( PDF ) Análise de aspectos moleculares no modelo de progressão do melanoma cutâneo por meio do estudo imunoistiquímico (tissue microarray-TMA)

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ANÁLISE DE ASPECTOS MOLECULARES NO

MODELO DE PROGRESSÃO DO MELANOMA

CUTÂNEO POR MEIO DO ESTUDO

IMUNOISTOQUÍMICO (TISSUE MICROARRAY-TMA)

GISELE GARGANTINI REZZE

Tese apresentada à Fundação Antônio

Prudente para a obtenção do Título de

Doutorado em Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Dr. Gilles Landman

Co-Orientador: Dr. João Pedreira Duprat Neto

São Paulo

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente

Rezze, GG

Análise de aspectos moleculares no modelo de progressão do

melanoma cutâneo por meio do estudo imunoistiquímico (tissue

microarray-TMA) / Gisele Gargantini Rezze – São Paulo, 2008.

116p.

Tese (Doutorado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de Concentração:

Oncologia.

Orientador: Gilles Landman

Descritores: 1. IMUNOHISTOQUIMICA. 2. MELANOMA. 3. CONEXINA

43 4. MOLÉCULAS DE ADESÃO INTERCELULAR 5. CITOCERATINAS. 6.

CALICREINA. 7. TISSUE ARRAY ANALYSIS.

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais

A minha filha Nicole e sobrinha Yasmin

A minha irmã e às geminhas Clara e Sofia

A minha querida avó Yolanda

Ao meu tio Júnior (in memorian)

AGRADECIMENTOS

Esta tese foi fruto de muito esforço e colaboração. Se não houvesse boa

vontade e competência de todas as pessoas envolvidas eu não realizaria

este trabalho. Agradeço pela amizade e sentimentos positivos de todos

aqueles que me ajudaram.

Agradeço a Deus por me dar sabedoria e capacidade para o trabalho.

Agradeço minha mãe, Sônia, por ser a pessoa que sempre cuidou de todos

nós e com quem posso contar incondicionalmente.

Agradeço meu pai, Cecil, pelos conselhos sábios na hora certa. Obrigada

por ter nos acolhido!

Agradeço a toda minha família pela torcida e carinho sempre.

Agradeço a Maria José por toda a sua ajuda, principalmente espiritual.

Obrigada por sua amizade e por tomar conta de mim como uma segunda

mãe.

Agradeço ao meu orientador Dr. Gilles Landman por ter me dado esta

oportunidade e por ter confiança na minha capacidade profissional,

principalmente nos momentos mais difíceis (que não foram poucos!). “Gilles,

meu maior agradecimento está dentro do meu coração.”

Agradeço ao diretor da pós-graduação Prof. Doutor Fernando Augusto

Soares por toda a sua compreensão e apoio sempre! Em todos os

momentos de insegurança a sua atitude firme me dava ânimo para

continuar.

Agradeço ao Dr. João Duprat, meu chefe, por sempre me valorizar

profissionalmente e também acreditar na viabilidade deste trabalho. João a

sua ajuda é sempre tão calma e tão importante nas horas em que pareço um

furacão!

Agradeço ao Dr. Rogério Izar Neves por ter me incentivado na vida

acadêmica e profissional.

Agradeço a Fernanda, assistente de pesquisa do departamento de oncologia

cutânea, pela paciência de levantar e digitar meus dados e por ter me

ajudado a terminar as benditas tabelas!

Agradeço ao Ivan por ter realizado todas as reações imunoistoquímicas. Eu

não sabia que você era um verdadeiro artista!

Agradeço ao Seven pela amizade e boa vontade. Você sempre encontrou

tempo para me ajudar!

Agradeço ao Carlinhos pela confecção dos TMAs de nevos e melanomas

finos. Que bom que conseguimos afiar o punch com uma lixa de unha!

Agradeço a Dirlei e ao Hugo, meus fiéis escudeiros, pela amizade,

compreensão e força!

Agradeço ao José Humberto pela estatística fantástica! Foi muito bom

receber os resultados finais!

Agradeço ao meu amigo Ernesto que me salvou no meio de tantas tabelas!

Agradeço a minha amiga Roberta por ser sempre o meu porto seguro!

Agradeço a Clara por ter me ajudado a realizar uma parte muito chata do

levantamento de dados e sempre com um sorriso no rosto.

Agradeço a Ana Kuninari, coordenadora da pós-graduação da FAP, pela

amizade e carinho. Eu também confio em Deus.

Agradeço a querida Suely por todo o trabalho com a formatação, bibliografia

e muitas outras coisas! Su, você é 10!

Agradeço ao Moris por compartilhar comigo o sofrimento de utilizar o ACIS.

Obrigada por me ensinar tanto!

Agradeço a Gilmara por fazer o possível e o impossível para agendar um

horário com seu chefe!

Agradeço a Dra. Bianca por ter realizado o TMA de melanoma invasivo e

agradeço ao Dr. Christiano pelo TMA de melanoma com LNS positivo.

Agradeço ao Dr. Luiz Fernando Lima Reis pela idéia da realização deste

trabalho.

Agradeço a Nair e Waleska por realizarem um trabalho tão valioso e que deu

origem a minha tese.

Agradeço ao Dr. Alexandre por me ouvir, você sempre foi um bom amigo!

Agradeço às pós-docs Claudia e Marcilei por toda ajuda com o ACIS.

Agradeço a boa vontade de todos os alunos da pós do departamento de

anatomia patológica.

Agradeço ao meu amigo Otávio pelo incentivo. Eu sinto a sua falta no dia-a-

dia do hospital.

Agradeço a Dete por ter paciência com meus papéis espalhados na sala do

computador.

Agradeço a Rosanira pelas orações e pelas risadas.

Agradeço às amigas Camila, Fafá, Pires e Bia pelos encontros divertidos

que me faziam esquecer o tanto que eu ainda tinha que realizar!

Agradeço à auxiliar Gláucia e à enfermeira Leila pelos momentos de

descontração durante o atendimento no hospital.

Agradeço toda equipe da biblioteca pela qualidade e rapidez no

atendimento.

Agradeço a Rosi por me salvar em horas cruciais!

Agradeço a Simone e Fátima por estarem sempre bem humoradas e

interessadas no andamento do meu trabalho.

Agradeço a todos os técnicos do departamento de anatomia patológica que

direta ou indiretamente me ajudaram.

Agradeço aos médicos do departamento de anatomia patológica por sempre

me tratarem com gentileza e muita consideração.

Agradeço a todos do meu departamento, oncologia cutânea, pelo trabalho

de excelência que realizamos no dia-a-dia.

Agradeço aos pacientes que são os nossos maiores parceiros!

RESUMO

Rezze GG. Análise de aspectos moleculares no modelo de progressão

do melanoma cutâneo por meio do estudo imunoistiquímico (tissue

microarray-TMA). São Paulo; 2008. [Tese de Doutorado-Fundação Antonio

Prudente]

Introdução: O melanoma cutâneo é uma neoplasia de comportamento

biológico muito agressivo e se origina dos melanócitos localizados na

camada basal da epiderme. A sua incidência vem aumentando

mundialmente na população branca. Elder e colaboradores propuseram um

modelo de desenvolvimento e progressão dos melanomas baseado em

modelos experimentais, observações clínicas e histopatológicas. Este

modelo é composto por seis etapas: melanócito precursor, nevos comuns,

com presença de melanócitos normais, nevos displásicos, com presença de

atipia estrutural e arquitetural dos melanócitos, melanoma de crescimento

radial (intraepidérmico), melanoma de crescimento vertical (invasão da

derme) e melanoma metastático. Novas tecnologias, como o TMA estão

sendo utilizadas para o estudo de proteínas no modelo de progressão

tumoral utilizando-se de nevos comuns, nevos atípicos, melanomas

primários e metastáticos. Estes estudos permitem avaliar o comportamento

de marcadores envolvidos no desenvolvimento e progressão do melanoma

na tentativa de caracterizar os eventos moleculares e celulares e auxiliar no

entendimento da transformação de um nevo em melanoma. Objetivos:

Estudar as proteínas conexina 43, desmocolina 3, citoceratina 5, calicreina 6

e calicreinas 7, que estão envolvidas em adesão e comunicação celular no

modelo de progressão do melanoma cutâneo. Material e métodos: Por meio

da técnica de TMA foram analisados 59 amostras de nevos comuns, 29 de

nevos atípicos 133 melanomas invasivos e 29 metástases. Foi realizada

imunoistoquímica com utilização do permanent red para as proteínas

conexina 43, desmocolina 3 e citoceratina 5. Para as reações de calicreina 6

e 7, foi realizada a revelação com diaminobenzidine (DAB). A leitura das

lâminas foi realizada utilizando-se a microscopia digital (ACIS III). Para a

avaliação da expressão de cada anticorpo foi utilizado o escore combinado

(EC) devido a utilização de parâmetros de intensidade e quantidade da área

marcada. Para a análise estatística empregou-se o teste de Mann-Whitney e

de Kruskal-Wallis na comparação de valores medianos de expressão dos

marcadores biomoleculares. O teste de Tukey foi utilizado para a avaliar a

correlação entre os marcadores dois a dois. A correlação entre os

marcadores biomoleculares foi realizado por meio do coeficiente de

Spearman. O nível de significância adotado para todos os testes foi de 5%.

Resultados: A expressão de conexina 43 foi maior em melanoma em relação

aos nevos atípicos e comuns. A comparação da expressão de conexina 43

entre nevos comuns e atípicos não se mostrou estatisticamente significativa.

Na avaliação entre a expressão de conexina 43 e a espessura do tumor

(índice de Breslow) e expressão de conexina 43 e estadiamento do tumor,

não houve resultado estatisticamente significativo. Na avaliação da

expressão de conexina 43 e o status linfonodal, a maior expressão foi nos

pacientes que apresentavam metástase. A expressão de desmocolina 3 foi

maior nos melanomas em relação aos nevos comuns e atípicos. A

comparação da expressão de desmocolina 3 entre nevos comuns e atípicos

não se mostrou estatisticamente significativa. Na avaliação entre a

expressão de desmocolina 3 e a espessura do tumor (índice de Breslow) e

expressão de desmocolina 3 e estadiamento do tumor, não houve resultado

estatisticamente significativo. Na avaliação da expressão de desmocolina 3 e

o status linfonodal, a maior expressão foi nos pacientes que apresentavam

metástase. A expressão de citoceratina 5 foi maior nos nevos atípicos em

relação aos melanomas e nevos comuns. A expressão de citoceratina 5 foi

maior nos melanomas em relação aos nevos comuns. Na comparação entre

a expressão de citoceratina 5 e a espessura de Breslow, os melanomas

finos apresentaram maior expressão em relação aos melanomas acima de

1mm. Na comparação entre a expressão de citoceratina 5 e o estádio do

melanoma, o estádio I apresentou maior expressão em relação ao estádio II

e III e IV. Na avaliação da expressão de CK5 e o status linfonodal, a maior

expressão foi nos pacientes que apresentavam metástase. A KLK6

apresentou expressão aumentada nos melanomas em relação aos nevos.

Na comparação entre a expressão de KLK6 e a espessura do tumor e entre

a expressão de KLK6 e o estádio do melanoma, não houve resultado

estatisticamente significativo. A expressão de KLK7 foi maior nos nevos

atípicos em comparação com os nevos comuns e o melanoma. A expressão

de KLK7 foi maior nos melanomas em comparação com os nevos comuns.

Na avaliação da expressão de KLK7 e a espessura do tumor, os melanomas

com espessura maior que 4mm apresentaram maior expressão em

comparação aos melanomas finos (<1mm) e intermediários (1,01-4,00mm).

Na avaliação da expressão de KLK7 com o estadiamento do melanoma, o

estádio I apresentou maior expressão em relação ao estádio II. Na avaliação

da expressão de KLK7 e o status linfonodal, a maior expressão foi nos

pacientes que não apresentavam metástase. Na correlação entre a

expressão dos marcadores houve correlação positiva e moderada entre

Cx43 e DSC3 e entre KLK6 e KLK7. Conclusão: A microscopia digital

permitiu a realização da comparação da expressão imunoistoquímica dos

marcadores com o modelo de progressão do melanoma. A expressão de

desmocolina 3 e conexina 43 foi maior em melanomas comparado aos

nevos comuns e atípicos. A expressão de citoceratina 5 e calicreina 7 foi

maior em nevos atípicos em relação aos melanomas e nevos comuns e

maior nos melanoma em relação aos nevos comuns. A expressão de

calicreina 6 foi maior em melanomas em relação aos nevos comuns. Houve

uma correlação positiva e moderada entre a expressão de conexina 43 e

desmocolina 3 e entre calicreina 6 e calicreina 7. Conclusão final: as

proteínas de adesão e comunicação celular poderiam contribuir no

desenvolvimento tumoral descrito no modelo de progressão do melanoma.

SUMMARY

Rezze GG. [Analysis of the molecular aspects on the progress

melanoma model using the immunohistochemical study (tissue

microarray-TMA] São Paulo; 2008. [Tese de Doutorado-Fundação Antonio

Prudente]

Cutaneous melanoma is an agressive cancer, derived from the epidermal

basal layer melanocytes. The incidence is growing around the world in

caucasians. Based on experimental, clinical and histophatological

observations Elder et al., proposed a development and progression

melanoma model. New high throughput methods such as tissue microarray

(TMA) are being used to evaluate the role of numerous proteins on the

melanoma progression model using common nevus, atypical nevus, primary

melanomas and metastatic melanomas. These studies allow to establish

their participation in the melanoma model and to characterize the molecular

and cellular events and help to better understand the pathways involved in

melanoma pathogenesis. Adhesion molecules and related proteins have

been reported to have a role in this pathway. The purpose of this study was

to evaluate the immunohistochemical participation of connexin 43 (Cx43),

desmocollin 3 (DSC3), citokeratin 5 (CK5), kalikrein 6 (KLK6) and kalikrein 7

(KLK7), cellular adhesion and communication proteins, in the progression

melanoma model. We analyzed 59 samples of common nevus, 29 atypical

nevus, 133 invasive and 29 metastatic melanomas by TMA. The

immunostaining was evaluated with digital microscopy (ACIS III). Connexin

43 and DSC3 expression was higher in melanoma compared to atypical and

common nevi (p<0,001). CK5 expression was higher in atypical nevus than in

melanomas and common nevus (p<0,001). The CK5 expression on

melanomas had higher expression than common nevus (p<0,001). Thin

melanomas had higher CK5 expression than the intermediate and thick

melanomas (>1mm) (P<0,001). Stage I had higher CK5 expression than

stage II and III/IV (p=0,006 and p=0,004). CK5 expression was also higher in

patients with lymph node metastasis (p<0,001). Higher KLK6 expression was

found in melanomas compared to common nevus (p<0,001). A higher KLK7

expression was found in atypical nevus compared to common nevus and

melanoma (p<0,001). Its expression was higher in melanomas than the

common nevus (p<0,001). Higher KLK7 expression was found in thick

melanomas (>4mm) compared to thin (<1mm) (p=0,014). Stage I

melanomas had higher KLK7 expression in relation to the stage II

melanomas (p=0,045). A higher expression was found in patients with no

metastatic lymph node (p=0,005). The correlation was positive between Cx43

and DSC3 and between KLK6 and KLK7. The digital microscopy allowed us

to study the expression of the biomarkers in melanoma. The expression of

DSC3 and Cx43 were higher in melanomas than common and atypical

nevus. The expression of CK5 and KLK7 were higher on atypical nevus than

common nevus and melanomas and higher on the melanomas than the

common nevus. The KLK6 expression was higher on melanomas than the

common nevus. There was a positive and moderate correlation between

Cx43 and DCS3 and KLK6 and KLK7. In the final conclusion: the cellular

adhesion and communication proteins may contribute to melanoma

pathogenesis in the context of the melanoma progression model.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de progressão tumoral em melanomas.......................... 19

Figura 2 Modelo de descamação da epiderme........................................ 29

Figura 3 A confecção do TMA................................................................... 45

Figura 4 Esquema da marcação em cruz (utilizando-se a circunferência

em cruz de 40X) utilizada para cada amostra do TMA...............

Figura 5 Exemplo de menor expressão na membrana celular

(imunoistoquímica de Cx43 em células do melanoma cutâneo,

Microfotografia 400X).................................................................. 51

Figura 6 Exemplo de maior expressão na membrana celular

(imunoistoquímica de Cx43 em células do melanoma cutâneo,

Microfotografia 400X).................................................................. 51

Figura 7 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de DSC3

em células névicas...................................................................... 82

Figura 8 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de DSC3

em células do melanoma............................................................

Figura 9 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de Cx43

em células do melanoma............................................................

Figura 10 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de Cx43

em células névicas...................................................................... 86

Figura 11 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de CK5

em células de nevo comum.........................................................

Figura 12 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de CK5

em células atípicas do nevo atípico............................................ 91

Figura 13 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de CK5

em células do melanoma cutâneo............................................... 92

Figura 14 A estrutura do desmossomo e sua correlação com CK5............ 93

Figura 15 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de KLK6

em células névicas...................................................................... 96

Figura 16 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de KLK6

em células de melanoma............................................................

Figura 17 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de KLK7

em células névicas......................................................................

Figura 18 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de KLK7

em células atípicas do nevo atípico............................................ 97

Figura 19 Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de KLK7

em células do melanoma............................................................ 98

Figura 20 Modelo de progressão tumoral em melanomas e a expressão

das proteínas estudadas............................................................. 101

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Descrição da freqüência e porcentagem dos tipos de lesão

em relação ao total de lesões estudadas................................... 55

Tabela 2 Descrição da média e mediana da idade ao diagnóstico,

índice de Breslow, índice mitótico, número de linfonodos

sentinelas positivos e número de linfonodos sentinelas

encontrados para os casos de melanoma cutâneo................... 56

Tabela 3 Descrição da freqüência e porcentagem do tipo histológico da

lesão primária dos melanomas cutâneos estudados.................

Tabela 4 Descrição da freqüência e porcentagem do tipo de

crescimento da lesão primária dos melanomas cutâneos

estudados...................................................................................

Tabela 5

Descrição da freqüência e porcentagem do índice de Breslow

(4 categorias) das lesões de melanoma cutâneo estudadas.

...

Tabela 6

Descrição da freqüência e porcentagem do nível de Clark

encontrado no total de melanomas cutâneos estudados.........

Tabela 7 Descrição da freqüência e porcentagem da ulceração

histológica encontrada nos casos de melanoma cutâneo

estudados................................................................................... 58

Tabela 8 Descrição da freqüência e porcentagem de regressão

encontrada nos casos de melanoma cutâneo estudados.......... 59

Tabela 9 Descrição da freqüência e porcentagem em relação ao

estádio dos pacientes com melanoma cutâneo estudados....... 59

Tabela 10 Descrição da média e mediana dos anticorpos utilizados para

o total de casos marcados.........................................................

Tabela 11 Descrição da média e mediana do escore combinado dos

anticorpos estudados em relação ao tipo de lesão (nevo

comum, nevo atípico e melanoma cutâneo). Os valores das

medianas estão em vermelho.................................................... 61

Tabela 12 Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo

com o tipo de lesão.................................................................... 64

Tabela 13 Descrição da média e mediana do escore combinado dos

anticorpos estudados em relação ao índice de Breslow em 3

categorias. Os valores das medianas estão em vermelho........ 65

Tabela 14 Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo

com a espessura em milímetros (mm) do melanoma cutâneo

(Breslow). Os valores estatisticamente significativos estão em

vermelho..................................................................................... 67

Tabela 15 Descrição da média e mediana do escore combinado dos

anticorpos estudados em relação ao estadiamento em 3

categorias. Os valores das medianas estão em vermelho........

Tabela 16 Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo

com o estadiamento dos pacientes com melanoma cutâneo

em 3 categorias (estádio I, II e III/IV). Os valores

estatisticamente significativos estão em vermelho.................... 70

Tabela 17 Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo

com o status linfonodal. Os valores estatisticamente

significativos estão em vermelho............................................... 72

Tabela 18 Correlação entre a expressão das proteínas estudadas........... 74

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Fatores de risco clínicos para o desenvolvimento do

melanoma cutâneo.................................................................... 16

Quadro 2 Classificação TNM do Melanoma.............................................. 43

Quadro 3 Estadiamento clínico e patológico do Melanoma...................... 44

Quadro 4 Anticorpos utilizados no protocolo de reações 1....................... 48

Quadro 5 Anticorpos utilizados no protocolo de reações 2....................... 50

Quadro 6 Descrição das proteínas (estudadas) envolvidas na adesão e

comunicação celular.................................................................. 77

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 A estrutura da Pele 1

1.2 A biologia e desenvolvimento dos Melanócitos 3

1.3 A unidade de pigmentação – interação entre melanócitos

e ceratinócitos 5

1.4 Os nevos melanocíticos 8

1.5 A orígem e incidência do Melanoma Cutâneo 11

1.6 Fatores de risco para o desenvolvimento do Melanoma Cutâneo 12

1.6.1 Fatores Ambientais 12

1.6.2 Fatores Constitucionais 13

1.6.3 Fatores Genéticos 15

1.6.4 Imunoistoquímica 16

1.7 Modelo de progressão do Melanoma 17

1.8 O estudo do câncer por meio do tissue microarray (TMA) 19

1.9 Utilização do TMA no estudo do modelo de progressão do

Melanoma 21

1.10 A utilização da técnica de microarranjos de CDNA no estudo

do modelo de progressão do melanoma 22

1.11 Utilização do TMA no estudo do modelo de Progressão do

Melanoma 23

1.11.1 Desmocolina 3 (Dsc3) 24

1.11.2 Calicreinas (KLK) 27

1.11.3 Citoceratina 5 (CK5) 31

1.11.4 cx43 33

2 JUSTIFICATIVA 34

3 OBJETIVOS 36

3.1 Objetivos gerais 36

3.2 Objetivos específicos 36

4 MATERIAIS E MÉTODOS 37

4.1 Casuística 37

4.2 Critérios de Inclusão 38

4.3 Análise Histológica 39

4.3.1 Confecção do TMA 44

4.3.2 Imunoistoquímica 46

4.3.3 Leitura das lâminas 52

4.4 Análise estatística 53

5 RESULTADOS 55

5.1 Descrição das variáveis do estudo 55

5.2 Comparação entre o tipo de lesão (nevo comum, nevo atípico

e melanoma cutâneo) e a expressão dos anticorpos estudados 60

5.3 Comparação entre o índice de Breslow e a expressão dos

anticorpos estudados nas lesões de melanoma cutâneo 64

5.4 Comparação entre o estadiamento e a expressão dos anticorpos

estudados nas lesões de melanoma cutâneo 68

5.5 Comparação entre o status linfonodal e a expressão dos anticorpos

estudados nas lesões de melanoma cutâneo 71

5.6 Estudo da correlação entre a expressão dos marcadores

biomoleculares 72

6 DISCUSSÃO 75

6.1 Correlação entre a expressão dos marcadores biomoleculares 99

7 CONCLUSÕES 100

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 102

1 INTRODUÇÃO

A pele é o maior órgão do corpo humano, serve de revestimento para

separar o meio interno do ambiente externo, constituindo uma barreira

protetora dos tecidos mais profundos contra a ação dos agentes físicos

(raios ultra-violetas), químicos e bacterianos. Desempenha importante

função de regular a temperatura por meio da transpiração ou vasoconstrição.

A pele é também um órgão dos sentidos, uma vez que suas extremidades

nervosas reagem à dor, ao calor, ao frio, ao tato e à pressão e é o

responsável pelo fornecimento da vitamina (CHU et al. 2003).

1.1 A ESTRUTURA DA PELE

A epiderme é um epitélio escamoso estratificado ceratinizado, que se

renova continuamente e origina estruturas denominadas apêndices

epidérmicos (unidades pilo-sebáceas, unhas e glândulas sudoríparas). Tem

aproximadamente 0,4 a 1,5mm de espessura (epiderme) enquanto a

espessura total da pele (epiderme e derme) pode variar de 1,5 a 4mm

(dependendo da região anatômica).

Os ceratinócitos são as células que compõem a maior parte da

epiderme e estão organizados em quatro camadas (basal, espinhosa,

granulosa e córnea). As células migram da camada basal para a superfície

externa, para formar camadas progressivamente diferenciadas

(ceratinizadas) (CHU et al. 2003).

Entre os ceratinócitos da epiderme existem células chamadas

imigrantes, que são compostas por melanócitos, células de Langerhans e

células de Merkel. Os melanócitos e as células de Langerhans migram para

a epiderme durante o desenvolvimento embrionário. As células de Merkel

(receptor tátil) provavelmente se diferenciam in situ. Outras células, como os

linfócitos, são habitantes transitórios e raros da pele (CHU et al. 2003).

A junção dermo-epidérmica é a zona da membrana basal que forma a

interface entre a epiderme e a derme. A sua principal função é resistir às

forças mecânicas externas, sustentar a epiderme, determinar a polaridade

de seu crescimento, organizar o citoesqueleto das células basais, produzir

sinais durante o desenvolvimento e funcionar como barreira semi-permeável.

A estrutura da membrana basal é quase toda produzida pelos ceratinócitos,

com mínima contribuição dos fibroblastos da derme (CHU et al. 2003).

A junção dermo-epidérmica pode ser dividida em três

compartimentos: filamentos de ancoragem (hemi-desmossomos), que se

ligam aos ceratinócitos basais, a lâmina densa (formada principalmente por

colágeno tipo IV) e a sub-lâmina densa formada pelas fibrilas de ancoragem

(colágeno tipo VII).

A derme é um sistema integrado de fibras, filamentos e tecido

conectivo amorfo que aloja nervos, vasos, apêndices epidérmicos,

fibroblastos, macrófagos, mastócitos e outras células como linfócitos,

plasmócitos e leucócitos provenientes do sangue, em resposta à diferentes

estímulos. É responsável pela elasticidade e flexibilidade da pele, promove

proteção mecânica, ajuda na termorregulação, e possui receptores

sensoriais. A derme está organizada em duas regiões, a derme papilar e a

derme reticular (CHU et al. 2003).

A derme papilar se localiza logo abaixo da membrana basal e é

formada por fibrilas de colágeno de pequeno diâmetro e fibras elásticas

oxitalânicas. Possui alta densidade de fibroblastos que se proliferam

rapidamente, tem alta atividade metabólica e produz diferentes tipos de

proteoglicanas, comparada com a derme reticular (CHU et al. 2003).

A derme reticular se localiza abaixo da derme papilar e é composta

por fibrilas de colágeno de grande diâmetro que estão organizadas em

grandes feixes e existe uma maior abundância de fibras elásticas. A

transição entre a derme papilar e reticular é marcada pela presença do plexo

vascular superficial, denominada derme intermediária, onde há maior

presença de fibroblastos e células inflamatórias, em relação à derme

reticular profunda (CHU et al. 2003)..

1.2 A BIOLOGIA E DESENVOLVIMENTO DOS MELANÓCITOS

Os melanócitos são as células responsáveis pela produção de

melanina, que determina a cor da pele, cabelos e olhos. Estas células

exercem efeitos biológicos significativos que variam desde conseqüências

comportamentais de importância cosmética até o câncer cutâneo mais

devastador, o melanoma.

As células precursoras dos melanócitos são os melanoblastos de

origem neuroectodérmica. Os melanoblastos primários estão localizados na

crista neural, se proliferam e dão origem aos melanócitos secundários. Após

um dia de proliferação, os melanoblastos precursores dão origem aos

melanoblastos terciários, que começam a migrar dorso-lateralmente, duas

ou três semanas após a fertilização (LARUE et al. 2003). Os melanoblastos

terciários atravessam a membrana basal que separa a derme da epiderme,

invadem a epiderme e permanecem em contato com a membrana basal,

sendo chamados de melanoblastos quaternários. Os melanoblastos

quaternários se diferenciam em melanócitos epidérmicos, onde permanecem

quiescentes, apesar de seu potencial proliferativo (LARUE et al. 2003;

CHAMMAS et al. 2003).

Durante o desenvolvimento, o primeiro fator de transcrição que parece

estar envolvido na transição das células precursoras em melanoblastos é

denominado Microphtalmia - associated transcription factor (Mitf). A

interação do receptor de membrana celular C-Kit com seu ligante Steel factor

resulta na fosforilação de Mitf, mediada pela ativação da via de MAPKinase,

além do recrutamento seletivo de CPB/p300, que são fatores transcricionais

co-ativadores. A fosforilação de Mitf ativa a transcrição de um conjunto de

genes que regulam a proliferação e diferenciação dos melanoblastos em

melanócitos na epiderme. Alguns estudos sugerem que Mitf além de ter um

papel importante na diferenciação (pigmentação), também está envolvido

nos processos de proliferação e sobrevivência durante o desenvolvimento

dos melanócitos (WIDLUND e FISHER 2003). O aumento da expressão de

Mitf na maioria das lesões de melanoma primários, incluindo os não

pigmentados, sugere sua possível utilização na realização do diagnóstico

deste tipo de câncer (WIDLUND et al. 2002).

A proteína Wnt também está envolvida na diferenciação dos

melanoblastos em melanócitos por meio da ativação do receptor Frizzled.

Esta ativação resulta na inativação de GSK3 e conseqüente aumento de β-

catenina no citoplasma, que migra para o núcleo, ativando os fatores de

transcrição Tcf/Lef, levando à ativação de um grupo de genes (c-Myc, Ciclina

D1 e Mitf), responsável pela proliferação e diferenciação celular (WIDLUND

et al. 2002; PHAM et al. 2003).

A regulação dos níveis de β-catenina é feita pelo complexo protéico

formado por GSK3β, Axina e APC, que determina o nível de ubiquitinização

e posterior degradação de β-catenina. A existência de mutação nos genes

que codificam as proteínas do complexo protéico (GSK3, Axina e APC) que

levam ao aumento de β-catenina de localização nuclear, tem sido descrita no

melanoma. No núcleo, a β-catenina interage com os fatores de transcrição

TCF/Lef, levando à ativação de genes com atividade mitogênica (WIDLUND

et al. 2002; LARUE et al. 2003; HALABAN et al. 2003).

1.3 A UNIDADE DE PIGMENTAÇÃO – INTERAÇÃO ENTRE

MELANÓCITOS E CERATINÓCITOS

Após a diferenciação do melanoblasto em melanócito, que ocorre na

epiderme, este permanece aderido à membrana basal, intercalado por 5 a 8

queratinócitos basais. Na epiderme, os melanócitos interagem com múltiplos

ceratinócitos (aproximadamente 35-40 ceratinócitos), formando as unidades

de pigmentação. Por meio das expansões dendríticas dos melanócitos

ocorre a transferência dos melanossomos (organelas contendo melanina)

para os ceratinócitos, no processo de pigmentação epidérmica (LI e

HERLYN 2000).

A radiação ultra-violeta induz ao dano celular, levando à formação de

dímeros de pirimidina, resultando em alterações estruturais do DNA

(mutações). Além disto, a radiação ultra-violeta leva à proliferação dos

melanócitos pela indução de fatores de crescimento celular produzidos por

ceratinócitos e fibroblastos (bFGF, HGF/SF e ET1). Por tudo isso, a

exposição solar excessiva precoce pode manifestar-se tardiamente em

transformação maligna dos melanócitos (WIDLUND et al. 2002). A melanina

tem papel importante na defesa natural da pele contra os efeitos deletérios

da radiação solar ultra-violeta. A radiação UV (ultra-violeta) ativa a

proliferação dos melanócitos, a produção de melanina e a tranferência dos

melanossomas para os ceratinócitos epidérmicos (HALABAN et al. 2003).

Os melanossomas ricos em melanina são translocados dos

melanócitos para os ceratinócitos por meio dos prolongamentos dendríticos,

mecanismo ainda não totalmente elucidado (BOISSY 2003). Três métodos

de transferência foram propostos: o primeiro mecanismo envolve secreção

do conteúdo melanossomal do melanócito para o espaço intercelular e

endocitose pelos ceratinócitos epidérmicos; o segundo modelo propõe uma

fusão direta das membranas plasmáticas dos melanócitos e ceratinócitos

(necessitando da presença da proteína SNARE); e o terceiro modelo propõe

que a região distal do prolongamento dendrítico dos melanócitos sejam

fagocitados pelos ceratinócitos (HALABAN et al. 2003).

Independente do mecanismo de transferência dos melanossomas dos

melanócitos para os ceratinócitos, estas células estão em comunicação. A

adesão entre melanócitos e ceratinócitos ocorre principalmente por meio da

interação das moléculas de E-caderina, presentes nas junções aderentes

tanto de melanócitos como de ceratinócitos (LI e HERLYN 2000). O estado

não-proliferativo dos melanócitos, nas unidades de pigmentação, parece

justificar-se pelo contato célula-célula entre melanócitos e ceratinócitos

(inibição por contato). Os melanócitos normais quando presentes na derme,

deixam de expressar E-caderina e passam a expressar N-caderina (HSU et

al. 2000; CHAMMAS et al. 2003).

Na adesão célula-célula, as moléculas de β-catenina são recrutadas

pelas moléculas de E-caderina na formação dos desmossomos, assim, a

substituição de E-caderina por N-caderina também contribuiria para o

aumento do pool citoplasmático de β-catenina que, na ausência de

degradação adequada poderia migrar para o núcleo e estimular a

proliferação, por meio da ativação de fatores transcricionais nucleares Tcf/

Lef (LI e HERLYN 2000; LARUE et al. 2003).

1.4 OS NEVOS MELANOCÍTICOS

Os nevos melanocíticos adquiridos são formados por células

pigmentadas que possuem características comuns aos melanócitos, mas

apresentam uma diferenciação alterada que leva à proliferação, formação de

ninhos e capacidade de invasão da derme (GONTIER et al. 2004). As

células melanocíticas névicas são mais arredondadas, perdem seus

dendritos e acumulam pigmentação. Os nevos comuns são subdivididos

histologicamente em nevos juncionais (células névicas na junção dermo-

epidérmica), compostos (células névicas na junção dermo-epidérmica e

derme) e intradérmicos (células névicas na derme) seguindo seu ciclo de

vida natural (MAITRA et al. 2002).

A teoria “Abtropfung” surgiu para explicar a formação do

compartimento dérmico dos nevos melanocíticos. Unna, em 1893, propôs

que as células névicas se originam na epiderme e posteriormente migram

para a derme (WORRET e BURGDORF 1998; GONTIER et al. 2004).

Os nevos comuns aparecem na infância, seu número está relacionado

a fatores genéticos (tipo de pele) e fatores ambientais (exposição UV). Os

nevos parecem estar ativos (proliferação e diferenciação) durante a infância

e adolescência e tornam-se estáveis nos adultos. A monitorização das

lesões névicas por meio da dermatoscopia digital confirma que, a presença

de alterações das características dermatoscópicas (por exemplo,

aparecimento de glóbulos periféricos), é mais comum em indivíduos até 20

anos (KITTLER 2007).

GONTIER et al. (2004) realizaram estudos com reconstrução

tridimensional da pele, utilizando nevos congênitos e verificaram a

diminuição da expressão de E-caderina nas células névicas da derme e re-

expressão de E-caderina quando as células do nevo congênito eram

implantadas na epiderme. Este estudo contribuiu com a hipótese de que as

células pigmentadas perdem o controle negativo dos ceratinócitos quando

estão na derme e são capazes de proliferar, formando o compartimento

dérmico dos nevos (GONTIER et al. 2004).

A presença de muitos nevos adquiridos (nevos comuns e nevos

atípicos) é um marcador de risco para o desenvolvimento do melanoma

cutâneo. Acredita-se também que os nevos melanocíticos comuns

adquiridos e os nevos atípicos sejam lesões precursoras do melanoma

cutâneo. A maior evidência a favor desta teoria é a associação entre nevos e

melanomas observadas clínica e histologicamente. A presença clínica de

nevos na região do melanoma já foi descrita entre 19% e 85% e a

associação histológica entre nevos e melanomas variou de 4% a 72%.

(SKENDER-KALNENAS 1995) Estudos realizados com indivíduos com

nevos displásicos, revelaram que os melanomas surgiram em contigüidade

histológica com os nevos atípicos em 44 a 80% (NAEYAERT e BROCHEZ

2003).

Os nevos atípicos são caracterizados clinicamente por lesões

maculares com cinco milímetros ou mais de diâmetro, geralmente com

bordas irregulares ou indefinidas e múltiplas cores. A síndrome do nevo

atípico é caracterizada pela presença de pelo menos um nevo atípico clínico

e mais de cinqüenta nevos melanocíticos (comuns ou atípicos), de acordo

com a classificação do NIH Consensus Conference (NAEYAERT e

BROCHEZ 2003).

Em relação aos nevos atípicos, a presença de características clínicas

de atipia se correlaciona imperfeitamente com a presença de displasia

histológica. Em um estudo envolvendo 101 pacientes com melanoma

esporádico, a lesão clínica mais atípica foi removida cirurgicamente e a

presença de displasia foi verificada histologicamente em 7% dos casos nos

quais as lesões apresentavam apenas uma característica clínica de

displasia, 23% nos casos com duas características clinicas de atipia e 62%

nos casos com três delas (NAEYAERT e BROCHEZ 2003).

O nevo atípico pode ser confundido com o melanoma tanto

clinicamente como histopatologicamente. Em um estudo realizado por

BROCHEZ et al. em (2002), um grupo de lesões histologicamente

diagnosticadas como nevos atípicos por patologistas experientes foram

diagnosticadas como melanomas e por outro grupo (de patologistas) em

21% dos casos, os melanomas in situ e finos foram diagnosticados como

nevos atípicos em 12% dos casos (NAEYAERT e BROCHEZ 2003).

O diagnóstico histológico do nevo atípico é baseado na identificação

de anormalidades citológicas e arquiteturais específicas e atualmente não

existe um critério que seja universalmente aceito. O diagnóstico baseado em

critérios maiores e menores é o mais utilizado. Os critérios maiores são:

proliferação de nevomelanócitos atípicos na região da membrana basal se

estendendo por três cristas epidérmicas em relação ao componente

intradérmico e proliferação melanocítica intraepidérmica (lentiginosa ou

epitelióide). Os critérios menores são: fibrose concêntrica eosinofílica

envolvendo as cristas epidérmicas ou fibroplasia lamelar, neovascularização,

resposta inflamatória dérmica e fusão de cristas. O diagnóstico é realizado

se houver 2 critérios maiores e pelo menos 2 critérios menores (NAEYAERT

e BROCHEZ 2003).

1.5 A ORÍGEM E INCIDÊNCIA DO MELANOMA CUTÂNEO

O melanoma é uma neoplasia de comportamento biológico muito

agressivo, originada dos melanócitos que estão localizados na camada basal

da epiderme, infundíbulo e região bulbar dos folículos pilosos, na coróide e

leptomeninges.

A incidência do melanoma tem dobrado, mundialmente, em pacientes

de pele clara, nos últimos dez anos (LORENTZEN et al. 1999). A maior taxa

de incidência e mortalidade mundial se encontra na Austrália. Neste país, é

o câncer mais comum em homens e o segundo em mulheres, na faixa etária

de 15 a 44 anos, sendo considerado um problema de saúde pública

(MARKS 2002).

No Brasil, dados do Instituto Nacional de Câncer - INCA revelam uma

incidência global de melanoma variando de zero a 8,73 por 100.000

habitantes, sendo estimados 5820 novos casos para o ano 2005, com a

maior taxa de incidência no Estado de Santa Catarina (Ministério da Saúde

2004). Pode-se observar que a incidência desta neoplasia dobrou em

Florianópolis e Porto Alegre entre 2003 e 2005, dados considerados

alarmantes, devido ao curto espaço de tempo decorrido. Considerando-se

estes fatos, é provável que o melanoma seja sub-notificado. O Hospital AC

Camargo de São Paulo tem sido referência no tratamento do melanoma e o

número de casos novos tratados por ano é de aproximadamente 200

pacientes (dados não publicados).

O melanoma cutâneo é uma neoplasia que acomete os jovens,

apresenta alta agressividade e é refratária aos tratamentos atuais quando há

o desenvolvimento de metástases (SLOMINSKI et al. 1998a, b; SHEN et al.

2003). A cura do melanoma cutâneo está relacionada com a excisão do

tumor em sua fase inicial de desenvolvimento e está bem estabelecida a

necessidade do diagnóstico precoce (LANGLEY et al. 1999).

1.6 FATORES DE RISCO PARA O DESENVOLVIMENTO DO

MELANOMA CUTÂNEO

Os fatores de risco para o desenvolvimento do melanoma cutâneo

podem ser caracterizados como ambientais, constitucionais, genéticos e

outros.

1.6.1 Fatores Ambientais

A radiação ultra-violeta (RUV) foi identificada como o fator de risco

ambiental mais importante para o desenvolvimento do câncer da pele

(KENNEDY

et al. 2003). A RUV promove alterações na pele por seu efeito

mutagênico no DNA, estimulando a produção de fatores de crescimento,

reduzindo a imunidade local e promovendo espécies de oxigênio reativo que

resulta em dano do DNA e supressão da apoptose, levando à carcinogênese

(EL-DEIRY 2007; RÜNGER e KAPPES 2008). Os ácidos nucléicos

absorvem diretamente a radiação UVB, promovendo a formação de dímeros

de pirimidina e fotoprodutos que resultam em mutação no DNA (EL-DEIRY

2007; RÜNGER e KAPPES 2008) e carcinogênese. Existe também a

absorção indireta da radiação UVA por outros cromóforos, como moléculas

de oxigênio, gerando oxigênio reativo que levam ao dano do DNA e

conseqüente efeito mutagênico e carcinogênico (RÜNGER e KAPPES

2008).

A história pessoal de queimaduras solares dolorosas ocorridas até os

20 anos de idade está associada ao desenvolvimento do melanoma cutâneo

(KENNEDY

et al. 2003). O desenvolvimento do melanoma cutâneo está

associado mais à exposição solar intermitente do que à exposição solar

crônica (Quadro 1). A associação entre queimadura solar e melanoma

cutâneo sofre a influência da latitude, sendo que em altas latitudes o risco de

desenvolvimento do melanoma é maior do que em baixas latitudes

(GANDINI

et al. 2005a) (Quadro 1).

1.6.2 Fatores Constitucionais

Os indivíduos que apresentam fototipos de pele I e II da classificação

de Fitzpatrick apresentam risco maior de desenvolvimento do melanoma

cutâneo em relação àqueles que nunca se queimam e bronzeiam com

facilidade (Quadro 1). Os indivíduos que apresentam pele clara, olhos azuis,

cabelos vermelhos e muitas efélides apresentam risco aumentado de

desenvolvimento do melanoma cutâneo (MARRETT et al. 1992; GANDINI

al. 2005b; LIVINGSTON et al. 2007; MAREHBIAN et al. 2007) (Quadro 1).

O número de nevos comuns e atípicos são importantes fatores de

risco independentes para o desenvolvimento do melanoma cutâneo

(THOMAS

et al 2007). Se um indivíduo apresenta de 100 a 115 lesões

névicas o risco de desenvolvimento do melanoma é de 7 a 12 vezes maior

em relação a um indivíduo com apenas, no máximo, 10 a 15 nevos comuns

(SKENDER-KALNENAS et al. 1995; GRULICH et al. 1996; GANDINI et al.

2005c) (Quadro 1). Para um indivíduo com 5 nevos atípicos, seu risco de

desenvolvimento do melanoma cutâneo é de 6 vezes em relação a um

indivíduo que não apresenta nenhuma lesão atípica (Quadro 1) (SKENDER-

KALNENAS et al. 1995; GANDINI et al. 2005c).

Os pacientes com melanoma cutâneo prévio têm um risco maior de

desenvolver um segundo melanoma (TUCKER et al. 1985; GRULICH et al.

1996; LEVI et al. 1997; ULIASZ e LEBWOHL 2007). O risco de

desenvolvimento de um segundo melanoma primário observado por

DIFRONZIO et al. (1999)

foi de 2,8 em cinco anos e 3,6 em dez anos. LEVI

et al. (1997)

encontraram um risco de 4,7 em seguimento de vinte anos e

FERRONE et al. (2005)

descreveram um risco de 8,6 em seguimento de seis

anos (Quadro 1).

A associação entre câncer da pele não melanoma e o aumento do

risco de desenvolvimento do melanoma cutâneo é bem estabelecido.

BOWER et al. (2000) e THOMPSON et al. (2005) encontraram risco de

melanoma de 2.9 em pacientes com câncer da pele não melanoma (Quadro

1).

1.6.3 Fatores Genéticos

Algumas síndromes genéticas são caracterizadas pelo

desenvolvimento do melanoma cutâneo. O xeroderma pigmentoso é

autossômico recessivo, caracterizado pelo surgimento precoce de ceratoses

actínicas, CBCs, CECs e melanoma cutâneo. Foram identificados sete

genes (XPA ao XPG) responsáveis pelo processo de reparação do DNA

após dano pela RUV que podem sofrer mutação levando ao aparecimento

de tumores (TSAO 2001).

Aproximadamente 10% dos melanomas são hereditários e

caracterizam a síndrome do melanoma familial (PLATZ et al. 2000). O

melanoma familial é um termo utilizado para caracterizar as famílias com um

ou mais parentes de primeiro grau com diagnóstico de melanoma

(GOLDSTEIN e TUCKER 1995). O melanoma familial é uma condição

genética e, até o momento, dois genes foram envolvidos, o CDKN2A e o

CDK4, localizados no cromossomo 9p21. A mutação do gene supressor de

tumor CDKN2A foi descrita em 20% dos melanomas familiais (KRAEMER

2003; THOMPSON et al. 2005; WANG et al. 2005). O risco de desenvolver

melanoma é de 30 a 70 vezes maior em indivíduos com história familial

significativa comparada com a população geral (THOMPSON et al. 2005;

ISAACSON e RAMSAY 2007) (Quadro 1).

1.6.4 Imunossupressão

Os pacientes com transplante renal, submetidos à terapia

imunossupresora, apresentam risco de desenvolver o melanoma cutâneo em

três vezes, se comparados com a população geral (JENSEN et al. 1999)

(Quadro 1).

Os pacientes com infecção HIV apresentam risco relativo de

desenvolvimento do melanoma cutâneo de 1,5 (GRULICH et al. 1999).

Quadro 1 - Fatores de risco clínicos para o desenvolvimento do melanoma

cutâneo.

Risco Relativo Melanoma Cutâneo

Fatores Constitucionais

Tipode pele I 2,1

Efélides 2,1

Cabelos ruivos 3,6

Olhos azuis 1,5

Presença de nevos melanocíticos

Comuns (100 – 115 lesões) 7-12

Atípicos (5 lesões) 6

História pessoal de câncer da pele

Melanoma 8,6

Não melanoma 2,9

Fatores Genéticos

Melanoma familial 30-70

Fatores Ambientais

Exposição solar intermitente 1,4

Exposição solar crônica 1,1

Queimadura solar/ Alta latitude 2,5

Queimadura solar/ Baixa latitude 1,9

Outros Fatores

Imunossupressão 3

Fonte: Adaptada de THOMPSON et al. (2005).

1.7 MODELO DE PROGRESSÃO DO MELANOMA

CLARK et al. (1984) propuseram um modelo de desenvolvimento e

progressão dos melanomas, baseado em modelos experimentais,

observações clínicas e histopatológicas, composto por 6 etapas: (0):

melanócito precursor; (1): nevos comuns adquiridos ou congênitos, com

presença de melanócitos normais; (2) nevos displásicos, com atipia

estrutural e arquitetural, sugere-se que sejam lesões precursoras de

melanoma; (3) melanoma de crescimento radial, melanomas primários não-

tumorigênicos sem capacidade de metastatização; (4): melanoma de

crescimento vertical, melanomas primários que invadem a derme e com

capacidade potencial de metastatização; (5): melanoma metastático (CLARK

et al. 1984; LI e HERLYN 2000; CHAMMAS et al. 2003).

No modelo de progressão, os nevos comuns adquiridos ou congênitos

são formados por células nevomelanocíticas, melanócitos de formato oval,

ausência de dendritos e capacidade de formar ninhos em todas as camadas

da epiderme e derme (CLARK et al. 1984).

Propõe-se que o componente dérmico dos nevos compostos resulte

da migração de células névicas da junção dermo-epidérmica para a derme.

Na derme profunda, as células névicas sofrem o processo de diferenciação,

tornando-se morfologicamente menores e sem a capacidade proliferativa

(CLARK et al. 1984).

Acredita-se que a formação de nevos advindos de melanócitos

maduros seja induzida pela disrrupção da comunicação célula-célula entre

ceratinócitos e melanócitos, levando a um escape do melanócito ao controle

regulatório do ceratinócito. Sugere-se ainda que a proliferação limitada das

células névicas na derme se deva pela aparente ausência de aberrações

cromossômicas (CLARK et al. 1984).

A progressão de melanócitos precursores ou nevos adquiridos

comuns em nevos displásicos (ou atípicos) e melanoma de crescimento

radial parece decorrer da aquisição de alterações genéticas. As células

apresentam atipia citológica e arquitetural, perdem a adesão com a

membrana basal sem sofrerem apoptose e modificam-se antigênicamente e

suscitam uma resposta imune do hospedeiro. Na fase de crescimento radial,

ocorre um crescimento celular tumoral limitado à epiderme ou com mínima

invasão dérmica (CLARK et al. 1984).

Na fase de crescimento vertical, as células adquirem um

comportamento proliferativo e invasivo descontrolado, iniciando o processo

de angiogênese, acionamento de mecanismos de escape da resposta imune

do hospedeiro, o que confere ao tumor, capacidade de metastatização

(CLARK et al. 1984).

Fonte: Adaptado de CLARK et al. (1984)

Figura 1 - Modelo de progressão tumoral em melanomas.

1.8 O ESTUDO DO CÂNCER POR MEIO DO TISSUE

MICROARRAY (TMA)

A técnica de tissue microarray - TMA foi descrita em 1998 por

KONONEN et al. e permite a avaliação de centenas de amostras teciduais,

fixadas em formalina em bloco de parafina, em uma única lâmina (RUBIN

2001; KORABIOWSKA et al. 2004). Este método para análise de expressão

gênica é de extrema importância, dada a grande variedade de genes

candidatos descobertos por meio da técnica de cDNA microarray (FRANTZ

et al. 2001; RUBIN 2001). A técnica de TMA baseia-se na análise de

amostras de tecidos em blocos de parafina que compõem os arquivos de

Hiperplasia

Melanocítica

Nevo

Juncional

Nevo

Displásico

Melanoma

RGP

Melanoma

VGP

patologia. Desta forma, grande variedade de tumores, além de amostras

numerosas, pode ser estudada (ALIZADEH et al. 2001; LEWIS et al. 2001;

KIELHORN et al. 2003; PACIFICO et al. 2005). Mais importante ainda é o

fato de que as amostras podem ter sido coletadas há vários anos, permitindo

a devida análise de dados em relação ao acompanhamento e evolução

clínica dos doadores dos tecidos estudados (ALIZADEH et al. 2001;

BUBENDORF 2001; KIELHORN et al. 2003). A técnica de TMA baseia-se na

obtenção de amostras de blocos de parafina coletadas por meio de agulha

(punch) com diâmetro de 0,6; 1,0; 1,5 ou 2,0 milímetros, que são inseridas

em um bloco receptor, por meio de um aparelho chamado Tissue

Microarrayer (BUBENDORF 2001). Pode-se, assim, coletar até 700

espécimes em cada bloco receptor, com pouca mutilação do bloco de

origem. O bloco receptor montado pode prover de 100 a 400 cortes de 5 a 8

micras, que podem ser analisados por meio de grande variedade de 11

sondas de DNA, RNA e proteínas (ALIZADEH et al. 2001; BUBENDORF

2001; LEWIS et al. 2001; KORABIOWSKA et al. 2004; PACIFICO et al.

2004). Pode-se, então, realizar, simultaneamente, a análise de DNA, RNA e

expressão de proteínas em todos os espécimes em um único experimento e,

ainda, analisar centenas de marcadores moleculares no mesmo grupo de

espécimes.

1.9 UTILIZAÇÃO DO TMA NO ESTUDO DO MODELO DE

PROGRESSÃO DO MELANOMA

As lesões benignas e malignas originadas dos melanócitos

representam um dos melhores modelos de estudo da progressão tumoral,

sendo o nevo melanocítico considerado o primeiro passo da via de

progressão tumoral descrita para os melanomas (ELDER et al. 1989).

Poucos foram os trabalhos realizados com amostras de nevos e

melanomas finos pela dificuldade de obtenção de amostra representativa do

tumor por meio da técnica de confecção do TMA. Em um trabalho publicado

por TELLEZ et al. (2007) para verificação da expressão da proteína alpha –

2 (AP – 2) e do receptor de protease ativada 1 (PAR – 1) no modelo de

progressão do melanoma, na construção do TMA foram utilizadas amostras

de nevos melanocíticos comuns, nevos melanocíticos atípicos, melanomas

primários e melanomas metastáticos.

Como conclusão observaram que a perda da proteína AP – 2

(progressão tumoral e potencial metastático) é um evento crucial na

progressão do melanoma humano e contribui para a evolução para o

fenótipo metastático por meio da ativação da via de PAR – 1 (efeito

mitogênico, sobrevivência e metástase) (TELLEZ et al. 2007).

Na tentativa de caracterizar a expressão das proteínas em diferentes

fases do modelo de progressão tumoral nos melanomas (ciclo celular,

apoptose, antígenos, fatores transcricionais, reparo do DNA e outras),

ALONSO et al. (2004) estudaram 39 proteínas utilizando TMA. Foram

confeccionados seis diferentes TMAs, contendo nevos melanocíticos

comuns, melanoma de crescimento radial, melanoma de crescimento

vertical, melanomas nodulares e metástases de melanoma.

SIMIONATO NETO et al. (2007) utilizaram a técnica de TMA para

descrever a expressão de alpha –v – beta3 integrina (αvβ3) nos melanomas

cutâneos. Para este estudo, os nevos melanocíticos e o melanoma fino

foram analisados em cortes histológicos tradicionais e o TMA foi realizado

apenas para os melanomas invasivos e metástáticos. Os resultados

mostraram que a proteína αvβ3 não teve impacto no comportamento

tumoral, apesar de se mostrar com expressão aumentada nos melanomas in

situ.

1.10 A UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE MICROARRANJOS DE

CDNA NO ESTUDO DO MODELO DE PROGRESSÃO DO

MELANOMA

A tecnologia de microarranjos de cDNA permite a análise de milhares

de genes em um único experimento e tem sido empregada em diversas

doenças humanas, particularmente no estudo dos cânceres, com o objetivo

de identificar genes envolvidos na oncogênese e progressão tumoral (KIM et

al. 2002). Esta técnica está sendo utilizada em lesões melanocíticas

contribuindo na identificação de genes diferencialmente expressos entre

nevos, melanomas primários (SEYKORA et al. 2003) e metastáticos (HAQQ

et al. 2005).

1.11 UTILIZAÇÃO DA ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA

(ARRAY) NO ESTUDO DO MODELO DE PROGRESSÃO DO

MELANOMA REALIZADO NO HOSPITAL A.C. CAMARGO –

MOTIVAÇÃO DO PRESENTE ESTUDO

Realizou-se um estudo no Laboratório de Inflamação do Instituto

Ludwig de Pesquisa para o Câncer/ Hospital A.C. Camargo por meio da

técnica de microarranjos de cDNA e estudou-se o perfil de expressão gênica

dos melanomas e nevos melanocíticos compostos e intradérmicos

(MARTINS 2007; MUTO 2007). Houve diferenças na expressão gênica

global entre nevos melanocíticos e melanomas, uma vez que as amostras

puderam ser separadas por métodos de grupamento não supervisionados.

Foram identificados 510 trios classificadores capazes de distinguir as

amostras com 100% de precisão. Treze módulos funcionais mostraram

alterações com significância estatística entre nevo e melanoma,

correspondendo a genes envolvidos com junção intercelular, comunicação e

adesão celular.

Alguns genes como claudina 4, proteína gap junction A1, calicreina 7,

desmocolina 3 e ceratina 5 encontravam-se com aumento de expressão em

nevos melanocíticos, enquanto que colágeno tipo IV alfa1 e laminina 4

mostravam-se com aumento de expressão em melanomas. Foi verificado

que a relação entre colágeno 4/ desmocolina 3 era >1 em melanomas

cutâneos e <1 em nevos melanocíticos benignos (MUTO 2007).

Estes dados sinalizam que a interação melanócito-ceratinócito,

melanócito-melanócito e melanócito-matriz extracelular pode ter um papel

significativo na gênese das lesões melanocíticas e possivelmente no

comportamento biológico dos melanomas.

1.11.1 Desmocolina 3 (Dsc3)

O gene que codifica a proteína desmocolina 3 está localizado no

cromossômo 18 na localização 18q12.1. A proteína codificada por este gene

é uma glicoproteína transmembrânica cálcio-dependente que é membro da

subfamília da superfamília das caderinas. Os membros desta família

desmossomal foram encontrados primariamente nas células epiteliais e são

considerados proteínas adesivas e necessárias para a adesão celular e

formação dos desmossomos.

A adesão célula-célula é considerada importante para o

desenvolvimento e manutenção de um órgão humano. Nos tecidos celulares

escamosos, a adesão celular promove a integridade do tecido para proteção

do ambiente externo. A adesão celular na epiderme é mantida por duas

principais estruturas de adesão: as junções aderentes e os desmossomos.

As junções aderentes são formadas pelas caderinas clássicas e pelas

proteínas α-catenina, β-catenina e plakoglobina e são conectadas aos

microfilamentos de actina. Os desmossomos são compostos pos dois tipos

de caderinas desmossomais: desmogleína e desmocolina. A desmocolina 3

é considerada essencial na formação dos desmossomos, pois o seu domínio

terminal citoplasmático é responsável pelo recrutamento das plakoglobinas,

desmoplakinas e inserção com as ceratinas (HANAKAWA et al. 2000). As

desmocolinas 1 e 3 estão expressas apenas em epitélios estratificados

escamosos. A desmocolina 1 é mais expressa na porção mais terminal e

diferenciada do epitélio. A desmocolina 3 é mais expressa nas camadas

mais próxima da membrana basal (OSHIRO et al. 2005).

A participação dos componentes demossomais no câncer é

enigmática e uma das mais intrigantes funções das proteínas

desmossomais, relacionadas ao câncer, é a habilidade de inibir a motilidade

celular (OSHIRO et al. 2005).

O gene da desmocolina 3 está expresso em tecidos normais de mama

e sua expressão se mostrou diminuída nos tumores primários de mama e

linhagens celulares de câncer de mama. Neste trabalho realizado por

OSHIRO et al. (2005), a expressão do gene que codifica a proteína

desmocolina 3 (DSC3) mostrou-se diminuída em 72% dos tumores primários

de mama e 79% das linhagens celulares de câncer de mama testadas. O

silenciamento de DSC3 foi relacionado a hipermetilação aberrante de

citosina em 41% dos tumores primários de mama. Demonstrou-se in vitro,

que DSC3 encontrava-se epigeneticamente silenciado, nas linhagens

celulares de câncer de mama, decorrentes da hipermetilação de citosina na

região promotora (OSHIRO et al. 2003, 2005).

Muitos dos espécimes de tumores primários nas quais a perda da

expressão de DSC3 foi verificada, não foram associadas com a metilação da

região promotora. Nestes casos, OSHIRO et al. (2003, 2005) hipotetizaram

que a perda de fatores transcricionais críticos levaria à exposição das

regiões promotoras, que sofreriam a hipermetilação aberrante de citosina

induzindo silenciamento da expressão gênica, semelhante à regulação

epigenética dos genes. Demonstraram ainda, que DSC3 é um gene de

resposta ao gene p53 uma vez que a adição de p53 selvagem é suficiente

para induzir acetilação do promotor de DSC3 e induzir re-expressão de

DSC3 em linhagens celulares de câncer de mama.

As caderinas desmossomais em humanos são sete, sendo três

desmocolinas (DSC1-3) e quatro desmogleínas (DSG1-4). A perda da

expressão das caderinas desmossomais já foi descrita em vários tipos de

câncer (BIEDERMANN et al. 2005; OSHIRO et al. 2005) e a expressão

aumentada destas caderinas em cultura de fibroblastos não adesivos gera

adesão e inibe a invasão celular, levando à hipótese de que as proteínas

desmossomais têm um papel como genes supressores de tumor (TSELEPIS

et al. 1998).

KHAN et al. (2006) demonstraram pela primeira vez que a expressão

de DSC2 está reduzida no câncer colorretal (o tecido colorretal normal

expressa apenas DSC2) e é acompanhada pela expressão de novo das

DSC1 e DSC3. As alterações no padrão de expressão das desmocolinas

levaria à alteração da função dos desmossomos e reduziria a adesão entre

as células epiteliais colônicas, resultando em uma propensão à proliferação

celular, invasão e metástases. A substituição das isoformas da desmocolina

poderia afetar a localização dos constituintes desmossomais no citoplasma,

principalmente a redistribuição da plakoglobina (γ - catenina) da membrana

para o citoplasma, levando à ativação da via de ativação do oncogene c-

myc. Os distúrbios da expressão das desmocolinas poderia afetar a via de

sinalização de β – catenina. A desrregulação de β – catenina poderia ter

papel importante nas fases iniciais da tumorigênese colorretal (KHAN et al.

2006).

1.11.2 Calicreinas (KLKs)

As calicreinas são um subgrupo das proteases de serina com

diferentes funções fisiológicas. Muitas são as evidências que sugerem que

algumas calicreinas estão envolvidas com a carcinogênese e são

consideradas potenciais marcadores moleculares de diagnóstico e

prognóstico em diferentes neoplasias. O gene que codifica os quinze

membros da subfamília das calicreinas está localizado no cromossomo 19.

(PALIOURAS et al. 2007; SHAW e DIAMANDIS 2007). As calicreinas estão

expressas em diferentes tecidos humanos. A expressão de KLK2, KLK3,

KLK4, KLK11 e KLK15 foi verificada na próstata por meio da dosagem do

RNAm. Quase todas as calicreinas foram encontradas nas glândulas

salivares e alguns subgrupos foram descritos na pele (KLK1, KLK4, KLK5,

KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLK10, KLK11, KLK13 e KLK14), pâncreas

(KLK1, KLK6,-13) e sistema nervoso central (KLK6, KLK7, KLK8, KLK9 e

KLK14). A presença das calicreinas nos fluidos biológicos como soro,

plasma seminal e leite em mulheres durante o período de amamentação

confirma que são proteínas secretadas in vivo (BORGOÑO et al. 2004).

Algumas enzimas codificadas por este gene (KLK) parecem estar

envolvidas com a proteólise de estruturas intercelulares de coesão que

precedem a descamação fisiológica das camadas mais superficiais da

epiderme. A descamação das camadas da epiderme é um processo natural

e importante para a contínua regeneração da pele. O descontrole patológico

da descamação e a inflamação da pele são responsáveis pelos sintomas

observados em doenças severas da pele como síndrome de Netherton

(ictiose linear circunflexa), psoríase, dermatite atópica e outras. As proteínas

KLK5 e KLK7 têm papel essencial nestes processos, degradando os

desmossomos, que são estruturas responsáveis pela adesão célula-célula e

que promovem ativação de proteínas pró-inflamatórias (EGELRUD et al.

2005)

A proteína LEKTI é reguladora do processo de descamação

epidérmica por meio do controle da atividade de KLK5 e KLK7. DERAISON

et al. (2007) propuseram um modelo de descamação (Figura 2) no qual o pH

controla a atividade das calicreinas, regulando suas interações com LEKTI.

No estrato córneo mais profundo o pH neutro permite uma grande interação

entre LEKTI e as KLKs no interstício dos corneócitos, impedindo a clivagem

dos corneodesmossomos. Conforme a acidificação da camada córnea mais

superficial, ocorre a dissociação entre LEKTI/KLK5 e LEKTI/KLK7,

permitindo a degradação dos corneodesmossomos. Nas camadas mais

superficiais da camada córnea o pH é baixo suficiente para assegurar uma

grande dissociação entre LEKTI e as KLKs (KLK5 e KLK7). As KLKs em pH

ácido ganham atividade e degradam os componentes desmossomais como

desmogleina 1, desmocolina 1 e corneodesmosina. A completa degradação

dos desmossomos leva ao despregamento dos corneócitos mais superficiais

(descamação epidérmica) (CAUBET et al. 2004; DERAISON et al. 2007).

Fonte: DERAISON et al. (2007)

Figura 2 - Modelo de descamação da epiderme.

BRATTSAND et al. (2005) em um estudo in vitro verificaram que a

KLK7 é a responsável pela maior parte da atividade proteolítica no estrato

córneo. A KLK5 é ativadora da KLK7, do seu próprio precursor e o precursor

da KLK14, por sua vez, a KLK14 ativa o precursor da KLK5 que resulta na

ativação da KLK7. Esta cascata proteolítica descrita no processo de

descamação celular provavelmente envolve outras calicreinas com baixo

nível de expressão presentes na epiderme.

BORGOÑO et al. (2007) em um estudo in vitro, evidenciaram o

envolvimento das KLK1, KLK5, KLK6 e KLK14 no processo de descamação

epidérmica por meio da clivagem da desmogleína1 (componente dos

desmossomos) promovida por estas proteínas.

Por meio da técnica de PCR, JOHNSON et al. (2007) encontraram o

aumento da expressão de KLK7 em adenocarcinomas ductais pancreáticos

em relação ao tecido pancreático normal. Baseados nas observações de que

a KLK7 está envolvida com a descamação celular e tem a propriedade de

clivar o domínio extracelular da proteína E-caderina diminuindo a agregação

entre as células pancreáticas, propuseram que a expressão aberrante de

KLK7 pode ter papel importante no desenvolvimento do câncer pancreático.

Utilizando tecido fresco congelado, SHAN et al. (2006) observaram

que a proteína KLK7 se apresentava em baixas concentrações em tecido

ovariano normal, em lesões benignas do ovário e tumores não ovarianos

metastáticos. No câncer ovariano, entretanto, KLK7 se encontrava 10 a 15

vezes aumentada e este aumento se correlacionou com os estádios mais

avançados da doença.

Em relação à KLK6, além de se mostrar envolvida com a cascata

proteolítica da descamação epidérmica, foi encontrada com grande

expressão em doenças do sistema nervoso central (SNC). Alguns achados

laboratoriais sugeriram que a KLK6 é uma molécula mediadora inflamatória

das doenças desmielinizantes do SNC (CHRISTOPHI et al. 2004).

1.11.3 Citoceratina 5 (CK5)

As citoceratinas são filamentos intermediários e estão subdivididas

em duas famílias baseadas no peso molecular. O tipo I é uma subfamília

composta por citoceratinas ácidas e o tipo II é composta por citoceratinas

básicas. Nas células, as citoceratinas são geralmente encontradas aos

pares, um de cada família. Existe uma correlação entre a complexidade do

epitélio e o tamanho das subunidades expressas. Como regra, epitélios

simples expressam citoceratinas de baixo peso molecular e epitélios

estratificados contêm citoceratinas de alto peso molecular (RIBEIRO-SILVA

et al. 2005) A relação entre os padrões de expressão das citoceratinas e o

grau de diferenciação celular tem sido estudado na tentativa de reconhecer

painéis de expressão de citoceratinas em diferentes neoplasias (SIGEL et al.

2001).

A proteína citoceratina 5 (CK5) é um membro da família das ceratinas

cujo gene está localizado no cromossomo 12 e é uma citoceratina tipoII. A

citoceratina 5 e 14 são expressas na camada basal da epiderme, ceratina 1

e 10 na camada espinhosa e ceratina 2 e 11 na camada granulosa. Na

epiderme em proliferação, como por exemplo, na pasoríase ou no processo

de cicatrização epidérmica, os ceratinócitos suprabasais sintetizam

citoceratinas 6 e 16 (BHAWAN et al. 2005).

Geneticamente se considera a inexistência da expressão de

citoceratinas nos melanócitos e nas células da crista neural. KATAGATA et

al. (1999) demonstraram a presença das subunidades de ceratina (K) K8 e

K18 em cultura de células da crista neural e a presença de K1, K5, K10 e

K14 em cultura de melanócitos. Observaram, através da microscopia

eletrônica, que as subunidades das citoceratinas não formavam filamentos

em cultura de células do melanoma. Postularam que existe uma alteração na

formação dos filamentos de citoceratina durante o processo de

transformação do melanócito para o melanoma.

BHAWAN et al. (2005) demonstraram a presença de K16 nos

melanócitos da pele humana normal e em cultura de melanócitos, em estudo

imunoistoquímico. Sugeriram que a expressão da citoceratina em

melanócitos pode afetar a formação dos dendritos e sua interação com os

ceratinócitos epidérmicos.

MIETTINEN e FRANSSILA (1989) observaram por meio de estudo

imunoistoquímico a presença de filamentos de proteínas intermediárias nos

melanócitos atípicos. Concluíram que a composição do citiesqueleto dos

melanomas é mais complexa do que se pensava previamente e que os

melanomas contêm citoceratinas.

1.11.4 Cx43

As junções tipo fenda (gap junctions) são canais da membrana celular

especializadas e têm a função de permitir a transferência pequenas

moléculas (<100Dalton), íons, água e nucleotídeos, que passam

seletivamente de uma célula à outra. São importantes na coordenação do

desenvolvimento e homeostase celular. São compostos por dois hemicanais

provenientes da cada uma das células em contato, chamados de conexons.

Cada conexon é composto por seis proteínas transmembrana, as conexinas.

O gene da família das conexinas codifica 21 diferentes proteínas nos

humanos. A conexina 43 é a mais abundante em um grande espectro de

tecidos, nos epitélios, coração, útero, tecido conectivo e cérebro (TROSKO e

RUCH 1998; LANGLOIS et al. 2008).

Seis subunidades da conexina 43 são oligomerizadas no aparelho de

Golgi e formam o conexon (hemicanal) que, por sua vez, é transportado para

a superfície celular. Na superfície celular o conexon se alinha com o

conexon da célula adjacente para formar um canal. Centenas de canais se

agregam em uma placa (gap junction plaques) (TROSKO e RUCH 1998).

2 JUSTIFICATIVA

O melanoma cutâneo é um tumor resultante das interações

complexas entre os fatores genéticos, constitucionais e ambientais. Sua

incidência vem aumentando mundialmente na população branca, sendo

superado apenas pelo câncer de pulmão e tem alta taxa de mortalidade

(HALABAN 1993). Teoricamente pode se originar dos nevos melanocíticos,

dentre eles os nevos atípicos (SLOMINSKI et al. 2001). O prognóstico está

relacionado com a profundidade da lesão na pele sendo o diagnóstico

precoce de fundamental importância. O tratamento cirúrgico nos estádios

iniciais da doença, na maioria dos casos, é curativo, porém nos estádios

avançados o tratamento permanece limitado uma vez que o melanoma é

considerado um tumor radio e quimio-resistente (WANG et al. 1995).

Assim, justifica-se o estudo de marcadores tumorais que possam

auxiliar no entendimento da origem e desenvolvimento do melanoma, do

ponto de vista molecular. A caracterização da expressão alterada de genes,

por meio do estudo das proteínas no processo de transformação do nevo

para o melanoma poderá contribuir na identificação de lesões potenciais

precursoras, que seriam caracterizadas por um fenótipo considerado de alto

risco para o desenvolvimento desta neoplasia resultando no tratamento em

estádios muito precoces, levando à cura ou melhorando a sobrevida dos

pacientes. O estudo das proteínas também poderia contribuir para o

entendimento de vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento e

progressão tumoral.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

1. Avaliar a expressão de proteínas envolvidas na junção intercelular,

comunicação intercelular e adesão celular em nevos comuns, nevos

atípicos, melanomas invasivos (finos e espessos) e melanoma

metastático, visando contribuir para o entendimento dos processos

moleculares que levam um nevo a se transformar em melanoma

(Modelo de Progressão do Melanoma).

2. Validar os dados obtidos de genes diferencialmente expressos

identificados por microarranjos de cDNA em pesquisas realizadas

nesta instituição.

3.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 Avaliar a expressão da proteína conexina 43 (proteína gap junction),

calicreina 7, calicreina 6, desmocolina 3 e keratina 5 em nevos

comuns, nevos atípicos, melanomas invasivos (finos e espessos) e

metástases de melanoma por meio do estudo imunoistoquímico,

utilizando-se a técnica de TMA.

2 Avaliar a correlação entre as proteínas estudadas no modelo de

progressão do melanoma.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CASUÍSTICA

Foram utilizadas lâminas do TMA de melanomas extensivos

superficiais com Breslow maior que 1mm e metástases, confeccionado no

Departamento de Anatomia Patológica do Hospital A.C. Camargo para a

tese de mestrado da Dra. Bianca Costa Soares de Sá contendo 111 casos

(de 1994 a 2000) (SÁ 2005). Foram utilizadas lâminas do TMA de

melanomas cutâneos submetidos à pesquisa do linfonodo sentinela com 67

casos, confeccionado no Departamento de Anatomia Patológica do Hospital

A.C. Camargo para a tese de mestrado do Dr. Christiano Horta (LIMA

JUNIOR 2006). Os TMAs utilizados continham no total 27 casos de nevos

comuns como controle (10 e 17 casos respectivamente).

Foram selecionados 32 casos de nevos melanocíticos comuns de

pacientes que foram submetidos à exérese cirúrgica dos mesmos no período

de 2003 a 2007 e 22 nevos atípicos de pacientes que foram submetidos à

exérese cirúrgica no período de 2003 a 2006 para confecção de TMA de

nevos comuns e atípicos.

Foram selecionados 25 casos de melanoma fino (Breslow < 1mm) de

pacientes que foram submetidos à exérese cirúrgica dos mesmos no período

de 2003 a 2005 para confecção de TMA de melanomas finos.

4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

Para a confecção de todos os TMAs:

1 Pacientes cujo diagnóstico histopatológico (melanoma cutâneo, nevo

atípico e nevo comum) tenha sido realizado no Hospital A.C. Camargo

cujos blocos de parafina estavam disponíveis nos arquivos do

Departamento de Anatomia Patológica, dispondo de material

suficiente para confecção do TMA.

2 Pacientes cujo diagnóstico de melanoma foi realizado no Hospital

A.C. Camargo submetidos à pesquisa de linfonodo sentinela, com

blocos de parafina disponíveis nos arquivos do Departamento de

Anatomia Patológica e que contenham material suficiente para o

estudo.

3 Nos pacientes em que havia metástases para estudo, foram incluídas

aquelas cujos blocos de parafina estavam disponíveis nos arquivos do

Departamento de Anatomia Patológica e que dispunham de material

suficiente para confecção do TMA.

4 Pacientes com pelo menos 2 anos de seguimento clínico encontrado

nos prontuários a partir do diagnóstico histopatológico de melanoma

cutâneo.

4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA

Os preparados histológicos foram revistos e classificados de acordo

com o protocolo de diagnóstico utilizado na instituição (Departamento de

Anatomia Patológica do Hospital A.C. Camargo), em consonância com o

consenso histopatológico proposto pelo Grupo Brasileiro de Melanoma

(LANDMAN et al. 2003)

Foram avaliados os seguintes critérios:

a. Tipo histológico: foram considerados: lentigo maligno melanoma,

melanoma extensivo superficial, melanoma acral lentiginoso,

melanoma nodular e outros (melanoma desmoplásico, neurotrópico,

nevóide, spitzóide e verrucoso.). Sabe-se que a fase in situ do

melanoma tem períodos variáveis de evolução para fase infiltrativa,

sendo muita longa no lentigo maligno melanoma e curta no extensivo

superficial e acral lentiginoso. Na fase infiltrativa alguns tipos de

melanoma parecem se comportar de forma mais agressiva como o

melanoma nodular.

b. Fase de crescimento: são consideradas as fases de crescimento:

Radial: não tumorigênica; in situ e/ou microinvasiva, caracterizada por

crescimento indolente mas progressivo. As células melanocíticas na

derme não apresentam mitoses, crescimento expansivo ou necrose e

estão isoladas ou em pequenos grupamentos.

Vertical: invasiva, caracterizada por crescimento infiltrativo da derme,

com alto grau de atipia nuclear, mitoses, invasão dos tecidos

adjacentes e necrose. Em lesões pouco espessas utiliza-se três

critérios: a) ninhos dérmicos maiores que os epidérmicos; b) qualquer

mitose dérmica; c) ninhos de qualquer tamanho com crescimento

expansivo nítido, comprimindo a derme adjacente.

c. Nível de Clark: determinado pelos cinco níveis definidos por CLARK et

al. (1969). São eles:

Nível I: limitação das células de melanoma à epiderme e seus

apêndices.

Nível II: extensão à derme papilar com poucas células de

melanoma estendendo-se à interface entre a derme papilar e a

reticular.

Nível III: extensão das células tumorais por toda a derme papilar

sem invadir a derme reticular

Nível IV: invasão da derme reticular.

Nível V: invasão da tela subcutânea.

d. Profundidade segundo BRESLOW (1970): Esta medida determina o

volume da neoplasia e correlaciona-se diretamente com a

profundidade de infiltração do tumor. É expressa em milímetros e

determinada a partir da camada granulosa até a célula neoplásica

mais profunda encontrada. A espessura do tumor é considerada o

fator prognóstico isolado mais importante nos pacientes com

melanoma localizado (estádios I e II) (BALCH et al. 2001a). O limite

de 1 mm define os melanomas finos e de bom prognóstico e o

estadiamento, determinado pelo American Joint Committee on

Cancer, define para a categoria T (tumor) os limites de 1.0, 2.0 e

4.0mm (BALCH et al. 2001a) (Quadro1).

e. Índice mitótico: avaliado em lesões em fase vertical de crescimento,

na área de maior concentração de mitoses, e, equivale a quantidade

de mitoses em aproximadamente 1mm

(10 campos de grande

aumento na objetiva de 40x). O índice mitótico é também considerado

um importante fator prognóstico nos pacientes com melanoma e em

alguns estudos até com maior significância que a ulceração, mas

estes dados ainda são controversos, principalmente pelo uso de

diferentes métodos de mensuração nos diversos estudos sobre o

tema (AZZOLA et al. 2003; BUSAM 2004; FRANCKEN et al. 2004;

BARNHILL et al. 2005; NAGORE et al. 2005).

f. Ulceração: é definida como solução de continuidade da epiderme,

substituída por tampão fibrino-leucocitário sobre a lesão primária, em

decorrência da infiltração neoplásica (BALCH et al. 2001b). A

ulceração é o segundo fator prognóstico mais importante nos

melanomas localizados (estádios I e II) (BALCH et al. 2001a e b). Nos

melanomas em estádio III, é a característica histológica de pior

prognóstico do tumor primário (BALCH et al. 2001a e b). Nos

melanomas com espessura acima de 1 mm é considerada o fator

preditivo mais significativo, representando maior risco de

desenvolvimento de metástases (BALCH et al. 2001a e b). A

presença de ulceração define os subgrupos da categoria T (tumor) de

acordo com o novo estadiamento determinado pelo American Joint

Committee on Cancer (BALCH et al. 2001a e b) (Quadros 1 e 2).

g. Regressão: é definida como uma área, dentro do melanoma, onde há

ausência de células neoplásicas na epiderme e na derme,

substituídas por tecido fibroso e aumento da vascularização, podendo

ser encontrados linfócitos e melanófagos (CLARK et al. 1989). As

opiniões entre os autores são controversas em relação à associação

entre regressão e pior prognóstico do tumor (BLESSING et al. 1990).

A regressão é encontrada em cerca de 1/3 dos casos de melanoma.

Ao contrário do que se esperaria, o encontro de regressão tem sido

associado a um pior prognóstico, possivelmente indicando que a

neoplasia antes do processo regressivo estaria a uma profundidade

maior do que a atualmente encontrada, portanto com evolução mais

reservada. Outra explicação possível indica que o sistema imune

reconheceria clones selecionados de células neoplásicas, destruindo-

os, o que por outro lado selecionaria clones resistentes à resposta

imune do hospedeiro (TRAU et al. 1983; CLARK et al. 1989).

Quadro 2 - Classificação TNM do Melanoma, segundo American Joint

Committee on Cancer, 2002.

T Espessura Ulceração

Tis Melanoma in situ

T1 ≤ 1 mm a: ausência de ulceração e nível II/III b: com ulceração ou nível IV/V

T2 1 – 2 mm a: ausência de ulceração b: com ulceração

T3 2 – 4 mm a: ausência de ulceração b: com ulceração

T4 > 4 mm a: ausência de ulceração b: com ulceração

N No linfonodos metastáticos Infiltração tumoral do linfonodo

N1 1 linfonodo

a: micrometástases*

b: macrometástase**

N2 2 – 3 linfonodos

a: micrometástases*

b: macrometástase**

4 ou mais linfonodos metastáticos, ou linfonodos confluentes, ou metástases em

trânsito / satelitoses com linfonodos metastáticos

* micrometástases são diagnosticadas após pesquisa de linfonodo sentinela ou

linfadenectomia eletiva

**macrometástases são definidas como metástases em linfonodo, clinicamente detectável,

confirmado por linfadenectomia terapêutica ou quando a metástase linfonodal exibe

extensão extracapsular macroscópica

M1 Localização DHL no soro

M1a Metástase cutânea, subcutânea ou nodal à distância Normal

M1b Metástase em pulmão Normal

M1c

Metástases em outras víceras

Qualquer metástase

Normal

elevado

Fonte: Adaptado de BALCH et al. (2001b)

Quadro 3 - Estadiamento clínico e patológico do Melanoma, segundo

American Joint Committee on Cancer, 2002.

Estadiamento clínico* Estadiamento patológico+

T N M T N M

0 Tis N0 M0 0 Tis N0 M0

IA T1a N0 M0 IA T1a N0 M0

IB T1b

T2a

IB T1b

T2a

IIA T2b

T3a

IIA T2b

T3a

IIB T3b

T4a

IIB T3b

T4a

IIC T4b N0 M0 IIC T4b N0 N0

III QqT N1

M0 III

IIIA T1-4a

T1-4a

N1a

N2a

IIIB T1-4b

T1-4b

T1-4a

T1-4a/b

N1a

N2a

N1b

N2b

N2c

IIIC T1-4b

T1-4b

QqT

N1b

N2b

IV QqT QqN M1 IV QqT QqN M1

*estadiamento clínico inclui microestadiamento do melanoma primário e avaliação clínica e

radiológica para metástases.

+estadiamento patológico inclui microestadiamento do melanoma primário e informações

patológicas a respeito dos linfonodos regionais após linfadenectomia parcial ou completa.

Fonte: Adaptado de BALCH et al. (2001b)

4.3.1 Confecção do TMA

A partir da lâmina original corada com Hematoxilina Eosina (H&E) as

áreas de tumor foram marcadas com caneta e serviram de guia para

identificação da área equivalente a ser puncionada no bloco “doador”. O

cilindro de tecido retirado do bloco doador foi transferido para o bloco

receptor por meio do uso do equipamento disponível no Departamento de

Anatomia Patológica do Hospital do Câncer: tissue microarrayer (Beecher

Instrunents ®, Silver Spring, EUA) (Figura 3).

Legenda: À esquerda ilustração da técnica necessária para a confecção do TMA. Ao meio o

bloco de TMA já confeccionado. À direita o bloco de TMA e uma lâmina corada em H&E.

Figura 3 – A confecção do TMA

Os blocos de TMA foram confeccionados com cilindros, em duplicata,

de um milímetro (tissue microrrayer punch MP10-1,0 mm) de diâmetro de

amostras do tumor (melanomas cutâneos), em duplicata (dois cores de

cada caso). Foram incluídas amostras de nevos melanocíticos como controle

das reações. Foi adicionado um cilindro de tecido hepático para orientação

inicial de cada seqüência dos casos utilizados.

A mesma técnica foi utilizada para a realização do TMA de nevos

comuns e nevos atípicos e o TMA de melanoma fino. Este último foi

realizado em triplicata (3 cores de cada caso) para maior representatividade

do tecido.

Confecção das lâminas de vidro a partir dos TMAs de melanoma

invasivo e melanoma invasivo com LNS positivo.

A partir do bloco de TMA foram preparados 100 cortes histológicos

seriados em lâminas de vidro previamente tratadas com película aderente

especial (Instrumedics USA) na espessura de 5 μm.

As lâminas 01, 10, 40, 60, 80 e 100 foram coradas com Hematoxilina

e Eosina para controle da representatividade do material. Duas lâminas

distando 10 cortes entre si foram utilizadas para reação de imunoistoquímica

para os marcadores acima mencionados. Por meio de uma planilha

realizada em Excel® (Windows® – Microsoft® office) é possível localizar

cada caso nas lâminas do TMA.

A partir dos blocos dos TMAs de nevos e melanomas finos foram

preparados 50 cortes histológicos com espessura de 5 μm e as lâminas 1,

25 e 40 foram coradas com Hematoxilina e Eosina para controle da

representatividade do material. As lâminas de 1 a 39 foram preparadas

utilizando-se o método da fita adesiva (tape) e as lâminas 40 a 50 foram

preparadas pelo método tradicional (Figura 3)

4.3.2 Imunoistoquímica

As reações imunoistoquímicas foram realizadas nas lâminas dos

TMAs confeccionados (melanomas invasivos e nevos melanocíticos)

utilizando-se os protocolos de reação padrão. Para os anticorpos

desmocolina 3, citoceratina 5 e conexina 3 foi utilizado o permanent red na

tentativa de diminuir a interferência da melanina na leitura dos marcadores.

Protocolo de Reações 1:

1- Desparafinização dos cortes das lâminas adesivas de TMA

(Instrumedics-Hackensack NJ, EUA) e hidratação dos cortes

histológicos: 3 banhos em Xilol, 4 banhos de álcool, água corrente;

2- Recuperação antigênica por calor, em câmara de pressão controlada

por microprocessador (PASCAL);

3- Lavagem em água corrente por 5 minutos; água destilada;

4- Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H

)

3%, com 3 trocas de 5 minutos cada;

5- Lavagem em água corrente por 5 minutos; água destilada

6- Bloqueio de proteínas: 20 minutos com Bloqueador de Proteínas

(DAKO) em câmara úmida à temperatura ambiente;

7- Retirar excesso do bloqueador;

8- Incubação do anticorpo primário em câmara úmida por 2 horas à

temperatura ambiente com diluições pré-estabelecidas para cada

anticorpo (Quadro 1);

9- Lavagem em PBS: 3 trocas de 5 minutos cada;

10- Incubação anticorpo secundário biotinilado (LSAB, DAKO) por 20

minutos em câmara úmida à temperatura ambiente;

11- Lavagem em PBS: 3 trocas de 5 minutos cada;

12- Incubação com complexo streptoavidina-peroxidase( LSAB, DAKO)

por 20 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente;

13- Lavagem em PBS: 3 trocas de 5 minutos cada;

14- Revelação da reação com cromógeno diaminobenzidine (DAB): 5

minutos: Kit Liquid DAB+ Substrate Chromogen System

(DakoCytomation, Carpinteria, Califórnia);

15- Lavagem em água corrente por 5 minutos;

16- Contracoloração com Hematoxilina de Harris por 2 minutos;

17- Lavagem em água corrente por 5 minutos;

18- Desidratação em álcool, Xilol, montagem da lâminas com entellan

(Merck 7961);

19- Leitura em microscópio óptico comum.

Quadro 4 - Anticorpos utilizados no protocolo de reações 1.

Anticorpo Diluição Marca Clone

Recuperação

antigência

Amplificação

Calicreina 7 1/200

R&D

Systems

policlonal Pascal Citrato pH 6,0 LSAB- HRP

Calicreina 6 1/50

R&D

Systems

policlonal Pascal Citrato pH 6,0 LSAB -HRP

Protocolo de Reações 2:

1- Desparafinização e hidratação dos cortes histológicos: 3 banhos em

Xilol (5 minutos cada), 4 banhos de álcool, lavagem por 5 minutos em

água corrente;

2- Recuperação antigênica na Pascal (Câmara de Pressão) em solução

Citrato pH 6,0 à 125º C (30 segundos após atingir 125ºC e pressão

entre 20 e 25 psi).

3- Lavagem em água corrente por 5 minutos;

4- Bloqueio da peroxidase endógena: 3 banhos de 5 minutos cada com

Peróxido de Hidrogênio 10 volumes;

5- Lavagem em PBS;

6- Bloqueio de proteínas: 20 minutos com Bloqueador de Proteínas

(DAKO);

7- Incubação do anticorpo primário por 2 horas à temperatura ambiente

(diluição pré-estabelecida) (Quadro 1);

8- Lavagem em PBS;

9- Incubação com anticorpo secundário (LINK) (Envision G/2

System/AP) (DAKO) por 30 minutos à temperatura ambiente;

10- Lavagem em PBS;

11- Incubação com polímero conjugado com Fosfatase alcalina (Envision

G/2 System/AP) (DAKO);

12- Lavagem em PBS;

13- Revelação da reação com solução de cromógeno Permanent

Red/Levamisole (Tampão, Permanent Red, levamisole) por 15

minutos à temperatura ambiente;

14- Lavagem em PBS;

15- Lavagem em água destilada;

16- Contracoloração com Hematoxilina de Harris por 1 minuto;

17- Lavagem em água corrente por 5 minutos;

18- Lavegem em água destilada;

19- Secar e montar em meio permanente.

Quadro 5 - Anticorpos utilizados no protocolo de reações 2.

Anticorpo Diluição Marca Clone Recuperação amplificação

Connexin 43 1/100 Zymed Policlonal Pascal/Citrato

pH6,0

Envision G/2

System/AP

Citoceratina 5 1/200 Thermo

Scientific

XM26 Pascal/Citrato

pH6,0

Envision G/2

System/AP

Desmocollin 3 Kit pronto

p/uso

Biodesign

International

Dsc3-U114 Pascal/Citrato

pH6,0

Envision G/2

System/AP

Figura 4 - Esquema da marcação em cruz (utilizando-se a circunferência em

cruz de 40X) utilizada para cada amostra do TMA.

Figura 5 - Exemplo de menor expressão na membrana celular

(imunoistoquímica de Cx43 em células do melanoma cutâneo,

Microfotografia 400X).

Figura 6 - Exemplo de maior expressão na membrana celular

(imunoistoquímica de Cx43 em células do melanoma cutâneo,

Microfotografia 400X).

4.3.3 Leitura das lâminas

As lâminas de TMA foram analisadas por meio da microscopia digital

realizada com o programa ACIS III (Automated Cellular Imaging System-

ChromaVision Medical Systems®, San Juan Capistrano Califórnia – Estados

Unido da América). Este programa identifica as células de interesse por meio

da detecção de cores características produzidas pelas reações de

imunoistoquímica de rotina. Mais de 150 parâmetros morfométricos são

utilizados para avaliar as células alvo. Algumas de suas caraterísticas são:

sensibilidade e acurácia, avaliação em quantidade e com boa

reprodutibilidade e as avaliações podem ser arquivadas permanentemente.

As amostras consideradas válidas para análise por meio da

microscopia digital foram aquelas que apresentavam pelo menos vinte e

cinco por cento do tecido tumoral representado. Para cada amostra (core)

foram selecionadas cinco áreas com maior celularidade (hot spots),

distribuídas em cruz (vide esquema), utilizando-se a circunferência de 40X

(recurso disponível no programa ACIS III). Quando a amostra não permitia a

distribuição em cruz, as circunferências de 40X eram marcadas

aleatoriamente nas áreas de maior celularidade (hot spots). Na marcação

dos nevos atípicos utilizou-se a circunferência de 60X pois a área de maior

celularidade dos melanócitos atípicos se encontrava na junção dermo-

epidermica e na tentativa de reduzir a contaminação por ceratinócitos

marcados adjacentes, optou-se pela menor área.

Para a avaliação da expressão do anticorpo em cada caso estudado

por meio da microscopia digital (ACIS) foi utilizado um escore que foi

chamado de escore combinado (EC), devido à utilização os parâmetros de

intensidade e quantidade de área marcada. A definição de EC é a

multiplicação da intensidade pela área estudada, sendo a área definida

como a área marrom dividida a soma da área marrom com azul (HES et al.

2007; KANEHIRA et al. 2008).

EC = Intensidade X % Área marcada

% Área marcada = Área Marrom / Área Azul + Área Marrom

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A caracterização da população de estudo foi realizada por meio de

estatística descritiva.

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi realizado para verificar a

aderência à normalidade da expressão dos marcadores biomoleculares.

Como nenhum dos marcadores respeitou uma distribuição gaussiana, optou-

se pela utilização de testes não paramétricos.

Empregaram-se os testes de Mann-Whitney e de Kruskal-Wallis para

comparar os valores medianos de expressão dos marcadores

biomoleculares, respectivamente entre dois grupos e três grupos não

pareados. Para avaliação post hoc (comparações múltiplas dois a dois)

utilizou-se o teste de Tukey HSD. Avaliou-se a correlação entre os

marcadores biomoleculares por meio do coeficiente de Spearman.

O nível de significância adotado em todos os testes estatísticos foi

igual a 5%.

5 RESULTADOS

5.1 DESCRIÇÃO DAS VARIÁVEIS DO ESTUDO

O total de lesões estudadas foi de 272 lesões sendo 59 (21,7%)

nevos comuns, 22 (8,1%) nevos atípicos, 162 (89,3%) melanomas cutâneos

34 (12,5%) melanomas finos (<1mm), 92 (33,8%) intermediários (1,01 -

4,0mm) e 36 (>4mm) espessos) e 29 (10,7%) metástases.

Tabela 1 - Descrição da freqüência e porcentagem dos tipos de lesão em

relação ao total de lesões estudadas.

Freqüência Porcentagem

Nevo

59 21,7

Nevo atípico

22 8,1

Malanoma fino (<= 1 mm)

34 12,5

Melanoma intermediário (1,01 - 4,0 mm)

92 33,8

Melanoma espesso (> 4 mm)

36 13,2

Metástases

29 10,7

Total

272 100,0

A idade média dos pacientes ao diagnóstico de melanoma cutâneo foi

de 54,40 anos e mediana de 54 anos. A média da mensuração do índice de

Breslow foi de 3,04 mm e mediana de 1,87mm. A média do índice mitótico

foi de 5,88CGA e mediana de 3,00 campos de grande aumento.

Tabela 2 - Descrição da média e mediana da idade ao diagnóstico, índice de

Breslow, índice mitótico, número de linfonodos sentinelas positivos e número

de linfonodos sentinelas encontrados para os casos de melanoma cutâneo.

Idade ao diagnóstico

(anos)

Breslow (mm)

Índice mitótico

(CGA)

Total de casos

162 162 162

Média

54,40 3,0454 5,88

Mediana

54,00 1,8700 3,00

Mm: Milímetros. LNS: Linfonodo sentinela. CGA: Campos de grande aumento.

A grande maioria dos melanomas cutâneos estudados era do tipo extensivo

superficial com 132 (81,48%) lesões. Seis (3,7%) casos eram do tipo

nodular, 17 (10,49%) eram do tipo acral lentiginoso e 7 (4,32%) do tipo não

classificável.

Tabela 3 - Descrição da freqüência e porcentagem do tipo histológico da

lesão primária dos melanomas cutâneos estudados.

Freqüência Porcentagem

Extensivo

superficial

132 81,48

Nodular

6 3,7

Acral lentiginoso

17 10,49

Não classificável

7 4,32

Total

162 100,0

Em relação ao tipo de crescimento da lesão nos melanomas

cutâneos, houve predominância do crescimento vertical em relação ao

crescimento radial, o primeiro com 158 (97,5%) casos e o segundo com

apenas 4 (2,5%) casos.

Tabela 4 - Descrição da freqüência e porcentagem do tipo de crescimento

da lesão primária dos melanomas cutâneos estudados.

Freqüência Porcentagem

Vertical

158 97,5

Radial

4 2,5

Total

162 100,0

Havia 34 (21%) lesões de melanoma com índice de Breslow menor

que 1mm, 49 (30,2%) lesões com 1,01 a 2,00mm, 43 (26,5%) lesões com

2,01 a 4,00mm e 36 (22,2%) lesões com índice de Breslow maior que 4mm.

Tabela 5 - Descrição da freqüência e porcentagem do índice de Breslow (4

categorias) das lesões de melanoma cutâneo estudadas.

Freqüência Porcentagem

Até 1 mm

34 21,0

1,01 - 2,00 mm

49 30,2

2,01 - 4,00 mm

43 26,5

> 4 mm

36 22,2

Total

162 100,0

Mm: milímetros.

O nível de Clark foi avaliado nas lesões de melanoma cutâneo e 1

(0,6%) lesão apresentava nível 1, 8 (4,9%) lesões nível 2, 91 (56,2%) lesões

nível 3, 45 (27,8%) lesões nível 4 e 17 (10,5%) lesões nível 5.

Tabela 6 - Descrição da freqüência e porcentagem do nível de Clark

encontrado no total de melanomas cutâneos estudados.

Freqüência Porcentagem

Nível 1

1 ,6

Nível 2

8 4,9

Nível 3

91 56,2

Nível 4

45 27,8

Nível 5

17 10,5

Total

162 100,0

Na avaliação da ulceração histológica nas lesões de melanoma

cutâneo, 49 (30,2%) lesões apresentavam ulceração e 113 (69,8%) não

apresentavam.

Tabela 7 - Descrição da freqüência e porcentagem da ulceração histológica

encontrada nos casos de melanoma cutâneo estudados.

Freqüência Porcentagem

Presença de

ulceração

49 30,2

Ausência de

ulceração

113 69,8

Total

162 100,0

Na avaliação da presença de regressão histológica na lesão primária

de melanoma cutâneo, 30 (18,5%) lesões apresentavam regressão e 132

(81,5%) não apresentavam.

Tabela 8 - Descrição da freqüência e porcentagem de regressão encontrada

nos casos de melanoma cutâneo estudados.

Freqüência Porcentagem

Presença de regressão

30 18,5

Ausência de regressão

132 81,5

Total

162 100,0

A pesquisa do linfonodo sentinela foi realizada em 113 (69,8%) dos

casos de melanoma cutâneo. A metástase linfonodal ocorreu em 83

(51,23%) casos de melanoma cutâneo, a metástase em pele em 17 (10,5%)

e visceral em 17 (10,5%) casos.

No estadiamento final para os casos de melanoma cutâneo

estudados, 70 (43,2%) pacientes apresentavam estádio I, 74 (27,2%) estádio

II e 18 (11,1%) estádios III e IV.

Tabela 9 - Descrição da freqüência e porcentagem em relação ao estádio

dos pacientes com melanoma cutâneo estudados.

Freqüência Porcentagem

Estádio 1

70 43,2

Estádio 2

74 45,7

Estádios 3 / 4

18 11,1

Total

162 100,0

Em relação aos anticorpos estudados, foram avaliadas as médias e

medianas da marcação de cada um deles para o total de lesões estudadas,

vide Tabela X.

Tabela 10 - Descrição da média e mediana dos anticorpos utilizados para o

total de casos marcados.

CK5

Score

combinado

Cx 43

Score

combinado

DSC 3

Score

combinado

KLK6

Score

combinado

KLK7

Score

combinado

Total de casos

marcados

213 227 231 217 231

Média

33,1795 44,5159 19,7793 6,8985 24,3257

Mediana

9,2743 41,1816 16,1319 2,1273 17,6121

5.2 COMPARAÇÃO ENTRE O TIPO DE LESÃO (NEVO COMUM,

NEVO ATÍPICO E MELANOMA CUTÂNEO) E A EXPRESSÃO DOS

ANTICORPOS ESTUDADOS

As medianas do escore combinado (Tabela 11) em relação ao tipo de

lesão estudada foi obtida para a realização do estudo da correlação entre

elas e a expressão dos anticorpos (CK5, Cx43, DSC3, KLK6 e KLK7).

Tabela 11 - Descrição da média e mediana do escore combinado dos

anticorpos estudados em relação ao tipo de lesão (nevo comum, nevo

atípico e melanoma cutâneo). Os valores das medianas estão em vermelho.

Tipo

lesão

CK5

Score

combinado

Cx 43

Score

combinado

DSC 3

Score

combinado

KLK6

Score

combinado

KLK7

Score

combinado

45 43 47 46 48

Média

5,5381 16,7020 2,9328 ,6057 4,9670

Nevo

Mediana

1,9217 12,7998 ,1579 ,0594 1,3850

11 17 17 15 17

Média

77,3388 20,1604 3,1302 3,6719 46,6206

Nevo

atípico

Mediana

79,7345 18,2395 2,3759 ,4800 39,7313

132 141 141 129 139

Média

31,0949 54,2878 25,6873 8,9487 27,8776

Melanoma

Mediana

19,3077 56,2688 22,4588 4,3951 23,1054

188 201 205 190 204

Média

27,6834 43,3607 18,5998 6,5123 24,0488

Total

Mediana

10,5523 40,8991 15,1224 1,6981 16,5828

N: Total de casos.

• CK5

A CK5 apresentou-se com expressão aumentada nos nevos atípicos

em relação aos nevos comuns e ao melanoma cutâneo, assim como a

expressão desta proteína apresentou expressão aumentada nos melanomas

cutâneos em relação aos nevos comuns, realizando-se o teste de Kruskal-

Wallis (p<0,001). Na avaliação pelo teste de Tukey corroborou-se o achado

anterior com p<0,001 (Tabela 12).

• Cx43

A CX43 mostrou aumento de expressão nos melanomas cutâneos em

relação aos nevos comuns e nevos atípicos e os nevos atípicos

apresentaram aumento da expressão em relação aos nevos comuns,

utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis (p<0,001). Na avaliação pelo teste de

Tukey o aumento de expressão verificado nas lesões de melanoma cutâneo

em relação aos nevos comuns e nevos atípicos foi estatisticamente

significativo (p<0,001). O aumento de expressão dos nevos atípicos em

relação aos nevos comuns não apresentou significado estatístico (p=0,878)

(Tabela 12).

• DSC3

Houve um aumento de expressão de DSC3 nos melanomas cutâneos

em relação aos nevos atípicos e nevos comuns pelo teste de Kruskal-Wallis

e aumento de expressão dos nevos atípicos em relação aos nevos comuns

(p<0,001). Na avaliação pelo teste de Tukey o aumento de expressão dos

melanomas em relação aos nevos atípicos e nevos comuns apresentou

significância estatística (p<0,001), porém o aumento de expressão dos

nevos atípicos em relação aos nevos comuns não apresentou a mesma

significância (p=0,999) (Tabela 12).

• KLK6

A KLK6 apresentou aumento de expressão nas lesões de melanoma

cutâneo em relação aos nevos atípicos e nevos comuns e houve aumento

de expressão desta proteína nos nevos atípicos em relação aos nevos

comuns pelo teste de Kyuskal-Wallis (p<0,001). Na avaliação pelo teste de

Tukey houve significância estatística no aumento de expressão verificado

nas lesões de melanoma cutâneo em relação aos nevos atípicos e nevos

comuns (p<0,001) (Tabela 12).

• KLK7

A proteína KLK7 apresentou maior expressão nas lesões de nevo

atípico em relação aos nevos comuns e melanoma cutâneo, o melanoma

cutâneo apresentou maior expressão em relação aos nevos comuns pelo

teste de Kruskal-Wallis (p<0,001). Utilizando-se o teste de Tukey, verificou-

se maior expressão dos nevos atípicos em relação aos nevos comuns e

melanomas cutâneos e maior de expressão nos melanomas cutâneos em

relação aos nevos comuns com valores estatisticamente significativos

(p<0,001 e p=0,001) (Tabela 12).

Tabela 12 - Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo com

o tipo de lesão.

Avaliação post-hoc pelo teste

de Tukey HSD (valor de P)

Marcador Lesão n Mediana

Teste de

Kruskal-

Wallis

(valor de P)

Nevo

atípico

Melanom

Citoceratina 5

Nevo

45 1,9 < 0,001

NA < 0,001 < 0,001

Nevo atípico

11 79,7

< 0,001 NA < 0,001

Melanoma

132 19,3

< 0,001 < 0,001 NA

Conexina 43

Nevo 43 12,8 < 0,001 NA 0,878 < 0,001

Nevo atípico

17 18,2

0,878 NA < 0,001

Melanoma

141 56,3

< 0,001 < 0,001 NA

Desmocolin

a 3

Nevo

47 0,2 < 0,001

NA 0,999 < 0,001

Nevo atípico

17 2,4

0,999 NA < 0,001

Melanoma

141 22,5

< 0,001 < 0,001 NA

Calicreina 6

Nevo

46 0,1 < 0,001

NA 0,518 < 0,001

Nevo atípico

15 0,5

0,518 NA 0,102

Melanoma

129 4,4

< 0,001 0,102 NA

Calicreina 7

Nevo

48 1,4 < 0,001

NA < 0,001 < 0,001

Nevo atípico

17 39,7

< 0,001 NA 0,001

Melanoma

139 23,1

< 0,001 0,001 NA

NA: Não se aplica. n: Total de casos.

5.3 COMPARAÇÃO ENTRE O ÍNDICE DE BRESLOW E A

EXPRESSÃO DOS ANTICORPOS ESTUDADOS NAS LESÕES DE

MELANOMA CUTÂNEO

Foi realizada a comparação entre o índice de Breslow em 3 categorias

(<1mm, 1,01 – 4,00mm e >4mm) e a marcação dos anticorpos CK5, Cx43,

DSC3, KLK6 e KLK7 por meio da mediana do escore combinado (Tabela 13)

obtido na avaliação (microscopia digital) das lesões de melanoma cutâneo.

Tabela 13 - Descrição da média e mediana do escore combinado dos

anticorpos estudados em relação ao índice de Breslow em 3 categorias. Os

valores das medianas estão em vermelho.

Breslow

(3 categorias)

CK5 Score

combinado

(SC)

Cx43 Score

combinado

DSC 3

Score

combinado

KLK6

Score

combinado

KLK7

Score

combinado

28 28 32 24 28

Média

60,6685 57,7064 27,7382 5,9774 37,5099

Até 1mm

Mediana

73,1159 56,9642 25,6155 1,0740 39,4369

72 78 74 69 76

Média

22,1500 50,2388 25,0729 9,7536 27,4439

1,01 - 4,00

Mediana

10,6295 52,5596 21,0083 5,8885 20,0852

32 35 35 36 35

Média

25,3441 60,5765 25,1112 9,3871 21,1134

> 4 mm

Mediana

10,5523 60,3492 25,2277 4,0258 15,4237

132 141 141 129 139

Média

31,0949 54,2878 25,6873 8,9487 27,8776

Total

Mediana

19,3077 56,2688 22,4588 4,3951 23,1054

N: Total de casos.

• CK5

Em relação aos grupos estudados (<1mm, 1,01 – 4,00mm e >4mm),

foi possível verificar-se maior expressão de CK5 nos melanomas finos

(<1mm) em relação aos melanomas intermediários (1,01 – 4,00mm) e

espessos (>4mm). Esta diferença foi estatisticamente significativa utilizando-

se o teste de Kruskal-Wallis (p<0,001). Na avaliação pelo teste de Tukey

comprovou-se que houve maior expressão de CK5 nos melanomas finos em

relação aos melanomas intermediários (p<0,001) e em relação aos

melanomas espessos (p<0,001), porém na análise entre os melanomas

intermediários e espessos que apresentavam mediana do escore combinado

de 10,6 não houve diferença estatística (p=0,846) (Tabela 14).

• Cx43

Em relação à proteína Cx43 o teste de Kruskal-Wallis não mostrou

diferenças significativas entre o escore combinado para os melanomas finos,

intermediários e espessos (Tabela 14).

• DSC3

Em relação à proteína DSC3 o teste de Kruskal-Wallis não mostrou

diferenças significativas entre o escore combinado para os melanomas finos,

intermediários e espessos (Tabela 14).

• KLK6

A KLK6 apresentou diferenças de expressão entre os grupos

estudados no teste de Kruskal-Wallis (p=0,032). A expressão dos

melanomas intermediários foi maior que a expressão dos melanomas finos e

melanomas espessos e a expressão dos melanomas espessos foi maior que

a dos melanomas finos. Na realização do teste de Tukey não houve

diferença estatística significativa entre os grupos (Tabela 14).

• KLK7

A expressão de KLK7 nos melanomas finos foi maior que a expressão

verificada nos melanomas intermediários e espessos (p=0,05). A expressão

desta proteína foi maior nos melanomas intermediários em relação aos

melanomas espessos (p=0,05). O teste de Tukey comprovou a maior

expressão nos melanomas finos em relação aos melanomas espessos

(p=0,014) (Tabela 14).

Tabela 14 - Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo com

a espessura em milímetros (mm) do melanoma cutâneo (Breslow). Os

valores estatisticamente significativos estão em vermelho.

Avaliação post-hoc pelo teste

de Tukey HSD (valor de P)

Marcador

Espessura do

melanoma

em mm

(Breslow)

Media

Teste de

Kruskal-

Wallis

(valor de

Até

1,00

1,01 –

4,00 mm

> 4,00

Citoceratina 5

Até 1,00 mm

28 73,1 < 0,001

NA < 0,001

0,001

1,01 – 4,00

72 10,6

< 0,001 NA 0,846

> 4,00 mm

32 10,6

< 0,001 0,846 NA

Conexina 43

Até 1,00 mm

28 57,0 0,188

NA NA NA

1,01 – 4,00

72 52,6

NA NA NA

> 4,00 mm

37 60,3

NA NA NA

Desmocolina

Até 1,00 mm

32 25,6 0,687

NA NA NA

1,01 – 4,00

74 21,0

NA NA NA

> 4,00 mm

35 25,2

NA NA NA

Calicreina 6

Até 1,00 mm 24 1,1 0,032 NA 0,334 0,484

1,01 – 4,00

69 5,9

0,334 NA 0,986

> 4,00 mm

36 4,0

0,484 0,986 NA

Calicreina 7

Até 1,00 mm

28 39,4 0,005

NA 0,113 0,014

1,01 – 4,00

76 20,1

0,113 NA 0,359

> 4,00 mm

35 15,4

0,014 0,359 NA

NA: Não se aplica. N: Total de casos.

5.4 COMPARAÇÃO ENTRE O ESTADIAMENTO E A EXPRESSÃO

DOS ANTICORPOS ESTUDADOS NAS LESÕES DE MELANOMA

CUTÂNEO

Foi realizado o estudo de comparação entre as medianas dos escores

combinados dos diferentes marcadores (CK5, Cx43, DSC, KLK6 e KLK7)

nas lesões de melanoma cutâneo e o estadiamento (Tabela 15).

Tabela 15 - Descrição da média e mediana do escore combinado dos

anticorpos estudados em relação ao estadiamento em 3 categorias. Os

valores das medianas estão em vermelho.

Estadiamento

final

(3 categorias)

CK5 Score

combinado

(SC)

CON 43

Score

combinado

DSC 3 Score

combinado

KLK6 Score

combinado

KLK7 Score

combinado

53 57 57 47 55

Média

42,7067 50,3988 25,8937 8,0876 34,2332

Estádio 1

Mediana

48,2568 48,6615 21,5237 3,9808 33,4194

63 70 68 65 67

Média

25,3884 58,3854 24,6903 10,1129 24,2851

Estádio 2

Mediana

13,4426 60,5634 20,9439 5,5547 15,9590

16 14 16 17 17

Média

15,1005 49,6339 29,1895 6,8787 21,4738

Estádios 3 -

Mediana

2,3900 54,8560 25,9807 3,0925 14,0288

132 141 141 129 139

Média

31,0949 54,2878 25,6873 8,9487 27,8776

Total

Mediana

19,3077 56,2688 22,4588 4,3951 23,1054

N: Total de casos.

• CK5

A CK5 apresentou maior expressão nos pacientes estádio I em

relação aos pacientes de estádio II e III/IV e nos pacientes de estádio II

houve maior expressão em relação aos pacientes de estádio III pelo teste de

Kruskal-Wallis (p=0,002). Na avaliação pelo teste de Tukey, houve maior

expressão de CK5 no estádio I em relação aos estádios II e III/IV (p0,006 e

p=0,004) (Tabela 16).

• Cx43

A comparação entre a mediana dos escores combinados nos estádios

I, II e III/IV e a proteína conexina 43 não apresentou valores estatisticamente

significativos pelo teste de Kruskal-Wallis (p=0,197) (Tabela 16).

• DSC3

A comparação entre a mediana dos escores combinados nos estádios

I, II e III/IV e a proteína desmocolina 3 não apresentou valores

estatisticamente significativos pelo teste de Kruskal-Wallis (p=0,667) (Tabela

16).

• KLK6

A comparação entre a mediana dos escores combinados nos estádios

I, II e III/IV e a proteína KLK6 não apresentou valores estatisticamente

significativos pelo teste de Kruskal-Wallis (p=0,485) (Tabela 16).

• KLK7

A calicreina 7 apresentou-se com maior expressão nos pacientes com

estádio I em relação aos pacientes estádio II e III/IV e houve maior sua

expressão nos pacientes estádio II em relação aos pacientes estádio III/IV

pelo teste de Kruskal-Wallis (p=0,007). Na avaliação pelo teste de Tukey, a

maior expressão da KLK7 ocorreu nos pacientes estádio I em relação aos

pacientes estádio II foi estatisticamente significativa (p=0,045) (Tabela 16).

Tabela 16 - Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo com

o estadiamento dos pacientes com melanoma cutâneo em 3 categorias

(estádio I, II e III/IV). Os valores estatisticamente significativos estão em

vermelho.

Avaliação post-hoc pelo

teste de Tukey HSD (valor

de P)

Marcador Estadiamento n

Median

Teste de

Kruskal-

Wallis

(valor de

Estádio

Estádi

o II

Estádio

s III e

Citoceratina 5

Estádio I

53 48,3 0,002

-- 0,006 0,004

Estádio II

63 13,4

0,006 -- 0,434

Estádios III e

16 2,4

0,004 0,434 --

Conexina 43

Estádio I

57 48,7 0,197

NA NA NA

Estádio II

70 60,6

NA NA NA

Estádios III e

14 54,9

NA NA NA

Desmocolin

a 3

Estádio I

57 21,5 0,667

NA NA NA

Estádio II

68 20,9

NA NA NA

Estádios III e

16 26,0

NA NA NA

Calicreina 6

Estádio I

47 4,0 0,485

NA NA NA

Estádio II 65 5,6 NA NA NA

Estádios III e

17 3,1

NA NA NA

Calicreina 7

Estádio I 55 33,4 0,007 -- 0,045 0,110

Estádio II 67 16,0 0,045 -- 0,892

Estádios III e

17 14,0

0,110 0,892 --

NA: Não se aplica. n: Total de casos.

5.5 COMPARAÇÃO ENTRE O STATUS LINFONODAL E A

EXPRESSÃO DOS ANTICORPOS ESTUDADOS NAS LESÕES DE

MELANOMA CUTÂNEO

Para efeito estatístico, na comparação da expressão dos marcadores

estudados, os dois TMA foram utilizados em conjunto, avaliando-se

pacientes com e sem metástases linfonodais, não se considerando o tipo, se

micro ou macrometástases.

Foi realizado o estudo comparativo entre os valores medianos dos

escores combinados dos marcadores estudados (CK5, Cx43, DSC3, KLK6 e

KLK7) e o status linfonodal dos pacientes com melanoma cutâneo por meio

do teste de Mann-Whitney.

A CK5 apresentava-se com maior expressão nos pacientes com

presença de metástase linfonodal (p<0,001). A conexina 43 apresentava-se

com maior expressão nos pacientes com metástase linfonodal (p=0,009). A

desmocolina apresentava-se com maior expressão nos pacientes com

metástase linfonodal (p=0,001). A KLK6 apresentava-se com maior

expressão nos pacientes com metástase linfonodal, porém estatisticamente

não significativa (p=0,618). A calicreina 7 apresentou-se com maior

expressão nos pacientes sem metástase linfonodal (p=0,005) (Tabela 17).

Tabela 17 - Valores medianos da expressão dos marcadores de acordo com

o status linfonodal. Os valores estatisticamente significativos estão em

vermelho.

Marcador Metástase linfonodal n Mediana

Teste de

Mann-Whitney

(valor de P)

Citoceratina 5

Sim 77 22,1 < 0,001

Não 35 1,63

Conexina 43

Sim 79 60,3 0,009

Não 44 46,4

Desmocolina 3

Sim 80 28,2 0,001

Não 39 15,1

Calicreina 6

Sim 80 6,1 0,618

Não 35 4,0

Calicreina 7

Sim 81 16,0 0,005

Não 39 33,4

n: Total de casos.

5.6 ESTUDO DA CORRELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DOS

MARCADORES BIOMOLECULARES

Na avaliação da correlação da expressão entre os marcadores

tumorais calculado o coeficiente de Spearman (rho). A correlação é

considerada fraca se o valor de rho <0,25, regular se 0,25< rho <0,50,

moderada se 0,50< rho <0,75, forte se 0,75< rho <1 e perfeita se rho =1.

Todos os resultados obtidos nesta avaliação apresentaram valores positivos

de rho e foram estatisticamente significativos (Tabela 18). O valor positivo

significa que na correlação entre a expressão dos marcadores se um

marcador tem expressão aumentada, o outro também tem.

• CK5

Houve uma fraca correlação entre CK5 e Cx43 (rho=0,224), CK5 e

DSC3 (rho=0,212) e CK5 e KLK6 (rho=0,248). A correlação entre CK5 e

KLK7 foi regular (rho=0,486) (Tabela 18).

• Cx43

Houve uma fraca correlação entre a expressão de Cx43 e CK5

(rho=0,224) e Cx43 e KLK7 (rho=0,244). A correlação entre Cx43 e DSC3 foi

moderada (rho=0,708) e a correlação entre a expressão da conexina 43 e

KLK6 foi regular (rho=0,429) (Tabela 18).

• DSC3

Houve uma fraca correlação entre a expressão de DSC3 e CK5

(rho=0,212) e DSC3 e KLK7 (rho=0,291). A correlação entre DSC3 e Cx43

foi moderada (rho=0,708) e a correlação entre DSC3 e KLK6 foi regular

(rho=0,396) (Tabela 18).

• KLK6

Houve uma fraca correlação entre a expressão de KLK6 e CK5

(rho=0,248). A correlação da expressão entre KLK6 e Cx43 foi regular

(rho=0,429), assim como a correlação da expressão entre KLK6 e DSC3

(rho=0,396). A correlação da expressão de KLK6 e KLK7 foi moderada

(rho=0,569) (Tabela 18).

• KLK7

Houve uma fraca correlação entre a expressão de KLK7 e Cx43

(rho=0,244). Houve uma regular correlação entre a expressão de KLK7 e

CK5 (rho=0,486) e KLK7 e DSC3 (rho=0,291). A correlação da expressão da

KLK7 e KLK6 foi moderada (rho=0,569) (Tabela18).

Tabela 18 – Correlação entre a expressão das proteínas estudadas.

Marcador

Keratina

Conexina

Desmocolina

Calicreina

Citoceratina 5

Spearman

(rho)

NA 0,224 0,212 0,248 0,486

Valor de P NA 0,001 0,003 < 0,001 < 0,001

Conexina 43

Spearman

(rho)

0,224 NA 0,708 0,429 0,244

Valor de P 0,001 NA < 0,001 < 0,001 < 0,001

Desmocolina

Spearman

(rho)

0,212 0,708 NA 0,396 0,291

Valor de P 0,003 < 0,001 NA < 0,001 < 0,001

Calicreina 6

Spearman

(rho)

0,248 0,429 0,396 NA 0,569

Valor de P < 0,001 < 0,001 < 0,001 NA < 0,001

Calicreina 7

Spearman

(rho)

0,486 0,244 0,291 0,569 NA

Valor de P < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001 NA

NA: Não se aplica.

5 DISCUSSÃO

Os resultados apresentados foram obtidos por meio de análise de

imagens digitalizadas com alta resolução, o que permitiu a identificação de

modificações sutis da imunomarcação.

Utilizou-se uma padronização de identificação das áreas a serem

estudadas por meio de circunferências pré-determinadas pelo programa, e

que não delimitam exclusivamente o tecido contendo melanócitos (névicos

ou atípicos), principalmente nas amostras de nevos atípicos onde as áreas

de hot spot estavam localizadas junção dermo-epidermica e não foi possível

selecionar apenas os melanócitos atípicos havendo contaminação pelos

ceratinócitos Desta forma, a fim de evitar possível viés de contagem, foram

escolhidas as áreas mais representativas da lesão em estudo. Além disto,

como se trata de estudo comparativo entre expressões protéicas, o viés, se

efetivamente presente, ocorreu em todas as amostras, diluindo a sua

participação na interpretação dos resultados. Contribuiu para a melhor

avaliação, o fato de que em todas as lesões, foi realizado um estudo em

quadruplicata, permitindo uma melhor avaliação estatística comparativa.

Na confecção dos TMAs de nevos melanocíticos e melanomas finos

houve uma dificuldade com relação à obtenção das amostras do bloco

doador. Nas lesões que apresentam a epiderme íntegra o punch utilizado

para obtenção da amostra do doador não é cortante dificultando sua

aquisição. Após afiarmos o punch com uma lixa delicada, não houve mais

perda do material.

As funções de comunicação intercelular e adesão celular ocorrem por

meio das estruturas celulares denominadas junções. As junções que

mantêm o epitélio coeso, formando ligações mecânicas, são de três tipos

principais: junções aderentes, desmossomos e hemidesmossomos. As

junções aderentes e os desmossomos ligam uma célula epitelial à outra e os

hemidesmossomos ligam a célula epitelial à lâmina basal. A junção tipo

fenda (gap junction) permite a passagem de íons e pequenas moléculas de

uma célula à outra (ALBERTS et al. 1997).

Os melanócitos não possuem hemidesmossomos verdadeiros, há

estruturas especializadas que os une à lâmina basal, do tipo

hemidesmossomos, estruturas pouco estudadas e denominadas de “placas

densas” (TARNOWSKI 1970). As “placas densas” encontradas nos

melanócitos diferem dos hemidesmossomos dos ceratinócitos basais por

apresentarem filamentos menos elétron densos convergindo para a placa à

microscopia eletrônica (TARNOWSKI 1970).

As alterações em relação às proteínas estudadas, envolvidas com a

adesão e comunicação celular e que fazem parte de estruturas celulares

importantes (Quadro 6), poderão interferir direta ou indiretamente na

comunicação de melanócitos com ceratinócitos e/ou matriz extracelular. As

proteínas desmocolina 3 e citoceratina 5 estão envolvidas com a formação e

manutenção dos desmossomos, hemidesmossomos e da estrutura celular. A

conexina 43 é importante na formação das junções tipo fenda (gap

junctions). As proteínas calicreina 6 e 7 estão envolvidas com a descamação

celular epidérmica.

Quadro 6 - Descrição das proteínas (estudadas) envolvidas na adesão e

comunicação celular.

Estrutura celular Proteínas envolvidas Função

Desmossomos e

hemidesmossomos

Desmocolina 3 e citoceratina 5 Adesão e estrutura celular

Junções tipo fenda Conexina 43 Comunicação celular

• Desmocolina 3

O desenvolvimento do câncer é em parte caracterizado pela

habilidade das células de romperem a adesão célula-célula e invadirem o

tecido adjacente. A troca da E-cadenina por N-caderina já foi documentada

em uma variedade de tumores, incluindo as lesões melanocíticas (nevos e

melanomas). Esta substituição leva à perda da adesão celular e progressão

tumoral (KHAN et al. 2006).

Alterações espaciais e funcionais da interação entre melanócitos e

ceratinócitos foram descritas, como a perda da associação dos melanócitos

com a epiderme, capacidade proliferativa dos melanócitos e invasão da

derme. Sugere-se que o fenótipo maligno do melanoma reflita um distúrbio

no controle normal de vias de transdução de sinais dependentes da E-

caderina dos ceratinócitos adjacentes. Alguns estudos demonstraram que a

interação molecular por meio de E-caderina, entre ceratinócitos e

melanócitos, induz inibição do crescimento de células de melanoma in vitro,

porém não existem evidências de que esta regulação negativa seja

suficiente para iniciar um melanoma (LI et al. 2001).

Admite-se que a substituição de E-caderina por N-caderina permite

que as células melanocíticas escapem do controle dos ceratinócitos

vizinhos, conferindo às células do melanoma, demonstrada in vitro e in vivo,

capacidade potencial de interação com fibroblastos N-caderina positivos da

derme e células endoteliais, ou seja, adquirem novas propriedades adesivas,

que facilitariam a invasão e metastatização. A substituição de E-caderina por

N-caderina foi observada no processo de diferenciação e migração do

melanoblasto, durante o desenvolvimento embrionário normal e nos

processos de invasão e metástase, durante o desenvolvimento tumoral (LI et

al. 2001).

Os nevos melanocíticos são formados por células pigmentadas com

características comuns aos melanócitos, porém apresentam uma

diferenciação alterada que leva à formação de ninhos e invasão dérmica

(GONTIER et al. 2004). A E-caderina é considerada a maior responsável

pela adesão entre os melanócitos e os ceratinócitos epidérmicos e tem

importância na função e localização do melanócito na epiderme. Estudos

realizados com nevos adquiridos demonstraram a fraca presença de E-

caderinas em ninhos localizados na junção dermo-epidérmica (GONTIER et

al. 2004). Em um estudo imunoistoquímico, foi possível observar que as

células dérmicas dos nevos congênitos isoladas ou em ninhos não

expressavam E-cadenina. Neste mesmo estudo, os autores sugeriram que a

perda de E-caderina estaria envolvida com a formação de ninhos, mas não

com a migração na derme e sugeriram que possivelmente um defeito no

controle dos ceratinócitos sobre os melanócitos poderia ser um evento inicial

na formação dos nevos. A perda do controle dos ceratinócitos leva à

proliferação e à formação do compartimento dérmico dos nevos

melanocíticos (GONTIER et al. 2004).

Muitos estudos têm demonstrado que a formação das junções

aderentes é pré-requisito para a formação dos desmossomos. Em estudo

realizado por HANAKAWA et al. (2000), a desmocolina 3 mostrou-se estar

envolvida não só com a formação dos desmossomos, mas também com as

junções aderentes. A porção citoplasmática da desmocolina 3 interagia não

só com a plakoglobina, mas também com a β-catenina. Assim, propuseram

uma hipótese molecular para a formação dos desmossomos: o contato

célula-célula se inicia com a caderina clássica (E-caderina) responsáveis

pela formação das junções aderentes. Para maior estabilidade da interação

célula-célula, a desmocolina 3 é recrutada como um componente inicial dos

desmossomos mediado pelas junções aderentes. Este recrutamento é

facilitado pela interação da desmocolina 3 com a β-catenina. Finalmente, a

desmocolina 3 se posiciona no sítio de contato, recrutando outros

componentes desmossomais incluindo a desmoplakina e plakoglobina.

Assim, a desmocolina 3 tem papel importante na formação dos

desmossomos após o estabelecimento das junções aderentes (HANAKAWA

et al. 2000).

No presente estudo, o encontro da maior expressão da desmocolina 3

em melanomas em relação aos nevos comuns (Figuras 7 e 8) e atípicos

pode estar relacionado com a troca de E-caderina por N-caderina que levaria

ao aumento de β-catenina citoplasmática e perda da interação entre β-

catenina e a desmocolina 3 e conseqüentemente perda da adesão celular e

início da nevogênese. A nossa hipótese propõe que o hemidesmossomo dos

melanócitos descrito por TARNOWSKI (1970) contenha as mesmas

proteínas de adesão do desmossomo, porém com estrutura diferente. A

desmocolina 3, então, se apresentaria com menor expressão na fase

precoce do modelo de progressão tumoral dos melanomas, ou seja, nos

nevos comuns e nevos atípicos.

OSHIRO et al. (2005) demonstraram que DSC3 é um gene de

resposta ao gene p53 e que DSC3 e p53 encontravam-se silenciados em

câncer da mama. Em um estudo imunoistoquímico observaram que os

melanomas com espessura acima de 1,0 mm apresentaram maior

expressão de p53 nuclear, estando em concordância com dados da literatura

que definem a superexpressão de p53 como sendo um evento tardio na

gênese dos melanomas e estando relacionada à progressão tumoral

(PIEPKORN 2000; CZAJKOWSKI et al. 2002; HUSSEIN et al. 2003; SÁ et

al. (in press). Considerando-se que, no trabalho de SÁ (2005), houve

aumento da expressão de p53 em melanomas mais profundos, e que estes

resultados foram obtidos do mesmo TMA utilizado no presente estudo, seria

possível hipotetizar que na progressão dos melanomas invasivos maiores

que 1 mm, o aumento da expressão do gene p53 levaria à ativação de

DSC3, justificando-se o encontro de uma maior expressão de DSC3 nos

melanomas estudados em relação aos nevos.

No entanto, o estudo da associação entre a expressão da

desmocolina 3 e a espessura de Breslow em 3 categorias (>1mm, 1,01 –

4,00mm e >4mm), assim como no estudo de associação da expressão da

desmocolina 3 e o estadiamento dos pacientes com diagnóstico de

melanoma cutâneo, não evidenciou-se diferenças estatísticas significativas.

Desta forma, a relação p53/DSC3 acima mencionada não pôde ser

comprovada utilizando-se o método imunoistoquímico.

No estudo da associação entre a expressão da desmocolina 3 e o

status linfonodal, a maior expressão verificada nos pacientes com metástase

linfonodal em relação aos pacientes sem a presença desta corrobora a

hipótese de que a maior expressão desta proteína é um evento tardio no

modelo de progressão tumoral nos melanomas.

Legenda: Menor expressão de DSC3 no citoplasma (coloração rósea).

Figura 7 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de DSC3 em

melanoma.

Legenda: Maior expressão de DSC3 no citoplasma (coloração rósea).

Figura 8 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de DSC3 em

células névicas.

Cx43

A formação das gap junctions também requer a adesão célula-célula

apropriada e as caderinas são as principais proteínas envolvidas no

processo de adesão celular (TROSKO e RUCH 1998).

A maioria das células neoplásicas apresentam junções tipo fenda

reduzidas com pouca expressão de conexina. A alteração da expressão de

conexina foi encontrada em um grande número de tumores como da glia,

hepatocarcinomas, endometriais e da cérvice (TROSKO e RUCH 1998;

LANGLOIS et al. 2008). O aumento da expressão de conexina 43 também já

foi descrito em células neoplásicas em diferentes estudos, porém não indica

anormalidade da comunicação (TROSKO e RUCH 1998).

A expressão de conexina 43 foi observada no epitélio estratificado da

cérvice humana. Em estudo imunoistoquímico em cérvice humana, não

houve marcação de conexina 43 nas células basais e estrato córneo e houve

uma distribuição heterogênea da marcação para conexina 43 fosforilada na

camada espinhosa e granulosa. Esta distribuição sugere uma diferença

fisiológica entre as células localizadas nas diferentes camadas e especula-

se que o padrão de fosforilação da conexina 43 se correlaciona com o

estágio de diferenciação celular de um epitélio. Neste mesmo estudo

observou-se que o aumento da expressão de conexina 43 fosforilada em

NIC III (carcinoma in situ) e carcinoma invasivo da cérvice parece não ser a

causa do processo de malignização, mas resultado da alteração da

organização estrutural do tecido (LANGLOIS et al. 2008).

Alguns fatores de crescimento podem alterar a função das gap

junctions. O mecanismo de inibição das gap junctions pelo fator de

crescimento epidérmico está relacionado ao estímulo de fosforilação das

conexinas pela proteína quinase de ativação mitogênica (MAPK) e

fechamento dos canais em fenda (TROSKO e RUCH 1998).

PATTON et al. (2005) estabeleceram um modelo de desenvolvimento

do melanoma em zebrafish demonstrando a relevância patológica da

ativação de BRAF e deficiência de p53 na formação do melanoma. Neste

estudo a mutação de BRAF mostrou-se suficiente para a transformação de

melanócitos em nevos. A mutação com ativação de BRAF por meio da via

de ativação de MAPK associada à deficiência de p53 promoveu a

transformação dos melanócitos em melanoma neste sistema animal.

No presente estudo houve maior expressão de conexina 43 nos

melanomas cutâneos em relação aos nevos comuns e atípicos (Figuras 9 e

10). A maior expressão verificada em células do melanoma é compatível

com o encontrado por LANGLOIS et al. (2008) em NIC III e carcinoma

invasivo da cérvice. Porém, a conexina 43 neste estudo apresentou-se com

maior expressão na membrana celular e a conexina 43 utilizada por

LANGLOIS et al. (2008) apresentou-se com expressão aumentada no

citoplasma.

A menor expressão dos nevos comuns e atípicos em relação ao

melanoma encontrada em nosso estudo (Figuras 9 e 10) poderia ser

explicada baseando-se nos achados de PATTON et al. (2005) em relação

aos nevos e melanomas, ou seja, nos nevos e nas fases iniciais dos

melanomas ocorreria mutação e ativação de BRAF levando à ativação da

cascata de sinalização de MAPK e conseqüentemente inibindo as gap

junctions por meio da fosforilação da conexina 43. Nas fases mais tardias do

modelo de progressão tumoral dos melanomas cutâneos a conexina 43 tem

aumento de sua expressão provavelmente relacionado à invasão e

metástase. Infelizmente quando se avaliou a expressão de conexina 43 e

espessura de Breslow os dados não se mostraram significativos e não foi

possível confirmar a hipótese de que nos melanomas finos a expressão de

conexina 43 é menor em relação aos melanomas intermediários e espessos.

O mesmo ocorreu em relação à comparação entre a expressão de conexina

43 e o estadiamento do melanoma.

No estudo de associação entre a expressão de conexina 43 e o status

linfonodal observou-se uma maior expressão desta proteína em pacientes

com metástase linfonodal em relação aos que não a apresentaram. Este

dado indiretamente corrobora nossa hipótese de que nas fases mais tardias

do melanoma a conexina 43 se apresentaria com maior expressão.

Legenda: Maior expressão de Cx43 na membrana celular (coloração rósea).

Figura 9 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de Cx43 em

células do melanoma.

Legenda: Menor expressão de Cx43 na membrana celular (coloração rósea).

Figura 10 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de Cx43 em

células névicas.

CK5

A expressão de CK5 nos estudo de microarranjos de cDNA

anteriormente realizados pelo grupo de REIS et al. (dados não publicados)

foi evidenciada após microdissecção à laser das áreas de interesse, sem a

contaminação de eventuais elementos epiteliais. Este detalhe técnico é

muito importante, uma vez que não há apenas uma menção na literatura da

presença de CK5 em melanócitos e que os resultados mostraram aumento

da expressão dos genes de CK5 nos nevos em relação aos melanomas. De

fato, em nossos resultados, a expressão imunoistoquímica de CK5 foi maior

em nevos atípicos em relação ao melanoma, embora em nevos comuns se

tenha encontrado expressão bem menor, em oposição ao trabalho com

microarranjos onde a expressão era muito superior em nevos em relação

aos melanomas.

O tecido mamário é composto por dois tipos celulares distintos, as

células luminais e basais que apresentam diferentes padrões de expressão

das citoceratinas. As células luminais contêm as CK7, CK8, CK18 e CK19 e

as células basais contêm citoceratinas de alto peso molecular, as CK5 e

CK14. O perfil das citoceratinas em certos processos patológicos da mama

pode ajudar na identificação da natureza das células patológicas, permitindo

a realização do diagnóstico. Na hiperplasia ductal da mama a maioria das

células coram para os anticorpos CK5 e CK6. Em contraste, o carcinoma

ductal convencional in situ, formado por células predominantemente ductais,

cora para as CK8, CK18 e CK19 e não coram para CK5 e CK6. Essa

diferença do perfil de expressão das citoceratinas por meio do estudo

imunoistoquímico tem sido explorada com sucesso atualmente na distinção

entre hiperplasias ductais da mama e o carcinoma ductal in situ da mama

(RABBAN et al. 2006). A expressão de CK5 e CK6 também se mostrou útil

na distinção entre a hiperplasia ductal da mama e o carcinoma ductal sólido

in situ da mama (subtipo de carcinoma muito semelhante histologicamente à

hiperplasia ductal da mama) uma vez que as amostras de tecido do

carcinoma ductal sólido in situ da mama não corou para as CK5 e CK6

(RABBAN et al. 2006).

CHU e WEISS (2002) realizaram um estudo com 509 casos de

carcinomas de diferentes órgãos e verificaram a expressão de CK5/6.

Confirmaram a utilidade de CK5/6 na distinção entre mesotelioma (aumento

de expressão) de adenocarcinoma pulmonar (ausência de expressão) e de

adenocarcinoma não pulmonar (aumento de expressão, porém com

necessidade de associação com outros marcadores tumorais para

realização do diagnóstico). Observaram que os carcinomas originados do

epitélio estratificado e de células mioepiteliais originadas de vários tecidos

coraram para CK5/6, podendo ser usado como marcador de carcinoma

espinocelular, carcinoma basocelular, carcinoma de células transicionais,

tumores de glândulas salivares e timoma. A proteína CK5/6 também se

mostrou útil na distinção entre glândulas prostáticas benignas e malignas

(CHU e WEISS 2002).

No estudo de RABBAN et al. (2006) a CK5 teve papel na

diferenciação entre lesões hiperplásicas ductais (consideradas pré-

neoplasias) da mama e o carcinoma ductal in situ. As lesões hiperplásicas

ductais expressaram CK5 e o carcinoma ductal in situ não expressou a

proteína. Embora a comparação de células epiteliais com melanócitos,

células de origens embriológicas diferentes seja discutível, em nosso

trabalho, a sua maior expressão nos nevos atípicos, poderia significar um

possível marcador de transformação maligna, baseando-se nas observações

de RABBAN et al. (2006).

A menor expressão de CK5 observada nos nevos comuns em relação

aos nevos atípicos e melanoma em nosso estudo (Figuras 11 a 13) poderia

ser justificada pela perda da adesão célula-célula que ocorre com a troca da

E-caderina por N-caderina na superfície celular e alterações na expressão

de DSC3 levando à perda da adesão celular (GONTIER et al. 2004). A

extremidade dos filamentos intermediários (compostos pelas ceratinas) está

ancorada nos desmossomos e se associa aos componentes laterais

desmoplaquina e plakoglobina, que por sua vez estão ligadas as

desmocolinas (Figura 14) (ALBERTS et al. 1997). A menor expressão de

desmocolina 3 poderia levar à menor expressão de CK5 nas células névicas

devido a perda da adesão celular e conseqüentemente perda da capacidade

das citoceratinas de formarem filamentos. Esta perda da formação dos

filamentos foi descrita por KATAGATA et al. (1999) em cultura de células de

melanoma, mas acreditamos que ela já se inicie nos nevos comuns (fase

inicial do modelo de progressão do melanoma). Assim, justifica-se o

encontro de menor expressão de citoceratina 5 em nevos em relação aos

melanomas cutâneos. Postula-se que nos melanomas a perda da adesão

celular seja maior, havendo maior desestruturação celular e maior expressão

da citoceratina 5.

O encontro da expressão aumentada da citoceratina 5 nos nevos

atípicos pode ser justificada pela contaminação dos ceratinócitos basais que

expressam esta proteína, como descrito por BHAWAN et al. (2005).

Sugerimos que a expressão de CK5 possa ser maior que a encontrada nos

nevos comuns, porém acreditamos que não seja maior que a expressão

encontrada nos melanomas cutâneos. Nos melanomas haveria importante

perda da adesão celular e conseqüentemente perda da estrutura celular

acentuada com maior expressão de CK5. Por ausência de dados da

literatura que corroborem com nossas observações, não existe segurança

em afirmar que os eventos descritos ocorram na comunicação entre os

melanócitos.

Legenda: Menor expressão de CK5 citoplasmática. Notar a ausência da pigmentação em

ninhos de células névicas.

Figura 11 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de CK5 em

células de nevo comum.

Legenda: Maior expressão de CK5 citoplasmática. Notar a dificuldade de demarcação das

áreas contendo células atípicas na epiderme pela presença dos ceratinócitos pigmentados.

Figura 12 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de CK5 em

células atípicas do nevo atípico.

Legenda: Expressão intermediária no citoplasma. Notar a sensibilidade da microscopia

digital na detecção do marcador.

Figura 13 - Microfotografia (400X): Expressão imunoistoquímica de CK5 em

células do melanoma cutâneo.

Diante destes resultados, é lícito supor que as estruturas

denominadas hemidesmossomos, propostas por TARNOWSKI (1970)

possam ter participação neste mecanismo de adesão.

Legenda:

(A) Eletromicrografia de 3 desmossomos de células intestinais de camundongo.

(B) Eletron micrografia de um único desmossomo entres duas células epidérmicas

mostrando os filamentos intermediários. (C) Os componentes estruturais de um

desmossomo. Na superfície citoplasmática de cada célula existe uma placa densa

composta de proteínas de ancoragem intracelular. Os filamentos intermediários estão

aderidos na superfície cellular de cada placa. Proteínas de adesão transmembrana da

família das caderinas se ligam à placa e interagem com o domínio extracelular da

membrana celular adjacente por meio de um mecanismo cálcio dependente. (D) Alguns dos

componentes moleculares do desmossomo. A desmogleína e a desmocolina são membros

da família das proteínas de adesão caderinas. Suas caudas citoplasmáticas se ligam à

plakoglobina que por sua vez se liga à desmoplaquina. A desmoplaquina também se liga

aos filamentos intermediários.

Fonte: ALBERTS et al. (1997)

Figura 14 - A estrutura do desmossomo e sua correlação com CK5.

A diferença de expressão de CK5 em nevos comuns, nevos atípicos e

melanomas observada em nosso estudo poderia compor um padrão de

expressão que ajudaria na distinção das etapas do modelo de progressão do

melanoma cutâneo. A lesão precursora (nevo comum) apresentaria menor

expressão da proteína, a lesão intermediária (nevo atípico) apresentaria

maior expressão e a lesão neoplásica invasiva (melanoma) apresentaria

expressão intermediária.

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