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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Odontologia
Jonas Capelli Júnior
Alteração nos níveis de metaloproteinases da matriz e quimiocinas
no fluido gengival durante o movimento dentário ortodôntico
Rio de Janeiro
2007
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Jonas Capelli Júnior
Alteração nos níveis de metaloproteinases da matriz e quimiocinas
no fluido gengival durante o movimento dentário ortodôntico
Tese apresentada, como requisito
parcial para obtenção do título de
Doutor, ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia, da
Universidade do Estado do Rio de
Janeiro. Área de concentração:
Ortodontia.
Orientadores: Prof. Dr. Carlos Marcelo da Silva Figueredo
Prof. Dr. Ricardo Palmier Teles
Rio de Janeiro
2007
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CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/CBB
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta
tese.
_______________________________________ _________________________
Assinatura Data
C171 Capelli Júnior, Jonas.
Alteração nos níveis de metaloproteinases da matriz e quimiocinas no
fluido gengival durante o movimento dentário ortodôntico / Jonas Capelli
Júnior. – 2007.
66 f.
Orientadores: Carlos Marcelo da Silva Figueredo, Ricardo Palmier
Teles.
Tese (doutorado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
Faculdade de Odontologia.
1. Ortodontia. 2. Citocinas. 3. Metaloproteinases. I. Figueredo, Carlos
Marcelo da Silva. II. Teles, Ricardo Palmier. III. Universidade do Estado
do Rio de Janeiro. Faculdade de Odontologia. IV. Título.
CDU
616.314
_
Jonas Capelli Júnior
Alteração nos níveis de metaloproteinases da matriz e quimiocinas
no fluido gengival durante o movimento dentário ortodôntico
Tese apresentada, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor, ao Programa de
Pós-Graduação em Odontologia, da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Área de concentração: Ortodontia.
Aprovada em 29 de junho de 2007.
Orientadores:
______________________________________________
Prof. Dr. Carlos Marcelo da Silva Figueredo
Faculdade de Odontologia da UERJ
______________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Palmier Teles
Department of Periodontology, The Forsyth Institute
Banca examinadora:
______________________________________________
Profª. Drª. Flavia Raposo Gebara Artese
Faculdade de Odontologia da UERJ
______________________________________________
Prof. Dr. Marco Antonio de Oliveira Almeida
Faculdade de Odontologia da UERJ
______________________________________________
Prof. Dr. Orlando Motohiro Tanaka
Faculdade de Odontologia da PUC-PR
______________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Guimarães Fischer
Faculdade de Odontologia da UERJ
______________________________________________
Prof. Dr. Robert Willer Farinazzo Vitral
Faculdade de Odontologia da UFJF
Rio de Janeiro
2007
DEDICATÓRIA
À Carolina, Rafaela e Katia,
amores da minha vida.
AGRADECIMENTOS
A confecção de um trabalho como este é tarefa complexa. Pela exigência que a ciência
nos impõe, pelo destino ao qual ele se propõe e pelas nossas limitações inerentes. Tamanha
dificuldade só é possível de ser transposta com ajuda e por isso estas palavras de gratidão.
Ao professor Ricardo Teles que tornou possível a realização deste estudo ao nos
acolher no Forsyth Institute. Com grande competência, muita sabedoria e a valiosa amizade
fez da orientação deste trabalho uma atividade prazerosa. E claro, à Dra. Flavia Teles que
compartilhou e nos ajudou em cada momento da execução do experimento.
Ao professor Carlos Marcelo Figueredo pela sugestão do tema, acompanhamento da
pesquisa, orientação na elaboração do texto. Enfim, por toda ajuda.
Ao professor Ricardo Fischer, amigo de longos anos, co-responsável pelo meu
ingresso no curso de Doutorado, pelo total suporte da Pós-Graduação da FO-UERJ.
Ao professor Alp Kantarci pelo apoio do Departamento de Periodontia e Biologia Oral
da Boston University nos primeiros passos com o Luminex.
A Dra. Vera Lucia Cosendey, amiga de fé e irmã camarada que esteve sempre
disponível para suprir minha ausência.
Ao Dr. Rivail Jr. por toda disponibilidade no acompanhamento periodontal dos
pacientes durante o estudo.
Ao Dr. Bruno Rescala e a Dra. Cristiane Canavarro que tanto auxiliaram na complexa
tarefa de enviar as amostras para os EUA e lá chegarem em condições de serem aproveitadas.
Aos professores Antonio Carlos Peixoto e Marco Antonio Almeida pelo honroso
convite feito há 25 anos atrás para ingressar no magistério, fato este que mudou toda uma
trajetória de vida.
Aos professores Alvaro Mendes, Alvaro Fernandes, Catia Quintão, Flavia Artese, José
Augusto Miguel e Maria Teresa Goldner pela divisão da responsabilidade de ensinar
Ortodontia em um dos centros de maior respeitabilidade do país.
Aos Drs. Daniela Feu, Daniel Fernandes, Felipe de Assis, Gisele Abrahão, Luciana
Abi-Ramia e Rhita Almeida por terem exercido a competência típica dos alunos e ex-alunos
de Ortodontia da UERJ, e assim auxiliado na condução clínica dos casos apresentados neste
trabalho.
Às funcionárias da Ortodontia, Elaine dos Anjos e Dna. Maria da Penha por terem se
empenhado para que os pacientes estivessem sempre presentes nos horários marcados, fator
decisivo na condução da pesquisa. E a secretária Mônica, pelo suporte incondicional nos
bastidores da clínica.
Aos funcionários da secretaria de Pós-graduação, José Carlos de Medeiros, Denise
Muniz e Antonio Dias, pela forma com que conseguiram administrar a estranha situação de
professor/aluno do programa de pós-graduação.
Viver sem nome, de modo demasiado obscuro para despertar inveja
ou hostilidade, com a cabeça fria, um punhado de conhecimento
e a bagagem plena de experiências, ser para o espírito uma espécie
de médico de pobres e ajudar a um ou outro, cuja cabeça esteja perturbada
pelas opiniões, sem que ele perceba quem o ajudou! Saber ser pequeno
para ser acessível a todos e não humilhar jamais. Ignorar muitas injustiças
e rastejar como os vermes através de toda espécie de erros, para poder
alcançar as almas secretas em seus caminhos mais recônditos. Viver sempre
numa espécie de amor e sempre com o mesmo egoísmo e a mesma alegria de ser!
Possuir poder e ao mesmo tempo viver retirado e resignado. Banhar-se sempre
ao sol da suavidade e da graça, seguro de que o acesso ao sublime está sempre às
mãos.
Eis o que seria uma vida! Eis a razão para viver uma longa vida!
Friedrich Nietzsche
RESUMO
CAPELLI JÚNIOR, Jonas. Alteração nos níveis de metaloproteinases da matriz e
quimiocinas no fluido gengival durante o movimento dentário ortodôntico. 2007. 66 f.
Tese (Doutorado em Odontologia) – Faculdade de Odontologia, Universidade do Estado do
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
O objetivo do presente estudo foi avaliar os níveis das metaloproteinases da matriz
MMP-9, MMP-3 e MMP-13, e das quimiocinas MCP-1, MIP-1β e RANTES, no fluido
gengival de dentes sob força ortodôntica. Foram recrutados 14 pacientes (3 homens e 11
mulheres) que foram submetidos à movimentação ortodôntica dos caninos superiores.
Amostras do fluido gengival foram coletadas com tiras de Periopaper em diferentes tempos. O
volume do FG foi determinado com o uso do Periotron
®
e os niveis das MMPs e das
quimiocinas quantificados usando-se uma multianálise imunoenzimática com microesferas.
Os resultados mostraram que existe um aumento significativo no volume do FG na área de
pressão em quase todos os tempos analisados, quando comparados às áreas de tensão. Os
níveis da MMP-9 foram muito superiores aos das MMP-13 e MMP-3. Na análise da evolução
do tempo pode ser observada uma alteração significativa nos níveis da quantidade total de
MMP-9, MMP-13 e MMP-3 e na concentração de MMP-13 e MMP-3 durante o período de
movimentação dentária no lado de pressão. A elevação dos níveis de expressão destas MMPs
1 hora após a aplicação da força ortodôntica sugere que estas enzimas estejam envolvidas na
remodelação periodontal induzida. As quimiocinas MCP-1, MIP-1β e RANTES foram
detectadas no sulco gengival em todos os diferentes intervalos de tempo analisados, nas áreas
de tensão e de pressão. Porém, diversas amostras estavam abaixo do nível de detecção do
ensaio e, os níveis dessas quimiocinas no fluido gengival não parecem ser alterados pelas
forças ortodônticas.
Palavras-chave: Citocinas. Metaloproteinases da matriz.
ABSTRACT
The goal of the present study was to evaluate the levels of the matrix
metalloproteinases MMP-9, MMP-3 and MMP-13 and of the chemokines MCP-1, MIP-1β
and RANTES in the gingival crevicular fluid of teeth under orthodontic forces. Fourteen
subjects (3 males and 11 females) were enrolled and subjected to orthodontic tooth movement
of their maxillary canines. Samples of gingival crevicular fluid were collected from both
tension and pressure sides using Periopaper strips at different time points. The volume of
GCF was determined using a Periotron
®
and the levels of MMPs and chemokines quantified
using a multiplex microbead immunoassay. The results demonstrated that the levels of MMP-
9 were higher than the levels of MMP-13 and MMP-3. Statistically significant fluctuations
during the orthodontic tooth movement could be detected for the total amount of MMP-9,
MMP-13 and MMP-3 and for the concentration of MMP-13 and MMP-3 at the pressure side.
The elevation in the levels of these MMPs, 1 hour after the application of the orthodontic
force, suggests that these enzymes are involved in the induced periodontal remodeling. The
chemokines MCP-1, MIP-1β and RANTES were detected in the GCF in both tension and
pressure sides at different time points. However, several samples were below the level of
detection of the assay and the levels of theses mediators in GCF did not seem to be altered by
the orthodontic forces.
Keywords: Cytokines. Matrix metalloproteinase.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –
Figura 2 –
Figura 3 –
Figura 4 –
Figura 5 –
Figura 6 –
Figura 7 –
Figura 8 –
Figura 9 –
Gráfico das alterações das médias do volume do FG nas áreas de
pressão e tensão ao longo do tempo...........................................................
Gráfico da quantidade total de MMP-3, em picogramas (pg), durante os
diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica...................
Gráfico da quantidade total de MMP-13, em picogramas (pg), durante
os diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica..............
Gráfico da mediana de intensidade de fluorescência de MMP-9 durante
os diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica..............
Gráfico da concentração de MMP-3 /µl durante os diferentes intervalos
de tempo da movimentação ortodôntica.....................................................
Gráfico da concentração de MMP-13 /µl durante os diferentes intervalos
de tempo da movimentação ortodôntica.....................................................
Gráfico da quantidade de MIP-1β , em picogramas (pg), durante os
diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica...................
Gráfico da quantidade total de MCP-1, em picogramas (pg), durante os
diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica...................
Gráfico da quantidade total de RANTES, em picogramas (pg), durante
os diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica..............
42
44
44
45
45
46
48
48
49
TABELA
Tabela 1 –
Quantidade total, expressa em picogramas (pg), de proteína inflamatória
de macrófago 1β (MIP-1β), proteína quimiotática para monócitos 1
(MCP-1) e a citocina regulada sob ativação, expressa e secretada por
células T normais (RANTES)....................................................................
47
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AINES antiinflamatórios não-esteroidais
ALP fosfatase alcalina
βG enzima β-glucuronidase
CSF fator estimulador de colônia
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
FG fluido gengival
GF fatores de crescimento
GM-CSF fator estimulador de colônia granulócito-macrófago
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1
IFN interferon
IG índice gengival
IL interleucina
IL-1RA interleucina 1 receptor antagonista
IP índice de placa
LDH lactate dehidrogenase
LP ligamento periodontal
MCP-1 proteína quimiotática para monócitos 1
MMP metaloproteinase da matriz
MIP-2 proteína inflamatória de macrófago 2
MIP-1α proteína inflamatória de macrófago 1alpha
MIP-1β proteína inflamatória de macrófago 1beta
ODF fator de diferenciação de osteoclastos
OPG osteoprotegerina
Pg picogramas
PGs protaglandinas
PGE
1
prostaglandina E
1
PGE
2
prostaglandina E
2
RANK ativador do receptor do fator nuclear ĸΒ
RANKL ligante ativador do receptor do fator nuclear ĸΒ
RANTES citocina regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais
RPM rotações por minuto
RT-PCR reação em cadeia da polimerase transcriptase
TIMP inibidor tecidual da metaloproteinase
TNF fator de necrose tumoral
µl microlitros
SUMÁRIO
1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.3
2
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
INTRODUÇÃO........................................................................................
REVISÃO DA LITERATURA...............................................................
Efeito do movimento dentário ortodôntico sobre os tecidos
periodontais...............................................................................................
Efeitos sobre os tecidos gengivais..............................................................
Efeitos sobre o ligamento periodontal........................................................
Efeitos sobre o tecido ósseo.......................................................................
Mediadores inflamatórios e movimento dentário ortodôntico.............
Citocinas pró-inflamatórias........................................................................
Quimiocinas................................................................................................
Metaloproteinases da matriz.......................................................................
Prostaglandinas...........................................................................................
Níveis dos mediadores inflamatórios no fluido gengival durante a
movimentação ortodôntica......................................................................
PROPOSIÇÃO.........................................................................................
MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................
Seleção dos pacientes................................................................................
Dispositivo ortodôntico............................................................................
Monitoramento clínico.............................................................................
Monitoramento imunológico...................................................................
Coleta de amostras de fluido gengival.......................................................
Multianálise imunoenzimática com microesferas......................................
Luminex 100
®
............................................................................................
16
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18
18
20
22
25
25
27
28
30
30
36
37
37
37
38
38
38
39
40
3.5
4
4.1
4.2
4.3
4.4
5
6
Tratamento estatístico..............................................................................
RESULTADOS.........................................................................................
Clínicos......................................................................................................
Mudanças no volume de fluido gengival ao longo do tempo................
Mudanças nos níveis de MMPs ao longo do tempo...............................
Mudanças nos níveis de quimiocinas ao longo do tempo......................
DISCUSSÃO.............................................................................................
CONCLUSÕES........................................................................................
REFERÊNCIAS.......................................................................................
ANEXO 1 - Termo de consentimento pós-informado...............................
ANEXO 2 - Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário Pedro Ernesto.......................................................................
41
42
42
42
43
46
50
57
58
65
66
16
INTRODUÇÃO
O movimento dentário ortodôntico é induzido por estímulo mecânico e possibilitado
pela remodelação do ligamento periodontal e osso alveolar. A pré-condição para as atividades
de remodelação, e consequentemente o deslocamento dentário, é a ocorrência de um processo
inflamatório. Mudanças vasculares e celulares associadas ao movimento dentário são eventos
que foram extensamente reconhecidos e descritos na literatura ortodôntica (VANDEVSKA-
RADUNOVIC, 1999). Estudos realizados no início do século 20 objetivaram principalmente
a análise das mudanças histológicas nos tecidos periodontais após o movimento dentário.
Estes estudos mostraram a atividade celular no ligamento periodontal mecanicamente
estressado, envolvendo fibroblastos, células endoteliais, osteoblastos, osteócitos e células
endostais. Além destes achados, descobriu-se também que o estresse mecânico altera as
propriedades estruturais dos tecidos, no nível celular, molecular e genético. (KRISHNAN e
DAVIDOVITCH, 2006).
A força mecânica aplicada sobre o dente é transmitida aos tecidos de suporte do
periodonto e têm início as atividades de remodelação que permitem o movimento do dente
através do osso alveolar. A fase inicial do movimento dentário ortodôntico, que envolve uma
resposta inflamatória aguda, é caracterizada pela vasodilatação periodontal e a migração de
leucócitos para fora dos capilares do ligamento periodontal. Os mediadores da inflamação
podem desencadear os processos biológicos associados com a remodelação periodontal
induzida e a aposição e reabsorção do osso alveolar (DUDIC et al, 2006).
Existe portanto, um delicado e bem balanceado processo de remodelação da matriz
extracelular nos tecidos periodontais, com objetivo de permitir o movimento do dente,
enquanto mantêm-se a integridade funcional do periodonto. As células mais abundantes no
periodonto são os fibroblastos e estas células produzem as metaloproteinases da matiz
(MMPs) e inibidores teciduais da metaloproteinase (TIMPs) que parecem desempenhar um
papel importante na manutenção da integridade funcional da matriz extracelular periodontal
(APAJALAHTI et al., 2003; NAHAM et al, 2004).
A remodelação da matriz extracelular é passo crítico na movimentação ortodôntica,
mas é necessária a remodelação óssea subseqüente. O sistema imune parece desempenhar um
papel na regulação do processo de remodelação óssea. Incluindo a produção de citocinas
pelos leucócitos que migram dos capilares dilatados do ligamento periodontal após a
aplicação da força ortodôntica (HEASMAN et al, 1996; KRISHNAN e DAVIDOVITCH,
17
2006; MEIKLE, 2006; NORTON, 2000; TAKAHASHI et al 2006). Dentre as diversas
citocinas envolvidas no processo de aposição/reabsorção óssea, as quimiocinas podem ter
importante papel na resposta do hospedeiro pelo recrutamento de células inflamatórias no
foco de inflamação ativa. E pela indução da liberação de outros mediadores celulares
(EMINGIL et al, 2004; EMINGIL et al, 2005).
Pode ser observado que os tecidos periodontais respondem rapidamente ao estresse
mecânico com conseqüentes mudanças metabólicas que permitem o movimento dentário.
Uma maneira de avaliar estas mudanças é através da análise da composição do fluido
gengival. Este é um método simples e não invasivo que tem sido utilizado para investigar a
resposta celular no ligamento periodontal durante o tratamento ortodôntico. Uma variedade de
substâncias envolvidas na remodelação óssea, e produzidas pelas células do ligamento
periodontal em quantidade suficiente para estarem difusas no fluido gengival, têm sido bem
documentadas (DUDIC et al, 2006).
Amostras de tecido do ligamento periodontal ou do osso alveolar, sob o processo de
reabsorção durante o movimento dentário, não podem ser obtidas em humanos. Embora a
localização de citocinas e mediadores inflamatórios no ligamento periodontal de animais
possa ser acompanhada por técnicas de imunohistoquímica, em humanos é necessário o
emprego de um método não invasivo. Portanto, os níveis destas moléculas quantificadas no
fluido gengival, proporcionam uma medição indireta das mudanças que ocorrem nos tecidos
periodontais, durante a movimentação ortodôntica. A hipótese de que a compressão do
ligamento periodontal resulta na migração dos produtos bioquímicos para o sulco gengival é a
base para o desenho experimental de muitas pesquisas que investigam a biologia do
movimento dentário ortodôntico (BAŞARAN et al, 2006).
18
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Efeito do movimento dentário ortodôntico sobre os tecidos periodontais
1.1.1 Efeitos sobre os tecidos gengivais
Os elementos teciduais que sofrem mudanças durante os movimentos dentários são
principalmente: o ligamento periodontal, com suas células, fibras de suporte, capilares e
células nervosas; e o osso alveolar. A literatura ortodôntica privilegia os estudos sobre a
resposta do ligamento periodontal e principalmente a remodelação do osso alveolar à força
ortodôntica. No entanto, as características da gengiva devem ser consideradas como um
importante fator nas alterações teciduais envolvidas na movimentação dentária (REDLICH et
al, 1999).
A gengiva é composta de epitélio e tecido conjuntivo que é ligada à parte externa do
osso alveolar e à região supracrestal do dente. As fibras colágenas são os componentes
estruturais principais da matriz extracelular da gengiva. Uma gengiva sadia contém colágeno
intersticial do tipo-I (90%) , colágeno tipo-III (8%) e colágeno tipo IV, V, VI e VIII (2%). A
análise ultra-estrutural revela dois padrões na disposição do colágeno gengival: 1- largas
fibras de colágeno tipo-I, na sua maioria dispostas paralelamente e interpostas por finas
fibrilas. Esta disposição das fibras colágenas confere elasticidade e rigidez ao tecido, que
sustenta as pesadas forças mastigatórias; 2- fibras curtas e finas, em uma malha reticular
localizada principalmente na membrana basal do epitélio e ao redor dos vasos sanguíneos
(TERVAHARTIALA, 2003).
As fibras colágenas da gengiva estão reunidas de acordo com a sua origem e inserção.
Os grupos mais importantes são as fibras dento - gengivais e as fibras transeptais. O colágeno
gengival tem um ritmo intenso de remodelação. As fibras transeptais têm uma taxa
particularmente elevada de remodelação, sendo tão elevada quanto aquela do colágeno do
ligamento periodontal (REDLICH et al, 1999).
O alto ritmo do metabolismo do colágeno gengival é uma característica
fisiologicamente intrínseca, tornando-o capaz de manter sua integridade, pelo equilíbrio entre
a síntese e a degradação. Além da rede colágena, a gengiva também contém uma rede de
19
fibras elásticas, que compreende 6% do total proteico da gengiva humana. Esta rede é
composta por três diferentes tipos de fibras, chamadas elásticas, elaunínicas e fibras
oxitalânicas, que dão propriedades elásticas à gengiva, necessárias como proteção às forças de
compressão. A matriz extracelular da gengiva também contém proteoglicanos, tais como
condroitinsulfato, dermatansulfato, e heparansulfato. Os proteoglicanos representam uma
família de macromoléculas, proteicas na sua essência, que compõem uma cadeia chamada
glicosaminoglicanos. Proteoglicanos são importantes organizadores da matriz extracelular e
têm importante papel na manutenção da integridade estrutural do tecido conjuntivo (LINDHE,
1999).
No movimento ortodôntico rotacional, há um alongamento das fibras oxitalânicas e
uma reorientação das fibras colágenas gengivais. A instabilidade clínica dos dentes
rotacionados, tem sido atribuída às fibras colágenas estiradas. Assim, as fibras estiradas que
se originam na gengiva e se inserem no cemento, tracionam o dente de volta para a posição
pré-movimento. Para aliviar o dente rotacionado das forças exercidas pelas fibras estiradas,
foi proposta a fibrotomia circunferencial supracrestal (EDWARDS, 1970). A reorganização
do ligamento periodontal ocorre em torno de um período de três a quatro meses, ao passo que
a cadeia das fibras colágenas gengivais remodelam-se em torno de quatro a seis meses, e as
fibras elásticas supracrestais permanecem estiradas por mais de 232 dias. Em estudo
prospectivo com 15 anos de observação, envolvendo 320 casos ortodônticos tratados
consecutivamente, pode ser constatado que a fibrotomia foi mais efetiva no alívio da recidiva
da giroversão que na recidiva de movimentos labiolinguais. A fibrotomia foi mais bem
sucedida na redução da recidiva do segmento anterior superior que no anterior inferior. No
entanto, houve uma variação individual imprevisível no movimento dentário após o
tratamento ortodôntico, tanto nos pacientes que se submeteram à fibrotomia, como nos que
não se submeteram (EDWARDS, 1988).
O efeito da força ortodôntica sobre o ritmo de síntese dos fibroblastos gengivais tem
sido estudado histoquimicamente com prolina marcada com tritio (3H). A incorporação de
prolina 3H na gengiva foi medida após a abertura do espaço interdental de incisivos de ratos.
Foi documentado que a prolina é encontrada no colágeno recém formado em quantidades
elevadas, tanto na lâmina dura como na região transeptal, o que sugere que a força ortodôntica
estimula a produção de colágeno na gengiva (BOISSON e GIANELLY, 1981).
As células mais abundantes na gengiva são os fibroblastos. Seu volume compreende
5,6% do total do volume gengival. Outras células residentes na gengiva são: macrófagos,
linfócitos, células mastóides, células endoteliais e células nervosas. A função dos fibroblastos
20
e outras células estão intimamente associadas com a matriz extracelular, que proporciona um
apropriado micro ambiente para a atividade celular. Este efeito na matriz extracelular é
mediado por receptores celulares específicos, fazendo com que a integridade funcional do
tecido gengival seja mantida por estas interações célula-matriz extracelular (REDLICH et al,
1999).
O efeito do estímulo mecânico sobre o gene de transcrição do colágeno tipo I e da
colagenase tecidual (MMP1 – metaloproteinase da matriz 1) foi estudado nos fibroblastos
gengivais in vitro usando a reação em cadeia da polimerase transcriptase (RT-PCR).
Fibroblastos gengivais de cães em cultura foram submetidos a uma força análoga à força
ortodôntica usando centrifugação. Sob estas condições, o nível de transcrição do colágeno
tipo I esteve significativamente aumentado, enquanto a colagenase tecidual (MMP1) esteve
diminuída. Estas mudanças sugerem que após a aplicação de pressão, os fibroblastos
gengivais apresentaram um distúrbio no equilíbrio entre a síntese e a degradação do colágeno,
necessário para manutenção adequada da estabilidade tecidual (REDLICH et al, 1999).
Ao contrário do osso e do ligamento periodontal, o tecido gengival não é reabsorvido
após o tratamento ortodôntico, mas sim comprimido e consequentemente retraído. O fato da
força ortodôntica não produzir reabsorção gengival, previne a formação de bolsa periodontal e
subsequentemente a perda de inserção do dente da gengiva. As fibras colágenas são
inicialmente rompidas durante a aplicação das forças ortodônticas, mas os genes para
colágeno e elastina são ativados enquanto que os de colagenase são inibidos, modificando a
composição da matriz extracelular da gengiva (REDLICH et al, 1999).
1.1.2 Efeitos sobre o ligamento periodontal
A aplicação de uma força ortodôntica cria áreas de tensão e compressão no ligamento
periodontal com extensão e localização dependentes do tipo de movimento dentário desejado.
Nas áreas de tensão há um alargamento do ligamento periodontal e estiramento das fibras
periodontais. As fibras precisam ser alongadas para o dente se deslocar. Ocorre uma rápida
proliferação de fibroblastos 8-40 horas após a aplicação da força (REITAN, 1951).
Fibroblastos estão distribuídos desigualmente por todo o ligamento periodontal alargado,
tendo a menor proliferação localizada próxima a raiz do dente e a maior encontrada próxima
21
ao osso alveolar (DAVIDOVITCH et al, 1988) Ocorre também um aumento das fibras
oxitalânicas no ligamento periodontal próximo à raiz (REITAN e RYGH, 1994).
Mudanças vasculares subseqüentes ocorrem com a dilatação dos capilares sanguíneos
e aumento na atividade vascular. Macrófagos são encontrados em grande número próximos
aos vasos sanguíneos nas zonas de tensão. Ao se empregar forças de grande intensidade, são
encontradas mudanças degenerativas nos capilares venosos, com hemorragia e morte celular.
(OPPENHEIN, 1944).
O volume de colágeno reduz nos três primeiros dias, assim como a invasão vascular
aumenta. A diminuição no colágeno é mediada pelas colagenases produzidas pelos
macrófagos ou pelos fibroblastos através da interação macrófagos/fibroblastos. As enzimas
responsáveis pela diminuição do colágeno são moduladas pelo estresse mecânico. É possível
que a reabsorção do colágeno periodontal seja influenciada pela alteração na produção do
inibidor de colagenase e pode ocorrer sem atividade fagocitária dos fibroblastos. Assim que
migram a partir do osso, os fibroblastos secretam tanto novas fibras completas como novas
fibrilas que são incorporadas às fibras existentes, permitindo que ocorra o alongamento. As
fibras velhas são expostas pelo osso que está avançando, enquanto o novo colágeno secretado
é incorporado tanto no osteóide como no ligamento periodontal (TEN CATE e ANDERSON,
1986).
Na zona de pressão os espaços do ligamento periodontal são estreitados no período
inicial subseqüente à aplicação da força ortodôntica. Mesmo utilizando forças de baixa
intensidade, a compressão do suprimento sanguíneo em áreas limitadas da membrana
periodontal é muitas vezes inevitável. Isso leva a uma necrose local do ligamento, trombose,
degeneração dos vasos sanguíneos e cristalização dos eritrócitos. O resultado é uma área
necrótica estéril (hialinização) que é usualmente limitada a 1 a 2 mm em diâmetro, mas pode
ser ampliada como resultado da sustentação de uma força ortodôntica de grande intensidade
(REITAN, 1951; RYGH, 1972).
O suprimento sanguíneo no ligamento periodontal é reduzido, mas é mantido quando
forças de baixa intensidade são utilizadas. Assim, a atividade celular aumenta com a
diferenciação dos fibroblastos e osteoclastos. A reabsorção do colágeno ocorre de forma
similar ao lado de tensão, suportada pelo aumento da vascularização e acompanhado pelos
macrófagos, com reabsorção do osso alveolar (REITAN e RYGH, 1994). Estas mudanças são
acompanhadas de mudanças nos níveis de glucosaminoglicanos detectadas no fluido gengival
(LAST et al, 1988; SAMUELS et al, 1993; PENDER et al, 1994).
22
A regeneração e proliferação de vasos sanguíneos dentro da zona de pressão
usualmente ocorrem após sete dias (REITAN e RYGH, 1994). Quando a zona de hialinização
persiste, o movimento dentário é interrompido. As células não podem diferenciar-se em
osteoclastos e não ocorre reabsorção óssea a partir do ligamento periodontal (RYGH et al,
1986). A remoção da zona hialinizada ocorre através da invasão da área necrótica por células
e vasos sanguíneos do ligamento periodontal vizinho não danificado (DAVIDOVITCH et al,
1980). A penetração dos capilares na zona hialinizada parece ser um fator importante no
processo de remoção e reparo, com macrófagos sendo encontrados extensivamente nas áreas
perivasculares. Os macrófagos digerem e removem completamente a área hialinizada e o osso
alveolar adjacente é removido por reabsorção por solapamento. A área pós-hialinizada é
caracterizada por uma intensa atividade celular, restabelecendo os feixes de fibras colágenas
funcionalmente orientados, e uma nova camada de cemento e osso alveolar. Estas mudanças
estão associadas com o alargamento do espaço do ligamento periodontal, mas que é
restaurado a dimensões normais quando a remodelação está completada (HEASMAN et
al,1996; THILANDER et al., 2002).
1.1.3 Efeitos sobre o tecido ósseo
OPPENHEIM em 1911 publicou os resultados de um trabalho experimental com
macacos, considerando que o tecido ósseo reage à pressão pela transformação de sua
arquitetura. Isto acontece pela reabsorção do osso presente e deposição de novo tecido ósseo,
processo que ocorre simultaneamente. A deposição finalmente prepondera sobre a reabsorção
(OPPENHEIM, 1911).
A remodelação do osso alveolar com o movimento dentário ortodôntico é
caracterizada por uma ativação sincronizada de numerosas unidades multicelulares ósseas
com períodos distintos de deposição e reabsorção nos sítios de tensão e pressão (KING e
KEELING, 1995). A remodelação óssea pode continuar a ocorrer mesmo após a força
ortodôntica inicial ter decaído. Durante os três dias subseqüentes à aplicação da força, pouca
modificação óssea é detectável, mas isto é seguido rapidamente por uma onda de reabsorção
do quinto para o sétimo dia. A reabsorção envolve a remoção de componentes orgânicos e
minerais da matriz óssea extracelular, por células osteolíticas, primariamente os osteoclastos.
O osteócito pode também atuar como um agente reabsorvedor local (MEGHJI, 1992). A
23
invasão osteoclástica ocorre em duas ondas. A primeira onda é derivada de população de
células locais que podem chegar em horas após a aplicação da força ortodôntica (REITAN,
1951). A segunda onda leva mais de dois dias para ser transportada pelo sistema vascular.
Pré-osteoclastos em descanso chegam via suprimento sanguíneo para serem transformadas em
osteoclastos ativos na superfície óssea e os osteoblastos são fundamentais neste processo.
Mudanças no ambiente local da tensão de oxigênio sugerem ser o gatilho para a função dos
osteoblastos (TUNCAY e BARKER, 1994). Pré-osteoclastos são derivados de monócitos e a
atuação das quimiocinas é imperativa para esse processo. A MCP-1 parece estar diretamente
envolvida na fusão de pré-osteoclastos em osteoclastos (KIM et al, 2005).
Embora os osteoclastos sejam as principais células de reabsorção óssea, os
osteoblastos contêm receptores da maior parte dos agentes da reabsorção óssea, tais como o
hormônio da paratireóide, vitamina D e citocinas. Os osteoblastos também liberam
colagenase, particularmente em resposta ao hormônio da paratireóide, deste modo facilitando
a reabsorção osteoclástica. Há uma complexa interação entre osteoblastos e osteoclastos para
produzir a reabsorção óssea (SANDY et al, 1993). A reabsorção óssea é conseguida pela
secreção de ácidos orgânicos, enzimas lisossomiais e metaloproteinases (KEELING et al,
1993). Essas substâncias dissolvem os cristais de hidroxiapatita e reabsorvem a matriz
orgânica no processo chamado “reabsorção frontal”, e o movimento dentário se inicia.
Reabsorção frontal é caracterizada histologicamente pelo alargamento da membrana
periodontal e os osteoclastos são espalhados sobre a uma extensa área da superfície do osso
alveolar (REITAN e RYGH 1994). Quando a hialinização ocorre, os osteoclastos aparecem
nas superfícies dos espaços medulares adjacentes ou na superfície do processo alveolar e o
osso alveolar adjacente é removido por reabsorção solapante. Em humanos, o período de
hialinização demora aproximadamente 2 ou 3 semanas. Quando há uma alta densidade óssea,
a duração é maior (THILANDER et al, 2002).
Células da linhagem osteoblástica desempenham um papel determinante na
remodelação óssea, processo que envolve interações entre osteoblastos e osteoclastos,
hormônios sistêmicos, citocinas e fatores de crescimento. A base de comunicação entre
osteoblastos e osteoclastos é uma proteína de superfície celular, que está localizada na
superfície dos osteoblastos e é responsável pela indução da osteoclastogênese. Esse fator de
sinalização celular é denominado ligante ativador do receptor do fator nuclear ĸΒ (RANKL).
A união do RANKL ao seu receptor cognato, ativador do receptor do fator nuclear ĸΒ
(RANK), processada na superfície das células progenitoras de osteoclastos, induz a
osteoclastogênese e ativa os osteoclastos. A molécula que inibe a osteoclastogênese é
24
conhecida como osteoprotegerina (OPG) que é secretada pelos osteoblastos com a função de
bloquear a formação de osteoclastos, assim como a reabsorção óssea. As interações RANKL-
OPG constituem um sistema receptor-ligante que regula diretamente a diferenciação
osteoclástica. O OPG age como um inibidor da osteoclastogênese por competição com o
RANKL nos receptores da membrana celular. As evidências sugerem que a produção de
RANKL e OPG no ligamento periodontal desempenha importante papel na regulação da
remodelação do tecido conjuntivo e reabsorção óssea durante o movimento dentário
ortodôntico (DOLCE et al, 2002; HUANG et al, 2005; KAWASAKI et al, 2006; MEIKLE,
2006).
Nas áreas de tensão, os osteoblastos são recrutados por células progenitoras locais no
ligamento periodontal. Isto é acompanhado por intensa atividade vascular dentro do osso
alveolar. Logo após o início da proliferação celular, o tecido osteóide será depositado no lado
de tensão. A formação desse novo osteóide é até certo ponto dependente em forma e
espessura dos feixes de fibras. Se forem grossas, o osteóide recém-formado se depositará ao
longo dos feixes de fibras estiradas, resultando na formação de lâminas ósseas. Se os feixes de
fibras são mais finos, formar-se-á uma camada mais uniforme de osteóide ao longo da
superfície óssea (REITAN e RYGH, 1994). Os osteoblastos secretam matriz orgânica
extracelular óssea, incluindo colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina e osteoconectina. Em
adição, fosfatase alcalina, proteoglicanos e fatores reguladores do crescimento, que estão
estocados na matriz óssea, são liberados. Osteoclastos, pela liberação de fatores de
crescimento polipeptídicos, também estimulam os osteoblastos a proliferarem e sintetizarem a
matriz proteica (MEGHJI, 1992). A proliferação celular é vista, em humanos, 30 a 40 horas
após a aplicação da força ortodôntica. O pico dos níveis de fosfatase alcalina acontece
aproximadamente sete dias após e coincide com o início da deposição do osteóide (KEELING
et al, 1993). Osso novo é depositado ao longo dos feixes de fibras colágenas e a calcificação
das camadas mais profundas do osteóide inicia-se rapidamente, enquanto a camada superficial
permanece não calcificada (HEASMAN et al, 1996; RYGH, 1972).
O processo da reabsorção óssea é muito mais rápido que o da aposição óssea; um
período de três meses é necessário para recolocar osso que foi reabsorvido em apenas duas ou
três semanas. A genética molecular que regula a função e diferenciação dos osteoclastos
parece ser mais simples que a dos osteoblastos (MASELLA e MEISTER, 2006). O resultado
clínico é a prevalência de grande mobilidade nos dentes que estão sob tratamento ortodôntico
ativo. Essa diferença de sincronia entre a remoção de tecido e a osteogênese também contribui
25
para a necessidade de contenção dos dentes recentemente movimentados (HUANG et al,
2005).
1.2 Mediadores inflamatórios e movimento dentário ortodôntico
Uma das questões mais intrigantes no movimento dentário ortodôntico diz respeito ao
processo de reabsorção nas áreas tradicionalmente descritas como de pressão e a deposição
óssea nas áreas descritas como de tensão. Isto leva a pergunta: como as células distinguem
entre os lados de tensão e os de compressão? Uma resposta a esta pergunta foi proposta em
1986, quando foi sugerido que ela estaria no campo da biologia das citocinas. De acordo com
esta hipótese, o resultado da formação ou reabsorção óssea dependeria de: 1) citocinas
produzidas localmente por células mecanicamente ativadas e 2) estado funcional das células
alvo disponíveis (SANDY et al, 1993). As citocinas já descritas que afetam o metabolismo
ósseo e, deste modo, o movimento dentário ortodôntico incluem a interleucina 1 (IL-1),
interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator de
necrose tumoral alfa (TNFα), interferon gamma (IFNγ) e fator de diferenciação de
osteoclastos (ODF). Fora as citocinas, existem outros mediadores da inflamação e da
remodelação tecidual que também foram implicados no mecanismo de movimentação
dentária induzidos por forças ortodônticas, tais como as metaloproteinases da matriz e as
prostaglandinas (KRISHNAN e DAVIDOVITCH, 2006).
As citocinas estão envolvidas na iniciação, amplificação, perpetuação e resolução do
processo inflamatório. São mediadores chave para o dano tecidual e desempenham importante
papel no movimento dentário. São classificadas em pró-inflamatórias e antiinflamatórias. As
pró-inflamatórias são: TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6 e IL-8. As antiinflamatórias são: IL-4, IL-10 e
IL-13 (BAŞARAN et al, 2006).
1.2.1
Citocinas pró-inflamatórias
A interleucina IL-1 existe em duas formas, alpha e beta, na qual a interleucina IL-1β e
a principal forma fisiológica e é secretada principalmente pelos monócitos/macrófagos, mas
26
também pode ser liberada por células endoteliais, fibroblastos, e células epiteliais. A secreção
de IL-1β é desencadeada por vários estímulos, incluindo neurotransmissores, produtos
bacterianos, outras citocinas e forças mecânicas. A IL-1β é a citocina mais potente na indução
da reabsorção óssea, estimulando a função osteoclástica ao passo que inibe a formação óssea
pelos osteoblastos (GRIEVE et al, 1994).
A interleucina IL-2 é derivada dos linfócitos T. Está envolvida na ativação e
estimulação dos macrófagos, linfócitos natural killers, e osteoclastos. Por estar envolvida na
estimulação da reabsorção óssea por aumento na atividade osteoclástica, tem sido sugerido
que a IL-2 desempenha importante papel na patogênese da doença periodontal (SACAREL-
CAMINAGA et al, 2002).
A interleucina IL-6 e o fator de necrose tumoral α (TNF-α) também são citocinas pró-
inflamatórias que atuam na remodelação óssea, na reabsorção óssea e deposição de novo
tecido ósseo (ALHASHIMI et al, 2001). A IL-6 regula a resposta imune nos sítios inflamados
e tem uma atividade autócrina / parácrina que estimula a formação osteoclástica e a atividade
de reabsorção óssea (KURIHARA et al, 1990).
A interleucina IL-8 é uma potente citocina pró-inflamatória que desempenha papel
chave no recrutamento e ativação dos neutrófilos durante o processo inflamatório. É secretada
principalmente pelos monócitos e é importante na regulação da reabsorção do osso alveolar
durante o movimento dentário, agindo nos estágios iniciais da resposta inflamatória
(TUNCER et al, 2005).
O fator de necrose tumoral α (TNF-α) é uma citocina que aparece cedo na cascata de
eventos da resposta inflamatória e pode ser detectada e quantificada no sulco gengival de
dentes sob movimentação ortodôntica. Nos tecidos, essa citocina se encontra primariamente
no ligamento periodontal comprimido e no osso em processo de reabsorção, adjacente à
superfície radicular (KARACAY et al, 2007; NORTON, 2000).
O interferon gamma (IFN-γ) é uma citocina sintetizada pelos linfócitos T e linfócitos
natural killers após ativação pelo sistema imune e processo inflamatório, e têm múltiplas
funções na regulação imune. O IFN-γ inibe a reabsorção óssea, por seu efeito inibitório da
diferenciação osteoclástica (MERMUT et al , 2007). Em estudo feito com ratos wistar pôde
ser observado que o IFN-γ esteve envolvido na remodelação óssea durante o movimento
dentário induzido, e suprimiu fortemente a osteoclastogênese. Foi sugerido que a
administração do IFN-γ poderia ser clinicamente útil para o controle da ancoragem
ortodôntica, uma vez que inibe a movimentação dentária (MERMUT et al, 2007).
27
1.2.2 Quimiocinas
Uma série de citocinas bem caracterizadas, conhecidas como quimiocinas, possuem
função quimiotática para os leucócitos, particularmente para os neutrófilos, linfócitos e
monócitos. Estas moléculas agem para recrutar células de defesa para áreas onde elas são
necessárias, e são importantes nas respostas mediadas por células. O termo quimiocina é
empregado para descrever estas moléculas e é uma forma abreviada do termo “citocina
quimiotática” (LINDHE, 1999).
O estágio inicial do movimento dentário ortodôntico é caracterizado por resposta
inflamatória aguda, onde ocorre uma migração de leucócitos. Isto sugere que a presença de
sinais quimiotáticos específicos possa desempenhar papel na remodelação óssea, em
particular na reabsorção. Através de hibridização in situ em ratos wistar foi analisada a
indução das quimiocinas MCP-1, RANTES e MIP-2, no lado de pressão do movimento
dentário ortodôntico. O movimento mesial nos primeiros molares superiores foi realizado com
aparelhagem fixa por 3, 7 e 10 dias, nos diferentes grupos de animais. Os resultados
demonstraram que MCP-1, RANTES e MIP-2 são altamente expressadas durante os estágios
iniciais do movimento dentário ortodôntico. No dia 3, a MCP-1 mostrou máxima indução na
zona de pressão, seguida em intensidade pela RANTES e MIP-2. A indução destas
quimiocinas declinou no dia 7 e manteve baixos níveis no dia 10 (ALHASHIMI et al, 1999).
O TNF-α é uma citocina que induz a reabsorção óssea estimulando a proliferação e
diferenciação das células progenitoras de osteoclastos e também estimulam a expressão de
MCP-1. Pacientes com periodontite crônica e periodontite agressiva podem ter um aumento
nos níveis no LP de MCP-1 e TNF-α e uma correlação entre o aumento dos seus níveis. Para
testar esta hipótese amostras de fluido gengival foram coletados de 25 pacientes com
periodontite agressiva, de 20 pacientes com periodontite crônica e 20 pacientes controles.
Com teste ELISA para MCP-1 e TNF-α pode ser observado que a concentração e a
quantidade total destes mediadores não foram diferentes entre os grupos com doença, mas o
total de MCP-1 e TNF-α foram significativamente maior que no grupo controle. Estes
resultados sugeriram que a MCP-1 pode ter um importante papel na ativação e recrutamento
de células imunes e inflamatórias na doença periodontal, e ambos, pacientes com doença
crônica e agressiva, podem ter o mesmo padrão de expressão de MCP-1. A forte correlação
entre os níveis de MCP-1 e TNF-α no fluido gengival pode influenciar no mecanismo de
amplificação dos eventos inflamatórios na inflamação gengival (KURTIS et al, 2005).
28
A expressão das moléculas quimioatraentes (ICAM-1 e MCP-1) induzidas pela IL-1β
também foi exacerbada por antiinflamatórios. A expressão destas moléculas pelas células
endoteliais media o recrutamento adicional de células inflamatórias circulante para o local da
injúria. Estas células são capazes de liberar citocinas e outros mediadores inflamatórios e
desta maneira contribuir para a reação inflamatória que ocorre no LP durante o movimento
dentário ortodôntico (KYRKANIDES et al, 2000).
1.2.3 Metaloproteinases da matriz
A remodelação da matriz extracelular é um passo crítico em diversos processos
biológicos, tais como reparo tecidual, remodelação tecidual e movimento dentário
ortodôntico. Durante o movimento dentário ortodôntico há um delicado e bem balanceado
processo de remodelação da matriz extracelular no periodonto adjacente, com objetivo de
permitir o movimento do dente, enquanto mantêm-se a integridade funcional do periodonto.
As células mais abundantes no periodonto são os fibroblastos e estas células produzem
metaloproteinases da matriz (MMP) e inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMP) e
parecem desempenhar um papel importante na manutenção da integridade funcional da matriz
extracelular periodontal. As MMPs são uma família de enzimas degradantes da matriz que
estão implicadas na remodelação do ligamento periodontal, tanto em condições fisiológicas
como patológicas (APAJALAHTI et al., 2003; NAHAM et al, 2004).
A expressão dos níveis de MMP-8 e MMP-13 foi estudada por hibridização in situ e
reação em cadeia da polimerase transcriptase (RT-PCR) no movimento dentário de ratos,
considerando lados de pressão e tensão. Ambas metaloproteinases da matriz aumentaram
temporariamente seus níveis durante o movimento ativo, diferencialmente regulado por forças
de pressão e tensão e pareceram desempenhar importante papel na remodelação do ligamento
periodontal (TAKAHASHI et al, 2003).
Através da técnica de hibridização in situ foi analisada a expressão dos níveis de
MMP-2, MMP-9 e TIMP-1-3 em dentes de ratos submetidos à movimentação. A expressão
dos níveis destes genes esteve aumentada temporariamente nas células do periodonto, como
cementoblastos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no lado de pressão do dente sob
movimento. O aumento temporário da expressão dos genes no lado de tensão foi limitado aos
osteoblastos e cementoblastos. Pode ser concluído que os níveis de MMP-2 e MMP-9
29
aumentam temporariamente em ambos os lados, pressão e tensão, durante o movimento
dentário induzido, concomitante com o aumento dos genes para as TIMPs. A expressão dos
níveis dos genes que codificam MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 e TIMP-3 aparecem para
regular diferencialmente as várias regiões dos tecidos do ligamento periodontal sob tensão e
compressão. Estas diferenças no perfil de expressão dos genes podem regular
combinatoriamente o ritmo e extensão da remodelação do colágeno da matriz extracelular do
LP durante o movimento dentário ortodôntico (TAKAHASHI et al, 2006).
Para avaliar as metaloproteinases da matriz MMP-1 e MMP-2 foram estudados 11
pacientes com indicação de extração dos 1
os
pré-molares superiores. Os dentes caninos foram
retraídos com força de 150 gramas e tiveram amostras do FG, nos lados de pressão e tensão,
coletadas nos tempos: após 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas e 8 horas, para análise em
Western blot. Tanto no lado de pressão como no de tensão, a força aplicada induziu um
aumento no nível de MMP-1 uma hora após, que permaneceu elevado até 3 horas e depois
desapareceu. O nível de MMP-2 aumentou significantemente 1 hora após a aplicação da
força, no lado de tensão, e gradualmente retornou aos níveis basais após 8 horas. No lado de
pressão o nível foi dependente do tempo e atingiu seu pico após 8 horas. Não tendo havido
sinais de inflamação gengival ou formação de bolsas durante o estudo, supôs-se que as células
do periodonto poderiam elevar a produção destas MMPs e esta alta expressão refletiria a
atividade remodeladora do LP sob forças ortodônticas. Porém, esta conclusão deve ser vista
com cautela, já que existe a possibilidade de contaminação entre as duas zonas de análise do
sulco gengival a despeito do fato da aplicação da força gerar um lado de tensão e outro de
pressão (CANTARELLA et al, 2006).
A ativação de cultura de células endoteliais de ratos pela IL-1β resultou em aumento
da síntese de MMP-9, bem como da atividade de colagenase, acompanhada pela redução da
síntese de procolágeno. A administração de antiinflamatório resultou em exacerbação da
atividade de colagenase (MMP-2 e MMP-9). Concomitantemente, a síntese do procolágeno
voltou ao normal. Devido a remodelação do colágeno ser o resultado do balanço entre síntese
e destruição, estes achados indicaram que a inibição da atividade de ciclooxigenase pode
potencialmente induzir a uma alteração vascular e remodelação extracelular, afetando o
movimento dentário ortodôntico (KYRKANIDES et al, 2000).
30
1.2.4 Prostaglandinas
Forças ortodônticas também estão associadas à indução do aumento dos níveis das
prostaglandinas (PGs) e leucotrienes, tanto nas células ósseas como nas periodontais. Juntos,
PGs e leucotrienes são potentes mediadores inflamatórios que levam a um aumento do fluxo
sanguíneo e permeabilidade capilar. A administração de injeções de prostaglandina PG
1
ou
PG
2
em humanos, macacos e ratos aceleraram o movimento dentário ortodôntico
(YAMASAKI, et al, 1984). Um grande problema da administração local das PGs é o
desconforto, já que as prostaglandinas são mediadores da dor. A maioria dos estudos com
prostaglandinas E
2
tem demonstrado um aumento no risco de reabsorção radicular
proporcional ao aumento no ritmo do movimento dentário (LEIKER et al, 1995). A
prostaglandina E
1
foi usada para testar o aumento do movimento dentário ortodôntico em
animais. Uma dose de 10 µg/dia por 14 dias, aumentou a quantidade de movimento dentário
ortodôntico, tendo tendência estatisticamente insignificante de aumento na reabsorção
radicular nos grupos tratados com PG
1
(SEKHAVAT et al, 2002). A prostaglandina é um
mediador da reabsorção óssea em um grande número de patologias, incluindo periodontite,
trauma e câncer. Entre as subclasses de prostaglandinas, a PGE é estreitamente relacionada
com a reabsorção óssea. O aumento da produção de PGE
2
por osteoblastos mecanicamente
deformados e fibroblastos gengivais foi demonstrado de forma clara (LEE et al, 2004).
1.3 Níveis dos mediadores inflamatórios no fluido gengival durante a movimentação
ortodôntica
O fluido do sulco gengival é um transudato que resulta da permeabilidade capilar dos
vasos do plexo dento-gengival. Esta permeabilidade está intimamente relacionada com a
extensão da inflamação gengival. Mesmo quando a gengiva parece sadia, bactérias estão
presentes no sulco e estimulam o fluxo do fluido gengival contendo baixos níveis de proteínas
plasmáticas. Vários estudos têm confirmado a teoria de que o fluido gengival é uma complexa
“sopa” que contém, em adição aos constituintes do fluido extracelular, enzimas das células
inflamatórias e do tecido conjuntivo, produtos da degradação tecidual e celular, e uma
variedade de citocinas pró-inflamatórias. Células intactas estão também presentes, como
31
células epiteliais, vindas do epitélio juncional, e leucócitos polimorfonucleares que migram
através dos espaços intercelulares do epitélio juncional. A concentração de muitos destes
constituintes no FG aumenta significativamente durante o movimento dentário ortodôntico
(GOODSON, 2003; GRIFFITHS, 2000; HEASMAN et al, 1996), quando elevações
significantes nas concentrações dos mediadores da inflamação, tais como as citocinas e
prostaglandinas, ocorrem temporariamente (KRISHNAN e DAVIDOVITCH, 2006)
Assim sendo, uma série de marcadores inflamatórios foram quantificados no FG
durante o movimento dentário ortodôntico em humanos. A grande vantagem do uso desse
fluido como amostra é que ele permite investigar, de forma não invasiva e longitudinal,
alterações nos níveis teciduais de mediadores inflamatórios durante a movimentação
ortodôntica (UEMATSU et al, 1996; BAŞARAN et al, 2006).
Em estudo feito com 10 pacientes ortodônticos pode ser constatado, com ELISA, que
os níveis de IL-1β e PGE
2
estiveram aumentados no fluido gengival de dentes sob
movimentação, 1 hora e 24 horas após a aplicação da força. Após sete dias os níveis
retornaram aos valores iniciais. Estes resultados demonstraram que os indutores de reabsorção
óssea PGE
2
e IL-1β, produzidos dentro do periodonto, são detectáveis no fluido gengival
durante as fases iniciais do movimento dentário e retornam aos valores iniciais após sete dias
(GRIEVE et al, 1994). Os níveis de IL-1β e PGE
2
foram quantificados no fluido gengival, nos
lados de tensão e pressão, de dentes sob movimentação dentária. Elásticos de separação foram
colocados mesialmente aos primeiros molares superiores e inferiores, e o fluido gengival foi
coletado nos tempos -7 dias, 0, 1 minuto após, 1 hora, 1 dia e 7 dias. Os resultados mostraram
que os níveis de IL-1β e PGE
2
estiveram aumentados, tanto no lado de tensão como no de
pressão, nos dentes com elástico. Nos dentes controle os níveis destes mediadores
mantiveram-se nos mesmos patamares durante todo o experimento (DUDIC et al, 2006).
O efeito de forças leves e contínuas e forças interrompidas sobre a os níveis de IL-1β e
PGE
2
foi avaliado em 10 pacientes submetidos à extração dos 1
os
pré-molares e retração dos
dentes caninos superiores. O fluido gengival foi coletado em 10 tempos durante três semanas.
Os resultados mostraram que nos dentes que receberam forças leves e contínuas, os níveis de
IL-1β e PGE
2
tiveram uma elevação significativa 24 horas após o início do movimento e
depois decresceram. Nos dentes submetidos à força interrompida, mas que foi reativada a
cada semana, os níveis de IL-1β aumentaram 24 horas após o inicio e houve grande aumento
24 horas após a primeira reativação. Os níveis de PGE
2
aumentaram significativamente 24
horas após e permaneceram altos por uma semana. A sinergia entre a expressão de PGE
2
e IL-
1β e o tipo de força aplicada não foi evidente após uma semana do ensaio. Ambos os lados,
32
com diferentes tipos de força, mostraram grande movimento comparados ao lado controle e
não houve diferença entre os lados testados. Pode ser concluído que uma mecânica bem
controlada, com reativações em tempos corretos, pode regular a secreção de IL-1β, mas
existem limitações no aumento destes mediadores em função de variações individuais (LEE et
al, 2004).
Através da técnica de hibridização in situ as expressões do RNA mensageiro da IL-
1β, IL-6 e TNF-α foram avaliadas após 3, 7 e 10 dias da aplicação da força ortodôntica. Pode
ser observado que o estímulo mecânico induziu à síntese de IL-1β e IL-6 com expressão
máxima 3 dias após a aplicação da força e a partir daí os valores declinaram. A expressão do
TNF-α não foi detectada tanto no dentes teste como nos dentes controle durante o período de
observação. Foi constatada a necessidade de melhor compreensão das bases moleculares das
comunicações célula-célula durante a remodelação induzida mecanicamente, e o melhor
conhecimento de outras citocinas e quimiocinas, que podem participar da remodelação óssea
durante o movimento dentário ortodôntico (ALHASHIMI et al, 2001).
Os níveis de expressão do TNF-α no fluido gengival de dentes caninos sob duas
diferentes técnicas de distalização, com forças contínuas e com forças pesadas intermitentes,
foram avaliados. A análise do fluido gengival foi feita com ELISA e os resultados
demonstraram que a concentração de TNF-α aumentou não significativamente após 24 horas e
declinou acentuadamente após sete dias no grupo submetido à força contínua. A força pesada
induziu rápida liberação de TNF-α e a resposta tecidual continuou por período de tempo mais
longo. Foi considerado que a força pesada deve ser cuidadosamente aplicada, para se prevenir
de eventuais efeitos indesejados da liberação excessiva deste mediador (KARACAY et al,
2007).
A quantificação de três mediadores inflamatórios, prostaglandina PGE
2
, interleucina
IL-6 e fator estimulador de colônia granulócito-macrófago GM-CSF foi realizada em
pacientes jovens e adultos sob movimentação ortodôntica. Foi coletado fluido gengival de
incisivos laterais superiores submetidos ao movimento de inclinação labial com arco
ortodôntico. A concentração de PGE
2
esteve significativamente elevada após 24 horas da
aplicação da força nos pacientes juvenis e nos adultos, enquanto que a concentração de IL-6 e
GM-CSF esteve aumentada apenas nos jovens. A quantidade total dos três mediadores no
fluido gengival aumentou significativamente no tempo 24 horas, nos dois grupos. Concluiu-se
que no início do movimento dentário nos jovens, os níveis dos mediadores expressam maior
intensidade que nos adultos, o que estaria coerente com o fato de que o movimento dentário
nos jovens é mais rápido que nos adultos, e inicia-se sem demora (REN et al, 2002).
33
As variáveis velocidade e início do movimento dentário, e a quantificação das
interleucinas IL-1β e IL-1RA foram estudadas em 6 pacientes em crescimento e 4 adultos. Os
casos tratados com extrações de 1
os
pré-molares, tiveram os dentes caninos superiores
retraídos com arco segmentado, com diferentes intensidades de força. Foram empregados 18,
60, 120 e 240 gramas de força para retração dos caninos, distribuídos aleatoriamente pelos
diferentes pacientes. Foi observado que houve diferenças entre os indivíduos na velocidade de
translação dos caninos, com movimento sendo possível com intensidade de força de 18 a 120
gramas. A demora na translação dentária foi observada nos caninos submetidos a 240 gramas
de força. A velocidade de translação dentária foi significativamente maior nos pacientes com
crescimento e esteve associada ao aumento na concentração de IL-1β e IL-1RA (IWASAKI et
al, 2000).
O metabolismo de peptidases desempenha importante papel na modulação dos níveis
de neuropeptídeos biologicamente ativos, quando a substância P é componente do fluido
gengival, pode potencializar o processo inflamatório no movimento dentário ortodôntico. Os
níveis de substância P e IL-1β no fluido gengival foram quantificados, através de ELISA, em
nove pacientes submetidos à retração de dentes caninos. No experimento, foi utilizada uma
força de 250 gramas derivada de elástico em cadeia. Os tempos de coleta do FG, lados de
pressão e tensão, foram: antes do início da aplicação da força, e após 1 hora, 4 horas, 8 horas,
72 horas, 120 horas e 168 horas. Após a ativação da força foram encontradas diferenças
significativas entre os lados controle e teste. Os valores de substância P e IL-1β estiveram
maiores após 8, 24 e 72 horas. Entretanto, não houve diferença entre os lados controle e
experimental no tempo 168 horas. Foi concluído que a substância P e a IL-1β estariam
envolvidas na inflamação periodontal como resposta ao estresse mecânico (YAMAGUCHI et
al, 2006).
Doze pacientes ortodônticos com necessidade de extração dos 1
os
pré-molares tiveram
os caninos retraídos com elásticos em cadeia, com 250 gramas de força, e os níveis de
citocinas presentes no fluido gengival quantificados com ELISA. Os mediadores estudados
foram: interleucinas IL-1β e IL-6, fator de necrose tumoral TNF-α, fator de crescimento
epidermal EGF, e β
2
microglobulina. A concentração de todos os mediadores esteve
aumentada 24 horas após a aplicação da força ortodôntica e sugeriu que a alteração nos níveis
das citocinas esteve associada com o processo de remodelação óssea necessária à
movimentação dentária (UEMATSU et al, 1996).
Os níveis de IL-8 foram avaliados durante a aplicação de forças ortodônticas sobre
dentes caninos superiores e inferiores em casos tratados com extrações de 1
os
pré-molares. Os
34
dentes superiores foram retraídos com força de 115 gramas e os inferiores com 90 gramas,
com arcos segmentados. Os tempos de coleta do fluido gengival, nos lados de tensão e
pressão, foram: imediatamente antes da aplicação da força, após 1 hora, 24 horas, 6 dias, 10
dias e 30 dias. Embora tenha havido um aumento na concentração de IL-8, analisado com
ELISA, no lado de tensão após 1 hora, 24 horas, 6 dias e 10 dias, um declínio foi observado
após 30 dias. O lado de pressão não demonstrou este aumento em qualquer período, exceto no
tempo 10 dias. A concentração de IL-8, em ambos os lados diminuiu e os valores se
aproximaram, no tempo 30 dias. A resposta local à força ortodôntica parece aumentar os
níveis de IL-8 e acúmulo de neutrófilos nos estágios iniciais da movimentação (TUNCER et
al, 2005).
Os níveis no FG de diversas enzimas também foram quantificados durante o
movimento dentário ortodôntico. Um aumento nos níveis de lactato dehidrogenase (LDH) no
fluído gengival de dentes sob movimentação ortodôntica quando comparados aos dentes
controle (sem movimentação) também foi relatado. Além disso, foram encontrados pequenos
aumentos nos níveis de aspartato aminotransferase (PERINETTI et al, 2003; PERINETTI et
al, 2005). A atividade da fosfatase alcalina (ALP) no sulco gengival também pode ser afetada
pelas forças derivadas do tratamento ortodôntico e, nos dentes sob movimento, os níveis
estavam significativamente elevados no lado de tensão comparados com o lado de
compressão (PERINETTI et al, 2002).
Ao empregar 100 gramas de força para retração dos dentes caninos, em casos tratados
com extrações, puderam ser verificadas mudanças nos níveis da fosfatase alcalina no sétimo,
décimo quarto, e vigésimo primeiro dias após o inicio da retração. O pico do aumento da
atividade ocorreu no 14
o
dia seguido de uma significativa queda, especialmente no lado de
tensão (BATRA et al, 2006).
É preciso considerar o fato de que o paciente ao estar utilizando acessórios
ortodônticos pode contribuir para o aumento da placa bacteriana e inflamação gengival, que
estaria relacionado ao aumento da atividade enzimática em todos os sítios (PERINETTI et al,
2003; PERINETTI et al, 2005). A limpeza dos dentes com aparelhagem ortodôntica é
dificultada e a escovação pode ser auxiliada, em situações especiais como nos pacientes que
se submeteram a cirurgia ortognática, com um controle químico da placa bacteriana. O melhor
produto para controle da gengivite, em pacientes ortodônticos, é a clorexidina. O gluconato de
clorexidina a 0.12% é um importante agente terapêutico no controle da inflamação,
sangramento gengival e acúmulo de placa em pacientes ortodônticos (BOYD, 2004;
BRIGHTMAN et al, 1991).
35
Os níveis dos mediadores inflamatórios interleucina-1β (IL-1β) e da enzima β-
glucuronidase (βG) foram quantificados no fluido do sulco gengival de pacientes sob
expansão rápida da maxila. Quatro semanas antes da instalação do aparelho expansor Hyrex
os pacientes receberam profilaxia, instruções de higiene oral e iniciaram bochechos com
clorexidina. Os pacientes foram observados a cada sete dias durante o período de ativação (21
dias) e mais uma semana, na fase de estabilização. O tempo total de observação foi de 28 dias.
O estudo demonstrou que os níveis dos mediadores inflamatórios diminuíram após o regime
de controle de placa bacteriana e que forças ortodônticas leves (elásticos de separação) e
pesadas (expansor) induziram aumento nos níveis de IL-1β e βG no fluido gengival. Os
achados sustentam a hipótese de que o estímulo mecânico causa uma reação inflamatória
dentro dos tecidos periodontais, que por sua vez dispara o processo biológico associado com a
remodelação óssea. (TZUNNETOU et al, 1999).
36
2 PROPOSIÇÃO
Este estudo tem como proposta analisar a composição do fluido gengival nas áreas de
pressão e tensão de caninos superiores submetidos à movimentação ortodôntica. Tendo como
objetivos específicos:
1 – Quantificar, em diferentes intervalos de tempo, as alterações no volume do fluido
gengival;
2 – Quantificar a presença das metaloproteinases da matriz - MMP-9, MMP-13 e
MMP-3;
3 – Detectar a presença das quimiocinas – proteína inflamatória de macrófago 1β
(MIP-1β), proteína quimiotática para monócitos 1 (MCP-1) e a citocina regulada sob ativação,
expressa e secretada por células T normais (RANTES).
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Seleção de Pacientes
Participaram nesse estudo 14 pacientes da clínica do curso de especialização em
Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A
seleção dos pacientes não obedeceu a critérios relacionados a idade, sexo, raça ou
classificação de maloclusões, exceto que todos tinham indicação de extração dos primeiros
pré-molares superiores como parte do planejamento do tratamento ortodôntico. Estes
pacientes foram informados das características e dos objetivos do presente trabalho, e
assinaram um termo de consentimento pós-informado (anexo 1, página 73; aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Pedro Ernesto da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro – anexo 2, página 74). O grupo de pacientes era composto de 3 homens e 11 mulheres
(18,8 ± 4,8 anos; variação de 12 a 28 anos).
3.2 Dispositivo ortodôntico
Nos caninos e segundos pré-molares foram colados bráquetes 0.022” x 0.028”
(Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) e confeccionados e cimentados anéis nos primeiros molares
com tubos triplos 0.055” x 0.022” x 0.028” (Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) soldados por
vestibular e tubos 2 x 0.036” (Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) por palatina. Os pré-molares
foram extraídos com no mínimo 20 dias de antecedência à retração dos caninos. Os caninos
foram retraídos em um arco segmentado 0.017”x 0.025” confeccionado com fio TMA
(Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) com alça vertical, ativada por mola de Niti (Morelli, Sorocaba,
SP, Brasil) gerando uma força de 150g, medida com tensiômetro (Dentaurum, Ispringen,
Alemanha). Um fio auxiliar passivo foi amarrado no tubo dos primeiros molares e bráquetes
dos segundos pré-molares superiores (IWASAKI et al, 2000; IWASAKI et al, 2005). O
recurso auxiliar de ancoragem foi feito com barra transpalatina conectando os primeiros
molares superiores, com fio de calibre 0.032” (Morelli, Sorocaba, SP, Brasil).
38
3.3 Monitoramento Clínico
Os exames clínicos incluíram: (1) Índice de Placa (IP); (2) Índice Gengival (IG); O
exame periodontal foi realizado por um único examinador previamente calibrado. As medidas
de IP e IG foram determinadas com uma sonda periodontal manual do tipo Goldman-
Fox/Williams (Hu-Friedy, Chicago - IL, EUA). As medidas foram realizadas nos 6 sítios de
todos os dentes (mesio-vestibular, médio-vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, médio-
lingual e disto-lingual) em todas as consultas da realização do estudo. Sete dias anteriores ao
início da aplicação da força ortodôntica, os pacientes receberam instruções de higiene oral, e
foram orientados a escovarem os dentes com escova específica (Oral-B, São Paulo-SP,
Brasil), a utilizarem um mesmo dentifrício Colgate Total 12 (Colgate/Palmolive, São
Bernardo do Campo-SP, Brasil) e a bochecharem com clorexidina a 0,12% (Noplak, Lab.
Daudt, Rio de Janeiro-RJ, Brasil) duas vezes ao dia por quatro semanas consecutivas.
3.4 Monitoramento Imunológico
3.4.1 Coleta de amostras de fluido gengival (FG)
Foram coletadas amostras das faces mesial e distal dos caninos superiores de cada
paciente, em 7 intervalos de tempo. A primeira coleta foi feita 7 dias antes do início da
aplicação da força ortodôntica, chamado tempo -7d. A segunda coleta no dia da aplicação da
força, chamado tempo 0. A terceira, uma hora após a aplicação da força, chamado tempo 1h.
A quarta, vinte e quatro horas após a aplicação da força, chamado tempo 24 hs. A quinta, duas
semanas após a aplicação da força, chamado tempo 14d. A sexta, três semanas após a
aplicação da força, chamado tempo 21d. E a sétima, 80 dias após a primeira aplicação da
força, chamado tempo 80d.
Os sítios coletados foram isolados com rolos de algodão, secos com ar e a placa
supragengival removida com cureta (Hu-Friedy, Chicago - IL, EUA) . Uma tira padrão de
papel absorvente (Periopaper, IDE Interstate, Amityville, NY) foi introduzida no sulco
39
gengival, até certa resistência ser sentida e foi deixada em posição por 30 segundos. O volume
do FG foi imediatamente determinado através da utilização do medidor de FG previamente
calibrado (Periotron 8000, IDE Interstate, Amityville, NY). As pinças do eletrodo eram
limpas e secas e o monitor digital zerado após cada medição. As tiras de papel foram
colocadas individualmente em tubos Eppendorf e armazenadas a -80
o
C até análise.
3.4.2 Multianálise imunoenzimática com microesferas
A metodologia da multianálise imunoenzimática consiste na utilização de conjuntos de
microesferas (beads) que têm adicionados anticorpos de captura para análises individuais.
Dois conjuntos foram utilizados: um para metaloproteinases – Human 3-Plex MMP Antibody
Bead Kit e outro para quimiocinas – Human MCP-1, MIP-1β, RANTES Antibody Bead Kit
(BioSource International, Califórnia, CA).
Placas de filtração e ensaio de 96 poços (BioSource International, California, CA)
foram utilizadas.
As placas foram preparadas da seguinte forma:
1- Pré-lavagem dos poços designados para análise. Um volume de 0,2 ml da solução de
lavagem foi adicionado aos poços da placa de exame. Após 30 segundos foi feita a aspiração
com sugador a vácuo;
2- A solução contendo as beads foi posta em um vibrador por 30 segundos e em seguida em
um aparelho de ultra-som por mais 30 segundos;
3- Foram adicionados 25 μl da solução contendo as beads em cada poço da placa de ensaio.
Após as beads serem adicionadas à placa, esta foi recoberta com folha de alumínio, para
minimizar a exposição à luz;
4- Foi adicionado 0,2 ml da solução de lavagem à cada poço e após 15 a 30 segundos de
impregnação das beads, a solução de lavagem foi aspirada com o sugador a vácuo. Esta etapa
foi repetida mais uma vez e o filtro da parte inferior da placa sendo seco com papel toalha
para remover líquidos residuais;
5- Foi adicionado 50 μl do tampão de incubação em cada poço.
6- Nos poços designados para confecção da curva padrão foi adicionado 100 μl da diluição
padrão proveniente do kit de análise;
40
7- Nos poços designados para análise foi adicionado 50 μl do Assay Diluent, seguido de 50 μl
da amostra;
8- A placa foi recoberta com folha de alumínio e posta para incubar em um agitador orbital
por 2 horas, a 350 RPM, à temperatura ambiente. A velocidade de mistura deveria ser
suficiente para manter as beads suspensas durante a incubação;
9- Após as 2 horas de incubação, o líquido dos poços foi removido por aspiração a vácuo.
10- Foi adicionado 0,2 ml da solução de lavagem, e após 30 segundos de contato com as
beads, foi aspirado com o sugador a vácuo. Esta etapa foi repetida mais uma vez.
11- Foi adicionado em cada poço 100 μl de uma solução contendo o anticorpo de detecção
biotinilado e a placa colocada para incubar por 1 hora à temperatura ambiente em um agitador
orbital (350 RPM);
12- Após 1 hora de incubação, o líquido dos poços foi removido por aspiração a vácuo e a
placa lavada duas vezes com 200 μl/poco de solução de lavagem.
13- Foi adicionado 100 μl de uma solução de estreptavidina conjugada a uma proteina
fluorescente (R-phycoerythrin) e a placa colocada para incubar por 30 minutos à temperatura
ambiente em um agitador orbital (350 RPM).
14- Após a incubação o líquido da placa foi removido por aspiração e as beads lavadas 3
vezes com 0.2 ml da solução de lavagem.
15- Foram adicionados 100 μl da solução de lavagem em cada poço. A placa foi colocada no
misturador orbital por 3 minutos a 350 RPMs, para resuspender as beads e em seguida a placa
foi levada para análise no Luminex 100
®
(Luminex Corporate, Austin, TX).
3.4.3
Luminex 100
®
Uma vez inserida na plataforma de encaixe da placa de 96 poços do Luminex 100
®
, o
processo de leitura é obtido através de dois feixes de lasers. Um primeiro feixe de laser
identifica as propriedades espectrais das beads, permitindo o monitoramento simultâneo de
até 100 alvos diferentes. O segundo laser excita a R-phycoerythrin presente na superficie das
beads, e a intensidade da fluorescência é medida e reportada num computador acoplado ao
Luminex 100 usando um software especifico (MasterPlex® CT v1.0, MiraiBio, San
Francisco, CA). Cerca de 100 beads por alvo foram analisadas e a mediana da intensidade de
41
fluorescência reportada. As medidas de fluorescência para a curva padrão foram plotadas
contra as concentrações dos diversos mediadores e regressão linear utilizada para calcular a
concentração das amostras de FG.
3.5 Tratamento estatístico
O teste não paramétrico de Friedman foi usado para testar a significância das
diferenças ao longo do tempo. O volume de FG foi comparado nos diferentes intervalos de
tempo, usando o teste de Dunn de comparação múltipla. A significância das diferenças nos
níveis das MMPs entre os diferentes tempos de monitoramento (ex: -7 vs. 0; 0 vs. 1h, 1h vs.
24h, etc) foi investigada usando o teste de Dunn de comparação múltipla.
5 RESULTADOS
no volume de fluido gengival ao longo do tempo:
final
42
4 RESULTADOS
4.1 Clínicos
Apesar das diferentes posições iniciais dos caninos superiores, em todos os pacientes
da amostra puderam ser observados movimento de distalização, com magnitudes
diferenciadas.
4.2 Mudanças no volume de fluido gengival ao longo do tempo
A figura 1 apresenta a média dos volumes de FG em μl nos lados Pressão (n = 14) e
Tensão (n = 14) ao longo do tempo. Os resultados demonstraram que houve uma alteração
significativa do volume de FG ao longo do tempo tanto no lado de pressão (p < 0,001) quanto
no lado de tensão (p < 0,01). No lado pressão, o volume de FG foi significativamente menor
nos tempos 0 (p < 0,01) e 24h (p < 0,001) comparados com o tempo 80d, usando o teste de
Dunn de comparação múltipla.
Tensão
Pressão
FG vol. (
µ
l)
p
< 0,001
p
< 0,01
Figura 1 - Gráfico das alterações das médias do volume do FG nas áreas
de pressão e tensão ao longo do tempo.
** p < 0,01 e *** p < 0,001.
43
4.3 Mudanças nos níveis de MMPs ao longo do tempo:
As figuras 2, 3 e 4 demonstram as alterações ao longo do tempo nos níveis médios das
MMPs 3, 13 e 9, respectivamente (n = 10). O teste não paramétrico de Friedman foi usado
para testar a significância das diferenças ao longo do tempo. Para as três MMPs, ocorreram
alterações significativas ao longo do tempo no lado de pressão, ao passo que as flutuações no
lado de tensão não foram estatisticamente significativas. Nenhum dos resultados foi
estatisticamente significativo para nenhuma das MMPs. Para as MMPs 3 e 13 os dados estão
expressos em média de picogramas para as duas amostras de cada tipo de sítio (pressão ou
tensão). No caso da MMP-9, os dados correspondem a média para as duas amostras de cada
tipo de sítio da “mediana de intensidade de fluorescência”. Essa unidade resulta da medida da
fluorescência de 100 microesferas durante o processamento das amostras no Luminex 100
®
.
Os dados não puderam ser convertidos para picogramas porque os níveis de MMP-9 estavam
acima do maior valor da curva padrão do Luminex 100
®
; 42 ng/ml o que corresponde a 8.400
pg/sítio.
Cabe notar que mesmo quando os dados das MMPs 3 e 13 foram convertidos para
concentração em pg/μl de fluido (figuras 5 e 6), a tendência de elevação dessas MMPs no
tempo 1h se manteve. Isso sugere que essa elevação não pode ser justificada meramente pelo
aumento de volume do fluido gengival, e teve que envolver aumento na produção e ou
liberação dessas MMPs no tecido conjuntivo gengival. Embora essa elevação não tenha sido
estatisticamente significativa, se calcularmos o tamanho da amostra necessária para detectar
uma diferença idêntica a presente na nossa amostra para a MMP-13 total entre os tempos 0 e
1h, no lado de pressão, com α = 0,05 e poder de 80%, obtemos que com 16 indivíduos essa
diferença seria significativa. Devido a problemas técnicos com o Luminex 100
®
, nossa
amostra final para as MMPs foi de 10 indivíduos.
al
44
TensãoPressão TensãoPressão
Figura 2 – Gráfico da quantidade total de MMP-3, em picogramas (pg), durante os diferentes
intervalos de tempo da movimentação ortodôntica.
TensãoPressão TensãoPressão
Figura 3 – Gráfico da quantidade total de MMP-13, em picogramas (pg), durante os diferentes
intervalos de tempo da movimentação ortodôntica.
45
Mediana de intensidade de fluorescência
TensãoPressão
Mediana de intensidade de fluorescência
TensãoPressão
Figura 4 – Gráfico da mediana de intensidade de fluores
TensãoPressão
MMP-3 pg/µl MMP-3 pg/µl
TensãoPressão TensãoPressão
MMP-3 pg/µl MMP-3 pg/µl
cência de MMP-9 durante os
iferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica.
MMP-3 (pg/µl) durante os diferentes intervalos de
mpo da movimentação ortodôntica.
final
d
Figura 5 – Gráfico da concentração de
te
46
MMP-13 pg/µl MMP-13 pg/µl
TensãoPressão
MMP-13 pg/µl MMP-13 pg/µlMMP-13 pg/µl MMP-13 pg/µl
TensãoPressão
Figura 6 – Gráfico da concentração de MMP-13 (pg/µl) durante os diferentes intervalos de
tempo da movimentação ortodôntica.
4.4 Mudanças nos níveis de quimiocinas ao longo do tempo:
Os resultados mostraram que as quimiocinas proteína inflamatória de macrófago 1β
(MIP-1β), proteína quimiotática para monócitos 1 (MCP-1) e a citocina regulada sob ativação,
expressa e secretada por células T normais (RANTES) foram expressas no sulco gengival em
todos os diferentes intervalos de tempo analisados. Porém, diversas amostras estavam abaixo
do nível de detecção do ensaio. Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram a quantidade
total, expressa em picogramas (pg) e o percentual de sítios onde estas moléculas foram
detectadas. As figuras 7, 8 e 9 ilustram as alterações nos níveis das quimiocinas ao longo do
tempo. O teste não paramétrico de Friedman foi usado para testar a significância das
diferenças ao longo do tempo. Nenhuma das flutuações das quimiocinas ao longo do tempo
foi significativa, tanto no lado de pressão quanto no lado de tensão.
final
47
Tabela 1 – Quantidade total, expressa em picogramas (pg), de proteína inflamatória de macrófago 1β (MIP-1β), proteína quimiotática para
monócitos 1 (MCP-1) e a citocina regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais (RANTES).
Tensão
Tempo -7 d 0 1 h 24 h 14 d 21 d 80 d
MCP (pg)
0.12
+ 0.14 0.10 + 0.20 0.06 + 0.09 0.12 + 0.28 0.09 + 0.17 0.04 + 0.06 0.11 + 0.13
MCP % sitios +
43 21 21 29 21 21 43
MIP (pg)
1.74
+ 2.74 1.07 + 2.66 1.28 + 3.36 1.04 + 1.34 1.52 + 3.02 0.53 + 0.57 0.65 + 0.77
MIP % sitios +
71 50 57 64 64 64 57
RANTES (pg)
0.14
+ 0.19 0.11 + 0.22 0.09 + 0.23 0.11 + 0.25 0.15 + 0.23 0.03 + 0.07 0.11 + 0.24
RANTES % sitios +
43 21 21 21 43 14 29
Pressão
Tempo -7 d 0 1 h 24 h 14 d 21 d 80 d
MCP (pg)
0.11
+ 0.13 0.07 + 0.08 0.08 + 0.11 0.05 + 0.08 0.05 + 0.07 0.06 + 0.13 0.09 + 0.17
MCP % sitios +
36 43 36 29 21 14 29
MIP (pg)
1.47
+ 2.69 1.12 + 2.38 0.58 + 0.84 0.69 + 0.66 0.63 + 0.86 0.80 + 1.61 0.56 + 1.14
MIP % sitios +
64 43 57 71 64 57 43
RANTES (pg)
0.36
+ 0.46 0.04 + 0.12 0.15 + 0.19 0.18 + 0.39 0.07 + 0.12 0.18 + 0.34 0.11 + 0.30
57 7 43 29 21 29 21
RANTES % sitios +
% Sítios + : Porcentagem de sítios positivos para a molécula
52
48
Pressão
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
1
10
100
MIP
Tempo
Picogramas
(Escala logarítmica)
Tensão
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.01
0.1
1
10
100
MIP
Tempo
Pressão
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
1
10
100
MIP
Tempo
Picogramas
(Escala logarítmica)
Tensão
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.01
0.1
1
10
100
MIP
Tempo
Figura 7 – Gráfico da quantidade total de MIP-1β, em picogramas (pg), durante os diferentes
intervalos de tempo da movimentação ortodôntica.
Pressão
Tensão
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
1
10
MCP
Tempo
Figura 8 – Gráfico da quantidade total de MCP-1, em picogramas (pg), durante os diferentes
tervalos de tempo da movimentação ortodôntica.
in
1
0.1
0.01
0.001
-7d 0 1h 24h
10
MCP
Tempo
Picogramas
(Escala logarítmica)
14d 21d 80d
49
Pressão
Figura 9 – Gráfico da quantidade total de RANTES, em picogramas (pg), durante os
diferentes intervalos de tempo da movimentação ortodôntica.
Tensão
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
1
10
RANTES
Tempo
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
1
10
RANTES
Tempo
s
(E mica)
Pressão
Tensão
Picograma
scala logarít
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
1
10
RANTES
Tempo
1
-7d 0 1h 24h 14d 21d 80d
0.001
0.01
0.1
10
RANTES
Tempo
s
(E mica)
Picograma
scala logarít
50
5 DISCUSSÃO
A essência do tratamento ortodôntico está em movimentar os dentes através do osso
lveolar. Um movimento dentário preciso e controlado pode ser otimizado com o uso de uma
ecânica apropriada e conhecimento das subseqüentes respostas teciduais. Embora a arte de
se movimentar dentes esteja sendo praticada há muito tempo, o exato mecanismo pelos quais
s forças ortodônticas orquestram o movimento dentário não é totalmente compreendido
l, 1983).
este estudo o dispositivo descrito por IWASAKI (IWASAKI et al, 2000; IWASAKI
et al, 2005) mostrou-se efetivo para distalização dos caninos. O dispositivo de tracionamento,
confec
uais considerados ideais (REN et al, 2003). Foram utilizadas 150g
para re
tanto, os níveis destas moléculas quantificadas no fluido gengival, proporcionam
uma m
a
m
a
(MOSTAFA et a
N
cionado com arco segmentado, pode ser adaptado às diferentes posições iniciais dos
caninos dos pacientes da amostra, sem que houvesse necessidade de um nivelamento prévio.
Por se tratar de tracionamento com arco segmentado, o problema da fricção fio/bráquete foi
minimizado (RABOUD et al 1997; SIATKOWSKI, 1997; HAYASHI et al, 2004). O controle
da intensidade da força foi realizado de forma cuidadosa, a despeito da dificuldade em se
estabelecer valores individ
tração de cada canino, estando de acordo com trabalhos prévios (STOREY e SMITH,
1952; SMITH e STOREY, 1952). Durante o período do experimento, os pacientes não
relataram sensibilidade dolorosa como reação desagradável à terapia ortodôntica. Mesmo com
o controle de força sendo feito de forma efetiva, pode ser observada uma tendência à
inclinação da coroa ao invés de um movimento de translação propriamente dito. No entanto,
esta inclinação desfavorável pode ser corrigida nas etapas subseqüentes do tratamento
ortodôntico.
A aplicação de uma força ortodôntica sobre o dente, como durante a retração dos
caninos, causa um deslocamento gradual dos fluidos do ligamento periodontal, acompanhado
pela distorção das células e da matriz extracelular (GRIEVE et al, 1994). Amostras de tecido
do ligamento periodontal ou do osso alveolar, sob o processo de reabsorção durante o
movimento dentário, não podem ser obtidas em humanos. Embora a localização de citocinas e
mediadores inflamatórios no ligamento periodontal de animais possa ser acompanhada por
técnicas de imunohistoquímica, em humanos é necessário o emprego de um método não
invasivo. Por
edição indireta das mudanças que ocorrem nos tecidos periodontais, durante a
movimentação ortodôntica. A hipótese de que a compressão do ligamento periodontal resulta
51
na migração dos produtos bioquímicos para o sulco gengival é a base para o desenho
experimental de muitos trabalhos investigando a biologia do movimento dentário ortodôntico
(BAŞARAN et al, 2006).
Estudos prévios sugeriram que o fluxo do fluido gengival reflete as mudanças dos
tecidos periodontais mais profundos, como osso alveolar e ligamento periodontal, de dentes
sob a ação do tratamento ortodôntico (GRIEVE et al, 1994; HEASMAN et al, 1996;
IWASAKI et al, 2000; KRISHNAN e DAVIDOVITCH, 2006; MASELLA e MEISTER,
2006). O aumento do fluxo do fluido pode ser constatado em dentes sob movimentação
ortodôntica, assim como sua redução durante a fase de contenção do tratamento ortodôntico,
quando os movimentos dentários cessaram (PENDER et al, 1994). Esta oscilação do volume
do fluido gengival em dentes sob estresse mecânico seria uma alteração associada ao início de
um pro
adas instruções de higiene oral e iniciado uma terapia de bochechos diários com
glucon
cesso inflamatório subseqüente. Processo inflamatório que estaria envolvido na cascata
de eventos necessários ao movimento dentário ortodôntico (CONSOLARO, 2005;
HEASMAN et al, 1996; IWASAKI et al, 2000; KRISHNAN e DAVIDOVITCH, 2006;
MASELLA e MEISTER, 2006). A direção do fluxo do fluido gengival em dentes sob estresse
mecânico, seria da área de pressão para a área de tensão, tanto apical como coronalmente em
direção ao sulco gengival. A compressão do ligamento periodontal estaria associada ao
aparecimento de mediadores bioquímicos liberados pelas células que seriam detectados no
fluido gengival. Além do que, o efeito da força ortodôntica sobre o ligamento periodontal é
rápido, com as modificações ocorrendo minutos após sua aplicação (SUGIYAMA et al,
2003).
Neste estudo a alteração no volume do fluido gengival mostrou uma oscilação ao
longo do tempo. No tempo -7d, quando os pacientes apresentavam seus padrões próprios de
higiene bucal, os valores de leitura do Periotron
®
mostraram índices indicativos de presença
de inflamação suave no tecido gengival, com valores maiores no sítio de pressão,
possivelmente em virtude de maior dificuldade de higienização da face distal dos caninos.
Estes valores estiveram de acordo com estudo prévio que quantificou o volume de fluido
gengival em pacientes portadores de gengivite (GOODSON, 2003). No tempo 0, quando
foram d
ato de clorexidina, o volume do fluido gengival foi reduzido e as leituras do Periotron
®
mostraram valores mais baixos, sem diferenças entre os lados de pressão e tensão. Uma hora
após a aplicação da força ortodôntica, o volume do fluido gengival aumentou no lado de
pressão, apesar de um efetivo controle da placa bacteriana. No tempo 24hs houve uma
redução no volume do fluido no lado de pressão, que retomou valores elevados nos dias 14 e
52
21 e, aumentando ainda mais entre os dias 21 e 80, quando foi suspensa a utilização da
clorexidina. No lado de tensão houve apenas uma pequena flutuação no volume de fluido
gengival, que apresentou uma tendência de elevação no último período de acompanhamento
(entre os dias 21 e 80). Este achado pode ser visto no estudo de TUNCER e cols, no lado de
tensão, e consideraram ser decorrente do estágio inicial de uma resposta inflamatória a um
trauma mecânico (TUNCER et al, 2005).
O fluido do sulco gengival é um transudato derivado do soro que banha o sulco
gengival ou a bolsa periodontal, e que segue um gradiente osmótico dos tecidos locais.
Durante o estabelecimento da doença periodontal, esse fluido se converte num exsudato
inflamatório. À medida que este fluido sai da microcirculação do hospedeiro, passa através
dos tecidos inflamados, e acaba no interior da bolsa periodontal, ele captura mediadores
envolvidos na resposta inflamatória e subprodutos do metabolismo do tecido local. Estes
constituintes no fluido do sulco gengival podem ser colhidos de uma forma não invasiva em
tiras de filtro de papel, quantificados e qualificados utilizando-se uma série de métodos.
Divers
identificadas no fluido do sulco gengival, e os níveis
enzimá
os desses marcadores presentes no fluido gengival foram medidos durante o
movimento ortodôntico, incluindo metabólitos do ácido aracdônico (PGE
2
), citocinas,
colagenases, metabólitos derivados da catepsina, proteases neutras, β-glucoronidase, aspartato
aminotransferase e fosfatase alcalina (ALHASHIMI et al, 2001; BAŞARAN et al, 2006;
BATRA et al, 2006; CARLOS et al, 2006; GRIEVE et al, 1994; ISIK et al, 2005; IWASAKI
et al, 2005; KARACAY et al, 2007; LEE et al, 2004; PERINETTI et al, 2002; PERINETTI et
al, 2003; PERINETTI et al, 2005).
As metaloproteinases da matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas que participam da
degradação do colágeno e outras moléculas da matriz extracelular. MMPs geralmente são
classificadas em diferentes subgrupos, que incluem as gelatinases (MMP-2 e MMP-9),
colagenases (MMP-1, MMP-8, e MMP-13), estromelisinas (MMP-3, MMP-10, e MMP-11),
MMPs associadas à membrana (MT1-6 MMPs), e outros tipos (MASSOVA et al, 1998). Os
níveis de expressão destas MMPs são regulados pelos mediadores pró-inflamatórios, tais
como as prostaglandinas (PGs) e as interleucinas (ILs) (TAKAHASHI et al,2006).
Colagenases ativas têm sido
ticos parecem aumentar linearmente com a intensidade da inflamação gengival
(LINDHE, 1999; PERINETTI et al, 2003; PERINETTI et al, 2005). Nos dentes em
movimento, estas enzimas são expressadas pelos cementoblastos, osteoblastos e fibroblastos.
Dependente da cinética do movimento, os cementoblastos expressam a MMP-9 em estágios
iniciais, enquanto os osteoblastos respondem mais tarde (TAKAHASHI et al, 2006). Isto está
53
de acordo com estudo prévio analisando a MMP-8 (TAKAHASHI et al, 2003). As fibras do
ligamento periodontal são danificadas por estresse mecânico localizado, na borda de tecido
duro e
a detecção das MMP-9, MMP-13 e MMP-3. Tendo havido oscilação nos seus índices
durante
ovavelmente associada à presença de neutrófilos no sulco gengival. Os níveis
de MM
a biológica
imedia
no tecido mole do ligamento periodontal, dano este causado pela aplicação da força
ortodôntica. Isto provoca uma ruptura física das fibras colágenas, que são removidas e
reconstruídas no processo de reparo tecidual durante e após o movimento dentário
(HEASMAN et al, 1996; KRISHNAN e DAVIDOVITCH, 2006; MEIKLE, 2006; NORTON,
2000).
Neste estudo procuramos quantificar três diferentes metaloproteinases da matriz,
representando três diferentes subgrupos: a MMP-3 do grupo das estromelisinas, a MMP-9 do
grupo das gelatinases e a MMP-13 do grupo das colagenases (WOLF et al, 2005). Essas
MMPs foram escolhidas para investigação por estarem envolvidas em diferentes fases da
remodelação do colágeno e catalizarem a degradação inicial da maioria das matrizes proteicas
extracelulares.
Foi possível observarmos que a multianálise imunoenzimática com microesferas foi
efetiva n
o período de observação da movimentação dentária (Figuras 2-4). Apesar dos gráficos
apresentarem curvas de aspecto semelhante, os níveis de expressão da MMP-9, que degrada
inúmeros substratos inclusive colágeno do tipo I, foram muito superiores, aos das MMP-3 e
MMP-13. Os altos níveis de expressão da MMP-9 estiveram além da curva padrão utilizada
no Luminex 100
®
com o Human 3-Plex MMP antibody Bead Kit. Esta alta quantidade de
MMP-9 está pr
P-13, que degrada colágeno do tipo I, II e III foram superiores aos da MMP-3, uma
estromelisina que tem a habilidade não só de degradar a matriz extracelular, como poder
ativar outras MMPs, incluindo MMP-1, -8, -9 e -13 (TERVAHARTIALA, 2003).
Na análise da evolução do tempo pode ser observado que houve oscilação nos níveis
da quantidade total de MMP-9, MMP-13 e MMP-3 durante o período de movimentação
dentária no lado de pressão (Figuras 2, 3 e 4). Houve redução nos índices das três MMPs do
tempo -7d para o tempo 0. Esta redução pode estar relacionada a uma oscilação na
quantificação das enzimas em dois diferentes intervalos de tempo, ou ser conseqüência da
melhora no padrão de higiene oral. Esta redução foi similar àquela encontrada na análise do
volume do fluido gengival, no mesmo intervalo de tempo. Do tempo 0 para o tempo 1h houve
uma tendência de aumento nos níveis das MMPs que pode ser resultante da respost
ta à aplicação da força ortodôntica. Do tempo 1h para o tempo 24hs houve uma
tendência de redução nos índices das MMPs quantificadas no sulco gengival, achado similar
54
ao lado de tensão. A hipótese provável seria a do consumo imediato das enzimas relacionadas
à degradação do colágeno induzida pelas forças ortodônticas, fazendo com que seus níveis
diminuíssem temporariamente. Do tempo 24hs para os tempos 14d, 21d e 80d houve aumento
progressivo nos níveis das MMPs confirmando os achados de outros trabalhos
(CANTARELLA et al, 2006; TAKAHASHI et al, 2003; TAKAHASHI et al, 2006).
No lado de tensão houve uma pequena flutuação nos níveis das MMPs no fluido
gengival ao longo do tempo. Apenas no tempo 24hs houve uma tendência de redução em
todas as MMPs. Uma hipótese para justificar esta redução seria o consumo das MMPs
presentes nos tecidos periodontais, responsáveis pelo contínuo processo de remodelação e que
seriam consumidas no estágio mais inicial do movimento dentário.
Do tempo 21d para o tempo 80d as três MMPs tiveram seus níveis aumentados. Neste
intervalo de tempo a retração dos caninos continuava de forma contínua e os pacientes haviam
interrompido a utilização da clorexidina, superpondo a inflamação gengival ao estresse
mecâni
ntração das MMPs. Nos
demais
a α incluem a interleucina-8
(IL-8)
como
co como agente desencadeador das enzimas proteolíticas.
Ao se considerar os achados da concentração das MMPs, podemos observar uma
flutuação menos acentuada nos diferentes intervalos de tempo. No lado de pressão, do tempo
0 para o tempo 1h, houve um aumento similar àquele visto na quantidade total, sugerindo uma
interdependência entre a quantidade de fluido gengival e a conce
tempos a concentração de MMPs manteve-se em patamares similares (Figuras 5 e 6).
Quimiocinas são citocinas quimioatraentes que formam uma larga família dividida em
4 grupos baseado em critérios estruturais, funcionais e genéticos. Incluem as CXC (família α),
CC (família β), linfotactinas, e neurotactinas. Membros da famíli
e a proteína inflamatória de macrófago 2 (MIP-2). A família β inclui a proteína
inflamatória de macrófago 1α (MIP-1α), a proteína inflamatória de macrófago 1β (MIP-1β), a
proteína quimiotática para monócitos 1 (MCP-1), e a citocina regulada sob ativação, expressa
e secretada por células T normais (RANTES). Estes são potentes agentes quimiotáticos para
monócitos, linfócitos e outros tipos celulares, como basófilos e eosinófilos. Quimiocinas, tais
MIP-1α, MCP-1 e RANTES, induzem a migração e o acúmulo de leucócitos nas
regiões inflamadas (EMINGIL et al, 2004; EMINGIL et al, 2005).
No presente estudo as quimiocinas MCP-1, MIP-1β e RANTES foram detectadas no
sulco gengival em todos os diferentes intervalos de tempo analisados, nas áreas de tensão e de
pressão (Tabela 1). O que confirmou a sensibilidade da multianálise imunoenzimática com
microesferas específicas para identificação destas moléculas. Porém, diversas amostras
55
estavam abaixo do nível de detecção do ensaio e, os níveis dessas quimiocinas no fluido
gengival, não parecem ser alterados pelas forças ortodônticas (Figuras 7, 8 e 9).
Na literatura ainda são poucos os trabalhos que associam as quimiocinas com o
movim
999).
icação
da forç
eterminados limites, os
osteocl
ento dentário. Um estudo feito com IL-8 mostrou aumento nos seus níveis no lado de
tensão do movimento dentário, nos estágios iniciais da aplicação da força ortodôntica, ao
passo que no lado de pressão não houve aumento (TUNCER et al, 2005). Em um modelo
animal em ratos usando hibridização in situ, a quimiocina MCP-1 mostrou máxima indução
três dias após a aplicação da força ortodôntica, seguida em intensidade pela RANTES e MIP-
2, sugerindo sua presença no início do movimento dentário (ALHASHIMI et al,1
MCP-1 e MIP-1β têm o efeito de recrutar e ativar as células alvo – monócitos. A
RANTES é um potente quimioatraente para eosinófilos, monócitos e células T. Estas
quimiocinas podem ter importante papel na resposta do hospedeiro pelo recrutamento de
células inflamatórias no foco de inflamação ativa, e pela indução da liberação de outros
mediadores celulares (EMINGIL et al, 2004; EMINGIL et al, 2005). Sua presença foi
evidenciada no fluido gengival de pacientes com periodontite crônica (GAMONAL et al,
2000). A literatura sugere que na cascata de eventos celulares que se inicia após a apl
a ortodôntica, há liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF-α e
estas citocinas irão induzir as quimiocinas como MCP-1, MIP-1β e RANTES. Estas
quimiocinas por sua vez irão ativar e recrutar células da linhagem monócitos/macrófagos.
Células residentes, como fibroblastos e osteoblastos, podem também ter participação na
indução de MCP-1, MIP-1β e RANTES (ALHASHIMI et al, 1999).
A remoção da zona de hialinização (necrose estéril) observada nas áreas de
compressão, durante o estágio inicial da aplicação da força ortodôntica, é produzida
principalmente pela ação fagocítica dos macrófagos. Nas zonas hialinizadas, as células não
conseguem se diferenciar em osteoclastos e não é possível ocorrer reabsorção óssea a partir da
membrana periodontal. Nesta fase o osso alveolar adjacente é removido por meio da
reabsorção indireta através da atividade osteoclástica, nas superfícies dos espaços medulares
adjacentes. Desde que a força ortodôntica seja mantida dentro de d
astos irão, subsequentemente, atacar a superfície óssea em uma área muito mais ampla,
e o movimento dentário se processará. (THILANDER et al, 2002)
Assim, o papel das quimiocinas na movimentação dentária ortodôntica estaria
associado ao fato desses mediadores estarem envolvidos na migração de monócitos para o
ligamento periodontal, aonde irão se diferenciar em osteoclastos e macrófagos, ambos os tipos
celulares essenciais para a movimentação ortodôntica.
56
Este estudo detectou as quimiocinas MCP-1, MIP-1β e RANTES, porém em valores
baixos, o que pode ser reflexo delas serem expressas primariamente no ligamento periodontal.
Enquanto que na quantificação das MMPs é preciso considerar que estas enzimas são também
express
SHIMI et al, 1999).
as no tecido conjuntivo gengival. O trabalho de ALHASHIMI e cols. identificou as
quimiocinas MCP-1, RANTES e MIP-2 no período inicial da aplicação da força ortodôntica,
porém foi realizado em hibridização in situ usando ratos wistar, ou seja um modelo de análise
bastante diferente do estudo do fluido gengival (ALHA
Portanto, é possivel que a presença das quimiocinas MCP-1, MIP-1β e RANTES no
fluido gengival, durante a movimentação ortodôntica, não seja tão marcada como as citocinas
pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6 e TNF-α. Ao passo que as MMPs, envolvidas na
remodelação das fibras dentogengivais, tenham a alteração de seus níveis refletidas em maior
intensidade na composição do fluido gengival.
57
6 CONCLUSÕES
Pela metodologia aplicada e pelos resultados obtidos, torna-se possível apresentar as
seguintes conclusões:
1 – Existe um aumento significativo no volume do fluido gengival na área de pressão
em todos os tempos analisados, com exceção do 0 e 24hs, quando comparados às áreas de
tensão. Isto sugere uma maior reação inflamatória no lado de pressão.
2 – A elevação dos níveis de expressão das MMP-9, MMP-13 e MMP-3, 1 hora após a
aplicação da força ortodôntica sugere que estas enzimas estejam envolvidas na remodelação
periodontal induzida. Os níveis de expressão da MMP-9 foram muito superiores aos das
MMP-13 e MMP-3. Na análise da evolução do tempo pode ser observada uma alteração
significativa nos níveis da quantidade total de MMP-9, MMP-13 e MMP-3 e na concentração
de MMP-13 e MMP-3 durante o período de movimentação dentária no lado de pressão.
3 – As quimiocinas MCP-1, MIP-1β e RANTES foram detectadas no sulco gengival
em todos os diferentes intervalos de tempo analisados, nas áreas de tensão e de pressão.
Porém, diversas amostras estavam abaixo do nível de detecção do ensaio e, os níveis dessas
quimiocinas no fluido gengival não parecem ser alterados pelas forças ortodônticas.
58
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65
ANEXO 1 – Termo de consentimento pós-informado
TERMO DE CONSENTIMENTO
Prezado paciente e/ou Responsável:
Este é um estudo que tem como objetivo avaliar o fluido gengival encontrado próximo
a alguns dentes que serão movimentados no tratamento ortodôntico. O procedimento de coleta
da saliva será feito com tiras de papel, é indolor e não invasivo. Somente serão selecionados
para participar neste estudo, pacientes em cujo plano de tratamento estejam previstas
extrações de pré-molares. A participação é voluntária e não irá trazer nenhum malefício ao
paciente. Nos dias pré-determinados, é obrigatório o comparecimento, para que sejam
realizados os procedimentos clínicos e de coleta do fluído gengival, sem quaisquer ônus.
Os dados gerados neste trabalho são confidenciais e só serão utilizados com fins
científicos, como a publicação de artigos, conferências, painéis ou temas-livres.
Eu,__________________________________________________________________
________________________________________________ certifico que, lendo as
informações contidas no termo de consentimento e suficientemente esclarecido(a) sobre
todos os itens, autorizo a minha participação ou participação do meu filho(a).
Rio de Janeiro, ____ de __________________ de 2006
Nome do paciente
participante:____________________________________________________________
Assinatura do Paciente ou Responsável:
________________________________________________________________
66
ANEXO 2 – Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Pedro
Ernesto
final
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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