( PDF ) Estudo do efeito farmacolóogico da (alfa), (beta)-amirina, uma mistura de triterpenos isolada de Protium heptaphyllum, na pancreatite aguda experimental

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

CAROLINE MOURÃO MELO

ESTUDO DO EFEITO FARMACOLÓGICO DA α,β

ββ

β-AMIRINA,

UMA MISTURA DE TRITERPENOS ISOLADA DE Protium

heptaphyllum, NA PANCREATITE AGUDA EXPERIMENTAL

FORTALEZA-CE

2009

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CAROLINE MOURÃO MELO

ESTUDO DO EFEITO FARMACOLÓGICO DA α,β

ββ

β-AMIRINA,

UMA MISTURA DE TRITERPENOS ISOLADA DE Protium

heptaphyllum, NA PANCREATITE AGUDA EXPERIMENTAL

Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia do

Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal do

Ceará como requisito parcial para

obtenção do título de Doutor em

Farmacologia.

Orientador (a):

Prof

. Dra. Flávia Almeida Santos

Fortaleza

2009

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M485e Melo, Caroline Mourão

Estudo do efeito farmacológico da α,β-amirina, uma mistura de

triterpenos isolada de Protium heptaphyllum, na pancreatite aguda

experimental / Caroline Mourão Melo. – Fortaleza, 2009.

152f. : il.

Orientadora: Profª. Dra. Flávia Almeida Santos

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de

Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.

1. Pancreatite 2. Arginina 3. Ceruleína 4. Citocinas I. Santos, Flávia

Almeida (Orient.) II. Título.

CDD: 616.33

CAROLINE MOURÃO MELO

ESTUDO DO EFEITO FARMACOLÓGICO DA α

αα

α,β

ββ

β-AMIRINA, UMA MISTURA DE

TRITERPENOS ISOLADA DE Protium heptaphyllum, NA PANCREATITE AGUDA

EXPERIMENTAL

Tese submetida á Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia

do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará,

como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.

Aprovada em: 23/11/2009

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Profa. Dra. Flávia Almeida Santos (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará-UFC

_______________________________________

Profa. Dra. Rosilene Moretti Marçal

Universidade Federal de Sergipe-UFS

_______________________________________

Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy

Universidade Estadual do Ceará-UECE

_______________________________________

Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito

Universidade Federal do Ceará-UFC

_______________________________________

Prof. Dr. Miguel Ângelo Nobre e Souza

Universidade Federal do Ceará-UFC

DEDICATÓRIA

Momentos únicos, importantes e algumas vezes difíceis marcaram essa etapa de

minha vida! Agradeço a DEUS pela coragem e determinação que me foi concedida

para que eu pudesse concluir com sapiência esse relevante trabalho. Noivado,

casamento, viagens freqüentes, gravidez, distância de meu companheiro...

SAUDADES, angustiante! Que muitas vezes me abateram e outras me deram ainda

mais força para que eu continuasse e diminuísse o mais rápido possível a distância

entre nós. Saudades mútuas... Que o impediram de acompanhar com afinco o

desenvolvimento embrionário de nosso tão amado e esperado FILHO!

Dedico esse trabalho, principalmente a DEUS, e a duas pessoas em especial, que

me fizeram sentir e viver histórias inesquecíveis... Ao ALEX, que aprendo a amar

mais a cada dia e ao nosso filho, MATEUS, que agora com oito meses, acrescentou

em minha VIDA mais um motivo para SORRIR, LUTAR, AMAR... Enfim, para

SEGUIR em frente!

SIMPLESMENTE, AMO VOCÊS!

Aos meus pais Maria Soares Mourão e

Raimundo Beserra Melo, pelo incentivo na

busca de meus objetivos.

À minha irmã Clarisse e ao meu cunhado

Glaydson pelo apoio na fase mais importante de

minha vida e principalmente pela amizade.

Aos meus irmãos Danilo e Carine por

sempre estarem presentes nos mais

importantes momentos de minha vida.

Ao mais novo integrante da família, meu

afilhado e sobrinho, Felipe, que mesmo tão

pequeno, acrescentou em minha vida um

motivo a mais para sorrir.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Flávia Almeida Santos pela orientação e confiança que me possibilitou

realizar esse importante trabalho.

Ao Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao pela colaboração fundamental para a

execução desse trabalho.

À Profa. Dra. Mariana Chaves pelo fornecimento da mistura dos triterpenos α- e β-

amirina, a base de realização deste trabalho.

Às Professoras Geanne Matos de Andrade, Gerly Anne de Castro Brito e Adriana

Tomé pela contribuição nas avaliações histopatológicas e imunohistoquímicas.

Às Doutorandas Silvéria, Cinthya, Marjorie, Alana e Ana Carla pela colaboração nos

meus experimentos e principalmente pela amizade.

Às mestrandas Natália, Talita e Karine pela amizade.

Aos bolsistas de iniciação centífica, amigos do curso de pós-graduação, professores

e funcionários da Universidade Federal do Ceará que direta ou indiretamente

contribuíram para a realização desta tese.

A todos os meus familiares pelo carinho, confiança e amizade, principalmente a

minha avó Rosila, mãe de todas as virtudes.

À Olinda, Josemildo, Aleson, Amanda e Ana Beatriz, pessoas maravilhosas que

fazem parte de minha vida.

Aos meus amigos Karol e Windson sempre presentes em minha vida.

Ao CNPq pelo apoio financeiro

“Seja a mudança que você quer ver no mundo”

Dalai Lama

RESUMO

Os triterpenos pentacíclicos são compostos naturais com atividade antiinflamatória e

citoprotetora e são relativamente atóxicos. A pancreatite aguda, uma inflamação

aguda do pâncreas, pode levar à síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS)

e à síndrome da disfunção múltipla de órgãos (MODS), condições que podem levar

o paciente ao óbito. Neste trabalho, a mistura de triterpenos pentacíclicos α,β-

amirina, isolada do Protium hepthaphyllum, foi investigada quanto aos seus efeitos

nos modelos de pancreatite aguda induzida por L-arginina em ratos e por ceruleína

em camundongos. No modelo de pancreatite aguda induzida por L-arginina, ratos

Wistar machos foram tratados com a mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg,

v.o.) ou com o veículo (2% de Tween 80 em água destilada, 10ml/kg) 48, 24 e 1,5h

antes da administração de L-arginina (2 x 2,5 g/kg; 1 h de intervalo) ou com

metilprednisolona (30 mg/kg, i.m.) 30 min antes da administração de L-arginina. Na

pancreatite induzida por ceruleína, camundongos Swiss machos foram tratados com

a mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) ou com o veículo (2% de Tween

80 em água destilada, 10ml/kg) 48, 24 e 1,5h antes da administração de ceruleína (5

x 50 µg/kg; 1 h de intervalo) ou com talidomida (200 mg/kg, v.o.) 1h antes da

administração de ceruleína. Animais tratados apenas com salina (0,9%, NaCl) foram

incluídos nos dois modelos. Foram analisados o edema pancreático, níveis séricos

de amilase, lipase e citocinas (TNFα, IL-6), mieloperoxidase, substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS), histologia e imunohistoquímica (TNF-α, iNOS e

nitrotirosina) pancreática. L-arginina e ceruleína aumentaram significativamente o

edema pancreático e os níveis séricos de amilase, lipase, TNFα, IL-6. A avaliação

histopatológica do pâncreas revelou a presença de edema, infiltração neutrofílica,

hemorragia, vacuolização e necrose acinar. Foi observado um aumento acentuado

na expressão de TNFα, iNOS e nitrotirosina na avaliação por imunohistoquímica. O

pré-tratamento com alfa e beta-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.), metilprednisolona

(30 mg/kg, i.m.) ou talidomida (200 mg/kg, v.o.) atenuaram significativamente a

severidade da pancreatite aguda induzida tanto por L-arginina, quanto por ceruleína,

evidenciado pela redução do edema pancreático, amilase, lipase e citocinas séricas,

mieloperoxidase e TBARS pancreático. Além disso, o tratamento com α,β-amirina e

com as drogas de referência suprimiram as alterações histopatológicas e a

expressão de citocinas e nitrotirosina pancreáticas. Em conjunto, esses resultados

indicam que α,β-amirina melhora a severidade da pancreatite aguda induzida por L-

arginina ou ceruleína por agir como antiinflamatório e antioxidante.

Palavras Chaves

Pancreatite; Triterpeno; α,β-Amirina; Arginina; Ceruleína; Citocinas; Rato;

Camundongo

ABSTRACT

Triterpenes are natural compounds with anti-inflammatory and cytoprotective effects

relatively non-toxic. Acute pancreatitis, an inflammation of the pancreas, may lead to

systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and multiple organ dysfunction

syndrome (MODS), conditions that can lead the patient to death. In this study, a

mixture of triterpenes isolated from Protium hepthaphyllum was investigated for their

effects in models of acute pancreatitis. In the model of acute pancreatitis induced by

L-arginine, male Wistar rats were treated with a mixture of α,β-amyrin (10, 30 and

100 mg/kg, p.o.) or with vehicle (2% Tween 80 in distilled water, 10 ml/kg) 48, 24 and

1.5 h before the administration of L-arginine (2 x 2.5 g/kg, 1 h apart) or with

metilprednisolone (30 mg/kg, i.m.) 30 min before the administration of L-arginine. In

cerulein-induced pancreatitis, male Swiss mice were treated with a mixture of α,β-

amyrin (10, 30 and 100 mg/kg, p.o.) or with vehicle (2% Tween 80 in distilled water,

10 ml/kg) 48, 24 and 1.5 h before administration of cerulein (5 x 50 mg/kg, 1 h apart)

or with thalidomide (200 mg/kg, p.o.) 1h before administration of cerulein. Animals

treated with saline (0.9% NaCl) were included in both models. We analyzed the

pancreatic edema, serum amylase, lipase and cytokines (TNF-α, IL-6),

myeloperoxidase, reactive substances to thiobarbituric acid (TBARS), histology and

immunohistochemistry (TNF-α, iNOS and nitrotyrosine) pancreatic. L-arginine and

cerulein significantly increased pancreatic edema and serum levels of amylase,

lipase, TNF-α and IL-6. Histopathologic evaluation of pancreas revealed the

presence of edema, neutrophil infiltration, hemorrhage, acinar vacuolization and

necrosis. We observed a marked increase in the expression of TNF-α, iNOS and

nitrotyrosine in the evaluation by immunohistochemistry. The pre-treatment with

alpha and beta-amyrin (10, 30 and 100 mg/kg, p.o.), metilprednisolone (30 mg/kg,

i.m.) or thalidomide (200 mg/kg, p.o.) significantly attenuated the severity of acute

pancreatitis induced by either L-arginine, and by cerulein, as evidenced by the

reduction of pancreatic edema, amylase, lipase and serum cytokines,

myeloperoxidase and pancreatic TBARS. Furthermore, treatment with α,β-amyrin

and the reference drugs suppressed the histopathological changes and expression of

cytokines and nitrotyrosine pancreatic. Together, these results indicate that the

mixture of α,β-amyrin reduces the severity of acute pancreatitis induced by L-arginine

or cerulein acting as anti-inflammatory and antioxidant agent.

Keywords

Pancreatitis; Triterpene; α,β-Amyrin; Arginine; Cerulein; Cytokines; Rate; Mice

LISTA DE SIGLAS

mais ou menos

% Percentagem

® Marca registrada

Alfa

Beta

µL

Microlitro

µm

Micrometro

µM

Micromolar

C Grau centígrado

ANOVA Análise de variância

aICAM-1 Anti molécula de adesão intercelular-1

Íon cálcio

CCK Colecistocinina

c-fos Oncogene c-fos

CGRP Peptídio relacionado ao gene da calcitonina

c-NOS Óxido nítrico sintase constitutiva

COX-2 Ciclooxigease-2

CPRE Colangiopancreatografia retrógrada endoscópica

CSE

Cistationina-γ-liase

CTBS Cistationina-B-sintase

CTSB Catepsina B

DAB Solução substarto cromógeno

Dl Decilitro

DL-50 Dose letal 50

DNA Ácido desoxirribonucléico

E.P.M. Erro padrão da média

ERRO(s) Espécies reativas de oxigênio

et al. ...e colaboradores

G Grama

GRO-α/CINC Oncogene-α relacionadoao crescimento/quimioatraente de

neutrófilos indutor de quimiocina

H Hora

S Sulfeto de hidrogênio

Peróxido de hidrogênio

HTAB Hexadeciltrimetilamônio

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1

IL Interleucina

i.m. Intramuscular

iNOS Óxido nítrico sintase induzida

i.p. Intraperitoneal

KCl Cloreto de potássio

Kg Quilograma

L Litro

L-arg L-arginina

L-NAME N G- Nitro-L-arginina metil éster

Mg Miligrama

min. Minuto

Mm Milimolar

Ml Mililitro

MCP-1 Proteína quimiotática de monócito-1

MDA Malonilaldeído

MPO Mieloperoxidase

NF-κB

NF-KappaB

NEP Endopeptidase neutra

NK1 Receptores de neurocinina 1

Nm Nanômetro

NO Óxido Nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

Ânion superóxido

Hidroxil

ONOO

Peroxinitrito

P Peso

PAF Fator ativador de plaquetas

PAF-AH PAF-acetilhidrolase

PAG Propargilglicina

PAT Peptídeo ativador de tripsinogênio

PBS Tampão fosfato

Pg Picograma

PGE Prostaglandina E

PKC Proteína quinase C

PLA Fosfolipase

METILPRED Metilprednisolona

P Nível de significância

PA Pancreatite aguda

PC Pancreatite crônica

SNAREs Proteína receptora ao fator sensível à N-etilmaleimida

TAL Talidomida

TC Tomografia computadorizada

TBA Ácido tiobarbitúrico

TBARS Substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico

TNF-α Fator de necrose tumoral-α

TRPV-1 Receptores vanilóide-1

U Unidade

V Volume

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

VIP Polipeptídio intestinal vasoativo

v.o. Via oral

LISTA DE TABELAS

Tabela Página

Tabela 1 - Marcadores séricos determinantes do diagnóstico e

prognóstico da doença

Tabela 2 - Tratamento farmacológico da pancreatite aguda.

Revisão de drogas testadas em modelos animais

experimentais e triagem clínica

Tabela 3 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre as

alterações morfológicas observadas em resposta ao

tratamento com L-arg

Tabela 4 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a

intensidade de reação observada nas lâminas de

imunohistoquímica para a determinação de iNOS em

resposta ao tratamento com L-arg

Tabela 5 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a

intensidade de reação observada nas lâminas de

imunohistoquímica para a determinação de TNF-α em

resposta ao tratamento com L-arg

Tabela 6 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a

intensidade de reação observada nas lâminas de

imunohistoquímica para a determinação de

nitrotirosina em resposta ao tratamento com L-arg

Tabela 7 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre as

alterações morfológicas observadas em resposta ao

tratamento com CER

Tabela 8 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a

intensidade de reação observada nas lâminas de

imunohistoquímica para a determinação de TNF-α em

resposta ao tratamento com CER

Tabela 9 -

Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a

intensidade de reação observada nas lâminas de

imunohistoquímica para a determinação de iNOS em

resposta ao tratamento com CER

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

Figura 1 - Estrutura do pâncreas (cabeça, corpo e cauda)

Figura 2 - Os ácinos (unidade funcional do pâncreas exócrino)

Figura 3 - Características fisiopatológicas do desenvolvimento da

pancreatite aguda

Figura 4 - Pancreatite aguda: ativação de enzimas digestivas nas

células acinares e mudanças patológicas

Figura 5 -

Fotografia da espécie Protium heptaphyllum March

Figura 6 -

Fotografia ilustrando folhas e frutos do Protium

heptaphyllum

Figura 7 - Fotografia ilustrando queima do exsudato óleo-

resinoso do Protium heptaphyllum

Figura 8 -

Estrutura química dos triterpenos pentacíclicos α- e β-

amirina

Figura 9 -

Processo de isolamento da mistura dos triterpenos α-

e β-amirina da resina de Protium heptaphyllum March

Figura 10 -

Efeito de α- e β-amirina (α,β-amirina) e METILPRED

sobre os níveis de amilase sérica em resposta a

administração de L-arg em ratos

Figura 11 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre os níveis

de lipase sérica em resposta a administração de L-arg

em ratos

Figura 12 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre o grau de

edema pancreático em resposta a administração de L-

arg em ratos

Figura 13 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre o aumento

da atividade de MPO em resposta a administração de

L-arg em ratos

Figura 14 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre o aumento

de TBARS em resposta a administração de L-arg em

ratos

Figura 15 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre o aumento

dos níveis teciduais de nitrato e nitrito em resposta a

administração de L-arg em ratos

Figura 16 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre os níveis

séricos de TNF-α em resposta a administração de L-

arg em ratos

Figura 17 -

Efeito de α,β-amirina e METILPRED sobre os níveis

séricos de IL-6 em resposta a administração de L-arg

em ratos

Figura 18 - Fotomicrografia representativa do tecido pancreático

de ratos submetidos a administração de altas doses de

L-arg

Figura 19 - Imunorreatividade para a determinação de iNOS no

tecido pancreático de ratos submetidos à

administração de altas doses de L-arg

Figura 20 -

Imunorreatividade para a determinação de TNF-α no

tecido pancreático de ratos submetidos à

administração de altas doses de L-arg

Figura 21 - Imunorreatividade para a determinação de nitrotirosina

no tecido pancreático de ratos submetidos à

administração de altas doses de L-arg

Figura 22 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre os níveis de amilase

sérica em resposta a administração de ceruleína

(CER) em camundongos

Figura 23 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre os níveis de lipase

sérica em resposta a administração de CER em

camundongos

Figura 24 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre o grau de edema

pancreático em resposta a administração de CER em

camundongos

Figura 25 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre o aumento de MPO

em resposta a administração de CER em

camundongos

Figura 26 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre o aumento de

TBARS em resposta a administração de CER em

camundongos

Figura 27 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre os níveis séricos de

TNF-α em resposta a administração de CER em

camundongos

Figura 28 -

Efeito de α,β-amirina e TAL sobre os níveis séricos de

IL-6 em resposta a administração de CER em

camundongos

Figura 29 - Fotomicrografia representativa do tecido pancreático

de camundongos submetidos à administração de altas

doses de CER

Figura 30 -

Imunoreatividade para a determinação de TNF-α no

tecido pancreático de camundongos submetidos à

administração de altas doses de CER

Figura 31 - Imunoreatividade para a determinação de iNOS no

tecido pancreático de camundongos submetidos à

administração de altas doses de CER

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO........................................................................................................................................18

1.1.

Generalidades....................................................................................................................................18

1.2.

O pâncreas .........................................................................................................................................19

1.2.1.

Pancreatite...................................................................................................................................22

1.2.2.

Pancreatite Aguda ......................................................................................................................23

1.2.2.1.

Revisão Bibliográfica..........................................................................................................24

1.2.2.2.

Quadro clínico, diagnóstico e tratamento........................................................................33

1.2.2.3.

Modelos experimentais de pancreatite aguda................................................................37

1.2.2.3.1.

Pancreatite aguda induzida por L-arginina................................................................38

1.2.2.3.2.

Pancreatite aguda induzida por ceruleína .................................................................39

1.2.3.

Plantas medicinais e pancreatite..............................................................................................40

1.3.

Protium heptaphyllum (Aubl.) March. .........................................................................................43

1.3.1.

Alfa e Beta- amirina....................................................................................................................46

RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA.......................................................................................................47

OBJETIVOS................................................................................................................................................49

3.1.

Geral.....................................................................................................................................................49

3.2.

Específicos.........................................................................................................................................49

MATERIAIS.............................................................................................................................................50

4.1.

Material botânico ..............................................................................................................................50

4.2.

Animais experimentais....................................................................................................................50

4.3.

Drogas e reagentes..........................................................................................................................51

4.4.

Equipamentos....................................................................................................................................52

MÉTODOS...............................................................................................................................................53

5.1.

Obtenção da mistura dos triterpenos

-amirina (extração e fracionamento) ...............53

5.2.

Caracterização da atividade da mistura de

αα

ββ

-amirina na pancreatite aguda induzida

pela administração de L-arginina em ratos e ceruleína em camundongos ..................................55

5.2.1.

Pancreatite aguda induzida por L-arginina .............................................................................55

5.2.2.

Pancreatite aguda induzida por ceruleína...............................................................................55

5.2.3.

Determinação de amilase e lipase sérica................................................................................56

5.2.4.

Determinação do grau de edema pancreático .......................................................................56

5.2.5.

Determinação da atividade da mieloperoxidase....................................................................56

5.2.6.

Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico..........................................57

5.2.7.

Determinação de nitrato e nitrito ..............................................................................................57

5.2.8.

Determinação sérica de TNF-α e IL-6.....................................................................................58

5.2.9.

Avaliação histológica do pâncreas...........................................................................................58

5.2.10.

Estudo imunohistoquímico para a determinação de TNF-α, iNOS e nitrotirosina........59

5.3.

Análise estatística ............................................................................................................................60

RESULTADOS........................................................................................................................................61

6.1.

Obtenção da mistura dos triterpenos

αα

ββ

-amirina (identificação).......................................61

6.2.

Pancreatite aguda induzida por L-arginina e ceruleína..........................................................61

6.3.

Caracterização da atividade da mistura de

αα

ββ

-amirina na pancreatite aguda induzida

pela administração de L-arginina em ratos ...........................................................................................62

6.3.1.

Determinação de amilase sérica..............................................................................................62

6.3.2.

Determinação de lipase sérica..................................................................................................63

6.3.3.

Determinação do grau de edema pancreático .......................................................................64

6.3.4.

Determinação da atividade da mieloperoxidase....................................................................65

6.3.5.

Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico..........................................66

6.3.6.

Determinação de nitrato e nitrito ..............................................................................................67

6.3.7.

Determinação sérica de TNF-α ................................................................................................68

6.3.8.

Determinação sérica de IL-6.....................................................................................................69

6.3.9.

Avaliação histológica do pâncreas...........................................................................................70

6.3.10.

Estudo imunohistoquímico para a determinação de iNOS...............................................72

6.3.11.

Estudo imunohistoquímico para a determinação de TNF-α.............................................74

6.3.12.

Estudo imunohistoquímico para a determinação de nitrotirosina....................................76

6.4.

Caracterização da atividade da mistura de

αα

ββ

-amirina na pancreatite aguda induzida

pela administração de ceruleína em camundongos............................................................................78

6.4.1.

Determinação de amilase sérica..............................................................................................78

6.4.2.

Determinação de lipase sérica..................................................................................................79

6.4.3.

Determinação do grau de edema pancreático .......................................................................80

6.4.4.

Determinação da atividade da mieloperoxidase....................................................................81

6.4.5.

Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico..........................................82

6.4.6.

Determinação sérica de TNF-α ................................................................................................83

6.4.7.

Determinação sérica de IL-6.....................................................................................................84

6.4.8.

Avaliação histológica do pâncreas...........................................................................................85

6.4.9.

Estudo imunohistoquímico para a determinação de TNF-α.................................................87

6.4.10.

Estudo imunohistoquímico para determinação de iNOS..................................................89

DISCUSSÃO ...........................................................................................................................................91

CONCLUSÕES.....................................................................................................................................109

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................................111

1. INTRODUÇÃO

1.1. Generalidades

Desde muito tempo, os produtos naturais, notavelmente os originados de

plantas, tem sido uma importante fonte de agentes terapêuticos. Aproximadamente

vinte e cinco porcento de todas as drogas avaliadas como agentes terapêuticos são

derivadas de produtos naturais (CALIXTO, 2005). Assim, as plantas medicinais

tornaram-se o grande alvo das indústrias farmacêuticas e institutos de pesquisa na

busca de novas drogas e compostos com atividade terapêutica (EVANS, 1996).

As plantas medicinais têm sido utilizadas tradicionalmente para o

tratamento de várias enfermidades. Sua aplicação é vasta e abrange desde o

combate ao câncer até os microrganismos patogênicos (SILVA et al., 2004;

CALIXTO, 2000). As plantas, além de seu uso na medicina popular com finalidades

terapêuticas, têm contribuído, ao longo dos anos, para a obtenção de vários

fármacos, até hoje amplamente utilizados na clínica, como a emetina, a vincristina, a

colchicina e a rutina (CECHINEL FILHO, 1998).

A pesquisa sistemática para a obtenção de novas substâncias com

finalidade terapêutica pode ser executada por meio de vários processos. Os mais

utilizados são a síntese de novas moléculas, a modificação molecular de

substâncias naturais e/ou sintéticas com propriedades farmacológicas definidas,

extração, isolamento e purificação de novos compostos de fontes naturais,

especialmente de origem vegetal, as quais se caracterizam como uma fonte

inesgotável de substâncias potencialmente ativas como medicamento (DI STASI,

1996). Devido principalmente ao avanço da química combinatória, as pesquisas

sobre produtos naturais na indústria farmacêutica teve um lento declínio. Todavia,

relevantes evidências para as companhias farmacêuticas mostraram que para

algumas doenças complexas, os produtos naturais ainda representam um grande

valor para a produção de novas entidades químicas (CALIXTO, 2005).

No Brasil, especialmente na Região Nordeste, o uso de plantas

medicinais e preparações caseiras assumem importância fundamental no tratamento

das patologias que afetam as populações de baixa renda, tendo em vista a

deficiência da assistência médica, a influência da transmissão oral dos hábitos

culturais e a disponibilidade da flora (MATOS, 1989).

Juntos, os países da América Latina possuem grande parte da

biodiversidade do mundo. O Brasil sozinho possui de 20 a 22% de todas as plantas

e microorganismos existentes. Todavia, é estimado que não mais do que 25.000

espécies de plantas foram objetos de alguma investigação científica. (CALIXTO,

2005). Contudo, o potencial dos produtos de origem natural, como fontes de novas

drogas, continua largamente inexplorado uma vez que somente pequena fração de

plantas, animais e microorganismos têm sido investigados fitoquímica e

biologicamente (HAMBURGER & HOSTETTMANN, 1991).

Com o objetivo de assegurar o acesso, uso correto de plantas medicinais

e fitoterápicos pela população, bem como à utilização sustentável da biodiversidade

brasileira e o desenvolvimento da indústria nacional, foi aprovado no dia 22 de junho

de 2006 a Política Nacional de Plantas Medicinais e fitoterápicos pelo governo

federal (BRASIL, 2006).

1.2. O pâncreas

Apesar de o pâncreas ser conhecido desde a Grécia Clássica, só em

1579 Ambrose Paré fez a primeira descrição clara da pancreatite aguda (PA). Em

1856 Claude Bernard induziu pela primeira vez PA no cão, descobrindo o efeito da

lipase, florescendo então o interesse por este órgão. Em 1883 Chiari admitia que a

PA fosse causada pela ativação intrapancreática de enzimas proteolíticas,

estabelecendo a teoria da autodigestão do órgão. Reginald Fitz, em 1889,

apresentou um estudo clínico a partir de análise de material patológico de 53

doentes com PA, constituindo uma obra de referência na investigação e tratamento

da PA durante um século. Em 1895 Mouret sugeriu a hiperestimulação colinérgica

como o responsável por aquele fenômeno e em 1901 Eugene Opie enfatizou a

relação causal com a litíase biliar e propôs a teoria do “canal comum”

(NEOPTOLEMOS, 1989).

O pâncreas é uma glândula de aproximadamente 15 cm de extensão que

se localiza atrás do estômago e entre o duodeno e o baço. Ele pode ser dividido em

cabeça, corpo e cauda (Figura 1).

Figura 1. Estrutura do pâncreas (cabeça, corpo e cauda)

O pâncreas possui duas unidades funcionais, a exócrina e a endócrina. O

pâncreas endócrino consiste das ilhotas de langerhans, que produzem insulina,

glucagon, somatostatina e polipetídeo pancreático, que funcionam na manutenção

da hemostasia da glicose. O pâncreas exócrino é constituído pelos ácinos e por

ductos, que drenam os ácinos, cujas funções primárias são a síntese e secreção dos

componentes enzimático e aquoso do suco pancreático, responsáveis pela digestão

dos alimentos e pela neutralização dos conteúdos duodenais (LEUNG & IP, 2006).

O pâncreas exócrino é estruturalmente semelhante a um “cacho de uvas”,

sua arquitetura contém túbulos que são cercados por células adjacentes com

formato piramidal, as células acinares, levando à formação de estruturas chamadas

de ácinos (Figura 2). Os ácinos estão rodeados por tecido conjuntivo suportando

uma rede de capilares e terminações nervosas. A principal função das células

epiteliais colunares, que revestem os ductos pancreáticos, é a secreção do

componente aquoso do suco pancreático, uma solução alcalina, rica em água e

bicarbonato, que facilita o transporte das enzimas digestivas e aumenta o pH

duodenal para uma ação ótima dessas enzimas. As células acinares são

especializadas na síntese, armazenamento e secreção de enzimas digestivas,

proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, carboxipeptidase), α-amilase, lipases

(triacilglicerol hidrolase, hidrolase de éster do colesterol, fosfolipase A2),

ribonuclease, desoxirribonuclease e inibidor da tripsina (WHITCOMB et al., 1999;

GODINHO, 1997).

Figura 2. Os ácinos (unidade funcional do pâncreas exócrino)

(Figura adaptada a partir de DAWRA et al., 2006)

A síntese das enzimas ocorre nos ribossomos do retículo endoplasmático,

sendo transportadas nas vesículas de transporte para o Aparelho de Golgi, onde são

separadas em diferentes grupos, segundo a sua função (WHITCOMB et al., 1999).

As enzimas digestivas contidas nos grânulos de zimogênio encontram-se na forma

de precursores inativos (tripsinogênio, quimiotripsinogênio e procarboxipeptidase),

ativando-se apenas no lúmen intestinal por hidrólise do tripsinogênio em tripsina. A

tripsina, uma vez ativada, funciona como autocatalizadora e desencadeia a ativação

das pró-enzimas restantes. Pequenas quantidades de tripsina podem formar-se

fisiologicamente no pâncreas, sendo eficientemente controladas pelos mecanismos

de síntese de inibidores específicos da tripsina pancreática, como inibidores

serinoproteases tipo Kazal 1 (PSTI ou SPINK 1), autólise da tripsina ativada e

inativação sistêmica pelas antiproteases séricas (FROSSARD et al., 2008).

Os inibidores da tripsina pancreática se ligam e inativam

aproximadamente 20% da tripsina potencial dos grânulos de zimogênio, através da

inibição competitiva do domínio catalítico da tripsina (HIROTA et al., 2006). Se a

ativação intra-acinar de tripsina ultrapassar a capacidade inibitória do SPINK 1,

ainda há uma segunda linha de defesa efetuada pela hidrólise irreversível mediada

por proteases catiônicas em que se inclui a própria tripsina (SZMOLA et al., 2003). A

terceira e última linha de defesa à cascata de ativação das proteases é a inibição

sérica pela α2-macroglobulina, α1-antitripsina, antiquimiotripsina, inter-a-tripsina e

C1 esterase que estão presentes em abundância no interstício pancreático (VEGE &

CHARI, 2007).

Uma vez falhando os mecanismos inibitórios da tripsina pancreática, a

tripsina ativada nas células acinares leva a ativação de várias enzimas.

Adicionalmente, a inflamação é iniciada com a produção local de mediadores, a qual

se relaciona com a severidade da doença (NORMAN et al., 1996).

1.2.1. Pancreatite

A pancreatite aguda (PA) é uma desordem inflamatória do pâncreas

exócrino caracterizada por edema pancreático, necrose acinar, hemorragia e

necrose lipídica assim como inflamação e infiltração perivascular do pâncreas,

podendo ainda atingir outros órgãos como fígado e pulmões. Os pacientes

apresentam dor abdominal, náuseas e vômitos e aumento dos níveis séricos de

lipase e amilase. Embora a maioria dos episódios de PA seja discreta, com

recuperação total dos pacientes, ataques agudos recorrentes podem acarretar em

mudanças irreversíveis no pâncreas, caracterizadas por atrofia acinar e fibrose

(pancreatite crônica) (TATTERSALL et al., 2008).

A pancreatite crônica é uma condição caracterizada por um dano

progressivo e irreverssível de ambos os componentes, exócrinos e endócrinos, do

pâncreas, resultando eventualmente em uma dor intensa, grande insuficiência

exócrina (má-digestão) e diabetes (DIMAGNO et al., 1993). Estima-se que nos

países industrializados a incidência de pancreatite crônica varia numa proporção de

3,5 a 10% da população. O abuso de álcool está associado a maior parte dos casos.

No entanto, outros fatores, assim como, pancreatite hereditária, pancreatite tropical

(BALAKRISHNAN et al., 2006), pancreatite autoimune, obstrução ductal, ou

condições secundárias sistêmicas, tais como hipertrigliceridemia e hipercalcemia

estão também implicados (DIMAGNO et al., 1993; AHMED et al., 2006; ETEMAD &

WHITCOMB et al., 2001). Existe ainda, uma proporção de casos em que a causa

não pode ser identificada (pancreatite idiopática) (AMMANN et al., 1984). Todavia,

com o recente progresso na identificação de fatores genéticos, a proporção de casos

que permanecem sem causas conhecidas tem diminuído.

1.2.2. Pancreatite Aguda

A PA leve pode ser autolimitada e não necessitar de tratamento, contudo

aproximadamente 25% dos pacientes irão apresentar um quadro grave com

mortalidade de 30-50%. A mortalidade relacionada aos episódios agudos é causada

pela síndrome da resposta inflamatória sistêmica e subseqüente falência múltipla de

órgãos. Aproximadamente 50% das mortes ocorrem dentro da primeira semana

após o início da PA e esses pacientes sofrem um ataque inicial severo e

desenvolvem uma reação inflamatória sistêmica exagerada como o desenvolvimento

da disfunção múltipla de órgãos e morte. Os pacientes com ataque severo, que

sobrevivem à primeira semana, podem desenvolver extensa necrose pancreática

retroperitoneal, onde a infecção do tecido necrosado leva a sepse, a resposta

inflamatória sistêmica, a falência múltipla de órgãos e a morte (BHATIA et al., 2005;

ELFAR et al., 2007).

1.2.2.1. Revisão Bibliográfica

Os ácinos pancreáticos apresentam acentuada importância como células

responsáveis pelos eventos iniciais críticos da PA, nesse sentido foram

desenvolvidas técnicas para o estudo dos ácinos, ou mesmo das células acinares

isoladas. Atualmente, é descrito que a estimulação com acetilcolina, colecistocinina,

gastrina ou substância P ativa receptores localizados na membrana basolateral das

células acinares, causando a geração de um sinal intracelular de Ca

, que por sua

vez, desencadeia a fusão de grânulos de zimogênios com a membrana apical,

levando a secreção das enzimas. Essa fusão é mediada por proteínas receptoras

conhecidas como SNAREs (Proteína receptora ao fator sensível à N-etilmaleimida),

mecanismo que é desencadeado pelo Ca

, mas que não está totalmente elucidado.

Nesse contexto, há o envolvimento das vias de sinalização de inositol

trifosfato/diacilglicerol, que elevam a concentração de Ca

intracelular, ativam a

proteína quinase C, com subseqüente desencadeamento da exocitose dependente

de Ca

. Já as vias de sinalização iniciadas pela secretina ou polipeptídeo vasoativo

intestinal (VIP) na membrana basolateral são mediadas pelo aumento dos níveis de

AMPc e subsequente ativação da proteína quinase A, também levando à secreção

dos grânulos de zimogênio (WILLIAMS, 2001; WASLE & EDWARDSON, 2002). Tais

mecanismos representam mecanismos fisiológicos para a secreção dos grânulos de

zimogênio. O entendimento dos mesmos pode ser valioso para a compreensão dos

eventos intracelulares que desencadeiam a pancreatite aguda, visto que, nessa

condição, a injúria e ruptura dos ácinos pancreáticos permitem a exposição das

enzimas pancreáticas ao tecido e os subseqüentes efeitos inflamatórios (BATHIA et

al., 2005).

A PA é, portanto, uma doença de patogenia obscura provocada por

múltiplas etiologias distintas que iniciam um fenômeno comum central - a ativação

intrapancreática das enzimas digestivas - com uma evolução imprevisível. Há mais

de um século que a PA é considerada como um processo de autodigestão do

pâncreas, resultante da ativação prematura das enzimas pancreáticas. Contudo, os

mecanismos fisiopatológicos que condicionam esse fenômeno não estão ainda

completamente esclarecidos (SLEISENGER et al., 1998; SPIRO, 1993).

A causa mais comum (30-50%) de pancreatite aguda no cenário clínico é

a obstrução biliar, geralmente microlitíase (TOOULI et al., 2002). O alcoolismo é a

segunda causa mais comum, e a PA alcoólica recorrente leva à pancreatite crônica

(AMMANN & MUELLHAUPT et al., 1994). Infecção, resposta auto-imune, trauma,

drogas, procedimentos endoscópicos (ex. CPRE), hiperlipidemia e

hiperparatireoidismo representam apenas 10% dos casos dessa doença (LOVE et

al., 2009; FRANO et al., 2009; AYOUB et al., 2009; FORTSON et al., 1995; TOOULI

et al., 2002; BRUDGE & VANDAN, 1999).

A PA é uma desordem inflamatória, que envolve uma complexa cascata

de eventos imunológicos, que afetam, não somente a patogênese da doença, mas o

seu curso. Qualquer que seja o evento inicial, que leve a ativação prematura de

enzimas digestivas, a progressão da doença pode ser vista em três fases contínuas:

inflamação local do pâncreas, resposta inflamatória generalizada e a fase final de

falência de múltiplos órgãos (BHATIA et al., 2000; BHATIA et al., 2001; BHATIA,

2002).

Apesar da PA ser uma doença auto-limitada na maioria dos casos,

aproximadamente 15-30% destes progridem para uma pancreatite aguda severa

(SAP) com uma alta taxa de mortalidade. Apesar da patogênese da PA não estar

totalmente elucidada, alguns mecanismos são bem conhecidos: ativação excessiva

de leucócitos que leva a uma cascata de reações mediadas por citocinas e

mediadores inflamatórios, auto-digestão pancreática, distúrbio da microcirculação

pancreática e translocação de bactérias do intestino para o tecido pancreático. Estes

mecanismos atuam um sobre o outro (ZHANG et al., 2009).

Mediadores inflamatórios estão envolvidos em todas as etapas do

desenvolvimento da pancreatite aguda, sendo responsáveis por provocarem e

agravarem distúrbios da microcirculação em todo o corpo, levando à lesão de

múltiplos órgãos (MENGER et al., 2001). Os mecanismos pelos quais os mediadores

inflamatórios provocam distúrbios da microcirculação são basicamente três.

Aumento da permeabilidade capilar e diminuição da velocidade do fluxo sanguíneo

capilar, promoção da contração de artérias e veias e promoção da agregação

plaquetária e indução de trombose (ZHANG et al., 2009).

A injúria do ácino pancreático, que permite a liberação de enzimas

pancreáticas (tripsina, quimiotripsina e elastase) dentro do tecido pancreático, inicia

a autodigestão e consequentemente o desenvolvimento da pancreatite aguda. As

proteases ativadas (tripsina e elastase) e a quebra da lipase dentro do tecido e

membranas celulares causam edema, dano vascular, hemorragia e necrose (figura

3) (NORMAN et al., 1996; BHATIA M, et al. 2005).

Vários caminhos estão envolvidos na conversão intracelular de

zimogênios pancreáticos em enzimas ativas. Esses caminhos incluem: Auto-ativação

do tripsinogênio em tripsina; Quebra do tripsinogênio em tripsina pela hidrolase

lisossomial Catepsina B (CTSB); Diminuição da atividade do inibidor de tripsina

intracelular pancreático; Liberação de zimogênios e enzimas lisossomiais dentro do

citoplasma e subseqüente ativação proteolítica; Manobras de zimogênios em

membranas vinculadas a compartimentos que contém proteases ativas; Captação e

tratamento de zimogênios secretados pelos caminhos endocíticos; Aumento da

suscetibilidade de zimogênios à proteólise devido à oxidação ou descondensação.

Os mecanismos que tem merecido mais destaque são: a auto-ativação do

tripsinogênio e a ativação inapropriada do tripsinogênio (GORELICK & OTANI, 1999;

GORELICK et al., 1999; NARUSE, 2003) (figura 4).

Em adição, radicais livres de oxigênio, liberados secundariamente a

injúria pancreática, causam inativação dos inibidores de protease circulantes,

contribuindo para o acúmulo de proteases ativadas no tecido pancreático. As

alterações pancreáticas levam a um aumento das concentrações intracelulares de

cálcio, com a redução do pH intracelular, ambos causando ativação prematura do

tripsinogênio por meio de uma supra-regulação de NF-κB. Em adição, a tripsina

acarreta na ativação de outras cascatas, incluindo o complemento, cinina-calicreína,

coagulação e fibrinólise (ELFAR et al., 2007).

Figura 3. Características fisiopatológicas do desenvolvimento da pancreatite aguda

(figura adaptada a partir de BHATIA et al., 2005).

Figura 4. Pancreatite aguda: ativação de enzimas digestivas nas células acinares e

mudanças patológicas (adaptado a partir de BHATIA et al., 2005).

Lúmem Acinar

Ativação de catepsina B/ Auto-

ativação do tripsinogênio/

Ativação inapropriada de

tripsinogênio

Ativação de zimogênios

Ruptura da organela

Injúria celular

Morte celular

Fator desencadeante

Lesão da célula acinar

Ativação da tripsina

Ativação

da cinina-

calicreína

Ativação da

quimiotripsina

Ativação da

elastase

Ativação da

fosfolipase A

Ativação

da lipase

Edema e

inflamação

Edema e lesão

vascular

Lesão vascular

e hemorragias

Necrose e

coagulação

Esteatonecrose

O dano celular acinar resulta em uma ativação local do sistema

imunológico, incluindo células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células T,

células endoteliais, entre outras, que leva a liberação de uma grande quantidade de

mediadores inflamatórios (FROSSARD et al., 1999; MAKHIJA & KINGSNORTH,

2002). Diminuição de oxigênio livre do organismo e a geração de radicais livres

derivados de oxigênio também contribuem para a injúria (POCH et al., 1999). Assim,

independente do fator inicial que levou ao desenvolvimento da doença, a severidade

do dano pancreático está relacionada com a injúria das células acinares e ativação

de células inflamatórias e endoteliais. Então, complicações locais, necrose da célula

acinar, formação de pseudocisto e abscesso, podem se desenvolver, e a injúria em

órgãos remotos, tais como os pulmões, podem seguir à liberação de vários

mediadores do pâncreas ou de órgãos extra pancreáticos tais como o fígado

(PASTOR et al., 2003).

Os mediadores inflamatórios que se acredita participar na fisiopatologia

da PA incluem o TNF-α, IL-1β, IL-6, PAF, ICAM-1, IL-8, GRO-α/CINC (oncogene-α

relacionado ao crescimento/quimioatraente de neutrófilos indutor de quimiocina),

MCP-1 (proteína quimiotática de monócitos-1), substância P, peptídeo ativador de

tripsinogênio (PAT), o gás sulfídrico (H

S) e o óxido nítrico (NO). Como mediadores

antiinflamatórios que exercem um importante papel na PA temos a IL-10,

componente do complemento C5a, receptor solúvel de TNF-α, antagonista de

receptor IL-1 (IL-1ra) e endopeptidase neutra (NEP). A expressão de vários desses

mediadores é regulada por fatores de transcrição como o NF-κB. As citocinas levam

a uma supra regulação de moléculas de adesão localmente e em órgãos distantes

(ex. pulmões) e ativam uma cascata de eventos que incluem a migração de

leucócitos, a produção de PLA

, ativação do complemento, degranulação de

neutrófilos, produção de NO e de espécies reativas de oxigênio (EROs) (MAKHIJA

et al., 2002; PEZZILLI et al., 2004; BHATIA et al., 2005; ELFAR et al., 2007).

A ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e a redução da expressão dos

inibidores de κB foram demonstradas no modelo de PA induzida por ceruleína em

ratos (GUKOVSKY et al., 1996; HAN & LOGSDON, 2000; GRADY et al., 1997;

BHATIA et al., 2002; BHATIA et al., 2005). Steinle et al. (1999) demonstraram que a

ativação do NF-κB está envolvida em um aumento da injúria e da inflamação

tecidual em modelos experimentais de PA. Outros autores mostraram que a sua

inibição atenua a severidade ou melhora a sobrevivência em diferentes modelos

experimentais de PA (ETHRIDGE et al., 2002; SATOH et al., 1999; DUNN et al.,

1997). Chen et al. (2002) ativaram diretamente o NF-κB pancreático, o que resultou

no início de uma resposta inflamatória pancreática. Nos modelos experimentais de

PA induzida pela injeção de taurocolato de sódio, ligação do ducto biliopancreático e

L-arginina (L-arg) foi observado um aumento na expressão e/ou ativação do NF-κB

(RAKONCZAY et al., 2008).

Os níveis de TNF-α e IL-1β estão elevados no início e durante o

progresso da PA (BHATIA et al., 2000; BHATIA et al., 2001; BHATIA, 2002; BHATIA

et al., 2005; NORMAN et al., 1995; HIROTA et al., 2000). A inibição de TNF-α e IL-

1β atenuam a severidade da pancreatite em diferentes modelos experimentais. O

bloqueio do receptor de IL-1 antes ou logo após a indução da PA está associado

com a redução da severidade da pancreatite e redução do dano pancreático

intrínseco. A neutralização do TNF-α com um anticorpo policlonal reduziu a

severidade da PA experimental em ratos. Estratégias que interferem com a tradução

de TNF-α e IL-1β, processamento e liberação intracelular, em vez de antagonizar

seus efeitos também diminuem a severidade da PA em modelos experimentais

(HUGHES et al., 1996; BHATIA et al., 2005). O TNF-α pode ser determinado no

plasma, bem como no tecido pancreático, no curso da PA (de BEAUX et al., 1996;

POORAN et al., 2003) e contribui para a progressão sistêmica e danos pancreáticos

observados na PA severa (NORMAN, 1998; GRANGER et al., 2005).

A IL-6 possui alta especificidade e sensibilidade em distinguir a PA leve

da grave apresentando correlação com as taxas de mortalidade. Quando associada

à elevação de lipase sérica, melhora ainda mais a acurácia do diagnóstico e

prognóstico (PEZZILLI et al., 1995). Níveis plasmáticos de IL-6 correlacionam-se

com anormalidades hemodinâmicas na PA em coelhos (JAMBRIK et al., 2002).

Camundongos transgênicos que expressam IL-6 humana são mais susceptíveis a

PA, e o uso de anticorpo monoclonal anti-IL-6 exerce um efeito protetor contra a PA

(SUZUKI et al., 2000).

O PAF é sintetizado pelos ácinos pancreáticos e as concentrações

pancreáticas desse mediador estão elevadas durante o curso da PA (HOFBAUER et

al., 1998 e ZHOU et al., 1993). Em modelos animais, injeções intraperitoneal ou

intravascular de PAF podem provocar ou aumentar a severidade da PA

(KONTUREK et al., 1992 e EMMANUELLI, 1989). Níveis teciduais pulmonares e

sanguíneos também aumentam, indicando que PAF é um mediador chave da

resposta inflamatória sistêmica (HOFBAUER et al., 1998).

Uma das complicações mais comuns da PA é a injúria pulmonar aguda,

onde a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) exerce um importante papel,

participando na adesão e ativação de leucócitos, indução de mediadores

inflamatórios, disfunção da microcirculação pulmonar, síndrome do estresse

respiratório agudo, falência múltipla de órgãos e morte. O mecanismo modulatório

da ICAM-1 durante esse processo está associado com a ativação do NF-κB (ZHANG

et al., 2009). O uso de anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 (aICAM-1) mostra efeito

terapêutico em vários tipos de modelos experimentais de injúria pulmonar aguda

(YOKOMURA et al., 2001). Se o aICAM-1 é administrado no estágio inicial da PA

observa-se uma melhor proteção do pâncreas e da função pulmonar (WERNER et

al., 1998).

A IL-8 se eleva precocemente e é considerada um bom marcador de

gravidade na PA (GROSS, 1992). Um anticorpo anti-IL8 humana foi associado com

a redução da injúria pulmonar em um modelo experimental de pancreatite aguda em

coelhos (SHOKUHI et al., 2002).

MCP-1 e MIP-2 participam na patogênese de PA experimental (XU et al.,

2008; ISHIBASHI et al., 2008; BHATIA et al., 2005; BRADY et al., 2002). O aumento

da MCP-1 sérica na admissão do paciente com PA está associado com o

desenvolvimento de PA severa (REGNÉR et al., 2008). A expressão de CXCL10 e

CXCR3 com outras quimiocinas CXC/CC (CXCL9, CXCL11, CCL3, CCL4, CCL5) em

tecidos pancreáticos de pacientes com pancreatite crônica sugerem a sua

participação na progressão da inflamação crônica (SINGH et al., 2007). A

administração de Ac-RRWWCR-NH2, um potente inibidor da ligação de quimiocinas

CXC ao receptor (CXR2) resultou na proteção de camundongos contra a PA

induzida por ceruleína (BHATIA & HEDGE, 2007). Rau et al. (2003) avaliando

pacientes com PA mostraram que a PA complicada está associada com o aumento

significativo, local e sistêmico, das concentrações de MCP-1.

A substância P (SP) atuando através dos receptores de neurocinina-1

(NK1) de membranas nas células efetoras, aumenta a permeabilidade microvascular

e promove o extravasamento de proteínas plasmáticas do espaço intravascular para

o espaço extravascular, com subseqüente formação de edema. Foram encontrados

níveis pancreáticos elevados de SP e expressão aumentada de NK1 em células

acinares durante a pancreatite aguda experimental (BHATIA et al. 1998). Em

camundongos geneticamente modificados, desprovido de receptores NK-1,

demonstrou-se uma redução na severidade da pancreatite e injúria pulmonar

associada à mesma, indicando que a SP, através destes receptores, é um

importante mediador da PA e injúria pulmonar (BATHIA et al., 1998, MAA et al.,

2000). Além disso, a pancreatite pode ser atenuada por antagonistas do receptor

NK1 (BHATIA et al., 2003; GRADY et al., 2000).

O Peptídeo ativador de tripsinogênio (PAT), produto da conversão do

tripsinogênio em tripsina, é um marcador validado, que apresenta a melhor

correlação com a gravidade da doença. Na pancreatite aguda grave, a inativação

inapropriada do tripsinogênio no interior do pâncreas resulta na liberação do PAT no

plasma, urina e peritônio. Portanto, a concentração plasmática de PAT parece ser o

melhor e mais precoce marcador da pancreatite aguda (BHATIA et al., 2000).

O gás sulfídrico (H

S) é produzido nos tecidos dos mamíferos a partir

dos aminoácidos L-cisteína e hemocisteína pela ação das enzimas cistationina-β-

sintase (CBS) e cistationina-γ-liase (CSE). Um aumento na biossíntese de H

S foi

demonstrado em modelos animais de choque séptico e hemorrágico, pancreatite e

edema de pata em ratos (BHATIA et al., 2005; LI et al., 2006). Tamizhselvi et al.

(2007) e Bathia et al. (2005) demonstraram que na pancreatite experimental induzida

por ceruleína ocorre um aumento na expressão de RNAm para a CSE e na

biossíntese de H

S e que a administração de PAG (DL-propargilglicina, um inibidor

irreversível da CSE) reduz a severidade e reduz a lesão pulmonar na pancreatite por

ceruleína. Tamizhselvi et al. (2008) demonstraram que o efeito pró-inflamatório do

S no modelo de pancreatite experimental por ceruleína pode ser mediado por

quimocinas (MIP-1alfa e MIP-2).

A ativação da fosfolipase A

contribui para o dano pancreático e para as

complicações sistêmicas durante a PA (FRIESS et al., 2001).

A ativação de proteina quinase C (PKC) e a mobilização do Ca

intracelular levam a ativação, induzida pela colecistocinina (CCK), do NF-κB no

pâncreas (HAN & LOGSDON, 2000; SHI et al., 2007). A ativação de NF-κB pode

aumentar a sensibilidade pancreática à resposta inflamatória através de caminhos

de sinalização envolvendo novas ou atípicas isoformas de PKC (GUKOVSKAYA et

al., 2004). A PKC ativada pode não somente iniciar a ativação de NF-κB, mas

também induzir a produção de mediadores inflamatórios, esta pode ainda ser

proteoliticamente ativada por uma variedade de proteases (HASHIMOTO &

YAMAMURA, 1989; CHAKRABORTI et al., 2004).

O óxido nítrico (NO) está envolvido na fisiologia da PA (DIMAGNO, 2007;

CEVIKEL et al., 2003) e na patogênese da pancreatite crônica (MORSELLI-LABATE

et al., 2007). Pacientes com altos níveis séricos de NO apresentam

significativamente um maior risco de apresentar sepse e mortalidade (METTU et al.,

2003). Muitos estudos mostram um aumento no plasma e no tecido pancreático de

NO, assim como uma elevação da atividade de NO sintase (NOS) na pancreatite

aguda (CUZZOCREA et al., 2002; DABROWSKI & GABRYELEWICZ, 1994). Em um

modelo experimental de PA induzida por dose suprafisiológica de ceruleína em

camundongos foi observado um aumento da produção de NO no plasma, pâncreas

e pulmões, assim como aumento da expressão de NOS pancreática e pulmonar

(ANG et al., 2007). Shields et al (2006) observou que a inibição de iNOS (óxido

nítrico sintase induzida) por aminoguanidina (inibidor específico de iNOS)

significativamente reduziu a pancreatite em um modelo de PA induzida por L-arg em

ratos.

A translocação de bactérias do intestino para o pâncreas também

representa grande importância na patogenia da PA. As complicações sépticas

causadas por infecção bacteriana, frequentemente de origem entérica, representam

80% dos casos de morte na PA necrosante. A infecção aos tecidos pancreáticos e

peripancreático por bactérias entéricas está diretamente relacionada à magnitude da

necrose presente no pâncreas, e tem como provável mecanismo de origem a

translocação bacteriana por aumento da permeabilidade da barreira entérica

(TARPILA et al., 1993).

1.2.2.2. Quadro clínico, diagnóstico e tratamento

Nem sempre o quadro clínico da PA é característico, o que torna difícil o

seu diagnóstico. A dor abdominal constitui a manifestação mais característica da

doença, cuja intensidade varia de ligeira e desconfortável a intensa e incapacitante,

inicialmente pode ser epigástrica e peri-umbilical podendo se irradiar para o dorso ou

para todo o abdômen. Náuseas e vômitos, acompanhados de parada na eliminação

de gases e fezes podem estar presentes. O paciente pode ainda apresentar febre,

hipotensão, alteração respiratória e distensão abdominal (BANK, 1997 & CARROLL

et al., 2007).

Dentre as manifestações sistêmicas da PA grave podemos citar a

leucocitose, hemólise, coagulação intravascular disseminada, seqüestro de líquido

para o terceiro espaço, síndrome da angústia respiratória do adulto, necrose

gordurosa difusa, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, síndrome da

disfunção múltipla de órgãos (CRAWFORD & COTRAN, 2000; ELFAR et al., 2007).

Não existe um ensaio laboratorial ou um sinal clínico específico que

caracterize a PA. A amilase e a lipase, secretadas pelas células pancreáticas, são

os marcadores laboratoriais mais utilizados no diagnóstico da doença. A tomografia

computadorizada (TC) pode ser realizada na admissão do paciente para a

confirmação do diagnóstico e após 4 dias para a observação de complicações como

o acúmulo de fluídos e necrose. O exame de ressonância magnética identifica a

necrose e o acúmulo de flúidos melhor que o exame de TC (FROSSARD et al.,

2008).

Outros exames laboratoriais, tais como o leucograma, transaminases,

desidrogenase láctica, cálcio sérico, glicemia, gasometria e creatinina, são

particularmente úteis na caracterização da gravidade da doença (BANK et al., 1983;

RANSON et al., 1985), o mesmo acontecendo com a dosagem da proteína C reativa

(MAYER et al., 1984) e da interleucina-6 (PEZZILLI et al., 1995).

Pesquisas estão sendo realizadas na tentativa de determinar potenciais

marcadores biológicos para a severidade e prognóstico da doença. Tripsinogênios e

proteases pancreáticas envolvidas no processo de autodigestão pancreática são

marcadores promissores. Outros marcadores investigados são alanina

transaminase, peptídeo ativador de tripsinogênio (PAT), procalcitonina, fosfolipase

A2, proteína C reativa e citocinas como IL-6 e IL-8 (Tabela 1) (KELLY, 1976; BANK

et al., 1983; RANSON et al., 1985; GUMASTE et al., 1993; CARROLL et al., 2007).

Na forma mais leve da doença, principalmente aquela devido à presença

de cálculo biliar, a terapia é de suporte e inclui a reposição de líquido, alivio da dor,

administração de oxigênio, antieméticos e atenção às necessidades nutricionais. Os

episódios severos de PA necessitam de uma equipe multidisciplinar

(gastroenterologista, radiologista, intensivista e cirugião) e apesar da instalação de

um tratamento apropriado a taxa de mortalidade dos ataques severos não mudou

significativamente nas últimas duas décadas. Para esses pacientes, ressuscitação,

suporte nutricional e monitoramento de complicações (prevenção de necrose

pancreática e prevenção de infecção pancreática, uma vez estabelecida a necrose)

são importantes (CARROLL et al., 2007; FROSSARD et al., 2008).

O tratamento tradicional na PA com jejum e nutrição parenteral, tem sido

modificado para nutrição enteral na pancreatite severa e ingestão oral na pancreatite

leve a moderada. A nutrição enteral reduz as complicações da infecção e a

mortalidade na pancreatite severa, comparada a nutrição parenteral (BAKKER et al.,

2009; ANDERSSON et al., 2009).

A infecção da necrose pancreática é uma complicação que se desenvolve

em 40-70% dos pacientes durante a segunda ou terceira semana, sendo uma causa

de mortalidade. Apesar de existirem divergências quanto ao benefício da profilaxia

com antibióticos no tratamento da PA, quando na presença de infecção o tratamento

é realizado com o uso de antibióticos (p.ex. carbapenemas, fluoroquinolonas

associado a metronidazol, cefalosporinas de 3ª. geração associado a metronidazol e

vancomicina) (BANKS et al., 2006; FROSSARD et al., 2008).

Bang et al. (2008) publicaram um artigo de revisão sumarizando os

resultados da utilização de várias drogas na prevenção e tratamento da PA clínica e

experimental (Tabela 2).

A intervenção cirúrgica ficou reservada para os casos de infecção da

necrose pancreática, diagnosticada por tomografia computadorizada ou ressonância

nuclear magnética e, principalmente, por punção com agulha fina (SARR et al.,

1991). Também se reserva a intervenção cirúrgica aos pacientes graves, com

insuficiência de múltiplos órgãos, que não apresentaram melhora após 72 horas de

cuidados intensivos (BEGER et al., 1985; BRANUM et al., 1998; RANSON, 1997).

Quanto à intervenção sobre a necrose não infectada, esta deve ser postergada ao

máximo, se possível depois da terceira semana, e para sua abordagem diversas

modalidades cirúrgicas podem ser empregadas (TRIVINO et al., 2002).

Vários centros internacionais recomendam o uso de técnicas menos

invasivas no manejo da pancreatite necrosante, como a drenagem percutânea

guiada por imagem (PCD) para a melhora da morbidade e mortalidade. Outros

recomendam o uso de técnicas endoscópicas para o debridamento da necrose

pancreática infectada, como a cirurgia endoscópica trans-luminal por orifício natural

(Natural Orifice Translumenal Endoscopic Surgery-NOTES), uma alternativa aos

procedimentos abertos (HINES & REBER, 2009).

Embora muito se discuta quanto ao valor da colangiopancreatografia

retrógrada endoscópica (CPRE) e papilotomia endoscópica, estas estão bem

indicadas em doentes com obstáculo ao nível da ampola biliopancreática, seja por

cálculo, seja por processo inflamatório, particularmente na vigência de colangite

(NEOPTOLEMOS et al., 1988).

Tabela 1. Marcadores séricos determinantes do diagnóstico e prognóstico da

doença

Teste Laboratorial (HORA) Propósito Observações clínicas e limitações

Alanina transaminase

12 a 24

Diagnóstico e etiologia

Associado com a pancreatite biliar;três

vezes mais elevada na presença de

pancreatite aguda, apresentando um valor

preditivo positivo de 95% no diagnóstico

da pancreatite aguda biliar.

Amilase

2 a 12

Diagnóstico

Mais acurado quando está duas vezes

mais elevado do que o normal; os níveis

de amilase e a sensibilidade diminuem

com o tempo desde o início dos sintomas.

Proteína C reativa

24 a 48

Preditivo de severidade

Marcador tardio, altos níveis está

associado com necrose pancreática.

Interleucina-6 18 a 48 Preditivo de severidade Indicação precoce de gravidade

Interleucina-8 12 a 24 Preditivo de severidade Indicação precoce de gravidade

Lípase

4 a 8

Diagnóstico

Aumento da sensibilidade na pancreatite

induzida por álcool; mais específica e

sensível do que a amilase para detectar a

pancreatite aguda.

Fosfolipase A

Preditivo de severidade

Associado com o desenvolvimento de

necrose pancreática e falência pulmonar.

Procalcitonina 24 a 36 Preditivo de severidade Indicação precoce de gravidade; altas

concentrações em necrose infectada.

Peptídeo ativador de

tripsinogênio

Em poucas

horas

Diagnóstico e preditivo

de severidade

Marcador precoce da pancreatite aguda,

apresenta uma estreita correlação com a

severidade.

Fonte: CARROLL et al. (2007).

Tabela 2. Tratamento farmacológico da pancreatite aguda. Revisão de drogas

testadas em modelos animais experimentais e triagem clínica

Nome Mecanismos Efeito em modelos animais Resultados em triagens

humanas

Somatostatina Inibição da secreção pancreática Não reduz a mortalidade Não reduz a mortalidade

Octretide Inibição da secreção pancreática Não tem efeito (resultados

divergentes)

Não reduz a mortalidade

Mesilato de gabexate Inibidor de protease Redução de escores

histológicos

Pode reduzir a

mortalidade

N-acetil-cisteína Redução do estresse oxidativo Reduz a severidade Não reduz a mortalidade

Óxido de nitrogênio Melhora da microcirculação Redução do edema Triagem não publicada

Esteróides Anti-inflamatório não específico Redução da mortalidade Triagem não publicada

Interleucina-10 Anti-inflamatório Redução da mortalidade Triagem não publicada

Anticorpo TNF-α

Anti-inflamatório específico Redução da mortalidade Triagem não publicada

Inibidor de PAF Anti-inflamatório específico Não reduz a mortalidade Não reduz a mortalidade

Antibióticos Antibacteriano - Redução da mortalidade

Probióticos Prevenção da colonização do

intestino

- Não reduz a mortalidade

Fonte: BANG et al. (2008).

1.2.2.3. Modelos experimentais de pancreatite aguda

Em modelos experimentais de pancreatite aguda, as células acinares

morrem através de necrose e de apoptose (KAISER et al., 1995; GUKOVSKAYA et

al., 1996; MARENINOVA et al., 2006). A razão apoptose/necrose pode variar dentre

os diferentes modelos experimentais. A severidade da pancreatite experimental

correlaciona-se diretamente com a extensão da necrose e inversamente com a

extensão da apoptose (KAISER et al., 1995; GUKOVSKAYA et al., 1996; SALUJA et

al., 1996; SANDOVAL et al., 1996; BHATIA, 2004; GUKOVSKAYA & PANDOL,

2004; MARENINOVA et al., 2006), porém os mecanismos que explicam essas

diferenças são pouco compreendidos.

A necrose da célula acinar, e em particular, a necrose recorrente, é uma

das mais sérias complicações da pancreatite aguda (RARATY et al., 2004; BASSI et

al., 2003; CONNOR & NEOPTOLEMOS, 2004). Baseado nas informações de que as

formas brandas de pancreatite experimental estão associadas com uma maior taxa

de apoptose e de que as formas severas estão associadas com uma maior taxa de

necrose existe a hipótese de que a mudança de um quadro de necrose para um

quadro de apoptose possa ser benéfica na pancreatite aguda (KAISER et al., 1995;

GUKOVSKAYA et al., 1996; SALUJA et al., 1996; SANDOVAL et al., 1996; BHATIA,

2004; GUKOVSKAYA & PANDOL, 2004; MARENINOVA et al., 2006).

Vários modelos experimentais de PA foram desenvolvidos na tentativa de

compreensão de sua fisiopatologia, das alterações histológicas, do grau de

severidade e da falência de órgãos como os pulmões, rins, fígado e intestino. Os

modelos apresentam vantagens e desvantagens e a seleção de um modelo irá

depender do objetivo experimental (CHAN & LEUNG, 2007; ZHANG et al., 2006;

PANDOL et al., 2007; FOLCH-PUY, 2007; UHLAMNN et al., 2007; HE et al., 2007).

Dentre os modelos experimentais de pancreatite aguda podemos citar

aqueles induzidos por altas doses de L-arg, pela administração de CCK ou de seu

análogo ceruleína, por dieta deficiente em colina e suplementada com etionamida,

pela perfusão/injeção no ducto pancreático de sais biliares ou taurocolato de sódio,

pela ligação do ducto biliopancreático ou por indução de alterações vasculares

pancreáticas (GRANGER & REMICK, 2005; CHANG & LEUNG, 2007).

Apesar da grande quantidade de modelos experimentais existentes para o

estudo da PA, os mecanismos envolvidos no desenvolvimento dessa doença ainda

não são completamente entendidos, sendo necessários estudos mais aprofundados

para um melhor entendimento de sua fisiopatologia, bem como do efeito dos

agentes terapêuticos.

1.2.2.3.1. Pancreatite aguda induzida por L-arginina

Uma única injeção intraperitoneal de L-arg (250-500mg/100g/peso

corporal) pode induzir uma pancreatite necrosante em ratos, coelhos e

camundongos. Após 24 h da injeção de L-arg, a inflamação do tecido pancreático é

confirmada por histologia e mudanças características dos parâmetros laboratoriais

que podem ser observadas a partir de 12 h após sua administração. Esse modelo é

reproduzível, não invasivo e produz necrose acinar de maneira dose dependente,

sendo um modelo de estudo da patogênese da pancreatite aguda (CZAKO et al.,

2000; DABROWSKI et al., 1999; HEGYI et al., 2004; RAKONCZAY et al., 2003;

VARGA et al., 1997; ZHAO et al., 2004; CHAN & LEUNG, 2007).

O mecanismo pelo qual a L-arg induz a PA ainda não está claro. Contudo,

seu efeito tóxico sobre o pâncreas deve-se em parte a inibição da síntese protéica,

excessiva produção de óxido nítrico e peroxidação lipídica. O excesso de L-arg,

assim como de outros aminoácidos básicos, pode suprimir a ornitina descarboxilase,

que é a enzima determinante da síntese de poliaminas. A redução dos níveis de

poliaminas retarda a síntese de ácidos nucléicos interferindo na síntese protéica. O

tecido pancrear é particularmente vulnerável a essa forma de toxicidade (CHAN &

LEUNG, 2007). Algumas evidências sugerem que radicais livres de oxigênio, óxido

nítrico e mediadores inflamatórios apresentam um papel chave nesse modelo

(VARGA et al., 1997; CZAKO et al., 2000; TAKACS et al., 2002; RAKONCZAY et al.,

2003).

A L-arginina produz um aumento significativo da amilase plasmática, da

razão peso pancreático/peso corporal, dos níveis de IL-6, da atividade da

mieloperoxidase (MPO) pancreática, ativação de tripsina, mudanças histológicas

(incluindo acumulação de fluídos, destruição da histoarquitetura, vacuolização das

células acinares, extensiva necrose de células acinares e infiltração neutrofílica),

como também pode produzir injúria pulmonar (CZAKO et al., 2000; DABROWSKI et

al., 1999; HEGYI et al., 2004; RAKONCZAY et al., 2003; VARGA et al., 1997; ZHAO

et al., 2004; DHARA et al., 2006; SZABOLCS et al., 2006a).

1.2.2.3.2. Pancreatite aguda induzida por ceruleína

A pancreatite induzida por ceruleína, um análogo da CCK, apresenta uma

alteração histológica muito semelhante à fase inicial da PA em humanos. A ceruleína

pode induzir pancreatite em camundongos, ratos, coelhos, cães e porcos. O modelo

é rápido, não-invasivo, reproduzível, sendo bastante utilizado (CHAN & LEUNG,

2007).

A ceruleína, agindo através de receptores da CCK, estimula de forma

exagerada as células acinares. A ativação da tripsina intracelular pode ativar o

tripsinogênio e outros zimogênios, iniciando uma série de eventos ativados por

proteases. A enzima digestiva uma vez ativada degrada proteínas celulares,

incluindo proteínas estruturais (como F-actin), o que eventualmente leva a uma

autodigestão pancreática (CHAN & LEUNG, 2007).

O modelo experimental com injeções múltiplas de ceruleína tem sido um

dos mais utilizados para indução de pancreatite associada com injúria pulmonar em

camundongos e ratos. Este modelo é particularmente importante porque a PA

associada com injúria pulmonar é uma complicação comum, que contribui de forma

significativa, para o aumento da taxa de mortalidade dos pacientes (PASTOR et al.,

2003; CHAN & LEUNG, 2007).

Após 24 horas da indução da pancreatite pela administração de ceruleína,

observam-se danos ao tecido pancreático caracterizado por infiltrado de células

inflamatórias, vacuolização, depleção dos grânulos de zimogênio, necrose de células

acinares e edema, assim como mudanças características de parâmetros

laboratoriais, tais como, aumento da amilase e lipase séricas, aumento da atividade

de MPO pancreática e aumento de citocinas pró-inflamatórias (p. ex.: TNF-α e IL-1β)

(MALLEO et al., 2007; GÓMEZ et al., 2006).

Estão presentes nesse modelo espécies reativas do oxigênio (EROS),

TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, COX-2, SP e alterações histológicas pancreáticas como

degeneração celular acinar, edema e infiltrado inflamatório. Exames

imunohistoquímicos demonstraram marcado aumento na imunorreatividade para

TGF-β e VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) no pâncreas de

camundongos tratados com ceruleína (GENOVESE et al., 2006a; WILDI et al.,

2007). No fígado podem ser observadas alterações histológicas como necrose,

vacuolização, congestão vascular, infiltrado inflamatório. Alterações pulmonares

também podem ser observadas (GRANGER & REMICK, 2005; ESREFOGLU et al.,

2006; CHAN & LEUNG, 2007; BHATIA et al., 2005, 2007).

1.2.3. Plantas medicinais e pancreatite

A pancreatite aguda apresenta uma incidência de aproximadamente 40

casos por ano por 100.000 adultos e até o momento não se tem um tratamento

eficaz para a doença. Pesquisas têm sido realizadas na busca de novas estratégias

terapêuticas, dentre elas a pesquisa com produtos naturais. Vários estudos mostram

a ação de produtos naturais em modelos experimentais de pancreatite, como

podemos citar:

 Polifenóis do chá verde (Green tea) reduziram as alterações bioquímicas e

histológicas em modelo de pancreatite aguda por ceruleína em camundongos,

pela redução da ativação do NF-

κB e do estresse oxidativo (BABU et al.,

2009). O extrato do chá verde, devido ao seu potencial antioxidante, pode

prevenir a fibrose pancreática pela inibição da ativação das células do

interstício do pâncreas como evidenciado em um estudo experimental

realizado in vitro (ASAUMI et al., 2006).

 Salvia miltiorrhizae, uma planta da medicina chinesa, reduziu o conteúdo de

endotoxina plasmática e IL-6 sérica, promoveu a expressão de proteína Bax no

pâncreas e melhorou as alterações patológicas pancreáticas assim como

reduziu a mortalidade em modelo de pancretite severa induzida por taurocolato

de sódio em ratos (RUIPING et al., 2009).

 O extrato de Gardenia jasminoides apresenta uma atividade contra a

pancreatite aguda grave pela redução da amilase sérica, da atividade da

mieloperoxidase sérica e tecidual, TNF-α e IL-6 séricos e da injúria provocada

pelos radicais livres de oxigênio, óxido nítrico e endotoxinas (MAO et al., 2003;

WANG et al., 2003). JUNG et al. (2008) mostraram que o extrato dessa planta

diminui significativamente a severidade da PA associada à injúria pulmonar,

evidenciado pela redução do edema pancreático, infiltração neutrofílica, níveis

séricos de amilase, lipase e de citocinas.

 O resveratrol, polifenol encontrado na casca da semente da uva preta, que

possui atividade antioxidante e antiinflamatória, mostrou ação protetora do

dano cerebral induzido pela pancreatite aguda severa e na pancreatite

experimental induzida por colecistocinina e ter-butil-hidroperóxido em ratos,

reduzindo as alterações histopatológicas pancreáticas, inibindo a ativação do

NF-κB e reduzindo os níveis pancreáticos de TNF-α. (JHA et al., 2009;

LAWINSKI et al., 2005; SZABOLCS et al., 2006b).

 A preparação chinesa Qing Yi Tang melhora a motilidade do trato

gastrintestinal, através da estimulação da atividade mioelétrica, na pancreatite

induzida por ceruleína e deoxicolato de sódio em animais experimentais (LI et

al., 2007).

 Hyericum perforatum, planta medicinal que contêm vários compostos

polifenólicos, como flavonóides e ácidos fenólicos, atenua a pancreatite

induzida por ceruleína em camundongos, reduzindo as alterações

histopatológicas pancreáticas, a expressão de ICAM-1 e a atividade da

mieloperoxidase (GENOVESE et al., 2006b).

 Patrinia scabiosaefolia, planta da medicina tradicional oriental, usada

popularmente no tratamento de várias doenças como edema, apendicite,

endometriose e inflamação, demonstrou ação protetora na pancreatite induzida

por colecistocinina em ratos (SEO et al., 2006).

 Ácido beta-ursólico isolado de Salvia officinales, inibe proteases in vitro

(tripsina, trombina e uroquinase). As proteases exercem um papel regulatório

em uma variedade de patologias, incluindo a pancreatite (JEDINÁK et al.,

2006).

 Taraxacum officinale, que possui atividade antiinflamatória, tem ação protetora

na pancreatite induzida por colecistocinina em ratos, reduzindo o edema

pancreático, os níveis de IL-6 e TNF-α e aumentando os níveis de HSP60 e

HSP72 (SEO et al., 2005).

 O extrato do chá preto apresenta importante atividade antioxidante. Em um

modelo experimental de pancreatite em ratos induzida pela administração de

colecistocinina associado a etanol foi observado que o extrato desse chá

previne o desenvolvimento da doença devido o seu potencial antioxidante,

aintinflamatório e antiapoptótico (DOLAN et al., 2005).

 O extrato de “grapefruit” (pomelo ou toranja) que possui atividade

antibacteriana, antifúngica e antioxidante, pela presença de naringenina, um

flavonóide citoprotetor, reduziu a pancreatite induzida por isquemia de

reperfusão em ratos, provavelmente por mecanismo antioxidante (DEMBINSKI

et al., 2004).

 O extrato padronizado de Gingko biloba (Egb761) exerce ação protetora em

modelo de pancreatite induzida por taurocolato de sódio em ratos,

possivelmente por ação antioxidante, reduzindo os níveis séricos de amilase e

lipase e as alterações histopatológicas (ZEYBEK et al., 2003).

 Ruibarbo apresenta efeitos protetores contra a pancreatite aguda. Redução da

amilase e lipase sérica, melhora dos sintomas da dor abdominal e da

microcirculação, redução dos níveis plasmáticos de TNF-α e IL-6, inibição da

ativação excessiva de macrófagos e infiltração de neutrófilos e redução da

produção de radicais livres de oxigênio são alguns de seus efeitos (ZHANG et

al., 2005 e ZHAO et al., 2003).

 Emblica officinalis, planta prescrita na medicina Ayurvédica, tem ação protetora

na pancreatite experimental em cães (THORAT et al., 1995).

1.3. Protium heptaphyllum (Aubl.) March.

A família Burseraceae compreende 16 gêneros e mais de 800 espécies

encontradas na região Amazônica, Piauí, Bahia, Minas Gerais, Goiás do Brasil e em

países como Suriname, Colômbia, Venezuela e Paraguai. Dentre as espécies temos

o Protium heptaphyllum (Aubl.) March que é popularmente conhecido como

almecegueira, breu-branco verdadeiro, almecegueira cheirosa, almecegueira de

cheiro, almecegueira vermelha e almecegueiro bravo (CORRÊA, 1984).

O Protium heptaphyllum (Aubl.) March é uma árvore de grande porte, com

altura que varia de 10 a 20 metros (figura 5), com ocorrência em todo o Brasil,

vegetando em terrenos arenosos, tanto úmidos quanto secos (CORRÊA, 1984). Esta

espécie fornece madeira moderadamente pesada (densidade 0,77 g/cm

compacta, dócil ao cepilho, bastante elástica e de grande durabilidade em lugares

secos, sendo de excelente qualidade para a construção civil (LORENZI, 1992).

Possuindo casca cinzenta, pouco espessa; folhas pinadas, com 2-3 jugos ou raras

vezes 4, possuindo de 5 a 9 folíolos oblongos, comumente 7 (daí o nome da

espécie) inteiros, glabros, de 10 cm de comprimentos e 5 cm de largura (figura 6);

flores verdes amareladas, pequenas e abundantes, dispostas em panículas; fruto

com drupa vermelha, de forma ovóide, contendo polpa resinosa e amarela,

envolvendo uma semente, ou raras vezes mais de uma, com até quatro (CORRÊA,

1984).

Do tronco da espécie Protium heptaphyllum March, quando lesionado,

exsuda uma resina oleosa e amorfa rica em substâncias aromáticas, cujas

aplicações gerais são: fabricações de vernizes e tintas, na calafetagem de

embarcações, em rituais religiosos, em cosméticos, repelente de insetos e

aromatizante de ambientes (figura 7). Em sua forma natural a resina é utilizada na

medicina popular como antiinflamatório, gastroprotetor, analgésico, expectorante e

cicatrizante de feridas (SIANI et al., 1999).

A partir de estudos químicos do óleo-resina proveniente de P.

heptaphyllum foram caracterizados e isolados muitos constituintes. A resina da

almécega é constituída por substâncias de natureza terpênica, sendo o óleo

essencial rico em monoterpenóides e fenilpropanóides (BANDEIRA et al., 2001;

SIANI et al., 1999 e ZOGHBI et al., 1995). Entre os constituintes fixos, a literatura

registra a presença de um monoterpeno trioxigenado e quatro misturas binárias de

triterpenóides (BANDEIRA et al., 2002; MAIA et al., 2000 e SUSSUNAGA et al.,

2001), onde se destaca a mistura de α- e β- amirina (figura 8).

Figura 5.

Fotografia da espécie Protium

heptaphyllum March.

Figura 6.

Fotografia ilustrando folhas e

frutos do Protium heptaphyllum.

Figura 7. Fotografia ilustrando queima do exsudato óleo-resinoso do

Protium heptaphyllum.

24 23

Figura 8. Estrutura química dos triterpenos pentacíclicos α- e β- amirina.

- amirina

1.3.1. Alfa e Beta- amirina

A mistura de triterpenos pentacíclicos alfa e beta-amirina (α,β-amirina) é o

constituinte majoritário da resina do P. hepthaphyllum (figura 8) (VIEIRA-JÚNIOR et

al., 2005). Essa mistura de triterpenos pode ser encontrada em outras espécies

vegetais como Moldenhawera nutans (VALE et al., 2005), Achillea alexandri-regis

(KUNDAKOVIC et al., 2004), Sideritis candicans Ait (HERNANDEZ-PEREZ et al.,

2004) e Carmona retusa (VILLASENOR et al., 2004).

Nosso laboratório mostrou que a mistura de α,β-amirina possui

propriedades gastroprotetora (OLIVEIRA et al., 2004a), antipruriginosa (OLIVEIRA et

al., 2004b), antinociceptiva visceral (LIMA-JÚNIOR et al., 2006), hepatoprotetora

(OLIVEIRA et al., 2005), inibidora da expressão de receptor NK-1 em modelo de

cistite hemorrágica (LIMA-JÚNIOR et al., 2007), antinociceptiva em dor orofacial em

ratos (HOLANDA et al., 2008a) e antiinflamatória em modelo de periodontite em

ratos (HOLANDA et al., 2008b).

Otuki et al. (2005a) demonstraram uma atividade antinociceptiva para a

mistura de α,β-amirina, isolada do Protium kleinii, envolvendo a participação da

proteína quinase C e proteína quinase A, e a atividade antiinflamatória tópica da α-

amirina (OTUKI et al., 2005b). Medeiros et al. (2007) caracterizaram o mecanismo

da atividade antiinflamatória tópica de α-amirina, que envolve a supressão de PGE

por mecanismos envolvendo a supressão da expressão de COX-2 e bloqueio da

ativação de NFκB. Aragão et al. (2004 e 2006) avaliaram uma atividade ansiolítica e

antidepressiva e atividade antiagregante plaquetária da mistura de α,β-amirina.

Kweifio-Okai et al. (1992) demonstraram atividade antilipoxigenase para esse

composto. Vitor et al. (2009) estudaram uma atividade antiinflamatória da mistura de

α,β-amirina em modelo de colite ulcerativa em ratos induzida por TNBS cujo

mecanismo envolve a supressão de citocinas inflamatórias e COX-2, possivelmente

pela inibição de NF-κB.

2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

A incidência da pancreatite e a morbimortalidade associada à doença

demanda uma atenção sobre o problema. A patogênese da pancreatite aguda é

multifatorial e uma interação entre citocinas, mediadores inflamatórios e espécies

reativas de oxigênio contribui para a amplificação da cascata inflamatória não-

controlada (PEREDA et al., 2006). Até o momento não existe um tratamento eficaz

para a doença, os objetivos da terapêutica clínica incluem o controle da dor,

medidas de suporte, suprir necessidades nutricionais, monitorar as complicações,

prevenir a infecção pancreática e a necrose pancreática (CARROLL et al., 2007).

Plantas medicinais e seus princípios ativos que possuem atividade

antiinflamatória e/ou antioxidante demonstraram ação protetora em modelos animais

de pancreatite. A mistura de terpenos α,β-amirina, isolada do P. heptaphyllum,

demonstrou várias ações biológicas como gastroproteção, ação antipruriginosa,

antinociceptiva e hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2004a,b; OLIVEIRA et al., 2005;

OTUKI et al. 2005a,b; LIMA-JÚNIOR, 2006; MEDEIROS et al., 2007; HOLANDA et

al., 2008a,b). Muitos triterpenóides com atividade antiinflamatória, derivados de

plantas, incluindo derivados do oleanano e ursano foram descritos por atuar como

inibidores competitivos de serina proteases, tripsina e quimiotripsina, que apresenta

um papel chave no desenvolvimento da pancreatite aguda (RAJIC et al., 2001;

GRANGER & REMICK, 2005). Efeito esse que pode também estar envolvido na

atividade de α,β- amirina no modelo de PA, uma vez que essa mistura de triterpenos

apresenta semelhança estrutural aos triterpenos oleanano e ursano.

Portanto, esta pesquisa justifica-se pelos seguintes argumentos:

 A incidência elevada da pancreatite aguda na população e a mortalidade

associada à doença.

 A inexistência, até o momento, de um tratamento eficaz para a doença e a

necessidade de se buscar novas opções terapêuticas, com qualidade,

eficácia e segurança comprovadas.

 A demonstração da atividade protetora pancreática de plantas medicinais e

de seus princípios ativos em modelos experimentais de pancreatite aguda.

 As atividades farmacológicas (atividade antiinflamatória, citoprotetora,

antinociceptiva e inibidora da expressão de NK-1r) apresentadas pela mistura

de terpenos α,β-amirina isolada do P. hepthaphyllum.

 As atividades de triterpenóides no modelo de PA, oleanano e ursano, com

semelhança estrutural à mistura de α,β-amirina.

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

O Protium heptaphyllum produz uma resina rica em triterpenos

pentacíclicos, como a mistura de α,β-amirina, substância de compravadas atividades

antiinflamatória, gastroprotetora, antitumoral, antinociceptiva, antipruritogênica,

hepatoprotetora, antilipoxigenase e antiagregante plaquetária. Uma vez que não

existem relatos sobre a atividade da mistrura de α,β-amirina sobre a pancreatite, e

que esta é uma doença com um alto índice de morbimortalidade, esse trabalho teve

como objetivo geral o estudo do efeito farmacológico da α,β-amirina na pancreatite

aguda experimental.

3.2. Específicos

 Investigar o efeito de α,β-amirina na PA induzida por L-arginina em ratos e

ceruleína em camundongos, analisando parâmetros bioquímicos séricos

(amilase e lipase) e pancreáticos (mieloperoxidase, peroxidação lipídica e

nitrato/nitrito) e edema pancreático;

 Avaliar o efeito de α,β-amirina na PA induzida por L-arginina em ratos e

ceruleína em camundongos através de análise histopatológica, medida de

citocinas séricas por ELISA (TNF-α e IL-6) e imunomarcação para TNF-α,

iNOS, e nitrotirosina em tecido pancreático.

4. MATERIAIS

4.1. Material botânico

A resina da almécega (Protium heptaphyllum March) foi adquirida no

Mercado Central de Teresina – PI, proveniente de um almecegal existente no

município de Timom – MA. A espécie vegetal foi coletada nesse local e identificada

no Herbário Graziela Barroso e registrada a exsicata com o Nº. 18.247. O material

de estudo, a mistura de triterpenos α,β-amirina, foi extraída a partir da resina de P.

heptaphylum pela Profa. Dra. Mariana Helena Chaves no Departamento de Química

da Universidade Federal do Piauí.

4.2. Animais experimentais

Foram utilizados para a realização desse estudo ratos Wistar machos,

pesando entre 200 – 250 gramas e camundongos albinos Swiss, adultos, machos,

pesando entre 25 - 30 gramas. Todos os animais utilizados foram provenientes do

Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia e do Biotério Central

da UFC, mantidos em caixas de prolipropileno, à temperatura média de 26 ± 2°C em

ciclos de claro-escuro de 12/12 h, recebendo ração padrão e água à vontade. Os

animais foram habituados para o teste 2 horas antes da experimentação.

O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo CEPA (Comitê de

Ética na Pesquisa Animal) desta Universidade (números de protocolo: 41/2008 e

85/2008).

4.3. Drogas e reagentes

PRODUTO ORIGEM

Tween 80 Sigma, USA

L-arginina Sigma, USA

Ceruleína Sigma, USA

Metilprednisolona Biolab, Brasil

Talidomida FUNED, Brasil

Kit para determinação de Amilase Labtest, Brasil

Kit para determinação de lipase Bioclin, Brasil

Brometo de hexadecilmetilamônio Sigma, USA

diidrocloreto de o-dianisidine Sigma, USA

Diidrocloreto de N-1-(naftil)-

etilenodiamina

Sigma-Aldrich, Brasil

Sulfanilamida Sigma-Aldrich, Brasil

Ácido tiobarbitúrico Sigma-Aldrich, Brasil

Kit Elisa para determinação deTNF-α

Quantikine®, R&D Systems, USA

Kit Elisa para determinação de IL-6 Quantikine®, R&D Systems, USA

Peróxido de hidrogênio Sigma, USA

Anticorpo primário anti-TNF-α anti-

mouse

Sigma-Aldrich, Brasil

Anticorpo primário anti-óxido nítrico

sintase induzida anti-mouse

Sigma-Aldrich, Brasil

Anticorpo primário anti-nitrotirosina

anti-mouse

Sigma-Aldrich, Brasil

Meio de montagem Sigma, USA

DAB DakoCytomation , USA

EnVisionTM/AP K1396 kit DakoCytomation , USA

4.4. Equipamentos

EQUIPAMENTOS ORIGEM

Balança para animais (mod. MF-6) Filizola, Brasil

Balança analítica (mod. AX-200) Shimadzu, Japão

Centrífuga refrigerada (0206281) Cientec CT 5500 DR

Material cirúrgico -

Espectofotômetro Bayer-RA 50

Leitor de placas (mod. DTX 880) Backman Coulter

Micropipetas Biohit

Micrótomo -

Microscópio eletrônico Nikon

Pipetas automáticas Jecons

5. MÉTODOS

5.1. Obtenção da mistura dos triterpenos α,β-amirina (extração e

fracionamento)

O material vegetal (410 g) foi dissolvido em metanol/diclorometano (4:1),

filtrado e o solvente concentrado, obtendo-se 408 g da resina. A resina (12 g) foi

submetida à cromatografia em coluna de gel de sílica (280 g), empacotada com

hexano, utilizando como eluente hexano e acetato de etila, em ordem crescente de

polaridade. Foram coletadas 104 frações, de aproximadamente 125 mL, as quais

foram concentradas em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, e analisadas

por cromatografia em camada delgada comparativa de gel de sílica. A fração M-19

(5,43 g), eluída em hexano-AcOEt (9:1), foi submetidas à caracterização, utilizando

técnicas espectroscópicas (RMN

H e

C-BB 1HD, e DEPT 135°) e de análise

térmica (TG e DSC). A metodologia de extração, fracionamento e caracterização dos

componentes da fração M-19 (figura 9) foram realizados pela Profa. Dra. Mariana

Helena Chaves do Departamento de Química da Universidade Federal do Piauí.

Figura 9. Processo de isolamento da mistura dos triterpenos α, β- amirina da resina

de Protium heptaphyllum.

αα

α- e β

β β

β- amirina

(63:37)

(Análise do espectro de

Ressonância

Magnética Nuclear

RMN-

H e

Resina crua

(410 g)

Dissolvido em

metanol/diclorometano (4:1)

Solução

Filtração e evaporação do solvente

em rotavapor

Resina amorfa

(408 g)

Cromatografia em coluna de sílica

gel (eluido em hexano e acetato

de etila)

Outras

frações

Fração M

5,43 g

Resina amorfa

(Amostra 12 g)

5.2. Caracterização da atividade da mistura de α

αα

α,β

ββ

β-amirina na pancreatite

aguda induzida pela administração de L-arginina em ratos e ceruleína

em camundongos

5.2.1. Pancreatite aguda induzida por L-arginina

Ratos Wistar machos (n=6 por grupo) foram tratados oralmente com o

veículo (2% Tween 80 em água destilada, 10 ml/kg) ou com α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg), 48, 24 e 1,5 h antes da administração intraperitoneal de L-arginina (L-

arg, 2 X 2,5 g/kg, suspendida em solução salina) no intervalo de 1h (WICK et al.,

2006). Um grupo que recebeu somente salina, i.p., foi incluído no estudo.

Metilprednisolona (METILPRED, 30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da

primeira injeção de L-arg. Após 24 h da última injeção de L-arginina todos os

animais foram sacrificados. Os ratos foram anestesiados com éter e amostras de

sangue foram coletadas através da punção venosa do plexo orbital, posteriormente

os animais foram sacrificados por deslocamento cervical para a retirada de amostras

da cabeça do pâncreas. Em seguida foram determinados os parâmetros que

compõem parte dos objetivos experimentais desse estudo.

5.2.2. Pancreatite aguda induzida por ceruleína

Camundongos Swiss machos (n=8 por grupo) foram tratados oralmente

com o veículo (2% Tween 80 em água destilada, 10 ml/kg), ou com α,β-amirina (10,

30 e 100 mg/kg), 48, 24 e 1,5 h antes da administração intraperitoneal (i.p.) de

ceruleína (5 X 50µg/kg, suspendida em solução salina) no intervalo de 1h (MALLEO

et al., 2008). Um grupo que recebeu apenas salina, i.p., foi incluído no estudo.

Talidomida (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 1h antes da primeira injeção de

ceruleína. Os camundongos foram anestesiados com éter e amostras de sangue

foram coletadas através da punção venosa do plexo orbital, posteriormente os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical para a retirada de amostras da

cabeça do pâncreas. Em seguida foram determinados os parâmetros que compõem

parte dos objetivos experimentais desse estudo.

5.2.3. Determinação de amilase e lipase sérica

As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados e

centrifugados à 3000 g por 10 min à 4° C. Foi feita a determinação da amilase e

lipase sérica por método colorimétrico usando o kit comercial para a determinação

de amilase e kit comercial para a determinação de lipase, respectivamente. A

análise foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

5.2.4. Determinação do grau de edema pancreático

O método descrito por Szabolcs et al. (2006) foi seguido. Após 24 h da

última injeção de L-arginina ou ceruleína os animais foram pesados, sacrificados por

deslocamento cervical e o pâncreas foi em seguida removido e pesado. A relação

entre o peso do pâncreas (mg) e o peso corpóreo do animal (g) foi indicativa de

edema pancreático (mg/g).

5.2.5. Determinação da atividade da mieloperoxidase

Amostras da cabeça do pâncreas foram congeladas em nitrogênio líquido

e homogeneizadas em uma solução de brometo de hexadeciltrimetilamônio 0,5 %

(HTAB) em tampão fosfato 50 mM (HTAB, pH 6,0, 1mL para 50mg do tecido). O

homogenato (10%) foi submetido a três ciclos de congelamento, 5 min (-70°C) e

descongelamento (água a 37°C). As amostras foram en tão centrifugadas (4000 rpm,

por 15 min, 4°C) para remover o material insolúvel. A MPO presente no

sobrenadante (0,1 mL) foi analisada espectrofotometricamente após adição de 2,9

mL de tampão fosfato (50 mM, pH 6,0) contendo 0,167 mg/mL de hidrocloreto de o-

dianisidina e 0,0005% de peróxido de hidrogênio. A absorbância a 470 nm foi

medida nos tempos de 0 e 5 min (KRAWISZ et al., 1984).

5.2.6. Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

Essa técnica foi descrita por Ohkawa et al. (1979). Baseia-se na medida

dos níveis de malonildialdeído (MDA), produto final da peroxidação lipídica, o qual

reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) formando o complexo de coloração rosa

(cromóforo) que pode ser quantificado em espectrofotômetro a 532 nm. O complexo

formado por substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) é amplamente

usado como biomarcadores de peroxidação lipídica em sistemas biológicos.

Amostras do pâncreas dos animais foram retiradas, pesadas e homogeneizada com

KCl 0,15 M (relação 1:10). Foram adicionados a 500 µL desse homogenato 200 µL

de duodecil sulfato de sódio 8,1% e 1,5 mL de ácido acético 20%, o pH da solução

foi ajustado para 3,5. Foram adicionados ainda 1,5 mL de ácido tiobarbitúrico (0,8%

p/v) e quantidade de água destilada suficiente para completar volume final de 4 mL.

Todas as amostras foram colocadas em banho-maria, a 95° C, durante 1 h. Após

resfriamento da amostra, foram adicionados 1 mL de água destilada e 5 mL de n-

butanol. Posteriormente, os tubos de ensaio foram fechados, agitados durante 1 min

e, em seguida, os mesmos foram centrifugados a 1400g durante 10 min. A

absorbância do sobrenadante foi medida a 532 nm.

5.2.7. Determinação de nitrato e nitrito

Essa determinação foi realizada apenas na pancreatite induzida por L-arg

em ratos. O reagente de Griess (constituída de solução de sulfanilamida a 1% e

solução de N-1-(naftil)-etilenodiamina a 0,1% na proporção de 1:1, ambas em ácido

fosfórico a 5%) revela a presença de nitrito em amostras (urina, plasma,

homogenato tecidual) pela reação de diazotização que forma um cromóforo de cor

rosa, com um pico de absorbância a 560 nm. Para a realização do teste foram

utilizados 100 µL do reagente de Griess e adicionados 100 µL do sobrenadante

(centrifugado) do homogenato do pâncreas dos ratos em KCl a 10% ou 100 µL do

padrão em diferentes concentrações. Para o branco foi utilizado 100 µL do reagente

de Griess e adicionados 100 µL de KCl a 10%. A leitura da absorbância foi realizada

a 560 nm e feita num leitor de placa. A leitura da absorbância do padrão (y) foi

plotada contra a concentração de cada padrão (x), e foideterminada a equação da

reta, que foi usada para determinar a concentração de nitrato e nitrito em cada

amostra (GREEN et al., 1981).

5.2.8. Determinação sérica de TNF-α e IL-6

As determinações de TNF-α e IL-6 séricos foram realizadas 24 h após a

última administração de L-arginina ou ceruleína. Amostras de sangue foram

centrifugadas à 3000 g durante 10 min à 4° C. Os ní veis de TNF-α e IL-6 foram

medidos no sobrenadante através da utilização do kit comercial para a determinação

de TNF-α ou IL-6. As determinações foram realizadas de acordo com as instruções

do fabricante.

5.2.9. Avaliação histológica do pâncreas

Amostras da cabeça do pâncreas foram retiradas 24 h após a última

injeção de L-arginina ou ceruleína, fixadas em formol a 10%, embebidas em parafina

por métodos padronizados, cortados em seções de 5 µm, com auxílio de um

micrótomo, corados com hematoxilina-eosina, avaliadas sob microscopia pela Profa.

Dra. Gerly Anne de Castro Brito que não tinha conhecimento da identidade da

amostra. As alterações morfológicas características de pancreatite avaliadas foram

edema, infiltração inflamatória, vacuolização, necrose e hemorragia. O grau de

edema foi determinado utilizando uma escala de 0 a 3 (0= ausente, 1 = edema

interlobular, 2= edema interlobular e moderado edema intralobular, e 3 = edema

interlobular e severo edema intralobular), a presença de infiltrado inflamatório foi

também analisada obedecendo uma grade de 0 a 3 (0= ausente 1= infiltração

perivascular escassa, 2= moderada infiltração perivascular e escassa infiltração

difusa, e 3 = abundante infiltração difusa), O grau de vacuolização foi baseado na

porcentagem apropriada de células acinares envolvidas: 0= ausente, 1= menos do

que 25%, 2= entre 25 e 50%, e 3= mais do que 50% das células acinares. A necrose

foi analisada pela atribuição de escores de 0 a 3 (0= ausente, 1= menos do que 15%

de células pancreáticas envolvidas, 2= de 15 a 35% das células pancreáticas

envolvidas, e 3= mais do que 35% de células envolvidas. Para a avaliação da

hemorragia, seguiu-se com a atribuição de escores: 0= ausente, 1= de 1 a 2 focus

hemorrágicos por lâmina, 2= de 3 a 5 focus hemorrágicos por lâmina, 3= mais do

que 5 focus hemorrágicos por lâmina (DEMBINSKI et al., 2008).

5.2.10. Estudo imunohistoquímico para a determinação de TNF-α, iNOS e

nitrotirosina

As amostras de pâncreas foram fixadas em solução tamponada de

formaldeído a 10%, durante 24 h e processadas em parafina e cortes (5µm) seriados

foram feitos em lâminas gelatinizadas. As lâminas foram inicialmente

desparafinizadas e as ligações proteícas não específicas foram bloqueadas pela

incubação do tecido com soro de cabra diluído numa proporção de 0,5% em PBS

por 45 min. As lâminas foram em seguida lavadas 3 vezes com PBS por 10 min

cada. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário anti-TNF-α anti-mouse,

anti-óxido nítrico sintase induzida anti-mouse ou anti-nitrotirosina anti-mouse

(determinado apenas para a pancreatite aguda induzida por L-arg em ratos) por 12 h

à 4°C diluído numa proporção de 1:400 em PBS conten do albumina sérica bovina.

As lâminas foram cuidadosamente lavadas 3 vezes com PBS (pH=7,4) por 5 min. As

lâminas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado com fosfatase

alcalina (30 min) seguida pela aplicação de uma solução contendo levamisol e o

substrato Fast Red, ou as lâminas foram incubadas com o anticorpo secundário

biotinilado (40 min), seguida pela aplicação de estreptavidina peroxidase (30 min) e

aplicação de solução de DAB (solução substrato cromógeno) para a obtenção de

uma coloração marrom, em seguida foi feita uma contra-coloração com hematoxilina

de Harry. Posteriormente, as lâminas foram lavadas cuidadosamente com água

destilada, secadas, montadas com o meio de montagem e avaliadas

quantitativamente através da atribuição de escores de acordo com a intensidade da

reação observada nas lâminas pela Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito.

Intensidade de reação ausente (0), leve (1), moderada (2), forte (3), coloração

intensa (4) (LIMA, 2004).

5.3. Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± E.P.M. (erro padrão da

média). Para a comparação múltipla dos dados paramétricos, foi utilizada a Análise

de Variância (ANOVA), e o nível de significância entre os grupos foi determinado

pelo teste de Student Newman Keul.

Para as análises histológicas e imunohistoquímicas os valores foram

expressos como a mediana dos escores, acompanhado pelos valores mínimo e

máximo. Para comparação múltipla dos dados não paramétricos, foi utilizado o Teste

de Kruskal Wallis, e o nível de significância entre os grupos foi determinado pelo

teste de Dunns.

Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

6. RESULTADOS

6.1. Obtenção da mistura dos triterpenos α

αα

α,β

ββ

β-amirina (identificação)

O espectro de RMN

H da fração M-19 apresentou um duplo dubleto em δ

3,22 (J=5 e 11 Hz), característico de triterpenóides do tipo 3β-OH e dois tripletos em

δ 5,15 e 5,20, correspondentes à CH de olefinas. Esta análise foi confirmada pelos

espectros de RMN

C – BB e DEPT 135°. A comparação dos resultados obt idos

com os relatados na literatura permitiu identificar os triterpenóides α-amirina e β-

amirina (Figura 8), na razão de 63:37, determinada por comparação dos valores da

integração dos sinais da região de olefinas (δ 5,15 e 5,20) e do hidrogênio em

carbono carbinólico (δ 3,22; H-3), no espectro de RMN

H. Considerando-se que

foram obtidos, após fracionamento cromatográfico, 5,43 g (45,3%) da mistura de α-

amirina e β-amirina, bem como a proporção entre elas, constatou-se que 28,3%

(3,43 g) da resina corresponde à α-amirina e 16,6% (2,0 g) à β-amirina (Figura 9).

6.2. Pancreatite aguda induzida por L-arginina e ceruleína

A administração de L-arginina em ratos e ceruleína em camundongos foi

responsável pelo desenvolvimento de pancreatite aguda evidenciado por aumento

de parâmetros bioquímicos séricos (amilase, lipase), pancreáticos (mieloperoxidase,

peroxidação lipídica e nitrato/nitrito) e edema pancreático, assim como através de

análise histopatológica, medida de citocinas séricas por ELISA (TNF-α e IL-6) e

imunomarcação para TNF-α, iNOS, e nitrotirosina em tecido pancreático.

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Amilase sérica (U/dL)

6.3. Caracterização da atividade da mistura de α

αα

α,β

ββ

β-amirina na pancreatite

aguda induzida pela administração de L-arginina em ratos

6.3.1. Determinação de amilase sérica

α,β-amirina 10, 30 e 100 mg/kg, v.o., reduziu (p<0,001) a amilase sérica

para 2759 ± 70,8; 2550 ± 29,0 e 2381 ± 56,6 U/dL (redução de 10; 17 e 22%),

respectivamente, quando comparado ao grupo L-arg (3070 ± 20,5 U/dL).

METILPRED (30 mg/kg, i.m.), antiinflamatório esteroidal, controle positivo, reduziu

os níveis da amilase para 2692 ± 75,4 U/dL (p<0,001), 12% de redução (Figura 10).

Figura 10. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre os níveis de amilase

sérica em resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80

em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes de L-arg.

Um grupo que recebeu salina i.p. foi incluído. Os valores representam a média ±

E.P.M. dos níveis de amilase (U/dL). Foram utilizados 6 animais por grupo.

p<0,001

vs salina;

p<0,001 vs L-arg (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

arginina

Salina

Veículo

10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

6.3.2. Determinação de lipase sérica

A mistrura de α,β-amirina nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg, v.o., reduziu

(p<0,001) o aumento da lipase sérica de 82,2 ± 11,7 U/L (L-arg) para 35,7± 3,8; 32,3

± 2,7 e 25,5 ± 0,7 U/L (redução de 56; 61 e 69%) respectivamente. METILPRED (30

mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,001) os níveis séricos da lipase de 82,2

± 11,7 U/L (L-arg) para 23,3 ± 3,9 U/L, mostrando uma redução de 72% da lipase

sérica (Figura 11).

Figura 11. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre os níveis de lipase sérica

em resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80 em

água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da primeira

injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. dos níveis séricos de lipase (U/L). Foram

utilizados 6 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,001 vs L-arg (ANOVA e

teste de Student Newman Keul).

100

Lipase sérica (U/L)

Salina Veículo 10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

6.3.3. Determinação do grau de edema pancreático

Os valores do edema para a mistura de α,β-amirina nas doses 10, 30 e

100 mg/kg foi de 4,5 ± 0,1; 3,4 ± 0,2 e 2,9 ± 0,1 mg/g, respectivamente. Para o grupo

da L-arg o edema foi de 4,7 ± 0,3 mg/g. Apenas as doses de 30 e 100 mg/kg de α,β-

amirina reduziram significativamente o edema pancreático, em 28 e 36%,

respectivamente. METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,001)

o edema pancreático de 4,7 ± 0,3 mg/g (L-arg) para 3,0 ± 0,2 mg/g, mostrando uma

redução de 35% do edema (Figura 12).

Figura 12. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre o edema pancreático em

resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80 em água

destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da primeira

injeção de L-arginina. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no

estudo. Os valores representam a média ± E.P.M. da relação entre o peso do

pâncreas e o peso do animal (mg/g). Foram utilizados 6 animais por grupo.

p<0,05

vs salina;

p<0,001 vs L-arg (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

Salina Veículo 10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

Edema pancreático (mg/g)

6.3.4. Determinação da atividade da mieloperoxidase

A mistrura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg v.o.) reduziu (p<0,05) o

aumento da atividade de MPO induzida por L-arg de 0,05 ± 0,002 (Abs. 470nm) para

0,04 ± 0,005; 0,03 ± 0,005 e 0,03 ± 0,001 (Abs. 470nm) (redução de 27; 38 e 40%

respectivamente). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu (p<0,05) o aumento da

atividade de MPO para 0,03 ± 0,007 (Abs. 470nm), mostrando uma redução de 34%

do aumento da atividade de MPO (Figura 13).

Figura 13. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre o aumento da atividade de

MPO em resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80

em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da primeira

injeção de L-arginina. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no

estudo. Os valores representam a média ± E.P.M. da atividade de MPO (Abs.

470nm). Foram utilizados 6 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,05 vs L-arg

(ANOVA e teste de Student Newman Keul).

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Atividade da MPO (Abs 470nm)

Salina Veículo 10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

6.3.5. Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

A mistrura de α,β-amirina nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg, v.o., reduziu

de maneira significativa (p<0,001) o aumento da quantidade de TBARS de 27,7 ± 1,6

µM para 14,9 ± 1,4; 16,5 ± 2,6 e 12,2 ± 1,9 µM (redução de 46; 40 e 56%)

respectivamente. METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,001)

o aumento da quantidade de TBARS de 27,7 ± 1,6 µM (L-arg) para 4,0 ± 0,3 µM,

mostrando uma redução de 86% do aumento de TBARS (Figura 14).

Figura 14. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre o aumento de TBARS em

resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80 em água

destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da primeira

injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. da quantidade de TBARS (µM). Foram

utilizados 6 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,001 vs L-arg (ANOVA e

teste de Student-Newman-Keul).

Salina

Veículo 10 30 100 30

mg/kg

Concentração TBARS (Micromolar)

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

6.3.6. Determinação de nitrato e nitrito

A mistura de α,β-amirina nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg v.o. reduziu de

maneira significativa (p<0,05) o aumento de nitrato e nitrito no homogenato tecidual

de 0,9 ± 0,08 µM (L-arg) para 0,6 ± 0,02; 0,6 ± 0,07 e 0,5 ± 0,12 µM (redução de 29;

38 e 47%) respectivamente. METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente

(p<0,05) os níveis de nitrato e nitrito 0,9 ± 0,08 µM (L-arg) para 0,6 ± 0,06 µM,

mostrando uma redução de 28% dos níveis de nitrato e nitritio (Figura 15).

Figura 15. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre o aumento dos níveis

teciduais de nitrato e nitrito em resposta a administração de L-arg em ratos.

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-

arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30

min antes da primeira injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi

incluído no estudo. Os valores representam a média ± E.P.M. dos níveis teciduais de

nitrato e nitrito (µM). Foram utilizados 6 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,01 vs L-arg;

p<0,05 vs L-arg (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Nitrato e nitrito (Micromolar)

Salina Veículo 10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

6.3.7. Determinação sérica de TNF-α

A mistrura de α,β-amirina apenas nas doses 30 e 100 mg/kg v.o.

reduziram significativamente (p<0,05) os níveis de TNF-α de 24,4 ± 3,4 pg/mL (L-

arg) para 17,2 ± 1,1 e 17,6 ± 0,9 pg/mL (redução de 29 e 28%) respectivamente.

METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,05) os níveis de TNF-α

sérico de 24,4 ± 3,4 pg/mL (L-arg) para 17,9 ± 1,4, mostrando uma redução de 26%

dos níveis de TNF-α (Figura 16).

Figura 16. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre os níveis séricos de TNF-α

em resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80 em

água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da primeira

injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. dos níveis séricos de TNF-α. Foram utilizados

6 animais por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs L-arg (ANOVA e teste de Student

Newman Keul).

Níveis séricos de TNF-alfa (pg/mL)

Salina Veículo 10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

b b

6.3.8. Determinação sérica de IL-6

A mistura de α,β-amirina nas doses 10, 30 e 100 mg/kg v.o. reduziu

significativamente (p<0,05) os níveis de IL-6 de 126,4 ± 5,6 pg/mL (L-arg) para 113,2

± 5,6; 93,9 ± 3,1 e 93,4 ± 2,1 pg/mL (redução de 10; 26 e 26%) respectivamente.

METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,05) os níveis de IL-6

sérico de 126,4 ± 5,6 pg/mL (L-arg) para 110,6 ± 4,6, mostrando um percentual de

inibição de 12% dos níveis de IL-6 (Figura 17).

Figura 17. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e METILPRED sobre os níveis séricos de IL-6

em resposta a administração de L-arg em ratos. Veículo (2% de Tween 80 em

água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h

de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30 min antes da primeira

injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. dos níveis séricos de IL-6. Foram utilizados 6

animais por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,001 vs L-arg;

p<0,05 vs L-arg (ANOVA e

teste de Student Newman Keul).

100

120

140

Níveis séricos de IL-6 (pg/mL)

Salina Veículo 10 30 100 30

mg/kg

αα

ββ

-amirina

METILPRED

L-arginina

6.3.9. Avaliação histológica do pâncreas

A figura 18 e a tabela 3 demonstram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre as alterações morfológicas observadas no tecido pancreático (edema,

infiltrado inflamatório, vacuolização acinar, necrose e hemorragia) em resposta a

administração de L-arginina em ratos. O tratamento com α,β-amirina (10, 30 e 100

mg/kg v.o.) reduziu (p<0,05) as alterações observadas. METILPRED (30 mg/kg, i.m.)

reduziu significativamente (p<0,05) as aletrações histológicas observadas.

Figura 18. Fotomicrografia representativa do tecido pancreático de ratos

submetidos à administração de L-arg. A: Salina; B: Veículo + L-arginina,

mostrando alterações histológicas características de pancreatite aguda (edema inter

e intralobular, infiltrado inflamatório, vacuolização acinar, necrose e hemorragia); C:

α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) + L-arginia e D: METILPRED (30 mg/kg, i.m.) + L-

arginina. O tratamento com α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e METILPRED (30 mg/kg,

i.m.) preveniram as alterações morfológicas observadas no tecido pancreático.

Hematoxilina-Eosina (aumento 400X).

Tabela 3: Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre as alterações morfológicas

observadas em resposta ao tratamento com L-arg.

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-

arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30

min antes da primeira injeção de L-arginina. Um grupo que recebeu apenas salina

i.p. foi incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores,

mostrando o intervalo mínimo e máximo dos escores atribuído. Foram utilizados (4-

6) animais por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,01 vs salina;

p<0,05 vs L-arg e

p<0,01 vs L-arg (Teste de Kruskal Wallis e Teste de Dunns).

Grupo Edema

(0-3)

Infiltrado

inflamatório

(0-3)

Vacuolização

acinar

(0-3)

Necrose

(0-3)

Hemorragia

(0-3)

Salina 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0)

L-arginina 3 (2-3)

2 (2-3)

3 (3-3)

2 (2-3)

α,β-amirina

10mg/kg

0 (0-0)

0 (0-1)

0 (0-0)

α,β-amirina

30mg/kg

0 (0-0)

α,β-amirina

100mg/kg

0 (0-0)

0 (0-1)

0 (0-0)

Metilprednisolona

30mg/kg

0 (0-1)

0 (0-0)

1 (0-1)

0 (0-0)

0 (0-1)

6.3.10. Estudo imunohistoquímico para a determinação de iNOS

A figura 19 e a tabela 4 demonstram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre a intensidade da reação observadas nas lâminas de

imunohistoquímica para determinação de óxido nítrico sintase induzida (iNOS)

observadas no tecido pancreático e nas células acinares, em resposta a

administração de L-arg em ratos. O tratamento com a mistura de α,β-amirina nas

doses de 30 e 100 mg/kg v.o. reduziram de maneira significativa (p<0,05) a

intensidade de reação observada. METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu

significativamente (p<0,05) a intensidade de reação observada.

Figura 19. Imunorreatividade para a determinação de iNOS no tecido

pancreático de ratos submetidos à administração de L-arg. A: Salina; B: Veículo

+ L-arginina; C: α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) + L-arginina e D: METILPRED (30

mg/kg, i.m.) + L-arginina. O tratamento com α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e

METILPRED (30 mg/kg, i.m.), diminuíram a imunomarcação observada no tecido

pancreático (aumento 400 X).

Tabela 4: Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a intensidade de reação

observada nas lâminas de imunohistoquímica para a determinação de iNOS em

resposta ao tratamento com L-arg.

Grupo iNOS

(0-4)

Salina 1 (0-1)

L-arginina 4 (3-4)

α,β-amirina 10mg/kg

2 (2-3)

α,β-amirina 30mg/kg

1 (1-2)

α,β-amirina 100mg/kg

1 (1-2)

Metilprednisolona 30mg/kg 1,5 (1-2)

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-

arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30

min antes da primeira injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi

incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores, mostrando o

intervalo mínimo e máximo dos escores atribuídos. Foram utilizados (4-6) animais

por grupo.

p<0,01 vs salina;

p<0,05 vs L-arg (Teste de Kruskal Wallis e Teste de

Dunns).

6.3.11. Estudo imunohistoquímico para a determinação de TNF-α

A figura 20 e a tabela 5 demonstram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre a intensidade da reação observadas nas lâminas de

imunohistoquímicas para determinação de TNF-α observadas no tecido pancreático

e nas células acinares, em resposta a administração de L-arg em ratos. O

tratamento com a mistrura de α,β-amirina nas doses de 10 e 100 mg/kg v.o. reduziu

de maneira significativa (p<0,05) a intensidade de reação observada. METILPRED

(30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,05) a intensidade de reação

observada.

Figura 20. Imunorreatividade para a determinação de TNF-α

αα

α no tecido

pancreático de ratos submetidos à administração de L-arg. A: Salina; B: Veículo

+ L-arginina; C: α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e D: METILPRED (30 mg/kg, i.m.). O

tratamento com α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e METILPRED (30 mg/kg, i.m.),

diminuíram de maneira significativa as marcações imunohistoquímicas observadas

no tecido pancreático (aumento 400 X).

Tabela 5: Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a intensidade de reação

observada nas lâminas de imunohistoquímica para a determinação de TNF-α em

resposta ao tratamento com L-arg.

Grupo

TNF-α

αα

(0-4)

Salina 0 (0-0)

L-arginina 3 (3-3)

α,β-amirina 10mg/kg

0,5 (0-1)

α,β-amirina 30mg/kg

1 (0-3)

α,β-amirina 100mg/kg

0,5 (0-1)

Metilprednisolona 30mg/kg 0 (0-1)

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-

arg (2 X 2,5 g/kg; 1 h de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30

min antes da primeira injeção de L-arg. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi

incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores, mostrando o

intervalo mínimo e máximo dos escores atribuídos. Foram utilizados (4-6) animais

por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs L-arg (Teste de Kruskal Wallis e Teste de

Dunns).

6.3.12. Estudo imunohistoquímico para a determinação de nitrotirosina

A figura 21 e a tabela 6 demonstram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre a intensidade da reação observadas nas lâminas de

imunohistoquímicas para determinação de nitrotirosina observadas no tecido

pancreático e nas células acinares, em resposta a administração de L-arginina em

ratos. O tratamento com a mistrura de α,β-amirina nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg

v.o. reduziu de maneira significativa (p<0,05) a intensidade de reação observada.

METILPRED (30 mg/kg, i.m.) reduziu significativamente (p<0,05) a intensidade de

reação observada.

Figura 21. Imunorreatividade para a determinação de nitrotirosina no tecido

pancreático de ratos submetidos à administração de L-arg. A: Salina; B: Veículo

+ L-arginina; C: α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e D: METILPRED (30 mg/kg, i.m.). O

tratamento com α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e METILPRED (30 mg/kg, i.m.),

diminuíram significativamente as marcações imunohistoquímicas observadas no

tecido pancreático (aumento 400 X).

Tabela 6: Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a intensidade de reação

observada nas lâminas de imunohistoquímica para a determinação de nitrotirosina

em resposta ao tratamento com L-arg.

Grupo Nitrotirosina

(0-4)

Salina 0 (0-0)

L-arginina 4 (3-4)

α,β-amirina 10mg/kg

0 (0-1)

α,β-amirina 30mg/kg

0 (0-1)

α,β-amirina 100mg/kg

0 (0-1)

Metilprednisolona 30mg/kg 0 (0-2)

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de L-

arg. (2 X 2,5 g/kg; 1 h de intervalo). METILPRED (30 mg/kg, i.m.) foi administrada 30

min antes da primeira injeção de L-arginina. Um grupo que recebeu apenas salina

i.p. foi incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores,

mostrando o intervalo mínimo e máximo dos escores atribuído. Foram utilizados (4-

6) animais por grupo.

p<0,01 vs salina;

p<0,05 vs L-arg (ANOVA seguida pelo teste

de Kruskal Wallis).

500

1000

1500

2000

2500

Amilase sérica (U/dL)

6.4. Caracterização da atividade da mistura de α

αα

α,β

ββ

β-amirina na pancreatite

aguda induzida pela administração de ceruleína em camundongos

6.4.1. Determinação de amilase sérica

α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg v.o.) reduziu (p<0,001) a amilase sérica

de 1835 ± 129,7 U/dL (ceruleína) para 826,6 ± 36,3; 591,4 ± 75,4 e 336,5 ± 24,8

U/dL (redução de 55; 68 e 82%) respectivamente. TAL (200 mg/kg, v.o.)

antiinflamatório, controle positivo utilizado, reduziu (p<0,001) os níveis séricos da

amilase para 1298 ± 140,8 U/dL, mostrando uma redução de 29% (Figura 22).

Figura 22. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre os níveis de amilase sérica em

resposta a administração de ceruleína (CER) em camundongos. Veículo (2% de

Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg,

v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de CER (5 X 50

µg/kg; 1h de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes de CER.

Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído. Os valores representam a

média ± E.P.M. dos níveis de amilase (U/dL). Foram utilizados 8 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,001 vs CER (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

Salina

Veículo

10 30 100 200

mg/kg

αα

ββ

-amirina

TAL

Ceruleína

6.4.2. Determinação de lipase sérica

A mistrura de α,β-amirina apenas na dose de 100 mg/kg v.o. reduziu de

maneira significativa (p<0,001) o aumento da lipase sérica de 237,7 ± 8,9 U/L para

123,6 ± 19,7 U/L (redução de 48%). TAL (200 mg/kg, v.o.) reduziu significativamente

(p<0,01) os níveis séricos da lipase de 237,7 ± 19,7 U/L (CER) para 179,7 ± 16,6

U/L, mostrando uma redução de 24,4% da lipase sérica (Figura 23).

Figura 23. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre os níveis de lipase sérica em

resposta a administração de CER em camundongos. Veículo (2% de Tween 80

em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração intraperitoneal de CER (5 X 50

µg/kg; 1 h de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes da

primeira injeção i.p. de CER. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no

estudo. Os valores representam a média ± E.P.M. dos níveis séricos de lipase (U/L).

Foram utilizados 8 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,001 vs CER;

p<0,01

vs CER (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

Salina Veículo 10 30 100 200

mg/kg

αα

ββ

-amirina

TAL

Ceruleína

100

150

200

250

300

Lipase sérica (U/L)

6.4.3. Determinação do grau de edema pancreático

A mistrura de α,β-amirina apenas nas doses 30 e 100 mg/kg, v.o., reduziu

significativamente (p<0,05) o edema de 5,9 ± 0,2 mg/g para 5,1 ± 0,2 e 4,8 ± 0,2

mg/g (redução de 14 e 19%) respectivamente. TAL (200 mg/kg, v.o.) reduziu

significativamente (p<0,001) o grau de edema pancreático de 5,9 ± 0,2 mg/g (CER)

para 4,3 ± 0,1 mg/g, mostrando uma redução de 28% do edema (Figura 24).

Figura 24. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre o grau de edema pancreático em

resposta a administração de CER em camundongos. Veículo (2% de Tween 80

em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de CER (5 X 50 µg/kg; 1 h

de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes da primeira injeção

de ceruleína. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. da relação entre o peso do pâncreas e o peso

do animal. Foram utilizados 8 animais por grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,05 vs L-

arg;

p<0,01 vs CER;

p<0,001 vs CER (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

Veículo

10 30 100 200

αα

ββ

-amirina

TAL

Ceruleína

Salina

mg/kg

Edema pancreático (mg/g)

6.4.4. Determinação da atividade da mieloperoxidase

A mistrura de α,β-amirina nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg v.o. reduziu

de maneira significativa (p<0,05) o aumento da atividade de MPO induzida pela

administração de CER de 0,1 ± 0,02 (Abs. 470 nm) para 0,05 ± 0,007; 0,05 ± 0,01 e

0,05 ± 0,06 (Abs. 470 nm) (redução de 49; 54 e 47%) respectivamente. TAL (200

mg/kg, v.o.) reduziu significativamente (p<0,05) o aumento da atividade de MPO de

0,1 ± 0,02 (Abs. 470 nm) (CER) para 0,07 ± 0,004 (Abs. 470 nm), mostrando uma

redução de 27% do aumento da atividade de MPO (Figura 25).

Figura 25. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre o aumento da atividade de MPO

em resposta a administração de CER em camundongos. Veículo (2% de Tween

80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de CER (5 X 50 µg/kg; 1 h

de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes da primeira injeção

de ceruleína. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. da atividade de MPO (Abs. 470 nm). Foram

utilizados 8 animais por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs L-arg (ANOVA e teste

de Student Newman Keul).

Salina Veículo 10 30 100 200

mg/kg

αα

ββ

-amirina

TAL

Ceruleína

b b

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

Atividade de MPO (Abs 470nm)

6.4.5. Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg v.o.) reduziu (p<0,05) o aumento da

quantidade de TBARS de 27,8 ± 1,4 µM para 23,3 ± 0,9; 21,8 ± 1,9 e 21,7 ± 1,2 µM

(redução de 16; 22 e 22%) respectivamente. TAL (200 mg/kg, v.o.) reduziu

significativamente (p<0,05) o aumento da quantidade de TBARS para 22,3 ± 0,9 µM,

mostrando uma redução de 20% do aumento de TBARS (Figura 26).

Figura 26. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre o aumento de TBARS em resposta

a administração de CER em camundongos. Veículo (2% de Tween 80 em água

destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de CER (5 X 50 µg/kg; 1 h

de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes da primeira injeção

de ceruleína. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os

valores representam a média ± E.P.M. da quantidade de TBARS (µM). Foram

utilizados 8 animais por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs CER (ANOVA e teste

de Student Newman Keul).

Ceruleína

Concentração TBARS (Micromolar)

αα

ββ

-amirina

TAL

Salina

Veículo 10 30 100 200

mg/kg

6.4.6. Determinação sérica de TNF-α

A mistrura de α,β-amirina nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg v.o. reduziu

significativamente (p<0,05) os níveis de TNF-α de 123,0 ± 8,6 pg/mL para 42,6 ± 9,0;

35,2 ± 10,2 e 9,16 ± 6,3 pg/mL (redução de 65; 71 e 92%) respectivamente. TAL

(200 mg/kg, v.o.) reduziu significativamente (p<0,05) os níveis de TNF-α sérico de

123,0 ± 8,6 pg/mL (CER) para 33,2 ± 4,5 pg/mL mostrando uma redução de 73%

dos níveis de TNF-α (Figura 27) .

Figura 27. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre os níveis séricos de TNF-α em

resposta a administração de CER em camundongos. Veículo (2% de Tween 80

em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de CER (5 X 50 µg/kg; 1 h

de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes da primeira injeção

de CER. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os valores

representam a média ± E.P.M. dos níveis séricos de TNF-α. Foram utilizados 8

animais por grupo.

p<0,01 vs salina;

p<0,05 vs veículo;

p<0,01 vs veículo (ANOVA

e teste de Student Newman Keul).

mg/kg

Salina Veículo 10 30 100 200

αα

ββ

-amirina

TAL

Ceruleína

100

120

140

Níveis séricos de TNF-alfa (pg/mL)

6.4.7. Determinação sérica de IL-6

A mistrura de α,β-amirina nas doses 10, 30 e 100 mg/kg v.o. reduziu

significativamente (p<0,05) os níveis de IL-6 de 50,8 ± 19,7 pg/mL para 12,8 ± 1,8;

11,3 ± 2,7 e 8,8 ± 2,9 pg/mL (redução de 75; 78 e 83%) respectivamente. TAL (200

mg/kg, v.o.) reduziu significativamente (p<0,05) os níveis de IL-6 sérico de 50,8 ±

19,7 pg/mL (CER) para 25,1 ± 3,9 pg/mL, mostrando um percentual de inibição de

50,5% dos níveis de IL-6 (Figura 28).

Figura 28. Efeito de α

αα

α,β

ββ

β-amirina e TAL sobre os níveis séricos de IL-6 em

resposta a administração de CER em camundongos. Veículo (2% de Tween 80

em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de CER (5 X 50 µg/kg; 1 h

de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min antes da CER. Um grupo

que recebeu apenas salina i.p. foi incluído no estudo. Os valores representam a

média ± E.P.M. dos níveis séricos de IL-6. Foram utilizados 8 animais por grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs CER (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

Salina Veículo 10 30 100 200

mg/kg

αα

ββ

-amirina

TAL

Ceruleína

Níveis séricos de IL-6 (pg/mL)

6.4.8. Avaliação histológica do pâncreas

A figura 29 e tabela 7 demonstram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre as alterações morfológicas observadas no tecido pancreático (edema,

infiltrado inflamatório, vacuolização acinar e necrose) em resposta a administração

de CER em camundongos. O tratamento com a mistrura de α,β-amirina na dose de

100 mg/kg v.o. reduziu as alterações observadas. TAL (200 mg/kg, v.o.) reduziu

significativamente (p<0,05) as alterações histológicas observadas.

Figura 29. Fotomicrografia representativa do tecido pancreático de

camundongos submetidos à administração de altas doses de CER. A: salina,

mostrando uma arquitetura normal; B: veículo + ceruleína, mostrando

desorganização da arquitetura pancreática, com vacuolização das células acinares,

grande área de necrose das células acinares e infiltrado de células inflamatórias; C:

α,β-amirina (100 mg/kg) e D: TAL (200 mg/kg), mostrando proteção dos danos

histológicos do pâncreas induzidos por CER. Hematoxilina-Eosina (aumento 400 X).

Tabela 7: Efeitos do tratamento de α,β-amirina sobre as alterações morfológicas

observadas em resposta a administração de CER em camundongos

Grupo Edema

(0-3)

Infiltrado

inflamatório

(0-3)

Vacuolização

acinar

(0-3)

Necrose

(0-3)

Salina 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0)

Ceruleína 2 (1-3)

2 (1-3)

2 (0-3)

1,5 (0-3)

α,β-amirina10mg/kg

1 (0-2) 1 (0-3) 1 (0-2) 0,5 (0-3)

α,β-amirina 30mg/kg

1 (0-3) 1 (0-2) 1 (0-2) 0 (0-1)

α,β-amirina 100mg/kg

0 (0-0)

0 (0-1)

0 (0-0)

Talidomida 200 mg/kg 0 (0-1)

0 (0-1)

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de

CER (5 X 50 µg/kg; 1 h de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min

antes da primeira injeção de CER. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi

incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores, mostrando os

valores mínimo e máximo dos escores atribuído. Foram utilizados (6-8) animais por

grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs ceruleína (Teste de Kruskal Wallis e Teste de

Dunns).

6.4.9. Estudo imunohistoquímico para a determinação de TNF-α

A figura 30 e a tabela 8 mostram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre a reação observada nas lâminas de imunohistoquímicas para

determinação de TNF-α no tecido pancreático, nas células acinares e células

inflamatórias em resposta a administração de CER em camundongos. O tratamento

com a mistrura de α,β-amirina nas doses de 30 e 100 mg/kg v.o. mostrou menor

imunoreatividade quando comparada ao grupo CER. TAL (200 mg/kg, v.o.) também

mostrou baixa intensidade de reação quando comparado ao grupo CER.

Figura 30. Imunoreatividade para a determinação de TNF-α no tecido

pancreático de camundongos submetidos à administração de altas doses de

CER. A: Salina; B: Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) +

Ceruleína; C: α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e D: Talidomida (200 mg/kg, v.o.)

(aumento 400 X).

Tabela 8: Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a intensidade de reação

observada nas lâminas de imunohistoquímica para a determinação de TNF-α em

resposta ao tratamento com CER.

Grupo

TNF-α

αα

(0-4)

Salina 0 (0-0)

Ceruleína 3,5 (3-4)

α,β-amirina 10mg/kg

1,0 (1-1)

α,β-amirina 30mg/kg

0,5 (0-1)

α,β-amirina 100mg/kg

0,5 (0-1)

Talidomida 200mg/kg 0,5 (0-1)

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de

CER (5 X 50 µg/kg; 1 h de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min

antes da primeira injeção de CER. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi

incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores, mostrando o

intervalo mínimo e máximo dos escores atribuído. Foram utilizados (6-8) animais por

grupo.

p<0,001 vs salina;

p<0,05 vs ceruleína (Teste de Kruskal Wallis e Teste de

Dunns).

6.4.10. Estudo imunohistoquímico para determinação de iNOS

A figura 31 e a tabela 9 mostram o efeito da administração oral de α,β-

amirina sobre a reação observada nas lâminas de imunohistoquímicas para

determinação de iNOS no tecido pancreático, nas células acinares e células

inflamatórias, em resposta a administração de ceruleína em camundongos. O

tratamento com a mistrura de α,β-amirina na dose de 100 mg/kg v.o. mostrou menor

imunoreatividade quando comparada ao grupo CER. TAL (200 mg/kg, v.o.) também

mostrou baixa intensidade de reação quando comparado ao grupo CER.

Figura 31. Imunoreatividade para a determinação de iNOS no tecido

pancreático de camundongos submetidos à administração de altas doses de

CER. A: Salina; B: Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) +

Ceruleína; C: α,β-amirina (100 mg/kg, v.o.) e D: Talidomida (200 mg/kg, v.o.).

Tabela 9: Efeito do tratamento com α,β-amirina sobre a intensidade de reação

observada nas lâminas de imunohistoquímica para a determinação de iNOS em

resposta ao tratamento com CER.

Grupo iNOS

(0-4)

Salina 0,5 (0-1)

Ceruleína 4,0 (3-4)

α,β-amirina 10mg/kg

1,5 (1-2)

α,β-amirina 30mg/kg

1,0 (0-2)

α,β-amirina 100mg/kg

0,5 (0-1)

Talidomida 200mg/kg 0,5 (0-1)

Veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o., 10 mL/kg) e α,β-amirina (10, 30 e

100 mg/kg, v.o.) foram administrados 48, 24 e 1,5 h antes da administração i.p. de

CER (5 X 50 µg/kg; 1 h de intervalo). TAL (200 mg/kg, v.o.) foi administrada 60 min

antes da primeira injeção de CER. Um grupo que recebeu apenas salina i.p. foi

incluído no estudo. Os valores representam a mediana dos escores, mostrando o

intervalo mínimo e máximo dos escores atribuído. Foram utilizados (6-8) animais por

grupo.

p<0,05 vs salina;

p<0,05 vs ceruleína (Teste de Kruskal Wallis e Teste de

Dunns).

7. DISCUSSÃO

A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico

alternativo de grande aceitação pela população e vem crescendo junto à

comunidade médica. No entanto, devem ser utilizadas plantas cujas atividades

biológicas tenham sido investigadas cientificamente, apresentando comprovada

eficácia e segurança (CECHINEL & YUNES,1998; KINGORN, 2001).

A importância das plantas medicinais deve-se também por sua

contribuição como fonte natural de fármacos e por proporcionar grandes chances de

obter-se uma molécula protótipo devido à diversidade de constituintes presentes

nestas (KINGORN, 2001; MORETTO, 2000). A partir dos produtos naturais,

incluindo as toxinas extraídas de animais, de bactérias, de fungos ou de plantas, foi

possível compreender os diversos fenômenos relacionados à biologia celular e

molecular e a eletrofisiologia, permitindo que estruturas biológicas fossem

identificadas, isoladas e clonadas. O que tornou possível à indústria farmacêutica

modelar drogas providas de maior seletividade e também mais eficazes contra várias

patologias (CALIXTO, 2005).

Aproximadamente 25% de todas as drogas modernas disponíveis são

derivadas, direta ou indiretamente, de plantas (DE SMET, 1997). Entre os exemplos

mais interessantes estão os salicilatos que levaram ao desenvolvimento das maiores

classes de drogas analgésicas, principalmente, opióides e drogas antiinflamatórias

não esteroidais (CALIXTO et al., 2000, 2001).

Protium heptaphyllum, uma Burseraceae, popularmente denominada por

almecegueira, breu-branco verdadeiro, almecegueira cheirosa, almecegueira de

cheiro, almecegueira vermelha e almecegueiro bravo (CORRÊA, 1984), é

freqüentemente encontrada na Amazônia e no Nordeste do Brasil. A resina coletada

do tronco dessa espécie apresenta comprovadas propriedades antiinflamatórias e

analgésicas (SIANI et al., 1999).

A análise fitoquímica de P. heptaphyllum revelou a presença de

monoterpenos e triterpenos pentacíclicos, incluindo a mistura de α,β-amirina

componente majoritário encontrado na resina (SUSUNAGA et al., 2001; VIEIRA-

JUNIOR, 2005), a qual, a partir de estudos prévios, foi atribuída diversas atividades

farmacológicas, tais como: antinociceptiva, anti-inflamatória, antipruritogênica,

gastroprotetora e hepatoprotetora (OLIVEIRA et al., 2004 a,b, 2005a; HOLANDA-

PINTO et al., 2008 a, b; LIMA-JUNIOR et al., 2006, 2007).

Estudos de toxicidade aguda, realizados tanto com a resina quanto com a

mistura de α,β-amirina, revelaram baixa toxicidade, uma vez que não foi possível

estabelecer a DL

. A administração oral da resina ou da mistura de α,β-amirina até

as doses de 5g/kg e 3g/kg, respectivamente, não foram tóxicas aos camundongos

com até 72 horas de observação. Da mesma forma os animais que receberam, por

via intraperitoneal, a resina ou a mistura de α,β-amirina até as doses de 1g/kg e

2g/kg, respectivamente, não mostraram sinais clínicos de toxicidade e nenhuma

morte foi observada no período de até 72 horas (OLIVEIRA et al., 2004a).

Pesquisas experimentais demonstraram a eficácia de compostos

derivados de plantas, Hypericum perforatum (GENOVESE et al., 2006), Gardênia

jasminoides (JUNG et al., 2008), Patrinia scabiosaefolia (SEO et al., 2006),

Taraxacum officinale (SEO et al., 2005) e Gingko biloba (ZEYBEK et al., 2003), bem

como de compostos antioxidantes, tais como: melatonina, ácido ascórbico, N-

acetilcisteina, ômega-3 e resveratrol (FOITZIK et al., 2002; ESREFOGLU et al.,

2006; LAWINSKI et al., 2005; SZABOLCS et al., 2006b) na prevenção da pancreatite

aguda experimental por mecanismos que envolvem: redução de mudanças

histológicas pancreáticas, redução da atividade da mieloperoxidase, inibição da

ativação de NF-κB, redução dos níveis pancreáticos de TNF-α e IL-6, redução dos

níveis séricos de amilase e lipase, redução do estresse oxidativo e redução de óxido

nítrico (NO) (GENOVESE et al., 2006; JUNG et al., 2008; MAO et al., 2003; WANG

et al., 2003; SEO et al., 2005, 2006; ZEYBEK et al., 2003; FOITZIK et al., 2002;

ESREFOGLU et al., 2006; LAWINSKI et al., 2005; SZABOLCS et al., 2006b).

Diante do grande uso popular do P. heptaphyllum, da segurança, eficácia

e das atividades farmacológicas atribuídas à mistura de

α,β-amirina, bem como da

eficácia de compostos derivados de plantas na prevenção ou melhora da pancreatite

aguda, foi investigado no presente estudo, a potencial atividade dessa mistura na

prevenção do desenvolvimento de pancreatite aguda em modelos experimentais

induzidos por L-arginina ou ceruleína.

Existe uma variedade de protocolos experimentais para o estudo da PA,

entretanto esse trabalho procurou avaliar a atividade de α,β- amirina em modelos de

PA induzida por L-arginina e ceruleína por serem modelos não invasivos, facilmente

reprodutíveis e rápidos. Juntos os dois modelos fornecem subsídios para o

entendimento da patogênese e das complicações associadas à PA. Sendo o modelo

de L-arginina mais indicado para o estudo da patogênese da PA, tendo como

vantagem de atingir apenas o pâncreas pelos seus efeitos tóxicos, enquanto que o

modelo da ceruleína permite estudar complicações associadas, PA associada à

injúria pulmonar, uma complicação comum que contribui de forma significativa com o

aumento da taxa de mortalidade dos pacientes. O modelo induzido por ceruleína

ainda apresenta a vantagem de reproduzir as características clínicas da pancreatite

aguda que acomete seres humanos (CHAN & LEUNG, 2007).

Há mais de um século a PA é usualmente considerada como uma doença

autodigestiva do pâncreas, acompanhada pela ativação prematura de proteases

intracelulares (STEER et al., 1993). No entanto, são necessários maiores estudos

para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos que condicionam esse

fenômeno (SLEISENGER et al., 1998; SPIRO, 1993).

O mecanismo pelo qual a L-arginina induz PA ainda não está

completamente elucidado. No entanto, seu efeito tóxico sobre o pâncreas deve-se

em parte a inibição de síntese protéica, excessiva produção de óxido nítrico e

peroxidação lipídica (CHAN & LEUNG, 2007). Algumas evidências sugerem que

radicais livres de oxigênio, óxido nítrico e mediadores inflamatórios têm um papel

chave nesse modelo (VARGA et al., 1997; CZAKO et al., 2000; TAKACS et al.,

2002; RAKONCZAY et al., 2003).

Altas doses de L-arginina resultam no desenvolvimento de PA necrosante

(MIZUNUMA et al., 1984). A partir de evidências experimentais foi observado que o

modelo de PA induzida por L-arginina está associado a um aumento significativo da

amilase plasmática, da razão peso pancreático/peso corporal, dos níveis de IL-6, da

atividade da MPO pancreática, ativação de tripsina, mudanças histológicas

(incluindo acumulação de flúidos, destruição da histoarquitetura, vacuolização das

células acinares, extensiva necrose de células acinares e infiltração neutrofílica).

(CZAKO et al., 2000; DABROWSKI et al., 1999; HEGYI et al., 2004; RAKONCZAY et

al., 2003; VARGA et al., 1997; ZHAO et al., 2004; DHARA et al., 2006; SZABOLCS

et al., 2006a).

Em acréscimo às observações já mencionadas, o fator de transcrição NF-

κB, TNF-α, IL--1β, IL-6, PAF e radicais livres estão envolvidos na patogênese da

pancreatite aguda induzida tanto por L-arginina, quanto por ceruleína (NONAKA et

al., 1990; BATHIA et al., 2005 a,b; GRANGER & REMICK,2005).

Determinações séricas de amilase e lipase são usadas como marcadores

de pancreatite, uma vez que seus níveis elevados em pacientes são altamente

sugestivos do desenvolvimento dessa doença (DAWRA et al., 2007). Após o início

da inflamação pancreática, já nas primeiras horas, a amilase e lipase séricas

elevam-se. A amilase sérica reduz-se mais rapidamente do que a lipase, e pode

retornar à normalidade em até 24 horas. Por esse motivo, a lipase é melhor

indicadora de pancreatite do que a amilase em pacientes que são avaliados vários

dias após o início da crise pancreática (KOLAR et al., 1984).

No modelo experimental de PA por L-arginina os níveis séricos de

amilase começam a elevar-se após 12 horas da administração de L-arginina, sendo

o pico de elevação em torno de 24 horas. A lipase sérica também se encontra

elevada nas 24h após a administração de L-arginina (SZABOLCS et al., 2006a).

Os resultados da presente investigação mostram que a L-arginina elevou

os níveis séricos de amilase e lipase, em ratos, após 24 horas da sua administração,

e que a mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg) é oralmente ativa na atenuação

dos níveis séricos dessas enzimas, sugerindo uma atividade contra a pancreatite

aguda, uma vez que está envolvida na redução dos níveis séricos de enzimas que

participam da patogênese da PA. Metilprednisolona (30 mg/kg), controle positivo

utilizado nesse estudo também foi eficaz na redução dos níveis séricos de amilase e

lipase. Estudos experimentais mostram que agentes glicocorticóides, semelhantes à

metilpredinisolona, são capazes de atenuar a inflamação do tecido pancreático,

evidenciado pela redução dos níveis séricos de amilase (KANDIL et al., 2006).

Na PA, além da ativação de proteases digestivas, observa-se a presença

de infiltrado de células inflamatórias, ativação leucocitária, liberação de mediadores

inflamatórios e necrose celular acinar (BATHIA et al., 2005a; REGNER et al., 2008).

A ativação intra-acinar prematura de enzimas digestivas é o evento central da

patogênese dessa doença. A resposta inflamatória é parcialmente causada pela

liberação de quimiocinas das células acinares, seguida pelo recrutamento de

linfócitos T helper e macrófagos levando ao desenvolvimento de edema pancreático

e acúmulo de neutrófilos. O estresse oxidativo está também envolvido na

patogênese da doença pancreática (RAU et al., 2000; LEUNG & CHAN, 2009).

A literatura relata que o aumento da atividade de mieloperoxidase (MPO)

de neutrófilos está presente em vários processos patológicos e está associado com

um aumento do risco do estresse oxidativo, como no caso de enfermidades

infecciosas, enfermidades inflamatórias e na isquemia de reperfusão (MORALES et

al., 1998). A administração de L-arginina resulta em uma significativa infiltração de

células inflamatórias, predominantemente neutrófilos, a qual está correlacionada

com o aumento da atividade de MPO tecidual (DAWRA et al., 2007). A inibição da

MPO é o um indicativo de atividade antiinflamatória (FUJII et al., 2002).

Os resultados mostram que a mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100

mg/kg), assim como a metilprednisolona (30 mg/kg), são efetivos em reduzir a

migração de leucócitos polimorfonucleares, avaliado indiretamente através da

determinação da atividade da MPO e pela análise histológica. Resultado que indica

uma possível atividade antiinflamatória para a mistura de α,β- amirina.

Trabalhos anteriores têm sugerido que os neutrófilos estão envolvidos na

produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (BABBS, 1992), e que a L-

arginina e a ceruleína induzem a formação em excesso de EROs, seguida pela

ativação do fator de transcrição NF-κB, aumentando, dessa forma, a expressão de

TNF-α e outras citocinas (KIM et al., 2000; RAKONCZAY et al., 2008). O excesso de

EROs e de espécies reativas de nitrogênio (ERN) produzidas pela enzima óxido

nítrico sintase (NOS), isoformas de NADPH oxidase, ou por bi-produtos da cadeia

transportadora de elétrons mitocondrial tem sido implicado na patogênese da

pancreatite aguda (LEUNG & CHAN, 2009). O estresse oxidativo é um processo

deletério que pode ser um importante mediador dos danos às estruturas celulares,

incluindo lipídios e membranas, proteínas enzimáticas e estruturais e DNA celular.

Agentes antioxidantes semelhantes a N-acetilcisteína e raxofelast são eficientes em

inibir a ativação de NF-κB em modelos animais de pancreatite (RAKONCAZAY et al.,

2008).

É conhecido que as células acinares produzem grande quantidade de

EROs nos estágios iniciais da PA em ratos. A produção dessas EROs pode ser

aumentada na PA pela atividade leucocitária, levando a uma alteração no

citoesqueleto das células acinares e danos às membranas celulares. A degradação

de ácidos graxos poliinsaturados nas membranas celulares que ocorre

secundariamente ao excesso de produção de EROs, resulta na destruição da

membrana e produção de malonialdeído (MDA), um indicador de geração de

espécies reativas de oxigênio (DABROWSKI et al., 1988).

Portanto, EROs estão envolvidos como um importante fator na

patogênese e progresso da PA. Como são espécies bioquímicas altamente reativas,

exercem seus efeitos patofisiológicos pelo ataque direto a lipídios e proteínas nas

membranas biológicas, causando sua disfunção (FARBER et al., 1990).

Trabalhos experimentais mostram que mecanismos semelhantes ao

estresse oxidativo está envolvido no desenvolvimento da PA (SALUJA et al., 1985;

SCHOENBERG et al., 1994; SANFEY et al., 1985, 2000; RAU et al., 2000). Contudo,

a medida de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) é usada para

avaliar a lipoperoxidação, ou seja, quando os lipídios sofrem ação dos radicais livres.

TBARS reflete a quantidade de malonaldeído (MDA) formado, produto final da

peroxidação dos ácidos graxos da membrana (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001).

Neste estudo, foi observado que a L-arginina aumenta o estresse

oxidativo, como comprovado pela formação aumentada de TBARS no pâncreas, um

indicador de peroxidação lipídica. A mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg) e

metilprednisolona (30 mg/kg) potencialmente suprimiram a lipoperoxidação,

evidenciado pela redução da formação das substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico. Evento que reflete uma possível atividade antioxidante para a mistura

de α,β-amirina, que pode resultar em inibição do fator de transcrição NF-κB e

redução da síntese de mediadores inflamatórios.

Estudos preliminares mostram que a mistura de α,β-amirina é capaz de

reduzir a formação aumentada de TBARS em modelo experimental de periodontite

aguda (HOLANDA PINTO, 2008). A literatura relata ainda uma atividade antioxidante

da resina de P. Heptaphillum e da mistura de α,β-amirina em modelo de lesões

gástricas induzida por etanol e atividade antioxidante da mistura de α,β-amirina em

modelo de lesão hepática induzida por acetominofeno (OLIVEIRA et al., 2004a e

2005).

Nesse contexto, o papel do estresse oxidativo na pancreatite aguda tem

sido estudado em vários modelos animais (DING et al., 2003; SALUJA et al., 1985;

SANFEY et al., 1985; URUNUELA et al., 2002) e em seres humanos (PARK et al.,

2003). Trabalhos prévios têm indicado que agentes antioxidantes, tais como:

melatonina, retinol, ácido ascórbico e N-acetilcisteína apresentam efeitos benéficos

no tratamento da PA induzida por L-arginina e ceruleína (SZABOLCS et al., 2006a;

PARK et al., 2003; JAWOREk et al., 2003; QI et al., 1999).

Uma importante característica da pancreatite aguda é a inflamação

pancreática seguida de recrutamento de leucócitos que associado aos mediadores

inflamatórios apresentam um papel crítico na patogênese da PA (BATHIA et al.,

2000; BATHIA, 2002 e 2004). Estudos experimentais mostram que citocinas

apresentam um papel importante na PA, assim como provocam uma ativação

inapropriada do sistema imune, aumentando a severidade da doença local e das

complicações sistêmicas (RINDERKNECHT, 1988). Portanto, a infiltração de

leucócitos e liberação de mediadores pelas células acinares apresentam um papel

central na amplificação do processo inflamatório.

Dentre os mediadores pró-inflamatórios que, acredita-se, estarem

envolvidos na patofisiologia da PA, podem-se citar: TNF-α, IL-1β, IL-6, PAF, ICAM-1

e IL-8. A expressão de vários desses mediadores é regulada pelo fator de

transcrição NF-κB (ALGUL et al., 2002; MERCURIO et al., 1999). A inibição de NF-

κB atenua a severidade ou melhora a sobrevivência em diferentes modelos

experimentais de PA (ETHRIDIGE et al., 2002; DUNN et al., 1997). TNF-α e IL-6

estão aumentadas tanto na pancreatite experimental, quanto na pancreatite humana

(DE BEAUX et al., 1996; GUKOVSKAYA et al., 1997; NORMAN et al., 1997). A

literatura relata que TNF-α apresenta um papel central no desenvolvimento da PA

severa, atuando nos estágios iniciais da doença em curso (MALLEO et al., 2007) e

IL-6 constitui o principal mediador na síntese de proteínas de fase aguda

(PAPACHRISTOU, 2008).

Os níveis de TNF-α estão elevados no início e durante o progresso da PA

experimental (BHATIA, 2002; BHATIA et al., 2005; NORMAN et al., 1995 e HIROTA

et al., 2000) e a inibição de TNF-α, assim como a neutralização do TNF-α com um

anticorpo policlonal, atenua a severidade da PA experimental (HUGHES et al., 1996;

BHATIA et al., 2005). O TNF-α pode ser determinado no plasma, bem como no

tecido pancreático (de BEAUX et al., 1996; POORAN et al., 2003).

Nesse estudo, os resultados mostram que o pré-tratamento dos ratos com

a mistura de α,β- amirina (10, 30 e 100 mg/kg) e metilprednisolona (30mg/kg)

atenuou os níveis de TNF-α sérico, assim como a expressão de TNF-α no tecido

pancreático, induzido pela administração de L-arginina.

A IL-6 possui alta especificidade e sensibilidade em distinguir a PA leve

da grave apresentando correlação com as taxas de mortalidade. Quando associada

à elevação de lipase sérica, melhora ainda mais a acurácia do diagnóstico e

prognóstico (PEZZILLI et al., 1995). Níveis plasmáticos de IL-6 correlacionam-se

com anormalidades hemodinâmicas na PA em coelhos (JAMBRIK et al., 2002).

Camundongos transgênicos que expressam IL-6 humana são mais susceptíveis a

PA, e o uso de anticorpo monoclonal anti-IL-6 exerce um efeito protetor na PA

(SUZUKI et al., 2000). Trabalhos prévios mostraram que um significativo aumento da

atividade de MPO associado ao aumento de IL-6 no pâncreas está associado à

iniciação do processo inflamatório no pâncreas, bem como que IL-6 é uma

importante citocina inflamatória no modelo de PA induzida por L-arginina

(SZABOLCS et al., 2006a).

Níveis séricos elevados de IL-6 também foram observados após a

administração de L-arginina em ratos e o pré-tratamento com a mistura de α,β-

amirina (10, 30 e 100 mg/kg) e metilprednisolona (30mg/kg) atenuou os níveis

séricos de IL-6.

A literatura mostra que muitos triterpenos pentacíclicos, que possuem

estrutura química semelhante à α,β-amirina, tais como ácido boswellico, ácido

oleanólico e ácido ursólico, exercem sua atividade antiinflamatória por inibir a

expressão de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12,

através da inibição de fatores de transcrição, como o NF-κB (BANSKOTA et al.,

2000; SYROVETS et al., 2005; SHISHODIA et al., 2003).

Estudos recentes mostraram que a mistura de α,β-amirina e a α-amirina

tem capacidade de inibir a ativação de NF-κB (MEDEIROS et al., 2007; VITOR et al.,

2008) assim como os níveis de TNF-α em modelo experimental de periodontite

aguda (HOLANDA PINTO et al., 2008).

Como a mistura de α,β-amirina foi hábil em atenuar os níveis séricos de

TNF-α e IL-6, sugere-se que a atividade deste triterpeno pentacíclico em modelo

experimental de pancreatite aguda se deve a inibição de citocinas pró-inflamatórias,

que pode ser, em parte, mediada pela inibição de NF-κB, uma vez que compostos

com estrutra química semelhante, tais como ácido boswellico, ácido oleanólico e

ácido ursólico, exercem sua atividade antiinflamatória por inibir a expressão de

citocinas pró-inflamatórias.

100

Citocinas pró-inflamatórias e endotoxinas induzem a expressão da enzima

óxido nítrico sintase (iNOS), culminando com a produção de grande quantidade de

óxido nítrico (NO) (MONCADA et al., 1991), o qual está implicado na patofisiologia

da pancreatite aguda (DIMAGNO, 2007). A iNOS pode ter um importante papel pró-

inflamatório na pancreatite (AL-MUFI et al., 1998;TSUKAHARA et al., 1996).

Estudos sugerem que a liberação de citocinas de alguns tipos de células

é dependente do dano à membrana celular mediado pelo NO (VALLETTE et al.,

1997). O aumento da produção de NO poderia, no entanto, resultar na ativação de

uma alça de alimentação positiva para as células inflamatórias, em que o NO

aumentaria a síntese de citocinas, como IL-1β e TNF-α, que por sua vez poderiam

induzir a expressão de iNOS (MARCINKIEWICZ et al., 1995).

A pancreatite aguda induzida por doses suprafisiológicas de L-arginina

induz um aumento da expressão e atividade de iNOS (SCHIELDS et al., 2006).

Hipótese, essa, consistente com a observação desse estudo que mostrou um

aumento da expressão de iNOS induzido pela administração de L-arginina e que

α,β- amirina, assim como metilprednisolona, reduzem a expressão dessa enzima.

Estudos experimentais mostraram que camundongos deficientes de iNOS

apresentam resistência para a pancreatite aguda, sugerindo um papel deletério de

iNOS/NO na patogênese dessa doença e que o L-NAME, um inibidor não específico

de NOS, significativamente previne o desenvolvimento de pancreatite aguda

(CUZZOCREA, 2002). Essas observações sugerem que α,β-amirina regula a

severidade da pancreatite indiretamente pela modulação da expressão de iNOS/NO.

A produção de NO, que ocorre como conseqüência do aumento de

expressão de iNOS, pode estar envolvida com o estresse oxidativo no pâncreas.

Assim, contribuindo para a provável iniciação e progressão da inflamação

pancreática (ANG et al., 2009).

O exato mecanismo pelo qual L-argnina leva ao desenvolvimento da PA

não está completamente esclarecido, no entanto, sabe-se que L-arginina é um

101

precursor da síntese de NO, o qual contribui para a patogenia da PA (DAWRA et al.,

2006). Nesse estudo, foi observado que L-arginina induz um aumento dos níveis de

NO, quantificado indiretamente através da produção de nitrato/nitrito.

A mistura de α,β-amirina em todas as doses testadas e metilprednisolona

(30 mg/kg) causaram uma significativa inibição na produção de nitrato/nitrito,

metabólitos estáveis do óxido nítrico cuja determinação nos flúidos biológicos tem

sido utilizada para estimar a produção de NO. Esta inibição na produção de

nitrato/nitrito evidenciada no modelo de PA induzida por L-arginina pode estar

associada a uma possível inibição da expressão de iNOS.

A interação de NO com o ânion superóxido leva a formação de

peroxinitrito, um potente agente oxidante, que, por sua vez, se decompõe em outras

espécies reativas de oxigênio, as quais reagem com resíduos de tirosina para formar

nitrotirosina (BECKMAN et al., 1992). A presença de nitrotirosina em proteínas

representa um marcador de formação endógena de peroxinitrito.

No presente estudo, a mistura de α,β-amirina em todas as doses testadas

e metilprednisolona preveniram a formação de peroxinitrito no modelo de pancreatite

aguda induzida por L-arginina, que foi evidenciado pela diminuição da expressão de

nitrotirosina nas células pancreáticas. Essa observação associada à diminuição da

produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico reforça a hipótese de que a

atividade de α,β-amirina se deve em parte por uma ação antioxidante.

Em resposta a inflamação da pancreatite aguda, pode-se observar o

desenvolvimento de edema pancreático. Nesse estudo, a L-arginina induziu a

formação de edema pancreático, evidenciado pelo aumento da relação peso do

pâncreas/peso do animal e pela análise histopatológica. A mistura de α,β-amirina

(10, 30 e 100mg/kg) e a metilprednisolona (30 mg/kg) foram hábeis em atenuar a

formação do edema.

Além das observações já relatadas a PA está associada a mudanças

histológicas, incluindo: acúmulo de flúidos, destruição da histoarquitetura das células

102

acinares, vacuolização, necrose acinar, hemorragia e infiltração neutrofílica

(SCHMIDT et al., 1992; DING et al., 2003). Relembrando a doença que acomete

seres humanos.

Estudos prévios demonstraram que a L-arginina leva ao desenvolvimento

de alterações morfológicas semelhantes as que ocorrem na pancreatite aguda, tais

como necrose das células acinares, em ratos (TAKÁCS et al.; 1996; VARGA et al.;

1997). Essas alterações podem ser pelo menos em parte mediadas pelo estresse

oxidativo pancreático (BRAGANZA, 1990).

No presente estudo, a L-arginina foi responsável pelo desenvolvimento de

alterações histológicas no tecido pancreático, tais como: edema, vacuolização das

células acinares, infiltrado inflamatório, necrose e hemorragia. A mistura de α,β-

amirina (10, 30 e 100 mg/kg) e metilprednisolona (30 mg/kg) atenuaram as

alterações histológicas observadas.

Metilprednisolona, controle positivo utilizado nesse estudo, é uma potente

glicocorticóide antiinflamatório. Estudos experimentais mostram que os

glicocorticóides atenuam a síntese, liberação e ação de citocinas inflamatórias pela

inibição da ativação do fator de transcrição NF-κB (ADOCK et al., 1994;

SCHEINMAN et al., 1995). Antagonistas de glicocorticóides amplificam o processo

inflamatório e aumentam a produção de IL-6 e TNF-α (PASZT et al., 2004; LAZAR et

al., 1992).

Nossos resultados demonstram que em relação à pancreatite aguda

induzida por L-arginina, a mistura de α,β-amirina foi capaz de reduzir de forma

significativa a resposta inflamatória aguda por mecanismos antioxidantes e de

redução da infiltração pancreática de células inflamatórias e redução da produção de

mediadores inflamatórios.

Com o intuito de caracterizar a atividade potencial da mistura de α,β-

amirina em modelos experimentais de pancreatite aguda foi avaliada a ação desses

triterpenos pentacíclicos no modelo de pancreatite aguda induzida por ceruleína.

103

A ceruleína, análogo da colecistocinina (CCK), induz pancreatite aguda

em camundongos atuando através dos receptores de colecistocinina, levando a uma

exagerada estimulação das células acinares seguida por uma prematura ativação do

tripsinogênio e degradação lisossomal de organelas intracelulares nos vacúolos

autofágicos nas células acinares, bem como por um marcado edema intersticial

(NIEDARAU et al., 1990; WISNER et al., 1988; SALUJA et al., 1985; WATANABE et

al., 1984). A ativação do tripsinogênio e de outros zimogênios são responsáveis pela

iniciação de uma série de eventos ativados por proteases. As enzimas digestivas

uma vez ativadas degradam proteínas celulares, incluindo proteínas estruturais

(como F-actin), o que eventualmente leva a uma autodigestão pancreática (CHAN &

LEUNG, 2007).

O modelo de PA induzido por doses suprafisiológicas de ceruleína é

acompanhado por danos ao tecido pancreático caracterizado por infiltrado de células

inflamatórias, vacuolização, depleção dos grânulos de zimogênio, necrose de células

acinares e edema, assim como mudanças características de parâmetros

laboratoriais, tais como, aumento da amilase e lipase séricas, aumento da atividade

de mieloperoxidase pancreática e aumento de citocinas pró-inflamatórias (MALLEO

et al., 2007; GÓMEZ et al., 2006). Alterações essas que podem ser observadas 24

horas após a administração de ceruleína (MALLEO et al., 2007). Esse modelo

reproduz as características da PA que acomete seres humanos (VAN WESTERLOO

et al., 2003).

O presente estudo demonstrou que a mistura dos triterpenos α,β-amirina

atenuam a severidade da PA induzida por ceruleína em camundongos. Em

particular, foi demonstrado que o pré-tratamento com α,β-amirina reduz a inflamação

pancreática, assim como a injúria tecidual associada, através da redução dos níveis

de amilase e lipase séricas, redução da infiltração de neutrófilos, redução da

peroxidação lipídica, melhora das alterações histológicas, redução da produção de

citocinas inflamatórias TNF-α e IL-6 e redução da expressão de TNF-α e iNOS.

O aumento sérico de amilase e lipase são observados em conseqüência

da administração de ceruleína em camundongos (E

ŞREFOĞLU et al., 2006). Essas

104

observações estão de acordo com o nosso estudo, onde após 24 horas da

administração de ceruleína em camundongos foi observada uma elevação dessas

importantes enzimas pancreáticas (DAWRA et al., 2007).

O pré-tratamento com a mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg) foi

eficaz em reduzir os níveis séricos de amilase, em resposta a administração de

ceruleína em camundongos. Os níveis séricos de lipase elevados pela administração

de ceruleína, apenas foi reduzido por α,β-amirina na dose de 100 mg/kg. Talidomida

(200mg/kg), controle positivo utilizado nesse modelo, também foi eficaz na redução

dos níveis séricos de amilase e lipase.

Uma importante característica secundária a administração de ceruleína é

o aumento do recrutamento de neutrófilos no pâncreas (SONG et al., 2002). A

atividade de MPO, indicativa de ativação e sequestro de neutrófilos, foi avaliada na

tentativa de determinar a habilidade de α,β-amirina sobre o infiltrado de células

inflamatórias.

Os resultados mostram que a mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100

mg/kg), assim como a talidomida (200 mg/kg), atenuaram a migração de leucócitos

polimorfonucleares, uma vez que reduziram a atividade de mieloperoxidase.

Resultados que indicam uma prevenção contra a infiltração neutrofílica no pâncreas

e conseqüentemente uma diminuição da injúria pancreática.

Estudos prévios mostraram que o modelo de PA induzida por ceruleína

em ratos está associado a um aumento da concentração de radicais de oxigênio e

de produtos de peroxidação lipídica nas fases iniciais do processo inflamatório

(GOUGH et al., 1990; DABROWSKI et al., 1988; SCHOENBERG et al., 1989).

Portanto, espécies reativas de oxigênio apresentam um papel importante no

desenvolvimento da PA induzida por ceruleína (EŞREFOĞLU et al., 2006). O exato

mecanismo da patogenia da PA não é claramente entendido, mas evidências

sugerem que o dano pancreático seja devido aos efeitos tóxicos de EROs (PARK et

al., 2003; DABROWISKI et al., 1999). Altas concentrações de EROs estão

associados a formação de malonilaldeído (MDA). Entretanto, a determinação de

TBARS, usada para avaliar a lipoperoxidação, reflete a quantidade de malonaldeído

105

(MDA) formado, um produto final da peroxidação dos ácidos graxos da membrana

(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001).

No presente estudo, foi observado que a ceruleína aumentou o estresse

oxidativo, como comprovado pela formação aumentada de TBARS no pâncreas, um

indicador de peroxidação lipídica. A mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg) e a

talidomida (200 mg/kg) apresentaram efeitos benéficos em relação à

lipoperoxidação, evidenciado pela redução da formação de TBARS.

A observação de que a mistura de α,β-amirina atenua o estresse oxidativo

no modelo de PA induzida por ceruleína, pela supressão de TBARS, associado à

redução do recrutamento de neutrófilos, determinado indiretamente pela atividade de

MPO, bem como as ações desses triterpenos pentacíclicos sobre a PA induzida por

L-arginina reforça a hipótese de uma atividade antioxidante para o composto em

questão. Atividade, essa, consistente com o que a literatura relata para conhecidas

substâncias antioxidantes, tais como: melatonina, N-acetilcisteína e ácido ascórbico,

que apresentam efeitos promissores no modelo de PA induzida por ceruleína

(BARLAS et al., 2004; JAWOREK et al., 2003; GOMEZ-CAMBRONERO et al.,

2000).

Estudos realizados com a mistura de α,β- amirina e com α-amirina

observou-se a capacidade dessas substâncias em inibir o NF-κB (MEDEIROS et al.,

2007; VITOR et al., 2008). N-acetilcisteína, raxofelast e ditiocarbamato de pirrolidina,

agentes antioxidantes, são eficientes inibidores da ativação do fator de transcrição

NF-κB em modelos animal de pancreatite (RAKONCZAY et al., 2008). Contudo, a

atividade de α,β-amirina em melhorar a PA induzida por ceruleína se deve em parte

por uma ação antioxidante e conseqüente supressão de NF-κB.

EROs levam a um aumento da expressão de TNF-α no modelo de PA

induzida por ceruleína secundariamente a ativação do fator de transcrição NF-κB

(KIM et al., 2000). TNF-α apresenta um papel central no desenvolvimento da PA e

IL-6 constitui o principal mediador na síntese de proteínas de fase aguda (MALLEO

106

et al., 2007; PAPACHRISTOU, 2008). Caracterizando a importância do estudo

dessas citocinas em modelos experimentais de PA.

Os resultados mostram que o pré-tratamento dos camundongos com a

mistura de α,β-amirina (10, 30 e 100 mg/kg) e talidomida (200 mg/kg) atenuaram o

aumento de TNF-α e IL-6 séricos secundários à administração de ceruleína, assim

como reduziram a expressão de TNF-α no tecido pancreático, avaliado por técnica

de imunohistoquímica.

A pancreatite aguda induzida por doses suprafisiológicas de ceruleína

induz um aumento da expressão e atividade de iNOS (ANG, et al., 2009). Relato

consistente com a observação desse estudo que mostrou um aumento da expressão

de iNOS induzido pela administração de ceruleína e que α,β-amirina, assim como

talidomida reduzem a expressão dessa enzima.

As EROs, enzimas pancreáticas ativadas, citocinas e neutrófilos estão

associados ao aumento da permeabilidade capilar e formação de edema

(DABROWSKI et al., 1999). O edema pancreático foi determinado nesse estudo pelo

aumento da razão entre o peso do pâncreas/peso do animal. A ceruleína apresentou

habilidade em induzir a formação de edema pancreático, o qual foi atenuado pela

mistura de α,β-amirina (30 e 100mg/kg) e pela talidomida (200 mg/kg). O edema

pancreático, assim como outras alterações no tecido pancreático, pode ser

confirmado por histologia. No presente estudo, a ceruleína foi responsável por

alterações histológicas do tecido pancreático, tais como edema, vacuolização das

células acinares, infiltrado inflamatório e necrose. A mistura de α,β-amirina (100

mg/kg) e talidomida (200 mg/kg) atenuaram as alterações histológicas observadas.

Nossos resultados demonstram que assim como na PA induzida por L-

arginina, na PA induzida por ceruleína, a mistura de α,β-amirina reduziu de forma

significativa a resposta inflamatória aguda por mecanismos antioxidantes e de

redução da infiltração pancreática de células inflamatórias e redução da produção de

mediadores inflamatórios.

107

Muitos triterpenóides com atividade antiinflamatória, derivados de plantas,

incluindo derivados do oleanano e ursano foram descritos previamente por atuarem

como inibidores competitivos de serina proteases, tripsina e quimiotripsina, que

apresentam um papel chave no desenvolvimento da pancreatite aguda (RAJIC et al.,

2001; GRANGER & REMICK, 2005). Efeito esse pode também estar envolvido na

atividade da mistura de α,β-amirina no modelo de PA, uma vez que essa mistura de

triterpenos apresenta semelhança estrutural aos triterpenos oleanano e ursano,

contudo estas atividades ainda precisam ser pesquisadas.

Talidomida, o controle positivo usado nesse modelo é um derivado

sintético do ácido glutâmico que inibe a produção de TNF-α, modula a adesividade

microvascular, através da modificação das moléculas de adesão da superfície

celular e suprime a atividade de NF-κB (SAMPAIO et al., 1991; MOREIRA et al.,

1993; YASUI et al., 2005). Talidomida mostrou melhora da lesão pancreática

similarmente a mistura de α,β-amirina. Esse achado está de acordo com as

observações de Malleo et al. (2007) que mostrou a eficácia de talidomida no modelo

de pancreatite aguda experimental induzida por ceruleína.

Tanto na PA induzida por L-arginina, quanto na PA induzida por ceruleína

foram observadas alterações bioquímicas (aumento sérico de amilase, lipase, IL-6 e

TNF-α, aumento de MPO, TBARS e nitrato/nitrito) e histológicas (edema, infiltrado

inflamatório, vacuolização, necrose e hemorragia) características de processo

inflamatório, as quais foram significativamente atenuadas pelo pré-tratamento com a

mistura de α,β-amirina, esses achados ampliam o espectro das ações

antiinflamatórias e antioxidantes já estudadas para o composto em questão.

Estudos mostram que a inervação neural do pâncreas pode exercer um

papel importante da iniciação e manutenção da resposta inflamatória na injúria

pancreática. O pâncreas é inervado pelo vago, neurônios simpáticos e

parassimpáticos assim como neurônios sensoriais (NIEBERGALL-ROTH & SINGER,

2001). A ativação de neurônios sensoriais primários pancreáticos causa a liberação

de neuropeptideos vasoativos e inflamatórios, como bradicinina, CGRP e substância

P, responsáveis pelo extravasamento plasmáticos e infiltração neutrofílica

(KIRCHGESSNER & LIU, 2000; LARSSON, 1979; SEIFERT et al., 1985). Os

neurônios sensoriais primários do pâncreas expressam receptores TRPV1 cuja

108

ativação induz inflamação pancreática (LIDDLE, 2007). O bloqueio desses

receptores, pela capzasepina, melhora significativamente a pancretite experimental

(NATHAN et al., 2001).

Apesar de não ter sido objetivo deste trabalho o estudo do envolvimento

dos receptores TRPV1 na ação da mistura de α,β-amirina nos modelos de

pancreatite, estudos preliminares realizados em nosso laboratório demonstraram

que esta mistura de triterpenos é capaz de inibir os receptores TRPV1 em modelo

experimental de inflamação e nocicepção visceral (LIMA-JÚNIOR et al., 2006 e

2007). Possivelmente o bloqueio dos receptores TRPV1 pela mistura de α,β-amirina

pode está auxiliando na sua ação antiinflamatória na pancreatite experimental,

contudo experimentos são necessários para comprovar esta participação.

Apesar da relevância da PA, não existe um tratamento eficaz para essa

doença. Contudo, pesquisas, utilizando produtos naturais (extratos de plantas,

componentes como flavonóides, triterpenos, antraquinonas, dentres outros) têm sido

realizadas na busca de novas estratégias terapêuticas para a doença. A literatura

relata que esses compostos apresentam atividade na PA por mecanismos que

envolvem atenuação de alterações histológicas, diminição da atividade de MPO,

inibição da ativação de NF-κB, redução dos níveis séricos de amilase, lipase, IL-6 e

TNF-α e inibição de proteases. Nesse trabalho vimos que a mistura de α, β-amirina

atenua a severidade da PA por mecanismos semelhantes aos já estudados para

outros compostos naturais. Entretanto, pode-se sugerir que esses compostos podem

contribuir para o desenvolvimento de drogas terapêuticas para o tratamento da PA,

uma vez que eles atenuam importantes alterações observadas em modelos

experimentais de PA.

Estudos futuros poderão ser realizados para caracterizar a atividade

desses triterpenos pentacíclicos em relação aos mecanismos nociceptivos

envolvidos, uma vez que a dor em decorrência da PA é bastante intensa e de difícil

tratamento, representando uma relevante característica clínica dessa doença.

109

8. CONCLUSÕES

 Este trabalho reproduziu o modelo de pancreatite aguda induzida por L-

arginina e por ceruleína descrito na literatura evidenciado por alterações

bioquímicas, inflamatórias e histopatológicas;

 A mistura de α,β-amirina reduziu a resposta inflamatória nos modelos de

pancreatite aguda induzido por L-arginina e por ceruleína, o que foi

evidenciado através de alterações bioquímicas (amilase e lipase) e

histopatológicas. Apesar de ter representado uma diferença significativa

(p<0,05), a amilase sérica foi pouco afetada nos dois modelos. A lipase sérica

sofreu uma grande elevação em resposta à administração de L-arginina;

 Foi observado um aumento do recrutamento de neutrófilos em decorrência da

administração de L-arginina e ceruleína, evidenciado através da determinação

da atividade de MPO e análise histopatológica, o qual foi atenuado em virtude

do pré-tratamento com a mistura de α,β-amirina. A redução da atividade de

MPO pode ser interpretada como uma manifestação de atividade

antioxidante, o aumento da atividade de MPO foi um dos parâmetros mais

afetados na PA induzida por ceruleína;

 A mistura de α,β-amirina atenuou todos os parâmetros avaliados em ambos

os modelos experimentais de pancreatite aguda, por seu potente efeito

antiinflamatório e antioxidante;

 A mistura de α,β-amirina demonstrou atividade antiinflamatória nos modelos

de pancreatite aguda induzida por L-arginina e ceruleína através da redução

dos níveis séricos de citocinas inflamatórias (TNF-α e IL-6). E redução da

expressão tecidual de TNF-α;

110

 A mistura de α,β-amirina foi eficaz em reduzir a expressão de iNOS em

ambos os modelos experimentais, sugerindo que a atividade antiinflamatória

desse triterpeno possa ser secundária a inibição de citocinas e iNOS;

 No modelo de pancreatite aguda induzida por L-arginina foi observado um

aumento de óxido nítrico, quantificado indiretamente através da determinação

de nitrato/nitrito. A mistura de α,β-amirina foi eficaz em atenuar os níveis de

nitrato/nitrito. Sugerindo que a inibição de iNOS/NO esteja envolvido na

atividade antiinflamatória de α,β-amirina;

 No modelo de pancreatite aguda induzida por L-arginina, a mistura de α,β-

amirina significativamente reduziu a formação de peroxinitrito, quantificado

indiretamente por imunohistoquímica a partir da expressão de nitrotirosina no

tecido pancreático. Evidência que reforça uma possível atividade antioxidante

para este composto;

 Foi observado que a mistura de α,β-amirina atenuou o edema inflamatório

formado em resposta a administração de L-arginina e ceruleína;

 L-arginina e ceruleína levaram a mudanças significativas da histologia

pancreática, como: vacuolização, edema, necrose, infiltrado inflamatório e

hemorragia. A mistura de α,β-amirina foi eficaz em atenuar essas alterações;

 A partir dos dados apresentados, Conclui-se, que a atividade da mistura de

α,β-amirina seja devida a uma atividade antioxidante e antiinflamatória desse

composto, como evidenciado pela redução de: recrutamento de neutrófilos,

peroxidação lipídica, citocinas inflamatórias e iNOS;

 Esse trabalho demonstrou a habilidade da mistura de α,β-amirina em

melhorar a PA experimental induzida tanto por L-arginina quanto por

ceruleína. A demonstração da atividade desse composto nos dois modelos é

importante uma vez que a L-arginina na dose utilizada é responsável apenas

por complicações locais envolvidas na PA, enquanto que a PA induzida por

ceruleína está também associada a complicações sistêmicas.

111

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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