ads:
SENSIBILIDADE À DESSECAÇÃO, ARMAZENAMENTO,
GERMINAÇÃO E MORFOLOGIA DE SEMENTES DE Cupania
vernalis Camb.
CARLOS VINÍCIO VIEIRA
2005
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
CARLOS VINÍCIO VIEIRA
SENSIBILIDADE À DESSECAÇÃO, ARMAZENAMENTO,
GERMINAÇÃO E MORFOLOGIA DE SEMENTES DE Cupania vernalis
Camb.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras como parte das
exigências do programa de Pós-Graduação
em Agronomia, área de concentração em
Fisiologia Vegetal, para a obtenção do
título de "Mestre".
Orientador
Prof. Dr. Amauri Alves de
Alvarenga
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2005
ads:
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Vieira, Carlos Vinício
Sensibilidade à dessecação, armazenamento, germinação e morfologia de
sementes de Cupania vernalis Camb. / Carlos Vinício Vieira. -- Lavras : UFLA,
2005.
65 p. : il.
Orientador: Amauri Alves de Alvarenga
Dissertação (Mestrado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Camboatá. 2. Sapindaceae. 3. Variação fisiológica. 4. Variação bioquímica.
5. Variação ultraestrutural. 6. Variação morfoanatômica. I. Universidade Federal
de Lavras. II. Título.
CDD-582.16
-634.9
CARLOS VINÍCIO VIEIRA
SENSIBILIDADE À DESSECAÇÃO, ARMAZENAMENTO,
GERMINAÇÃO E MORFOLOGIA DE SEMENTES DE Cupania vernalis
Camb.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de
concentração em Fisiologia Vegetal, para
a obtenção do título de "Mestre".
APROVADA em 9 setembro de 2005
Pesq. Dr. Edvaldo Aparecido Amaral da Silva UFLA
Prof. Dr Evaristo Mauro de Castro UFLA
Prof. Dr Renato Mendes Guimarães UFLA
Prof. Dr. Amauri Alves de Alvarenga
DBI/UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
Resplandecente é a sabedoria,
e sua beleza é inalterável:
os que a amam descobrem-na facilmente,
os que a procuram encontram-na.
Sab 6, 12-13,
DEDICO.
À comunidade científica,
OFEREÇO.
AGRADECIMENTOS
Gostaria eu que essa página fosse suficiente para relatar e agradecer uma
parte da minha vida, não apenas no período de pós-graduação, mas que iniciou a
partir do momento em que passei no vestibular. Logo em seguida, já no início do
curso de agronomia, Deus me presenteou colocando pessoas no meu caminho
que foram as melhores amizades, as quais cultivo até nos dias atuais. Amigos de
alojamento estudantil. Esses vão ficar gravados pra sempre. Luciano Donizete,
mais do que um amigo... seus ensinamentos me fizeram engrandecer ainda mais.
Cezinha, meu grande amigo de balada, nossas histórias de bagunça ainda vão
gerar muitas risadas. Natalino, vou ser sincero, a moça que casar com você é a
maior sortuda, pois, afinal, esse era o único cara sério. Dr. Garga, pessoa humilde
como essa, nem de encomenda se encontra mais. Elvis, esse me ensinou que as
coisas sempre podem ser resolvidas de uma forma mais fácil. Grande amigo de
curso e de estudos. Professor Evaristo, a você sou muito grato por quem sou e
onde estou hoje, pessoa que me adotou e me ensinou não apenas anatomia
vegetal, mas como lidar com situações futuras, como pessoa e como profissional.
“Faça bem feito hoje, que no futuro colheremos bons frutos”. Fiz com o coração
e hoje sou feliz por isso. Muito obrigado, professor e fique sabendo que não pára
por aqui, ainda temos muito para partilhar. Professor Amauri, mais que um
orientador, um amigo, pessoa a quem agradeço pelo empenho na minha formação
e nas nossas conversas sobre a vida e sobre as oportunidades dadas a mim.
Professores Renato Mendes Guimarães, Eduardo Alves e Edvaldo Aparecido
Amaral da Silva, muito obrigado pela disposição e troca de idéias sobre a
execução dos experimentos. Agradeço a todos os professores do curso de
Fisiologia Vegetal, pelos conhecimentos transmitidos dentro e fora da sala de
aula. Agradeço ao grande amigo Morbeck que, nos momentos em que passei por
problemas financeiros estava lá com o mensalão disponível. Joel, Odorêncio,
Tanhã, Lena e Barrinha, a amizade de vocês é mais do que um presente. Joel
sempre fui eu...
Agradeço a vivência que todos meus colegas de curso me
proporcionaram, cada um ficará registrado no coração.
Agradeço à Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de
Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, pela oportunidade. À CAPES, pela
concessão da bolsa e ao grande amigo Msc Érico de Castro Lima Júnior, pelos
conhecimentos partilhados e que me proporcionoram trabalhar com essa espécie.
Por fim, agradeço aos meus pais, Baltazar Luiz Vieira e Maria Aparecida
Inácio Vieira, por terem me incentivado a continuar na vida acadêmica. A todos
que por esse momento tenho no coração, aqui fica meu sincero muito obrigado ao
pai, Deus. “Caminho, verdade e vida”.
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................i
ABSTRACT ..........................................................................................................ii
1 INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................1
2 REFERENCIAL TEÓRICO...............................................................................2
2.1 Descrição da espécie.........................................................................................2
2.2 Aspectos da tolerância à dessecação e do armazenamento de sementes ..........3
2.2.1 Papel de moléculas protetoras na tolerância à dessecação.............................9
2.2.1.1 Oligossacarideos (carboidratos solúveis)....................................................9
2.2.1.2 Proteínas termorresistentes.......................................................................10
2.3 Estudos ultra-estruturais ................................................................................12
2.4 Germinação, anatomia e morfologia de plântulas..........................................13
3 MATERIAL E MÉTODOS ..............................................................................14
3.1 Cosiderações gerais.........................................................................................14
3.2 Ponto crítico de secagem das sementes ..........................................................14
3.3 Armazenamento das sementes........................................................................16
3.4 Análise ultra-estrutural da semente durante a secagem e armazenamento....17
3.5 Determinação de açúcares solúveis totais......................................................17
3.7 Extração e quantificação de proteínas termorresistentes ...............................18
3.8 Caracterização anatômica e morfológica ......................................................19
3.9 Análise estatística ..........................................................................................20
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................21
4.1 Aspectos da germinação e ultra-estruturais em sementes de Cupania
vernalis Camb. submetidas a testes de tolerância à dessecação ...........................21
4.2 Germinação e aspectos ultra-estruturais de sementes de Cupania
vernalis Camb. submetidas ao armazenamento..................................................26
4.3 Carboidratos solúveis: açúcares solúveis totais.............................................36
4.4 Proteínas termorresistentes............................................................................38
4.5 Características morfológicas e anatômicas de plântulas de Cupania
vernalis Camb......................................................................................................40
4.5.1 Características anatômicas da semente.......................................................40
4.5.2 Morfologia da germinação..........................................................................42
4.5.3 Características anatômicas das plântulas nos diferentes estádios
de desenvolvimento ............................................................................................43
5 CONCLUSÕES.................................................................................................49
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................50
ANEXOS..............................................................................................................59
i
RESUMO
VIEIRA, Carlos Vinício. Sensibilidade à dessecação, armazenamento,
germinação e morfologia de sementes de Cupania vernalis Camb. Lavras:
UFLA, 2005. 61 p. (Dissertação – Mestrado em Agronomia/Fisiologia Vegetal)
∗
Sementes de Cupania vernalis Camb. possuem características recalcitrantes
quando submetidas à secagem, além de uma curta longevidade, necessitando da
aplicação de conhecimentos relacionados a fatores que interferem no
armazenamento e conservação. Nesse estudo, objetivou-se avaliar as variações
fisiológicas, bioquímicas, ultra-estruturais e morfoanatômicas de sementes de
Cupania vernalis Camb., quando submetidas a diferentes temperaturas e teores
de água, durante o armazenamento. Para o estudo da dessecação, as sementes
foram secadas nos seguintes graus de umidade: 45%, 40%, 35%, 30%, 25%,
20%, 15% e 10%, posteriormente submetidas a testes para identificação de
proteínas termorresistentes e colocadas para germinar. No armazenamento,
sementes com graus de umidade de 40%, 35%, 30% foram acondicionadas em
sacos plásticos e armazenadas sob temperatura controlada de 10ºC e 25ºC,
avaliadas nos tempos, 0, 120 e 240 dias, quanto ao grau de umidade,
germinação, IVE, açúcares solúveis totais e características ultra-estruturais. Na
caracterização dos tecidos da semente, foi empregado teste histoquímico com
Sudan III, Floroglucinol e Lugol. Para a descrição anatômica das plântulas,
empregou-se azul de astra com safranina. Os resultados referentes ao teste de
tolerância à dessecação revelaram que 30% de umidade é o grau crítico, sendo
classificada como recalcitrante, havendo expressão de HSP. A combinação do
grau de umidade de 40% com a temperatura de 10ºC favorece sua conservação.
Sementes conservadas a 25ºC, apresentaram maior teor de açúcares solúveis
totais. As sementes são revestidas por um tegumento lignificado e, aos 60 dias
após a protrusão, já é identificado o inicio da formação de estruturas secundárias
na plântula.
∗
Comitê Orientador: Amauri Alves de Alvarenga (Orientador) – UFLA,
Evaristo Mauro de Castro (Co-orientador)- UFLA.
ii
ABSTRACT
VIEIRA, Carlos Vinício. Sensibility to desiccation, storage, germination and
morphology of Cupania vernalis Camb. seeds. Lavras: UFLA, 2005. 61 p.
(Dissertation – Master in Agronomy/Plant Physiology)
∗
Cupania vernalis Camb. seeds have a short longevity with a recalcitrant
behavior when submitted to drying. These demand the development and
adoption of technologies to improve storage and conservation of the seeds. Thus,
the objective of this work was to evaluate physiological, biochemical, ultra-
structural and morpho-anatomic aspects of Cupania vernalis seeds at different
storage temperatures and seed moisture content. For the desiccation sensitivity
studies the seeds were dried at eight different water content: 45%, 40%, 35%,
30%, 25%, 20%, 15% and 10%. The expression pattern of proteins resistant to
heat and seed germination were verified at each moisture content. Seeds with
40%, 35% and 30% of water content were conditioned in plastic bags and stored
at 10ºC and 25ºC under controlled temperature. During 0, 120 and 240 days of
storage seeds were taken for evaluation of water content, germination,
emergency index, soluble sugars content and ultra-structural studies. The
morpho-anatomic study of the seeds was performed by using a hystochemical
test with Sudan III, Floroglucinol and Lugol. For the anatomical description of
the seedlings was used Astra blue with Safranin. The results regarding to
desiccation sensitivity showed that the water content at 30% was critical. During
desiccation the recalcitrant behavior was confirmed, although the _expression of
proteins resistant to heat was observed at 30% of water content. The moisture
content of 40% in combination with 10ºC during storage favors seeds
conservation. Seeds stored at 25ºC showed higher soluble sugars content. The
morpho-anatomic studies showed that the seeds were covered by a lignified
tegument and at 60 days after radicle protrusion the formation of secondary
structures in the seedlings was observed.
∗
Guidance Committe: Dr. Amauri Alves de Alvarenga -UFLA (Adviser) -
UFLA, Dr. Evaristo Mauro de Castro – UFLA (Co-adviser).
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
A flora brasileira representa a maior diversidade de espécies vegetais do
mundo, com grande potencial de utilização para diversos fins. No entanto, a
maioria das espécies carece de estudos relacionados à conservação de sementes
e germinação.
Em uma avaliação sobre a importância de uma determinada espécie,
torna-se difícil encontrar parâmetros que não a classifiquem como não sendo de
interesse conservacionista ou de grande potencial econômico, tendo em vista
seus valiosos produtos, como madeira, frutos, resinas, medicamentos e néctares,
dentre outros.
Nos últimos anos, não só o país, mas o mundo todo, tem sido vítima de
uma exploração extrativista e descontrolada dos recursos naturais,
principalmente dos cerrados e florestas, para a ocupação por áreas agrícolas e
pecuária, colocando em risco de extinção várias espécies consideradas de grande
importância para a integridade dos ecossistemas.
Projetos de recomposição ou recuperação de áreas degradadas são
dependentes de formas de coleta, conservação e propagação de espécies com
potencial para tal finalidade.
O êxito dos projetos de reflorestamento depende, entre outros fatores, da
correta seleção de espécies, bem como da disponibilidade e conservação de suas
sementes. Devido à grande diversidade de espécies e as suas complexas inter-
relações e interações com o meio, a seleção será tanto mais correta quanto maior
for o conhecimento relativo às espécies de interesse principalmente quanto a sua
propagação.
Pouco se sabe sobre o armazenamento (conservação) e posterior
germinação de Cupania vernalis Camb.A sensibilidade à dessecação é admitida
como interferente na conservação dessas sementes (Lima Júnior, 2004). Desse
2
modo, tem-se sugerido o armazenamento com elevados graus de umidade em
sacos plásticos. Segundo Lorenzi (2000), a germinação das sementes é lenta e
muito baixa; por isso elas devem ser semeadas logo após a colheita, uma vez que
a viabilidade é curta.
Diante dessa problemática, este trabalho objetivou avaliar as variações
fisiológicas, bioquímicas, ultra-estruturais e morfoanatômicas de sementes de
Cupania vernalis Camb., quando submetidas a diferentes temperaturas e teores
de água, durante o armazenamento.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Descrição da espécie
Cupania vernalis Camb., uma das principais espécie da família
Sapindaceae, é conhecida popularmente como camboatá, camboatã e arco-de-
peneira, dentre outros. As plantas, quando adultas, podem atingir de 10 a 22m de
altura, com tronco entre 50-70cm de diâmetro. Suas folhas são simples no
estádio inicial de desenvolvimento, lançando, posteriormente, folhas compostas,
pinadas e alternas, com 10 a 18 folíolos de 6 a 15cm de comprimento e bordos
serrados. As flores são pequenas, em panículas de 10 a 20cm de largura.
Floresce entre os meses de março a maio e a maturação dos frutos ocorre entre
os meses de setembro a novembro. Os frutos são do tipo cápsula, contendo de
uma a três sementes ovóides de cor negra brilhante com arilo amarelo-
alaranjado. A espécie é de grande utilidade, pois a sua madeira é própria para
obras internas, marcenaria, forma para calçados, lenha e carvão. Pode ser
empregada no paisagismo, principalmente na arborização de ruas. É uma espécie
de grande utilidade para plantios mistos destinados à recuperação de áreas
degradadas de preservação permanente, pois, além de serem adaptadas à
3
insolação direta, os seus frutos são utilizados na alimentação por pássaros
(Lorenzi, 2000).
As espécies da família Sapindaceae são tradicionalmente utilizadas na
medicina como diuréticos, estimulantes, expectorantes, sedativos, vermífugos e
contra estomatites e dermatites, em diversas partes do mundo. No Brasil, a
espécie Paullinia cupana, popularmente conhecida como guaraná, é a mais
difundida e conhecida representante da família (Cavalcanti, 2001). Extratos da
casca da arvore da espécie Cupania vernalis são utilizados na medicina popular
contra tosses convulsivas e asma (Rodrigues & Carvalho, 2001).
2.2 Aspectos da tolerância à dessecação e do armazenamento de sementes
Durante o desenvolvimento, as sementes que toleram a dessecação
progridem por fases de histodiferenciação com aumentos na biomassa e
deposição de reservas, seguidas por um ganho rápido de matéria seca durante a
maturação e posterior secagem, cessando a acumulação de matéria seca com a
diminuição da biomassa e perda de água pela semente. Logo após a
histodiferenciação, as sementes adquirem a habilidade de germinar e tornam-se
tolerantes à dessecação.
A maior parte das espécies possui sementes denominadas ortodoxas, as
quais suportam dessecação a graus de umidade de até 5%; outras produzem
sementes classificadas como intermediárias, que toleram dessecação a graus de
umidade de até 10% a 12,5%, enquanto outras possuem sementes conhecidas
como recalcitrantes, que não toleram dessecação a graus de umidade inferiores a
15% ou 20% (Roberts, 1973; Hong & Ellis, 1996). Recentemente, as sementes
ortodoxas, intermediárias e recalcitrantes, que até então apresentavam uma
abordagem qualitativa, passaram a ter um enfoque quantitativo (Walters, 2000),
levando em consideração a magnitude da tolerância à dessecação entre as
4
sementes altamente sensíveis e as que suportam a perda de maior parte de água
presente (Berjak e Pammenter, 2000).
Sementes recalcitrantes, ou seja, aquelas não toleram perdas
significativas do conteúdo de água e baixas temperaturas, sofrem
histodiferenciação até certo ponto, de forma semelhante às sementes ortodoxas,
que é seguida por uma fase de acumulação de reservas (Farrant et al., 1992).
Porém, o padrão de desenvolvimento em sementes recalcitrantes se apresenta de
forma diferencial com acumulação de matéria seca até o momento da dispersão
(Lin e Chen, 1995).
De todas as espécies já estudadas, com exceção de Avicennia marina,
nas demais existe uma redução no conteúdo de água com a etapa final do
desenvolvimento da semente. Em sementes de A. marina, o conteúdo de água
permanece inalterado durante o desenvolvimento, com a mesma taxa de matéria
seca e água. Isso ocorre em função das reservas principais nessa espécie serem
açúcares solúveis, em vez de compostos insolúveis (Farrant et al., 1992).
A diminuição no conteúdo de água ao final do desenvolvimento é
acompanhada por um aumento na tolerância à dessecação na maioria das
sementes recalcitrantes. Isso foi demonstrado nas seguintes espécies: Acer
pseudoplatanus (Hong & Ellis, 1990), Quercus robur (Finch-Savage, 1992), A.
hippocastanum (Pritchard, 1991; Farrant et al., 1997), Camellia sinensis (Berjak
et al., 1993) e Machilus thunbergii (Lin & Chen, 1995). Durante o
desenvolvimento das sementes de Q. robur, o aumento na tolerância à
dessecação foi acompanhado por um aumento na quantidade de proteínas
termorresitentes pertencentes à família das dehydrinas e ABA (Farrant et al,
1997), embora o conteúdo de ABA crescente fosse associado à prevenção da
germinação precoce. Em sementes em desenvolvimento de Machilus thunbergii,
a concentração de ABA declinou com o fim do desenvolvimento, enquanto a
tolerância à dessecação aumentava, sugerindo que o ABA não tenha induzido a
5
tolerância à dessecação (Lin e Chen, 1995). Esses autores ainda sugerem que a
recalcitrância em sementes é uma conseqüência prematura do desenvolvimento.
A água, como fator fundamental da semente, participa de vários eventos
metabólicos relacionados à estabilidade de membranas, bem como na
conformação de proteínas. Quando removida abaixo do limite suportado pela
célula, podem ocorrer danos aos microtúbulos (Faria et al., 2004), aumento da
concentração dos solutos, alteração do pH intracelular, aceleração de reações
degenerativas, desnaturação de proteínas e perda da integridade de membranas
(Sun & Leopold, 1997). Alguns mecanismos de proteção têm sido reportados
para a aquisição de tolerância à dessecação e manutenção de viabilidade durante
o armazenamento: a atuação de sistemas antioxidantes, a concentração e a ação
de moléculas protetoras, incluindo as LEA proteínas (Late embryogenisis
abundant), a formação do estado vítreo em função da presença de
oligossacarídeos da série rafínósica (estaquiose e verbascose) e a operação de
sistemas de reparo durante a reidratação (Su & Leopold, 1997; Berjak e
Pammenter, 2000; Hoekstra et al., 2001).
Teoricamente, a tolerância à dessecação tende a aumentar com o número
de mecanismos de proteção em atividade de tal modo que, provavelmente, exista
um gradiente de tolerância dependente da interação efetiva entre os mecanismos
que estão presentes (Berjak & Pammenter, 2000).
Embora a secagem de sementes recalcitrantes resulte no declínio da
viabilidade (Roberts, 1973), a literatura tem reportado, entre as espécies,
considerável variação na sensibilidade à dessecação. Farrant et al. (1988),
admitindo esta variação, propuseram a separação das sementes recalcitrantes nas
categorias altamente recalcitrantes (pequena tolerância à dessecação),
moderadamente recalcitrantes (moderada tolerância à dessecação) e
minimamente recalcitrantes (elevada tolerância à perda de água).
6
A secagem parcial pode contribuir para a conservação de sementes
recalcitrantes (Chin, 1988), mesmo naquelas que toleram dessecação a valores
ligeiramente inferiores ao grau de umidade original. Porém, pode ocorrer perda
de viabilidade em função dessa desidratação, podendo ser atribuída a duas
causas principais: como conseqüência de metabolismo desequilibrado durante a
desidratação e, possivelmente, também quando são armazenadas na condição
hidratada ou, então, em função de danos causados pela desidratação, quando a
água é essencial para a integridade de estruturas intracelulares (Berjak e
Pammenter, 2003).
Em função da inevitável deterioração das sementes e da grande variação
existente entre as espécies, entre lotes da mesma espécie e entre unidades do
mesmo lote, buscam-se, no armazenamento, estratégias para manter as sementes
íntegras e viáveis por períodos prolongados logo após a sua dispersão. Para as
espécies florestais, na maioria das vezes, torna-se difícil preservar a viabilidade
e o vigor das sementes; por isso, fatores, como temperatura e umidade, devem
ser considerados durante o armazenamento, visando prolongar a longevidade e a
sua viabilidade (Ramos, 1980; Alvarenga, 1987; Corrêa, 1997; Oladiran &
Agunbiade, 2000). Embora haja algumas discordâncias ou dificuldades na
diferenciação entre causas e conseqüências da deterioração, a seqüência
provável de eventos envolve redução na velocidade de germinação, redução do
potencial de armazenamento, desuniformidade e retardamento do crescimento e
desenvolvimento inicial de plântulas, aumento na sensibilidade a adversidades
ambientais, redução de emergência de plântulas no campo e aumento de
plântulas anormais com conseqüente morte (Delouche & Baskin, 1973).
A deterioração pode ser considerada um parâmetro que mede a qualidade
de um lote de sementes determinando seu potencial de conservação (Gentil,
2003). Toda e qualquer semente armazenada sofre deterioração, podendo ser
rápida ou lenta, dependendo das características ambientais e das características
7
das próprias sementes. Geralmente, a redução da luminosidade, da temperatura e
da umidade de sementes e ambiente faz com que seu metabolismo seja reduzido
e que os microrganismos que as deterioram fiquem fora de ação, aumentando
sua longevidade (Vieira et al., 2001).
Elliott, citado por Hong e Ellis (2003), dividiu as sementes de árvores de
florestas temperadas em três classes: as que podem ser desidratadas, as que
podem sobreviver com desidratação parcial e as que raramente podem ser
desidratadas.
A classificação de sementes em ortodoxas e recalcitrantes, proposta por
Roberts, em 1973, é a mais utilizada atualmente para o comportamento de
sementes quanto às condições de armazenamento (Roberts citado por Hong e
Ellis, 2003). Uma terceira categoria foi proposta por Ellis et al. (1990), citados
por Hong e Ellis (2003), as intermediárias, cuja definição está baseada na
resposta de longevidade ao ambiente de armazenamento; estas apresentam
tendência para longevidade crescente, quanto menor o grau de umidade da
semente no armazenamento (sob condição de ar-seco). Mas, esta condição é
invertida a um grau de umidade relativamente alto e, a partir deste ponto, a
redução do grau de umidade implica em redução da longevidade. Segundo
Bonner (1989), as sementes que podem ser estocadas com menos de 10% de
umidade mantendo ou aumentando a longevidade são consideradas ortodoxas; as
sementes recalcitrantes não podem ser desidratadas para graus de umidade
abaixo de 25% a 50%, dependendo da espécie, sem perder a viabilidade
(Bonner, 2001). Esta sensibilidade para dessecação tem implicações importantes
no armazenamento de sementes. Sementes ortodoxas podem ser desidratadas
sem danos para baixos graus de umidade e, sob uma extensa gama de ambientes,
sendo que a longevidade no armazenamento aumenta com a diminuição do grau
de umidade e da temperatura de modo controlado (Hong e Ellis, 2003).
8
O armazenamento de sementes recalcitrantes sob condições de elevada
umidade e temperatura gera condições favoráveis ao desenvolvimento de
microrganismos. A incidência de microrganismos em sementes recalcitrantes
com graus de umidade acima de 10% a 13% pode comprometer a viabilidade
(Harrington, 1972). Diversos fungos, principalmente do gênero Fusarium
(Boyce, 1989), têm sido encontrados em associação com sementes recalcitrantes
armazenadas. A ação prejudicial desses microrganismos pode requerer o
tratamento com fungicidas (Fu et al., 1990).
Tratamentos fúngicos aplicados em sementes de Eugenia calycina, uma
espécie considerada altamente recalcitrante, reduziu a incidência de fungos
saprofíticos, não afetando a germinação final das sementes. Por outro lado, o
excesso de determinados fungicidas pode reduzir a velocidade de germinação
(Joachim et al.,1994).
Uma aplicação prática para evitar a proliferação de fungos em condições
de armazenamento tem sido usar ambientes com temperaturas em torno de 0ºC a
5ºC; contudo, particularmente em espécies de origem tropical, a sensibilidade a
baixas temperaturas dificulta a prática do uso de temperaturas inferiores a 10ºC
(King & Roberts, 1979).
Diversos trabalhos relatam o papel de fungos na deterioração de
sementes recalcitrantes durante o armazenamento, porém, não existe nenhum
trabalho publicado sobre estratégias de defesa de sementes contra ataque de
fungos, como os mecanismos que são descritos e bem conhecidos em plantas
(Calistru et al., 2000; Sutherland
et al., 2002). A possível resposta quanto à
vulnerabilidade de sementes recalcitrantes a fungos poderia ser a inabilidade
pela resposta de hipersensibilidade, sugerindo a ausência de genes de resistência
que poderiam interagir com os genes de avirulência dos patógenos (Merhar et
al., 2003).
9
2.2.1 Papel de moléculas protetoras na tolerância à dessecação
2.2.1.1 Oligossacarídeos (carboidratos solúveis)
Diversas evidências suportam a idéia de açúcares solúveis, agindo como
“substitutos de água”, podem desempenhar um papel chave na tolerância à
dessecação e, conseqüentemente, na conservação de sementes. Este fato se deve
à proteção das membranas, na fase de transição de lipídeos induzida pela
dessecação, além de proteger as proteínas, e ou por formar vidro sob
temperaturas fisiológicas. Todavia, diversos autores relatam uma alta
concentração de sacarose e oligossacarídeos durante o desenvolvimento de
sementes recalcitrantes (Farrant, Pammenter e Berjak, 1993), sugerindo que a
capacidade de tolerar desidratação não é somente devido à presença desses
carboidratos. Entretanto, os efeitos protetores dos açúcares, in vivo, são,
provavelmente, mais complexos que os observados nestes modelos de sistemas
(Leprince, Hendry e McKersie, 1993).
A acumulação de açúcares não redutores, particularmente da série
rafinósica, deduz a presença de tolerância, podendo ser de dois modos. O
primeiro é que, quando ocorre a desidratação, açúcares específicos substituem a
água associada com a superfície da membrana, mantendo o espaçamento correto
dos grupos de lipídios, prevenindo assim as transições da fase cristalina para a
fase gel. No segundo modo, foi sugerido que a trealose poderia ser o mais
efetivo dos açúcares que poderia substituir a água dessa maneira. Isto parece que
não ocorre em sementes de angiospermas, nas quais a sacarose se apresenta
como o mais abundante dos oligossacarídeos (Pammenter e Berjak, 1999). O
segundo modo refere-se à vitrificação da fase aquosa referindo a um estado
vítreo. Quando ocorre perda de água, a sacarose e certos oligossacarídeos
formam uma alta viscosidade, impondo efeitos na atividade intracelular,
reduzindo efeitos danosos do metabolismo desordenado e, talvez, protegendo as
10
macromoléculas de desnaturação ou minimizando o efeito de transições da fase
gel das membranas fosfolipidicas.
Leopold et al., (1994) sugeriram que o papel da vitrificação não é tanto o
de conferir tolerância à dessecação, mas para manter a viabilidade das sementes
por um período prolongado no estado seco. Porém, a habilidade para a formação
de vitrificação não pode ser declarada como tolerância à dessecação, pois foi
mostrado que ocorre também em algumas sementes sensíveis à dessecação.
Walters et al. (1997) sugeriram outro papel para os açúcares, associando-os com
LEAs de forma a controlar a perda de água.
Hoekstra et al. (1997) afirmaram que enquanto açúcares são primordiais
na formação do estado vítreo, eles podem não ser particularmente efetivos em
termos de interação com os grupos cabeça das moléculas de lipídios, propondo
que a estabilização mais efetiva seria alcançada pela migração de moléculas
anfipáticas.
2.2.1.2 Proteínas termorresistentes
Durante a dessecação de sementes em desenvolvimento, pode ocorrer a
acumulação de um grupo particular de mRNAs e protéinas relacionadas,
denominadas “Late Embryogenis Abundant”. LEA mRNAs, que aparecem em
tecidos embrionários no início da dessecação e tornam-se as mais prevalentes
espécies de mRNA, no estado seco, declinando progressivamente várias horas
após a embebição da semente (Baker, Steele e Durs, 1988). A regulação dos
genes LEA parece ser principalmente transcricional, em que o ABA desempenha
um importante papel (Baker, Steele e Durs, 1988; Williamson e Quatrano, 1998;
Roberton e Chandler, 1992), embora, em alguns casos, a regulação pós-
transcricional seja relatada (Williamson e Quatrano, 1998).
A síntese de LEAs parece estar associada a elevados níveis de ABA que
ocorrem durante o desenvolvimento das sementes (Kermode, 1990). Porém, a
expressão de um segundo grupo de genes de LEAs foi registrada acontecendo
11
com o início da maturação e secagem, quando os níveis de ABA são
relativamente baixos (Oliver e Bewley, 1997). Isso demonstra que a regulação
da expressão de genes LEA envolve componentes de rotas de transdução
diferentes das responsáveis pelo ABA (Kermode,1997).
A síntese de LEAs pode ser regulada por diferentes mecanismos em
diferentes tipos de sementes. Oliver e Bewley (1997) sugerem que uma
evidência equivoca é a de que o ABA tenha papel direto na indução e
manutenção da tolerância à dessecação. A visão que existe a respeito dessas
proteínas deve-se à sua natureza anfipática, com capacidade de inibir a
desnaturação de várias macromoléculas. As LEAs possuem propriedades de
estabilizar estruturas intracelulares sob condições de estresse, incluídos os
estresses causados por perda severa de água, devido à sua propriedade de ligação
com íons e água (Close, 1997). Um outro papel adicional que é realizado pelas
proteínas LEAs é a capacidade de associação com açúcares, em que ambos
operam em proteção quando ocorre perda de água na fase de maturação e
secagem (Walters et al., 1997).
Em um estudo comparativo de duas espécies tropicais recalcitrantes,
Han et al. (1997) observaram que não havia a presença de proteínas LEAs em
uma das espécies, mas ocorria a acumulação durante o desenvolvimento da
outra. Tratamentos que normalmente induzem à produção destas proteínas
(aplicação de ABA ou resfriamento) não tiveram nenhum efeito na espécie que
não apresentou LEA. Dessa forma, fica claro que a habilidade ou a falta de
expressão de proteínas LEAs não podem ser levadas como indicações de que
sementes de uma espécie podem resistir à desidratação, (Blackman et al., 1991).
Isso indica que a tolerância à dessecação em sementes não pode ser resultado
apenas da presença de LEAs e, sim, provalvemente, por meio de muitos
mecanismos ou processos de expressão variável.
12
Um dos mecanismos mais estudados na adaptação dos organismos à
condição de estresse é a indução de proteínas resistentes ao calor, heat shock
proteins (HSP), que inclui várias famílias de proteínas conservadas. Segundo
Vertucci & Farrant (1995), a função das HSP tem sido relacionada com a
preservação e o reparo das estruturas macromoleculares durante a desidratação
ou reidratação, respectivamente. Embora todos os organismos sintetizem HSP
em resposta ao calor, o balanço de proteínas sintetizadas e a relativa importância
das famílias individuais de HSP na tolerância ao estresse variam enormemente
entre organismos (Queitsch et al., 2000). As principais classes das HSP, citadas
por Hong & Vierling (2000), estão presentes em plantas e incluem proteínas de
peso molecular que variam de 15 a 28 kDa; Hsp60; Hsp70; Hsp90 e Hsp100.
2.3 Estudos ultra-estruturais
Estudos de ultra-estrutura conduzidos durante os últimos anos vêm
contribuindo para compreensão a respeito das diferentes respostas à desidratação
e armazenamento apresentadas por sementes altamente recalcitrantes, como as
de Avicennia marina e por sementes ortodoxas, como as de Phaseolus vulgaris.
Membranas das organelas celulares, o citoesqueleto e o nucleoesqueleto são
essenciais para o perfeito funcionamento da célula e danos a essas estruturas
durante a desidratação podem levar à perda de viabilidade. O estado do
metabolismo ou fisiologia celular reflete na diferenciação da mitocôndria e em
sinais visíveis na síntese de membranas e proteínas fornecidas pelo complexo de
Golgi e o retículo endoplasmático. Esses marcadores ultra-estruturais mostram
os danos celulares causados pela secagem excessiva imposta em sementes
recalcitrantes e mostram também que as sementes recalcitrantes passam pelos
estádios iniciais de germinação quando armazenadas com grau de umidade
relativamente alto (Berjak e Pammenter, 2000).
13
2.4 Germinação, anatomia e morfologia de plântulas
Estudos relacionados à propagação de plantas envolvem conhecimentos
relacionados às estruturas das sementes, bem como mudanças que ocorrem
desde o momento da embebição, passando pela protrusão da radícula até a
formação da plântula.
Segundo Camargo et al. (2000), o conhecimento das estruturas
morfológicas das sementes pode contribuir para um melhor entendimento do
processo de germinação.
Crestana e Beltrati, citados por Camargo et al. (2000), comentam em
seus trabalhos que estudos anatômicos e morfológicos da germinação em
espécies florestais são fundamentais e de caráter urgente, em função da drástica
e elevada redução de populações naturais decorrentes de alterações ambientais
causadas pelo desmatamento continuado.
Segundo Lorenzi (2000), a espécie Cupania vernalis Camb. apresenta
germinação lenta e muito baixa e suas sementes devem ser semeadas logo após
a colheita, pois sua viabilidade é curta. Em função dessa curta longevidade,
Lima Júnior (2004) ressalta que esse fator constitui-se num entrave no processo
de propagação e, conseqüentemente, na produção de mudas dessa espécie.
Algumas sementes, quando atingem a maturação, podem expressar
dormência primária causada por embrião imaturo, presença de inibidores,
tegumento impermeável à água e gases, conferindo resistência física à protrusão
da radícula (Tigabu & Oden, 2001).
Lima Júnior (2004), trabalhando com a espécie Cupania vernalis, não
verificou nenhum impedimento para a absorção de água em suas sementes.
Entretanto, verificou-se, ao longo do período de observação, um retardamento na
absorção de água em sementes intactas em relação às sementes destituídas de
tegumento. Nesse mesmo estudo, fazendo uma comparação da porcentagem
final de germinação e IVG entre sementes intactas e sem tegumento, foi possível
14
verificar que a presença do tegumento contribuiu efetivamente para a redução da
germinação das sementes da citada espécie, pelo fato de atuar no retardamento
da absorção de água e, muito provavelmente, na resistência física ao crescimento
do embrião. A presença de uma densa e espessa camada de esclerênquima na
testa da semente atua como uma barreira à retomada do crescimento do eixo
embrionário.
Por meio do conhecimento da estrutura da semente, podem-se obter
indicações sobre a germinação, armazenamento, viabilidade e métodos de
semeadura (Kuniyoshi, 1983), enquanto os estudos morfológicos tendem a
auxiliar na identificação botânica da espécie, interpretando os testes de
laboratório e o reconhecimento da espécie em bancos de sementes do solo e em
fase de plântulas em formações florestais. Estas análises contribuem para os
estudos dos mecanismos de dispersão, sucessão e regeneração natural das
espécies (Melo et al., 2004).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Considerações gerais
O presente estudo foi conduzido no Laboratório de Crescimento e
Desenvolvimento de Plantas, Setor de Fisiologia Vegetal, do Departamento de
Biologia da Universidade Federal de Lavras, MG. Os frutos de Cupania vernalis
Camb. foram coletados na época de dispersão (setembro de 2004), em árvores
localizadas em Macaia, município de Bom Sucesso, MG, próximo à Hidrelétrica
do Funil.
3.2 Ponto crítico de secagem das sementes
Após a deiscência dos frutos sobre bancadas em condições de
laboratório, determinou-se a umidade inicial das sementes por meio do método
15
de estufa a 105 ± 3ºC, por 24 horas (Brasil, 1992), utilizando-se três repetições
de 10 sementes. Os resultados, expressos em porcentagem, foram calculados
com base no peso úmido. Em seguida, procedeu-se o abaixamento do grau de
umidade de 46% até 10% em estufa de ventilação regulada para 35ºC constante.
Foram realizados testes de germinação, quando as sementes submetidas à
secagem atingiram as respectivas umidades: 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% e
10%. Os teores de água das sementes verificados após a determinação inicial
foram avaliados por pesos, por meio da equação descrita por Cromarty et al.
(1985):
Pf = pi (100 – Ui) x (100 – Uf)
-1
, em que:
Pf = peso da amostra (g) após a secagem;
Pi = peso da amostra (g) antes da secagem;
Ui = grau de umidade (%) antes da secagem;
Uf = grau de umidade (%) desejado após a secagem.
Para cada teste de germinação foi utilizada uma amostra de 100
sementes, constituída de 4 repetições de 25 sementes. As sementes foram
acondicionadas em caixas tipo gerbox com vermiculita. A germinação foi
conduzida a uma temperatura de 30ºC em câmaras de germinação modelo BOD
347 Fanem ou Eletrolab (Lima Júnior, 2004). As avaliações de germinação
foram realizadas diariamente, utilizando-se, como parâmetro de germinação, a
protrusão da radícula e a emissão do hipocótilo a ± 5mm. A velocidade de
emergência das plântulas foi realizada no mesmo experimento de germinação,
sendo considerada como emersas as plântulas que apresentavam, no mínimo,
3mm de parte aérea. Para o cálculo do índice de velocidade de emergência (IVE)
foi empregada a equação proposta por Maguire (1962).
16
3.3 Armazenamento das sementes
Inicialmente, foi retirada uma amostra para a verificação do grau de
umidade inicial do lote. Após essa determinação, as sementes foram submetidas
à secagem, em ambiente controlado com 35ºC em estufa de ventilação, visando
à obtenção dos tratamentos 40%, 35% e 30%, referentes aos graus de umidade
desejados. Durante a secagem, as sementes foram colocadas em sacos de papel
perfurados sobre prateleiras de metal perfuradas.
Os tratamentos foram obtidos por meio do acompanhamento de perda de
peso das sementes durante a secagem. Para isso, amostras de sementes, com
pesos iniciais previamente conhecidos, foram acondicionadas em sacos de papel
e distribuídos nas prateleiras da estufa para posterior pesagem em intervalos
regulares. Os pesos finais das amostras, correspondentes a cada um dos graus de
umidade desejados, foram previamente determinados por meio da equação
descrita por Cromarty et al. (1985).
À medida que foram sendo conseguidos os graus de umidade próximos
aos desejados, amostras foram retiradas, homogeneizadas e divididas em frações
que, por sua vez, foram embaladas em sacos plásticos e mantidas,
provisoriamente, em temperatura ambiente de 22 ± 2ºC, durante a obtenção dos
demais tratamentos. Posteriormente, as amostras, correspondentes aos diferentes
graus de umidade, foram estocadas em ambientes com temperaturas controladas
de 10ºC, em câmara fria e em estufa a 25ºC. As sementes foram submetidas a
avaliações no início do armazenamento (caracterização em graus de umidade,
perfazendo os tratamentos adicionais) e aos 120 e 240 dias. Para a identificação
qualitativa da presença de microrganismos durante o armazenamento, as
sementes foram submetidas a técnicas de microscopia eletrônica de varredura e
posterior análise no Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de
Lavras.
17
3.4 Análise ultra-estrutural da semente durante a secagem e
armazenamento
Análise ultra-estrutural da semente durante a secagem e armazenamento
foi realizada no Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-
Estrutural (LME) do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de
Lavras. Fragmentos de 3mm foram retirados de cinco sementes de cada
tratamento (graus de umidade e períodos de armazenamento), localizadas na
região do eixo embrionário e, em seguida, foram fixados numa solução
composta de glutaraldeido (2,5%) e paraformaldeído (2,5%) em tampão
cacodilato, pH 7,0 0,05M + CaCl
2
0,001M por um tempo superior a uma hora,
em temperatura controlada por geladeira. Posteriormente, esses fragmentos
foram lavados em tampão cacodilato 0,05M (três vezes de 10 minutos) e imersos
em glicerol 30% por um tempo de 30 minutos. Com o auxílio de uma chapa de
aço inoxidável e bisturi, procedeu-se ao descarte de pontas do material e
seccionamento das regiões de interesse. Esses foram lavados em água destilada e
pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato 0,05 M, por 1-2
horas, para posterior desidratação em gradiente de acetona (30, 50, 70. 90 por 10
minutos e três vezes por 10 minutos em 100%). Em seguida, as amostras foram
secadas ao ponto crítico, montadas nos stubs para sofrerem o procedimento de
metalização em ouro e observação em microscópio eletrônico de varredura da
marca LEO Evo 40 com aplicação do software LEOQUIF (Leo User Interface).
Para o procedimento de montagem das pranchas e melhoria das imagens, foi
utilizado o software Photoshop 7.0, com auxílio do CorelDRAW 8.
3.5 Determinação de açúcares solúveis totais
Sementes de Cupania vernalis Camb. foram separadas em amostras
durante o período de armazenamento e, posteriormente, congeladas em freezer a
18
uma temperatura de -20ºC. As avaliações foram efetuadas nos tempos zero
(testemunha), quatro e oito meses. Para a testemunha, foi considerada apenas a
semente nas umidades de 40%; 35% e 30%. Já nos intervalos de quatro e oito
meses além das umidades, foram considerados também os ambientes de
armazenamento, câmara fria a 10ºC e estufa regulada para 25ºC.
Os açúcares solúveis totais foram extraídos pela homogeneização
(maceração) de 100mg de massa fresca da região do eixo embrionário em 3mL
de água, seguida de centrifugação a 10.000g por 15 minutos a 4ºC e coleta do
sobrenadante. O processo foi realizado por duas vezes e os sobrenadantes
combinados.
A partir de alíquotas do sobrenadante, foram quantificados açúcares
solúveis totais pelo método da Antrona (Yemm & Willis, 1954).
3.7 Extração e quantificação de proteínas termorresitentes
Foram utilizadas amostras de 10 sementes de Cupania vernalis para
cada tratamento referente aos graus de umidade de, 45%, 40%, 35% e 30%,
maceradas em nitrogênio líquido. O pó obtido foi armazenado em “deep freezer”
a -85ºC.
A extração da fração protéica foi realizada, adicionando-se, em 100mg
de tecido embrionário, 1,0 mL do tampão de extração (50mM tris-HCl-7,5; 500
mM NaCl; 5 mM MgCl
2
; 1 mM PMSF), centrifugados por 30 minutos a 4ºC,
seguido de incubação a 80ºC, por 15 minutos. Em seguida, os tratamentos foram
liofilizados e ressuspensos em 200µl do tampão de extração.
O extrato obtido foi submetido à quantificação de proteínas totais pelo
método de Bradford (1976). Antes da aplicação no gel, os tubos de amostras
contendo extrato mais 10µl de solução tampão da amostra (5mL de glicerol;
2,5mL de solução tampão do gel concentrado; 2,5mg de azul bromofenol e
completado o volume para 25mL de água deionizada), foram colocados em
19
banho-maria com água em ebulição por 3 minutos. Foram aplicados 5µg de
proteína total de cada tratamento em géis de poliacrilamida SDS-PAGE a 12,5%
(gel separador) e 4% (gel concentrador). O padrão aplicado foi BenchMark
TM
Protein Ladder (invitrogen). A corrida eletroforética foi realizada a 150V, por
cerca de 3 horas. Após a migração eletroforética, os géis foram corados em
Coomassie Blue a 0,05%, conforme Alfenas et al. (1991), durante 12 horas e
descorados em solução de ácido acético 10%.
3.8 Caracterização anatômica e morfológica
Para a execução desse experimento, plântulas foram obtidas por meio
da germinação conduzida a uma temperatura de 30ºC em câmara de germinação
modelo BOD (Lima Júnior, 2004). Foram consideradas germinadas sementes
que apresentaram 5mm de parte aérea e radícula com ± 5mm de comprimento. A
partir desse ponto, foram considerados os seguintes estádios de
desenvolvimento: 1º (logo após a protrusão ± 5 dias); 2º (10 dias após a
protrusão); 3º (30 dias) e 4º (estádio referente à 60 dias após a protrusão).
Depois de completados esses estádios de desenvolvimento, as plântulas foram
fixadas em álcool 70% e submetidas à avaliações anatômicas por meio de seções
transversais distanciadas a ± 2mm do ponto de inserção dos cotilédones, obtidas
em cortes à mão livre com auxílio de lâmina de barbear e posterior coloração
com safranina e azul de astra, na proporção de 5% de safranina com 95% de azul
de astra. Os cotilédones provenientes de material fresco foram submetidos a
cortes transversais, para determinar o tipo de reserva, utilizando-se os seguintes
reagentes, Lugol, para detectar a presença de amido e Sudam III, para detectar
lipídios (Kraus & Arduim, 1997). Para o estudo histoquímico do tegumento
foram empregados safranina e floroglucinol, em material fresco. Para todos
estudos, seguiu-se montagem de lâminas provisórias e semipermanentes,
20
segundo técnicas descritas por Johansen (1940). As observações foram
realizadas em microscópio Olympus CBB.
O diâmetro do cilindro vascular e córtex foi avaliado por meio de seções
transversais de lâminas semipermanentes em 5 sementes pós-germinadas, sendo
as medições realizadas com uso do microscópio KEN-A-VISION 2100 equipado
com uma ocular micrométrica. As medidas foram realizadas em três campos por
radícula e ou hipocótilo, perfazendo-se um total de 30 medições para cada região
avaliada, em cada estádio de desenvolvimento.
Para o estudo da morfologia das plântulas, foi feita uma repicagem das
plântulas logo depois de ocorrida a germinação para bandejas plásticas de 80 x
40 x 20cm sobre bancadas em sala de crescimento, tendo vermiculita como
substrato. Foram retiradas plântulas em diversos estádios de desenvolvimento,
que foram fixadas em álcool 70% e, posteriormente, fotocopiadas em scaner
para estudo da morfologia.
3.9 Análise estatística
O delineamento adotado foi o inteiramente casualizado, em esquema
fatorial 3 x 2 x 2 (três graus de umidade, 40%, 35% e 30%, com duas condições
de armazenamento, 10ºC e 25 ºC, dois períodos de armazenamento, 120 e 240
dias), mais três tratamentos adicionais, constituindo a testemunha na época de
avaliação (0), perfazendo, 40%, 35%, e 30% de umidade, com quatro repetições.
Na análise estatística, os dados foram transformados em arco seno raiz quadrada
de x/100. Na comparação das médias, foi utilizado o software SISVAR,
aplicando-se regressão e teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
21
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Aspectos da germinação e ultra-estruturais em sementes de Cupania
vernalis camb. submetidas a testes de tolerância à dessecação
As sementes de Cupania vernalis apresentaram grau de umidade inicial
de 46%, com conseqüentes respostas à perda de água durante a dessecação,
caracterizando alguns pontos distintos de forma significativa entre os
tratamentos, os quais podem ser observados na Figura 1. A redução no grau de
umidade de 45% até 30% não afetou o desempenho fisiológico das sementes de
forma significativa, porém, abaixo de 30% de umidade, danos à dessecação
reduziram o percentual final de germinação. Quando o grau de umidade foi
reduzido abaixo de 11,5%, não houve mais germinação. Lima Júnior (2004)
observou para esta espécie que 30% é o grau de umidade no qual é possível
verificar uma redução acentuada no percentual de germinação, afetando
negativamente a germinação dessas sementes e caracterizando o grau de
umidade crítico. Porém, as avaliações observadas na Figura 3B revelaram danos
de secagem a um grau de umidade de 35%, quando ainda não se observava
redução na germinação. Resultados semelhantes foram observados por Lima
Júnior (2004).
Os danos causados pela secagem das sementes podem ser observados na
Figura 3B, evidenciados pela desorganização do vacúolo, que se apresenta de
forma dilacerada. Paralelamente, observou-se que as sementes não toleram a
dessecação a valores iguais ou inferiores a 11,5% de água, embora os danos
observados para esses níveis já sejam irreparáveis, em função da forte evidência
de dilaceração de membrana e parede celular (figura 3D).
22
y = -0,053x
2
+ 6,10x - 62,10
R
2
= 0,9475
0
20
40
60
80
100
1015202530354045
Grau de umidade (%)
% de Germinação
FIGURA 1. Efeito da secagem no percentual de germinação de sementes de
Cupania vernalis submetidas ao teste de tolerância à dessecação.
UFLA, Lavras, MG, 2005.
Lima Júnior (2004), trabalhando com sementes de Cupania vernalis,
verificou que as sementes, quando desidratadas em estufa sem circulação de ar,
atingiram menores médias de umidade quando comparadas às sementes secas
em condições de temperatura ambiente, durante todo período de secagem,
perdendo a viabilidade aos 33 dias de secagem e atingindo um grau de umidade
de 18%. Isso mostra que a taxa de secagem afeta a porcentagem de germinação,
sendo mais favorável a secagem rápida.
Resultados semelhantes foram encontrados quando utilizada o uso de
estufa regulada para 35ºC com circulação de ar (Figura 2). Provavelmente, a
perda de umidade de forma lenta pela semente se deve à estrutura do tegumento
que possui uma camada de células em forma de paliçada com características
hidrofóbicas (Figura 10).
Estudando o efeito da secagem controlada em sementes de Eugenia
involucrata, de 57% até 13% umidade, Maluf et al. (2003) concluíram que a
23
velocidade de secagem não altera a sensibilidade dos diásporos (semente mais
endocarpo) à dessecação. Porém, a redução do grau de umidade para níveis
inferiores a 51% prejudica a capacidade germinativa e o potencial de
armazenamento.
Resultados divulgados pela FAO (1993) revelaram que descobertas
relacionadas ao grau crítico de umidade são prioridade nas pesquisas sobre
conservação de sementes. Ele pode ser obtido através da elaboração de curvas de
desidratação confrontadas com curvas de viabilidade, objetivando determinar o
grau de umidade ideal para a manutenção de viabilidade das sementes durante o
armazenamento.
Sementes de Cupania vernalis apresentam grau crítico de umidade
próximo de 30%, permitindo, nessa faixa, uma melhor utilização para posterior
conservação em armazenamento (Figura 2). Carvalho (2000) classificou essa
espécie como recalcitrante, mediante o uso de um protocolo associando taxa de
secagem com baixas temperaturas de armazenamento, sendo a dessecação feita
em sala climatizada a 20ºC com 60% de umidade relativa e posterior
armazenamento por 5ºC e (–)18 ºC, durante 90 dias.
A redução da germinação das sementes secadas a 20% provavelmente
ocorreu em função dos danos ao sistema de membranas das células e ou ao
citoesqueleto do eixo embrionário por ocasião da secagem, de forma que as
paredes das células apresentam algumas irregularidades com o conteúdo celular
compacto (Figura 3C).
24
FIGURA 2. Relação entre porcentagem de germinação e grau de umidade com
o período de secagem das sementes. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Por meio das organizações celulares do eixo embrionário, é possível
verificar a viabilidade da semente, pois consiste de pontos iniciais para a
translocação de sinalizadores ou mensageiros químicos para o endosperma e ou
cotilédones para que ocorram a degradação e a mobilização de suas reservas
que, no final, irá culminar com a protrusão radicular. Comparando-se os
resultados da Figura 3 com os dados do gráfico da Figura 1, quando o grau de
umidade foi reduzido para níveis de 25% de umidade, observa-se que houve
uma redução no percentual de germinação de aproximadamente 55%. Esse
decréscimo no percentual é devido à natureza de recalcitrância da espécie, não
tolerando a perda de água. Para sementes de espécies recalcitrantes, o mais
comum é o surgimento da ruptura de membranas e coalescência de corpos
protéicos (Brandão Júnior, 2002). Nas Figuras 3C e 3D, observa-se uma
desorganização celular característica de perda da integridade de membranas.
25
FIGURA 3. Fotomicrografias obtidas com aplicação de microscopia eletrônica
de varredura. LEO Evo 40, software LEOQUIF (Leo User Interface).
A representa 45%, B 35%, C 25% e D 15% de umidade na semente.
LME do Departamento de Fitopatologia, julho, 2005. Barra: 10µm.
UFLA, Lavras, MG, 2005.
Nas Figuras 3B e 3D estão representadas estruturas contrastantes. Na
semente com 35% de umidade é possível observar a presença do núcleo e
vacúolo com início de aparente desorganização. Na Figura 3D, com 15% de
umidade, observa-se o início da formação de cristais nos espaços intercelulares e
um desarranjo de toda a estrutura do eixo embrionário. Essas observações são
condizentes com a literatura, conforme resultados encontrados por Brandão
Júnior (2000) em sementes de Coffea arábica e Coffea canephora submetidas a
testes de tolerância à dessecação.
Esses resultados demonstram que a espécie Cupania vernalis apresenta
danos com a secagem e que demonstra comportamento recalcitrante,
26
apresentando respostas condizentes com as encontradas na literatura. Contudo,
ainda necessita de uma investigação mais detalhada para a identificação de
estruturas resultantes de estresses causados em função da perda de água do
tecido embrionário.
4.2 Germinação e aspectos ultra-estruturais de sementes de Cupania
vernalis Camb. submetidas ao armazenamento
O grau de umidade das sementes permaneceu sem alterações
significativas durante todo o período de armazenamento. Esses resultados
refletem na eficiência da embalagem de saco plástico na manutenção do grau de
umidade, independente do ambiente de armazenamento (Tabela 1).
Lima Júnior (2004), trabalhando com o armazenamento de Cupania
vernalis em câmara fria e embaladas em sacos plástico, constatou, ao final de
120 dias de armazenamento, uma redução do grau de umidade de 46% para
40%.
TABELA 1. Grau de umidade (%) de sementes de Cupania vernalis Camb.,
durante o armazenamento. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Temperatura Período de armazenamento (dias)
0 120 240
25ºC 40 40 35
35 34 30
30 30 28
10ºC 40 40 40
35 35 32
30 30 30
Durante todo período de armazenamento, maior porcentagem de
germinação foi obtida com as sementes de Cupania vernalis armazenadas em
27
câmara fria a 10ºC (Tabela 2, Figura 4). Os dados da Tabela 2 revelam que a
umidade de 40%, pré-definida para o armazenamento associado à baixa
temperatura, apresenta uma maior porcentagem de germinação, comparando os
níveis de umidade para cada ambiente de armazenamento, sendo essa a melhor
umidade indicada para o armazenamento.
Ferreira e Gentil (2003), estudando graus umidade relacionados com
ambiente de armazenamento em sementes de camu-camu, definiram que o ideal
é o armazenamento com grau de umidade elevado (próximo a 46%) e,
preferencialmente, sob temperatura de 20 ºC, para manter a viabilidade e o vigor
pelo período de 150 dias. O mesmo comportamento é observado para sementes
de Cupania vernalis, no período compreendido entre 120 e 240 dias, com as
sementes a 40% de umidade, porém, com a temperatura de armazenamento de
10ºC.
O armazenamento de sementes sob baixas temperaturas é benéfico para
várias espécies; algumas vezes é essencial, porém, pode ser prejudicial a outras
(Roberts, 1973; Andrade et al., 1997).
28
FIGURA 4. Valores médios de porcentagem de germinação de sementes de
Cupania vernalis dentro de cada época de avaliação durante 4 meses
(120 dias) e 8 meses (240 dias) de armazenamento a 10ºC e 25ºC.
UFLA, Lavras, MG, 2005.
Para as sementes armazenadas a 25ºC houve uma queda acentuada na
germinação. Essa queda ocorreu em função da temperatura de armazenamento
ser próxima à temperatura ótima de germinação para essa espécie, ocasionando a
germinação dentro da embalagem (Figura 5). Lima Júnior (2004) obteve
melhores resultados de germinação em temperaturas entre 25ºC e 35ºC.
Em geral, o armazenamento de sementes com graus de umidade mais
elevados é favorecido pela adoção de temperaturas inferiores à do ambiente de
produção (Barbedo, 1997). A elevação da temperatura, nesses casos, pode
acelerar a deterioração (Harrington, 1972; Roberts, 1972).
29
TABELA 2. Comparação de médias de germinação dos níveis de umidade
dentro dos níveis do fator temperatura durante o armazenamento.
Letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, dentro de cada
fator, não diferem significativamente entre si, pelo teste de Tukey, a
5% de probabilidade. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Umidade
Temperatura
30% 35% 40%
10ºC 36 aA 68 bA 86 bA
25ºC 14 aB 15 aB 50 bB
Comparando-se os tratamentos adicionais em formas de contrastes com
o esquema fatorial, observa-se que existem diferenças significativas para os três
adicionais e, comparando-se os tratamentos adicionais com as melhores médias
observadas durante o armazenamento, encontrou-se que, os tratamentos
correspondentes aos graus de umidade de 40% armazenados por 120 dias a 10ºC
e 25ºC não apresentaram diferenças significativas em comparação com os
adicionais. Já para a condição de 40% de umidade aos 240 dias de
armazenamento a 10ºC, foram observadas diferenças significativas, sendo sua
média inferior ao tratamento adicional correspondente ao grau de umidade de
40%.
A redução do grau de umidade de 40% para 30% afetou negativamente a
viabilidade e o vigor das sementes armazenadas, causando uma redução da
velocidade de emergência das plântulas (Tabela 3). Os resultados demonstraram
diferenças significativas quanto aos fatores épocas de avaliação e temperaturas
de armazenamento. Para o fator época, o melhor IVE foi observado aos 120 dias
de armazenamento e a melhor temperatura foi de 10ºC. O IVE mede a qualidade
de um lote de sementes, de forma que, quanto maior seu valor, pode-se
30
considerar melhor vigor para as sementes. Resultados semelhantes foram
encontrados por Maluf et al. (2003), trabalhando com a espécie Eugenia
involucrata, segundo os quais, a redução do grau de umidade a níveis de 53%
permitiu a conservação dos diásporos por até 180 dias, sob condições de câmara
fria e em embalagens plásticas.
TABELA 3. IVE em sementes de Cupania vernalis Camb. variando o grau de
umidade durante o armazenamento. Médias seguidas da mesma letra
na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de
Tukey, a de 5% de probabilidade. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Grau de umidade (%) Médias
40 2,04 a
35 1,14 b
30 0,64 b
Semelhante à germinação, para o IVE foram observadas diferenças
significativas dos contrastes entre os tratamentos adicionais com o esquema
fatorial. A condição de armazenamento em que as sementes tinham 40% de
umidade a 10ºC durante 120 dias foi superior ao tratamento adicional
correspondente ao grau de umidade de 30%. Isso se deve, possivelmente, a uma
melhor uniformidade do lote das sementes armazenadas. O tratamento adicional
com grau de umidade de 35% apresentou um IVE superior ao tratamento em que
as sementes foram submetias a 35% de umidade em 10ºC por 240 dias de
armazenamento.
31
FIGURA 5: Germinação de sementes de Cupania vernalis Camb. durante o
armazenamento em diferentes temperaturas nas diferente épocas. A
e C- representam sementes com 30% de umidade ao final de 120 e
240 dias de armazenamento a 10ºC e 25ºC; B e D- sementes
armazenadas com 40% de umidade ao final de 240 dias de
armazenamento, B: 25ºC e D: 10ºC. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Outra causa que levou à queda de germinação e conseqüente redução do
IVE foi a presença de microrganismos durante o armazenamento. O grau de
umidade e a temperatura são definidos como fundamentais no estabelecimento
de fungos durante o armazenamento de sementes (Christensen, 1972).
Penicillium sp e Aspergillus sp desenvolvem-se em graus de umidade entre 10%
a 20% (Harrington, 1972).
Com o decorrer do período de armazenamento, observou-se um aumento
expressivo de ataque desses microrganismos, caracterizando uma das principais
causas da deterioração dessas sementes. Após os 120 dias de armazenamento, o
ataque de Alternaria e Aspergillus foi maior para as sementes com graus de
32
umidade de 35% e 30% nos dois ambientes de armazenamento (Figura 6). Foi
observada, uma ocorrência maior de esporos de Aspergillus em sementes com
grau de umidade de 40%. No entanto, não foi constatado dano severo na
porcentagem final de armazenamento em função desse ataque.
A redução do grau de umidade de 45% para 40% favorece a conservação
de sementes de Cupania vernalis mantendo a viabilidade durante o
armazenamento. Porém, essa alta umidade tende a aumentar a infestação desses
patógenos.
FIGURA 6: Representação do ataque de microrganismos, durante o
armazenamento, em sementes de Cupania vernalis em
ambientes de 10ºC e 25ºC. (A e C- Alternaria sp. B e D-
esporos de Aspergillus sp.). UFLA, Lavras, MG, 2005.
33
Os resultados referentes à ultra-estrutura revelaram que, aos 120 dias de
armazenamento, houve uma tendência de formação de grandes áreas vacuolares
(Figura 7B), sendo essas estruturas identificadas com maior exatidão aos 240
dias de armazenamento (Figura 8, setas). A formação desses vacúolos serve
como escape para a manutenção da integridade do conteúdo celular. O que
geralmente não é percebido é a importância do vacúolo como centro de retorno
intracelular. Em situações de estresse, a vacuolização ou aumento da atividade
de vacúolos pré-existentes servem para remover organelas deterioradas ou
material redundante que possivelmente esteja no citoplasma (Berjak &
Pammenter, 2000).
A remoção de água durante o armazenamento ocasiona a deterioração
das membranas celulares em função do estresse. Berjak & Pammenter (2000)
deram início a trabalhos com a espécie Avicennia marina projetando para
averiguar efeitos em situações de variação nas perdas de proporções de água. Os
primeiros resultados observados foram de que a remoção de 29% do total
original de água presente resultou na deterioração de muitas sementes e, na
situação de perda de água de 35% ou mais, houve deterioração por completa
(morte letal). A análise ultra-estrutural do primórdio radicular ao conteúdo
original de água apresentou células compactas, com pequenos vacúolos. O
mesmo comportamento pode ser observado no eixo embrionário das sementes de
Cupania vernalis, porém, não com perdas significativas no conteúdo de água.
Na ocasião é considerada também a possibilidade de um estresse de
desidratação que ativa uma excitação no metabolismo. Esse estresse moderado é
confirmado na ativação do metabolismo de eixos embrionários de sementes
recalcitrantes e esta excitação parece ser correlacionada com a germinação, fato
que ocorreu nas sementes durante o armazenamento. Resultados semelhantes
foram confirmados, por meio das indicações ultra-estruturais e bioquímicas, por
Berjak & Pammenter (2000).
34
FIGURA 7. Fotomicrografias obtidas com aplicação de microscopia eletrônica
de varredura. LEO Evo 40, software LEOQUIF (Leo User
Interface) aos 120 dias de armazenamento. Ambas com 40% de
umidade, A refere-se a 10ºC e B 25ºC. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Pelos resultados apresentados relacionados à ultra-estrutura de sementes
de Cupania vernalis, é possível observar que o metabolismo continua ativo
durante situações de armazenamento em condições em que são mantidos os
conteúdos de umidade elevados. Com isso, essas sementes ficam crescentemente
sensíveis à dessecação, em função de mudanças na germinação. Essas
observações são apresentadas pelas fortes evidências de sinais da divisão celular
(Figura 8/40% umidade 10ºC).
O fato dessas sementes não tolerarem a desidratação as classifica como
recalcitrantes, constituindo um dos maiores impasses para o armazenamento das
mesmas, pois, na maioria das condições as quais são submetidas acaba
ocorrendo a germinação. A conclusão final reflete na impossibilidade de
armazenamento dessa categoria de sementes em longo prazo, que não permite
perda de água, pois, na condição hidratada, é alcançada a condição fisiológica
para divisão celular e conseqüente germinação.
35
FIGURA 8: Fotomicrografias obtidas com aplicação de microscopia eletrônica
de varredura. LEO Evo 40, software LEOQUIF (Leo User Interface)
aos 240 dias de armazenamento (Figuras A, C e E, correspondem a
40%, 35%, 30% de umidade armazenadas a 10ºC), (Figuras B, D e
F, referem-se a 40%, 35% e 30% de umidade armazenadas a 25ºC).
Setas indicam sinais de divisão celular e formação de vacúolos.
UFLA, Lavras, MG, 2005.
36
4.3 Carboidratos solúveis: açúcares solúveis totais (AST)
As variações dos níveis de açúcares solúveis totais observados durante o
período de armazenamento apresentam-se de forma crescente para o ambiente de
25ºC em resposta à secagem e ao período de armazenamento (Tabela 4). Esse
considerável aumento observado nesses componentes durante o armazenamento
deve-se, provavelmente, ao fato da temperatura de armazenamento ser próxima
da temperatura ótima de germinação, considerada entre 25ºC a 35ºC constante
(Lima Júnior, 2004). Esse aumento do teor de AST ao longo do período de
armazenamento pode ser explicado pela forma metabolicamente ativa como são
classificadas as sementes recalcitrantes, que continuam translocando açúcares
para o eixo embrionário para a pronta germinação.
TABELA 4. Teores de açúcares solúveis totais (AST), em mg/g MF,
encontrados em sementes de Cupania vernalis durante o período de
armazenamento. Médias seguidas da mesma letra (maiúsculas) na
coluna e linha (minúsculas) não diferem significativamente entre si,
pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. UFLA, Lavras, MG,
2005.
120 dias 240 dias
Umidade 10ºC 25ºC 10ºC 25ºC
40% 125,88 aA 183,10 Ab 121,33 aA 206,10 bA
35% 178,88 bA 140,01 Aa 100,62 aA 257,35 bA
30% 170,68 aA 195,94 Ab 100,00 aA 338,88 bA
Os resultados apresentados na Tabela 4 são provenientes da interação
entre umidades de armazenamento versus temperaturas de armazenamento com
os diferentes períodos de avaliação. Observa-se, no desdobramento, que,
fixando-se os níveis de épocas e temperaturas de armazenamento para o efeito
37
de umidades, existem diferenças significativas de forma que, para a condição do
ambiente de 10ºC, ocorreu um maior acúmulo de açúcares solúveis totais para
sementes armazenadas por 120 dias com grau de umidade de 35%. Com o
decorrer do armazenamento até 240 dias, esses níveis diminuíram,
provalvemente em função da taxa respiratória elevada durante esse período.
Segundo Bewley & Black (1994), esses carboidratos, que são inicialmente
formados nas sementes, servem como substrato para a respiração durante o
período pré-germinativo.
Outro ponto observado é com relação ao aumento dos teores de açúcares
solúveis totais aos 240 dias para os graus de umidade de 35% e 30%, com 25ºC.
Possivelmente, esses elevados teores de açúcares apresentados devem-se ao
maior número de sementes germinadas observadas nas embalagens durante o
período de armazenamento.
Observando-se os contrastes entre os tratamentos adicionais com as
médias dos tratamentos armazenados a 10ºC por 120 dias e aos 240 dias a 25ºC,
observou-se diferenças significativas, de forma que o tratamento adicional
correspondente ao grau de umidade de 30%, apresentou teores de açúcares
superiores aos tratamentos com graus de umidade de 40% e 30%, armazenadas
até aos 120 dias a 10ºC. Para os demais, as médias dos tratamentos armazenados
foram superiores às médias dos tratamentos adicionais.
Com relação aos tratamentos submetidos a 25ºC por 240 dias, foi
também observada diferença de forma que as médias desses tratamentos foram
todas superiores em relação aos tratamentos adicionais. Esses resultados
demonstram que houve mobilização de carboidratos durante o período de
armazenamento, na condição de 25ºC.
Embora este tipo de comportamento em espécies recalcitrantes seja
ainda incipiente, em sementes ortodoxas, por outro lado, na literatura há relatos
38
de comportamentos semelhantes com relação a diferenças nos teores de açúcares
solúveis totais (Pontes et al., 2002).
4.4 Proteínas termorresistentes
As expressões de proteínas termorresistentes em extratos protéicos
obtidos de sementes de Cupania vernalis submetidas à secagem com redução do
grau de umidade de 45% para 30% encontram-se na Figura 9. As proteínas
observadas apresentam pesos moleculares entre 10, 25 e 60kDa. Essas
observações sugerem que o estresse causado pela redução do grau de umidade
pode estar associado à indução de proteínas resistentes ao calor, heat shock
proteins (HSP).
FIGURA 9. Padrão eletroforético de proteínas termotolerantes extraídas de
eixos embrionários de sementes de Cupania vernalis Camb.
durante a dessecação (P, proteína padrão). UFLA, Lavras, MG,
2005.
39
Para os tratamentos com graus de umidade de 40% e 35% não foi
observada a expressão de proteínas com pesos moleculares entre 10 e 25kDa. No
entanto, após o choque térmico a 80ºC e posterior quantificação pelo método de
Bradford (1976), foram observadas quantias expressivas de proteínas
semelhantes aos demais tratamentos, que, possivelmente, estão relacionadas ao
grupo das HSPs.
Segundo Vertucci & Farrant (1995), as HSP têm sido relatadas como
funcionais na preservação e reparo de estruturas macromoleculares durante a
desidratação ou reidratação, respectivamente.
Salomão et al. (2002) classificaram as HSP como pertencentes à família
do segundo grupo de genes relacionadas à termotolerância. Tanto essas proteínas
como as do grupo das LEAs possuem características hidrofílicas, são resistentes
à desidratação, estáveis, solúveis a altas temperaturas, não possuindo, no
entanto, um estado termodinâmico preferencial. Devido a essas propriedades,
tem sido sugerida a função de osmo-protetoras, ou reparadoras de danos
causados pela desidratação.
Os resultados observados pelo padrão eletroforético reforçam a
possibilidade de que sementes de Cupania vernalis possuem quantias
expressivas de macromoléculas capazes de garantir a desidratação parcial das
sementes, sem contudo, causar danos letais. Porém, a habilidade de expressar ou
não HSPs, ou proteínas semelhantes às LEAs e dehidrinas, não pode ser tomada
como um indicativo de tolerância ou não à desidratação (Blackman et al., 1991).
40
4.5 Características morfológicas e anatômicas de sementes e plântulas de
Cupania vernalis Camb.
4.5.1 Características anatômicas da semente
Sementes de Cupania vernalis possuem tegumento resistente que
confere uma barreira à pronta germinação. Anatomicamente, o tegumento
apresenta duas diferentes camadas, evidenciando diferentes grupos celulares: o
primeiro, constituído de células estreitas e longas em paliçada, sendo facilmente
visível (Figura 10B, seta superior); o segundo grupo é formado por células de
formato irregular, com paredes espessas, constituído de vários estratos; já o
terceiro grupo de células é caracterizado por uma película (Figura 10B, seta
inferior).
Lima Júnior (2004), investigando a incapacidade de sementes de
Cupania vernalis em absorver água, concluiu que sementes com a presença do
tegumento apresentavam uma redução a embebição. Além da baixa capacidade
de embebição, o tegumento foi caracterizado como responsável pelo
impedimento da protrusão radicular.
Segundo Popinigis (1985), a embebição e as trocas gasosas de sementes
com tegumento impermeável à água são impedidas devido à presença de uma
camada de células paliçádicas com paredes espessas e recobertas por substâncias
hidrófobas. Essas substâncias podem ser observadas nas estruturas do endocarpo
de sementes de Cupania vernalis (Figura 10A e 10B). Estes resultados foram
confirmados por meio de testes histoquímicos com floroglucinol, sudan III e
safranina 1%.
O tegumento dessas sementes possui uma cavidade onde é projetado o
eixo embrionário (Figura 10A, setas), de forma que, quando ocorre a embebição,
pode ocorrer facilidade de ruptura nessa região. Essa estratégia pode ser
observada, por meio das características apresentadas pelas células que são
41
projetadas na região posterior ao eixo, sendo essas de natureza celulósica
apresentada pela coloração com azul de astra (Figura 10A). O cotilédone
apresenta células volumosas, com seus conteúdos ocupados por uma imensa
massa de grânulos de amido (Figura 10C), apresentando ser uma espécie
amilácea. Foi observada a presença de lipídios, somente nas células da epiderme
dos cotilédones (Figura 10D).
Esses aspectos mencionados refletem no processo de conservação das
sementes e propagação sexuada de uma determinada espécie, que depende de
informações relacionadas às características estruturais provindas do
desenvolvimento de tecidos.
FIGURA 10. Seções transversais de sementes de Cupania vernalis Camb. (A e
B representando tegumento); (C e D: cotilédone). UFLA, Lavras,
MG, 2005.
42
Para muitas espécies tropicais, a germinação ocorre logo após a
completa maturação e conseqüente dispersão das sementes (Alexandre, 1980),
enquanto que, para outras espécies, as sementes permanecem dormentes por
muitos anos (Carpenter et al., 1993). Sementes de Cupania vernalis possuem a
capacidade de germinar logo após a dispersão, porém, deve ser desprovida do
tegumento (Figura 10A; 10B). Essas sementes apresentam um comportamento
semelhante à dormência primária, gerada durante o desenvolvimento, na fase de
histodiferenciação de forma que, quando exógena, é causada pela presença de
tecido tegumentar ou endosperma, que estão ao redor do embrião (Popinigis,
1985).
4.5.2 Morfologia da germinação
A germinação das sementes de Cupania vernalis é hipógea, com
emergência vertical ereta. Os eventos da germinação podem ser observados na
Figura 11. A embebição só foi possível através da remoção do tegumento. Esse
tipo de barreira constitui um sério problema que afeta a germinação e a
homogeneidade das plântulas, relacionado ao tempo de formação das mudas.
A germinação é iniciada com a hidratação dos cotilédones e eixo
embrionário. A protrusão ocorre após o quinto dia de embebição. Inicialmente, a
raiz primária apresenta-se cônica, glabra, curva de cor amarelada e, à medida
que ocorrem o alongamento e a diferenciação celular, adquire cor marrom-
acinzentada com a presença de tricomas radiculares (Figura 11).
O hipocótilo é cilíndrico, espesso, longo e de coloração marrom. Os
cotilédones, inicialmente, são de cor amarelo-claro, de forma que à medida que
vai ocorrendo a formação da plântula, tornam-se de cor creme.
A plântula apresenta sistema radicular pivotante com raiz primária axial,
sublenhosa, mais espessa na base e afilada no ápice; coifa cilíndrica, castanho
escuro, raízes secundárias curtas, com algumas ramificações (Figura 11). As
43
plântulas de Cupania vernalis possuem sistema radicular axial e ramificam-se
secundariamente 20 dias após a germinação. O colo, ou coleto, é visível pela
diferença de cor entre o hipocótilo clorofilado e a raiz aclorofilada e leve
constrição entre estes órgãos. O hipocótilo é curto e glabro; os cotilédones são
de coloração esverdeada e espessos, de forma curta e peciolados côncavo-
convexos com formato ovado a oblongo; o epicótilo é pouco desenvolvido de
forma clorofilada. O primeiro par de folíolos completamente expandidos foi
observado aos noventa dias após a germinação, com filotaxia alterno-helicidal.
FIGURA 11. Representação esquemática dos estádios iniciais da germinação
de sementes de Cupania vernalis Camb até o estádio de
plântula. UFLA, Lavras, MG, 2005.
4.5.3 Características anatômicas das plântulas nos diferentes estádios de
desenvolvimento
Por meio de estudos da anatomia e reconhecimento das estruturas
internas das plântulas, foi possível identificar o estado de normalidade das
44
mesmas. A presença ou ausência de determinadas estruturas permitem inferir
sobre o status do desenvolvimento vegetal.
A literatura botânica brasileira registra trabalhos de morfologia de
plântulas de espécies de mata (Silva, 2001), mas não estudos de anatomia, o que
dificulta, eventualmente, a compreensão de todo o processo de desenvolvimento
estrutural, fisiológico e ecológico de plantas florestais nos seus estádios iniciais.
Nos gráficos das Figuras 12 e 13 encontram-se dados que representam a
evolução do padrão de desenvolvimento, aparentemente, de crescimento normal
de plântulas de Cupania vernalis, de forma que é observada uma constante tanto
para a descrição do caule quanto das avaliações efetuadas no sistema radicular.
Observa-se que, à medida em que ocorre um leve aumento na espessura do feixe
vascular, ocorre também um aumento na espessura do córtex, porém, de forma
não significativa. Logo após a protrusão, o feixe vascular apresenta uma
espessura próxima de 50µm e, ao final de 60 dias (4º estádio), aproximadamente
70µm. Esses resultados permitem garantir a integridade da plântula, sendo essa a
maior preocupação depois de ocorrida a germinação. De maneira semelhante,
Melo et al. (2004) afirmam que estudos relacionando tanto à morfologia externa
como interna, vêm auxiliar na identificação botânica da espécie, seja na
interpretação dos testes de laboratório ou no reconhecimento dessas espécies em
bancos de sementes durante a fase de plântula em formações florestais.
45
FIGURA 12. Espessura do córtex e feixe vascular do caule de plântulas de
Cupania vernalis Camb nos diferentes estádios de
desenvolvimento. UFLA, Lavras, MG, 2005.
46
FIGURA 13. Espessura do córtex e diâmetro do cilindro vascular de raízes de
plântulas de Cupania vernalis Camb nos diferentes estádios de
desenvolvimento. UFLA, Lavras, MG, 2005.
Durante o desenvolvimento do caule e raiz, ocorre também a deposição
de lignina e formação de anéis esclerênquimáticos no caule, formando barreiras
ao enraizamento, já na fase jovem. Essa característica impede que a espécie
venha a ser propagada de forma assexuada por estaquia (Figura 14). Para o
sistema radicular, o aumento na espessura do córtex ocorre em função de
divisões periclinais e do aumento radial dessas células. Esse crescimento é
limitado, sendo que, ao final do desenvolvimento primário e início do
desenvolvimento secundário, a camada mais interna é caracterizada pela
endoderme, com presença de estrias de Caspary (Figura 15). Aos 60 dias após a
germinação, notou-se a presença de raízes secundárias com um alto grau de
deposição de lignina, demonstrando uma característica típica de lenhosas nativas
(Figura 15D).
47
FIGURA 14. Fotomicrografias da seção transversal do caule de Cupania
vernalisCamb.; A: protrusão e B: 10; C: 30 e D 60 dias após a
germinação. Barra = 80µm. (A)- seta indicando o inicio de
formação dos feixes vasculares; (B)- início de formação do anel
esclerenquimático; (C)- Anel esclerenquimático com alguns
espaçamentos e (D) com formação contínua do anel
esclerenquimático. UFLA, Lavras, MG, 2005.
48
FIGURA 15. Fotomicrografias da seção transversal de raízes de Cupania
vernalis Camb.; A: protrusão e B: 10; C: 30 e D 60 dias após a
germinação. Barra: 200µm. UFLA, Lavras, MG, 2005.
49
5 CONCLUSÕES
A redução do grau de umidade de 45% para 35% não afeta o
desempenho fisiológico de sementes de Cupania vernalis Camb.
Sementes de Cupania vernalis Camb apresentam grau de umidade
crítico de 30% e grau de umidade letal de 11,5%.
O grau de umidade de 40% prédefinido para o armazenamento,
associado à baixa temperatura de armazenamento a 10 ºC, confere melhor
conservação às sementes.
O ambiente de armazenamento de 25ºC proporcionou aumento de
translocação de carboidratos para o eixo embrionário, demonstrando não ser
uma condição ideal para conservação.
Foi observada a expressão de proteínas termorresistentes (HSP) em
resposta à desidratação.
As sementes de Cupania vernalis Camb são revestidas por um
tegumento com presença de lignina.
Aos 60 dias após a germinação é possível observar a presença contínua
de anéis esclerenquimáticos no caulículo.
50
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXANDRE, D. Y. Caricature saisonnier de la fructification dans une forêt
hygrophile de Côte d’ Ivoire. Terre et la Vie Revie d’Ecologie, Paris, v. 34, n.
3, p. 335-350, 1980.
ALVARENGA, S. Influência de diferentes teores de umidade, embalagens e
ambientes sobre a preservação da viabilidade e vigor de sementes de pau-
santo (Kielmeyera coriacea Mart.). 1987. 84 p. Dissertação (Mestrado) –
Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR.
ALFENAS, A. C.; PETERS, I.; BRUCE, W.; PASSADOS, G. C. Eletroforese
de proteínas e isoenzimas de fungos e essências florestais. Viçosa: UFV,
1991. 242 p.
ANDRADE, A. C. S.; CUNHA, R.; REIS, R. B.; ALMEIDA, K. J. Conservação
de sementes de cagaita (Eugenia dysenterica DC.)- Myrtaceae. Informativo
ABRATES, Brasília, v. 7, n. 1/2, p. 205, jul./ago. 1997.
BAKER, J.; STEELE, C.; DURS, L. , III. Sequence and characterization of 6
Lea proteins and their genes from cotton. Plant Molecular Biology, Dordrecht,
v. 11, n. 3, p. 277-291, 1988.
BARBEDO, C. J. Armazenamento de sementes de Inga uruguensis HOOK
& AM. 1997. 71 p. Tese (Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “ Luiz
de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP.
BERJAK, P.; PAMMENTER, N. W. Orthodox and Recalcitrant Seeds. In:
Tropical tree seed manual. [S. l. ]: USDA Forest Service’s/Reforestation,
Nurseries, & Genetics Resources, 2003.
BERJAK, P.; PAMMENTER, N. W. What ultrastructure has told us about
recalcitrant seeds. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, Londrina, v. 12, p.
22-55, abr. 2000.
BERJAK, P.; VERTUCCI, C. W.; PAMMENTER, N. W. Desiccation-sensitive
(recalcitrant) seeds: Effects of developmental status and dehydration rate on
characteristics of water and desiccation-sensitivity in Camellia sinensis. Seed
Science Research, Wallington, v. 3, n. 2, p. 155-166, June 1993.
51
BEWLEY, J. D.; BLACK, M. Seeds: physiology of development and
germination. New York: Plenum Press, 1994. 445 p.
BLACKMAN, S. A.; WETTLAUFER, S. H.; OBENDORF, R. L.; LEOPOLD,
A. C. Maturation proteins associated with desiccation tolerance in soybean.
Plant Physiology, Rockville, v. 96, n. 3, p. 868-874, July 1991.
BONNER, F. T. Seed Biology. In: Woody plant seed manual. (S. l.): USDA
Forest Service’s/Reforestation, Nurseries, & Genetics Resources, 2001.
BONNER, F. T. Tropical forest seeds: biology, quality and tecnology. In:
SIMPÓSIO BRASILEIRO SOBRE SEMENTES FLORESTAIS, 2., 1989,
Atibaia. Anais... São Paulo: SEMA-SP/IF, 1989. p. 263-274.
BOYCE, K. G. Report of the seed storage. Committee 1986 – 1989. Seed
Science and Technology, Zurich, v. 17, p. 135-142, 1989. Supplement. 1.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry, New York, v. 72, n. 1/2, p. 248-254, 1976.
BRANDÃO JUNIOR, D. Marcadores da tolerância à dessecação de sementes
de cafeeiro. 2000. 144 p. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Lavras,
Lavras, MG.
BRANDÃO JUNIOR, D. S.; VIEIRA, M. G. G.; HILHORST, H. W. M.
Aquisição da tolerância à dessecação nos diferentes estádios de desenvolvimento
de sementes de cafeeiro (Coffea arabica L.). Ciência e Agrotecnologia, Lavras,
v. 26, n. 4, p. 673-681, out./dez. 2002.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Regras para análise de sementes. Brasília,
1992. 365 p.
CALISTRU, C.; MCLEAN, M.; PAMMENTER, N. W.; BERJAK, P. The
effects of mycofloral infection on the viability and ultrastructure of wet-stored
recalcitrant seeds of Avicennia marina (Forssk.) Vierh. Seed Science Research,
Wallingford, v. 10, n. 3, p. 341-353, Sept. 2000.
CAMARGO, I. P.; CASTRO, E. M.; GAVILANES, M. L. Aspectos da
anatomia e morfologia de amêndoas e plântulas de castanheira-do-brasil. Cerne,
Lavras, v. 6, n. 2, p. 011-018, 2000.
52
CARPENTER, W. J.; OSTMARK, E. R.; RUPPERT, K. C. Promoting rapid
germination of needle palm seed. Proceedings, Florida State Horticultural
Society, Gainesville, v. 106, p. 336-338, May 1993.
CARVALHO, L. R. Classificação fisiológica de sementes de espécies
florestais quanto à capacidade de armazenamento. 2000. 97 p. Dissertação
(Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
CHIN, H. F. Recalcitrant seeds: a status report. Rome: IBPGR, 1988. 18 p.
CHRISTENSEN, C. M. Microflora and seed deterioration. In: ROBERTS, E. H.
(Ed). Viability of Seed. Syracuse university press, 1972. cap3, p. 59-93.
CLOSE, T. J. Dehydrins: a commonality in the response of plants to dehydration
and low temperature. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 100, n. 2, p.
291-296, June 1997.
CROMARTRY, A. S.; ELLIS, R. H.; ROBERTS, E. H. Desing of seed storage
facilities for genetic conservation. Rome: IBPGR, 1985. 100 p.
CORREA, F. L. O. Efeito da embalagem e do ambiente de armazenamento
na germinação e vigor de sementes de goiabeira (Psidium guajava L.). 1997.
57 p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
CAVALCANTI, S. B. T.; TELES, H. L.; SILVA, D. H. S.; FURLAN, M.;
YOUNG, M. C. M.; BOLZANI, V. S. New tetra-acetylated oligosaccharide
diterpene from Cupania vernalis Camb. Journal of the Braziliam Chemical
Society, São Paulo, v. 12, n. 3, p. 413-416, May/June 2001.
DELOUCHE, J. C.; BASKIN, C. C. Accelerated aging techniques for predicting
the relative storability of seed lots. Seed Science and Technology, Zurich, v. 1,
n. 2, p. 427-552, 1973.
DURE, L. H.; CHOUCH, M.; HARADA, J.; MUNDY, H. J.; QUATRANO, R.;
THOMAS, T.; SUNG, Z. R. Common amino acid sequence domains among the
LEA proteins of higher plants. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 12, n. 5,
p. 475-486, May 1989.
FAO. Ex situ storage of seeds, pollen and in vitro cultures of perennial woody
plant species. informativo ABRATES, Brasilia, v. 5, n. 2, p. 184, ago. 1995.
53
FARIA, J. M. R.; VAN LAMMEREN, A. A. M.; HILHORST, H. W. M.
Desiccation sensitivity and cell cycle aspects in seeds of Inga vera subsp.
Affinis. Seed Science Research, Wallingford, v. 14, n. 2, p. 165-178, June 2004.
FARRANT, J. M.; PAMMENTER, N. W.; BERJAK, P. Development of the
recalcitrant (homoiohydrous) seeds of Avicennia marina: Anatomical,
ultrastructural and biochemical events associated with development from
histodifferentiation to maturation. Annals of Botany, London, v. 70, n. 1, p. 75-
86, July 1992.
FARRANT, J. M.; PAMMENTER, N. W.; BERJAK, P. Seed development in
relation to desiccation tolerance: A comparison between desiccation-sensitive
(recalcitrant) seeds of Avicennia marina and desiccation-tolerant types. Seed
Science Research, Wallingford, v. 3, n. 1, p. 1-13, Mar. 1993.
FARRANT, J. M.; PAMMENTER, N. W.; BERJAK, P. Recalcitrance – a
current assessment. Seed Science and Technology, Zurich, v. 16, n. 1, p. 155-
166, 1988.
FARRANT, J. M.; PAMMENTER, N. W.; BERJAK, P.; WALTERS, C.
Subcellular organization and metabolic activity during the development of seeds
that attain different levels of desiccation tolerance. Seed Science Research,
Wallingford, v. 7, n. 2, p. 135-144, June 1997.
FERREIRA, S. A. do N.; GENTIL, D. F. de O. Armazenamento de sementes de
camu-camu (Myrciaria dubia) com diferentes graus de umidade e temperaturas.
Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 25, n. 3, p. 440-442, dez.
2003.
FINCH-SAVAGE, W. E.; CLAY, H. A.; BLAKE, P. S.; BROWNING, G. Seed
development in the recalcitrant species Quercus robur L. : water status and
endogenous abscisic acid levels. Jornal Experimental Botany, Cambridge, v.
43, n. 250, p. 671-679, May 1992.
FU, J. R.; ZHANG, H. Z.; WANG, X. P.; QIAO, Y. P.; HUANG, X. L.
Physiological studies on desiccation, wet storage and cryopreservation of
recalcitrant seeds of three fruit species and their excised embryonic axes. Seed
Science and Technology, Zurich, v. 18, n. 3, p. 743-751, 1990.
GENTIL, D. F. O. Conservação de sementes de Myrciaria dubia (H. B. K)
McVAUGH. 2003. 41 p. Tese (Doutorado) Escola Superior de Agricultura
“Luiz de Queiroz”, Piracicaba, SP.
54
HAN, B.; BERJAK, P.; PAMMENTER, N. W.; FARRANT, J. M.; KERMODE,
A. R. The recalcitrant plant species, Castanospermum australe and Trichilia
dregeana, differ in their ability to produce dehydrin-related polypeptides during
seed maturation and in response to ABA or water-deficit-related stresses.
Journal of Experimental Botany, Cambridge, v. 48, n. 3/4, p 1717-1726, Sept.
1997.
HARRINGTON, J. F. Seed storage and longevity. In: KOZLOWSKI, T. T. Seed
biology. New York: Academic Press, 1972. v. 3, p. 145-245.
HOEKSTRA, F. A.; GOLOVINA, E. A.; BUTTINK, J. Mechanisms of plant
desiccation tolerance. Trends in Plant Science, Oxford, v. 6, n. 9, p. 431-438,
Sept. 2001.
HOEKSTRA, F. A.; WOLKERS, W. F.; BUITINK, J.; GOLOVINA, E. A.;
CROWE, J. H.; CROWE, L. M. Membrane stabilization in the dry state.
Comparative Biochemistry and Physiology, Oxford, v. 117A, n. 3, p. 335-
341, July 1997.
HONG, S. W.; VIERLING, E. Mutants of Arabidopsis thaliana defective in the
acquisition of tolerance to high temperature stress. Proceedings of the National
Academy of Science of the United States of America, Washington, v. 97, n. 8,
p. 4392-4397, Apr. 2000.
HONG, T. D.; ELLIS, R. H. A comparison of maturation drying, germination,
and desiccation tolerance between developing seeds of Acer pseudoplatanus L.
and Acer platanoides L. New Phytologist, Cambridge, v. 116, n. 4, p. 589-596,
Dec. 1990.
HONG, T. D.; ELLIS, R. H. A protocol to determine seed storange
behaviour: Rome: IPGRI, 1996. 62 p. (IPGRI. Techinical bulletim, 1).
HONG, T. D.; ELLIS, R. H. Storage. In: Tropical tree seed manual. [S. l]:
USDA Forest Service’s, Reforestation, Nurseries, & Genetics Resources, 2003.
Chap. 3.
JOACHIM, F. W.; BULOW, V.; CARMONA, R.; PARENTE, V. T.
Armazenamento e tratamento de sementes de pitanga vermelha do cerrado
(Eugenia calycina). Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 29, n. 6, p.
961- 970, jun. 1994.
55
JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. 2. ed. Bombay: Tata McGraw-Hill
Book Company, 1940.
KERMODE, A. R. Approaches to elucidate the basis of desiccation-tolerance in
seeds. Seed Science Research, Wallingford, v. 7, n. 1, p. 75-95, Mar. 1997.
KING, M. W.; ROBERTS, E. H. The storage of recalcitrant seeds:
achievements and possible approaches. Rome: IBPGR, 1979. 96 p.
KRAUS, J. E.; ARDUIN, M. Manual básico de métodos em morfologia
vegetal. Rio de Janeiro: EDUR. 198 p.
KUNIYOSHI, Y. S. Morfologia da semente e da germinação de 25 espécies
arbóreas de uma floresta com Araucária. 1983. 233 p. Dissertação (Mestrado)
- Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR.
LEOPOLD, A. C.; SUN, W. Q.; BERNALLUGO, I. The glassy state in seeds:
analysis and function. Seed Science Research, Wallingford, v. 4, n. 4, p. 267-
274, Dec. 1994.
LEPRINCE, O.; HENDRY, G. A. F.; MCKERSIE, B. D. The mechanisms of
desiccation tolerance in developing seeds. Seed Science Research, Wallingford,
v. 3, n. 3, p. 231-246, Sept. 1993.
LIMA JÚNIOR, E. C. Germinação, armazenamento de sementes e fisio-
anatomia de plantas jovens de Cupania venalis Camb. 2004. 115 p.
Dissertação (Mestrado) - Universidade federal de Lavras, Lavras, MG.
LIN, T. -P.; CHEN, M. -H. Biochemical characteristics associated with the
development of the desiccation sensitive seeds of Machilus thunbergii Sieb. &
Zucc. Annals of Botany, London, v. 76, n. 4, p. 381-387, Oct. 1995.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas
arbóreas nativas do Brasil. 3. ed. Nova Odessa: Editora Plantarum, 2000. v. 1.
MAGUIRE, J. D. Speed of germination: aid in selection and evaluation for
seedling emergence and vigour. Crop Science, Madison, v. 2, n. 2, p. 176-177,
Mar./Apr. 1962.
MALUF, A. G.; BILIA, D. A. C.; BARBEDO, C. J. Drying and storage of
Eugenia involucrata DC. SEEDS. Scientia Agricola, Piracicaba, v. 60, n. 3, p.
471-475, Jul./Sept. 2003a.
56
MELO, M. G. G.; MENDONÇA, M. S.; MENDES, A. M. S. Análise
morfológica de sementes, germinação e plântulas de jatobá (Hymenaea
intermedia Ducke var. adenotricha (Ducke) Lee & Lang.) (Leguminosae-
caesalpinioideae). Acta Amazônica, Manaus, v. 34, n. 1, p. 9-14, Mar. 2004.
MERHAR, V. S. A.; CALISTRU, C.; BERJAK, P. A Study of Some
Biochemical and Histopathological Responses of Wet-stored Recalcitrant Seeds
of Avicennia marina Infected by Fusarium moniliforme. Annals of Botany,
London, v. 92, n. 3, p. 401-408, Sept. 2003.
MUNDY, J.; CHUA, N. H. Abscisic acid and water-stress induce a novel rice
gene. EMBO Journal, Oxford, v. 7, n. 8, p. 2279-2286, Aug. 1988.
OLADIRAN, J. A.; AGUNBIADE, S. A. Germination and seedling
development from pepper (Capsicum annuum L.) seeds following sotorage in
different packaging materials. Seed Science & Technology, Zurich, v. 28, n. 2,
p. 413-419, 2000.
OLIVER, M. J.; BEWLEY, J. D. Desiccation-tolerance of plant tissues: A
mechanistic overview. Horticultural Reviews, New York, v. 18, p. 171-213,
1997.
PAMMENTER, N. W.; BERJAK, P. A review of recalcitrant seed physiology in
relation to desiccation-tolerance mechanisms. Seed Science Research,
Wallingford, v. 9, n. 1, p. 13-37, Mar. 1999.
PONTES, A. C.; LIMA E BORGES, E. E.; BORGES, C. G.; SOARES, C. P. B.
Mobilização de reservas em sementes de Apuleia leiocarpa (Vogel) J. F. macbr.
(Garapa) durante a embebição. Revista Árvore, Viçosa-MG, v. 26, n. 5, p. 593-
601, set./out. 2002.
POPININGIS, F. Fisiologia de sementes. Brasília: AGRIPLAN, 1985. 285 p.
PRITCHARD, H. W. Water potential and embryonic axis viability in
recalcitrant seeds of Quercus rubra. Annals of Botany, London,, v. 67, n. 1, p.
43-49, Jan. 1991.
QUEITSCH, C.; HONG, S. W.; VIERLING, E.; LINDQUIST, S. Heat shock
protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell,
Rockville, v. 12, n. 4, p. 479-492, Apr. 2000.
57
RAMOS, A. Influência de cinco tipos de embalagens na germinação e no
vigor de sementes de angico - Parapiptadenia rigida (benth)brenan, caixeta –
Tabebuia cassinoides (lam.)dc e caroba – Jacaranda micrantha cham.
armazenadas em câmara fria e a temperatura ambiente. 1980. 134 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR.
ROBERTON, M.; CHANDLER, P. M. Pea dehydrins: identification,
characterization and expression. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 19, n.
6, p. 1031-1044, Sept. 1992.
ROBERTS, E. H. Predicting the storage life of seeds. Seed Science &
Technology, Zurich, v. 1, n. 3, p. 499-514, 1973.
ROBERTS, E. H. Storage evironment and the control of viability. In: Roberts,
E. H. (Ed). Viability of Seed. Syracuse university press, 1972. cap2, p. 14-58.
RODRIGUES, V. E. G.; CARVALHO, D. A. Plantas medicinais no domínio
dos cerrados. Lavras: Editora UFLA, 2001. 180 p.
SALOMÃO, A. N.; LIMA, L. H. C.; FERREIRA, M. A. Adaptação de método
para extração de proteínas de sementes de cerejeira (Amburana cearensis (Fr.
All.) A. C. Smith). Comunicado Técnico, Brasília, DF, n. 64, p. 1-6, 2002.
SILVA, L. L. Morfologia, anatomia e desenvolvimento dos frutos, sementes
e plântulas de Zanthoxylum rhoifolium Lam. , Esenbeckia grandiflora Mart.
, Dictyoloma vandellianum Adr. Juss. e Balfourodendron riedelianum
(Engler) Engler (Rutaceae). 2001. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual
Paulista, Rio Claro.
SUN, W. Q.; LEOPOLD, A. C. Cytoplasmic vitrification and survival
anhydrobiotic organisms. Comparative Biochemistry Physiology, Oxford, v.
117A, n. 3, p. 327-333, July 1997.
SUTHERLAND, J. R.; DIEKMANN, M.; BERJAK, P. Forest tree seed health
for germoplasm conservation. Rome: IPGRI, 2000.
TIGABU, M.; ODEM, P. C. Effect of scarification, giberellic acid and
temperature on seed germination of two multipurpose Albizia species from
Ethiopia. Seed Science and Technology, Zurich, v. 29 n. 1, p. 11-20, 2001.
VERTUCCI, C. W.; FARRANT, J. M. Acquisition and loss of desiccation
tolerance. In: KIGEL, J.; GALILI, G. (Ed.). Seed development and
germination. New York: Marcel Dekker, 1995. p. 237-271.
58
VIEIRA, A. H.; MARTINS, E. P.; PEQUENO, P. L. de L.; LOCATELLI, M.;
SOUZA, M. G. de. Técnicas de produção de sementes florestais. Porto Velho:
Embrapa, CT 205, 2001. p. 1-4.
WALTERS, C. Levels of recalcitrance in seeds. Revista Brasileira de
Fisiologia, Londrina, v. 12, n. 1, p. 7-21, abr. 2000.
WALTERS, C.; RIED, J. L.; WALKERSIMMONS, M. K. Heat-soluble proteins
extracted from wheat embryos have tightly bound sugars and unusual hydration
properties. Seed Science Research, Wallingford, v. 7, n. 2, p. 125- 134, June
1997.
WILLIAMSON, J. D.; QUATRANO, R. S. ABA-regulation of two classes of
embryo-specific sequences in mature wheat embryos. Plant Physiology,
Rockville, v. 86, n. 1, p. 208-215, Jan. 1998.
YEMM, E. W.; WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts
by anthrone. The Biochemical Journal, London, v. 53, n. 3, p. 508-514, 1954.
59
ANEXOS
TABELA A - Análise de variância para germinação durante o armazenamento.
TABELA A1 - Análise de variância para o desdobramento dos níveis de
umidade dentro dos níveis do fator temperatura durante o armazenamento.
TABELA A2 - Análise de variância para os contrastes dos tratamentos
adicionais com as melhores médias de germinação. Adicional 1 (40% de
umidade no tempo 0); Adicional 2 (35% de umidade no tempo 0); Adicional 3
(30% de umidade no tempo 0).
TABELA B - Análise de variância para IVE durante o armazenamento.
TABELA B1 - Análise de variância para os contrastes dos tratamentos
adicionais com as melhores médias de IVG. Adicional 1 (40% de umidade no
tempo 0); Adicional 2 (35% de umidade no tempo 0); Adicional 3 (30% de
umidade no tempo 0).
TABELA C - Análise de variância para os teores de açúcares solúveis totais
encontrados durante o armazenamento.
TABELA C1 - Análise de variância para o desdobramento dos níveis de
umidade fixado época e temperatura no período de armazenamento.
TABELA C2 - Análise de variância para os contrastes dos tratamentos
adicionais com as melhores médias de teores de açúcares solúveis totais.
60
Adicional 1 (40% de umidade no tempo 0); Adicional 2 (35% de umidade no
tempo 0); Adicional 3 (30% de umidade no tempo 0).
TABELA A- Análise de variância para germinação durante o armazenamento.
FV GL SQ QM F Pr>Fc
Umidade 2 21660,0 10830,0 34,388 0,000
Época 1 5084,1 5084,1 16,143 0,000
Temperatura 1 11844,1 11844,1 37,608 0,000
Ad1 vs Fatorial 1 6574,40 6574,40 20,875 0,000
Ad2 vs Fatorial 1 6242,97 6242,97 19,823 0,000
Ad3 vs Fatorial 1 3645,83 3645,83 8,859 0,004
Um*Época 2 823,0 411,5 1,306 0,289
Um*temperatura 2 2813,0 1406,5 4,466 0,017
Época*temperatura 1 520,1 520,1 1,651 0,205
Um*ep*temp 2 198,0 99,0 0,314 0,578
Erro 45 14172 314,93
Total 59 76260
Tabela A1- Análise de variância para o desdobramento dos níveis de umidade
dentro dos níveis do fator temperatura.
FV GL SQ QM F Pr>Fc
Um / 10 ºC 2 10081,33 5040,66 16,005 0,0000
Um / 25 ºC 2 14391,75 7195,87 22,849 0,0000
Residuo 45 14172,50 314,93
61
TABELA A2 . Análise de variância para os contrastes dos tratamentos
adicionais com as melhores médias de germinação. Adicional 1 (40% de
umidade no tempo 0); Adicional 2 (35% de umidade no tempo 0); Adicional 3
(30% de umidade no tempo 0).
FV. GL. QM Fc Pr>Fc
Contraste 1 1 8,00 0,025 0,8741
Contraste 2 1 2,00 0,006 0,9368
Contraste 3 1 128,00 0,406 0,5270
Contraste 4 1 300,125 0,953 0,3342
Contraste 5 1 253,125 0,804 0,3747
Contraste 6 1 10,125 0,032 0,8585
Contraste 7 1 12168,00 38,638 0,0000
Contraste 8 1 578,00 1,835 0,1823
Contraste 9 1 128,00 0,406 0,5270
Resíduo 45 314,92
1= ad1 vs trat1;2= ad2 vs trat1; 3= ad3 vs trat1; 4= ad1 vs trat2; 5= ad2 vs trat2;
6= ad3 vs trat2; 7= ad1 vs trat3; 8= ad2 vs trat3; 9= ad3 vs trat3.
Observação:
Tratamento 1 (40% de umidade aos 120 dias de armazenamento a 10 ºC);
Tratamento 2 (40% de umidade aos 120 dias de armazenamento a 25 ºC) e
Tratamento 3 (40% de umidade aos 240 dias de armazenamento a 10 ºC).
62
TABELA B-Análise de variância para IVE, durante o armazenamento.
FV GL SQ QM F Pr>Fc
Umidade 2 16,2604 8,1302 31,983 0,000
Época 1 1,5052 1,5052 5,921 0,018
Temperatura 1 14,8519 14,8519 58,426 0,000
Ad1 vs Fatorial 1 3,41508 3,41508 13,434 0,000
Ad2 vs Fatorial 1 8,0164 8,0164 31,537 0,001
Ad3 vs Fatorial 1 1,148 1,148 4,516 0,039
Um*Época 2 0,6529 0,3265 1,284 0,286
Um*temperatura 2 1,0138 0,5069 1,994 0,148
Época*temperatura 1 0,1102 0,1102 0,433 0,513
Um*ep*temp 2 0,2529 0,1265 0,497 0,611
Erro 45 11,442 0,2542
Total 59 60,469
63
TABELA B1. Análise de variância para os contrastes dos tratamentos adicionais
com as melhores médias de IVG. Adicional 1 (40% de umidade no tempo 0);
Adicional 2 (35% de umidade no tempo 0); Adicional 3 (30% de umidade no
tempo 0).
FV GL QM Fc Pr>Fc
Contraste 1
1 0.361250 1,4211 0,239
Contraste 2 1 0.005000 0,0196 0,889
Contraste 3 1 1.280000 5,0354 0,0297
Contraste 4 1 0.026450 0,1045 0,7479
Contraste 5 1 0.696200 2,724 0,7479
Contraste 6 1 0.135200 0,531 0,469
Contraste 7 1 0.266450 1,048 0,311
Contraste 8 1 1.411200 5,551 0,0228
Contraste 9 1 0.000200 7,867
Resíduo 45 0.2542
1= ad1 vs trat1; 2= ad2 vs trat1; 3= ad3 vs trat1; 4= ad1 vs trat2; 5= ad2 vs trat2;
6= ad3 vs trat2; 7= ad1 vs trat3; 8= ad2 vs trat3; 9= ad3 vs trat3.
Observação:
Tratamento 1 (40% de umidade aos 120 dias de armazenamento a 10 ºC);
Tratamento 2 (40% de umidade aos 240 dias de armazenamento a 10 ºC) e
Tratamento 3 (35% de umidade aos 240 dias de armazenamento a 10 ºC).
64
Tabela C - Análise de variância para o desdobramento dos níveis de umidade
fixados época e temperatura, no período de armazenamento.
FV GL SQ QM F Pr>Fc
Umidade 2 7251 3625 5,027 0,0213
Época 1 34 34 0,047 0,954
Temperatura 1 32204 32204 44,665 0,000
Ad1 vs Fatorial 1 16906,88 16906,88 23,449 0,000
Ad2 vs Fatorial 1 5164,96 5164,96 7,163 0,0172
Ad3 vs Fatorial 1 8536,07 8536,07 11,839 0,003
Um*Época 2 3602 1801 2,497 0,115
Um*temperatura 2 17157 8578 11,897 0,000
Época*temperatura 1 50882 50882 70,571 0,000
Um*ep*temp 2 19472 9736 13,503 0,000
Erro 15 10819 721
Total 23 139595
TABELA C1– Análise de variância para o desdobramento dos níveis de
umidade fixados época e temperatura, no período de armazenamento.
FV GL SQ QM Fc Pr>Fc
Umidade/1 2 24748,43 12374,21 17,162 0,0001
Umidade/2 2 3433,18 1716,59 2,380 0,126
Umidade/3 2 1368,03 684,01 0,948 0,409
Umidade/4 2 17928,79 8964,39 12,433 0,0005
Resíduo 15 10819 721
Codificação usada para o desdobramento
código Época (dias) Temperatura ºC
1 120 10
2 120 25
3 240 10
4 240 25
65
TABELA C2 - Análise de variância para os contrastes dos tratamentos
adicionais com as melhores médias de teores de açúcares solúveis totais.
Adicional 1 (40% de umidade no tempo 0); Adicional 2 (35% de umidade no
tempo 0); Adicional 3 (30% de umidade no tempo 0).
FV
GL QM Fc Pr>Fc
Contraste 1 1 1393,902 1,933 0,1847
Contraste 2 1 5,736 0,007 0,934
Contraste 3 1 13134,306 18,216 0,0006
Contraste 4 1 36227,412 50,246 0,0000
Contraste 5 1 22681,866 31,458 0,0000
Contraste 6 1 1474,176 2,044 0,173
Contraste 7 1 6746,979 9,357 0,007
Contraste 8 1 1798,608 2,494 0,135
Contraste 9 1 4872,040 6,757 0,0201
Contraste 10 1 13826,232 19,176 0,0005
Contraste 11 1 6061,401 8,406 0,0110
Contraste 12 1 1180,266 1,636 0,220
Contraste 13 1 28495,128 39,521 0,000
Contraste 14 1 16660,355 23,107 0,000
Contraste 15 1 284,428 0,394 0,539
Contraste 16 1 62667,612 86,917 0,0000
Contraste 17 1 4354,466 61,517 0,0000
Contraste 18 1 9681,576 13,427 0,0023
Resíduo 15 721
1= ad1 vs trat1; 2= ad2 vs trat1; 3= ad3 vs trat1; 4= ad1 vs trat2; 5= ad2 vs trat2;
6= ad3 vs trat2; 7= ad1 vs trat3; 8= ad2 vs trat3; 9= ad3 vs trat3; 10= ad1 vs
trat4; 11= ad2 vs trat4; 12= ad3 vs trat4; 13= ad1 vs trat5; 14= ad2 vs trat5; 15=
ad3 vs trat5; 16= ad1 vs trat6; 17= ad2 vs trat6; 18= ad3 vs trat6.
Observação:
Tratamento 1 (40% de umidade aos 120 dias de armazenamento a 10 ºC);
Tratamento 2 (35% de umidade aos 120 dias de armazenamento a 10 ºC) e
Tratamento 3 (30% de umidade aos 120 dias de armazenamento a 10 ºC).
Tratamento 4 (40% de umidade aos 240 dias de armazenamento a 25 ºC);
Tratamento 5 (35% de umidade aos 240 dias de armazenamento a 25 ºC) e
Tratamento 6 (30% de umidade aos 240 dias de armazenamento a 25 ºC).
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
