
CCL18 3,93E-8
CCL20 1,98E-6
VWF 5,18E-3
IL1B 9,56E-3
AHSA1 9,68E-3
NR4A2 1,20E-2
CAPG 4,12E-2
Regulação da progressão do ciclo celular FOSB 1,47E-31
(GO0074) INHBA 7,26E-10
MYC 2,15E-5
SPHK1 5,50E-2
Parada do ciclo celular (GO7050) MYC 4,60E-3
INHBA 4,60E-3
Regulação negativa da progressão do ciclo celular MYC 4,60E-3
(GO45786) INHBA 4,60E-3
Braço 1
Metabolismo de prostaglandinas e luecotrienos PTGS1 3,85E-7
(GeneDeck)
Região extracelular (GO5576) POSTN 3,45E-25
KLK13 3,16E-17
INHBA 1,18E-14
KLK6 1,42E-13
AREG 8,90E-11
MMP9 1,08E-6
FSTL1 1,26E-4
Espaço extracelular (GO5615) AREG 4,66E-10
MMP9 6,39E-9
FSTL1 8,50E-5
CCL20 3,03E-4
MMP13 4,55E-2
Moléculas CD (KEGG) BST2 1,32E-18
TNFSF10 6,13E-8
CD82 7,00E-8
PLAUR 2,33E-5
ITGA5 4,01E-4
IL1R2 4,70E-4
PVRL1 9,36E-3
CD151 9,99E-3
NT5E 1,12E-2
TACSTD1 1,25E-2
Adesão celular (GO7155) POSTN 4,00E-25
MTSS1 7,55E-9
FXYD5 1,98E-3
GPR56 1,54E-2
Proliferação celular (GO8283) AREG 2,81E-20
BST2 3,10E-16
MYC 3,59E-12
CYR61 2,94E-7
EMP1 6,59E-3
SHC1 3,36E-2
KLF4 3,65E-2
IL1B 4,44E-2
Atividade metaloendopeptidase (GO04222) MMP9 8,58E-6
Linhagem de células hematopoéticas (KEGG) IL1R2 3,72E-5
IL6 1,99E-2
IL1B 3,11E-2
ITGA5 3,11E-2
Via de sinalização de Toll-like receptor (KEGG) MAP2K6 6,32E-25
CXCL9 8,40E-24
Ciclo celular (GO7049) FOSB 3,67E-21
MYC 3,96E-17
MCM2 1,53E-12
INHBA 1,77E-5
Protein binding (GO5515) FOSB 8,51E-25
AREG 1,62E-22
KLK6 6,53E-18
MCM2 5,92E-13
CCL18 2,77E-10
MYC 1,08E-9
EFNB2 1,20E-8
MYH10 1,28E-8
CCL20 4,37E-6
INHBA 9,92E-6
NTRK2 3,65E-4
IL1B 7,20E-4
PRKDC 8,12E-4
PAWR 2,80E-2
E2F1 3,30E-2
FXYD5 3,79E-2
LBR 4,03E-2
DHX9 4,03E-2
GRB7 4,60E-2
EGFR 4,60E-2
PLP2 4,98E-2
AKT1 4,98E-2
Resposta inflamatória (GO6954) CCL20 1,81E-3
Braço 2
Ciclo de uréia e metabolismo de grupos amino (KEGG) ODC1 2,90E-13
Desenvolvimento da epiderme (GO8544) KLK7 4,27E-10
EVPL 1,01E-2
Ligação ao receptor de TGF-β (GO5160) INHBA 9,87E-10
Cascata do complemeto e coagulação (GeneDeck) PLAU 3,49E-09
PLAUR 1,71E-3
Fosforilação oxidativa (KEGG) UQCRC1 2,25E-14
COX6B1 1,84E-6
Junções oclusivas (GeneDeck) INADL 3,59E-10
MYH10 1,65E-9
PPP2R2C 4,35E-6
TJP2 9,92E-5
AKT1 1,85E-2
SPTAN1 4,13E-2
Junção intercelular (GO5911) EVPL 8,10E-7
Tabela Whitfield 2 (ciclo celular) MCM2 1,88E-14
CCNB2 1,51E-7
PCNA 4,82E-2
Moléculas de adesão celular (KEGG) COL1A2 6,95E-37
THBS4 7,41E-29
COL6A3 9,79E-22
COL6A3 2,34E-14
CYR61 1,61E-7
NTN4 2,02E-4
LAMA4 1,61E-3
LAMB1 1,85E-3
Processamento e apresentação de antígenos (KEGG) HLA-DMB 6,21E-5
RFX5 1,65E-2
IFI30 1,65E-2
Anexo 5 - (Tabela 16) Vias e módulos funcionais alterados em amostras de
CECP localizadas (sem comprometimento linfonodal, não realizou radioterapia
adjuvante e não apresentou recidivas) (verde representa módulo inativo e
vermelho, ativo).
Grupo Módulo Gene p-valor
Tumores Metaloendopeptidase (GO4222) MMP9 2,7E-7
localizados Espaço extracelular (GO5615) MMP9 1,3E-5
(9 amostras)
AREG 2,9E-4
CCL20 3,7E-4
MMP13 2,8E-2
Matriz extracelular (GO5578) POSTN 3,7E-12
LAMA4 7,8E-4
Protein binding (GO5515) FOSB 1,1E-19
KLK6 1,7E-11
AREG 1,3E-10
MCM2 2,5E-7
EFNB2 2,7E-6
NTRK2 3,7E-4
IL1B 3,7E-4
CCL20 3,7E-4
MYC 5,0E-4
CCL18 5,8E-4
PAWR 9,9E-4
MYH10 1,4E-3
GRB7 1,7E-3
EGFR 2,2E-3
GPR56 2,8E-3
Ciclo celular (GeneDeck) MCM2 3,3E-7
CDKN1B 3,1E-6
Tabela Whitfield 2 (ciclo celular) CCNB2 4,1E-6
Assinatura de metástase S100P 6,6E-9
CYR61 2,8E-7
CCL18 2,8E-7
COL6A3 1,7E-5
COL6A3 2,0E-4
PLAU 1,6E-2
Moléculas de adesão celular COL1A2 2,1E-18
(KEGG) THBS4 5,8E-15
COL6A3 6,1E-13
COL6A3 7,3E-11
CYR61 1,7E-6
LAMA4 1,2E-2
Adesão focal (KEGG) COL1A2 1,0E-29
COL6A3 1,9E-18
COL6A3 8,9E-16
THBS4 4,7E-15
LAMA4 4,5E-5
ACTN1 3,4E-4
LAMB1 9,6E-4
VAV3 4,7E-2
Adesão focal (GeneDeck) THBS4 4,6E-27
COL6A3 1,9E-21
COL6A3 1,9E-21
LAMA4 5,3E-6
VWF 1,9E-2
TTN 2,4E-2
Cancer de pulmão de LAMA4 1,3E-5
pequenas células (hsa05222) CDKN1B 2,6E-3
Degradação de nitrobenzeno (KEGG) PRMT2 2,7E-7
Metabolismo de aminofosfonato (KEGG) PRMT2 1,1E5
Metabolismo de andrógenos (KEGG) PRMT2 5,4E-05
Junção intercelular (GO5911) EVPL 3,2E-5
Via das calicreínas KLK13 2,2E-12
KLK7 8,9E-5
KLK6 3,9E-3
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