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Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Análise de genes de Mycobacterium leprae associados com resistência a
rifampicina, dapsona e ofloxacin, em amostras clínicas de pacientes com
hanseníase (recidiva) no município do Rio de Janeiro.
por
ALEXADRE ARAUJO CUHA DOS SATOS
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo
Cruz como parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em Biologia Parasitária
Orientador: Dr. Philip Noel Suffys
Rio de Janeiro
Junho 2009
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ii
dos Santos, Alexandre Araujo Cunha
ANÁLISE DE GENES DE MYCOBACTERIUM LEPRAE ASSOCIADOS COM
RESISTÊNCIA A RIFAMPICINA, DAPSONA E OFLOXACIN EM AMOSTRAS
CLÍNICAS DE PACIENTES COM HANSENÍASE (RECIDIVA) NO MUNICÍPIO DO RIO
DE JANEIRO
Alexandre Araujo Cunha dos Santos – Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz
2009 xvi 66fls
Dissertação de Mestrado apresentada à Coordenação do Curso de Pós- Graduação em
Biologia Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz
Área de concentração: Biologia Molecular aplicada a Micobactérias
1. Hanseníase, 2. Resistência medicamentosa, 3. Recidiva
I Fundação Oswaldo Cruz. II Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Biologia Molecular
Aplicada a Micobactérias
III Título
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iii
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Análise de genes de Mycobacterium leprae associados com resistência a
rifampicina, dapsona e ofloxacin em amostras clínicas de pacientes com
hanseníase (recidiva) no município do Rio de Janeiro.
por
ALEXADRE ARAUJO CUHA DOS SATOS
Orientador: Philip Noel Suffys
Banca Examinadora: Dra. Alice de Miranda Machado - Revisora
Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Dr. José Augusto Nery
Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Dr. Rafael Silva Duarte
Universidade Federal do Rio de Janeiro -
UFRJ
Suplentes: Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani
Instituto Oswaldo Cruz -
FIOCRUZ
Dr. Neio Lucio Fernandes Boechat
Universidade Federal do Rio de Janeiro -
UFRJ
Rio de Janeiro
Junho 2009
iv
Dedico esta dissertação a todos os meus
familiares, amigos e em especial a minha
namorada por todo apoio e paciência nos
momentos de dificuldade durante os últimos
dois anos. Obrigado por tudo.
v
“Enquanto houver um coração infantil, o
Vasco será imortal” Cyro Aranha
vi
AGRADECIMETOS
Aos meus pais Jose Antonio e Norma, minha irmã Thais e minha namorada,
amiga e companheira Mariana pelo amor, carinho, apoio e amizade. Obrigado por me
ensinarem a ser paciente e persistente sempre!
Aos meus queridos avós Marcelino, Dalva, Maria e José (in memorian), por
todo incentivo e carinho dispensados em todos os momentos da vida.
A todos os meus amigos que sempre estiveram ali todas as vezes que as forças
me faltaram, sempre com palavras de incentivo e carinho.
A toda equipe do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias,
verdadeiros amigos: Adalgiza, a quem eu devo tudo que eu aprendi no laboratório, uma
verdadeira orientadora; ao Diego por toda ajuda na bancada e momentos de descontração; à
Daniela, por ter me dado a oportunidade de participar do LABMAM; Lia, Erica, Atiná,
Milena, Amanda, Sidra, Luis e demais pessoas do laboratório. Muito obrigada pelas inúmeras
horas de trabalho, risos e brincadeiras. Ao pessoal da Plataforma de Seqüenciamento da
FIOCRUZ, em especial a Aline por sempre desculpar os meus atrasos na entrega das placas.
Ao pessoal do Ambulatório Souza Araújo – FIOCRUZ pelas biopsias fornecidas e pela ajuda
nas informações sobre os pacientes.
Aos meus amigos e colegas da turma de Mestrado da Biologia Parasitária, em
especial a Daniele Misael, que foi “madrinha” do que de melhor me aconteceu durante o
mestrado, minha namorada Mariana Gandini.
Aos integrantes da banca, pela gentileza de aceitarem o convite.
À CAPES e à FIOCRUZ pelo apoio científico e financeiro.
A todos aqueles que de alguma maneira contribuíram para o desenvolvimento
deste trabalho.
vii
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Fotomicrografia de esfregaço de linfa colhida de uma lesão de pele de
Hanseníase, corado pelo Ziehl-Neelsen, mostrando o M. leprae isolado ou formando
globias.
3
Figura 1.2: Coeficientes de detecção de casos novos de hanseníase por 100.000
habitantes, regiões, e Brasil, 2001 - 2007.
7
Figura 1.3: A descoberta dos antibióticos. 9
Figura 1.4: Sequência parcial do gene rpoB de isolados clínicos de M. leprae. 14
Figura 1.5: Sequência nucleotídica parcial do gene folP1 da cepa Thai 53 e de isolados
clínicos de M. leprae.
15
Figura 1.6: Estrutura e sequência nucleotídica parcial do gene gyrA de isolados clínicos
de M. leprae.
16
Figura 3.1: Eletroforese em gel de agarose 3%, com marcador de 50 pb. Primer utilizado
Mrpo.
22
Figura 3.2: Programa SeqScape versão 2.6 da Applied Byosistems 26
Figura 3.3: Plasmídios folP. 27
Figura 3.4: Plasmídio folP 101, sem mutação 27
Figura 3.5: Plasmídio folP 102 e 103. 28
Figura 4.1: Sequência do gene rpoB. 30
Figura 4.2: Sequenciamento rpoB, sem mutação. 31
ix
Figura 4.3: Sequência do gene folP. 32
Figura 4.4: Sequenciamento folP: Não apresenta mutação. 33
Figura 4.5: Sequenciamento folP com suspeita de cultura mista. 34
Figura 4.6: Seqüência do gene gyrB. 35
Figura 4.7: Sequenciamento gyrB, sem mutação. 36
Figura 4.8: Seqüência do gene gyrA. 37
Figura 4.9: Sequenciamento gyrA. 37
Figura 4.10: Sequenciamento gyrA. Comparação entre uma amostra com mutação e uma
sem.
38
Figura 4.11: Sequenciamento gyrA. Comparação entre duas biópsias do mesmo paciente
em épocas diferentes.
39
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1: O esquema poliquimioterápico (PQT). 9
Tabela 1.2: Alvos na bactéria e agente antimicrobiano. 10
Tabela 1.3: Número absoluto de casos notificados de hanseníase, por modo de entrada,
segundo UF de residência e Região, Brasil – 2008.
11
e
12
Tabela.4.1: Genes analisados
29
Tabela 4.2: Relação entre baciloscopia e % de amplificação 29
Tabela 4.3: Pacientes com Recidiva que possuem 2 biópsias 38
e
39
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A = Adenina
A.S.A = Ambulatório Souza Araújo
ATP = Adenosina tri-fosfato (do inglês “Adenosine triphosphate”)
BAAR = Bacilos álcool-ácidos resistentes
BB = Borderline-borderline
BL = Borderline lepromatoso
BT = Borderline tuberculóide
C = Citosina
CLO = Clofazimina
CNDS/MS = Coordenação Nacional de Dermatologia Sanitária – Ministério da Saúde
DDS = Dapsona (Diaminodifenilssulfona)
DNA = Ácido desoxirribonucléico (do inglês “Deoxyribonucleic Acid”)
DNDS = Divisão Nacional de Dermatologia Sanitária
dNTP = desoxirribonucleotídeo trifosfatado (do inglês “Deoxyribonucleotide triphosphate”)
EDTA = Etilenodiaminotetracético (do inglês “EthyleneDiamineTetrAcetic acid”)
ENH = Eritema nodoso hansênico
G = Guanina
GC = Guanina-Citosina
HPLC = Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês “High Performance Liquid
Chromatography”)
IB = Índice de baciloscopia
IOC = Institudo Oswaldo Cruz
LL = Lepromatoso
LLp = Lepra lepromatosa polar
LLs = Lepra lepromatosa subpolar
MAC = Complexo Mycobacterium avium (do inglês “Mycobacterium avium complex”)
MB = Multibacilar
MCT-CNPq / MS-SCTIE-DECIT = Ministério da Ciência e Tecnologia – Conselho Nacional
de desenvolvimento Científico e Tecnológico – Ministério da saúde - Secretaria de Ciência,
Tecnologia e Insumos Estratégicos - Departamento de Ciência e Tecnologia
MHI = Hanseníase indeterminada
MS = Ministério da Saúde
OMS = Organização Mundial de Saúde
PABA = Ácido para-amino-benzóico (do inglês “p-amino benzoic acid”)
PB = Paucibacilar
PCR = Reação em cadeia de polimerase (do inglês “Polymerase Chain Reaction”)
PDTIS/FIOCRUZ = Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde –
Fundação Oswaldo Cruz
PPD = Derivado protéico purificado (do inglês “protein purified derivative”)
PQT = Poliquimioterapia
QRDR = regiões que determinam resistência a quinolonas (do inglês “Quinolone-resistant
determining region”)
RMP = Rifampicina
RNA = Ácido ribonucléico (do inglês “Ribonucleic Acid”)
RR = Reação reversa
SES-RJ – Secretária de Estado da Saúde do Rio de Janeiro
SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SNPs = Polimorfismos de base única (do inglês “Single-nucleotide polymorphism”)
xii
SSCP = Polimorfismo de conformação de filamento único (do inglês “Single Stranded
Conformational Polymorphism”)
SVS = Secretária de Vigilância Sanitária
T = Timina
TBE = Tris-ácido-bórico- EDTA
Tris-HCl = Cloridrato de tris-(hidroximetil)-aminometano
TT = Tuberculóide
UFRJ = Universidade Federal do Rio de Janeiro
VNTR = Análise do número variável de repetições (do inglês “Variable-Number Tandem
Repeats”)
UF = Unidade da Federação
xiii
RESUMO
A Hanseníase é causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae) e é um problema de
saúde pública em países da Ásia, América Latina e África. O tratamento poliquimioterápico
da doença é recomendado pela Organização Mundial da Saúde desde 1982, mas teve
implantação gradual no Brasil a partir de 1986, passando a ser o único esquema nacional em
1991. No início dos anos 90, o Ministério da Saúde implantou a dose fixa do tratamento
poliquimioterápico (PQT). O uso irregular das drogas (auto-administradas) pode levar ao
surgimento de resistência, portanto monitorar a existência de resistência à ação do antibiótico
rifampicina é muito importante, pois é a droga mais bactericida da PQT. O alvo da
rifampicina é a subunidade beta da RNA polimerase, que é decodificada pelo gene rpoB do
M. leprae. Uma substituição no códon da serina (posição 531) pela leucina, causada por uma
mutação deste gene, parece ser a principal causa da resistência à rifampicina. Todas as
mutações associadas à resistência no rpoB são localizadas nos domínios 500-540 – sistema
numérico usado em rpoB de E. coli. As mutações no gene folP, decodificador da
dihidropteroato sintetase do M. leprae, foram associadas a resistência à dapsona. A resistência
às quinolonas tem sido associada à mutação nos genes gyrA e gyrB, que codificam as
subunidades α e β da DNA girase de várias micobactérias incluindo M. leprae. Avaliamos
neste estudo, através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento, a presença
de mutações nos genes rpoB, folP, gyrA e gyrB em 85 amostras de pacientes residentes no
estado do Rio de Janeiro com hanseníase multibacilar e suspeita de recidiva. Não
encontramos nenhuma mutação que indicasse resistência a drogas nos quatro genes estudados,
o que possivelmente sugere que os casos de recidiva não são causados por resistência
medicamentosa e sim por uma nova infecção. Uma vez que a população susceptível ao bacilo,
mesmo depois de curada, permanece no local onde foi previamente infectada em contato com
as possíveis fontes de transmissão. Esse estudo vem colaborar para o desenvolvimento de
critérios laboratoriais para o diagnóstico correto de recidiva, uma vez que não existem no
Brasil parâmetros técnicos e nem metodologia científica apropriada para aplicação na rede
básica do Sistema Único de Saúde.
xiv
ABSTRACT
Leprosy is caused by Mycobacterium leprae and it is a public health problem in
several countries of Asia, Latin America and Africa. The multidrug treatment of the illness is
recommended by the World Health Organization (WHO) since 1982, but it had gradual
implantation in Brazil from 1986, becoming the unique accepted treatment in 1991. At the
beginning of 90’s, the Health department implanted a fixed dose of multidrug therapy (MDT).
As the irregular use of drugs (self-managed) can lead to resistance, it is advisable to monitor
the existence of rifampim resistance is very important, because it is the most bactericidal drug
of MDT. The target of rifampim is the β subunit of RNA polymerase that is encoded by rpoB
gene from M. leprae. A substitution in serine 531 for leucine, caused by a mutation, seems to
be the main cause of the rifampim resistance. All the mutations associated with resistance in
rpoB gene are located between 500 and 540 position, numerical system used in rpoB gene
from E.coli. Mutations in folP gene, which encodes dihydropteroate synthase of M. leprae,
had been associated to dapsone resistance. Ofloxacin resistance has been associated to
mutations in gyrA and gyrB gene, which encodes the subunit α and β from DNA gyrase of
many mycobacteria including M. leprae. We evaluated in this study, the presence of
mutations in rpoB, folP, gyrA and gyrB genes in 85 samples of multibacillary leprosy patients
with suspicious relapses cases, that living in Rio de Janeiro, through the polymerase chain
reaction (PCR) and DNA sequencing. We didn’t find any mutation that indicated resistance in
four genes studied, which could possibly indicates that the relapse cases are not caused by
drug resistance but by newly acquired infections. Since the bacillus sensitive population, even
after cured, remains in the same place where it was infected for the first time in contact with
the possible transmissions sources. This study collaborate for laboratorial criteria
development for the correct relapses cases diagnosis, since there is not, in Brazil, technician
parameters and appropriate scientific methodologies for application in Unique health System.
xv
SUMÁRIO
1. ITRODUÇÃO.................................................................................................................1
1.1. O gênero Mycobacterium ..........................................................................................1
1.2. O Mycobacterium leprae ...........................................................................................2
1.3. A Hanseníase .............................................................................................................4
1.4. Classificação da Hanseníase.....................................................................................4
1.5. A Hanseníase no mundo...........................................................................................6
1.6. A Hanseníase no Brasil.............................................................................................7
1.7. O esquema poliquimioterápico - OMS....................................................................8
1.8. Mecanismos de ação dos antimicrobianos. .............................................................9
1.9. A resistência na Hanseníase ...................................................................................10
1.9.1. Resistência à rifampicina. ..............................................................................13
1.9.2. Resistência à dapsona. ....................................................................................14
1.9.3. Resistência ao ofloxacin..................................................................................16
1.10. Avanços da biologia molecular no estudo das micobactérias. ........................17
2. OBJETIVOS....................................................................................................................18
2.1. Geral: .......................................................................................................................18
2.2. Específicos: ..............................................................................................................18
3. METODOLOGIA...........................................................................................................19
3.1. Investigação de resistência em M. leprae ..............................................................19
3.2. Recebimento das amostras clínicas .......................................................................19
3.3. Protocolo de recebimento de amostras, informação clínica/epidemiológica e
estocagem.............................................................................................................................19
3.4. Processamento das amostras..................................................................................20
3.4.1. Extração do DA com sephaglas ..................................................................20
3.4.2. Extração de DA com Qiagen.......................................................................20
3.5. Análise genética.......................................................................................................21
3.5.1. Reação da polimerase em cadeia (PCR). ......................................................21
3.5.2. Eletroforese em gel de agarose ......................................................................22
3.5.3. Purificação dos produtos de DA .................................................................23
3.5.4. Sequenciamento. .............................................................................................24
3.5.5. Controles utilizados ........................................................................................26
3.6. Análises estatísticas.................................................................................................28
xvi
4. RESULTADOS ...............................................................................................................29
4.1. Pacientes e informação clínica/epidemiológica ....................................................29
4.2. Recebimento das amostras e processamento........................................................30
4.3. Analise genética.......................................................................................................30
4.3.1. SPs e resistência............................................................................................30
5. DISCUSSÃO....................................................................................................................40
6. COCLUSÃO E PERSPECTIVAS..............................................................................45
7. AEXOS..........................................................................................................................46
8. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................61
1
1. ITRODUÇÃO
1.1. O gênero Mycobacterium
A história taxonômica do gênero Mycobacterium é complexa e imbricada,
particularmente com, Corynebacterium, ocardia e Rhodococcus. Foi em 1896 que
Lehmann e Neumann propuseram o gênero Mycobacterium incluindo os bacilos da
hanseníase (lepra) e da tuberculose, anteriormente classificados como sendo Bacterium leprae
e Bacterium tuberculosis. Posteriormente, algumas centenas de espécies micobacterianas
foram descritas, entretanto apenas 41 foram incluídas na “Approved Lists of Bacterial
Names”, publicadas no International Journal of Systematic Bacteriology [1]. Atualmente,
mais de uma centena de espécies são descritas e consideradas por muitos como pertencentes
ao gênero Mycobacterium. Entretanto, uma recente revisão considera 85 espécies
micobacterianas como convenientemente validadas [2].
Desde o fim do séc. XIX, o enorme interesse despertado pelo bacilo de Koch foi
responsável pelo viés clínico que favoreceu a idéia de subdivisão taxonômica das
micobactérias fundamentada essencialmente nos vínculos destas bactérias com M.
tuberculosis. Deste fato decorre a ampla utilização, ainda hoje, das denominados
micobactérias atípicas e anteriormente micobactérias outras não tuberculosas (MOTT) para as
micobactérias que não são identificáveis como M. bovis ou M. tuberculosis. Somente na
década de 1950 foi proposta uma classificação para as micobactérias. Assim, segundo
Runyon, as micobactérias atípicas, anônimas ou não classificadas são artificialmente divididas
em 4 grupos, conforme suas velocidades de crescimento e produção de pigmentos [3].
A exceção do M. leprae e do M. lepraemurium, ainda com dificuldades para serem
cultivadas “in vitro”, as micobactérias são distribuídas em dois grandes grupos taxonômicos
segundo suas velocidades de crescimento em condições ótimas de cultura. As micobactérias
de crescimento rápido apresentam um tempo de geração de 2 a 5 horas e formam colônia(s)
visível em meio sólido em 7 dias (ou menos), enquanto as micobactérias ditas como de
crescimento lento apresentam um tempo de geração médio de 24 horas e necessitam de mais
de uma semana para formarem uma colônia. As micobactérias são bactérias em forma de
bastonetes, que raramente formam ramificações. Estas células são caracterizadas por uma
propriedade tintorial: a álcool-ácido resistência [4].
Depois do estabelecimento das classificações fenotípicas, as micobactérias foram
classificadas de acordo com critérios genéticos. O DNA micobacteriano apresenta um
2
elevado percentual de guanina (G) e de citosina (C), que varia de 62 a 70%, exceto no caso de
M. leprae cujo cromossoma contem 58% de G+C. Tanto o sequenciamento do RNAr 16S de
muitas espécies micobacterianas quanto o posterior sequenciamento do genoma completo de
diferentes micobatérias permitiram demonstrar que suas sequências nucleotídicas são muito
semelhantes. Mais que isto, confirmaram que a divisão das micobactérias segundo suas
velocidades de crescimento corresponde efetivamente a uma segregação filogenética[5-7].
Os genomas micobacterianos são constituídos de um único cromossoma circular de
4.4 megabases (Mb), 4.35 Mb e 2.8 Mb respectivamente para M. tuberculosis, M. bovis BCG
Pasteur e M. leprae. O genoma de M. tuberculosis H37Rv, a cepa de referência mais
amplamente utilizada em experimentação e que conservou sua virulência para animais de
laboratório desde seu isolamento em 1905, é composto de 4.411.529 pares de bases[7]. Este
genoma exibe um conteúdo médio de guanina-citosina (G+C) de 65,6 %, e certas regiões
apresentam um conteúdo de G+C superior a 80 %. Ele apresenta uma elevada capacidade de
codificação (superior a 90%), comparável ao do genoma de outras bactérias sequenciadas. A
análise bio-informática permitiu a identificação de 50 genes que codificam RNAs estáveis e
3924 genes que codificam proteínas [6].
As micobactérias são amplamente distribuídas no ambiente e por esta razão não é
surpresa que algumas espécies consideradas saprófitas tenham sido associadas com doença,
especialmente em indivíduos imunologicamente comprometidos [8, 9]. As espécies mais
importantes são as micobactérias patogênicas restritas: o Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis), Mycobacterium leprae. (M. Leprae) e o complexo Mycobacterium. avium-
intracellulare (MAC), causador de 90% das micobacterioses em pacientes imunologicamente
comprometidos [5, 10].
1.2. O Mycobacterium leprae
O M. leprae é uma bactéria com forma de bacilo álcool-ácido resistente, intracelular
obrigatória causador da Hanseníase, que se identifica pela técnica de Ziehl-Neelsen,
descoberta em 1873 por Armauer Hansen na Noruega.. O M. leprae (Figura 1), é de
crescimento extremamente lento quando comparado a outras bactérias e tem parede celular
muito rica em lipídios. O M. leprae é capaz de infectar grande número de pessoas (alta
infectividade), mas poucos adoecem, (baixa patogenicidade). O poder imunogênico do bacilo
é responsável pelo alto potencial incapacitante da hanseníase [4].
3
A micobactéria parasita os macrófagos e as células de Schwann que formam a mielina
dos nervos periféricos. A destruição da bainha de mielina leva à disfunção dos nervos. O
sistema imunitário reage eficazmente às micobactérias pela formação de granulomas
tuberculóides. Este tipo de reação imunitária ao M. leprae é extremamente importante na
progressão da Hanseníase. Na falta dela, a bactéria sobrevive à fagocitose e multiplica-se
dentro dos macrófagos. Se houver uma reação TH1, citotóxica, com formação de granulomas
sequestradores da bactéria e com destruição dos macrófagos infectados, a doença torna-se
quase benigna e não é capaz de progredir: é a lepra tuberculóide. Se no entanto for activada
uma resposta TH2, com produção de anticorpos, não há formação de granulomas e a bactéria
dissemina-se, surgindo a lepra típica, ou lepra lepromatosa [4, 11].
O homem tem sido reconhecido como a principal fonte de infecção, e o mais
importante reservatório do bacilo para saúde pública. Os doentes multibacilares sem
tratamento (Hanseníase virchowiana e Hanseníase dimorfa) são capazes de eliminar grandes
quantidades de bacilos pela mucosa nasal. Já os doentes paucibacilares (indeterminados e
tuberculóides) não são considerados importantes como fonte de transmissão da doença devido
a sua baixa carga bacilar. Outros reservatórios, ainda em estudo, estão sendo investigados,
como alguns animais, em especial o tatu (Dasypus novemcinctus), o macaco mangabei
(Cercocebus torquatus), o chipanzé (Pan troglodytes) e a água [12-15].
O M. leprae pode persistir e, presumivelmente, também proliferar, num ambiente em
associação com certas plantas. Assim, a infecção também poderia resultar do contato repetido
e prolongado com fontes ambientais que contenham o bacilo viável. Entretanto, como o M.
leprae não pode ser cultivado, esta hipótese se torna de difícil validação experimental e as
evidências são obtidas apenas indiretamente, através de estudos epidemiológicos[16].
Figura 1.1: Fotomicrografia de esfregaço de linfa colhida de
uma lesão de pele de Hanseníase, corado pelo Ziehl-Neelsen,
mostrando o M. leprae isolado ou formando globias. Extraído
de Rinaldi A., 2005. [17].
4
1.3. A Hanseníase
A Hanseníase é uma doença granulomatosa crônica proveniente de infecção pelo M.
leprae. Este bacilo tem a capacidade de infectar cerca de 90% dos indivíduos (alta
infectividade), mas apenas cerca de 10% adoecem (baixa patogenicidade), propriedades estas
que não são função apenas de suas características intrínsecas, mas que dependem, sobretudo,
de sua relação com o hospedeiro e grau de endemicidade do meio. O domicílio é apontado
como importante espaço de transmissão da doença, embora ainda existam lacunas de
conhecimento quanto aos prováveis fatores de risco implicados, especialmente aqueles
relacionados ao ambiente social. A Hanseníase parece ser uma das mais antigas doenças que
acomete o homem. As referências mais remotas datam de 600 AC. e procedem da Ásia, que,
juntamente com a África, podem ser consideradas o berço da doença. A melhoria das
condições de vida e o avanço do conhecimento científico modificaram significativamente a
incidência da Hanseníase [18].
A Hanseníase apresenta longo período de incubação, de dois a sete anos em média.
Logo, é menos frequente na infância, salvo em áreas mais endêmicas onde a exposição
precoce em focos domiciliares, aumenta a incidência de casos nessa faixa etária. Como em
outras doenças infecciosas, a conversão de infecção em doença depende de interações entre
fatores individuais do hospedeiro, ambientais e do próprio M. leprae. Embora acometa ambos
os sexos, observa-se predominância do sexo masculino, em uma relação de dois para um [18].
1.4. Classificação da Hanseníase.
A Classificação Internacional de Madri, feita por Rabelo e proposta em 1953 por
Bechelli e Rotberg no Sexto Congresso Internacional de Lepra em Madri, dividiu a
Hanseníase em: Tipo lepromatoso (Virchowiano), pólo maligno; Tipo tuberculóide, pólo
benigno; Grupo dimorfo e Grupo indeterminado. Em 1962, Ridley e Jopling propusera uma
nova classificação, modificada posteriormente, dividindo a Hanseníase em cinco grupos. Por
ser uma classificação mais complexa foi adotada principalmente em instituições de pesquisa e
por especialistas. Os grupos propostos foram definidos considerando aspectos clínico,
bacteriológico, histopatológico e imunológico: Tuberculóide (TT) que corresponde à forma
polar, benigna, estável, da Classificação de Madri; Borderline tuberculóide (BT); Borderline
borderline (BB); Borderline lepromatoso (BL); Lepromatoso (LL) equivalente à forma
Virchowiana, maligna, mais agressiva na Classificação de Madri. Adicionalmente, para a
5
forma inicial da doença, ainda sem definição imunológica dentro desse espectro, considera- se
a forma Indeterminada (MHI) como a classificação de Madri [19, 20].
As manifestações neurológicas da Hanseníase são variáveis, dependendo da forma
clínica e podem ser agravadas durante o tratamento poliquimioterápico devido à maior
exposição antigênica ocasionada pela destruição bacilar. Na forma TT, as lesões neurais são
mais precoces, assimétricas e intensamente agressivas. Já na forma LL, as alterações
neurológicas são de evolução crônica, insidiosa e lenta, sendo que a lesão dos troncos
nervosos é mais tardia e tendendo a ser simétrica e menos agressiva do que na tuberculóide. A
forma BB pode assumir características intermediárias às formas dos pólos tuberculóide (BT) e
virchowiano (BL) [20-23].
Sobre o espectro imunológico da Hanseníase impõem-se ainda as chamadas reações
hansenianas ou episódios reacionais, fenômenos inflamatórios agudos localizados ou
sistêmicos, que ocorrem comumente antes, durante ou após o tratamento específico da
doença. Guardam relação com a carga bacilar e a resposta imune do hospedeiro, podendo ser
classificadas em dois tipos: reação tipo 1 ou reação reversa (RR) e reação tipo 2 ou eritema
nodoso hanseniano (ENH). Essas distintas condições costumam ocorrer separadamente, mas
podem surgir em diferentes épocas no mesmo paciente, sendo importante reconhecer que
ambas podem resultar em perda permanente da função nervosa. As reações podem ocorrer em
todas as formas clínicas, com exceção do grupo tuberculóide polar, e, geralmente, seguem
fatores desencadeantes, tais como infecções intercorrentes, vacinação, gravidez, puerpério,
uso de medicamentos iodados, estresse físico e emocional, devendo ser prontamente
diagnosticadas e tratadas.
No entanto, os fatores precipitantes e mecanismos fisiopatológicos
envolvidos no desencadeamento de ambos os tipos de episódio reacional permanecem ainda
mal definidos [11, 24, 25].
Em 1982 a OMS propôs uma classificação operacional para fins de tratamento,
baseando-se nas manifestações clínicas e na baciloscopia, para ser utilizada nos programas de
controle, individualizando-se as formas paucibacilares e multibacilares [26].
• Hanseníase paucibacilar: Clinicamente, observa-se de uma a cinco lesões
hipopigmentadas ou eritematosas, com distribuição assimétrica, perda da
sensibilidade e comprometimento de um só tronco nervoso. A baciloscopia é
negativa. Inclui a Hanseníase indeterminada e a tuberculóide da Classificação de
Madri, e a forma TT e BT da Classificação de Ridley e Jopling.
• Hanseníase multibacilar: Clinicamente, apresenta-se com mais de cinco lesões
com distribuição assimétrica, perda da sensibilidade e pode haver
6
comprometimento de vários troncos nervosos. A baciloscopia é positiva em pelo
menos uma localização. Inclui a Hanseníase virchowiana (lepromatosa) e a
dimorfa da Classificação de Madri ou a forma LL, BL, BB e alguns casos de BT
da Classificação de Ridley e Jopling.
O diagnóstico clínico baseia-se em três sinais cardinais: lesões anestésicas de pele,
espessamento de nervos periféricos e BAAR presentes nas biópsias de lesões de pele [27],
onde se faz a coloração pelo método de Ziehl-Neelsen e apresenta-se o resultado sob a forma
de índice baciloscópico (IB), numa escala que vai de 0 a 6+. A baciloscopia mostra-se
negativa (IB=0) nas formas tuberculóide e indeterminada, fortemente positiva na forma
virchowiana e revela resultado intermediário nas formas dimorfas [28].
1.5. A Hanseníase no mundo
Em 1991, a Organização Mundial de Saúde e seus Estados Membros comprometeram-
se a eliminar a Hanseníase como um problema de saúde pública até o ano de 2000. A
eliminação foi definida como uma prevalência menor que um caso por 10.000 habitantes [29].
No início de 2000, 641.091 casos de Hanseníase foram registrados para tratamento e
678.758 casos novos foram detectados no mundo. Um ano após o estabelecimento da data
para a meta de eliminação, a taxa de prevalência mundial era de aproximadamente 1.25 por
10.000 habitantes. Entre os 122 países considerados endêmicos em 1985, 98 países
alcançaram a meta de eliminação e a prevalência mundial foi reduzida em 86%. Isto ocorreu
graças à melhora no manejo dos casos, baixíssimas taxas de abandono do tratamento(No
A.S.A é de aproximadamente 2%), altas taxas de cura, ausência de resistência aos
medicamentos e a curta duração do tratamento [29].
Muitos países previamente definidos como endêmicos eliminaram a doença (<1
caso/10.000 habitantes) durante 2007. A República Democrática do Congo e Moçambique
alcançaram este importante estágio. Entretanto áreas de alta endemicidade ainda persistem em
países como Brasil, Angola, República Central Africana, India, Madagascar, Nepal e
Tanzânia. Estes países permanecem comprometidos em eliminar a doença, e intensificaram as
atividades de controle da Hanseníase [30].
Segundo dados recebidos de 118 países no início de 2008, a taxa de prevalência
mundial foi de 212,802 casos enquanto o número de novos casos detectados durante o ano de
7
2007 foi de 254,525 (excluindo o pequeno número de casos na Europa). O número de novos
casos detectados decaíram em 11,100 casos (4%) durante 2007 comparando com 2006 [30].
1.6. A Hanseníase no Brasil.
O Brasil ocupa o segundo lugar do mundo em número absoluto de casos de
Hanseníase, sendo o primeiro das Américas. A doença é endêmica em todo o território
nacional, embora com distribuição irregular. As regiões Norte, Nordeste e Centro-oeste são as
que apresentam, as maiores taxas de prevalência e detecção da doença [31].
Aproximadamente, 94% dos casos conhecidos nas Américas e 94% dos casos novos
diagnosticados são notificados pelo Brasil. Ao longo das últimas décadas, as taxas de
prevalência têm declinado ano a ano, resultado da consolidação do tratamento
poliquimioterápico. Em 1999, havia expectativa de que se alcançasse a meta de eliminação da
doença em 2005 quando a prevalência deveria ser inferior a 1,0/10.000 habitantes, mas em
2006 foram diagnosticados 38333 casos novos e a prevalência média foi de 2,1/10000 [15,
32] (figura 1.2).
Figura 1.2: Coeficientes de detecção de casos novos de Hanseníase por 100.000
habitantes, regiões, e Brasil, 2001 - 2007. Fonte: Serviço de Vigilância em Saúde [33]
Tanto pela sua magnitude quanto pelas sequelas que a doença acarreta e consequentes
transtornos emocionais e sociais para o doente e sua família, a Hanseníase é, ainda hoje, um
dos mais sérios problemas de saúde pública do Brasil. O projeto brasileiro de eliminação da
Hanseníase, do ponto de vista da infra-estrutura dos serviços, tem se fundamentado
8
basicamente em uma proposta de ampliação da rede de diagnóstico e atenção ao paciente,
mediante a descentralização das atividades para os serviços de atenção básica à saúde.
Paralelo a isto, a divulgação dos sinais e sintomas da doença para a população em geral
constitui um instrumento para a eliminação da endemia. As mudanças propostas nesse novo
modelo de organização dos serviços de saúde pretendem romper com a tendência do
atendimento espontâneo – aquele voltado às pessoas que, na dependência de seu grau de
percepção ou sofrimento, procuram os serviços de saúde – para proporcionar uma oferta
organizada em função dos principais agravos e grupos populacionais prioritários. No que diz
respeito às intervenções sobre a Hanseníase, é indispensável o diagnóstico das necessidades
da população, a definição de área de abrangência de uma unidade de saúde, e o planejamento
dos recursos a serem alocados [34, 35].
1.7. O esquema poliquimioterápico - OMS.
A Poliquimioterapia (PQT), tratamento vigente para a Hanseníase é recomendada
desde 1982 pela OMS, e teve implantação gradual no Brasil a partir de 1986, passando a ser o
único esquema nacional em 1991. No início dos anos 90, o Ministério da Saúde implantou a
dose fixa de tratamento PQT, adotando o termo alto por cura, para os doentes que
completassem este esquema dentro dos prazos estabelecidos: 6 doses nos casos PB em até 9
meses e 24 doses nos casos MB em até 36 meses. Em 1998, a OMS reduziu o tratamento dos
multibacilares para 12 doses fixas, a serem completadas em até 18 meses. Na mesma época
foram disponibilizadas as drogas Ofloxacina e Minociclina, para esquemas alternativos, em
substituição a RMP e DDS respectivamente [28, 36, 37].
9
Tabela 1.1: O esquema poliquimioterápico (PQT).
Formas/Medicamento Paucibacilar Multibacilar
Rifampicina (RFM)
600mg, uma vez por mês,
supervisionada
600mg, uma vez por mês,
supervisionada
Dapsona (DDS)
100mg/dia auto-
administrada
100mg/dia auto-
administrada
Clofazimina (CFZ)
-
300mg, uma vez por mês,
supervisionada + 100mg
em dias alternados ou
50mg/dia auto-
administrada
Extraído do guia de controle epidemiológico [38].
1.8. Mecanismos de ação dos antimicrobianos.
A introdução dos antibióticos para quimioterapias contra infecções bacterianas tem
sido uma das mais importantes conquistas médicas nos últimos cinquenta anos (Figura 1.3).
Entretanto a emergência de bactérias resistentes às drogas cria a constante necessidade de
novas drogas antibacterianas [39].
Figura 1.3: A descoberta dos antibióticos. Extraído de Chopra e colaboradores,
(2002) [39].
10
O desenvolvimento de antimicrobianos tem sido um sucesso nos componentes
essenciais das cinco áreas do metabolismo bacteriano: síntese de parede celular, síntese de
proteínas, síntese de RNA, síntese de DNA e metabolismo intermediário [39, 40]. As bases
moleculares da ação dos antibióticos são bem estudadas e seus principais alvos estão bem
determinados na maioria dos casos (Tabela 1.2).
Tabela 1.2: Alvos na bactéria e agente antimicrobiano.
Extraído de Chopra e colaboradores, 2002 [39]
1.9. A resistência na Hanseníase
A resistência primária é conceituada como a situação na qual as cepas de
Mycobacterium leprae que infectaram determinado indivíduo seriam desde o início
resistentes, independente do uso do medicamento. A principal causa deste tipo de resistência
são os pacientes bacilíferos que desenvolveram resistência secundária à medicação e que
podem infectar outros indivíduos. A resistência secundária aparece durante o tratamento da
Hanseníase, quando pacientes faziam uso de dose baixa ou irregular de sulfona (DDS) e
mesmo em alguns casos com dose terapêutica eficaz e regular, levando ao surgimento de
mutantes resistentes de M. leprae. [28].
Em meados de 70, publicações em todo o mundo registraram a resistência à sulfona
(DDS), então único fármaco para tratamento da Hanseníase. Ainda nessa década surgem
outros medicamentos específicos, como a clofazimina (CLO) e a rifampicina (RMP), além
das primeiras recomendações dos esquemas terapêuticos associados, utilizando dois ou três
11
quimioterápicos [41]. No Brasil, Talhari e colaboradores detectaram os primeiros casos de
sulfono-resistência secundária e também de resistência primária, na Amazônia, em 1985 [42].
O Ministério da Saúde adotou então, o esquema associado-DNDS que foi difundido na rede
de saúde pública, a partir de 1978 com o uso de DDS + RMP.
Os critérios para o diagnóstico de recidiva em Hanseníase ainda não estão bem
definidos, variando de acordo com o lugar ou autor. Operacionalmente, a Coordenação
Nacional de Dermatologia Sanitária (CNDS/MS) considera na definição de recidiva em
Hanseníase, baseada na Organização Mundial de Saúde (OMS) e em sua própria conceituação
a ocorrência de sinais de atividade clínica da doença, após alta por cura [36]. Atualmente, de
acordo com o Ministério da Saúde para o diagnóstico de recidiva após a PQT/OMS faz-se
necessária a utilização de critérios de suspeição e de confirmação [28, 37].
A distribuição de corticoesteróide na rede vem permitindo a utilização do mesmo na
atenção básica, inclusive sem supervisão médica propiciando a ocorrência de co-morbidades
graves. Seu uso no tratamento das reações é eficaz mas pode esconder os primeiros sinais de
recidiva [37, 43].
Dados de janeiro de 2009, ainda não divulgados, mostram que em 2008, foram
registrados 31.191 casos novos, sendo que 1216 casos foram diagnosticados como recidiva
(Tabela 1.3).
Tabela 1.3: úmero absoluto de casos notificados de Hanseníase, por modo de entrada,
segundo UF de residência e Região, Brasil – 2008
UF Residência
Caso
Novo
Transf. de
outro Estado
Transf. de
outro Pais
Recidiva
Outros
Ingressos
Total
Região Norte 7146
116
2
290
263
7817
Rondonia 981
11
2
14
36
1044
Acre 242
2
0
13
3
260
Amazonas 647
11
0
69
24
751
Roraima 170
5
0
7
5
187
Para 3701
55
0
157
137
4050
Amapa 122
5
0
10
5
142
Tocantins 1283
27
0
20
53
1383
Nordeste 12.455
134
4
506
354
13.453
Maranhao 3752
54
2
119
209
4136
Piaui 1261
11
0
59
28
1359
Ceara 1932
22
1
66
16
2037
Rio Grande do
Norte
231
2
0
4
2
239
12
Paraiba 497
6
0
20
9
532
Pernambuco 2016
12
0
109
36
2173
Alagoas 340
7
0
10
5
362
Sergipe 403
0
1
18
6
428
Bahia 2023
20
0
101
43
2187
Sudeste 5.918
73
3
233
130
6.357
Minas Gerais 1595
21
1
28
48
1693
Espirito Santo 1028
8
0
22
23
1081
Rio de Janeiro 1487
10
0
65
23
1585
Sao Paulo 1808
34
2
118
36
1998
Sul 1.523
12
2
94
41
1.672
Parana 1182
8
2
78
23
1293
Santa Catarina 182
4
0
10
15
211
Rio Grande do Sul 159
0
0
6
3
168
Centro Oeste 4.149
50
2
93
165
4.459
Mato Grosso do
Sul
476
5
1
19
21
522
Mato Grosso 1461
18
0
49
44
1572
Goias 1982
20
1
21
97
2121
Distrito Federal 230
7
0
4
3
244
Brasil 31.191
385
13
1.216
953
33.758
Ignorado/Em
Branco
9
0
0
0
1
10
Fonte: SINAN/SVS-MS; Dados preliminares ainda não divulgados (22/01/2009)
Estudos recentes têm demonstrado que 19% de 265 Mycobacterium. leprae isolados
de biópsias de pacientes de Hanseníase foram resistentes a várias concentrações de DDS,
RMP ou CLO, 6.23% delas resistentes a mais de uma droga [44].
Cunha e colaboradores em 2007, encontraram um dado oficial de entrada de casos de
Hanseníase, residentes em D. Caxias, por recidiva no SINAN, de 6%, no período de 1990-
2001. A validação no arquivo local, entretanto, constatou que apenas 0,35% eram recidivas. O
erro no caso parece ter sido provocado na mudança do sistema de informação anterior para o
SINAN, na Secretária de Estado da Saúde do Rio de Janeiro (SES-RJ) [45]. Por outro lado,
sabe-se que provavelmente o número de casos retratados nas unidades locais seja maior que
as notificações recebidas com diagnóstico de recidiva [46]. Em estudo das características
clínicas de 155 pacientes retratados como recidiva em Pernambuco [47], constatou que 34%
deles apresentavam reação pós-alta sendo que 54% foram retratados nos primeiros três anos
após alta, baseando-se principalmente em critérios diagnósticos clínicos.
13
A vigilância epidemiológica dos casos de recidiva é o principal meio de avaliação da
eficácia do esquema terapêutico da Hanseníase. Entretanto, os estudos de recidiva na
literatura utilizam, muitas vezes, diferentes indicadores epidemiológicos, o que dificulta uma
comparação dos resultados. Segundo Daumerie e Pannikar (1995) [48], quando o número
absoluto de recidivas ultrapassarem 1%, está indicada a confirmação dos casos, e estudo das
respectivas coortes. Maroja e colaboradores (2000) encontraram uma taxa bruta de 0,95% em
dados secundários de 29.000 casos com alta entre 1982-2001, submetidos aos recentes
esquemas terapêuticos, em Manaus [49]. Nery e colaboradores (2003) encontraram uma taxa
bruta de 0,18% em coortes de 1584 pacientes, curados entre 1986 – 2000 (RJ) [50]. Oliveira
(1996) encontrou percentual de 0,33/pac/ano de observação avaliando coortes de 155
pacientes com média de 50 meses pós-alta de PQT fixa em 1995 (AM e RJ) [51].
Os dados da Organização Mundial de Saúde informam que as taxas de recidiva em
Hanseníase após os tratamentos poliquimioterápicos com duração fixa preconizada de acordo
com a classificação operacional variam de 4.0% a 0.12% num seguimento de nove anos. Estes
dados estão sujeitos a críticas em virtude da falta de padronização de critérios para um caso de
recidiva e pelas diferentes condições operacionais dos estudos. No Brasil, a inexistência de
critérios clínicos e laboratoriais para o diagnóstico correto de recidiva indica a necessidade
urgente de desenvolvimento de Projetos de Pesquisa com metodologia científica apropriada
cujo produto final seja constituído por parâmetros técnicos para aplicação na rede básica do
Sistema Único de Saúde. Tradicionalmente utilizada, a técnica de Shepard, com inoculação do
produto da coleta de material da lesão de pele, obtida após PQT, em pata de camundongo,
caracteriza-se por um alto custo e utiliza muitos animais, tempo de resultado de
aproximadamente um ano devido ao tempo longo de divisão do M. leprae (11-14 dias). Essas
características da técnica dificultariam uniformizar um trabalho em diferentes estados. A
análise da sequência de DNA, através da reação em cadeia de polimerase (PCR) pode
identificar mutações associadas com resistência no genoma do M. leprae, e localizar os casos
de resistência. Constitui-se num método “in vitro”, rápido e de menor gasto (5 a 10% do custo
da inoculação) [52, 53].
1.9.1. Resistência à rifampicina.
As rifamicinas são uma classe de componentes lipofílicos que difundem-se
rapidamente no envelope celular hidrofóbico das micobatérias. O mais conhecido membro
deste grupo é a rifampicina, uma droga de primeira linha para o tratamento da tuberculose,
14
Hanseníase e outras doenças causadas por micobactérias. A RNA polimerase é um complexo
de enzima que existe em duas formas: a parte central da enzima (consistindo de duas
subunidades α, e uma cópia de cada uma das subunidades β, β’ e ω) [54]. Monitorizar a
existência de resistência a rifampicina é muito importante, pois é a droga mais bactericida da
PQT. Segundo Ji B. (2002), o uso irregular das drogas (auto-administradas) pode levar ao
surgimento de resistência a rifampicina [53].
O mecanismo molecular da resistência a rifampicina foi primeiramente descrito em
Escherichia coli e foi elucidado em 1993 em M leprae. O alvo da rifampicina é a subunidade
beta da RNA polimerase dependente de DNA, que é decodificada pelo gene rpoB do
M.leprae, bloqueando a transcrição. Uma substituição no códon da serina (posição 531) pela
leucina, causada por uma mutação deste gene, parece ser a principal causa da resistência a
rifampicina. A região do genoma de M. leprae contendo o gene rpoB (Figura 1.4) foi uma das
primeiras a serem sequenciadas e analisadas. Todas as mutações associadas ao rpoB com
resistência em micobactéria são localizadas nos domínios 500-540 – sistema numérico usado
em rpoB de E. coli [55-59]
.
Figura 1.4: Sequência parcial do gene rpoB de isolados clínicos
de M. leprae. Extraído de Maeda, S. 2001[60].
1.9.2. Resistência à dapsona.
A diamino-diphenyl-sulfone (DDS), ou dapsona, foi o primeiro antibiótico efetivo
contra a Hanseníase em todo mundo. Ela age inibindo a síntese de ácido fólico, pela
competição com o ácido para-amino-benzóico (PABA) na bactéria, devido a sua similaridade
estrutural, inibindo assim, a formação de DNA e RNA, impedindo a replicação e transcrição
15
do mesmo. O PABA é essencial para o M leprae, para a síntese de ácido fólico e
consequentemente para a síntese de purinas, envolvidas diretamente na formação de DNA e
RNA. Desde que a dapsona foi usada como monoterapia, o M. leprae resistente a dapsona
aparece em torno de 80% das pessoas com recidiva (resistência secundaria) e em 40% nos
novos casos (resistência primária). Resistência à dapsona foi molecularmente detectada em
1964 e envolve duas mutações no gene folP1 – Figura 1.5
.
Em 1976, foi demonstrada, pela
primeira vez, a presença de pacientes com resistência primária à dapsona. Para isso, foram
inoculados na pata de camundongos, bacilos de oito pacientes com Hanseníase virchowiana,
virgens de tratamento, tendo sido demonstrado que cinco cepas eram dapsona-resistentes [61-
68].
A resistência à sulfona é da maior importância em todos os sentidos. Para os serviços
médicos: porque todas as drogas alternativas são mais dispendiosas e, frequentemente, mais
tóxicas; para o paciente: porque a recorrência resultará num período maior de doença e,
muitas vezes, em dano tecidual adicional; para os contatos: porque a resistência primária só
será detectada posteriormente, período no qual poderá ocorrer deterioração clínica importante.
Após a PQT, a resistência à dapsona está menos comum, embora a prevalência não seja bem
conhecida, pois existem poucos trabalhos sobre o assunto [56, 58, 69].
Figura 1.5: Sequência nucleotídica parcial do gene folP1 da cepa Thai
53 e de isolados clínicos de M. leprae. Extraído de Maeda, S.
2001.[60].
16
1.9.3. Resistência ao ofloxacin.
De todos os medicamentos que estão atualmente sendo testados, inegavelmente as
quinolonas são as mais promissoras. As quinolonas são derivadas do ácido carboxílico
piridona e ácido nalidíxico, e foram sintetizadas no início dos anos 60. Sua atividade foi
grandemente aumentada com a introdução de um átomo de flúor na posição 6 do anel
quinoleínico. Alguns desses compostos mais potentes, como as fluorquinolonas tem afinidade
por uma enzima alvo, a DNA girase (DNA-topoisomerase II), responsável pelo enrolamento
do DNA bacteriano. Em concentrações não muito maiores do que sua concentração inibitória
mínima, muitas delas apresentam intensa atividade antibacteriana. São também ativos contra o
M. tuberculosis e outras micobactérias cultiváveis. A DNA girase e responsável, em parte,
pela manutenção da topologia do DNA dentro da célula bacteriana [70].
A DNA girase consiste de duas proteínas, gyrA e gyrB, que formam um complexo de
enzima ativa A
2
B
2
. A girase introduz mudanças na topologia do DNA circular fechado por
clivagem da hélice de ambas as fitas, formando quatro bases fracas. As quinolonas enxertam a
toxidade na célula bacteriana por estabilizar a fenda da dupla hélice de DNA desfavorecendo
a ligação da girase, afetando a replicação, transcrição e reparo. Mutações em ambos, na
subunidade gyrA e gyrB conferem resistência ou hipersensibilidade à ação das quinolonas
[71].
Figura 1.6: Estrutura e sequência nucleotídica parcial do gene gyrA de
isolados clínicos de M. leprae. Extraído de Maeda, 2001.
17
1.10. Avanços da biologia molecular no estudo das micobactérias.
A identificação das micobactérias foi tradicionalmente baseada na bioquímica e
característica de crescimento. Devido à micobactéria se multiplicar lentamente esse tipo de
identificação leva semanas de incubação. Com a introdução de novos métodos de
identificação, seqüenciamento do 16S DNA ribossomal, cromatografia de alta resolução
(HPLC), PCR e análise de restrição do gene hsp65 (PRA), o número de novas espécies tem
aumentado dramaticamente nos últimos anos, com espécies, tais como, M. genavense, M.
interjection, M. triplex, M. celatum e M. lentiflavum [72].
Nas últimas três décadas, testemunhamos um rápido progresso no entendimento da
biologia molecular do M. leprae. Em seguimento ao completo sequenciamento do genoma do
bacilo em 2001, os estudos evoluíram drasticamente. Com a informação sobre a estrutura
genética, diversas técnicas de biologia molecular têm sido desenvolvidas para diagnosticar a
resistência medicamentosa e a epidemiologia da Hanseníase [73].
Os mais modernos métodos de identificação auxiliares de diagnóstico incluem
cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), uso de sondas de DNA, reação em cadeia de
polimerase, (PCR), microarranjo de DNA [9, 74]. Entretanto, com o declínio da prevalência
mundial da Hanseníase, houve uma redução no interesse do estudo de novos métodos de
diagnóstico. Ainda assim técnicas moleculares para o estudo da dinâmica de transmissão e
resistência às drogas continuam a ser necessárias, principalmente no diagnóstico das recidivas
e no controle de casos novos [73].
18
2. OBJETIVOS
2.1. Geral:
• Avaliar as mutações associadas à resistência medicamentosa do M. leprae à
Rifampicina, Dapsona e Ofloxacin em pacientes com recidiva de Hanseníase
através da análise das sequências genéticas.
2.2. Específicos:
• Padronizar, aperfeiçoar e avaliar métodos de análise de sequências de três
genes associados com resistência, sendo rpoB (rifampicina), folP (dapsona) e
gyrA, B (ofloxacin).
• Verificar a natureza e frequência das mutações nos diferentes genes.
19
3. METODOLOGIA
3.1. Investigação de resistência em M. leprae
Esta Dissertação de Mestrado está inserida no projeto “Magnitude e caracterização das
recidivas de Hanseníase em pacientes submetidos aos esquemas poliquimioterápicos / OMS e
apoio à identificação de cepas resistentes do M. leprae em cinco estados brasileiros” para
padronizar a definição de recidiva e avaliar a magnitude do problema no Brasil e coordenado
pela Dra. Maria Leide W de Oliveira, aprovado para apoio financeiro dentro do edital MCT-
CNPq / MS-SCTIE-DECIT – Nº 35/2005.
Investigamos 85 pacientes, dentre os quais, sete recebemos a primeira biopsia e a
biopsia da recidiva, enquanto os demais somente recebemos a biopsia da recidiva.
3.2. Recebimento das amostras clínicas
No presente estudo utilizamos amostras dos pacientes com suspeita ou recidiva
confirmada de Hanseníase de moradores do município do Rio de Janeiro, encaminhados ao
ambulatório Souza Araújo –Laboratório de Hanseníase – IOC – Fiocruz – RJ e da Disciplina
de Dermatologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho - UFRJ.
A informação clínica/epidemiológica dos pacientes foi colhida e registrada em
formulário (Anexo 1).
3.3. Protocolo de recebimento de amostras, informação clínica/epidemiológica e
estocagem.
As amostras eram biópsias de pele, colhidas com “punch” de 6mm, através de um
procedimento idêntico ao utilizado para apoio do diagnóstico. Imediatamente após a coleta, as
biopsias foram colocadas em tubo de microcentrifuga com tampa de rosca contendo etanol
70% e mantidas a temperatura ambiente.
20
3.4. Processamento das amostras.
3.4.1. Extração do DA com sephaglas
Utilizamos um protocolo “in house” adaptado do FlexiPrep kit (Amersham Biosciences)
para extração de DNA a partir de amostras de tecido.
A biopsia foi re-hidratada com água estéril durante 10 minutos e foi retirado o excesso
de água. À biopsia foram adicionados 100 l de beads (micropartículas de vidro) e água e esta
foi macerada com bastão descartável. Foram adicionados 150 a 200 µl de sephaglas
(FlexiPrep kit), agitou-se gentilmente por 1 minuto para dissolver o “pellet”. As amostras
foram centrifugadas a 14.000 rpm por 15 segundos e retirou-se o sobrenadante. Lavou-se o
“pellet” com 200 µl do tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 2 mM EDTA, 200 mM
NaCl – adicionado etanol a concentração final de 60%), ressuspendeu-se o “pellet” utilizando
o vortex e centrifugou-se a 14.000 rpm de 2 a 3 minutos. Após a centrifugação, removeu-se o
sobrenadante e adicionou-se 300 µl de etanol 70 % ressuspendendo o “pellet” novamente.
Centrifugou-se por 2 – 3 minutos a 14.000 rpm e removeu-se o sobrenadante. Ressuspendeu-
se parcialmente o “pelle”t em água milli-Q, deixando secar a temperatura ambiente por 10
minutos. Adicionou-se 50 a 100 µl de água milli-Q para ressuspender o “pellet” por 5 minutos
a temperatura ambiente, utilizando o vortex ocasionalmente para manter a sephaglas em
suspensão. Centrifugou-se a suspensão por 1 minuto, transferiu-se o sobrenadante para outro
tubo onde foram armazenados a -20°C.
3.4.2. Extração de DA com Qiagen
Foi utilizado o kit “DNeasy Blood & Tissue Kit – Spin – Column Protocol N. Cat.
69506” da Qiagen na extração do DNA.
A biopsia foi cortada em pequenos pedaços e colocada em tubo de 1,5 ml contendo
200l de solução diluente (10% de proteinase K em tampão ATL). A solução foi misturada
com auxílio do vortex e incubada a 56 ºC até completar a lise celular (misturando com o
vortex, ocasionalmente durante a incubação). Após a incubação, a solução foi misturada com
o vortex durante 15 segundos e adicionou-se 200 l de tampão AL. A solução foi novamente
misturada com o vortex e então adicionou-se 200 l de etanol (96 – 100%). Após uma nova
mistura com auxílio do vortex, pipetou-se a solução para a coluna mini spin acoplada a um
tubo coletor de 2 ml e centrifugou-se a aproximadamente 6.000 xg (8.000 rpm) durante 1
21
minuto. Descartou-se o sobrenadante e o tubo coletor. Colocou-se a coluna em outro tubo
coletor de 2 ml. Adicionou-se 500 l de tampão AW1 Centrifugou-se a aproximadamente a
6.000 xg (8.000 rpm) durante 1 minuto. Descartou-se o fluído e tubo coletor. Colocou-se a
coluna em um novo tubo coletor, adicionou-se 500 l de tampão AW2. Centrifugou-se
durante 3 minutos a 20.000 xg (14.000 rpm). Descartou-se o fluído e o tubo coletor.
Transferiu-se a coluna spin para um novo tubo de microcentrifuga (eppendorf de 1,5 ml ou 2
ml) e adicionou-se 200 l de tampão AE para eluir, incubou-se por 1 minuto a
aproximadamente 6.000 xg (8.000 rpm). O DNA foi armazenado a – 20 ºC.
3.5. Análise genética.
Os DNAs purificados das biópsias de pacientes com recidiva, foram usados na
amplificação e sequenciamento dos genes rpoB, folPI e gyrA e B. [56, 75, 76].
3.5.1. Reação da polimerase em cadeia (PCR).
3.5.1.1. Iniciadores utilizados:
1. Iniciadores sistema de PCR A:
• Mrpo – F 5’ – GGT GGT CGC CGC TAT CAA G – 3’
• Mrpo – R 5’ – TTT GCG GTA CGG TGT TTC G – 3’
2. Iniciadores sistema de PCR B:
• folP – F 5’ – TAC TTA CTG TAA TCC CCT GTG CTG – 3’
• folP – R 5’ – TTG ATC CTG ACG ATG CTG TC – 3’
• gyrA – F 5’ – TAA GTC AGC ACG GTC AGT CG
– 3’
• gyrA – R 5’ – GAC ACA CAA TAA CGC ATC GC – 3’
• gyrB – F 5’ – ACT GAT CCT CGA AGT TCT GAA CTG – 3’
• gyrB – R 5’ – CAA TGC CGT AAT AAT TGC TTG AA – 3’
3.5.1.2.Condições dos sistemas de PCR:
PCR A:
• 1 U de Taq DNA polimerase, 100 M de cada dNTP, 0,5 M dos iniciadores (MrpoB
F e MrpoB R), 2,0 mM de MgCl
2
em um volume final de 50l. A amplificação foi
realizada nas seguintes condições: 94ºC durante 5 minutos, 1 ciclo; seguido de
desnaturação a 94ºC durante 45 segundos e anelamento de 65 – 60ºC durante 45
22
segundos, diminuindo 1ºC por ciclo (Touchdown), 72ºC de extensão durante 90
segundos; 94ºC durante 45 segundos, 59ºC durante 45 segundos e 72ºC durante 90
segundos, 30 ciclos; e 72ºC durante 7 minutos, 1 ciclo.
PCR B:
• 1 U de Taq DNA polimerase, 100 M de cada dNTP, 0,5 M dos iniciadores (folP –
F, folP – R, gyrA – F, gyrA – R, gyrB – F, gyrB – R ), 1,5 mM de MgCl
2
em um
volume final de 50l. A amplificação foi realizada nas seguintes condições: 94ºC
durante 5 minutos, 1 ciclo; seguido de desnaturação a 94ºC durante 45 segundos e
anelamento de 68 – 63ºC durante 45 segundos, diminuindo 1ºC por ciclo durante
(Touchdown ), 72ºC de extensão durante 90 segundos; 94ºC durante 45 segundos,
58ºC durante 45 segundos e 72ºC durante 90 segundos, 35 ciclos; e 72ºC durante 10
minutos, 1 ciclo.
3.5.2. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de PCR foram confirmados por eletroforese em gel de agarose 3% a 80V.
Após a corrida, o DNA foi corado por brometo de etídio (0,5 g/ml) e visualizado sob luz
U.V. em um transluminador. Os produtos amplificados foram purificados e sequênciados.
Figura 3.1: Eletroforese em gel de agarose 3%, com
marcador de 100 pb. Primer utilizado folP.
23
3.5.3. Purificação dos produtos de DA
Para a purificação dos produtos de DNA amplificados foi utilizado o kit
“ChargeSwitch PCR Clean-up Kit”.
Este sistema permite rápida e eficiente purificação dos produtos de PCR de sal,
iniciadores, dNTPs e outros reagentes que não são ácidos nucléicos. Depois do PCR, os
produtos são purificados em pouco tempo sem o uso de centrífugas ou solventes orgânicos. O
Kit é específico para purificação de fragmentos de DNA variando de 90b a 40kb e permite a
variação do volume a ser purificado de modo a aumentar o seu rendimento. O ChargeSwitch é
uma tecnologia nova baseada em esfera magnética que provê uma superfície de ligação que é
dependente de carga e do PH do tampão circundante para facilitar a purificação do ácido
nucléico. Em baixo PH, as esferas magnéticas tem uma carga positiva e se ligam ao ácido
nucléico carregado negativamente. Proteínas e outros contaminantes não se ligam e são
descartados com o tampão de lavagem. Para eluir o ácido nucléico, a carga na superfície é
neutralizada por elevação do H para 8,5 usando um tampão de eluição com baixo sal. O DNA
urificado elui instantaneamente neste tampão de eluição. A recuperação é muito boa e permite
que um volume pequeno da reação de PCR seja utilizado [77].
Para um rendimento satisfatório para os nossos objetivos, utilizamos o seguinte
protocolo na reação:
Tranferiu-se 25 µl do produto amplificado para um tubo de eppendorf estéril de 1,5 ml.
Colocou-se 25 l do tampão de purificação (purification buffer N5) e 3 l de bead (magnetic
beads). Misturou-se o conteúdo do eppendorf e o colocou na estante com imã por 1 minuto.
Após 1 minuto descartou-se o todo o sobrenadante. Após o descarte do sobrenadante, o
epeendorf foi retirado da estante e foram adicionados 80 l do tampão de lavagem (wash
buffer W12), e misturou novamente até dissolver todo o pellet. O eppendorf foi colocado
novamente na estante com imã por mais 1 minuto, e novamente descartou-se todo o
sobrenadante. Repetiu-se a fase de lavagem do DNA com Wash Buffer e novamente
descartou-se todo o sobrenadante. Após a segunda lavagem, colocou-se 23 l do tampão de
eluição (elution buffer E5) e misturou o produto até dissolver o pellet. O eppendorf foi levado
à estante com imã novamente, esperou-se 1 minuto e 19 l do sobrenadante foram
transferidos para o tubo de eppendorf estéril de 0,5 ml, onde o DNA purificado ficou
armazenado.
24
3.5.4. Sequenciamento.
3.5.4.1.Condições do PCR de sequenciamento
Os métodos de sequenciamento automático utilizam os nucleotídeos de terminação e
um tipo de marcação que permite a identificação das cadeias resultantes. A marcação
empregada neste processo é feita com moléculas fluorogênicas, ou seja, compostos capazes de
emitir fluorescência quando excitados por uma fonte de luz. No sistema utilizado pelo nosso
laboratório (Plataforma PDTIS/FIOCRUZ [sistema da Applied Biosystem]), a fonte de luz
empregada para excitação dos fluoróforos é um laser de argônio acoplado a um sofisticado
sistema óptico, capaz de direcionar o feixe de laser precisamente sobre as amostras a serem
analisadas. O sinal fluorescente gerado pela excitação com laser é direcionado pelo sistema
ótico a um sistema digital, capaz de decodificar o sinal eletrônico, transmitindo-o ao
comutador acoplado o qual, através de softwares específicos irá traduzir este sinal em uma
sequência de DNA.
As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando-se o “Kit ABI RISM Big
Dye Terminator v3.1” (PE Applied Biosystems) de acordo com as informações do
fabricante e adaptadas em nosso laboratório. Neste sistema a marcação fluorescente encontra-
se na extremidade 3’ do nucleotídeo de terminação, com cada cor correspondendo à uma base
específica. Sendo assim, é possível sequenciar uma amostra de DNA com uma única reação,
contendo todos os terminadores juntos. Em cada reação de sequenciamento, utilizamos
aproximadamente 20ng do produto amplificado e os iniciadores internos desenhados apenas
para o sequenciamento e com finalidade de resolver bem o início da sequência pegando os
iniciadores externos. As reações foram analisadas no sequenciador de 48 capilares “ABI
PRISM 3730 Genetic Analyzer” (Applied Biosystems), situado no Laboratório de Biologia
Molecular da FIOCRUZ/Plataforma PDTIS.
Para a reação de sequenciamento, utilizamos as seguintes concentrações: 1 l de DNA
purificado; 1 l do Primer utilizado (folP, rpoB, gyrA, gyrB) na concentração de 3,2 pmol;
0,5 l de BigDye; 1,5 l de Tampão 5X; 6 l de H
2
O.A reação de sequenciamento foi
realizada nas seguintes condições: 96 °C por 10 segundos, 50 °C por 5 segundos, 60 °C por 4
minutos, durante 40 ciclos.
25
3.5.4.2. Precipitação do produto de sequenciamento em placa
Após a reação de sequenciamento, Adicionou-se 30 µl de isopropanol 75% à placa,
agitou-se rapidamente durante 10 segundos e foi deixado em repouso durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Centrifugou-se a 4000 rpm por 45 minutos a 20 °C. Após a
centrifugação, a placa foi invertida em papel toalha, e foi agitada levemente para cair todo o
sobrenadante (A placa foi levada a centrifuga novamente onde foi dado um spin para limpar a
parede com a placa invertida em papel klinex, 500 rpm no máximo). Adicionou-se 50 µl de
etanol 75%, centrifugou-se à 4000 rpm por 15 minutos. Inverteu-se a placa em papel toalha
Klinex e foi dado um spin rápido (como no passo anterior até chegar a 500 rpm). Secou-se o
pellet a 60 °C por 10 minutos no próprio termociclador. Se não for sequenciar logo em
seguida, congele a placa. Antes do sequenciamento, ressuspendeu-se em 10 µl de formamida
(ultra pura), e a placa foi deixada no termociclador durante 3 minutos a 95 °C e logo em
seguida colocada no gelo úmido (choque – térmico para desnaturação). Após a desnaturação a
placa foi levada ao sequenciador.
3.5.4.3.Análise da sequência
O resultado do sequenciamento foi analisado através do programa SeqScape versão
2.6 da Applied Byosistems (Figuras 3.3 e 3.4). Este software é uma ferramenta de
alinhamento e comparação de sequências que permite uma rápida identificação de variantes
na sequência. O software permite alinhar e comparar as sequências obtidas diretamente do
sequenciador automático contra uma sequência referencia. Ele é capaz de alinhar e comparar
múltilas amostras mostrando o eletroferograma e o índice de qualidade de cada sequência e o
índice de qualidade do alinhamento e da comparação permitindo dois tipos de análises:
• Identificação de variantes nucleotídicas e aminoácidicas. O software identifica
posições que diferem da sequência referencia e as classifica como variantes
conhecidas ou desconhecidas.
• Identificação de genótipos, alelos ou haplótipos de uma biblioteca. Além da
identificação de variantes, o software busca em bibliotecas e bases de dados de
genótipos, alelos ou haplótipos e identifica o alelo que mais rigorosamente se
iguala com a sequencia consenso. As sequências consenso utilizadas para
comparação foram retiradas do Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/).
26
Para facilitar a análise, o software gera um relatório das variantes encontradas na
comparação.
Figura 3.2: Programa SeqScape versão 2.6 da Applied Byosistems
3.5.5. Controles utilizados
Como controle positivo da reação de PCR, recebemos outras cinco biopsias de
pacientes multibacilares do Ambulatório Souza Araújo além dos controles enviados pelo Dr.
Brennan e Dra. Vara Vissa do “Mycobacteria Research Laboratories, Department of
Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, USA” (M. leprae
NHDP-63, 4923, I480, I487, 3045, Thai 53, Thai 55, A606 e 3039).
Para determinar a sensibilidade do sistema de PCR e seqüenciamento na identificação
dos SNPs, utilizamos 3 plasmídios (folP 101, folP 102 e folP 103), demonstrando que o
programa é capaz de identificar mutações de um nucleotídeo (Figura 3.3). Plasmídio folP 101
(sem mutação, figura 3.4), plasmídio folP 102 (substituição de uma citosina por uma timina
no nucleotídeo 158, figura 3.5), folP 103 ( substituição de uma citosina por uma guanina no
nucleotídeo 164, figura 3.5).
27
Figura 3.3: Plasmídios folP. Em destaque os 3 plasmídios utilizados (em verde); as
mutações no folp 102 e folp 103 e o folp 101 sem mutação (em vermelho).
Figura 3.4: Plasmídio folP 101 sem mutação.
28
Figura 3.5: A) Plasmídio folP 102 com a substituição de uma citosina por uma timina no
nucleotídeo 158. Em destaque a mutação (em vermelho) e o pico vermelho de timina
substituindo o pico azul de citosina (em preto). B) Plasmídio folP 103 com a substituição de
uma citosina por uma guanina no nucleotídeo 164. Em destaque a mutação (em vermelho) e o
pico preto de guanina substituindo o pico azul de citosina (em preto).
3.6. Análises estatísticas
Utilizamos o teste binomial para analisar a mutação no gene gyrA onde avaliamos a
proporção de C e T na população estudada, e o resultado encontrado foi que os dois SNPs
estão distribuídos em igual proporção na população.
A
B
29
4. RESULTADOS
Trabalhamos na investigação de resistência em M leprae provenientes de pacientes
com ou suspeita de recidivas do estado do Rio de Janeiro, utilizando os seguintes alvos: gene
rpoB (rifampicina), folP (dapsona), gyrA e gyrB (ofloxacim). A tabela 4.1 mostra o número
de biopsias processadas e a situação atual dos sequenciamentos obtidos até agora.
Tabela 4.1: Genes analisados.
Sequenciadas
ão
amplificaram
Total
folP
38 amostras 35 amostras 73
amostras
rpoB
43 amostras 32 amostras 75
amostras
gyrB
45 amostras 26 amostras 71
amostras
gyrA
47 amostras 21 amostras 68
amostras
4.1. Pacientes e informação clínica/epidemiológica
A maioria dos pacientes reside na região da Leopoldina e Baixada Fluminense (Nova
Iguaçu, Nilópolis, São João de Meriti e Belford-Roxo, Duque de Caxias, Magé, Itaguaí).
Regiões onde a detecção de casos novos é bastante elevada (anexo 2).
Os pacientes tinham baciloscopia positiva de 1+ a 6+, embora alguns tivessem
baciloscopia zero ou apenas poeira bacilar, (tabela BAAR, anexo 3). Nos de bciloscopia até
2+ obtivemos 71,2% de amplificação no PCR, e nas amostras com índices maiores do que 4+,
o percentual de amplificação aumentou para 85,7% (tabela 4.2).
Tabela 4.2: Relação entre baciloscopia e % de amplificação
Índice de
baciloscopia
% de Amplificação Não amplificaram
0+-2+ 71,2% 38,8%
2+-4+ 83,9% 16,1%
4+-6+ 85,7% 14,3
30
4.2. Recebimento das amostras e processamento.
Recebemos 85 biopsias em etanol a 70% referentes a 78 pacientes que foram
processadas e analisadas para os genes de interesse no estudo.
4.3. Analise genética.
4.3.1. SPs e resistência.
Trabalhos relatam “Single-nucleotide polymorphism (SNPs)” como uma possível
ferramenta de apoio epidemiológico no estudo da Hanseníase, bem como, transmissão,
recidiva, re-infecção, adoecimento recente e reservatórios: ambientais ou animais [78].
Estamos utilizando a identificação das SNPs nos genes folP, rpoB, gyrA e gyrB como apoio
na investigação de resistência medicamentosa aos fármacos utilizados no tratamento da
Hanseníase.
4.3.1.1.Gene rpoB
Figura 4.1: Sequência Z14314 do gene rpoB extraída do
PUBMED. Em destaque os primers que nós utilizamos (vermelho) e
as regiões citadas na literatura como causadoras de resistência
(amarelo).
31
Para as pesquisa de mutações no gene rpoB conseguimos finalizar o sequenciamento
em 43 das 85 biopsias recebidas. Novamente, algumas amostras não amplificaram (32
amostras), provavelmente porque trabalhamos com amostras em que a baciloscopia era menor
que 1+. Outras amostras (7) ainda estão em fase de processamento, mas até agora nenhuma
mutação foi encontrada no gene rpoB (figura 4.5).
Figura 4.2: Sequenciamento rpoB. Não apresenta mutação.
32
4.3.1.2.Gene folP
Figura 4.3: Sequência AL023093 do gene folP extraída do PUBMED. Em destaque os
primers que nós utilizamos (vermelho) e as regiões citadas na literatura como causadoras de
resistência.
Das 85 biopsias recebidas durante a investigação de resistência em apenas 38
conseguimos finalizar o sequenciamento. Como utilizamos amostras com baciloscopia menor
que 1+, algumas amostras não amplificaram (35 amostras) e outras ainda estão em fase de
processamento (9 amostras), até o momento nenhuma mutação foi encontrada no gene folP
(Figura 4.2)
33
Figura 4.4: Sequenciamento folP: Não apresenta mutação.
Embora nenhuma mutação tenha sido encontrada no gene folP alguns isolados
demonstraram aparente infecção mista e ainda estão sendo investigados (figura 4.3). Para que
tivéssemos certeza de que o sistema estava sendo eficiente utilizamos, durante o estudo, três
controles para o gene folP: folP 101 sem mutação ou seja selvagem; folP 102 contendo a
mutação no aminoácido 53 e o folP 103 contendo a mutação no aminoácido 55 (figuras 3.5 a
3.8).
34
Figura 4.5: Sequenciamento folP. Suspeita de cultura mista
(Terceiro e décimo primeiro nucleotídeo). A) K indicando um
pico de guanina e um de timina no terceiro nucleotídeo e o Y
indicando um pico de citosina e um de timina no décimo primeiro
nucleotídeo; B) Um pico de guanina (preto) e um de timina
(vermelho) no terceiro nucleotídeo; C) Um pico de citosina (azul)
e um de timina (vermelho) no décimo primeiro nucleotídeo.
A
B
C
35
4.3.1.3.Gene gyrB
Figura 4.6: Sequência NC 002677 do gene gyrB extraída do
PUBMED. Em destaque os primers que nós utilizamos (vermelho) e
a região citada na literatura como causadora de resistência (amarelo).
Das 85 biopsias recebidas durante a investigação de resistência em relação ao gene
gyrB, em apenas 45 conseguimos finalizar o sequenciamento, 11 estão em fase de
processamento e 26 amostras não amplificaram, Até agora nenhuma mutação foi encontrada
no gene gyrB (figura 4.7).
36
Figura 4.7: Sequenciamento gyrB, sem mutação
37
4.3.1.4. Gene gyrA
Figura 4.8: Sequência NC 002677 do gene gyrA extraída do
PUBMED. Em destaque os primers que nós utilizamos (vermelho),
a regiões citadas na literatura como causadoras de resistência
(amarelo) e a mutação encontrada (roxo).
Das 85 biopsias em 47 conseguimos finalizar o sequenciamento da gyrA. Foi
encontrada uma mutação silenciosa (substituição de uma citosina por uma timina) no
aminoácido/códon 92 (E.coli) referente ao códon 99 (Mycobacterium), que não havia sido
descrita anteriormente (Figura 4.9 e 4.10).
Figura 4.9: Sequenciamento gyrA. Em destaque a substituição da citosina por
uma timina (vermelho).
38
Figura 4.10: A) Sequenciamento gyrA comparando uma
amostra com a mutação e uma sem, em destaque a
mutação(vermelho). B) Pico de timina em vermelho; C) Pico de
citosina em azul.
Além disso, após os resultados obtidos através do sequenciamento do gene gyrA,
analisamos 7 pacientes que tinham uma biópsia anterior ao primeiro tratamento
poliquimioterápico indicado pela OMS e também tinham uma nova biópsia obtida no seu
regresso ao ambulatório ao reaparecerem os sintomas. Todos os pacientes usaram dapsona,
rifampicina e clofazimina por um ano (exceto dois deles que usaram rifampicina e dapsona).
Nenhuma mutação que causasse resistência foi encontrada nesses pacientes, porém foi
observada uma substituição (CT) que não alterava o aminoácido da girase, mas dividia o M.
leprae em duas populações circulantes distintas (tabela 4.3 e figura 4.11).
Tabela 4.3: Pacientes com Recidiva que possuem 2 biópsias analisadas – mutação no gyrA.
Pacientes/
diagnóstico
Biópsia/
Baciloscopia
Data Tratamento gyrA Reação Residência/
município
A - LL 2016 – poeira
bacilar
24305 – 5+
23/07/1992
06/11/2003
PQT/MB
C
T
N.I.
Tipo 2
RJ/Conjunto
Esperança
B – BL
18904 – 4+
23229 – 6+
19/09/1998
23/04/2001
PQT/MB
T
C
N.I.
Tipo 2
RJ/Acarí
A
B
C
39
C - LLS 18433 – 6+
21743 – 4+
16/09/1987
17/09/1997
PQT/MB
T
C
Tipo 2
Tipo 2
RJ/Vila da Penha
D - BL 18418 – 5+
22798 – 3+
27/08/1997
05/06/2000
PQT/MB
T
C
Tipo 1
Tipo 1
Baixada
Fluminense/Nova
Iguaçu
E - BL 18740 – 4+
24106 – 6+
25/05/1988
19/05/2003
PQT/MB
T
T
N.I.
Tipo 2
Baixada
Fluminense/ São
João de Meriti
F - LLS 19502 – 5+
23597 – 6+
17/01/1990
28/01/2002
PQT/MB
T
T
Tipo 2
Tipo 2
RJ/ Madureira
G - LLS 19500 – 4+
22477 – 4+
17/01/1990
04/08/1999
PQT/MB
T
C
Tipo 2
Tipo 2
Baixada
Fluminense/Nova
Iguaçu
N.I. – Dados não informados; Em amarelo os pacientes onde foi encontrada a substituição (CT) no seu retorno ao
ambulatório.
Figura 4.11: Sequenciamento gyrA: A) Amostra 9R sem mutação; B)
Amostra 14R com mutação em destaque (vermelho); C) Amostra 9R
com o pico azul de citosina em destaque (preto); D) Amostra 14R com
o pico vermelho de timina em destaque (preto).
A
B
C
D
40
5. DISCUSSÃO
Os critérios para o diagnóstico de recidiva em Hanseníase ainda não estão bem
definidos, variando de acordo com o lugar ou autor. No Brasil esse diagnóstico é baseado em
normas preconizadas pela OMS, como sendo a ocorrência de sinais de atividade clínica da
doença, após alta por cura. Atualmente, de acordo com o Ministério da Saúde para o
diagnóstico de recidiva após a PQT/OMS faz-se necessária a utilização de critérios de
suspeição e de confirmação [36, 37].
Para os pacientes paucibacilares (PB), os critérios de suspeição e confirmação são
estritamente clínicos e aplicados nos casos que, após alta por cura, apresentarem lesões
dermatoneurológicas novas ou exacerbação de lesões antigas, dor neural ou alterações de
sensibilidade cutânea que não respondem ao tratamento com corticosteróides. Para os
pacientes multibacilares (MB), os critérios são clínicos para a suspeição e clínico e
laboratorial para confirmação. São suspeitos os pacientes que apresentarem os sinais cutâneos
e neurológicos e que não responderem ao tratamento com talidomida e ou corticosteróides nas
doses e prazos recomendados. Para confirmação deve ser utilizado o critério clínico de
ausência de resposta às drogas anti-reacionais e os critérios laboratoriais dos exames
baciloscópico e histopatológico. Se o exame baciloscópico apresentar bacilos íntegros ou se
for observado um aumento de dois logs em qualquer sítio de coleta, quando comparado com o
exame da alta, confirma-se a recidiva. No exame histopatológico a confirmação é feita pela
presença de padrão multibacilar [37].
Entre os pacientes MB também é frequente a reação reversa ser confundida com
recidiva, mas a confirmação diagnóstica seria possível com a utilização do exame
baciloscópico, pela presença de bacilos íntegros, pela histologia e pela inoculação em pata de
camundongo [79].
O manejo do paciente após o tratamento de Hanseníase, em especial os que
apresentam episódios reacionais, traz muitas dúvidas quanto à presença de doença em
atividade ou quadro reacional. Esses episódios, bastante frequentes, principalmente nos
primeiros anos após a alta terapêutica, exigem o diagnóstico diferencial com as recidivas,
sendo necessários recursos clínicos e laboratoriais. Esse fato motivou o surgimento de vários
critérios de diagnóstico diferencial, na tentativa de orientar o clínico para adoção de medidas
mais ou menos padronizadas para cada situação. Apesar de esses critérios serem difundidos
na literatura médica, ainda há dificuldades na sua interpretação e no acesso aos exames
laboratoriais, além de não estarem bem definidos, verificando-se discordância entre os autores
que abordaram o tema [51, 80].
41
Las Águas em 1997 citou que as recidivas em geral não ocorrem antes dos seis anos
após alta, e em sua experiência pessoal elas ocorreram mais frequentemente entre seis e dez
anos [81]. Gebre refere que as recidivas usualmente ocorrem entre dois e três anos após o
término do tratamento, quando as reações também são mais prováveis [82]. Jamet et al. e
Marchoux,
em estudos controlados sobre recidiva em pacientes multibacilares, concluíram
que elas se apresentam mais tarde, de cinco a sete anos após o término do tratamento [83, 84].
Por outro lado, houve muitos avanços nos estudos dos eventos moleculares
responsáveis pela resistência às drogas em micobactérias. A detecção molecular de resistência
em micobactérias é baseada no estudo por PCR das mutações nos genes da bactéria que
codificam para os alvos das drogas. Outros métodos têm sido usados para a identificação de
mutações, como o SSCP (Single-stranded conformational polymorphism), “DNA
Heteroduplex Analysis” e “DNA microarray” [74, 85-88]. A técnica de SSCP foi
desenvolvida por Orita e colaboradores em 1989. O SSCP (Single-Strand Conformation
Polymorphism) é um método de triagem de mutações que permite detectar alterações na
mobilidade eletroforética de fitas simples de ácidos nuclécos em condições não-desnaturantes.
As fitas simples de ácidos nucléicos formam estruturas secundárias em solução que dependem
da composição/seqüência de bases e do tamanho da fita simples. Mudança em uma base na
seqüência do ácido nucléico amplificado pela PCR pode ser detectada por SSCP. Os perfis de
SSCP podem ser detectados por autorradiografia marcando-se os produtos da PCR com
substâncias radiativas. Atualmente são utilizados os sistemas de detecção por coloração dos
géis de eletroforese com nitrato de prata [89]. A HDA (Heteroduplex Analysis) se fundamenta
na separação de fitas híbridas de DNA por sistema eletroforético não-desnaturante. As fitas
duplas de DNA (produtos da PCR) de amostras com mutação são desnaturadas por
aquecimento e, a seguir, são hibridizadas com amostras sem mutação, formando- se hibridos
homoduplex e heteroduplex. As moléculas híbridas são separadas por eletroforese em gel
poliacrilamida não-desnaturante, sendo que as moléculas homoduplex e heteroduplex
apresentam diferentes migrações eletroforéticas. A detecção desses produtos pode ser
realizada por coloração com brometo de etídeo ou nitrato de prata [90]. A técnica de
microarranjos de DNA permite o estudo da expressão de um grande conjunto de genes em um
único experimento, possibilitando a investigação de respostas celulares em detalhes, bem
como inferências sobre função e interação entre genes. Porém, apesar dos microarranjos de
DNA serem atualmente uma das técnicas mais difundidas para estudos funcionais em
pesquisas nas áreas de biologia e medicina, é extremamente difícil analisar a enorme
quantidade de dados gerados sem auxílio computacional [91].
42
Escolhemos como população de estudo biopsias de pacientes do Estado do Rio de
Janeiro previamente tratados pelo esquema poliquimioterápico. Nossa abordagem para avaliar
a contribuição da resistência contra as drogas no desenvolvimento da recidiva foi baseada em
dados da literatura, mostrando que existe uma relação estreita entre resistência e mutações e
optamos como metodologia o sequenciamento. Na literatura encontram-se diversos casos de
resistência a dapsona, rifampicina e ofloxacin e alguns casos de resistência a mais de uma
droga. O padrão de resistência em M. leprae é semelhante ao padrão encontrado em M.
tuberculosis e é motivo de grande preocupação. Entretanto, para o sucesso da eliminação da
Hanseníase, ainda existem diversos problemas a serem investigados, como os locais de
infecção e reinfecção e a detecção dos casos de resistência [64, 92-94].
Neste trabalho avaliamos a presença e eventual natureza e a prevalência de mutações
em quatro genes que foram descritos a serem relacionados à resistência as drogas usadas no
tratamento PQT da Hanseníase. Até agora, após a análise da sequencia de folP, rpoB, gyrA e
gyrB em biópsias de 85 pacientes, não foi verificada a presença de nenhuma mutação que
indicasse resistência.
A ausência de mutações genéticas em genes que tradicionalmente foram associados
com o desenvolvimento de resistência a drogas tanto em M. leprae quanto em outras espécies
de micobactérias, tais como o M. tuberculosis [94], nos induziu a acreditar que a maioria dos
casos de recidiva em hansenianos não são causados por resistência medicamentosa e sim por
uma nova infecção ou por um quadro reacional que induziu a um erro de avaliação como
recidiva.
É importante refletir sobre a possibilidade de reinfecção, com base na irreversibilidade
da deficiência imunológica específica ao M. leprae [95]. Parece-nos plausível que re-infecção
por M. leprae nos nossos casos é a responsável por um novo episódio clínico da Hanseníase.
Levando em consideração o fato que muitos destes pacientes permanecem, após a cura, nos
locais onde foram infectados pela primeira vez e não mudam seu comportamento de risco,
podem continuar em contato com uma possível fonte de infecção. Entretanto não podemos
desconsiderar outros mecanismos que poderiam causar a recidiva como bacilos latentes ou
bacilos não alcançáveis pelas drogas,
como por exemplo, bacilos residindo e proliferando em
células de Schwann [96, 97].
Além disso, analisamos os resultados obtidos através do sequenciamento do gene
gyrA, onde dentre as 85 amostras clínicas seqüenciadas, 7 delas pertenciam a pacientes que
tinham uma biópsia anterior ao tratamento poliquimioterápico indicado pela OMS. Todos os
pacientes usaram dapsona, rinfampicina e clofazimina por um ano e foram considerados
curados. Ao analisarmos a biopsia obtida no seu regresso ao ambulatório após os primeiros
43
sintomas reaparecerem, não identificamos nenhuma mutação que causasse resistência.
Entretanto foi encontrada uma substituição (CT) que não havia na amostra da infecção
inicial e que poderia indicar a existência de duas populações circulantes distintas de M.
leprae. A reinfecção, então, seria por uma cepa de M. leprae ainda desconhecida pelo
hospedeiro.
Sequências peptídicas em regiões que determinam resistência a quinolonas (QRDR) na
subunidade A e B da DNA girase são bem conservadas entre os procariotos. Embora cada
uma destas regiões tenha de 98 a 100% de similaridade no gênero Mycobacterium, as
sequências nucleotídicas são espécie-específicas e podem ser usadas para distinguir espécies
fenotipica, bioquimica e geneticamente semelhantes como M. avium e M. intracellulare; M.
chelonae e M. abcessus; e M. fortuitum, M. peregrinum e uma terceira biovariante de M.
fortuitum [98]. As duas populações de M. leprae podem auxiliar no estudo epidemiológico da
Hanseníase traçando um perfil das cepas circulantes no estado do Rio de Janeiro.
Além desta mutação silenciosa encontrada no gene gyrA, também encontramos uma
suspeita de cultura mista ao analisar o gene folP. Na literatura encontram-se alguns trabalhos
sobre cultura mista e hetero-resistência em Mycobacterium tuberculosis [99-101], mas não há
registro de hetero-resistência em M. leprae Provavelmente, isso se dá devido à diferença na
metodologia utilizada nestes trabalhos onde o DNA analisado era obtido de culturas “in vitro”
inviabilizando a utilização de metodologia semelhante em trabalhos com M. leprae. Apenas
dois trabalhos, ambos de 2008 sugerem cultura mista em M. leprae. No primeiro, os autores
compararam VNTR (“Variable-Number Tandem Repeats”) e SNPs (“Single Nucleotide
Polymorphisms”) e em cinco de seis casos eles sugerem que a diferença encontrada nos seus
resultados é causada pela variabilidade encontrada no VNTR, porém em um dos seis casos
uma coinfecção parecia mais provável [78]. No segundo trabalho, os autores sugerem que
uma nova espécie de micobactéria seria a causadora da Lepra lepromatosa difusa (DLL), o
Mycobacterium lepromatosis. Neste artigo, os autores encontraram em dois casos a presença
tanto do M. leprae quanto da nova espécie proposta, demonstrando coinfecção [102]. Nos
nossos resultados no gene folP, há suspeita de cultura mista devido a duplicidade nos picos no
terceiro e décimo primeiro nucleotídeo da sequência, entretanto não podemos sugerir hetero-
resistência, pois estas regiões do gene folP onde encontramos esta duplicidade não são
reconhecidas como causadoras de resistência.
No Brasil, a inexistência da uniformização dos critérios clínicos e laboratoriais para o
diagnóstico correto de recidiva indica a necessidade urgente de desenvolvimento de Projetos
de Pesquisa com metodologia científica apropriada, cujo produto final seja constituído por
parâmetros técnicos para aplicação na rede básica do Sistema Único de Saúde. Testes de
44
sensibilidade realizados em patas de camundongos (Técnica de Shepard [103]) ainda são
utilizados, mas as desvantagens já apontadas anteriormente dificultariam a obtenção de um
resultado uniforme em diferentes estados e atrasaria o tratamento
Testes diagnósticos laboratoriais sensíveis e específicos como o PCR e
sequenciamento poderiam ser centralizados em poucos laboratórios e ser de grande utilidade
na detecção de cepas resistentes as drogas utilizadas no tratamento da Hanseníase.
45
6. COCLUSÃO E PERSPECTIVAS
Não achamos evidências para modificações genéticas nos genes folP, rpoB, gyrA e
gyrB em nenhuma das amostras analisadas.
Assumindo que o conceito que resistência em Hanseníase está diretamente associada
com mutações, acreditamos que este fenômeno não é o principal mecanismo responsável pela
recidiva. O achado de que parte dos casos, que permitiam análise dos bacilos presentes no
primeiro e segundo episódio da doença apresentaram isolados geneticamente distintos,
fortalece a hipótese de uma provável nova infecção.
Temos como perspectivas para esse trabalho:
• Verificar se a ausência de mutações causadoras de resistência é fenômeno local
(RJ) ou características de pacientes de outras regiões do país.
• Determinar se mutações estão presentes em outras regiões dos genes
estudados.
• Verificar se hetero-resistência existe em Hanseníase e explicar a ausência de
SNPs.
• Avaliar a relação entre os SNPs (não indicativos de resistência) e outros
marcadores genéticos em M. leprae.
• Aumentar o número de pacientes pesquisados comparando os nossosa
resultados com resultados com os de outros estados, traçando, assim, o perfil
da população de M. leprae circulante no Brasil.
• Possibilitar o desenvolvimento de um projeto de pesquisa com metodologia
científica apropriada cujo produto final seja a aplicação na rede básica do
Sistema Único de Saúde.
46
7. AEXOS
47
Projeto RECHANS – FICHA DE INVESTIGAÇÃO DE CASO DE RECIDIVA DE
HANSENÍASE
1) N° ________ 2) UF ____ 3) U.S. atual __________ 4) U.S. trat. Inicial __________
5) Nome: __________________________________ 6) Pront: ________ 7) SINAN: _________
8) D.nasc: _ _/_ _/_ _ _ _ 9) Sexo 10) Escolaridade: __ anos 11) Ocupação: ___________
12) Endereço: _____________________________________________ 13) Tel: _____________
14) Tempo de residência: __________ 15) Residência anterior: __________________________
16) N° cômodos na casa: ____ 17) Convive com hansen: N S 18) Tipo contato: ________
19) Nome: ___________________________________________ _Dt diagnóstico: _ _/_ _/_ _ _ _
20) Nome: ____________________________________________ Dt diagnóstico: _ _/_ _/_ _ _ _
21) Dt.Diag./Tto.Inicial: _ _/_ _/_ _ _ _ 22) FC: I T BT BB BV V FNP NC
23) G.I.Física 0 1 2 NA 24) Baciloscopia: Pos Neg NR Índice _______ NR
25) Histopatologia: I T BT BB BV V NC NR CC 26) ILB __________
27) Esquema de tratamento: PQT/PB 6 DS PQT/MB 12 DS DNDS+PQT
DNDS Outros __________________________________________________________
28) Reação hans. No tratamento: S N 29) Tipo I Tipo II Mista
30) Dt alta/cura: _ _/_ _/_ _ _ _ 31) GIF 0 1 2 NA 32) N° troncos nervosos
afetados/alta: ____
Pós Alta: 33) Reação S N 34) Tipo: I II mista neurite isolada
35) Dt 1°surto: _ _/_ _/_ _ _ _ 36) Dt. último surto: _ _/_ _/_ _ _ _
37) Tratmto: Pred Talid P+T Outros _________________________________
38) N° meses tratamento: Pred. ___ 39) Talid. ____ 40) Clofaz. ___ 41) Resposta: Boa
Sem sucesso 42) Crit clínico Recidiva: S N
43) Lesões: macula pápula infiltração difusa nódulos Placas infiltradas
Úlceras area hipoestésica 44) Reação: S N
45) Tipo: I II mista neurite isolada 46) Comp geral: S N
48
47) GIF 0 1 2 NA 48)N° troncos nervosos afetados/alta:___ 49) Dta últ aval: _ _/_ _/_ _
50) Re-Tto. PQT S N 51) Esquema terapêutico instituído: PQT/PB 6DS
PQT/MB 12 DS PQT/MB 24 DS Outros _____________________________________
_____________________________________________________________________________
52) Dt diag. Recidiva _ _/_ _/_ _ _ _ Local diagnóstico: Própria US US de referência
53) Lesões: macula pápula infiltração difusa nódulos Placas infiltradas
Úlceras area hipoestésica
54) FC: I T BT BB BV V NC
55) GIF 0 1 2 NA 56) Reação: S N
57) Tipo: I II mista neurite isolada 58) Comp geral: S N
59) N troncos nervosos afetados:_____ 60) N ulnar mediano fibular T post Outros _______
61) Baciloscopia: Pos Neg NR 62) Desc. Morfol. Globias agrupados isolados
63) Índice _____NR Íntegros fragmentados
64) Histopatologia: I T BT BB BV V NC 65) Local Bióp Pele Nervo
66) Descriç. Globias agrupados íntegros fragmentados isolados 67) ILB _____
68) Sorologia: 1-MLFLOW______ 2-ELISA atual ______ 3-anterior____ 4-posterior____ 5-NR
Data: _ _/_ _/_ _ _ _ Origem Teste: _____________________________________________
69) Co-morbidades: ____________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
70) Sensibilidade medicamentosa-sequenciamento
rpoB mutação Não Sim Tipo __________________________________________
FolP1 mutation Não Sim Tipo __________________________________________
GyrA mutation Não Sim Tipo __________________________________________
Obs: ________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Assinatura Função Data / /
49
71) Esq. De tratamento: PQT/PB 6DS PQT/MB 12 DS PQT/MB 24 DS Outros ____
_____________________________________________________________________________
72) Data de início de re-tratamento: ___/____/______
Avaliação clínica e neurológica 3° mês de tratamento 73) Quadro cutâneo
Melhorado inalterado piorado 74) Reação N S ________________________
OBS:________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Médico responsável ______________________ Função _______________ Data ___/___/____
Avaliação clínica e neurológica 6° mês de tratamento
76) Quadro cutâneo: melhorado inalterado piorado 77) reação N S Tipo: I
II mista neurite isolada
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Médico responsável ______________________ Função _______________ Data ___/___/____
Avaliação clínica e neurológica 12° mês de tratamento
78) Dt alta/cura: _ _/_ _/_ _ _ _ 79) GIF 0 1 2 NA 80) N° troncos nervosos
afetados:____
81) Reação: N S Tipo: I II mista neurite isolada
Descrição de garras e seqüelas ___________________________________________________
82) Baciloscopia: Pos Neg NR 83) Desc. Morfol. Globias agrupados
isolados íntegros fragmentados 84) Índice _____NR 85) Sorologia: MLFLOW ____
86) Quadro cutâneo: lesões residuais lesões infiltradas ulcerações garras
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Médico responsável ______________________ Função _______________ Data ___/___/____
50
Fig 1) Lesões início tratamento Fig 2) Final de tratamento
Fig 3)-Recidiva-OBS: Fig 4)- Fim do re-tratamento tratamento
OBS: _______________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Médico responsável_________________________________ Função: ___________________
Data de preenchimento: _ _/_ _/_ _ _ _
51
FICHA DE AVALIAÇÃO EUROLÓGICA SIMPLIFICADA
Face
1ª / / 2ª / / 3ª / /
ariz
D E D E D E
Queixa principal
Ressecamento (S/N)
Ferida (S/N)
Perfuração de septo (S/N)
Olhos
D E D E D E
Queixa principal
Fecha olhos s/força (mm)
Fecha olhos c/força (mm)
Triquíase (S/N) / Ectrópico (S/N)
Dimin.sensib. córnea (S/N)
Opacidade córnea (S/N)
Catarata (S/N)
Acuidade visual
Membros Superiores
1ª / / 2ª / / 3ª / /
Queixa principal
Palpação dos nervos
D E D E D E
Ulnar
Mediano
Radial
Legenda: N = normal, E = espessado e D = dor
Avaliação da força
1ª / / 2ª / / 3ª / /
D E D E D E
Abrir dedo mínimo
Abdução do 5” dedo (nervo ulnar)
Elevar o polegar
Abdução do polegar (nervo mediano)
Elevar o punho
Extensão do punho (nervo radial)
Legenda: F = forte, D = diminuída, P = paralisado ou 5 = forte, 4 = resistência parcial, 3 = movimento
completo, 2 = movimento parcial, 1 = contração, 0 = paralisado
ISPEÇÃO E AVALIAÇÃO SESITIVA
1ª / / 2ª / / 3ª / /
D E D E D E
Legenda: Caneta/Filamento lilás (2g) Sente Não sente ou Monofilamentos: seguir cores
Garra móvel = M, Garra rígida = R, Reabsorção =
, Ferida =
52
MEMBROS IFERIORES
1ª / / 2ª / / 3ª / /
Queixa principal
Palpação de nervos D E D E D E
Fibular
Tibial Posterior
Legenda: N=normal E=espessado D=dor
Avaliação da força
1ª / / 2ª / / 3ª / /
D E D E D E
Elevar o hálux
Extensão de hálux
(nervo fibular)
Elevar o pé
Dorsiflexão de pé
(nervo fibular)
Legenda: F = forte, D = diminuída, P = paralisado ou 5 = forte, 4 = Resistência parcial, 3 = Movimento
Completo, 2 = Movimento parcial, 1 = Contração, 0 = Paralisado
ISPEÇÃO E AVALIAÇÃO SESITIVA
1ª / / 2ª / / 3ª / /
D E D E D E
Legenda: Caneta/Filamento lilás (2g) Sente Não sente ou Monofilamentos: seguir cores
Garra móvel = M, Garra rígida = R, Reabsorção =
, Ferida =
CLASSIFICAÇÃO DO GRAU DE ICAPACIDADE (OMS)
DATA DA
AVALIAÇÃO
OLHOS MÃOS PÉS
MAIOR
GRAU
ASSIATURA
D E D E D E
Aval. diagnóstico / /
Aval. de alta / /
53
VIII – Anexo 2
Coeficiente de Detecção 1998 - 2007 Hanseníase
Estado do Rio de Janeiro e Municípios
Município / Ano 1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
Angra dos Reis 18,85
20,65
17,61
14,26
23,75
10,80
12,79
4,99
10,41
14,88
Aperibé 0,00
38,12
24,94
62,36
23,87
46,81
68,87
11,00
21,56
0,00
Araruama 66,22
65,58
61,59
99,03
54,66
53,26
19,47
30,71
30,88
26,21
Areal 0,00
10,58
0,00
0,00
0,00
0,00
18,90
0,00
35,88
0,00
Armação de Búzios 0,00
5,91
10,99
5,49
5,05
48,62
23,46
17,38
4,19
36,39
Arraial do Cabo 0,00
0,00
0,00
4,19
8,09
7,96
15,68
3,79
11,18
0,00
Barra do Piraí 5,67
13,42
7,91
7,91
12,16
8,76
5,42
6,36
4,19
2,07
Barra Mansa 5,35
8,88
8,78
8,20
13,93
12,72
10,94
9,13
15,90
7,35
Belford Roxo 40,52
36,45
34,98
32,91
34,67
33,68
26,06
31,20
28,02
22,12
Bom Jardim 4,45
4,38
8,83
4,41
8,67
12,89
0,00
0,00
8,28
8,21
Bom Jesus do Itabapoana 21,05
17,79
14,86
17,83
14,51
37,34
25,58
22,21
21,95
10,85
Cabo Frio 27,24
25,94
26,02
23,65
21,76
39,16
18,91
16,28
7,25
15,75
Cachoeiras de Macacu 4,46
4,39
4,12
4,12
13,92
21,52
15,41
11,16
20,11
14,38
Cambuci 26,98
20,29
13,63
40,90
41,11
20,61
13,77
27,70
0,00
20,90
Campos dos Goytacazes 17,69
15,31
28,26
30,47
30,23
30,50
33,14
26,28
26,07
22,63
Cantagalo 0,00
5,22
5,04
20,17
4,97
4,93
4,90
4,83
14,37
14,27
Carapebus 0,00
0,00
0,00
46,16
0,00
10,47
10,26
9,83
9,63
0,00
Cardoso Moreira 16,95
34,07
63,52
47,64
55,79
31,91
55,96
80,22
32,15
40,26
Carmo 51,84
19,29
32,70
26,16
32,35
12,88
38,45
19,01
31,52
31,34
Casimiro de Abreu 23,01
17,84
9,03
27,09
34,01
8,28
28,23
19,05
29,65
25,26
Comendador Levy Gasparian 0,00
0,00
0,00
25,24
24,69
0,00
12,09
11,83
0,00
0,00
Conceição de Macabu 0,00
5,26
5,32
15,97
10,44
5,24
5,19
5,08
10,06
9,96
Cordeiro 0,00
0,00
0,00
0,00
5,27
36,51
20,67
5,06
10,02
9,91
Duas Barras 40,08
0,00
0,00
0,00
19,17
0,00
9,50
0,00
0,00
18,65
54
Duque de Caxias 47,10
48,48
47,07
47,58
43,23
50,33
39,43
30,61
30,18
29,53
Engenheiro Paulo de Frontin 15,68
7,78
0,00
8,22
8,21
24,59
8,19
24,53
16,35
32,65
Guapimirim 117,51
43,04
57,97
39,52
69,95
65,86
64,35
56,64
41,99
45,30
Iguaba Grande 9,59
27,92
13,25
6,63
23,98
22,97
11,02
10,09
4,96
9,52
Itaboraí 24,12
25,87
28,27
33,07
41,11
37,23
40,81
31,96
26,70
16,37
Itaguaí 47,80
52,25
25,61
29,27
23,28
42,17
55,84
37,37
31,33
35,77
Italva 7,45
0,00
7,92
0,00
15,88
7,95
0,00
23,94
47,94
16,00
Itaocara 46,88
29,72
47,82
30,43
13,04
34,75
30,40
21,69
21,68
4,34
Itaperuna 35,17
19,65
34,59
29,98
40,65
27,96
34,35
31,46
32,20
23,37
Itatiaia 30,11
12,41
20,21
36,38
45,18
7,30
10,62
3,31
12,84
18,69
Japeri 26,76
23,48
28,82
63,64
55,20
48,50
26,56
35,02
38,46
41,77
Laje do Muriaé 0,00
0,00
12,64
0,00
24,98
0,00
0,00
12,21
0,00
12,07
Macaé 27,11
18,31
15,10
13,59
13,52
29,82
28,39
14,71
12,44
9,09
Macuco 0,00
0,00
0,00
20,47
0,00
0,00
21,65
44,70
22,70
0,00
Magé 52,59
40,28
37,41
26,72
44,71
42,04
35,89
35,74
36,71
19,86
Mangaratiba 46,75
49,82
12,05
28,11
18,96
22,18
14,43
30,75
26,61
32,43
Maricá 21,64
26,99
14,33
15,64
14,44
27,89
20,23
37,64
22,21
5,86
Mendes 0,00
34,07
0,00
5,78
5,74
0,00
17,07
0,00
5,62
22,38
Mesquita 0,00
0,00
0,00
0,00
18,08
21,26
26,04
18,63
20,48
21,22
Miguel Pereira 14,68
4,86
4,18
12,55
4,03
7,91
3,89
7,49
14,71
10,83
Miracema 16,47
12,39
18,47
0,00
21,84
18,07
10,77
14,13
17,53
3,48
Natividade 6,50
6,45
6,61
46,28
19,70
32,73
6,53
45,37
38,75
12,87
Nilópolis 32,47
41,07
18,22
16,26
14,40
21,66
22,38
15,23
10,63
14,00
Niterói 20,35
17,83
15,89
16,11
17,01
13,07
13,44
9,07
11,33
9,81
Nova Friburgo 7,64
7,62
2,88
5,77
2,86
2,28
4,55
3,95
1,68
2,24
Nova Iguaçu 29,38
27,02
27,81
25,96
35,11
27,64
26,99
23,23
21,79
20,39
Paracambi 12,28
14,53
27,18
27,18
36,30
33,55
40,37
20,92
25,31
25,05
Paraíba do Sul 2,98
0,00
2,67
0,00
2,62
12,99
7,73
2,53
5,00
4,95
Parati 33,64
19,40
30,46
37,23
35,80
60,75
28,28
36,30
47,48
55,36
Paty do Alferes 0,00
4,34
8,02
0,00
3,89
0,00
0,00
3,66
3,60
3,55
Petrópolis 5,07
1,79
8,38
1,74
3,75
3,71
2,01
3,92
1,62
1,59
Pinheiral 0,00
10,32
5,13
5,13
4,88
4,77
4,67
4,45
4,35
12,74
55
Piraí 4,10
15,91
9,04
18,08
0,00
0,00
4,28
12,49
16,42
20,24
Porciúncula 12,59
0,00
12,54
31,34
36,93
12,21
12,11
0,00
11,78
23,35
Porto Real 22,02
21,55
0,00
24,80
15,37
7,44
7,21
13,50
26,13
18,99
Quatis 9,53
27,82
0,00
9,32
17,95
17,64
43,39
8,36
49,26
24,19
Queimados 17,70
19,13
38,53
40,17
37,83
37,17
35,01
49,81
26,60
27,52
Quissamã 7,47
29,09
7,31
14,63
20,91
13,64
40,06
25,51
31,16
12,20
Resende 25,37
34,78
23,91
14,35
23,88
18,94
23,92
19,59
18,37
8,20
Rio Bonito 21,23
14,77
2,01
14,09
21,72
9,79
11,64
7,61
9,43
7,47
Rio Claro 33,57
19,86
18,49
0,00
0,00
0,00
5,79
0,00
0,00
0,00
Rio das Flores 0,00
0,00
13,11
26,23
12,70
25,04
12,35
0,00
0,00
0,00
Rio das Ostras 12,99
3,12
32,95
38,44
29,81
38,07
31,97
20,91
26,07
26,97
Rio de Janeiro 21,40
23,52
18,80
16,76
17,58
15,58
15,57
13,39
12,84
11,30
Santa Maria Madalena 9,33
0,00
0,00
9,55
9,62
28,95
0,00
0,00
0,00
0,00
Santo Antônio de Pádua 0,00
2,90
0,00
2,58
20,09
17,34
22,01
11,88
25,77
16,17
São Fidélis 8,03
7,95
16,31
24,46
29,53
40,03
15,92
7,86
10,41
10,34
São Francisco de Itabapoana 0,00
8,00
4,86
2,43
4,67
2,30
4,51
0,00
4,26
0,00
São Gonçalo 23,89
27,38
15,60
15,37
22,85
21,72
19,55
16,34
14,38
11,97
São João da Barra 20,67
13,58
7,22
36,12
46,44
21,32
17,68
10,49
3,48
3,46
São João de Meriti 43,13
38,63
28,48
33,59
35,43
31,09
25,27
35,75
28,05
17,46
São José de Ubá 0,00
0,00
15,59
46,78
15,37
45,80
0,00
14,95
14,84
0,00
São José do Vale do Rio Preto 0,00
0,00
10,37
0,00
0,00
19,56
4,80
0,00
0,00
0,00
São Pedro da Aldeia 8,41
4,89
7,91
4,74
17,78
15,83
8,40
10,54
7,62
3,70
São Sebastião do Alto 0,00
0,00
35,71
23,80
23,48
0,00
0,00
11,44
11,36
11,28
Sapucaia 11,47
0,00
0,00
0,00
28,54
11,31
5,60
0,00
16,27
0,00
Saquarema 6,35
14,37
24,78
68,62
28,81
12,29
51,40
27,60
28,47
15,42
Seropédica 20,92
27,36
27,58
41,37
32,10
34,25
36,32
37,32
20,84
31,84
Silva Jardim 0,00
0,00
9,41
9,41
31,93
35,99
13,31
17,23
8,48
4,18
Sumidouro 0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
6,70
6,64
0,00
Tanguá 8,12
15,87
30,70
23,03
44,10
28,84
38,91
27,14
29,90
26,05
Teresópolis 8,65
4,68
7,97
7,24
6,35
6,97
5,51
2,69
3,98
3,93
Trajano de Morais 19,10
48,00
0,00
39,85
10,09
50,75
0,00
0,00
0,00
0,00
Três Rios 6,02
6,01
11,11
15,28
9,56
9,48
8,06
3,96
5,23
0,00
56
Valença 35,57
24,21
31,67
13,57
8,89
7,35
4,38
5,73
1,42
1,41
Varre-Sai 0,00
0,00
12,73
25,46
0,00
37,13
0,00
12,03
0,00
0,00
Vassouras 13,66
10,21
6,36
15,90
15,61
12,38
6,14
15,06
8,95
11,82
Volta Redonda 10,93
14,56
12,81
7,02
10,54
15,28
12,36
6,26
11,23
7,29
Estado 24,03
24,31
21,48
21,20
22,72
21,85
20,06
17,72
16,75
14,41
Dados sujeitos a revisão: Fonte:SESDEC\SAS\SVS\ADS - banco de dados de setembro de 2008 p/ as informações de 2001 a 2007 e de janeiro de 2007 p/ os casos de 1998 a 2000. O
Coeficiente de Detecção foi calculado por 100.000 habitantes.
57
Anexo 3
ID IB folP rpoB + mlres gyrA gyrB gyrA Local
1R 4 OK OK OK OK T
Baixada Fluminense/ São João de Meriti
2R 0 OK OK OK OK C
Baixada Fluminense/Nova Iguaçu
3R 4 OK OK OK OK T
Baixada Fluminense / São João de Meriti
4R 0.41 OK OK OK OK C
RJ / Vila da Penha
5R 0.41 OK OK OK OK T
RJ / Vila da Penha
6R 6,85 OK OK P OK T
RJ / Acari
7R 0 OK OK OK OK T
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
8R 2,42 OK OK OK OK T
RJ / Madureira
9R 4,7 N OK P N C
RJ / Conjunto Esperança
10R 2,42 OK OK OK OK T
RJ / Madureira
11R 1,49 OK OK OK OK T
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
12R 1,49 OK OK OK OK C
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
13R 2,33 OK OK OK OK T Baixada Fluminense / Duque de Caxias
14R 4,7 OK OK OK OK T
RJ / Conjunto Esperança
15R 3,8 OK OK OK P C
Baixada Fluminense / Magé
16R 0 OK OK OK OK T
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
17R N P P OK São Gonçalo
18R N P P P São Gonçalo
19R 3,8 OK OK OK OK C
Baixada Fluminense / Magé
20R 5,7 OK OK OK OK C
RJ/Acari
21R OK OK OK OK T
22R 1,33 N N P N Baixada Fluminense / Itaguaí
23R 1,33 N N OK OK C Baixada Fluminense / Itaguaí
25R 4 OK OK OK OK C
26R 4 OK OK OK OK C
58
27R 0,25 N N P OK T
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
28R OK OK OK OK C
29R P N OK OK T
30R 4,4 OK OK OK OK T
31R 2 OK OK OK OK T
32R N N OK OK C
33R 0 N N P OK C
Baixada Fluminense / Queimados
34R 0 N OK N P
43R OK OK OK OK T
44R OK OK OK OK C
Baixada Fluminense / Magé
45R 2? OK P P OK
46R 0? P N OK N C
47R 3,25 OK OK OK OK T
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
48R OK N OK P T
49R N N P OK C
50R 4,5 OK OK OK OK T
51R P N OK OK C RJ / Campo Grande
52R 0 N N N OK
Baixada Fluminense / Duque de Caxias
53R N N N N
54R 0 N N OK P C
55R 1,5 OK OK OK OK C
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
56R 4 OK N P P RJ / Bonsucesso
58R OK OK OK P T
60R 0 N N P N C
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
61R 4,5 OK OK OK OK C
62R 3,33 P OK OK OK RJ
63R N P P OK RJ / Méier
64R 0 P N OK N C
Baixada Fluminense / São João de Meriti
65R 3 P N N N RJ / Bonsucesso
66R 0,75 N N OK N C
59
77R 0 N N P P Rio de janeiro
79R OK OK N N
Baixada Fluminense / Magé
80R 1 OK OK OK OK T RJ / Inhaúma
81R 0 N N N N
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
82R 0 N N OK OK C
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
113R 2,5 N N N N Baixada Fluminense / Belford Roxo
114R 0 N N N N Baixada Fluminense / Nilópolis
115R N N N N
117R 1,25 P OK OK OK C
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
137R 3,75 OK OK N OK RJ / Fazendinha
138R 4 OK OK OK P T
Baixada Fluminense / Magé
139R 0 N N OK OK C
Baixada Fluminense / Magé
140R 3,25 OK OK N P
Baixada Fluminense / São João de Meriti
151R N N N N
152R 0 N N N P RJ / Campo Grande
190R N N N N
191R N N N N Baixada Fluminense / Duque de Caxias
192R N N N N T
203R N OK P N RJ / Colégio
204R N N N N
Baixada Fluminense / Nova Iguaçu
208R N N N N RJ / Bonsucesso
209R N P N N RJ / Riachuelo
210R N N N N RJ / Piedade
215R N N N N RJ / Kosmos
218R P OK OK N T
Baixada Fluminense/ São João de Meriti
219R P P OK N C Baixada Fluminense / Mesquita
222R N OK OK N C
230R N P P N
231R P OK P N
233R N N N
60
24976 OK OK OK OK T
24977 OK OK OK OK T
24981 OK OK OK OK T
24982 OK OK OK OK T
24983 OK OK OK OK T
NHDP-63 OK OK OK OK T
3039 OK OK OK P C
3045 OK OK OK OK C
4923 OK N OK OK C
A606 OK N OK OK C
I480 OK N OK OK C
I487 OK N OK P C
Thai53 OK P OK P C
MlCris OK OK OK OK C
NHDP-65 N N N N
Folp101 OK N N N
Folp102 OK N N N
Folp103 OK N N N
C – Citosina no códon 99 do gyrA de mycobacterium; T - Timina no códon 99 do gyrA de Mycobacterium; N – Não amplificou; OK – Amostra
seqüenciada; P – Amostra em processamento; IB – Índice de baciloscopia; ID – Número da amostra; Em azul os controles utilizados.
61
8. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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