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DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA DE PRODUÇÃO DE CEPAS DE
MYCOBACTERIUM BOVIS CALMETTE-GUÉRIN (BCG) QUE EXPRESSA FATOR DE
VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICAS (EPEC)
HALYKA LUZÓRIO FRANZOTTI VASCONCELLOS
CAMPOS DOS GOYTACAZES
ABRIL 2009
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II
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CEPAS DE
MYCOBACTERIUM BOVIS CALMETTE-GUÉRIN (BCG) QUE
EXPRESSA FATOR DE VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI
ENTEROPATOGÊNICAS (EPEC)
Halyka Luzório Franzotti Vasconcellos
‖Dissertação submetida ao Centro de
Biociências e Biotecnologia, da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, como Parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Biociências
e Biotecnologia.‖
Orientador: Prof. Wilmar Dias da Silva
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro -
UENF
Campos dos Goytacazes – RJ
2009
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III
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CEPAS DE
MYCOBACTERIUM BOVIS CALMETTE-GUÉRIN (BCG) QUE
EXPRESSA FATOR DE VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI
ENTEROPATOGÊNICAS (EPEC)
Halyka Luzório Franzotti Vasconcellos
‖Dissertação submetida ao Centro de
Biociências e Biotecnologia, da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, como Parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Biociências
e Biotecnologia.‖
Aprovada em 17 de abril de 2009.
Comissão examinadora:
----------------------------------------------------------
Dr. Milton Kanashiro (UENF)
----------------------------------------------------------
Dr. Messias Gonzaga Pereira (UENF)
----------------------------------------------------------
Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis (UFG)
----------------------------------------------------------
Orientador: Dr. Wilmar Dias da Silva (UENF)
IV
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia do Reconhecer do
Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, sob a orientação do Prof. Dr. Wilmar Dias da Silva.
Apoio Financeiro:
Fundo de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Parque de Alta Tecnologia do Norte Fluminense (TECNORTE)
Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF)
V
Dedico esta dissertação a Deus e minha Família,
principalmente minha Mãe.
VI
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a DEUS pelo dom da vida, pelo dom da fé que me fez
seguir em frente e não desistir nunca, por me conceder o privilégio de conhecer
todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para minha vida chegar até
aqui, na realização de um sonho!!!
Minha família, a base de tudo!!!! Meu alicerce, meu orgulho, meu amor e minha
paixão!!! Muito obrigada por todo o amor, e todo o suporte!!! Sem vocês eu não
chegaria tão longe!!! Se eu tivesse que escolher, nasceria mais mil vezes nessa
família linda que é a nossa. Essa vitória também é de vocês!!!
Ao meu querido Prof. Wilmar Dias da Silva, pessoa incrível. Muito obrigada por fazer
parte da minha vida! Com o Senhor aprendi não só a ciência da imunologia, mas
aprendi a ser uma pessoa melhor. Orgulho-me muito de trabalhar com o Senhor!
A Profa. Thereza Kipnis, pelo exemplo de mulher e pesquisadora, mesmo estando
distante se fez presente em todos os momentos, e agora mais do que nunca sei que
estará sempre ajudando a guiar meus passos! A Senhora fará muita falta!!!
Aos queridos amigos do LBR, principalmente meus companheiros de grupo
Claudinha, Verônica, David, Juju e Rita, que me ensinaram o que era uma EPEC e
nunca se mostraram cansados para me ajudar, sem vocês eu não teria conseguido.
Aos amigos que nem eram do meu grupo, mas sempre estiveram dispostos a me
ajudar como Fabrício, Núbia, Patrícia, Verônica, Rodrigo, Eduardo, Lynna, Flávia.
Minhas amigas do coração, Gláucia, Albinha, Flavinha, Lívia, Yo, que fizeram minha
vida longe de casa ser muito agradável, vocês são indispensáveis. Aos amigos
Franz, Inarei, Tiago pelos momentos alegres. Meu muito obrigada a todos vocês!!!!
VII
Aos professores e técnicos da UENF, principalmente os do LBR, que não cansaram
de me ajudar, com muito carinho, para que meus experimentos obtivessem sucesso.
Ao Prof Gonçalo Apolinário que fez despertar em mim o amor pela Biologia
Molecular e todo seu grupo do sequenciamento, principalmente Valéria e Adriana.
Não poderia deixar de agradecer a Claudia Almeida, sempre tão disponível para me
ouvir e me ajudar. Ao Prof Victor Flores pela incansável ajuda com minha revisão e
banca do projeto. Aos Profs Messias e Milton e Dra Ana Paula por aceitarem com
muita gentileza participar da minha banca.
Ao amigo Dr. Ivan nascimento, pessoa fundamental e indispensável na minha
dissertação, e que contribuiu muito para o meu crescimento e formação profissional.
Obrigada pela compreensão e paciência, em todos os momentos desse 1 ano de
amizade, pelo exemplo de ânimo e bom humor, mesmo diante das dificuldades.
Nunca vou esquecer da confiança e do incentivo!!! Agradecerei sempre....
Ao Dr. André Kipnis pelos ensinamentos indispensáveis, pela confiança absoluta,
pois mesmo estando tão longe sempre esteve me auxiliando e incentivando! Muito
obrigada sempre!!!
A Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis pela disposição em participar da minha banca
examinadora. Muito obrigada!!!!
A Dra Luciana Leite e a Dra Roxane, Chefes de Laboratórios do Instituto Butantan e
suas equipes, que abriram as portas dos seus laboratórios e me receberam muito
bem, esse estágio foi fundamental para meu trabalho.
Enfim, a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho!
VIII
Índice
Introdução..................................................................................................................
Escherichia coli – E. Coli ENTEROPATOGÊNICA – EPEC ................................
Estágios da Patogênese de EPEC ......................................................................
BFP ......................................................................................................................
Resposta Imune à EPEC ....................................................................................
Terapia ................................................................................................................
Justificativa.................................................................................................................
Objetivo......................................................................................................................
Objetivo geral .......................................................................................................
Objetivos específicos............................................................................................
Materiais e Métodos ..................................................................................................
Plasmídeos ...........................................................................................................
PCR .....................................................................................................................
Bactérias e condições de cultura ........................................................................
Clonagem do gene bfpA no vetor pGEM-T easy .................................................
Construção dos vetores de expressão .................................................................
Validação dos clones pela PCR............................................................................
Analise dos produtos da PCR ..............................................................................
Desenho dos oligonucleotídeos específicos ........................................................
Seqüênciamento ..................................................................................................
Manipulação dos veículos ...................................................................................
Mycobacterium smegmatis .............................................................................
BCG .................................................................................................................
Competência ........................................................................................................
IX
Transformação e seleção ....................................................................................
Extração de proteínas ..........................................................................................
Preparação da vacina...........................................................................................
Quantificação de proteína ....................................................................................
Determinação do número de unidades formadoras de colônias (UFC) ..............
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA CONTENDO DODECIL SULFATO DE SÓDIO
(SDS PAGE) ..............................................................................................................
IMMUNOBLOTTING ...................................................................................................
ANIMAIS ..................................................................................................................
Esquema de imunização ......................................................................................
Colheita de Sangue .............................................................................................
Elisa .....................................................................................................................
Detecção de anticorpos Anti-BfpA por Western Blotting .....................................
Desenvolvimento de modelos experimentais de diarréia e choque
endotoxêmico induzido por EPEC ...........................................................................
Resultados ................................................................................................................
Clonagem da seqüência codificadora para BfpA de EPEC nos plasmídios
pLA71, pLA73 e pMIP12 ..........................................................................................
Validação da clonagem dos vetores pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e pMH12-bfpA
...................................................................................................................................
Expressão da proteína BfpA em Mycobacterium semgmatis recombinante e
BCG recombinante ...................................................................................................
Resposta humoral de camundongos imunizados com rBCG-pLH71-bfpA,
rBCG-pLH73-bfpA e rBCG-pMH12-bfpA .................................................................
Modelos experimentais de diarréia e choque endotoxêmico induzido por
EPEC..........................................................................................................................
Discussão...................................................................................................................
Conclusões.................................................................................................................
X
Referências Bibliográficas..........................................................................................
XI
Lista de Figuras
Figura 1: Esquema dos quatro estágios de patogênese de EPEC .......................
10
Figura 2: Digestão dos plasmídeos pGemT-BfpA, pLA71 , pLA73 e pMIP12 .......
40
Figura 3: Representação esquemática dos vetores de expressão da série pLA...
41
Figura 4: Representação esquemática do vetor de expressão pMIP12 ...............
42
Figura 5: Validação da clonagem dos vetores pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e
pMH12-bfpA ..........................................................................................................
43
Figura 6: Validação da clonagem dos vetores pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e
pMH12-bfpA ..........................................................................................................
44
Figura 7: Expressão da proteína BfpA de EPEC em Mycobacterium smegmatis
recombinante .........................................................................................................
45
Figura 8: Expressão da proteína BfpA de EPEC em BCG recombinante..............
47
Figura 9: Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-BfpA detectados por
ELISA em soro de camundongos imunizados com BCG .....................................
49
Figura 10: Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-BfpA detectados por
ELISA em soro de camundongos imunizados com rBCG-pH71.1.........................
49
Figura 11: Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-BfpA detectados por
ELISA em soro de camundongos imunizados com rBCG-pH71.2.........................
51
Figura 12: Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-BfpA detectados por
ELISA em soro de camundongos imunizados com rBCG-pH73.1.........................
52
Figura 13: Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-BfpA detectados por
ELISA em soro de camundongos imunizados com rBCG-pH73.2.........................
53
Figura 14: Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-BfpA detectados por
ELISA em soro de camundongos imunizados com rBCG-pMH12.........................
54
XII
Figura 15: Detecção de anticorpos IgM e IgG anti-BfpA de camundongos
imunizados com as vacinas recombinantes ..........................................................
55
Figura 16: Índice de sobrevivência observado até 72h após a infecção ...............
56
Figura 17: Contagem das células presentes no infiltrado peritoneal de
camundongos infectados com EPEC típica e atípica em Câmara de Neubauer
nos tempos 0, 8 e 20h após a infecção..................................................................
57
Figura 18: Contagem das células presentes no infiltrado peritoneal de
camundongos infectados com EPEC típica e atípica por Cytospin, nos tempos
0, 8 e 20h após a infecção ....................................................................................
57
Figura 19: Contagem do numero de CFU encontrado no lavado peritoneal nos
tempos 0, 8 e 20 horas após infecção com EPEC típica ou atípica.......................
58
XIII
Lista de Tabelas
Tabela 1: Prevalência de EPEC em crianças com diarréia em países em
desenvolvimento ...................................................................................................
3
Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados para amplificação por PCR do gene do
antígeno BfpA de EPEC .......................................................................................
26
Tabela 3: Divisão dos grupos de camundongos para imunização ........................
34
Tabela 4: Esquema de Imunização de camundongos para verificar a produção
de anticorpos anti-BfpA e anti-BCG.......................................................................
34
XIV
Lista de Abreviaturas
AA Adesão ou aderência agregativa
AE Attachment and Effacement
APS Persulfato de Amônio
BfpA Bundle – forming pili A (subunidade principal do BFP)
BFP Bundle – forming pili
BCA Ácido Biciconínico
BSA Albumina Sérica Bovina
Cont. Controle
DAB Diaminobenzidina
DL
50
Dose Letal capaz de matar 50% da população testada
DMEM Meio de cultura Eagle Modificado por Dulbecco´s
D.O. Densidade Óptica
EAEC Escherichia coli enteroagregativa
EAF Fator de aderência à EPEC (plasmídeo)
EHEC Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC Escherichia coli enteroinvasiva
ELISA Ensaio de Imunoadsorção Ligado á Enzima
Esp Proteínas secretadas por EPEC
ETEC Escherichia coli enterotoxigênica
IgG Imunoglobulina G
IgY Imunoglobulina Y
i.p. Intraperitoneal
IPTG Isopropil-tio--D-galactosídeo
LA Aderência localizada
LEE Lócus of Enterocyte Effacement
XV
min. Minutos
OPD Ortofenildiamina
PBS Tampão Salina Fosfato
PKC Proteína C quinase
PMN Polimorfonucleares
SDS-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio
TEMED Tetrametiletilenodiamina
Tir Receptor de intimina
WAS Wiskott- Aldrich Syndrome
WASP Wiskott- Aldrich Syndrome Protein
XVI
RESUMO
Diarréia é uma das maiores causas de morte em crianças, causando mais de
2 milhões de mortes por ano em todo o mundo. Rotavirus, Giárdia, Cryptosporidium,
E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli (EPEC) são os agentes causadores de
diarréia mais importantes.
EPEC adere nas células epiteliais caracterizando o fenótipo de Aderência
localizada (LA). Esta adesão primária é mediada pela bundle-forming pilus (BFP)
expressado por EPEC. BFP é um importante fator de virulência de EPEC. A principal
subunidade do BFP é o bfpA. LA é seguida de lesão ―attaching and effacing‖ (AE) a
qual é caracterizada pela destruição do microvilo, aderência íntima da bactéria no
epitélio intestinal, formação do pedestal e polimerização de actina e outros
elementos do citoesqueleto.
BCG é uma vacina usada rotineiramente em crianças para prevenção de
infecção por Mycobacterium tuberculosis. Além disso, muitas vantagens estão
associadas ao uso do BCG como sistema apresentador de antígeno, incluindo
propriedades adjuvantes, estabilidade e segurança, e pode ser administrado via oral
e intramuscular.
Esse estudo desenvolveu uma rBCG-bfpA expressando a proteína
recombinante BfpA de maneira estável e capaz de induzir níveis séricos de
anticorpos anti-BfpA em camundongos.
Palavras-chaves: Diarréia, EPEC, BCG, plasmídios, gene bfpA, vacina.
XVII
ABSTRACT
Diarrhea is one of the leading causes of death in children, accounting for
approximately 2 million deaths each year worldwide. Rotavirus, Giardia,
Cryptosporidium, enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) and enteropathogenic
E. coli (EPEC) are the most important of the diarrhea-causing agents.
Enteropathogenic Escherichia coli [EPEC] adheres to epithelial cells in circumscribed
clusters designated localized adherence [LA] phenotype.
Primary adhesion is mediated by the bundle-forming pilus [BFP] expressed by
EPEC. BFP is an important virulence factor of EPEC. This factor is a BfpA encoding
gene that is localized in plasmids with 50-70MDa. LA is followed by the ―attaching
and effacing‖ [AE] lesion, which is characterized by microvilli destruction, intimate
adherence of bacteria to the intestinal epithelium, pedestal formation, and
aggregation of polarized actin and other elements of the cytoskeleton at sites of
bacterial attachment. Within adherent micro-colonies of EPEC, the bundle-forming
pili organize a meshwork, attaching bacteria to each other, and tethering individual
bacteria to the host cell surface.
BCG is a vaccine that is routinely used to immunize children to prevent
infections with Mycobacterium tuberculosis. Besides inducing reasonable protection
against tuberculosis, the BCG vaccine preparations are quite stable, safe, and can
be used either intramuscularly or orally. This study aims to develop a bfpA -
recombinant BCG expressing the corresponding BfpA recombinant protein.
Key-words: Diarrhea; EPEC, BCG; plasmids; bfpA gene; vaccine.
XVIII
1 - Introdução
XIX
O ressurgimento de doenças infecciosas nos tempos atuais, tal como
tuberculose e diarréia, tem despertado interesse pelo entendimento do processo
infeccioso e da resposta imunológica. Tal ocorrência deve-se pela associação de
fatores como o aparecimento simultâneo de novas doenças, o desenvolvimento de
resistência a antibióticos por muitos patógenos e o aumento da população humana.
Entre as novas doenças que favorecem o aumento da doença tuberculose, sem
dúvida alguma, o vírus da imunodeficiência (HIV) é o mais importante. Estes estudos
focam na definição de mecanismos moleculares e celulares utilizados por esses
patógenos (Steele-Mortimer et al., 2000).
Diarréia é um problema importante de saúde pública no mundo,
principalmente em países em desenvolvimento, sendo responsável por mais de dois
milhões de mortes a cada ano, particularmente entre crianças com menos de cinco
anos (World Health Organization (WHO)). O impacto das diarréias é mais notável na
infância, idade em que ocorrem diarréias mais graves e freqüentes, sendo
responsável por aumento no percentual/ano de internações. Nos países mais
pobres, a diarreia é a terceira causa mais comum de morte em crianças menores de
5 anos, ficando logo atrás das causas neonatais e da pneumonia (The United
Nations Children's Fund (UNICEF)). O número anual de mortes por diarreia em todo
o mundo corresponde a aproximadamente o mesmo número de mortes por AIDS,
incluindo todas as faixas etárias – atualmente esse número é estimado em 2,1
milhões (World Health Organization (WHO)). Contudo, a diarréia atrai muito menos
atenção do que o HIV/AIDS ou outras doenças da moda, como a malária, que
responde por 1,3 milhões de mortes por ano em todas as faixas etárias. No período
de um ano, ocorrem, na África, Ásia e América Latina, cerca de 2,6 episódios de
diarréias por criança e 3,3 milhões de mortes em crianças com idade inferior a cinco
anos (Bern C. et al., 1992). Somente no Brasil, no período de 2003-2005, a taxa de
mortalidade por diarréia infantil ultrapassou 4% de todos os óbitos ocorridos (Brasil.
Ministério da Saúde).
A falta de condições apropriadas de saneamento favorece a existência de
altos níves de contaminação ambiental, afetando crianças e levando a um alto índice
de infecções entéricas. O padrão de prevalência existente para diarréia infantil no
XX
Brasil tem sido praticamente imutável nos últimos 40 anos, representado
principalmente pela alta taxa populacional, más condições de habitação e saúde
pública (Fagundes-Neto e Scaletsky, 2000).
Grande número de microorganismos, incluindo vírus, bactérias e protozoários
são associados com diarréia infecciosa, contribuindo para a morbidade e
mortalidade infantil em todo o Mundo (Rodrigues, J. et. al., 2003). As infecções por
cepas patogênicas podem ser limitadas às superfícies da mucosa ou podem
disseminar-se pelo corpo, produzindo infecções no trato urinário,
meningite/septicemia e diarréia (Cleary et al., 2001).
1.1 - Escherichia coli – E. Coli ENTEROPATOGÊNICA - EPEC
Escherichia coli, pertence à família Enterobacteriaceae, a classe γ-
proteobactéria e ao gênero Escherichia, conquanto seja a principal bactéria
comensal da microbiota do intestino grosso humano (cerca de 10
12
bactérias) (Silva,
J. A. e Silva, W. D. 2005), cepas patogênicas podem competir com a comensal e
causar infecção. Entre essas cepas destacam-se as Escherichia coli
enteropatogênicas (EPEC) que, por processos ainda mal conhecidos adquiriram
plasmídeos e genes codificadores de fatores de virulência (Vallance and Finlay.
2000). Cepas de EPEC parecem estar cada vez mais evidentes em comunidades
onde as condições sanitárias não são adequadas (Fagundes-Neto e Scaletsky,
2000). Portanto, as condições sócio-econômicas são fatores importantes na
incidência de enfermidades diarréicas em crianças que vivem no meio rural e em
regiões mais pobres das grandes cidades. Nesses núcleos populacionais a
manifestação de diarréias ocorre, respectivamente, após os seis primeiros meses e
durante os três primeiros meses. Esta disparidade tem sido atribuída à diminuição
do aleitamento materno nas sociedades industrializadas e à superlotação de
hospitais com recém-nascidos susceptíveis de países em que o número de partos
hospitalares ultrapassa os partos residenciais (Cleary et al., 2001). A doença, em
adultos, está associada à ingestão de grandes quantidades de inóculos, estando, em
XXI
alguns casos esporádicos, associados com outros fatores como diabetes e acloridria
(Levine e Edelman, 1984; Nataro e Kaper, 1998).
Estudo realizado em São Paulo/Brasil, por Fagundes-Neto e Scaletsky, 2000,
com crianças menores de 5 anos, principalmente hospitalizadas, com objetivo de
determinar os fatores clínicos e epidemiológicos associados com a letalidade por
diarréia severa e, em especial por EPEC, avaliou alguns parâmetros como estado
nutricional, idade, tolerância alimentar, agente enteropatogênico isolados de fezes,
entre outros. Uma das conclusões foi que o fator de risco para morte estava
associado com a presença de EPEC isolada de fezes em 52,9% dos pacientes do
grupo com idade média de 3,8 meses contra 23,9% de pacientes com a média de
7,1 meses de vida. Demonstrou-se, com essas observações, maior percentual de
positividade para EPEC em pacientes com idade abaixo de 6 meses. Além disto,
sorogrupos de EPEC foram os patógenos mais freqüentemente isolados. A presença
de intolerância alimentar também teve associação positiva neste estudo.
Os neonatos podem adquirir EPEC durante os primeiros dias de vida por
várias maneiras como a transmissão de organismos da mãe para o feto via canal do
parto ou retal, de outras crianças com diarréia através das mãos contaminadas,
através de adultos assintomáticos ou crianças maiores que estejam eliminando
EPEC, por água ou ar, por fômites, por organismos presentes em fórmulas ou
suplementos alimentares. Dentre todas estas prováveis vias, as duas primeiras têm
tido maior significado, sendo a rota oro-fecal a mais freqüente em todos os casos.
Recém-nascidos contraem infecção por EPEC pelo contato íntimo e prolongado com
pessoas que excretam este organismo em hospitais ou grupos familiares. Em
prematuros, a prevalência é maior devido a prolongada estada destes no hospital, o
aumento da manipulação e pela superpopulação em instituições susceptíveis à
EPEC (Cleary et al., 2001; Nataro e Kaper 1998).
A primeira associação causa – efeito da cepa enteropatogênica, foi descrita
por John Bray em 1945 (Bray, J. 1945), quando demonstrou que EPEC era a causa
de diarréia em berçários de Londres. O termo enteropatogênica foi criado para
descrever cepas associadas com diarréia infantil. Além de EPEC (Clark, S. C. et.
al.,2003) como causa de diarréia infantil, no Mundo, cinco outras cepas de E. coli
XXII
patogênicas também causadoras de diarréia (DEC) foram identificadas:
enterotoxigênica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC), enterohemorrágica (EHEC),
enteroagregativa (EAEC), difusamente aderida (DAEC) (Rodrigues, J. et. al., 2003) e
extraintestinal (EXPEC) (Silva, J. A. e Silva, W. D. 2005). ETEC, EAEC e EHEC são
produtores de toxinas, EPEC, EAEC, e DAEC expressam adesão características
(localizada, agregativa e difusiva, respectivamente) em células epiteliais e são então
referidas como E. coli enteroaderente, EIEC distingue-se pela capacidade de invadir
células epiteliais e por não produzir toxinas (Rodrigues, J. et. al., 2003) (Tabela 1).
Tabela 1 – Prevalencia de EPEC em crianças com diarréia em países em
desenvolvimento. ( Ochoa et, al., 2008)
EPEC, historicamente, foi definida em termos de suas características
negativas, particularmente pela sua inabilidade de produzir enterotoxinas e de
invadir a célula hospedeira como Shigella
(Clark, S. C. et. al.,2003). Estudos
recentes, sobretudo com a introdução de métodos de biologia celular e molecular,
têm permitido conhecer-se os mecanismos de virulência da EPEC (Clark, S. C. et.
al.,2003). A infecção por EPEC geralmente causa formas agudas de diarréia, mas
casos severos de doença protraída podem ocorrer em certas formas de infecção
(Nataro e Kaper 1998). Diarréia intensa, aquosa, vômitos e febre são sintomas
comuns da infecção por EPEC (Nataro e Kaper 1998). Quase todas as crianças
mostram sinais e sintomas de infecção entre 2 a 12 dias após a exposição, podendo
XXIII
ter um período curto, de 24 horas, quando a infecção é naturalmente adquirida ou
experimental em humanos. Dados epidemiológicos indicam que adultos e crianças
com idade superior a 2 anos raramente desenvolvem infecção ativa quando em
contato com crianças doentes (Levine, 1984). As crianças quando expostas à EPEC,
durante a infância, adquirem imunidade e não se reinfectam posteriormente
(Schriefer et al., 1999).
No Simpósio Internacional sobre EPEC realizado em São Paulo em 1995, a
seguinte definição para EPEC foi proposta: ―EPEC are diarrhogenic Escherichia
coli that produce a characteristic histophatology known as attaching and
effacing (A/E) on intestinal cells and that do not produce Shiga, Shiga-like, or
verocytotoxins. EPEC of human origin posses a virulence plasmid known as
the EAF (EPEC adherence factor) plasmid that encodes localized adherence on
cultured epithelial cells mediated by the Bundle Forming Pilus, while atypical
EPEC do not posses this plasmid‖ (Second International Symposium on EPEC,
1995 apud Silva, J. A. e Silva, W. D. 2005).
EPEC penetra células de culturas de tecidos in vitro, mas esta forma de infecção
não tem sido observada in vivo (Donnenberg, M. S. et. al., 1989; Francis, C. L. et.
al., 1991). EPEC adere em forma de grumos na superfície dos enterócitos, formando
adesão característica denominada adesão localizada (LA, do inglês ―localized
adhesion” LA). A virulência da EPEC depende primariamente da sua capacidade
para induzir a lesão característica observada logo em seguida ao contato íntimo da
bactéria com a membrana plasmática apical da célula hospedeira. Caracteriza-se
esta lesão por destruição das vilosidades localizadas ao redor da região do contato
entre bactéria e enterócito com distorção de parte da membrana celular. Deste
contato resulta acentuado rearranjo do citoesqueleto, particularmente com formação
de um pedestal constituído de actina no sítio do contato da célula com a bactéria. A
lesão resultante, denominada ―attaching and effacing lesion (AE) (Moon, H. W. et.
al.,1983; Nataro, J. P. et. al.,1985), acontece logo e seguida ao estabelecimento de
LA. EPEC é considerada protótipo da família de patógenos indutores de lesão A/E
(Vallance and Finlay. 2000). A formação da lesão AE tem sido demonstrada in vivo
através de biópsias de intestino (Rothbaum, R. J. et. al.,1982;Taylor, C. J. et. al.,
XXIV
1986) e in vitro em linhagens celulares (Francis, C. L. et. al.,1991). Em seguida ao
estabelecimento de AE, há redução na capacidade do enterócito para absorver
conteúdo (nutrientes mais água) do interior do tubo intestinal com desequilíbrio
eletrolítico, saída excessiva de água para a luz do intestino, sintoma típico da
diarréia profusa causada por EPEC (S.C.Clark, et. al.,2003).
Assim como a EPEC, EHEC também infecta e induz lesão tipo AE no sítio de
contato com a célula alvo. Entretanto, estas lesões diferem em composição,
localização e mecanismos fisiológicos e moleculares das lesões produzidas por
EPEC (DeVinney, R. et. al. 2001; Gabastou, J. M. et. al. 1995), localizando-se
essencialmente no íleo terminal ou no cólon (Hart, C. A. et. al., 1993).
Os genes que codificam fatores de virulência necessários para a formação da
lesão A/E e pedestal pela EPEC se encontram associados em um grupo de genes
de 35-kb denominado ―Lócus of enterocyte effacement‖ (LEE) (Nataro e Kaper 1998;
McDaniel e Kaper 1997). Outros enteropatógenos que também produzem lesão AE,
incluindo EHEC, C. freundii e patógeno de coelho RDEC-1, também possuem LEE
(McDaniel et. al., 1995). A região completa da LEE foi seqüenciada e contém genes
reguladores transcricionais, tal como o regulador de LEE ou Ler (Dean e Kenny
2005), translocadores, chaperoninas moleculares, assim como outros genes para a
formação do pedestal. Estes incluem vários genes que codificam proteínas tipo III,
chamadas de Esps (proteínas secretadas por EPEC), incluindo EspA, EspB, EspD e
EspF, adesinas, intimina e o receptor translocado de intimina, Tir. Mutações em
algum desses fatores, com exceção do EspF, previne a formação da lesão AE em
modelos de cultura de células epiteliais (DeVinney et. al., 1999). O canal
transportador é organizado pela associação de moléculas EspA. Através deste canal
é que moléculas efetuadoras como Tir, EspB e EspD, também produzidas pela
bactéria, se transferem para a superfície da célula hospedeira. Tir funciona como
receptor para intimina, enquanto EspB e EspD são usadas para formar poros
através dos quais outras moléculas, também fatores de virulência, são introduzidas
no interior da célula (Warawa et. al., 1999;Ide et. al., 2001; Knutton et. al., 1998).
O primeiro gene identificado dentro da LEE foi eaeA, agora conhecido como
eae (Ide et. al., 2001). A proteína codificada por eae, conhecida como intimina, está
XXV
presente em todas as bactérias produtoras de AE e é requerida para ativação da
transdução de sinal que leva ao remodelamento da superfície celular no sitio de
contato com a EPEC e formação do pedestal (Phillips et. al. 2000). Já foram
descritos quatro subtipos de intimina: , , e (Phillips and Frankel, 2000).
1.2 - Estágios da Patogênese de EPEC
A formação da lesão característica histopatológica AE induzida por EPEC
envolve quatro estágios, sem uma seqüência temporal exata (Figura 1) (Clark et.
al.,2003; Knutton et. al.,1998). O primeiro estágio é a aderência inicial da bactéria
com a célula epitelial intestinal do hospedeiro (Vallance and Finlay. 2000), onde a
EPEC expressa fímbrias de 7nm de diâmetro que se agregam para formar feixes
que se entrelaçam ligando uma bactéria a outra, denominados, assim, de pili
formador de feixes ou ―bundle-forming-pili‖ (Bfp), intimina e em menor escala,
filamentos associados EspA. A expressão destes determinantes é dependente de
genes plasmidiais e cromossomais (Clark et. al.,2003). Neste estagio, EPEC forma
microcolônias densas na superfície da célula conhecida, como lesão LA (Nataro and
Kaper, 1998). Este padrão de LA está caracteristicamente associado com
sorogrupos clássicos de EPEC e diarréia (Scaletsky, et. al., 1996. ). A colonização
do intestino por EPEC pode ser influenciada pela expressão de BFP, de outras
adesinas bem como pelo envolvimento de fatores reguladores da expressão de
virulência (Kenny et. al., 1997). Alguns trabalhos demonstraram que anticorpos
produzidos contra BFP maduro (expressado na membrana externa da célula)
reduziram o nível de LA e reconheceram epítopos comuns a estruturas morfológicas
semelhantes à fimbria elaborada por diferentes sorotipos de EPEC (Girón et al.,
1993 e Schriefer et al., 1999). Soro contendo anticorpos contra BFP purificado
reduziu significativamente, mas não totalmente, a aderência localizada da cepa
EPEC B171 (O111:NM) (Nataro e Kaper, 1998).
Depois da aderência inicial pelo BFP, vários outros fatores bacterianos, como
EspA, EspB e EspD, participam do segundo estágio, os quais além de interferirem
na formação de lesão A/E, também são peças-chave na indução de várias vias de
XXVI
sinalização na célula hospedeira (Nataro e Kaper, 1998). Estas proteínas são
lançadas no citoplasma da célula epitelial do hospedeiro pelo sistema de secreção
tipo III codificado pelos genes esc e sep (secretion of E. coli proteins), localizados
dentro de uma ilha de patogenicidade cromossomal, denominada LEE (Lócus of
Enterocyte Effacement) (Vallance and Finlay. 2000). As moléculas efetoras
secretadas ativadas iniciam a transdução de sinais, causando alterações no
citoesqueleto da célula do hospedeiro, resultando numa despolimerização da actina
e perda da microvilosidade. O receptor Tir ( Translocated Intimin Receptor, antes
denominado Hp90-Host epithelial protein) é modificado pela ação da proteína
quinase A e proteína tirosino-quinase e é inserido na célula hospedeira (Clark et.
al.,2003).
As proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo III são observadas no
sobrenadante de EPEC crescidas em meio de cultura de tecido e no sobrenadante
de meio contendo células infectadas por EPEC. A secreção destas proteínas é
induzida sob condições de cultivo semelhantes àquelas encontradas no trato
gastrointestinal e são reguladas pela temperatura, pH e osmolaridade (Kenny et al.,
1997; De Vinney et al., 1999).
EPEC também induz dentro da célula hospedeira a ativação de Nuclear
Factor-κB (NF-κB) e de duas quinases, a proteína quinase C (PKC) e a quinase de
cadeia leve de miosina (MLC quinase). A PKC induz alterações no equilíbrio
eletrolítico de secreções in vivo e in vitro. MLC quinase induz aumento da
permeabilidade das junções intercelulares. A ativação de NF-κB está associada com
o aumento da expressão de IL-8 e com recrutamento de polimorfonucleares (PMN)
(Nataro e Kaper, 1998, Vallance and Finlay. 2000).
No terceiro estágio, os filamentos EspA são eliminados da superfície da
bactéria, a intimina se liga ao receptor Tir (região C-terminal), resultando numa
adesão íntima e acumulação de actina e outros elementos do citoesqueleto (Clark et
al., 2003) como por exemplo talina, ezrina, cortactina e vinculina (Vallance and
Finlay. 2000; Silva, J. A., Silva, W. D. 2005), abaixo do sítio de aderência da
bactéria (Clark et. al., 2003). A intimina participa na reorganização do citoesqueleto
adjacente da célula hospedeira após a ativação das tirosinas quinases na célula
XXVII
hospedeira. Este evento parece ser necessário para a completa expressão dos
efeitos da EPEC no citoesqueleto (Donnenberg et al., 1992; Goosney et al., 1999).
Em voluntários humanos covalescentes de uma infecção experimental por EPEC foi
observada uma forte resposta imune humoral com produção de anticorpos para
intima, sugerindo que esta proteína desempenhe papel importante na virulência da
EPEC em humanos (Nataro e Kaper, 1998).
Durante o quarto estágio, rearranjo de elementos do citoesqueleto no sitio de
aderência da bactéria, resulta na formação do pedestal, microestrutura celular
característica da infecção por EPEC. O deslocamento de moléculas efetoras para
esta região da célula interrompe processos funcionais intracelulares nas células do
hospedeiro, resultando em perda na integridade da junção-firme (tight-junction) e da
função mitocondrial, levando a um desequilíbrio eletrolítico e eventual morte celular
(Clark et. al., 2003).
Figura 1 – Esquema dos quatro estágios da patogênese de EPEC. (Clarke et. al., 2003)
1.3 - BFP
XXVIII
A aderência localizada (LA) da EPEC depende de genes cromossomais e de
um conjunto de genes Bfp em um plasmídeo de cerca de 92kb (60MDa) denominado
plasmídeo EAF (Baldini et. al., 1983; Girón and Schoolnik, 1991). Ensaios realizados
em voluntários com cepas defeituosas ou curadas do plasmídeo EAF (ex: JPN15,
B171-4), responsável pelo operon BFP, ocasionaram somente 20 a 36% de diarréia.
O mesmo acontece com cepas deficientes no gene eaeA, demonstrando, assim, a
importância da aderência inicial, da formação de microcolônias e lesão AE na
estimulação da secreção intestinal (Donnenberg et al., 1993). Bieber et al., (1998)
utilizando voluntários humanos na infecção experimental com EPEC 171-8,
carreadora de bfpA, bfpT (perA) ou bfpF inativados, demonstraram que a diarréia era
menos intensa do que nos voluntários que receberam a cepa selvagem.
EPEC EAF-positiva quando cultivada em meio de cultura celular apropriado,
forma auto-agregados bacterianos, fenômeno que não acontece em presença de d-
manose. E. coli enteropatogênicas EAF-negativas, ao contrário da cepa EAF-
positiva, não se auto-agregam (Clark et. al., 2003). EPEC tem sido classificada
segundo seu plasmídeo expresse (classe I) ou não (classe II) EAF (Nataro et. al.,
1985). As cepas cujos plasmídeos expressam EAF são também denominadas
EPECs Típicas, enquanto as que não expressam são denominadas atípicas(Trabulsi
et. al., 2002). Típicas e atípicas frequentemente ocorrem dentro de um mesmo
sorotipo (Trabulsi et. al., 2002).
Cepas de E. coli produzem vários tipos de pili de aderência, alguns dos quais
podem estar envolvidos com sua patogenicidade (Hacker, J. 1992). O Bfp,
originalmente descrito por Girón e colaboradores (Girón et. Al., 1993), é um pilus
longo, flexível, composto de estruturas semelhantes a cordas entrelaçadas e
expressado na superfície bacteriana como agregados alinhados lateralmente,
pertence ao grupo de fímbrias e de pilus tipo IV, de acordo com análise de sua
seqüência de proteínas e morfologia (Blank et al., 2000). Este pode ser parcial ou
totalmente responsável pelo fenótipo da LA; participa no recrutamento da bactéria
direcionando-a para a célula hospedeira (Giron et. Al., 1993). BFP é encontrado em
uma variedade de bactérias gram-negativas, patógenos de humanos, animais e
plantas.
XXIX
Dados recentes (Khursigara et. al., 2001) mostraram ligação do Bfp com o
fosfolipídeo fosfatidiletanolamina, mecanismo que tem sido proposto tanto para
EPEC como para outras bactérias, como o responsável pela interação do Bfp com
células do hospedeiro. Demonstrou-se que sorotipos de EPEC se ligam a um
complexo receptor de carboidrato (glicoproteínas e glicolipídeos) e que EPEC perde
seu Bfp quando exposta a glicoconjugados sintéticos de N-acetillactosamina, o
mesmo glicoconjugado que inibe a formação de LA por EPEC em células HEp-2
(Hyland et. al., 2006) . A seqüência amino-terminal da principal proteína estrutural do
Bfp indica um pilus tipo IV (Giron et. al.,1991) similar àqueles expressados por
outras bactérias patogênicas, como Pseudomonas aeruginosa, Neisseria
gonorrhoeae, Moraxella bovis, Dichelobacter nodosus, e Vibrio cholerae (Stone et.
al., 1996).
Todos os pilli tipo IV possuem características estruturais similares com a
região amino-terminal conservada (Girón et. al., 1997). O método de PCR tem sido
utilizado para detecção de genes bfp de EPEC (Gunzburg et al., 1995), não
amplificando DNA de outras bactérias enteropatogênicas revelando seqüências
100% específicas para EPEC que possuem fenótipo LA. Anticorpos monoclonais
contra Bfp (Girón et al., 1995) estão sendo utilizados para diagnóstico e estudo da
interação do Bfp com células do hospedeiro.
A principal subunidade estrutural do Bfp é o BfpA (Donnenberg et al.,1992).
O BfpA, tem uma massa molecular aparente de 19.5 kDA e a seqüência de
aminoácidos da região N-terminal relaciona-se com a região de outras proteínas
requeridas para a biossíntese de fímbrias tipo IV de vários outros organismos
patogênicos, incluindo Vibrio Cholerae (homologia com pilus co-regulado pela toxina
– Tcp – Toxin-co-regulated-pili). Pseudomonas aeruginoa e Neisseria gonorrhoeae
(Girón et al., 1991; Shoel et al., 1996). Além da homologia com Tcp, várias outras
similaridades foram identificadas, tais como: ambos os pili (EPEC e Vibrio cholerae)
são induzidos por condições ambientais; ambas proteínas formam feixes distintos de
filamentos agregados lateralmente em condições específicas de pH e força iônica;
além da demonstração de que preparações purificadas de BFP e Tcp são capazes
de aglutinar hemácias humanas e de camundongo do tipo O e CD-1,
XXX
respectivamente (Girón et al., 1991). Blank et al., (2000) relataram variações
extensas entre genes de bfpA encontrado em vários sorotipos de cepas de EPEC.
Identificaram oito alelos diferentes de bfpA, agrupados em α (3) e β (5), tornando
evidente a transferência horizontal de bfpA através de diversas linhagens de EPEC,
e conseqüentemente evolução deste patógeno. A forma madura da proteína BfpA
está associada à membrana e sua expressão é regulada no nível transcripcional e
ocorre durante crescimento exponencial da bactéria, à temperatura de 35 a 37°C, na
presença de cálcio. Íons amônio reduzem significativamente a expressão de bfpA e
o fenótipo LA (Clark S. C. et al., 2003).
Genes externos ao operon BFP também são requeridos para expressão
completa do BfpA. Por exemplo, perA, perB e perC (regulador de plasmídeo
codificado), também conhecidos como bfpT, bfpV e bfpW, respectivamente (Gomez-
Duarte et al.,1995; Tobe et al.,1996). Além disso, mutação no lócus cromossomal
dsbA, que codifica a enzima isomerase dissulfeto, leva á perda da LA (Zhang et al.,
1994), sugerindo que ponte dissulfeto é requerida para a biogênese da Bfp
(S.C.Clark et al., 2003).
Durante a infecção por EPEC, várias vias de sinais de tradução são
estimuladas dentro da célula epitelial hospedeira. Fosforilações de proteínas e
eventos de sinalização resultantes são complexas. Envolvem proteínas tanto da
bactéria quanto da célula hospedeira (Clark S. C. et al., 2003). Uma das vias resulta
da fosforilação de resíduos de tirosina em substratos que estão co-localizados com a
actina acumulada no sítio de contato com a bactéria. A maior fosforilação de
substrato encontrada em células infectadas por EPEC é o receptor Tir (Kenny et
al.,1997). Especula-se que Tir seja também fosforilado em resíduos serino-treonina
(Kenny, B. 1999). A fosforilação da tirosina durante a infecção por EPEC é critica
para a acumulação da actina, pois em sua ausência, não ocorre a formação da lesão
AE (Kenny et al.,1997). A infecção por EPEC também dispara outras cascatas de
sinalização dentro da célula hospedeira, incluindo inositol fosfato, ativação da
proteína quinase C (PKC), fosfolipase C (PLC)- e do fator de transcrição NF-B
(DeVinney et al., 1999). Uma conseqüência da ativação inositol trifosfato é a
liberação de cálcio intracelular (Vallance and Finlay. 2000; Kenny and Finlay. 1997).
XXXI
A ativação do NF-B em cultura de células epiteliais T84 ocorre em associação com
o aumento da produção de inteleucina-8 (IL-8) e recrutamento de células
polimorfonucleares (PMNs) (Savkovic et al., 1996; Savkovic et al., 1997).
A fosforilação de proteínas não-tirosina também ocorre na junção entre a
bactéria e a célula hospedeira. A principal proteína fosforilada em células Caco-2
infectadas com EPEC é a cadeia leve da miosina, componente do citoesqueleto,
que, quando fosforilada, regula a organização de actina em células não
musculares (Manjarrez-Hernandez et al., 1991; Manjarrez-Hernandez et al., 1992).
Tem sido sugerido que a extensa fosforilação de serina-treonina da cadeia leve da
miosina das células do hospedeiro leva a uma destruição irreversível da função dos
microvili e crescimento da quantidade de actina no local de junção da bactéria e a
célula hospedeira. O aumento desta fosforilação devido à infecção com EPEC
também resulta em perturbação da função de barreira do epitélio intestinal. Isto
provavelmente é um fator contribuinte para a diarréia causada por EPEC (Zhang et
al., 1994).
Espécies pertencentes à família Enterobacteriacea incluindo Salmonella,
Shigella e Yersinia também têm mostrado induzir apoptose em células hospedeiras
in vitro ou in vivo (Monack et al., 1997). Também Helicobacter pylory, que
compartilha com EPEC a capacidade de aderir intimamente e causar a fosforilação
de tirosina em células hospedeiras, causa apoptose em células gástricas (Moss et
al., 1996).
Os mecanismos de aderência de EPEC a células hospedeiras são capazes
de ativar vias anti-apoptóticas na célula hospedeira. Foi demonstrado a ativação de
tirosina quinase, proteína quinase C e do Fator de transcrição NF-kB, todos
considerados como participantes de vias supressoras da morte celular (Evans et al.,
1995). Estudos têm demonstrado que EPEC estimula todas estas vias de
sinalização. Sinais de indução de morte por EPEC poderiam incluir aumento de
cálcio intracelular, rearranjo do citoesqueleto, danos por agentes oxidantes e
alteração da membrana celular resultando na introdução de proteínas bacterianas na
célula hospedeira pela via de secreção tipo III (Mannick et al., 1996). É possível que
o sistema se secreção tipo III seja o responsável pela ruptura da integridade da
XXXII
membrana observada em resposta a infecção por EPEC, Salmonella, Shigella e
Yersinia.
1.4 - Resposta Imune à EPEC
A interação de bactérias que acarretam lesão do tipo A/E com o epitélio
intestinal do hospedeiro promovem respostas imune inata e adquirida. Análises
histológicas em tecidos infectados com EPEC ou C. rodentium revelaram a presença
de inflamação com infiltrado de neutrófilos e macrófagos no exsudato (Sears e
Kaper, 1996; Vallance e Finlay, 2000).
O recrutamento de PMN está associado à ativação do fator de transcrição NF-
kB, o qual estimula a transcrição de IL-8 por células epiteliais (Savkovick et al.,
1997). A EPEC bloqueia seu próprio reconhecimento por células fagocitárias
semelhantes a macrófagos através de um mecanismo associado com a
desfosforilaçao de tirosina das proteínas do hospedeiro (via secreção tipo III e de
proteínas secretadas EspA, EspB e EspD) resultando na inibição da fagocitose
(Goosney et al., 1999; Vallance e Finlay, 2000).
A proteção contra infecções entéricas em humanos, na imunidade
adquirida ou humoral, correlaciona-se mais com níveis de anticorpos de secreções
locais do que com títulos de anticorpos séricos.
A indução de imunidade local nas mucosas é crítica na infância. Na
estrutura do MALT(mucosa-associated lymphoid tissue) destacam-se tanto folículos
linfóides agregados das placas de Peyer, do íleo, como folículos linfóides solitários,
dispersos na mucosa e submucosa do apêndice e porção distal do intestino. A
importância funcional deste compartimento de tecido linfóide ressalta-se pelo fato de
cerca de 80-90% dos imunócitos produtores de imunoglobulinas (Igs) encontrarem-
se nas mucosas e glândulas exócrinas (Brandtzaeg et al., 1999).
Os produtos mais importantes desses imunócitos são IgA polimérica
(pIgA) e IgM pentamérica (pIgM). PIgA e pIgM possuem sítios de ligação para
receptores poliméricos de Igs (pIgR) denominados peças de secreção (PS),
essenciais ao transporte ativo da molécula de Ig através da célula epitelial. O sítio de
ligação pIgR/PS depende da incorporação covalente da cadeia J na estrutura
XXXIII
quaternária dos polímeros na ocasião em que estão sendo produzidos pelos
imunócitos (Silva, J. A., Silva, W. D. 2005).
A produção de pIgA e pIgM inicia-se com a tomada de antígenos (Ags)
solúveis ou particulados pelas células M localizadas entre as células epiteliais da
mucosa intestinal. As células M transferem as moléculas de Ags para células
apresentadoras de Ags (APC). Depois de processados, peptídeos imunogênicos
associados a produtos do complexo principal de histocompatibilidade da classe II
são expostos na superfície das células APC e apresentados a linfócitos T CD4
+
virgens. Da interação e diferenciação entre diferentes subtipos de linfócitos resultam
plasmócitos produtores de Igs específicas para Ags recolhidos nas mucosas, além
de células de memória. O aparecimento no colostro e leite de anticorpos produzidos
nas secreções reflete a importância do eixo imunológico ―MALT- glândula mamária-
migração de linfócitos B‖ na proteção do recém-nascido (Brandtzaeg et al.,1999;
Goldblum et al.,1996) . A migração de linfócitos B já comprometidos com antígenos
recuperados na mucosa intestinal para gânglios linfáticos mesentéricos, explica a
presença de (pIgA) e IgM circulantes específicos para estes antígenos (Goldblum et
al.,1996; Brandtzaeg et al.,1999).
IgA secretória (sIgA) humana presente em leite materno inibe a aderência
localizada de uma cepa de EPEC a culturas de células e também reagem com
antígenos de EPEC, particularmente com intimina (Cravioto et al., 1991). Camara et
al. (1994) confirmaram a participação da sIgA presente no colostro na inibição da
adesão localizada de EPEC à célula epitelial. Mulheres mexicanas também
apresentaram abundante sIgA no leite materno que reagiu fortemente com intimina e
proteínas de 80 a 70kDa, isoladas de vários sorogrupos O oriundos de casos de
diarréia infantil severa. Esta reação ampla de sIgA à EPEC é explicada por estudos
preliminares que demonstraram que as amostras de leite de mulheres vivendo em
condições sanitárias pobres apresentaram uma reação mais forte de sIgA à
proteínas de EPEC que amostras de leite de mulheres vivendo em condições
sanitárias boas (Manjarrez-Hernandez et al., 2000).
Dados epidemiológicos indicam que nas áreas endêmicas a diarréia
causada por EPEC é mais comum e mais grave na primeira infância,
XXXIV
progressivamente menos freqüente e mais branda na segunda e terceira infâncias e
rara em adultos (Levine and Edelman, 1984). Já o aparecimento de anticorpos
circulantes segue curso inverso: não são detectáveis na primeira infância, aumentam
com a idade e atingem níveis mais elevados nos adultos (Neter et al.,1955). Admite-
se, portanto, que exposição a EPEC durante infância, induza imunidade contra este
patógeno. Esses dados sugerem que o desenvolvimento de vacinas contra EPEC
seria de grande utilidade em países como o Brasil que, de maneira perversa, se
associa subnutrição, condições precárias de habitação, falta de água potável e de
rede de esgotos (Silva, J. A., Silva, W. D. 2005). Ainda não se sabe se a baixa
incidência de diarréia por EPEC em crianças com idade mais avançada e em adultos
é devido à imunidade adquirida ou um aprimoramento desta.
Uma investigação da resposta humoral contra intimina, EspA e EspB e
BfpA em crianças brasileiras de dois meses a três anos de vida, com diarréia aguda,
atendidas no Hospital Universitário (SP), detectou grande quantidade de anticorpos
anti-BfpA e anti-EspB seguido de anti-EspA e anti-intimina dez dias após o início da
diarréia. Este fato indica que BFP e produtos de LEE são produzidos in vivo durante
a infecção natural por EPEC e que estes estimulam uma resposta imune contra
determinantes de virulência de EPEC (Martinez et al., 1999)
Os imunógenos que poderiam ser incluídos na formulação de vacinas
anti-EPEC, na forma de clones ou de subunidades, seriam alguns dos fatores de
virulência já conhecidos, como os produtos de genes localizados no plasmídio EAF e
no lócus EAE (Silva, J. A., Silva, W. D. 2005).
BfpA, subunidade dos feixes de BfpA, pelas atividades que exerce
durante as interações da EPEC com a célula hospedeira e pelas propriedades
imunogênicas que exibe, seria um dos candidatos a ser incluído na formulação da
vacina anti-EPEC (Silva, J. A., Silva, W. D. 2005).
Um recombinante bfpA, referido SL3261 (pBfpA), expresso na cepa de
aroA Salmonella typhimurium administrado por via oral para camundongos BALB/c
evoca títulos elevados e persistentes de anticorpos anti-BfpA (Schriefer et al.,1999).
SL3261 (pBfpA), foi construído amplificando-se, por PCR, cópias da região de bfpA
XXXV
obtidas do plasmídeo EAF da cepa B171 de EPEC. A cepa que contém as cópias
desejadas foi clonada em plasmídeos. Após subclonagem, de uma cópia intacta de
bfpA no vetor de expressão pCYTEXP1, o produto pBfpA foi usado para transformar
a amostra não patogênica de Salmonella, aroA S. typhimurium, cepa SL3261,
gerando Sl3261(pBfpA). Este recombinante expressava pBfpA, como indicado pela
presença de uma proteína de 21 kDa. A identidade da proteína recombinante obtida
com BfpA nativa, foi determinada usando-se anticorpos anti-BfpA.
Construções subseqüentes de plasmídeos semelhantes em E. coli não
patogênica, usando ―forward and reverse primers‖ de 32 bp de comprimento
correspondentes às terminações ‗5 e 3‘ de bfpA de Sl3261(pBfpA), permitiram a
obtenção do plasmídeo pEU84 (Quintana-Flores et al.,2002). A proteína
recombinante BfpA recuperada desse plasmídeo foi usada como imunógeno em
galinhas poedeiras, induzindo títulos elevados de anticorpos IgY anti-BfpA. Os
anticorpos IgY, isolados e purificados da gema dos ovos, reconheciam de maneira
semelhante, BfpA recombinante e nativa, bloqueavam a indução de LA no sistema in
vitro EPEC-células HeLa, inibiam o crescimento em cultura de EPEC B171/EAF
(+)
,
porém não de EPEC B171/EAF
(-)
, e discriminavam amostras de EPEC de outras
cepas de E. coli não patogênicas (Almeida et al.,2003). Essas observações
confirmaram o elevado poder imunogênico de BfpA (Schriefer et al.,1999).
A imunogenicidade dos fatores de virulência codificados por genes em
LEE esta também sendo investigada, principalmente relacionada à proteção de
mucosas, onde a amamentação de recém-nascidos tem sido amplamente defendida
por muitos pesquisadores, como tratamento preventivo de muitas infecções
entéricas. Já foi demonstrado que o colostro e leite materno contêm pIgA específicas
para intimina, BfpA, EspA, EspB e Tir (Loureiro et al., 1998; De Souza Campos
Fernandes et al., 2002; Sanches et al. 2000).
Há, portanto, possibilidade real de formulação de vacina anti-EPEC
usando segmentos gênicos de LEE ou EAF ou alguns de seus produtos como BfpA,
intimina e EspB, na construção de vacinas (Silva, J. A., Silva, W. D. 2005).
XXXVI
1.5 - Terapia
Como ocorre na maioria dos casos de gastroenterites, a hidratação oral
ou parental é um dos principais objetivos do tratamento como prevenção da
desidratação. O uso da terapia antimicrobiana nas gastroenterites de neonatos por
EPEC ainda é bastante polêmica. Existem estudos que apontam os benefícios do
uso de antibiótico na eliminação de EPEC do trato gastrointestinal, na redução do
risco de infecção cruzada, na comunidade, surtos em berçários ou creches, ou
modificando a severidade da doença. Com base em inúmeros fatores de efeitos
benéficos na clinica, recomenda-se a administração de antimicrobianos de uso oral,
não absorvíveis, no tratamento de recém-nascidos acometidos por gastroenterites
por EPEC severas e moderadas. Este tratamento deve ser acompanhado até as
culturas de fezes tornarem-se negativas para EPEC. De fato, a terapia de suporte
antimicrobiana mostra a erradicação dos sintomas de EPEC em poucos dias,
diminuindo a contaminação ambiental, porém pode ocorrer o isolamento, ou seja, a
manutenção deste microrganismo durante e após o curso da doença em 15 a 30%
dos pacientes (Cleary et al., 2001).
Por causa de uma variedade de antibióticos usados no tratamento de
EPEC, úteis em muitos casos, tem ocorrido o aparecimento de cepas múlti-
resistentes. Assim, o conhecimento dos padrões de susceptibilidade de EPEC é
importante para determinar o sucesso da terapia. Outras terapias como
administração de subsilato de bismuto e administração no leite contendo Igs de
bovino anti-EPEC têm sido comprovadamente úteis (Nataro e Kaper, 1998; Cleary et
al., 2001).
XXXVII
2 - Justificativa
XXXVIII
A tuberculose continua sendo um sério problema de saúde pública, não
somente entre os países em desenvolvimento, mas também nos países
desenvolvidos. Acomete cerca de um terço da população mundial sendo
responsável por mais de dois milhões de mortes anualmente (Bloom and Murry,
1992). A vacina contra a tuberculose, chamada de BCG, sigla decorrente da
expressão Bacilo de Calmette-Guérin, é preparada a partir de uma cepa derivada de
uma cepa de Mycobacterium bovis, atenuada por repicagens sucessivas (Rook et
al., 2005).
M. bovis BCG é considerado um candidato promissor para o desenvolvimento
de um sistema vetor vivo para entregar antígenos estranhos ao sistema imune
(Hanson et al., 1995; Ohara and Yamada, 2001). Muitas vantagens estão
associadas com o uso da BCG como sistema apresentador de antígeno, incluindo
suas propriedades adjuvantes, habilidade em disparar uma resposta imune humoral
e celular através de antígenos heterólogos, termo-estabilidade e mais importante, a
possibilidade de se obter uma resposta imune eficiente com apenas uma dose
(Ohara and Yamada, 2001). Durante a última década, sistemas de expressão em
BCG têm sido desenvolvidos para a produção de uma variedade de antígenos virais,
bacterianos e parasitários, e a capacidade desses sistemas recombinantes em
induzir respostas imunes humoral e celular em vários modelos experimentais está
estabelecido (Aldovini and Young. 1991; Lamgranderie et al., 1997; Ohara and
Yamada, 2001), como por exemplo infecção por pneumococo (Langermann et al.,
1994) e leishmania cutânea ( Abdelhak et al.,1995).
A obtenção de BCG recombinantes que expressem produtos do gene bfpA de
EPEC teriam duas utilidades: fonte alternativa de proteínas recombinantes BfpA,
originalmente expressas em Salmonella ou E. coli, para análises morfofuncionais da
molécula deste fator de virulência, e seu uso potencial como vacina dupla anti-EPEC
e anti-M. tuberculosis.
XXXIX
3 - Objetivos
XL
3.1 - Objetivo Geral
Este trabalho foi delineado com o objetivo de desenvolver uma vacina BCG
recombinante, que fosse capaz de induzir resposta imune específica para epítopos
presentes na proteína recombinante BfpA.
3.2 - Objetivos Específicos
1. Clonar genes bfpA nos plasmídeos de expressão (pLA71, pLA73 e pMIP12)
em M. smegmetis e M. bovis, e obter e selecionar cepas de BCG que
contenham um dos vetores recombinantes pLH71-bfpA, pLH73-bfpA ou
pMH12-bfpA.
2. Validação da clonagem por sequênciamento.
3. Verificar se as cepas de rBCGs contendo o gene bfpA sintetizam a proteína
recombinante BfpA.
4. Desenvolver protocolos para investigar o potencial imunogênico das cepas e
usando produção de anticorpos como referencial.
5. Desenvolver protocolos teste, in vivo, de imunoproteção usando cepas EPEC
típica e atípica como agente infeccioso nos modelos de diarréia e choque
endotoxêmico.
XLI
4 - MATERIAIS E
MÉTODOS
XLII
Plasmídeos
Os vetores multifuncionais (shuttle vectors) E. coli /micobactéria pLA71,
pLA73 e pMIP12 são plasmídeos pontes. Os vetores pLA71 e pLA73 foram
gentilmente cedidos pela Dra. Brigitte Gicquel do Instituto Pasteur (Paris, França).
Os vetores pLA71 e pLA73 são derivados do pRR3 e contém origem de replicação
de E. coli e micobactéria, o gene para aminoglicosídio fosfotransferases, um
marcador de seleção para kanamicina, e o promotor, pBlaF*, um promotor mutado
da -lactamase de M. fortuitum (Murray A. et al, 1992). O promotor pBlaF* é seguido
de diferentes fragmentos do gene da -lactamase fundidos a fosfatase alcalina
(phoA). pLA71 apresenta um inserto de 1384 pb contendo o promotor pBlaF* mais a
região codificadora de 32 aminoácidos da seqüência sinal de exportação da -
lactamase e 5 aminoácidos da proteína madura. pLA73 contém um inserto de 2155
pb, contendo o promotor pBlaF*e o gene completo da -lactamase (Blam) (Timm J.
et al, 1994). Ambos contém um sítio de clonagem múltipla (MCS) após a seqüência
da -lactamase. O cassete de expressão está entre terminadores para garantir
que a expressão seja dirigida apenas por este promotor.
O plasmídeo pMIP12 possui uma sequência de Shine-Dalgarno
micobacteriana forte que permite que o gene inserido tenha uma expressão elevada,
além de também possuir origem de replicação para E. coli e para Micobactérias,
gene de resistência para canamicina e o promotor do gene da beta-lactamase
(pBlaF) de Mycobacterium fortuitum com seu codon ATG de iniciação.
Oligonucleotídeos
a
Seqüência dos oligonucleotídeos
b
pLA71 e 73-FP 5‘- TAGGGTACCCCTGTCTTTGATTGAATCTGCAATGGTGCTT – 3‘
pLA71 e 73-RP 5‘TAGGGTACCGCGGCCGCGATAATCTTACTTCATAAAATATGTAAC
TTTATTGGT 3‘
pMIP12-FP 5‘- TAGGGATCCCTGTCTTTGATTGAATCTGCAATGGTGCTT –3‘
pMIP12-RP 5‘- TAGGGTACCTTACTTCATAAAATATGTAACTTTATTGGT –3‘
XLIII
PCR
O gene bfpA foi amplificado a partir do plasmídeo pCYTEXPI::bfpA (Schriefer A. et
al., 1999) utilizando-se os seguintes os oligonucleotídeos iniciadores da tabela 2.
Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados para amplificação por PCR do gene
do antígeno BfpA de E. coli Enteropatogênica.
a
FP, oligonucleotídeo direto; RP, oligonucleotídeo reverso
b
Os sítios de restrições KpnI, NotI e BamHI estão sublinhados.
Foram realizados 35 ciclos de amplificação de 50 segundos a 92
o
C, 60
segundos a 54
o
C e 50 segundos a 72
o
C. Os fragmentos foram separados em gel
de agarose 1,0 % e purificados através do GFX
TM
PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences).
Bactérias e condições de cultura
Todas as etapas de clonagem foram executadas em E. coli DH5, sendo
transformadas pelo método padrão de CaCl
2
e cultivadas em Luria-Bertani (LB)
contendo, quando necessário ampicilina 100 g/mL ou kanamicina 20 g/mL
Clonagem do gene bfpA no vetor pGEM-T easy
O produto de PCR purificado foi inserido no vetor pGEM-T easy (Promega)
seguindo as orientações do fabricante, transformado em E. coli DH5 e plaqueados
em meio LB contendo ampicilina, IPTG e X-gal para seleção dos clones
recombinantes (brancos). A confirmação da clonagem foi feita após extração do
DNA plasmidial de colônias brancas e digestão com a enzima de restrição EcoRI
para visualizar a liberação do inserto.
Construção dos vetores de expressão
XLIV
O gene bfpA foi excisado do plasmídio pGemT Easy –bfpA gentilmente
cedido pelo Dr. André Kipnis (Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,
Universidade Federal de Goiás) digerido com as endonucleases NotI e KpnI, sendo
o fragmento liberado da digestão purificado pelo GFX
TM
PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (Amersham Biosciences). O fragmento gerado possui
aproximadamente 600pb.
Após purificação, esse fragmento foi clonado, a partir desses mesmos sítios
de restrição, nos vetores de expressão de expressão pLA71 e 73 previamente
digeridos com NotI e KpnI e pMIP12 previamente digerido com KpnI e BamHI. Os
oligonucleotídeos foram desenhados para que a inserção dos fragmentos em pLA71,
pLA73 e pMIP12 permitisse que a fase de leitura fosse mantida para a produção da
proteína de fusão. As construções obtidas foram então denominadas pLH71-bfpA,
pLH73-bfpA e pMH12-bfpA. Os plasmídeos resultantes dessa clonagem foram
usados para a transformação da cepa E. coli DH5α. As colônias possivelmente
positivas foram selecionadas em meio LB contendo kanamicina. Minipreparações
plasmidiais a partir das colônias selecionadas foram analisadas por restrição com as
enzimas NotI/KpnI eBamHI/KpnI em busca de plasmídeos que carregavam o inserto
bfpA.
Validação dos clones pela PCR
Analisou-se o DNA plasmidial em gel de agarose 0,8% corado com brometo
de etídio. As amostras contendo DNA plasmidial foram então submetidas ao
experimento de validação dos clones. O objetivo deste experimento era confirmar a
presença do inserto no DNA plasmidial bacteriano.
Analise dos produtos da PCR
Amostras das misturas de reação (25µl) foram aplicadas em gel de agarose a
1,5% corado com brometo de etídio, após acréscimo de 10µl do tampão de amostra
concentrado em cada tubo de reação. O tampão de amostra 6X concentrado foram
XLV
acrescentados azul de bromoferol 0,25% e glicerol 30% em água. Realizou-se
eletroforese a 120V em tampão de corrida TAE ( 0,04M tris- Acetato; 0,001M EDTA).
Foi utilizado o marcador 1Kb Ladder (promega, EUA). Os produtos da PCR foram
então analisados em transiluminador UV e o gel fotodocumentado no aparelho
Image Master
®
VDS (Amersham Pharmacia,EUA).
Desenho dos oligonucleotídeos específicos
Após uma pesquisa (NCBI- Sequence Viewer) da seqüência dos plasmídios
pLA71, pLA73 e pMIP12, oligonucleotídeos específicos que pareassem com sítios
no gene da beta-lactamase (blaF gene) foram desenhados através do Programa
Oligo Tech, version 1,00, Copyright
©
1995. A síntese dos oligonucleotídeos foi
encomendada à empresa Integrated DNA Technologies (IDT).
Plasmídio
Oligonucleotídeo
TM
pLA71
5‘ CCA ATG ACC GGA CTA TCG CG 3‘
56,7 °C
pLA73
5‘TTT CGG TGC TCT GGA TCG CG 3‘
60.2 °C
pMIP12
5‘ TTC AAA CTA TCG CCG GCT GA 3‘
58,1 °C
Sequênciamento
Cada plasmídeo contendo o gene bfpA foi seqüenciado na direção 5‘ – 3‘,
utilizando um primer em tubo individual. Cada tubo de reação de seqüenciamento
continha 1µl, 2 µl e 6 µl da amostra pMH12-bfpA, pLH71-bfpA e pLH73-bfpA,
respectivamente, 3,2pmol do oligonucleotídeo específico para o fragmento, 0,5µl do
Kit Big Dye
TM
Terminador Cycle Sequencing Reaction (Applied Biosystems), 2µl de
Big Dye Terminator Buffer e água milliQ qsp para 10µl. O Kit Big Dye
TM
Terminador
XLVI
Cycle Sequencing Reaction (Applied Biosystems) contém a AmpliTaqDNA
Polimerase, o tampão apropriado para a enzima, os desoxirribonucleotídeos e os
dideoxirribonucleotídeos conjugados com fluorógeno. A reação de seqüenciamento
foi realizada em termociclador PTC-100
TM
Programmable Thermal Controller MJ
Research Inc., através do seguinte programa: pMH12-bfpA e pLH71-bfpA: 96ºC 1
minuto, 96ºC 15 segundos, 57ºC 30 segundos, 60ºC 4 minutos, as três últimas
etapas foram repetidas 25 vezes. pLH73-bfpA: 96ºC 1 minuto, 96ºC 15 segundos,
60,2ºC 30 segundos, 60ºC 4 minutos, as três últimas etapas foram repetidas 25
vezes.
Ao término do programa, cada produto de reação foi lavado com isopropanol
e etanol para remoção dos dideoxinucleotídeos não incorporados aos fragmentos
obtidos. Em cada tubo de seqüenciamento foram adicionados 40µl de isopropanol
65%. Após incubação de trinta minutos, os tubos foram centrifugados por 25 minutos
a 12.000rpm (26ºC) e os sobrenadantes foram descartados. Adicionaram-se 200µl
de etanol 60% aos tubos e procedeu-se à centrifugação de 5 minutos a 12.000rpm
(26ºC). Os sobrenadantes foram também descartados e os tubos foram secos no
termociclador com a tampa aberta por 2 minutos a 95ºC. Ao término deste
procedimento, os tubos foram armazenados ao abrigo da luz.
Adicionou-se Formamida, 10μl por tubo, os tubos foram colocados numa placa
para seqüênciamento e levada ao termociclador para desnaturar durante 1 minuto a
96ºC, logo após colocada em banho de gelo para ocorrer um choque térmico. A
placa foi levada ao seqüenciador automático AB-Applied Biosystems/HITACHI-3130.
Os dados foram armazenados e analisados pelo programa DNA Sequencing
Analysis 5,2 Patch2- UENF (3130 Genetic Analyzer). Todos os seqüenciamentos
foram realizados no Núcleo de Análise Genômica da UENF com a colaboração do
Prof. Dr. Gonçalo Apolinário de Souza Filho.
Manipulação dos veículos:
-Mycobacterium smegmatis
XLVII
Foi usada a cepa MC155 Mycobacterium smegmatis cedida pelo Instituto
Butantan.
-BCG
Foi usada a cepa Moreau de Mycobacteriun bovis (BCG) cedida pelo Instituto
Butantan.
Competência
M. bovis BCG foram cultivadas em garrafas de 500 mL contendo 100 mL de
meio líquido Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, Oxford, UK) contendo albumina-
dextrose-catalase (ADC) 10% mais Tween80 0,05% (MB7H9) ou meio sólido
Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com ácido oléico-albumina-dextrose-
catalase (OADC) 10% (MB7H10), contendo ou não kanamicina (20 g/mL) a 37
o
C
em atmosfera úmida contendo 5 % de CO
2
com agitação periódica até a D.O. 0,5 a
600 nm. A cultura foi então centrifugada, lavada duas vezes com água miliQ a 4
o
C e
ressuspendidas em 10 % de glicerol. O estoque de BCG competente foi mantido a -
80
o
C.
Transformação e seleção
Micobactérias BCG competentes foram transformadas com os plasmídeos de
expressão por eletroporação. Para eletroporação, uma alíquota estoque de 50-200
l de BCG competente foi misturada com 1-10 g de DNA plasmidial em cuveta de
eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 F e 1000 ,
num eletroporador de pulsação (BioRad, Hemel Hempstead, UK). Após
eletroporação, o conteúdo das cuvetas foi recuperado em 5 mL de meio MB7H9 sem
antibiótico e incubado a 37
o
C por 20 h antes de ser semeado sobre MB7H10
XLVIII
contendo kanamicina (20 g/mL). Esperou-se de 20 a 30 dias de incubação a 37
o
C
em estufa com atmosfera úmida contendo 5 % de CO
2
para a seleção de colônias
transformadas. Para extração de proteínas ou preparação de vacina, as colônias
isoladas de BCG foram crescidas em garrafas de 200 mL contendo 50 mL de meio
Middle brook 7H9 suplementado com albumina de soro bovino 10 % ou Middle brook
7H10 suplementado com ODC, mais kanamicina 40 g/mL e incubadas a 37
o
C em
atmosfera úmida contendo 5 % de CO
2
até a saturação (20-30 dias).
Extração de proteínas
A partir dos 50 mL de meio de cultura descrito acima, 5 mL foram destinados
à extração de proteínas e os outros 45 mL para a preparação de vacina. Para a
extração de proteínas os 5 mL foram centrifugados a 4 000 rpm por 10‘, lavado (1x)
com 5 mL de PBS, centrifugados novamente e as bactérias re-suspensas em 500 l
de PBS estéril contendo inibidores de proteases como DTT, PMSF, Aproptin,
Leupeptin e Pepstatin (0.5 microlitro de cada). Em seguida congelaram-se as
amostras a -20
o
C para posterior sonicação. A sonicação, 18 ciclos com 10 segundos
cada, com intervalos de 10 segundos, as amostras foram centrifugadas para
precipitação de sólidos, e os sobrenadantes recuperados para quantificação de
proteína. Os extratos protéicos foram então aplicados em SDS-PAGE (gel de
poliacrilamida mais duodecil sulfato de sódio).
Preparação da vacina
Os 45 mL restantes foram centrifugados a 4 000 rpm por 10 minutos, o
precipitado lavado (2x) com 5 mL de água mili-Q estéril, centrifugado novamente e
as bactérias re-suspensas em 1 mL de uma solução de glicerol a 10 % em água,
estéril. As amostras foram aliquotadas em 50μl e conservadas a – 70
o
C para então
serem usadas como vacinas nos camundongos.
XLIX
Quantificação de proteína
A quantificação de proteínas de todas as amostras foi feita através do método
do Ácido Bicinconínico, utilizando BSA (Bovine Serum Albumin) para gerar a curva
padrão de análise.
Determinação do número de unidades formadoras de colônias (UFC).
Antes de se injetar as vacinas nos camundongos, foi preciso determinar o
número de UFC que seria aplicada nos animais. Amostras das vacinas foram
diluídas 10
5
e 10
6
vezes e plaqueadas em 7H10 mais kanamicina 20g/mL. Ao final
de 21 dias o número de colônias presentes nas placas foi contado, determinando-se
então o volume de vacina necessário para se introduzir 10
6
UFC de rBCG em cada
animal.
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio (SDS
PAGE)
Os géis de SDS-PAGE foram feitos em sistema descontínuo (Bio Rad Mini
Protean II, USA), constituído de gel separador com 12% de acrilamida (1,5 mL de
Tris-HCl 3M pH 8.8; 2,4 mL de Acrilamida/bisacrilamida 30%; 20μL de SDS a 10%;
45 μL de APS a 10%; 5 μL de TEMED; 2 mL de água destilada) e o gel de
empilhamento com 4% de acrilamida (1,5mL de Tris-HCl pH 6.8; 400μL de
Acrilamida/Bisacrilamida; 30μL SDS a 10%; 30μL de APS a 10%; 6μL de TEMED;
L
1,049mL de água destilada) em tampão de corrida Tris-Glicina (Tris-base 1,5%;
Glicina 7,2%; SDS 0.5%: pH 8,3) segundo a metodologia descrita por Laemmli
(1970). A corrente elétrica utilizada foi de 80v até as amostras cruzarem o gel de
empilhamento, em seguida, ajustada para 120v até o fim da corrida. Amostras de
extratos de rBCG (30 g/poço) foram aplicadas paralelamente.
Immunoblotting
Primeiramente, realizou-se uma SDS-PAGE conforme anteriormente descrito.
O gel foi carregado com 30μg de cada lisado de rBCG, rBCG-pLA71.1, rBCG-
pLA71.2, rBCG-pLA73.1, rBCG-pLA73.2, rBCG-pMIP12. Em seguida, as proteínas
contidas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio Rad,
USA) utilizando o sistema Bio Rad Mini Transblot II sob voltagem constante de 10v
por um período de 2h em tampão fosfato (Na
2
HPO
4
1,5%; NaH
2
PO
4
1,2%). Após a
transferência, a membrana foi corada com Ponceau S (Sigma Chemical Co, EUA)
(Ponseau S 1g; ác. acético 1mL; H
2
O destilada 100mL), lavada com água destilada
e bloqueada com 50mL de leite desnatado (leite Molico a 5% em PBST) overnight a
4ºC. Em seguida, a membrana foi incubada com anticorpo anti-BfpA de galinha (IgY)
e coelho (IgG), diluídos 1:300 e 1:1000, respectivamente, e incubados durante 1,5
hora a temperatura ambiente. A membrana foi lavada 5 vezes com PBST (NaCl
0,8%; Na
2
HPO
4
1,15%; KCl 0,2%; KH
2
PO
4
0,2%; 0,5% tween) por 5min cada
lavagem. Foi incubada com Anticorpo anti-IgY e anti-IgG marcado com peroxidase
(Southern Biotecnologies, EUA), diluído 1:3000 e 1:1000, respectivamente, durante
1,5h a temperatura ambiente. A membrana foi, novamente, lavada 5 vezes com
PBST (NaCl 0,8%; Na
2
HPO
4
1,15%; KCl 0,2%; KH
2
PO
4
0,2%; 0,5% tween) por
5min. Após as lavagens, a membrana foi revelada com solução 3,3-
Diaminobenzidina (DAB) (4,9mL H
2
0; 0,1mL Tris 2M pH 7,5; 0,3mL Imidazol 0,1mL,
5mg DAB, 0,05mL H
2
0
2
), a reação foi interrompida com adição de água destilada,
logo após a visualização das bandas.
ANIMAIS
Foram utilizados camundongos Swiss albinos do sexo feminino com cerca de
quatro semanas de vida, pesando entre 18 e 22g, CD14 knock out do sexo feminino
LI
com quatro semanas de vida e MyD88 knock out do sexo feminino com quatro
semanas de vida. Os animais foram fornecidos pelo Biotério de Camundongos
Isogênicos de Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Todos os animais foram mantidos em ambiente
com renovação de ar, alimentação e água ad libitum, obedecendo às normas éticas
para uso de animais de experimentação.
Esquema de imunização
Os camundongos Swiss foram divididos em seis grupos de acordo com a
Tabela 3. Todos os grupos foram imunizados quatro vezes (Sendo os boosters 7, 35
e 49 dias após a primeira imunização, de acordo com esquema apresentado na
Tabela 4) injetando-se, por via intraperitoneal (i. p.), 200µl de uma solução salina
estéril contendo 1x10
6
UFC/camundongo de BCG ou rBCG , o grupo 1, usado como
controle, foi imunizado com a vacina BCG, grupo 2 imunizado com a vacina rBCG-
pLH71.1.bfpA, grupo 3 imunizado com a vacina rBCG-pLH71.2.bfpA, grupo 4
imunizado com a vacina rBCG-pLH73.1.bfpA, grupo 5 imunizado com a vacina
rBCG-pLH73.2.bfpA e grupo 6 imunizado com a vacina rBCG-pMH12.bfpA .
Tabela 3: Divisão dos grupos de camundongos para imunização.
Grupo
Animais
Vacina
1
4 camundongos
BCG (controle negativo)
2
6 camundongos
rBCG-pLH71.1.bfpA
3
6 camundongos
rBCG-pLH71.2.bfpA
4
6 camundongos
rBCG-pLH73.1.bfpA
5
6 camundongos
rBCG-pLH73.2.bfpA
LII
6
6 camundongos
rBCG-pMH12.bfpA
Tabela 4: Esquema de Imunização de camundongos para verificar a produção
de anticorpos anti-BfpA e anti-BCG.
Dia (s)
Dose / Camundongo
0
10
6
bactérias
7
10
6
bactérias
35
10
6
bactérias
49
10
6
bactérias
Camundongos Swiss com 4 semanas de vida, pesando em média 18-22g, foram
injetados intraperitonealmente com suspensões de salina estéril contendo 1x10
6
rBCG/camundongo.
Coleta de Sangue
Amostras de sangue foram colhidas por capilaridade do plexo retro-orbital do
olho direito antes do início da imunização e 24 dias, 43 dias e 57 dias após a
primeira imunização. Após coagulação em temperatura ambiente (T.A.), as amostras
ficaram a 4°C overnight. As amostras foram centrifugadas a 1000g por 10 minutos a
T.A., os soros separados, aliquotados e armazenados a -20°C.
Elisa
LIII
As análises de indução de anticorpos específicos contra BfpA nos soros dos
animais imunizados foram feitas pelo método de ELISA. Numa placa de 96 poços
(Nalgene Nunc International, Rochester, N. Y.) foi adsorvida a proteína, BfpA ou
Extrato de BCG, (30g/mL) diluída em 50 µl de tampão Carbonato-bicarbonato, pH
9,6 e incubada a 4
o
C por toda noite. Após a adsorção do antígeno, as placas foram
lavadas duas vezes com PBST e bloqueados com gelatina 1% (150L/poço) diluída
em PBS por uma hora, a temperatura ambiente. Após o bloqueio e três novas
lavagens com PBST, foram acrescentados os anticorpos (50L/poço) diluídos em
PBST, começando com uma diluição inicial de 1:2 seguindo de diluições (fator 5) até
o limite de 1:250. Como controle, foi utilizado IgG de camundongos imunizados com
BCG e IgY anti-BfpA. A incubação da placa foi feita a 37ºC por 45 min. Após três
lavagens com PBST, foi adicionado o anticorpo conjugado anti-IgG de camundongo
(Southern Biotechnologies, EUA) marcado com peroxidase diluído 1:2000
(50L/poço) em PBST e nova incubação foi realizada a 37ºC por 45min. Esta reação
foi revelada pela adição do substrato H
2
O
2
e ortofenildiamina – OPD (Sigma
Chemical Co, EUA) diluídos em tampão (5,75mL H
2
0 dest.; 3,25mL ác. cítrico 0,1M;
3,5mL fosfato de sódio 0,2M; 5mg OPD; 0,005 H
2
0
2
). A reação foi interrompida
adicionando-se H
2
SO
4
3N (50L/poço) e lida em comprimento de onda de 492 nm
em espectrofotômetro de placas (Tittertek Multiskan).
Detecção de anticorpos Anti-BfpA por Western Blotting
Amostras da proteína BfpA purificada foram submetidas a SDS-PAGE com
gel contendo12% de acrilamida. A cada canaleta foram aplicados 15µg da proteína
BfpA purificada.
Ao termino da corrida, o gel foi submetido à etapa de eletrotransferência para
uma membrana de nitrocelulose de 0,45µm (Bio Rad). O gel, a membrana de
nitrocelulose e outros componentes do sistema de eletrotransferência foram imersos
em tampão de tranferência previamente resfriados a 4°C. em seguida, o gel foi
montado segundo orientações do fabricante Bio-Rad- Mini TRansfer Cell (Bio-Rad
Laboratories, Richmond, USA). Este sistema foi submetido à corrente de 80V/400mA
LIV
por 120 minutos. Terminada a tranferência, a membrana de nitrocelulose foi corada
por vermelho de Ponceau a 0,1% (Ponceau S Solution- Sigma Chemical Co., St
Louis, USA) para verificar se houve sucesso na transferência, e descorada com
água destilada. A seguir, a membrana foi imersa em uma solução bloqueadora (PBS
com 0,1% de Tween20 e 5% de leite em pó desnatado) overnight a 4°C. Após este
período, as membranas foram incubadas por 1,5h a T.A., sob agitação constante,
com um pool dos soros das quatro imunizaçoes de cada camundongo diluídos
(1:100) em solução de PBST 0,1% com 5 % de leite em pó desnatado. Na etapa
seguinte as membranas foram lavadas 5 vezes com PBST 0,1% por 5 minutos cada
lavagem, e incubadas com o segundo anticorpo Anti- IgM e IgG de camundongo
conjugado a peroxidase diluído 1:2000 em PBST 0,1% durante 1,5h a T.A. sob
agitação. Em seguida, foram feitas mais 5 lavagens com PBST 0,1% e a reação foi
revelada com uma solução contendo substrato enzimático mais a substância
cromógena 3,3‘diabenobenzidina (DAB- Sigma Co. St. Louis, EUA). Assim que as
bandas tornaram-se claramente visíveis, a reaçao foi interrompida pela adição de
água.
Desenvolvimento de modelos experimentais de diarréia e choque
endotoxêmico induzido por EPEC
Três grupos com oito camundongos BALB/c cada, três grupos com 4
camundongos CD14 knock out cada e três grupos com 4 camundongos MyD88
knock out cada foram infectados com 7,68 x 10
7
bactérias/camundongo, grupos 1 foi
infectado com a cepa B171 EPEC – EAF
(-)
numa solução de 200µl do meio de
cultura DMEM High Glucose, grupos 2 foi infectado com a cepa B171 EPEC – EAF
(+)
numa solução também de DMEM High Glucose e grupos 3 com DMEM High
Glucose, via oral (modelo diarréia), ou via intraperitoneal (modelo choque
endotoxêmico). No modelo diarréia a inoculação das bactérias é antecedida
(10min) pela introdução, via oral, de 200l de uma solução a 10% de bicarbonato de
sódio. Os sinais de diarréia como fezes aquosas, elevado consumo de água, perda
de peso e morte (relação mortos/vivos) durante o período de 72h após a infecção
foram registrados. Os sinais de endotoxemia, como prostração, alterações da
LV
coagulabilidade sangüínea, hemorragia e morte (relação mortos/vivos) também
foram registrados nas 72h após a infecção. Em ambos modelos, amostras de
sangue e lavado peritoneal foram coletados e armazenadas a 4°C para identificação
e contagem das células.
LVI
5 - Resultados
LVII
1- Clonagem da seqüência codificadora para BfpA de EPEC nos
plasmídeos pLA71, pLA73 e pMIP12.
Para a construção dos vetores de expressão de BfpA em BCG, o gene desta
subunidade foi amplificado por PCR a partir da construção pCYTEXPI::bfpA
utilizando iniciadores específicos. Um amplicon de aproximadamente 600pb foi
gerado como produto do PCR, e purificado a partir de um gel preparativo de agarose
usando o Kit-GFX
TM
PCR and Gel Band Purification Kit e clonado no vetor pGEM-T
easy originando a construção pGemT-BfpA o qual foi então digerido com as
endonucleases de restrição NotI e KpnI para liberação do inserto correspondente ao
gene bfpA. Os plasmídeos pLA71 e pLA73 também foram digeridos com as enzimas
de restrição Kpn I e Not I, e o pMIP12 foi digerido com as enzimas de restrição
BamH I e Kpn I (Fig 2). O gene bfpA foi então ligado aos vetores pLA71, pLA73 e
pMIP12, gentilmente cedidos pela Dra. Brigitte Gicquel do Instituto Pasteur (Fig 3 e
Fig 4). Estes oligonucleotídeos foram desenhados de modo que a inserção de BfpA
em pLA71 ou pLA73 mantivesse a fase de leitura com a seqüência sinal da -
lactamase ou com a -lactamase inteira para a produção das proteínas de fusão. As
construções obtidas foram denominadas pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e pMH12-bfpA.
Células competentes de Escherichia coli cepa DH5α foram transformadas com
pLA71-bfpA, pLA73-bfpA e pMIP12-bfpA. Dez colônias da placa contendo pLA73-
bfpA, 3 colônias da placa contendo pLA71-bfpA e 1 colônia da placa pMIP12-bfpA
foram selecionadas e analisadas. Os clones foram validados por PCR, utilizando os
mesmos iniciadores da clonagem.
LVIII
Fig 2- Digestão dos plasmídeos pGemT-BfpA, pLA71, pLA73 e pMIP12. Os
plasmídeos pGemT-BfpA, pLA71 e pLA73 foram digeridos pelas endonucleases KpnI e NotI
e do plasmídeo pMIP12 pelas endonucleases KpnI e BamHI. 1, PM; 2, pLA71; 3, pLA71; 4,
pLA73; 5, bfpA purificado; 6, pGemT-BfpA; 7, pMIP12. O gene bfpA possui
aproximandamente 600Kb, sendo indicado pelo 0,65Kb.
LIX
Figura 3- Representação esquemática dos vetores de expressão da série pLA.
Os dois vetores contêm as origens de replicação, ori-(E. coli) e ori-(myco); o gene de
resistência a kanamicina Km; o promotor mutado da -lactamase, pBlaF*; o códon
de iniciação e a seqüência sinal da -lactamase e o gene phoA. O gene heterólogo
ficaria em fusão com a seqüência sinal da -lactamase em pLA71 e em fusão com a
-lactamase inteira em pLA73.
LX
Figura 4- Representação esquemática do vetor de expressão pMIP12. O vetor
contém as origens de replicação, ori-(E. coli) e ori-(myco); o gene de resistência a
kanamicina Km; o promotor mutado da -lactamase, pBlaF*; o códon de iniciação e
sequência de Shine-Dalgarno micobacteriana.O gene heterólogo ficaria em fusão
com o promotor mutado da -lactamase.
LXI
2- Validação da clonagem dos vetores pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e
pMH12-bfpA
Para corroborar os resultados obtidos a partir da clonagem nos vetores
pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e pMH12-bfpA, realizamos o Método de Miniprep e
digestões com as endonucleases de restrição Kpn I e Not I para os plasmídeos
pLH71-bfpA (Fig 5A), pLH73-bfpA (Fig 5B) e as endonucleases KpnI e BamHI para
o plasmideo pMH12-bfpA (Fig 5C), como metodologia-base de validação .
Para verificar se o gene foi clonado na posição correta e observar possíveis
modificações no gene bfpA foi utilizado o seqüenciamento dos plasmideos pLH71-
bfpA, pLH73-bfpA e pMH12-bfpA (Fig 6).
Figura 5- Validação da clonagem dos vetores pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e
pMH12-bfpA: As construções foram confirmadas por análise de restrição. A, 1- PM,
2-6 plasmídeos pLH71-bfpA digeridos com as endonucleases KpnI e NotI; B, 1- PM,
2-6 plasmídeos pLH73-bfpA digeridos com as endonucleases KpnI e NotI; C, 1- PM,
2- pMIP12 vazio, 3-4 plasmídeos pMH12-bfpA digeridos com as endonucleases KpnI
e BamHI, 5-6 plasmídeos pMH12-bfpA digeridos com as endonucleases BamHI e
MboI, 7- poço vazio e 8 plasmídeo pMH12-bfpA digerido com as endonucleases
KpnI e AfeI.
LXII
Figura 6- Validação da clonagem dos vetores pLH71-bfpA, pLH73-bfpA e
pMH12-bfpA: As construções foram confirmadas por sequênciamento. A, pLH71-
bfpA; B, pLH73-bfpA; C, pMH12-bfpA. O destaque em vermelho aponta para o
começo o do gene bfpA sequenciado, e mostrar que o gene bfpA foi clonado de
maneira correta.
LXIII
3- Expressão da proteína BfpA em Mycobacterium smegmatis
recombinante e BCG recombinante
Alíquotas de Mycobacterium smegmatis MC155 competente foram transformados
com os vetores de expressão pLH71-bfpA ou pLH73-bfpA ou pMH12-bfpA. Os
transformantes foram então selecionados em meio sólido contendo kanamicina e
expandidos posteriormente em meio liquido, gerando rSmeg-pLH71-bfpA, rSmeg-
pLH73-bfpA, rSmeg-pMH12-bfpA, respectivamente. Extrato total dos diferentes
clones de rSmeg foram submetidos a SDS-PAGE seguido de Western blot usando
anticorpo IgG rabbit policlonal anti-BfpA. Só foi possível observar a expressão de
uma proteína de aproximadamente 21kD no ensaio de Western blot na construção
rSmeg-pMH12-bfpA (Fig 7, poço 8). O controle negativo, Smeg, não apresentou
banda (Fig. 7, poço 9). Como controle positivo foi usada duas amostras de BfpA
purificadas de EPEC (Fig 7, poço 2), onde se pode observar a banda
correspondente à proteína BfpA (Fig 7, poços 1-2).
Figura 7- Expressão da proteína BfpA da EPEC em Mycobacterium smegmatis
recombinante. Extrato total de Mycobacterium smegmatis ou Mycobacterium
LXIV
smegmatis recombinante (30 g) foram analisados por Western blot usando um
anticorpo IgG rabbit anti-BfpA. 1, BfpA; 2, BfpA; 3-4, rSmeg transformado com o
vetor pLH71-bfpA; 5-7, rSmeg transformados com o vetor pLH73-bfpA; 8, rSmeg
transformado com o vetor pMH12-bfpA; 9, Smeg nativa.
BCG competente foi transformado com pLH71-bfpA ou pLH73-bfpA ou
pMH12-bfpA e os clones de rBCG transformados foram selecionados em meio sólido
MB7H10/kanamicina e expandidos em meio líquido. Extratos protéicos de rBCG
transformados com os respectivos vetores de expressão foram fracionados em SDS-
PAGE 10% e submetidos à análise por Western blot usando um anticorpo policlonal
IgG rabbit anti-BfpA (Gentilmente cedido pela Dra Roxane). Os clones de rBCG
transformados com pMH12-bfpA, (rBCG-pMH12-bfpA) apresentaram uma banda
imunoreativa, correspondente a uma proteína de baixo peso molecular
provavelmente devido a algum grau de degradação da proteína fusionada, já que a
proteína BfpA apresenta um peso molecular de 21 kDa (Fig. 8, poço 9 e 2,
respectivamente), que é o peso molecular esperado da proteína de fusão BfpA. Já o
extrato de rBCG-pLA71 apresentou uma banda de 25 kDa, peso molecular esperado
da fusão entre a proteína BfpA com a seqüência sinal da -lactamase (21 + 4 kDa)
(Fig , poços 3-4). Os clones de rBCG transformados com pLH73-bfpA, (rBCG-
pLH73-bfpA) apresentaram uma banda imunoreativa de aproximandamente 54kD,
correspondente à fusão de BfpA com a -lactamase inteira (21 + 33 kDa) (Fig. 8,
poços 6-7). O controle negativo, BCG, não apresentou banda (poço 1). Como
controle positivo foi usada uma amostra de BfpA purificada (Fig. 8, poço 2), onde se
pode observar a banda correspondente à proteína BfpA (aproximadamente 21kDa)
(Fig 8, poço 2).
LXV
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 8- Expressão da proteína BfpA da EPEC em BCG recombinante. Extrato
total de BCG ou BCG recombinante (30 g) foram analisados por Western blot
usando anticorpo IgG rabbit anti-BfpA. 1, BCG; 2, BfpA; 3-4, rBCG transformado com
o vetor pLH71-bfpA; 5, sobrenadante do lisado da rBCG transformado com o vetor
pLH71-bfpA; 6-7, rBCG transformados com o vetor pLH73-bfpA; 8, sobrenadante do
lisado da rBCG transformado com o vetor pLH73-bfpA; 9, rBCG transformado com o
vetor pMH12-bfpA.
4- Resposta humoral de camundongos imunizados com rBCG-pLH71-bfpA,
rBCG-pLH73-bfpA e rBCG-pMH12-bfpA
Para verificar os níveis séricos de anticorpos específicos, titulou-se por ELISA
os anticorpos IgG e IgM anti-BfpA no soro dos camundongos vacinados. Grupos de
6 camundongos Swiss fêmeas foram imunizados i.p. com 10
6
UFC de rBCG-pLH71-
bfpA ou rBCG-pLH73-bfpA ou rBCG-pMH12-bfpA. Camundongos controles foram
imunizados com BCG (Fig 9). Uma dose reforço sob as mesmas condições foi
administrada após 7, 35 e 49 dias da primeira imunização. Os soros foram coletados
LXVI
individualmente no primeiro dia e a cada 1 semana após a primeira imunização e
boosters, e analisados por ELISA quanto à presença de anticorpos anti-BfpA. Após
os bossters, os camundongos que receberam as rBCG com seus respectivos
plasmídeos transformados com bfpA mostraram um aumento crescente nos níveis
de anticorpos anti-BfpA e obtiveram títulos máximos na última imunização, quando
comparados com o controle BCG (Figs. 10-14)
Os resultados do ELISA apontaram para a expressão da BfpA, dado
que a produção de anticorpos específicos contra BfpA foi detectada no soro dos
animais imunizados com rBCG-pLH71-bfpA ou rBCG-pLH73-bfpA ou rBCG-pMH12-
bfpA e foi caracterizada como dose dependente.
LXVII
BCG 2 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÕES
DO 592nm
camundongo 1
camundongo 2
camundongo 3
camundongo 4
controle positivo
controle negativo
BCG 3 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÕES
DO 592nm
CAMUNDONGO 1
CAMUNDONGO 2
CAMUNDONGO 3
CAMUNDONGO 4
CONTROLE POSITIVO
CONTROLE NEGATIVO
BCG 4 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÕES
DO 592nm
CAMUNDONGO 1
CAMUNDONGO 2
CAMUNDONGO 3
CAMUNDONGO 4
CONTROLE POSITIVO
CONTROLE NEGATIVO
Figura 9- Níveis séricos de anticorpos Ig Total anti-BfpA detectados por ELISA em soro
de camundongos vacinados com BCG. Grupo controle (negativo).
LXVIII
pLA71.1 2 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSITIVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA71.1 2 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSITIVO
pLA71.1 3 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSITIVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA71.1 3 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
pLA71.1 4 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IV O
pLA71.1 4 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
Figura 10- Níveis séricos de anticorpos Ig Total anti-BfpA detectados por ELISA em
soro de camundongos vacinados com rBCG- pLH71.1-bfpA. A- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH71.1 analisados com gráficos DO x diluições. B- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH71.1 analisados com gráficos utilizando a medida U-ELISA.
LXIX
pLA71.2 2 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA71.2 2 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONTROLE POSIT IVO
pLA71.2 3 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA71.2 3 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
pLA71.2 4 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSITIVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA71.2 4 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
Figura 11- Níveis séricos de anticorpos Ig Total anti-BfpA detectados por ELISA em
soro de camundongos vacinados com rBCG- pLH71.2-bfpA. A- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH71.2 analisados com gráficos DO x diluições. B- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH71.2 analisados com gráficos utilizando a medida U-ELISA.
LXX
pLA73.1 2 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA73.1 2 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
pLA73.1 3 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA73.1 3 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
pLA73.1 4 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA73.1 4 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONT ROLE POSIT IVO
Figura 12- Níveis séricos de anticorpos Ig Total anti-BfpA detectados por ELISA em
soro de camundongos vacinados com rBCG- pLH73.1-bfpA. A- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH73.1 analisados com gráficos DO x diluições. B- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH73.1 analisados com gráficos utilizando a medida U-ELISA.
LXXI
pLA73.2 2 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IV O
CNT ROLE NEGATIVO
pLA73.2 2 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONTROLE POSITIVO
pLA73.2 3 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA73.2 3 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONTROLE POSITIVO
pLA73.2 4 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pLA73.2 4 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONTROLE POSITIVO
Figura 13- Níveis séricos de anticorpos Ig Total anti-BfpA detectados por ELISA em
soro de camundongos vacinados com rBCG- pLH73.2-bfpA. A- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH73.2 analizados com gráficos DO x diluições. B- Soro de animais
imunizados com rBCG-pLH73.2 analizados com gráficos utilizando a medida U-ELISA.
LXXII
pMIP12 2 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pMIP12 3 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 3
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pMIP12 3 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONTROLE POSITIVO
pMIP12 4 IMUNIZAÇÃO
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0,5 0,1 0,02 0,004
DILUIÇÃO
DO 592nm
CA MUNDONGO 1
CA MUNDONGO 2
CA MUNDONGO 4
CA MUNDONGO 5
CA MUNDONGO 6
CONT ROLE POSIT IVO
CONT ROLE NEGAT IVO
pMIP12 4 IMUNIZAÇÃO
0
2
4
6
8
10
12
0,5 0,1 0,02 0
DILUIÇÃO
U-ELISA
U-ELISA
CONTROLE POSITIVO
Figura 14- Níveis séricos de anticorpos Ig Total anti-BfpA detectados por ELISA em
soro de camundongos vacinados com rBCG- pMH12-bfpA. A- Soro de animais
imunizados com rBCG-pMH12 analizados com gráficos DO x diluições. B- Soro de animais
imunizados com rBCG-pMH12 analizados com gráficos utilizando a medida U-ELISA.
LXXIII
As amostras da proteína BfpA de EPEC foram submetidas a eletroforese SDS-PAGE
e posteriormente transferidas à membrana de nitrocelulose e submetidas a reação individual
com anticorpos IgM e IgG provenientes do soro dos camundongos imunizados. Pode-se
observar na Figura 15 que os anticorpos séricos IgM e IgG foram capazes de reconhecer a
proteína BfpA com exceção do grupo de camundongos imunizados com BCG não
tranformado com os plasmídeos clonados com BfpA. O controle positivo (IgY anti-BfpA) foi
capaz de reconhecer a proteína purificada BfpA.
Figura 15 – Detecção de anticorpos Ig Total anti-BfpA de camundongos imunizados
com as vacinas recombinantes. A- Grupo de 6 Camundongos imunizados com rBCG-
pLH71-bfpA. B- Grupo de 6 Camundongos imunizados com rBCG-pLH73-bfpA. C- Grupo de
5 Camundongos imunizados com rBCG-pMH12-bfpA. D- Grupo de 4 Camundongos
imunizados com BCG (Controle negativo).
LXXIV
5- Modelos experimentais de diarréia e choque endotoxêmico induzido por
EPEC
Diarréia não foi observada em animais infectados com EPEC. Entretanto,
choque séptico foi observado tanto em camundongos Balb/c quanto em
camundongos CD14 KO e Myd88 KO infectados com 7,68 x 10
7
EPEC típica e
EPEC atípica (Fig.16). Camundongos previamente tratados com IgY anti-BfpA e
infectados com EPEC típica não mostrou um índice de sobrevivência
significativamente diferente do tempo inicial (tempo 0h)). Porém todos os grupos
demonstraram uma redução significativa do índice de sobrevivência passadas 24h
da infecção. Isto mostra uma atividade neutralizante específica do anticorpo IgY anti-
BfpA (Fig. 16).
LXXV
Figura 16- Índice de sobrevivência observado até 72h após a infecção: A-
Camundongos Balb/c, CD14 KO e Myd88 KO infectados com 7,68 x 10
7
EPEC típica ou
atípica. Representativo de três experimentos. B- Índice de sobrevivência de camundongos
Balb/c previamente tratados com 1,5mg/ml de IgY especíco ou não específico e infectados
com7,68 x 10
7
EPEC típica ou atípica ou controle.
Foi coletado um infiltrado de células do peritônio dos camundongos após 8 horas da
infecção com EPEC típica ou atípica (Fig. 17). Neste infiltrado, os neutrófilos foram as
células predominantes, totalizando 61,3% (±3.2%) ou 72.3% (±2.5%) das células
encontradas nos camundongos infectados com EPEC atípica e típica, respectivamente,
quando comparado com o controle (36% ±5.3%) (p<0.001). A presença de linfócitos no
infiltrado peritoneal foi significante (p<0.001) após 8 horas da infecção com EPEC típica
(Fig. 18).
LXXVI
Figura 17 – Contagem das células presentes no infiltrado peritoneal de
camundongos infectados com EPEC típica e atípica em Câmara de Neubauer, nos
tempos 0, oito e vinte horas após a infecção. A quantidade de células foi máxima no
tempo de oito horas após a infecção.
Figura 18 – Contagem das células presentes no infiltrado peritoneal de
camundongos infectados com EPEC típica e atípica por Cytospin, nos tempos 0, oito
e vinte horas após a infecção. Neutrófilos manteve-se em maior quantidade em todos os
tempos quando comparados com os linfócitos.
O número de CFU do lavado peritoneal foi maior em camundongos infectados com
EPEC atípica (Fig. 19). Depois de 8 horas da infecção, o número de CFU encontrado nos
lavados peritoneais de camundongos infectados com EPEC típica foi drasticamente
LXXVII
reduzido, e após 20 horas não foi observado nenhuma CFU nas placas contendo LB-Ágar.
Camundongos Balb/c previamente tratados com anticorpo IgY anti-BfpA ou anticorpo não
específico, não alteraram este resultado (dados não mostrados).
Figura 19 – Contagem do número de CFU encontrado no lavado peritoneal nos
tempos 0, 8 e 20 horas após a infecção com EPEC típica ou atípica.
LXXVIII
6 - Discussão
LXXIX
A diarréia infantil é responsável por mais de dois milhões de mortes em
crianças menores de 5 anos por ano em todo o mundo. A grande maioria das mortes
ocorre em países em desenvolvimento, na primeira infância, onde a EPEC é um dos
principais agentes bacterianos envolvidos. Baixas condições sócio- econômicas e
subnutrição são causas concorrentes que favorecem a existência e manutenção da
contaminação por E. coli no meio ambiente (Fagundes- Neto e Scaletsky, 2000).
As medidas direcionadas à prevenção, tratamento e controle de infecções
envolvem vigilância epidemiológica permanente e em grande escala. A
imunoprofilaxia, ou vacinação, é a medida mais eficiente e menos onerosa na
prevenção de doenças infecciosas. A erradicação da varíola e o sucesso com a
tríplice (DTP - difteria, tétano e pertussis, ou tosse comprida) e com a Sabin são
provas contundentes da importância desses programas de vacinação. No entanto,
fatores culturais, sociais e econômicos dificultam a realização de diversas
campanhas de vacinação, especialmente em países em desenvolvimento, onde os
sistemas de saúde são por vezes déficitários. Essa conjuntura levou a comunidade
científica a um esforço para desenvolver vacinas multivalentes. Em especial,
procuram-se veículos vivos de apresentação de antígenos, uma vez que a
expressão contínua do imunógeno poderia eliminar a necessidade de várias doses
de reforço para se alcançar uma proteção máxima, o que é o caso de várias vacinas
atualmente em uso. Veículos que têm sido particularmente investigados são:
Vaccínia, Salmonella atenuada, ou BCG (Bacilo Calmette-Guerin, vacina contra a
tuberculose), com resultados empolgantes (Levine, 1997).
Neste trabalho propusemos um sistema de produção de cepas de
Mycobacterium Bovis Calmette-Guerin (BCG) que expressa fator de virulência (BfpA)
de EPEC. Para tal, geramos umas cepas de BCG recombinantes capazes de
expressar a proteína BfpA e assim induzir níveis séricos de anticorpos anti-BfpA. A
proteína BfpA é um dos mediadores envolvidos nos fenótipos de aderência
localizada (LA) e autoagregação (AA) de EPEC à células epiteliais ou à enterócitos
em culturas in vitro e em biópsias. A BfpA é uma proteína integrante da patogênese
inicial da bactéria, que é marcadamente bloqueada por antissoros específicos
contendo anticorpos anti-BfpA.
LXXX
O BfpA teve seu gene (bfpA) clonado, inserido em vetores de expressão
(pLA71, pLA73 e pMIP12). Estes foram usados para transformar cepas de
Mycobacterium smegmatis e Mycobacterium bovis. Nós obtivemos uma expressão
estável da proteína BfpA de EPEC em fusão tanto com a proteína beta-lactamase
inteira quanto quando fusionada somente com sua seqüência sinal e também no
vetor pMIP12.
Em nosso estudo demonstramos que a imunização intraperitoneal de
camundongos BALB/c com a vacina BCG recombinante expressando a proteína
BfpA foi capaz de induzir resposta imune BfpA-específica como ocorreu previamente
com a expressão de BfpA em Salmonella typhimurium (Shriefer et al, 1999). A
adição de doses subseqüentes em nosso programa de imunização, induziu um
aumento da resposta específica.
A escolha da BCG como vetor do gene bfpA pode ser justificada por várias
razões: primeiro, é uma das vacinas mais utilizadas mundialmente, tendo já sido
administrada a 3 bilhões de indivíduos; segundo, é recomendada pela OMS para
ser administrada ao nascimento e por via oral não sendo afetada pelos anticorpos
maternos; terceiro, possui um potente efeito imunoestimulante e adjuvante; quarto, é
capaz de estimular tanto resposta imune humoral quanto celular; quinto, é uma das
vacinas replicantes mais estáveis, induzindo imunidade duradoura; sexto, é segura e
estável a temperatura ambiente e tem um baixo custo de produção (Bloom & Fine,
1994).
Micobactérias como M. tuberculosis ou BCG infectam macrófagos e podem
sobreviver por longos períodos no seu interior, estimulando continuamente o sistema
imune. Vários estudos têm demonstrado que BCG recombinante expressando
proteínas heterólogas pode induzir os 3 tipos de resposta imune necessários para
proteção contra vários patógenos: I) produção de anticorpos IgG por células B; II)
proliferação de linfócitos T e produção de linfocinas, inclusive interferon-gama (IFN-
g); III) e produção de linfócitos T-citotóxicos, com restrição por classe I do complexo
principal de histocompatibilidade. Antígenos de diversos patógenos virais,
bacterianos e de parasitas, como HIV, Streptococcus pneumoniae, Clostridium
tetani, Borrelia burgdorferi, Plasmodium falciparum, Schistosoma mansoni, etc,
LXXXI
foram expressos em BCG recombinante, induzindo respostas humorais e/ou
celulares e, em alguns casos, levando à proteção contra um desafio com o patógeno
(Gicquel, 1995).
O esquema de imunização de camundongos com BCG recombinante,
contendo o gene bfpA, foi capaz de induzir uma resposta imune com altos níveis de
anticorpos séricos (Fig10-14) Estes anticorpos anti-BfpA foram detectados no
plasma sanguíneo após as primeiras imunizações com a vacina BCG recombinante
e aumentaram com a realização de Boosters. Estes resultados apontam para a
utilização da vacina BCG recombinante contendo o gene bfpA como uma vacina de
eleição para combater a diarréia infantil causada por EPEC.
No desenvolvimento de uma vacina de BCG recombinante, a expressão da
proteína heteróloga pode ser conseguida através de um vetor de expressão
extracromossomal ou a partir de um vetor integrativo, sendo que o primeiro, em
geral, leva à maiores níveis de expressão e o segundo, a expressão mais estável.
Os vetores de expressão extracromossomais têm sido mais utilizados, sendo
vetores-ponte com origem para replicação em micobactéria e em Escherichia coli,
onde é realizada toda a manipulação genética dos vetores. Os vetores de expressão
devem ter um marcador de seleção para isolar os transformantes, onde se usa em
geral um gene de resistência a antibiótico. O gene que tem sido mais usado é o
gene Tn903, que confere resistência a kanamicina, uma vez que as micobactérias
são naturalmente resistentes a antibióticos b-lactâmicos (3).
Nós utilizamos vetores de expressão que contêm o promotor pBlaF*, que
levou a elevada expressão de antígenos de outros patógenos, com ou sem a
seqüência sinal de exportação da b-lactamase (ssBlam) (gentilmente cedidos pela
Dra. Brigitte Gicquel, Instituto Pasteur, Paris), que os direcionaria à exportação.
Assim, o vetor pLA71 coloca o gene em fusão com ssBlam e o pLA73 com o gene
inteiro da Blam.
A expressão de BfpA em Salmonella já havia sido descrita, demonstrando
proteção induzida. No entanto, uma vez que essas são vacinas vivas, podendo
permanecer no organismo por longos períodos, não seria aceitável sua
LXXXII
administração em humanos, pela possibilidade de disseminação do gene de
resistência a antibiótico para outras bactérias. Recentemente foi descrito um sistema
de expressão em BCG, utilizando cepas auxotróficas, desenvolvidas para posterior
complementação com um vetor que expresse o gene eliminado, conjuntamente com
o antígeno recombinante. Dessa forma, evita-se a seleção com antibiótico e,
conseqüentemente, o uso do gene de resistência, produzindo-se uma cepa de rBCG
adequada para administração em humanos.
Nossos resultados indicam que rBCG-BfpA poderia constituir uma vacina
eficiente e de baixo custo, contra tuberculose e diarreia causada por EPEC com
claras vantagens para países em desenvolvimento.
Muitas têm sido as tentativas para a elaboração de modelos experimentais de
diarréia e choque séptico induzido por EPEC, mas até agora nada foi padronizado
com a diarréia. Porém, em camundongos infectados com EPEC foi observado
choque séptico.
LXXXIII
7- Conclusões
LXXXIV
De acordo com os resultados obtidos, foi possível chegar as seguintes
conclusões:
Foi possível a clonagem e expressão do gene bfpA nos plasmídios pLA71,
pLA73 e pMIP12.
Os camundongos imunizados com a proteína recombinante BfpA, expressada
em vetor BCG, produzem anticorpos específicos capazes de reconhecer o BfpA
purificado.
Foi possível caracterizar um modelo animal para o choque endotoxêmico
induzido por EPEC, mas não um modelo animal para diarréia causada pelo
patógeno.
LXXXV
LXXXVI
8 - Referências
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