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Daiane Toledo Quaglio
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia
Bioanalítica para Quantificação de Ivermectina em Plasma
Humano Utilizando Cromatografia Líquida com Detecção
por Espectrometria de Massas
(LC-MS/MS)
Bragança Paulista – SP
2009
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ii
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iii
Ficha catalográfica elaborada pelas bibliotecárias do Setor de
Processamento Técnico da Universidade São Francisco.
QV 38 Quaglio, Daiane Toledo.
Q21d Desenvolvimento e validação de uma metodologia
bioanalítica para quantificação de ivermectina em
plasma humano utilizando a cromatografia líquida com
detecção por espectrometria de massas (LC-MS/MS) /
Daiane Toledo Quaglio. -- Bragança Paulista, 2009.
57 p.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação
Stricto Sensu em Ciências da Saúde da Universidade São
Francisco.
Orientação: Eduardo César Meurer.
1. Ivermectina. 2. Cromatografia líquida. 3. Validação de
método. 4. Espectrometria de massas. I. Meurer, Eduardo César.
II. Título.
iv
UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
Programa de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia Bioanalítica para
Quantificação de Ivermectina em Plasma HumanoUtilizando
Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de
Massas
(LC-MS/MS)
Daiane Toledo Quaglio
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde, área de Farmacologia Geral e
Clínica da Universidade São Francisco –
USF.
Orientador:
Prof. Dr. Eduardo César Meurer
BRAGANÇA PAULISTA – SP
2009
v
UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
Pragrama de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde
Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia Bioanalítica para
Quantificação de Ivermectina em Plasma Humano Utilizando
Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de
Massas
(LC-MS/MS)
Daiane Toledo Quaglio
Orientador: Prof. Dr.Eduardo César Meurer
Data Defesa: 18/09/2009
Comissão Examinadora:
Prof. Dr Luiz Alberto B. Moraes, USP- Ribeirão Preto
Doutor pela UNICAMP – Campinas , Brasil.
Prof. Dra. Silvana Calafatti Carandina, USF.
Doutora pela UFSCAR – São Carlos, Brasil.
Prof. Dr. Rodrigo Ramos Catharino, UNICAMP.
Doutor pela UNICAMP – Campinas , Brasil.
Prof Dr. Marcelo Lima Ribeiro, USF.
Doutor pela UNICAMP – Campinas , Brasil.
vi
DEDICATÓRIA
Aos meus pais pelo amor, incentivo, dedicação e
compreensão, em todos os momentos da minha
vida.
Ao meu querido irmão Diego, que esteve sempre
incentivando e apoiando todas as minhas decisões.
Ao Eduardo pelo constante apoio e dedicação.
vii
AGRADECIMENTO
Ao Prof. Dr. Eduardo César Meurer, pela
orientação, ensinamentos, atenção e incentivo.
Ao Prof. Dr. Fabio Alessandro Proença Barros,
pelos ensinamentos e contribuições na execução
deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório Core Pesquisas
Clínicas pela colaboração na execução deste
trabalho e amizade.
Ao Laboratório Unifag pelas contribuições para
realização deste trabalho.
Aos professores do Mestrado em Ciências da
saúde da Universidade São Francisco que
contribuíram com seus conhecimentos para a
conclusão do meu trabalho, com sabedoria e
dedicação.
A Deus por tudo que conquistei até hoje, pois sem
Ele, nada seria possível
viii
EPÍGRAFE
"Presta o ouvido a todos, e a poucos a voz. Ouve
as censuras dos demais; mas reserva tua própria
opinião." [ William Shakespeare ]
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AcF
Ácido Fórmico
AcNH
4
Acetato de Amônio
Anvisa
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
API
Ionização a Pressão Atmosférica
ATP
Adenosina Trifosfato
CGAR-EM
Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectro deMassas
CID
Dissociação Induzida por Colisão
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-EM/EM
Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massas Seqüencial
CL-EM
Cromatografia Líquida com detecção por Espectrometria de Massas
Cmáx
Concentração plasmática máxima
CQ
Controle de Qualidade
CQA
Controle de Qualidade Alto
CQB
Controle de Qualidade Baixo
CQD
Controle de Qualidade de Diluição
CQM
Controle de Qualidade Médio
EM/EM (EM
2
)
Espectrometria de Massas em Seqüência
ESI
Electrospray
FDA
Food and Drug Administration
FE
Fase Estacionária
FM
Fase Móvel
GABA
Ácido Gama-aminobutírico
HUSF
Hospital Universitário São Francisco
IES-EM
Espectrometria de Massas com Ionização porElectrospray
LOD
Limite de Detecção
LOQ
Limite de Quantificação
m/z
Razão massa/carga
MRM
Monitoramento de reações multiplas
NH
4
OH
Hidróxido de Amônio
SNC
Sistema Nervoso Central
SPE
Extração líquida em fase sólida
SRM
Monitoramento de Reação Seletiva
TCA
Ácido Tricloroacético
TFA
Ácido Trifluoracético
x
THF
Tetrahidrofurano
USP
United States Pharmacopeia
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 01
Terapêutica da Ivermectina..........................................................................04
Tabela 02
Curva de Calibração para Ivermectina.........................................................28
Tabela 03
Controles de Qualidade de Ivermectina.......................................................29
Tabela 04
Equações da curva de calibração das três linearidades..............................45
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Fórmula estrutural da Ivermectina...................................................................1
Figura 02
Representação do processo de migração diferencial de seus componentes
entre a fase móvel e a fase estacionária........................................................10
Figura 03
Representação esquemática de um sistema de CLAE:Esta técnica conta
com um reservatório de fase móvel (1), um sistema de distribuição de
solvente (2), uma válvula de injeção de amostra (3), uma coluna de alta
pressão (4), um detector (5) e um computador para monitorar o sistema e
apresentar os resultados (6)...........................................................................11
Figura 04
Discrição básica do espectrômetro de massas..............................................13
Figura 05
Figura 06
Utilização da espectrometria de massas em diferentes áreas do
conhecimento. Todos os dados foram obtidos de pesquisa realizada em
www.isiknowledge.com, no período de 1993 a 2004, considerando as 500
primeiras citações de cada ano. No gráfico aparecem apenas áreas que
atingiram mais de 1%.....................................................................................14
Formação dos íons na fonte deelectrospray e análise dos íons com suas
respectivas razões massa/carga para aquisição do espectro de massas......15
Figura 07
Nebulização....................................................................................................16
Figura 08
Ilustração do analisador quadrupolar..............................................................17
Figura 09
Demonstração da aplicação dos potencias nas barras metálicas do
analisador quadrupolar...................................................................................17
Figura 10
Demonstração dos eixos nos quais sofrem influência dos potenciais aplicados
no analisador quadrupolar..............................................................................18
Figura 11
Esquema do separador quadrupolo................................................................18
Figura 12
Ilustração de espectro de massastriplo quadrupolar.....................................19
Figura 13
(a) Representação dos símbolos utilizados em um experimento b) EM e c)
EM
2
.................................................................................................................20
Figura 14
Espectro de massas da Ivermectina, no modo positivo (a) e no modo negativo
(b)....................................................................................................................33
Figura 15
Ilustração dos parâmetros otimizados, (a) ESI- e (b) ESI+............................34
Figura 16
Espectro de EM/EM da dissociação da Ivermectina no modo positivo a 55V e
a fragmentação proposta formando o íon dem/z 329....................................36
Figura 17
Fórmula estrutural da Doramectina................................................................38
Figura 18
Cromatograma que demonstra os componentes endógenosdo extrato da
Ivermectina em plasma...................................................................................41
xiii
Figura 19
Plasma branco normal lote 16492/7 a) Cromatograma referente ao branco do
analito. b) Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma
branco normal lote 52169/4 c) Cromatograma referente ao branco do analito.
d) Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco
Lipêmico lote 56977/1. e) Cromatograma referente ao branco doanalito. f)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco
Hemolisado lote 56956/1. g) Cromatograma referente ao branco do analito.
h) Cromatograma referente ao branco do padrão interno..............................43
Figura 20
A) Cromatograma referente a solução de Ivermectina 0,5 ng/mL (LQ). B)
Cromatograma referente a solução de Doramectina 62,5 ng/mL...................43
Figura 21
Resultados da média das linearidades...........................................................45
Figura 22
Resultados das análises intra-lote plasma normal.........................................46
Figura 23
Resultados das análises intra-lote plasma lipêmico.......................................47
Figura 24
Resultados das análises intra-lote plasma hemolisado..................................47
Figura 25
Resultados das análises inter-lote..................................................................48
Figura 26
Resultados das análises dos controles de qualidade de diluição...................49
Figura 27
Resultados das recuperações dos controles de qualidade (CQB, CQM e
CQB) e do padrão interno...............................................................................49
Figura 28
Resultados da estabilidade em tempo e condições de análise entre o tempo
0 h e 12 h........................................................................................................50
Figura 29
Resultados da estabilidade entre os ciclos de degelo....................................51
Figura 30
Resultados da estabilidade das amostras não processadas..........................52
Figura 31
Resultados da estabilidade das soluções padrão para Ivermectina e
Doramectina....................................................................................................53
xiv
RESUMO
A metodologia bioanalítica utilizando cromatografia líquida com detecção por
espectrometria de massas (LC-MS/MS) foi desenvolvida e validada para quantificação de
Ivermectina em plasma humano utilizando Doramectina como padrão interno. A extração de
Ivermectina do plasma humano foi conduzida através de extração líquido-líquido com uma
mistura de hexano/ acetato de etila (50:50 v/v),depois de centrifugados e secos os extratos
foram ressuspendidos em fase móvel. A fase móvel utilizada foi acetonitrila/ acetato de
amônio 0,026 Mol/L / metanol (94:5:1 v/v/v), utilizando um fluxo de 0,6 mL/min, o tempo total
de corrida foi de 4,30 min, o analito teve um tempo de retenção de 2,45 min. Foi utilizado as
colunas X-Terra RP18 (3,5 µm, 50 x 4,6 mm) e X-Terra C8 (5 µm, 100 x 2,1 mm), mantidas
a temperatura ambiente (~20
o
C), o volume de injeção foi de 15,0 µL. Através do
espectrômetro de massas utilizando a fonte de electrospray, foi obtido um limite de
quantificação de 0,5 ng/mL e um intervalo dinâmico de 0,5 -100,0 ng/mL. Na especificidade,
não houve nenhum interferente nos tempos de retenção do fármaco (2,45 min) e do padrão
interno (2,20 min), o coeficiente de variação (CV) obtido na linearidade foi de 3,62%, a
precisão e exatidão foram avaliadas inter-lote e intra-lote, seus coeficientes de variação
foram abaixo de 7%, a recuperação obtida foi de aproximadamente 84% para a Ivermectina
e de aproximadamente 98% para o padrão interno. Os resultados das análises
demonstraram que todos os testes realizados encontraram-se dentro dos limites permitidos
pela legislação vigente. A estabilidade das amostras também se mostrou adequada quando
armazenadas a -70ºC. A metodologia bioanalítica se mostrou adequada para a análise de
Ivermectina em plasma humano.
Palavras chave: Ivermectina, Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de
Massas.
xv
ABSTRACT
A sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-
MS/MS) method for Ivermectine quantification in human plasma is presented. Sample
preparation consisted of addition of Doramectine as internal standard (IS), liquid-liquid
extraction in acidic conditions using a mixture of hexane/ethyl acetate (11V/V) as extracting
solvent, followed by centrifugation, solvent evaporation and sample reconstitution in mobile
phase. Both Ivermectine and IS were analyzed using a C18 column and a mobile-phase
composed of acetonitrile: ammonium acetate 25 mmol.l
-1
:methanol (94:5:1 v/v/v). Eluted
compounds were monitored using positive mode electrospray (ES) tandem mass
spectrometry. Analyses were carried out by selected reaction monitoring (SRM) using the
sodiated molecule to ionic fragment combinations of m/z 896.9 > 329.1 (Ivermectine) and
m/z 921.3 > 353.2 (Doramectine) with short chromatographic run time of 4.3 min. The peak
areas ratio (response) of the analyte and IS were used for quantification of Ivermectine. The
achieved limit of quantification (LOQ) was 0.5 ng/mL assay exhibited a linear dynamic range
of 0.5-100.0 ng/mL with a determination coefficient (r
2
) of at least 0.98. Validation results on
selectivity, linearity, accuracy, precision and stability in plasma, demonstrated the
applicability of this analytical method to pharmacokinetic studies accordly to FDA guidelines.
Key words: Ivermectine - mass spectrometry – bioanalytical method
xvi
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO.....................................................................................................................
01
1.1
IVERMECTINA..........................................................................................................
01
1.1.1
Atividade Antiparasitária e Resistência....................................................
02
1.1.2
Absorção, Distribuição e Excreção...........................................................
03
1.1.3
Terapêutica..................................................................................................
04
1.1.4
Toxicidade, Efeitos Colaterais e Precauções...........................................
05
1.2
MEDICAMENTOS GENÉRICOS...............................................................................
05
1.2.1
Histórico......................................................................................................
05
1.2.2
Medicamento Genérico..............................................................................
07
1.2.3
Definições....................................................................................................
07
1.3
FATORES QUE AFETAM A BIODISPONIBILIDADE DE MEDICAMENTOS..........
08
1.4
TÉCNICA BIOANALÍTICA........................................................................................
09
1.4.1
Cromatografia Líquida................................................................................
09
1.4.1.1
Tipos de Cromatografia............................................................
11
1.4.1.2
Modos de Separação................................................................
12
1.4.1.2.1
Cromatografia em Fase Normal..........................
12
1.4.1.2.2
Cromatografia em Fase Reversa.........................
12
1.4.2
Espectrometria de Massas.........................................................................
13
1.4.2.1
Fonte de Ions – Electrospray (ESI)..........................................
14
1.4.2.2
Analisador Quadrupolar...........................................................
16
1.4.2.2.1
Simbologia dos Experimentos de
Espectrometria de Massas Seqüencial..............
20
1.4.2.3
Cromatografia Líquida com detecção por Espectrometria
de massas.................................................................................
20
1.5
TRATAMENTO DE AMOSTRAS..............................................................................
21
1.6
REVISÃO DA LITERATURA.....................................................................................
23
2.
OBJETIVO...........................................................................................................................
25
3.
MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................................
26
3.1.
MÉTODO ANALÍTICO...............................................................................................
26
3.1.1
Princípios do Método.................................................................................
26
3.1.2
Equipamentos e Materiais..........................................................................
26
3.1.3
Preparo das Soluções Utilizadas na Validação.......................................
27
3.1.4
Fase Móvel Utilizada...................................................................................
27
3.1.5
Preparo dos Padrões da Curva de Calibração e das Amostras
Controle de Qualidade.....................................................................
27
3.1.6
Preparo da Solução de Doramectina........................................................
29
3.2
METODOLOGIA ANALÍTICA...................................................................................
29
3.2.1
Condições Cromatográficas......................................................................
29
xvii
3.2.2
Condições de Detecção no Espectrômetro de Massas no modo
EM/EM..........................................................................................................
30
3.2.3
Extração de Amostras................................................................................
30
4.
RESULTADOS E DISCUSSÕES........................................................................................
31
4.1
DESENVOLVIMENTO...............................................................................................
31
4.1.1
Análise Química..........................................................................................
31
4.1.2
Espectro no Modo EM e Ionização.................................................
32
4.1.3
Espectro no Modo EM/EM...............................................................
35
4.1.4
Acoplamento do Sistema de CLAE e EM.......................................
36
4.1.5
Escolha do Padrão-Interno.............................................................
37
4.1.6
Preparo da Amostra.........................................................................
38
4.1.6.1
Volume da Amostra.........................................................
39
4.1.6.2
Adição de Padrão-Interno...............................................
39
4.1.6.3
Ajuste de pH.....................................................................
39
4.1.6.4
Extração Líquido-Líquido................................................
39
4.1.6.5
Separação de Fases e Reconstituição da Amostra......
39
4.1.7
Ajustes Finais do Método Bioanalítico..........................................
40
4.1.7.1
Ajustes no Preparo de Amostra.....................................
40
4.1.7.2
Ajustes da Cromatografia Líquida.................................
40
4.2
VALIDAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO...........................................................
41
4.2.1
Padrões........................................................................................................
42
4.2.2
Seletividade.................................................................................................
42
4.2.3
Determinação do Limite de Quantificação...............................................
44
4.2.4
Linearidade..................................................................................................
44
4.2.5
Precisão e Exatidão....................................................................................
45
4.2.5.1
Validação intra-lote...................................................................
46
4.2.5.2
Validação inter-lote...................................................................
48
4.2.6
Validação da Diluição.................................................................................
48
4.2.7
Recuperação...............................................................................................
49
4.2.8
Estudo de Estabilidade do Fármaco no Fluído Biológico......................
50
4.2.8.1
Estabilidade de curta duração.................................................
50
4.2.8.1.1
Estabilidade no tempo e condições de
análise....................................................................
50
4.2.8.1.2
Estabilidade do fármaco em ciclos de
congelamento e degelo........................................
51
4.2.8.2
Estabilidade das amostras de plasma não processadas......
52
4.2.8.3
Estabilidade de soluções padrão............................................
53
5.
CONCLUSÃO......................................................................................................................
54
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ..................................................................................
55
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 IVERMECTINA
Em meados de 1970 uma pesquisa sobre produtos naturais em camundongos
revelou uma melhora no quadro de infecção por Nematospiroides dubius após a
submissão desses a um caldo de fermentação da actinobactéria do solo
(Streptomyces avermitilis). O isolamento de componentes anti-helmínticos de
culturas desses organismos levou a descoberta de uma nova classe de lactonas
com 16 membros, as avermectinas. Na Figura 01, está apresentada a fórmula
estrutural da Ivermectina (mistura de 90% de 5-O-dimetil-22,23-dihidroavermectina
A
1a
e 10% 5-O-dimetil-25-di(1-metilpropil)-22,23-dihidro25-(1-metiletil)avermectina
A
1a
) geralmente identificada como 22,23-dihidroavermectina B
1a
e B
1b
, uma droga
semisintética empregada ao tratamento de infecções causadas por nematódeos
parasitos (nematelmintos) e artrópodes (insetos, carrapatos e cupins) que acometem
criações e animais domésticos.
(1)
Figura 01 – Fórmula Estrutural da Ivermectina
A Ivermectina é um pó branco amarelado, não higroscópico, com ponto de
fusão de 155º.C. É uma molécula insolúvel em água, mas totalmente solúvel em
metanol e etanol.
(28)
A Ivermectina é um macrolídeo, um grupo de moléculas
orgânicas com um anel de lactona de 16 membros aos quais se ligam dois
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 IVERMECTINA
Em meados de 1970 uma pesquisa sobre produtos naturais em camundongos
revelou uma melhora no quadro de infecção por Nematospiroides dubius após a
submissão desses a um caldo de fermentação da actinobactéria do solo
(Streptomyces avermitilis). O isolamento de componentes anti-helmínticos de
culturas desses organismos levou a descoberta de uma nova classe de lactonas
com 16 membros, as avermectinas. Na Figura 01, está apresentada a fórmula
estrutural da Ivermectina (mistura de 90% de 5-O-dimetil-22,23-dihidroavermectina
A
1a
e 10% 5-O-dimetil-25-di(1-metilpropil)-22,23-dihidro25-(1-metiletil)avermectina
A
1a
) geralmente identificada como 22,23-dihidroavermectina B
1a
e B
1b
, uma droga
semisintética empregada ao tratamento de infecções causadas por nematódeos
parasitos (nematelmintos) e artrópodes (insetos, carrapatos e cupins) que acometem
criações e animais domésticos.
(1)
Figura 01 – Fórmula Estrutural da Ivermectina
A Ivermectina é um pó branco amarelado, não higroscópico, com ponto de
fusão de 155º.C. É uma molécula insolúvel em água, mas totalmente solúvel em
metanol e etanol.
(28)
A Ivermectina é um macrolídeo, um grupo de moléculas
orgânicas com um anel de lactona de 16 membros aos quais se ligam dois
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 IVERMECTINA
Em meados de 1970 uma pesquisa sobre produtos naturais em camundongos
revelou uma melhora no quadro de infecção por Nematospiroides dubius após a
submissão desses a um caldo de fermentação da actinobactéria do solo
(Streptomyces avermitilis). O isolamento de componentes anti-helmínticos de
culturas desses organismos levou a descoberta de uma nova classe de lactonas
com 16 membros, as avermectinas. Na Figura 01, está apresentada a fórmula
estrutural da Ivermectina (mistura de 90% de 5-O-dimetil-22,23-dihidroavermectina
A
1a
e 10% 5-O-dimetil-25-di(1-metilpropil)-22,23-dihidro25-(1-metiletil)avermectina
A
1a
) geralmente identificada como 22,23-dihidroavermectina B
1a
e B
1b
, uma droga
semisintética empregada ao tratamento de infecções causadas por nematódeos
parasitos (nematelmintos) e artrópodes (insetos, carrapatos e cupins) que acometem
criações e animais domésticos.
(1)
Figura 01 – Fórmula Estrutural da Ivermectina
A Ivermectina é um pó branco amarelado, não higroscópico, com ponto de
fusão de 155º.C. É uma molécula insolúvel em água, mas totalmente solúvel em
metanol e etanol.
(28)
A Ivermectina é um macrolídeo, um grupo de moléculas
orgânicas com um anel de lactona de 16 membros aos quais se ligam dois
2
desoxiglicois (Figura 01). Estes grupos orgânicos têm características fracamente
básicas, pois tem átomos de oxigênio na sua composição, que possui um par de
elétrons livres que podem ser protonados, sodiados ou potassiados.
Em 1996, após a aprovação do FDA (Food and Drug Administration), a
Ivermectina passou a ser empregada ao tratamento da oncocercose, a infecção
causada por filária responsável pela cegueira do rio e também para o tratamento da
estrogiloidíase intestinal em humanos.
(1)
1.1.1 Atividade Antiparasitária e Resistência
A Ivermectina age através da imobilização dos organismos atacados por meio
da indução de paralisia tônica da musculatura, apresentando eficácia contra
determinados estágios de crescimento de muitos nematódeos parasitos e insetos que
acometem animais e seres humanos.
(1)
A execução de trabalhos com os nematódeos de vida livre (Caenorhabditis
elegans) permitiu a observação do mecanismo de ação da avermectina sobre o
grupo cloro (Cl
-
). Os canais de cloro previamente abertos por glutamato são
expressos nas células do músculo faríngeo desses vermes, gerando o efeito
inibitório potente e acentuado das avermectinas no comportamento alimentar desses
organismos. Encontrados apenas em invertebrados, esses canais e duas de suas
subunidades cloradas foram expressos e caracterizados nos oócitos de Xenopus
laevis. A ativação e a potencialização da avermectina abala diretamente na corrente
de cloro sensível ao glutamato, na atividade nematicida e na afinidade de ligação da
membrana nesse sistema.
(1)
As informações sobre organismos resistentes à ação da avermectina são
escassas, devido à complexidade do assunto. Foram descritos muitos fenótipos
fisiológicos e de crescimento “resistentes” às avermectinas, mas as relações
definitivas entre esses fenótipos e os subtipos de receptores nativos da avermectina,
locais, números e afinidade de ligação ainda precisam ser esclarecidos.
(1)
No Haemonchus contortus o desenvolvimento da resistência é conseqüente
das alterações nos genes que codificam os supostos componentes dos canais de
cloro aberto por glutamato, e nos genes que codificam os transportadores de
glicoproteína P dependentes de ATP (adenosina trifosfato) que ligam as
avermectinas.
(1)
3
Nos nematódeos resistentes a ivermectina foi detectado um grande aumento
da ligação do glutamato de baixa afinidade, mas ainda não é possível relacionar
esse aumento à resistência ao fármaco. As avermectinas também se ligam com alta
afinidade aos canais de cloro controlados por receptores do GABA (ácido gama-
aminobutírico) no cérebro de vertebrados, mas sua afinidade nos invertebrados é
cerca de cem vezes maior.
(1)
A Ivermectina é eficaz contra as microfilárias, mas não contra os vermes
adultos W. bancrofti, B. malayi, L. loa e M. ozzardi, isso porque age bloqueando a
saída das microfilárias do útero das fêmeas adultas, influenciando diretamente no
crescimento das larvas. A redução das microfilárias na pele permite que o fármaco
diminua a transmissão ao vetor borrachudo Simulium. A Ivermectina também
apresenta efeitos positivos em humanos contra A. lunmbricoides, S. stercoralis e a
larva migrans cutânea. Outros nematódeos gastrointestinais são parcialmente
atacados ou irresponsíveis.
(1)
1.1.2 Absorção, Distribuição e Excreção
Através da administração oral da Ivermectina, as concentrações plasmáticas
são aproximadamente proporcionais a dose. Em dois estudos conduzidos após a
uma única dose de 12 mg em voluntários sadios alimentados (representando uma
dose média de 165 µg/Kg), a concentração máxima plasmática do componente
majoritário B
1a
foi de 46,6 (± 21,9) ng/mL aproximadamente 4 horas após a
administração.
(1)
Aproximadamente 93% da Ivermectina liga-se às proteínas plasmáticas,
sendo convertida pelo CYP3A4 hepático em pelo menos dez metabólitos, a maior
parte sendo derivados hidroxilados e desmetilados. As condições plasmáticas
máximas em seres humanos são observadas entre 4 e 5 horas após a administração
da Ivermectina, e a longa meia-vida terminal em adultos é de aproximadamente 57
horas, resultando principalmente em uma baixa depuração sistêmica (cerca de 1-2
L/h) e um grande volume aparente de distribuição.
(1)
A Ivermectina é excretada através das fezes, sendo eliminada de forma
praticamente inalterada em um período de aproximadamente 12 dias. Em seres
humanos a excreção pela urina não é observada, seja na forma não conjugada ou
conjugada. Concentrações teciduais mais elevadas ocorrem no fígado e no tecido
adiposo, e níveis extremamente baixos são visualizados no cérebro, embora, devido
4
a sua lipossolubilidade, poderia ser esperado que o fármaco pudesse ultrapassar a
barreira hematoencefálica. Porém, estudos realizados em camundongos
transgênicos sugerem que uma bomba de efluxo de glicoproteína P na barreira
hematoencefálica impede a entrada da Ivermectina no SNC (sistema nervoso
central), esse fato e a afinidade limitada da Ivermectina pelos receptores no SNC
são a justificativa para a relativa segurança desse fármaco em humanos.
(1)
1.1.3 Terapêutica
Tabela 01 – Terapêutica da Ivermectina
(1)
.
Enfermidade
Terapêutica
Observações
Oncocercose
Doses orais únicas de
Ivermectina (150 µg/kg)
administrados a cada 6-12
meses para adultos e crianças
com idade igual ou acima de 5
anos.
O tratamento resulta na reversão da
linfadenopatia e das alterações
inflamatórias agudas nos tecidos
oculares e detém o desenvolvimento
posterior de patologia ocular devida
as microfilárias.
Filaríase
Linfática
Uma única dose anual de
Ivermectina (200-400 µg/kg) e
uma de Albendazol (400 mg)
são eficazes no controle de
filaríase linfática.
O período de tratamento é de cerca
de 4-6 anos e baseia-se na
fecundidade estimada dos vermes
adultos. O esquema duplo de
fármacos também reduz as infecções
por nematódeos intestinais
Infecções por
Nematódeos
Intestinais
Uma única dose de 100 µg/kg
de Ivermectina é tão eficaz
quanto o tratamento tradicional
da estrongiloidíase intestinal
com Tiabendazol e menos
tóxica
O fármaco é eficaz contra outras
doenças coexistentes, como a
ascaridíase, tricuríase e a
enterobíase, porém a eficácia da
Ivermectina contra estrongiloidíase
disseminada ainda precisa ser
determinada.
5
1.1.4 Toxicidade, Efeitos Colaterais e Precauções
A Ivermectina é bem tolerada por humanos e outros mamíferos, e sua
toxicidade e conseqüente das reações semelhantes à reação de Mazzotti às
microfilárias mortas. A intensidade e a natureza dessas reações se relacionam com
a quantidade de microfilárias, a duração e o tipo de infecções pelas filárias. Em
animais, doses bastante elevadas podem acarretar em sinais de toxicidade do SNC
como letargia, ataxia, midríase, tremores, e posteriormente morte. Raramente
ocorrem reações mais graves que incluem febre elevada, taquicardia, hipotensão,
prostação, tontura, cefaléia, mialgia, artralgia, diarréia, edema facial e periférico, que
podem responder ao tratamento com glicocorticóides.
(1)
Comparada a Dietilcarbamazepina, a Ivermectina induz efeitos colaterais
menos danosos, raramente acentuando as lesões dos tecidos oculares na
oncocercose. Efeitos colaterais graves, porém raros, como incapacidade acentuada
e encefalopatias nos pacientes co-infectados com grandes quantidades de
microfilárias L. loa já foram detectados, e existem poucas evidências sobre a
atividade teratogênica ou carcinogênica da Ivermectina.
(1)
A Ivermectina é contra indicada nos quadros associados a um
enfraquecimento da barreira hematoencefálica, já que surte efeitos nos receptores
GABA no SNC. A co-administração do fármaco com outros agentes que deprimem a
atividade do SNC, também exige uma maior atenção já que as possíveis interações
adversas da Ivermectina com outros fármacos que são extensamente metabolizados
pela CYP3A4 hepática necessitam de avaliação. O uso de Ivermectina em crianças
com menos de 5 anos de idade e em mulheres grávidas ainda não foi aprovado.
Mulheres que fazem uso do fármaco em período de amamentação secretam baixos
níveis de Ivermectina no leite, mas as conseqüências para os lactentes ainda são
desconhecidas.
(1)
1.2 MEDICAMENTOS GENÉRICOS
1.2.1 Histórico
A produção de medicamentos genéricos pela indústria farmacêutica teve
inicio na década de 60, através da iniciativa do governo Norte Americano, porém,
somente no ano de 1984 foram estabelecidos os critérios de registro desse tipo de
medicamento, critérios que posteriormente vieram a ser adotados num âmbito
internacional.
(2)
6
A base para o modelo de produção de medicamentos genéricos nos EUA foi
estabelecida seguindo os parâmetros de Hatch-Waxman (The Drug Price
Competition and Patent Term Restoration Act), tornando a bioequivalência uma
etapa aceitável para a comprovação científica de sua segurança e eficácia. A oferta
desse novo produto com qualidade comprovada em larga escala, trouxe benefícios a
população, tornando a indústria de medicamentos genéricos competitiva e
promissora.
(2)
No Brasil o programa de medicamentos genéricos foi implantado em 1999
após a promulgação da Lei 9787, três anos após as leis de patentes vigorarem no
país. Os resultados da implantação do programa já puderam ser observados quatro
anos depois, onde os medicamentos genéricos já apresentavam 4 mil
apresentações farmacêuticas, abrangendo as principais classes terapêuticas e mais
de 60% das necessidades das prescrições.
(2)
De acordo com a Legislação Brasileira, os medicamentos genéricos só podem
ser consumidos depois de garantida a sua eficácia e segurança através de testes de
bioequivalência (in vivo) e equivalência farmacêutica (in vitro). O teste de
bioequivalência tem a finalidade de comprovar que o medicamento genérico segue o
mesmo comportamento do medicamento referência/inovador quando estudados
sobre um mesmo desenho experimental, e nele são avaliados parâmetros como a
velocidade e a extensão de absorção de um princípio ativo administrado por via
extravascular. Os testes de equivalência farmacêutica têm o objetivo de garantir que
a composição do produto seja idêntica a do medicamento de referência/inovador que
lhe deu origem. Todo esse cuidado que cerca o registro dos genéricos e se estende
para as etapas de produção e comercialização destes medicamentos se faz
essencial para assegurar sua principal propriedade: a intercambialidade. Esta
consiste no benefício dos medicamentos genéricos substituírem os medicamentos
de referência/inovadores prescritos.
(2)
No Brasil, a intercambialidade dos genéricos foi definida pela ANVISA
(Agência Nacional de Vigilância Sanitária) na Resolução 391, de 9 de agosto de
1999, posteriormente publicada novamente como a Resolução RDC 135, de 29 de
maio de 2003. Ali estão descritos os requisitos e critérios técnicos para registro de
medicamentos genéricos, incluindo os procedimentos referentes à
intercambialidade.
(2)
7
1.2.2 Medicamento Genérico
Segundo a concepção da Organização Mundial da Saúde (OMS), o
medicamento genérico é um produto intercambiável, ou seja, apresenta
características como princípio ativo, concentração, forma farmacêutica, via de
administração, posologia e indicação terapêutica, preventiva ou diagnóstica iguais as
do medicamento referência, devendo apresentar a mesma segurança e eficácia
clínica, e para isso passam obrigatoriamente por testes de equivalência farmacêutica
e bioequivalência/biodisponibilidade.
(2)
Os medicamentos similares contêm características como: princípio ativo,
concentração, forma farmacêutica, via de administração, posologia e indicação
terapêutica, preventiva ou diagnóstica, iguais as do medicamento referência, mas os
testes de biodisponibilidade/bioequivalência não foram obrigatórios para este
segmento. Para ser considerado similar basta ter a equivalência farmacêutica em
relação ao medicamento referência comprovada.
(3)
1.2.3 Definições
Biodisponibilidade - É uma propriedade biológica relacionada à velocidade e a
extensão de absorção de um princípio ativo administrado por via extravascular, de
um indivíduo, envolvendo também a eficácia clínica do medicamento. Medicamentos
administrados por via intravenosa, não apresentam essa propriedade, uma vez que
o processo de absorção não ocorre por esta via.
(2)
Bioequivalência - estudo in vivo – consiste em comparações qualitativas e
quantitativas do desempenho de medicamentos teste e referência, quanto ao
princípio ativo e biodisponibilidade, quando estudados sobre um mesmo desenho
experimental. São considerados bioequivalentes os medicamentos que ao serem
administrados na mesma concentração molar e condições experimentais, não
apresentarem diferença estatisticamente significativas em relação à
biodisponibilidade.
(2)
Biodisponibilidade Relativa – Análise comparativa, entre medicamento teste e
medicamento referência, da razão entre a quantidade e velocidade que o princípio
ativo leva para alcançar à circulação sistêmica a partir da administração
extravascular.
(4)
Equivalência Farmacêutica – estudo in vitro – consiste na comparação
empírica do medicamento teste com o medicamento referência avaliando
8
qualitativamente e quantitativamente a concentração, o princípio ativo, a forma
farmacêutica, a indicação e a via de administração dos mesmos. As análises devem
cumprir com as especificações atualizadas da Farmacopéia Brasileira e, na ausência
destas, com as de outros códigos autorizados pela legislação vigente ou, ainda, com
outros padrões aplicáveis de qualidade, relacionados à identidade, dosagem,
pureza, potência, uniformidade de conteúdo, tempo de desintegração e velocidade
de dissolução, quando for o caso.
(3)
Equivalentes Terapêuticos - Medicamentos com a mesma eficácia clínica e o
mesmo potencial para gerar efeitos adversos, em relação ao medicamento
referência. É importante ressaltar que a equivalência farmacêutica não comprova,
necessariamente, equivalência terapêutica, tendo em vista que as diferenças nos
excipientes ou nos processos de fabricação podem conduzir a diferenças de
desempenho do produto.
(2)
O desenvolvimento de novos medicamentos pode não ocorrer devido a
fatores que afetam a biodisponibilidade do mesmo.
1.3 FATORES QUE AFETAM A BIODISPONIBILIDADE DE MEDICAMENTOS
A biodisponibilidade de uma forma farmacêutica administrada por via oral
pode ser influenciada por diversos fatores fisiológicos e físico-químicos.
Considerando-se que a absorção ocorre somente após a solubilização do fármaco,
os processos de desintegração da forma farmacêutica sólida, liberação e dissolução
do fármaco e sua permeabilidade através das membranas biológicas, são etapas
determinantes na biodisponibilidade.
(5)
Os principais fatores que irão influenciar na biodisponibilidade de uma forma
farmacêutica são as características físico-químicas do fármaco, as características da
forma farmacêutica e seus excipientes e também fatores fisiológicos relacionados ao
trato gastrointestinal (TGI).
(5)
Para o que o medicamento em teste seja considerado bioequivalente ao
medicamento de referência, podem ser realizadas análises dos dois medicamentos
através da técnica de cromatografia líquida com detecção por espectrometria de
massas.
9
1.4 TÉCNICA BIOANALíTICA
A espectrometria de massas é uma técnica de grande participação na
indústria farmacêutica, seja no de controle de qualidade ou em pesquisas de novos
fármacos e formulações. No Brasil a análise de fármacos em amostras biológicas
utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por Espectrometria
de Massas seqüencial (CLAE-EM/EM) para o desenvolvimento de métodos para
bioequivalência, é um segmento de grande importância econômica, que trouxe
divisas com a prestação de serviços na área de química analítica. A CLAE-EM/EM
apresenta um crescimento promissor devido as enormes vantagens que apresenta
sobre outras técnicas tradicionalmente empregadas no setor analítico, essas
vantagens são observadas principalmente quanto a velocidade, seletividade e
sensibilidade da técnica.
(6)
1.4.1 Cromatografia Líquida
Criada em 1950, a cromatografia líquida já sofreu muitos avanços até os dias
atuais. O desenvolvimento contínuo de novas partículas de fases estacionárias (FE)
resultou na obtenção de colunas mais seletivas, eficientes e estáveis química e
mecanicamente. Nos últimos quarenta anos, a técnica mais desenvolvida, difundida
e empregada em laboratórios de análise de indústrias químicas e farmacêuticas,
bem como em áreas médicas entre muitos outros campos da ciência, é a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
(7)
A importância da cromatografia líquida de alta eficiência é justificada devido a
sua capacidade de analisar compostos que não são suficientemente voláteis para a
cromatografia a gás. A CLAE é uma técnica que utiliza uma alta pressão para fazer
com que o composto em análise passe mais rapidamente pela coluna
cromatográfica contendo partículas muito finas, que garantem a eficiência das
separações (com alta resolução).
(8)
A separação cromatográfica se dá através da migração diferencial dos
componentes de uma mistura devido às diferenças de polaridade entre a fase móvel
e a fase estacionária, conforme demonstrado na Figura 02. A migração diferencial
ocorre por meio de interações entre os componentes da mistura e as fases móvel e
estacionária, e podem ser do tipo pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas e
hidrofóbicas ou forças de Van der Waals, entre outras. Fatores como composição da
10
fase móvel, composição da fase estacionária e temperatura da separação, podem
alterar a migração dos componentes da mistura através da coluna.
(9)
O alargamento de bandas é conseqüência de processos físicos como a
difusão de Eddy (ou de múltiplos caminhos), transferência de massa de fase móvel,
transferência de fase móvel estagnada, transferência de fase estacionária e difusão
longitudinal.
(10)
Figura 02 – Representação do processo de migração diferencial de seus componentes entre a fase
móvel e a fase estacionária.
A instrumentação necessária para CLAE é extremamente sofisticada, muito
diferente dos aparelhos utilizados pela Cromatografia Líquida clássica isto está
representado na Figura 03.
(10)
11
Figura 03 – Representação esquemática de um sistema de CLAE: Esta técnica conta com um
reservatório de fase móvel (1), um sistema de distribuição de solvente (2), uma válvula de injeção de
amostra (3), uma coluna de alta pressão (4), um detector (5) e um computador para monitorar o
sistema e apresentar os resultados (6).
1.4.1.1 Tipos de cromatografia
A cromatografia é dividida em diferentes categorias com base no mecanismo
de interação entre o soluto e a fase estacionária.
(8)
A cromatografia de adsorção utiliza uma fase estacionária sólida e uma fase
móvel líquida ou gasosa. Nesta técnica o soluto é adsorvido na superfície das
partículas sólidas, e quanto mais forte for o grau de adsorção do soluto, mais
lentamente a partícula se deslocará pela coluna.
(8)
Na cromatografia de partição a fase estacionária líquida empregada deve
apresentar alto ponto de ebulição e estar ligada a uma superfície sólida
normalmente dentro da coluna de sílica (SiO
2
) na cromatografia a gás. O soluto deve
encontrar-se em equilíbrio entre a fase estacionária e a fase móvel.
(8)
A cromatografia de troca iônica é uma técnica cujo ânion (como –SO
3
-
), ou
cátions (como –N(CH
3
)
3
+
), encontram-se ligados covalentemente à fase estacionária
sólida, que nesse tipo de cromatografia costuma ser uma resina. Os íons do soluto,
com carga oposta, são atraídos para a fase estacionária por forças eletrostáticas. A
fase móvel nesse caso é um líquido.
(8)
Na cromatografia de exclusão molecular a separação das moléculas se dá
pelo tamanho, como os solutos maiores passando com maior velocidade pela
coluna. No caso ideal, não ocorre interações atrativas entre a fase estacionária e o
soluto. A fase móvel, líquida ou gasosa, passa através de um gel poroso. Os poros
são suficientemente pequenos para excluírem as moléculas maiores de soluto, mas
12
permitem a penetração de moléculas menores no gel tornando maior o tempo que
estas moléculas ficarão retidas na coluna.
(8)
A cromatografia de afinidade é uma técnica mais seletiva pois utiliza
interações específicas entre um tipo de soluto e uma segunda molécula que se
encontra covalentemente ligada (imobilizada) à fase estacionária. Por exemplo, a
molécula imobilizada pode ser um anticorpo para uma determinada proteína.
(8)
1.4.1.2 Modos de separação
Cada classe de analito empregado em cromatografia necessita de um modo de
separação específico, devido às interações analito-fase móvel, analito-fase estacionária, e
fase móvel-fase estacionária existentes. Dessa forma, foram propostos dois modelos de
retenção em cromatografia líquida. O primeiro proposto Scott e Kucera, interação-solvente,
e o segundo por Snyder, competição-solvente. Os dois modelos são equivalentes, uma vez
que ambos consideram que, em uma dada separação, a interação do analito com a fase
estacionária permanece constante. Portanto, a retenção é determinada pela composição da
fase móvel.
(9)
1.4.1.2.1 Cromatografia em fase normal
A cromatografia de fase normal consiste em um sistema cuja fase móvel é
apolar e a fase estacionária é polar. Os solventes usados são geralmente uma
mistura de solventes orgânicos sem a adição de água, e as fases estacionárias são
adsorventes orgânicos (sílica, alumina) ou fases polares quimicamente ligadas
(ciano, diol, fenil, amino). Esse modo de cromatografia é normalmente empregado
em análises de moléculas neutras, embora também possa ser utilizado para a
separação de moléculas ionizáveis ou iônicas.
(9)
1.4.1.2.2 Cromatografia em fase reversa
A cromatografia de fase reversa é o sistema em que a fase móvel é polar e a
fase estacionaria é apolar. A cromatografia em fase reversa apresenta maior
utilização em CLAE, uma vez que permite a separação de uma grande variedade de
analitos e o uso de fases móveis aquosas. A fase móvel mais comumente
empregada é uma mistura de acetonitrila/água, podendo a acetonitrila, quando
necessário, ser substituída por metanol ou tetrahidrofurano (THF). O uso de apenas
estes três solventes deve-se à pequena quantidade de solventes orgânicos
13
miscíveis em água. O princípio da separação em fase reversa é a hidrofobia e deve-
se principalmente a interações entre a parte apolar do analito e a fase estacionária
apolar, isto é, à repulsão desta parte do analito pela fase móvel aquosa.
(9)
1.4.2 Espectrometria de massas
A espectrometria de massas (EM) é uma técnica analítica que vem sendo
utilizada desde o início do século 20
(11)
e permitiu a descoberta de vários marcos
importantes na física e na química, desde o elétron até a análise de proteínas, mais
conhecido como proteoma.
(12)
A EM permite a determinação estrutural e a análise quantitativa de moléculas
orgânicas. Essas análises são feitas através da ionização e fragmentação das
espécies ionizadas gerando espectros os quais retratam características da molécula
como um todo ou partes da mesma.
(8)
Os componentes chave do espectrômetro de massas estão representados na
Figura 04 e são eles: o sistema de amostragem (a), a fonte de íons (b), que tem a
finalidade de transformar partículas do analito do seu estado neutro para a sua
forma iônica, o analisador (c), responsável pela separação dos íons, o detector (d)
que atua como gerador de sinais mensuráveis e o sistema de dados (e).
(9)
Logo abaixo, na Figura 04 está apresentada uma representação esquemática
dos componentes de um espectrômetro de massas.
Figura 04 – Descrição básica do espectrômetro de massas.
13
miscíveis em água. O princípio da separação em fase reversa é a hidrofobia e deve-
se principalmente a interações entre a parte apolar do analito e a fase estacionária
apolar, isto é, à repulsão desta parte do analito pela fase móvel aquosa.
(9)
1.4.2 Espectrometria de massas
A espectrometria de massas (EM) é uma técnica analítica que vem sendo
utilizada desde o início do século 20
(11)
e permitiu a descoberta de vários marcos
importantes na física e na química, desde o elétron até a análise de proteínas, mais
conhecido como proteoma.
(12)
A EM permite a determinação estrutural e a análise quantitativa de moléculas
orgânicas. Essas análises são feitas através da ionização e fragmentação das
espécies ionizadas gerando espectros os quais retratam características da molécula
como um todo ou partes da mesma.
(8)
Os componentes chave do espectrômetro de massas estão representados na
Figura 04 e são eles: o sistema de amostragem (a), a fonte de íons (b), que tem a
finalidade de transformar partículas do analito do seu estado neutro para a sua
forma iônica, o analisador (c), responsável pela separação dos íons, o detector (d)
que atua como gerador de sinais mensuráveis e o sistema de dados (e).
(9)
Logo abaixo, na Figura 04 está apresentada uma representação esquemática
dos componentes de um espectrômetro de massas.
Figura 04 – Descrição básica do espectrômetro de massas.
13
miscíveis em água. O princípio da separação em fase reversa é a hidrofobia e deve-
se principalmente a interações entre a parte apolar do analito e a fase estacionária
apolar, isto é, à repulsão desta parte do analito pela fase móvel aquosa.
(9)
1.4.2 Espectrometria de massas
A espectrometria de massas (EM) é uma técnica analítica que vem sendo
utilizada desde o início do século 20
(11)
e permitiu a descoberta de vários marcos
importantes na física e na química, desde o elétron até a análise de proteínas, mais
conhecido como proteoma.
(12)
A EM permite a determinação estrutural e a análise quantitativa de moléculas
orgânicas. Essas análises são feitas através da ionização e fragmentação das
espécies ionizadas gerando espectros os quais retratam características da molécula
como um todo ou partes da mesma.
(8)
Os componentes chave do espectrômetro de massas estão representados na
Figura 04 e são eles: o sistema de amostragem (a), a fonte de íons (b), que tem a
finalidade de transformar partículas do analito do seu estado neutro para a sua
forma iônica, o analisador (c), responsável pela separação dos íons, o detector (d)
que atua como gerador de sinais mensuráveis e o sistema de dados (e).
(9)
Logo abaixo, na Figura 04 está apresentada uma representação esquemática
dos componentes de um espectrômetro de massas.
Figura 04 – Descrição básica do espectrômetro de massas.
14
1.4.2.1 Fonte Íons – Electrospray (ESI).
Nos últimos anos, a espectrometria de massas tem se difundido nas mais
diversas áreas da ciência, conforme na Figura 05.
(13)
Este avanço da espectrometria
de massas pode ser atribuído a descoberta da ionização por electrospray (ESI-EM),
a qual permitiu o acoplamento com a cromatografia líquida.
Figura 05 – Utilização da espectrometria de massas em diferentes áreas do conhecimento. Todos os
dados foram obtidos de pesquisa realizada em www.isiknowledge.com, no período de 1993 a 2004,
considerando as 500 primeiras citações de cada ano. No gráfico aparecem apenas áreas que
atingiram mais de 1%.
(13)
A interface entre CLAE e EM foi um desafio para os cientistas, devido ser
necessário desviar uma grande parte da fase móvel para fora do espectrômetro de
massas. Outro grande desafio foi a necessidade da transformação das espécies
termolábeis da amostra em solução para íons na fase gasosa. A interface que surgiu
para resolver estes dois desafios foi denominada fonte de electrospray.
(14)
O sistema
de electrospray pode ser definido como sendo um circuito elétrico que dirige os íons
formados em solução para a fase gasosa, conforme ilustrado na Figura 06.
(15)
15
Figura 06 – Formação dos íons na fonte de electrospray e análise dos íons com suas respectivas
razões massa/carga para aquisição do espectro de massas.
O electrospray é conhecido como um dos métodos de ionização mais
brandos, onde são analisados componentes de alta labilidade como os fármacos.
(15)
No processo, a fase móvel contendo o analito ionizado proveniente do
sistema de CLAE é inserida na fonte de ionização, numa dada vazão através de um
capilar de aço ao qual é aplicado um alto potencial elétrico em torno de 4 kV, essa
alta voltagem faz com que ocorra a separação das cargas provenientes da solução
em análise, geralmente essa separação é por volta de 1%. O nitrogênio é
geralmente utilizado como gás de nebulização e dessolvatação, que permite a
secagem das gotas carregadas fazendo com que os íons se dirijam para a fase
gasosa.
(8;15)
O líquido carregado eletricamente que sai do capilar forma um cone (cone de
Taylor), posteriormente esse cone se transforma em um fino filamento e, finalmente
se dispersa em gotículas carregadas que vão sendo secas e por fim se formam íons
gasosos para serem analisados no EM.
(8)
A formação dos íons em fase gasosa pode ser explicada através de dois
modelos: o de carga residual (charged residue model, CRM) e o de evaporação de
íons (ion evaporation model, IEM). No CRM, as gotículas carregadas vão
16
evaporando-se até ao ponto onde as cargas presentes começam a sofrer repulsão
eletrostática ocasionando a explosão da gotícula, chamada de explosão coulômbica,
formando gotas carregadas menores até que todo o solvente seja evaporado.
(15)
No
IEM, as gotículas carregadas vão evaporando-se até ao ponto onde as cargas
presentes começam a sofrer repulsão eletrostática ocasionando a evaporação dos
íons.
(15)
Na Figura 07 é visualizada a formação do spray de gotículas carregadas,
chamado de nebulização.
Figura 07 – Nebulização.
1.4.2.2 Analisador Quadrupolar
O quadrupolo é o separador de íons (através de suas m/z) mais utilizado, ele
é constituído por quatro hastes metálicas paralelas conforme ilustrado na Figura
08.
(8)
17
Figura 08 – Ilustração do analisador quadrupolar.
A separação de m/z dos íons do analisador de massas quadrupolar é feito
através da aplicação de uma combinação de potenciais tempo-independente (dc) e
tempo-dependente (ac), conforme demonstrado na Figura 09. Quando é aplicado um
potencial ac juntamente com o dc, temos um efeito onde somente íons estáveis a
esse potencial vão oscilar de forma a alcançar o detector. Os outros íons gerados na
fonte que não são estáveis não serão detectados. Quando aplicamos os potenciais
dc sobre os quadrupolos um par deles vai ficar a maior parte do tempo positivo,
enquanto os outros dois quadrupolos ficarão a maior parte do tempo negativos. No
momento em que se aplica o potencial ac estes potenciais positivos e negativos irão
oscilar até que ocorra a inversão de polaridades. Este efeito sobre a trajetória dos
íons se dá tanto nos eixos X-Z quanto nos eixos Y-Z (Figura 10).
(16)
Figura 09 – Demonstração da aplicação dos potencias nas barras metálicas do analisador
quadrupolar.
18
Figura 10 – Demonstração dos eixos nos quais sofrem influência dos potenciais aplicados no
analisador quadrupolar.
Para que os íons viagem da fonte de ionização para o detector, conforme
demonstrado na Figura 11, os íons devem ser estáveis quando são aplicados os
potencias ac e dc, caso os íons não sejam estáveis, eles colidem com as barras
metálicas ou saem do analisador e assim não são detectados.
(16)
Figura 11 – Esquema do separador quadrupolo.
18
Figura 10 – Demonstração dos eixos nos quais sofrem influência dos potenciais aplicados no
analisador quadrupolar.
Para que os íons viagem da fonte de ionização para o detector, conforme
demonstrado na Figura 11, os íons devem ser estáveis quando são aplicados os
potencias ac e dc, caso os íons não sejam estáveis, eles colidem com as barras
metálicas ou saem do analisador e assim não são detectados.
(16)
Figura 11 – Esquema do separador quadrupolo.
18
Figura 10 – Demonstração dos eixos nos quais sofrem influência dos potenciais aplicados no
analisador quadrupolar.
Para que os íons viagem da fonte de ionização para o detector, conforme
demonstrado na Figura 11, os íons devem ser estáveis quando são aplicados os
potencias ac e dc, caso os íons não sejam estáveis, eles colidem com as barras
metálicas ou saem do analisador e assim não são detectados.
(16)
Figura 11 – Esquema do separador quadrupolo.
19
O analisador quadrupolar apresenta resolução inferior a de outros
analisadores, porém apresenta vantagens quanto a sua sensibilidade, devido a não
necessidade do uso de fendas para remover parte dos íons (apresentadas em
outros analisadores).
(8)
Em espectrometria de massas seqüencial ou EM/EM (EM
2
) o íon principal é
selecionado da fragmentação dando origem a um espectro de massas sequencial.
Os íons filhos são obtidos da fragmentação espontânea ou induzida do íon
precursor. Em misturas complexas, esses íons filhos fornecem evidências
inequívocas da presença de um composto conhecido, e no caso da análise de
compostos novos ou desconhecidos, esses íons filhos permitem a obtenção de
muitas informações estruturais.
(17)
Encontra-se na Figura 12 a esquematização do funcionamento de um
espectrômetro de massas quadrupolar triplo, onde uma mistura de íons é inserida no
quadrupolo Q1, liberando apenas um íon precursor. No segundo estágio q2 o íon
precursor colide com as moléculas de N
2
ou Ar em uma pressão de 10
-8
a 10
-6
bar e
se fragmenta formando os íons filhos, permitindo a passagem de todos os íons com
diferentes massas para o terceiro estágio, Q3. O quadrupolo Q3 atua como um
segundo filtro, permitindo que somente determinados íons filhos passem para o
detector.
(8)
Figura 12 – Ilustração de espectro de massas triplo quadrupolar.
19
O analisador quadrupolar apresenta resolução inferior a de outros
analisadores, porém apresenta vantagens quanto a sua sensibilidade, devido a não
necessidade do uso de fendas para remover parte dos íons (apresentadas em
outros analisadores).
(8)
Em espectrometria de massas seqüencial ou EM/EM (EM
2
) o íon principal é
selecionado da fragmentação dando origem a um espectro de massas sequencial.
Os íons filhos são obtidos da fragmentação espontânea ou induzida do íon
precursor. Em misturas complexas, esses íons filhos fornecem evidências
inequívocas da presença de um composto conhecido, e no caso da análise de
compostos novos ou desconhecidos, esses íons filhos permitem a obtenção de
muitas informações estruturais.
(17)
Encontra-se na Figura 12 a esquematização do funcionamento de um
espectrômetro de massas quadrupolar triplo, onde uma mistura de íons é inserida no
quadrupolo Q1, liberando apenas um íon precursor. No segundo estágio q2 o íon
precursor colide com as moléculas de N
2
ou Ar em uma pressão de 10
-8
a 10
-6
bar e
se fragmenta formando os íons filhos, permitindo a passagem de todos os íons com
diferentes massas para o terceiro estágio, Q3. O quadrupolo Q3 atua como um
segundo filtro, permitindo que somente determinados íons filhos passem para o
detector.
(8)
Figura 12 – Ilustração de espectro de massas triplo quadrupolar.
19
O analisador quadrupolar apresenta resolução inferior a de outros
analisadores, porém apresenta vantagens quanto a sua sensibilidade, devido a não
necessidade do uso de fendas para remover parte dos íons (apresentadas em
outros analisadores).
(8)
Em espectrometria de massas seqüencial ou EM/EM (EM
2
) o íon principal é
selecionado da fragmentação dando origem a um espectro de massas sequencial.
Os íons filhos são obtidos da fragmentação espontânea ou induzida do íon
precursor. Em misturas complexas, esses íons filhos fornecem evidências
inequívocas da presença de um composto conhecido, e no caso da análise de
compostos novos ou desconhecidos, esses íons filhos permitem a obtenção de
muitas informações estruturais.
(17)
Encontra-se na Figura 12 a esquematização do funcionamento de um
espectrômetro de massas quadrupolar triplo, onde uma mistura de íons é inserida no
quadrupolo Q1, liberando apenas um íon precursor. No segundo estágio q2 o íon
precursor colide com as moléculas de N
2
ou Ar em uma pressão de 10
-8
a 10
-6
bar e
se fragmenta formando os íons filhos, permitindo a passagem de todos os íons com
diferentes massas para o terceiro estágio, Q3. O quadrupolo Q3 atua como um
segundo filtro, permitindo que somente determinados íons filhos passem para o
detector.
(8)
Figura 12 – Ilustração de espectro de massas triplo quadrupolar.
20
1.4.2.2.1 Simbologia dos Experimentos de Espectrometria de Massas
Sequencial
Na Figura 13, está descrito resumidamente a simbologia utilizada para
experimentos de espectrometria de massas seqüencial.
Figura 13 –Representação dos símbolos utilizados em um experimento(a) EM b) EM
2
.
Na Figura 13(a), o círculo vazio representa o analisador de massas em modo
de varredura, onde detecta as razões m/z dos íons que são transmitidos por ele, já o
círculo cheio representa quando um íon de determinada razão m/z está selecionado
no analisador e a seta representa o fluxo dos íons por uma câmara de colisão, onde
através da fragmentação pode ocorrer perda de massa. A Figura 13(b) é utilizada
para representação em experimentos EM
2
, onde o quadrupolo Q1 está sendo
utilizado na seleção e Q3 está analisando os produtos formados na reação com
moléculas neutras no quadrupolo q2.
(15)
1.4.2.3 Cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas
Um detector ideal em sistema cromatográfico deve apresentar peculiaridades
como alta sensibilidade, alta seletividade, boa resposta a um grande número de
classes de compostos e habilidade na detecção de misturas complexas permitindo
um elevado número de análise. Sendo também indispensável a possibilidade de uso
do detector em análises quantitativas. Todas essas características são encontradas
no acoplamento de um cromatógrafo e um espectrômetro de massas, combinando
as vantagens da cromatografia (alta seletividade e eficiência de separação) com as
vantagens da espectrometria de massas (obtenção de informação estrutural, massa
molar e aumento adicional de seletividade). Porém, para que o acoplamento seja
possível, idealmente, é necessário que as características de cada instrumento sejam
respeitadas para sua conexão. Assim como não devem ocorrer modificações
21
químicas não controladas do analito e perda de amostra durante a sua passagem do
cromatógrafo para o espectrômetro de massas.
(18)
O maior problema de compatibilidade entre o cromatógrafo líquido e o
espectrometro de massas é devido ao cromatógrafo trabalhar com analitos em
solução e o espetrometro de massas trabalhar com analitos na fase gasosa.
(13)
Porém este problema foi completamente resolvido com a utilização de uma
ionização especial, a qual foi denominada electrospray. Uma vez que os compostos
separados por CLAE são relativamente pouco voláteis e/ou sensíveis à temperatura,
a fonte de ESI vem sendo a mais utilizada para o acoplamento das duas técnicas.
Nos dias de hoje para a análise de fármacos em baixíssima concentração (menor
que 0,1 ng/mL) e matrizes complexas é a técnica mais utilizada em todo o mundo.
(18)
A técnica de CLAE acoplada com EM tem diversas vantagens citadas acima,
porém na maioria dos casos é necessário que as amostras sejam tratadas, este
tratamento visa eliminar componentes que diminuam a ionização pela técnica de
electrospray.
1.5 TRATAMENTO DE AMOSTRAS
O tratamento da amostra consiste na obtenção da amostra de interesse com
a menor quantidade de interferentes possíveis, esta etapa é de fundamental
importância para análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, pois garante
que existe compatibilidade da amostra com o eluente utilizado, e previne danos a
coluna cromatográfica. A etapa de preparação da amostra é a mais demorada do
método e a qual podem ocorrer maior número de erros.
(10)
Existem vários tipos de preparo de amostras em materiais biológicos, os mais
utilizados são as extrações líquido-líquido e a precipitação de proteínas. A presença
de compostos endógenos em sua composição pode comprometer a análise
pretendida, especialmente por causa da concentração dos analitos quase sempre
muito baixa, na ordem de ng/mL. O princípio ativo e/ou os metabólitos podem se
ligar às proteínas, porém em um processo de extração essas ligações devem ser
quebradas.
(10)
A extração líquido-líquido é feita pela partição da amostra entre dois líquidos
imiscíveis, sendo normalmente um aquoso e outro orgânico. A extração dos
compostos pela fase orgânica só acontece se os compostos possuírem a
lipofilicidade necessária para serem extraídos por um solvente mais orgânico.
(10)
22
A extração líquido-líquido consiste na transferência de um soluto presente em
uma fase mais complexa (matriz) para outra fase mais simples (solvente) sendo
denominada extração. De modo geral, em química analítica, as extrações são feitas
no intuito de concentrar o analito desejado, ou separá-lo das espécies que
interferem na sua análise. Os solventes mais comumente utilizados são o éter
dietílico, acetato de etila e o hexano, pois apresentam imiscibilidade em soluções
polares (matrizes aquosas), além de densidades menores que a da água. Essas
diferenças de polaridade e densidade fazem com que, num processo de extração,
esses solventes permaneçam numa fase separada acima da fase aquosa. O
clorofórmio e o diclorometano também são solventes utilizados, porém, mais densos
que a água, encontrando-se abaixo da fase aquosa no processo de extração, e
devido a questões ambientais somente são utilizados em casos de ultima escolha.
(8)
Outro tipo de preparo de amostra para análise de fluídos biológicos como
plasma, soro ou urina, é a precipitação das proteínas presentes na amostra, este
método pode ser executado de diversas formas, como: aquecimento; tratamento
com ácidos, bases ou solventes orgânicos miscíveis com água, como metanol,
acetonitrila e etanol. A proteína precipitada é separada após centrifugação e o
sobrenadante é, em muitos casos, injetado diretamente no cromatógrafo ou então
submetido a um determinado método de extração líquido-líquido.
(10)
No processo de tratamento de amostras, o principal objetivo é a obtenção do
analito com o mínimo de interferentes possíveis, sendo que uma alta recuperação é
desejável, porém em alguns casos não é necessária. O preparo da amostra deve
gerar dados precisos e exatos e não necessariamente altas recuperações garantem
essa precisão e exatidão. Primeiramente deve-se considerar a solubilidade do
composto a ser analisado, bem como a pureza do solvente extrator.
(10)
Para compostos ionizáveis (a maioria dos fármacos), além das considerações
acima, deve-se levar em conta o pH da matriz biológica. São muito utilizadas
extrações com adição de ácido ou base (neutralização do analito), e posterior
extração com solvente orgânico. Quando utilizado na extração solventes menos
densos que a água facilita a separação através do congelamento e centrifugação
para separação das fases imiscíveis.
(10)
Para que as análises sejam consideradas confiáveis, devemos validar essa
metodologia e assim garantir que a mesma está dentro dos parâmetros aceitáveis
pelas Anvisa e FDA.
23
1.6 REVISÃO DA LITERATURA
Em Danaher e colaboradores,
(22)
foi feita uma revisão de várias metodologias
utilizadas na determinação de macrocíclicos em matrizes biológicas. A cromatografia
líquida de fluorescência e cromatografia líquida com detecção por espectrometria de
massas foram as técnicas de escolha para a determinação de resíduos de
macrocíclicos. A primeira técnica tem vantagens sobre a segunda em termos de
custo, mas a espectrometria de massas é mais sensível e seletiva. Muitos dos
recentes métodos utilizados para a determinação de multi-resíduos de macrocíclicos
são feitos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas, isto é
alcançado através da utilização de padrões internos e procedimentos de preparo de
amostra mais adequados. Outro método que pode ser usado são os imunoquímicos,
onde são utilizados anticorpos, mas estes são restritos a alguns macrocíclicos.
Já em Durden,
(23)
foi utilizada a cromatografia líquida acoplada e
espectrometria de massas seqüencial para a determinação de Abamectina,
Doramectina, Eprinomectina, Mexodectina e Ivermectina em leite.
Em Hernando e colaboradores,
(24)
utilizaram a CLAE-EM/EM para a
confirmação e quantificação de resíduos de Avermectinas em alimentos. O limite de
quantificação desse método foi de 0,15-5 ppb, para o preparo da amostra foi
utilizado extração líquida em fase sólida (SPE), foi feito gradiente de fase móvel
durante o tempo da corrida cromatográfica de 4,5 minutos, para que a separação
dos compostos fosse determinada.
Em Kitzman e colaboradores,
(25)
foi determinado Ivermectina em plasma
humano para aplicação em estudos de farmacocinética clínica através de
cromatografia líquida com detector de fluorescência. A curva de calibração utilizada
foi de 0,2-200 ng/mL. O tempo de corrida foi de 32 minutos e também foi utilizada
extração líquida em fase sólida (SPE) para o preparo de amostras.
Pereira e colaboradores,
(26)
fizeram a determinação de Ivermectina em
plasma humano e de ratos, onde foi obtido uma curva de calibração de 1-2000
ng/mL. Neste método foi feito um gradiente de fase móvel, onde foi variado a
composição da mesma durante 4,50 minutos para melhor separação cromatográfica.
Já em Croubels e colaboradores,
(27)
foi feito a determinação de Ivermectina
em plasma animal, de bezerros, o preparo das amostras foi feito através da
precipitação de proteínas utilizando acetonitrila, o LQ foi de 1 ng/mL e sua curva de
24
calibração foi de 1-100 ng/mL, também foi utilizado um gradiente de fase móvel,
onde foi variado a composição da mesma durante 10 minutos.
Nos estudos realizados, conforme citado acima, foram feitas determinações
através da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas e
fluorescência para determinação de resíduos em alimentos, em plasma de animais e
também humano, o presente estudo foi feito a determinação em plasma humano
para aplicação em estudos farmacocinéticos, portanto para desenvolvimento dessa
metodologia deve-se obter a maior rapidez possível nas análises e robustez para o
alto volume de amostras que esta aplicação requer.
O preparo das amostras foi feito através da extração líquido-líquido, que é um
tipo de extração simples e barato, enquanto os demais métodos utilizaram a
desproteinização e SPE.
Esta metodologia apresenta-se como uma ótima alternativa para a
quantificação de Ivermectina em plasma humano, já que tem o tempo de corrida
comparável aos métodos mais rápidos da literatura (4,5 min), e quando comparado
com estes apresenta um menor limite de quantificação (0,5 ng/mL). O método
apresentado por Kitzman e col.
(25)
apresenta o menor limite de quantificação em
matriz plasmática (0,2 ng/mL), no entanto o longo tempo de corrida desta
metodologia (32,0 min) compromete sua viabilidade para análises de grandes
quantidades de amostras que requer estudos farmacocinéticos e de bioequivalência
(700 a 2000 amostras).
25
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e validação de uma
metodologia bioanalítica para quantificação de Ivermectina em plasma humano
utilizando a Cromatografia Líquida com detecção por Espectrometria de Massas
(LC-MS/MS), empregando Doramectina como padrão interno.
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MÉTODO BIOANALÍTICO
3.1.1 Princípios do Método
A Ivermectina, juntamente com seu padrão interno, Doramectina, foram
extraídos do plasma humano através de uma extração líquido-líquido com hexano e
acetato de etila na proporção de 50:50 (v/v), em seguida as amostras foram secas
sob fluxo de nitrogênio e ressuspendidas em fase móvel (acetonitrila/acetato de
amônio 0,026 Mol.L
-1
/metanol (94:5:1% v/v/v)). Após isso as amostras foram
analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas no modo
EM/EM.
3.1.2 Equipamentos e Materiais
Os equipamentos e materiais utilizados são:
Pipetas automáticas Gilson de 1000 uL e 200 uL;
Mesa agitadora Fine PCR;
Misturador Phoenix;
Balança analítica Precisa 40SM-200A
Cromatógrafo Líquido Shimadzu;
Espectrômetro de Massas Waters Micromass/Quattro Micro™;
Programa de gerenciamento dos dados Micromass/MassLynx 4.0;
Os reagentes utilizados foram: acetona, acetonitrila, ácido clorídrico,
acetato de amônio, acetato de etila, metanol, hexano e água
ultrapurificada através do Milli-Q;
Foi utilizado plasma humano nas condições normal, lipêmico e
hemolisado, para a elaboração dos níveis da curva de calibração e
amostras de controles de qualidade.
27
3.1.3 Preparo das Soluções Utilizadas na Validação
As soluções foram preparadas e armazenadas em geladeira a 4
o
C e
substituídas de acordo com os prazos de validade pré-determinados.
Foi preparada a solução de Ivermectina na concentração de 201,6 ug/mL
diluída em acetona, a partir desta solução foi feita uma diluição na concentração de
100 g/mL. A solução de Doramectina foi feita na concentração de 203,0 ug/mL
diluída em acetona. A partir desta solução foi feita uma diluição na concentração de
100 g/mL.
3.1.4 Fase Móvel Utilizada
A solução utilizada como fase móvel foi preparada de acordo com a
necessidade e substituída diariamente. Fase móvel: acetonitrila/acetato de amônio
0,026 Mol.L
-1
/metanol (94:5:1 v/v/v).
3.1.5 Preparo dos Padrões da Curva de Calibração e das Amostras Controle de
Qualidade
Diante de uma pesquisa bibliográfica, determinou-se a concentração
plasmática máxima (Cmáx) para uma determinada dose administrada, a partir desse
ponto determinou-se as concentrações dos padrões da curva de calibração e das
amostras controles de qualidade.
A legislação vigente determina que a curva de calibração deverá conter de
seis a oito níveis de calibração fora a amostra branca (matriz biológica isenta de
padrão do fármaco e do padrão interno) e a amostra zero (matriz biológica com
adição de padrão interno), o primeiro nível é o LQ e o ultimo nível tem a
concentração de aproximadamente o dobro do Cmáx, os demais pontos são
distribuídos entre esses dois, mas estando mais próximo do Cmáx.
Os padrões da curva de calibração foram preparados adicionando-se o analito
a ser analisado ao plasma humano. As concentrações dos níveis da curva de
calibração estão apresentadas na Tabela 02.
28
Tabela 02 - Curva de Calibração para Ivermectina
Nível
Amostra
Concentração no plasma (ng/mL)
B
Branco
-
Z
Zero
-
1
Ivermectina
0,5
2
Ivermectina
1,0
3
Ivermectina
5,0
4
Ivermectina
10,0
5
Ivermectina
15,0
6
Ivermectina
25,0
7
Ivermectina
50,0
8
Ivermectina
100,0
Os controles de qualidade (CQ) têm 2 objetivos distintos: Os definidos por LQ
são utilizados para determinar o Limite de Quantificação (LQ) do método analítico.
Para sua determinação foram feitas análises da matriz biológica contendo
concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível quantificável com
precisão e exatidão aceitáveis. Os controles de qualidade baixo (CQB), controles de
qualidade médio (CQM) e os controles de qualidade alto (CQA) foram utilizados para
monitorar a precisão e exatidão do método de quantificação durante os ensaios.
O CQB é determinado como sendo três vezes a concentração do LQ, o CQA
é de 75-90% do ponto mais alto da curva e o CQM seria a média aproximada do
CQB e CQA.
Todas as amostras dos controles de qualidade foram preparadas
adicionando-se o analito a ser analisado ao plasma humano. As concentrações dos
controles de qualidade estão apresentadas na Tabela 03.
29
Tabela 03 - Controles de qualidade de Ivermectina
CQ
Analito
Concentração no plasma
(ng/mL)
LQ
Ivermectina
0,5
CQB
Ivermectina
1,5
CQM
Ivermectina
40,0
CQA
Ivermectina
80,0
Os controles de qualidade e os níveis da curva de calibração foram
devidamente fracionados em tubos ependorff e armazenados à -70
o
C.
3.1.6 Preparo da Solução de Doramectina
A escolha da concentração do padrão interno, ou seja da Doramectina, é feita
através das áreas obtidas nas análises, a área da Doramectina deverá ser
aproximadamente de duas a três vezes menor do que a área do nível mais
concentrado da curva de calibração em solução. E a partir disso determinou-se a
concentração mais adequada, que foi de 62,5 ng/mL.
3.2 METODOLOGIA ANALÍTICA
3.2.1 Condições Cromatográficas
As análises cromatográficas foram realizadas usando colunas analíticas X-
Terra RP18 (3,5 m, 50 x 4,6 mm) e X-Terra C8 (5 m, 100 x 2,1 mm), mantidas a
temperatura ambiente (~20
o
C).
O Cromatógrafo Líquido com detecção por Espectrometria de Massas no
modo EM/EM foi programado para operar com fluxo de 0,6 mL/min, volume de
injeção de 15,0 L e tempo total de corrida foi ajustado para 4,30 min.
Os tempos de retenção da Ivermectina e Doramectina são 2,45 min e 2,20
mim respectivamente.
A faixa de linearidade foi de 0,5-100 ng/mL e a matriz biológica utilizada foi
plasma humano.
30
3.2.2 Condições de Detecção no Espectrômetro de Massas no modo EM/EM
Os parâmetros do equipamento utilizados para monitorar Ivermectina e
Doramectina foram: Fonte de ionização por electrospray operando em modo positivo
(ES+) e MRM 896,90 > 329,10 e 921,30 > 353,20, respectivamente. A temperatura
da fonte foi de 100º C e dessolvatação de 450º C. O fluxo dos gases do cone e
dessolvatação foram 0 e 500 L/h, respectivamente. Os valores de voltagem do
capilar, cone e energia de colisão foram, respectivamente, 3,30 KV, 75,0 V e 55,0 eV
para Ivermectina e para Doramectina, tendo como pressão de Argônio para a
dissociação 4,5 x 10
-3
mbar.
3.2.3 Extração das Amostras
O procedimento de extração das amostras descrito a seguir foi utilizado
durante o desenvolvimento do método e sua validação. Para a extração do analito
(Ivermectina) e do padrão interno (Doramectina) das amostras biológicas, seguiu-se
os seguintes passos:
1) Em tubos eppendorff colocou-se 200 L de plasma humano, 50 L da
solução do padrão interno (Doramectina 250,0 ng/mL em fase móvel).
Agitou-se por 2 minutos em mesa agitadora;
2) Adicionou-se 50 L de ácido clorídrico 0,1 Mol/L. Agitou-se por 1 minuto
em mesa agitadora;
3) Adicionou-se 1000 µL hexano/acetato de etila (50:50 v/v). Agitou-se por 5
minutos em mesa agitadora;
4) Centrifugou-se por 5 minutos, 14000 rpm à temperatura de 4º C;
5) Transferiu-se 800 L da fase orgânica para tubos eppendorff, evaporou-se
o solvente sob fluxo de nitrogênio e ressuspendeu-se o resíduo em 200 L
de fase móvel. Agitou-se por 1 minuto em mesa agitadora. Transferiu-se
as amostras para inserts de vidro descartáveis e, em seguida, injetou-se
alíquotas de 15,0 L no sistema cromatográfico.
31
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. DESENVOLVIMENTO
4.1.1 – Análise Química
A Ivermectina é uma molécula insolúvel em água e solúvel em
hidrocarbonetos o que significa que é simples extrair esta molécula do plasma (que
é uma solução aquosa) por solventes orgânicos (por exemplo, hexano, acetato de
etila, etc.).
(28)
A Ivermectina é um macrolídeo, um grupo de moléculas orgânicas com
um anel de lactona de 16 membros aos quais se ligam dois desoxiglicois (Figura 01).
Estes grupos orgânicos têm características fracamente básicas, pois tem átomos de
oxigênio na sua composição, que possui um par de elétrons livres que podem ser
protonados, sodiados ou potassiados. Esta característica química levemente básica
leva esta molécula a ser ionizada positivamente e, portanto o teste inicial no
espectrômetro de massas foi conduzido em modo positivo de ionização. Deve-se
ressaltar que se a molécula tem grupos ácidos deve-se proceder à análise em modo
negativo.
Como ponto inicial, utilizando a característica levemente básica da
Ivermectina preparou-se soluções as quais facilitam a protonação da molécula. Os
primeiros solventes a serem testados foram metanol/água e acetonitrila/água com
um agente ionizante, que podem ser chamados de modificadores orgânicos. No
caso de ionização positiva utiliza-se ácido fórmico ou acetato de amônio. Por outro
lado se a molécula fosse básica a escolha seria hidróxido de amônio e acetato de
amônio. O acetato de amônio tem características anfóteras, pode tanto protonar
como desprotonar compostos orgânicos, dependendo das características ácido-base
do analito.
No caso de ionização positiva o mais utilizado é acido fórmico, porém em
certos casos o acetato de amônio produz uma ionização mais pronunciada em
moléculas que tem uma basicidade branda. Este caso não pode ser explicado pelo
pKa do íon amônio e do acetato de amônio, pois o pKa do íon amônio é menor que
do acido fórmico e portanto este íon amônio deve ser um agente de protonação mais
fraco do que o ácido fórmico.
(8)
Porém podemos explicar este comportamento devido
a amônia ser mais estável do que o formiato na fase gasosa.
Em compostos ácidos pode-se utilizar tanto uma base fraca como hidróxido
de amônio ou acetato de amônio. Precisa-se com estes dopantes promover a
retirada de um próton do analito. É fácil de entender que o hidróxido de amônio
32
promova a remoção do próton do analito devido o grupamento hidroxila ser muito
básico aceitando um próton. No acetato de amônio o grupo acetato tem esta função,
porém, de uma forma mais amena devido ao íon acetato ser menos básico que o íon
hidroxila.
A utilização de metanol/água ou acetonitrila/água, tem uma função muito
importante, primeiramente a utilização de água é fundamental devido à ionização ser
facilitada neste meio e o composto orgânico polar ajuda na secagem do spray,
porém a proporção utilizada é muito variável de um composto para outro,
primeiramente devemos levar em consideração a solubilidade do composto a ser
analisado. A qualidade da água também é de fundamental importância haja vista
que sais podem suprimir a ionização do composto desejado sendo usualmente
utilizada a água ultra-pura com a menor quantidade de íons possível. Outro ponto a
ser considerado é o uso de vidrarias contaminadas com detergentes, o que pode
causar supressão iônica.
(29;30)
Mesmo sabendo que as características de
solubilidade do metanol e da acetonitrila sejam muito parecidas, deve-se levar em
consideração o maior custo da acetonitrila, porém maior pureza, sendo que
geralmente obtém-se a melhor ionização tanto em modo positivo como negativo.
4.1.2 – Espectro no Modo EM e Ionização
A obtenção dos espectros é conduzida em condições iniciais padrão para
modo EM de analisadores e fonte (ESI-: resolução do primeiro quadrupolo 12 V;
energia de saída do íon do primeiro quadrupolo 1 V ; entrada no quadrupolo de
colisão 50 V, energia de colisão 1V, saída do quadrupolo de colisão 50 V; resolução
do terceiro quadrupolo 12 V; saída do terceiro quadrupolo 3 V; detector multiplicador
de elétrons 950 V; ESI+: resolução do primeiro quadrupolo 15 V; energia de saída do
íon do primeiro quadrupolo 1 V ; entrada no quadrupolo de colisão 50 V, energia de
colisão 1 V, saída do quadrupolo de colisão 50 V; resolução do terceiro quadrupolo
15 V; saída do terceiro quadrupolo 3 V; detector multiplicador de elétrons 950 V),
devemos nesta etapa escolher a faixa de massas a ser analisada, esta faixa deve
compreender a massa molecular dos compostos de interesse.
Depois de carregadas as condições iniciais de modo EM pelo software, liga-
se a bomba de infusão (geralmente entre 10 µL/min a 50 µL/min). Foram testadas
várias soluções de Ivermectina: a) metanol/água com 0,1% de ácido fórmico;
metanol/água com 10mM de acetato de amônio; acetonitrila/água com 0,1 % de
33
ácido fórmico; e por ultimo acetonitrila/água com 10mM de acetato de amônio. Estes
testes foram feitos por infusão direta no espectrômetro de massas no modo EM
positivo e negativo de ionização. A Figura 14 abaixo mostra dois espectros de
massas da Ivermectina obtidos no modo positivo (a) e negativo (b). A melhor
composição para obter espectros mais intensos da Ivermectina foi em modo positivo
com acetonitrila/água com 10 mM de acetato de amônio.
(a)
(b)
Figura 14 - Espectro de massas da Ivermectina, no modo positivo (a) e no modo negativo (b).
Na Figura 14 acima, podemos verificar que a ionização ocorre tanto em modo
negativo como positivo, porém o espectro em modo positivo é bem mais intenso
para o íon de interesse de m/z 897,que é o íon sodiado (MNa
+
). A molécula da
Ivermectina tem características levemente básicas (vários oxigênios com pares de
elétrons livres), e levemente ácidas (carbono alfa lactônico levemente ácido),
portanto pode ser ionizada tanto em modo positivo como negativo. Uma
característica muito interessante observada na Figura 14 é a alta formação de aduto
de sódio, o que propiciou uma alta ionização da Ivermectina. Podemos verificar
também na Figura 14 a ausência da Ivermectina protonada, mostrando o quanto
maior é a afinidade da molécula por sódio em detrimento da molécula protonada.
Quando comparamos o modo positivo e negativo podemos perceber
intensidades muito maiores no modo positivo do que no modo negativo. Geralmente
o modo de ionização negativo é menos sensível e para uma molécula que se
apresenta anfótera e com alta afinidade por sódio o resultado em modo positivo foi
m/z
800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950
%
0
100
MS-IVERMECTINAAPCI+ 1 (0.053) Scan AP+
7.97e6
897
821
817
837
822
894
838
892
870
866
882
885
898
913
899
901
910
914
919
926 942
m/z
800 805 810 815 820 825 830 835 840 845 850 855 860 865 870 875 880 885 890 895 900
%
0
100
MS-IVERMECTINA 23 (0.425) Cm (21:34) Scan ES-
1.64e6
873
872
837
837
822
805
802
809
810
815
819
824
832
828
855
838 854
846
845
847
856
858
864
868
871
874
874
876
885
880
881
888
895
895
898
900
34
muito mais favorável, observe na Figura 14(a) temos uma intensidade de sinal de
7,97x10
6
para o MNa
+
e na Figura 14(b) temos a intensidade para [M-H]
-
de 1,64x10
-
6
, portanto escolheu-se o modo positivo de ionização.
Depois de verificado o melhor solvente foram otimizadas as voltagens da
fonte que inclui capilar, cone, extrator, lente rf, temperatura do bloco e de gás de
dessolvatação, bem como de fluxo de gás de cone e dessolvatação. A otimização
destes parâmetros foi feita de forma on-line pela infusão da solução 1ug/mL de
Ivermectina previamente preparada. Esta primeira otimização de parâmetros da
fonte (sintonia do espectrômetro de massas) é chamada de otimização grosseira,
pois não se leva em consideração os parâmetros do sistema de CLAE como fluxo e
volume de injeção. A Figura 15 mostra uma captura de imagem da tela do software
indicando as condições padrão dos analisadores para obtenção de espectros de
massas de estágio simples em modo positivo e negativo.
a) ESI- b) ESI+
Figura 15 – Ilustração dos parâmetros otimizados, (a) ESI- e (b) ESI+.
Cada parâmetro deve ser variado individualmente para valores maiores e
menores visando o aumento de corrente iônica para a espécie em questão e a
estabilidade da intensidade do íon, é importante que o valor do fluxo da infusão
propicie um spray contínuo. Esta primeira otimização por infusão tem um fluxo muito
menor quando comparado com o fluxo provindo do cromatógrafo líquido, entre 100 a
600 µL/min, portanto todos os parâmetros de fonte devem ser novamente otimizados
após o acoplamento.
35
A obtenção do espectro de massas de estágio simples é muito importante
devido à confirmação se o padrão esta com o fármaco intacto (não houve
degradação) e não ocorreu erro na preparação da solução. Eventualmente existem
alguns problemas que envolvem contra-íons, devido a estes eventualmente
suprimirem a ionização o que deve ser considerado nesta etapa. O fármaco
molecular responde em certos casos diferentemente do fármaco no estado de sal
(p.ex. oxalato, cloridrato etc).
4.1.3 – Espectro no Modo EM/EM
Após a obtenção do espectro de EM, foram feitos ajustes nos analisadores de
massas para obtenção dos espectros de EM/EM, onde selecionou-se a massa do
íon precursor no primeiro quadrupolo, abriu-se o gás de colisão (argônio) para que
ocorresse a fragmentação no segundo quadrupolo e varredura no terceiro
quadrupolo. As condições de fonte foram as mesmas para EM/EM, porém nos
analisadores modificou-se a voltagem de entrada na cela de colisão para -1, a
energia de colisão para um valor maior que 0V e energia de saída do quadrupolo de
colisão para 1 (o gás de colisão foi aberto com uma pressão inicial na cela de 3x10
-3
Torr), essas condições aumentam a intensidade dos sinais no espectro de EM/EM.
Desta forma a voltagem de colisão e a pressão na cela de colisão foram
otimizadas (energia de colisão aumentada e pressão do gás argônio aumentada e
diminuída) de forma on-line, observando-se a elevação na intensidade dos
fragmentos e a diminuição em intensidade do íon precursor, a Figura 16 mostra o
espectro de massas de duplo estágio, com a seleção do íon precursor, colisão do
mesmo com gás argônio e varredura dos íons no terceiro quadrupolo juntamente
com a fragmentação proposta.
36
Figura 16 - Espectro de EM/EM da dissociação da Ivermectina no modo positivo a 55V e a
fragmentação proposta formando o íon de m/z 329.
4.1.4 – Acoplamento do Sistema de CLAE e EM
Acoplou-se o sistema de CLAE ao espectrômetro de massas, utilizando a
coluna C18 de menor dimensão disponível (Polaris 3 C18 50 x 2,0 mm). A primeira
fase-móvel utilizada foi igual à composição do solvente de melhor ionização
verificado na obtenção do espectro de EM.
A função do espectrômetro de massas utilizado para monitorar os compostos
iônicos que emergem da coluna cromatográfica é chamado de MRM (monitoramento
de reação múltipla), constituído dos íons observados e suas respectivas energias de
m/z
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950
%
0
100
MSMS-IVERMECTINAAPCI+ 3 (0.160) Sm (Mn, 2x0.75); Cm (1:14) Daughters of 898AP+
8.43e5
329
183
153
139
109
95
80
69
135
167
240
193
224
211
311
305
303
281
251
257
285
897
753
457
449
353
334
377
358
385
431
609
497
478
547
521
503
591
575
691
642
625
665
735
835
769
816 879
37
colisão), esta função vem dos dados gerados pelo espectro de EM/EM para
Ivermectina, utilizou-se o canal de fragmentação 896,90 > 329,10. (energia do cone
75 V e colisão 55 V)
A função MRM é a que se utiliza para as análises por injeção através do
sistema de CLAE-EM/EM, fornecendo o máximo de seletividade e sensibilidade.
Esta função MRM significa que se selecionou o íon de interesse no primeiro
quadrupolo, promoveu-se uma reação química de fragmentação no segundo
quadrupolo e selecionou-se o fragmento específico no último quadrupolo, íons estes
que são detectados no multiplicador de elétrons.
Depois de montada a função MRM otimizou-se as voltagem de cone e de
colisão visando uma maior intensidade do sinal.
Depois de montar estas funções, foi feita novamente a otimização de todos
os parâmetros do espectrômetro de massas (fonte e analisadores) para se obter
maior sensibilidade, o que chamamos de sintonia fina. Depois disso foram feitos
ajustes do sistema de CLAE, como lavagem do sistema de injeção e ajuste de
volume de injeção para reduzir ao máximo o efeito de carry-over. Estes ajustes
foram feitos utilizando solução que foi utilizada para infusão (1ug/mL) e solvente
puro.
4.1.5 – Escolha do Padrão-Interno
A escolha do padrão interno segue a linha de raciocínio onde o ideal é uma
molécula muito parecida com o analito, porém com massa molecular diferente. A
molécula ideal seria o próprio analito deuterado, porém o mesmo tem um valor
elevado, então lançou-se mão de um composto com estrutura similar. Este
composto deve ter diversas características compatíveis para análise, inicialmente a
solubilidade do padrão interno deve ser muito parecida com a do fármaco, bem
como suas funções orgânicas.O padrão interno escolhido foi a Doramectina
mostrada na Figura 17.
38
Figura 17 – Fórmula estrutural da Doramectina.
Podemos perceber na fórmula estrutural que a Doramectina é similar a da
Ivermectina e suas funções orgânicas são as mesmas também. O padrão interno é
utilizado para corrigir ou constatar algum possível problema no seu método de
extração, visto que ele tem concentração fixa e está em um canal diferente do
analito. Como nosso método de quantificação é feito através da razão entre a área
do nosso analito e do seu padrão interno, através do desvio padrão conseguimos
verificar se ocorreu algum erro e se este foi corrigido pelo padrão interno.
Após a escolha do padrão interno, procedeu-se as mesmas etapas de EM,
EM/EM e MRM exceto a otimização, devido o padrão interno ter que seguir o mesmo
comportamento do fármaco otimizado previamente. Depois de montar as funções
MRM com o canal do fármaco e do padrão interno injetou-se os dois fármacos puros
para observar se não há contaminação de um fármaco com o outro (contaminação
cruzada).
4.1.6 – Preparo da Amostra
Os testes de extração foram realizados com amostras de plasma branco,
plasma branco com padrão interno, plasma com Ivermectina nas concentrações de
LQ, CQB, CQM e CQA. Nestes testes considerou-se possíveis contaminações dos
solventes, aparatos de extração, interferentes endógenos e recuperação do fármaco.
39
Os solventes avaliados foram o éter dietílico, terc-metil-butil éter, hexano e acetato
de etila
4.1.6.1 – Volume da Amostra
Inicialmente determinou-se um volume inicial da amostra de 200 µL, devido
este ser geralmente o melhor volume para obter-se uma ótima agitação em tubos
ependorffs de 2 mL. Este volume foi otimizado e verificou-se que 200 µL foi o melhor
volume encontrado.
4.1.6.2 – Adição de padrão-interno
Depois de separado o volume de 200 µL adicionou-se o padrão interno que
tem finalidade de corrigir erros da extração como perdas de volumes durante o
processo, um volume adequado de padrão interno é tal que não ocorra precipitação
de proteínas muito pronunciada dificultando na homogeneização das amostras. O
volume de PI adicionado foi de 50 µL da solução de Doramectina 250,0 ng/mL.
4.1.6.3 – Ajuste de pH
As moléculas orgânicas têm solubilidade em solventes orgânicos quando
estão em sua forma molecular (neutra), portanto adicionou-se 50 L de ácido
clorídrico 0,1 mol/L para fazer com que a Ivermectina ficasse na forma neutra.
4.1.6.4 – Extração Líquido-Líquido
O líquido extrator é utilizado para retirar os compostos de interesse da
matriz aquosa para a fase orgânica. O volume de líquido extrator utilizado
inicialmente foi de 1000 µL, ou seja, um volume de cinco vezes o de plasma, para
favorecer a extração. Um volume menor é indesejado já que pode ser saturado de
Ivermectina mais facilmente e um volume maior pode provocar uma
homogeneização menos eficiente. A mistura dos solventes hexano e acetato de etila
(50:50 v/v) apresentou os melhores resultados de reprodutibilidade e recuperação.
4.1.6.5 – Separação de fases e reconstituição da amostra
Estes sistemas de duas fases foram agitados e depois centrifugados para
separar as fases: orgânica e aquosa. Depois de separadas as fases transferiu-se a
fase orgânica para outro ependorff, o qual foi levado a um secador de amostras (dry-
40
block) e depois de seco sob fluxo de nitrogênio, reconstitui-se o extrato em fase
móvel, que foi mais adequada devido melhor solubilidade. Em outros casos pode-se
testar outros solventes como: acetonitrila, metanol e água, tanto quanto a mistura
deles.
4.1.7 – Ajustes Finais do Método Bioanalítico
4.1.7.1 – Ajustes no preparo de amostra
Depois do teste de extração é possível fazer alguns ajustes em cada uma das
etapas da extração, entre eles, o volume das alíquotas da amostra, os tempos de
agitação, a concentração dos modificadores de reações, volume do liquido extrator,
temperatura da centrífuga para obtenção de melhor separação das fases,
recuperação, reprodutibilidade e velocidade do preparo da amostra. No caso da
Ivermectina não foi necessário ajustes destes parâmetros.
4.1.7.2 – Ajustes da cromatografia líquida
Foi realizada nesta etapa ajustes do sistema de HPLC visando melhor
separação de contaminantes (interferentes endógenos ou dos solventes de
extração), maior velocidade de analise e menor efeito de carry-over. No
cromatograma da corrida analítica para analise da Ivermectina, Na Figura 18,
podemos visualizar dois compostos endógenos em tempos de retenção próximos ao
da Ivermectina. Estes compostos endógenos foram separados da Ivermectina com o
emprego de duas colunas, uma de C8 e outra de C18 em linha o que se chama de
HPLC bidimensional. Interessantemente os compostos endógenos além de ter
mesmo íon precursor e fragmento, apresentavam características químicas parecidas
já que foram extraídos do plasma pelo mesmo solvente orgânico. Analisando o
cromatograma abaixo (Figura 18) temos além da Ivermectina no tempo de retenção
2,38, dois endógenos em 0,96 e 3,21. O endógeno com tempo de retenção em 0,96
é o que tem menor afinidade pelas colunas de C18 e C8, o endógeno de tempo de
retenção de 3,21 é o que apresenta maior afinidade com as colunas, se fosse
utilizada somente a coluna C18 não seria separado a Ivermectina do endógeno 3,21.
41
Figura 18 – Cromatograma que demonstra os componentes endógenos do extrato da Ivermectina em
plasma.
Por fim este método foi testado através da análise de uma exatidão e então
submetido a validação analítica conforme RE 899 da ANVISA.
4.2 VALIDAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO.
A partir do desenvolvimento do método procedeu-se a validação experimental
para verificação de parâmetros os quais permitiram a determinação de Ivermectina
em plasma humano utilizando Doramectina como Padrão Interno. Estes
procedimentos e resultados serão apresentados em seguida para demonstrar que o
método analítico descrito é adequado e confiável para as análises propostas.
Usualmente em análises de fármacos em plasma humano, é necessário que o
método bioanalítico seja muito confiável, pois os resultados dessas análises inferem
em limiares de toxicidade. Para que se tenha certeza de que este método tenha
confiabilidade deve-se testar parâmetros em duas etapas, a validação e a verificação
de estabilidade.
A validação inclui os testes de seletividade, linearidade, precisão e exatidão,
assim como a determinação do limite de quantificação, concentrações dos padrões
de calibração e das amostras de controle de qualidade. A verificação das
estabilidades inclui os testes de toda e qualquer alteração de temperaturas e
matrizes durante o preparo e injeção da amostra, garantindo que estas alterações
não vão provocar degradação das mesmas durante o processo de coleta e análise
do plasma.
Ivermectina 1.0 ng/mL
Time
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25
%
0
100
Exatidao-LQ-Diluicao-01_curva_06 1: MRM of 1 Channel ES+
TIC
5.33e4
2.38
0.96
0.05
0.71
0.36
0.47
0.74
2.02
1.49
1.38
1.21
1.85
1.52
2.11
2.41
3.21
3.11
2.87
2.57
3.26
3.47
3.51
3.69
3.80
3.94
4.19
42
4.2.1 Padrões
Para a realização destes testes foram utilizados padrões de referência com
procedência identificável para o preparo das soluções. A Ivermectina, é um padrão
de referência USP com certificado de análise e a Doramectina, padrão de referência
Sigma-Aldrich também com certificado de análise.
4.2.2 Seletividade
Para confirmar a seletividade do método, foram analisadas amostras de plasma
humano isenta de Ivermectina e Doramectina obtidas de seis indivíduos nas
seguintes condições, quatro plasmas humanos normais, um plasma humano
lipêmico e um plasma humano hemolisado, com os seguintes lotes respectivamente:
16492/7, 52169/4, 21414/3, 56966/1, 56977/1 e 56956/1. Todos esses plasmas
foram obtidos no Hospital Universitário São Francisco (HUSF)
Na Figura 19 estão apresentados os cromatogramas das amostras de plasma
branco testadas utilizando-se os procedimentos de extração e as condições
cromatográficas propostas. Para avaliar interferências no tempo de retenção do
fármaco e do padrão interno, os resultados foram comparados com aqueles obtidos
com uma solução do analito em concentração próxima ao LQ (Figura 20).
43
Figura 19 - Plasma branco normal lote 16492/7 a) Cromatograma referente ao branco do analito. b)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco normal lote 52169/4 c)
Cromatograma referente ao branco do analito. d) Cromatograma referente ao branco do padrão
interno. Plasma branco Lipêmico lote 56977/1. e) Cromatograma referente ao branco do analito. f)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco Hemolisado lote 56956/1. g)
Cromatograma referente ao branco do analito. h) Cromatograma referente ao branco do padrão
interno.
Figura 20 – a) Cromatograma referente a Solução de Ivermectina 0,5 ng/mL (LQ). b) Cromatograma
referente a solução de Doramectina 62,5 ng/mL.
43
Figura 19 - Plasma branco normal lote 16492/7 a) Cromatograma referente ao branco do analito. b)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco normal lote 52169/4 c)
Cromatograma referente ao branco do analito. d) Cromatograma referente ao branco do padrão
interno. Plasma branco Lipêmico lote 56977/1. e) Cromatograma referente ao branco do analito. f)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco Hemolisado lote 56956/1. g)
Cromatograma referente ao branco do analito. h) Cromatograma referente ao branco do padrão
interno.
Figura 20 – a) Cromatograma referente a Solução de Ivermectina 0,5 ng/mL (LQ). b) Cromatograma
referente a solução de Doramectina 62,5 ng/mL.
43
Figura 19 - Plasma branco normal lote 16492/7 a) Cromatograma referente ao branco do analito. b)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco normal lote 52169/4 c)
Cromatograma referente ao branco do analito. d) Cromatograma referente ao branco do padrão
interno. Plasma branco Lipêmico lote 56977/1. e) Cromatograma referente ao branco do analito. f)
Cromatograma referente ao branco do padrão interno. Plasma branco Hemolisado lote 56956/1. g)
Cromatograma referente ao branco do analito. h) Cromatograma referente ao branco do padrão
interno.
Figura 20 – a) Cromatograma referente a Solução de Ivermectina 0,5 ng/mL (LQ). b) Cromatograma
referente a solução de Doramectina 62,5 ng/mL.
44
Diante da análise dos cromatogramas obtidos durante o teste de especificidade,
não foi encontrado nenhum interferente no tempo de retenção da Ivermectina e da
Doramectina.
4.2.3 Determinação do Limite de Quantificação
O limite de quantificação foi definido levando-se em consideração a
sensibilidade, precisão e exatidão do método analítico. Para a determinação do LQ,
foram feitas análises da matriz biológica contendo concentrações decrescentes do
fármaco até o menor nível quantificável com precisão e exatidão aceitáveis. Com
isso, tentou-se assegurar que os menores valores possíveis fossem analisados, por
meio de repetições de análises, com valores sucessivamente menores, quando os
inicialmente escolhidos fossem quantificados com precisão e exatidão aceitáveis.
Para avaliar a sensibilidade, precisão e exatidão do método, amostras de controle de
qualidade LQ também foram incluídas no procedimento de validação.
Alguns critérios foram seguidos para a definição do LQ.
O primeiro seria que o pico para o LQ fosse, no mínimo, 5 vezes maior que
qualquer interferência na amostra branco no tempo de retenção da Ivermectina.
O outro seria que o pico de resposta da Ivermectina no LQ deve ser identificável
e reprodutível com desvio de no máximo 20% e exatidão entre 80-120% em relação
à concentração nominal do padrão, através da análise de, no mínimo, cinco
amostras de padrões. Respeitando esses critérios, foi encontrado um valor de 0,5
ng/mL para o LQ.
4.2.4 Linearidade
A linearidade da curva de calibração foi avaliada dentro dos alguns critérios.
Primeiro, o desvio deve ser menor ou igual a 20% em relação a concentração
nominal para o LQ. E também deve ser menor ou igual a 15% em relação à
concentração nominal para as outras concentrações da curva de calibração.
Outro critério seria que no máximo 33% das amostras podem variar acima dos
parâmetros permitidos, exceto LQ e o ponto mais alto da curva de calibração. E por
último, o coeficiente de correlação será aceito se for igual ou maior do que 0,98.
A média dos valores das linearidades estão representados no Figura 21 e as
curvas de calibração na Tabela 04.
45
Figura 21 – Resultados da média das linearidades.
Tabela 04 – Equações da curva de calibração das três linearidades:
Equação da Curva de Calibração
Equação da curva de calibração 1: y = 0,0299226x + 0,000871695 r = 0,999475
Equação da curva de calibração 2: y = 0,0292867x + 0,00424236 r = 0,994047
Equação da curva de calibração 3: y = 0,0279417x + 0,00254956 r = 0,999023
Coeficiente de Variação do a (%) = 3,48
4.2.5 Precisão e Exatidão
Para avaliar a precisão e exatidão do método, quatro concentrações distintas, na
faixa esperada de concentrações foram analisadas, utilizando-se determinações por
concentração. A precisão e exatidão foram determinadas em um mesmo lote
(precisão e exatidão intra-lote) e em lotes diferentes (precisão e exatidão inter-lotes).
A seguir os procedimentos realizados para a determinação dos parâmetros
envolvidos, bem como critérios de validação e respectivos resultados estão
apresentados.
*A Exatidão é calculada através da seguinte fórmula: Média X100/Valor Nominal.
*A Precisão é calculada através da seguinte fórmula: Desvio PadrãoX100/Média.
y = 1,005x - 0,146
R² = 0,999
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 20 40 60 80 100
Concentração Encontrada (ng/mL)
Concentração Nominal (ng/mL)
Linearidade
Média das Linearidades
Linear (Média das
Linearidades)
46
4.2.5.1 Validação intra-lote
A precisão e exatidão intra-lote foram determinadas utilizando-se um lote
contendo uma curva de calibração contendo os padrões definidos anteriormente e
cinco amostras de cada controle de qualidade definido acima.
Os seguintes critérios abaixo foram seguidos, para que a precisão e exatidão
intra-lote fosse considerada aprovada.
Ter uma precisão para os controles CQB, CQM e CQA, o coeficiente de variação
(CV) não deveria exceder 15% e para o LQ, admitiu-se valores menores ou iguais a
20%.
No caso da exatidão, apresentar um valor para as amostras CQB, CQM e CQA
dentro do desvio de 15% do valor nominal e para o LQ, admitiu-se desvios
menores ou iguais a 20%.
Os resultados das análises intra-lote estão apresentados nas Figuras 22, 23 e
24.
Figura 22– Resultados das análises intra-lote plasma normal.
47
Figura 23 – Resultados das análises intra-lote plasma lipêmico.
Figura 24 – Resultados das análises intra-lote plasma hemolisado.
48
4.2.5.2 Validação inter-lotes
Os critérios seguidos para considerar a precisão e exatidão inter-lotes aprovadas
foram os mesmos da validação intra-lotes.
Os dados das análises inter-lotes estão apresentados no Figura 25.
Figura 25 – Resultados das análises inter-lotes.
4.2.6 Validação da Diluição
A validação da diluição foi feita com o objetivo de garantir que possíveis
diluições de pontos que tenham uma concentração acima do limite superior da curva
de calibração apresentem resultados precisos e exatos.
Para avaliação da exatidão e precisão foi estabelecido controles de qualidade
de diluição (CQD) com valor nominal de 170 ng/mL, equivalente ao último ponto da
curva acrescido de 70%, diluídos com plasma branco na proporção de 1:3(F
d
=4).
Os dados das análises inter-lotes que foram realizadas com três lotes diferentes
estão apresentados no Figura 26.
49
Figura 26 – Resultados das análises dos controles de qualidade de diluição.
4.2.7 Recuperação
O cálculo da recuperação é feito através da comparação das áreas dos picos de
Ivermectina (CQB; CQM e CQA) das amostras extraídas em plasma com as áreas
dos picos de Ivermectina preparadas em solução. O mesmo é feito para a
Doramectina utilizando uma solução na concentração de 62,5 ng/mL. Os resultados
estão demonstrados na Figura 27.
Figura 27 – Resultados das recuperações dos controles de qualidade (CQB, CQM e CQB) e do
padrão interno.
4,701
-15
-10
-5
0
5
10
15
CQD1
Coeficiente de Variação (CV) %
Controles de Qualidade Diluídos
Série3
90,722
Exatidão (%)
49
Figura 26 – Resultados das análises dos controles de qualidade de diluição.
4.2.7 Recuperação
O cálculo da recuperação é feito através da comparação das áreas dos picos de
Ivermectina (CQB; CQM e CQA) das amostras extraídas em plasma com as áreas
dos picos de Ivermectina preparadas em solução. O mesmo é feito para a
Doramectina utilizando uma solução na concentração de 62,5 ng/mL. Os resultados
estão demonstrados na Figura 27.
Figura 27 – Resultados das recuperações dos controles de qualidade (CQB, CQM e CQB) e do
padrão interno.
4,701
4,392
2,610
CQD1
CQD2
CQD3
Controles de Qualidade Diluídos
Série3
Limites de Coeficiente de Variação
94,002
97,353
90,722
49
Figura 26 – Resultados das análises dos controles de qualidade de diluição.
4.2.7 Recuperação
O cálculo da recuperação é feito através da comparação das áreas dos picos de
Ivermectina (CQB; CQM e CQA) das amostras extraídas em plasma com as áreas
dos picos de Ivermectina preparadas em solução. O mesmo é feito para a
Doramectina utilizando uma solução na concentração de 62,5 ng/mL. Os resultados
estão demonstrados na Figura 27.
Figura 27 – Resultados das recuperações dos controles de qualidade (CQB, CQM e CQB) e do
padrão interno.
50
4.2.8 Estudo de Estabilidade do Fármaco no Fluido Biológico
4.2.8.1. Estabilidade de curta duração
4.2.8.1.1. Estabilidade no tempo e condições de análise
Na avaliação da estabilidade da Ivermectina no tempo e condições de análises,
as amostras processadas foram mantidas dentro do auto-injetor em temperatura
ambiente, e os controles de qualidade foram analisados em triplicada nos tempos de
0, 2, 4, 6, 8, 10, e 12 horas.
Os resultados estão demonstrados na Figura 28.
Figura 28 – Resultados da estabilidade em tempo e condições de análise entre o tempo 0 h e 12 h.
A Figura 28 apresenta as variações obtidas quando são comparados os valores
médios de CQB, CQM e CQA obtidos no tempo 0 h com os valores médios de CQB,
CQM e CQA obtidos no tempo 12 h. Os resultados obtidos estão abaixo do desvio
permitido de 15% para os três controles analisados e, portanto, pode-se concluir que
as amostras permaneceram estáveis dentro do auto-injetor durante o período de 12
horas.
51
4.2.8.1.2. Estabilidade do fármaco em ciclos de congelamento e degelo
A avaliação da Ivermectina durante três ciclos de degelo foi feita através da
análise de cinco amostras de cada controle de qualidade conforme descrito abaixo,
comparadas com valores obtidos de amostras recém preparadas às quais
apresentaram valores de precisão menores 6,88% e de exatidão em torno de 100%
(CQB 99,16%, CQM 101,60% e CQA 102,22%).
Primeiro as amostras (CQB, CQM e CQA) (degelo 01) foram congeladas a -70
o
C e mantidas por 24 horas, após isso foram submetidas ao degelo natural à
temperatura ambiente, em seguida extraídas e analisadas. Posteriormente
congeladas novamente a
-70
o
C e mantidas nesta temperatura por 12 a 24 horas e depois submetidas
novamente ao degelo natural a temperatura ambiente (degelo 02) e analisadas. As
amostras foram congeladas outra vez e após esse degelo foram extraídas e
analisadas (degelo 3), completando o ciclo de degelos.
Na Figura 29 estão apresentadas as variações das médias para cada controle
de qualidade (CQB, CQM e CQA) em cada ciclo de congelamento e degelo em
relação às médias obtidas para as amostras recém-preparadas.
Figura 29 – Resultados da estabilidade entre os ciclos de degelo.
52
Comparando-se as variações entre as médias dos CQB, CQM e CQA para
amostras recém-preparadas e as médias dos CQB, CQM e CQA em cada ciclo de
congelamento e degelo pode-se concluir que a Ivermectina analisada no plasma
humano é estável nos três ciclos de congelamento e degelo quando armazenadas a
-70C.
4.2.8.2. Estabilidade das amostras de plasma não processadas
Diante do tempo em que as amostras do estudo foram mantidas à temperatura
ambiente, foram analisados cinco de cada controles de qualidade (CQB, CQM e
CQA). Estas foram analisadas após seis horas a temperatura ambiente juntamente
com amostras recém preparadas.
Na Figura 30 estão apresentados os resultados das análises realizadas
com amostras após serem mantidas por 6 horas a temperatura ambiente, sendo
comparadas com amostras recém preparadas.
Figura 30 – Resultados da estabilidade das amostras não processadas.
Comparando-se os valores médios obtidos para os controles de qualidade CQB,
CQM e CQA das amostras recém preparadas, com os resultados obtidos dos
controles de qualidade CQB, CQM e CQA mantidos durante seis horas à
temperatura ambiente, conforme demonstrado na Figura 30, pode-se concluir que os
mesmos foram estáveis, uma vez que os desvios encontrados foram inferiores a
15%.
53
4.2.8.3 Estabilidade de soluções padrão
Foram analisadas soluções de Ivermectina 100 ng/mL e Doramectina 250 ng/mL
no tempo 0 horas, após 6 horas de preparo mantida a temperatura ambiente e após
15 dias de armazenamento a 4
o
C.
Na Figura 31 estão apresentados os resultados das áreas do analito e do padrão
interno para as soluções analisadas após 6 horas de preparo mantidas à
temperatura ambiente e amostras analisadas após de 15 dias mantidas sob
refrigeração, em relação às médias obtidas para as soluções recém preparadas.
Figura 31 – Resultados da estabilidade das soluções padrão para Ivermectina eDoramectina.
54
5. CONCLUSÃO
O método desenvolvido se mostrou adequado para análise de Ivermectina em
plasma humano. A extração da Ivermectina do plasma humano se mostrou eficaz
como pode ser verificado durante os testes realizados para a validação. O limite de
quantificação foi adequado e obtive-se uma corrida cromatográfica curta, assim ele
se mostrou adequado para estudos de farmacocinética e bioequivalência
farmacêutica, visto que nestes são analisados uma grande quantidade de amostras.
A validação deste método foi feita com sucesso, uma vez que cumpriu os
critérios estabelecidos pela RE nº 899, de 29 de maio de 2003.
Na seletividade não ocorreram interferências nos tempos de retenção do
fármaco ou estas foram menores que 20% da resposta do padrão LQ. Não houve
interferência no tempo de retenção do padrão interno ou esta foi menor que 5% da
resposta na concentração utilizada nos testes. Quanto a sensibilidade, a menor
concentração da curva de calibração foi aceito com um CV < 20%. Já na precisão, o
coeficiente de variação (CV) calculado para os controles de qualidade CQB, CQM e
CQA foram menores ou iguais a 15% e menores ou iguais a 20% para o controle de
qualidade LQ. A exatidão foi calculada para o controle de qualidade LQ e para os
controles de qualidade CQB, CQM e CQA apresentaram valores compreendidos
dentro do desvio de + 20% e + 15%, respectivamente, em relação ao valor nominal.
As estabilidades no tempo e condições de análise, os resultados obtidos
estão abaixo do desvio permitido de 15% para os três controles analisados e,
portanto, as amostras permaneceram estáveis dentro do auto-injetor durante o
período de 12 horas. Com estabilidade do fármaco em ciclos de congelamento e
degelo, foi analisado os controles e diante disso a Ivermectina analisada no plasma
humano é estável nos três ciclos de congelamento e degelo quando armazenadas a
-70 C. A estabilidade das amostras de plasma não processadas, após 6 horas a
temperatura ambiente foi verificado que sua variação não excedeu 15%, sendo
assim, as amostras permaneceram estáveis.
Diante da metodologia cumprir todos os parâmetros avaliados estabelecidos
pela legislação, podemos concluir que o mesmo é adequado para análise de
Ivermectina em plasma humano.
55
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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“Regulamento Técnico para Medicamentos Genéricos”. Diário Oficial da União, Poder
Executivo, Brasília, 02 jan. 2001.
4. BRASIL. Resolução RDC n
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133. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária aprova
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Executivo, Brasília, 16 abr. 1999.
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