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Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Fisiologia e Biofísica
Aline Alves Lara
REMODELAMENTO MOLECULAR EM CARDIOMIÓCITOS DE CAMUNDONGOS
DEFICIENTES EM TRANSPORTADOR VESICULAR DE ACETILCOLINA
Belo Horizonte
2009
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LL
Aline Alves Lara
REMODELAMENTO MOLECULAR EM CARDIOMIÓCITOS DE CAMUNDONGOS
DEFICIENTES EM TRANSPORTADOR VESICULAR DE ACETILCOLINA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas –
Fisiologia e Farmacologia da Universidade
Federal de Minas Gerais como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Orientadora: Profª. Drª. Silvia Guatimosim
Belo Horizonte
2009
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LLL
“O Senhor é meu pastor e nada me faltará”
LY
AGRADECIMENTOS
Meu muito obrigada!
A Deus por ter me presenteado com tantas pessoas especiais:
Silvia, minha orientadora, pessoa que admiro e respeito, exemplo de
profissionalismo e dedicação, simplicidade e amizade;
Meus colegas de laboratório que fazem do nosso ambiente de trabalho um lugar
harmonioso:
Fabrício, que me deu a mão e me ajudou a vencer o primeiro desafio;
Diogo, pelo coleguismo;
Keninha, Aline, Taty, Na, Edy, Ló, Camilinha, amigas para toda a vida;
Lucas, pela amizade;
Sheila, pelo ensinamento e compreensão;
Tia Tânea, por comprar minhas brigas;
Tia Debrinha e Ju, minha segunda família;
Enéas, meu companheiro de todas as horas;
Meus irmãos, pelo apoio e carinho;
Meus sobrinhos, alegria da minha vida;
Meus pais, pela coragem e determinação, por entenderem a minha ausência.
Y
AGRADECIMENTOS AOS COLABORADORES
De modo especial:
Aos Professores Marco Antônio Máximo Prado e Vânia Ferreira Prado, que
desenvolveram o modelo VAChT KD
HOM
.
Ao Professor Alvair Pinto de Almeida e ao aluno Dênis Derly Damasceno, que
realizaram os experimentos de coração isolado em sistema de Langerndorff.
Ao Professor Robert Gros, pelas medidas hemodinâmicas in vivo.
Ao Professor Anderson Ferreira, pelas análises histológicas.
A aluna Raquel Sirvente, pela realização dos experimentos de eco cardiografia.
Aos Professores Rodrigo Ribeiro Resende e Rita Pires, pelos experimentos de PCR
em tempo real.
YL
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
A
260
= absorbância no comprimento de onda de 260 nanômetro
ACh = acetilcolina
ACh
cito
= acetilcolina citosólica
AChE = acetilcolinesterase
ACh
ves
= acetilcolina vesicular
AMPc = monofosfato cíclico de adenosina
ANP = peptídeo natriurético atrial
BNP = peptídeo natriurético cerebral
bpm = batimentos por minuto
BSA = albumina de soro bovino (do inglês Bovine Serum Albumin)
Ca
2+
= íon cálcio
cDNA = DNA complementar
ChAT = colina acetiltransferase
ChT1= transportador de colina de alta afinidade
CT = ciclos (do inglês cycle threshold)
DAPI = 4’, 6-diamindino-2-fenilindol
DMEM = meio de cultura (do inglês Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium)
DNA= ácido desoxirribonucleico
DNase = deoxirribonuclease
EDTA-2Na = Ethylenediaminetetraacetic acid
f = fator de diluição
F/F
0
= fluorescência máxima/fluorescência mínima
FC = freqüência cardíaca
Fluo-4/AM = Flúor 4 aceto-metil-éster
G
i/0
= proteína G inibitória
H
+
ves
= próton vesicular
HF = do inglês high-frequency power
HRP = do inglês horseradish peroxidase
IgG = imunoglobulina G
IM = infarto do miocárdio
ISO = isoproterenol
LF = do inglês low-frequency power
YLL
M
1
= receptor muscarínico do tipo M
1
M
2
= receptor muscarínico do tipo M
2
M
2
-KO = knockout para o receptor muscarínico M
2
M
3
= receptor muscarínico do tipo M
3
M
4
= receptor muscarínico do tipo M
4
M
5
= receptor muscarínico do tipo M
5
MgCl
2
= cloreto de magnésio
M-MLV RT = do inglês Minus
Moloney murine leukemia virus-reverse transcriptase
Na
3
VO
4
= ortovanadato
NaCl = cloreto de sódio
NaF = fluoreto de sódio
PBS = tampão fosfato-salino (do inglês Phosphate buffered saline)
PBS-T = tampão fostato-salino com tween20 (do inglês Phosphate buffered saline
tween-20)
PCR = reação em cadeia de polimerase (do inglês polymerase chain reaction)
PFA = paraformaldeído
PKA = proteína quinase A
PKC = proteína quinase C
PLN = fosfolamban
PMSF = Phenylmethylsulphonyl fluoride
P-PLN = fosfolamban fosforilada
PVDF = membrana de Polyvinylidene fluoride
RA = receptor adrenérgico
RM = receptor muscarínico
RNA = ácido ribonucleico
RNAm = RNA mensageiro
RNase = ribonuclease
SDS = dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE = gel de acrilamida (do inglês sodium dodecyl (lauryl) sulfate-
poliacrilamida)
Ser = serina
SERCA = ATPase-Ca
2+
do retículo sarcoplasmático
SNA = sistema nervoso autonômico
YLLL
T50 = tempo gasto para que o pico do transiente decaia em 50% do seu valor
máximo
u.a. = unidade arbitrária
VAChT = transportador vesicular de acetilcolina
VAChT KD
HOM
= knockdown homozigoto para o VAChT
VAChT KD
HOM
PIR= VAChT KD
HOM
tratado com piridostigmina
vAPTase = ATPase vacuolar do tipo V
VMAT = transportadores vesiculares monoaminas
ȕ
1
= receptor ȕ
1
adrenérgico
ȕ-MHC = cadeia pesada de miosina
L[
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Desenho esquemático da neurotransmissão colinérgica. A ACh é
sintetizada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT) e armazenada em
vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). Com a
exocitose, o neurotransmissor pode se ligar a receptores pré e pós-sinápticos.
Após ser rapidamente degradada pela acetilcolinesterase (AChE), a colina é
novamente recaptada para o terminal pré-sináptico pelo transportador de colina de
alta afinidade (ChT1). Fonte: MARTINS- SILVA, 2008, p.3 .........................................4
Figura 2 – Esquema representativo da vesícula sináptica. O transportador
vesicular de acetilcolina (VAChT) usa o gradiente químico produzido pela ATPase
vacuolar do tipo V (vATPase) para transportar acetilcolina do citosol colinérgico
pré-sináptico (ACh
cito
) para o interior da vesícula sináptica (ACh
ves
), trocando dois
prótons (H
+
ves
) por uma molécula de ACh. Fonte: LIMA, 2008, p.5..............................6
Figura 3 – Razão entre o peso do coração (mg) e o comprimento da tíbia (mm) de
camundongos WT e VAChT KD
HOM
.............................................................................18
Figura 4 – Medida da área celular dos cardiomiócitos dos camundongos WT e
VAChT KD
HOM
. .............................................................................................................19
Figura 5 – PCR em tempo real comparando a expressão do RNAm dos genes que
codificam ANP, BNP e ß-MHC em miócitos ventriculares de camundongos WT e
VAChT KD
HOM
.) ............................................................................................................20
Figura 6 – Transiente de Ca
2+
. A-Imagem representativa obtida através da
microscopia confocal. Cardiomiócitos foram submetidos a estimulação elétrica (1
Hz). B-Amplitude do transiente de Ca
2+
em miócitos ventriculares de camundongos
WT e VAChT KD
HOM
. C-Cinética do decaimento do pico do transiente de Ca
2+
em
miócitos ventriculares de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. ....................................21
Figura 7 – Porcentagem de encurtamento dos miócitos ventriculares isolados de
animais WT e VAChT KD
HOM
. ......................................................................................22
Figura 8 – Níveis de expressão da SERCA encontrados no coração de
camundongos WT e VAChT KD
HOM
. ............................................................................23
Figura 9 – Níveis de expressão e fosforilação da PLN. A-Expressão da PLN nos
corações de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. B-Nível de fosforilação da PLN
nos corações de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. .................................................24
Figura 10 – PCR em tempo real. A-Nível de expressão de RNAm do gene que
codifica o receptor muscarínico M
2
nos corações dos camundongos WT e VAChT
KD
HOM
. B-Nível de expressão do RNAm do gene que codifica o receptor ȕ
1
adrenérgico nos corações dos animais WT e VAChT KD
HOM
.......................................25
[
Figura 11 – PCR em tempo real comparando a expressão do RNAm dos genes
que codificam receptores muscarínicos em cardiomiócitos dos animais WT e
VAChT KD
HOM
. .............................................................................................................26
Figura 12 – Razão entre o peso do coração (mg) e o comprimento da tíbia (mm) de
animais WT, VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. ......................................................27
Figura 13 – Medida da área celular dos cardiomiócitos dos camundongos WT,
VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR.............................................................................28
Figura 14 – PCR em tempo real comparando a expressão do RNAm dos genes
que codificam ANP, BNP e ß-MHC em cardiomiócitos dos animais WT, VAChT
KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR ........................................................................................29
Figura 15 – Transiente de Ca
2+
. A-Imagem representativa obtida através da
microscopia confocal. Cardiomiócitos foram submetidos a estimulação elétrica (1
Hz). B-Amplitude do transiente Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos WT,
VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. C-Cinética do decaimento do pico do
transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos WT, VAChT KD
HOM
e
VAChT KD
HOM
PIR........................................................................................................30
Figura 16 – PCR em tempo real. A-Expressão do RNAm do gene que codifica o
receptor muscarínico M
2
nos corações dos animais WT, VAChT KD
HOM
e VAChT
KD
HOM
PIR. B- Expressão do RNAm do gene que codifica o receptor ȕ
1
adrenérgico nos corações dos animais WT, VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. ......31
Figura 17 – Razão entre o peso do coração (mg) e o comprimento da tíbia (mm) de
animais WT e VAChT KD
HOM
com seis meses de vida ................................................32
Figura 18 – Medida da área celular dos cardiomiócitos dos animais WT e VAChT
KD
HOM
com seis meses de vida....................................................................................33
Figura 19 – Transiente de Ca
2+
. A-Imagem representativa obtida através da
microscopia confocal. Cardiomiócitos foram submetidos a estimulação elétrica (1
Hz). B-Amplitude do pico do transiente Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos
WT e VAChT KD
HOM
. C-Cinética do decaimento do pico do transiente de Ca
2+
em
cardiomiócitos de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. ...............................................34
Figura 20 – Porcentagem de encurtamento dos miócitos ventriculares isolados de
animais WT e VAChT KD
HOM
com seis meses de vida. ...............................................35
[L
RESUMO
Introdução: A função cardíaca é regulada pelo Sistema Nervoso Autônomo,
e apesar de ser bem conhecido o papel da hiperatividade simpática no
desenvolvimento de insuficiências cardíacas, muito pouco se sabe sobre a
participação do tônus parassimpático nesse processo. Recentemente, foi
desenvolvido um modelo de disfunção colinérgica, o camundongo VAChT KD
HOM
,
esse camundongo apresenta aproximadamente 70% de redução nos níveis de
VAChT, o transportador vesicular de acetilcolina (ACh), a proteína responsável pelo
empacotamento de ACh nas vesículas secretórias, tornando possível uma maior
investigação do papel da atividade colinérgica no coração. Objetivo: Investigar a
disfunção cardíaca do camundongo VAChT KD
HOM
no plano celular. Métodos e
Resultados: Foram utilizados camundongos WT e VAChT KD
HOM
com 10 e 12
semanas ou seis meses de vida. Para confirmar o papel da estimulação colinérgica
nos efeitos observados os camundongos VAChT KD
HOM
com 12 semanas foram
tratados com piridostigmina (VAChT KD
HOM
PIR). Para análise do Ca
2+
intracelular,
cardiomiócito isolados foram incubados com sonda Flúor 4-AM e as imagens de
fluorescência obtidas em microscopia confocal. Foi observada uma diminuição
significativa no pico e na velocidade de decaimento do pico do transiente de Ca
2+
nos cardiomiócitos dos camundongos VAChT KD
HOM
quando comparados às células
dos camundongos WT e VAChT KD
HOM
PIR. A disfunção no Ca
2+
foi condizente com
a redução na contratilidade celular observada nos cardiomiócitos dos camundongos
VAChT KD
HOM
. O tratamento com piridostigmina também reverteu os altos níveis de
RNAm para os genes que codificam ANP, BNP, ȕ-MHC e receptor muscarínico M2
nos miócitos ventriculares dos camundongos VAChT KD
HOM
, sem interferir nos
baixos níveis de RNAm para o gene que codifica receptor ȕ1-adrenérgico. Para
análise de proteínas, foi realizada a técnica de Western Blot. Corroborando os dados
do transiente de Ca
2+
, os corações dos camundongos VAChT KD
HOM
apresentaram
uma diminuição na expressão da SERCA e na fosforilação da PLN quando
comparado ao WT. Estudos feitos com camundongos com seis meses de vida
mostraram que os camundongos VAChT KD
HOM
quando comparados aos WT
apresentaram hipertrófica cardíaca, quando avaliada a razão entre o peso do
coração e o comprimento da tíbia, e a área celular. No entanto, a disfunção na
sinalização e na contratilidade celular foi semelhante nas duas fases da vida
estudadas. Conclusões: A disautonomia causada pela redução da atividade
parassimpática, devido à diminuição na expressão do VAChT, causa disfunção
cardíaca, caracterizada por alterações na expressão gênica e na sinalização
intracelular de Ca
2+
e disfunção contrátil.
Palavras Chave: VAChT, Ca
2+
, Cardiomiócito
[LL
ABSTRACT
Introduction: The cardiac function is regulated by autonomic nervous system, and
despite much is known about the role of sympathetic overactivation in development
of heart failure, much less is known about the involvement of the parasympathetic
tone this process. Recently generated transgenic model of cholinergic dysfunction,
the VAChT KD
HOM
mouse presented approximately 70% reduction in the levels of
VAChT, the vesicular acetylcholine (ACh) transporter, the protein responsible for
packaging of ACh in secretory vesicles. This new transgenic mouse model made
possible the investigation of the consequences of reduced cholinergic activity in the
heart. Objective: To investigate cardiac function in VAChT KD
HOM
mouse at the
cellular level. Methods and Results: We used WT and VAChT KD
HOM
mice with 10
and 12 weeks or six months of life. To investigate the role of cholinergic tone in the
observed results, VAChT KD
HOM
mice with 12 weeks were treated with
pyridostigmine (VAChT KD
HOM
PYR). To analyze intracellular Ca
2+
, isolated
cardiomyocytes were performed in Fluo 4-AM loaded cells and fluorescence images
were obtained by using a confocal microscope. VAChT KD
HOM
cardiomyocytes
developed significantly smaller and slower intracellular Ca
2+
transients than WT and
VAChT KD
HOM
PIR cells. The Ca
2+
dysfunction observed in cardiomyocytes from
VAChT KD
HOM
mice explains the reduction in cellular contractility observed in these
cells. Pyridostigmine-treatment of VAChT KD
HOM
mice also reversed mRNA levels
encoding ANP, BNP, ȕ-MHC and M2-muscarinic receptor in ventricular myocytes,
without any effect on mRNA levels of ȕ1-adrenergic receptor. To assess protein
expression levels Western Blot experiments were carried out. Corroborating the Ca
2+
transient data, hearts of VAChT KD
HOM
mice presented a reduction in SERCA
expression levels, and lower PLN phosphorylation than WT hearts. The study
performed with six-months old mice showed that hearts from VAChT KD
HOM
mice
present cardiac hypertrophy when compared to WT hearts, when evaluated the tibia
length and body weight ratio and cardiomyocyte cell area. Cardiomyocytes from 6
month-old VAChT-KD
HOM
mice also presented contractile and Ca
2+
signaling
dysfunction when compared to WT cells. Conclusions: Dysautonomy caused by
decreased parasympathetic activity, due to reduced VAChT expression, causes
cardiac dysfunction, characterized by changes in cardiac gene expression and
intracellular calcium handling and contractility dysfunction.
Key-words: VAChT, Ca
2+
, Cardiomyocyte
[LLL
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 01
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 03
2.1. ACETILCOLINA ............................................................................................ 03
2.2. TRANSPORTADOR VESICULAR DE ACETILCOLINA (VAChT) ................. 05
2.3. DISAUTONOMIA E A FUNÇÃO CARDÍACA ................................................ 06
2.4. CAMUNDONGO VAChT KD
HOM
: UM MODELO DE DISFUNÇÃO
COLINÉRGICA.............................................................................................. 09
2.5. VAChT KD
HOM
APRESENTA DISFUNÇÃO CARDÍACA ............................... 09
3. OBJETIVOS......................................................................................................... 11
3.1. OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 11
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 11
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 12
4.1. ANIMAIS E TRATAMENTO........................................................................... 12
4.2.
ISOLAMENTO DOS CARDIOMIÓCITOS VENTRICULARES
............................... 12
4.3.
TRANSIENTE DE CÁLCIO E ENCURTAMENTO DO CARDIOMIÓCITO
.............. 12
4.4.
WESTERN BLOT
............................................................................................ 13
4.5.
MEDIDA DO TAMANHO DO CORAÇÃO
........................................................... 14
4.6.
IMUNOFLUORESCÊNCIA E ÁREA CELULAR....................................................... 14
4.7. EXTRAÇÃO DE RNA, TRANSCRIÇÃO REVERSA E PCR EM TEMPO
REAL ............................................................................................................ 15
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................... 17
5. RESULTADOS..................................................................................................... 18
5.1. MEDIDAS DE TAMANHO DO CORAÇÃO E ÁREA CELULAR .................... 18
5.2. MARCADORES DE ESTRESSE CARDÍACO............................................... 19
5.3. ANÁLISE DA SINALIZAÇÃO DE Ca
2+
.......................................................... 20
5.4. PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NO ACOPLAMENTO EXCITAÇÃO-
CONTRAÇÃO................................................................................................ 22
5.5. RECEPTORES MUSCARÍNICO M
2
E ȕ-1ADRENÉRGICO.......................... 24
5.6. ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA VIA INIBIDOR DE COLINESTERASE....... 26
5.7. ANIMAIS VAChT KD
HOM
COM SEIS MESES DE VIDA................................. 31
6. DISCUSSÃO........................................................................................................ 36
7. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 40
8. REFERÊNCIAS.................................................................................................... 41
1
1. INTRODUÇÃO
Nas doenças cardiovasculares está bem estabelecida a influência da
superatividade simpática (THAYER & LANE, 2005), mas pouco se sabe sobre o papel
do tônus colinérgico na manutenção da função cardíaca. Estudos sugerem que o
desbalanço autonômico pode contribuir para o mau funcionamento do miocárdio
(OKOSHI e cols., 2004), e que a disfunção parassimpática pode preceder a
hiperatividade simpática na insuficiência cardíaca (AMORIM e cols., 1981).
Estudos recentes demonstraram que camundongos knockout para o receptor M
2
(M
2
-KO) apresentam maior susceptibilidade ao estresse cardíaco, sugerindo um
possível papel protetor do sistema nervoso parassimpático no coração (LACROIX e
cols., 2008). Corroborando essa hipótese, a estimulação vagal tem mostrado ser
benéfica na insuficiência cardíaca (LI e cols., 2004). No entanto, os mecanismos
envolvidos nesta cardioproteção, assim como a influência do parassimpático na
contração ventricular, ainda são pouco conhecidos. Isso se deve, parcialmente, a falta
de modelos animais que apresentem disfunção colinérgica, uma vez que alterações
crônicas na liberação de acetilcolina (ACh) podem ser letais.
Recentemente, PRADO e colaboradores (2006) desenvolveram um modelo
animal de disfunção colinérgica, o camundongo VAChT knockdown homozigoto -
VAChT KD
HOM
. Esse camundongo apresenta diminuição na expressão do transportador
vesicular de acetilcolina (VAChT), uma proteína responsável pelo empacotamento
desse neurotransmissor em vesículas secretórias. A redução na expressão do VAChT,
nesses camundongos, levou a uma diminuição na liberação de ACh, com conseqüentes
distúrbios neuromusculares e alterações cognitivas.
Neste trabalho utilizamos esse modelo transgênico para investigar como a
redução crônica da neurotransmissão colinérgica afeta a fisiologia cardíaca, com um
foco maior para o cardiomiócito ventricular. Adicionalmente, testamos a hipótese de que
o aumento da atividade colinérgica poderia reverter as alterações cardíacas observadas
no camundongo VAChT KD
HOM
. Os dados encontrados aqui mostram que a perda do
2
tônus colinérgico leva a insuficiência cardíaca e a um remodelamento patológico do
miócito ventricular, sugerindo uma ação protetora do tônus colinérgico no coração.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. ACETILCOLINA
Desde o início do século passado, já era conhecida a atividade vaso depressora
da acetilcolina e a capacidade desta molécula em estimular nervos parassimpáticos
(DALE e cols., 1914). Entretanto, foi somente em 1921 que a ACh foi identificada como
um neurotransmissor (LOEWI, 1921).
A ACh é o neurotransmissor das junções neuromusculares, do sistema nervoso
autônomo e de alguns neurônios do sistema nervoso central. No sistema nervoso
autônomo, ACh é o transmissor das fibras pré e pós-ganglionares parassimpáticas e
das fibras pré-ganglionares simpáticas, controlando inúmeras funções mantenedoras da
homeostase como a contração da musculatura gástrica, ritmo cardíaco e secreções de
alguns hormônios. No sistema nervoso central, a ACh parece estar envolvida em
processos cognitivos como atenção, memória, aprendizado e vigília (PEPEU e
GIOVANINNI, 2004).
A biossíntese da ACh ocorre no citosol do terminal dos neurônios colinérgicos
onde a colina é acetilada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT) utilizando acetil-
CoA como doador de grupo acetil. O substrato acetil-CoA, proveniente da produção de
glicose, é uma substância presente em todas as células. Por outro lado, a colina não
pode ser sintetizada novamente pelos tecidos nervosos. A fonte de colina para as
células neurais vem principalmente da dieta e é entregue às células nervosas pela
corrente sangüínea (SCAGNELLI e cols., 1991). A outra fonte de colina é a
fosfatidilcolina presente na membrana celular, porém a utilização desse fosfolípide
pelas células neurais é baixa (BLUSZTAJN e cols., 1987). Depois de sintetizada, a
acetilcolina é armazenada em vesículas pré-sinápticas pela ação do transportador
vesicular de acetilcolina (VAChT). Após ser exocitada, a ACh é rapidamente degradada
na fenda sináptica pela enzima acetilcolinesterase (AChE), sendo a colina recaptada
para o terminal pré-sináptico pelo transportador de colina de alta afinidade, ChT1
(PRADO e cols., 2002; PRADO e cols., 2006) (Fig.1).
4
Figura 1: Desenho esquemático da neurotransmissão colinérgica. A ACh é
sintetizada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT) e armazenada em vesículas
sinápticas pelo transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). Com a exocitose, o
neurotransmissor pode se ligar a receptores pré e pós-sinápticos. Após ser rapidamente
degradada pela acetilcolinesterase (AChE), a colina é novamente recaptada para o
terminal pré-sináptico pelo transportador de colina de alta afinidade (ChT1). Fonte:
MARTINS-SILVA, 2008, p.3.
Uma rica inervação colinérgica é encontrada no nodo sinoatrial, miocárdio atrial,
nodo atrio-ventricular e no sistema de condução de muitas espécies animais (KENT e
cols., 1974). Embora pouco abundante, as fibras parassimpáticas são também
encontradas por todo ventrículo (NAGATA e cols., 2000). O controle do sistema nervoso
parassimpático no coração é mediado pela estimulação dos receptores muscarínicos
ACh
ACETYL-CoA + CHOLINE
Choline
acetyltransferase
ACh
ATP
PG
2 H
+
Post-synaptic
receptors
Ca
2+
ACh
ATP
ACETATE
CHOLINE
Na
+
Pre-synaptic
receptor
Ca
2+
Channel
AChE
Endosome
Cholinergic
synapse
ACh
ATP
ChT1
VAChT
5
M
2
. Esses receptores são acoplados as proteínas G
i/o
, tendo como resposta à ACh,
inibição da adenilato ciclase, contrapondo-se assim a via de sinalização dependente de
AMPc – PKA (LANZAFAME e cols., 2003). G
i/o
também aumenta diretamente a
atividade dos canais de potássio, resultando na hiperpolarização dos nodos sinusal e
atrio-ventricular (SZABO e OTERO, 1989). Recentemente, estudos indicam que a
atividade parassimpática via estimulação de receptores M
2
pela ACh inibe canais de
Ca
2+
do tipo L, causando redução da contratilidade dos miócitos ventriculares (NAGATA
e cols., 2000; VALENZUELA e cols., 1997).
2.2. TRANSPORTADOR VESICULAR DE ACETILCOLINA (VAChT)
O VAChT é uma glicoproteína de vesículas sinápticas que apresenta 12
domínios transmembrana e possui homologia com os transportadores vesiculares
monoaminas (VMATs) (AFONSO e cols., 1994). Assim como o VMAT e outros
transportadores vesiculares, o VAChT troca dois prótons por uma molécula de ACh
citoplasmática (Fig.2), sendo por conseguinte dependente de um gradiente
eletroquímico. Entretanto, estes transportadores dependem mais do gradiente químico
do que do gradiente elétrico, ou seja, requerem mais prótons do que movimentos de
cargas (EDWARDS, 2007). Estudos utilizando vesículas sinápticas de Torpedo
californica, mostraram a presença de uma ATPase vacuolar do tipo V que acidifica as
vesículas, gerando o gradiente eletroquímico necessário para o VAChT transportar ACh
(ANDERSON e cols., 1983; NGUYEN e cols., 1998). BARBOSA e colaboradores (1999)
identificaram e caracterizaram o gene do VAChT de camundongo, que mostrou alta
homologia à seqüência do transportador de rato (98%) e humano (95%). Também foi
demonstrado que o VAChT é fosforilado por PKC e que alterações na sua atividade
podem influenciar a sensibilidade dos neurônios colinérgicos ao vesamicol (CLARIZIA e
cols, 1999).
A possibilidade de aumentar a potência sináptica por alterar o tamanho quântico
sugere uma estratégia terapêutica para tratar doenças caracterizadas por uma
deficiência na liberação de acetilcolina. Embora os mecanismos sejam apenas
6
parcialmente conhecidos, dados indicam um importante papel para o VAChT na
regulação de tamanho quântico (WILLIAMS, 1997).
Figura 2: Esquema representativo da vesícula sináptica. O transportador vesicular
de acetilcolina (VAChT) usa o gradiente químico produzido pela ATPase vacuolar do
tipo V (vATPase) para transportar acetilcolina do citosol colinérgico pré-sináptico
(ACh
cito
) para o interior da vesícula sináptica (ACh
ves
), trocando dois prótons (H
+
ves
) por
uma molécula de ACh. Fonte: LIMA, 2008, p.5.
2.3. DISAUTONOMIA E A FUNÇÃO CARDÍACA
O papel do Sistema Nervoso Autônomo (SNA) em uma ampla gama de doenças
é bem estabelecido, e o seu desbalanço, como ocorre, por exemplo, com o aumento da
atividade simpática ou em resposta a uma hipoatividade parassimpática (OKOSHI e
cols., 2004) é conhecido como disautonomia. Nas doenças cardiovasculares está bem
estabelecida a influência da superatividade simpática (THAYER & LANE, 2005), mas
pouco se sabe sobre o papel do tônus colinégico na manutenção da função cardíaca.
7
A supressão da função colinérgica tem sido vista em uma variedade de doenças
cardiovasculares, incluindo hipertensão, falência cardíaca congestiva, obesidade e
diabetes (LaCROIX e cols., 2007). Além disso, DE MEERSMAN e colaboradores (2007)
demonstraram que o envelhecimento é também acompanhado de uma diminuição da
atividade parassimpática em humanos, sendo observado um decréscimo significativo no
controle cardíaco vagal, especialmente após infarto do miocárdio. Em pacientes
diabéticos também foi observado um prejuízo da atividade parassimpática, já anomalias
na atividade adrenérgica foram menos comuns e de menor gravidade. Dos 12 pacientes
diabéticos analisados, nove sofriam de insuficiência cardíaca (LLOYD-MOSTYN e
WATKINS, 1975).
WU e colaboradores (2008) estudaram a relação entre função autonômica
cardíaca e hipertensão em quarto grupos distintos de indivíduos: 1- normotensos; 2-
normotensos com histórico familiar de hipertensão; 3- pré-hipertensos e 4- hipertensos.
Foram avaliados parâmetros de variabilidade da freqüência cardíaca por análise
espectral, dentre eles o índice de alta freqüência (HF), que representa atividade
parassimpática. Os resultados obtidos mostraram que os grupos 2, 3 e 4 apresentaram
HF reduzido quando comparados ao grupo 1. Por outro lado, o aumento da atividade
simpática, identificado pelo índice de baixa freqüência, LF, só foi encontrado em
indivíduos pré-hipertensos. Esses resultados sugerem que a redução da atividade vagal
e o desbalanço autonômico estejam associados com o risco de desenvolver
hipertensão.
Outro mecanismo usado para investigar a importância do tônus parassimpático
no coração é a estimulação do nervo vago. Para isso, ratos Sprague-Dawley com oito
semanas de vida tiveram a artéria coronária ocluída para indução do infarto do
miocárdio (IM). A estimulação elétrica do nervo vago consistia em pulsos regulares com
duração de 0,2 ms, em uma freqüência de 20Hz, com duração de 10 segundos/minuto
por seis semanas. Registros dos batimentos cardíacos mostraram que o grupo
submetido ao IM foi acompanhado de um aumento na freqüência cardíaca, contudo, a
estimulação vagal foi capaz de reduzi-la no grupo IM tratado em mais de 10%. Já a
pressão sangüínea, não foi alterada com o tratamento, apresentando valores menores
8
nos grupos com IM. Surpreendentemente, a taxa de sobrevivência dos animais
submetidos a estimulação vagal chegou a ser 40% maior a dos animais não tratados.
Tais evidências fortalecem a hipótese de que a estimulação vagal é benéfica na
falência cardíaca (LI e cols, 2004).
VANOLI e colaboradores (1991) investigaram o potencial antifibrilatório da
ativação vagal em cães submetidos ao IM, utilizando de estimulação elétrica do nervo
vago. Para isso, foi introduzido na artéria coronária esquerda um transdutor e no nervo
vago cervical direito um eletrodo. Estímulos elétricos crônicos do vago (3mseg; 1.0-3.0
mA; 3-8 Hz; FC=170 bpm) foram ou não aplicados aos cães logo após o IM. Esses
animais foram submetidos a sessões de treinamento físico e teste isquêmico. Os
resultados demonstraram que a estimulação elétrica vagal provê significativa proteção
contra fibrilação ventricular, uma vez que, 90% dos cães infartados que sofreram
estimulação elétrica vagal mostram-se resistentes a fibrilação ventricular causada por
estresse cardíaco causado pelo treinamento físico.
Estudos indicam que a disfunção ventricular esquerda nem sempre é
acompanhada pelo aumento da atividade simpática, e que mudanças no controle
parassimpático cardíaco podem preceder o aumento da atividade simpática durante o
desenvolvimento da insuficiência cardíaca. ISHISE e colaboradores (1998) utilizaram o
modelo de insuficiência cardíaca congestiva induzida por taquicardia em cães
conscientes para avaliar a modulação simpato-vagal em relação às mudanças na
contratilidade e relaxamento do ventrículo esquerdo. Os resultados mostraram que a
disfunção contrátil do ventrículo esquerdo foi acompanhada pelo decréscimo da
atividade parassimpática (identificada pela variabilidade da freqüência cardíaca), e de
forma gradual e progressiva, pelo aumento da atividade simpática (mensurada pela
concentração plasmática crescente de norepinefrina).
Em resumo, estes estudos sugerem que o desbalanço autonômico pode
contribuir para o mau funcionamento do miocárdio. Entretanto, o mecanismo envolvido
na cardioproteção ainda é pouco compreendido.
9
2.4. CAMUNDONGO VAChT KD
HOM
: UM MODELO DE DISFUNÇÃO COLINÉRGICA
A principal ferramenta utilizada no estudo da função do VAChT tem sido o
bloqueador vesamicol (ANDERSON e cols., 1983; VAN DER KLOOT, 2003). Entretanto,
esta substância apresenta limitações em seu uso, pois apresenta efeitos não
específicos como, por exemplo, bloqueio de receptores nicotínicos e Į-
adrenoreceptores (BUCKINGHAM e cols., 1993; WANNAN e cols., 1991) e efeito
anestésico local (GIROD e cols., 1991). Mas recentemente, com os avanços da biologia
molecular, tornou-se possível explorar os danos causados pela redução da atividade
colinérgica causada pela deleção parcial da expressão do VAChT.
O desenvolvimento do camundongo VAChT KD
HOM
se deu através da inserção de
um cassete de 3.8 Kb, contendo o gene de resistência ao antibiótico neomicina e da
enzima timidina cinase na região 5’ não traduzida do gene VAChT (Fig.3).
Camundongos VAChT mutantes foram gerados por recombinação homóloga do
cruzamento 129S6/SvEvTac (129S6) x C57BL/6J, esse novo background foi cruzado
com C57BL/6Uni (provenientes da Universidade de Campinas) por 3 gerações. Estes
foram então cruzados com C57BL/6, resultando em uma linhagem infértil. Por último,
camundongos heterozigotos foram cruzados dando origem ao VAChT KD
HOM
. Este
animal apresenta uma redução de 65% na expressão da proteína VAChT. Mostrou-se
também, que o VAChT KD
HOM
não apresenta alterações em outras proteínas envolvidas
na síntese e liberação de ACh tão pouco na recaptação de colina. A redução na
expressão do VAChT foi caracterizada por uma diminuição na liberação de ACh, com
conseqüentes distúrbios neuromusculares acompanhados de alterações cognitivas
(PRADO e cols., 2006).
2.5. CAMUNDONGOS VAChT KD
HOM
APRESENTAM DISFUNÇÃO CARDÍACA
Experimentos realizados por nossos colaboradores demonstraram que o
camundongo VAChT KD
HOM
apresenta disfunção cardíaca (LARA e cols., submetido):
10
1- Através da inserção de um cateter de Millar no coração dos animais WT e VAChT
KD
HOM
, foi concluído que camundongos VAChT KD
HOM
quando comparados aos
camundongos WT apresentam redução no índice de contratilidade cardíaca e na
pressão sistólica do ventrículo esquerdo, além de menor pressão diastólica final. Além
disso, a resposta cardíaca ao isoproterenol foi significativamente atenuada nos animais
VAChT KD
HOM
.
2- Resultado obtido através de ecocardiograma em modo M revelou que os
camundongos VAChT KD
HOM
apresentam uma redução na fração de encurtamento
ventricular esquerdo quando comparados ao animais selvagens. Em animais com 12
semanas de vida não foram encontradas diferenças na espessura do septo ventricular
nem na parede do ventrículo esquerdo.
3- Experimentos com coração isolado usando o sistema de Langendorff mostraram que
a tensão sistólica dos animais VAChT KD
HOM
estava reduzida, além de apresentarem
uma bradicardia mais acentuada na presença de acetilcolina (13ȝmol/L) e uma menor
resposta contrátil à infusão de isoproterenol (10ȝmol/L) quando comparados aos
corações dos camundongos controle. De forma interessante, a freqüência cardíaca
registrada no coração ex vivo foi menor no VAChT KD
HOM
,
quando comparada a
freqüência cardíaca dos corações WT.
4- Análises de morfometria foram realizadas em corações de camundongos WT e
VAChT KD
HOM
com idade de três e seis meses. Entre os corações dos camundongos
jovens não foi encontrada diferença na cavidade do ventrículo esquerdo, mas foi
identificada uma redução significativa no diâmetro dos cardiomiócitos de camundongos
VAChT KD
HOM
, quando comparados aos camundongos WT. Já nos corações dos
camundongos VAChT KD
HOM
com seis meses de vida foi observada uma diminuição no
tamanho da cavidade ventricular esquerda, quando comparada aos corações dos
animais controle. Com relação ao diâmetro dos cardiomiócitos, não foi observada
diferença entre os grupos experimentais.
11
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Investigar a disfunção cardíaca do camundongo VAChT KD
HOM
no plano celular.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o tamanho do coração e a área celular dos cardiomiócitos dos
camundongos VAChT KD
HOM
.
Avaliar possíveis alterações na expressão de marcadores de estresse cardíaco e
de receptores muscarínico M
2
e ȕ
1
adrenérgico nos cardiomiócitos dos camundongos
VAChT KD
HOM
.
Avaliar a sinalização intracelular de Ca
2+
, bem como proteínas envolvidas nesse
processo.
Avaliar a contração celular dos cardiomiócitos dos camundongos VAChT KD
HOM
.
Investigar, com o uso de inibidor de colinesterase, se a disfunção cardíaca
observada no camundongo VAChT KD
HOM
é realmente uma conseqüência da redução
da neurotransmissão colinérgica.
Investigar a progressão da insuficiência cardíaca no camundongo VAChT KD
HOM
com seis meses de vida.
12
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. ANIMAIS E TRATAMENTO
Os animais VAChT KD
HOM
e WT foram cedidos pelos Professores Dr. Marco
Antônio Máximo Prado e Dra. Vânia Ferreira Prado.
Os animais foram mantidos no Biotério de Camundongos Transgênicos sob ciclo
de 12:12 claro-escuro, sem restrição de água ou alimento. Sendo estes utilizados em
experimentos com idade entre 10 e 12 semanas ou 6 meses.
A piridostigmina (Sigma) foi diluída em salina, 1mg/Kg, administrada via
intraperitoneal, duas vezes ao dia, por duas semanas.
4.2. ISOLAMENTO DOS CARDIOMIÓCITOS VENTRICULARES
Para a obtenção dos cardiomiócitos utilizou-se o procedimento padrão para a
dissociação enzimática do tecido como descrito por MITRA E MORAD (1985). Após a
dissociação dos cardiomiócitos ventriculares, as células foram colocadas em meio de
cultura DMEM (Sigma) até a realização dos experimentos.
4.3. TRANSIENTE DE CÁLCIO E ENCURTAMENTO DO CARDIOMIÓCITO
Para a realização da medida do transiente de cálcio intracelular e do
encurtamento celular, foi feita incubação dos cardiomiócitos com uma sonda
fluorescente sensível ao cálcio (flúor-4/AM – 5 µmol/L), excitada no comprimento de
onda de 488nm e com emissão em 515nm, durante 30 minutos em temperatura
ambiente. Após a marcação, as células cardíacas foram estimuladas na freqüência de
1,0 hertz, com um pulso quadrado de duração de 5ms e 30v. Após a aplicação de 8
pulsos elétricos foi feita uma varredura repetitiva ao longo de uma linha no eixo
longitudinal das células, utilizando-se um microscópio Confocal Zeiss 510 Meta
(GUATIMOSIM e cols., 2001). A liberação global de Ca
2+
foi analisada pelo software
13
IDL 6,0 (Research System, Inc., Boulder, CO). O registro da imagem para análise do
encurtamento celular necessariamente compreende as extremidades longitudinais da
célula.
4.4. WESTERN BLOT
O tecido ventricular cardíaco foi homogeneizado em tampão de lise (100mM
NaCl, 50mM Tris-base, 5mM EDTA–2Na, 50mM Na
4
P
2
O
7
x10H
2
O, 1mM MgCl
2
pH=8,0)
com detergentes (Nonidet P40 1%, Triton x-100 0.3% e Sodium deoxycholate 0.5%),
contendo inibidores de protease (PMSF
200mM, benzamidina 15.7mg/mL, pepstatina
10ȝM, aprotinina 10mg/mL) e inibidores de fosfatase (20mM NaF e 1mM Na
3
VO
4
). Ao
fim desse procedimento, o conteúdo foi centrifugado por 12 minutos, à 4ºC e a 5.900g.
As proteínas foram quantificadas utilizando o método de Bradford (BRADFORD, 1976).
60µg de proteína foram então diluídas em tampão de amostra (5X - 2M Tris pH=6.8,
20% Glicerol, 30% SDS, 25% β-mercaptoetanol, 0,1% Azul de Bromofenol) para
separação em gel de SDS-PAGE (sodium dodecyl (lauryl) sulfate-poliacrilamida) em
concentração de 10 - 15%, dependendo da massa molecular da proteína estudada, e
4% o gel de concentração.
Após serem separadas em gel, as proteínas foram transferidas para uma
membrana de nitrocelulose ou PVDF. A qualidade da transferência foi monitorada
através da coloração da membrana com solução de Ponceau (0,2%). A membrana foi
então lavada com PBS contendo 0.1% Tween 20 (PBS-T) e colocada por 1 hora em
solução de bloqueio (PBS-T com 5% de leite desnatado) a fim de bloquear ligações não
específicas. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas overnight em câmara fria,
com temperatura 4ºC, com o anticorpo primário específico.
Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: anti-SERCA
(1:2000, ABR),
anti-PLB (1:5000, ABR), anti-P-PLB Ser16 (1:1000, ABR) e α-Tubulina (1:3000, Cell
Signaling). Em seguida, a membrana foi novamente lavada com PBS-T (5 vezes por 5
14
minutos). E então incubada com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase (HRP)
(Goat anti-mouse/rabbit IgG-HRP 1:5000, Sigma) por 1 hora. E mais uma vez a
membrana foi lavada como descrito anteriormente. As bandas protéicas foram
detectadas por reação de quimioluminescência (ECL plus – Amersham Biotecnology) e
a intensidade das mesmas foi avaliada por análise densitométrica através do software
ImageQuant™. Em todos os experimentos os níveis de proteína foram normalizados
pelos níveis de expressão da α-Tubulina, com exceção da P-PLN, que foi normalizada
pela PLN.
4.5. MEDIDA DO TAMANHO DO CORAÇÃO
Utilizou-se da razão entre o peso do coração e o comprimento da tíbia para
obtenção do tamanho do coração entre os diferentes grupos experimentais.
4.6. IMUNOFLUORESCÊNCIA E ÁREA CELULAR
Os cardiomiócitos foram fixados em paraformaldeído (PFA) 4% por 15 minutos,
posteriormente foram feitas 3 lavagens de 5 minutos com PBS. Em seguida as células
foram incubadas por 1 hora com solução de bloqueio (PBS, BSA 1%, triton X-100
0,5%). Com essa mesma solução foi feita a incubação overnight com o anticorpo anti-Į-
actinina (1:200, Sigma). Após as lavagens os cardiomiócitos foram incubados por 1
hora com anticorpo anti-mouse conjugado a Alexa-488 (1:500, Molecular Probes) e
DAPI (1:25, Sigma) em solução de bloqueio. Repetiram-se as lavagens e os
cardiomiócitos foram ressuspendidos em 20µl de PBS. As lâminas foram montadas
usando Hydromount (National diagnostics) e vedadas com esmalte incolor.
Para obtenção da área celular as imagens de imunofluorescência dos miócitos
ventriculares, obtidas através do microscópio Confocal Zeiss 510 Meta, foram
analisadas no software LSM Image Browser.
15
4.7. EXTRAÇÃO DE RNA, TRANSCRIÇÃO REVERSA E PCR EM TEMPO REAL
O RNA total de tecido cardíaco ou de cardiomiócitos adultos foi extraído
utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) e o método desenvolvido por CHOMCZYNSKI e
SACCHI (1987). No homogeneizado formado foi adicionado clorofórmio, esse complexo
foi incubado por 5 minutos a 37°C e centrifugados por 15 minutos a 4°C e 16.100g. A
fase superior foi coletada e o RNA foi precipitado com álcool isopropílico por 16 horas a
-20°C. Uma nova centrifugação foi realizada e o pellet de RNA foi então lavado com
etanol 70% para posteriormente ser ressuspendido em água tratada com DEPC
(dietilpirocarbonato). O RNA foi quantificado por espectrofotometria nos comprimentos
de ondas de 260 e 280 nm e armazenado a -80°C. A concentração do RNA foi
estimada por absorbância ótica pela fórmula: [RNA] µg/µl = (A
260
fx40/1000), onde f é o
fator de diluição e 40 é o fator de conversão. Contaminantes de DNA foram removidos
com adição de DNase I (Ambion
Inc., Austin, TX) e a integridade do RNA total foi
verificada através de um gel de agarose corado com 2 % de brometo de etídeo.
Dois µg de RNA total foram utilizados como moldes para a síntese de cDNA na
presença de 50 ng de iniciadores randômicos (random primers), 200 U de M-MLV RT
(RevertAid
TM
H Minus
Moloney murine leukemia virus-reverse transcriptase, Fermentas
Inc., Hanover, MD, USA), 200 U µl Rnase Out (Fermentas
Inc., Hanover, MD, USA), 0,5
mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl
2,
1 X de tampão da M-MLV RT em um volume final de
20 µl. O ciclo usado na reação foi de: 10 min a 20°C, 45 min a 42°C, 5 min a 95°C e 10
min a 4°C. Foi usado o termociclador PTC-100
TM
, MJ Research, INC.
A primeira fita de cDNA foi sintetizada usando o High Capacity cDNA
Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, USA), de acordo com as recomendações do
fabricante. Depois da transcrição reversa, o cDNA foi submetido ao Rotor-Gene 6000
Real-Time Rotary Analyzer (Corbett Robotics Inc., San Francisco, USA) usando Power
SYBR Green Master Mix (Biosystems, CA, USA). Para a reação foi usado um volume
final de 20µl, contendo 0.5 µM de iniciador (primer), 10µl of Power SYBR Green Master
Mix 2X e 1µl de cDNA. As reações passaram por 45 ciclos depois da desnaturação
16
inicial (95°C por 2 minutos) com os seguintes parâmetros: 95°C (desnaturação), 15s;
60°C (anelamento e extensão), 60s (RESENDE e cols., 2007; RESENDE e cols., 2008).
Para cada experimento, a reação sem cDNA foi usada como controle negativo. Em
adição, a ausência de contaminantes de DNA foi calculada em amostras de RT-
negativo. A análise da curva de dissociação dos produtos da PCR foram obtidas
aquecendo as amostras de 60°C a 95°C a 0.1°C/s, afim de avaliar a especificidade dos
iniciadores. A quantificação relativa da expressão gênica foi feita usando o método 2
-
¨¨Ct
, como descrito abaixo, os dados foram normalizados pela expressão gênica de ȕ-
actina. Foram obtidos produtos de PCR com menos de 100 pares de bases de
comprimento. Os primers foram sintetizados pela DNA Technologies, Coralville, IA.
Para a realização de PCRs em cardiomiócitos foram utilizados os primers para os
genes de interesse listados na tabela 1. Os primers listados na tabela 2 foram utilizados
para a realização de PCRs em tecido caríaco.
A quantificação da amplificação gênica foi realizada pela determinação do limiar
de ciclos (cycle threshold, CT) baseado na fluorescência detectada dentro da região
geométrica da curva semi-log do perfil de amplificação. Um perfil de amplificação para
cada amostra foi gerado demonstrando o aumento na fluorescência do corante
indicador (reporter dye fluorescence, Rn) para cada ciclo da PCR. De cada perfil de
amplificação um valor de limiar do ciclo foi calculado, representando o número do ciclo
da PCR em que a fluorescência foi detectada acima de um limiar arbitrário, com base
na variabilidade das linhas de base dos quinze primeiros ciclos. A quantificação relativa
da expressão do gene alvo foi avaliada usando o método comparativo do CT como
descrito previamente (MEDHURST e cols., 2000). O valor de ǻCT foi determinado pela
subtração do CT de cada amostra do valor do CT da ȕ-actina, respectiva para cada
amostra usada como controle interno. O cálculo do ǻǻCT envolve o uso da média do
ǻCT do grupo controle como uma constante arbitrária para subtrair de todos os outros
valores médios de ǻCT. As mudanças na expressão gênica do gene de interesse são
equivalentes a 2
-ǻǻCT
. Os valores foram analisados pela ANOVA seguida pela
comparação pareada do teste de Tukey (Tukey’s HSD test), com nível de significância
de 5%.
17
Tabela 1: Seqüência dos primers utilizados na realização de PCRs em miócitos
ventriculares.
PRIMER 5’-3’ Reversa 5’-3’
ANP GGATTTCAAGAACCTGCTAGA CTTCATCGGTCTGCTCGCTCA
BNP GCCAGTCTCCAGAGCAATTC CCTTGGTCCTTCAAGAGCTG
ȕ-MHC CTCCAACATGGAGCAGATCA GCTCCGGTGCTCATTCAT
RM M1 TTGGCACTTTCTCCATGAAC GGCCAGTGTGCCCAGAGC
RM M2 GCTGCGTGGGTTCTTTCCT CCCCTACGATGAACTGCCAG
RM M3 CCATCTGGCAAGTGGTCTTC TGCCACAATGACAAGGATGTTG
RM M4 GTGACTGCCATCGAGATCGTAC CAAACTTTCGGGCCACATTG
RM M5 GGCCCAGAGAGAACGGAAC TTCCCGTTGTTGAGGTGCTT
ȕ-actina GACGGCCAGGTCATCACTATTG AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC
RM
= Receptor Muscarínico
Tabela 2: Seqüência dos primers utilizados na realização de PCRs em tecido cardíaco.
PRIMER
5’-3’ Reversa 5’-3’
RM M2 ATGTTGTCAGCAATGCCTCCG CCCTACGATGAACTGCCAGAA
RA ȕ -1 ATCTGGTCATGGGATTGCTGGTGG
CTGGCCGTCACAGACAGCACATCT
ȕ-actina TGGAATCCTGTGGCATCCATGA AATGCCTGGGTACATGGTGGTA
RM
= Receptor Muscarínico; RA = Receptor Adrenérgico
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos pela média ± erro padrão. As análises foram
realizadas através do teste t Student ou ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. A
significância foi estabelecida para um P < 0.05.
18
5. RESULTADOS
5.1. MEDIDAS DE TAMANHO DO CORAÇÃO E ÁREA CELULAR
Para verificar possíveis alterações na dimensão dos corações dos animais
VAChT KD
HOM
, utilizou-se a razão entre o peso do coração e o comprimento da tíbia.
Através dessa análise observou-se que os camundongos VAChT KD
HOM
apresentam
um coração significativamente menor que os camundongos WT (Fig.:3), com uma
diminuição de aproximadamente 7%.
Figura 3: Razão entre o peso do coração (mg) e o comprimento da tíbia (mm) de
camundongos WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0.05. n= número de animais utilizados.
Uma vez verificada a redução no tamanho do coração dos animais VAChT
KD
HOM
, decidiu-se investigar se esta alteração poderia estar relacionada com a
diminuição no tamanho do cardiomiócito ventricular. Para isso, utilizou-se a técnica de
imunofluorescência, com os cardiomiócitos previamente marcados com anticorpo anti-
Į-actinina, uma vez que a Į-actinina é uma proteína de citoesqueleto. As imagens
obtidas por microscopia confocal mostraram que os cardiomiócitos dos camundongos
VAChT KD
HOM
apresentam uma menor área celular quando comparados aos
cardiomiócitos provenientes de camundongos WT (Fig.:4). Esse dado sugere que a
WT KD
HOM
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
n=30
n=32
*
Peso do coração/
Comprimento da tíbia
(mg/mm)
19
atrofia cardíaca pode ser atribuída, pelo menos em parte, a uma mudança na área
celular.
WT KD
HOM
0
700
1400
2100
n=36
n=52
*
Área celular (
µ
µ
µ
µ
m
2
)
Figura 4: Medida da área celular dos cardiomiócitos dos camundongos WT e VAChT
KD
HOM
. *=p<0.05. n= número de células analisadas. Barra=10µm.
5.2. MARCADORES DE ESTRESSE CARDÍACO
Alguns genes são expressos durante o desenvolvimento embrionário e são
somente re-expressos sob condições de estresse (FREY e OLSON, 2003). Aqui, foram
avaliados os níveis de expressão do RNA mensageiro (RNAm) do gene que codifica o
pepitídeo natriurético atrial (ANP), pepitídeo natriurético tipo B (BNP) e a cadeia pesada
de miosina (ȕ-MHC). Todos esses marcadores de estresse estavam aumentados nos
cardiomiócitos dos camundongos VAChT KD
HOM
em relação aos cardiomiócitos WT
(Fig.:5).
20
0.0
0.7
1.4
2.1
WT (n=8)
KD
HOM
(n=9)
*
*
*
ANP BNP β-MHC
Expressão relativa de RNAm
Figura 5: PCR em tempo real comparando a expressão do RNAm dos genes que
codificam ANP, BNP e ȕ-MHC em miócitos ventriculares de camundongos WT e
VAChT KD
HOM
. *=p<0.05. n= número de experimentos independentes.
5.3. ANÁLISE DA SINALIZAÇÃO DE Ca
2+
O Ca
2+
tem papel chave na regulação da função cardíaca e alterações de Ca
2+
podem influenciar a fisiologia e a patologia dos cardiomiócitos (BERS, 2002; BERS,
2006). Por isso, decidiu-se investigar possíveis alterações na sinalização intracelular de
Ca
2+
nos cardiomiócitos dos animais VAChT KD
HOM
. Para isso, miócitos ventriculares
de ambos os grupos foram incubados com sonda fluorescente sensível ao Ca
2+
(Flúor-
4/AM), estimulados na freqüência de 1Hz e a razão entre a fluorescência máxima e
mínima (F/F
0
), foi analisada para obtenção do pico do transiente de Ca
2+
. A figura 6-A
mostra uma imagem representativa do transiente de Ca
2+
em miócitos ventriculares. Os
resultados apresentados na figura 6-B mostram que os cardiomiócitos de animais
VAChT KD
HOM
apresentaram uma redução significativa do pico do transiente de Ca
2+
,
quando comparados aos animais WT, sugerindo uma possível diminuição na função
contrátil dessas células. Outro parâmetro observado foi o decaimento do pico do
transiente de Ca
2+
. Aqui, verificou-se o tempo decorrido para que o pico do transiente
decaísse em 50% do seu valor máximo (T50). O resultado obtido mostra que o valor de
T50 foi maior nos miócitos ventriculares dos animais VAChT KD
HOM
,
quando
comparados
aos cardiomiócitos de camundongos WT. Em outras palavras, a velocidade
21
na qual o Ca
2+
é retirado do citosol, após a contração, foi menor nas células
ventriculares dos VAChT KD
HOM
(Fig.: 6-C).
Figura 6: Transiente de Ca
2+
. A-Imagem representativa obtida através da microscopia
confocal. Cardiomiócitos foram submetidos a estimulação elétrica (1 Hz). B-Amplitude
do transiente de Ca
2+
em miócitos ventriculares de camundongos WT e VAChT KD
HOM
.
C-Cinética do decaimento do pico do transiente de Ca
2+
em miócitos ventriculares de
camundongos WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0.05. n= número de células analisadas.
Para confirmar se havia alterações na função contrátil nos miócitos ventriculares
dos animais VAChT KD
HOM
foram obtidas imagens da contração celular através de
microscopia confocal. A figura 7 apresenta o percentual de encurtamento dos
cardiomiócitos provenientes de ambos os grupos experimentais, mostrando uma
diminuição significativa de 24.5% nas células de camundongos VAChT KD
HOM
em
relação as células controle.
WT KD
HOM
0.0
1.2
2.4
3.6
4.8
n=166
n=122
*
Pico do transiente de Ca
2+
(F/F
0
)
WT KD
HOM
0
100
200
300
400
n=166
n=122
*
Decaimento de Ca
2+
(T50, ms)
A
C
B
22
WT KD
HOM
0
2
4
6
8
n=73
n=79
*
Contração celular
(% de encurtamento)
Figura 7: Porcentagem de encurtamento dos miócitos ventriculares isolados de animais
WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0.05. n= número de células analisadas.
5.4. PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NO ACOPLAMENTO EXCITAÇÃO-CONTRAÇÃO
Considerando as alterações observadas na dinâmica do Ca
2+
e na contratilidade
do cardiomiócito, decidiu-se investigar a expressão de proteínas-chaves envolvidas na
regulação intracelular de Ca
2+
no miócito ventricular.
Verificou-se inicialmente a expressão da SERCA (ATPase-Ca
2+
do retículo
sarcoplasmático), responsável pela recaptação de Ca
2+
do citosol de volta para o
retículo sarcoplasmático, após contração celular (GUATIMOSIM e cols., 2002). A figura
8 mostra uma diminuição de aproximadamente 25% da expressão da SERCA nos
corações de animais VAChT KD
HOM
em relação aos animais WT.
23
Figura 8: Níveis de expressão da SERCA encontrados no coração de camundongos
WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0,05. n= número de experimentos independentes.
u.a.=unidades arbitrárias.
A atividade da SERCA é controlada pela fosfolamban (PLB). No seu estado
desfosforilado, a PLN inibe a atividade da SERCA, no entanto ao ser fosforilada, a PLB
deixa de inibir a SERCA, permitindo que ocorra a recaptação ativa do Ca
2+
de volta ao
retículo sarcoplasmático (BRITTSAN e cols., 2000; GUATIMOSIM e cols., 2002).
Sabendo-se das alterações na expressão da SERCA, o próximo passo foi
verificar se a expressão e a fosforilação da PLN estariam alteradas. Através do Western
blot foi possível verificar um aumento na expressão da PLN e uma redução no nível de
fosforilação dessa proteína no sítio da Ser16 nos corações dos animais mutantes em
relação aos corações dos animais WT (Fig.:9).
24
Figura 9: Níveis de expressão e fosforilação da PLN. A-Expressão da PLN nos
corações de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. B-Nível de fosforilação da PLN nos
corações de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0,05. n= número de experimentos
independentes. u.a.=unidades arbitrárias.
5.5. RECEPTORES: MUSCARÍNICO M
2
E ȕ
1
ADRENÉRGICO
Visando entender um pouco sobre o balanço autonômico que atua na atividade
cardíaca do camundongo VAChT KD
HOM
, partiu-se para investigar a expressão de
RNAm dos genes que codificam os receptores muscarínicos M
2
e ȕ
1
adrenérgicos no
coração dos animais WT e VAChT KD
HOM
. Verificou-se que a expressão do receptor M
2
está aumentada em 115,7% no coração dos camundongos VAChT KD
HOM
, enquanto a
expressão do receptor ȕ
1
adrenérgico está reduzida em 41,05% (Fig.:10).
25
Figura 10: PCR em tempo real. A-Nível de expressão de RNAm do gene que codifica o
receptor muscarínico M
2
nos corações dos camundongos WT e VAChT KD
HOM
. B-Nível
de expressão do RNAm do gene que codifica o receptor ȕ
1
adrenérgico nos corações
dos animais WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0,05. n= número de experimentos
independentes.
Também foi investigado os níveis de expressão de RNAm dos genes que
codificam todas as classes de receptores muscarínicos no cardiomiócito. Observou-se
que apesar dos receptores muscarínicos M
1
e M
3
serem menos expressosos nessas
células em relação ao M
2
, a expressão destes receptores estava significativamente
aumentada nos miócitos ventriculares dos animais VAChT KD
HOM
, quando comparados
aos miócitos ventriculares dos animais WT. Por outro lado, os receptores M
4
e M
5
apresentaram baixos níveis de expressão nas células de ambos os grupos
experimentais (Fig.:11).
A
WT KD
HOM
0
25
50
75
100
n=4
n=4
*
β
β
β
β
1
adrenérgico
(% do controle)
WT KD
HOM
0
100
200
300
*
Expressão de M
2
(% do controle)
B
26
0
1
2
3
4
M1
M5M4M3M2
*
*
*
Expressão relativa de RNAm
WT (n=5)
KD
HOM
(n=7)
Figura 11: PCR em tempo real comparando a expressão do RNAm dos genes que
codificam receptores muscarínicos em cardiomiócitos dos animais WT e VAChT KD
HOM
.
*=p<0,05. n= número de experimentos independentes.
5.6. ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA VIA INIBIDOR DE COLINESTERASE
Para confirmar que a disfunção cardíaca observada nos animais VAChT KD
HOM
era de fato resultado da redução na neurotransmissão colinérgica, os camundongos
VAChT KD
HOM
foram tratados com um inibidor de colinesterase, a piridostigmina, na
tentativa de restaurar os níveis de ACh na fenda sináptica desses camundongos.
Para isso, foi montado um novo grupo experimental com os animais mutantes
tratados com piridostigmina (VAChT KD
HOM
PIR). A droga foi diluída em salina, 1mg/Kg,
administrada via intraperitoneal, duas vezes ao dia, por duas semanas. Desta forma,
alguns dos parâmetros utilizados para caracterizar o modelo cardíaco do VAChT KD
HOM
foram refeitos para avaliar a resposta cardíaca à piridostigmina.
A figura 12 correlaciona o tamanho dos corações dos três grupos experimentais,
pode ser observado que o tratamento com a piridostigmina foi capaz de reverter a
atrofia cardíaca encontrada no coração do animal VAChT KD
HOM
.
27
Figura 12: Razão entre o peso do coração (mg) e o comprimento da tíbia (mm) de
animais WT, VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. *=p<0,05 versus WT e #=p<0,05
versus VAChT KD
HOM
PIR. n= número de corações utilizados.
Para investigar se o aumento no tamanho do coração observado nos animais
VAChT KD
HOM
PIR estava relacionado com alterações na dimensão da célula
ventricular, utilizou-se de cardiomiócitos marcados com anticorpo anti-Į-actinina.
Análise de experimentos prévios utilizando imagens obtidas por microscopia confocal
mostraram que os cardiomiócitos ventriculares dos camundongos VAChT KD
HOM
PIR
apresentaram área celular maior que os cardiomiócitos dos camundongos VAChT
KD
HOM
, entretanto ainda são menores quando comparados aos miócitos ventriculares
dos camundongos WT (Fig.:13).
WT KD
HOM
KD
HOM
PIR
0
3
6
9
12
n=30
n=32
n=9
*
#
Peso do coração/
Comprimento da tíbia
(mg/mm)
28
Figura 13: Medida da área celular dos cardiomiócitos dos camundongos WT, VAChT
KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. *=p<0,05 versus WT e #=p<0,05 versus VAChT KD
HOM
PIR. n= número de células analisadas. Barra=10µm.
Uma vez verificado o aumento na área celular e no tamanho do coração dos
camundongos VAChT KD
HOM
PIR, decidiu-se investigar se havia alguma relação entre a
piridostigmina e os marcadores de estresse cardíaco. Por PCR em tempo real, foi
identificada uma diminuição significativa nos níveis de expressão do RNAm dos genes
que codificam o peptídeo natriurético atrial (ANP), pepitídeo natriurético tipo B (BNP) e
a cadeia pesada de miosina (ȕ-MHC) nos miócitos ventriculares dos animais VAChT
KD
HOM
PIR (Fig.:14).
WT KD
HOM
KD
HOM
PIR
0
700
1400
2100
n=36
n=52
n=10
*
#
*
Área celular (
µ
µ
µ
µ
m
2
)
29
ANP
BNP
β
ββ
β
-MHC
0.0
0.7
1.4
2.1
WT (n=8)
KD
HOM
(n=9)
*
#
*
*
#
#
KD
HOM
PIR (n=5)
Expressão relativa de RNAm
Figura 14: PCR em tempo real comparando a expressão do RNAm dos genes que
codificam ANP, BNP e ȕ-MHC em cardiomiócitos dos animais WT, VAChT KD
HOM
e
VAChT KD
HOM
PIR. *=p<0.05 versus WT e #=p<0,05 versus VAChT KD
HOM
PIR. n=
número de experimentos independentes.
Em seguida analisamos o efeito do tratamento com piridostigmina no transiente
de Ca
2+
. A figura 15 mostra a ação da piridostigmina na célula ventricular do
camundongo VAChT KD
HOM
tratado. É observado que tanto o pico quanto o decaimento
do transiente de Ca
2+
nas células dos camundongos VAChT KD
HOM
PIR alcançaram
valores similares aos vistos nos cardiomiócitos dos camundongos WT.
30
B C
WT KD
HOM
KD
HOM
PIR
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
n=166
n=122
n=142
*
#
Pico do transiente de Ca
2+
(F/F
0
)
WT KD
HOM
KD
HOM
PIR
0
100
200
300
400
n=166
n=142
n=122
*
#
Decaimento de Ca
2+
(T50, ms)
Figura 15: Transiente de Ca
2+
. A-Imagem representativa obtida através da icroscopia
confocal. Cardiomiócitos foram submetidos a estimulação elétrica (1 Hz). B-Amplitude
do transiente Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos WT, VAChT KD
HOM
e VAChT
KD
HOM
PIR. C-Cinética do decaimento do pico do transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos
de camundongos WT, VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. *=p<0,05 versus WT e
#=p<0,05 versus. n= número de células analisadas.
Na figura 16 é possível identificar que o tratamento com piridostigmina foi capaz
de reverter os níveis de expressão de RNAm do gene que codifica o receptor
muscarínico M
2
nos corações dos animais VAChT KD
HOM
PIR. Mas, diferentemente, o
tratamento por 15 dias com piridostigmina não alterou os níveis de expressão de RNAm
do gene que codifica o receptor ȕ1-adrenérgico nos corações dos animais VAChT
KD
HOM
PIR.
A
31
Figura 16: PCR em tempo real. A-Expressão do RNAm do gene que codifica o receptor
muscarínico M
2
nos corações dos animais WT, VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. B-
Expressão do RNAm do gene que codifica o receptor ȕ
1
adrenérgico nos corações dos
animais WT, VAChT KD
HOM
e VAChT KD
HOM
PIR. *=p<0,05 versus WT e #=p<0,05
versus VAChT KD
HOM
PIR. n= número de experimentos independentes.
5.7. ANIMAIS VAChT KD
HOM
COM SEIS MESES DE VIDA
Para investigar a progressão da disfunção cardíca no modelo do animal VAChT
KD
HOM
foram analisados alguns parâmetros utilizando-se de animais WT e VAChT
KD
HOM
com de seis meses de vida.
Ao comparar o tamanho do coração de animais WT e VAChT KD
HOM
com seis
meses de vida, utilizando-se da razão entre o peso do coração e o comprimento da
tíbia, pôde-se observar que, diferentemente do observado nos animais com 3 meses de
vida, não houve diferença entre o tamanho do coração dos animais mais velhos
(Fig.:17).
WT KD
HOM
KD
HOM
PIR
0
25
50
75
100
*
*
n=4
n=4
n=4
β
β
β
β
1
adrenérgico
(% do controle)
WT KD
HOM
KD
HOM
PIR
0
70
140
210
280
*
#
Expressão M
2
(% do controle)
A
B
32
WT 6 meses KD
HOM
6 meses
0
3
6
9
12
n=11
n=13
Peso do coração/
Comprimento da tibia
(mg/mm)
Figura 17: Razão entre o peso do coração (mg) e o comprimento da tíbia (mm) de
animais WT e VAChT KD
HOM
com seis meses de vida. n= número de corações
utilizados.
Uma vez que não foi mais identificada a atrofia nos corações dos animais VAChT
KD
HOM
, decidiu-se constatar se o mesmo estaria ocorrendo nos miócitos ventriculares.
Novamente, utilizou-se de cardiomiócitos marcados através de imunofluorescência com
anticorpo anti-Į-actinina. As imagens obtidas por microscopia confocal mostraram que
os cardiomiócitos dos camundongos VAChT KD
HOM
com seis meses de vida
apresentam a mesma medida da área celular, quando comparados aos cardiomiócitos
provenientes de camundongos WT com a mesma idade (Fig.:18).
33
0
1000
2000
n=19
n=24
WT 6meses
KD
HOM
6meses
Area celular (
µ
µ
µ
µ
m
2
)
Figura 18:
Medida da área celular dos cardiomiócitos dos animais WT e VAChT KD
HOM
com seis meses de vida. n= número de células analisadas. Barra=10µm.
Para verificar se as alterações na sinalização de Ca
2+
nos cardiomiócitos dos
animais VAChT KD
HOM
mantiveram-se com o envelhecimento, miócitos ventriculares de
ambos os grupos foram incubados com sonda fluorescente sensível ao Ca
2+
e o pico e
o decaimento de Ca
2+
foram mensurados. É possível verificar na figura abaixo que tanto
o pico quanto o decaimento do transiente de Ca
2+
mantiveram-se alterados nos
cardiomiócitos ventriculares dos camundongos VAChT KD
HOM
quando comparados aos
animais WT, novamente sugerindo uma possível diminuição na função contrátil dessas
células.
34
Figura 19: Transiente de Ca
2+
. A-Imagem representativa obtida através da microscopia
confocal. Cardiomiócitos foram submetidos a estimulação elétrica (1 Hz).
B-Amplitude
do pico do transiente
Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos WT e VAChT KD
HOM
. C-
Cinética do decaimento do pico do transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de
camundongos WT e VAChT KD
HOM
. *=p<0,05 versus WT. n= número de células
utilizadas.
Para confirmar se havia alterações na função contrátil nos miócitos ventriculares
dos animais VAChT KD
HOM
idosos, imagens da contração celular foram obtidas através
de microscopia confocal. A figura 20 representa o percentual de encurtamento dessas
células, mostrando que a disfunção contrátil celular é persistente nas células dos
camundongos VAChT KD
HOM
com seis meses em relação ao WT.
0
100
200
n=154
n=154
*
WT 6meses
KD
HOM
6meses
Decaimento de Ca
2+
(T50, ms)
0.0
1.3
2.6
3.9
5.2
n=154
n=154
*
WT 6meses
KD
HOM
6meses
Pico do transiente de Ca
2+
(F/F
0
)
A
B
35
0
1
2
3
4
n=82
n=83
*
WT 6meses
KD
HOM
6meses
Contração celular
(% de encurtamento)
Figura 20: Porcentagem de encurtamento dos miócitos ventriculares isolados de
animais WT e VAChT KD
HOM
com seis meses de vida. *=p<0.05. n= número de células
analisadas.
36
6. DISCUSSÃO
Neste trabalho nós mostramos evidências de que a redução do tônus colinérgico
no camundongo VAChT KD
HOM
causa mudanças na expressão gênica cardíaca que
conduzem a um remodelamento molecular com alterações no Ca
2+
intracelular e
diminuição da função do miócito ventricular. Além disso, corações de camundongos
VAChT KD
HOM
apresentaram alterações significativas na expressão e função de
receptores autonômicos, com atenuação da resposta do receptor ȕ
1
adrenérgico ao
isoproterenol e exacerbação da resposta mediada pelo receptor muscarínico M
2
a ACh.
Este fenótipo pôde ser revertido com o tratamento com inibidor de colinesterase, a
piridostigmina. Em conjunto, esses dados mostram que a redução do tônus colinérgico
leva a disfunção cardíaca.
O VAChT KD
HOM
quando comparado a um outro modelo de disfunção
colinérgica, o camundongo knockout para o receptor M
2
-ACh (M
2
-KO) (LACROIX e
cols., 2008), apresentou diferenças consideráveis, uma vez que os camundongos M
2
-
KO não apresentaram disfunção cardíaca sob condições basais. A disfunção cardíaca é
observada nos animais M
2
-KO, apenas quando estes são submetidos a uma situação
de estresse, como ao estímulo com isoproterenol. Mas, por que esses dois modelos de
disfunção colinérgica são tão distintos? Talvez a consideração mais relevante seja que
a redução na expressão do VAChT interfira nas duas vias autonômicas, enquanto a
deleção do receptor M
2
é localizada. Além disso, a expressão de outros receptores
muscarínicos já foi descrita no coração (SHARMA e cols., 1997; WANG e cols., 2004).
Apesar de menos expressos os receptores M
1
e M
3
foram identificados no coração,
onde diferentemente dos receptores M
2
, possuem atividade inotrópica positiva
(SHARMA e cols., 1996; KITAZAWA e cols., 2009). Alterações na expressão destes
receptores podem também explicar as diferenças apresentadas entre o VAChT KD
HOM
e
o M
2
-KO. Nós identificamos um aumento nos níveis de expressão de RNAm do genes
que codificam receptores muscarínicos M
1
e M
3
em cardiomiócitos dos camundongos
VAChT KD
HOM
.
37
A redução da liberação de ACh nos corações do camundongos VAChT KD
HOM
teve como resposta compensatória a superexpressão do receptor muscarínico M
2
,
identificado por PCR em tempo real. A funcionalidade dos receptores M
2
foi confirmada
com experimento de coração isolado infundido com solução contendo ACh (13ȝM),
quando os corações dos camundongos VAChT KD
HOM
apresentaram maior resposta
bradicárdica. A exata contribuição dos receptores M
2
para o fenótipo do VAChT KD
HOM
ainda não está esclarecida, mas como os receptores M
2
acoplam a proteína G
i/0
,
levando a inibição da adenilato ciclase (LANZAFAME e cols., 2003), talvez isso possa
estar contribuindo com a menor resposta adrenérgica observada nos camundongos
VAChT KD
HOM
.
De forma contrária, o VAChT KD
HOM
apresentou redução na expressão do RNAm
do gene que codifica o receptor ȕ
1
adrenérgico. Esse resultado foi confirmado com
experimentos in vivo (cateter de Miller) e ex vivo (coração isolado), em ambos o VAChT
KD
HOM
apresentou atenuação da resposta adrenérgica, sugerindo alterações
significativas nessa via. A redução na expressão e na função dos receptores ȕ
1
adrenérgicos é observada em modelos de superatividade simpática (PENELA e cols.,
2006; GRASSI e cols., 2009), esse dado sugere, portanto, que o camundongo VAChT
KD
HOM
tenha uma sobreposição da atividade simpática sobre a atividade
parassimpática.
Se o camundongo VAChT KD
HOM
realmente desenvolve uma hiperatividade
simpática, por que ele apresenta atrofia cardíaca? Não conhecemos o mecanismo pelo
qual a disfunção cardíaca progride nesse modelo, mas estudos com VAChT KD
HOM
com
seis meses de idade mostraram que nessa fase da vida os animais WT e VAChT KD
HOM
não apresentam diferença na medida do tamanho do coração. Essas mesmas
alterações foram também observadas no diâmetro e na área celular dos cardiomiócitos
ventriculares. Esses resultados indicam que entre o terceiro e o sexto mês, o
cardiomiócito e o coração do camundongo VAChT KD
HOM
apresentaram crescimento
maior do que o observado nos camundongos WT. Além disso, análise morfométrica
mostrou que a cavidade ventricular esquerda do VAChT KD
HOM
jovem era igual a do
38
coração do camundongo selvagem, mas com seis meses de vida a cavidade do
ventrículo esquerdo do VAChT KD
HOM
é menor, sugerindo uma hipertrofia concêntrica.
Esse dado sugere mais uma vez que a atividade simpática no camundongo VAChT
KD
HOM
pode estar aumentada.
As alterações na amplitude e no decaimento do transiente de Ca
2+
, com
conseqüente redução na contratilidade dos miócitos ventriculares dos camundongos
VAChT KD
HOM
foram observadas tanto para o animal jovem, quanto para o de seis
meses de vida, com relação aos seus respectivos controles. Essas alterações na
dinâmica do cálcio, observadas em diversos modelos animais de insuficiência cardíaca
(CURRIE e SMITH, 1999; DEL MONTE e cols., 2001; GOMEZ e cols., 1997; GOMEZ e
cols., 2001; HOBAI e O'ROURKE, 2001; SONG e cols., 2005), podem ser explicadas
pela diminuição da expressão da SERCA e da fosforilação da PLN. Não podemos
excluir a possibilidade de outras proteínas estarem envolvidas na disfunção da
sinalização de Ca
2+
observada nesse modelo de disfunção cardíaca.
Em geral, manipulações gênicas que melhoram a carga de Ca
2+
, ou pela terapia
gênica da SERCA ou pela deleção da PLN, têm sido benéficas na prevenção da
disfunção cardíaca em modelos de falência cardíaca (SAKATA e cols., 2007; SOBIE e
cols., 2003; WAGGONER e KRANIAS, 2005). Não sabemos por quais mecanismos a
piridostigmina conseguiu melhorar o cálcio intracelular, mas é fato que o tratamento
com esse inibidor de colinesterase restaurou a sinalização de Ca
2+
, melhorando assim a
contração do miocárdio nos camundongos VAChT KD
HOM
, como foi observado no
ecocardiograma e no coração isolado.
Dados clínicos mostram que a deficiência parassimpática precede o aumento da
atividade simpática durante o desenvolvimento da insuficiência cardíaca (AMORIM e
cols., 1981). Em humanos, análise espectral sugere que no envelhecimento, um dos
maiores fatores de risco para a insuficiência cardíaca, a atividade parassimpática está
diminuída (DE MEERSMAN e cols., 2007). Além disso, estudos com animais
corroboram esses dados mostrando que o desbalanço autonômico no estagio inicial da
39
insuficiência cardíaca em cães é primeiramente causado pelo tônus vagal (ISHISE e
cols., 1998). Nesse sentido, evidências recentes sugerem ser a estimulação da
atividade parassimpática um importante alvo terapêutico na falência cardíaca (THAYER
e LANE, 2007; SERRA e cols., 2009). Nossos resultados dão crédito a esta
possibilidade, uma vez que o tratamento com inibidor de colinesterase melhora a
função cardíaca do camundongo VAChT KD
HOM
, assim como outros estudos na
literatura que mostram o papel protetor do sistema parassimpático no coração (LI e
cols., 2004; THAYER e LANE., 2007).
40
7. CONCLUSÃO
Nosso estudo demonstrou que a disautonomia causada primariamente por
redução da atividade parassimpática, devido à diminuição na expressão do VAChT, tem
como conseqüência disfunção cardíaca, caracterizada por alterações na expressão
gênica e na maquinaria intracelular de Ca
2+
e disfunção contrátil. Nosso estudo abre
novas fronteiras identificando um fingerprint molecular causado pela redução
colinérgica, podendo ser o VAChT KD
HOM
um modelo de disfunção cardíaca onde a
redução da atividade colinérgica precede a hiperatividade simpática.
41
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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splicinf leads to two cholinergic proteins in Caenorhabditis elegans. J Mol Biol. 4: 647-
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AMORIM, D.S.; DARGIE, H.J.; HEER, K.; BROWN, M.; JENNER, D.; OLSEN, E.G.;
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